Lista abrevierilor [305373]

Cuprins

Lista abrevierilor

ADN Acid dezoxiribonucleic

AJCC American Joint Committee on Cancer

AKT Protein kinaza B

APC Adenomatous polyposis coli gene

ATP Adenozin trifosfat

B2A Receptorii beta 2 [anonimizat] 3’,5’ adenil monofosfat ciclic

CCR Cancer colorectal

CKIα/ε Casein kinaza I α/ε

COX-2 Ciclooxigenaza-2

CREB/ATF cAMP Response Element Binding Protein/Activating Transcription Factor

DAB 3,3’-[anonimizat] a [anonimizat] – [anonimizat] a [anonimizat] a submucoasei

GABA Acidul γ-animo butiric

GH growth hormone

GSK3β Kinaza glicogen sintaza 3β

HB-[anonimizat]-polyposis colorectal cancer/ [anonimizat]-1 insulin-like growth factor

IOD Integrated optical density

K-ras v-Ki-ras2, [anonimizat]

M3R Receptorii m 3 [anonimizat] – kinaza activata de factori mitogeni

MDR1 Multidrug resistance 1

MMP7 Matrix metalloproteinase-7

MMR mismatch repair genes

MSI Microsatellite Instability/[anonimizat]-[anonimizat] B

NGF Nerve growth factor

NT-3 Neurotrophin-3

NT-4/5 Neurotrophin-4/5

PAF Polipoza adenomatoasă familială

PBS Phosphate buffered saline solution

PI3K Fosfoinozitid 3-kinaza

PKA Protein kinaza A

[anonimizat]-albastru – Red Green Blue

ROI Regions of interest

SNE Sistemul nervos enteric

TCF T-[anonimizat] T

TrkA Receptorii pentru neurotrofine

UICC Union Internationale Contre Le Cancer/ [anonimizat] o neoplazie des intalnită a cărei incidență și prevalență se gasește pe o direcție progresivă la nivel mondial. Ca prevalență se află pe locul doi la sexul masculin după cancerul de prostată și pe al treilea loc în rândul populatiei feminine după cancerul de sân și corp uterin [1], supraviețuirea prin tipul acesta de neoplasm fiind diferită la treapta globală de la o [anonimizat] o [anonimizat], [anonimizat].

Această lucrare dorește sa realizeze o examinare descriptivă a [anonimizat], cercetând expresia receptorilor beta 2 adrenergici la nivelul țesutului neoplazic cât și în țesutul sanatos periturmoral. Atât microclimatul tumoral dar și componenții săi joacă un rol foarte de important în producerea neoplaziei colorectală cât și în evoluția tumorală.

[anonimizat] o parte, neoplasmul colorectal tinde să rămână una din cele mai importante neoplazii atât ca incidență ,morbiditate cât și mortalitate la nivelul populației de pe glob, iar pe de altă parte, recent se dorește a se înlocui modelul tradițional de maladie cu modelul de maladie biopsihosocială ce dispune o abordare mai complicată atât a determinismului fiziopatologic al maladiilor dar și a deciziilor de diagnostic și tratament. Interdependențele dintre celulele maligne, cele ale endoteliului vascular, matrixul extracelular, componentele sistemului imun cât și alte elemente, au profitat de un număr mare de studii extinse în ultimii ani pentru implementarea de noi procedee de terapie țintită molecular (ex: tratamentele antiangiogenice). În pofida acestui fapt, sistemele ce sunt incriminate în patogenia și extinderea neoplasmului colorectal se gasesc și la această oră departe de a fi deslușite în întregime.

Noțiunea de a realiza legături între influențele psihologice și neoplasm nu reprezintă o noțiune nouă, ea circulă de peste două mii de ani și îi revine lui Galen, care a constatat că femeile cu fire melancolică dezvoltau cancer mamar într-o proporție superioară altor tipuri temperamentale .

Acestă cercetare este împarțită în două mari părți. Partea cea dintâi am studiat literatura de specialitate în ceea ce privește, în special, factorii cu risc pentru dezvoltarea neoplasmului colorectal, mecanismele fundamentale incriminate în cancerogeneza colorectală, mijloace de semnalizare intracelulară incriminate si ele în carcinogeneza colorectală, cât și unele informații cu privire la anumiți receptori pentru neurotransmițători, cum sunt receptorii B2A pentru catecolamine.

În partea secundă am efectuat cercetarea propriu-zisă, în care am evaluat expresia receptorilor beta 2 adrenergici în țesutul tumoral și peritumoral din adenocarcinomul colorectal. Am produs de asemnea legături între trăsăturile clinicopatologie și concluziile obținute după finalizarea acestui studiu, ca într-un sfarsit să închei lucrarea de față cu discuții și concluzii.

Pe această cale doresc să aduc deosebite mulțumiri conducătorului științific al lucrării mele de licență, domnului Profesor Universitar Doctor Cristin Constantin Vere si îndrumătorului, domnului Asistent Universitar Doctor Georgică Târtea pentru îndrumarea excepțională și sprijinul acordat în vederea realizării acestei lucrări de licență.

De asemenea, doresc să mulțumesc și familiei mele care mi-a fost alături tot timpul pregătirii mele universitare.

Stadiul cunoașterii

I.1. Cancerul colorectal

I.1.1. Epidemiologie

Conform Organizației Mondiale a Sănătății în anul 2012, la nivel global, cancerul colorectal (CCR) insuma aproximativ 10% din totalitatea cazurilor de neoplazie la bărbați, aflându-se pe locul doi pentru această categorie, și 9.2% din totalul cazurilor de neoplazie la femei, în acest caz fiind pe locul al treilea [2]. Există o mare variație în ceea ce privește prevalența acestei neoplazii, aproximativ 55% din cazurile cu cancer colorectal înregistrându-se în țările dezvoltate, marea prevalență a acestei boli înregistrându-se în Australia/Noua Zeelandă (44.8/100 000 pentru sexul masculin și 32.2/100 000 pentru sexul feminin) în timp ce cea mai mică prevalență s-a înregistrat în Africa de Vest (4.5/100 000 pentru sexul masculin și 3.8/100 000 pentru sexul feminin) [2].În același timp mortalitatea prin acest tip de neoplasm are mari variabilități de la o regiune geografică la alta, pe plan global înregistrându-se o rată de deces prin acest tip de neoplazie de 8.5% din totalul deceselor cauzate de cancer, peste de 52% dintre aceste decese situându-se în țările slab dezvoltate [2].

La 1 ianuarie 2016 în Statele Unite ale Americii erau 1.4 milioane de pacienți diagnosticați cu CCR, 95% dintre supraviețuitorii cu CCR având peste 60 de ani (1 391 440), în timp ce aproximativ 5% din bolnavi (60 610) au avut sub 60 de ani [1]. De asemenea, în anul 2016 au fost presupuse a fi diagnosticate 134 490 de cazuri noi de CCR, etatea medie de diagnostic fiind de 66 de ani pentru sexul masculin si 70 de ani pentru sexul feminin [1].

În Europa incidența CCR este mai mare la sexul masculin în comparație cu sexul feminin, în rândul barbaților fiind o incidență a CCR de 13.2%, după neoplasmul de prostată (22.8%) și plămân (15.9%) în timp ce pentru sexul feminin incidența CCR este de 12.7%, pe primul loc în rândul femeilor aflându-se neoplasmul de glandă mamară (28.8%) [3]. Rate crescute de incidență standardizată în funcție de vârstă s-au înregistrat pentru bărbați în Slovacia (92/100 000), Ungaria (87/100 000) si Cehia (81/100 000) în timp ce pentru femei cele mai crescute rate de incidență standardizată în funcție de vârstă s-au înregistrat în Norvegia (54/100 000), Danemarca (53/ 100 000) și Olanda (50/100 000) [3].

În Romania, CCR se află atât ca incidență cât și ca mortalitate pe treapta a doua la ambele sexe, pentru sexul masculin pe primul loc fiind cancerul pulmonar și pentru sexul feminin fiind cancerul mamar [3]. În anul 2012 incidență standardizată în funcție de vârstă pentru barbați a fost de 50.3/100.000 iar pentru sexul feminin de 29.3/100.000 în timp ce mortalitatea prin aceasta neoplazie a fost de 27.5/100.000 pentru sexul masculin, iar pentru sexul feminin de 14.7/100.000 [3].

De subliniat că incidența standardizată în funcție de etate nu a suferit chimbări semnificative la nivel mundial între 1990-2013, maximul de impact pentru această neoplazie fiind înregistrat la 65 de ani [4]. De altfel, posibilitatea de a dezvolta CCR înaintea varstei de 79 de ani a rămas mare la bărbați (1 din 27) comparativ cu femeile (1 din 43) [4].

Cu privire la supravietuirea la 5 ani a bolnavilor cu CCR după diagnostic, putem spune că pentru bolnavii identificați între anii 1975-1977 aceasta era de 51 %, la cei identificați în perioada 1987-1989 aceasta era de 60% în timp ce la pacienții identificați cu CCR între anii 2004-2010 supraviețuirea la 5 ani se situează la 65% [5].

Nu în ultimul rând trebuie spus că aproximativ 25% din bolnavii cu cancer colorectal au metastaze de la diagnosticul inițial, în timp ce aproape 50% din bolnavii cu acest tip de cancer vor dezvolta metastaze, fapt ce are contribuție majoră la creșterea mortalității prin acest tip de neoplasm [6].

Deși s-au făcut progrese majore în ceea ce inseamnă screeningul acestei maladii sau metodele terapeutice chirurgicale si medicale, CCR a determinat 11.6% din mortalitatea prin cancer în Europa în anul 2012 în randul sexului masculin și 13.0% din decesele prin neoplasm în rândul sexului feminin [6].

I.1.2. Procese fiziopatologice prezente în carcinogeneza colorectală

Cancerul colorectal are mulți factori de risc, o mare parte dintre ei suprapunându-se peste un teren predispus genetic [7]. Mai mult decât atât, CCR reprezintă un model de carcinogeneză multistadială caracterizată prin apariția modificări genetice succesive, răspunzătoare de transformarea unei celule colice normale în celulă malignă [7]. Numeroase studii ale degradării genetice, somatice și constituționale au autorizat indentificarea multor căi de carcinogeneză colorectală [7].

I.1.2.1. Factorii de risc implicați în cancerul colorectal

I.1.2.1.1. Vârsta.

94% din cazurile cu CCR sunt prezente la persoanele peste 50 de ani, dovadă ce poate atesta că riscul de aparitie a CCR crește cu vârsta [8].

I.1.2.1.2. Sexul.

CCR are o incidență crescută în rândul sexului masculin decât în rândul sexului feminin [2,3].

I.1.2.1.3. Istoric de carcinom colorectal

Subiecții tratați pentru cancer intestinal au riscul de a produce neoplasm colorectal metacron ce se menține toată viața, un risc dublu față de populația generală [7]. În cazul în care se prezintă unul sau mai multe adenoame, riscul de a manifesta CCR este multiplicat cu 5 [7]. Mai mult decât atât, precedentele heredocolaterale de CCR la o rudă de gradul întâi produc o creștere a riscului față de populația generală, acest risc crescând proporțional cu numarul mai mare de rude afectate de neoplasmul colorectal [7].

I.1.2.1.4. Prezența de polipi colorectali.

Leziunile benigne polipoase adenomatoase asociaza un risc mare de a vira spre un fenotip malign. Schimbarea epiteliului colic rezultă în majoritatea cazurilor din filiația adenom-displazie-cancer [8]. CCR se dezvoltă pornind de la leziuni precanceroase, criptele aberante fiind prima leziune observabilă ce corespunde unei abateri la nivelul stomei criptei ce se marește și la nivelul căreia se produce o hiperplazie epitelială, dezvoltându-se apoi spre andemon [8]. Până in ultimul timp toate leziunile hiperplazice colorectale erau considerate aproximativ inofensive, fără potențial de malignizare [9]. Acum însă este acceptata dovada că acest tip de polipi sunt de fapt un grup eterogen, denumiți acum polipi zimțați , definiți în primul rând printr-o infațișare de dinți de fierăstrău [9]. Acest grup cuprinde leziunile premaligne ca adenomul zimțat sesil, adenomul zimțat obișnuit și polipul hiperplazic [10, 11]. Acest tip de leziuni sunt premergătoare unei transformări maligne în aproximativ 20 – 35 % din cazuri [10]. În mod separat, polipii adenomatoși sunt premergătorii unor leziuni neoplazice în aproape 70% din cazurile de CCR [10]. Acest tip de polipi sunt imparțiți în tubulari, viloși și tubulo-viloși [12]. Pericolul de a dezvolta CCR din tipul acesta de leziuni depinde de număr, histologie și mărimea lor. Astfel, au risc mic de a produce neoplasm colorectal bolnavii care au fost confirmați cu 1-2 polipi adenomatoși tubulari și cu mărimi sub 10 mm în timp ce bolnavii care au fost diagnosticați cu mai mult de 3 polipi adenomatoși tubulari cu mărimea peste 10 mm au risc mare, asemenea polipilor viloși, de a produce neoplasm colorectal [13].

I.1.2.1.5. Fumatul.

Organizația mondială a sănătății a avertizat în ceea ce privește fumatul, relatând că în secolul XX excesul de tutun a dus la pierderea a sute de milioane de vieți omenești și pentru secolul următor sunt prevăzute peste un miliard de morți dacă excesul de tutun nu se oprește [14]. Fumatul a fost invinuit în mai multe tipuri de neoplasm cum ar fi neoplasmul pulmonar, hepatic, esofagian, pancreatic și chiar de colon [15]. Studii actuale arată ca fumatul crește de doua ori riscul de cancer colorectal [16]. Riscul relativ de a produce CCR crește cu 25% după fumatul unui pachet de țigări pe zi timp de 10 ani și cu aproape 40% după fumatul unui pachet de țigări pe zi timp de 30 de ani [17]. Posibilele mecanisme pe care le pune in mișcare fumatul sunt constituite de alterarea funcției obisnuite a genelor cât și denaturarea replicării lor prin intermediul carcinogenilor aflați în fumul de țigări cum sunt acetaldehida, benzpirenul, amine aromatice și N-nitrozamine care se incrucișează cu ADN-ul celular [16].

I.1.2.1.6. Consumul de alcool.

