Disciplina Biochimie și Chimia factorilor de mediu [305289]

[anonimizat] a unor detergenți de pe piața românească

2018

Introducere

În anul 1913 germanul chimist Otto Röhm a [anonimizat]. [anonimizat] 1985, 70% [anonimizat]. În prezent aproximativ toată industria detergenților din întreaga lume utilizează enzime ca și ingrediente cheie [1]. Pentru ca o enzimă să poată fi introdusă în compoziția unui detergent aceasta trebuie să prezinte o scară largă de pH și temperatură (temperaturi scăzute pentru hainele sintetice și crescute pentru hainele de bumbac). O altă caracteristică pe care trebuie să o dețină este stabilitatea față de celelalte substanțe componente ale detergeților cum ar fi surfactanții sau agenții de albire.

[anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat]-o [anonimizat] a [anonimizat] o eficacitate crescută la temperaturi reduse (sub valoarea temperaturii optime in vivo de 37°C), cu sensibitate redusă la temperaturi ridicate (peste 60°C). Detergenții enzimatici sunt detergenții din categoria produselor “ecologice” ([anonimizat], [anonimizat], cu risc de poluare minim și cu stabilitate crescută în diferite formulări de detergenți) [2].

[anonimizat], capacitatea de spălare a detergentului. [anonimizat], temperatura, [anonimizat] a enzimei, [anonimizat] a detergentului.

PARTEA GENERALĂ

Capitolul I -Considerente teoretice

I.1. Ce sunt detergenții?

[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], baze, [anonimizat], enzime [3]. [anonimizat] o grupare chimică care diferă în funcție de tipul de detergent (Fig.I.1). Detergenții comerciali pot fi: anionici, cationici, neionici și biodegradabili.

Fig.I.1 – Formula chimică a detergenților convenționali (clasici)

I.2. Ce conțin detergenții?

Compoziția chimică a detergenților este redată în Tabelul I.1.

Tab. I.1- Compoziția unui detergent comercial [4]

I.3. Cum acționează detergenții?

[anonimizat]ului. Capetele hidrofobe din detergent cuprind compușii nepolari în interior, mai exact murdăria, formând astfel o micelă, iar datorită capului hidrofil al surfactantului aceasta este înlăturată cu ajutorul apei[5](Fig.I.2).Pe lângă procesul de emulsificare mai are loc saponificarea alcalină la temperaturi ridicate, oxidarea de către agenții de înălbire și mai ales cataliza produsă de enzime care este studiată în amănunt în capitolele următoare.

Fig.I.2 – Procesul de emulsionare

I.4. Ce sunt enzimele?

Aproximativ toate reacțiile din organism au loc în prezența enzimelor, care sunt biocatalizatori proteici cu rolul de a accelera rata acestor reacții fără a suferii modificări. Activitatea acestora este modulată de către activatori sau inhibitori enzimatici – substanțe care activează sau inactivează procesele enzimatice.

Fiecărei enzime îi sunt atribuite două denumiri. Prima denumire reprezintă formula concisă, recomandată, convenabilă sub aspectul utilizării uzuale. Cea de-a doua denumire reprezintă o formulă științifică mai complexă, care este folosită în situații în care enzima trebuie recunoscută complet [6].

I.5. Structura enzimelor

Enzimele pot fi simple (holoenzime) formate doar din parte proteică cu centrul activ conținând aminoacizi activi (cisteină, serină) și heteroenzime formate dintr-o parte proteică și o parte neproteică (grupare prostetică). Metaloenzimele sunt enzimele la care gruparea prostetică este un ion metalic cu rol de a stabiliza enzima participând totodată și la actul catalitic.

Enzimele prezintă o structură tridimensională (Fig.I.3), proteică, care depinde foarte mult de posibilitatea formării de legături de hidrogen între grupări funcționale active din structura unor aminoacizi (grupări hidroxilice ale serinei, tirozinei sau treoninei sau grupări carboxilice neincluse în legătura peptidică a acidului aspartic sau glutamic) sau intra/intercatenar în cazul structurilor secundare tip α helix sau β foaie pliată a lanțului polipeptidic, toate acestea fiind favorizate de mediul apos[7].

Fig.I.3 – Structura tridimensională a unei enzime [8].

I.6. Cum acționează enzimele?

Mecanismul de acțiune enzimatic poate fi perceput din două perspective diferite. În ceea ce privește prima perspectivă, cataliza este tratată din punct de vedere energetic, altfel spus, enzima oferă o cale alternativă, eficace din punct de vedere energetic, în comparație cu reacțiile ce au loc în lipsa enzimelor. Prin prisma celei de-a doua perspective, este descris modul în care centrul activ al enzimei facilitează cataliza [6,9].

Perspectiva energetică

În aproximativ toate reacțiile chimice există o barieră de energie care trebuie depășită pentru a avea loc reacția. În lipsa unei enzime, doar o mică parte a moleculelor posedă suficientă energie pentru a depășii pragul tranzitional [6]. În general numărul de molecule transformate crește invers proporțional cu energia liberă, de activare. De exemplu, fig. I.4 prezintă schimburile de energie pe parcursul transformării reactantului A în produsul de reacție B și al parcurgerii stării de tranziție (T*)[6,9].

Fig.I.4 – Efectul unei enzime asupra energiei de activare a unei reacții

Chimia situsului activ

În acest caz vorbim despre un mecanism molecular complex care dispune de o varietate de reacții chimice capabile să convertească substratul în produs final (Fig.I.5). Formarea complexului enzimă-substrat se poate reprezenta prin doua modele, modelul Ficher (lacăt – cheie) unde subtratul se potrivește perfect în centrul activ al enzimei iar cel de-al doilea, modelul central indus (Koshland) unde centrul activ al enzimei are o structură diferită de substrat dar în prezența substratului suferă modificări conformaționale și astfel se formează complexul substrat-enzimă.

Fig.I.5 -Mecanismul de acțiune al enzimei – situs activ

I.7. Enzimele în formularea detergenților

Utilizara enzimelor în procesele de fermantare sunt cunoscute încă din antichitate. Existența lor a fost asociată cu istoria Greciei antice, unde enzimele provenite de la microorganisme au fost utilizate la fabricarea berii, producerea de alcool, fabricarea brânzeturilor etc [10]. Astăzi, enzimele sunt componente importante ale produselor de curățare, acestea sunt utilizate pe scară largă în detergenții moderni cu scopul remodelării eficienței de curățare al detergenților.

Enzimele din compoziția detergenților trec cel mai frecvent prin procese de immobilizare. Prin acest proces se înțelege captarea unei molecule de enzimă pe un suport solid prin absorbție sau prin legare chimică, astfel enzima este protejată de condițiile nefavorabile din mediu. Immobilizarea este adesea cheia optimizării performanței operaționale a unei enzime utilizate în diferite procese industriale deoarece duce astfel la obținerea unor produse chimice ecologice și la condiții ușoare de reacție(pH fiziologic, temperatură) fiind astfel și un catalizator biodegradabil. Enzime immobilizatepot fi reutilizate [11].

