Evaluarea diversității genetice a speciei Scardinius racovitzai [305262]
UNIVERSITATEA ”ALEXANDRU IOAN CUZA” DIN IAȘI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA: BIOLOGIE
LUCRARE DE LICENȚĂ
Evaluarea diversității genetice a speciei Scardinius racovitzai
Coordonator științific:
Conf. dr. habil. Lucian GORGAN
Candidat: [anonimizat]-Alice JÎTCĂ
IAȘI
2017
Cuprins
INTRODUCERE 3
CAPITOLUL I-Caracterizarea biologică a speciei Scardinus racovitzai 6
1.1. Încadrare sistematică 6
1.2. Anatomie si morfologie 11
1.2.1. Morfologie externă 12
1.2.2. Colorația 13
1.2.3. Înmulțire 14
1.3. Caracterizarea familiei Cyprinidae 14
1.4. Istoricul cercetărilor 15
1.5. Ecologie și areal 18
1.5.1. Ecologie 18
1.5.2. Areal 18
CAPITOLUL 2. Material și metode 20
2.1. Materialul biologic 20
2.2. Izolarea și purificarea ADN 20
2.2.1. [anonimizat]-IQ System 21
2.2.2. Extracția ADN din probele de țesut muscular 22
2.3. Amplificarea genică a citocrom oxidazei I 27
2.3.1. Reacția de polimerizare în lanț (PCR) 28
2.3.2. Amplificarea genei care determină sinteza citocrom oxidazei I (COXI) 32
2.4. Validarea și secvențierea ampliconilor 33
2.4.1. Electroforeza produșilor PCR în gel de agaroză 33
2.4.2. Purificarea produșilor PCR 35
2.4.3. Reacția de secvențiere 36
2.4.4. Purificarea produșilor de secvențiere 37
2.5. Analiza populațională 40
2.6. Analiza filogenetică 42
2.6.1. Construcția arborilor filogenetici prin metoda UPGMA 42
2.6.2. Construcția arborilor filogenetici prin metoda Maximum Likelihood (ML) 43
2.6.3. Construcția arborilor filogenetici prin metoda Bayesiană 43
CAPITOLUL 3. Rezultate și discuții 50
3.1. Cuantificare ADN 50
3.2. Electroforeza ampliconilor 51
CONCLUZII 56
ANEXA 1 57
BIBLIOGRAFIE 60
INTRODUCERE
Activitatea umană și-a [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat] o modificare a [anonimizat] o [anonimizat] (Primack, 2002).
Progresele realizate în domeniul biologiei moleculare au necesitat extinderea și aprofundarea cunoștințelor în domenii conexe (biochimia, microbiologia, genetica, fizica, matematica).
În 1960, Zuckerkandl și Pauling au fost cei care au făcut un prim pas în domeniul filogeniei moleculare stabilind primul arbore filogenetic al vertebratelor. [anonimizat] s-a [anonimizat], [anonimizat].
[anonimizat] o [anonimizat], [anonimizat] (RELP), metoda utilizată pentru prima dată de David Botstein (1978), [anonimizat] (PCR).
[anonimizat] 1986, a schimbat pe deplin cursul studiilor în domeniul geneticii populaționale și al biologiei conservării. Metoda a permis caracterizarea unui număr mare de fragmente de ADN (marker genetici) [anonimizat]-un timp relativ scurt (Bertorelle et al, 2009).
Pornind de la descoperirea tehnicii PCR, un pas important pentru genetica moleculară, numeroase tehnici s-au dezvoltat rapid ulterior și au fost folosite cu succes pentru identificarea părinților, a urmașilor sau a indivizilor înrudiți atât din populațiile aflate în captivitate, cât și din cele sălbatice. Rezultatele obținute au servit conservării diversității genetice prin monitorizarea speciilor invazive dar și a celor pe cale de dispariție. Ele au putut fi folosite pentru stabilirea identității și provenienței speciilor necunoscute pe bază de asemănare între populații din zone geografice cunoscute și de asemenea au permis cuantificarea variabilității genetice din cadrul populațiilor precedente și descendenților din prezent, permițând astfel evaluarea ratei la care variația genetică a scăzut și s-a regenerat în populațiile din zone geografice fragmentate (Smith si Wayne, 1996).
S-au extins cercetările asupra genomului diverselor organisme procariote și eucariote, dar și asupra genomului uman (în 1990 este lansat proiectul "Genomul uman" iar în 2001 este secvențiat în totalitate).
Folosirea metodelor matematice în studiul eredității populațiilor a determinat apariția unui domeniu nou al biologiei-genetica populațiilor. Prin populație se înțelege totalitatea indivizilor dintr-o anumită specie care sunt legați între ei: se pot încrucișa sexuat, au ascendenți și descendenți comuni.
Bazele geneticii populațiilor au fost puse în 1908 de matematicianul G. H. Hardy în Anglia și de medical W. Weinberg în Germania, care au studiat independent frecvența genelor la nivelul populațiilor.
Distribuția mare a ciprinidelor ridică întrebări de ordin evolutiv și biogeografic, referitoare la evoluția și radiația viitoare a acestor specii. În ceea ce privește originea ciprinidelor, singurele răspunsuri clare sunt date de paleobiogeografie:
Maxima diversitate a ciprinidelor se întâlnește în Asia de Sud și este reprezentată de majoritatea liniilor evolutive (Howes,1991; Briggs, 1995; Nelson, 2006)
Ciprinidele nord americane derivă din ciprinidele asiatice (Briggs,1995)
Ciprinidele europene par a fi derivate din ciprinidele asiatice care au colonizat Europa în Oligocen (Briggs, 1995)
Ciprinidele africane ar putea fi derivate din ciprinidele asiatice deoarece cele două continente au fost unite în Miocen.
Dar cele mai vechi fosile de Cyprinidae descoperite în Africa provin din Kenya și se consideră că ar fi trăit acum 16-18 milioane de ani.
După Obrhelova 1971, unele din cele mai vechi fosile de ciprinide au fost descoperite în straturile din Oligocen ale Europei Centrale. De asemenea, s-a mai observat faptul că în Peninsula Iberică și în sudul Greciei există numeroase specii endemice, datorită izolării acestora de restul continentului.
Scopul lucrării este de a evalua diversitatea genetică a speciei Scardinius racovitzai de pe teritoriul României. Pentru atingerea acestor obiective, au fost parcurse următoarele etape: izolarea și purificarea ADN total, cuantificarea calitativă și cantitativă a ADN total, amplificarea markerilor moleculari prin PCR, verificarea ampliconilor prin electroforeză în gel de agaroză și secvențierea. Studiile au fost efectuate în cadrul Laboratorului de Genetică Moleculară al Facultății de Biologie din Universitatea ,,Alexandru Ioan Cuza”, Iași.
CAPITOLUL I-Caracterizarea biologică a speciei Scardinus racovitzai
Încadrare sistematică
Scardinius racovitzai (Roșioara de Pețea sau roșioara termală, roșioara lui Racoviță)
Tabel 1 Încadrarea sistematică a speciei S. racovitzai
Familia Cyprinidae
Această familie reprezintă cea mai numeroasă familie de pești de apă dulce și este răspândită în întreaga lume cu excepția Australiei și Americii de Sud (Nelson, 1994).
Familia cuprinde peste 200 de genuri și aproximativ 2000 specii răspândite într-o mare varietate de habitate. Genurile se grupează în 10 subfamilii imprecis delimitate. În regiunea Euro-mediteraneană trăiesc 33 de genuri, dintre care 20 sunt prezente în bazinul Dunării (Bănărescu, 1964).
Peștii aparținând acestei familii au corpul de formă variabilă, acoperit cu solzi cicloizi, mai rar nud. Linia laterală este completă sau incompletă. Dorsala și anala au lungimi variabile și prezintă 2-4 radii simple. Oasele gurii sunt fără dinți, iar oasele faringiene sunt foarte bine dezvoltate, falciforme, prevăzute cu dinți dispuși pe 1-3 rânduri, de formă variabilă. Gura este lipsită de mustăți dar la unele specii poate prezinta cel mult două perechi de mustăți (Bănărescu, 1964).
Înotătoarele ventrale au două radii simple și 5-8 radii divizate. Pectoralele au o radie simplă și 13-17 radii divizate iar caudala este totdeauna scobită. Vezica cu aer este mereu prezentă, este compartimentată și este legată de urechea internă prin aparatul lui Weber (opt oase mici transformate din prima vertebră) care are rolul de a transmite vibrațiile către urechea internă.
Peștii au fost răspândiți pe toate continentele (cu excepția Noii Zeelande, Madagascarului, Americii de Sud). Acești pești trăiesc de obicei în ape dulci, unele cazuri de excepție fiind Leuciscus idus, Abramis brama și Pelecus Cultratus care trăiesc în Marea Baltică sau în ape sărate cu un conținut de sare între 1‰ și 10‰.
În Asia, speciile Scardinius sunt pești care pot trăi și în mare. Pe continentul European, acești pești nu se găsesc în Norvegia și Islanda. În Africa și Asia acești pești nu se pot întâlni în regiunile de deșert. De asemenea, nu se pot întâlni în regiunile polare ca Siberia de Nord, aproape de cercul polar, nordul insulelor Filipine, Noua Guinee, Australia și Madagascar ca și toate insulele din Oceania. În America de Nord peștii trăiesc între cercul polar și tropicul racului, nu trăiesc pe Terranova sau în nordul Labradorului, iar în Alaska se pot întâlni numai pe cursul superior și mijlociu al fluviului Yukon. Unele specii endemice ca „Pseudophoxinus stymphalicus”, care trăiesc în Peloponez sau Grecia centrală au un areal de răspândire foarte redus .
Majoritatea ciprinidelor se hrănesc în principal cu vegetație și cu nevertebrate, cel mai probabil din cauza lipsei dinților și a stomacului. Dar unele specii (Aspius aspius) sunt prădătoare. Unele specii de ciprinide, cum ar fi cosașul (Ctenopharyngdon idella) sunt ierbivore specializate, altele, cum ar fi scobarul (Chondrostoma nasus) mănâncă alge și alte microorganisme, în timp ce alte specii, Mylopharyngdon piceus sunt specializate în hrănirea cu melci. Din acest motiv, ciprinidele sunt adesea introduse ca un instrument de management pentru a controla diverși factori de mediu acvatici, cum ar fi vegetația acvatică și bolile transmise de melci.
Genul Scardinius
Genul Scardinius cuprinde pești de dimensiuni mijlocii ce trăiesc în diferite habitate: de la lacuri la ape lin curgătoare, asociate de obicei cu vegetație acvatică. Majoritatea speciilor prezintă în stadii adulte linii întunecate de culoare gri (Kottelat, M. 2007).
Genul Scardinius cuprinde 10 specii:
Scardinius acarnanicus (Economidis, 1991)
Scardinius dergle (Heckel & Kner, 1858)
Scardinius erythrophtalmus (Bogutskaya, 1997)
Scardinius graecus (Stephanidis, 1937)
Scardinius hesperidius (Bonaparte, 1845)
Scardinius knezevici (Bianco& Kner, 1858 )
Scardinius plotizza (Heckel & Kner, 1858 )
Scardinius racovitzai (G. J. Muller, 1985 )
Scardinius scardafa (Bonaparte, 1837)
Scardiunius elmaliensis (Bogutskaya, 1997)
Scardinius acarnanicus (Figura 1)este o specie ce își are habitatul în lacuri și râuri cu debite mari, trăiește mai mult de 7 ani și atinge maturitatea sexuală la vârsta de 2-3 ani, depunând icre începând din luna martie și până în iulie. Se găsește doar în Grecia și se deosebește de celelalte specii ale genului Scardinius din peninsula balcanică prin următoarele caractere: mărimea corpului este de aproximativ 280 mm iar profilul capului este vizibil concav cu botul orientat în sus ; lungimea capului reprezintă 24-30% din lungimea standard a corpului; înotătoarea anală prezintă aproximativ 10 radii iar cea pectorală are 16 radii. Este o specie amenințată cu dispariția în viitorul apropiat (Iliadou & Ondrias, 1980).
