1. Introducere………………………………………………………………………………………3 2. Aspecte teoretice…………………………………………………………………………………4 2.1. Porfirii…………………………………………………………………………………4… [305699]

CUPRINS

1. Introducere………………………………………………………………………………………3

2. Aspecte teoretice…………………………………………………………………………………4

2.1. Porfirii…………………………………………………………………………………4

2.1.1. Calea de sinteză a hem-ului………………………………………………….4

2.1.2. Defecte genetice ce duc la acumularea de precursori porfirinici…………….6

2.1.3. Tipurile de porfirii acute……………………………………………………..7

2.1.3.1. Porfiria acută intermitentă (PAI) ………………………………….8

2.1.3.2. Porfiria variegată…………………………………………………..8

2.1.3.3.Coproporfiria ereditară……………………………………………..9

2.1.3.4. Porfiria acid δ aminolevulinic dehidratază deficientă……………..9

2.1.4. Simptomatica atacurilor acute……………………………………………….9

2.1.5 Neuropatia ca rezultat al porfiriilor acute……………………………………11

2.1.6. Factori declanșatori ai atacurilor de porfirie………………………………..13

2.1.7. Diagnostic și control al bolii………………………………………………..15

2.1.7.1. Teste biochimice și modalități de diagnostic……………………..15

2.1.7.2. Controlul bolii……………………………………………………18

2.2. Implicarea canalelor TRP în percepția durerii………………………………………..20

2.2.1. Caracteristici generale ale canalelor TRP…………………………………..20

2.2.2. Expresie și distribuție………………………………………………………21

2.2.3. Farmacologia și modularea…………………………………………………22

2.2.3.1. TRPV1……………………………………………………………22

2.2.3.2. TRPA1……………………………………………………………23

2.2.3.3. TRPM8……………………………………………………………24

2.2.3.4. Interacții între diferite canale……………………………………..24

2.2.4. Implicarea în nocicepție și diferite tipuri de durere…………………………25

2.2.5. Durerea asociată neuropatiei……………………………………………….27

2.2.5.1. Rolul TRPV1……………………………………………………..30

2.2.5.2. Rolul TRPA1……………………………………………………..32

2.2.5.3. Rolul TRPM8…………………………………………………….33

2.3. Interferența ARN mediată de ARN mic de interferență………………………………35

2.3.1. Fenomenul de interferență ARN……………………………………………35

2.3.2. Structură ARNsi……………………………………………………………37

2.3.3. ARNsi endogen…………………………………………………………….38

2.3.4. [anonimizat]2………………….39

2.3.5. Agenți de transfecție………………………………………………………..42

2.3.6. Optimizarea eficienței silențierii și metode de măsurare a acesteia…………44

3. Materiale și metode…………………………………………………………………………….46

3.1. Reactivi și soluții utilizate……………………………………………………………46

3.2. Mod de lucru…………………………………………………………………………47

3.2.1. Cultură primară de neuroni din ganglionii spinali de la șobolan……………47

3.2.2. Silențierea genei pentru porfobilinogen deaminază (PBGD) ………………47

3.2.3. Imagistică de calciu pentru observarea activității canalelor TRPA1, TRPV1 și TRPM8…………………………………………………………………………………………48

3.2.4. Western blot pentru evidențierea silențierii genei PBGD………………….50

3.2.5. Imagistică ROS…………………………………………………………….52

4. Rezultate și discuții…………………………………………………………………………….54

4.1. Rezultate……………………………………………………………………………..54

4.1.1. Silențierea genei HMBS în neuroni din DRG de șoboloan și determinarea nivelului proteinei prin Western blot………………………………………………………………54

4.1.2. Imagistică de calciu pentru evidențierea activității modificate a TRPA1, TRPV1 și TRPM8…………………………………………………………………………………55

4.1.3. Imagistica DRG a speciilor reactive de oxigen……………………………..60

4.2. Discuții……………………………………………………………………………….61

5. Concluzii……………………………………………………………………………….62

6. Bibliografie…………………………………………………………………………….63

7. Listă figuri………………………………………………………………………………67

Introducere

Porfiriile acute sunt afecțiuni metabolice moștenite ce rezultă din incapacitatea celulelor de a sinteza eficient hem. [anonimizat] negative rezultate atât din cauza cantității insuficiente de hem cât și din cauza acumulării unor precursori toxici, ca acidul d aminolevulinic (ALA) sau porfobilinogenul (PBG) (Lin și colab, 2011).

Porfiria acută intermitentă este forma de porfirie acută cu cel mai mare impact la nivelul populației, afectând aproximativ 1 din 75 de mii de persoane, existând însă în Suedia un efect de fondator, fiind raportate cazuri la 1 din 1000 de persoane (Puy și colab, 2010). Maladia este marcată de atacuri acute, caracterizate de simptomatică nespecifică ce include dureri abdominale, slăbiciuni și dureri ale membrelor, greață, emeză, dar și manifestări psihiatrice ca anxietate depresie și paranoia (Lin și colab, 2011).

O altă caracteristică a porfiriilor acute este instalarea neuropatiei periferice. Aceasta poate rezulta ca o consecință a nivelului redus de hem, ce duce la o funcționare anormală a catenei transportoare de electroni mitocondrială și cantități reduse de ATP, dar și din cauza efectului neurotoxic direct al intermediarilor din calea de sinteză. Deși în literatură este raportată în principal neuropatia motorie, este cunoscut faptul că există și neuropatie a neuronilor senzitivi (Lin și colab, 2011).

Canalele Transient Receptor Potential (TRP), în special TRP melastatin 8 (TRPM8), TRP vaniloid 1 (TRPV1) și TRP ankirin 1 (TRPA1) sunt implicate în transmiterea durerii, fiind exprimate în nociceptori. Durerea neuropatică poate apărea din mai multe motive, printre acestea numărându-se și lezarea nervilor (Basso și Altier, 2017), afecțiune ce apare și în porfiriile acute. În aceste condiții, TRPV1, TRPA1 și TRPM8 au funcțiile și nivelul de expresie alterate, conducând la o transmitere anormală a durerii, fiind semnalate hiperalgezie mecanică, termică, cât și alodinie la frig (Jardin și colab, 2017).

În cadrul lucrării este investigată activitatea TRPA1, TRPV1 și TRPM8 în condiții ce mimează porfiria acută intermitentă, condiții obținute prin interferență ARN ce împiedică expresia porfobilinogen deaminazei, enzima cel mai des afectată în aceste maladii. De asemenea, a fost investigată și capacitatea precursorilor ALA și PBG acumulați intracelular de a produce specii reactive de oxigen.

2. Aspecte teoretice

2.1. Porfirii

2.1.1. Calea de sinteză a hem-ului

Hem-ul este o grupare prostetică alcăuită dintr-un complex al fierului cu protoporfirina IX, necesară pentru funcționarea tuturor organismelor aerobe (Ponka, 1999). Prin intermediul transportului de electroni facilitat de citocromi (în structura cărora se află), acesta este implicat în desfășurarea reacțiilor din catena respiratorie mitocondrială (Ponka, 1999; Puy și colab, 2011). Hemproteinele cuprind catalazele, peroxidaze, hidroxilaze pentru sinteza hormonilor steroizi (Ponka, 1999; Lin și colab, 2011) dar și proteine ce fixează oxigenul ca hemoglobiona și mioglobina. Sinteza hem-ului în celulele liniei eritrocitare reprezintă aproximativ 85% din sinteza totală zilnică. Cealaltă fracție este realizată în principal în hepatocite, aproape exclusiv pentru formarea citocromului P450 și a diferite enzime din reticulul endoplasmic al hepatocitelor (Balwani și Desnick, 2012).

Formarea hem-ului este realizată pe parcursul a opt etape enzimatice distincte, prima și ultimele trei reacții desfășurându-se în mitocondrie, celelalte în citosol (Balwani și Desnick, 2012). Calea de sinteză a hem-ului debutează cu reacția catalizată de acid δ aminolevulinic (ALA) sintaza (ALAS), prin care sunt condensate o moleculă de glicină și o moleculă de succinil coenzima A pentru a forma o moleculă de ALA (Lin și colab, 2011, Ponka 1999). ALA sintaza se găsește sub forma a două izoenzime codificate de gene diferite (Balwani și Desnick, 2012), ALAS 1 fiind situată pe cromozomul 3, iar ALAS 2 pe cromozomul X (Bissell și Wang, 2015). ALAS 1 este o genă exprimată bazal în toate celulele organismului, în timp ce ALAS 2 este specifică liniei de diferențiere a eritrocitelor. (Balwani și Desnick, 2012). ALAS 1 este inhibată de produsul final al căii metabolice, și anume hem-ul (Herrick și McColl, 2005). ALAS 1 este controlată și de efectul glucozic (nivele mari de glucoză sau carbohidrați), prin modularea factorilor de transcripție, printre care Peroxizom proliferator-activat receptor gamma coactivator PGC-1. ALAS 2 se găsește sub controlul factorilor de transcripție eritroizi, cum ar fi factorul de legare GATA 1 și sitemul de proteine reglatoare de Fe (Wang și colab, 2018). Acidul δ aminolevulinic se întălnește în literatură și ca acid 5 aminolevulinic sau acid d aminolevulinic.

ALA este apoi dimerizat pentru a se forma porfobilinogen (PBG) (Lin și colab, 2011), reacție catalizată de ALA dehidrataza și realizată în citosol (Bissell și Wang, 2015). Ulteriror, patru molecule de PBG sunt condensate rezultând hidroximetil bilan, prin acțiunea enzimei hidroximetil bilan sintază (HMBS), care este numită și porfobilinogen deaminază (PBGD). Hidroximetil bilanul este convertit în uroporfirinogen (Harper și Sardh, 2014), de o enzimă numită uroporfirinogen III sintază, reacție urmată de o decarboxilare catalitază de uroporfirinogen III decarboxilaza cu formare de coproporfirinogen. Calea metabolică se continuă prin activitatea coproporfirinogen oxidazei, enzimă ce duce la formarea de protoporfirinogen IX, ce este apoi convertit la protoporfirina IX de către protoporfirinogen oxidaza. În final atașarea unui atom de Fe mediată de ferochelatază duce la formarea de hem (Harper și Sardh, 2014; Kim și coalb, 2015). Ultimele trei reacții se desfășoară în mitocondrie, (Fig 1) (Ponka, 1999).

Figură 1: Calea de sinteză a hem-ului. Prima etapă enzimatică presupune formarea ALA dintr-o moleculă de succinil CoA și o moleculă de glicină, iar ultima este reprezentată de atașarea unei molecule de Fe la protoporfirina IX. Prima și ultimele 3 etape se desfășoară în mitocondrie, restul în citosol. Grupările acetil au fost notate Ac, acid propionic Pr, vinil Vi. Figură adaptată după Ponka, 1999.

Enzima ce controlează viteza căii metabolice în ficat este ALAS 1, activitatea, expresia și transportul acesteia fiind controlate de nivelul de hem liber din celule. Astfel, hem-ul blochează translocarea în mitocondrie a enzimei traduse în citosol, dar poate bloca și sinteza de ARNm pentru aceasta (Balwani și Desnick, 2012; Besur și colab, 2015). De asemenea, în condiții normale, hem-ul afectează stabilitatea ARNm al ALAS 1 și promovează degradarea proteinei mediată de proteaza Lon din mitocondrie. Rata crescută a expresiei ALAS 1 poate fi un rezultat al utilizării medicamentelor și compușilor chimici lipofilici ce interacționează cu receptori nucleari ce se leagă de regiunile enhancer ale genei (Besur și colab, 2015). O altă enzimă ce regleză viteza căii metabolice este PBGD, proteină și genă asociată importante pentru afecțiunile acestei căi (Herrick și McColl, 2005).

În celulele eritropoietice din măduva osoasă se desfășoară majoritatea sintezei hem-ului din organism, iar aceasta e controlată diferit față de cea din ficat. Reglajul se desfășoară în timpul diferențierii celulelor sub acțiunea eritropoietinei, dependent de disponibilitatea ionilor de Fe (Puy și colab, 2010). Aceștia sunt esențiali întrucât reglează translația ARNm pentru ALAS 2 și sunt substrat pentru ferochelatază (Balwani și colab, 2012). ALAS 2 este specifică pentru celulele eritroide, întrucât gena conține elemente gentice reglatoare cis, la care se pot lega diferiți factori de transcripție, printre care factorului nuclear eritroid 2. De asemenea, activitatea enzimei nu e inhibată de hem, iar în linii celulare s-a arătat că acesta promovează translația ARNm al ALAS 2 (Ponka, 1999).

2.1.2. Defecte genetice ce duc la acumularea de precursori porfirinici

Porfiriile sunt boli moștenite, autozomal dominante, autozomal recesive, X-lincate, sau dobândite (porfiria cutanea tarda), în care una din genele ce codifică pentru enzimele din calea de sinteză a hem-ului este afectată (Balwani și colab, 2012). În mod obșnuit sunt clasificate ca porfirii acute, caracterizate de simptome neuropsihiatrice, sau cutanate, marcate de hipersensibilitatea la lumina soarelui. Pot fi clasificate și ca porfirii eritropoietice sau hepatice, în funcție de țesutul afectat de defectele genetice (Harper și Sardh, 2014). Porfiria acută intermitentă (PAI), cea mai răspândită formă de porfirie acută, rezultă din urma unor mutații la nivelul genei ce codifică enzima PBGD (Siegesmund și colab, 2010), coproporfiria ereditară (CPE) rezultă din mutații în gena pentru coproforfirinogen oxidază (CPOX), iar porfiria variegată (PV) rezultă din cauza mutațiilor din gena protoporfirinogen oxidazei (PPOX). Cea mai rară dintre porfiriile acute este porifiria ALA dehidratază deficientă, numită și porfiria Doss (Poblete-Gutierrez și colab, 2006), fiind semnalate mai puțin de 20 de cazuri la nivel mondial (Balwani și colab, 2012). Au fost raportate câteva cazuri de PAI în care ambele gene erau defecte, pacienții homozigoți suferind manifestări neurologice severe în copilărie (Harper și Sardh, 2014).

Mutațiile ce induc pierderea funcției genei ALAS 2 conduc la instalarea anemiei sideroblastice X lincate, în timp ce mutațiile ce determină câștig de funcție (de obicei afectează ultimul exon al genei), sunt cauza protoporfiriei eritropoietice X lincate (Balwani și colab, 2012).

2.1.3. Tipurile de porfirii acute

Termenul de porfirie derivă din grecul ”porphyra” (un pigment violet) și a fost folosit pentru prima oară de chimistul german Hoppe-Seyler în 1871 când a remarcat moleculele porfirinice. El a folosit termenul ”hematoporfirin” pentru a descrie pigmentul violet-roșiatic izolat din hematină (compus format prin oxdiarea hem-ului). Porfiria acută intermitentă a fost prima oară descrisă formal în 1937, însă din date istorice se poate determina că au mai existat figuri importante ce este posibil să fi suferit această afecțiune. Regele George al III-lea și Vincent van Gogh se numără printre personalitățile a căror simptomatică ar fi putut indica un diagnostic cu porfirie, întrucât prezentau dureri abdominale, tulburări gastrointestinale, slăbiciune musculară și diferite afecțiuni psihice (Lin și colab, 2011).

Tipurile principale de porfirie acută (autozomal dominante) sunt porfiria acută intermitentă (PAI), porfirira variegată (PV) și coproforfiria ereditară (CPE), pe lângă care s-a raportat și porfiria ALA dehidratază deficientă, autozomal recesivă (Balwani și colab, 2012). Aceste tipuri de porfirii au fost considerate acute întrucât atacurile presupun aceleași tipuri de simptome nespecifice (Siegesmund și colab, 2010), printre care dureri abdominale de lungă durată, greață, tahicardie, hipertensiune arterială, diferite afecțiuni neurologice și psihiatrice, convulsii (Poblete-Gutierrez și colab, 2006).

Este imporant de notat că în PAI, PV si CPE mutațiile determină o reducere cu aproximativ 50% a activității enzimatice obișnuite, nu o pierdere totală a funcției (Wang și colab, 2018)

2.1.3.1. Porfiria acută intermitentă (PAI)

PAI este cea mai prevalentă formă de porfirie acută, este o afecțiune genetică autozomal dominantă caracterizată de dureri abdominale rezultate în urma crizelor neuroviscerale (Herrick și McColl, 2005). Boala este cea mai severă din clasa sa din punct de vedere clinic și apare la 5-10 persoane din 100 de mii (Wang și colab, 2018). Permeanța bolii este însă mică, deoarece mutațiile la nivelul genei HMBS apar la aproximativ 1 din 100 după unele aprecieri, (Herrick și McColl, 2005) sau 1 din 500 conform altora (Lin și colab, 2011). S-a remarcat însă un efect de fondator în nordul Suediei, unde afecțiunea apare la 1 din 1000 de persoane, incidență mult mai mare față de media europeană de 1 din 75 de mii (Puy și colab, 2010). Gravitatea afecțiunii ar putea fi determinată de activitatea bazală redusă a HMBS hepatic, fiind doar puțin mai activă decât prima enzimă din calea metabolică, ALAS 1 (Wang și colab, 2018).

În PAI, PBGD are o funcție alterată, astfel nu se poate forma destul uroporfirinogen pentru a se continua calea metabolică de sinteză a hem-ului, în consecință acumulându-se în celule precursorii ALA și PBG. Gena pentru PBGD are 15 exoni, se găsește pe brațul lung al cromozomului 11 la oameni și conține în structura sa doi promotori. Unul determină transcrierea unui ARNm constitutiv în toate celulele, iar celălalt este specific eritroid, diferențierea rezultând prin procese de splicing alternativ (Herrick și McColl, 2005), forma eritrocitară neprezentând exonul 2 (Bissell și Wang, 2015). Mutații pot apărea în ambele izoforme ale enzimei (Herrick și McColl, 2005). Majoritatea mutațiilor sunt mis-sens și determină introducerea unui codon stop fiind tradusă o enzimă incompletă și nefuncțională. Până la 90% din pacienții heterozigoți cu PAI sunt asimptomatici de-a lungul vieții (Lin și colab, 2011).