Enzimele sunt obținute prin fermentația unor sisteme biologice cum ar fi ciuperci, drojdie, bacterii și sunt considerate componente regenerabile, ecologice[12]. În comparație cu enzimele extrase din plante și animale, enzimele microbiene prezintă o varietate mai mare a activității catalitice, o capacitate de producere mai crescută, cu un timp mai scurt și cu o manipulare genetică ridicată. Enzimele obținute prin fermentare fungică și bacteriană pot fi izolate oricând, nefiind influențate de fluctuațiile sezoniere. Un alt avantaj al enzimelor microbiene este că acestea cresc mult mai repede decât cele din plante sau animale, pe un mediu mai puțin costisitor iar activitatea enzimatică este mult mai stabilă fiind active într-un interval larg de pH și temperatură [13,14,15].

I.8. Efectele enzimatice asupra omului si a mediului

Pornind de la ipoteza că obținerea enzimelor care fac parte din compoziția detergenților enzimatici se face prin fermentare bacteriană și fungică și de la prezența tot mai largă a enzimelor în compoziția detergenților comeciali există studii din literatura de specialitate privind riscul alergenic al detergenților comerciali având în vedere potențialul recunoscut al proteinelor (enzime) de a produce răspuns immunologic la expunere acută, subacută sau cronică[16,17]. Analiza datelor din literatură arată că la fel ca în cazul majorității, substanțele la care este expus un individ, doza poate determina efectele toxice, în cazul enzimelor acestea nu prezintă toxicitate acută, cronică sau genotoxicitate decât în concentrații mari (Fig.I.7). Alte studii arată că enzimele produc sensibilizare respiratorie putând determina astm alergic prin urmare raspuns de tip IgE (Fig.I.6) [18,19]. Studiile de toxicitate din literatură sunt majoritatea efectuate pe animale de experiență (porci) iar studiile la om sunt limitate de considerente etice – ceea ce ridică problema extrapolării rezultatelor la specia umanăîn cazul consumatorilor și a angajaților din industria detergenților expuși cronic[20].

Introducerea enzimelor în compoziția detergenților contribuie într-o măsură la reducerea poluării mediului. Se cunoaște faptul că detergenții joacă un rol important în direcția creșterii poluării prin ajungerea acestora în râuri, sisteme de apă publice datorită unui proces de purificare a apei necorespunzător[5]. Există studii care urmăresc îmbunătățirea proprietăților de spălare a detergenților dar și modificarea compoziției lor cu scopul obținerii unor produse ecologice, biodegradabile – reducerea cantității utilizate de aditivi – surfactanți, fosfați, înlocuirea lor cu biocompuși – enzime, dar și influența acestor aditivi asupra activității enzimatice [21] de asemenea, există studii privind influența durității apei asupra eficacității unor surfactanți (dodecilsulfat de sodiu, alchilbenzen sulfonat de sodiu, laurilsulfat de sodiu) [22, 23] însă nu sunt descrise studii privind modificarea activității enzimatice proteolitice, amilolitice și lipolitice a detergentilor în funcție de duritatea apei, în timpul unui ciclu de spălare, în mașina de spălat.

Utilizarea agenților chlelatanți precum acid etilen-diamino-tetraacetic (EDTA), acid dietilen-diamino-pentaacetic (DTPA), în compoziția detergenților este limitată de faptul că nu sunt biodegradabili, și se încearcă înlocuirea lor cu compuși precum acid nitrilo-triacetic (NTA), acid etilen-diamino-disuccinic(EDDS), acid imino-disuccinic (IDS) [24, 25].

I.9. Factorii care pot influența activitatea enzimatică

Duritatea apei, determinată de prezența ionilor de calciu și magneziu poate influența activitatea enzimatică, ionii metalici având rol de modulatori ai activității enzimatice – efect activator sau, dimpotrivă, inhibitor, prin modificarea sarcinilor electrice în centrul activ, acesta devenind mai apt sau mai puțin apt pentru legarea substratului, participând activ în procese de oxido-reducere sau formând complexe insolubile cu produșii de reacție. Pe de altă parte, ionii metalici pot determina denaturarea protein-enzimelor prin deshidratare [25] astfel efectul catalitic fiind modificat.

Un alt factor important este temperatura, se cunoaște faptul că viteza de reacție crește direct proporțional cu temperatura până în momentul atingerii unei viteze maxime. Această ascensiune a temperaturii reprezintă rezultatul creșterii numărului de molecule încărcate cu suficientă energie electrică pentru a depășii bariera energetică a stării de tranziție și a forma produsul final de reacție. Creșterea sau scăderea temperaturii în afara intervalului optim poate duce la denaturarea respectiv împiedicarea activării enzimei [26]. Industria chimică a detergenților pare să stăpânească acest parametru fizic deoarece pe piața românească există o multitudine de detergenți enzimatici cu un interval de temperatură destul de larg (20 °C – 90 °C).

Valorile extreme ale pH-ului pot induce denaturarea enzimei, deoarece structura unei molecule proteice active din punct de vedere catalitic depinde de profilul ionic al catenelor aminoacide laterale [28]. Acest factor nu reprezintă însă un impediment foarte mare deoarece ezimele obținute prin fermentare bacteriană dispun de un interval larg de pH.

Prin urmare obținerea unor enzime stabile la pH alcalin, pe un interval de temperatură cât mai larg și cu o activitate catalitică independentă de duritatea apei este unul din dezideratele industriei chimice a detergenților [27, 28, 29].

PARTEA SPECIALĂ

Capitolul II -Determinarea activității enzimatice în funcție de duritatea apei

II.1. Premisele și scopul lucrării

Producătorii de detergent recomandă adăugarea unor anumite cantități de detergent în mașina de spălat în funcție de volumul cuvei de spălare și a cantității de rufe care vor fi spălate și, având in vedere conținutul enzimatic al detergentului care se presupune că îmbunătățește eficiența spălării, recomandă temperaturi de spălare reduse și cicluri de spălare scurte ceea ce ar reduce costul procesului și economisirea resurselor energetice.

Totuși este cunoscut faptul că, in vivo, activitatea enzimatică depinde de prezența ionilor metalici, aceștia putând activa enzimele sau, dimpotrivă, să aibă efect inhibitor sau toxic asupra lor. Pornind de la considerentul că, duritatea apei în țara noastră este extrem de diferită lucrarea a avut ca scop determinarea eficacității enzimatice a unor detergenți comerciali de pe piața românească cu conținut declarat de enzime în prezența unor cantități variabile de ioni metalici în mediul de spălare folosind o metodă adaptată după Farmacopeea Europeană Ediția a VII-a [30]. Putem pleca de la doua ipoteze. Prima ipoteză, ipoteza nulă, H0-conform căreia nu există diferențe semnificative din punct de vedere statistic în activitatea enzimatică a unui detergent în prezența concetrațiilor diferite de ioni metalici din mediu și ipoteza alternativă, H1 – există diferențe semnificative din punct de vedere statistic în activitatea enzimatică în prezența apelor de diferite durități.

II.2. Materiale și metode

II.2.1. Determinarea durității apei

Reactivi și materiale folosite

Acid clorhidric 10%;

Soluție tampon de clorură de amoniu;

Indicator Eriocrom negru T;

Soluție EDTA 0,01 M;

pHmetru Consort C833(fig.II.1).

Fig.II.1 pH – metrul utilizat

Principiul metodei. Metoda este una complexometrică: cationii metalici prezenți în apă care reprezintă duritatea sunt complexați de către sarea disodică a acidului etilen-diamino-tetraacetic (EDTA) (Fig.II.2) în prezență de Eriocrom negru T. Virajul culorii soluției este de la culoarea roșie la albastru net și reprezintă sfarșitul titrării [31].