Scardinius dergle această specie își are habitatul în râuri lent curgătoare, lacuri cu ape linștite, în izvoare carstice din Livno, Croația, în lacurile Busko și Mandecko. Se deosebește de celelalte specii ale genului Scardinius din peninsula balcanică prin : profilul capului este drept, cu botul orientat înainte, nu prezintă cocoașă în spatele cefei, lungimea capului este de 28-32% din lungimea standard a corpului (Figura 2), înotătoarea anală prezintă 10 radii iar linia laterală constă într-o serie de aproximativ 43 de solzi. Ca și specia S. acarnanicus, Scardinius dergle este o specie amenințată cu dispariția în viitorul apropiat (Heckel&Kner,1858).
Scardinius erythrophtalmus este o specie de apă dulce , traiește în grup, în ape dulci stătătoare precum lacuri, bălți, iazuri sau unele râuri cu un curs lent din munții Ural și până la munții Pirinei, limita de nord fiind Finlanda iar cea de sud Italia. A fost introdusă în Spania și Corsica. Această specie preferă ape mai puțin adânci dar bogate în vegetație acvatică. Are corpul turtit lateral, înotătoarele pectorale sunt de culoare roșiatică, cele dorsale, abdominale și codala sunt de culoare portocalie-roșiatică (Figura 3). Lungimea capului reprezintă 24-28% din lugimea standard a corpului. Depune icre începând cu luna aprilie și până în iulie, atunci când temperatura apei crește peste 15°C. Specia nu prezintă risc de dispariție (Bănărescu, 1964).
Scardinius graecus se găsește în Grecia, în lacul Yliki. A fost semnalată și în fostul lac Paralimni. Depune icre începând cu luna martie și până în luna iunie. Icrele aderă de plantele acvatice și după 4 zile, icrele eclozează la temperatura de 25°C. Lungimea capului reprezintă 24-35% din lungimea standard a corpului ( Figura 4). Înotătoarele pectorale au 14-18 radii. Scardinius graecus prezintă un risc extrem de ridicat de dispariție în sălbaticie.
Scardinius hesperidicus sau roșioara italiană este răspândită în bazinul Mării Adriatice și a Mării Tireniene din Slovenia și Italia. Trăiește mai mult de 15 ani și atinge maturitatea sexuală la vârsta de 3 ani. Depune icre atunci când temperatura depășește 18°C și se hrănește cu macrofite și cu insecte. Se deosebește de celelalte specii ale genului din Marea Mediterană prin: botul orientat în sus, nu prezintă cocoașă în spatele cefei, lungimea capului reprezintă 24-27% din lungimea standard (Figura 5). Poate avea dimenisuni de până la 40 cm. Specia nu prezintă risc de dispariție (Bruno, 1987).
Scardinius knezevici trăiește în bazine cu adâncime mare și în zonele malurilor mlăștinoase ale lacurilor. Este răspândită în lacurile Ohrid (Albania , Macedonia) și Skadar ( Montenegro, Albania). Prezintă cocoașă în spatele cefei. Toate înotătoarele sunt de culoare gri (Figura 6). Poate avea dimensiuni de peste 26 cm. Este o specie vulnerabilă și prezintă risc ridicat de periclitare în sălbăticie (Bianco & Kottelat, 2005).
Scardinius plotizza este răspândită în Bosnia și Herțegovina, Croația, lacul Desne. Trăiește în râuri cu vegetație acvatică bogată, în ape stătătoare, iazuri și lacuri. Specia nu prezintă cocoașă în spatele cefei, lungimea capului reprezintă 29-31% din lungimea standard. Înotătoarele sunt de culoare gri închis, corpul este de culoare argintie. Poate depăși dimensiunea de 20 cm (Figura 7). Specia nu prezintă risc de dispariție (Heckel & Kner, 1858 ).
Scadinius scardafa preferă apele cu vegetație acvatică din zona Italiei. Aparent, a fost întrodusă în lacul Scanno din Italia, singura locație cunoscută pentru supraviețuirea acestei specii. A mai fost semnalată în lacul Massaciuccoli (Italia) dar nu se cunosc mai multe detalii despre populația din acea zonă. Depășește dimensiunile de 35 cm (Figura 8) și depune icre începând cu luna aprilie și până în iulie. Este o specie pe cale de dispariție, cu risc extrem de ridicat de dispariție în sălbăticie (Bianco, 1994).
Scardinius elmaliensis este o specie endemică apelor din Turcia. Este sensibilă la activitățile omului, de aceea, în prezent se află în declin. Principalul habitat a fost drenat și transformat în teren agricol . Specia nu mai există în Avlan Gölü . Este o specie cu risc ridicat de dispariție.
Anatomie si morfologie
Scardinius racovitzai ( roșioara termală sau roșioara lui Racoviță) este o specie pe cale de dispariție, endemică apelor din România , descoperită și descrisă ca specie nouă în lucrarea lui G. Muller în anul 1958, (Scardinius recovitzai nova species ( Pisces, Cyprinidae) eine relikte Rotfederaus Westrumanien, Senckenbergiana Biologica 39, pg. 165-168,) în apele lacului termal 1 Mai (bazinul pârâului Pețea, județul Bihor) și denumită după marele biolog Emil Racoviță. O perioadă a fost considerată subspecie cunoscută sub denumirea de Scardinius erythrophthalmus racovitzai. Peștele este o specie strict termofilă, trăiește numai în apele calde ale pârâului Pețea, un pește adaptat existenței în ape termale cu temperaturi cuprinse între 27-34°C, care nu supraviețuiește în ape cu temperaturi mai mici de 20 de grade ( Bănărescu, 1964).
Morfologie externă
Are corpul înalt, oval în secțiune transversală, comprimat lateral și fără gibozitate după ceafă (Figura 9). Capul cu un profil dorsal convex; lățimea capului egală cu 15-17% din lungimea standard a corpului, iar lungimea capului echivalentă cu 28 – 31% din lungimea standard a corpului. Gura terminală, cu o deschidere a gurii semiorizontală. Dinții faringieni dispuși pe două rânduri.
Figura 9 Scardinius racovitzai (https://peterlengyel.files.wordpress.com/2012/05/dsc_9321.jpg)
Între nări există un șanț. Lungimea peduncului caudal se cuprinde de 1,3-1,7 în înălțimea sa. Înotătoarea dorsală este împinsă mult îndărăt, marginea ei anterioară fiind în jumătatea posterioară a corpului și evident în urma inserției înotătoarelor ventrale. Înotătoarea caudală este bifurcată (Kottelat, 2007).
Figura 10 Scardinius racovitzai (https://peterlengyel.files.wordpress.com/2012/05/dsc_9406.jpg)
Colorația
Spatele este de culoare verde smarald mai mult sau mai puțin întunecat. Părțile laterale ale capului și laturile corpului sunt albe, cu un luciu argintiu strălucitor. Abdomenul alb, uneori cu tentă gălbuie la baza înotătoarelor. Irisul argintiu cu margini aurite (Figura 11). Înotătoarele sunt semitransparente. Înotătoarea dorsală cenușie iar cele perechi alături de înotătoarea anală și lobul inferior al înotătoarei caudale sunt gălbui, cu marginile exterioare de culoare roșie (Kottelat, 2007).
Figura 12 Scardinius racovitzai (https://peterlengyel.files.wordpress.com/2012/05/dsc_9326.jpg)
Înmulțire
Masculii ating maturitatea sexuală la vârsta de un an și femelele de la unu la doi ani. După Muller, 1958 specia se reproduce în ape stagnante, din aprilie până în iulie, depune icre pe vegetația submersă, de culoare ușor rozalie și cu un diametru de 1,2-1,3 mm. În urma studierii și analizei în captivitate, comportamentul reproductiv se manifestă exclusiv pe durata nopții, cu o mare probabilitate între orele 0-6 a.m.
Depune icre o dată pe an începând din aprilie și până în iulie atunci când apa depășește 18°C. Icrele aderă de plantele acvatice din care iese puietul la cca. 3 – 10 zile. În perioada de împerechere, masculii au culorile mai accentuate.
Caracterizarea familiei Cyprinidae
Primele încercări de evidențiere și numărare a cromosomilor la pești aparține cercetătorilor Moore (1980), Van der Strict (1985) și Sobota (1897) , dar cercetările privind citogenetica și filogenia peștilor s-au făcut după anul 1960.
Cunoștințele privind mecanismele eredității la pești se bazează pe studiile făcute pe membri ai ordinului Cypriniformes (Lebistes reticulatus, Carassius sp., Cyprinus sp., Salmo sp.). Mecanismul determinismului sexual la peștii osoși nu este încă elucidat, însă spre deosebire de mamifere, unde femelele au XX iar masculii XY, sau păsări – unde este exact invers (masculii au XX și femelele XY), la pești se întâlnesc ambele situații.
În ceea ce privește numărul de cromosomi, ultimile cercetări arată că numărul diploid de cromosomi la pești variază între 18 și 104. Observațiile asupra numărului de cromosomi la pești sunt mult mai puține față de oricare alt grup de animale. Creșterea interesului asupra numărului de cromosomi și a morfologiei acestora promite importante contribuții la fundamentarea anumitor teorii privind evoluția și filogenia peștilor (Gorgan, 2007).
După Minciu și Bâra, 1985, în cadrul familiei Cyprinidae s-au identificat două categorii de specii- una în care complementul diploid variază în jurul numărului 100 (Cyprinus carpio 2n=100, Carassius auratus 2n=104), iar cealaltă cu specii la care 2n variază în jurul numărului 50 (Barbus tetrazona 2n=50, Barbus fasciatus 2n=52).
Istoricul cercetărilor
După Garcia-Berthou & Moreno-Amich 2000, specia Scardinius erythrophthalmus a fost introdusă într-un lac carstic din Peninsula Iberică (lacul Banyoles din Spania), un lac cu un conținut redus de nutrienți dominat de specii exotice de pești, în vederea studierii habitatului și a variației hranei roșioarei. Printre cele mai importante prăzi animale se numără: cladocerul Daphnia longispina și Scapholeberis rammneri. S-a observat faptul că S. erythrophthalmus consumă zoplanctonul apei mai mult primăvara și toamna. Alimentația speciei se diferențiază prin importanța materialului vegetal și a diferitelor specii de nevertebrate neustonice, în special S. rammeri și stadiile tardive de dezvoltare ale nematocerilor reprezintă o puternică partițonare a resurselor cu alte specii de pești.
După Johansson 1987, interacțiunea competitivă dintre babușcă și roșioară au fost investigate în două tipuri de habitate: o suprafață de apă curgătoare, fără vegetație acvatică și o zonă de apă a cărei suprafață este acoperită cu nuferi și vegetație acvatică. În captivitate, ratele de creștere a ambelor specii a fost mai mică când aceastea au fost ținute în același habitat decât atunci când au fost investigate în habitate diferite, lucru ce demonstrează concurența interspecifică. Babușca, specie ce își are originea în regiuni geografice diferite a prezentat cea mai mare rată de creștere în ambele habitate, deși preferă suprafețe de ape curgătoare. S-a mai observat faptul că alimentația celor două specii este aceași în ambele habitate și constă în principal în zooplancton. În captivitate, impactul babușcăi asupra zooplanctonului de dimensiuni și densitate medie, împreună cu celelalte rezultate ale studiilor efectuate în laborator, au indicat faptul că babușca Rutilus rutilus este mai competitivă în ape curgătoare.
