Proiect De Diplomă1 [304992]

PROIECT DE DIPLOMĂ

SUBSTITUENȚI DE TIMPAN CU ARHITECTURĂ FIBROASĂ ȘI EFECT ANTIINFLAMATOR

Student: [anonimizat]-Ioana DRUG

Conducător Științific: SL. Dr. Ing. Diana-Maria DRĂGUȘIN-ŽAKMAN

București

Iulie 2018

INTRODUCERE

Memoriu justificativ

Deteriorarea membranei timpanice care ar putea proveni din otita cronică a urechii medii sau dintr-o perforare traumatizantă are ca rezultat pierderea auzului. Otita cronică a urechii medii este o [anonimizat] a acesteia este de 4,76%, ceea ce înseamnă că în fiecare an se înregistrează 31 de milioane de cazuri. În fiecare an, 28.000 de pacienți mor din cauza complicațiilor otitei. [anonimizat] o atenție urgentă pentru a face față acestei probleme masive de sănătate. Tratamentul acestei boli este adesea complicat de inflamații și infecții bacteriene recurente care întârzie sau chiar opresc procesul de vindecare.

Scopul acestui studiu este de a dezvolta un model de structură fibroasă multistrat prin tehnica de electrofilare cu proprietăți antiinflamatorii datorită încărcării cu un model de medicament (Piroxicam-β-ciclodextrină) cu potențial de înlocuire a membranei timpanice.

[anonimizat]. Deteriorarea membranei timpanice care ar putea proveni din otita cronică a [anonimizat] o [anonimizat]-o perforare traumatizantă are ca rezultat pierderea auzului din cauza transmiterii inegale a sunetului [1, 2]. [anonimizat] a [anonimizat], febra, tinitus, vertij, paralizie facială etc. Otita cronică a urechii medii este o [anonimizat] a acesteia, estimată de Organizația Mondială a Sănătății, este de 4,76%, ceea ce înseamnă că în fiecare an se înregistrează 31 de milioane de cazuri, 22,6% dintre acestea apărând anual la vârsta de sub 5 ani. În fiecare an, 28.000 de pacienți mor din cauza complicațiilor otitei.

[anonimizat] o atenție urgentă pentru a [anonimizat] a Sănătății[1].

1.3 Descriere problematicii abordate în proiect

Așa cum este prezentat de Lim [3], [anonimizat]-un strat epidermal, o lamina propria și un strat epitelial al mucoasei. Stratul fibros conține o cantitate mare de colagen de tip II și III și o cantitate mică de colagen I. Compoziția neobișnuită a colagenului implică caracterul fizic unic al părții întinse a membranei timpanice. Multe cazuri de otită cronică de la nivelul urechii medii necesită intervenții chirurgicale pentru a evita complicațiile și pentru a [anonimizat], meningită, abcese intracraniene și chiar moarte. Tratamentul acestei boli este adesea complicat de infecțiile bacteriene recurente care întârzie sau chiar opresc procesul de vindecare. Prin urmare, a fost studiată posibilitatea de eliminare a spațiilor paratimpanice pentru scăderea ratei de recurență. În prezent, metodele chirurgicale, cum ar fi miringoplastia sau timpanoplastia, sunt considerate ca fiind cele mai eficiente și mai fiabile tratamente pentru perforațiile mambranei timpanice. Studiile au arătat că perforațiile persistă la mai mult de 15% dintre pacienții pediatrici după timpanoplastia primară [4] și rata de chirurgie de revizuire pentru pacienții cu otită cronică la nivelul urechii medii este aproape dublă față de această rată, 28% [5]. Mai multe materiale autologene au fost utilizare pentru eliminare, inclusiv os, grăsime, cartilaj și mușchi. Această abordare este asociată cu morbiditatea la nivelul locului de donare, incizii suplimentare, timp îndelungat de lucru și lipsă de material în cazurile de revizuire. Până în prezent, o serie de materiale aloplastice au fost investigate ca scaffold-uri potrivite pentru a susține regenerarea membranei timpanice. Aceste materiale includ materiale anorganice cum ar fi hidroxiapatita, particule ceramice de sticlă bioactivă și os demineralizat, cum ar fi Otomimix®, dar și materiale organice precum gelatina biopolimerilor (de exemplu Geofoam®), acidul hialuronic, derivații [6] și colagenul (de exemplu, membranele BioGide®)[7].

1.4 Limitările abordărilor prin analizarea stadiului actual al cunoașterii legate de tema studiului

În ciuda tuturor acestor progrese, există încă probleme importante care trebuie abordate, astfel încât țesutul regenerat normal să înlocuiască în cele din urmă scaffold-ul. Micile nereguli din materiale pot să nu fie perceptibile în momentul operației, ceea ce duce la rezultate imprevizibile. Prin urmare, poate apărea retragerea sau reperforația membranei timpanice datorită diferențelor de presiune din urechea medie. Scaffold-urile actuale nu au proprietăți biomecanice și alte proprietăți ale materialului în comparație cu membrana timpanică normală. Acest lucru poate afecta funcția de auz pe termen lung. Unele materiale autologene pot fi dizolvate atunci când sunt implantate și unele materiale aloplastice pot să nu fie potrivite pentru a fi utilizate datorită posibilității racției corpului uman la corpul străin introdus [8].

În ceea ce privește necesitatea unor sisteme eficiente de administrare a medicamentelor în urechea internă sunt explorate materialele disponibile în prezent în comerț. Acestea includ, printre altele, hidrogeluri de gelatină (Gelfoam®) îmbibate cu sisteme de gentamicină pe bază de acid hialuronic (Seprapack®) pentru livrarea dexametazonei, a colagenului și a diferiților chitosani ca bioadezivi pentru eliberarea neomicinei [9]. Din cauza persistenței infecțiilor din urechea internă, sistemele de livrare a medicamentelor pe termen lung rămân o nevoie persistentă.