Fig.II.2 -Reacția chimică dintre EDTA și calciu

Mod de lucru. Într-un vas de laborator se adaugă apa de analizat și se încălzește la aproximativ 50°C, se adaugă apoi soluția de tampon amoniacal pentru a aduce pH-ul soluției la 10, Eriocrom T și se titrează cu EDTA. Virajul culorii este de la roșu până la albastru net.

Probele de apă au fost recoltate din diferite județe (Fig. II.3) – din sistemul public de alimentare cu apă sau apă de fântână obținută de la hidrofor și utilizată casnic.

Fig. II.3 – Sursele de recoltare ale apei

S-au obținut rezultatele din tabelul de mai jos (Tab. II.1) și au fost selecționate pentru influența durității asupra activității enzimatice 6 surse de apă cu durități semnificative (mică, mare și două valori cuprinse între aceste două).

Tab.II.1. Valoarea duritățiiapei din probele analizate

II.2.2. Determinarea activității enzimatice amilolitice, lipolitice și proteolitice a unor detergenți folosind ape de diferite durități

Pentru proba practică au fost aleși 6 detergenți lichizi de pe piața românească cu activitate enzimatică declarată, care au fost codificați după cum urmează D1 – D6.

Determinarea activității enzimatice a detergenților s-a făcut prin metode descrise în Farmacopeea Europeană Ediția a VII-a pentru pulberea de pancreatină și adaptate pentru determinări din detergenți [30].

Substanța etalon a fost preparată din 150 mg pulbere de pancreatină (10000 unități lipazice, 8000 unități amilazice, 600 unități protazice conform conform farmacopeei europene) de puritate farmaceutică, suspendată în apă distilată astfel încât aceasta să fie diluată de 50 de ori.

Probele de detergent au fost diluate conform recomandărilor producătorilor, de 100 de ori, direct în mini-mașina de spălat, cu apă de diferite durități.

Activitatea enzimatică a fost determinată cu ajutorul băii cu ultratermostat U1 (fig. II.4), produsă de Medingen cu următoarele caracteristici tehnice: putere = 650 W, termostat 10-90 0C, motor 1450 rpm, pentru a simula condițiile unei mașini de spălat normale. Baia cu ultratermostat U1 este prevăzută cu o cuvă din metal în partea inferioară dreaptă a mașinii, de o capacitate de aproximativ 2 L, cuva conține în interior un sistem de agitare cu care se poate asigura o bună omogenizare a probelor de detergent. În partea superioară prezintă un termometru de unde se fixează temperatura dorită pentru ciclul de spălare și un buton de oprire/pornire.

II.2.2.1. Determinarea activității enzimatice proteolitice a unor detergenți comerciali

În cazul proteazelor Farmacopeea Europeană prezintă o metodă spectofotometrcă care se bazează pe citirea absorbanței unei probe obținute din hidoliză legăturilor peptidice din structura cazeinei în prezența enzimelor din detergent diluat cu ape de diferite durități la 275 nm[30].

Reactivi și materiale utilizate

Soluție tampon de borat pH 7,5;

Soluție de clorură de calciu 0,02M;

Acid tricloracetic 50 g/L;

Cazeină SERVA;

Spectofotometru UV-VIS, Spectro Double Beam PC(Fig.II.5).

Fig.II.5 –SpectofotometruUV-VIS Double Beam PC

Prepararea soluției standard de cazeină. S-a determinat in prealabil conținutul de apă a cazeinei (10,36%). Fiola de cântărire în care se află proba se ține în etuvă la 60°C timp de 4 ore. S-a cântărit o cantitate de substanță echivalentă cu 1,25 g substanță activă peste care se adaugă apa distilată, NaOH 0,1M și se agită timp de un minut. În cele ce urmează se adaugă restul de apă distilată și se omogenizează cu ajutorul unui agitator magnetic până la clarificarea soluției (Fig. II.6). S-a ajustat pH-ul la 8 cu HCl 1M. Soluția obținută s-a utilizat în ziua preparării.

Fig.II.6: Obținerea cazeinei

Mod de lucru. Detergenții au fost diluați direct în baia cu ultratermostat U1 cu ape de diferite durități și apoi incubați împreună cu substratul, cazeina. La sfârșitul ciclului de spălare probele se centrifughează și apoi se măsoară absorbanța supernatantului rezultat la spectofotometru UV-VIS (Fig. II.7). În paralel s-a preparat și o probă etalon cu suspensie de pancreatină în condițiile descrise mai sus.

Fig. II.7 – Determinarea activității proteolitice

II.2.2.2. Determinarea activității amilolitice a unor detergenți enzimatici

Determinarea activității amilolitice se bazează pe o metodă volumetrică și anume titrarea iodometrică excesului de amidon rămas nedescompus în prezența amilazei din detergent [30].

Reactivi utilizați:

Soluție NaCl 11,7 g/L;

Tampon fosfat pH 6,8;

Acid clorhidric 1M;

Hidroxid de sodiu 0,1 M;

Iodură de potasiu 0,1 N;

Tiosulfat de sodiu 1 M.

Prepararea soluției amidon. S-a determinat în prealabil conținutul de apă al amidonului. Fiola de cântărire în care se află proba se ține în etuvă la 120°C timp de 4 ore. S-a cântărit o cantitate de substanță echivalentă cu 2 g substanță activă, peste care se adaugă apă distilată. Suspensia se toarnă peste o cantitate de apă la fierbere și după spălarea cantitativă a flaconului, se aduce din nou la fierbere, sub agitare continuă. Se utilizează în ziua preparării (fig. II.8)

Fig.II.8 – Prepararea soluției de amidon

Mod de lucru. Detergentul a fost diluat direct în baia cu ultratermostat U1 cu apă de diferite durități, s-a introdus substratul, amidonul 1% și se lasă la incubare 30 minute la 20°C, conform recomandărilor producătorilor de detergenți enzimatici comerciali. După incubare în baia cu ultratermostat U1, se adaugă HCl 1M pentru inhibarea activității enzimatice și se recoltează într-un flacon erlenmayer probă, se adaugă KI 0,1 M, NaOH 0,1 M și se lasă în repaus la întuneric la temperatura camerei 15 minute. Se titrează excesul de iod cu Na2S2O31M. În paralel s-a preparat și o probă etalon cu suspensie de pancreatină în condițiile descrise mai sus (Fig. II.9).

Fig. II.9. Determinarea activității amilolitice

II.2.2.3. Determinarea activității lipazice a unor detergenți enzimatici

Sub acțiunea lipazei prin hidroliza trigliceridelor (fig. II.10) sunt eliberați acizi grași din emulsii stabile de uleiuri vegetale, care urmează să fie determinați prin titrarea cu NaOH în prezența fenoftaleinei [32].

Fig.II.10 – Reacția de hidroliză a trigliceridelor

Reactivi utilizați

Emulsie de ulei de floarea soarelui: se omogenizează 10 g de ulei de floarea soarelui rafinat cu 5 g gumă arabică, fin pulverizată și 7,5 g apă. Se adaugă apoi treptat până la 100 ml, agitând continuu;

Tampon tris pH=8;

Soluție Fenoftaleină 0,1% în alcool etilic 96o;

Soluție NaOH 0,05N;

Alcool etilic 96o.