2.1.3.2. Porfiria variegată

Porfiria variegată nu este la fel de prevalentă în Europa ca PAI, însă este foarte comună în Africa de Sud și Chile, din cauza unui efect de fondator, incidența fiind de 1 din 30 de mii în populația albă (Puy și colab, 2010; Siegesmund și colab, 2010). Efectul de fondator din Africa de Sud poate fi asociat direct cu un colonist olandez din 1688. În prezent, aproximativ 20000 de oameni suferă de această boală, 90% dintre ei prezentând aceeași mutație (Bissell și Wang, 2015). Mutația determinantă a bolii este în cadrul genei PPOX, codificatoare pentru protoporfirinogen oxidaza. Împreună cu coproporfiria ereditară sunt singurele forme de porfirii acute în care simptomele includ afecțiuni ale pielii asemănătoare cu cele observate în porfiria cutanea tarda, de aceea au fost numite și porfirii neurocutanate (Siegesmund și colab, 2010).

2.1.3.3. Coproporfiria ereditară

Coproporfiria ereditară este o afecțiune rară cu simptomatică asemănătoare porfiriei variegate. Defectul genetic este remarcat în gena CPOX, codificatoare pentru coproporfirinogen oxidază, a șasea enzimă din calea de sinteză a hem-ului. Asemănător cu PV, sunt semnalate leziuni cutanate în zonele expuse la soare (Poblete-Gutierrez și colab, 2006; Siegesmund și colab, 2010).

2.1.3.4. Porfiria acid δ aminolevulinic dehidratază deficientă

Porfiria Doss este singura formă de porfirie acută atutozomal recesivă, defectele sunt prezente pe ambii cromozomi, în cadrul genei ce codifică pentru ALA dehidratază. Sunt foarte puține cazuri semnalate la nivel mondial, iar manifestările bolii sunt asemănătoare cu cele ale PAI (Poblete-Gutierrez și colab, 2006; Balwani și Desnick, 2012).

2.1.4. Simptomatica atacurilor acute

Atacurile acute sunt caracterizate de simptome nespecifice (Siegesmund și colab, 2010). De asemenea, nu prezintă o componentă inflamatorie și nu sunt niciodată semnalate febră sau leucocitoză (Balwani și Desnick, 2012). Crizele sunt marcate de dureri abdominale, dureri și slăbiciuni ale membrelor, dureri în piept, gât sau în zona capului (Fig 2) (Cardenas și Guerrero, 2018), dar și greață, vomă, constipație sau diaree. Hipertensiune, tahicardie și aritmii cardiace sunt prezente în aproape toate cazurile, consecință a activității anormale a sistemului nervos autonom (Lin și colab, 2011). S-a demonstrat că nivele ridicate de ALA, caracteristice atacurilor acute au un efect direct asupra sistemului digestiv, promovând spasmele intestinale (Cardenas și Guerrero, 2018).

Figură 2: Cele mai frecvente manifestări ale durerii în crizele acute de porfirie, figură adaptată după Cardenas și Guerrero, 2018.

Neuropatia motorie poate duce la pareză și paralizie, iar implicarea sistemului respirator poate rezulta în stop cardio-respirator și moarte (Gorchein, 1997; Harper și Sardh, 2014). Implicarea sistemului nervos central a fost dedusă din manifestările psihiatrice ce includ anxietate, depresie, insomnie, agitație, confuzie și halucinații (Lin și colab, 2011; Harper și Sardh, 2014). Se presupune că simptomele asociate sistemului nervos central sunt mediate în parte de nervul vag (Siegesmund și colab, 2010). Pacienții cu PAI pot dezvolta în timpul unui atac convulsii și encefalopatii, cele din urmă fiind observate prin anormalități la analiza cu rezonanță magnetică. Persoanele pot prezenta leziuni corticale similare encefalopatiilor reversibile. Consulviile apar doar la 5% din pacienții cu PAI și sunt un rezultat al hiponatremiei instalată ca urmare a pierderilor gastrointestinale majore sau secreției anormale de vasopresină (Puy și colab, 2010; Lin și colab, 2011). Un alt motiv al apariției convulsiilor este hipomagnezia indusă de dehidratare și dezechilibru electrolitic (Puy și colab, 2010).

De asemenea, s-au remarcat leziuni vasospastice și citotoxice în sistemul vascular renal, din cauza excesului de metaboliți porfirinici ce traversează vasele de sânge (Cardenas și Guerrero, 2018). Insuficiența renală apare la pacienții cu porfirie atât acută cât și cronică (Siegesmund și colab, 2010). În timpul atacurilor acute s-au măsurat nivele de catecolamine de până la 10 ori mai ridicate, fapt ce explică hipertensiunea arterială. Un efect secundar al hiperactivității sistemului nervos simpatic este generarea de vasospasme, care după un timp suficient de lung pot induce leziuni ischemice (Cardenas și Guerrero, 2018).

În ceea ce privește porfiriile acute, doar pacienții cu CPE și PV prezintă fotosensibilitate și apariția iritațiilor cutanate la contactul cu lumina (Gorchein, 1997; Herrick și McColl, 2005). Dacă nu sunt tratate, atacurile acute pot fi fatale (Herrick și McColl, 2005). Recuperarea după un atac ușor poate dura câteva zile, iar în cazul atacurilor severe poate dura de la câteva săptămâni la luni (Siegesmund și colab, 2010).

Mai puțin de 10% din pacienți suferă atacuri recurente, femeile fiind mai predispuse decât bărbații. De asemenea, s-a remarcat faptul că atacurile sunt foarte rare înainte de pubertate și după menopauză, manifestându-se cel mai adesea în al treilea deceniu de viață, indiciu al implicării hormonilor în declanșare (Puy și colab, 2010). Atacurile se manifestă cel mai des în faza luteală a ciclului menstrual, când nivelul de progesteron este cel mai ridicat (Wang și colab, 2018). CPE este de asemenea mai des întâlnită la femei decât la bărbați (Siegesmund și colab, 2010).

Toate porfiriile acute autozomal dominante au fost introduse ca factori de risc pentru dezvoltarea carcinoamelor hepatocelulare, mai multe studii găsind o asociere între cancerul hepatic și porfiriile acute hepatice (Siegesmund și colab, 2010). Rezultatele unui studiu realizat în Suedia au raportat o creștere a riscului de cancer hepatic cu 80% și 150% pentru bărbați, respectiv femei ce suferă de porfirii hepatice, după vârsta de 50 de ani (Bissell și colab, 2017).

Afecțiuni ce prezintă simptomatică asemănătoare porfiriilor acute sunt tirozinemia ereditară și intoxicarea cu plumb. Aceste două afecțiuni interferă cu sinteza hem-ului, inactivând parțial ALA dehidrataza, determinând astfel acumularea unei concentrații excesive de ALA, dar nu și de PBG (Bissell și Wang, 2015).

2.1.5 Neuropatia ca rezultat al porfiriilor acute

Neuropatia porfirinică se manifestă de obicei în porfiriile acute, în special în PAI și este caracterizată de lezarea sistemului nervos central, autonom, visceral sau periferic. Dacă stresorii inițiali nu sunt îndepărtați, simptome ca depresia, starea delirică și cuadriplegia se pot agrava (Siegesmund și colab, 2010).

Există posibilitatea apariției neuropatiei în cazurile în care se administrează medicamente porfirinogene în timpul unui atac. Neuropatia este în mare parte motorie, fiind afectați mai des mușchii brațelor decât cei ai picioarelor, iar pacienții semnalează durere musculară și slăbiciune (Puy și colab, 2010). Totuși, întrucât nu este specifică, neuropatia porfirinică și efectele sale în sistemul nervos central nu pot fi folosite pentru diagnostic (Siegesmund și colab, 2010).

Pareza poate apărea doar localizat, însă slăbiciunea poate evolua până la paralizie bulbară, stop respirator și moarte. Printre efectele pe termen lung se numără paralizia membrelor, sindromul cerebelar, orbire și afecțiuni ale stării de cunoștință, ce pot evolua până la comă (Puy și colab, 2010).

Principala caracteristică ce se remarcă în PAI este disfuncția autonomă și a nervilor. Există mai multe ipoteze ce încearcă să explice acest fapt. În primul rând e luată în considerare neurotoxicitatea dată de acumularea de ALA și PBG în celule, ce determină formarea de specii reactive de oxigen și demielinizarea neuronilor (Lin și colab, 2011; Cardenas și Guerrero, 2018). Concentrații mari de ALA în creier ar putea afecta endoteliul și bariera hemato-encefalică, dar și activitatea acidului gama amino butiric (GABA), prin interacțiunea cu receptorii pentru GABA și pentru glutamat din sistemul limbic. Acest lucru este posibil întrucât ALA și PBG au structuri similare cu GABA. Deficiența de hem este posibil să inducă degenerarea sistemului nervos central și disfuncția neuronală prin alterarea vitezei de propagare a potențialelor de acțiune, activității acetil-colinei și funcției ATP-azei de sodiu și potasiu. O altă enzimă afectată de insuficiența de hem este triptofan pirolaza hepatică, lipsa grupării prostetice ducând la inactivarea sa. Consecințe ale acestui fapt ar putea fi nivele crescute de triptofan în creier, scăderea nivelului de melatonină și o rată de sinteză și degradare mai mare a 5-hidroxitriptaminei (serotonină). Instabilitatea concentrației de serotonină duce la o transmisie alterată a nocicepției la nivel central și periferic, iar ca un efect secundar destabilizează motilitatea intestinală. ALA este un agent ce peroxidează lipidele, iar deficiența de melatonină induce o vulnerabilitate accentuată la acest tip de peroxidare (Cardenas și Guerrero, 2018).

O altă ipoteză ce încearcă să explice neurotoxicitatea în porfirii este bazată pe reducerea concentrației de hem și mai ales implicarea acestuia ca grupare prostetică în funcționarea eficientă a catenei respiratorii mitocondriale. Nivele scăzute de hem pot duce la disfuncții energetice (nu mai funcționează catena transportatoare de electroni din mitocondrie) și astfel la o funcționare anormală a ATP-azei de sodiu și potasiu. Pe lângă concentrația mică de ATP, se observă și o funcționare defectuoasă a hemproteinelor și enzimelor de detoxifiere, cum ar fi citocromul P450 (Lin și colab, 2011).

Neurotoxicitatea contribuie la degenerarea și instalarea disfuncției nervilor. În urma autopsiilor s-a raportat cromatoliza extinsă a celulelor coarnelor anterioare ale măduvei spinării, cel mai probabil din cauza leziunilor axonale. Biopsii musculare au arătat modificări neurogenice, printre care și o pierdere substanțială de fibre nervoase, denervarea completă fiind prezentă doar în puțini mușchi (Lin și colab, 2011).

Administrarea de ALA în modele animale induce afecțiuni la nivelul ADN, mitocondriilor și formarea de specii reactive de oxigen. Având în vedere concentrațiile crescute ale acestui precursor în atacurile acute, aceste acțiuni ar putea explica efectele asupra neuronilor. ALA nu este însă singurul factor ce le determină, întrucât administrarea acestui metabolit unor subiecți sănătoși nu induce simptome specifice porfiriilor (Lin și colab, 2011).

Efcetele de lungă durată ale porfiriilor includ demielinizarea nervului vag și cromatoliza celulelor din sistemul simpatic în special a ganglionilor celiaci (Cardena și Guerrero, 2018).

2.1.6. Factori declanșatori ai atacurilor de porfirie

Există mai mulți factori ce pot duce la instalarea unui atac acut în PAI (Herrick și McColl, 2005). Declanșatorii din mediu sunt stresul, înfometarea și emeza, elemente ce induc sinteza de hem (Lin și colab, 2011). Citocromul P450 este principala proteină implicată în atacurile acute de porfirie și orice fenomen din organism ce necesită o cantitate mărită a acestei proteine va induce sinteza de hem. Printre aceste fenomene se numără acțiunea progesteronilor, metabolizarea barbituricelor, fumatul și consumul de alcool (Herrick și McColl, 2005). Acești facori induc și expresia mai accentuată la nivel de proteină a ALAS, enzimă a cărei activitate promovează atacurile (Balwani și Desnick, 2012). De asmenea, febra și postul induc activarea hem oxigenazei, fapt ce rezultă în scăderea cantității disponibile de hem. Toate acestea duc la necesitatea sintezei grupării prostetice în cantități mai mari comparativ cu condițiile normale, astfel fiind crescută activitatea ALAS 1 și formarea de ALA în exces, factor declanșator al atacului acut (Herrick și McColl, 2005).

Majoritatea substanțelor ce induc un atac porfirinic acut activează căile metabolice în care e implicat citocromul P450, dar această enzimă poate fi afectată și indirect prin acțiuni chirurgicale sau infecții ce activează hem oxigenaza, enzima ce catabolizează hem-ul, Fig (3) (Cardenas și Guerrero, 2018).

Figură 3: Inducerea unui atac acut, determinată de scăderea concentrației de hem. Hem are un efect inhibitor direct asupra ALAS 1. Nivelul de hem poate scădea ca urmare a conusmării citocromului P450, implicat în metabolizarea medicamentelor și a unor hormoni, și prin catabolismul său catalizat de hem oxigenază, enzimă activată în post, inflamații și infecții. Dacă nivelul de hem este scăzut, activitatea ALAS 1 este crescută, însă defectul în proteina PBGD determină acumularea de ALA și PBG în celule, molecule ce produc efecte neurotoxice și pot fi observate în urină. Figură adaptată după Harper și Sardh, 2014.

Un alt factor ce induce expresia crescută de ALAS și astfel formarea exagerată de ALA ce nu poate fi convertit în PBG este deficiența de glucoză sau produși glicogenici ce în mod normal sunt supresori ai expresiei ALAS (Besur și colab, 2015).

S-a remarcat că unele din atacurile acute ale pacienților cu PAI sau PV ce au fost declanșate în cadrul spitalelor și au fost tratate necorespunzător au prezentat simptome mai severe decât cele ce nu au fost tratate. Din acest motiv s-au identificat medicamente ce accentuează intensitatea unui atac acut, printre acestea numărându-se barbituricele și sulfonamidele. Porfirinogenitatea unui compus poate fi demonstrată experimental prin determinarea creșterii activității ALAS, creșterii ratei de sinteză a precursorilor porfirinici în celule, sau prin determinarea de cantități crescute de ALA sau PBG în șobolani. Animalele experimentale sunt tratate cu compuși ce inhibă calea de sinteză a hem-ului, astfel încât orice răspuns determinat de acțiunea medicamentelor va fi amplificat pentru a mima porfiriile hepatice latente de la oameni (Gorchein, 1997). Alte modele animale în care PBGD prezintă activitate redusă cu 70% au fost dezvoltate pentru studiul bolii. Aceste animale au o concentrație bazală de ALA și PBG crescută, iar atacurile acute pot fi declanșate oricând prin administrarea de fenobarbital. Prin investigarea acestor modele animale, poate fi observată evoluția neuropatiei motorii, degradarea axonilor și amplitudinile mai mici ale potențialelor de acțiune motorii sumate (Lin și colab, 2011).

Unele medicamente pot avea efect direct asupra căii de sinteză a hem-ului, prin generarea de inhibitori de ferochelatază. Poate exista și un efect indirect prin activarea exagerată a căii, ca rezultat al distrugerii citocromului P450 sau inactivării acestuia prin N-alchilarea grupării prostetice. Aceste efecte au fost studiate în modele animale administrându-se în asociere și compuși ce acționează prin formarea de specii reactive de oxigen, ce inhibă uroporfirinogen decarboxilaza, dar și compuși ce inhibă PBGD direct, cum ar fi sulfonamidele. O dificultate în acestă strategie de studiu este că modelele nu aduceau informații despre neuropatia rezultată în urma porfiriei. Pentru studiul neuropatiei se pot folosit șobolani a căror activitatea a PBGD a fost redusă cu 30% (Gorchein, 1997).

Majoritatea datelor obținute au fost relevante și în cazuri clinice. Totuși, în urma acestor experimente s-a observat că există medicamente ce au indus răspunsuri la animalele experimentale, dar nu și la pacienți. Mai grav este că au fost semnalate medicamente ce nu induceau răspuns în modelele animale folosite, dar au amplificat atacurile acute la pacienți (Gorchein, 1997).

Întrucât hormonii sunt un factor declanșator al atacurilor acute, s-a pus problema afectării sarcinii de către PAI. Un studiu efectuat pe 27 de femei pe parcursul a 33 de sarcini a concluzionat că nu există complicații determinate de porfirii, iar tratamentul obișnuit pentru crize nu afectează fătul (Siegesmund și colab, 2010).

2.1.7. Diagnostic și control al bolii

2.1.7.1. Teste biochimice și modalități de diagnostic

ALA și PBG sunt solubili în soluții apoase, în timp ce următorii intermediari, de la uroporfirină până la protoporfirina IX sunt din ce în ce mai lipofilici din cauza decarboxilărilor succesive. Diferențele în solubilitate sunt evidente în căile de excreție, întrucât intermediarii solubili, inclusiv uroporfirina sunt eliminați exclusiv prin urină, coproporfirina este eliminată atât renal cât și mediat de ficat, iar protoporfirina nu e detectabilă în urină, consecință a lipofilicității crescute (Bissell și Wang, 2015).

PAI se caracterizează prin funcționarea deficitară a PBGD, ce duce la acumularea în celule de ALA și PBG, precursori neurotoxici ai hem-ului. Un atac acut poate fi detectat prin determinarea istoricului familial, dar este cel mai adesea determinat biochimic prin dozarea ALA sau PBG din urină (Herrick și McColl, 2005; Siegesmund și colab, 2010). Dozarea PBG si ALA din urină se face cu ajutorul testului colorimetric ce folosește reactivul Ehrlich, și anume p-dimetil aminobenzaldehidă (Gorchein, 1997). Concentrația normală din urină este 0-18μmol/dl, dar în timpul unui atac acut poate depăși 880 μmol/dl (Lin și colab, 2011). Este posibilă excreția de urină roșie sau închisă la culoare, simptom folosit în diagnostic (Puy și colab, 2010).

O altă metodă ce poate fi folosită în diagnostic este măsurarea amplitudinii potențialului de acțiune motor sumat, o reducere a acestuia fiind corelată cu neuropatia indusă de PAI. S-au raportat și anormalități în conducția nervilor senzitivi, dar într-o proporție mai mică decât în cei motori. Studiul mușchilor la pacienții cu PAI indică schimbări neurogenice, printre care se numără o pierdere severă de fibre nervoase, însă nu există efecte vizibile asupra mușchilor propriu ziși. Alte studii au arătat degenerarea nervilor motori și senzitivi. Touși, aceste investigații electrofiziologice sunt nespecifice, iar pentru un diagnostic eficient al porfiriilor sunt indispensabile investigațiile biochimice, enzimatice și genetice (Lin și colab, 2011).

