Bolile tiroidiene reprezintă cele mai frecvente afecțiuni ale patologiei endocrine și de aceea o atenție deosebită este acordată managementului… [305445]

PARTEA SPECIALA

SCOPUL SI OBIECTIVELE

Bolile tiroidiene reprezintă cele mai frecvente afecțiuni ale patologiei endocrine și de aceea o [anonimizat].(borda)

[anonimizat] , este grevat sub aspect patogenic atât de influențe de ordin endogen (dominate de factori genetici ) , cât și exogeni ( dominate de aportul de iod ).(borda)

Tumorile tiroidiene : gușa , [anonimizat] (de ordin primar sau secundar ) [anonimizat] , diagnostic și terapeutic.(borda)

Cele 2 clasificări expuse ( clasificarea OMS și clasificarea TNM-2002) [anonimizat] , [anonimizat].

Deși tumorile maligne tiroidiene nu dețin o [anonimizat].

[anonimizat] a Spitalului Județean de Urgență Brașov pe o perioadă de 5 ani.

Studiul dorește evaluarea completă a [anonimizat].

Obiectivele studiului

Evaluarea apariției bolii în raport cu sexul și vârsta pacienților;

Identificarea elementelor histopatologice care caracterizează diagnosticul tumorilor maligne.

[anonimizat].

Identificarea unui panel de anticorpi pentru diagnosticarea tumorilor maligne de tiroida și stabilirea fenotipala a tumorii.

II. MATERIAL ȘI METODA

TIPUL DE STUDIU

Am efectuat un studiu retrospectiv pe o perioadă de 5 ani , respectiv 01.01.2011 – 31.12.2015 , bazându-se pe datele obținute ca urmare a [anonimizat] 1.

Tabelul 1.

Pentru efectuarea studiului s-a [anonimizat]: [anonimizat], literatura de specialitate iar introducerea cazurilor în studiu s-a bazat pe diagnosticul de externare.

Lotul studiat a pus în evidență o [anonimizat] ,după cum este prezentat în tabelul numărul 2.

Tabelul 2.

[anonimizat] a pus în evidență următoarele date statistice după cum urmează în tabelul numărul 3.

Tabelul 3.

Pe baza datelor diagnostice furnizate de arhiva departamentului de anatomie patologică s-au înregistrat pe clase de afecțiuni benigne și maligne după cum urmeaza in tabelul numărul 4.

Tabelul 4

[anonimizat] s-au obținut următoarele date statistice după cum sunt evidențiate în tabelul numărul 5

.

Tabelul 5

Ultima coloana din tabelul numărul 5 aparține tipului de tumori maligne care și acestea pot fi clasificate în funcție de profilul tumorii , evidențiat prin analiza microscopică, pe baza tehnicilor histopatologice și fenotiparii prin examene imunohistochimice. Aceste diferențieri din cadrul studiului efectuat vor fi expuse mai departe în tabelul numărul 6 .

Tabelul 6.

PARTICULARITĂȚILE STUDIULUI

Primul obiectiv al studiului a fost evaluarea apariției bolii în funcție de sex și vârsta a pacienților cu afecțiuni tiroidiene .

Studiul a fost efectuat pe lotul de pacienți înregistrați în baza de date a departamentului de anatomie patologică a Spitalului Județean de Urgență Brașov . Introducerea în studiu a fost făcută absolut aleatorie , fiind în ordinea apariției cazurilor în secțiile de chirurgie .

Inițial am analizat structură pe sexe a lotului studiat ce au constituit grupul de studiu prezentat în figură 1.

Figura 1

După cum se observă din reprezentarea grafică persoanele cele mai afectate au fost cele de sex feminin.

Reprezentarea grafică a structurii pe grupe de vârsta a fost realizată în figură 2

.

Figura 2

Din reprezentarea grafică a structurii pe grupe de vârstă se evidențiază o creștere a afecțiunilor tiroidiene odată cu înaintarea în vârstă , vârful fiind cuprins în grupa de vârsta 51-60 de ani și o coborâre a diagramei în grupa de vârsta 71-80 de ani.

Din punctul de vedere al clasei tumorale reprezentarea grafică a lotului studiat în cei cinci ani se prezintă precum în figură 3.

Figura 3.

Se observă că din totalul cazurilor incluse în studiu pe parcursul celor 5 ani ponderea cea mai mare o au afecțiunile tumorale cu caracter benign.

Împărțirea pe tipuri de afecțiuni tiroidiene se reprezintă grafic precum în figura 4

Figura 4.

METODA DE LUCRU

Diagnosticul prezumtiv a fost elaborat de medicii specialiști endocrinologi pe baza anamnezei ,datelor clinice , imagistice si a analizelor de laborator , iar diagnosticul cert a fost stabilit in departamentul de anatomie patologică , in urma intervențiilor chirurgicale de tireodectomie totală sau subtotală.

Analizele de laborator furnizează date asupra secreției si concentrației hormonilor tiroidieni. Foliculii tiroidieni sintetizează 2 hormoni : triiodotironina , cunoscută și notată cu T3 , și tetraiodotironina care la rindul ei este cunoscută și notată cu T4. Secreția hormonilor tiroidieni este controlată de un hormon hipofizar și anume TSH ( Thyroid Stimulating Hormon ) și un hormon hipotalamic , fiind vorba de TRH ( Tirotropin Stimulating Hormon). T3 , T4 si TSH-ul actioneaza prin intermediul unor unor receptori specifici . TSH stimuleaza proliferarea tireocitelor.(borda).