Lipsa unei dinamici previzibile a bolilor urechii întărește necesitatea dezvoltării de materiale, dispozitive și metodologii de procesare care pot recapitula aspecte cheie ale urechii anatomice, pentru a îmbunătăți vindecarea și auzul. În același timp, acestea trebuie să fie eficiente din punct de vedere al costurilor și capabile să depășească provocările de reducere a proceselor fără a pierde calitatea produselor. Cercetări suplimentare sunt necesare pentru a găsi un echilibru bun între biodegrabilitatea, interactivitate celulară, proprietăți mecanice suficiente (rezistență și flexibilitate) și eliberarea susținută și controlată a diferitelor tipuri de medicamente. Un pas înaintea stadiului actual al tehnicii este reprezentat de modificarea biopolimerizărilor (bio)degradabile aprobate de FDA, utilizate ca blocuri de construcție, și de elaborarea unor construcții complexe fabricate pentru regenerarea țesuturilor scheletice [10].

ELECTROFILAREA

2.1 Istoricul procesului de electrofilare

Istoria metodei de electrofilare datează din anul 1902 și este trasată după modelul Cooley și Morton. În anul 1914, John Zeleny a raportat că lucrează la tratarea picăturilor lichide de pe capilarele de fier. De-a lungul acestui studiu, el a încercat să găsească un model matematic pentru lichidele aflate în câmp de forțe electrostatice. În anul 1930 Formhals a încercat să obțină fibre electrofilate, iar în ciuda faptului că a avut unele dezavantaje precum sistemul de uscare datorat distanței dintre duză și colector, acesta a modificat și îmbunătățit dispozitivul în anul 1940. Geoffrey Ingram Taylor a generat sprijinul teoretic pentru electrofilarea între anii 1964 și 1969. Cercetările sale au ajutat la îmbunătățirea electofilării prin modelarea formei zonei de încărcare care formează picătura prin câmp electric. De asemenea, colaborarea cu JR Melcher a dus la extinderea modelului dielectric leaky pentru conductorii lichizi. După aceea, în anii 1990, Reneker folosea tensiunea înaltă pentru dispersia polimerului și pentru a produce fibre cu diametru mai mic de 5µm [11].

2.2 Caracteristicile procesului de electrofilare

Nanofibrele sunt o clasă unică de nanomateriale cu multe proprietăți interesante datorită diametrului și a raportului mare între lungime și lățime. Ele au proprietăți mecanice excelente și suprafața ușor de modificat. Nanofibrele pot fi produse prin diferite tehnici cum ar fi desenarea, sinteza șablonului, separarea fazelor, autoasamblarea și electrofilarea. Dintre acestea, electrofilarea se dezvoltă rapid ca o tehnică simplă și fiabilă pentru prepararea nanofibrelor netede cu morfologie controlabilă dintr-o varietate de polimeri. Electrofilarea implică aplicarea unui câmp electric pentru a forma nanofibre dintr-o soluție de polimer încărcată. O schemă a procesului de electrofilare este prezentată în schema 1.

Schema 1. Schema procesului de electrofilare

Prin modificarea parametrilor de electrofilare și a proprietăților soluției de polimer, electrofilarea poate fi utilizată pentru a produce diferite morfologii. Grupul de cercetare a lui Reneker a controlat ramificarea și îndoirea jetului de polimer încărcat prin variația tensiunii de electrofilare pentru a forma "ghirlande" sau rețele sub formă de coloană de nanofibre polimerice care formează bucle suprapuse. Alte grupuri de cercetători au demonstrat utilizarea electrofilării pentru formarea de panglici plate în loc de fibre rotunde. Monitorizarea atentă a condițiilor de funcționare și a parametrilor soluțiilor poate conduce la producerea unor structuri poroase de membrane nanofibroase netede, fără defecte.

În acest studiu s-a folosit un echipament de electrofilare cu atmosferă controlată, EC-CLI, de la IME Technologies (figura 1).

Figura 1. Echipament de electrofilare EC-CLI de la IME Technologies

2.3 Factori care influențează procesul de electrofilare

Electrofilarea este o tehnică foarte versatilă prin faptul că topografia suprafeței, morfologia fibrei și orientarea sunt dictate, în mare parte, de proprietățile soluției și condițiile de funcționare. Deoarece reologia soluției de polimer este vitală pentru procesul de formare a fibrelor, proprietățile soluției, precum concentrația sau greutatea moleculară a polimerului, afectează în mod direct proprietățile fibrelor. Conductivitatea soluției de polimer este, de asemenea, un factor care poate schimba proprietățile finale ale fibrelor. Proprietățile fibrelor sunt afectate în mod direct de parametrii de proces, cum ar fi tensiunea aplicată, debitul soluției și distanța între vârf și colector. Parametrii de mediu, precum temperatura și umiditatea camerei de electrofilare, pot modifica morfologia fibrelor. Parametrii de procesare care influențează procesul de electrofilare sunt enumerați în tabelul 1 [12].

Tabel 1. Parametri de proces pentru electrofilare

Există mai mulți factori care pot influența procesul de electrofilare. Acești factori sunt clasificați în parametri de soluție, parametri de proces și parametri de mediu. Parametrii electrofilării includ câmpul electric aplicat, distanța dintre ac și colector, debitul și diametrul acului. Parametrii soluției includ solventul, concentrația polimerului, vâscozitatea și conductivitatea soluției. Parametrii de mediu includ umiditatea relativă și temperatura. Toți acești parametri afectează direct generarea de fibre electrofilate netede și fără defecte. Prin urmare, pentru a înțelege mai bine procesul de electrofilare și fabricarea nanofibrelor polimerice, este esențială înțelegerea efectelor tuturor acestor parametri.

2.3.1 Solventul

Selectarea solventului este unul dintre factorii-cheie pentru formarea nanofibrelor electrofilate netede și fără defecte. De obicei trebuie să ținem cont de două aspecte înainte de selectarea solventului. Mai întâi, solvenții preferați pentru procesul de electrofilare sunt polimerii care sunt solubili. În al doilea rând, solventul trebuie să aibă un punct de fierbere moderat. Punctul de fierbere dă o idee despre volatilitatea unui solvent. Se încearcă evitarea solvenților extrem de volatili deoarece punctele lor de fierbere scăzute și viteza mare de evaporare determină uscarea jetului în vârful acului. Această uscare va bloca vârful acului și, prin urmare, va crește vâscozitatea și va împiedica procesul de electrofilare. În mod similar, solvenții puțin volatili sunt, de asemenea, evitați deoarece punctele lor ridicate de fierbere împiedică uscarea în timpul zborului și la atingerea colectorului vor forma nanofibre cu mărgele, defecte.