Datorită gradului mare de mortalitate a speciilor ținute în captivitate într-un habitat ‘’cu nuferi’’, nu s-a putut trage nicio concluzie privind competiția interspecifică între cele două specii.
După Hofer 1987, în cazul babușcăi-Rutilus rutilus, activitatea proteolitică a rămas constantă aproape pe tot parcursul anului, în timp ce la cealaltă specie, la roșioara S. eythrophthalmus, activitatea proteolitică a crescut ca mai apoi să se reducă în timpul primelor luni după procesul de dezgheț din primăvară. În condiții normale de viață, ambele specii au arătat o mai înaltă activitate proteolitică atunci când se hrănesc cu animale decât atunci când consumă detritus organic. În condiții de laborator, la o temperatură de 16°, se observă o ușoară creștere a activității atunci când peștele este hrănit cu viermi. Iar în cazul hrănirii cu plante vegetale, se observă o dependență semnificativă a activității proteolitice față de temperatura mediului, lucru întâlnit doar la babușcă.
Diferențele dintre cele două specii studiate sunt însă însemnate. Sistemul digestiv al babușcăi este foarte adaptabil, răspunzând uimitor la schimbările de sezon. Însă la roșioară, sistemul digestiv nu este asa flexibil, fiind mult mai puțin afectat de schimbările de mediu.
Într-un studiu, realizat de Bianco în 2004, autorii au analizat prin diferite tehnici de bandare, cromozomii a 8 specii de Rutilus și Scardinuius, endemice în Italia. În paralel, aceleași analize au fost efectuate pe alte două specii leusciene, (subfamilie din fam Cyprinidae): Alburnus albidus și Leuciscus cephalus. Toate speciile care au fost analizate au același cariotip: 2n= 50 cromozomi, 8 perechi metacentrici + 13 perechi submetacentrici + 4 perechi subtelo/acrocentrici) cu regiunea de organizare a nucleolilor la capătul brațului scurt a unei perechi de cromozomi submetacentrici. Variația interspecifică a fost observată la nivelul distribuției heterocromatinei. S-a observat că o bandă C situată peritelomeric la prima pereche de cromozomi telocentrici caracterizează speciile de Rutilus și Scardinius. În ambele genuri, heterocromatina diferențiată pare să fie direcționată către direcția centromei- telomere, evident mai ales de-a lungul elementelor metacentrice ale cariotipului.
Conform unui studiu de caz, realizat de Nicolae Pop, în luna iunie a anului 2013 s-a demarat un proiect știintific și de conservare “Captive breeding and maintaining ex situ populations of Scardinius racovitzai and Melanopsis parreyssi”. Proiectul s-a desfășurat pe o perioadă de 18 luni (până în decembrie 2014) în parteneriat cu “Universitatea “Szent István” din Gödölö (Ungaria) și Acvariul Galați (Complexul Muzeal de Științe ale Naturii “Răsvan Angheluță”).
Obiectivele acestui proiect au fost: menținerea în captivitate a unor specii endemice și aproape deloc studiate (roșioara termală Scardinius recovitzai și melcul Melanopsis parryssi); cercetarea și reproducerea lor în captivitate pentru a se asigura o rezervă bună de indivizi în vederea evitării dispariției acestor specii.
Întrucât speciile endemice sunt puțin studiate, acest proiect a avut și o latură experimentală, furnizând informații referitoare la cerințele de mediu, la biologia, reproducerea, morfologia și genetica acestora. În urma analizelor genetice efectuate la Universitatea“Szent Gödölö” s-a stabilit că roșioara termală este foarte apropiată de roșioara comună, dar prezintă o diferență genetică și mai ales morfologică destul de semnificativă.
La toate instituțiile care au participat la acest proiect, creșterea în captivitate a avut un succes, peștii s-au adaptat bine la condițiile de mediu, s-au înregistrat depuneri de icre la roșioara termală, declanșate fie prin scăderea gradată a temperaturii apei de la 28°C la 23°C, pentru a stimula condițiile naturale din perioada de reproducere, fie prin inducție hormonală (injecții cu hormoni de crap).
După Crăciun 1997, timp de doi ani s-au făcut cercetări pe teren, cu privire la ecologia ecosistemului termal 1 Mai Oradea, precum și cercetări în laborator. În urma acestor cercetări s-a demontrat faptul că roșioara- Scardinius racovitzai este răspândită în cârduri, repartizate pe grupe de talie. Subadulții și puii formează cârduri mici sau foarte mari, în ape de adâncime foarte mică, lipsite de vegetație, iar adulții formează grupuri mici în ochiurile de apă liberă, existente în vegetație. În captivitate, într-un acvariu termal, cu substrat nisipos, cu flora tipică lacului reprezentată de Nymphaea lotus thermalis și cu fito și zooplancton tipic lacului termal 1 Mai, s-au introdus 38 de indivizi adulți de Scardinius racovitzai. Pe parcursul a câtorva luni de observații, s-au obținut următoarele rezultate: Scardinius racovitzai diferă prin multe caractere morfologice de specia comună Scardinius erithrophtalmus. Ca urmare a acestor caractere s-a observat o puternică tendință de agregare în cârd a indivizilor. Deși în acvariu au fost introduse și alte specii de pești, s-a observat faptul că roșioara termală nu primește în cârd nicio altă specie, ci realizează numai cârduri monospecifice, ca în natură. Scardinius racovitzai din lacul 1 Mai este o specie stric termofilă supraviețuirea ei fiind imposibilă atunci când temperatura apei scade sub 24°-25°C.
Telcean și Cupșa, în anul 2013 arată că acest taxon endemic, este prezent în număr mare în apele lacului termal la data cercetărilor din primăvara lui 2005, deși în apele răcite ale pârâului Pețea nu se mai poate găsi. Caută hrana în locurile acoperite de vegetație, consumând mai ales hrană de origine vegetală.
Ecologie și areal
Ecologie
Roșioara trăiește în apele termale ce au o temperatură de 27-34 °C și bogate în vegetație acvatică, în zone cu funduri nămoloase. Puietul consumă zooplancton, insecte acvatice și uneori pești de dimensiuni mici. Adulții se hrănesc în principal cu vegetația acvatică, alge filamentoase și diatomee pe care le ciugulește de pe substrat, dar și cu nevertebrate acvatice, larve și adulți de insecte acvatice și zooplancton.. Ei pot consuma hrană până la 40% din greutatea lor corporală pe zi, din care , aproximativ 80% este evacuat ca deșeu, eliberând astfel nutrienți în coloana de apă. Durata de viață este de aproximativ 17 ani iar maturitatea sexuală este atinsă la vârsta de 2 sau 3 ani.
Areal
Este răspândită numai în nord-vestul României pe o suprafață mai mică de 1 km ² : în lacul termal Pețea – Băile 1 Mai (Rezervația Naturală de la Băile 1 Mai-Oradea) și în aval de rezervație până la Rontău (Figura 13).
Figura 13 Scardinius racovitzai în România (https://www.google.ro/maps/place/Lacul+cu+Nuferi/@45.3449198,16.1346441,6.46z/data=!4m5!3m4!1s0x47463912b8aa2e0d:0x4d74270735dbb5!8m2!3d46.9978299!4d22.0012515)
Figura 14 Lacul 1 Mai (https://peterlengyel.files.wordpress.com/2012/05/dsc_4480.jpg)
Apele termale sunt caracterizate de temperaturi destul de ridicate și stabile, cu variații nesemnificative pe parcursul anului. Regimul termic cvasiconstant a produs modificări în metabolismul organismelor care s-au adaptat în aceste lacuri, adică au devenit dependente de apele calde, de aceea ele nu pot supraviețui în afara acestor ape.
CAPITOLUL 2. Material și metode
Materialul biologic
Pentru realizarea acestui studiu, materialul biologic folosit a fost reprezentat de țesut muscular (prelevat din mușchiul dorsal), solzi și mucus (prelevat prin tamponare tegumentară). Probele au provenit de la indivizi aparținând speciei Scardinius întâlnită pe teritoriul României: Scardinius racovitzai (Müller, 1958) și au fost conservate în alcool etilic absolut. În Figura 15 sunt reprezentate punctele de colectare a probelor.
Figura 15 Punctele de colectare a probelor
Izolarea și purificarea ADN
În vederea izolării și purificării ADN total, au fost folosite protocoale de lucru diferite, în funcție de tipul țesutului. Astfel, pentru probele reprezentate de solzi și mucus s-a folosit protocolul DNA-IQ System (DC6700 Promega), iar pentru probele de țesut muscular a fost folosit protocolul de extracție fenol-cloroform-alcool izoamilic (PCI) (Ausubel et al., 1995).
Extracția ADN din probele de solzi și mucus – protocolul DNA-IQ System
Acest protocol este destinat extracției de cantități mici de ADN, și se bazează pe atașarea moleculelor de ADN la particule de rășină, datorită încărcării electrice a acestora.
Indiferent de tipul și originea probei din care se urmărește a se extrage ADN, pașii urmați sunt aceeași, fiind diferită doar etapa de pregătire a probelor premergătoare extracției.
Acest protocol poate fi utilizat pentru extracția din:
Sânge (proaspăt sau păstrat în soluție tampon cu rol anticoagulant);
Oase;
Prezentarea protocolului
Se ia o cantitate de probe pentru analizat și se pune într-un tub Eppendorf;
Se adaugă tampon de liză și se incubează 30 de minute la 70°C;
Se adaugă rășina, se vortexează și ulterior se incubează la temperatura camerei;
Se vortexază câteva secunde, apoi se plasează tuburile pe standul magnetic (Figura 18), după care se elimină cu o pipetă tot lichidul;
Se spală de trei ori cu tampon de spălare și se elimină tot lichidul;
Se realizează o uscare cu capacele deschise la temperatura camerei;
Se adaugă tampon de eluție și se incubează la 65°C timp de 5 minute;
Se scot tuburile de la incubat și se așează pe standul magnetic;
Se scoate soluția de ADN și se pune în tuburi sterile etichetate;
Soluția de ADN se poate păstra pentru scurt timp la 4°C sau pe termen lung la -20°C.
Figura 17 Kit de extracție Wizard DNA IQ System (Promega)
Figura 18 Stand magnetic
Extracția ADN din probele de țesut muscular
Tehnica este folosită pentru extragerea ADN total din țesuturi proaspete, congelate sau păstrate în etanol (Ausubel et al., 1995).
Soluții:
1. Tampon pentru liza celulară:
Conține: Tris HCl 50mM (pH=8), SDS 1,0%, EDTA 25mM.
Pentru 50ml, într-o eprubetă se introduc 25ml H2O miliQ (apă distilată filtrată prin filtru de carbon, schimbător de ioni etc.) autoclavată, la care se adaugă 2,5ml soluție stoc 1M Tris HCl (pH=8), 5ml 10% SDS, 2,5ml 0,5M EDTA. Se completează volumul cu H2O miliQ până la 50ml și se introduce într-un tub Corning nou cu volumul de 50ml, neautoclavat.
Soluții stoc:
1. Soluție Tris-HCl 1M (pH=8): cantitățile sunt calculate pentru un volum de 100ml;
se dizolvă 12,11g Tris în 80ml H2O miliQ;
se corectează pH-ul la 8 cu HCl;
se autoclavează.
