Medicina naturistă, fitochimică este bazată pe relația dintre plante și ființele umane. [304612]

INTRODUCERE

Primele forme de tratare a [anonimizat], degenerarea epidermei și a țesuturilor de adâncime sau a [anonimizat]-a lungul veacurilor. Este greu de spus cum a [anonimizat] a fost cel empiric. [anonimizat], zãpada, ierburile și argila grăbesc vindecarea cu ajutorul acestora.

Printr-un proces de selecție a [anonimizat] 6 – 7000 de ani. [anonimizat]. [anonimizat].

Primele documente care conțin informații medicale dateazã de aproximativ 2500 de ani î.Hr. [anonimizat]ãrând și în papiruși egipteni .

[anonimizat] „substanțe active“. [anonimizat], determinând astfel acțiuni farmacodinamice caracteristice.

[anonimizat], așa cum sunt: taninurile, flavonoidele, cumarinele, [anonimizat], etc. Aceste substanțe determină o selectivitate scăzută a acțiunilor farmacoterapice și clasifică plantele medicinale în mai multe grupe farmacologice. [anonimizat], diuretic, antiinflamator, [anonimizat].

[anonimizat].

[anonimizat] a pomului pentru multiplicare. Datorită acestui fapt eu cred ca rodul plantelor este cel mai hrănitor aliment. Planta la creat să nu facă rău cărăușului matricei sale energetice.

Oamenii beneficiază de efectele terapeutice a [anonimizat]-[anonimizat].

Legat de rezultatele înregistrate în ultimii ani cu privire la plantele medicinale și aromatice și analiza datelor statistice se observă o creștere evidentă a [anonimizat], [anonimizat]. Studiile de piață confirmă și faptul că populația optează pentru produsele naturale datorită beneficiilor recunoscute unanim ale fitoterapiei: [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat].

[anonimizat], iar cultivarea plantelor medicinale poate reprezenta o bună oportunitate de afacere. Cererea de produse fitoterapeutice a dus la creșterea culturilor de plante medicinale, dar investițiile în acest domeniu nu sunt atât de mari precum în cazul medicamentelor de sinteză, clasice.

Flora spontană la nivel național include 3.700 de specii recunoscute ca având proprietăți vindecătoare, din care 370 de specii au însușiri recunoscute ca având efecte farmacodinamice. Producerea și comercializarea plantelor medicinale cultivate din flora spontană au devenit din ce în ce mai profitabile, determinând apariția unei noi surse de venituri pentru producători, comercianți, dar și pentru diverșii procesatori, în ceea ce privește produsele fitoterapeutice obținute.

Una dintre plantele cele mai utilizate în România și în lume este menta, planta care este tema noastră de licență.

Menta este una dintre cele mai uzuale plante medicinale încă din antichitate, frunze de menta fiind descoperite în piramide egiptene ce datează din anul 1.200 î.Hr.

Menta este o plantă care își are legenda ei. Legenda spune că numele plantei vine de la nimfa de rău Minthe. Zeul întunericului, Hades (Pluton) s-a îndrăgostit nebunește de frumoasa nimfă. Soția lui, foarte geloasă, a urmărit nimfa și-a îngropat-o în pământ. Zeul Hades (Pluton), doborât de suferința nimfei, a transformat-o într-o plantă cu miros puternic, dulce și amărui în același timp, ca dragostea. Mirosul puternic i-a fost dat pentru a o feri de a fi călcată în picioare de oameni.

Tot din legende aflăm că galii dormeau pe snopi de mentă proaspătă, înveliți în pânză. De asemenea, femeile slave își puneau la piept frunze de mentă în ziua nunții, fiind convinse că acestea le va ajuta să aibă o căsnicie lungă și fără probleme. Iar scoțienii își confecționau mături din snopi de mentă și cu acestea măturau odăile pentru a alunga toate bolile care puteau amenința familia.

Menta era cunoscută încă din antichitate fiind amintită în scrierile grecești (mintha sau minthae) și în cele latinești (mentha, menta).

Grecii o foloseau pentru a curața mesele la banchetele lor și în băi de plante pentru a stimula trupurile, în timp ce romanii o adăugau în sosuri, ca adjuvant pentru digestie, și ca odorizant de gură.

În multe culturi menta simboliza ospitalitate și era oferită oaspeților ca semn de bun venit și prietenie .

Hipocrat considera menta că este un afrodisiac și o recomanda în tratarea impotenței, dar o interzicea soldaților considerand ca i-ar putea deturna de la îndatoririle lor militare. Știința modernă i-a dat dreptate lui Hipocrat .