Un alt hormon sintetizat de tiroidă este calcitonina , care este de fapt un antagonist al parathormonului. Acești 2 hormoni acționează impreună pentru menținerea unei concentrații normale a calciului in ser și in fluidele extracelulare. (borda).

Funcția glandei tiroide se poate stabili atât clinic prin evaluarea semnelor și simptomelor de hipotiroidism sau hipertiroidism dar și paraclinic prin testele de funcțtionalitate tiroidiana. Un set minim de analize pentru tiroida consă in dozarea TSH , T4 ( freeT4) si T3 ( freeT3). In sânge hormonii tiroidieni circulă legați de proteine transportoare (99%) si liberi (1%). Întrucât globulina de legare a tiroxinei ( TBG principala proteină de transport a T3 si T4 ) este supusă unor influențe endo- și exogene ( crește in sarcină și dupa administrarea de contracetive orale , scade in sidromul nefrotic antrenând aceleși variatii ale T3 și T4 plasmatic ) , forma libera a hormonilor ( fT3 și fT4) este mai fiabilă decât cea plasmatică. Dintre cei 2 hormoni T3 este sintetizat majoritar , aproximativ 80% in periferie , prin conversie din T4 ( ceea ce insemnă ca T4 reflectă mai mult activitatea secretorie a tiroidei , iar T3 efectul asupra țesuturilor periferice ) .T3 este mai activ decât T4 insă are un timp de injumătațire mai mic.

INTERPRETAREA ANALIZELOR PENTRU TIROIDĂ. VALORI NORMALE , SCĂZUTE ȘI CRESCUTE.

Pe baza acestor informații interpretarea testelor de funcționalitate tiroidiană se face astfel :

TSH normal , T3 si T4 normale = eutirodism

TSH normal , fT4 crescut = sindrom de rezistență la acțiunea hormonilor tiroidieni.

TSH scăzut , fT4 normal , T3 crescut = tireotoxicoza T3.

TSH scăzut , fT4 crescut = hipertiroidism clinic manifest.

TSH scăzut , fT4 normal = hipertiroidism subclinic.

TSH crecut/normal , fT4 crescut = hipertiroidism hipotalamo-hipofizar.

TSH crescut , fT4 scăzut = hipotiroidism clinic manifest.

TSH crescut , fT4 normal = hipotiroidism subclinic.

TSH scăzut/normal , fT4 scăzut = hipotiroidism hipotalamo-hipofizar.

Valorile normale ale probelor sunt :

TSH = 0,6 – 4,6 mU/L

T4 = 60 – 182 nmol/L

fT4 = 12 – 22 pmol/L

T3 = 1,2 – 3,2 nmol/L

fT3 = 4 – 6,7 pmol/L

In evaluarea afecțiunilor tiroidiene , dozarea TSH și a hormonilor tiroidieni trebuie completată și de testele de autoimunitate tiroidiană ( anticorpi anti-tireoperoxidază ATPO , anticorpi anti-tireoglobulina ATG , și anticorpi anti-receptor pentru TSH = Trab) ecografie tiroidiană , scintigrafie tiroidiană , radioiodocaptare sau puncție-biopsie.

MANAGEMENTUL ANATOMO-PATOLOGIC AL LEZIUNILOR TIROIDIENE

ETAPA PREOPERATORIE

Aceasta etapa cuprinde mai exact examenul citologic , care se execută in urma punției cu ac fin.

Examenul citologic are o deosebită importanța in conduita terapeutică a afecțiunilor tiroidiene prin prisma faptului că se poate realiza diagnosticul diferențial intre tumorile benigne si cele maligne.

Puncția cu ac fin

Este o manevra cu un grad invaziv mai scăzut decât puncția-biopsică și cu o importanță covârșitoare in managementul nodulilor tiroidieni , făcând trierea acestora din punctul de vedere al intervenției chirurgicale de extirpare totală sau parțială , respectiv tireodectomie totală sau subtotală.

Una din conditițiile fundamentale pentru un diagnostic citologic corect și cu un grad inalt de siguranță este munca in echipă : endocrinolog , citolog , radiolog. In această echipă trebuie să existe o colaborare perfectă și un schimb de informații cât mai amnunțit privind aspectul morfologic al regiunii examinate , starea funcțională și imunologică a individului cât și discutarea aspectelor scintigrafice și ecografice ale țestului examinat , in speță glanda tiroidă.(borda)

Punția cu ac fin este recomandată cu prelicție in cazul nodulilor tiroidieni palpabili , care au ca dimensiuni cel puțin 1 cm si deci pot fi depistați in cazul unui consult clinic.

Indicațiile puncției cu ac fin

cresterea bruscă in volum a nodulului.

nodul foarte dur la palpare sau foarte solid la examinarea ecografică.

răgușelă sau paralizie a corzilor vocale.

iradiere prealabilă a zonei gâtului.

Contraindicațiile puncției cu ac fin sunt aproape inexistente ,doar cazuri de pacienți necooperanți sau in cazul unor afecțiuni hematologice cu deficiențe de coagulare. Mai exact există riscul major a unor hemoragii , in cazul pacienților cu deficiențe de coagulare și de aceea este foarte importanta realizarea unei ecografii in urma puncției cu ac fin.

Complicatiile legate de puncția cu ac fin sunt nesemnificative raportat la importanța datelor ce le furnizează această investigație. Printre cele mai frecvente complicatii ar fi :

hemoragii locale , hematoame ( mai rar intâlnite ).

durerea locala dupa puncție.

infecția post-puncțională , in cazul nerespectării măsurilor de asepsie.