2.3.2 Concentrației polimerului și vâscozitatea soluției

Procesul de electrofilare se bazează pe fenomenul de întindere uniaxială a unui jet încărcat. Întinderea jetului încărcat este semnificativ afectat de modificarea concentrației soluției polimerice. De exemplu, când concentrația soluției polimerice este scăzută, câmpul electric aplicat și tensiunea superficială determină lanțurile polimerice să se rupă în fragmente înainte de a ajunge pe colector. Aceste fragmente cauzează formarea de defecte. Creșterea concentrației soluției polimerice va conduce la o creștere a vâscozității, care apoi duce la încâlcirea lanțurilor de polimeri. Mai mult, creșterea concentrației dincolo de o valoare critică (concentrația la care se formează nanofibrele uniforme) împiedică curgerea soluției prin vârful acului (soluția de polimer se usucă în vârful acului metalic și îl blochează), ceea ce duce în cele din urmă la rezultate în nanofibre defecte. Se poate concluziona că, în plus față de parametrii de proces, determinarea valorilor critice ale parametrilor concentrație și vâscozitate este esențială pentru obținerea nanofibrelor fără defecte.

2.3.3 Conductivitatea soluției

Conductivitatea soluției nu afectează doar formarea conului din vârful acului, însă ajută la controlul nanofibrelor. În cazul soluției cu conductivitate inferioară, suprafața picăturii nu va avea nici o sarcină electrică pentru a forma conul din vârful acului, iar consecința este ca procesul de electrofilare nu va avea loc. Creșterea conductivității soluției la o valoare critică nu numai că va mări încărcătura electrică pe suprafața picăturii pentru a forma conul, dar va cauza, de asemenea, scăderea diametrului fibrei. Creșterea conductivității dincolo de o valoare critică va împiedica formarea conului și procesul propriu-zis. O soluție de polimer conductor va avea încărcări libere suficiente pentru a se deplasa pe suprafața fluidului și pentru a forma conul și pentru a iniția procesul de electrospinare. Conductivitatea unei soluții de polimer ar putea fi controlată prin adăugarea unei sări adecvate la soluție. Adăugarea de sare afectează electrospinarea în doua moduri: creșterea numărului de ioni în soluția de polimer și creșterea conductivității soluției polimerice.

2.3.4 Câmpul electric aplicat

În general, este cunoscut faptul că aplicarea unui flux de curent de la o sursă de alimentare de înaltă tensiune într-o soluție, prin intermediul unui ac metalic, va produce o picătură sferică care se va deforma în forma unui con și va forma nanofibre ultrafine. Se poate afirma faptul că diametrul fibrelor nu a fost schimbat dramatic prin variația voltajului aplicat. Tensiunea aplicată poate afecta anumiți factori, precum masa de polimer dintr-un vârf de ac, nivelul de alungire a jetului, morfologia jetului. Este, de asemenea, remarcat faptul că fibrele cu defecte au fost electrofilate cu un nivel prea ridicat tensiune aplicată. Deși efectele tensiunii au diferite tendințe, acesta nu are un rol semnificativ în controlul morfologiei fibrelor [13]. În figura 2 sunt prezentate ferestrele de reglare a tensiunii.

Figura 2. Ferestrele de reglare a tensiunii

2.3.5 Distanța dintre ac și colector

Distanța dintre vârful acului metalic și colector are un rol esențial în morfologia fibrelor electrofilate. Această distanță variază în funcție de sistemul de polimeri utilizat. Morfologia nanofibrelor este afectată de acestă distanță deoarece depinde de timpul de depunere, de rata de evaporare sau intervalul de instabilitate. Numeroase grupări de cercetători au studiat această distanță și au concluzionat că nanofibrele cu defecte sunt formate atunci când distanța este constantă în timp. Desigur, există și numeroase cazuri în care nu a fost observat nici un efect asupra morfologiei la schimbarea distanței dintre acul metalic și colector. Colectorul folosit are și el un rol important în obținerea fibrelor, iar în figura 3 sunt prezentați colectori disponibili pentru procesul de electrofilare (IME Technologies).

Figura 3. Tipuri de colectori folosiți în procesul de electrofilare

2.3.6 Debitului soluției

Fluxul soluției polimerice care iese prin vârful metalic determină morfologia nanofibrelor electrofilate. Creșterea valorii debitului dincolo de o valoare critică duce la creșterea diametrului fibrelor, dar și la formarea unor defecte din cauza uscării incomplete a jetului de nanofibre din vârful acului la colectorul metalic. Deoarece creșterile și scăderile debitului afectează formarea și diametrul fibrelor, este de preferat un debit minim. Avem prezentată în figura 4 fereastra de reglare a debitului.

Figura 4. Fereastra de reglare a debitului

2.3.7 Umiditatea și temperatura

În afară de parametrii de proces și cei de soluție, factorii de mediu, cum ar fi umiditatea relativă și temperatura (figura 5), afectează diametrul și morfologia nanofibrelor electrofilare. Umiditatea provoacă schimbări în diametrul nanofibrelor prin controlul procesului de solidificare a jetului încărcat. Acest fenomen, totuși, depinde de natura chimică a polimerului. Mai multe grupuri de cercetători au studiat modificarea diametrului nanofibrelor cu modificarea umidității și s-a observat o scădere condiserabilă a diametrului odată cu creșterea umidității. Temperatura provoacă două efecte: crește rata de evaporare a solventului și reduce vâscozitatea soluției. Cele două efecte duc tot la scăderea diametrului fibrelor electrofilate [14].