Pentru teste ulterioare poate fi determinată și activitatea PBGD eritrocitară, problema acestui test fiind că în aproximativ 5% din pacienți există o enzimă cu funcție alterată doar în ficat, nu și în celulele sangvine (Herrick și McColl, 2005). Acest test este posibil întrucât enzima e localizată în citosol și este astfel prezentă și în eritrocitele mature. Deși posibilele mutații în exonul 2 (eliminat prin splicing alternativ în forma eritrocitară a enzimei) induc rezultate fals negative și degradarea proteinei până la efectuarea testului poate induce rezultate fals pozitive, atunci când este folosită în corelație cu testele de urină, metoda poate identifica PAI în aproape 80% din cazuri (Bissell și Wang, 2015).

Întrucât majoritatea purtătorilor de mutații nu prezintă simptome și efecte biochimice ale acestora, analiza ADN este metoda cea mai sigură de diagnostic (Bissell și Wang, 2015).

Pentru testarea PV se recomandă înainte de analiza genică o analiză a plasmei, aceasta prezentând un maxim de fluorescență la 626-628 nm, ca urmare a nivelelor mari de porfirine circulante (Lin și colab, 2011). Analiza urinei este ineficientă întrucât nivelele de ALA, PBG și uroporfirină sunt doar puțin crescute față de normal (Siegesmund și colab, 2010).

CPE este asociată cu cantități mari de coproporfirină în urină și fecale, dar în timpul atacurilor și concentrațiile de ALA și PBG din urină sunt crescute (Siegesmund și colab, 2010).

Diagnosticul diferențial al tipurilor de porfirie acută (fără analiză genică) se realizează prin dozarea nivelului de porfirine din scaun, plasmă și urină. În cazul PAI nu se observă intermediari în materiile fecale, dar acestea sunt foarte prevalenți în PV și CPE. PAI prezintă însă nivele mari de ALA și PBG în urină. Diferențierea dintre PV și CPE se face prin testele din plasmă (Fig 4) (Lin și colab, 2011).

Figură 4: Schemă de diagnostic diferențial pentru tipurile de porfirie acută, figură adaptată după Besur și colab, 2015.

2.1.7.2. Controlul bolii

Cea mai eficientă metodă de control a porfiriilor acute este prevenirea atacurilor prin evitarea agenților declanșatori, dar și menținerea unei diete bogate în calorii și carbohidrați, glucoza funcționând ca un inhibitor al ALAS. Profilaxia împotriva atacurilor este esențială, întrucât acestea determină degradarea axonală a neuronilor, iar refacerea funcționalității acestora este lentă, chiar și după încetarea atacului (Gorchein, 1997).

Pentru a ameliora atacurile acute se recomandă administrarea de carbohidrați, deși trebuie luate considerare concentrația de sodiu din sânge și glicemia. Monitorizarea concentrației de sodiu este importantă întrucât se poate instala hiponatremia dacă se diluează prea mult sângele (Harper și Sardh, 2014). Hiponatremia poate conduce la convulsii, astfel se recomandă evitarea hiperhidratării. Un tratament eficient al atacurilor este hem-ul, acesta reducând nivelele de ALA și PBG circulante și urinare prin refacerea rezervei ficatului. Împreună cu hem-ul, s-a demonstrat eficiența administrării inhibitorilor de hem oxigenază (Gorchein, 1997; Lin și colab, 2011). Administrarea de hem în timpul unui atac acut determină și creșterea nivelului de hem intracelular în hepatocite, inhibând astfel sinteza și activitatea ALAS 1 (Bissell și Wang, 2015).

Doar un număr scăzut de pacienți au nevoie de administrări profilactice de hem, de obicei o dată sau de două ori pe săptămână. Medicamenetele folosite cel mai uzual sunt Panhematic (hidroxi-hem) și Normosang (arginat de hem), însă în cazul utilizărilor repetate poate apărea un fenomen de rezistență în care efectele benefice scad și cele adverse cresc. Printre efectele adverse se numără umflături, durere, sângerări ușoare ale gingiilor, creștere rapidă în greutate, urinare rară sau absentă (Wang și colab, 2018).

Pentru controlul PV se recomandă suplimentarea dietei cu vitaminele C și E, aportul crescut fiind capabil să reducă din leziunile oxidative ce apar în plasmă și neutrofile (Wang și colab, 2018).

În urma transplantului de ficat s-a observat o îmbunătățire a calității vieții la pacienții cu forme severe de PAI, argument pentru neurotoxicitatea indusă la nivel hepatic de acumularea precursorilor de hem (Puy și colab, 2010; Balwani și Desnick, 2012). Totuși, la pacienții cu insuficiență hepatică severă în care a fost transplantat ficatul bolnavilor de porfirie s-a semnalat o ameliorare a funcției ficatului, dar și o predispunere la atacuri acute de porfirie (Balwani și Desnick, 2012).

Se presupune că ar putea fi eficientă și terapia genică, ce presupune introducere de gene funcționale pentru HMBS în hepatocite. Testele cu această abordare făcute pe șoareci au un efect neuroprotector, prevenind distrugerea axonilor și anomaliile neurofiziologice (Lin și colab, 2011).

O altă posibilitate de tratare a PAI este utilizarea terapiei cu ARNsi specifici pentru ALAS 1. ARNsi este conjugat cu o grupare de N-acetil galactozamină pentru a fi specific pentru hepatocite. Studii pe șoareci au arătat eficacitatea acestei abordări de tratament, iar studiile clinice pe oameni sunt încă în faza 1. După o singură injecție subcutanată de ARNsi s-a reportat o scădere a nivelului proteic de ALAS 1 după 24 de ore, scădere ce a persistat timp de o lună Fig (5) (Bissell și colab, 2017).

Figură 5: Silențierea ARNm pentru ALAS 1 prin intermediul ARNsi. Molecule de ARNdc sintetic, specfice pentru ARNm al ALAS 1 pot fi preluate de hepatocite prin intermediul unei grupări auxiliare care se va lega de receptorii pentru galactoză. Complexul este endocitat, iar molecula de ARNsi este prelucrată de o proteină Dicer și încorporată în RISC. RISC induce interferența ARN prin degradarea moleculei de ARNm a ALAS 1. Figură adaptată după Bissell și colab, 2017.

2.2. Implicarea canalelor TRP în percepția durerii

2.2.1. Caracteristici generale ale canalelor TRP

Canalele Transient Receptor Potential (TRP) au fost observate pentru prima oară într-o tulpină mutantă de Drosophila melanogaster. În acele organisme, un canal permeabil pentru ioni de Na+ și Ca2+ nu funcționa corespunzător, astfel inducând potențiale de receptor tranziente, nu suținute, ale unor fotoreceptori. Proteinele superfamiliei TRP sunt canale ionice localizate în membrana plasmatică sau în membranele unor organite celulare și sunt implicate într-o multitudine de funcții celulare, inclusiv homeostazia Ca2+ și Mg2+ (Jardin și colab, 2017). Proteinele funcționale sunt exclusiv tetrameri, iar structurile pot fi homotetrameri sau heterotetrameri (Akopian, 2011). Activitatea lor modulează activitatea celulară prin influxul de cationi. Acest fapt duce la depolarizarea membranei, deschiderea canalelor dependente de voltaj, contracția mușchilor netezi, cât și control al modificărilor translaționale și post translaționale (Benemei și colab, 2015). Alte efecte posibile ale influxului de Ca2+ sunt proliferarea celulară, apoptoza, transcrierea și eliberarea de neurotransmițători, însă nu toate canalele TRP sunt permeabile pentru ionii de Ca2+ (Giorgi și colab, 2019).

Superfamilia TRP include mai multe familii, acestea fiind: TRPC (familia clasică/canonică), TRPV (familia vaniloidă), TRPM (familia melastatinei), TRPP (familia policistinei), TRPML (familia mucolipinei), TRPA (familia ankirinei) (Hung și Tan, 2018). Superfamilia este conservată pe linie evolutivă, întrucât proteinele sunt senzori importanți pentru diferiți stimuli mecanici și chimici. Canalele sunt neselective, permit în principal trecerea ionilor de Ca2+, dar este posibilă și trecrea Na+ sau K+ (Giorgi și colab, 2019). Canalele omoloage cu TRPV1 sunt esențiale în activitatea nevertebratelor, întrucât mediază traducerea stimulilor mecanici, osmotici și termici din mediu. Prima astfel de proteină, OSM-9, a fost identificată în C. elegans, este exprimată în neuronii ciliați și este necesară pentru traducerea atingerii nasului și detectarea soluțiilor hiperosmotice. În D. melanogaster, proteina omoloagă este denumită Nanchung (Nan) și este implicată în traducerea stimulilor mecanici (Kim și colab, 2003). În cazul mamiferelor, TRPV1 este activat de căldură și protoni, deschiderea acestuia ducând la formarea unui potențial de acțiune în neuroni, consecință a influxului cationilor (Marwaha și colab, 2016).

Toate canalele TRP sunt alcătuite din 6 domenii transmembranare (S1-S6) cu structuri secundare de α helix. Bucla P dintre segmentele S5 și S6 formează porul pe unde ionii pot traversa membrana plasmatică. Domeniile amino și carboxil terminale sunt localizate în citosol și sunt variabile în funcție de familie. În cazul TRPM și TRPV sunt importante pentru formarea complexelor homomere sau heteromere, dar și pentru interacția cu senzorul de Ca2+, și anume STIM1, din reticulul endoplasmic. A fost raportată existența unor domenii cu funcții specifice, atât TRPM8 cât și TRPV1 având un domeniu sensibil la voltaj, TRPV1 prezentând și un domeniu de legare la tubulină (Jardin și colab, 2017). TRPA1 prezintă o regiune amino terminală mai amplă decât celelalte canale, conținând 16 repetări ankirinice (Marwaha și colab, 2016). Acestea conferă proteinei o anumită elasticitate specifică și îi permite interacțiunea cu alte proteine, în special cele asociate citoscheletului (Jardin și colab, 2017).

2.2.2. Expresie și distribuție

Principalii nociceptori sunt fibrele C nemielinizate, ce transmit semnalele cu aproximativ 0.8m/s și fibrele Aδ, mielinizate, ce transmit impulsurile nervoase cu aproximativ 12m/s (Kambiz și colab, 2014). Aproximativ 30, până la 50% din neuronii din ganglionii rădăcinilor dorsale ale măduvei spinării (DRG) exprimă TRPV1, majoritatea fiind fibre C nemielinizate. A fost raportată și expresia TRPV1 în fibrele Aδ, însă în mai mică masură. Coexpresia TRPA1 și TRPV1 este de obicei întâlnită în nociceptorii de diametru mic (Dai, 2015). TRPV1 este exprimat în toți neuronii în care este exprimat TRPA1, iar TRPA1 se găsește în aproximativ 30% din neuronii în care este exprimat TRPV1 (Jardin și colab, 2017). TRPV1 este prezent nu doar pe membrana plasmatică a celulelor, cât și în membrana reticulului endoplasmic, sensibilitatea acestuia la agoniști fiind însă mult mai mică (Jardin și colab, 2017).

TRPV1 este exprimat în neuroni cu soma în DRG care au terminații ce inervează colonul, pancreasul, stomacul, duodenul și vezica urinară (Moore și colab, 2017). Pe lângă expresia din DRG, TRPV1 se găsește și în cortexul cerebral, hipocamp, talamus, trunchiul cerebral, anumite celule din sânge, fibroblaste și epiderma pielii (Akopian, 2011). A fost semnalată prezența TRPV1 și în neuronii măduvei spinării, în laminele I și II ale zonei superficiale ale coarnelor dorsale. Acestea sunt activate de neuronii primari aferenți, fapt ce determină eliberarea de glutamat și transmiterea sinaptică excitatorie către cornul dorsal (Marwaha și colab, 2016). TRPV1 exprimat în keratinocite are rolul de activa prin influxul ionilor Ca2+ o cale de semnalizare ce se finalizează prin eliberarea de adenozin trifosfat (ATP). ATP se leagă ulterior la receptorii P2X3 din fibrele Aδ și C. Întrucât keratinocitele exprimă la rândul lor P2X3, transmiterea mediată de ATP poate fi realizată paracrin și autocrin, amplificând astfel semnalul termic tradus inițial de TRPV1 (Kambiz și colab, 2014).

În afară de DRG și ganglionii trigeminali (TG), TRPA1 este exprimat în urechea internă și piele (Akopian, 2011), dar și în ganglionii nodoși și jugulari ai nervului vag (Moore și colab, 2017). În afara coexpresiei TRPV1 și TRPA1 în neuronii senzitivi, aceasta apare și în celelalte țesuturi (Akopian, 2011). Deși prezența TRPA1 și TRPV1 a fost raportată în diverse țesuturi, funcționalitatea acestora nu a fost demonstrată în toate cazurile (Fernandes și colab, 2012). În celulele care exprimă TRPV1 se găsesc alți mediatori ai durerii, și anume substanța P și peptida asociată genei calcitoninei (Calcitonin gene-related peptide-CGRP), care pot fi eliberate în urma activării TRPV1 (Giorgi și colab, 2019). Activarea mediată de acroleină și ozon a TRPA1 induce aritmie în șobolani și șoareci, cel mai probabil prin intermediul controlului autonom al nervului vag asupra funcției cardiace (Moore și colab, 2017).

TRPM8 este exprimat în DRG și ganglionii trigeminali, în neuronii cu diametru mic, dar nu în cei care exprimă și TRPV1 (Dai, 2015). De asemenea, s-a observat o preferință pentru nervii senzitivi de diametru mic din DRG și TG (Moore și colab, 2017).

2.2.3. Farmacologia și modularea

2.2.3.1. TRPV1

TRPV1 este activat de temeperaturi mai mari de 43°C (Jardin și colab, 2017) și pH mai mic de 5.9 (Marwaha și colab, 2016), canalul având și capacitatea de deschidere voltaj dependentă (Basso și Altier, 2017). Printre agoniștii chimici se numără alicina, capsaicina și camforul, cât și agoniști endogeni ca acidul 5-hidroxiperoxid arahidonic. Activitatea TRPV1 poate fi și amplificată de diferiți mediatori endogeni ai inflamației, cum ar fi bradikinina, ATP, factorul de creștere a nervilor (NGF) (Hung și Tan, 2018). Activitatea TRPV1 este modulată de acești mediatori inflamatori prin abilitatea acestora de a activa unele kinaze sau fosfataze. Calmodulina și AKAP (A-kinase anchor proteins) sunt de asemenea implicate în reglarea activității TRPV1 (Akopian, 2011). Senzitivitatea TRPV1 depinde de fosforilările mediate de protein kinaza A (PKA) și protein kinaza C (PKC) (Marwaha și colab, 2016). Streptozotocina, un compus folosit pentru a crea modele de studiu pentru diabetul de tip 1, are de asemenea capacitatea de a modula expresia și funcția TRPV1 (Naziroglu și colab, 2012). TRPV1 poate fi activat de alcoolul etilic, un cunoscut agent declanșator al migrenelor (Jardin și colab, 2017).

S-a observat că doze mari de capsaicină, agonist tipic al canalului, duc la distrugerea selectivă a fibrelor C și Aδ, inhibând astfel complet activitatea nervilor respectivi (Fernandes și colab, 2012). Deși TRPV1 este activat de o multitudine de stimuli fizici și chimici, este inhibat de anumiți modulatori endogeni. Astfel s-a arătat că noradrenalina atenuează răspunsul la capsaicină cu 60%. Mecanismul este mediat de receptorii adrenergici α2, ce inhibă stimulii nocivi ce ar fi ajuns la coarnele dorsale ale măduvei spinării (Jardin și colab, 2017).

Interesul pentru implicarea TRPV1 în diferite tipuri de durere este acela de a găsi antagoniști, întrucât șoareci TRPV1 knock-out nu mai prezintă comportamente specifice la aplicarea de stimulii termici acuți (Marwaha și colab, 2016).

2.2.3.2. TRPA1

TRPA1 este activat de compuși exogeni naturali, cum ar fi uleiul de muștar (alil izotiocianat-AITC), wasabi, hreanul, cinamaldehida din scorțișoară, alicina din usturoi și dialil disulfatul din ceapă. Diversitatea agoniștilor indică faptul că TRPA1 nu este un receptor farmacologic tipic, ci un receptor ce detectează reactivitatea compușilor. Agoniștii pot fi electrofili sau neelectrofili, iar cei electrofili funcționează prin modificarea unor resturi de cisteină din domeniul amino terminal al proteinei. De curând s-au identificat și unele resturi de lizină ce ar putea fi implicate în activarea canalului (Moore și colab, 2017). Mecanismul de activare determinat de agoniștii neelectrofili nu a fost complet elucidat (Dai, 2015). TRPA1 este implicat și in medierea efectului toxic al unor metale, printre care se numără zincul, cadmiul și cuprul, acest fapt fiind încă un argument pentru rolul său de detectarea a agenților nocivi din mediu (Moore și colab, 2017).

TRPA1 este activat de specii reactive de oxigen, acestea fiind un grup de agoniști electrofili ce interacționează cu resturile de cisteină menționate anterior (Dai, 2015; Giorgi și colab, 2019). Speciile reactive de oxigen rezultate din diferite cauze (leziunea țesuturilor de exemplu) duc la peroxidarea fosfolipidelor membranare și formarea de 4-hidroxi-2-nonenal, agonist endogen al TRPA1 (Hung și Tan, 2018). Canalul este de asemenea activat de temperaturi mai mici de 17°C (Jardin și colab, 2017). S-a observat totuși că temperaturile scăzute promovează formarea speciilor reactive de oxigen și eliberarea de calciu, activatori ai TRPA1. Curenții in vitro observați la temperaturi scăzute sunt mai mici decât cei obținuți prin aplicarea agoniștilor, astfel s-a tras concluzia că frigul doar amplifică funcția proteinei (Giorgi și colab, 2019).