Consimțământul informat al pacientului , face parte din actul de etică medicală și nu trebuie niciodată omisă discuția directă cu pacientul care trebuie informat despre importanța actului medical si complicațiile și pericolele la care este expus. Este de preferat ca acest consimțământ sa fie semnat de către pacient pentru a a vea si o valoare din punct de vedere juridic.

Exista o asociație medicala americana denumită pe scurt AMA , care recomandă ca formularele de consimțământ să fie cât mai complexe care să cuprindă cât mai multe date referitoare la : diagnosticul pacientului , beneficiile intervenției cât și riscurile la care este expus și totodată riscurile refuzului interventiei respective.

Informatii ce trebuie sa insoțească intotdeauna un eșantion , probă de laborator :

nume si prenume pacient , CNP , dată recoltare , unitatea unde s-a recoltat.

diagnosticul prezumtiv

localizarea nodulului impreuna cu date imagistice legate de marimea formatiunii nodulare.

antecedente de hipotiroidite , tiroidite autoimune , boală Basedow Graves.

antecedente de iradieri externe.

antecedente de cancer.

antecedente heredocolaterale de cancer tiroidian

rezultatele analizelor de laboarator efectuate , in special nivelul TSH-ului seric.

tratamente anterioare.

Tehnica puncției cu ac fin

Pentru a obține un preparat cu o importanță deosebită in stabilirea unui diagnostic citologic , manevra trebuie executată de personal calificat si cu destulă experienta atât in palparea nodulilor cât si a efectuării propriuzi-se a puncției tiroidiene.

Punctia cu ac fin se poate realiza prin metoda directă sau prin metoda echoghidată , cea din urmă având o acuratețe net superioară .

Imaginea 1 – Tehnica citopuncției

”Ghid de diagnostic in patologia endocrină” – Angela Borda , Nicole Berger – pag. 199

Metoda directă

Această metodă este specifică nodulilor tiroidieni cu posibiliatea de palpare crescută si se realizează in repaus de deglutiție. Poziția pacientului poate fi in decubit ventral sau decubit dorsal cu gâtul in superextensie , această poziție fiind propice pentru nodulii localizați retrosternal.

Se folosesc ace de seringa de 0,4 mm( 27G), 0,5 mm( 25G ) ,0,6 mm ( 23G ) , acestea fiind putin invazive și in general foarte bine tolerate de pacienți.

Materiale folosite la puncția cu ac fin sunt expuse in imaginile de mai jos.

Imaginea 2 – Ace si pistol pentru puncție

http://www.orvosok.hu/orvosiszotar/biopszia–biopsia-84

Imaginea 3 – Pistol Cameco cu seringă atașată

Aspirációs Citológia

Nodulul se puncționează inițial cu acul liber, după identificare și imobilizare intre doua degete ,ca in imaginea de mai sus , iar mai apoi se atașează pistolul Cameco.

Se aspiră ușor de câteva ori pâna la apariția primei picături de preparat ( sânge sau serozitate ). Folosirea portacului ușurează efectuarea manevrei , permițând si aspirarea unui conținut de consistența crescută ( coloid ). Puncționarea unui nodul se realizează de câteva ori , de la 2 până la 4 ori , iar după unii specialiști chiar pâna la 9 ori. Oricum cert este faptul că , cu cât se efectuează mai multe puncții cu atât se reduce riscul de rezultate fals negative sau de eșantioane neconforme insă și cu riscul mai ridicat de apariție a unor hemoragii.

După extragerea acului se comprimă locul puncției aproximativ 1 minut iar pentru evitarea complicațiilor hemoragice pacientul va ramâne in decubit dorsal timp de 15 minute.

Metoda echoghidată

Este o manevra mai precisă , asigură o acuratețe si un risc mult mai scăzut decât metoda directă.

Metoda echoghidată are indicație in cazul nodulilor profunzi , nepalpabili sau situați posterior , nodulilor mixști cu o componentă solidă si una lichidă iar puncția părții solide este imperios necesară.

Interveția poate fi executată de una sau două persoane, una care ține sonda echografică si cealaltă puncționează sau cea care execută puncția ghidează și sonda ecografică așa cum este prezentat in imaginea 4.

Imaginea 4 – Puncție echoghidată

Agobiopsia tiroidea ecoguidata

Prelucrarea materialului

Materialul obținut prin mișcarea de aspirație , se expulzează din acul seringii printr-o miscare ușoară pe suportul frotiului , mai exact lame de sticlă pentru microscop și va fi etalat imediat.

Imaginea 5 – Lame de sticlă pentru microscop

Calitatea eșantionului se poate aprecia macroscopic din punctul de vedere al culorii , vîscozității , abundenței.

Fixarea frotiului se va alege in funcție de colorația ce urmează a fi efectuată . Fixare la aer pentru colorația May-Grunwald-Giemsa si alcool 95% pentru colorații Papanicolau sau Hematoxilină-Eozină.

Eșantioanele de consistență lichidiană se centrifughează mai intâi la o viteză de 1000-1500 rot/min timp de 10 min. iar mai apoi din sediment se execută frotiul.