2. Soluție Tris-EDTA (TE) (pH=8,0): -cantitățile sunt considerate pentru un volum de 100ml;
într-o eprubetă de 100ml se introduce 1ml soluție stoc Tris-HCl 1M (pH=8);
200μl EDTA 0,5M;
se completează cu H2O-miliQ până la 100ml și se autoclavează.
3. Soluție NaOH 10N (100ml):
se cântăresc 40g NaOH
se adaugă 70ml H2O-miliQ autoclavată și se agită până la dizolvare;
se aduce volumul la 100ml;
nu se autoclavează.
4. Soluție SDS 10% (dodecil sulfat de sodiu):
se introduc 10g SDS în 80ml H2O-miliQ autoclavată și se încălzește soluția la 80șC pentru o mai bună dizolvare;
se ajustează pH-ul la 7.2 (dacă este necesar), utilizând HCl;
se aduce volumul la 100ml cu H2O-miliQ;
nu se autoclavează.
5. Soluție EDTA 0,5M (etilendiaminotetraacetat·sare disodică):
se cântăresc 18,61g EDTA, peste care se adaugă 80ml H2O-miliQ;
se agită puternic și se adaugă 1ml soluție NaOH 10N;
se adaugă NaOH până când soluția devine alcalină (pH=8,0), iar EDTA este dizolvat complet.
se aduce volumul la 100ml cu H2O-miliQ și se autoclavează;
Modul de lucru:
Se etichetează tuburi Eppendorf de 1,5ml autoclavate, în care se introduc câte 500μl soluție tampon (tampon pentru liză). Tuburile se țin închise, până în momentul introducerii țesutului.
Se cântăresc între 20 – 200mg de țesut muscular proaspăt, congelat sau conservat în alcool etilic 95% (în acest caz, țesutul se usucă înainte de cântărire, pe hârtie de filtru). Fragmentul de țesut se așează pe o lamă sterilă și se taie mărunt cu un bisturiu sau cu o lamă, sterilizate. Dacă fragmentul este mic (dacă provine de la un individ de 1 – 2cm), această etapă nu este necesară.
Se introduc fragmentele de țesut în tubul Eppendorf (de 1,5ml) corespunzător, care conține 500μl soluție tampon pentru liză. Această etapă se repetă pentru toți indivizii. În fiecare tub, se adaugă câte 10μl proteinază K (10μl reprezintă echivalentul a 200μg proteinază dintr-o soluție stoc 20mg/ml care este preparată și congelată la – 20°C). Se agită fiecare probă pe un vortex și se păstrează peste noapte în etuvă la 37°C.
Notă: pentru realizarea acestei etape se recomandă să se lucreze cu un număr de probe echivalent cu numărul de cuve din centrifugă.
În ziua următoare, sub nișă, în fiecare tub de 1,5ml se adaugă 600μl de soluție fenol : cloroform : alcool izoamilic (25 : 24 : 1), până la semnul superior al tubului. Se agită tuburile timp de 30 – 60 secunde, apoi se centrifughează (utilizând o centrifugă de masă), la o turație 8000 rotații/minut, timp de 4 minute. În timpul centrifugării, se etichetează noi tuburi Eppendorf de 1,5ml. La sfârșitul centrifugării, tuburile prezintă o fază inferioară de culoare gălbuie care conține solventul organic, o fază superioară care conține ADN și o fază intermediară unde sunt depozitate toate resturile pe care dorim să le eliminăm din soluția de ADN (Figura 19).
Figura 19 Separarea celor trei faze
Notă: dacă această fază intermediară este foarte mare, se repetă spălarea cu fenol : cloroform : alcool izoamilic, urmată de centrifugare. Dacă fazele sunt bine separate, se trece la etapa următoare.
Se separă faza superioară a fiecărui tub, în noile tuburi etichetate; – pentru aceasta se utilizează o pipetă, cu ajutorul căreia se extrag 700μl de ADN. Dacă pipetarea se face repede, iar concentrația ADN este foarte mare în faza superioară a tubului, în momentul pipetării, se pot extrage resturi ale fazei intermediare. Se extrage faza superioară din fiecare tub menținându-le deschise sub nișă, iar la sfârșit, se adaugă câte 550μl cloroform (Figura 21 A). Se agită tuburile timp de 30 – 60 secunde, apoi se centrifughează la 8000 rotații/minut, timp de 3 minute, utilizând o centrifugă de masă. În timpul centrifugării, se etichetează noi tuburi.
Se separă fazele superioare rezultate în urma centrifugării, în noile tuburi, în același mod ca în etapa precedentă, având grijă să nu se preia nimic din faza intermediară de separare (Figura 20 B).
Figura 20 . Etapa de amestec cu cloroform (A); Identificarea celor trei faze de la sfârșitul celei de a 2-a centrifugări(B)
Se adaugă 1ml etanol rece 95% (păstrat la -20°C) în noile tuburi după separare până la semnul superior al fiecărui tub. Se agită tuburile și se lasă la temperatura de -20°C, timp de 30 – 60 minute, timp în care se va forma un precipitat albicios (ADN total) pe fundul tuburilor (Figura 21).
Figura 21 Precipitarea ADN-ului în etanol
După precipitarea ADN, se centrifughează tuburile la 10.000 rotații/minut, timp de 5 minute, pentru sedimentare. Se elimină supernatantul și se așează tuburile deasupra unei hârtii de filtru, astfel încât să se scurgă ultimele picături de alcool.
Urmează uscarea peletelor, mutând tuburile, deschise, într-o centrifugă cu vacuum, unde sunt menținute timp de 10 minute, cu temperatura în scădere. Dacă în acest interval de timp sedimentele nu sunt uscate, se mai lasă tuburile încă 5 minute în centrifugă.
După uscarea peletelor, se adaugă în fiecare tub câte 200μl soluție TE (pH=8,0) și se resuspendă manual sau pipetând de câteva ori. Pentru o mai bună resuspensie, se pot lăsa între 15 și 30 minute la temperatura camerei, la 37°C sau timp mai îndelungat la 4°C. După resuspendarea peletelor de ADN, conținutul fiecărui tub este repartizat în trei tuburi de câte 1,5ml (etichetate anterior), punând câte 50μl din soluția resuspendată. Din cele trei tuburi ale unei probe, unul se păstrează la 4°C, iar celelalte două se congelează (-20°C – -80°C).
Amplificarea genică a citocrom oxidazei I
ADN izolat și purificat este supus ulterior reacției de polimerizare în lanț (PCR), prin care se multiplică exponențial o porțiune de material genetic, care se dorește a fi studiat. În cazul de față a fost amplificată citocrom oxidaza I. La genul Scardinius genomul mitocondrial măsoară între 16575 perechi de baze și 16580 perechi de baze (Figura 22).
Figura 22 Harta genomului mitocondrial la Scardinius sp.,
(https://en.wikipedia.org/wiki/Mitochondrial_DNA#/media/File:Mitochondrial_DNA_en.svg)
Reacția de polimerizare în lanț (PCR)
Principii generale
Reacția de polimerizare în lanț – PCR (Polymerase Chain Reaction) constituie o tehnică dezvoltată relativ recent pentru amplificarea in vitro a secvențelor de ADN. Într-un timp foarte scurt tehnica s-a transformat într-o unealtă atât de analiză a genelor cât și a tehnicilor de recombinare, permițând detectarea ADN din celule individuale și determinarea secvențelor provenite chiar și de la speciile dispărute. Aceasta se datorează sensibilității extrem de ridicate a acestei metode, capabilă de a detecta chiar și o singură moleculă de ADN dintr-o secvență specifică, în prezența unui exces de secvențe de ADN de 106 ori mai mare (Schleif, 1993).
Principiul de bază al reacției enzimatice a fost pentru prima dată descris de către Kleppe și Khorana în anul 1970, însă ei nu aveau posibilitatea de a realiza această tehnică în forma procesului automat în care se desfășoară astăzi (Kleppe et al., 1971). Metoda a fost introdusă în anul 1985 de către Kerry B. Mullins , în California, și a pornit de la o schemă teoretică menită să realizeze secvențe dideoxinucleotidice limitate ale unei gene umane folosind oligonucleotide sintetice, în scopul diagnosticării mutaților apărute în bolile comune umane (Mullins, 1990). Această metodă a fost mai întâi folosită pentru amplificarea ADN codificant pentru β-globină și pentru diagnosticul prenatal al siclemiei (Saiki et al., 1985). La început pentru extinderea primerilor atașați s-au folosit fragmente Klenow din ADN polimeraza I de la Escherichia coli, însă enzima a fost inactivată de temperaturile ridicate necesare pentru denaturarea ADN bicatenar. De aceea în timpul fiecărui ciclu trebuia adăugată enzimă proaspătă. În ceea ce privește polimeraza utilizată în prezent, ea are o caracteristică specială ce o face superioară enzimelor utilizate la început și anume faptul că este stabilă la temperaturi mari. Datorită acestui aspect, nu mai trebuie adăugată în fiecare ciclu de amplificare, deoarece enzima nu este inactivată. Această polimerază a fost izolată dintr-o bacterie numită Thermophilus aquaticus, care trăiește în izvoarele termale. De aici ea a primit și numele de Taq-polimeraza.
Tehnica PCR se bazează pe de o parte pe capacitatea organismelor de a-și replica propriul ADN, iar pe de altă parte, pe comportamentul specific al majorității polimerazelor de a recunoaște și a se atașa temporar la ADN monocatenar, într-un punct adiacent unei porțiuni bicatenare. Odată atașate, aceste polimeraze utilizează deoxi-nucelosid-trifosfații adăugați în mediul de reacție precum și energia stocată în legăturile fosforice pentru atașarea nucleotidelor la catena de ADN , sintetizând astfel un nou lanț bicatenar (Hillis et al., 1996). Întregul proces implică de asemenea repetarea unor cicluri termice, fiecare ciclu fiind alcătuit din 3 pași: primul pas constă în denaturarea ADN dublu-catenar, la o temperatură mai mare de 90oC, urmează apoi o scădere a temperaturii pentru atașarea primerilor, iar în cele din urmă temperatura este ușor ridicată pentru extinderea catenei de ADN cu ajutorul polimerazei și a deoxi-nucleosid-trifosfaților (Pühler, 1993).
Orice genă, chiar și din genomurile cele mai complexe poate fi amplificată în mod specific prin această metodă, atâta timp cât secvențele de nucleotide care flanchează regiunea țintă sunt cunoscute (Nguyen et al., 2006).
Primerii constituie perechi de secvențe nucleotidice de dimensiuni mici (cu o lungime cuprinsă între 18 și 30 de perechi de baze), sintetizate artificial, complementare fiecărei regiuni care flanchează gena de interes, unul dintre ei fiind complementar catenei directe, iar celălalt fiind complementar catenei reverse.
Pentru realizarea reacției PCR, mici cantități de ADN (de ordinul microgramelor) sunt combinate cu primerii, deoxinucelotid trifosfații, tampon de reacție, Taq-polimeraza, precum și co-factori pentru polimerază, cum este magneziul, în general adăugat sub formă de clorură de magneziu. Tot acest amestec funcționează în mod repetat, copiind secvența de ADN dintre primeri la o viteză de reacție și specificitate determinate în special de temperatură, iar rezultatul amplificărilor va depinde de interacțiunile eficiente dintre toți acești compuși.
Un ciclu de amplificare este alcătuit, după cum am precizat, din 3 pași: denaturarea ADN, atașarea primerilor și elongarea.