Pliniu o folosea ca analgezic în timp ce chinezii o utilizau ca antispasmodic și calmant.

Filipinezii o consideră și azi "yerba buena", adică iarbă bună împotriva tuturor relelor.

Odinioară, menta se găsea în toate gospodăriile țărănești românești. Era folosită ca iarbă de leac pentru bolile stomacului, pentru febră, bolile de plămâni ori alte suferințe. Rănile tot cu mentă erau acoperite, precum și înțepăturile de țânțari, pentru a domoli mâncărimile pielii. Menta era pusă la căpătâiul bolnavilor, pentru a-i proteja de rele, era pusă în sânul fetelor nemăritate, pentru a le păstra cuminți și era așezată lângă icoane, ca să apere gospodăria de secetă. Când aveau de făcut drumuri mai lungi, țăranii români își puneau frunze proaspete de mentă în opinci pentru ca drumul să li se pară mai ușor și mai scurt.

La noi în țară, menta a fost între primele plante aromatice și medicinale cultivate.

Prima cultură experimentală de mentă a fost facută de B. Pater în 1908 la Cluj.

În scopuri industriale, se cultivă din 1926. Cultura ei s-a inceput pe suprafete mai mari în Țara Bârsei, în jurul Brașovului, iar la Bod a luat ființă o distilerie.

Cea mai studiată specie de mentă la nivel mondial este Mentha piperita., cu varietățile rubescens și palescens. În România pe speciile Mentha piperita și arvensis s-au efectuat cercetări amănunțite, însă cei care s-au ocupat de cercetări s-au axat mai mult pe studiul compozițional, botanic și morfologic urmărindu-se comportamentul speciilor în cultură. Alte specii de mentă (Mentha spicata, suaveolens și rotundifolia) nu au fost introduse în culturi la noi în țară deoarece erau greu de procurat.

CAPITOLUL I: PREZENTAREA GENULUI DE PLANTĂ MENTHA

I.1. CARACTERE GENERALE ALE PLANTELOR DIN FAMILIA LAMIACEAE

Lamiaceae sau Labiatae (vezi figurile 1 și 2) este o familie importantă de plante cu inflorescențe, care este cunoscută și sub denumirea de „ familia de mentă “. În trecut se considera că plante din famila de mentă faceau parte din familia Verbenaceae. Prin anii ’90 studiile filogenetice au arătat că multe dintre speciile de plante care erau clasificate ca făcând parte din familia Verbenaceae aparțineau defapt familiei Lamiaceae. Această confuzie s-a realizat deoarece familiile de plante Verbenaceae și Lamiaceae sunt încadrate în același ordin Lamiales, astfel speciile de plante ce fac parte din aceste familii au unele caractere comune. Familia Lamiaceae are răspandire foarte largă la nivel global și conține în jur de 236 de genuri și între 6900 și 7200 de specii de plante. Genurile de plante cae aparțin acestei familii, conțin multe specii vegetale cum ar fi: Salvia (900), Scutellaria – 360 de specii , Stachys – 300 de specii, Plectranthus – 300 de specii, Hyptis – 280 de specii, Teucrium – 250 de specii, Thymus – 220 de specii, Nepeta – 200 de specii și Vitex – 250 de specii.

Plantele din această familie conțin principii active aromatice incluse în toate organele vegetale existente și sunt folosite din ce în ce mai răspândit sub formă ierburi culinare, precum busuiocul, menta, rozmarinul, salvia, cimbrul, maghiranul, oregano-ul, lavanda sau perilla. Unele dintre acestea sunt arbuști sau arbori, precum tecul și mai rar vița de vie.

Mulți membri ai familiei Labiatae sunt cultivați într-un mod foarte răspândit, nu neapărat pentru calitățile lor aromatice , ci și datorită faptului că sunt ușor de întreținut, fiind unele dintre cele mai simple specii de plante medicinale de cultivat. De asemenea, unele specii sunt crescute pentru frunzele lor comestibile, iar altele sunt crescute în scop decorativ, cum ar fi coleus-ul.

Există și plante care sunt crescute pentru importanța lor alimentară, dar în loc de frunze sunt utilizate semințele acestora, precum chia.

Numele original al familiei este Labiatae, fiind dat de forma florilor care au petale unite într-o buză superioară și una inferioară. Cu toate acestea, această denumire este încă considerată ca fiind una alternativă, iar cea de Lamiaceae este folosită în general de majoritatea botaniștilor.

Frunzele acestor plante apar așezate într-un mod opus, fiecare pereche în unghiuri drepte față de cel anterior (denumit decusat) sau verticilate.