Imaginea 6 – Centrifugă

Protocolul execuției citologiilor este :

– Frotiu gata intins :1.Uscare

2.Fixare-alcool etilic 96 sau alcool metilic

3.Uscare

4.Colorare Giemsa, HE, Papanicolaou

– Recipient cu produs patologic:1.Centrifugare

2.Intindere frotiuri

3.Uscare

4.Fixare-alcool etilic 96 sau alcool metilic

5.Uscare

6.Colorare Giemsa, HE

Colorații: se pot folosi reactivi preparați din pulberi sau kit-uri gata preparate. Timpii și concentrațiile menționate în rețete sunt orientative și se adaptează în funcție de condițiile locale (temperatură ambientală, duritatea și pH-ul apei de robinet etc). Colorația este considerată corectă dacă se obțin rezultatele preconizate.

După sedimentare și execuția frotiului lamele colorate au aspectul ca in imaginea 7

Imaginea 7 – Colorație Papanicolau

Din sedimentul obținut se pot executa si blocuri de parafină , adică sedimentul este prelucrat și inclus in bloc de parafină . Această operațiune se folosește atunci când se doresc și investigații suplimentare, cum ar fi investigații imunohistochimice.

Interpretarea unui frotiu citologic tiroidian necesită experiență din partea patologului care va trebui să aibă in vedere unele aspecte cum ar fi :

background-ul frotiului.

densitatea celulară

modul de grupare si specificitatea morfologică a celulelor epiteliale.

Pe lîngă pucția cu ac fin , din etapa preoperatorie mai fac parte și alte investigații, cum ar fi puncția biopsică. Puncția biopsică și pregătirea preparatului o voi prezenta in etapa postoperatorie intrucât tehnica este aceeași.

ETAPA INTRAOPERATORIE

Această etapă se referă strict la examenul intraoperator și anume examenul extemporaneu.

Examenul extemporaneu

Examenul extemporaneu este o investigație care in zilele noastre este folosită din ce in ce mai puțin tocmai datorită dezvoltării tot mai mult a tehnicii puncției cu ac fin și a citologiei.

Este o investigație mai laborioasa care necesită anestezie și se practică numai in cazuri de diagnostic incert sau in cazul unei citologii neconcludente.

Datele minime ce ar trebui să insoțească examenul extemporaneu sunt :

date clinice – vârstă, sex, date de laborator

rezultatul puncției cu ac fin.

preparatul ( piesa de analizat ) care trebuie să fie intreg, nesecționat.

Tehnica examenului extemporaneu

Examenul macroscopic si palparea piesei operatorii ajută anatomo-patologul la identificarea și localizarea leziunii iar prelevarea fragmentului pentru prelucrat se va face printr-o singură secționare in axul cel mai lung. O condiție esențială este ca fragmentul prelevat să conțină o parte din capsulă leziunii ( nodulului ) și o parte din țesut sănatos.

Etapele protocolului examenului extemporaneu sunt:

1. Se verifică documentele de insoțire a fragmentului tisular și fragmentul tisular similar protocolului de lucru pentru prelucrare histopatologică. În plus se verifică dacă fragmentul tisular este de dimensiuni suficiente examenului extemporaneu.

2. se înregistrează cazul intr-o condică dedicată examenelor de prelucrare la gheață.

3. se orientează macroscopic piesa; se dimensionează si se descrie fragmentul tisular; se prelevează fragmente tisulare pentru examenul extemporaneu.

4. se congelează fragmentului tisular – se montează fragmentul tisular pe suportul metalic și se îngheață în cryostat la temperatură sub minus 27C până devine perfect opac.

5. se secționează la criomicrotom – se niveleaza blocul tisular înghețat, efectuandu-se secțiuni la 2-10μ

6. Secțiunile obținute se etalează pe lame de sticlă cu ajutorul unui port-ac sau direct cu ajutorul plăcuței anti-rol.

7. Lamele cu material histopatologic secționat la gheață se coloreaza cu hematoxilină-eozină sau soluție de albastru de toluidina (colorații uzuale) sau Scharlach (colorație specială pentru lipide).

8. Se montează în apă, glicerină sau medii de montare solubile în solvenți organici.

POZA CU LAMA EXTEMP.

Complementar acestui procedeu , de secționare la microtomul de gheață , se mai practică și amprentarea fragmentului inainte de congelare , datorită faptului că prin refigerare se alterează detaliile nucleare , in special la carcinoamele papilare. Amprentarea se face deci din fragmentul proaspăt , pe lame de microscop , după care materialul depus pe lamă urmează protocolul colorației citologice.

Microtomul de gheață ( cryostatul ) este prezentat in imaginea 8

Imaginea 8 – Cryostat al laboratorului de anatomie-patologică al Spitalului de urgență Brașov

Elaborarea diagnosticului se va face de către anatomo-patolog după citirea la microscop a lamelor , acesta având trei posibilități : leziune benignă , leziune malignă sau se va aștepta rezultatul final după prelucrarea la parafină . In acest ultim caz se ajunge atunci cand imaginea de pe lamă nu este concludentă .

In patologia tiroidiană examenul extemporaneu nu are o mare sensibilitate ( intre 64-78 % ), dar are o mare specificitate ( 99-100 % ). Rezultatele fals negative și cazurile cu diagnostic amânat reprezintă, după studiile publicate in literatură intre 2,7 și 43 %. Se poate estima ca 15 pînă la 25 % din cancerele tiroidiene nu sunt detectate prin examen preoperator. ( borda )

ETAPA POSTOPERATORIE

Este etapa cea mai reprezentativă din punct de vedere histopatologic , datorită faptului ca in această etapă au loc toate transformările suferite de preparatele prelevate in vederea obținerii unui produs final de cea mai bună calitate și conform calității produsului final va fi și precizia diagnosticului pentru că nu se poate elabora un răspuns anatomo-patologic fără o calitate inaltă a produsului final , in speță lama ce va fi vizualizată la microscop.