Alcoolul a fost inculpat ca factor de risc pentru CCR, dovezi aduse de numeroase studii care arată o legatura de cauzalitate între consumul de alcool și pericolul de CCR [18,19]. Alcoolul marește riscul de cancer colorectal prin intermediul a două căi diferite. Pe de o parte influențează cancerul prin intermediul direcției lui de metabolizare din cauza că etanolul este oxidat în acetaldehidă și apoi în acetat, conseciința fiind o expunere a celulei la metaboliți posibil carcinogeni cum ar fi acetaldehida [19]. Mai mult, acetaldehida poate căra alți carcinogeni responsabili de apariția neoplaziei [20].Pe de altă parte, consumul îndelungat de etanol îndeplinește un efecto suprimant asupra acidului folic reieșind o debilitate în acțiunea acidului folic, ceea ce produce o hipometilare a ADN-ului și o sinteză anormală a sa, evenimente ce pot interfera cu înmulțirea celulară [19]. O metaanaliză actuala a raportat că există o legatură de cauzalitate între consumul de alcool și CCR. In comparație cu cei care nu consumă alcool sau consuma doar ocazional, consumul echilibrat de alcool (aproximativ 12.6-49.9 g/zi de etanol) a fost corelat cu un risc de a produce CCR de 21%, consumul major de alcool ( peste 50 g/zi de etanol) a fost corelat cu un risc de 52% de a dezvolta CCR în timp ce consumul redus de alcool (cantitate mai mica de 12.5 g/zi de etanol) nu a fost corelat cu riscul de cancer colorectal [18].

I.1.2.1.7. Obezitatea.

Excesul ponderal (supraponderea sau obezitatea) și sedentarismul sunt, deopotriva, în mod egal, factori participanți in riscul de dezvoltare al CCR și determină aproape 10% din cazurile de cancer colorectal [8]. Macanismul precis prin care acționează greutatea in exces și sedentarismul asupra procesului de malignizare nu este complet descifrat, dar roluri fundamentale în acest proces patologic par sa le revina diminuării adiponectinei și creșterea leptinei [21]. Adiponectina are numeroase efecte intre care se numara inhibarea angiogenezei, a proliferării celulare prin intermediul căii mTOR și producerea apoptozei [22]. Leptina secretată de țesutul grasos impiedică apoptoza și induce inmulțirea celulară prin intermediul căii PI3K/AKT/mTOR [23].

I.1.2.1.8. Dieta.

Un procent mare de CCR de aproape 30% este legat de factorii nutriționali [8]. Consumul de carne, in particular carne roșie prelucrata, sporește riscul de cancer colorectal conform multor studii efectuate în acest sens [24]. Prelucrarea cărnii prin metode variate printre care și afumarea pot conduce la formarea de produse chimice carcinogenetice cum sunt compușii N-nitrozo și hidrocarburile aromatice policiclice [25]. Deopotriva gătitul poate ajuta digestia cărnii, dar poate realiza prin prăjire sau gratar numeroși compuși chimici carcinogenetici inclusiv amine aromatice policiclice și hidrocarburi aromatice policiclice [25]. O analiza complexa despre mâncare și prevenția cancerului a subliniat o creștere cu 37% a pericolului de CCR la o dietă ce cuprindea peste 100 g de carne pe zi [26]. În sens invers, consumul crescut de fibre alimentare, în mod deosebit din cereale, sau cereale integrale se coreleaza cu un risc mai mic de cancer colorectal [25]. Autoritățile de săntătate publică din SUA si Marea Britanie recomandă adulților un consum zilnic de aproximativ 20 – 35 g de fibre alimentare pe zi [27].

I.1.2.1.9. Grăsimile animale și acizii biliari secundari.

Acizii biliari primari (acidul colic si chenodeoxicolic) provin din colesterol printr-o multitudine de reacții enzimatice ce au loc la nivelul ficatului [28]. După sinteză aceștia sunt conjugați cu glicină sau taurină ca dupa aceea să ajungă in tractul gastro-intestinal unde ajuta la digestia si absorbția lipidelor, colesterolului si vitaminelor liposolubile; in principiu ei sunt detergenții fiziologici și reglatorii homeostaziei țesutului epitelial intestinal în tractul gastro-intestinal [28]. Ulterior o mare parte din acizii biliari primari sunt reabsorbiți în porțiunea terminala a ileonului indeplinind astfel ciclul hepato-entero-hepatic [28]. O mică parte din acestia, aproape 5%, sunt transportati în colon fiind metabolizați in prezența florei bacteriane în acizi biliari secundari și anume acidul deoxicolic si acidul litocolic [28]. La concentrații fiziologice acidul deoxicolic si litocolic pot produce creșterea stresului oxidativ prin inmulțirea speciilor reactive de oxigen, deteriorarea AND-ului și mutații variate [29]. Etalarea continuă a celulelor epiteliale colonice la concentrații mari de acizi biliari, mai mult decat limitele fiziologie, poate produce instabilitate a ADN-ului, cu scadere a rezistenței la apoptoză, aberații mitotice dar și alte sisteme implicate în carcinogeneza colorectală [29]. Dieta bogată în grasimi de origine animală produce concentrații mari de acizi biliari secundari în colon ceea ce sporeste riscul de cancer colorectal [30].

I.1.2.1.10. Factorul genetic.

Aproximativ 5% din cazurile de neoplasm colorectal survin într-un context de boli ereditare predispozante la CCR, cu o transmitere autozomal dominantă și penetrație crescută [7]. O vârstă mai scazută de 50 de ani la diagnostic, antecedente tumorale personale, o agregare familială de neoplasme trebuie să evoce o predispunere familială și trebuie reconstruit arborele genealogic al subiectului [7]. Sindromul Lynch sau HNPCC (hereditary non-polyposis colorectal cancer) și polipoza adenomatoasă familială sunt cele două boli asociate genelor fundamentale de predispoziție pentru cancerul colorectal, actualmente descoperite.

a) Sindromul Lynch sau sindromul neoplasmului ereditar nonpolipozic colorectal (HNPCC/Hereditary non-polyposis colorectal cancer) este raspunzător de aproximativ 2-3% din totalul neoplasmelor colorectale și are o prevalență evaluată în populația generală de aproape 1 la 440 pacienți [31]. Acestă afecțiune are o transmitere autozomal dominantă cu penetrație mare (aproape 80-85%) si constituie forma cea mai des întalnită de cancer colorectal cu transmitere ereditară [8]. Sindromul acesta grupează mutații ale liniei germinative țintite pe gene MMR (mismatch repair genes) care sunt răspunzătoare de repararea imperfecțiunilor genetice de pe parcursul replicării celulare: MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 și EPCAM/TACSTD1 [32]. Au fost descoperite peste 9 gene de corectare a defectelor din timpul duplicării celulare, dar mutații inculpate în patogenia Sindromului Lynch au fost recunoscute doar la 5 dintre acestea, MLH1 într-un proporție de 49%, MSH2 38%, MSH6 9%, PSM2 2% și PSM1 0.3% [33]. Modificarea structurală a acestor gene provoacă instabilitatea microsateliților care reprezintă secvențe de nucleotide la nivelul anumitor gene, care nu codifică ci doar tipăresc un profil exclusiv fiecărei persoane; secvența aceasta de nucleotide este repetitiva, de 3 până la 100 de ori și sute de mii de microsateliți sunt formați de către genomul uman [34]. Despre fenomenul de inconstanța a microsateliților vom relata mai multe în secțiunea principalele mecanisme implicate în carcinogeneza colorectală.

Bolnavii cu HNPCC dezvoltă adesea cancer colorectal până la 50 de ani (media vârstei de descoperire a cancerului colorectal la pacienții cu modificări ale genelor MMR fiind de aproape 45 de ani) și aproximativ 33% din acești pacienți vor dezvolta o altă neoplazie în următorii 10 ani [35]. Neoplazii adiționale CCR extracolonice pot apărea în ovar, pancreas, uroteliu, tractul hepatobiliar, intestinul subțire, stomac, creier (varianta Sindromului Turcot) și adenoame sau carcinoame sebacee (varianta Sindromului Muir-Torre) [35].

Pentru a decela pacienții cu HNPCC care au un pericol mult mai mare de a manifesta cancer colorectal comparativ cu pacienții la care se dezvoltă în mod sporadic adenoame, au fost formulate criteriile clinice Amsterdam I care au fost modificate în anul 1999 – criteriile Amsterdam II [32]. De asemenea, existența criteriilor Amsterdam necesită o examinare de genetică oncologică și pentru decelarea acestui tip de alterare au fost formulate criteriile Bethesda [32].

Criteriile clinice Amsterdam II pentru a suspecta Sindromul Lynch sunt următoarele [36]:

– cel puțin trei indivizi înrudiți diagnosticați cu neoplasm din spectrul HNPCC (cancer colorectal, neoplasm de endometru, de intestin subțire, ureter, stomac, căi biliare, ovar și bazinet) dintre care unul sau doi au grad de rudenie de ordinul întai;

– sunt cuprinse de afectare cel puțin două generații succesive;

– cel puțin un individ a fost constatat înainte de 50 de ani;

– a fost eliminată polipoza adenomatoasă familială;

– neoplazia trebuie confirmată la examimarea histopatologică.

Trebuie amintit că termenul de Sindrom Turcot se raportează la situația în care bolnavii cu mutații ale genelor MMR atașează și neoplasm cerebral în vreme ce explesia de Sindrom Muir-Torre se raportează la situația în care bolnavii cu mutații ale genelor MMR grupează formațiuni tumnorale ale glandelor cutanate (adenocarcinoame, keratoacantoame sau adenoame sebacee) [37].

b) Polipoza adenomatoasă familială (PAF) reprezintă o maladie cu transmitere autozomal dominantă definită prin creșterea după pubertate a multor polipi adenomatoși în colon, leziuni ce se pot schimba in CCR înaintea vârstei de 45 de ani, la aproape 90% din bolnavii care au fost depistați cu această afecțiune. PAF este răspunzătoare de mai puțin de 1% dintre toate cazurile de neoplasm colorectal [37]. La un număr foarte mare de pacienți cu PAF sunt descrise manifestări extracolonice. In acest mod, se pot dezvolta polipii gastrici și duodenali, formațiuni desmoide, tumorile de tiroidă sau cerebrale, osteoame, hipertrofia congenitală de țesut retinian pigmentat, dentiție suplimentară și chisturi epidermoide; aceast amestec de exprimări colonice și extracolonice are denumirea de Sindromul Gardner [38].

Constatarea clinică a polipozei adenomatoase familiale obișnuite se bazează pe recunoașterea a mai mult de 100 de formațiuni polipoide colorectale. Există însă și o formă mai ușoară a acestei maladii caracterizată prin existența unui numar mai mic de formațiuni polipoide adenomatoase și un debut mai întârziat al bolii. Caracterizarea clinică a acestei boli nu este complet delimitată, astfel, suspiciunea de PAF se face la fiecare bolnav la care s-au identificat între 10 – 99 polipi adenomatoși [39].

Abaterea ce este inculpată de fenotipul acestei afecțiuni este reprezentată de alterarea prin deleție a exonului cu număr 15 al genei APC (adenomatous polyposis coli) situată pe brațul cromozomului 5, cu sarcină în transmiterea mesajelor între celule, transcripție și proliferare; similar, principalul rol al proteinei sistematizate de această genă se regăsește în reglarea căii Wnt de transducție a indicatorului prin interacțiunile cu proteina beta-catenina [40]. Într-o cercetare actuală s-a evidențiat faptul că mutațiile genei de fată au fost evidențiate la aproximativ 80% din bolnavii care au prezentat peste 1000 de formațiuni polipoide adenomatoase, 56% la cei care au prezentat între 100 – 999 polipi adenomatoși, 10% la cei la care s au evidențiat 20 – 99 polipi adenomatoși și la 5% la bolnavii care au prezentat între 10 – 19 polipi adenomatoși [41]. Proteina APC are atribuție și în legăturile dintre celulele țesutului epitelial colic și cadherine (adherine dependente de calciu) prin intermediul cărora se produce o parte majoră din comunicarea între celule.Proteina APC se leagă de proprietatea intracitoplasmatică a cadherinei asociată cu beta-catenina și GSK3-β, consolidând astfel funcționarea optimă a joncțiunilor intercelulare [42]. În plus, atașarea beta-cateninei în acest ansamblu produce o concentrație mai mică în citoplasmă a acesteia; in sens opus, beta-catenina în concentrație mare ar influența calea Wnt, având drept consecință accelerarea înmulțirii celulare și ar periclita apoptoza; sunt însă și diferite alte căi care includ beta-catenina în dezvoltarea neoplaziei colorectale [43].

Gradul de penetranță al PAF este aproape complet și în lipsa colectomiei toți bolnavii vor dezvolta CCR în ultima parte a decadei a patra de viața sau chiar mai precoce, în timp ce pentru polipoza adenomatoasă ușoară pericolul de a se manifesta CCR este de aproape 80% [8]. Polipoza adenomatoasă ușoară însă este rezultatul fie unei alterări bialelice a genei MYH (cu o răspândire autozomal recesivă) cu act important în refacerea leziunilor oxidative ale ADN-ului sau modificarea genei APC într-un loc diferit decât cel responsabil în polipoza adenomatoasă familială [44].

Este necesar să menționăm că există și alte polipoze regăsite mai rar, dar care prezintă în mod egal riscul de a conduce către CCR: polipoza juvenilă, polipoza hiperplazică și afecțiunea Peutz Jeghers. Afecțiunea Peutz Jeghers reprezintă o polipoză hamartomatoasă, ereditară, autosomal dominantă, ce afectează întregul tub digestivși care se însoțește cu lentigioza. Polipoza juvenilă reprezintă o altă polipoză hamartomatoasă survenită în urma unor mutații la nivelul genelor SMAD4 sau BMPRA1, amândouă având implicare în calea se semnalizare intermediată de TGF-β (transforming growth factor β). Nu ca un ultim argument, polipoza hiperplazică se caracterizează printr-un număr mare de polipi hiperplazici cu calibru mare și cauză necunoscută, dar care au un risc mare de transformare malignă [45].

I.1.2.1.11. Alți factori de risc pentru CCR

a) Diabetul zaharat.