Denaturarea
În această fază ADN bicatenar este denaturat la ADN monocatenar, datorită temperaturii ridicate (Figura 23). Trebuie folosită o temperatură de peste 90°C, în general preferându-se temperatura de 94°C. Încălzirea insuficientă sau exagerată pe parcursul etapei de denaturare duce la imposibilitatea desfășurării reacției de polimerizare. De asemenea și timpul de denaturare este foarte important, deoarece o denaturare prelungită poate reduce activitatea enzimei Taq-polimeraza. Spre exemplu, după 30 de cicluri de denaturare a câte 60 de secunde fiecare, Taq polimeraza își pierde aproape jumătate din activitate. În general, echilibrul optim între temperatură și durată, este de 30 de secunde la 94°C. Este foarte important însă ca reacția să atingă o temperatură și durată la care să se producă complet separarea lanțurilor, astfel că de multe ori este recomandată o durată de 60-120 de secunde pentru temperatura de 94-95°C.
Figura 23 Etapa de denaturare a ADN din timpul reacției PCR
(http://backtobiobasics.blogspot.com/)
Atașarea primerilor la ADN
Acest proces se realizează prin scăderea temperaturii soluției la 50-60oC timp de 15 secunde până la 2 minute. Temperatura la care are loc atașarea se calculează în funcție de structura primerilor. Expunerea limitată la temperaturi înalte ajută la menținerea activității polimerazei la cote maxime pe parcursul reacției. Atașarea primerilor poate depinde de concentrația primerilor, disponibilitatea locurilor de atașare sau prezența unor poziții de atașare non-ideale. În timpul în care temperatura este coborâtă de la etapa de denaturare, primerii se mișcă aleator în mediul de reacție, conduși de mișcarea browniană (Figura 24). Dacă temperatura de aliniere este prea mare nu toate moleculele de primer se vor atașa de ADN, iar dacă este prea mică pot avea loc alinieri nespecifice, generând astfel produși PCR nedoriți (Hillis et al., 1996).
Figura 24 Atașarea primerilor la matrița de ADN
(http://backtobiobasics.blogspot.com/)
Extensia
Fiecare ciclu se termină cu câteva minute (15 secunde până la 3 minute), la 68oC, în cursul cărora ADN polimeraza specială alungește secvența primerilor, sintetizând replicile catenelor ADN țintă, adăugând deoxiribonucleotide la capătul 3ʼ al fiecărui primer (Figura 25). În ce privește temperatura, polimeraza Taq funcționează bine la 72°C.
Figura 25 Extensia ADN
(http://backtobiobasics.blogspot.com/)
Taq polimeraza se leagă atât de matrița de ADN monocatenar cât și de deoxi-nucleotid-trifosfații care se găsesc în mediul de reacție și utilizează energia stocată în legăturile trifosfat pentru a cataliza reacția de atașare a nucleotidelor la a doua catenă a ADN. Enzima se mută apoi la noul capăt dublu-catenar procesul fiind repetat de sute și chiar mii de ori pe secundă. ADN polimeraza este unidirecțională. Începe prin a sintetiza capătului 3' al moleculei dublu catenare și sintetizează ADN nou în direcția 5'-3'. Cu toate acestea, natura bipolară a celor două catene complementare ale helixului standard, face posibil ca o polimerază să sintetizeze oricare din catene.
Cele mai multe reacții PCR au 20 – 40 asemenea cicluri. Termocycler-ul ridică și coboară ciclic temperatura amestecului de reacție, sub coordonarea riguroasă a unui computer. De obicei, rata de încălzire este de 0,3°C pe secundă și cea de răcire de 1°C pe secundă, pentru un singur ciclu de aproximativ 3,55 minute. Teoretic, după 30 de cicluri, fiecare genă țintă este amplificată de 230ori.
Amplificarea genei care determină sinteza citocrom oxidazei I (COXI)
În prezentul studiu secvențele ADN provenite de la indivizii speciei S. racovitzai au fost amplificate utilizând o pereche de primeri specifici pentru gena COXI, însumând 655 perechi de baze (pb):
FISH F1 (5’-TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC-3’, Ward et al., 2005);
FISH R1 (5’-TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA-3’, Ward et al., 2005).
Pentru reacția PCR a ambelor segmente, se folosesc tuburi tip Eppendorf cu o capacitate de 0,2ml și kitul de amplificare GoTaq® Green Master Mix (Promega Corporation, Madison, Wi, USA).
Compoziția mediului de reacție (Tabel 2) a fost:
Tabel 2 Compoziție mediu de reacție pentru amplificare
Cantitatea de ADN adăugat a variat între 2 µl și 2.5 µl în funcție de concentrația acestuia.
Procesul de amplificare a constat în 3 etape prezentate în Figura 26, temperatura de aliniere a primerilor fiind de 52°C.
Figura 26 Etapele programului de amplificare a genei COI
Validarea și secvențierea ampliconilor
Electroforeza produșilor PCR în gel de agaroză
La încheierea programului PCR, are loc verificarea prin electroforeza în gel de agaroză a produșilor obținuți.
Gelul de agaroză conține:
agaroză (Promega Corporation, Madison, Wi, USA);
tampon TBE 1X: soluție stoc 10X (108g tris Base, 55g acid boric, 40 ml EDTA 0,5M, se completează cu apă bidistilată până la 1l) și 1X soluție de lucru (89mM Tris base, 89mM acid boric, 2mM EDTA);
bromură de etidiu: pentru 1000X soluție stoc de concentrație 0,5mg/ml sunt necesare: 50 mg bromură de etidiu, 100 ml H2O bidistilată. Soluția stoc se diluează în proporție de 1:1000;
tampon de încărcare (blue-orange loadig dye): 20% glicerol, 1mg/ml bromfenol albastru, 1mg/ml xilencianol;
marker molecular de 100pb.
Viteza migrării ADN în gelul de agaroză depinde de:
mărimea moleculară a fragmentelor de ADN: ADN dublu-catenar migrează în gelul de agaroză invers proporțional cu log10 al numărului perechilor de baze (Higgins, 1994). Astfel moleculele mai mari vor migra mai puțin, în timp ce cele mai mici vor migra mai mult.
concentrația gelului de agaroză: există o relație liniară între logaritmul mobilității electroforetice a ADN(μ) și concentrația gelului (t) descrisă prin ecuația:
log(μ) = log μ0 – Kt x t,
unde μ0 este mobilitatea electroforetică liberă a ADN iar Kt este coeficientul de întârziere, o constantă legată de proprietățile gelului și mărimea și forma moleculelor ce migrează.
conformația ADN: ADN circular superspiralizat (forma I), ADN circular întrerupt (forma II) și ADN liniar (forma III) migrează în rate diferite în gelul de agaroză (Thorne, 1966). Mobilitatea relativă a celor 3 forme de ADN depinde atât de concentrația și tipul de agaroză utilizată în prepararea gelului cât și de voltajul curentului aplicat și puterea ionică a tamponului.
prezența bromurii de etidiu: intercalarea bromurii de etidiu poate cauza o scădere a încărcării negative a ADN dublu catenar și o creștere a durității și lungimii lui (Sharp et al, 1973).
Migrarea ampliconilor de interes în gel de agaroză a fost realizată diferențiat în funcție de lungimea acestora și de concentrația gelului electroforetic.
Astfel ampliconii genei citocrom oxidazei I au fost migrați în gel de concentrație 1%, timp de o oră, în câmp electric de 70V, pe când produșii amplificați pe microsateliți au fost migrați în gel electroforetic de agaroză cu o concentrație de 2%, timp de o oră și jumătate, în câmp electric de 60V, cuva de electroforeză fiind așezată pe gheață pe durata migrării, pentru a se evita pierderea rezoluției gelurilor, ca urmare a încălzirii soluției tampon (TBE 1X). După trecerea timpului de migrare gelurile au fost vizualizate în lumină UV, utilizând UVP TFM-20 High Performance U.V. Transilluminator (UVP, LLC, Canada).
Purificarea produșilor PCR
Produșii PCR obținuți au fost purificați în coloane utilizându-se kitul și protocolul Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, Wi, USA).
În funcție de rezultatul obținut după vizualizarea gelului, ampliconii de interes au fost purificați direct în cazul obținerii produșilor specifici sau decupați și purificați din gel, în cazul apariției amplificărilor nespecifice. Pentru purificarea din gel a ampliconilor, se adaugă o cantitate de Membrane Binding Solution, egală cu greutatea gelului, după care se incubează amestecul la o temperatură de 50-65˚C până la dizolvarea totală a gelului.
Protocolul de purificare conține 4 etape:
1. Procesarea produșilor PCR – se realizează prin adăugarea unui volum de Membrane Binding Solution egal cu cel existent în tuburi.
2. Legarea ADN:
se inserează minicoloanele în tuburile colectoare;
se transferă produșii PCR preparați în ansamblurile minicoloană – tub de colectare și se incubează la temperatura camerei, timp de un minut;
se centrifughează minicoloanele la 16000xg timp de un minut, după care se înlătură lichidul din tuburile colectoare.
3. Etapa de spălare:
se adaugă 700µl Membrane Wash Solution (preparată în prealabil prin adăugare de etanol), se centrifughează la 16000xg timp de un minut, după care se înlătură lichidul filtrat și se reintroduc minicoloanele în tuburile colectoare;
se repetă primul pas al acestei etape cu un volum de 500µl Membrane Wash Solution și se centrifughează la 16000xg timp de 5 minute;
se golesc în cele din urmă tuburile colectoare și se recentrifughează ansamblul tub colector – minicoloană timp de un minut, de această dată cu minicentrifuga deschisă, fără capacul de fixare a tuburilor, pentru a permite evaporarea reziduurilor de etanol.
4. Eluția:
se transferă minicoloanele în tuburi de microcentrifugă de 1,5ml;
se adaugă în minicoloane câte 50µl apă miliQ (Nucealse-Free Water), se incubează la temperatura camerei timp de un minut, după care se centrifughează la viteza de 16000xg timp de un minut;
se înlătură minicoloanele și se depozitează soluția de ADN la 4oC sau la -20oC.
În acest moment probele sunt pregătite pentru cuantificare și reacția de secvențiere.
Reacția de secvențiere
Această etapă are ca scop identificarea ordinii bazelor azotate, (adenina, guanina, citozina și timina), din cadrul genelor de interes, ordine care influențează dezvoltarea și funcționarea organismelor vii. Rezultatul secvențierii îl constituie obținerea unor fragmente de ADN, aparținând catenelor directă și reversă, care trebuie să se suprapună, putând fi ulterior alăturate într-o secvență unică (Lewin, 2004).
Secvențierea ADN prin metoda finalizării lanțului (Chain Termination) a fost dezvoltată de Sanger, în 1975. Aceasta se realizează in vitro utilizând un template ADN purificat în prealabil, în prezența polimerazei, a primerilor oligonucleotidici, a unor amestecuri de deoxinucleotid trifosfați (dNTP) și a unor dideoxinucleotid trifosfați marcați fluorescent (ddNTP). Polimereaza sintetizează lanțul polinucleotidic adiționând dNTP, până în momentul încorporării unui ddNTP, moment în care elongarea lanțului se oprește. Această oprire, duce la formarea unui mix de lanțuri ADN cu lungimi diferite, care pot fi separate prin electroforeză capilară. Kitul de secvențiere GenomeLab Dye Terminator Cycle Sequencing (Beckman Coulter) conține ddNTP marcate fluorescent, care sunt încorporate în poziția finală a lanțului polinucleotidic de ADN sintetizat, fiecare ddNTP (A, C, G, T) având o fluorescență diferită. Catenele de ADN având încorporate nucleotidele fluorescente sunt apoi separate, detectate și analizate, obținându-se la final secvența nucleotidică a fragmentului de interes.