În condiții obișnuite, TRPA1 uman poate fi hidroxilat la nivelul unui rest de prolină din domeniul ankirinic din regiunea amino terminală. Dacă această hidroxilare este împiedicată de o mutație sau de un inhibitor, sensibilitatea proteinei la peroxid de hidrogen în prezența frigului crește. S-a demonstrat în cadrul aceluiași studiu că inhibarea directă a prolil hidroxilazei la șoareci induce sensibilizarea TRPA1, acesta putând fi astfel activat de speciile reactive de oxigen produse de temperaturi scăzute (Moore și colab, 2017).

2.2.3.3. TRPM8

TRPM8 este activat de temperaturi mai mici de 25°C (Jardin și colab, 2017) și de agoniști naturali ca eucaliptolul și mentolul. Activarea TRPM8 la frig și în prezența mentolului este realizată doar în cazul asocierii cu PIP2, compusul fiind și agonist al proteinei. Hipersensibilitatea canalului poate fi mediată de nivelul de PIP2, în funcție de activarea dependentă de calciu a fosfolipazei C, ce hidrolizează moleculele de PIP2 (Moore și colab, 2017). Metilglioxalul este un metabolit intermediar ce apare în diabet și inhibă activitatea TRPM8, însă sunt necesare mai multe studii pentru evaluarea exactă a mecanismului de inhibiție (Ciobanu și colab, 2016).

TRPM8 are activitatea modulată de fosfolipaza A2 independentă de calciu (iPLA2), enzimă ce catalizează formarea de lizofosfolipide și acizi grași polinesaturați. Inhibarea iPLA2 reduce curenții induși de TRPM8 în prezența temperaturilor scăzute, mentolului și icilinei. Lizofosfatidil colina, compus produs de activitatea iPLA2 poate activa TRPM8 și la temperaturi de 37°C. Acizii grași polinesaturați (arahidonic, eicosapentanoic, docosahexanoic) sunt inhibitori ai TRPM8. Coaplicarea lizofosfatidil colinei și a acizilor grași menționați anterior determină activarea TRPM8, indicând impactul mai puternic al lizofosfolipidelor și implicarea produșilor iPLA2 în durerea asociată frigului (Moore și colab, 2017).

2.2.3.4. Interacții între diferite canale

Interacțiunea dintre TRPA1 și TRPV1 a fost observată prin mijloace farmacologice. Astfel, aplicarea de AITC duce la desensibilizarea TRPV1 prin intermediul unei fosfataze dependente de ioni de Ca2+, și anume calcineurina (Akopian, 2011). De altfel, TRPV1 suferă desensibilizări după expuneri prelungite sau repetate la capsaicină sau alți agoniști, dar induce și desensibilizarea TRPA1. Mecanismele de desensibilizare omologă și heterologă sunt diferite, primul fiind dependent de ionii de calciu, cel din urmă fiind independent de aceștia (Fernandes și colab, 2012). Desensibilizarea TRPA1 poate fi determinată de aplicarea de capsaicină, întrucât influxul de calciu determină activarea fosfolipazei C (PLC), ce scindează moleculele de PIP2. Influxul de calciu ca urmare a aplicării AITC induce activarea PLC doar în modelele de expresie heterologă, nu și în neuroni senzitivi. Totuși, aplicări repetate de AITC duc la desensibilizarea TRPA1, fapt explicat prin inducerea modificărilor determinate de interacția directă cu uleiul de muștar sau prin determinarea internalizării canalului. S-a raportat că TRPV1 blochează internalizarea TRPA1 mediată de aplicarea de AITC (Akopian, 2011).

Nu există agoniști specifici pentru complexul heterotetramer TRPA1-TRPV1, dar s-a raportat că anumiți agoniști specifici pentru TRPA1, cum ar fi canabinoidul AM1241, induc o activare la concentrații de 5 ori mai mici a TRPA1 când este coexprimat cu TRPV1 (Akopian, 2011).

2.2.4. Implicarea în nocicepție și diferite tipuri de durere

Durerea este răspunsul somatic sau visceral obținut în cazul contactului cu agenți nocivi sau leziunii țesuturilor (Dai, 2015). Prin intermediul potențialelor de acțiune, stimulii din mediu sunt traduși și transmiși măduvei spinării și ulterior ariilor superioare ale sistemului nervos central. Nociceptorii au funcția de a transmite semnalele posibil dăunătoare prin fibrele nervoase primare. În condiții normale, nociceptorii transmit potențiale de acțiune doar la contactul cu stimuli ce indică posibile leziuni ale țesuturilor (Hung și Tan, 2018). Semnalele pot fi chimice, mecanice sau termice, aceastea fiind detectate de canalele ionice din superfamilia TRP, în special TRPA1, TRPV1 și TRPM8. Activarea canalelor duce la deschiderea acestora, influxul de Na+ și Ca2+, depolarizarea membranei și inducerea de potențiale de acțiune mediate de alte canale dependente de voltaj (Jardin și colab, 2017).

Nocicepția poate fi modulată prin nivelul de excitație al nociceptorilor sau prin propagarea semnalului (Akopian, 2011). Nociceptorii sunt clasificați pe baza tipului de axon pe care îl prezintă. Astfel, există fibre, Aδ nemielinizate ce transmit senzațiile acute de durere și fibre C, activate de stimuli mecanici, termici și chimici. Există de asemenea și fibre Aβ ce transmit semnale inofensive (nu indică o leziune sau un agent chimic dăunător) (Giorgi și colab, 2019).

Canalele TRPV1, TRPA1 și TRPM8 sunt implicate în semnalizarea durerii viscerale. S-a arătat că silențierea TRPV1 prin mijloace de interferență ARN atenuează simptomele acetui tip de durere in vivo. Hipersensibilitatea viscerală ar putea fi mediată în cazul sindromului colonului iritabil de exepresii scăzute ale moleculei de microARN miR-199, ceea ce induce supraexpresia TRPV1 (Jardin și colab, 2017). TRPV1 este implicat și în durerea rezultată din inflamarea cronică gastrointestinală. În biopsii de la pacienți cu boli ce au în simptomatică inflamarea intestinului s-a remarcat o expresie crescută a TRPV1, corelată cu severitatea hipersensibilității. Răspunsul la capsaicină a TRPV1 a fost mult mai mare în animalele experimentale cărora le-a fost indusă colita. Tratamentul cu antagoniști în modele pentru sindromul colonului iritabil au prevenit instalarea hipersensibilității la șoareci adulți și au diminuat răspunsurile dureroase la adulți deja sensibilizați. S-a raportat că TRPV1 din nociceptorii aferenți primari are funcție și expresie crescute și în pancreatita cronică, inducând hiperalgezie (Moore și colab, 2017).

În mod obișnuit, TRPV1 este implicat în transmiterea durerii asociate proceselor inflamatorii sau leziunilor țesuturilor (Akopian, 2011; Jardin și colab, 2017). S-a arătat că antagoniștii pentru TRPV1 induc o atenuare a hiperalgeziei termice. TRPA1 mediază hiperalgezia mecanică și termică (pentru temperaturi scăzute) în aceleași modele experimentale. S-a demonstrat și faptul că TRPV1 este implicat și în durerea asociată cancerului osos, aceasta scăzând după inactivarea farmacologică a canalului ionic sau silențierea genei asociate acestuia. Expresia canalului și amplitudinea curenților mediați de TRPV1 din DRG sunt mult crescute în cazul acestei maladii (Jardin și colab, 2017). S-a demonstrat că supraexpresia ARNm și a proteinei este determinată de formaldehida endogenă, prin intermediul semnalizării protein kinazei activate de mitogen (MAPK) și fosfatidininozitol kinazei (Moore și colab, 2017). Într-un model experimental pentru cancerul osos, administrarea intraperitoneală a unui antagonist al TRPV1 împreună cu morfină a potențat efectul analgezic al morfinei (Jardin și colab, 2017).

Blocarea activității TRPM8 in vivo prin ARNsi sau antagoniști, sau folosirea de animale experimentale knock-out (TRPM8-/-) au demonstrat implicarea canalului în hiperalgezia la frig (Basso și Altier, 2017).

Țintirea nocicepției la nivel periferic are ca avantaj faptul că sistemul nervos central nu va fi afectat de posibilele analgezice utlizate (Akopian, 2011).

2.2.5. Durerea asociată neuropatiei

Durerea neuropatică afectează aproximativ 10% din populație și scade semnificativ calitatea vieții în pacienți. Aceasta este o condiție cronică ce poate apărea ca rezultat al terapiei împortriva cancerului, leziunilor măduvei spinării sau ale nervilor, infecțiilor virale, sclerozei în plăci și diabetului (Basso și Altier, 2017). Apare de obicei din cauza afectării sistemului nervos somato-senzitiv, ce poate apărea și din cauza nevralgiei postherpetice și durerii asociate membrelor amputate. Principalul fenomen ce induce durerea asociată neuropatiei este schimbarea patofiziologică indusă neuronilor senzitivi primari și semnalizarea defectuasă către sistemul nervos central (Dai, 2015). Deși mecanismele durerii neuropatice încep să fie înțelese din ce în ce mai bine, tratamentul este rezumat la analgezice clasice (Basso și Altier, 2017).

Durerea neuropatică poate apărea ca rezultat al creșterii concentrației locale de calciu la locul leziunii sau în măduva spinării, creștere determinată de activitatea canalelor de calciu dependente de voltaj sau a canalelor TRP, în special TRPA1 și TRPV1 (Fig 6). Când semnalul asociat durerii este transmis de la neuronii aferenți primari la sistemul nervos central, există transmițători nociceptivi, cum ar fi substanța P, ce sunt exocitați din terminațiile centrale ale neuronilor aferenți primari. Neurotransmițătorii modulează activitatea canalelor de calciu dependente de voltaj. Hiperactivarea neuronilor aferenți primari poate duce la exocitoza mai intensă a substanței P, astfel fiind creată o activare mai pronunțată a canalelor de calciu dependente de voltaj din neuronii postsinaptici. Prin acest mecanism este indusă hiperexcitabilitatea postsinaptică (Marwaha și colab, 2016).

Figură 6: Reprezentare schematică a mecanismelor în care sunt implicate TRPA1 și TRPV1 pentru a induce durerea neuropatică. În primul rând activarea canalelor duce la creșterea concentrației ionilor de calciu, cât și eliberarea acestora din reticulul endoplasmic (RE), fapt ce duce la eliberarea de neurotransmițători, producerea și eliberarea substanței P și activarea PKA și PKC. Toate aceste efecte au ca și consecință instalarea durerii neuropatice. Activitatea enzimatică a fosfolipazei A2 (PLA2) conduce la formarea de acid arahidonic (AA) ce poate fi transformat de ciclooxigenază (COCS) în prostaglandine (PG) sau de lipooxigenază (LOX) în acid 5-hidroperoxi arahidonic (5-HPETE). Acesta din urmă poate activa direct TRPV1 sau poate fi convertit în leucotriene (LT). PG și LT contribuie la intesitatea durerii neuropatice. Figură adaptată după Marwaha și colab, 2016

Există și o formă de neuropatie diabetică ce apare în cazul paciențiilor afectați de diabet de tip 1 sau 2. Aceasta este asociată cu reducerea conducției nervilor senzitivi și motori, dar și cu schimbări structurale în nervii periferici, printre care degenerarea axonală, demielinizare și microangiopatie. Neuropatia implică hiperalgezie sau alodinie, observată în șobolani tratați cu streptozotocină (compus ce induce modificări fiziologice asociate cu diabetul de tip 1) (Naziroglu și colab, 2012). De asemenea, influxul de calciu prin canalele de tip TRP dependent de stresul oxidativ este important în instalarea durerii neuropatice diabetice (Marwaha și colab, 2016).

În urma leziunii nervilor intervin modificări în soma neuronilor din DRG. Factorul de creștere a nervilor (NGF) secretat de celulele Schwann determină creșterea nivelului de ARNm pentru diferite TRP. De asemenea, se observă și o creșterea a expresiei proteice a TRP în terminațiile nervoase senzitive (Kambiz și colab, 2014). S-a observat că nivelul de expresie a TRPV1, TRPA1 și TRPM8 scade în neuronul afectat (în urma leziunii axonului), însă TRPA1 și TRPV1 au o expresie crescută în neuronii adiacenți. Mecanismul propus pentru acest efect este eliberarea de factori de creștere și de neurotransmițători în zona din jurul neuronului distrus, cauzând astfel și o creștere a excitabilității neuronilor din jur (Fig 7)(Dai, 2015).

Figură 7: Implicarea canalelor TRP în durerea neuropatică și consecințele distrugerii neuronilor. În cazul în care un nerv este lezat, acesta nu va mai funcționa corespunzător (vor apărea mai puține potențiale de acțiune). Distrugerea neuronilor va determina eliberarea de NGF și de alți factori neurotrofici ce conduc la supraexpresia TRPA1, TRPV1 și TRPM8, dar și o frecvență mai mare a generării potențialelor de acțiune în neuroni apropiați. Acest fenomen apare și în cazul neuropatiei induse de diabet sau chimioterapie. Figură adaptată dupa Dai, 2015.

Durerea neuropatică poate apărea și în urma tratamentelor cu agenți chimioterapeutici, cum ar fi oxaliplatina sau paclitaxelul. Șoareci tratați cu paclitaxel au fost studiați pentru a fi determinată implicarea canalelor TRP în hiperalgezia termică și alodinia mecanică (Fig 8) (Salat și Filipek, 2014). Paclitaxelul induce o activare a astrocitelor, ceea ce determină eliberarea citokinelor inflamatorii precum factorul de necroză tumoral α (TNF-α), interleukina 1β și interleukina 6. Moleculele respective duc la sensibilizarea neuronilor nociceptivi și la inflamația neurogenică, ceea ce conduce la durerea neuropatică periferică indusă (Ba și colab, 2018).

Figură 8: Observarea dezvoltării hiperalgeziei la temperaturi scăzute în șoareci tratați cu paclitaxel, comparativ cu animale control. Șoarecii au fost puși în apă la 4°C și s-a cronometrat perioada până a apărut un comportament nocifensiv. A fost făcut un test înainte de tratament și s-a observat același interval, însă timpul de reacție a scăzut semnificativ după 2 ore, respectiv 7 zile în grupul tratat cu paclitaxel. Acest fapt demonstrează hiperalgezia la frig indusă de tratamentul cu paclitaxel. Imagine adaptată după Salat și Filipek, 2014.

2.2.5.1. Rolul TRPV1

Ligația de nerv spinal duce la o creștere a expresiei TRPV1 în DRG și crește rata de activare a acestuia, ducând astfel la hiperalgezie termică (Fig 9). După lezarea nervului sciatic, TRPV1 de la terminațiile centrale ale neuronilor aferenți primari este supraexprimat și promovează eliberarea de CGRP și substanță P din terminațiile presinaptice centrale, rezultând în final la durerea asociată neuropatiei. Administrarea de antagoniști induce ameliorarea durerii neuropatice (Marwaha și colab, 2016). Inhibarea canalului ionic duce la scăderea durerii în modele pentru durerea neuropatică, iar proteina este supraexprimată în animale cu nervii spinali ligaturați, fapt corelat cu instalarea hiperalgeziei la temperaturi crescute (Moore și colab, 2017).

Figură 9: Implicarea canalelor TRP în diferite forme de durere neuropatică. În modelele de leziune ale nervilor, expresia TRPV1 scade în neuronii direct lezați, dar crește în neuroni adiacenți. În modelele diabetice, hipoxia și hiperglicemia duc la activarea exagerată a TRPV1, cât și metil glioxalul la activarea exagerată a TRPA1. În chimioterapia cu oxaliplatină sau paclitaxel se instalează hiperalgezia atât la temperaturi scăzute cât și crescute, dar și hipersensibilitatea mecanică. Figură adaptată după Basso și colab, 2017.

Principala caracteristică a TRPV1 din nociceptorii din DRG este scăderea temperaturii prag de activare după expunerea la molecule nociceptive (NGF, bradikinina, prostaglandina E2). Cel mai bine înțeles rol al canalului ionic în contextul neuropatiei este în neuropatia diabetică. Animalele diabetice prezintă două faze ale comportamentului asociat durerii. În primele stadii ale maladiei este instalată hiperalgezia, ca poi aceasta să se transforme în hipoalgezie. În timpul primei faze s-a remarcat o creștere a expresiei TRPV1 în axonii neuronilor ce inervează pielea și în neuronii din DRG. Supraexpresia a fost asociată cu curenți mai ampli înregistrați în neuroni din DRG. Implicarea canalului a fost confirmată când silențierea genei sau blocarea farmacologică au dus la ameliorarea durerii la șoareci. Mecanismul ce poate explica acest fapt implică hipoxia și hiperglicemia asociate primei faze a diabetului (Basso și Altier, 2017). Expresia canalului este de asemenea afectată. Densitatea de exprimarea a TRPV1 scade în fibrele C și crește în fibrele A, unde prezintă și o funcție amplificată, canale fiind fosforilate și relocate pe membrana plasmatică (Marwaha și colab, 2016).

2.2.5.2. Rolul TRPA1

În modelele de diabet și chimioterapie ale neuropatiei s-a demonstrat o creștere a nivelului de ARNm și proteină în cazul TRPA1 în terminațiile periferice și centrale ale nociceptorilor (Giorgi și colab, 2019). Astfel, TRPA1 a fost propus ca mediator al hiperalgeziei mecanice și al alodiniei la frig asociate neuropatiei (Jardin și colab, 2017). Prin studii ce au folosit microARN pentru silențierea expresiei canalului ionic s-a remarcat îmbunătățirea simptomelor în șoareci (Giorgi și colab, 2019).

Hipersensibilitatea mecanică ce apare în primele faze ale diabetului este ameliorată prin blocarea TRPA1. În etapa târzie a diabetului poate fi observat faptul că activitatea TRPA1 induce degenerarea fibrelor ce exprimă substanță P, inducând astfel alterări în simțul tactil, inhibarea canalului ionic ducând la restituirea funcției. În diabet s-a observt creșterea concentrației de metilglioxal, metabolit intermediar ce activează direct TRPA1 (Basso și Altier, 2017). Influxul exagerat de ioni de calciu provocat de deschiderea canalului poate induce degenerarea periferică a nervilor (Moore și colab, 2017).