Figura 5. Fereastra pentru modificarea temperaturii și a umidității

MATERIALE UTILIZATE

3.1 Gelatina de pește

Gelatina este un produs biodegradabil, biocompatibil, netoxic și un biopolimer nearcinogen. Se obține, de obicei, prin denaturarea parțială a colagenului care reprezintă 30% din totalul proteinei animale în toate viețuitoarele. Colagenul cuprinde toți cei 20 de aminoacizi în cele trei lanțuri a, care sunt stabilizate și interconectate de legăturile de hidrogen într-un triplu helix care se rotește în sensul acelor de ceasornic. Colagenul poate fi parțial distrus utilizând două pre-tratamente distincte, acidul și tratamentul alcalin, rezultând gelatină de tip A și respectiv B. Gelatina are unele dezavantaje privind aplicațiile pe termen lung, cum ar fi sistemele de livrare a medicamentelor, deoarece proteină se dizolvă rapid într-un mediu apos. Pentru a trece de această limitare, este necesară reticularea gelatinei.

Electrofilarea permite formare structurilor nanofibroase din gelatină prin dizolvarea polimerului cu un amestec de acid acetic cu acid formic sau cu soluții apoase de acid acetic și acetat de etil [15]. Datorită costului său relativ scăzut, a biocompatibilității sale excelente și biodegrabilității în medii fiziologice, gelatina este frecvent utilizată în aplicații alimentare, forografice, cosmetice, farmaceutice și medicale.

Gelatina din pește se extrage, în cea mai mare parte, din tilapia de Nil, iar datorită abundenței pescuitului din Thailanda, o mulțime de deșeuri sub formă de piele și oase de pește a fost generat în fiecare zi. Transformarea acestor deșeuri în produs cu valoare contribuie la consolidarea economiei. Aplicabilitatea gelatinei pentru fibrele ultrafine electrofilate a fost motivul principal pentru care aceasta s-a extras din oasele și piele peștilor. Compoziția de aminoacizi a gelatinei din pește a fost analizată și rezumată în tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziția de aminoacizi a gelatinei din pește [16]

3.2 Piroxicam-β-ciclodextrina

Piroxicam-β-ciclodextrina este un medicament cu proprietăți antiinflamatorii, analgezice și antipiretice care are complexul molecular 1:2,5. Molecula de ciclodextrină poate fi considerată o capsulă cu dimensiune moleculară care este capabilă să formeze un complex de incluziune cu molecula unei alte substanțe (figura 6). Complexul este menținut împreună prin forțe fizice și nu prin legături covalente. Complexul cu ciclodextrină permite modificarea proprietăților fizice și chimice ale medicamentului și, prin urmare, proprietățile sale farmacocinetice și, eventual, farmacodinamice.

.

β-ciclodextrina Piroxicam

Reprezentarea grafică a complexului piroxicam-β-ciclodextrină

Figura 6. Structurile chimice ale β-ciclodextrinei și piroxicamului și o reprezentare schematică a complexului de incluziune piroxicam-β-ciclodextrină [17].

4. PARTEA EXPERIMENTALĂ

4.1 Materiale utilizate

Pentru studiul experimental s-au folosit următoarele materiale: gelatina extrasă din piele de pește de apă rece (FG) cu masa molară de aproximativ 60 kDa, furnizor Sigma-Aldrich, Flamexin pulbere pentru soluție orală cu o compoziție de 20 mg piroxicam/plic sub formă de piroxicam-β-ciclodextrină (191,2 mg) și excipienți, produs de CHIESI FARMACEUTICI SPA, aldehidă glutarică (AG) soluție apoasă 50%, producător Sigma-Aldrich, etanol absolut (EtOH), producător Chemical Company, apă dublu distilată, produsă în laborator cu un bidistilor tip GFL 2102. Toți reactivi au fost utilizați ca atare, fără o purificare anterioară.

4.2 OBȚINEREA STRUCTURILOR FIBROASE PRIN ELECTROFILARE

4.2.1.Optimizarea parametrilor de proces

Pentru fabricarea structurilor fibroase și optimizarea parametrilor de proces s-a pregătit o soluție din FG 50 % w/v. S-a adăugat treptat FG în apă bidistilată până la atingerea concentrației vizate, sub agitare continua la o temperatură de maxim 40°C. Aceasta a fost lăsată să se răcească la temperatura camerei, ulterior fiind încărcată într-o seringă cu diametrul de 12,45 mm.

În prima parte a studiului, s-a urmărit optimizarea parametrilor de electrofilare a soluției apoase de FG pregătite, pornind de la studii anterioare [18].

Stabilirea tensiunii optime de electrofilare pentru soluția apoasă de FG 50%.

Stabilirea parametrilor de electrofilare a debutat cu optimizarea tensiunii și debitul de injectare. S-a folosit o plajă largă de parametrii. În tabelul 3 sunt prezentați parametrii utilizați pentru a obține membrane fibroase fără defecte majore (picături, fibre discontinue, etc.)

Tabelul 3. Tensiune și debit de injectare pentru soluția de FG 50%

Parametrii de fabricare constanți:

Volumul total de soluție injectat: 300 μL;

Dimensiuni colector: diametru de 10 mm, lungime de 200 mm;

Viteza de rotatie a colectorului: 150 RPM;

Diametrul acului de injectare: 0,8 mm;

Distanța dintre vârful acului și colector: 15 cm;

Viteza de mișcare a acului de-a lungul colectorului: 5 mm/s.

Așa cum se poate observa în figura 7 cazul parametrilor FG-A, s-au obținut fibre neomogene, însă îndepărtarea meșelor de pe colector a fost dificilă, acestea fiind foarte bine aderate la colector. Acest lucru s-ar putea datora unei evaporări insuficiente a solventului în timpul procesului de electrofilare.

În cazul parametrilor FG-C, s-au obținut fibre fără foarte multe defecte pe lungimea lor, însă în acest caz meșele obținute au fost mai puțin compacte (pufoase). Din acest motiv îndepărtarea meșelor de pe colector a fost de asemenea dificilă, fibrele delaminându-se.

Pentru parametrii FG-B, structurile fibroase obținute au fost uniforme ca dimensiune cât și ca dispunere pe întregul colector. Îndepărtarea meșelor obținute a fost facilă. Astfel, tensiunea și debitul folosite pentru sinteza fibrelor din această compoziție au fost considerate optime. Aspectul structurilor fibroase obținute după detașarea lor de pe colector este reprezentată în figura 8.