Mod de lucru. S-a introdus detergentul în ultratermostat U1 și s-a diluat cu apă de diferite durități, s-a adăugat substratul, emulsia uleioasă și s-a lăsat la incubat 30 minute la 20°C. După incubare s-a adăugat etanol 960 pentru inhibarea activității enzimatice, s-a recoltat proba și s-a titrat aciditatea probei cu NaOH 0.05N în prezența timoftaleinei ca indicator. În paralel s-a efectuat o probă martor prin incubarea aceleiași cantități de detergent cu proba de apă timp de o oră dar la care etanolul s-a adăugat înaintea substratului, emulsia uleioasă pentru verficarea acidității libere a probei în condițiile inhibării activității enzimatice și o probă etalon cu pancreatină cu activitate enzimatică cunoscută (Fig. II.11).

FigII.11 – Determinarea activității lipolitice

II.2.3. Determinarea activității enzimatice din detergenții comerciali în funcție de temperatură

Probele de detergent preparate în apă distilată au fost incubate în baia cu ultratermostat U1 în condițiile de lucru descrise mai sus la diferite temperaturi (10°C-90°C).

II.3. Rezultate și discuții

II.3.1. Determinarea activității proteolitice a unor detergenți în funcție de duritatea apei

Rezultatele obținute la determinarea activității proteolitice sunt redate în Tabelul II.2.

TabII.2. Activitatea proteolitică din diferiți detergenți

Din graficul prezentat în Fig.II.12 obținut pe baza rezultatelor din tabelul II.2 putem observa că detergentul D2 este practic lipsit de activitate proteolitică și că activitatea enzimatică depinde de duritatea apei – cu cât duritatea crește, crește și activitatea enzimatică a detergenților analizați.

Există studii în literatura de specialitate care arată că legarea ionilor de calciu în cetrul activ al enzimei este absolut necesară pentru stabilitatea și activitatea optimă a enzimei [33, 34], iar chelatanții de calciu prezenți în compoziția detergenților, prin formarea unor agregate micelare concurează cu enzima pentru legarea Ca2+. În această competiție pentru legarea Ca2+ trebuie să se țină seama de natura interacțiunilor, legăturile existente între structura proteică și ionul de calciu fiind mult mai puternice comparativ cu chelații, dar și că agenții chelatanți se află în cantitate mult mai mare decât enzimele în detergenți, prin urmare autorii recomandă adăugarea de CaCl2 în concentrații de ordinul 10-5 M în compozitia detergenților necesari pentru activitatea proteolitică [35].

Fig.II.12 – Activitatea proteolitică din diferiți detergenți

Un studiu din 2017 a raportat existența unei noi specii de protează izolată din Bacillus megaterium, enzimă, care este activă pe un interval de pH larg (3-12) și temperatură (10°C-80°C), având activitatea maximă la pH 10 și temperatura de 50°C, iar ionii metalici si agenți de albire nu par să influențeze semnificativ activitatea enzimei. Proprietățile acestei enzime fac ca aceasta să fie un candidat puternic pentru industria detergenților [36]. Un alt studiu efectuat de Jacques MJ et al din 2016 arată că enzimele proteolitice sunt capabile să îndepărteze petele de sange(fig. II.13) sau petele produse de proteinele aflate în galbenușul de ou, fără adăugarea unui detergent sau a altor substanțe aditive din compoziția detergenților, dar după o perioadă mai lungă de incubare [37].

Progresele în ingineria genică a proteazelor pentru detergenții de rufe cuprind o îmbunătățire simultană a rezistenței termice și a activității la temperaturi scăzute, o strategie rațională pentru a modula profilul de pH, un studiu recent din 2015 în această direcție a demostrat că substituția unor aminoacizi din structura unei serin-proteaze extrasă din Bacillus Gibsoniiîi imprimă acesteia o stabilitate foarte mare la temperaturi de 15°C respectiv 58°C [38].

Fig.II.13 Îndepărtarea petelor de sânge de către proteaze

Rolul proteazelor în detergenți este de a îndeparta petele de origine biologică. Determinarea eficienței detergenților în îndepartarea petelor se realizează prin metode vizuale (în cazul petelor colorate – sânge, cacao), prin aprecierea turbidității, metode densitometrice sau colorimetrice. Trebuie însă să se țină seama că detergenții cu conținut enzimatic de proteaze nu sunt recomandați a fi utilizați la țesăturile din lână și mătase deoarece se poate degrada ireversibil structura secundară a keratinei [39]. Cu toate acestea enzimele proteolitice extrase din bacteriile keratolitice prezintă aplicații importante în industria detergenților, ele făcând parte dintr-o nouă generație de enzime capabille să înlăture deșeurile keratinoase. Prin urmare ultimele cercetări ne prezintă înlocuirea substanțelor chimice din detergenți cu enzime proteolitice [40].

Protezele sunt enzime care determină scindarea legăturilor peptidice din structura proteinelor cu eliberare de aminoazici. Ele sunt găsite în tot organismul unde joacă un rol important în procesele metabolice și fiziologice. În plus față de importanța lor fiziologică, proteazele au o utilizare vastă la nivel industrial, intrând în compoziția detergenților de rufe, vase, aditivilor din alimente, industriei terapeutice și farmaceutice. În diferitele tratamente medicale, proteazele sunt folosite ca agenți activi (tratamentul osteoartitei, îndepartarea tesutului mort și vindecarea rănilor) [38].

Proteazele sunt enzime active in vivo pe un interval de pH foarte larg – de la pepsina activă la nivelul stomacului (pH=1.5-3.0) și până la tripsină și chimotripsină active la pH alcalin, prin urmare obținerea unor enzime proteolitice în scop comercial active la pH=8 nu reprezintă un impediment, însă proteazele trebuie să fie stabilizate pentru a împiedica inactivarea (proteoliza) altor enzime existente în detergenți, asta ar explica și activitatea aproximativ nulă a detergetului D2. Producătorii recomandă fie reducerea conținutului de apă a detergenților, fie adăugarea unor stabilizatori de tipul sistemului borat/propilen glicol. Având în vedere că numeroase proteaze conțin calciu în centrul activ și că agenții de chelatare (anticalcar) adăugați pot sechestra calciul, prezența acestuia în apa de spălare va crește activitatea proteolitică [41,42].

În industria detergenților proteazele sunt enzimele cele mai utilizate, reprezentânt astfel aproximativ 60% din totalul vânzărilor de la nivel global [43,44]. Majoritatea proteazelor utilizate în industria detergenților provin din plante, animale si microorganisme [37].

Un review din 2017 arată că detergenții și mai ales cei enzimatici pot determina dermatite atopice producând deshidratarea pielii, modificarea pH-ului cutanat, eliberarea de citokine proinflamotorii și chiar hipersensibilizare IgE mediată. Piața detergentilor enzimatici a evoluat mult – dacă în anii 70 alergiile de tip I, IgE mediate, erau destul de răspândite mai ales la persoanele cu teren atopic, în prezent prevalența acestor alergii este rară și datorată expunerii îndelungate sau la concentrații crescute de detergent (astm și alergii în cazul lucrătorilor din industria detergenților) [15,17,45].

II.3.2. Determinarea activității amilolitice a unor detergenți în funcție de duritatea apei

Amilaza are încă din trecut o utilizare științifică foarte largă în ceea ce privește industria alimentară, a diferitelor bauturi, a hârtiei, îmbracamintelor textile dar într-un mod special participă la aplicațiile industriale ale detergenților. Datorită acestui fapt, domeniul enzimatic a trecut printr-o perioadă de dezvoltare semnificativă, ducând de exemplu la fenomenul de immobilizare a acestora. Spălarea tot mai frecventăla temperaturi de 20-30°C și problema dizolvării petelor de natură glucidică la temperaturi scăzute, determină industria chimică spre utilizarea cât mai frecventă a amilazelor în compoziția detergenților [46].