Reacția de secvențiere s-a realizat pentru a doua jumătate a genei citocrom oxidaza I în tuburi tip Eppendorf de 0,2ml. Mediul de reacție s-a realizat pe baza reactivilor furnizați de kitul GenomeLab™ DTCS Quick Start (Beckman Coulter International). Volumul total al reacției de secvențiere este de 20µl/probă. Cantitatea soluției de ADN care trebuie adăugată în fiecare tub, se calculează în funcție de concentrația acestuia și de lungimea segmentului care urmează a fi analizat (Tabel 3).
Tabel 3 . Compoziția mediului pentru reacția de secvențiere
Etapele reacției PCR de secvențiere sunt furnizate de Genome LabTM Dye Terminator Cycle Secuencing (Beckman Coulter International SA, Nyon, Switzerland) fiind prezentate în Figura 27.
Figura 27 Etapele programului PCR a reacției de secvențiere
Secvențierea genei citocrom oxidaza c subunitatea 1 (COXI) s-a realizat în condițiile prezentate anterior folosind perechea de primeri: FISH-F1, FISH-R1.
Purificarea produșilor de secvențiere
După amplificarea ADN, are loc purificarea pe placa magnetică utilizând kitul Agencourt CleanSEQ (Beckman Coulter International SA, Nyon, Switzerland):
Materiale necesare:
SuperMagnet Plate;
Soluție isopropanol 73%;
Soluție Stop diluată (formată din 15.5 µl H2O; 6.2 µl NaAc 3 M pH=5.2; 6.2 µl Na2EDTA 100 mM pH=8.00; 3.1 µl Glycogen 20mg/ml).
Mod de lucru:
Se adaugă 0.55 µl Soluție Stop diluată, pentru fiecare µl din volumul reacției de secvențiere;
Se agită Agencourt CleanSEQ până la resuspendarea completă a rășinii;
Se adaugă câte 1µl Agencourt CleanSEQ pentru fiecare µl din volumul reacției de secvențiere (fară a se ține cont de volumul de Soluție Stop adăugat) în fiecare godeu al plăcii de secvențiere;
Se adaugă 110µl isopropanol 73% în ficare probă, după care se pipetează repetat până la omogenizare sau se vortexează;
Se incubează la temperatura camerei timp de minim 10 minute pentru legarea ampliconilor de rășină;
Placa se mută apoi pe SuperMagnet Plate timp de 3 – 5 minute sau până ce soluția devine curată;
Se înlătură supernatantul și se pipetează câte 200µl isopropanol 73% în fiecare godeu, urmând apoi o incubare de 3 minute;
Se înlătură tot isopropanolul și se repetă pasul anterior încă o dată, la ultima înlăturare a isopropanolului se încearcă să se scoată tot lichidul;
Se lasă la uscat pentru 10 – 20 de minute (un timp mai îndelungat de uscare va scădea considerabil semnalul secvenței);
Cu placa înlăturată de pe SuperMagnet Plate, se adaugă 40µl Sample Loading Solution în fiecare godeu, după care se pipetează ușor în mod repetat până la omogenizarea soluției;
Ulterior, placa se așează pe SuperMagnet Plate timp de 3 – 5 minute sau până când soluția devine limpede. Se transferă apoi 35µl soluție într-o nouă placă, se îndepărtează eventualele bule de aer formate, și se adaugă câte o picătură de ulei mineral provenit din kit în fiecare probă.
După finalizarea procesului de purificare, placa se încarcă în analizorul genetic (Beckman CEQ 8000, Beckman Coulter) și se rulează programul de secvențiere prezentat în Figura 28.
Figura 28 Parametrii programului de secvențiere
Prelucrarea primară a secvențelor sub formă de fluorograme (Figura 29) și corectarea, au fost realizate utilizând programul CEQ8000 furnizat de Beckman Coulter, iar datele au fost exportate în format .fasta pentru aliniere. Unirea secvențelor directe și reverse pentru fiecare individ, a fost efectuată utilizând programul MEGA 6 (Tamura et al., 2013) prin aliniere cu secvențele obținute de pe cei doi primeri și tăierea celor două catene, urmată de unirea într-o secvență unică.
Figura 29 Flourograma parțială a secvenței aparținând genei citocrom oxidaza I, la individul Sr06P
Alinierea tuturor secvențelor unei gene, provenite de la indivizi diferiți, a fost efectuată prin metodele Clustal W (Thompson et al., 1994) și Clustal V (Higgins și Sharp, 1988; Higgins, 1994; Wheeler, 2000) utilizând programul MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
Ulterior, alinierea secvențelor a fost utilizată pentru analiza populațională și filogeografică a indivizilor studiați, respectând etapele prezentate în Figura 30.
Figura 30 Etapele de analiză a secvențelor obținute
Analiza populațională
Pentru analiza populațională și interspecifică pe baza secvențelor obținute, s-a utilizat programul Arlequin 3.5 (Excoffier et al., 2010) și Structure v.2.3.4 (Pritchard et al., 2000; Falush et al., 2003, 2007; Hubisz et al., 2009).
Diversitatea genetică, interspecifică cât și intraspecifică a fost cuantificată prin calcularea următorilor indici:
Diversitatea haplotipurilor
Diversitatea haplotipurilor poate fi cuantificată prin calcularea:
frecvenței haplotipurilor într-o populație, reprezentând procentul de distribuție a unei forme genetice (a unui haplotip) într-o populație;
diversitatea genetică a haplotipurilor (h) ce descrie numărul și frecvențele diferitelor haplotipuri mitocondriale, reprezentând de fapt, echivalentul heterozigoției pentru loci haploizi.
Diversitatea nucleotidică
Diversitatea nucleotidică (π) reprezintă cuantificarea numărului de diferențe nucleotidice între 2 secvențe, exprimată prin media divergenței dintre secvențele analizate.
Mecanismele mutațiilor genice
Deleția – Pierderea uneia sau mai multor perechi de nucleotide;
Adiția – inserția uneia sau mai multor perechi de nucleotide;
Substituția – înlocuirea uneia sau mai multor perechi de nucleotide;
Inversia – unui fragment de ADN, cuprinzând cel puțin două perechi de nucleotide
Determină sinteza unei biomolecule modificate
Erori în procesul de replicare
Tranziții – înlocuirea unei baze purinice sau pirimidinice cu o altă bază de același tip: A G, T C
Transversii – înlocuirea unei baze purinice cu una pirimidinică și invers:
A – T, A – C, G – T, G – C (Figura 31)
Figura 31 Erori în procesul de replicare
În funcție de schimbările produse la sfârșitul procesului de translație, mutațiile pot fi:
nonsens (mutații terminatoare de catenă): – nu determină schimbări ale succesiunii aminoacizilor în molecula proteică, ci doar modificări ale numărului aminoacizilor.
mutații cu sens greșit (mutații directe sau de progresie): determină înlocuirea unui codon funcțional, cu un alt codon funcțional, rezultând înlocuirea unui aminoacid cu un altul.
mutații cu același sens (mutații silențioase sau mutații neutre): – deși determină schimbarea unei nucleotide, nu modifică aminoacidul din lanțul polipeptidic și deci, nu va fi afectată structura proteinei. Nemodificându-se structura proteinei, nu se va înregistra nici o modificare la nivel fenotipic.
mutații de reversie (mutații înapoi) – duc la reapariția formei sălbatice sau a unei stări alelice anterioare.
AMOVA (Analysis of Molecular Variance) (Excoffier et al., 1992)
AMOVA este utilizată pentru investigarea diversității unei specii sau a unei populații structurată în subpopulații sau subspecii analizându-se varianța frecvenței genei, luându-se în calcul și numărul de mutații dintre haplotipurile componente din acea populație.
Expansiunea demografică și spațială
Expansiunea demografică și spațială a unei populații poate fi calculată prin Mismatch distribution, reprezentând distribuția numărului de diferențe observate între perechile de haplotipuri. Această distribuție este de obicei multimodală în probe prelevate din populații aflate la echilibru demografic și unimodală la populațiile care au trecut printr-o expansiune demografică recentă (Rogers și Harpending, 1992; Slatkin și Hudson, 1991) sau o expansiune spațială cu un nivel ridicat de migrație între subpopulații vecine (Ray et al. 2003, Excoffier, 2004).
Analiza filogenetică
Analiza filogenetică și filogeografică a secvențelor obținute s-a realizat urmând doi pași principali:
Construcția arborilor filogenetici;
Reconstrucția filogeografică.
Reconstrucția relațiilor filogenetice s-a realizat prin construcția arborilor filogenetici utilizând trei metode diferite.
Construcția arborilor filogenetici prin metoda UPGMA
Metoda UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic Averages) reprezintă o metodă de construcție bazată pe distanță, atribuită autorilor Sokal și Michener (1958), utilizată atunci când rata de evoluție a genei este relativ constantă pe ramurile arborelui. Arborii de tip UPGMA sunt utilizați în studiile recente ca arbore de plecare (startingTree) în metoda Bayesiană.
Construcția arborilor filogenetici prin metoda Maximum Likelihood (ML)
Analizele filogenetice tind să deducă istoria evolutivă (sau un set de istorii probabile) care corespunde cel mai bine setului de date observat (în cazul de față este vorba de secvențe nucleotidice sau de aminoacizi dar poate fi vorba și de caractere morfologice, frecvente ale genelor, situsuri de restricție etc. Necunoscutele problemei sunt ordinea de ramificare și lungimea ramurilor a filogeniei. Pentru a aplica metodele ML este nevoie de un model concret de substituție ce descrie transformarea unei secvențe în alta.
Metodele ML de reconstrucție filogenetică evaluează ipoteza despre istoria evolutivă în termeni probabilistici (care este probabilitatea că o anumită istorie evolutivă – topologie și un anumit model de substituție vor da naștere datelor observate). O istorie evolutivă ce are o probabilitate mai mare de a da naștere datelor observate are prioritate față de una cu o probabilitate mai mică. Printre avantajele acestei metode se numără varianța mică și posibilitatea utilizării unui număr minim de parametri. Chiar pentru un număr mic de nucleotide, acest tip de metode depășesc de multe ori metodele bazate pe distanțe și cele MP (Gorgan, 2008).
Principiul de bază al metodei implică calcularea verosimilitudinii unei filogenii. Deoarece majoritatea modelelor de substituție folosite sunt reversibile în timp, verosimilitudinea unei filogenii este independentă de localizarea rădăcinii. Presupunând că fiecare situs evoluează independent putem calcula verosimilitudinea fiecărui situs separat și să combinăm aceste valori pentru obținerea unei valori finale. Metode ML sunt aplicabile atunci când secvențele de ADN sunt destul de apropiate între ele din punct de vedere filogenetic.
Construcția arborilor filogenetici prin metoda Bayesiană
Inferența Bayesiană (Bayesian inference, BI ) utilizează tehnici de simulare precum lanțuri Markov de tip Monte Carlo pentru a găsi arborele cu probabilitatea posterioară maximă (Posterior Probability ,PP). PP poate fi interpretată ca probabilitatea ca arborele să fie corect (Huelsenbeck et al., 2001), contrar valorilor probabile obținute prin analiza ML, după ecuația de mai jos:
Unde:
– – probabilitatea posterioară (PP)
– – probabilitatea prealabilă (Pr)
– – Likelihood
– – normalizare constantă
Probabilitățile posterioare sunt obținute prin combinarea probabilității prealabile (prior probability, Pr) a unei filogenii (Pr[arbore]), cu probabilitatea condiționării aliniamentului de secvențe la topologia unui arbore (Pr[Aliniament|Arbore]) (Huelsenbeck et al., 2001) (Figura 32). Probabilitatea prealabilă, se presupune de obicei a fi egală pentru toți arborii, verosimilitatea acestuia, și astfel, probabilitatea de a observa aliniamentul secvențelor, necesită ridicarea unor ipoteze specifice, cum ar fi alegerea unui model evolutiv de substituție evolutiv adecvat.