Figura 7. Modul de depunere al fibrelor pe colector în funcție de diferența de tensiune aplicată între ac și colector.

Figura 8. Aspectul fibrelor după detașarea de pe colector (A) pentru parametrii FG-B si (B) meșa obținută în cazul parametrilor FG-C

În toate cele 3 cazuri s-a identificat că debitul crește o dată cu creșterea tensiunii aplicate pentru a putea obține o picătură stabilă în vârful acului și pentru formarea conului Taylor (Figura 9). În cazul FG-B debitul optim de injectare este de 7 μL/min.

Figura 9. Formarea conului Taylor în cazul compoziției FG-B

Stabilirea umidității relative optime de electrofilare pentru soluția apoasă de FG 50%.

După optimizarea tensiunii aplicate și a debitului, s-a studiat influența parametrilor de mediu, și anume umiditatea relativă în care fibrele sunt produse asupra aspectului și omogenității meșelor fabricate. Valorile folosite sunt prezentate în tabelul 4.

Tabelul 4. Valorile umidității relative

Parametrii de fabricare constanți:

Volumul total de soluție injectat: 300 μL;

Dimensiuni colector: diametru de 2 mm, lungime de 150 mm;

Viteza de rotatie a colectorului: 150 rpm;

Diametrul acului de injectare: 0,8 mm;

Distanța dintre vârful acului și colector: 15 cm;

Viteza de mișcare a acului de-a lungul colectorului: 5 mm/s.

În cazurile de fabricare a substraturilor la umidități de 50% și 60% se poate observa o rugozitate crescută a meșelor (figura 10). În cazul unei umidități de 40% se poate vedea un aspect omogen al întregii structuri. Acest lucru se poate datora faptului că o umiditate mai scăzută permite evaporarea suficientă a solventului înainte de depunerea fibrei pe colector. În ceea ce privește umiditățile mai crescute de 50% si 60%, uscarea completă a fibrelor se realizează după depunerea acestora pe colector, ceea ce conduce la o modificare a structurilor, respectiv strângerea și cutarea lor.

Figura 10. Aspectul structurilor fibroase fabricate folosind diferite umidități relative

4.2.2 Fabricarea de structuri fibroase multistrat cu proprietăți antiinflamatorii

Partea a doua a studiului a vizat sinteza de structuri fibroase multistrat bioactive prin încărcarea fibrelor de gelatină cu un model de medicament antiinflamator. Principiul activ selectat a fost piroxicamul sub formă de piroxicam-β-ciclodextrină. În acest sens s-a folosit Flamexin, pulbere de soluție orală (solubilă în apă).

Pentru fabricarea structurilor multistrat, s-a pregătit o soluție din gelatină de peste

50 % w/v. S-a adăugat treptat gelatina de pește în apă distilată până la atingerea concentrației vizate, sub agitare continuă la o temperatură de maxim 40°C. Apoi s-au pregătit probe cu încărcări diferite de medicament. Astfel, a fost dizolvată pulberea de Flamexin în soluția de FG obținută anterior, până la omogenizare totală a probelor. Compozițiile finale sunt prezentate în tabelul 5. Pentru o mai bună omogenizare a componentelor, s-a utilizat o baie de ultrasunete ELMA S30H Elmasonic. După solubilizarea completă a componentelor în soluții, acestea au fost degazate folosind aceeași baie de ultrasonare. Îndepărtarea bulelor de aer din soluție este esențiala pentru procesul de electrofilare. Prezența acestora conduce la fibre discontinue prin ruperea jetului injectat.

Tabel 5. Compozițiile soluțiilor cu încărcări diferite de piroxicam

Structurile fibroase s-au obținut cu ajutorul aparatului de electrofilare EC-CLI (IME Technologies). Într-o primă etapă s-a încercat direct electrofilarea soluțiilor ID1-ID4, însă fibrele obținute au fost foarte fine și lipicioase, ceea ce a condus la imposibilitatea îndepărtării meselor astfel obținute de pe colector.

Structurile multistrat sunt alcătuite din 3 straturi depuse pe același colector în următoarea ordine: stratul 1: FG, stratul 2: FG-piroxicam (în diferite rapoarte conform tabelului 5) și stratul 3: FG (Schema 2). Straturile de gelatină au ca rol pe de o parte manevrarea mai ușoară a structurilor electrofilate și controlul eliberării de medicament din membrane, pe de altă parte.

Schema 2. Reprezentarea schematică a structurilor multistrat încărcate cu piroxicam-β-ciclodextrină în diferite cantități

Pentru electrofilarea soluțiilor multicomponent s-au folosit parametrii de proces conform tabelului 6. Stabilirea acestora a avut ca punct de plecare optimizarea parametrilor pentru soluția de FG.

Tabelul 6. Parametrii de fabricare variabili în funcție de compozițiile soluțiilor precursoare

Parametrii de fabricare constanți indiferent de compozițiile soluțiilor precursoare:

Volumul total de soluție injectat: 800 μL dintre care strat 1 – FG 100 μL, strat 2 ID1-ID4: 600 μL, strat 3 – FG 100 μL

Dimensiuni colector: diametru de 10 mm, lungime de 200 mm.

Viteza de rotație a colectorului: 150 RPM

Diametrul acului de injectare: 0,8 mm,

Distanța dintre vârful acului și colector: 15 cm,

Viteza de mișcare a acului de-a lungul colectorului: 5 mm/s.

Toate meșele fibroase au fost fabricate într-un mediu controlat, cu o temperatură constantă de 25°C și o umiditate relativă de 40%. Condițiile de mediu constante din interiorul incintei de fabricare a echipamentului, conduc la o bună reproductibilitate a sintezei structurilor electrofilate. În același timp permit optimizarea tuturor celorlalți parametrii de fabricare în funcție de parametrii de material.