Rezultatele obținute la determinarea activității amilolitice sunt redate în Tabelul II.3.

Tab. II.3. Activitatea amilolitică din diferiți detergenți

Deși există diferențe în ce privește capacitatea enzimelor din diferiți detergenți de a hidroliza amidonul, totuși prezența în diferite cantități a ionilor de calciu și magneziu în mediu nu pare să influențeze semnificativ din punct de vedere statistic (p>0,01*) activitatea catalitică (Fig. II.14), iar detergentul D2 prezintă cea mai mare activitate.

Fig.II.14. Activitatea amilolitică a unor detergenți

Aproximativ toate amilazele studiate conțin calciu în centru activ și anume, un loc comun pentru legarea ionului de calciu la interfața dintre domeniul A si domeniul B pentru a păstra structura funcțională a acesteia (fig. II.15) [47]. Un studiu din 2013 efectuat de Ghollasi M et al arată că obținerea unor enzime izolate din specii mutante de Bacillus megaterium cărora li s-a introdus un situs suplimentar de legare a ionului de calciu prin înlocuirea unui rest de histidină din structură cu acidul glutamic au prezentat o termostabilitate crescută și un interval larg de pH în care sunt active (3.5-9.0), ceea ce ar prezenta o mare importanță pentru industria detergenților [48].

Fig.II.15. Structura tridimensională a alfa amilazei cu cele 3 domenii [49]

Studii din literatură demonstrează că unele forme de amilaze pot lega de la doi ioni până la patru ioni de calciu, de exemplu, în cazul amilazelor extrase din speciile de Bacillus subtilis și Bacillus licheniformis[50,51].

Chiar dacă este demonstrat faptul că amilaza este o metaloenzimă, prezența ionilor metalici jucând un rol important în activitatea, stabilitatea termică și structurală a enzimei, anumite tipuri de amilaze și anume amilaza extrasă din Bacillus amyloliquefaciens este inactivată în prezența ionilor de mercur, cupru și cobalt, observându-se o descreștere a activității enzimatice cu 27,8%, 19,5% și respective 5,8% [50], această situație întâlnindu-se în cazul mai multor tipuri de amilaze [52].

Yadav JK arată că există un compromis pe care producătorii de detergent îl fac între activitatea enzimatică crescută (Ca2+ la concentrații mici 1.0-2.0 mM este activator al α-amilazei) și termostabiolitatea enzimei (Ca2+ în concentrații mari este inhibitor al enzimei) dar, în același timp aceasta devine termorezistentă [53], prin urmare după cum se observă din Fig.II.14 activitatea enzimatică a amilazei crește în general cu creșterea durității apei dar la valoarea cea mai înaltă (22,81 °dH) activitatea scade.

Tripathi P. în studiul său asupra unei amilaze izolată dintr-un tip de fasole și anume Vigna Radiata, care este capabilă să lege până la 3-4 ioni de calciu, demonstrează că aceasta nu este inactivată în prezența concentraților mari de calciu (100 mM), dar o dată cu scăderea concentrației de calciu scade si stabilitatea termică a enzimei. Un rol important în inactivarea enzimei la concentrții mari de calciu îl poate avea numărul de situsuri de legare pentru calciu [54].

Utilizarea alfa amilazei în compoziția detergenților și influența activității acesteia de către ionii bivalenti, prin modificarea rigidității structurale, ar putea ridica însă o problemă, deoarece detergenții conțin pe lângă celelalte componente și chelatanți de calciu [47]. Studiile care demonstrază influența ionului de calciu asupra activității α-amilazelor folosesc EDTA-ul pentru a complexa calciul, absența acestuia din mediu inactivează enzimele, chiar și în cazul amilazelor aparent independente de acțiunea calciului se presupune că acesta este atât de puternic legat de structura proteică încât nu poate fi îndepartat de EDTA [55].

Legarea ionului de calciu de structura proteică a α-amilazei crește stabilitatea termică și față de diferiți surfactanți și agenți tensioactivi a enzimei prin reducerea flexibilității structurii proteice [50], prin urmare există ipoteza “saturării” structurii enzimatice cu ioni de calciu a priori adăugării ei în detergenți, ceea ce ar explica pe de o parte influența scăzută a durității asupra activității enzimatice și pe de altă parte activitatea catalitică de 10 ori mai mare a amilazei la 90°C decât a lipazei sau a proteazelor din detergent(Fig.II.17).

Pentru a îndeparta influența ionilor de calciu asupra activității enzimatice, care uneori poate să fie negativă, s-au obținut specii mutante ai alfa amilazei, independete de concentrația calciului, cu stabilitate ridicată [56]. Însă există amilaze a căror activitate depinde de concentrația ionilor de Na+ din mediu, iar situsurile de legare pentru ionul de Na+ corespund cu situsurile de legare a ionilor de Ca2+. Descoperirea acestei alfa amilaze reprezintă un avantaj considerabil pentru industria detergenților [57].

II.3.3. Determinarea activității lipolitice a unor detergenți în funcție de duritatea apei

Rezultatele obținute la determinarea activității lipolitice sunt redate în Tabelul II.4

Tab. II.4 Activitatea lipazică din diferiți detergenți

Din graficul obținut(Fig.II.16) se poate observa că activitatea enzimatică crește cu creșterea durității apei, iar din punct de vedere statistic există diferențe semnificative (p<0,01*) în ce privește activitatea lipolitică a unui detergent în prezența concetrațiilor diferite de ioni metalici din mediu. Activitatea lipolitică din detergenții D2 si D3 este cel mai puțin influențată de duritatea apei, iar D3 are activitatea cea mai ridicată.

Creșterea activității enzimatice direct proporțional cu duritatea apei se bazează pe faptul că ionii de Ca2* activează lipaza, ducând la formarea de săruri insolubile (săpunuri) cu produșii de reacție, acizii grași, deplasând astfel echilibrul reacției spre dreapta. Fiecare moleculă de enzima dispune de un situs special pentru legarea ionilor de Ca2+ [58].

Este ridicată această problemă în cazul produselor farmaceutice sau alimentare cu conținut lipidic în formă emulsionată, controlul digestiei lipidelor la nivel intestinal sub acțiunea lipazei de origine pancreatică ridicând problema adăugării unor chelatanți care se pretează la utilizarea in vivo precum lizo-lecitina, and β-lactoglobulina [59] sau cosurfactanți precum Tween 20 [60].

Fig. II.16. Activitatea enzimatică lipolitică în diferiți detergenți

Un studiu efectuat de Hu M et al în 2010 arată că există o concentrație minimă de Ca2+ în mediu care este necesară pentru activitatea enzimatică a lipazei, astfel, în absența Ca2+ din mediu, activitatea enzimatică este < 12%, în timp ce la o concentrație de 20mM Ca2+ activitatea lipazei este >95 [59]. Un alt studiu efectuat de Neelima Kulkarni din anul 2002 a arătat că, adăugarea de clorura de calciu a dus la creșterea activității lipazei cu 26%, iar în prezența chelatanților precum EDTA, activitatea enzimatică a scăzut cu 20% [61]. Kanwar et al. (2006) prin studiul său a descoperit o crestere de 112,93 % a activității lipolitice în prezența Ca2+ dar și a altor ioni bivalenți (Mg2+ și Hg2+), însă și o scădere a activitatii enzimatice de 39,7% în prezența unei concentrații de 1mM a ionilor Co2+[62]. Un alt studiu din 2017 efectuat de Zarinviarsagh et al a demonstrat că lipaza extrasă din tulpina de O. intermedium MZV101 a fost activată în absența Ca2+ și chiar activitatea acesteia a fost inhibată de anumiți ioni bivalenți (Mg2+, Ba2+) si activată de Co2+. Activitatea surfactanților din detergent a crescut în prezența ionilor bivalenți și activitatea enzimatică a crescut în prezenta a 1% dodecilsulfat de sodiu[63].