Diabetul zaharat de tip 2 reprezintă o cauză de risc atât pentru cancerul colorectal [46] cat și pentru diferite tipologii de neoplazii cum ar fi neoplasmul de pancreas [47], plamâni [48], ovar [49], prostată [50] și rinichi [51]. Sunt numeroase ipoteze care atestă incriminarea diabetului zaharat tip 2 în patogenia CCR. In acest fel, factorul de creștere de tip insulinic (IGF-1, insulin-like growth factor) prezintă o serie de caracteristici printre care se gases si caracterele antiapoptotice ce pot fi incriminate în carcinogeneza colorectală [83]. Creșterea glicemiei poate, de asemenea, poate sa fie incriminată in patogenia acestei maladii prin stimularea căii de semnalizarea Wnt/β catenina, cât si prin intermediul inducerii stresului oxidativ și activarea factorului nuclear de trasncripție NF-kB (nuclear factor – kappa B) [8].

b) Bolile inflamatorii intestinale

Pacienții descoperiți cu sindroame inflamatorii intestinale (boala Crohn și rectocolita ulcero-hemoragică) prezintă un risc major de a prezenta cancer colorectal comparativ cu populația generală [52]. Pacienții cu maladii inflamatorii intestinale au posibilitatea sa dezvolte CCR prin sisteme similare cu cele sporadice. In acest fel, pot apărea mutatii ale genei APC, aneuploidii, metilarea ADN-ului, dinamizarea oncogenelor k-ras, activarea ciclooxigenazei-2 (COX-2), inconstanța micorsateliților, modificari ale genelor inhibitoare tumorale dar și alterări ale proteine p53. Pe când mutația p53 este mult mai intalnită in patogenia CCR produs la pacienții cu boli inflamatorii intestinale, in conformitate cu unele cercetari evidentiată la 85% din CCR asociate colitei ulcerative, alterări ale genei APC au fost mai puțin regasite în aceste cazuri [53]. O cercetare publicată în 2001 a demonstrat faptul că pericolul de a dezvolta CCR la pacienții cu colită ulcero-hemoragică reprezintă 2% după 10 ani de progres al bolii, 8% după a doua decada și 18% după a treia decada de viața [54].

c) Acromegalia

Acromegalia reprezintă o boală determinată adesea de un adenom la nivel hipofizar ce secretă hormon somatoform și un număr mare de studii evidențiaza o asociere între pragul crescut de hormon de creștere (GH – growth hormone), de factorul de creștere de tip insulinic (IGF-1) la fel de crescut în adenomul hipofizar secretor de hormon somatotrop și cancerul colorectal [55]. Incidența neoplasmului colorectal la bolnavii cu agromegalie are variație însă între 1.1% și 20% [55].

I.1.2.2. Principalele mecanisme moleculare implicate în carcinogeneza colorectală

Carcinogeneza colorectală este o transformare complexă în care schimbarea epiteliu colonic normal – adenom – carcinom cu fenotip impregnant se datorează în mod fundamental mutațiilor genetice succesive ce au loc în liniile germinale, mutații ce pot fi ereditare sau de novo. Cancerogeneza colorectală are în componență 3 mecanisme definitorii: inconstanța cromozomială (circa 85% din cazurile cu CCR), hipermetilarea citozinelor din insulele CpG (circa 25% din cazurile cu CCR) și inconstanța microsateliților (circa 15% din cazurile cu CCR) [56-58].

I.1.2.2.1. Instabilitatea cromozomială.

Instabilitatea cromozomială este legata de circa 80 – 85 % din cazurile sporadice de neoplasm colorectal. Acest sistem implicat în carcinogeneza colorectală însumează aneuploidia, care este o alterare a numărului de cromozomi și deficitul somatic al heterozigozității [57]. Instabilitatea cromozomială poate fi efectul unor defecte ale separării cromozomiale, unui deficit în repararea AND-ului celulelor, cât și în alterări ale unor oncogene ori gene de inhibiție tumorală [57,58]. Alterari ale genelor incriminate în mecanismul instabilității cromozomiale cuprind, în principal, genele K-ras, APC și gena P53 [59].

a) Gena K-ras.

Aflată pe cromozomul 12p12, aceasta (v-Ki-ras2, Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog gene) este o genă ce codifică o proteină de 21kD (p21ras) incriminată în transducția semnalului prin proteina G, adaptând în acest fel diferențierea și înmulțirea celulară [56]. Ea este respunzătoare de transducția stimulului mitogenic de la receptorul pentru EGF (epidermal growth factor) situat la suprafața, în interiorul cat și în nucleul celulei [106]. Datorită participării importante în transducția semnalului de le EGFR, existența mutației oncogenei K-ras produce un răspuns mult diminuat la anticorpii monoclonali anti EGFR utilizați pentru tratamentul cu țintă moleculară, exemplu fiind panitumumab-ul și cetuximab-ul [59].

b) Gena APC

Alterarile genei APC (Adenomatous polyposis coli gene) aflate pe cromozomul 5q sunt incriminate atât în aparițiile sporadice ale CCR cât și în polipoza adenomatoasă familială (PAF). Cu privire la implicarea genei APC în neoplazia colorectal am dezvoltat în secțiunea I.2.1.10.b) Polipoza adenomatoasă familială (PAF).

c) Proteina P53.

Gena ce codifică proteina P53 este poziționată pe cromozomul 17p [56]. Denumită și,, paznicul genomului ’’, proteina P53 are un atribuție crucială în ciclul celular și pastrarea stabilității genomice reprezentând una din cele mai cercetate proteine în cancer [59]. Dacă în momentul replicării celulare survin defecte ale AND-ului, proteina P53 stopează ciclul celulei în faza G1 și induce moartea celulei respective via căii mediate de caspază suprimând astfel activitațile mitocondriale. Alterarile acestei gene inhibitoare tumorale sunt foarte importante în carcinogeneză și sunt întalnite în proporție de 5% în cazul formațiunilor polipoide adenomatoase, 50% în cazul polipilor maligni și 75% în cazul cancerului colorectal invaziv [8,56,59].

I.1.2.2.2. Instabilitatea microsateliților.

Microsateliții sunt succesiuni repetitive de nucleotide ce la stadiul întregului genom nu codifică ci doar oferă unicitate persoanei. Pe parcursul replicării secvențelor succesive codante, ADN polimeraza are înclinarea de a suprima unele secvențe nucleotidice. Aceste greșeli sunt în mod normal refacute de proteinele sistemului MMR (mismatch repair system – sistem de refacere a asimetriei, refacerea bazelor nepereche) și instabilitatea microsateliților este consecința inactivării câstigate sau ereditare a sistemului MMR [8]. Componentele cu rol cel mai important ale sistemului de reparare a greșelilor replicării AND-ului sunt înfațișate de alterari ale ATP-azelor hMSH2, hMSH6, hMSH3, hMLH1, hPMS1, hPMS2 și hMLH3, participanți găsiți în circa 15% din cazurile de CCR și 3% din cazurile de Sindrom Lynch [57]. Tumorile care sunt definite de instabilitatea microsateliților (MSI – microsatellite instability) se pot include în MSI-H (high level of microsatellite instability – nivel crescut al instabilității microsateliților) care demonstrează instabilitate în două sau mai multe proteine și în MSI-L (low level of microsatellite instability – nivel coborât al instabilității mircrosatelților) [60], iar tumorile care nu demonstrează instabilitate a microsateliților sunt denumite MSS (microsatellite-stable) [61]. Actual screening-ul pentru perceperea profilului instabilității microsateliților conține: Bat-25, Bat-26, MONO-27, NR-21 și NR-24 [110]. Stabilirea statusului MSI se poate utiliza ca biomarker predictiv și de prognostic în CCR cât și în stabilirea liniei terapeutice cu viza chimioterapică [62].

I.1.2.2.3. Metilarea insulelor CpG.

Acesăa tipologie de mecanism carcinogenetic este inclus în modificările epigenetice care reprezintă o structură de fenomene ce pot sa modifice expresia unei gene fără a schimba secvența de nucleotide din ADN [8]. Insulele CpG sunt zone de nucleotide citozină-guanină aflate la nivelul promotorilor și exonilor primari ai genelor, hipermetilarea lor remarcându-se atât în neoplasm cât și in seneșcență [8]. Tumorile colorectale cu tipologia acesta de hipermetilare sunt remarcate a avea un fenotip CIMP (CpG island methylator phenotype) [63]. După gradul de densitatea a hipermetilării insulelor CpG se regăsesc trei categorii: CIMP-H (CpG island methylator phenotype high degree), CIMP-L (CpG island methylator phenotype low degree) și CIMP-N (CpG island methylator phenotype negative) [60]. Au fost recunoscute și legaturi între fenotipul CIMP-H și hipermetilarea genei MLH1, fenotipul MSI-H, poziționarea proximală a tumorii, vârsta avansată, sexul feminin, tipologia histologică mucinosă, gradul ridicat de direrențiere, dar și alterări ale genelor K-ras, BRAF, P53 [60]. A fost cercetat de asemenea și retroacțiunea la terapia cu 5-fluorouracil ținând cont de fenotipul CIMP, dar rezultatele în acest sens sunt foarte contradictorii [60].

I.1.2.3. Căi de semnalizare intracelulară implicate în carcinogeneza colorectală.

Cercetari recente au pozitivat ca alterarea genetică este implicată in carcinogeneza colorectală îndeosebi prin 5 căi de semnalizare intracelulară. Acestea fiind reprezentate de: TGF-β, Wnt/APC/β-catenina, p53, RAS/RAF/MAPK și PI3K/AKT/mTOR [8].

I.1.2.3.1. Wnt/APC/β-catenina.

Inactivarea căii Wnt/APC este mecanismul fundamental în carcinogeneza colorectală fiind regăsit la aproximativ 90% din bolnavii cu CCR [8]. Wnt reprezintă un ligand elaborat de celule mezemchimului de jur împrejurul mucoasei colice și de către celulele diferențiate Panetch legându-se de receptorul FZD (frizzled) ce se află pe suprafața celulelor progenitoare alezonei bazale a criptelor intestinale [64]. Lipirea acestui ligand produce inactivarea ansamblului intracitoplasmatic de alterare al β-cateninei alcatuit din proteina APC, proteina axin/axinin 2, casein kinaza I α/ε (CKIα/ε) și kinaza glicogen sintaza 3β (GSK3β) [65]. Concentrarea în exces a β-cateninei produce translocarea ei în nucleul celular unde are rol ca și co-factor pentru factorii de transcripție TCF (T-cell factor – factorul celulelor T) și LEF (lymphoid echancer factor – factorul limfoid potențator), determinanți de transcripție care activează gene variate implicate în înmultirea și maturarea celulelor intestinale, cum ar fi: c-Jun (JUN), c-myc (MYC), cyclin D1 (CCND1), MDR1 (multidrug resistance 1) dar și diferite alte gene ce pot avea determinanța și în carcinogeneza colorectală [8,65].

I.1.2.3.2. RAS/RAF/MAPK

Receptorul factorului de dezvoltare epidermală (EGFR – epidermal growth factor receptor) este inclus în familia receptorilor cu acțiune tirozin kinazică pentru diverși factori de creștere [8]. Există un număr mare de liganzi care lipindu-se de acești receptori produc activarea multor căi de semnalizare intracelulară, căi ce au diverse funcții celulare, în principal proliferarea, strămutarea și apoptoza celulară. Proteinele RAS au un rol mare în transducția semnalului de la receptorii de care am discutat spre mediul intracelular și insumează trei constituienți principali: K-ras, N-ras și H-ras. BRAF reprezintă o serin treonin kinază aflată în aval de K-ras [8]. Activarea BRAF produce activarea MAPK (mitogen-activated protein kinase – kinaza activată de factori mitogeni) sau ERK (extracellular signal-regulated kinase – kinaza ajustată de semnale extracelulare), activare ce conduce în cele din urmă la activarea factorilor de transcripție ca c-fos, c-myc, c-jun, ELK1, cycline D1 și cdk6 [8]. Alterarile proteinelor K-ras și BRAF conduc la transducția prelungită a acestor semnale intracelulare, usurând proliferarea celulară și împiedicând apoptoza prin intermediul protein kinzei activată de mitogeni [66].

I.1.2.3.3. PI3K/AKT/mTOR

Fosfoinozitid 3-kinaza (PI3K), protein kinaza B (AKT) și obiectivul rapamicienei la mamifere (mTor – mammalian target of rapamycin) constituie altă cale importantă incriminată în carcinogeneza colorectală [8]. Activarea căii acesteia de semnalizare intracelulară poate avantaja transcripția unui număr mare de gene implicate în proliferarea celulară (c-myc, cdk2), supresia apoptozei (Bcl2), cyclina D1 răspunzătoare de inducerea ciclului celular [67]. De asemenea, pot fi dezactivați factorii pro-apoptotici (BAD, Forkhead și casapsa-9). Calea prezentată de semnalizare intracelulară este fixată de proteina PTEN (Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten) a cărei tulburare prin mutațiile genei codificatoare este incriminata in carcinogeneză [68]. Este nevoie să menționăm și faptul că această cale de semnalizare poate activa și MMP-9 (metaloproteinaza 9) cu atribuție în degradarea matrixului extracelular (ECM) fiind avantajată astfel invazia tumorală și metastazarea [68].

I.1.3. Aspecte histopatologice ale cancerului colorectal.

Peste 90% din cazurile de neoplasm colorectal sunt adenocarcinoame cu origine în celulele țesutului epilelial ale mucoasei colonice [69]. Diferite tipuri mai puțin întalnite de neoplasm colorectal sunt ilustrate de tumori neuroendocrine, tumori scuamoase, adenoscuamoase și nediferențiate [70]. În mod unanim admis adenocarcinoamele au ca și caracteristică formarea de glande, în acest fel avem adenocarcinom înalt diferențiat dacă >95% din tumoră cuprinde glande, adenocarcinom moderat diferențiat in cazul existenței gladelor în procentaj de 50-95% și slab diferențiat dacă cuprinde glande formate într-un procent <50%. Adenocarcinomul moderat diferențiat reprezintă forma descoperită cel mai des (aproximativ 70%), adenocarcinomul slab diferențiat rămâne descoperit în proporție de circa 20% iar cel înalt diferențiat în proporție mai mică de 10% [69]. Conform Organizației Mondiale a Sănătății neoplaziile epiteliale colorectale insumează următoarele tipologii: adenocarcinom, adenocarcinom mucinos, carcinom cu celule ,,în inel cu pecete’’, cu celule mici, scuamos, adenoscuamos, carcinom medular și carcinom nediferențiat [69].

I. 1.4. Stadializarea cancerului colorectal.

Clasificarea TNM a cancerului colorectal, valabilă și la ora actuală, este ediția a șaptea a clasificării TNM din 2009 adoptată de Uniunea Internațională contra Cancerului (UICC – Union Internationale Contre Le Cancer) și de Comitetul Comun American pentru Cancer (AJCC – American Joint Committee on Cancer) sintetizată în tabelul 1 [71].

Tabelul 1. Stadializarea TNM a CCR (UICC/AJCC – 2009)

Clasificarea pe stadii anatomice și pe grupuri de prognostic este redată în tabelul 2 [71]:

Tabelul 2. Clasificarea pe stadii anatomice și pe grupuri de prognostic CCR (UICC/AJCC – 2009).

I.1.5. Opțiuni terapeutice în cancerul colorectal.

Conform ultimelor dispoziții în ceea ce privește tratametul neoplasmului colorectal, tratatul Societății Europene de Oncologie Medicală din 2016 propune ca atitudinea terapeutică a cancerului colorectal să reprezinte intersectarea medicilor specialisti ai mai multor specialitați și bazat pe evidente concrete [72].