Tulpinile sunt frecvent împărțite în tulpini transversale, dar nu la toate speciile familiei și această caracteristică este deseori găsită în familiile altor plante.

Florile sunt bilateral simetrice cu 5 petale și 5 sepale unite. Acestea sunt deseori bisexuale și verticilate.

Figura 1: Clasificarea științifică, taxonomică a plantelor din familia Lamiaceae

Figura 2: Trăsături morfologice caracteristice ale plantelor din familia Lamiaceae

Importanța terapeutică a speciilor din familia Labiatae este arătată în mod descrescător în urmatorul tabel:

Tabel 1: Exemple de plante cu importanță terapeutică din familia Labiatae

I.2. DESCRIEREA BOTANICĂ A GENULUI MENTHA

Genul Mentha este distribuit în întreaga lume și poate fi găsit în multe medii de viață. Acest gen face parte din familia Lamiaceae, care a fost descoperită, descrisă inițial și numită de biologul Jussieu (1789), care a dat acest nume în latină datorită florilor specifice pe care le au, având o petală inferioară similară.

Plantele din acest gen prezintă denumiri populare diverse, dintre care cele mai uzuale sunt ” borșniță, broastil, camfor, diană, ferent, ghiazmă, giugiuma, ghintă, iarba creață, iarbă neagră, iasmă, izmă bătrânească, izmă bună, izmă de gradină, izmă de leac, izmă de les, mintă, mintă creață, mintă moldovenească, mintă neagră, mintă de gradină, nină de camfor, nintă, nintă rece, piperită, izmă, voiestniță, menta broaștei, mentă creață, izma creață.” în funcție de zona geografică în care crește.

Familia Lamiaceae din care face parte și genul Mentha cuprinde o varietate de plante care au o distribuție destul de cosmopolită, de la regiuni temperate până la cele tropicale, acestea fiind localizate în primul rând în bazinul mediteranean. Speciile acestei familii se pot găsi atât sub formă de ierburi anuale sau perene, dar și sub formă de arbuști și copaci mici. Plantele din Lamiaceae sunt strâns aliate cu cele din familia Verbenaceae și, într-o revizuire recentă a familiei, mai multe genuri au fost transferate la Lamiaceae. Drept urmare, circumscripția Lamiaceae a fost modificată pentru a include opt subfamilii dintre care: Ajugoideae, Chloranthaceae, Lamioideae, Nepetoideae, Pogostemonoideae, Scutellarioideae, Teucrioideae și Viticoideae. Cu toate acestea, peste 47% din speciile familiei Lamiaceae se încadrează în subfamilia Nepetoideae.

Trăsăturile caracteristice ale speciilor din Lamiaceae, inclusiv genul Mentha, includ tulpinile care sunt păstrate în secțiune transversală și florile care sunt bisexuale, zigomorfice, bilateral simetrice, fiind compuse din cinci petale unite și profund lobate și cinci sepale unite; de obicei, petala inferioară este mai mare decât celelalte. În ceea ce privește fructele, acestea sunt uscate și lemnoase, fiind de tip schizocarp sau drupă. Frunzele au aspect distinctiv și sunt așezate opus una față de cealaltă, la nivelul crenguțelor plantelor, sub formă de perechi succesive în unghi drept (adică decusate), cu margini întregi sau lobate, ușor zimțate.

Multe specii din această familie, cum ar fi cele de mentă, au diferite utilizări comerciale importante, fiind folosite pentru producția produselor culinare, farmaceutice sau în industriile pe bază de plante și cele ornamentale.

Taxonomia genului Mentha a fost într-o continuă schimbare, cu peste 3000 de nume de specii de plante publicate încă din 1753, majoritatea acestora fiind sinonime sau având denumiri ce în prezent nu sunt pe deplin acceptate de biologi, adesea referindu-se la modul lor de cultivare. Genul Mentha este distribuit pe scară largă pe toate continentele (cu excepția Americii de Sud și a Antarcticii). Centrele de varietate ale acestui gen care grupează forme spontane și cultivate sunt Europa, Australia, Asia Centrală și Africa de Nord.

Majoritatea speciilor genului Mentha cresc și se dezvoltă cel mai bine în medii umede și soluri umede. Ele pot crește până la 10-120 cm înălțime și se pot răspândi pe o suprafață nedeterminată. Datorită tendinței de a se răspândi necontrolat, speciile de mentă sunt considerate invazive. Plantele de mentă preferă locurile reci, umede, în umbră parțială. Dar, în general, ele tolerează o gamă largă de condiții și pot fi, de asemenea, cultivate în plin soare. Cultivarea mentei s-a extins, extinzându-și amploarea de-a lungul suprafețelor altor plante agricole.