Figura 32 Principiul de estimare a PP în analiza BI
Determinarea modelului optim de substituție
Modelele de substituție sunt necesare pentru a ține cont de procesul probabil ca anumite situsuri nucleotide să sufere multiple mutații (Swofford et al., 1996). În total, există patru parametri care pot fi luați în considerare în modele de substituție nucleotidice: 1) rata de substituție dintre nucleotide; 2) frecvența celor patru nucleotide; 3) proporția de situsuri invariabile, și 4) heterogenitatea ratelor de substituție între site-uri (Posada și Crandall, 2001).
Determinarea modelului optim de substituție pentru setul de date analizat s-a realizat utilizând programul JModelTest v2.1 (Darriba et al., 2012), utilizând trei scheme de substituție (+F; +I; +G, 4 Categorii) și 11 topologii diferite, cel mai bun model fiind ales pe baza algoritmului Akaike Information Criterion (AIC; Akaike, 1974).
Calibrarea Arborilor filogenetici
Calibrarea arborilor filogenetici se poate realiza prin trei metode:
Rata medie de mutație: cunoașterea ratei de mutație poate servi ca punct de calibrare a unui arbore filogenetic, plecând de la premisa că aceasta nu prezintă un interval larg de variație pe structura arborelui, caz în care este utilizat un ceas molecular strict pentru toate ramurile arborelui.
Fosile: acestea de obicei ne oferă timpul minim al unui nod, dar nu oferă nici un indiciu despre vârsta maximă a nodului (Figura 33), acesta fiind calculată pe baza ratei de mutații având ca punct de plecare calibrarea fosilă.
Figura 33 Exemplu de calibrare fosilă în care cercul albastru reprezentând originea cladei, cea mai veche fosilă este reprezentată de cercul roșu, iar cercurile gri reprezentând fosile recente, porțiune in galben reprezintă durata de la originea cladei până la prima aparitie a fosilei din acea clada
Evenimente geologice: acestea pot oferi vârsta maximă a unui nod. De exemplu, un proces de speciație a avut loc pe o insulă oceanică, constrânge vârsta speciației să fie egală s-au mai mică cu vârsta insulei (Figura 34).
Figura 34 Exemplu de calibrarea a arborilor filogenetici utilizând evenimente geologice, în care vârsta maximă a fiecărei clade poate fi egală cu vârsta insulei
Analiza rezultatelor obținute
Pentru fiecare element calculat într-o analiza bayesiană, sunt o serie de parametri care descriu validitatea acestora, oferind indicii privind intervalul de valori al PP unui element, aceștia fiind:
Media: media valorilor unui element estimate de-a lungul lanțului MCMC (excluzând burn-in);
Stdev: deviația standard a mediei, în calcularea acestui parametru intră și mărimea efectivă a valorilor (ESS, effective sample size), astfel încât o valoare mică a ESS va determina o deviație standard mare;
Mediana: mediana valorilor unui element estimate de-a lungul lanțului MCMC (excluzând burn-in);
95% HPD Lower: limita inferioară a celei mai mari densități posterioare (HPD, highest posterior density) a intervalului. HPD reprezintă un interval credibil ce conține 95% din valorile calculate (Figura 35);
95% HPD Upper: limita superioară a celei mai mari densități posterioare (HPD) a intervalului. HPD reprezintă un interval credibil ce conține 95% din valorile calculate;
Timpul de autocorelare: reprezintă numărul de intinerații din lanțul MCMC în care două valori trebuie să fie una față de cealaltă pentru ca acestea să fie necorelate. Timpul de autocorelare (ACT, Auto-Correlation Time) este estimat din intervalul de valori obținute excluzând valorile burn-in;
Mărimea efectivă a valorilor: (ESS, Effective Sample Size) reprezintă un număr de valori independente echivalent cu intervalul de valori estimat. Valoarea acestui parametru este dată de raportul dintre lungimea lanțului MCMC și ACT. Pentru ca o analiză prin metoda Bayesiană să fie validă ESS trebuie să ia valori mai mari de 200.
Figura 35 Analiza datelor obținute în urma analizei filogenetice prin metoda Bayesiană în Tacer v1.5, în panoul din stânga sunt prezentate valorile medii și ESS pentru fiecare parametru investigat, iar in panoul din dreapta sunt prezentați principalii parametri de analiză a unui element și reprezentarea grafică a acestuia, porțiunea centrală a graficului colorată în albastru reprezentând HPD.
Sumarizarea arborilor obținuți
În urma unei analize filogenetice prin metoda Bayesiană se produce câte un arbore filogenetic la fiecare intinerație, fiind necesară apoi sumarizarea acestora la un singur arbore cu credibilitatea cladelor maximă (MCC, Maximum clade credibility tree), (Figura 36). Arborele MCC include valorile probabilității posterioare (PP) a nodurilor, estimările posterioare și limitele HPD a vârstei nodurilor și în cazul utilizării unui ceas molecular de tip relaxat-necorelat, rata acestuia.
Figura 36 Sumarizarea arborilor Bayesiani utilizând TreeAnnotator v1.8.0
Reconstrucția arborilor filogenetici prin metoda Bayesiană pentru setul de date analizat s-a realizat în soft-ul BEAST v1.7.5 (Bayesian Evolutionary Analysis Sampling Trees; Drummond et al., 2012), fișierele de input fiind setate în BEAUti (Bayesian Evolutionary Analysis Utility). Parametrii utilizații pentru setarea fișierului de input fiind diferiți în funcție de setul de secvențe analizat și de tipul de analiză investigat.
Determinarea validității datelor obținute s-a efectuat prin estimarea convergenței distribuțiilor posterioare (posterior distributions) în programul Tracer v1.5 (Rambaut et al., 2007). Vizualizarea și editarea grafică a arborilor filogenetici obținuți s-a realizat în FigTree v1.4.0 (Rambaut, 2007, 2009).
Reconstrucția filogeografică s-a realizat prin corelarea arborilor filogenetici cu timpul de divergentă a speciilor și cu evoluția condițiilor climatice.
CAPITOLUL 3. Rezultate și discuții
Cuantificare ADN
În urma extracției ADN prin cele două protocoale (DNA IQ-System și PCI) s-au obținut următoarele cantități de ADN (Tabel 4).
Tabel 4 Concentrații ADN
Electroforeza ampliconilor
Figura 37 Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a COI la Scardinius raovitzai
(volum probă 10µl, 70V), C-=control negativ, M100pb=marker molecular de 100pb)
În Figura 37 se observă faptul că s-au obținut cantități mari de ADN (aproximativ 700 pb) ce pot fi utilizate pentru reacția de secvențiere.
În urma analizei unui set de date alcătuit din 21 de secvențe ale genei COXI (Anexa 1) s-au identificat un număr de 7 haplotipuri la specia S. racovitzai, având o diversitate moleculară (h) de 48,05% [+/- 13,05%].
Diversitatea nucleotidică (π) (exprimată prin media divergenței dintre secvențele analizate) are valoarea de 0,005716, distanța medie dintre haplotipuri fiind doar de 3.5 nucleotide (Figura 38).
Figura 38 Matricea distanței dintre haplotipuri pentru specia S. racovitzai realizată prin analiza genei COXI
Datele din figura 38 arată că intensitatea culorii graficului este direct proporțională cu diferențele nucleotidice dintre secvențele de ADN. Astfel, cele mai multe diferențe nucleotidice au fost înregistrate între haplotipul 5 și haplotipul 2 (22) și reprezintă cel mai mare număr de diferențe nucleotidice calculat la specia Scardinius racovitzai.
Frecvența relativă a haplotipurilor la această specie a luat valori cuprinse între 4,55% și 72,7% (Figura 39, Figura 40), situsurile polimorfice identificate fiind în număr de 30, iar frecvența tranzițiilor (Ti/Tv) fiind de doar 0,35.
Figura 39 Frecvența relativă a haplotipurilor pentru specia S. racovitzai realizată prin analiza genei COXI
Figura 40 Frecvența relativă a haplotipurilor pentru specia S. racovitzai realizată prin analiza genei COXI
Cea mai mare frecvență a fost atinsă de haplotipul 1 (72,7%) fiind apoi urmat de celelalte haplotipuri (4,55%).
Heterozigoția așteptată (Expected heterozygosity) pentru această specie este relativ scăzută, având o valoare medie de 11,77 % (Figura 41), ceea ce indică o capacitate redusă de diversificare, corelată cu creșterea fenomenului de consangvinizare.
Figura 41 Heterozigoția așteptată pentru specia S. racovitzai realizată prin analiza genei COXI
Figura 42 Număr de alele pentru specia S. racovitzai
Figura 43 Arbore filogenetic ML al speciei Scardinius racovitzai (Outgroup = Carassius carassius)
Istoria evolutivă a specie Scardinius racovitzai a fost dedusă prin utilizarea metodei Maximum Likelihood, metodă bazată pe modelul Tamura – Nei. Astfel, s-a obținut arborele cu cea mai mare probabilitate (-14878.2797) prin aplicarea algoritmilor Neighbour-Join și BioNJ unei matrici de perechi de distanțe estimate folosind metoda Maximum Composite Likelihood (MCL) și apoi selectarea topologiei cu o valoare superioară probabilității logaritmice. Arborele prezintă o scală egală cu lungimea ramurii ce a fost măsurată în funcție de numărul de substituții pe situs (Figura 43).
Toate pozițiile care au prezentat lacune și date lipsă au fost eliminate. În final, au fost 651 de poziții. Analizele evolutive au fost efectuate în Mega 7 (Tamura, 1993).
CONCLUZII
Conform Listei Roșii a speciilor amenințate IUCN, specia Scardinius racovitzai, are statutul de specie critic amenințată (Critically Endangered B1ab(ii,iii)+2ab(ii,iii))
Pentru gena mitocondrială analizată COXI s-au obținut fragmente având lungimi de 700pb amplificate prin PCR și validate prin electroforeză în gel de agaroză,
În urma analizei și alinierii secvențelor obținute de la cei 21 de indivizi analizați, au fost identificate 7 hapotipuri aparținând speciei Scardinius racovitzai.
Din analiza secvențelor COXI, s-a constatat că diversitatea moleculară (h) are valori de 48,05 % [+/- 13,05%], ceea ce indică o variabilitate intraspecifică scăzută, confirmată de arealul redus și capacitatea scăzută de expansiune demografică.
Heterozigoția așteptată (Expected heterozygosity) pentru această specie este relativ scăzută, având o valoare medie de 11,77 %, ceea ce indică o capacitate redusă de diversificare, corelată cu creșterea fenomenului de consangvinizare.
Analiza filogenetică confirmă datele statistice și indică o similaritate accentuată între indivizii speciei Scardinius racovitzai.
ANEXA 1
Alinierea secvențelor citocrom oxidazei subunitatea I, pentru indivizii speciei Scardinius racovitzai (MEGA 7)
BIBLIOGRAFIE
AKAIKE H., 1974 – A new look at the statistical model identification, IEEE Transactions on Automatic Control, Vol. 19 (6): 716–723.