Blocarea farmacologică a TRPA1 în modelele de durere neuropatică obținute prin lezarea nervilor induce o ameliorare a alodiniei la frig. Același compus care blochează proteina în aceste modele (A-967079), nu induce și blocarea răspunsului la frig în animalele normale. În aceleași modele, scăderea nivelului de expresie a canalului ionic din DRG prin intermediul unor oligonucleotide antisens a indus atenuarea hipersensibilității la frig (Basso și Altier, 2017). În modelele cu nervii afectați apare și o hipersensibilitate mecanică, simptom ce poate fi îmbunătățit prin aceleași mijloace, și anume inhibare farmacologică sau silențiere genică. De asemenea, blocarea TRPA1 în neuropatia trigeminală a dus la scăderea nivelului de CGRP, substanță P și TRPV1 (Giorgi și colab, 2019).

Acroleina este formată în unele modele de neuropatie și determină producerea de curenți de calciu dependenți de TRPA1 în DRG, cât și supraexpresia canalului ionic. Speciile reactive de oxigen pot promova formarea acroleinei. Întrucât TRPA1 promovează exocitoza CGRP și substanței P, mecanismele ce promovează expresia crescută a proteinei vor induce indirect și o secreție crescută a mediatorilor. Prin intermediul CGRP și substanței P, nociceptorii ating un prag de activare mai scăzut, instalându-se astfel inflamația neurogenică. Durerea poate fi ameliorată cu ajutorul neutralizatorilor de acroleină sau inhibitorilor de TRPA1 (Giorgi și colab, 2019).

Speciile reactive de oxigen și de azot sunt importante în dezvoltarea durerii neuropatice, moleculele fiind agoniști cunoscuți ai TRPA1 (Jardin și colab, 2017). Durerea poate fi eliminată în animale experimentale prin deleția genei pentru TRPA1, blocarea proteinei sau introducerea de antioxidanți ca acidul α lipoic. În modelul de durere neuropatică bazat pe ligaturarea nervului safen (saphenous nerve constriction) s-a raportat o creștere a nivelului de ARNm pentru TRPA1 și D-aminoacid oxidază (enzimă a căror produși secundari includ peroxidul de hidrogen) în DRG (Giorgi și colab, 2019).

Alodinia la frig este un efect secundar des întâlnit al neuropatiei induse de compuși folosiți în chimioterapie, iar TRPA1 se presupune că ar fi canalul ionic ce ar media acest efect (Moore și colab, 2017). Proteina are o activitate amplificată în urma tratamentului cu agenți chimioterapeutici precum paclitaxelul sau oxaliplatina (Basso și Altier, 2017). În animalele experimentale tratate cu oxaliplatină se observă o sensibilizare exclusiv a TRPA1, nu și a TRPV1 (se instalează doar hipersensibilitatea la frig, nu și la căldură). S-a raportat că simptomele în modelele de studiu ale neuropatiei rezultate în uma chimioterapiei sunt îmbunătățite după administrarea de glutation, un agent reducător endogen. Molecula reduce secreția de CGRP și substanță P (compuși ce promovează vasodilatarea și inflamația neurogenică), dar și scade numărul de macrofage și monocite activate ce ar genera peroxid de hidrogen și ar activa TRPA1 (Giorgi și colab, 2019).

2.2.5.3. Rolul TRPM8

TRPM8 are un rol dual în durerea neuropatică asociată leziunilor nervilor- în anumite situații inhibarea canalului reduce durerea neuropatică, în timp ce în alte situații activarea cu agoniști demonstrează proprietăți analgezice (Moore și colab, 2017). Pe de-o parte, blocarea farmacologică sau silențierea genei au dus la reducerea hiperalgeziei la frig. Mai mult, în modelele experimentale s-a raportat o supraexprimare a proteinei în DRG. Pe de altă parte, s-a demonstrat că activarea TRPM8 are proprietăți analgezice, inducând alinarea simptomelor de hiperalgezie mecanică și termică în mai multe modele de durere neuropatică asociată leziunilor nervilor. TRPM8 este hiperactivat în durerea neuropatică asociată chimioterapiei. Acest fapt a fost demonstrat in vitro- neuronii din DRG în cultură tratați cu oxaliplatină au prezentat răspunsuri mai ample la temperaturi scăzute față de control. In vivo, s-a remarcat că blocarea canalului a dus la ameliorarea simptomelor asociate hipersensibilității la frig în șobolanii tratați cu oxaliplatină (Basso și Altier, 2017).

Alte studii au raportat implicarea TRPM8 în alodinia la frig rezultată în urma leziunii nervilor. Șobolani cu nervi afectați au prezentat reflexe mai puternice la frigul indus de evaporarea acetonei, dar și o creștere a numărului de neuroni ce exprimă TRPM8. Sensibilitatea la frig mediată de TRPM8 este amplificată de factori neurotrofici, cum ar fi atemina și NGF. Aceștia își exercită efectul prin intermediul unor receptori coexprimați cu canalul ionic (Moore și colab, 2017).

2.3. Interferența ARN mediată de ARN mic de interferență

2.3.1. Fenomenul de interferență ARN

Interferența ARN este un proces de reglare genică mediat de molecule de ARN, cum ar fi ARN mic de interferență (ARNsi) (Nikam și Gore, 2018) sau micro ARN (miARN). Silențierea este realizată post-transcripțional, după sinteza ARNm. A fost observată prima oară în 1990, în petunii transgenice ce ar fi trebuit să aibe o culoare mai intensă de violet, datorită unei gene modificate pentru calcon sintază (chs) (Agrawal și colab, 2003). Gena modificată conținea promotorul 35S de la virsului mozaic al conopidei, iar florile rezultate nu au avut culoarea urmărită (violet mai închis decât florile obișnuite), ci diferite nuanțe de alb, roz, sau modele ce nu au fost raportate anterior. Nivele de ARNm pentru chs au fost determinate atât în plante revertante, cât și în cele transformate, prin teste de protecție față de RN-aze. Cu ajutorul acestora s-a determinat un nivel de ARNm de până la 50 de ori mai mic în organismele cu gena modificată (în care au fost degradate și moleculele de ARNm rezultate din transcrierea genei normale). Fenomenul a fost numit inițial co-supresie (Napoli și colab, 1990).

ARNsi face parte din familia ARN mici de silențiere, în care sunt incluse și micro ARN, ARN ce interaționează cu PIWI (piARN) și altele. Caracteristicile definitorii ale acestei familii sunt lungimea relativ scurtă (20-30 de nucleotide) și interacția cu familia de proteine Argonaute (Ago), pe care le pot ghida la molecule de ARNm pe care le degradează, alterând astfel expresia genică. ARNsi derivă din ARN dubul catenar (ARNdc), prin clivarea mediată de o ribonuclează specifică, Dicer. Prin clivare se formează duplexuri ARNsi de aproximativ 21 nucleotide lungime, în cadrul cărora o monocatenă mediază silențierea (catena ghid, antisens), iar cealaltă este hidrolizată (catena pasager) (Ghildiyal și Zamore, 2009). ARNsi este cuplat cu Dicer, Ago2 și Proteina de legare la ARN a răspunsului transactivat (Transactivating Response RNA Binding Protein-TRBP) pentru a forma complexul de silențiere indus de ARN (RNA induced silencing complex-RISC). Ago2 hidrolizează catena pasager, după ce molecula ARNsi este desfăcută de un domeniu N-helicazic al proteinei Dicer, astfel formându-se complexul RISC activat. Acesta se poate lega la ARNm cu secvență complemetară cu cea a ARNsi, Ago2 având capacitatea de a cliva molecula de ARNm (Nikam și Gore, 2018).

Pentru studii in vitro și aplicații in vivo se poate folosi ARNsi sintetic ce mimează structurile produse de proteina Dicer din ARNdc (Fig 10). Moleculele astfel formate prin sinteză pot acționa direct în celule (Ho și colab, 2016). Moleculele sintetice prezintă efecte asemănătoare celor care ar apărea dacă ar fi implicate molecule naturale. De asemenea, folosind ARNsi sintetizat în laborator se poate obține fenomenul de interferență pentru gene ce s-au considerat imposibil de afectat prin mijloace farmacologice (”undruggable”). Printre maladiile care se încearcă a fi tratate prin folosirea ARNsi se numără sindromul ochiului uscat (gena pentru TRPV1), polipoza adenomatoasă familială (CTNNB1), cancer pancreatic (KRAS) (Kanasty și colab, 2013).

Când a fost descoperit procesul în Caenorhabditis elegans s-a presupus că ARNdc se poate lega de anumite molecule de ARNm, oprind translația, idee ce a fost infirmată ulterior, prin descoperirea RISC. De asemenea, pe C. elegans s-a demonstrat că interferența ARN poate fi transmisă ereditar (Ghildiyal și Zamore, 2009). Un avantaj al interferenței mediate de ARNsi este faptul că acesta nu se integrează în genom pentru a-și îndeplini funcția (Ho și colab, 2016). De asemenea, silențierea nu funcționează stoechiometric, experimente pe C. elegans au arătat că doar 2 molecule de ARNdc pot induce interferența unei gene exprimată abundent. (Agrawal și colab, 2003).

Figură 10: Interferența ARN mediată de RISC. Interferența se finalizează prin degradarea ARNm. Este prezentat de asemenea modul în care sunt incluse in complexul de silențiere moleculele de ARN exogen sau ARNsi sintetic. Moleculele de ARN exogen trebuie să fie inițial prelucrate de proteina Dicer Figură adaptată după Kanasty și colab, 2013.

2.3.2. Structură ARNsi

În urma clivării moleculei de ARNdc prin acțiunea Dicer se formează molecule de ARNsi ce prezintă la capetele 3’ câte două nucleotide neîmperecheate. (Kanasty și colab, 2013). Moleculele sunt asemănătoare produșilor hidrolizei mediate de RN-aza III de la Escherichia coli (Agrawal și colab, 2003). Moleculele au 21-25 nucleotide lungime (Nikam și Gore, 2018) și sunt formate dintr-o catenă ghid antisens ce va media silențierea și o catenă pasager ce va fi ulterior hidrolizată (Ghildiyal și Zamore, 2009). Moleculele de ARNsi pot fi identificate de proteinele Ago2 prin intermediul capetelor 3’. De asemenea, RISC poate face distincția între ARNdc și ADNdc, întrucât ANDdc are o conformație de tip B (helix de dreapta, 10 perechi de baze pe tur de spiră, 20 Å diametru), pe când ARNdc are o conformație de tip A (un tur de spiră are 11 perechi de baze, 23 Å diametru). Fosa majoră mai lată a conformației A este absolut necesară pentru interacția stabilă dintre RISC și ARNm ce va fi degradat. (Alagia și Eritja, 2016)

După maturarea RISC și hidroliza catenei pasager, Ago2 împarte catena ghid în 5 fragmente funcționale: ancoră, seed, central, 3’ suplimentară, coadă (Fig 11). Situsul ancoră, primul nucleotid al lanțului ghid, este asociat puternic cu domeniul MID al proteinei Ago2 și nu este implicat activ în recunoașterea ARNm. Gruparea fosfat din 5’ este necesară pentru realizarea eficientă a funcțiilor ARNsi, anume asocierea cu RISC și clivarea mediată de Ago2. S-a remarcat că există o preferință pentru adenină și uracil, acestea neavând rol în recunoașterea ARNm ci în menținerea stabilității complexului format între ARNm și Ago2. S-a observat de asemenea, că se pot induce modificări asupra regiunii ancoră pentru sporirea randamentului silențierii, de exemplu înlocuirea primului nucleotid cu un derivat triazolic. Regiunea seed (nucleotidele 2-8) este responsabilă de asocierea cu molecula țintă. Modificările făcute la nivelul acestei regiuni determină frecvența efectelor nespecifice. Regiunea centrală și cea suplimentară sunt necesare pentru recunoașterea moleculei ARNm țintă și există mai multe mecanisme prin care poate fi crescută specificitatea. Regiunea coadă prezintă cele 2 nucleotide ce nu erau împerecheate cu cealaltă catenă a ARNsi și interacționează cu domeniul PAZ al Ago2. Interacțiunea e necesară pentru dezorganizarea moleculei inițiale dublu catenare și hidroliza și eliminarea catenei pasager. Modificări la nivelul acestei regiuni pot duce la silențieri de lungă durată, inducând o rezistență mai mare la acțiunea nucleazelor. Aceste modificări au însă efecte remarcabile doar in vivo, eficiența in vitro fiind determinată de timpul de dublare celulară.(Alagia și Eritja, 2016).

Figură 11: Structura ARNsi în interacțiunea cu proteina Ago 2, figură adaptată după Alagia și Eritja, 2016.

2.3.3. ARNsi endogen

Inițial s-a observat prezența ARNsi endogen în plante, dar mai apoi s-a descoperit și în C. elegans, Drosophila melanogaster și mamifere. În plante și C. elegans, ARNsi endogen este format prin acțiunea ARN polimerazei ARN dependente proteină ce nu se găsește în genomul muștelor sau mamiferelor. Primul element endogen ARNsi remarcat a corespuns elementului nuclear lung interspersed L1, un retrotranspozon a cărui activitate a fost observată în celulele umane din cultură. Elementul complet L1 conține promotori atât pe catena sens cât și pe cea antisens, facilitând astfel transcrierea bidirecțională. Prin acest tip de transcriere se formează transcripți complementari ce pot fi procesați de Dicer pentru formarea de ARNsi. Nu se cunoaște însă mecanismul ce determină formarea acestui transcript. Au fost observate molecule de ARNsi endogene în celule germinative și somatice de D. melanogaster. Amestecuri de ARN scurte au fost imunoprecipitate și molecule de ARNsi au fost distinse de miARN și ARN PIWI prin structură și prin faptul că nu au uracil ca prim nucleotid. În tulpini de D. melanogaster mutante pentru dcr-2 și ago-2 s-a observat o creștere a nivelului de ARNm transpozomal, sugerând existența unei căi endogene de interferență ARN ce silențiază amplificarea acestor elemente mobile. ARNsi endogen în muște poate deriva din transpozomi, regiuni intergenice, transcripți ARN lungi și ARNm. ARNsi endogen a fost observat și în ovocitele de șoarece. Moleculele au tot o lungime de 21 nucleotide, sunt dependente de Dicer și pot fi derivate din transcripți ai unor pseudogene ce pot forma structuri repetitive inversate sau din gene codificatoare de proteine, anume cele ce se pot asocia cu pseudogene înrudite. Este posibil ca unele pseudogene să fie păstrate evolutiv pentru a putea regla expresia genelor din care au derivat (Ghildiyal și Zamore, 2009).

Rolul presupus al interferenței ARN in vivo este cel de silențiere a genelor post-transcripție (Agrawal și colab, 2003). Acest mecanism poate servi drept protecție împotriva infecțiilor virale, genelor parazite sau străine, dar rolul său încă nu este pe deplin elucidat (Ghildiyal și Zamore, 2009).

2.3.4. Proteinele de clivare ale ARNdc, RISC și proteina Ago2

Procesul de interferență presupune clivarea unor molecule de ARNdc endogene sau exogene în molecule mai mici ce vor determina în final degradarea unor molecule de ARNm. Acest fapt este realizat în principal de proteinele Dicer. Endonucleazele sunt conservate pe linie evolutivă, au 4 tipuri de domenii disticte (domeniu helicazic, domenii RN-ază III, domeniu de legare ARNdc și domeniu PAZ) (Agrawal și colab, 2003).

Mamiferele și C. elegans prezintă o singură ribonuclează Dicer, ce formează atât ARNsi cât și microARN. În organsimul viermelui s-a identificat o proteină adițională, de legare la ARNdc (RDE-4), proteină ce reglează activarea interferenței ARN. În D. melanogaster există două proteine Dicer, DCR-1 și DCR-2. DCR-1 formează prin activitatea sa microARN, în timp ce DCR-2 formează ARNsi. Produșii DCR-2 interacționează cu Ago 2 și duc la clivarea ARNm. S-a remarcat că genele dcr-2 și ago-2 de la Drosophila au o evoluție rapidă, fapt ce ar putea fi corelat cu funcția biologică a mecanismelor de interferență (Ghildiyal și Zamore, 2009), aceea de a proteja organismele de ADN paraziți, virusuri sau elemente genetice mobile (transpozomi și retrotranspozomi) (Agrawal și colab, 2003).

Mai multe experimente au arătat că în D. melanogaster, in vivo, clivarea ARNdc în ARNsi este dependentă de ATP. Activitatea în medii ce nu ofereau un aport suficient de energie era încetinită de până la 6 ori. La oameni, clivarea ARNdc în ARNsi este realizată în prezența ionilor de Mg2+, fără consum de ATP (Agrawal și colab, 2003).

În cadrul celulelor umane au fost identificate 8 proteine din familia Argonaute, dintre ele doar Ago2 având capacitatea de a cliva moleculele de ARNm. Datorită funcției sale, Ago2 are domenii și structură înalt conservate. Domeniul MID interacționează cu primul nucleotid de la capătul 5’ al catenei ghid ARNsi. Domeniul PIWI prezintă centrul catalitic activ ce determină degradarea ARNm țintă. Domeniul PAZ este hidrofob și recunoaște capătul 3’ neîmperecheat al catenei ghid. Lobul N este necesar pentru dezorganizarea ARNsi dublu catenar și maturarea RISC (Alagia și Eritja, 2016). Proteina omoloagă Ago2 în C. elegans e RDE1, având domenii PAZ și PIWI specifice (Agrawal și colab, 2003). În D. melanogaster, proteina Ago 2 are o secvență diferită de aminoacizi față de cea de la mamifere, neputând fi găsită o omologie (Ghildiyal și Zamore, 2009).

Complexul de silențiere indus de ARN este alcătuit din Dicer, Ago2, TRBP și molecule de ARNsi asociate complexului de încărcare a RISC. RISC poate prezenta și componente auxiliare, cum ar fi proteine ce direcționează ARNm specific către zone unde va fi degradat. RISC se maturează prin clivarea ARNsi dublu catenar (degradarea catenei pasager) și metilarea la capătul 3’. Metilarea este realizată de o proteină specifică, anume S-adenozil metiltransferaza metionin dependentă. La plante, atât ARNsi cât si microARN sunt metilate pentru a li se asigura stabilitatea (Ghildiyal și Zamore, 2009).

În D. melanogaster, identitatea monocatenelor de ARNsi este determinată de stabilitatea termodinamică a capatelor 5’, determinată de proteina de legătură R2D2, proteină auxiliară a complexului RISC (Ghildiyal și Zamore, 2009).