Existăși studii despre influența ionilor bivalenți asupra mediilor de creștere, care demonstrează căsecreția lipazei extracelulare din Pseudomanas Aeruginosași Aspergillus tererus creste la aditia de Ca2+ si Mg2+în mediul de cultură [61].

Diverse studii din literatură demonstrează existența unor tipuri de lipaze a căror activitate este independentă de concentrația ionilor divalenți, ceea ce ar explica activitatea ușor influențată a detergenților D2 și D3 de către ionii bivalenți.

In vivo influența ionilor de calciu asupra lipazei depinde și de natura substratului hidrolizat: în cazul acizilor grași cu catena scurtă (de exemplu trigliceridele din lapte), Ca2+ nu activează lipaza deoarece săpunurile rezultate sunt solubile în apă, efectul activator manifenstându-se doar în cazul esterilor de glicerol cu acizi grași cu catena lungă, saturați, așa cum este cazul trigliceridelor din uleiul de floarea soarelul (emusia uleioasă fiind folosită ca substrat în determinare) sau acizi grași nesaturați și polinesaturați de tip omega 3 sau 6) [64].

Procesul enzimatic catalizat de lipaze și fosfolipaze este extrem de complex – în afara reacțiilor de hidroliză a trigliceridelor și a fosfolipidelor, acestea catalizeazăși reacții de transacilare si transfosforilare [65]. În mod normal, petele de grăsime nu sunt ușor de îndepărtat la temperaturi scăzute folosind detergenți convenționali, prin urmare sunt necesare lipaze care sunt active la temperaturi mai scăzute și pot fi utilizate în formulări de detergenți [66]. Multe studii au contribuit cu eforturi considerabile la immobilizarea lipazelor pentru a explora stabilitatea enzimatică pe termen lung, care se așteaptă să reducă costul produsului și să îmbunătățească eficiența catalitică a lipazelor cu scopul utilizării acestora în industria detergenților [67].

Lipazele sunt izolate din natură din multe specii cum ar fi plante, animale, bacterii, fungi, dar doar cele de produse de microorganisme sunt folosite la fabricarea detergenților, produselor cosmetice, surfactanților [68]. Pentru a elimina neajunsurile culturilor microbiene (randament de producție scăzut și greu de controlat industrial) în prezent se aplică tehnici de recombinare heterologica a proteinelor într-un sistem gazda [69].

II.3.4. Determinarea activității enzimatice a unor detergenți în funcție de temperatură

Activitatea enzimatică crește direct proporțional cu creșterea temperaturii până la un anumit punct (considerat a fi temperatura optimă), după care această activitate scade (Fig. II.17). Detergenții enzimatici pot fi utilizați la temperaturi de 200C, ceea ce ar însemna reducerea consumului de energie electrică, conform recomandărilor de detergenți.

Tab.II.5. Influența temperaturii asupra activității enzimatice a detergentului D1

Din reprezentarea grafică (Fig. II.17) a activității enzimatice ca o funcție a temperaturii se observă că la această temperatură enzimele sunt puțin active, activitatea cea mai marcată fiind în jurul valorii de 370C. Spre deosebire de enzimele active in vivo, în cazul enzimelor obținute prin inginerie genetică activitatea enzimatică nu scade drastic cu creșterea temperaturii, activitatea enzimatică nu ajunge la valoarea 0 nici la temperaturi mai mari de 60 0C (Fig. II.17)

Fig. II.16. Activitatea enzimatică a unor detergenți în funcție de temperatură

Constatăm, însă, o activitate enzimatică scăzută a proteazei față de celelalte enzime la temperaturi mari ceea ce poate fi explicat printr-o influență directă a creșterii temperaturii asupra structurii substratului (denaturarea proteinelor cu creșterea temperaturii) cazeina fiind mult mai sensibilă la creșterea temperaturii comparativ cu amidonul sau emulsia uleioasă.

Această variabilitate a activității enzimatice cu temperatura este descrisă cel mai bine printr-o ecuație polinomială de ordinul 3, ceea ce ridică problema interpretării acestor date – activitatea enzimatică ar trebui să crească cu temperatura, să scadă și apoi să crească din nou. Pentru determinarea matematică a temperaturii optime pentru activitatea enzimatică s-a calculat derivata de ordinul I a funcției care exprimă variația activității enzimatice în funcție de temperatură. Chiar dacă o ecuație de gradul 2 are două soluții distincte, trebuie să luăm în considerare faptul că temperaturile apei de robinet din sistemul public de alimentare cu apă au valori pozitive și că valorile temperaturii optime peste 500C sunt puțin probabile din punct de vedere biologic. Astfel, în cazul amilazei această valoare calculată matematic este 34 0C, iar pentru lipaze și proteaze este de 33 0C și, respectiv, 27 0C.

Obținerea enzimelor cu activitate amilolitică din culturi bacteriene modificate genetic permite termorezistență și o sensibilitate redusă la variații de pH, însă, chiar și în cazul acestora, prezenta unor chelatanți de tipul EDTA-ului în mediu reduce activitatea enzimatică cu până la 22%. Un neajuns identificat de producătorii industriali este izolarea și purificarea dificilă și costisitoare a acestor varietăți [70].

Datele din literatură arată că activitatea lipazei este maximă la o temperatură de 400C și la un pH cuprins între 4,3-7,2. În cazul lipazei din detergenți, activitatea catalitică maximă este influențată și de valoarea pH-ului alcalin din mediu, valoare care poate crește sensibilitatea enzimei la variații mici de temperatură [71, 72].

Proteazele rezistente la temperaturi scăzute pot fi izolate din medii naturale care conțin microorganisme pshirofile, cu activitate proteolitică ridicată. Din păcate, aceste enzime nu îndeplinesc în general cerințele industriale datorită stabilității scăzute la temperaturi de 200C și randamente scăzute de producere la scară industrială. Pe de altă parte, enzimele extrase din organisme mezofile prezintă în acelaș timp eficiență catalitică ridicată și stabilitate termică la temperaturi de la 300C pana la 400C[38]. Proteazele prezintă un pH alcalin(pH=9-11) care pare să favorizeze procesul catalitic [73,74].

Concluzii

Cu un accent sporit asupra protecției mediului, utilizarea biocatalizatorilor a atras atenția într-un mod special ingineriei genetice. Este necesară explorarea continuă de microorganisme pentru producerea de enzime cu capacitatea de a satisface cerințele industriale. Performanța unui detergent bun este definită de mai mulți parametrii, cum ar fi duritatea apei, temperatura, pH, stabilitatea față de alte substanțe din compoziția detergentului (surfactanți, agenți de albire).