In această etapă piesa operatorie va parcurge intregul circuit al laboratorului de anatomie-patologică de la camera de primire probe pînă la eliberarea rezultatului.

Camera de primire probe este prezentată in imaginea 9

Imaginea 9 – Camera de primiri probe a Spitalului Județean de Urgențe Brașov

Principiul tehnicii histopatologice impune transformarea unui prelevat dintr-un organ sau țesut dintr-o masă tisulară opacă într-un preparat fin, translucid care permite vizualizarea microscopică a detaliilor structurale tisulare. Pentru a realiza aceasta prelevatul suferă transformări succesive.

Datele necesare obligatorii ce vor insoți piesa operatorie sunt :

se verifică dacă pe fișa de insoțire sunt trecute corect numele si prenumele pacientului, vârsta, numarul foii de observație, secția care solicită examenul histopatologic, diagnosticul clinic prezumptiv, denumirea materialului bioptic trimis, data recoltării, fixatorul utilizat, semnătura si parafa medicului care solicita diagnosticul histopatologic, numele si semnătura celui care a adus materialul bioptic/citologic.

verificarea materialului bioptic. Se va verifica dacă materialul bioptic/citologic este in recipient. Se va verifica dacă materialul bioptic este adus fixat (in formol sau altă substanță fixatoare) sau este proaspat. Se va verifica dacă din punct de vedere calitativ materialul bioptic/citologic nu este corespunzator (dimensiuni foarte mici și/sau cu arii intinse de necroză).Se va verifica concordanța ei documentelor de insotire a materialului bioptic – recipient material bioptic.

Inregistrare – acordarea de număr/caz; unui caz se poate acorda unul sau mai multe numere; dacă unui caz i se acordă un singur număr și în cursul orientării macroscopice se recoltează mai multe fragmente, acestea vor fi etichetate individual cu numere sau litere suplimentare (de exemplu număr caz 1000 din care se prelevează 3 fragmente cu numărul 1000/1, 1000/2 și 1000/3 sau 1000/A, 1000/B și 1000/C)sau 1001,1002,1003,etc; înregistrarea cazului se poate face înainte sau în cursul orientării macroscopice , insă deobicei se efectuează după prelevare pentru o evidențiere precisă a numărului de blocuri pentru fiecare caz in parte ( Ordinul 1217/2010 ).

Exemplul de etichetare a fiecărei casete (bloc de parafină ) in parte este prezentat in imaginea 10 și imaginea11

Imaginea 10 – Casete pentru fragmente bioptice prelevate folosite de către Spitalul Județean de Urgență

Brașov

Imaginea 11 – Casete de includere a fragmentelor prelevate

Una din cele mai importante etape ale procesului histopatologic este fixarea , care trebuie sa se producă cat mai repede posibil după prelevarea țesutului, operațiune efectuată de către medicul ce recoltează țesutul ori de către anatomopatolog.

Fixarea materialului prelevat trebuie să indeplinească anumite condiții și anume :

să nu producă contracția materialului.

să nu producă modificări structurale ( tumefieri )

să nu producă intărirea țesuturilor

Fixarea are scop stabilizarea propietăților țesuturilor in vederea procesării și depinde de o serie de factori cum ar fi :

scopul examinării microscopice

volumul piesei

tipul colorațiilor ce vor urma a fi efectuate ( POSDRU)

Proprietățile fixatorilor

Pentru ca o substanță să poată fi folosită ca fixator terbuie să indeplinească o serie de proprietăți ce țin de structura chimică, concentrație, ph, temperatură, presiune osmotică și nu in ultimul rînd trebuie să aiba o durată de timp cât mai scurtă.

Soluțiile fixatoare trebuie să aibă o presiune osmotică mare, pentru a putea pătrunde in țesuturi. Soluțiile izotone nu fixează iar soluțiile hipertone și hipotone produc modificări structurale ( intărirea și tumefierea pieselor).

Concentrația electrolitică optimă trebuie să fie de 2 – 4 ori mai mare decât a sângelui.

Ph-ul soluțiilor fixatoare trebuie să fie acid , in jur de 4.

O altă calitate a soluției fixatoare este temperatura la care se realizează fixarea. Difuzibilitatea moleculelor crește odată cu creșterea temperaturii, de exemplu rata de penetrare a unui țesut de către formaldehidă este mai rapidă la temperatură ridicată.(posdru)

Durata fixării, este o altă proprietate a soluției fixatoare , deosebit de importantă și este dependentă de tipul fixatorului, de exemplu 24 de ore pentru formaldehidă și 3 ore pentru fixatorul Carnoy. Fixarea nu este un proces chimic rapid,de moment, ci progresiv, porțiunile profunde ale pieselor fixându-se mai târziu, mai lent, mai ales dacă piesa operatorie este mai voluminoasă. In cazul pieselor voluminoase, se practică etalarea porțiunilor importante ce urmează a fi prelucrate și astfel este asigurată fixarea corectă pe intreaga suprafață a fragmentului.

Penetrabilitatea depinde atât de compoziția chimică cât și de de structura țesutului care urmează să fie fixat; țesuturile parenchimatoase sunt penetrate mai rapid decât decât cele conjunctive. (Raica și colab.1997;Burnette și Crocker,2005)

O fixare corectă intr-o soluție de formol in amestec cu bicromat pe timp de 24 de ore va rezulta o colorare foarte evidentă a nucleilor in timp ce o fixare prelungită, pînă la câteva zile va duce la modificări profunde ale structurii țesutului in ce privește bazofilia nucleară și va permite colorarea unor lipide și mitocondrii.