Rezecția chirurgicală constituie modalitatea terapeutică de bază în cancerul colorectal, dar alegerea tipul de intervenție chirurgicală trebuie sa ia în seamă localizarea tumorii, marimea ei, invazia țesuturilor și organelor cât și parametrii clinici ai bolnavului [73]. Opțiunile terapeutice de bază sunt reprezentate de endoscopie, chirurgie și chimioterapie, în unele cazuri rare fiind indicată radioterapia în neoplasmul de colon diferit față de neoplasmul rectal unde indicațiile radioterapiei fiind mai numeroase. În tabelul 3 este prezentată o sinteză a terapiilor în cancerul de colon în funcție de gradul clinic [73].

Tabelul 3. Metodele terapeutice ale cancerului de colon ajustate după EURECCA colorectal: multidisciplinary management: European consensus conference colon & rectum (2014).

1 EMR= Endoscopic mucosal resection – rezecție endoscopică a mucoasei

2 ESA= Endoscopic mucosal ablation – ablație endoscopică a mucoasei

3 ESD= Endoscopic submucosal dissection – disecție endoscopică a submucoasei

Trebuie precizat că metodele de teratie cu țintă moleculară cum ar fi anticorpii monoclonali ce au ca țintă receptorilor pentru factorul de dezvoltare epidermală sau pentru factorul de creștere al endoteliului vascular, exemplu bevacizumabul, sunt folosiți în cancerul colorectal cu metastaze în combinație cu chimioterapia [6].

I.2.Receptorii beta adrenergici

Receptorii beta adrenergici reprezintă receptorii uniți cu proteinele G. Stimularea lor inițiază o mulțime de rute de semnalizare intracelulară care cuprind adenilat ciclaza, 3’,5’ adenil monofosfat ciclic – cAMP, protein kinaza A – PKA, initializarea cascadei acidului arahidonic, cât și alte mijloace ce pot fi incriminate în cancerogeneza colorectală [74]. Receptorii beta adrenergici sunt incluși în familia receptorilor uniți cu proteinele G împreună cu receptorii alfa adrenergici, insumând în total 9 subdiviziuni de receptori. Receptorii beta adrenergici însumează trei tipuri β1-AR, β2-AR șî β3-AR pe când receptorii alfa adrenergici sunt de 6 tipuri α1A, α1B, α1D, α2A, α2B, α2C [75].

Atașarea noradrenalinei sau adrenalinei de receptorii beta adrenergici produce activarea Gαs din proteina G, care ulterior induce stimularea adenlilat ciclazei în perspectiva sintezei de 3’,5’ adenil monofosfat ciclic – cAMP [74]. cAMP poate determina diferite acte intracelulare, descrise mai jos, prin două mari posibilitați de semnalizare intracelulară.

Mai întâi cAMP produce o creștere a protein kinazei A (PKA). Protein kinaza A intermediază fosforilarea unei mari game de substraturi care conțin canalele ionice, proteine aparținând citoscheletului celular ,dar și diverse enzime efectoare, activare ce conduce în eventualitate la apariția răspunsului biologic exeplu fiind cunoscuta excitare a cotractilității miocardului sau destinderea mușchilui neted [76]. Protein kinaza A este capabilă, de asemenea, să fosforileze și factori de transcripție nucleară asemenea CREB/ATF (the cAMP Response Element Binding Protein/Activating Transcription Factor) [77]. PKA poate realiza și activarea kinazei receptorilor beta adrenergici (β-adrenergic receptor kinase – BARK), ce ulterior la rândul ei, produce acumularea beta arestinei și inhibarea receptorilor beta adrenergici. În continuare se produce activarea proto-oncogenei c-Src care realizează activarea factorilor de transcripție ca STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) cu activarea în aval a unor kinaze cum sunt kinaza de adeziune focală (focal adhesion kinase – FAK) cu sarcină importantă în modularea mobilității celulare prin punerea in mișcare a citoscheletului celular și în dezvoltarea rezistenței celulelor la apoptoză [74]. De asemenea, împreună cu protein kinaza A se mai activează și proteinele mitocondriale din familia Bcl-2 (Proteins in the B cell CLL/lymphoma 2), proteine supramanifestate într-un număr mai mare de tipuri de cancere, care pot împiedica apoptoza prin adaptarea homeostaziei impulsurilor electrice și semnalelor osmotice ale mitocondriilor celulelor tumorale la o multitudine de stimuli [78].

Cea de-a doua direcție majoră pe care și-o însușesc semnalele intracelulare produse de activarea receptorilor beta adrenergici prin intermediul adrenalinei și noradrenalinei, este activarea cAMP produsă de proteinele de substituție activate de adenilat ciclază (exchange protein activated by adenylyl cyclase – EPAC) care intermediază alte direcții de semnalizare intracelulară cum sunt protein kinaza stimulată de factori mitogeni (MAPK) cu consecințe variate în mecanismele biologice intracelulare cuprinzând aici activarea factorilor transcripționali nucleari ce sprijină exprimarea unor proteine incriminate în angiogeneză, invazia țesuturilor, trecerea epiteliu-mezemchim, dar separat și exprimarea unor proteine cu activitate în inhibarea răspunsului imun antitumoral [74].

Contribuții

proprii

II.1. Scopul și obiectivele cercetării

Am selecționat aceast subiect de cercetare deoarece, pe de o parte, neoplasmul colorectal tinde să rămână una din cele mai importante neoplazii atât ca incidență ,morbiditate cât și mortalitate la nivelul populației de pe glob, iar pe de altă parte, recent se dorește a se înlocui modelul tradițional de maladie cu modelul de maladie biopsihosocială. Astfel, deși noțiunea incriminării minții în dezvoltarea unor afecțiuni nu a caștigat multă atenție, în ultimii zeci de ani, mintea și trupul au fost supuse unei analize într-un sistem integrat, a cărui alterare produce suferință (felul în care un individ distinge această anomalie a stării de sănătate) și boală [79,80]. În doctrina biopsihosocială, simptomele, sunt produse fiziopatologic pe diferite căi și au posibilitatea de a fi perturbate atât de componente psihologice dar și socioculturale[80].

Noțiunea de a realiza legături între influențele psihologice și neoplasm nu reprezintă o noțiune nouă, ea circulă de peste două mii de ani și îi revine lui Galen, care a constatat că femeile cu fire melancolică dezvoltau cancer mamar într-o proporție superioară altor tipuri temperamentale [81].

Această lucrare incearcă să realizeze un studiu descriptiv al substratului fiziopatologic din dezvoltarea malignă colorectală țintit pe interrelațiile neuro-neoplazice. Astfel am conturat următoarele țeluri:

Conceperea unei cercetări analitice,observațional descriptive, pe o durată de doi ani în mod prospectiv, pentru studierea exprimării unor receptori pentru neurotransmițătorii sistemului avut in vedere, expuși de celulele maligne încancerul colorectal, schimbări ce pot fi asociate cu aspecte ale patogeniei și cancerogenezei colorectale;

Constituirea unei baze de date integrale care să cuprindă atât date cu caracter clinic cât și paraclinic aparținâd idivizilor incluși în cercetare;

Aprecierea expresiei receptorilor beta-2 adrenergici față de catecolamine în adenocarcinomul colorectal și crearea unor interdependențe cu anumite trăsături clinico-patologice ale bolnavilor ce fac parte din studiu;

Aprecierea expresiei receptorilor beta-2 adrenergici ce se manifestă la nivelul țesutului colonic normal din apropierea imediată a teritoriului de invazie tumorală și stabilirea unor conexiuni statistice cu diverse elemente clinico-patologice;

Redactarea unor ipoteze ce au legatură cu posibilele ținte prognostice și curative în neoplasmul colorectal din prisma funcționalitații prin examinarea unor recepori pentru neurotransmițătorii manifestați de celulele maligne.

II.2. Material și metode

II.2.1. Tipul studiului.

Am efectuat un studiu prospectiv în perioada noiembrie 2014 – septembrie 2016, de tip analitic observațional, studiu în care am însumat 70 de pacienți . Bolnavii au fost cuprinși în studiu consecutiv pentru a se ocoli bias-ul.

Bolnavii au fost premergător diagnosticați în Clinica I Medicală – Gastroenterologie a Spitalului Clinic Județean de Urgență Craiova, în temeiul unor principii de diagnostic, cu prezumție de formațiune malignă aflată la nivelul uneia din porțiunile colorectale. Bolnavilor li s-a realizat apoi terapie chirurgicală cu viză curativă în Clinica I de Chirurgie a spitalului Județean de Urgență Craiova, iar din fragmentul rezultat în urma rezecției chirurgicale au fost selecționate eșantioane de țesut tumoral ce au reprezentat materialul de studiu al acestei cercetări.

La început a existat un număr mai mare de bolnavi ce puteau lua parte la studiu (n=79,) dar o parte dintre ei au refuzat prezența la acest studiu (n=4), iar altă parte fie nu erau eligibili din punct de vedere criteriilor de includere în cercetare cum ar fi prezența unei formațiuni maligne cu localizare colorectală (n=2), fie în urma examenului anatomopatologic s-a constatat prezența unei alte formațiuni maligne diferită de adenocarcinomul colorectal (n=3).

Grupul de studiu a însumat într-un final un număr total de 70 de pacienți, dintre aceștia 10 bolnavi au reprezentat grupul martor și au fost aleși dintre pacienții cu obstrucție la nivel intestinal sau alte boli benigne, care au avut nevoie de rezecția chirurgicală a unei porțiuni de colon, iar restul de 60 de bolnavi au reprezentat grupul bolnavilor.

Toți indivizii din grupul bolnavilor au prezentat criteriile de includere în această cercetare și au fost instiințați în prealabil cu privire la toate etapele cercetării cât și despre păstrarea confidențialitații datelor cu caracter personal. Fiecare probă obținută a fost notată cu un număr unic iar din datele statistice și/sau imaginile prezentate în acest studiu am eliminat toate informațiile ce puteau conduce la indentificarea indivizilor incluși in această cercetare .

II.2.2. Criteriile de includere în cercetarea de față au fost următoarele:

Vărsta mai mare de 18 ani atât la barbați cât și la femei;

Determinarea tumorii maligne colorectală în lipsa prezenței altor antecedente personale de malignitate;

Examenul histopatologic pozitiv pentru adenocarcinom colorectal;

Semnarea formularului ce informează pacientul cu privire la etapele studiului si acordarea consimțămantului acestuia.

II.2.3. Criteriile de excludere din studiu au fost următoarele:

Vârsta sub de 18 ani;

Prezența in antecedente de neoplazii;

Examenul histopatologic pozitiv pentru alte formațiuni neuroendocrine sau alte tumori în afara adenocarcinoamelor colorectale;

Refuzul bolnavului de a particpa la studiu.

A fost realizată o bază de date cu caracteristicile clinico-patologice totale ale pacienților cuprinși în studiu, date obținute din foile de observație ale pacienților dar și din buletinele examenelor histopatologice. Așadar, au fost adunate informații despre sex, vârstă, mărimea tumorii, poziționarea tumorii primordiale (colon stang, transvers, drept sau sigmoid și rect), stadializările TNM în conformitate cu Comitetul American pentru Cancer (American Joint Committee on Cancer) și stadiile de diferențiere histopatologică in concordanță cu cele mai recente indicații ale Organizației Mondiale a Sănătății (World Health Organization – WHO) cuprinzând grupele de adenocarcinom colorectal înalt, moderat și slab diferențiat [69].

Studiul de față a fost autorizat de Comisia de Etică a UMF Craiova, întrunind toate criteriile Declarației de la Helsinki și ale Acordului de Bune Practici Medicale la care UMF Craiova a aderat, orice pacient inclus în această cercetare acceptând participarea prin semnarea documentului de informare și acord.

II.2.4. Prelucrarea pieselor de rezecție colorectală

Eșantioanele rezultate in urma rezecției chirurgicale au fost scufundate imediat după demersul chirurgical în soluție de formaldehidă 10% în care este prezent un pH neutru prin combinarea cu bicarbonat de calciu folosit pentru a dezactiva acidului formic. Cantitatea de soluție fixatoare de formaldehidă a fost de circa 15 ori mai ridicata decât volumul eșantionului fixat.

După procedeul de fixare în aldehida formică a produsului biologic s-a realizat lavajul cu apă apoi procedura de includere la parafină. Cu privire la această tehnică, mai întai s-a realizat înlăturarea totală a apei din piesele rezultate în urma rezecției chirurgicale prin scufundarea în alcool etilic cu concentrații variate,deoacere apa nu este miscibilă cu parafina, rezultând astfel etapa primară a includerii la parafină, purtând denumirea de deshidratarea. Apoi s-a realizat tehnica de clarificare în care alcoolul etilic folosit anterior a fost indepărtat în totalitate din structura tisulară. Produsul biologic rezultat a fost trecut ulterior prin trei băi consecutive de parafină și încorporat în fază finală într-un bloc de parafină și întărit, producându-se astfel parafinarea și înglobarea propriu-zisă.

Ultima treaptă a reprezentat secționarea blocurilor tisulare incluse în parafină, așezarea secțiunilor rezultate pe lame și nuanțarea cu hematoxilină-eozină (HE). Examinarea histopatologică de certitudine a fost realizată de Laboratorului de Anatomie Patologică din incinta Spitalului Clinic Județean de Urgență Craiova, examenul propriu-zis fiind îndeplinit de către un anatomopatolog cu experiență mare în acest domeniu.

II.2.5. Studiul imunohistochimic.

Eșantioanele biologice utilizate pentru examinările imunohistochimice din aceast studiu, ulterior diagnosticului histopatologic realizat în Laboratorului de Anatomie Patologică, au urmat prelucrarea și examinarea prin procedee imunohistochimice în Centrul pentru Studii de Morfologie Microscopică și Imunologie al UMF Craiova.

Blocurile de parafina, din fiecare realizându-se secțiuni succesive de circa 3 µm grosime prin intermediul unui microtom rotativ HM350 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), fiind dotat cu un mecanism de trecere al secțiunilor printr-un recipient cu apă rece (mecanism de transfer al secțiunilor) și un dispozitiv de răcire Peltier. Secțiunile rezultate au fost trecute apoi printr-o baie de apă cu temperatura de 40°C cu scopul a fi întinse și proporționate. Din recipientul cu apă având temperatura de 40°C fracțiunile au fost scoase pe lame ce conțineau pe suprafață polilizină (poly-L-lysine), resturi de aminoacizi cu sarcină electrică pozitivă, cu scopul de a amplifica aderența fracțiunilor succesive de lame. Aceste lame cu secțiuni tisulare incluse la parafină fiind uscate ulterior într-un termostat la 37°C vreme de 24 ore.

După cele 24h în care secțiunile de țesut au fost uscate, acestea au fost deparafinate întâi prin scufundarea în trei băi treptate de xilen,fiecare durând 15 minute , ulterior fiind rehidratate prin trecerea succesiva prin soluții de alcool având concentrații descrescătoare, având ca finalitate îndepărtarea oricarei urme de alcool prin clătirea cu apă distilată.