Studiul nostru arată că duritatea apei moduleză în sens pozitiv activitatea enzimatică, însă pe de altă parte, acesta poate influența capacitatea de spălare a detergentului prin formarea cu surfactanții ionici din compoziția acestora, săpunuri insolubile de calciu, ducând astfel la creșterea tensiunii artificialea a apei și la scăderea capacității de spumare. Însă o rezolvare a acestei probleme este utilizarea surfactanților neionici.

Prin urmare ipoteza nula, H0 – este respinsă, există diferențe semnificative din punct de vedere statistic în activitatea enzimatică a unui detergent în prezența apelor de diferite durități. Ținând cont de introducerea în comerț a detergenților enzimatici în anii ’60, de utilizarea unei cantități de compuși anorganici mai mică decât în detergenții clasici și înlocuirea acestora cu compuși organici, de efectul poluant asupra mediului mai redus, particularitățile individuale (indivizi cu teren atopic), reducerea consumului de electrictricitate, cicluri de spălare mai scurte și consum de apă redus,rapotul beneficiu risc,în cazul detergenților enzimatici ne arată mai multe avantaje decât dezavantaje.

Bibliografie

Muhammad S, Shahid T, Ahmed K – Enzyme proteases used in laundry detergentsengineering a review, Sci Int (Lahore), 2016, 28: 2711-2717.

Singh A, Sharma A, Bansal S-Comparative Interaction Study of Amylase and Surfactants for Potential Detergent Formulation, J Mol Liq, 2018, 261: 397-401.

Syafalni S, Abustan I, Dahlan I et al – Treatment of dye wastewater using granular activated carbon and zeolite filter, Modern Applied Science, 2012, 6: 37–51.

Grbavcic D, Bezbradica L, Zivkovic N et al – Production of lipase and protease from an indigenous Pseudomonas aeruginosa strain and their evaluation as detergent additives: compatibility study with detergent ingredients and washing performance, Bioresour Technol, 2011, 106: 11226-33.

Hanan S, El-Gawad A – Aquatic environmental monitoring and removal efficiency of detergents, Water Science and Technology, 2014, 28: 51-64.

Champe P, Harvey R – Biochimie Ilustrată, Ed. Medicala Callisto, USA, 2010, 56-57.

Bellissent-Funel MC, Hassanali A, Havenith M et al – Water determines the Structure and Dynamics of Proteins, Chemichal Reviews, 2016, 116: 7673-97.

Bassan C, Peixoto G, Galan JPM- Immobilization of Trypsin in Lignocellulosic Waste Material to Produce Peptides with Bioactive Potential from Whey Protein, Materials, 2016, 9: 357.

Gutteridge A – Understanding the relantionship between enzyme structure and catalysis, 2005, 1:23.

Sharma KM, Kumar R, Panwar S et al – Microbial alkaline proteases: Optimization of production parameters and their properties, Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 2016, 15: 115-126.

Hellmuth H, Dreja M – Understanding Interactions of Surfactants and Enzymes: Impact of Individual Surfactants on Stability and Wash Performance of Protease Enzyme in Detergents, Tenside Surfact Det, 2016, 53: 502-508.

Viniegra-González G, Favela-Torres E, Noe Aguilar C – Advantages of fungal enzyme production in solid state over liquid fermentation systems, Biochem Eng J, 2003, 13: 157-167.

Basketter D, Berg N, Kruszewski FH et al – The toxicology and immunology of detergent enzymes, Journal of Immunotoxicology, 2012, 9: 320-326.

Sheldon RA – Enzyme Immobilization: The Quest for Optimum Performance, Advanced Synthesis Catalysis, 2007, 349: 1289 – 1307.

Marcuschamer  DK, Oleskowicz-Popiel P, Simmons B et al-The challenge of enzyme cost in the production of lignocellulosic biofuels, Biotechnol. Bioeng, 2012, 109: 1083-1087.

Nanda V, Koder RL – Designing Artificial Enzymes by Intuition and Computation, Nature chemistry, 2010, 2: 14-24.

Schweigert MK, Mackenzie DP, Sarlo K – Occupational asthma and allergy associated with the use of enzymes in the detergent industry–a review of the epidemiology, toxicology and methods of prevention, ClinExp Allergy, 2000, 30: 1511-1518.

Sarlo K – Control of occupational asthma and allergy in the detergent industry, Annals of allergy, asthma & immunology, 2003, 90: 23-24.

Cullinan P, Harris JM, Hole AM et al – An outbreak of asthma in a modern detergent factory, The Lancet, 2000, 356: 1899-1900.

Chauhan M, Chauhan RS, Garlapati VK – Evaluation of a new lipase from Staphylococcus sp. for detergent additive capability, Biomed Res Int, 2013, 2013: 374967

Gotoh K, Horibe K, Mei Y et al – Effects of Water Hardness on Textile Detergency Performance in Aqueous Cleaning Systems, J Oleo Sci, 2016, 65: 123-33.

Gotoh K, Harayama K, Handa K – Combination effect of ultrasound and shake as a mechanical action for textile cleaning, Ultrasonic Sonochemistry, 2015, 22: 412-21.

Pinto IS, Neto IF, Soares HM – Biodegradable chelating agents for industrial, domestic, and agricultural applications – a review, Environ Sci and Pollut Res Int, 2014, 21: 11893-906.

Martins JG, Neto IF, Pinto IS et al – Alternative chelating agents: evaluation of the ready biodegradability and complexation properties, JEnviron SciHealth, 2014, 49: 344-54.

Bianco V, Franzese G – Contribution of Water to Pressure and Cold Denaturation of Proteins, Physical Review Letters, 2015,115: 108101.

Sindhu R, Binod P, Madhavan A et al – Molecular improvements in microbial α-amylases for enhanced stability and catalytic efficiency, Bioresour Technol, 2017, 245:1740-1748.

Mehta D, Satyanarayana T-Bacterial and Archaeal α-Amylases: Diversity and Amelioration of the Desirable Characteristics for Industrial Applications, Front in Microbiol, 2016, 7:1129.

Aloulou A, Puccinelli D, De Caro A et al – A comparative study on two fungal lipases from Thermomyces lanuginosus and Yarrowia lipolytica shows the combined effects of detergents and pH on lipase adsorption and activity, Biochimica et Biophysica Acta, 2007, 1771:1446-56.

Holum B – Elements of general and biological chemestry, Journal of chemical education, 1983, 60: 613.

European Pharmacopoeia, 2011, Ed. a VII-a, p. 2661.

Oșan A, Nagy E, Tero-Vescan A – Chimia sanitară a factorilor de mediu, ed. University press, Tîrgu Mureș, 2006, p.27.

Osan A, Nagy EE, Tero-Vescan A – Biochimie practică, Ed. University Press, Tirgu Mures, 2008, p. 96-97.

Vijayaraghavan P, Lazarus S, Prakash V et al – De-hairing protease production by an isolated Bacillus cereus strain AT under solid-state fermentation using cow dung: Biosynthesisand properties, Saudi Journal of Biological Sciences, 2014, 21: 27–34.

Tremacoldi CR, Monti R, Selistre-De-Araújo HS – Purification and properties of an alkaline protease of Aspergillus clavatus, World J of Microbiol and Biotechnol, 2007, 23: 295–299.

Stoner MR, Dale DA, Gualfetti PJ et al – Ca2+-surfactant interactions affect enzyme stability in detergent solutions, Biotechnol Prog, 2005, 21:1716-23.

Uttatree S, Kobtrakool K, Ketsuk A et al -A novel metal-tolerant, solvent and surfactant stable protease from a new strain of Bacillus megaterium, Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2017, 58: 623-631.