Orice soluție fixatoare are avantaje și dezavantaje , reprezentate de dispariția unor structuri moleculare, întăriri și tumefieri ale țesuturilor in cursul procesării, deficiențe de colorare histochimice și imunohistochimice.

Dezavantajul major al unui reactiv fixator constă in impactul extraordinar asupra organismului uman. De exemplu formaldehida este o substanță deosebit de toxică, riscurile folosirii de către personalul din laboratoarele de anatomie patologică fiind stabilite cert, atât din punctul de vedere al unei substanțe toxice cât și al efectului carcinogen.

TIPURI DE FIXATORI

Soluțiile fixatoare se impart in:

fixatori simpli

fixatori compuși

Fixatorii simpli sunt soluții in compoziția cărora nu mai intră in amestec și alt reactiv,de exemplu formaldehida, metanolul, acidul acetic glacial.

Fixatorii compuși sunt acele soluții in compoziția cărora intră și alți aditivi sau compuși complementari, cum ar fi fixatorul Carnoy – etanol+cloroform+acid acetic.

Cel mai uzual fixator simplu, care indeplinește o mare parte din cerințele histopatologice este formaldehida (formolul) care se gasește in concentrație de 38 – 40 % și se pastrează la temperaturi de peste 9*C datorită faptului că la temperaturi mai joase precipită iar calitătile fixatoare scad, și in concentrație de 10 % și un ph = 7 considerat cel mai util in histopatologie și chiar și in biologie moleculară.

In cazul unor guși voluminoase se pot executa incizii pentru a ajuta penetrarea fixatorului in structurile profunde.

PRELEVAREA/ORIENTAREA PIESELOR

Este o etapă din protocolul histopatologic ce implică o mare răspundere și necesită experiență din partea personalului ce execută această operațiune. Piesele primite in laboratorul de anatomie patologică pot avea diverse proveniențe, cum ar fi :

citologii

biopsii

piese operatorii

fragmente tisulare rezultate in urma necropsiilor.

Pentru fiecare intervenție operatorie există un protocol de orientare. In cazul tireodectomiilor pațiale sau totale o importanță majoră îl constituie examenul macroscopic, ce implică și determinarea greutății totale a piesei, un aspect deosebit de important in cazul chirurgiei de reducție a bolii Basedow.

Se notifică fiecare aspect particular al piesei operatorii, exterior boselat, hipervascularizat, marcaje cu fir al fiecărui lob, evetuala prezență a glandelor paratiroide și a prezenței limfonodulilor.

Imaginea 12 – Glandă tiroidă pregătită pentru orientare in departamentul de anatomie

patologică a Spitalului Județean de Urgență Brașov

Modul de secționare a pieselor de tireodectomie se realizează in totalitate pentru fiecare lob in parte, in secțiuni de 3-5 mm grosime. Feliile secționate trebuie detașate unele de altele pentru a se putea vizualiza și determina toate dimensiunile si structurile particulare ale tumorilor,cum ar fi depășirea capsulei și invadarea in profunzimea țesuturilor.

Imaginea 13 – Secțiuni de 3 – 5 mm ale unei glande tiroide

Numărul de secțiuni prelevate este dependent de aspectul macroscopic și datele colaterale ale cazului. In contextul unei hiperplazii sau al unei guși eterogene numărul secțiunilor va fi redus , 3-5 fragmente din fiecare lob – 1/3 superioară, 1/3 inferioară și partea centrală ( istmul ). Se va preciza localizarea fiecărui fragment in parte și se vor efectua secțiuni multiple , prelevându-se chiar tot fragmentul dacă leziunea o impune.

Limfonodulii ( ganglionii ) se vor preleva separat și se va nota numărul total de ganglioni gasiți pentru evaluarea stadiului de invazie tumorală.

PROCESAREA PIESELOR

Procesarea pieselor reprezintă totalitatea modificărilor suferite de fragmentele prelevate pînă să ajungă la stadiul de bloc. Adică fragmentul tisular va fi inglobat intr-o masă compactă de parafină.

Imaginea 14 – Blocuri de parafină ( arhivă personală )

Protocolul de procesare a piselor prelevate este urmatorul :

fixare

deshidratare

clarificare

impregnare cu parafină

includere

secționare

colorare

montare

Procesarea actuală se execută pe aparate speciale automate numite histoprocesoare.

Imaginea 15 – Histoprocesor al Spitalului de Urgență Brașov

Fixarea se realizează in cadrul protocolului de funcționare a histoprocesorului, cu formol de o concentrație mai scăzută, 5% pe o perioadă de timp stabilită in programul aparatului.

Deshidratarea este procesul prin care apa este îndepărtată din țesuturi. Deshidratarea se face deobicei cu alcool și se realizează treptat, progresiv începând cu concentrații de 70* > 80*> 90*>100* . In urma deshidratării volumul piesei se reduce cu aproximativ 5-10 % .

Clarificarea este etapa prin care sunt inlocuiți alcoolii cu reactivi miscibili cu parafina reprezentați de toluen , xilen sau benzen. Denumirea acestei etape se explică prin faptul că solvenții pătrund in structurile profunde ale piesei conferindu-i un aspect translucid. De fapt acest aspect ne și dovedește când clarificarea s-a terminat.

Impregnarea cu parafină este etapa prin care piesele sunt pătrunse de parafină, pregătind astfel pasul următor, includerea.