În celule se estimează că există o concentrație de 3-5 nM RISC, deci mecanismele de interferență ARN ar fi saturate la concentrații de 10-100pM ARNsi. În cazul experimentelor cu ARNsi transfectat, apare o competiție între acesta și moleculele miARN endogene pentru situsurile RISC. Astfel, în cazul unei transfecții pot apărea creșteri în exprimarea genelor silențiate în mod obișnuit de miARN (Alagia și colab, 2016).

Există posibilitatea transfecției stabile cu ARNsi, mai eficientă pentru celule de mamifere. Astfel, ADN ce codifică bulce scurte ARN (short-hairpin RNA – shARN) este introdus în celule, va fi integrat în genom și ARN polimerazele II sau III vor transcrie shARN ce va migra în citoplasmă și va iniția interferența ARN, prin activitatea unei ribonucleaze Drosha (realizează conversia shARN în ARNsi). ARNsi poate intra apoi în RISC pentru a opri expresia ARNm. Atașarea ARNsi la regiunea 3’ netradusă a ARNm, cu ajutorul proteinelor Ago1, Ago3 și Ago4 poate duce la represia translației. Complementaritatea cu o regiune ce va fi tradusă în aminoacizi va duce la degradarea moleculei de ARNm mediată de Ago2 (Fig 12) (Fakhr și colab, 2016).

Figură 12: Activarea mecanismului RISC de către ARNsi sau shARN ce este maturat ulterior în ARNsi. Mecanismul RISC poate fi activat atât de ARNsi, cât și de shARN ce pot fi maturate în molecule de ARNsi. Se poate realiza o transfecție stabilă cu ADN ce este transcris în shARN. Silențierea poate fi făcută prin clivarea ARNm, mediat de Ago2, dacă ARNsi este complementar cu o regiune ce va fi tradusă în aminoacizi. Cealată posibilitate e blocarea translației, mediată de complexul Ago 1-4, dacă există complementaritate cu regiuni necodificatoare din ARNm.

S-a reportat că mutații ale ARN polimerazei ARN dependente afectează interferența ARN în plante și C. elegans. Astfel, s-a presupus că ARN polimeraza ARN dependentă ar putea replica molecule de ARNsi pentru a putea fi amplificate și transmise generațiilor următoare. S-a observat și formarea de ARNsi specific pentru anumite ARNm, independent de ARNdc original. Interferența astfel rezultată a fost denumită interferență tranzientă, dar fenomenul de amplificare ARNsi nu a fost semnalat la mamifere sau D. melanogaster (Agrawal și colab, 2003).

2.3.5. Agenți de transfecție

S-a demonstrat că utilizarea ARNdc ce ar fi fost clivat este redundantă având în vedere că procesul de interferență ARN se realizează prin intermediul ARNsi. Astfel, se caută mijloace cât mai eficiente și specifice de transport a moleculelor mici de ARN, atât pentru realizarea unui potențial terapeutic, cât și pentru studii ale funcțiilor genelor in vitro.

Majoritatea sistemelor ARNsi pătrund în celule prin endocitoză. Veziculele pătrunse în celule fuzionează cu endozomii, iar anumite sisteme de transport interacționează cu pH-ul scăzut din cadrul endozomilor pentru a declanșa eliberarea ARNsi în citoplasmă (Kanasty și colab, 2013). Optimizarea transportului ARNsi in vivo constă în asigurarea unei protecții eficiente împortriva atacurilor enzimatice și facilitarea endocitozei nespecifice. Prin perfecționarea acestor paramatetri se poate realiza o eficiență mai mare a trasnmiterii (Ho și colab, 2016).

În ceea ce privește internalizarea de acizi nucleici de către o celulă, procesul este denumit transducție dacă este mediat viral sau transfecție dacă nu este mediat de un virus. Prin metodele prin care poate fi internalizat ADN pentru diferite terapii genice sau transformări, pot fi introduse în celule și molecule de ARN, atât ARNm pentru expresie proteică, cât și ARNsi pentru activarea mecanismului de interferență ARN. Sistemele virale sunt mai costistitoare, astfel, în special in vitro, se folosesc sistemele de transport nevirale (Damen și colab, 2018).

Cea mai mare provocare în utilizarea ARNsi este transportul până la celule și internalizarea acestuia. Mai multe teste clinice au arătat că translocarea de ARNsi nud prin membrane celulare nu este eficientă, așadar este importantă crearea de agenți de transport care să aducă moleculele de ARN la locul dorit (Foged, 2012). Unele din problemele ce apar în utilizarea ARNsi nud sunt potențialul imunogen și incapacitatea de a trece singur prin membranele celulare datorată dimensiunii (20-25 nucleotide) și hidrofilicității crescute (Kanasty și colab, 2013). Alte piedici sunt omniprezența nucleazelor și rata mare de excreție (Foged, 2012).

Agenții de transport lipidici sunt eficienți deoarece facilitează trecerea prin bistratul fosfolipidic al membranelor plasmatice. Întrucât moleculele de ARNsi au multe sarcini negative datorită scheletului pentozo-fosfat, cele mai multe lipide folosite pentru transport sunt lipide cationice ce pot interacționa cu sarcinile acidului nucleic. Complexul format între lipidele cationice și ARNsi se numește lipoplex și este un agregat stabil și heterogen. Eficacitatea crescută de transport a lipidelor cationice este datorată capacității de complexare cu moleculele de acizi ribonucleici mediată electrostatic (Foged, 2012).

Un alt avantaj al lipozomilor cationici este sarcina electrică globală pozitivă, ceea ce le permite aderarea la proteoglicanii încărcați negativ de pe suprafața celulelor. Un exemplu ce s-a demonstrat a fi eficient pentru transfecția ARNsi in vitro este lipidoid 98N12-5 (Fig 13), un izomer cu 5 cozi al trietilnetetramină-laurilaminopropionat. La aceste sisteme pot fi adăugate lipide cu proprietăți fuzogene ce fac mai ușoară endocitoza, destabilizând membrana plasmatică a celulelor țintă și fuzionând cu aceasta (Foged, 2012).

Figură 13: Structură lipidoid 98N12-5, figură preluată din Ho și colab, 2016.

Mai pot fi folosite lipide anionice sau neutre, avantajul lor fiind timpul de retenție crescut in vivo. Totuși, acestea prezintă dificultăți în încapsularea ARNsi, din cauza respulsiior electrostatice. Lipozomi neutrii compuși din dioleoil fosfatidil colină (DOPC) pot încapsula ARNsi în raport de 10:1. Moleculele de ARNsi pot fi căptușite cu un polimer policationic ce va putea interacționa cu lipozomi neutri sau anionici. De asemenea s-a demonstrat că utilizarea stabilizatorilor ca polietilen glicolul, permite transportul specific către zonele din organism unde țesutul endotelial este imperfect (cum ar fi în cazul tumorilor sau a procesului inflamator). Pentru o specificitate și mai crescută in vivo se pot atașa liganzi cum ar fi anticorpi, peptide, vitamine (Foged, 2012). Există diferiți liganzi pentru receptori specifici și peptide în complexe cu alți compuși ce pot pătrunde ușor în citoplasmă (Kanasty și colab, 2013).

Alte mijloace de transport pot fi polimerii, aceștia având o versatilitate foarte mare, propritățile lor fizico-chimice putând fi ajustate pentru condițiile necesare și pentru eficiență maximă. Prin intermediul scheletului pentozo-fosfat se pot forma poliplexe cu polimeri cationici. Proprietăți ce pot fi ajustate prin structura monomerilor sunt masa moleculară, densitatea sarcinilor electrice, hidrofobicitatea, tipurile de substituenți la catena laterală, proporția de ARN/polimer din cadrul poliplexului. Pentru transportul ARNsi se preferă polimeri ramificați cum ar fi dendrimerii de poiamidoamină, polipropilenimine sau poli L lizină (Fig 14) (Ho și colab, 2016).

Figură 14: Structura poli-L lizină-acid colic polietilen glicată. Poli-L lizina este modificată prin atașarea unui acid colid hidrofob și a polietilen glicolului prin intermediul unui linker sensibil la pH acid. Polimerul poate forma micele cationice alcătuite dintr-un miez hidrofob (ce permite încapsularea moleculelor insolubile în apă) și o suprafață hidrofilă (ce permite complexarea electrostatică cu acizii nucleici). Figură adaptată după Ho și colab, 2016.

O altă metodă de introducere a ARNsi în celule este electroporarea. Tehnica presupune utilizarea de pulsuri electrice puternice pentru a forma pori hidrofili în membrana plasmatică pentru perioade scurte de timp. Prin intermediul acestor pori pot fi preluate macromolecule hidrofile, printre care și ARNsi. Electroporarea are o eficiență mai mare pentru celule în suspensie și pentru alte tipuri de celule greu transfectabile. O problemă majoră a electroporării este mortalitatea mare a celulelor, astfel încât pentru o bună eficiență, trebuie optimizați anumiți parametri cum ar fi voltajul, numărul de pulsuri și durata pulsurilor (Han, 2018).

2.3.6. Optimizarea eficienței silențierii și metode de măsurare a acesteia

Capacitatea de silențiere a unei molecule de ARNsi nu este determinată doar de secvența de nucleotide cu care este complementară. Specificitatea este afectată de complementaritatea parțială cu alte situsuri. De asemenea, pot apărea dificultăți în complexarea cu moleculele de ARNm, care pot prezenta structuri secundare și terțiare. Pentru a se asigura o specificitate aproape absolută, pot fi create molecule validate prin metode bioinformatice (Alagia și colab, 2016).

Introducerea ARNsi în celule poate determina în acestea efecte ce nu sunt neapărat un rezultat al silențierii. Din acest motiv, cuantificarea eficienței silențierii este indicat să fie determinată independent de efectul fenotipic al acesteia. (Borawski și colab, 2007). Din acest motiv se caută sinteza de molecule ARNsi cu o specificitatea și un randament al silențierii cât mai mare, pentru a afecta cât mai puțin mecanismele autonome ale celulelor (Alagia și colab, 2016).

Astfel se poate studia efectul interferenței asupra unor gene exogene, cum ar fi luciferaza (pGL3) sau proteina fluorescentă verde (GFP). Prin măsurarea silențierii acestor gene raportor supraexprimate se poate determina doar influența ARNsi, putând astfel fi optimizate metodele de transfecție. Experimentele au fost făcute pe mai multe linii celulare în care s-a exprimat printr-un vector viral (lentivirus) gena pentru luciferază. În urma transfecției cu ARNsi mediată de lipide s-a observat că diferite linii celulare preferă diferiți agenți de transfecție, aceștia neafectând viabilitatea celulelor. Condițiile de transfecție folosite pentru silențierea luciferazei au fost folosite ulterior și pentru silențierea unor gene endogene, obținându-se o reducere a nivelului de ARNm de până la 70% (Borawski și colab, 2007).

Odată realizată transfecția, eficiența poate fi cuantificată atât prin Reacția de polimerizare în lanț, cantitativă, cu revers transcriere, (Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction RTq-PCR), pentru a se calcula nivelul de ARNm, sau Western Blot, pentru a se evalua expresia proteică, cât și funcțional. Abordarea prin RTq-PCR este utilă întrucât activitatea ARNsi duce la degradarea moleculelor de ARNm. Se poate face diferențierea între un grup de celule control și un grup de celule care au fost tratate cu ARNsi. Controlul negativ este realizat pentru a distinge efectele specifice ale ARNsi asupra genei de interes, de efectele nespecifice date de transfecție. Moleculele de ARNsi folosite în condiții control pot fi molecule cu aceeași compoziție nucleotidică, dar care nu prezintă omologie pentru genomul uman sau pentru zona țintită din genom. Moleculele de ARNsi astfel construite și folosite sunt denumite ARN Scrambled (Han, 2018).

În funcție de gena, respectiv proteina urmărită ar putea fi necesară și estimarea nivelului proteinei exprimate prin Western Blot, întrucât există proteine ce au un timp de viață lung. În cadrul acestor tipuri de modele, o examinare cu RTq-PCR ar indica o silențiere mai mare decât cea reală. Tot dependent de gena urmărită și rolul ei pot fi urmărite și efecte funcționale ale silențierii, cum ar fi nivelul de apoptoză, căile de semnalizare sau rata diviziunii celulare (Han, 2018).

3. Materiale și metode

3.1. Reactivi și soluții utilizate

Soluția de incubarea a celulelor în cultură (Inc Mix) conține NaCl 155mM, K2HPO4 1.5mM, acid 4-(2-hidroxietil) 1-piperazineteil sulfonic (HEPES) 5.6 mM, Na-HEPES 4.8mM. La acestea s-a adăugat glucoză și gentamicină (Sigma G-1272) pentru concentrații finale de 5mM, respectiv 50µg/ml; pH-ul soluției a fost ajustat la 7.2-7.4.

Mediul Nut Mix conține mediu Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) F12 la care s-a adăugat 1.5g bicarbonat de sodiu/L; pH-ul a fost ajustat la 7.4-7.5 la temperatura camerei, și care s-au adăugat ser de cal 10% (Sigma) și gentamicină 50µg/mL.

Soluția de desprindere a celulelor de substrat conține Tripsină (Sigma) 0.5mg/ml, acid etilendiamintetraacetic (EDTA) 0.5mg/ml și Phenol Red 11µg/ml.

Tamponul fosfat salin (PBS) conține NaCl 137mM, KCl 2.7mM, NaH2PO4 10mM, K2HPO4 1.8mM.

Soluția Ringer (extracelulară) cu glucoză conține NaCl 140mM, KCl 4mM, CaCl2 2mM, MgCl2 1mM, HEPES 10mM, NaOH 4.54 mM la pH 7.4 la 25° C, la care s-a adăugat glucoză pentru o concentrație finală 5mM.

Soluția de Calcium Green (Invitrogen) 2mM e preparată prin dizolvarea 50µg Calcium Green în 19.3µL dimetil sufloxid (DMSO, Sigma), fiind păstrată în alicoturi de 1µL la 4° C.

Tamponul de liză RIPA 1% conține 0.1% dodecil sulfat de sodiu (SDS), NaCl 50mM, Trisaminometan (Tris) 50mM, 2mM EDTA, 1% NP-40, 0.5% deoxicolat de sodiu (DOC); înainte de folosire s-a adăugat Protease inhibitor cocktail de la Roche Diagnostics 1%, orto-vanadat 1mM, acid iodacetic 5mM și fluorură de fenilmetansulfonil (PMSF) 1mM.

Tamponul de încărcare conține 250mM Tris-HCl la un pH de 6.8, 10% SDS, 0.5% bromfenol Blue, 50% glicerol și 500mM ditioeritriol (DTT).

Tamponul de migrare utilziat conține SDS 17.33mM, glicină 0.96M și Tris-bază 0.125M.

Tamponul de transfer conține Tris-bază 0.25M și glicină 1.9M la pH 8.3.

TBST conține soluție salină tamponată de Tris (TBS) și soluție Tween-20. TBS conține 50mM Tris și 0.15M NaCl la pH 7.5.

3.2. Mod de lucru

3.2.1.Cultură primară de neuroni din ganglionii spinali de la șobolan

Pentru realizarea culturilor de neuroni au fost utilizați șobolani masculi adulți (150-200 g) din rasa Wistar, care au fost sacrificați prin sufocare cu dioxid de carbon 100%, timp de 2 minute, după care a fost decapitați. Ganglionii spinali au fost extrași și au fost stocați într-un vas Petri de 35 mm diametru în Inc Mix (vezi 3.1. Reactivi și soluții utilziate).

Pentru disocierea neronilor s-a făcut un tratament enzimatic cu colagenază (extrasă de la Clostridium histolyticum, Sigma) 2mg/ml și dispază (Gibco) 3mg/ml dizolvate în Inc Mix, timp de o oră, la 37° C. După disocierea enzimatică, neuronii au fost preluați cu o pipetă Pasteur și puși în 1mL Nut Mix. Masa celulară a fost triturată cu ajutorul unei pipete Pasteur, după care s-a adăugat Nut Mix până la un volum final de 5 ml. Tubul a fost pus la centrifugat la 800xg, 10 minute la temperatura camerei. Peletul a fost resuspendat în 1mL Nut Mix, după care au fost pipetați câte 500µL în vase Petri de 35mm tratate cu poli-D-lizină 0.1mg/mL (Sigma), timp de 30 de minute. După ce au fost puse celulele, vasele au fost incubate o oră la 37° C, 5% CO2 pentru a se asigura aderarea. După incubare s-a adăugat aproximativ 2mL Nut Mix și neuronii au fost ținuți în incubator minim 3 ore înainte de transfecție.

3.2.2. Silențierea genei pentru porfobilinogen deaminază (PBGD)

Pentru transfecția cu ARN de silențiere (ARNsi) și ARN scrambled (ARN cu același raport al nucleotidelor componente dar care nu prezintă complementaritatea specifică pentru ARNm țintă) s-a folosit kit-ul Dharma FECT transfection de la GE Healthcare Dharmacon. Concentrația finală a ARNsi și ARN scrambled a fost de 25nmoli/volum final .Au fost preparate câte 10µl de ARNsi și ARN scrambled de concentrații 5µM. Pentru vase cu suprafața de 9cm2 s-au pregătit câte două tuburi, în primul s-au omogenitzat 10µL ARNsi, respectiv ARN scrambled, 5µM, cu 190µL mediu fără ser (pus la dispoziție de kit), în al doilea s-au pipetat 5µL Dharmafect (agent de trasnfecție lipidic) și 195µL mediu fără ser. După pipetări, tuburile au fost lăsate 5 minute la temperatura camerei, după care conținutul primului tub a fost turnat în cel de-al doilea și amestecul a fost lăsat timp de 20 de minute la temperatura camerei. În timpul incubării amestecului de tranfecție a fost sucționat mediul din vasele cu neuroni și înlocuit cu 1.6mL mediu proaspăt Nut Mix cu factor de creștere neuronal (NGF) 50 mg/ml. Amestecurile de transfecție au fost adăugate peste neuroni, iar vasele au fost păstrate în incubator la 37° C. După 24 de ore s-a sucționat mediul cu ARNsi, respectiv ARN scrambled și s-a adăugat aproximativ 2ml de mediu Nut Mix cu NGF. După încă 48 de ore, neuronii au fost tratați cu 500µL tripsină (vezi 3.1. Reactivi și soluții utilizate) timp de 3 minute pentru a se desprinde de pe vasele pe care au aderat. Suspensia rezultată a fost amestecată cu aproximativ 500µL Nut Mix după care a fost pusă la centrifugat 5 minute, 1000 RPM, la temperatura camerei. Peletul s-a resupendat în 200µL Nut Mix. Din cei 200 µL suspensie au fost plasați câte 20 de µL pe 4 lamele de sticlă (grosime 0.17mm, diametru 25mm) tratate în prealabil cu poli-D-lizină 0.1mg/mL timp de 30 de minute. Vasele au fost ținute o oră la 37° C, după care s-a adăugat aproximativ 2mL Nut Mix cu NGF și au mai fost incubate înca o oră. Restul de suspensie de neuroni a fost păstrată pentru analiza exprimării proteice prin tehnica Western blot, pentru evidențierea silențierii. Suspensia a fost pusă la centrifugat 5 minute, 1000RPM, la temperatura camerei, iar peletul a fost resuspendat în 200µL PBS (vezi 3.1. Reactivi și soluții utilizate), pentru spălare. Suspensia a fost centrifugată din nou în aceleași condiții, după care supernatantul a fost sucționat, iar peletul înghețat la -80° C.