Pentru redobândirea antigenică s-a realizat o fierbere vreme de 21 de minute (7 perioade în serie de câte 3 minute fiecare) în interiorul unui cuptor cu microunsetat la o cantitate de energie de 600 W într-o baie de citrat de sodiu la un pH acid de 6. Ulterior s-a realizat răcirea vreme de 30 de minute a lamelelor și clatirea apoi cu apă de la robinet împreuna cu apă distilată pentru alte 15 minute.

Urmatoarea treaptă parcursă a fost inhibarea activității peroxidazei endogene. În acest scop lamelele au fost incubate împreuna cu peroxid de hidrogen 1% și apă distilată vreme de 30 de minute la temperatură ambientală, ținute vreme de circa 30 de minute în 3% lapte praf fără grăsimi în soluție salină atenuată cu fosfat (PBS – phosphate buffered saline solution) , ulterior realizându-se incubarea cu anticorpii primari la 4°C vreme de 18 ore.

Anticorpii primari folosiți în studiul de față au fost reprezentați de: anticorp împotriva receptorului B2A – rabbit-anti-human anti-beta-2 adrenergic receptor (NBP2-15564, fiind diluat 1:200, Novus Biologicals, UK).

Pentru indepărtarea surplusului de anticorp primar, în urmatoarele 24 de ore au fost efectuate trei băi seriate în PBS ulterior adăugându-se anticorpii secundari. Amplificarea semnalului a durat 30 de minute,realizându-se prin utilizarea unui sistem particular de polimeri de peroxidază încorporați de imunoglobuline umane (Nikirei-Bioscience, Tokyo, Japan). Într-un sfârșit, semnalul a fost perceput cu 3,3’-diaminobenzidină (DAB, Dako),lamelele fiind acoperite cu DPX (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ulterior colorării cu hematoxilină-eozină. Toate fracțiunile tisulare au fost colorate pentru fiecare anticorp primar in parte și prelucrate în aceeași perioadă de timp în vederea respectării coerenței protocolului, în asociere cu eșantioanele de control nuanțate ori cu DAB ori cu hematoxilin-eozină în vederea obținerii unui spectru pur al culorilor respective. Eșantioanele de control negative au fost dobândite prin neglijarea anticorpilor primari.

II.2.6. Achiziția și procesarea imaginilor

Pentru a aprecia și evalua expresia imunohistochimică a particulelor țintă examinate în studiul noastru am folosit două metode.

Prima metodă, pentru obținerea imaginilor de pe lamele cu eșantioane de țesut am folosit un microscop Nikon 55i (Apidrag, București, România), aparat dotat cu o cameră de 6 megapixeli și senzor optic de înaltă acuratețe CCD (charge-couplet device) și programul pentru imagini:,,Image ProPlus AMS” (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). După obținerea imaginilor, au fost reprezentate regiuni de interes (ROI – regions of interest) pe lamele colorate cu DAB, pe fundamentul aceluiași aspect de culoare RGB în mod uniform, iar aceste zone de interes (ROI) au fost folosite pentru a estima aria impulsului și densitatea optică integrată (IOD – integrated optical density).

Cea de-a doua metodă, este folosită pentru obținerea imaginilor de pe lamele cu țesut unde am utilizat anticorpi primari pentru evidențierea receptorilor beta 2 adrenergici am folosit un microscop Nikon Eclipse 90i (Elta90, București, România) dotat cu o cameră ce detectează multiple spectre luminoase Nuance FX și un program de examinare Nuance (Perkin Elmer, Hopkinton, MA, USA). Ulterior obținerii imaginilor spectrale de pe eșantioanele individuale colorate cu DAB sau HE, am produs eficientizarea neamestecării canalelor de culoare și am definit expresia imunohistochimică a tiparului de interes (acest profil este reprezentat în Figurile 1A-D). În plus, semnalul DAB nemixat a fost calibrat prin estimarea suprafeței și densității optice integrate (media intensității/densității fiecărei arii luate în evidență), pe 10 cadre surprinse fără un tipar premergător cu un obiectiv de 20 x, folosind programul Image-Pro Plus AMS 7. A fost determinată media rezultatelor identificate pentru fiecare bolnav, și în cele din urmă au fost determinate mediile pentru toate grade de diferențiere histopatologică și făcute comparații între ele. În acelasi timp, stroma a fost pusă în considerare izolat în această analiză prin precizatea manuală a zonelor de interes pe cadrele captate, înainte de examinarea lor.

Figura 1.A. Exemplu de cadre succesive spectrale neamestecate a unei secțiuni. A – imunomarcaj pentru receptori B2A cu DAB, profil de culoare RGB, X400.

Figura 1.B. Imagine eterogenă, culorile albastru și maro suprapuse; imagine în contrast cu hematoxilină-eozină, X400.

Figura 1.C. Imagine nesuprapusă, semnal pur DAB pentru receptorii B2A expus în maro, X400.

Figura 1.D. Exemplu de cadre succesive spectrale neamestecate a unei secțiuni. D – cadru nemixat, semnal pur hematoxilină-eozină expus în albastru, X400.

II.2.7. Analiza statistică a datelor.

Informațiile dobândite prin folosirea programului Image-Pro Plus AMS au fost exportate și transpuse în grafice prin folosirea Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA) și examinate folosind programul SPSS (IBM SPSS Statistics, Version 20.0). Pentru a estima fluctuațiile statistice dintre două ansamble am recurs la testul t Student și evaluarea varianței ANOVA (analysis of variance) cu analiza post-hoc Bonferroni pentru a pune in balanță datele simultan pentru un număr mai mare de două grupuri. Legaturile au fost estimate cu ajutorul factorului de corelație Pearson. Datele totale au fost expuse ca medie ± deviația standard (SD) sau eroarea standard (SE). În totalitatea cazurilor, evaluarea p < 0.05 a fost folosită pentru a arata semnificația statistică.

II.3. Caracteristicile clinico-patologice ale pacienților incluși în studiu.

În acestă cercetare au fost cuprinși în total 70 de bolnavi, dintre care aproximativ15% (n=10) dintre aceștia au reprezentat lotul martor iar 85% (n=60) din bolnavi au reprezentat lotul bolnavilor (vezi Fig. 2). Indivizii diagnosticați cu neoplasm colorectal din lotul bolnavilor au fost împarțiți în trei subgrupuri egale din punct de vedere al numarului de pacienți, după stadiul de diferențiere al adenocarcinomului colorectal, si anume înalt (G1), moderat (G2) și slab diferențiat (G3) (vezi Fig. 3 – 5), ierarhizare realizată în concordanță cu cele mai recente criterii ale Organizației Mondiale a Sănătății (World Health Organization – WHO) prin intermediul unui anatomopatolog cu experiență vastă în domeniul neoplasmelor colorectale [73].

Figura 2. Repartiția pe loturi a bolnavilor incluși în studiu.

Figura 3. Adenocarcinom colorectal înalt diferențiat, colorație HE, X200.

Figura 4. Adenocarcinom colorectal moderat diferențiat, colorație HE, X200.

Figura 5. Adenocarcinom colorectal slab diferențiat, colorație HE, X200.

Vârsta cea mai mică a pacienților cuprinși în studiu a fost de 44 ani, în timp ce vârsta cea mai mare a bolnavilor incluși în cercetare a fost de 89 ani, cum se poate distinge în Tabelul 5. Bolnavii majoritari fiind reprezentați însă de cei cu vârsta peste 60 de ani (Figura 6, 7), din aceasta cauză am ales această valoare drept cut-off în cercetările statistice ulterioare ce au cuprins și vârsta.

Tabelul 4. Elemente statistice descriptive ale vârstele pacienților din întregul lot vizat.

Figura 6. Dispersia pacienților în funcție de grupa de vârstă.

Figura 7. Dispersia pacienților ce depinde de cut-off vârsta de 60 de ani.

În cadrul acestei lucrări am observat un impact crescut în rândul sexului masculin (n=40, circa 66% din lotul total de bolnavi) în timp ce sexul feminin a fost afectate în procent de circa 34% din întregul lot de studiu (n=20) (Figura 8).

Figura 8. Distribuția bolnavilor din lot pe sexe.

Bolnavii ai căror tumori au depașit 5 cm s-au prezentat în procent de 53% (n=32) în timp ce 47% din Indivizii din lotul bolnavilor au prezentat tumora sub 5 cm (Figura 9).

Figura 9. Distribuția bolnavilor din lotul total de indivizi reprezentați in funcție de mărimea tumorii.

Din subiecții cuprinși în lotul bolnavilor, circa 18% (n=11) au prezentat sediul tumorii la nivelul colonului drept sau transvers, iar restul de 82% (n=49) au avut localizarea tumorii la nivelul colonului stâng, sigmoidului sau rectului (Figura 10).

Figura 10. Distribuția indivizilor din lotul bolnavilor după localizarea tumorii.

În ceea ce privește aspectul macroscopic al formațiunii indivizii din lotul bolnavilor au fost separați în două categorii distinse pe baza aspectului de tip exofitic (n=24, respectiv 41% din lotul total de bolnavi) și profilului de tip infiltrativ sau ulcero-infiltrativ (n=36, respectiv 59% din totalul bolnavilor ) (Figura 11). Caractere distincte macroscopice ale formațiunii la examinarea colonoscopică efectuată în cadrul clinicii de Gastroenterologie a Spitalului Clinic Județean de Urgență Craiova fiind redate în Figura 12 – 14. În același timp, în Figura 15 este prezentat un aspect macroscopic al materialului tisular rezultat în urma rezecției chirurgicale.

Figura 11. Distribuția bolnavilor în funcție de profilul macroscopic al tumorii.

Figura 12 A, B. Neoplazie situată la nivelul sigmoidului, ulcerovegetantă, în circumferință , cu stenoză parțială.

Figura 13. Neoplazie situată la nivelul jocnțiunii rectosigmoidiene, cu caracter ulcerativ, semicircumferențială.

Figura 14. Neoplazie aflată la nivelul sigmoidului, cu caracter ulcero-vegetant, semicircumferențială, friabilă, ce sângerează rapid.

Figura 15. Aspect macroscopic al unui produs tisular de rezecție chirurgicală.

Ținând cont de categoria T a ierarhizării TNM (invazia tumorală), indivizii din lotul bolnavilor au fost împarțiți în procentaj de 35% (n=21) în categoria T1-2 și în procentaj de 65% (n=39) în categoria T3-4 (Figura 16).

Figura 16. Reprezentarea pacienților după invazia tumorală.

În funcție de matastazele în ganglionii limfatici din regiune relevate la examinarea microscopică a acestora, bolnavii au fost fost încadrați în proporție de 44% (n=26) în categoria N0-1 și în proporție de 56% (n=34) în categoria N≥2 (Figura 17).

Figura 17. Distribuția bolnavilor în funcție de diseminările în ganglionii limfatici din regiune.

II.4. Expresia receptorilor B2A

II.4.1. Expresia receptorilor B2A în CCR.

II.4.1.1. Caracterizare histopatologică.

Prin intermediul metodei microscopiei multispectrale nemixate (prezentată la II.2.6. Achiziția și procesarea imaginilor) am realizat definirea expresiei morfologice a receptorilor B2A.

În afară de o reacție citoplasmatică ușor difuză în mucoasa sănătoasă colonică, receptorii B2A au exprimat un tipar granulos în citoplasma enterocitelor, peste nuclei, spre porțiunea luminală a țesutului de acoperire. În celulele caliciforme, semnalul fiind perceput cel mai des sub nucleu. Celulele stromale au prezentat și ele, un tipar granular în domeniul citoplasmatic (Figura 1.A-D).

În adenocarcimoamele înalt diferențiate, partea majoră a semnalului fiind încă percepută spre zona luminală a celulelor neoplazice, deși întamplator s-a perceput un tipar granular al semnalului în polul inferior al celulelor (Figura 18.A-D).

Figura 18.A. Adenocarcinom înalt diferențiat, imunomarcaj utilizat pentru receptori B2A cu DAB, aspect de culoare RGB, X400.

Figura 18.B. Adenocarcinom înalt diferențiat, imagine mixată, colorația albastră și maro suprapuse; imagine în contrast cu colorația HE, X400.

Figura 18.C. Adenocarcinom înalt diferențiat, cadru nemixat, semnal pur DAB pentru receptorii B2A expus în maro, X400.

Figura 18.D. Adenocarcinom înalt diferențiat, cadru nemixat, semnal pur hematoxilină- eozină expus în albastru, X400.

În adenocarcinoamele moderat diferențiate expresia a dat impresia că-și piarde aspectul granular, semnalul prefacâdu-se mai difuz și mai pregnant în celule epiteliale (Figura 19.A-D).

Figura 19.A. Adenocarcinom moderat diferențiat, imunoexpunerea pentru receptori B2A cu DAB, aspect de culoare RGB, X400.

Figura 19.B. Adenocarcinom moderat diferențiat, cadru mixat, nuanțele albastru și maro suprapuse; cadru contrastat cu hematoxilină-eozină, X400.

Figura 19.C. Adenocarcinom moderat diferențiat, expunere nemixată semnal pur DAB pentru receptorii B2A prezentat în maro, X400.

Figura 19.D. Adenocarcinom moderat diferențiat, expunere nemixată semnal pur hematoxilină- eozină prezentat în albastru, X400.

Cu privire la adenocarcinoamele slab diferențiate, forța semnalului a escaladat în citoplasma celulelor neoplazice, iar pe un decor în general intens a fost capabilă identificarea punților de semnal deosebit de intense în împrejurimea nucleilor (Figura 20A-D, 21A-D). În același timp, s-a descoperit întamplator semnal cu tipar granular pana și în nuclei ori în pliurile membranei perinucleare. Cuantificarea directă a celulelor neoplazice care manifestă semnal intranuclear sau perinuclear a scos la iveală o distribuire heterogenă cu o medie de circa 12.84% a celulelor ce au prezentat acest tipar (± 13.10 % – DS, min= 4%, max= 50%).

Figura 20.A. Adenocarcinom slab diferențiat, imunoexpunere pentru receptori B2A cu DAB, relief de culoare RGB, X400.

Figura 20.B. Adenocarcinom slab diferențiat, cadru mixat, nuanțele albastru și maro suprapuse; expunere contrastată cu hematoxilină-eozină, X400.

Figura 20.C. Adenocarcinom slab diferențiat, expunere nemixată semnal pur DAB pentru receptorii B2A prezentat în maro, X400.

Figura 20.D. Adenocarcinom slab diferențiat, cadru nemixat semnal pur hematoxilină- eozină expus în albastru, X400.

Figura 21.A. Adenocarcinom slab diferențiat, imunoindicator pentru receptori B2A cu DAB, aspect de culoare RGB, X400.