Includerea este etapa prin care piesele sunt inglobate in blocuri de parafină cu ajutorul unor matrițe sau molduri.

Imaginea 16 – Mold pentru includere la parafină

Includerea propriuzisă se realizează cu ajutorul unei stații de includere care are in componență o cuvă care menține parafina la temperatură constantă.

Imaginea 17 – Stație de includere ( arhivă personală )

Rezultatul final al intregului proces este obținerea de secțiuni fine de 2- 4 microni din piesele incluse in parafină, care vor fi etalate pe lame de sticlă și pregătite pentru colorare.

Parafina este cel mai folosit mediu de includere datorită faptului că prezintă multe avantaje. Are punctul de topire destul de ridicat 54 -58* C și din punct de vedere material are costuri de achiziții mici. Impregnează țesuturile in profunzime formând un bloc compact perevenind torsionarea fragmentului in timpul secționării.

Secționarea se realizează cu ajutorul unor dispozitve numite microtoame. Microtoamele sunt de mai multe tipuri, in funcție de mediul de includere și tipul piesei. Așadar există microtoame cu mișcare verticală pentru parafină, microtoame cu mișcare orizontală pentru celoidină, microtoame de gheață (cryostate) pentru examene extemporaneu sau macrotoame pentru secțiuni foarte mari.

Imaginea 18 – Microtom cu mișcare verticală pentru parafină (arhivă personală)

Pentru obținerea de secțiuni fine, subțiri fără artefacte trebuiesc indeplinite anumite condiții:

îndepărtarea excesului de parafină (fasonarea blocului)

răcirea blocului de parafină – dacă blocul de parafină este răcit se obțin secțiuni subțiri

grosimea secțiunilor – pentru fasonarea blocurilor se vor utiliza vize de pătrundere in bloc mai mari,de 10-20 de microni, in schimb pentru secțiuni fine viza trebuie să fie cât mai mică, de 2-4 microni.

Secțiunile astfel obținute pentru a putea fi etalate pe lama de sticlă vor fi așezate cu grijă intr-o baie de flotație de unde vor fi intinse pe lamă cu ajutorul unui port ac sau tehnicienii cu experiență o fac in mod direct.

Imaginea 19 – Baie de flotație cu etalarea secțiunii pe lamă (arhivă personală)

Colorarea este etapa prin care materialul secționat și etalat pe lama de sticlă va trece printr-un proces de colorare care are ca scop punerea in evidență a diverselor structuri histologice in diverse culori.

Coloranții se pot extrage din pulberi sau sunt deja inglobați in cadrul unor kit-uri.

Coloranții de bază in anatomia patologică sunt Hematoxilina și Eozina.

Hematoxilina care se extrage din tulpina arborelui de băcan , se obține pulbere care se amestecă cu un mordant. In cazul hematoxilinei se folosește aluminiul și se obține soluția de hemalaun care colorează nucleii in rosu, culoarea fiind convertită in albastru-negru prin spalarea secțiunii in soluție slab alcalină. Soluțiile folosite pentru virarea culorii sunt apa de robinet, carbonatul saturat de litiu sau hidroxidul de amoniu în alcool.

Eozina este un colorant sintetic , cu un ph acid, derivat din fluoresceină. Fiind un colorant acid interacționează cu substraturile acidofile din țesuturi rezultînd colorații de la roz pal la roșu.

Există o multitudine de tipuri de colorații fiecare din ele având o specificitate aparte in funcție de organul studiat sau structura histologică.

Cea mai uzuală colorație , folosită peste tot in lume este colorația Hematoxilină – Eozină , care va pune in evidență nucleii colorați in albastru și citoplasma in roșu – roz. Colorațiile speciale ce sunt specifice glandei tiroide sunt colorația Roșu de Congo și colorația PAS.

Colorația Hematoxilină – Eozină

Trebuiesc parcurși o serie de timpi pentru realizarea colorației și anume :

deparafinarea secțiunilor de pe lame cu toluen , benzen sau xilen in 2-3 băi succesive.

hidratarea – se face la fel in băi succesive de alcool cu concentrații descendente de la 99* la 70* și mai apoi in apă.

colorarea cu Hematoxilină

spălare in apă de robinet sau in Carbonat de Litiu pentru virarea culorii in albastru

colorare cu Eozină

spălare cu apă de robinet

deshidratare in băi succesive de alcool, de la 70* la 99*.

clarificare in 2-3 băi succesive de toluen , benzen sau xilen.

montare – fixarea unei lamele foarte subțiri peste secțiunea colorată cu ajutorul unui adeziv (balsam).

Imaginea 20 – Colorație Hematoxilină – Eozină

http://www.scritub.com/medicina/ASPECTE-HISTOPATOLOGICE-IN-CAR93168.php

Colorația Roșu de Congo

Cu ajutorul acestei colorații se pune in evidență prezența amiloidului in preparatul histologic.

Timpii acestei colorații sunt:

deparafinare

hidratare

spălare

colorare cu soluție Roșu de Congo 0,5% – 10-30 minute

spălare în apă distilată

diferențiere în soluție KOH/ NaOH 0,2%

spălare apă distilată

hematoxilină – 2-5 minute

spălare

contrastare în soluție suprasaturată de Li2CO3

spălare

deshidratare

clarificare

montare

Rezultate – nucleii sunt colorați in albastru iar amiloidul in roșu-cărămiziu.La vizualizare cu ajutorul unui microscop cu fluorescență amiloidul apare in verde fosforescent.