Figura 11. Imagini din timpul procesului de electrofilare

4.2.3 STABILIZAREA STRUCTURILOR MULTISTRAT PRIN RETICULARE

Pentru stabilizarea structurilor multistrat, acestea au fost reticulate folosind o soluție etanolică de AG (0,5 % w/v). S-a evitat folosirea unei cantități mari de apă pentru a nu distruge structura fibroasă. De aceea, în timpul reticulării probele au fost imersate în baia de reticulare în tuburi cu capac, pentru a preveni umectarea suplimentară a soluției de reticulare cu vaporii de apă din atmosferă. Reticularea s-a realizat la temperatura camerei timp de 96 de ore.

După încheierea procesului de reticulare, meșele au fost purificate prin spălare în băi succesive de etanol, pentru îndepărtarea reactivilor nereacționați.

Uscarea membranelor s-a realizat în etuvă la o temperatură de 37 °C.

4.3 CARACTERIZAREA STRUCTURILOR MULTISTRAT

Pentru caracterizarea materialelor fabricate s-au folosit următoarele tehnici:

Spectroscopie în infraroșu cu transformata Fourier (FT-IR):Probele obținute au fost caracterizate folosind un spectrometru JASCO 4200 echipat cu dispozitiv ATR (reflexie totală atenuată) SpecacGolden Gate. Fiecare spectru fost înregistrat folosind 300 de scanări în intervalul de numere de undă 4000-600 cm-1, cu o rezoluție de 4 cm-1.

Microscopie optica (MO) s-a realizat folosind un microscop Nikon TE2000U, echipat cu o cameră CCD de 5MP și un obiectiv 4x.

Caracteristicile morfo-structurale ale structurilor fibroase acoperite cu aur au fost examinate prin microscopie electronica de baleiaj (SEM), folosind un echipament QUANTA INSPECT F SEM echipat cu un tun de emisie de electroni (FEG) cu o rezoluție de 1.2 nm.

4.3.1 Analiza vizuală

În primul rând s-a realizat o evaluare vizuală a structurilor obținute, așa cum se poate constata din figura 12.În cazul primului material, fabricat din combinația de compoziții ID0-ID1-ID0, s-a obținut o structură elastică, aceasta având tendința de încrețire după detașarea de pe colector. Pentru restul tuturor materialelor, s-au obținut structuri multistrat stabile dimensional în urma detașării de pe colector.

Figura 12. Depunerea omogenă a celor 3 straturi pe întreaga lungime a colectorului (a,b), structura fibroasă multistrat obținută pentru combinația de compoziții ID0-ID1-ID0 (c), structura fibroasă multistrat obținută pentru combinația de compoziții ID0-ID3-ID0 (d), structura fibroasă multistrat obținută pentru combinația de compoziții ID0-ID4-ID0 (e).

4.3.2 Analiza probelor prin spectroscopie în infraroșu cu transformata Fourier (FT-IR)

Pentru a confirma prezența tuturor componentelor în structurile fabricate prin electrofilare, studiul a continuat cu analize FT-IR. Au fost înregistrate spectrele componentelor din care au fost obținute soluțiile de electrofilare și anume, spectrul FG și al Flamexinului și spectrele pentru fiecare structură multistrat obținută prin combinarea celor două componente principale.

Spectrul FT-IR al gelatinei (figura 13, dreapta) prezintă un vârf larg la 3281 cm-1 cunoscut ca fiind un semnal comun pentru vibrațiile de întindere a O-H și N-H, un semnal la 3076 cm-1 atribuit legăturii N-H, la aproximativ 2943 cm-1 apar vibrațiile tipice pentru legăturile C-H saturate, iar vibrațiile specifice pentru amida I și amida II sunt prezente la 1631 cm-1 și la 1524 cm-1; ultimele două vibrații sunt tipice pentru grupările amidice ale proteinei.

Figura 13. Spectrul FT-IR al Flamexin, substanța activă piroxicam β ciclodextrinăși spectrul FT-IR al gelatinei de pește.

Spectrul FT-IR al Flamexinului (figura 13, stânga) prezintă o bandă largă cu două absorbante maxime: un maxim la 3227 cm–1 care provine de la vibrațiile grupelor OH (din piroxicam și 2-hidroxipropil-β-ciclodextrină), ν(OH), și cel de-al doilea la 3301 cm–1 care provin de la vibrațiile grupelor NH din amida secundară a piroxicamului, ν(NH). În intervalul de numere de undă 2984 – 2929 cm–1 sunt prezente benzile provenite de la vibrațiile grupelor C–H. Prezența grupelor SO2 din piroxicam este confirmată de benzile de la 1378 cm–1 și de la 1186 cm-1 provenind din vibrațiile asimetrice și simetrice de valență. Banda de absorbție de la 1637 cm–1 este rezultatul vibrației de valență ν(C=O) a amidei secundare, iar banda de absorbție de la 1526 cm–1 este rezultatul vibrației de deformare a grupei NH, δ(NH). Vibrații de deformare simetrice și asimetrice, provenite de la C–H se pot regăsi în spectru la 1415 cm-1 și 1304 cm–1. În intervalul de lungime de undă 1740 – 1601 cm–1 sunt prezente benzile de absorbție provenite de la inelul benzenic conjugat și piridină.

Banda complexă care se întinde în intervalul de lungimi de undă 1252 – 999 cm–1, cu maxime la 1084 cm–1, 1047 cm–1, 999 cm–1 poate fi definită prin cuplarea vibrațiilor asimetrice de valență ale C–O, C–O–C, C–C–O si C–C–C. Prezența unităților de glucopiranoză a 2-hidroxipropil-β-ciclodextrinei în conformația C1 scaun, este confirmată de benzile de la 938 cm–1și 871 cm–1, prezente în spectrul Flamexinului.

Analiza comparativă a spectrelor FT-IR ale compozițiilor ID1-ID4 cu spectrul gelatinei (ID0) și al Flamexinului (figura 14) indică prezența ambelor componente în amestecurile fizice ID2-ID4, prezența flamexinului fiind cel mai greu de detectat în compoziția ID1, unde acesta se află într-o cantitate foarte mică.