Figura 21.B. Adenocarcinom slab diferențiat, expunere mixată, nuanțele albastru și maro suprapuse; cadru contrastat cu hematoxilină-eozină, X400.

Figura 21.C. Adenocarcinom slab diferențiat, expunere nemixată semnal pur DAB pentru receptorii B2A prezentat în maro, X400.

Figura 21.D. Adenocarcinom slab diferențiat, expunere nemixată semnal pur hematoxilină- eozină expus în albastru, X400.

În medie nu s-au descoperit diferențe între semnalul receptorilor B2A din stroma stadiilor variate ale formatiunilor și lotul martor.

Receptorii B2A fiind întalniti în celulele stromale cât și în formațiunile nervoase și ganglionii nervoși. Atât în plexul submucos dar și în plexul mienteric, semnalul receptorilor B2A manifestat un tipar dens-difuz în domeniul citoplasmatic al celulelor ganglionare, dar și în citoplasma celulelor satelit (Figura 22.A-D – Figura 24.A-D). Manifestarea acestui semnal s-a prezentat mai vagă în interiorul citoplasmei celulelor Schwann de la nivelul fasciculelor nervoase conturate în țesutul non-tumoral.

În țesutul tumoral s-a manifestat o dispunere oarecum mai densă la nivelul citoplasmatic al celulelor ganglionare și, în mod particular, în fasciculele nervoase cu calibru mai mare s-a remarcat o escaladare a densității semnalului în paralel cu țesutul non-tumoral. Fasciculele nervoase cu calibru mai mic (cu diametru sub 20 µm) s-au colorat foarte puțin atât în țesutul neoplazic, dar și în cel de control.

Figura 22.A. Plexul Auerbach, imunoindicator pentru receptori B2A cu DAB, aspect de culoare RGB, X400.

Figura 22.B. Plexul Auerbach, imagine mixată, culorile albastru și maro suprapuse; imagine contrastată cu hematoxilină-eozină, X400.

Figura 22.C. Plexul Auerbach, cadru nemixat semnal pur DAB pentru receptorii B2A expus în maro, X400.

Figura 22.D. Plexul Auerbach, cadru nemixat semnal pur hematoxilină- eozină expus în albastru, X400.

Figura 23.A. Nerv simplu, imunoindicator pentru receptori B2A cu DAB, aspect de culoare RGB, X200.

Figura 23.B. Nerv simplu, expunere mixată, nuanțele albastru și maro suprapuse; expunere contrastată cu hematoxilină-eozină, X200.

Figura 22.C. Nerv simplu, cadru nemixat semnal pur DAB pentru receptorii B2A expus în maro, X200.

Figura 23.D. Nerv simplu, cadru nemixat semnal pur hematoxilină- eozină expus în albastru, X200.

Figura 24.A. Invazie perineurală, imunoindicator pentru receptori B2A cu DAB, aspect de culoare RGB, X400.

Figura 24.B. Invazie perineurală, cadru mixat, nuanțele albastru și maro suprapuse; cadru contrastat cu hematoxilină-eozină, X400.

Figura 24.C. Invazie perineurală, cadru nemixat semnal pur DAB pentru receptorii B2A expus în maro, X400.

Figura 24.D. Invazie perineurală, expunere nemixată semnal pur hematoxilină- eozină prezentat în albastru, X400.

II.4.1.2. Tiparul expresiei receptorilor B2A în mucoasa colică normală și în diferite grade de diferențiere ale adenocarcinomului colorectal.

În acestă lucrare au fost examinați zece indivizi pentru grupul de control și 19 bolnavi pentru fiecare clasă de diferențiere tumorală. Exprimarea receptorilor B2A fiind examinată prin stabilirea atât a suprafeței dar și a densității optice integrate (integrated optical density – IOD) a semnalului, la nivelul țesutului total dar și în epiteliu și stroma la toate cazurile cuprinse în această lucrare, iar concluziile au fost redate în medie ± SD.

Cu privire la expresia receptorilor B2A în totalitatea țesutului aparținând fiecărui pacient în parte ce a fost inclus în studiu, am descoperit că a este prezentă o evoluție graduală atât a suprafeței cât și a IOD (Figura 25, 26) de la țesutul sanatos la gradele variate de diferențiere ale adenocarcinomului colorectal, G1, G2 și G3 (de la 5596.4 ± 3395.9 µm2 pentru suprafață și 862275.0± 468788.7 pentru IOD în țesutul colonic normal la 11585.3 ± 5523.3 µm2 pentru suprafață și 1717362.9± 886276.2 pentru IOD în G1, 27881.1± 12128.5 µm2 pentru suprafață și 4240639.2± 1795331.7 pentru IOD în G2 și 37328.5± 9748.5 µm2 pentru suprafață și 5561160.5± 1721179.6 pentru IOD în G3).

Figura 25. Suprafața totală a semnalului receptorilor B2A.

Figura 26. IOD totală a semnalului receptorilor B2A.

Am constatat o deosebire statistică importantă la evaluarea varianței ANOVA succedată de testul post-hoc Bonfferoni la manifestarea semnalului din țesutul normal colonic și manifestarea acestuia din G2,G3 (p=0.000) și de altfel între G1 și G2, G3 (p=0.000) atât pentru suprafață dar și pentru IOD B2A.

Manifestul receptorilor B2A doar în epiteliul glandular a prezentat o escaladare graduală la fel ca expresia receptorilor B2A în țesutul total (Figura 27, 28), de la epiteliul colonic sănătos la G1, G2 și G3 (de la 3077.4 ± 1894.3 µm2 pentru suprafață și 485530.8 ± 299632.9 pentru IOD în epiteliul colonic sanatos la 7988.6 ± 5333.5 µm2 pentru suprafață și 1255041.6 ± 834265.5 pentru IOD în G1, 25423.0 ± 11112.6511 µm2 pentru suprafață și 3916561.91± 1675540.4 pentru IOD în G2 și 34780.1 ± 9256.9 µm2 suprafață respectiv 5185655.0 ± 1678804.2 pentru IOD în G3). În plus, în situația de față, am remarcat o fluctuație statistică semnificativă dintre țesutul colonic sănătos și G2, G3, asemănător cu manifestarea receptorilor B2A în țesutul total (p=0.000) respectiv între G1, G2 și G3 pe de altă parte (p=0.000), suplimentar am remarcat o deosebire statistic importantă între G2 și G3 (p=0.047) însă numai cu privire la aria semnalului, pentru IOD nefiind constatate diferențe statistic semnificative (p=0.141)..

Figura 27. Suprafața semnalului receptorilor B2A numai în epiteliul glandular.

Figura 28. IOD semnalului receptorilor B2A doar în epiteliul glandular.

În ceea ce privește compararea mediei ariei și IOD receptorilor B2A din stroma mucoasei colonice normale și diferitele grade de diferențiere ale adenocarcinomului colorectal,nu s-au gasit diferențe semnificative.(Figura 29, 30).. Aceste informații sugerează o escaladare a expresiei receptorilor B2A împreună cu gradul tumoral prin pricina epiteliului și nu a stromei.

Figura 29. Suprafața semnalului receptorilor B2A doar în stromă.

Figura 30. IOD semnalului receptorilor B2A doar în stromă.

II.4.1.3. Corelații între expresia receptorilor B2A și caracteristicile clinicopatologice ale pacienților incluși în studiu.

Atât suprafața receptorilor B2A dar și IOD au fost in legatură statisctic importantă cu mărimea formațiunii, invazia tumorală și diseminările în ganglionii lifatici regionali, pe de altă poarte între sexul pacienților, epicentrul tumorii și profilul macroscopic nu s-au remarcat legături statistice importante. În legatură cu vârsta bolnavilor, nu s-a sesizat o diferență importantă statistic pentru suprafața B2A între lotul de pacienți cu vârsta sub 60 de ani și grupul de bolnavi cu vârsta mai mare decât acest cut-off, iar pentru IOD B2A s-a remarcat o fluctuație statistic semnificativă (p=0.018). În plus, pentru formatiunile G1 am determinat că suprafața receptorilor B2A în epiteliu este în legatură inversă cu suprafața plexului Auerbach [r(14)=-0.540, p<0.05], iar pentru formațiunile G2 aria receptorilor B2A din epiteliul glandular a prezentat o deosebire indirectă atât cu suprafața plexului Auerbach [r(14)=-0.460, p<0.05] cât și cu cea a plexului Meissner [r(14)=-0.830, p<0.01]. Pentru ultimul grad de diferențiere G3 s-a aratat o corelație răsturnată atât cu aria plexului Auerbach [r(14)=-0.579, p<0.05] dar și cu cea a plexului Meissner [r(14)=-0.943, p<0.05]. În țesutul martor am detectat o corelație indirectă intensă între suprafața receptorilor B2A și suprafața relativă a plexului Auerbach [r(7)=-0.889, p<0.01], însa negativa și între aria receptorilor B2A și plexul Meissner.

II.4.2. Evaluarea expresiei receptorilor B2A în țesutul normal peritumoral la pacienții cu CCR.

Manifestarea receptorilor B2A a fost examinată în 64 de secțiuni de țesut sanatos de la nivel colorectal, din vecinatatea imediată a frontului de invazie tumorală.

Am dedus că este prezentă o corelație pozitivă între manifestarea receptorilor B2A în țesutul normal din vecinătatea tumorii și genul feminin, lotul cu vârstă mai mare de 50 de ani, mărimea tumorii >5 cm, invazia tumorală T3-4 și diseminarea în ganglionii limfatici din regiune N≥2. Cu privire la localizarea tumorală nu sunt deosebiri semnificativ statice. Toate aceste idei sunt afișate în Figura 31 – 36.

Figura 31. Expresia receptorilor B2A în țesutul sanatos peritumoral în funcție de sex (media, deviația standard și valoare p).

Figura 32. Expresia receptorilor B2A în țesutul sanatos peritumoral din punct de vedere al vârstei (media, deviația standard și valoare p).

Figura 33. Expresia receptorilor B2A în țesutul sanatos peritumoral dependentă de dimensiunea tumorii (media, deviația standard și valoare p).

Figura 34. Expresia receptorilor B2A în țesutul normal peritumoral dependentă de locul tumorii (media, deviația standard și valoare p).

Figura 35. Expresia receptorilor B2A în țesutul normal peritumoral dependentă de invazia tumorii (media, deviația standard și valoare p).

Figura 36. Expresia receptorilor B2A în țesutul sanătos peritumoral dependentă de diseminarea în ganglionii limfatici regionali (Media, deviația standard și valoare p).

Evaluând expresia receptorilor B2A din acest țesut aflat in vecinatatea tumorii în funcție de diferențierea tumorii, am constatat o deosebire semnificativa statistică între expresia receptorilor B2A din G1, G2 și manifestarea acestora din G3 (p=0.001) .

II.5. Discuții

Atât microclimatul neoplazic cât și cofactorii săi joacă un rol foarte important în cancerogeneza colorectală cât și în evoluția tumorală.

Interdependențele dintre celulele maligne, cele ale endoteliului vascular, matrixul extracelular, componentele sistemului imun cât și alte elemente, au profitat de un număr mare de studii extinse în ultimii ani pentru implementarea de noi procedee de terapie țintită molecular (ex: tratamentele antiangiogenice) [74]. În pofida acestui fapt, sistemele ce sunt incriminate în patogenia și extinderea neoplasmului colorectal se gasesc și la această oră departe de a fi deslușite în întregime. În patogenia și dezvoltarea cancerului colorectal,factorii nervoași din microclimatul tumoral par să aibă un rol principal. Spre exemplu, cu privire la invazia perineurală, Florian Liebl ș.a., într-o cercetare ce a cuprins 673 de bolnavi diagnosticați cu neoplasm colorectal, a descoperit că invazia perineurală afectează în mod negativ supraviețuirea bolnavilor cu CCR [82]. In pofida acestui fapt nu se știe cu certitudine la această oră dacă elementele nervoase sunt implicate mai întâi în interlegaturile neuro-neoplazice, ori dacă acestă sarcină îi revine celulelor maligne atât la nivelul colonului si rectului, dar și în alte focare ale procesului neoplazic.

În lucrarea noastră am studiat interlegaturile neuro-neoplazice în adenocarcinomul colorectal în ceeea ce privește caracterul funcțional, prin aprofundarea expresiei receptorilor B2A în adenocarcinomul colorectal.

În legatură cu configurația funcțională în interrelațiile neuro-neoplazice localizată la nivel colorectal, am selecționat să aprofundez expresia receptorilor B2A întrucât până la momentul de față s-au dezvăluit căi variate si multiple de semnalizare intracelulară intermediate de acest tip de receptori, care sunt incriminate în începerea, evoluția și diseminarea cancerului, așa cum vom prezenta mai jos.

Neurotransmițătorii care stimulează receptorii B2A sunt reprezentați în principal de epinefrină și norepinefrină. Sarcina norepinefrinei în neoplazia colorectal a fost nuanțat prin intensificarea activității locomotorii a celulelor SW 480 de adenocarcinom colorectal și prin inhibarea consecințelor acesteia tipul prezentat de celule prin folosirea unui beta blocant neselectiv de tipul propanololului [83]. De asemenea, așa cum am expus și în partea întâi a acestei lucrari, chiar dacă noradrenalina nu se secretată în mod direct din neuronii enterici, deplasarea noradrenalinei, ce joacă un rol fundamental în intermedierea efectelor îndeplinite de aceast neurotransmițător, este redată prin intermediul neuronilor enterici [71]. De astfel, epinefrina acționează pe tipul acesta de receptori reprezentând cel mai remarcabil agonist al B2A [84] . Studii multiple au pus în evidență acțiunea acesteia în adenocarcinomul colorectal [85].

Este larg înțeles ca receptorii B2A ai acestor neurotransmițători sunt receptori legați cu proteine G [76] și stimularea lor poate produce o multitudine de mijloace de comunicare intracelulară incriminate în carcinogeneză, cum este activarea cascadei acidului arahidonic, cât și alte mijloace prin prisma mesagerului secundar adenozin monofosfat ciclic (cyclic adenosine monophosphate – cAMP) [74]. Diferite alte mijloace de comunicare intracelulară pot fi: tirozin-protein kinaza Src (c-Src) incriminată în evoluția neoplasmului cât și în activarea diverselor alte căi de semnalizare; protein kinaza stimulată de factori mitogeni (mitogen-activated protein kinase – MAPK); protein kinaza B (Akt); kinazele activate de indicatorii extracelulari (extracellular signal-regulated kinases – ERK1/2); factori de răspuns petru adenozin monofosfatul ciclic (cAMP response elements – CREB) care se lipesc de anumite secvențe ADN producând diminuarea sau sporirea transcripției unor gene în aval [74]. Acest exemplu de receptori a fost analizat și în alte neoplazii ca neoplasmul de pancreas [74], neoplasmul de plămâni [86], neoplasmul de sân [87], neoplasmul de prostată [88] ș.a. În plus, analiza receptorilor B2A în lucrarea de licență de față a relevat o localizare probabilă intra/peri nucleară a acestei tipologii de receptori în adenocarcinoamele slab diferențiate, evocând o conexiune și mai puternică în semnalizarea intracelulară intermediată de tipul acesta de receptori în formațiunile slab diferențiate. Chiar dacă momentan nu sunt disponibile numeroase informații care să ateste în mod concret conexiunea dintre gradul de manifestare al receptorilor B2A și recidiva bolii, respectiv progresia clinică a bolnavilor, în viitor indivizii cuprinși în studiul de față vor fi monitorizați pentru a obține concluzii și în acest sens. Actual, detectarea intra/peri nucleară a acestor receptori B2A raportandu-se decât în cazul miocardocitelor din ventricul [89], însă în acestă lucrare este prezentată pentru prima dată localizarea în celulele adenocarcinomului colorectal. Cercetări viitoare cu caracter funcțional în plus și de microscopie electronică sunt utile pentru a desluși implicațiile acestei cercetări.