Imaginea 21 – Colorație Roșu-Congo in tiroidită autoimună Hashimoto

http://www.epathology.ro/patologie-sistemica/patologia-glandelor-endocrine/tiroida.html

Colorația PAS

Colorația PAS pune in evidență prezența mucopolizaharidelor și a glicogenului din țesuturi. Preparatul colorat PAS are nucleii colorați in albastru sau negru-albăstrui și restul structurilor ce ne interesează in roșu magenta.

Timpii de xecuție sunt:

deparafinare

hidratare

apă distilată

oxidare cu acid periodic 0,5-1% – 5 -10minute

apă distilată

reactiv Schiff – 5-15 minute

apă robinet – 10 minute

hematoxilină Mayer – 2-5 minute

apă robinet

contrastare în solutie saturata de Li2CO3

apă robinet

deshidratare

clarificare

montare

Imaginea 21 – Colorație PAS

(http://www.epathology.ro/lucrari-practice/tehnologie-si-coloratii/preparatul-microscopic-permanent.html)

Complementar tehnicilor histopatologice, colorația HE și colorațiile speciale, se execută și tehnici de imunohistochimie. Aceste teste imunohistochimice sunt metode ce combină testele histologice cu cele de imunologie, având la bază reacții antigen-anticorp.Reacțiile antigen-anticorp sunt puse in evidență prin intermediul unei substanțe cromogenice numită DAB.Au loc la nivel tisular și se urmărește evidențierea unui antigen (Ag) specific. Antigenii au specificitate pentru fiecare tip de țesut in parte și deci și tumorilor care provin tot din aceleași țesuturi.Antigenii pot fi depistați cu ajutorul unor anticorpi ( Ac ) obținuți fie pe culturi celulare fie prin imunizarea unor animale care deobicei sunt șoareci albi sau iepuri.aceștia din urmă fiind preferați datorită cantității mai mari de anticorp ce poate fi recoltată.

Un Ag conține mai multe molecule prin care se leagă anticorpii, denumită epitopi. Fiecare anticorp in parte are o specificitate pentru un epitop.

In patologia tiroidiană sunt folosiți o serie de anticorpi, ce se mai numesc și markeri tumorali, specifici acestui tip de țesut care confirmă originea celulelor din tumorile tiroidiene mai ales in cazul proceselor infiltrative și de limfoproliferare.

Principalii markeri tumorali utilizați in patologia tiroidiană sunt: TTF1 ( Thyroid Transcription Factor 1 ), TG (Tiroglobulina ), CT ( Calcitonina ), CG ( Chromogranina ), CK19 ( Citokeratina 19 ), HBME-1 ( Hector Batifora Cell Marker 1).

In tehnicile IHC se utilizează mai multe metode de punere in evidență a reacției antigen-anticorp și anume :

metoda directă

metoda indirectă

metode speciale

Metoda directă – este prima metodă folosită in IHC, și care utilizează un anticorp marcat cu o substanță fluorescentă sau o enzimă. Această tehnică este mai simpă insă are dezavantajul că are o specificitate redusă.

Metoda indirectă – mai este numită si tehnica sandwich pentru că este compusă din două sau mai multe etape. In cadrul acestei metode intră mai multe tehnici, fiecare având avantajele și dezavantajele ei. Cele mai importante tehnici sunt:

tehnica indirectă in două etape

tehnica indirectă in trei etape

metoda complexului avidină-biotină

metoda EPOS

metoda imunoaur-argint

metoda envision

metoda complexului avidină-biotină marcată.

Cea mai utilizată tehnică, care are o sensibilitate foarte mare și un timp de execuție redus este metoda complexului avidină-biotină, denumită și metoda ABC, folosită și in cadrul laboratorul Spitalului de Urgență Brașov.

TEHNICA IHC . METODA ABC

Deparafinare și hidratare:

Deparafinare in 3 băi de toluen ( 3×10 minute ) – 30`

Hidratare : – 2 băi de alcool etilic absolut ( 2 X 10 minute ) – 20`

– alcool etilic de 96* ( 1 X 10 minute ) – 10`

– alcool 700 ( 1 X 10 minute ) – 10`

Pretatarea lamelor

Pretatarea lamelor se face conform indicațiilor din prospect, fierbere la baia termostatată sau MW ( microunde ) in tampoane de fierbere cu ph diferit.

inhibare cu H2O2 – 3% ( 20 de minute ) – 20`

tratament enzimatic ( 2 minute ) – dacă este necesar

apă distilată ( 2X 10 minute ) – 20`

PBS ( 2 X 10 minute ) – 20`

incubare cu ser normal de animal ( 20 de minute ) – 20`

Incubare cu anticorp primar

Se face la temperatura camerei timp de o oră sau peste noapte.

– PBS 2 X 10 minute – 20`

Incubare cu anticorp secundar ( 30 de minute )

PBS ( 2 X 10 minute ) – 20`

5 . Streptavidina – 30 de minute

In loc de anticorpul secundar și streptavidină se poate face incubare cu polimer timp de 30 de minute

spălare cu apă de robinet.

6. DAB

Prepararea DAB – cromogen + substrat buffer , incubare 5 – 30 minute

spălare cu apă de robinet

7. Colorare HE ( hematoxilină cu cloral pentru IHC ).

spălare cu apă de robinet

8. Contracolorare cu carbonat de Litiu timp de 1 minut.

spălare cu apă de robinet.

9. Deshidratare și clarificare

– alcool etilic 700 ( 10 minute )

– alcool etilic 960 (10 minute )

– alcool absolut ( 2 X 10 minute )

– toluen ( 3 X 10 minute ).