3.2.3. Imagistică de calciu pentru observarea activității canalelor TRPA1, TRPV1 și TRPM8

Imagistica de calciu este o tehnică bazată pe capacitatea unor molecule de a emite fluorescență la contactul cu ioni de calciu. Primii compuși de acest tip au fost sintetizați la începutul anilor 80, până atunci fiind folosiți microelectrozi sau Aeqorina, o fotoproteină activată de calciu de la meduze. Metodele vechi nu puteau fi folosite cu ușurință pentru toate celulele mamiferelor. Propritetățile noilor compuși sunt bazate pe capacitatea de chelator de ioni de Ca2+ a acidului egtazic (EGTA). Proprietatea tuturor indicatorilor este faptul că legarea ionilor de calciu determină o schimbare a lungimii de undă în care este emisă fluorescența. Compușii sunt de două tipuri, primul tip prezintă exictare la lungimi de undă din domeniul ultraviolet (330-380 nm), iar cel de-al doilea fiind excitat de lumină la lungimi de undă din domeniul vizibil (450nm sau mai mult). Introducerea indicatorilor în celule presupune creșterea lipofilicității lor, întrucâ sunt molecule hidrofile. Lipofilicitatea este crescută prin esterificarea de acetoximetil la grupările carboxil din structura sa. Gruprările esterificate sunt hidrolizate de esteraze ce se găsesc în celulele în celulele încărcate (Lambert și Rainbow, 2013). Indicatorul folosit în experimentele realizate pentru această lucrare (Calcium Green-1) este de tipul 2.

Pentru a se realiza imagistica de calciu s-a folosit un amestec de conține soluție Ringer (vezi 3.1. Reactivi și soluții utilizate), Calcium Green-1 AM 2µM (indicator fluorescent de calciu, neutru din punct de vedere electric, care difuzează prin membrana plasmatică) (Invitrogen) și Pluronic F-123 0.02% (facilitează difuzia indicatorului fluorescent, având rol de surfactant) (Invitrogen). Amestecul a fost pipetat peste neuronii aderați pe lamelele de sticlă, după ce a fost aruncat mediul în care au fost incubați și s-a efectuat o spălare cu 1mL Ringer cu glucoză 5mM. Vasul a fost incubat 30 de minute, după care s-a efectuat încă o spălare cu 1mL ringer cu glucoză, iar după încă 30 de minute a putut fi făcută înregistrarea.

Pentru înregistrare lamelele cu neuroni au fost montate într-o cameră de teflon (MSC TD, Digimeter, Welwyn Garden, UK) pe masa unui microscop inversat Olympus IX70. Neuronii au fost iluminați de un LED albastru ce emite la 470nm, controlat de Dual OptoLED (Cairn Research, Faversham, UK). Semnalele de fluorescență s-au înregistrat cu ajutorul unei camere CCD (Cohu 4910; Pieper GmbH, Schwerte, Germania) controlată de programul Axon Imaging Workbench 2.2 (Axon Instruments, Union, CA), program ce a fost folosit și pentru obținerea imaginilor și analiza acestora.

Experimentele de imagistică de calciu au fost realizate pentru a observa modificările induse în urma silențierii enzimeri PBGD asupra canalelor ionice din familia TRP, din neuroni. Protocolul a constat în aplicarea de WS-12 5µM, (Sigma) (30 sec), alil izotiocianat 50µM (AITC, Fluka) (1 min), capsaicină 100nM (Cap, Sigma) (30 sec) și KCl (soluție Ringer fără glucoză cu KCl 50mM). Capsaicina a fost folosită pentru a putea fi selectați neuronii ce exprimă TRPV1, AITC pentru neuronii ce exprimă TRPA1, WS-12 pentru neuronii ce exprimă TRPM8. KCl a fost folosit pentru a se distinge neuronii de celelalte celule ce au proliferat în timpul incubărilor. Agoniștii au fost aplicați la intervale de câte 3 minute, între aplicări celulele fiind tratate cu soluție Ringer.

Variațiile nivelului de calciu intracelular indicate de fluorescență au fost analizate cu ajutorul unui Macro Excel urmărindu-se raportul între variația maximă de fluorescență în timpul stimulului și fluorescența inițială (ΔF/F0). ΔF reprezintă diferența dintre fluorescența maximă observată pe parcursul aplicării unui agonist (Fmax), iar F0 reprezintă fluorescența bazală a respectivului neuron. Valorile raportului mai mari de 0.1 au fost considerate drept răspuns. De asemenea a fost calculată și aria de sub grafic (A.U.C.) pentru fiecare stimul, indicator al influxului total de calciu în celule. Pentru prelucrarea și reprezentarea răspunsurilor neuronilor obținute în urma aplicării substanțelor din protocolul experimental a fost utilizat programul Origin 8 (OriginLab Corporation, Northhampton, MA, USA).

3.2.4. Western blot pentru evidențierea silențierii genei PBGD

Western blot este o tehnică de biologie moleculară prin care se poate evalua prezența dar si cantitatea unei proteine specifice dintr-un amestec. Tehnica presupune 3 pași. În primul rând, amestecul proteic trebuie supus electroforezi pentru a se asigura separarea în funcție de masa moleculară. În al doilea rând, proteinele migrate trebuie transferate pe un suport solid. În ultimul rând, odată ajunse pe suportul solid, proteinele de interes pot fi marcate și vizualizate cu ajutorul unor anticorpi. Anticorpul ce se leagă direct de proteina de interes se numește anticorp primar, iar anticorpul ce permite analiza calitativă și cantitativă se numește anticorp secundar. Probele cel mai des folosite sunt lizatele celulare, însă este nevoie de păstrarea lor pe gheață și adăugarea unor inhibitori de proteaze pentru a se asigura menținerea integrității acestora. De asemenea se recomandă încărcarea în gelul de electroforeză probe ale căror concentrație proteică este cunoscută pentru a se asigura compararea exactă a acestora (Mahmood și Yang, 2012).

Gelul de poliacrilamidă folosit are două componente, un gel de concentrare și un gel de migrare. Gelul de concentrare e mai poros, fapt ce permite formarea unui front subțire de migrare, ce poate apoi fi separat în al doilea fragment al gelului. Proteinele au fost denaturate termic înainte de încărcare, astfel încât migrarea lor să fie influențată doar de masa moleculară. Tamponul asigură încărcarea negativă uniformă, și deci migrarea spre catod (Mahmood și Yang, 2012).

Membrana pe care se realizează transferul poate fi de fluoro poliviniliden (PVDF) sau de nitroceluloză. Membranele de nitroceluloză au o afinitate mai mare pentru proteine, însă se pot rupe ușor și nu pot fi păstrate pentru analize ulterioare. Blocarea membranei împiedică legarea nespecifică a anticorpilor și poate fi realizată cu lapte 5% sau cu albumină serică bovină (BSA). Preferința pentru soluțiile de blocare este determinată de tipul de detecție (de exemplu, fosfoproteinele nu pot fi determinate pe membrane blocate cu lapte, întrucât cazeina, proteină găsită în lapte, este o fosfoproteină). Detecția se face de obicei prin intermediul unei enzime legate de anticorpul secundar, de obicei peroxidaza din hrean (Mahmood și Yang, 2012).

Neuronii înghețați la -80° C au fost dezghețați și resuspendați în 100µl tampon de liză RIPA 1% (vezi 3.1. Reactivi și soluții utilizate), pe gheață. Celulele s-au lizat mecanic prin trecerea printr-un ac de seringă de 5-6 ori, după care s-au ținut 20 de minute pe gheță. Tuburile au fost centrifugate 30 de minute, la 4° C, 20000 xg.

S-a determinat concentrația totală de proteină folosindu-se kitul Pierce BCA Protein Assay (Thermo Scientific). Reactivul s-a preparat amestecând 50 de părți din soluția A cu o parte din soluția B. Probele și controalele (tampon de liză a fost utilizat ca blank) au fost pipetate într-o placă cu 96 de godeuri, în duplicat. În fiecare godeu s-au amestecat 10µL probă, respectiv tampon de liză pentru blankuri cu 200µL soluție pentru colorare. Placa cu 96 de godeuri a fost incubată 30 de minute la 37° C. S-au citit concentrațiile de proteină pentru fiecare probă și s-au făcut diluțiile necesare cu tampon de liză pentru a se obține aceeași concentrație în fiecare probă. Peste probe a fost adăugat tampon de încărcare 5X (vezi 3.1. Reactivi și soluții utilizate), la o concentrație finală de 1X. Probele au fost denaturate termic la 95° C timp de 5 minute și încărcate într-un gel de poliacrilamidă de concentrație 10%. În primul godeu al gelului a fost încărcat un marker de masă moleculară, Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermofisher). În cuva de migrare a fost pus tampon de migrare (vezi 3.1. Reactivi și soluții utilizate). Cuva cu gelul a fost fixată la o sursă de curent și proteinele au migrat 15 minute la 150V și 45 minute la 180V. Migrarea s-a oprit când frontul de migrare a părăsit gelul.

Transferul proteinelor din gel pe membrana de PVDF s-a făcut în urma activării membranei. Aceasta a stat 2 minute în alcool etilic absolut după care a fost păstrată în tampon de transfer (vezi 3.1. Reactivi și soluții utilizate), cel puțin 5 minute. Odată scos din cuva de migrare gelul a fost ținut 5 minute în tampon de transfer. S-a asamblat un sandviș de transfer punându-se într-un suport, de la partea la care va fi conectat anodul către catod, în ordine: burete, hârtie de filtru îmbibată în tampon de transfer, gelul SDS PAGE în care au migrat proteinele, membrana de PVDF, hârtie de filtru îmbibată în tampon de transfer, burete. Suportul a fost pus într-o cuvă de transfer pe gheață pentru a menține o temperatură scăzută în timpul transferului. Cuva de transfer a fost conectată la o sursă de curent menținută o oră la un amperaj de 80mA.

După transfer membrana a fost pusă într-o soluție salină tamponată de Tris (TBS, vezi 3.1. Reactivi și soluții utilizate), care conține 1% Tween-2- (TBST). Membrana a fost blocată prin incubare cu lapte 5% (Sigma), prin balansare timp de o oră. După blocare, peste membrană a fost pus anticorpul anti PBGD obținut din iepure (Abcam, ab232927), 2µg/mL preparat în lapte 5%. Vasul a fost incubat peste noapte pe balansor, la 4° C. Membrana a fost spălată de trei ori în TBST timp de 5 minute, apoi s-a incubat cu anticorpul secundar anti iepure (Invitrogen) diluat 1:4000 în lapte 5%. Membrana a fost lăsată în soluția cu anticorpul secundar pe balansor timp de o oră, la temperatura camerei, după care au fost făcute 3 spălări cu TBST timp de 8 minute. Vizionarea proteinei PBGD s-a realizat ărin incubarea membranei timp de 5 minute cu substratul HRP Super Signal West Femto (Thermo Fischer Scientific), ce conține luminol și tampon pentru peroxidază, amestecate în raport de 1 la 1. După vizualizarea proteinei PBGD, membrana a fost incubată pe balansor timp de o oră cu anticorpul de control al încărcării, anti-GAPDH-HRP dizolvat în lapte 5% la un raport de 1:250. După încă 3 spălări cu TBST timp de 8 minute fiecare, s-a citit din nou luminescența după incubarea timp de 5 minute a membranei în substratul HRP.

Datele experimentale obținute au fost cuantificate cu ajutorul progamului ImageJ și prelucrate cu Origin 8 (OriginLab Corporation, Northhampton, MA, USA).

3.2.5. Imagistică ROS

Pentru realizarea experimentelor de imagistică de ROS au fost utilizați neuroni din ganglionii spinali de la șobolan, obținuți prin protocolul descris mai sus. Peletul format din neuroni, obținut în urma centrifugării a fost resuspendat în Nut Mix cu NGF și depus pe lamelele de sticlă tratate cu poli-D-lizină 0.1 mg/mL timp de 30 de minute, după ce în prealabil au fost sterilizate cu alcool etilic 100%. Neuronii puși pe lamele de sticlă au fost încărcați timp de 15 minute cu indicatorul de specii reactive de oxigen, diacetat de 2’ 7’ diclorodihidrofluoresceină (H2DCFDA, ThermoFischer Scientific) 50mM, dizolvat în DMSO, diluat în 1mL soluție Ringer cu glucoză 5mM. După incubare au fost efectuate trei spălări la intervale de 5 minute cu Ringer cu glucoză.

Experimentele de imagistică de ROS au fost realizate pentru a observa modificările induse de aplicarea ALA și PBG asupra nivelului speciilor reactive de oxigen din neuroni. În timpul înregistrării, neuronii au fost tratați cu ALA sau PBG (Sigma) 20µM în Ringer, timp de 10 minute. Peroxidul de hidrogen 100mM a fost aplicat la final și a fost folosit drept control pozitiv pentru formarea speciilor reactive de oxigen. Între aplicările de substanțe, neuronii au fost perfuzați cu soluție Ringer.

Pentru prelucrarea datelor și reprezentarea răspunsurilor neuronilor obținute în urma aplicării substanțelor din protocolul experimental a fost utilizat programul Origin 8 (OriginLab Corporation, Northhampton, MA, USA).

4. Rezultate și discuții

4.1. Rezultate

4.1.1. Silențierea genei HMBS în neuroni din DRG de șoboloan și determinarea nivelului proteinei prin Western blot

Corpii neuronilor din ganglionii spinali au fost supuși unui tratament cu ARNsi sau ARN scrambled conform protocolului descris în capitolul anterior (3.2.2.). Transfecția a fost realizată pentru a simula condițiile întâlnite în organismele cu porfirie acută intermitentă, diminuând expresiei genei PBGD la nivel de proteină. Nivelul de silențiere a fost apreciat prin evaluarea nivelului de exprimare al proteinei, prin tehnica Western blot descrisă în subcapitolul 3.2.4..

Figură 15: Aprecierea nivelul proteic din 3 populații de neuroni și aspectul benzilor de proteine marcate cu anticorpi specifici. Populațiile de neuroni au fost grupul control, netratați cu ARN sau cu agenți de transfecție, grupul ARN scrambled, tratat cu ARN ce nu afectează expresia proteică și grupul ARNsi, tratat cu ARNsi ce induce fenomenul de interferență ARN. Aprecierea a fost făcută prin Western Blot, folosindu-se anticorpi specifici pentru PBGD. Proteina de referință a fost gliceraldehid 3 fosfat dehidrogenaza (GAPDH). În total, s-a remarcat o scădere a expresiei HMBS la nivel de proteină cu aproximativ 30% față de grupul control.

4.1.2. Imagistică de calciu pentru evidențierea activității modificate a TRPA1, TRPV1 și TRPM8

Întrucât crizele acute de porfirie sunt marcate de diferite tipuri de durere și dezvoltarea bolii implică în unele cazuri și neuropatia nervilor senzitivi (Lin și colab, 2011), am presupus implicarea canalelor ionice observate de obicei în nocicepție. Înregistrări de imagistică de calciu au fost realizate pe DRG, confrom protocolului descris în 3.2.3., atât pentru neuroni care au fost tratați cu ARN scrambled, cât și pentru neuroni tratați cu ARNsi (mimând condițiile porfiriei acute intermitente).

Figură 16: Câmp de neuroni în care se observă activarea acestora la aplicarea diferiților agoniști specifici. Neuronii ce exprimă TRPM8 au fost identificați prin aplicarea de WS-12 (stânga sus). Neuronii ce exprimă TRPA1 au fost identificați prin aplicarea de AITC (dreapta sus). Neuronii ce exprimă TRPV1 au fost identificați prin aplicarea de capsaicină (stânga jos). Viabilitatea neuronală a fost confirmată prin aplicarea la final de soluție Ringer cu KCl, ce determină un influx puternic de calciu (dreapta jos). În fragmentele de stânga sus ale fiecărui chenar este reprezentat timpul la care a fost făcută poza. Influxul de calciu a putut fi observat datorită înărcării cu Calcium Green, indicator fluorescent, activat de ionii Ca2+. Imaginile au fost preluate cu ajutorul programului Axon Imaging Workbench 2.2 (Axon Instruments, Union, CA).

A fost apreciată variația numărului de neuroni care au răspuns la cei 3 agoniști în cele două condiții (tratament cu ARN scrambled, respectiv ARNsi).

Figură 17: Procentele de neuroni care au răspuns la diferiții stimuli. Se poate observa o proporție mai mare de neuroni care au răspuns la capsaicină în populațiile tratate cu ARNsi (aproximativ 42% din neuroni, comparativ cu doar 26% în populația tratată cu ARN scrambled)..

Fluorescența emisă în urma aplicării agoniștilor și soluției Ringer cu KCl a fost determinată pentru toate câmpurile ce conțineau neuroni (au prezentat o creștere a semnalului fluorescent la aplicarea de KCl).