Conform celui mai recent recensământ taxonomic, genul Mentha cuprinde 61 de specii și aproximativ 100 de soiuri și cultivare, împărțite în cinci secțiuni: Audibertia, Eriodontes, Mentha, Preslia și Pulegium. Sistemul taxonomic al acestui gen nu este pe deplin elucidat din cauza variațiilor morfologice puternice, a nivelurilor de ploidie (2n = 2x = 24 cromozomi până la 2n = 6x = 96 cromozomi) și a hibridizărilor, care pot fi realizate între forme spontane și cultivate.

În cadrul genului Mentha s-a sugerat faptul că cele cinci specii de bază, Mentha arvensis, Mentha aquatica, Mentha spicata, Mentha longifolia și Mentha suaveolens au dat naștere la alte 11 specii hibride. Cu toate acestea, Mentha spicata și posibil Mentha longifolia sunt, de asemenea, de origine hibridă și prezintă incongruență nucleară. De asemenea, filogeniile pe bază de ADN din plastidul celular al plantelor, indică ideea că toate speciile enumerate mai sus ar fi putut experimenta de-a lungul timpului, o oarecare extensie a fluxului genic reticulat în timpul evoluției lor.

Biologul Šarić-Kundalić și colaboratorii săi susțin faptul că există o diferențiere a plantelor din genul Mentha în 3 subgenuri, acestea fiind: cele capitatae, cele spicatae și cele verticillatae, denumirile acestora fiind bazate pe caracteristicele de inflorescență specifice ale plantelor din Mentha.

Subgenul capitatae include toate speciile cu inflorescență compactă, asemănătoare unui cap, precum ar specia Mentha aquatica. Subgenul spicatae conține specii cu inflorescență ce prezintă țepi, așa cum sunt Mentha spicata, Mentha longifolia și Mentha suaveolens. Al treilea subgen Verticilatae are doar un singur reprezentant, Mentha arvensis care are o inflorescență împărțită vertical în verticili.

a. Mentha aquatica b. Menta langifolia

c. Mentha spicata d. Mentha avensis e. Mentha rotundifolia

Figura 3: Exemple de specii de plante din genul Mentha

I.3. ÎNCADRAREA SISTEMATICĂ ȘI DESCRIEREA SPECIEI DE PLANTĂ MENTHA PIPERITA VARIETATEA RUBESCENS

Menta sau Mentha piperita este o plantă terapeutică aromatică ierboasă, perenă, din familia Lamiaceae sau Labiatae, ce reprezintă hibridul natural obținut prin încrucișarea speciilor de plante Mentha aquatica (2n = 96 cromozomi), care este originară din Europa septentrională, Mentha spicata (2n = 48 cromozomi) și Mentha rotundifolia.

Figura 4: Clasificarea științifică, taxonomică a speciei Mentha x piperita și aspecte morfologice ale plantei

Numele de gen Mentha este derivat din substantivul propriu grecesc Mintha, reprezentând numele unei nimfe mitice care s-a metamorfozat în această plantă; iar denumirea de specie piperita provine din latinescul piper, însemnând condimentul piper, făcându-se aluzie la gustul său aromat și înțepător. Specia aceasta are mai multe denumiri populare în diferite culturi ale lumii, cum ar fi vilayati pudina în Ayurveda, kara nane, izma și menta în Turcia, izmă de grădină, izmă bună, vaeșniță, mentă și mintă în România, ping în Irak și nana în Iran.

Produsul vegetal al său Menthae folium provine în întregime din variantele cultivate ale speciilor de mentă, fiind în general o plantă de cultură, care poate fi și sălbăticit în unele areale naturale, speciale și protejate prin lege ale țărilor lumii.

Mirosul acestui produs este aromat, caracteristic, care este accentuat în urma frecării, iar gustul său este răcoritor, iute și înțepător.

Această specie prezintă 2 varietăți de cultură importante:

I.3.1 Mentha piperita var. officinalis, forma rubescens

Este supranumită și „Black mint“, fiind cultivată predominant în România.