Consecințele studiului expresiei receptorilor B2A la nivelul cancerului colorectal sunt în acord cu numeroasele studii ce s-au realizat în ultima perioadă și care au voit să descifreze rolul avut de transmițătorii neuronali ai sitemului nervos prin prisma receptorilor expuși de celulele cancerului colorectal [90-93].

II.6. Concluzii

Adenocarcinomul colorectal se menține în topul celor mai mari probleme de sănătate publică, reprezentând un neoplasm a cărui incidență și prevalență se găsesc o axă ascendentă la nivel mondial.

Sistemele ce sunt incriminate în patogenia și progresia neoplasmului colorectal sunt și la ora actuală la mare distanță de a fi deslușite pe deplin.

În patogenia și progresia neoplasmului colorectal, factorii nervoși din microclimatul tumoral par să prezinte un rol important.

Receptorii B2A au fost identificați în celulele stromale dar și în nervii și ganglionii nervoși.

Calculul direct al celulelor tumorale ce manifestă semnal intranuclear/perinuclear pentru receptorii B2A a nuanțat o dispersie heterogenă cu o medie de 12.84% a celulelor ce au prezentat acest tipar.

În legătură cu expresia receptorilor B2A in totalitatea țesutului aparținând fiecărui individ inclus în cercetare, am depistat existența unei evoluții graduale atât a suprafeței dar și a IOD de la țesutul sănătos la diferitele grade de diferențiere ale neoplasmului colorectal, G1, G2 respectiv G3.

Manifestarea receptorilor B2A doar în epiteliul glandular a prezentat o evoluție graduală asemănătoare expresiei receptorilor B2A din țesutul total (Figura 26, 27), de la țesutul colonic sănătos la G1, G2, respectiv G3.

Per ansamblu nu s-au identificat diferențe majore între semnalul receptorilor B2A din stroma distinctelor stadii de tumori și grupul martor.

Atât suprafața receptorilor B2A dar și IOD au fost asociate semificativ statistic cu mărimea tumorii, invazia și diseminările neoplasmului în ganglionii limfatici regionali, în ceea ce privește sexul pacienților, localizarea formațiunii și profilul macroscopic nu s-au constatat diferențe statistic semnificative.

În privința vârstei bolnavilor, nu s-a regăsit diferență statistică semnificativă pentru suprafața receptorilor B2A între lotul de bolnavi cu vârsta de sub 60 de ani și lotul de indivizi cu vârsta dicolo de acest cut-off, iar pentru IOD B2A a fost prezentă o diferență statistic semnificativă.

Am descoperit că există o legătură pozitivă între manifestul receptorilor B2A în țesutul sănătos peritumoral și genul feminin, lotul de vârstă mai mare de 50 de ani, dimensiunea formațiunii peste 5 cm, invazia neoplazică T3-4 și diseminare în ganglionii limfatici regionali N≥2. Cu privire la localizarea tumorală nu sunt expuse diferențe statistic semnificative.

Cercetarea expresiei receptorilor B2A în țesutul sănătos peritumoral după stadiul de diferențiere tumorală, am constat o fluctuație statistic semnificativă între manifestarea receptorilor B2A din G1, G2 și expresia acesta din G3.

În concluzie, se poate afirma că receptorii B2A pentru epinefrină și norepinefrină, sunt detectați atât în mucoasa colonică sănătoasă cât și în celulele neoplasmului colorectal, sugerând ca atât sistemul nervos, prin neurotransmițătorii eliberați, iși realizează influența asupra cancerului colorectal prin prisma receptorilor expuși anterior și exprimați de celulele adenocarcinomului colorectal. Deopotrivă, receptorii B2A pot prezenta și un rol important în tratamentul antineoplazic și se pot folosiți factor important de prognostic.

Referințe

Miller KD, Siegel RL, Lin CC, Mariotto AB, Kramer JL, Rowland JH, Stein KD, Alteri R, Jemal A. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 2016 Jul; 66(4):271-89.

Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin DM, Forman D, Bray F. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer, 2015, 136(5):E359–E386.

Ferlay J, Steliarova-Foucher E, Lortet-Tieulent J, Rosso S, Coebergh JW, Comber H, Forman D, Bray F. Cancer incidence and mortality patterns in Europe: estimates for 40 countries in 2012. Eur J Cancer. 2013 Apr; 49(6):1374-403.

Fitzmaurice C, Moradi-Lakeh M, MacIntyre MF, Allen C, Hansen G, Woodbrook R, Wolfe C, Hamadeh RR, Moore A, Werdecker A, Gessner BD, Te Ao B, McMahon B, Karimkhani C, Dicker D, Pain A, Hamavid H, Yu C, Carpenter DO, Pereira DM, Nash D, Kazi DS, De Leo D, Plass D, Ukwaja KN, Thurston GD, Yun Jin K, Cooke GS, Schwebel DC, Simard EP, Mills E, Park EK, Catalá-López F, deVeber G, Gotay C, Khan G, Hosgood HD 3rd, Jonas JB, Sanabria J, Esteghamati A, Hankey GJ, Ali R, Lunevicius R, Beardsley J, Jacobsen KH, Takahashi K, Franklin RC, Ronfani L, Santos IS, Leasher JL, Singh J, Leigh J, Montico M, Naldi L, Shrime MG, Younis M, Yonemoto N, Breitborde N, Yip P, Pourmalek F, Tonelli M, Geleijnse J, Petzold M, Lotufo PA, Malekzadeh R, Dellavalle R, Weintraub R, Lucas R, Hay R, Vasankari T, Alsharif U, Rahimi-Movaghar V, Rojas-Rueda D, Westerman R, Sepanlou SG, Nolte S, Patten S, Weichenthal S, Abera SF, Fereshtehnejad SM, Shiue I, Driscoll T, Vlassov VV, Marcenes WS, Mekonnen W, MacLachlan J, Mueller U, Kim D, Melaku YA, Yano Y, Artaman A, Campos I, Dandona R, Murthy K, Cowie B, Trillini M, Eshrati B, Williams HC, Shibuya K, Amare AT, Antonio CA, Castañeda-Orjuela C, van Gool CH, Violante F, Oh IH, Deribe K, Soreide K, Knibbs L, Kereselidze M, Green M, Cardenas R, Roy N, Tillmann T, Li Y, Krueger H, Monasta L, Sreeramareddy CT, Dandona L, Wang H, Dey S, Sheikhbahaei S, Hafezi-Nejad N, Kumar GA, Vollset SE, Mokdad A, Salomon JA, Lozano R, Vos T, Forouzanfar M, Lopez A, Murray C, Naghavi M. The Global Burden of Cancer 2013. JAMA Oncol. 2015 Jul;1(4):505-27

Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 2015 Jan-Feb; 65(1):5-29.

Van Cutsem E, Cervantes A, Nordlinger B, Arnold D; ESMO Guidelines Working Group. Metastatic colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2014;25 (Suppl 3):1-9.

Viguier J, Bourlier P, Karsenti D, de Calan L et Danquechin Dorval E. Cancer du côlon. Encycl Méd Chir (Editions Scientifiques et Médicales Elsevier SAS, Paris, tous droits réservés), Gastro-entérologie, 9-068-A-10, 2003, 1 – 18.

Tougeron D. Carcinogenese colorectale, donnees fondamentales. EMC – Gastro-enterologie, 2014; 9 (3): 1 – 15.

Ballester V, Cruz-Correa M. Endoscopic Surveillance of Gastrointestinal Premalignant Lesions: Current Knowledge and Future Directions. Current opinion in gastroenterology. 2014; 30(5):477-483.

Rex DK, Ahnen DJ, Baron JA, Batts KP, Burke CA, Burt RW, Goldblum JR, Guillem JG, Kahi CJ, Kalady MF, O'Brien MJ, Odze RD, Ogino S, Parry S, Snover DC, Torlakovic EE, Wise PE, Young J, Church J. Serrated lesions of the colorectum: review and recommendations from an expert panel. Am J Gastroenterol. 2012 Sep; 107(9):1315-29.

Crockett SD, Snover DC, Ahnen DJ, Baron JA. Sessile serrated adenomas: an evidence-based guide to management. Clin Gastroenterol Hepatol. 2015 Jan; 13(1):11-26.

Lieberman DA, Rex DK, Winawer SJ, Giardiello FM, Johnson DA, Levin TR, United States Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer. Guidelines for colonoscopy surveillance after screening and polypectomy: a consensus update by the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer. Gastroenterology. 2012;143(3):844–857.

Baron TH, Smyrk TC, Rex DK. Recommended intervals between screening and surveillance colonoscopies. Mayo Clinic proceedings. 2013;88(8):854–858.

Organization WH. WHO Report on the Global Tobacco Epidemic, 2011. The mPower Package. 2011.

Huggett MT, Pereira SP. Diagnosing and managing pancreatic cancer. Practitioner. 2011;255:21–5.

Botteri E, Iodice S, Bagnardi V, Raimondi S, Lowenfels AB, Maisonneuve P. Smoking and colorectal cancer: a metaanalysis. JAMA 2008; 300: 2765-2778.

Cancer Care Ontario. Cancer Risk Factors in Ontario: Tobacco. Toronto, Canada, 2014. Valabil la https://www.cancercare. on.ca/common/pages/UserFile.aspx?fileId=294737 (accesat la 01.04.2018).

V. Fedirko, I. Tramacere, V. Bagnardi, M. Rota, L. Scotti, F. Islami, E. Negri, K. Straif, I. Romieu, C. La Vecchia, P. Boffetta, and M. Jenab. Alcohol drinking and colorectal cancer risk: an overall and dose–response meta-analysis of published studies. Ann Oncol, 2011; 22 (9): 1958-1972.

Svensson T, Yamaji T, Budhathoki S, Hidaka A, Iwasaki M, Sawada N, Inoue M, Sasazuki S, Shimazu T, and Tsuganeb S. Alcohol consumption, genetic variants in the alcohol- and folate metabolic pathways and colorectal cancer risk: the JPHC Study, 2016; 6: 36607.

Boffetta P, Hashibe M. Alcohol and cancer. Lancet Oncol 2006; 7: 149-156.

Tilg H, Moschen AR. Mechanisms behind the link between obesity and gastrointestinal cancers. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 2014; 28(4), 599-610.

Byeon JS, Jeong JY, Kim MJ, Lee SM, Nam WH, Myung SJ. Adiponectin and adiponectin receptor in relation to colorectal cancer progression. Int J Cancer, 2010; 127: 2758-67.

Endo H, Hosono K, Uchiyama T, Sakai E, Sugiyama M, Takahashi H et. al. Leptin acts as a growth factor for colorectal tumours at stages subsequent to tumour initiation in murine colon carcinogenesis. Gut, 2011; 60: 1363-71.

McCullough M., Gapstur SM, Shah R., Jacobs EJ, Campbell PT. Association between red and processed meat intake and mortality among colorectal cancer survivors. Journal of Clinical Oncology, 2013; 49:1126.

Bouvard V, Loomis D, Guyton KZ, Grosse Y, Ghissassi FE, Benbrahim-Tallaa L, Guha N, Mattock H, Straif K; International Agency for Research on Cancer Monograph Working Group. Carcinogenicity of consumption of red and processed meat, 2015; 16(16):1599-600.

World Cancer Research Fund, American Institute for Cancer Research. Food, Nutrition, Physical Activity and the Prevention of Cancer: A Global Perspective 2007. Valabil la http://www.aicr. org/assets/docs/pdf/reports/Second_Expert_Report.pdf (accesat în 01.05.2018).

World Cancer Research Fund, American Institute for Cancer Research. Continous Update Project Report. Food, Nutrition, Physical Activity, and the Prevention of Colorectal Cancer 2011. Valabil la http://www.wcrf.org/sites/default/files/Colorectal-Cancer-2011-Report.pdf (accesat la 01.05.2018)

Ajouz H, Mukherji D, Shamseddine A. Secondary bile acids: an underrecognized cause of colon cancer. World journal of surgical oncology, 2014; 12(1): 1.

Payne CM, Bernstein C, Dvorak K, Bernstein H: Hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon carcinogenesis. Clin Exp Gastroenterol. 2008; 1: 19-47.

Louis P, Hold GL, Flint HJ. The gut microbiota, bacterial metabolites and colorectal cancer. Nat Rev Microbiol. 2014 Oct;12(10):661-72.

Rubenstein JH, Enns R, Heidelbaugh J, Barkun A, Clinical Guidelines C: American Gastroenterological Association Institute guideline on the diagnosis and management of Lynch syndrome. Gastroenterology, 2015; 149: 777-782.

Stoffel EM, Mangu PB, Limburg PJ; American Society of Clinical Oncology.; European Society for Medical Oncology. Hereditary colorectal cancer syndromes: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline endorsement of the familial risk-colorectal cancer: European Society for Medical Oncology clinical practice guidelines.J Oncol Pract. 2015 May;11(3):e437-41.

Carethers JM. Differentiating Lynch-like from Lynch syndrome. Gastroenterology 2014; 146: 602-604

Li YC, Korol AB, Fahima T, Beiles A, Nevo E. Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review. Mol Ecol 2002; 11: 2453-2465.

Lynch HT, Lynch PM, Lanspa SJ, Snyder CL, Lynch JF, Boland CR: Review of the Lynch syndrome: history, molecular genetics, screening, differential diagnosis, and medicolegal ramifications. Clin Genet, 2009; 76: 1–18.

Vasen H, Watson P, Mecklin JP, Lynch H. New clinical criteria for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International Collaborative Group on HNPCC. Gastroenterology, 1999; 116(6), 1453–1456.

Balmaña J, Balaguer F, Cervantes A, Arnold D. Familial risk-colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines. Ann Oncol, 2013; 24 Suppl 6:vi73-80.