Jacques MJ, Christy PH, KumarTV – Screening, Production and Partial Purification of Protease from Pseudomonas Spp. and their Potential Applications, International Journal of Scientific & Engineering Research, 2016, 7: 29:35.

Vojcic L, Pitzler C, Korfer G – Advances in protease engineering for laundry detergents, New Biotechnology, 32: 629-634.

Niyonzima FN, More S – Detergent-compatible proteases: microbial production, properties, and stain removal analysis, Prep Biochem Biotechnol, 2015, 45:233-58.

Tanmay P, Arijit J, Amit KM et al – Bacterial keratinolytic protease, imminent starter for NextGen leather and detergent industries, Sustainable Chemistry and Pharmacy, 2016, 3: 8–22.

Mechri S, Elhoul Berrouina M, Omrane Benmrad M et al – Characterization of a novel protease from Aeribacillus pallidus strain VP3 with potential biotechnological interest, Int J Biol Macromol, 2017, 94: 221-232.

Patil U, Mokashe N, Chaudhari A- Detergent-compatible, organic solvent-tolerant alkaline protease from Bacillus circulans MTCC 7942: Purification and characterization, Prep Biochem Biotechnol, 2016, 46 :56-64.

Rao M, Tanksale B, Mohini AM et al – Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases, Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998, 62: 597-635.

Raval VH, Pillai S, Rawal CM et al – Biochemical and structural characterization of a detergent-stable serine alkaline protease from seawater haloalkaliphilic bacteria, Process Biochem, 2014, 49: 955-962.

Boothe DW, Tarbox JA, Tarbox MB – Atopic Dermatitis: Pathophysiology, Adv Exp Med Biol, 2017, 1027: 21-37.

Tuzmena N, Kalburcub T, Denizlic A – Amylase immobilization onto dye attached magnetic beads: Optimization and characterization, JMolCatal B Enzym, 2012, 78: 16– 23.

Nielsen JE, Borchert TV – Protein engineering of bacterial K-amylases, Biochimica et Biophysica Acta, 2000, 1543: 253-274.

Ghollasi M, Ghanbari-Safari M, Khajeh K – Improvement of thermal stability of a mutagenised α-amylase by manipulation of the calcium-binding site, Enzyme Microb Technol, 2013, 53: 406-413.

Kumari A, Singh VK, Kayastha AM – Molecular modeling of α-amylase from germinated soybean (Glycine max) and its functional diversity, International Journal of Genomics and Proteomics, 2013, 4: 64-71.

Fitter J – Structural and dynamical features contributing to thermostability inalpha-amylases, Cell Mol Life Sci, 2005, 65: 1925–1937.

Saboury A, Karbassi F – Thermodynamic studies on the interactionof calcium ions with alpha-amylase, Thermochimica Acta, 2000, 362: 121-12.

Witt W, Sauter JJ – Purification and characterization of α-amylase from poplar leaves, Phytochemistry, 1996, 41: 365-372.

Yadav JK – A differential behavior of α-amylase, in terms of catalytic activity and thermal stability, in response to higher concentration CaCl2, Int J Biol Macromol, 2012, 51:146-52.

Tripathi P, Hofmann H, Kayastha A et al – Conformational stability and integrity of α-amylase from mung beans: Evidence ofkinetic intermediate in GdmCl-induced unfolding, Biophysical Chemistry, 2008, 137: 95–99.

Leveque E, Janecek S, Hayea B. et al – Thermophilic archaeal amylolytic enzymes, Enzyme and Microbial Technology, 2000, 26: 3–14.

Irfan M, Nadeem M, Syed Q – Study on Some Properties of Calcium-dependent α-Amylase from Bacillus subtilis through Submerged Fermentation of Wheat Bran, Chem. Biochem. Eng, 2016, 30: 429–437.

Tsuyoshi N, Masahiro F, Akiko K -Crystal Structure of Calcium-free _-Amylase from Bacillus sp.Strain KSM-K38 (AmyK38) and Its Sodium Ion Binding Sites, 2003, 278: 24818–24824.

Jan-Willem F, Simons A, Muriel D – Identification of a Calcium Binding Site in Staphylococcus hyicus Lipase:Generation of Calcium-Independent Variants, Biochemistry, 1999, 38: 2-10.

Hu M, Li Y, DeckerEA et al – Role of calcium and calcium-binding agents on the lipase digestibility of emulsified lipids using an in vitro digestion model, Food Hydrocolloids, 2010, 24: 719-725.

Li Y, McClements DJ -Modulating lipid droplet intestinal lipolysis by electrostatic complexation with anionic polysaccharides: Influence of cosurfactants, Food Hydrocolloids, 2014, 35: 367-374.

Kulkarni N- Studies on lipase enzyme from Pseudomonasfluorescens NS2W2, 2002.

Kanwar SS, Ghazi IA, Chimni SS et al -Purification and properties of a novel extra-cellular thermotolerant metallolipase of Bacillus Coagulans MTCC-6375 isolate, Protein Expr Purif, 2006, 46: 421–8.

Mina Z, Gholamhossein E, Hossein S – Lipase and biosurfactant from Ochrobactrum intermedium strain MZV101 isolated by washing powder for detergentapplication, Lipids in Health and Disease, 2017, 16: 177.

Tero-Vescan A, Vancea S, Hutanu Aet al – Concordance and Controversy In Determining The Omega-3 Index In Plasma And Red Blood Cells Membrane, Farmacia, 2015, 63: 504-509.

Borrelli GM, Trono D – Recombinant Lipases and Phospholipases and Their Use as Biocatalysts for Industrial Applications, Int J Mol Sci, 2015, 16: 20774-840.

Fariha H, Aamer A, Sundus J et al- Enzymes used in detergents: Lipases, African Journal of Biotechnology, 2010, 9: 4836-4844.

Qingqing C, Chengbo H, Na Y et al- Enhanced activity and stability of industrial lipases immobilized onto spherelike bacterial cellulose, IntJBiol Macromol, 2018, 109: 1174–1181.

Bancerz R – Industrial application of lipases, Postepy Biochem, 2017, 63: 335-341.

Wang HK, Shao J, Wie YJet al -A novel low-temperature alkaline lipase from Acinetobacter johnsonii LP28 suitable for detergent formulation, Food Technol. Biotechnol, 2011, 49: 96–102.

Siddiqui A, Kamal M, Ayatollahi SA et al – Single Step Purification of Novel Thermostable and Chelator Resistant Amylase from Bacillus Licheniformis RM44 by Affinity Chromatography, Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 2017, 16: 1141-1146.

Seyhan F, Tijskens LMM, Evranuz O – Modelling temperature and pH dependence of lipase and peroxidase activity in Turkish hazelnuts, Journal of Food Engineering, 2002, 52: 387-395.

Malekabadi S, Badoei-Dalfard A, Karami Z – Biochemical characterization of a novel cold-active, halophilic and organic solvent-tolerant lipase from B. licheniformis KM12 with potential application for biodiesel production, Int J Biol Macromol, 2017, 109:389-398.

Kanekar PP, Nilegaonkar SS, Sarnaik SS, et al – Optimization of protease activity of alkaliphilic bacteria isolated from an alkaline lake in India, Bioresour Technol, 2002,85: 87-93.

Choudhary V – Compatibility with commercial detergents and stain removal capability of Aspergillus versicolor protease, J Acad Indus Res, 2012, 1: 301-305.