Figura 14. Sprectre FT-IR pentru compozițiile electrofilate ID0 – ID4 și pentru Flamexin

4.3.3 Caracterizarea morfo-structurală a structurilor multistrat prin microscopie optică (MO)

Microscopia optică reprezintă o metodă simplă și rapidă de analiză pentru evaluarea calitativă a structurilor fibroase obținute după electrofilare. Deși nu permite măsurare precisă a diametrului fibrelor, este o analiză facilă pentru examinarea anumitor aspecte ale fibrelor fabricate, cum ar fi structura fibroasă, lipsa de defecte sau de particule datorate electropulverizării.

Figura 15. Imagini de microscopie optică pentru: structura fibroasa obținută pe baza de ID0 (ID0 a-c); structura multistrat obținută din combinația de compoziții ID0-ID1-ID0 (ID1 a-c); structura multistrat obținută din combinația de compoziții ID0-ID2-ID0 (ID2 a-c); structura multistrat obținută din combinația de compoziții ID0-ID4-ID0 (ID4 a-c).

Evaluarea prin MO a probelor obținute prin electrofilare a evidențiat structura omogenă a meșelor fabricate și un aspect dens al acestora. Din acest motiv, lumina a parcurs cu dificultate grosimea structurilor multistrat (figura 15). De asemenea, s-a putut constatat lipsa unor defecte importante de-a lungul fibrelor, rezultat al unui proces laborios de optimizare a parametrilor de fabricare. Diametrele fibrelor sunt aproximativ constante, indiferent de soluțiile injectate, dimetrul mediu al acestora fiind de aproximativ 500 nm.

Imaginile de MO înregistrate pentru materialul multistrat obținut prin combinarea compozițiilor ID0-ID3-ID0, au arătat, pe lângă aspectul relativ omogen al probei, faptul ca sub structura fibroasă fină a gelatinei electrofilate, se găsește o a doua structură fibrilară, cu o morfologie ușor diferită, provenită din electrofilarea compoziției ID3. În ceea ce privește stratul 2, din mijlocul constructului, s-a constatat o tendință de a crea o structură internă mai compactă a multistratului, cu o porozitate mai închisă decât în cazul gelatinei.

Figura 16. Imagini de microscopie optică pentru structura multistrat obținută din combinația de compoziții ID0-ID3-ID0

4.3.4 Caracterizarea morfo-structurală a structurilor multistrat prin SEM

Imaginile înregistrate cu ajutorul SEM au confirmat rezultatele obținute prin MO. Mai mult au arătat ca diametrele fibrelor sunt mai mici, ceea ce poate conduce la o încărcare mai eficientă cu medicament, datorită raportului foarte mare între aria specifică și volum, respectiv o eliberare pe o perioadă mai lungă al acestuia. Evaluarea morfo-structurală a structurilor fibroase fabricate prin SEM a arătat faptul ca nu au apărut diferențe semnificative între straturile exterioare de gelatină electrofilate. Astfel fibrele obținute sunt omogene, continue, cu suprafețe netede, fără o orientare controlată pe o anumită direcție, fără defecte sub formă de picături de-a lungul lor și cu un diametru mediu de aproximativ 220 nm (figura 17).

Figura 17. Imagini de microscopie electronica de baleiaj care prezintă morfologia fibrelor de gelatina din stratul de la suprafața structurilor multistrat la diferite măriri: A – 1000 x, B – 20.000 x, C – 100.000 x, D – 400.000 x

4.4 PROIECTARE

În cadrul acestui capitol este prezentat procesul de proiectare al structurilor fibroase obținute din gelatină de pește prin electrofilare. Reprezentativă pentru acest proces este schema 3 în care se regăsesc ilustrate etapele ce intervin în fabricarea produsului final.

4.4.1 Fluxul tehnologic de fabricare a unui strat fibros de gelatină de pește

Schema 3. Fluxul tehnologic de fabricare a unui substrat fibros

FG – gelatină de pește

AG – aldehidă glutarică

EtOH – etanol absolut

Preparare precursor

In cadrul acestei etape, s-a adăugat treptat FG în apă bidistilată până la atingerea concentrației vizate (50% w/v), sub agitare continua la o temperatură de 40°C. Solubilizarea completă a biopolimerului durează aproximativ o oră.

Dozare

Această etapă presupune încărcarea unei seringi cu diametrul de 12,45 mm cu soluția precursoare pregătită în etapa anterioară. Soluția se toarnă cu atenție în seringă pentru a evita formarea de bule. Mediul este unul vâscos și determină pierderi de material pe pereții paharului, pierderile fiind de 5%.

Electrofilare

Etapa presupune realizarea procesului de electrofilare utilizând parametrii de fabricare descriși anterior (tabelul 6). În cadrul acestui proces pierderile de material sunt semnificative, reprezentând atât soluția de polimer rămasă în tubul conector dintre ac și seringă, în acul de electrofilare cât și solventul evaporat în timpul procesului de fabricare. Totalul pierderilor din această etapă este estimat la aproximativ 30% din masa de soluție introdusă în proces.

Colectare substrat

Substratul fibros obținut prin electrofilare este colectat de pe tamburul colector și depozitat în vederea menținerii integrității fizice și compoziționale. Pierde rezultate in cadrul acestei etape sunt mici, aproximativ 2%.

Uscare

Uscarea are ca scop evaporarea solventului rămas în fibre după procesul de electrofilare. Pierderile înregistrate în cadrul acestei etape sunt de 16,6%.

Reticulare

Reticularea se realizează cu soluție etanolică de aldehidă glutarică și are ca scop stabilizarea substratului fibros, precum și îmbunătățirea proprietăților mecanice ale acestuia. Reticularea s-a realizat la temperatura camerei timp de 96 de ore.

Procesul de reticulare presupune pregătirea băii de reticulare, soluție etanolică 0,5% de aldehidă glutarică, descrisă în fluxul tehnologic ca o etapă intermediară de Amestecare

Nu se înregistrează pierderi de masă ale probei în urma reticulării.

Purificare

După încheierea procesului de reticulare, meșele au fost purificate prin spălare în băi succesive de etanol, pentru îndepărtarea reactivilor nereacționați (pierderi 2% din substratul reticulat incomplet).