Groen EJ, Roos A, Muntinghe FL et al. Extra-intestinal manifestations of familial adenomatous polyposis. Ann Surg Oncol, 2008; 15: 2439–2450.

Nielsen M, Hes FJ, Nagengast FM et al. Germline mutations in APC and MUTYH are responsible for the majority of families with attenuated familial adenomatous polyposis. Clin Genet 2007; 71: 427–433.

Fearnhead NS, Britton MP, Bodmer WF. The ABC of APC. Hum Mol Genet 2001; 10: 721-733.

Grover S, Kastrinos F, Steyerberg EW et al. Prevalence and phenotypes of APC and MUTYH mutations in patients with multiple colorectal adenomas. JAMA, 2012; 308: 485–492.

Tian X, Liu Z, Niu B, Zhang J, Tan TK, Lee SR, Zhao Y, Harris DC, Zheng G. E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier. J Biomed Biotechnol 2011; 2011: 567305.

Draviam VM, Shapiro I, Aldridge B, Sorger PK. Misorientation and reduced stretching of aligned sister kinetochores promote chromosome missegregation in EB1- or APC-depleted cells. EMBO J 2006; 25: 2814-2827.

Al-Tassan N, Chmiel NH, Maynard J, Fleming N, Livingston AL, Williams GT, Hodges AK, Davies DR, David SS, Sampson JR, Cheadle JP. Inherited variants of MYH associated with somatic G:C–>T:A mutations in colorectal tumors. Nat Genet. 2002 Feb;30(2):227-32.

Boparai KS, Mathus-Vliegen EM, Koornstra JJ, Nagengast FM, van Leerdam M, van Noesel CJ, Houben M, Cats A, van Hest LP, Fockens P, Dekker E. Increased colorectal cancer risk during follow-up in patients with hyperplastic polyposis syndrome: a multicentre cohort study. Gut. 2010 Aug;59(8):1094-100.

Suchanek S, Grega T, Ngo O, Vojtechova G, Majek O, Minarikova P, Brogyuk N, Bunganic B, Seifert B, Dusek L, Zavoral M. How significant is the association between metabolic syndrome and prevalence of colorectal neoplasia? World J Gastroenterol. 2016 Sep 28;22(36):8103-11.

McAuliffe JC, Christein JD. Type 2 diabetes mellitus and pancreatic cancer. Surg Clin North Am 2013; 93: 619-627.

Inal A, Kaplan MA, Kucukoner M, Urakcı Z, Kılınc F, Isıkdogan A. Is diabetes mellitus a negative prognostic factor for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer? Rev Port Pneumol 2014; 20: 62-68

Shah MM, Erickson BK, Matin T, McGwin G, Martin JY, Daily LB, Pasko D, Haygood CW, Fauci JM, Leath CA. Diabetes mellitus and ovarian cancer: more complex than just increasing risk. Gynecol Oncol 2014; 135: 273-277.

Xu H, Jiang HW, Ding GX, Zhang H, Zhang LM, Mao SH, Ding Q. Diabetes mellitus and prostate cancer risk of different grade or stage: a systematic review and meta-analysis. Diabetes Res Clin Pract 2013; 99: 241-249.

Nayan M, Finelli A, Jewett MA, Juurlink DN, Austin PC, Kulkarni GS, Hamilton RJ. Diabetes and kidney cancer outcomes: a propensity score analysis. Endocrine. 2016 Nov 4.

Shinozaki M, Kobayashi K, Kunisaki R, Hisamatsu T, Naganuma M, Takahashi K, Iwao Y, Suzuki Y, Watanabe M, Itabashi M, Torii A, Takazoe M, Sugita A. Surveillance for Dysplasia in Patients with Ulcerative Colitis: Discrepancy between Guidelines and Practice. Dig Endosc. 2017 Jan 9.

Axelrad JE, Lichtiger S, Yajnik V. Inflammatory bowel disease and cancer: The role of inflammation, immunosuppression, and cancer treatment. World J Gastroenterol. 2016 May 28;22(20):4794-801.

Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 2001 Apr; 48(4):526-35.

Vilar L., Naves L. A., Caldato C., Caldato M. Acromegaly and colorectal cancer. Translational Gastrointestinal Cancer. 2015;4(1):28–38.

Coppedè F, Lopomo A, Spisni R, Migliore L. Genetic and epigenetic biomarkers for diagnosis, prognosis and treatment of colorectal cancer. World J Gastroenterol. 2014 Jan 28;20(4):943-56.

Tariq K, Ghias K. Colorectal cancer carcinogenesis: a review of mechanisms. Cancer Biol Med. 2016 Mar;13(1):120-35.

Müller MF, Ibrahim AE, Arends MJ. Molecular pathological classification of colorectal cancer. Virchows Arch. 2016 Aug;469(2):125-34.

Raskov H, Pommergaard HC, Burcharth J, Rosenberg J. Colorectal carcinogenesis–update and perspectives. World J Gastroenterol. 2014 Dec 28;20(48):18151-64.

Kudryavtseva AV, Lipatova AV, Zaretsky AR, Moskalev AA, Fedorova MS, Rasskazova AS, Shibukhova GA, Snezhkina AV, Kaprin AD, Alekseev BY, Dmitriev AA, Krasnov GS. Important molecular genetic markers of colorectal cancer. Oncotarget. 2016 Aug 16;7(33):53959-53983.

Rodrigues D, Longatto-Filho A, Martins SF. Predictive Biomarkers in Colorectal Cancer: From the Single Therapeutic Target to a Plethora of Options. Biomed Res Int. 2016;2016:6896024.

Aghagolzadeh P, Radpour R. New trends in molecular and cellular biomarker discovery for colorectal cancer. World J Gastroenterol. 2016 Jul 7;22(25):5678-93.

Colussi D, Brandi G, Bazzoli F, Ricciardiello L. Molecular pathways involved in colorectal cancer: implications for disease behavior and prevention. Int J Mol Sci. 2013 Aug 7; 14(8):16365-85.

Gregorieff A, Clevers H Genes Dev. Wnt signaling in the intestinal epithelium: from endoderm to cancer. 2005 Apr 15; 19(8):877-90.

Masuda M, Sawa M, Yamada T. Therapeutic targets in the Wnt signaling pathway: Feasibility of targeting TNIK in colorectal cancer. Pharmacol Ther. 2015 Dec;156:1-9.

Vakana E, Pratt S, Blosser W, Dowless M, Simpson N, Yuan XJ, Jaken S, Manro J, Stephens J, Zhang Y, Huber L, Peng SB, Stancato LF. LY3009120, a panRAF inhibitor, has significant anti-tumor activity in BRAF and KRAS mutant preclinical models of colorectal cancer. Oncotarget. 2016 Dec 16.

Halilovic E, She QB, Ye Q, Pagliarini R, Sellers WR, Solit DB, Rosen N. PIK3CA mutation uncouples tumor growth and cyclin D1 regulation from MEK/ERK and mutant KRAS signaling. Cancer Res. 2010 Sep 1; 70(17):6804-14.

Chiang EP, Tsai SY, Kuo YH, Pai MH, Chiu HL, Rodriguez RL, Tang FY. Caffeic acid derivatives inhibit the growth of colon cancer: involvement of the PI3-K/Akt and AMPK signaling pathways. PLoS One. 2014 Jun 24;9(6):e99631.

Hamilton SR, Bosman FT, Boffetta P, et al. Carcinoma of the colon and rectum. In: WHO Classification of Tumours of the Digestive System. Bosman FT, Carneiro F, Hruban RH, Theise ND, eds. Lyon: IARC Press, 2010:134-46.

Fleming M, Ravula S, Tatishchev SF, Wang HL. Colorectal carcinoma: Pathologic aspects. J Gastrointest Oncol. 2012 Sep;3(3):153-73.

American Joint Committee on Cancer. Adresă web: https://cancerstaging.org/referencestools/quickreferences/documents/colonmedium.pdf accesat în data de 01.05.2018.

Van Cutsem E, Cervantes A, Adam R, Sobrero A, Van Krieken JH, Aderka D, Benson A, Bodoky G, Ciardiello F, Aranda Aguilar E, Bardelli A, D'Hoore A, Diaz-Rubio E, Douillard JY, Ducreux M, Falcone A, Grothey A, Hoff P, Köhne CH, Labianca R, Laurent-Puig P, Gruenberger T, Haustermans K, Heinemann V, Ma B, Österlund P, Oyen WJ, Papamichael D, Pentheroudakis G, Pfeiffer P, Maughan T, Muro K, Normanno N, Price TJ, Punt C, Scheithauer W, Schmoll HJ, Ricke J, Roth A, Salazar R, Tabernero J, Taïeb J, Tejpar S, Wasan H, Yoshino T, Zaanan A, Arnold D. ESMO consensus guidelines for the management of patients with metastatic colorectal cancer. Ann Oncol. 2016 Aug;27(8):1386-422.

van de Velde CJ, Boelens PG, Borras JM, Coebergh JW, Cervantes A, van den Broek CB, Brown G, Blomqvist L, Beets-Tan RG, Van Cutsem E, Iversen LH, van Krieken JH, Marijnen CA, Espin E, Haustermans K, Glimelius B, Henning G, Gore-Booth J, Meldolesi E, Mroczkowski P, Quirke P, Rödel C, Roth A, Rutten H, Schmoll HJ, Smith JJ, Tanis PJ, Nagtegaal I, Naredi P, Ortiz H, Påhlman L, Taylor C, Wibe A, Wiggers T, Gambacorta MA, Aristei C, Valentini V. EURECCA colorectal: multidisciplinary management: European consensus conference colon & rectum.Eur J Cancer. 2014 Jan;50(1):1.e1-1.e34.

Schuller HM. Beta-adrenergic signaling, a novel target for cancer therapy? Oncotarget. 2010 Nov;1(7):466-9.

Vida G, Peña G, Kanashiro A, Thompson-Bonilla Mdel R, Palange D, Deitch EA, Ulloa L. FASEB J. β2-Adrenoreceptors of regulatory lymphocytes are essential for vagal neuromodulation of the innate immune system. 2011 Dec;25(12):4476-85.

Irina G, Katrin A, Terence EH. Organizational Complexity of b-adrenergic Receptor Signaling Systems. In: Wang Q, Benos DJ, Balaban R, Simon SA. Advances in Adrenergic Receptor Biology, Elsevier, 2011, 2:19-49.

Zhang X, Odom DT, Koo SH, Conkright MD, Canettieri G, Best J, Chen H, Jenner R, Herbolsheimer E, Jacobsen E, Kadam S, Ecker JR, Emerson B, Hogenesch JB, Unterman T, Young RA, Montminy M. Genome-wide analysis of cAMP-response element binding protein occupancy, phosphorylation, and target gene activation in human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Mar 22; 102(12):4459-64.

Zhang YL, Pang LQ, Wu Y, Wang XY, Wang CQ, Fan Y. Significance of Bcl-xL in human colon carcinoma. World J Gastroenterol. 2008 May 21;14(19):3069-73.

Novack DH, Cameron O, Epel E, Ader R, Waldstein SR, Levenstein S, Antoni MH, Wainer AR. Psychosomatic medicine: the scientific foundation of the biopsychosocial model. Acad Psychiatry. 2007 Sep-Oct;31(5):388-401.

Van Oudenhove L, Cuypers S. The relevance of the philosophical 'mind-body problem' for the status of psychosomatic medicine: a conceptual analysis of the biopsychosocial model. Med Health Care Philos. 2014 May;17(2):201-13.

Fife A, Beasley PJ, Fertig DL. Psychoneuroimmunology and cancer: historical perspectives and current research. Adv Neuroimmunol. 1996;6(2):179-90.

Liebl F, Demir IE, Rosenberg R, Boldis A, Yildiz E, Kujundzic K, Kehl T, Dischl D, Schuster T, Maak M, Becker K, Langer R, Laschinger M, Friess H, Ceyhan GO.The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin Cancer Res 2013; 19:50-61.

Masur K, Niggemann B, Zanker KS, Entschladen F. Norepinephrine-induced migration of SW 480 colon carcinoma cells is inhibited by beta-blockers. Cancer Res 2001; 61:2866-9.

Westfall TC, Westfall DP. Adrenergic agonists and antagonists. In: Brunton LL, Chabner BA, Knollmann BC . Goodman & Gilman’s the pharmacological basis of therapeutics. 12th edition, McGraw–Hill, New York, 2011, 277–334.

Yao H, Duan Z, Wang M, Awonuga AO, Rappolee D, Xie Y. Adrenaline induces chemoresistance in HT-29 colon adenocarcinoma cells. Cancer Genet Cytogenet 2009; 190:81-7

Al-Wadei HA, Plummer HK 3rd, Ullah MF, Unger B, Brody JR, Schuller HM. Social stress promotes and γ-aminobutyric acid inhibits tumor growth in mouse models of non-small cell lung cancer. Cancer Prev Res 2012; 5:189-96.

Sloan EK, Priceman SJ, Cox BF, Yu S, Pimentel MA, Tangkanangnukul V, Arevalo JM, Morizono K, Karanikolas BD, Wu L, Sood AK, Cole SW. The sympathetic nervous system induces a metastatic switch in primary breast cancer. Cancer Res 2010; 70: 7042-52.

Ventura S, Evans BA. Does the autonomic nervous system contribute to the initiation and progression of prostate cancer? Asian J Androl 2013; 15:715-6.

Boivin B, Lavoie C, Vaniotis G, Baragli A, Villeneuve LR, Ethier N, Trieu P, Allen BG, Hébert TE. Functional beta-adrenergic receptor signalling on nuclear membranes in adult rat and mouse ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Res 2006; 71:69-78.

Zhao CM, Hayakawa Y, Kodama Y, Muthupalani S, West-phalen CB, Andersen GT, Flatberg A, Johannessen H, Friedman RA, Renz BW, Sandvik AK, Beisvag V, Tomita H, Hara A, Quante M, Li Z, Gershon MD, Kaneko K, Fox JG, Wang TC, Chen D. Denervation suppresses gastric tumori-genesis. Sci Transl Med, 2014, 6(250):250ra115.

Guo K, Ma Q, Wang L, Hu H, Li J, Zhang D, Zhang M. Norepinephrine-induced invasion by pancreatic cancer cells is inhibited by propranolol. Oncol Rep, 2009, 22(4):825–830.

Novotny A. Aspects of non-neuronal signalling functions of acetylcholine in colorectal cancer: roles for the α7nAChR. Doctoral Thesis, Dissertation Series, University of Kalmar, Faculty of Natural Science, Högskolan i Kalmar, Kalmar, 2009, 76.

Grando SA, Pittelkow MR, Schallreuter KU. Adrenergic and cholinergic control in the biology of epidermis: physiological and clinical significance. J Invest Dermatol, 2006, 126(9): 1948–1965.