AUSUBEL F. M., BRENT R., KINGSTON R. E., MOORE D. D., SEIDMAN J. G., SMITH J. A., STRUHL K., 1995 – Current protocols in molecular biology, vol. 1, cap. 2 – Preparation and analysis of DNA. Phenol extraction and ethanol precipitation of DNA, Ed by John Wiley & Sons, Inc., p. 2.1.1. – 2.1.3.
BĂNĂRESCU P., 1964 – Fauna Republicii Populare Romane vol XIII-Pisces – Osteichtyes (Pesti ganoizi si ososi), Editura Academiei Republicii Populare Romania, București, p. 962-980.
BERTORELLE G., BRUFORD W. M, HAUFFER H, RIZZOLI A., VERNESI C., 2009 – Population Genetics for Animal Conservation, Cambridge University Press,p. 32-34
BIANCO P. G., 1994 – L’ittiofauna continentale dell’Appennino umbro-marchigano, barrier semipermeabile allo scambio di component primarie tra gli opposti versanti dell’Italia central, Biogeographia, 17: 159-170
BIANCO P. G., APREA G., BALLETO E., FULGIONE D., 2004- The karyology of the cyprinid genera Scardinius and Rutilus in southern Europe ,Ichtyological Research, 51, 274
BRIGGS J. C, 1995 – Global Biogeography, Elsevier, Amsterdam, p. 135-140.
BRUNO S., 1987 – Pesci d’Italia e crostacei d’aqua dolce, Gunti, Firenze, p.87-90
CĂRĂUȘU S., 1952 – Tratat de ihtiologie, Ed Academiei Republicii Populare Romane, București, p 171-176.
CARVALHO G. R., 1998 – Advances in Molecular Ecology.Nato Series A. Life Science, Ios Press, p. 1-16.
CRĂCIUN N., IONAȘCU A., 1997 – Ethological researches on the endemic thermal rudd ( Scardinius racovitzai G. Muller 1958) from the thermal lake of Petea stream, in english, Annals of the University of Bucharest, XLVI, p. 54-55.
CRĂCIUN, N., 1997 – Ethological researches on Scardinius racovitzai from the thermal lake 1 Mai-Oradea. Analele Universitatii Bucuresti, p. 31-40.
DARRIBA D., TABOADA G. L., DOALLO R., POSADA D., 2012 -jModelTest 2: more models, new heuristics and parallel computing, Nat Methods., vol. 9, p.772.
DRUMMOND A.J, SUCHARD M.A., XIE D., RAMBAUT A., 2012 – Bayesian phylogenetics with BEAUti and the BEAST 1.7, Mol. Biol. Evol., Vol.29 , p. 1969-1973.
EXCOFFIER L., 2004 – Patterns of DNA sequence diversity and genetic structure after a range expansion: lessons from the infinite-island model. Mol Ecol 13(4): 853-864.
EXCOFFIER L., LISCHER HEL., 2010 – Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows, Mol. Ecol. Res., 10(3), 564-567.
EXCOFFIER L., SMOUSE P. & QUATTRO JM., 1992. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics, 131 (2), 479–91.
FALUSH D., STEPHENS M., PRITCHARD J. K., 2007- Inference of population structure using multilocus genotype data: dominant markers and null alleles. Molecular Ecology Notes, 7, 574-578.
FALUSH D., WIRTH T., LINZ B., PRITCHARD J. K., STEPHENS M., 2003 – Traces of human migrations in Helicobacter pylori populations. Science 299: 1582–1585.
GARCÍA-BERTHOU E., MORENO-AMICH R., 2000 – Rudd (Scardinius erythrophthalmus) introduced to the Iberian peninsula : feeding ecology in Lake Banyoles, Hydrobiologia, Vol. 436, Nr.1, p. 159.
GHEORGHIȚĂ G., 2009 – Despre biogeneza și bioevoluție. Editura”Alma Mater’, Bacău, p. 140.
GORGAN D. L., 2007 – Filogenie Moleculară în cadrul genurilor Cyprinus și Carassius, Editura Universității „ Al. I. Cuza” Iași, p. 22-25.
GORGAN D. L., 2008. Introducere în studiul filogeniei și filogeografiei moleculare. Bioflux, Cluj-Napoca, p.76-81
HIGGINS D. G., 1994 – Clustal V: Multiple alignment of DNA and protein sequences. În Methods Mol. Biol., 25, 307 – 318.
HIGGINS D. G., SHARP P.M., (1989) – Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. CABIOS, 5, 2, 151-153.
HILLIS D. M., MORITZ C., MABLE M., BARBARA K., 1996 – Molecular systematics – second edition, Sinauer Associates, Inc, 472-512.
Hoffer R., 1987 – The adaptation of digestive enzymes to temperature, season and diet in roach, Rutilus rutilus and rudd Scardinius erythrophthalmus; Proteases, J. Fish Bio, 15, 373-379.
HOWES G. J. 1991 – Systematics and biogeography: an overview In Cyprinid fishes: Systematics, biology and exploitation, Edited by: Winfield IJ, Nelson JE. London: Chapman and Hall, p. 1-33.
HUELSENBECK J.P., RONQUIST .F, NIELSEN R., BOLLBACK JP., 2001- Bayesian inference of phylogeny and its impact on evolutionary biology, Science, 294(5550) :2310–2314.
JOHANSSON L., 1987 – Experimental evidence for interactive habitat segregation between roach (Rutilus rutilus) and rudd (Scardinius erythrophthalmus) in a shallow eutrophic lake, Oecologia, Vol. 73, Nr.1, p. 21.
KLEPPE K., OHTSUKA F., KLEPPE R., MOLINEUX I., KHORANA H. G., 1971 – Journal of Molecular Biology, Studies on Polynucleotides, 56, 341-361.
KOTTELAT M., BIANCO P. G., 2005 – On the valid name of the alborella, Alburnus arborella (Teleostei: Cyprinidae). Ichthyological Exploration of Freshwaters, 16 (2), 179-182.
KOTTELAT M., FREYHOF J., 1972 – Handbook of European freshwater fishes. Publications Kottelat, Cornol and Freyhof, Berlin, 646 p.
KUMAR S., STECHER G., AND TAMURA K., 2016 – MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets.Molecular Biology and Evolution 33:1870-1874
LEWIN B., 2004. Genes VIII. Ed. Pearson Prentice Hall, 426-452.
MINCIU D. R., BÂRA I. I., 1985 – Studiul complementului cromosomial la Pseudorasbora parva (Schlegel) (Pisces, Cyprinidae), Sem. Științ. Progrese în ameliorarea și tehnologia creșterii animalelor în sistem intensiv, Timișoara, p. 93
MULLER G., 1958 – Scardinius racovitzai-nova species (Pisces, Cyprinidae), eine relokte Rotfeder aus West-Rumänien. Senckenbergiana biologica 39: 165-168.
MULLINS K. B., 1990 – Specktrum Wiss, Eine Nachtfahrt und die Polymerase-Kettenreaktion, 6, 60-67.
NELSON J.S., 2006- Fishes of the World. 4th ed. Hoboken (New Jersey, USA): John Wiley & Sons, p. 194-196
NGUYEN T. T. T, HURWOOD D., MATHER P, NA-NAKORN N., KAMONRAT W., BARTLE D., 2006. Manual on application of molecular tools in aquaculture and inland fisheries management. Part I: conceptual basis of population genetic approaches, Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific, Bangkok, 29-35.
OBRHELOVA N. P., 1971 – Vergleinchende osteology der gattung Leuciscus (Pisces) aus tertiaren schichten der nordlichen und westlichen CSSR, Paleontolog, Abhandl. Nr 4, p. 549-660
OBRHELOVA, N. P., 1971 Vergleinchende osteologie der gattung Leuciscus (Pisces) aus tertiaren schichten der nordlichen und westlichen CSSR, Paleontolog. Abhandl. Nr. 4, p. 549-660.
POP N., 2016- Exploatarea resurselor minerale vs protectia mediului. Studiu de caz: Rezervația Naturală “Pârâul Pețea”, Presa Universitară Clujeană, Cluj-Napoca, p.17-28.
POSADA D., CRANDALL K. A., 2001- Selecting models of nucleotide substitution: an application to human immunodeficiency virus 1 (HIV-1). Mol Biol Evol 18(6): 897-906.
POSADA D., CRANDALL K. A., 2001. Evaluation of methods for detecting recombination from DNA sequences: computer simulations. Proc Natl Acad Sci U S A 98(24): 13757-13762.
POSADA D., CRANDALL K., 1998 – Modeltest: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics 14.
PRIMACK R. B., 2002 – Essentials of conservation Biology. 3rd edn Sunderland, Editura. SinauerAssociates, 1-22.
PRITCHARD J. K., STEPHENS M., DONNELLY P., 2000 – Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics, 155(2):945–959.
PÜHLER A., 1993. Genetic engineering of microorganisms. VCH, Weinheim, Germany, p. 178.
RAMBAUT A., 2007- FigTree (Version v1.4.0): http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree.
RAMBAUT A., 2009 – FigTree: http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree.
RAMBAUT A., DRUMMOND A. J., 2007 – Tracer (Version v1.5): http://beast.bio.ed.ac.uk/Tracer.
RAY N., CURRAT M., EXCOFFIER L., 2003. Intra-deme molecular diversity in spatially expanding populations. Mol Biol Evol 20(1): 76-86.
ROBERT F. SCHLEIF, 1993 – Genetics and Molecular Biology- ED. Johns Hopkins University Press, p. 286.
ROGERS A. R, HARPENDING H., 1992 – Population growth makes waves in the distribution of pairwise genetic differences, Mol Biol Evol 9(3):552-569.
SAIKI R. K., SCHARF S., FALOONA F., MULLIS K.B., HORN G.T., ERLICH HA., ARNHEIM N., 1985 – Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350-1356.
SLATKIN M., HUDSON R. R, 1991- Pairwise comparisons of mitochondrial DNA sequences in stable and exponentially growing populations, Genetics, 129(2): 555-562.
SMITH T. B., WAYNE R. K., 1996 – Molecular Genetic Approaches in Conservation. Oxford University Press, New York, p. 49.
SOBER. E., 1988 – Recontructing the Past-Parsimony. Evolution and Inference, Editura. Mit Press, p. 1-28.
SWOFFORD D. L., THORNE J. L., FELSENSTEIN J., & WIEGMANN B. M., 1996. The topology-dependent permutation test for monophyly does not test for monophyly. Syst Biol, 575-579.
SWOFFORD D., 1996 – Phylogenetic analysis using parsimony (and other methods), version 4.0. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, p. 218.
TAMURA K. AND NEI M. , 1993 – Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees, Molecular Biology and Evolution 10:512-526
TAMURA K., STECHER G., PETERSON D., FILIPSKI A., KUMAR S., 2013 – Mega6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30:2725–2729.
TELECEAN I. C., CUPȘA D., 2013 – The drastic deline of fish fauna in the thermal lake of „Baile 1 Mai”( Baile Episcopale, Bihor Country, Romania), Pisces Hungarici, 7:141-142
THOMPSON J. D., HIGGINS D. G. & GIBSON T. J., 1994 – CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res, 22(22), 4673-4680.
WARD R. D., ZEMLAK T. S., INNES B. H., LAST P. R., 2005- DNA barcoding Australia’s fish species. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 360, 1847– 1857.
WHEELER W., 2001. Homology and the Optimization of DNA Sequence Data. Cladistics, 17(1), S3-S11.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Evaluarea diversității genetice a speciei Scardinius racovitzai [305262] (ID: 305262)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.