Uscare

Uscarea are ca scop evaporarea solventului rămas în fibre după procesul de purificare. Nu se înregistrează pierderi de masă. Uscarea membranelor s-a realizat în etuvă la o temperatură de 37 °C.

După parcurgea acestor etape am obținut un substrat fibros purificat și uscat.

4.4.2 Bilanțul parțial de materiale

Bilanțul parțial de materiale a fost calculat pentru obținerea unui număr de 80 de bucăți structuri fibroase, cu o suprafață de aproximativ 125 de cm². Pentru fabricarea fiecărei meșe fibroase au fost injectați 800 µL soluție precursor.

În tabele 7 – 15 sunt prezentate calculele bilanțului de materiale pentru fiecare etapă.

Tabel 7. Dizolvarea polimerului

Tabel 8. Dozarea precursorului

Pierderi de 5%

Tabel 9. Electrofilarea

Pierderi de 30%

Tabel 10. Colectare fibre

Pierderi 2%

Tabel 11. Uscarea fibrelor

Pierderi 16,6%

Tabel 12. Prepararea băii de reticulare

Tabel 13. Reticularea fibrelor

Tabel 14. Purificareafibrelor

Pierderi 2% din substratul reticulat

Tabel 15. Uscare fibrelor

4.4.3 Bilanț total

Tabel 16. Bilanț total de materiale

4.4.4 Calcul economic

Pe baza acestui bilanț se poate realiza o estimare a costurilor cu materii prime necesare obținerii unei producții de 80 bucăți structuri fibroase/săptămână, fiecare bucată având o suprafață de 125 cm2. Calculul economic pentru o săptămână de producție, considerând numai costurile cu materiile prime (fără costuri cu energia, personal și alte categorii):

Tabel 17. Estimare costuri materii prime estimate corespunzător prețurilor Sigma-Aldrich [19]

Tabel 18. Calcul economic pe baza bilanțului total

5. CONCLUZII

Structurile fibroase pe bază de gelatină de pește încărcate cu piroxicam-β-ciclodextrină s-au obținut cu succes folosind tehnica de electrofilare.

S-a ales utilizarea gelatinei de pește deoarece prezintă o temperatură de gelifiere mai scăzută față de cea bovină sau porcină, și permite procesarea la temperatura camerei, fiind un aspect important în tehnica de electrofilare.

În vederea electrofilării soluțiilor, s-a folosit un electrospinner cu atmosferă controlată, EC-CLI (IME Technologies). Stabilirea parametrilor de proces este foarte importantă și necesită numeroase încercări.

Caracterizarea structurilor fibroase obținute a evidențiat faptul că compozițiile soluțiilor precursoare, precum și parametrii de proces stabiliți, au fost adecvați pentru obținerea unor fibre netede și omogene, fără defecte majore.

Imaginile de microscopie optică au oferit informații preliminare privind uniformitatea și morfologia fibrelor, evidențiând faptul că acestea își păstrează structura fibroasă și după reticulare.

Prin urmare, modelele de structuri fibroase multistrat fabricate prin tehnica de electrofilare pot avea potențial în înlocuirea membranei timpanice.

BIBLIOGRAFIE

1. WHO, W.H.O. Deafness and hearing loss. 2016.

2. Kozin, E.D., et al., Design, fabrication, and in vitro testing of novel three-dimensionally printed tympanic membrane grafts. Hearing Research, 2016. 340: p. 191-203.

3. Lim, D.J., Structure and function of the tympanic membrane: a review. Acta oto-rhino-laryngologica Belgica, 1995. 49(2): p. 101-115.

4. Hardman, J., et al., Tympanoplasty for Chronic Tympanic Membrane Perforation in Children: Systematic Review and Meta-analysis. Otology & Neurotology, 2015. 36(5): p. 796-804.

5. Kaylie, D.M., E.K. Gardner, and C.G. Jackson, Revision Chronic Ear Surgery. Otolaryngology–Head and Neck Surgery, 2006. 134(3): p. 443-450.

6. R.F., A., et al., Correlation between subjective and objective evaluation of the nasal airway. A systematic review of the highest level of evidence. Clinical Otolaryngology, 2009. 34(6): p. 518-525.

7. Pattent US9096688 B2, 2015.

8. Chul Ho Jang, Y.B.C., Chun Sik Bae, Evaluation of Bioactive Glass for Mastoid Obliteration: A Guinea Pig Model. In vivo, 2007.

9. Liu, H., J. Hao, and K.S. Li, Current strategies for drug delivery to the inner ear. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2013. 3(2): p. 86-96.

10. Meng, F., Z. Zhong, and J. Feijen, Stimuli-Responsive Polymersomes for Programmed Drug Delivery. Biomacromolecules, 2009. 10(2): p. 197-209.

11. Mirjalili, M. and S. Zohoori, Review for application of electrospinning and electrospun nanofibers technology in textile industry. Journal of Nanostructure in Chemistry, 2016. 6(3): p. 207-213.

12. Ahmed, F.E., B.S. Lalia, and R. Hashaikeh, A review on electrospinning for membrane fabrication: Challenges and applications. Desalination, 2015. 356: p. 15-30.

13. Tan, S.H., et al., Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer, 2005. 46(16): p. 6128-6134.

14. Haider, A., S. Haider, and I.-K. Kang, A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arabian Journal of Chemistry, 2015.

15. Correia, D.M., et al., Thermal and hydrolytic degradation of electrospun fish gelatin membranes. Polymer Testing, 2013. 32(5): p. 995-1000.

16. Songchotikunpan, P., J. Tattiyakul, and P. Supaphol, Extraction and electrospinning of gelatin from fish skin. International Journal of Biological Macromolecules, 2008. 42(3): p. 247-255.

17. Lee, C.R. and J.A. Balfour, Piroxicam-β-Cyclodextrin. Drugs, 1994. 48(6): p. 907-929.

18. Serafim, A., et al., Electrospun fish gelatin fibrous scaffolds with improved bio-interactions due to carboxylated nanodiamond loading. RSC Advances, 2015. 5(116): p. 95467-95477.

19. Available from: https://www.sigmaaldrich.com.