Figură 18: 6 neuroni care prezintă răspunsuri la aplicarea agoniștilor specifici pentru TRPM8, TRPA1, respectiv TRPV1. Pentru ambele tipuri de condiții (tratați cu ARN scrambled, notați cu negru pe grafic sau cu ARNsi, notați cu roșu) a fost folosit același protocol în timpul înregistrării. Acesta a fost descris în subcapitolul 3.2.3., 30 de secunde aplicare WS-12 5µM, 1 minut AITC 50µM și 30 de secunde Cap 100 nM. Au fost reprezentați neuroni în care raportul ΔF/F0 la aplicarea de Ringer cu KCl a fost mai mare ca 0,1. Pe abcisă este reprezentat timpul în minute, iar pe ordonată fluorescența exprimată în unități arbitrare.

Au fost selectați exclusiv neuroni ce prezentau o valoare a ΔF/F0 la aplicarea de KCl mai mare de 0,1, pentru a se asigura viabilitatea acestora. Au fost identificați toți neuronii ce îndeplineau această condiție și au fost selectați dintre aceștia cei ce au prezentat valori ΔF/F0 mai mari ca 0,1 și la aplicarea agoniștilor. A fost făcută o medie a valorilor ΔF/F0 pentru fiecare aplicare și au fost reprezentate comparativ (grupul tratat cu ARN scrambled și grupul tratat cu ARNsi).

Figură 19: Evaluarea statistică a răspunsurilor la cei 3 agoniști. A fost realizată o medie a ΔF/F0 a tuturor neuronilor care au răspuns la un anumit agonist. Cu negru este reprezentată media valorilor neuronilor tratați cu ARN scrambled (16 au răspuns la WS-12, 28 la AITC și 30 la Cap), iar cu roșu este reprezentată media valorilor neuronilor tratați cu ARNsi (21 au răspuns la WS-12, 33 la AITC și 51 la Cap). Barele de eroare reprezintă eroarea standard medie

Se observă din figura 18 că nu există diferențe semnificative statistic între răspunsurile neuronilor ce prezintă o expresie normală a HMBS și a celor ce prezintă o expresie alterată a acestei enzime.

A fost calculată și aria de sub grafic pentru a se verifica dacă există diferențe în cantitatea totală de calciu ce intră în celule în timpul stimulilor. Au fost selectați aceeași neuroni ca pentru cuantificarea ΔF/F0 întrucât aceștia prezentau răspunsuri veritabile la diferiții agoniști.

Figură 20: Evaluarea influxului total de calciu prin cuantificarea ariilor de sub curbă pe parcursul fiecărui stimul. Notațiile în figură sunt identice cu cele din figura anterioară.

Se observă că nu există diferențe relevante statistic nici în influxul total de calciu.

4.1.3. Imagistica DRG a speciilor reactive de oxigen

Deoarece în condițiile porfiriei acute intermitente se remarcă o acumulare a speciilor reactive de oxigen în celule ca rezultat a concentrațiilor crescute de ALA și PBG (Lin și colab, 2011; Cardenas și Guerrero, 2018) am încercat observarea acestor efecte in vitro, pe DRG.

Figură 21: Efectele aplicării ALA și PBG asupra nivelului de specii reactive de oxigen din DRG. A fost făcută o medie a fluorescenței neuronilor în fiecare dintre condiții. Neuronii au fost tratați conform protocolului descris în 3.2.5. (10 minute ALA sau PBG 20µM), indicatorul fluorescent pentru speciile reactive de oxigen fiind diacetatul de 2’ 7’ diclorodihidrofluoresceină. Pe abcisă este reprezentat timpul în minute și intervalele de aplicare ale intermediarilor (ALA și PBG) și a peroxidului de hidrogen (folosit drept control pozitiv pentru stresul oxidativ), iar pe ordonată este reprezentată fluorescența în unități arbitrare. Au fost evaluați 56 de neuroni în aplicările de PBG, 65 în aplicările de ALA și 60 pentru formarea unui grup control.

4.2. Discuții

Porfiriile acute sunt maladii ce afectează printre altele și sistemul nervos periferic, putând induce neuropatie periferică (Siegesmund și colab, 2011). Disfuncțiile nervilor pot apărea ca rezultat a mai mulți factori ce se acumulează în cadrul porfiriilor. Cei mai importanți sunt neurotoxicitatea directă determinată de concentrații intracelulare mari de ALA și PBG, principalii metaboliți observați în porfirii și acumularea de specii reactive de oxigen ca urmare a efectelor nocive ale intermediarilor (Cardenas și Guerrero, 2018). Un alt motiv ce explică afectarea neuronilor ar putea fi scăderea nivelului de hem și funcționarea defectuasă a catenei transportatoare de electroni din mitocondrie și astfel scăderea nivelului de ATP (Lin și colab, 2011).

Deoarece canalele TRP sunt principalele proteine implicate în transmiterea durerii și în special a durerii asociate neuropatiei (Jardin și colab, 2017), am presupus că ar putea avea o activitate modificată în cadrul contextului porfirinic. Un alt indicator al potențialei implicări a TRPA1 în simptomele asociate acestei maladii este activarea directă determinată de speciile reactive de oxigen (Dai, 2015).

În afară de diferența procentului de neuroni care au răspuns la capsaicină (Fig 17), experimentele realizate nu au produs rezultate semnificative din punct de vedere statistic. Nu s-a observat o creștere a fluorescenței determinate de specii reactive de oxigen în neuronii ganglionilor spinali în cultură primară în timpul perfuzării ALA sau PBG (Fig 21). Nu a fost remarcată nici o diferență în răspunsurile la agoniști (Fig 19) sau în influxul total de calciu (Fig 20) ale TRPA1, TRPV1 și TRPM8 în DRG care au fost tratați cu ARNsi ce a dus la o scădere a nivelului proteic cu aproximativ 30% (Fig 15).

Deși nu au fost obținute rezultatele așteptate, există anumite perspective de studiu. În primul rând ar putea fi optimizat protocolul de transfecție pentru a se obține o interferență ARN mai bună și implicit o cantitate mai mică de proteină în celule. De asemenea, ar putea fi testată activitatea canalelor TRP după perfuzarea sau incubarea DRG cu ALA și PBG pentru perioade mai mult sau mai puțin îndelungate. Sunt posibile și studiile pe DRG recoltați de la șobolani PBGD knock-out (PBGD-/-), pentru ca neuronii senzitivi din coarnele dorsale să fie afectați de condițiile complete ale afecțiunii. Ar putea fi făcute și experimente comportamentale pe șobolani PBGD knock-out, determinându-se intensitatea durerii la injectarea de diferiți agoniști pentru canale TRP, comparativ cu șobolani control.

5. Concluzii

Durearea ce apare în timpul crizelor acute de porfirie este unul din factorii principali ce scade calitatea vieții la pacienți. Descoperirea mecanismelor prin care aceasta este transmisă ar putea avea implicații în utilizarea de analgezice ce blochează direct respectivele mecansime. De asemenea, poate fi studiată și durerea asociată neuropatiei rezultate din urma acestor maladii.

Canalele TRPM8, TRPA1 și TRPV1 sunt principalii canditați pentru implicarea în transmiterea durerii asociată neuropatiei, iar în această lucrare a fost investigată implicarea lor în transmiterea durerii în cadrul porfiriilor acute.

Experimentele realizate pe DRG tratați cu ARNsi pentru PBGD, au arătat activitatea canalelor nu a fost modificată în condiții ce simulează porfiria acută intermitentă. De asemenea, în cadrul experimentelor pe DRG netratați cu ARNsi nu a fost observată o creștere a nivelului de ROS în celule perfuzate cu ALA sau PBG. Totuși, a fost observată o creștere a expresiei TRPV1 în cadrul neuronilor tratați cu ARNsi, comparativ cu neuronii tratați cu ARN scrambled (Fig 17). Este neclar însă efectul acestei aparente supraexpresii întrucât atât amplitudinea cât și influxul total de calciu din timpul răspunsurilor la agonistul specific au fost asemănătoare în cele două condiții.

Efectele pozitive ale descoperirii mecanismului molecular de transmitere a durerii în porfiriile acute sunt destul de mari pentru a justifica o continuare a explorării activității canditaților din familia TRP implicați de obicei în transmiterea durerii, în diferite condiții experimentale ce simulează cât mai fidel maladiile.

6. Bibliografie

1.Agrawal N., Dasaradhi P. V. N., Mohmmed A., Malhorta P., Bhatnagar R. K., Mukherjee S. K., 2003, RNA Interference: Biology, Mechanism, and Applications, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67 (4), 657-685.

2.Akopian N. A. 2010, Regulation of Nociceptive Transmission at the Periphery Via TRPA1-TRPV1 Interactions. Curr. Pharm. Biotechnol. 12, 89–94.

3.Alagia, A. & Eritja, R. ,2016, siRNA and RNAi optimization. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 7, 316–329.

4. Ba, X., Wang, J., Zhou, S., Luo, X., Peng, Y., Yang, S., Hao, Y., & Jin, G. 2018. Cinobufacini protects against paclitaxel-induced peripheral neuropathic pain and suppresses TRPV1 up-regulation and spinal astrocyte activation in rats. Biomed. Pharmacother. 108, 76–84.

5.Balwani, M. & Desnick, R. J. 2012 The porphyrias: Advances in diagnosis and treatment. Blood 120, 4496–4504.

6.Basso, L. & Altier, C. 2017 Transient Receptor Potential Channels in neuropathic pain. Curr. Opin. Pharmacol. 32, 9–15.

7.Benemei, S., Patacchini, R., Trevisani, M. & Geppetti, P. 2015 TRP channels. Curr. Opin. Pharmacol. 22, 18–23.

8.Besur, S., Schmeltzer, P. & Bonkovsky, H. L. 2015, Acute Porphyrias. J. Emerg. Med. 49, 305–312.

9.Bisell, D.M., Wang, B. 2015, Acute Hepatic Porphyria, J Clin Transl Hepatol, vol.3, 17-26

10.Bissell, D. M., Anderson, K. E. & Bonkovsky, H. L. 2017 Porphyria. N. Engl. J. Med. 377, 862–872.

11.Borawski, J., Lindeman, A., Buxton, F., Labow, M. & Gaither, L. A. ,2007, Optimization procedure for small interfering RNA transfection in a 384-well format. J. Biomol. Screen. 12, 546–559.

12.Cardenas, J. L. & Guerrero, C. 2018 Acute intermittent porphyria: general aspects with focus on pain. Curr. Med. Res. Opin. 34, 1309–1315.

13.Ciobanu, A. C., Selescu, T., Gasler, I., Soltuzu, L. & Babes, A. 2016 Glycolytic metabolite methylglyoxal inhibits cold and menthol activation of the transient receptor potential melastatin type 8 channel. J. Neurosci. Res. 94, 282–294.

14.Dai, Y. 2016, TRPs and pain. Semin. Immunopathol. 38, 277–291.

15.Damen, M., Groenen A. J. J., Dongen S. F. M, Nolte R. J. M.m Scholte B. J. Feiters M. C. ,2018,. Transfection by cationic gemini lipids and surfactants. Medchemcomm 9, 1404–1425.

16.Fakhr, E., Zare, F. & Teimoori-Toolabi, L., 2016, Precise and efficient siRNA design: A key point in competent gene silencing. Cancer Gene Ther. 23, 73–82.

17.Fernandes, E. S., Fernandes, M. A. & Keeble, J. E. 2012, The functions of TRPA1 and TRPV1: Moving away from sensory nerves. Br. J. Pharmacol. 166, 510–521.

18.Foged, C., 2012, siRNA Delivery with Lipid-based Systems: Promises and Pitfalls. Curr. Top. Med. Chem. 12, 97–107.

19.Ghildiyal, M. & Zamore, P. D., 2009, Small silencing RNAs: An expanding universe. Nat. Rev. Genet. 10, 94–108.

20.Giorgi, S., Nikolaeva-Koleva, M., Alarcón-Alarcón, D., Butrón, L. & González-Rodríguez, S. 2019, Is TRPA1 burning down TRPV1 as druggable target for the treatment of chronic pain? Int. J. Mol. Sci. 20, 1–20.

21.Gorchein A. 1997, Drug treatment in acute porphyria. Br J Clin Pharmacol;44(5):427‐434.

22.Han, H., 2018, RNA interference to knock down gene expression. Methods Mol. Biol. 1706, 293–302.

23.Harper, P. & Sardh, E. 2014, Management of acute intermittent porphyria. Expert Opin. Orphan Drugs 2, 349–368.

24.Herrick, A. L. & McColl, K. E. L. 2005 Acute intermittent porphyria. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 19, 235–249.

25.Ho, W., Zhang, X. Q. & Xu, X., 2016 Biomaterials in siRNA Delivery: A Comprehensive Review. Adv. Healthc. Mater. 5, 2715–2731.

26.Hung, C. Y. & Tan, C. H. 2018, TRP channels in nociception and pathological pain. Adv. Exp. Med. Biol. 1099, 13–27.

27.Jardín, I. et al. TRPs in pain sensation. Front. Physiol. 8, 1–10 (2017).

28. Kambiz S, Duraku LS, Holstege JC, Hovius SE, Ruigrok TJ, Walbeehm ET. 2014, Thermo-sensitive TRP channels in peripheral nerve injury: A review of their role in cold intolerance. J. Plast. Reconstr. Aesthetic Surg. 67, 591–599.

29.Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A. & Anderson, D., 2013, Delivery materials for siRNA therapeutics. Nat. Mater. 12, 967–977.

30. Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S., Kernan, M. J., & Kim, C, 2003, A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila. Nature. ;424(6944):81–84

31.Lambert D. G. & Rainbow R. D., 2013, Caclium Signaling Protocols Third Edition, Human Press

32.Lin, C. S. Y., Lee, M. J., Park, S. B. & Kiernan, M. C. 2011, Purple pigments: The pathophysiology of acute porphyric neuropathy. Clin. Neurophysiol. 122, 2336–2344 .

33.Mahmood, T. & Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4, 429–434 (2012).

34.Marwaha L, Bansal Y, Singh R, Saroj P, Bhandari R, Kuhad A. 2016, TRP channels: potential drug target for neuropathic pain. Inflammopharmacology. 24(6):305‐317.

35.Moore, C., Gupta, R., Jordt, S. E., Chen, Y. & Liedtke, W. B. 2018, Regulation of Pain and Itch by TRP Channels. Neurosci. Bull. 34, 120–142.

36.Napoli, C., Lemieux, C. & Jorgensen, R., 1990, Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2, 279–289.

37.Naziroǧlu, M., Merve Dikici, D. & Dursun, Ș. 2012, Role of oxidative stress and Ca2+ signaling on molecular pathways of neuropathic pain in diabetes: Focus on TRP channels. Neurochem. Res. 37, 2065–2075.

38.Nikam, R. R. & Gore, K. R., 2018, Journey of siRNA: Clinical Developments and Targeted Delivery. Nucleic Acid Ther. 28, 209–224.

39.Poblete-Gutiérrez, P., Wiederholt, T., Merk, H. F. & Frank, J. 2006, The porphyrias: Clinical presentation, diagnosis and treatment. Eur. J. Dermatology 16, 230–240.

40.Ponka, P. 1999, Cell biology of heme. Am. J. Med. Sci. 318, 241–256.

41.Puy, H., Gouya, L. & Deybach, J. C. 2010, Porphyrias. Lancet 375, 924–937.

42.Sałat, K. & Filipek, B. 2015, Antinociceptive activity of transient receptor potential channel TRPV1, TRPA1, and TRPM8 antagonists in neurogenic and neuropathic pain models in mice. J. Zhejiang Univ. Sci. B 16, 167–178.

43.Siegesmund, M., Van Tuyll Van Serooskerken, A. M., Poblete-Gutiérrez, P. & Frank, J. 2010, The acute hepatic porphyrias: Current status and future challenges. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 24, 593–605.

44.Wang, B., Rudnick, S., Cengia, B. & Bonkovsky, H. L. 2019, Acute Hepatic Porphyrias: Review and Recent Progress. Hepatol. Commun. 3, 193–206.

7. Listă figuri

Figură 1. Calea de sinteză a hem-ului……………………………………………………………….5

Figură 2. Cele mai frecvente manifestări ale durerii în crizele acute de porfirie…………………….9

Figură 3. Inducerea unui atac acut, determinată de scăderea concentrației de hem………………..14

Figură 4. Schemă de diagnostic diferențial pentru tipurile de porfirie acută………………………17

Figură 5. Silențierea ARNm pentru ALAS 1 prin intermediul ARNsi…………………………….19

Figură 6. Reprezentare schematică a mecanismelor în care sunt implicate TRPA1 și TRPV1 pentru a induce durerea neuropatică………………………………………………………………………28

Figură 7. Implicarea canalelor TRP în durerea neuropatică și consecințele distrugerii neuronilor..29

Figură 8. Observarea dezvoltării hiperalgeziei la temperaturi scăzute în șoareci tratați cu paclitaxel, comparativ cu animale control……………………………………………………………………30

Figură 9. Implicarea canalelor TRP în diferite forme de durere neuropatică………………………31

Figură 10. Interferența ARN mediată de RISC……………………………………………………36

Figură 11. Structura ARNsi în interacțiunea cu proteina Ago 2……………………………………38

Figură 12. Activarea mecanismului RISC de către ARNsi sau shARN ce este maturat ulterior în ARNsi…………………………………………………………………………………………….41

Figură 13. Structură lipidoid 98N12-5……………………………………………………………..43

Figură 14. Structura poli-L lizină-acid colic polietilen glicată……………………………………44

Figură 15. Aprecierea nivelul proteic din 3 populații de neuroni și aspectul benzilor de proteine marcate cu anticorpi specifici………………………………………………………………………54

Figură 16. Câmp de neuroni în care se observă activarea acestora la aplicarea diferiților agoniști specifici……………………………………………………………………………………………55

Figură 17. Procentele de neuroni care au răspuns la diferiții stimuli………………………………56

Figură 18. 6 neuroni care prezintă răspunsuri la aplicarea agoniștilor specifici pentru TRPM8, TRPA1, respectiv TRPV1…………………………………………………………………………57

Figură 19. Evaluarea statistică a răspunsurilor la cei 3 agoniști…………………………………..58

Figură 20. Evaluarea influxului total de calciu prin cuantificarea ariilor de sub curbă pe parcursul fiecărui stimul…………………………………………………………………………………….59

Figură 21. Efectele aplicării ALA și PBG asupra nivelului de specii reactive de oxigen din DRG ……………………………………………………………………………………………………60