Aceasta varietate de plantă se caracterizează prin următoarele: prezintă rizom orizontal, lignificat, cu stoloni și are o tulpină înaltă, de 30-100 cm , ramificată, pe care se află nervuri roșii-violacee, având și aceasta o culoare ușor roșiatică. Frunzele sunt de culoare verde-închis, fiind așezate opus unele față de altele și au formă ovată până la lanceolate, sunt pețiolate, lungi de 3-8 cm și late de 1,5-2,5 cm. Acestea prezintă margini inegal acut serate, pe dos există peri tectori pluricelulari mici, setiformi și numeroși peri glandulari de tip labiat, de culoare verde-închis. Florile sunt de tip zigomorfe, de culoare roz-violacee și sunt grupate în pseudoverticile de 5-10 cm. lungime. Ele prezintă caliciul tubulos, cu 10 nervuri proieminente, cu dinți ascuțiți, granduloși, iar corola este glabră, având tubul albicios, de dimensiuni aproape egale cu caliciul și limbul roz, cu 4 lobi, din care unul este mai lat. Androceul lor conține 4 stamine, fiind deobicei mai scurte decât corola, iar ovarul este așezat superior. Iar în ceea ce privește fructele, ele au formă de tretanucule ovoidale și sunt lucioase, de culoare brună, grupate câte 4 și acoperite persistent cu caliciul. Acesta se cultivă pe soluri ușoare, afânate, fertile de luncă, luto-nisipoase, cu apa freatică la mică adâncime, în România, mai ales în Câmpia de Vest, Câmpia Olteniei, Câmpia Burnazului, Câmpia Bărăganului, Câmpia Dobrogei, în zone din Țara Bârsei, în sudul și centrul Moldovei (Județele Bacău, Neamț, Galați, Vrancea), dar și în alte state ale Europei (cele nordice, cele balcanice și Marea Britanie) și de SUA. Perioada de recoltare este în perioada iunie-august (septembrie) în timpul înfloririi, iar organele vegetative sau cel reproducător folosite în scop terapeutic sunt reprezentate de frunzele (Menthae folium) și părțile aeriene ale plantei (Menthae herba).

Figura 5: Aspecte morfologice ale speciei Mentha piperita var. officinalis, forma rubescens

I.3.2 Mentha piperita var. officinalis, forma palescens

Această variație de mentă prezintă și denumirile de „mentă franțuzească“ sau de „White mint“ .

Figura 6: Aspecte morfologice ale speciei Mentha piperita var. officinalis, forma palescens

Planta prezintă în mare parte aceleași trăsături morfologice, caracteristice ca ale altor specii de mentă (inclusiv ca cele aparținând variației rubescens), cu deosebirea că tulpinile, frunzele și nervurile au culoare verde-pal, iar florile acestora sunt de culoare albă. Și, de asemenea, se recoltează în aceeași perioadă de timp și se cultivă în condiții similare cu variația rubescens, fiind răspândită în multe țări de pe continentele Europa și America (găsindu-se îndeosebi în câmpiile din Franța sau în regiunea Mitcham din Marea Britanie), iar uneori se găsește crescută într-un mod sălbăticit.

I.4. UTILIZĂRI FITOTERAPEUTICE ȘI DIVERSE ALE SPECIILOR DIN FAMILIA MENTHA

Dintre toate plantele ierboase, menta este una dintre cele mai revigorante și mai stimulatoare a tonusului energetic, fiind considerată „planta care învie spiritul“. Încă din Antichitate menta a fost și este îndrăgită și folosită destul de frecvent atât datorită aromei sale unice, cât și pentru gustul specific foarte răcoritor și ușor înțepător și pentru puterea sa ridicată de a vindeca. De accea, menta este utilizată atât în scopuri medicale, cât și în domeniile cosmeticii, aromaterapiei și alimentației sau cu diferite alte scopuri.

Din punct de vedere terapeutic, menta este folosită în tratamentul afecțiunilor gastro-intestinale și digestive, ce pot include mai multe tipuri de simptome sau manifestări generale sau specifice precum diverse forme de dureri abdominale (crampe, colici, etc.), meteorism, discomfortul canalului biliar, dispepsie, enterită, flatulență, gastrită, aciditate gastrică, aerofagie, colici intestinale și spasme ale canalului biliar, a vezicii biliare și tractului digestiv. Aceste utilizări se datorează acțiunilor spasmolitice, anestezice locale, carminative, antiseptice și coleretice, determinate de componentul chimic principal al produselor vegetale pe bază de mentă, mentol. De aceea, izma bună îmbunătățește funcțiile digestive ale organismului. În ceea ce privește acțiunea spasmolitică a plantei, aceasta este explicată de efectul de relaxare a musculaturii netede de la nivelul tubului digestiv, fiind determinată atât de principiul activ, mentol, dar și de alte substanțe chimice terapeutice conținute. De asemenea, produsele terapeutice pe bază de mentă (medicamente, ulei volatil dizolvat în apă aromatică) sunt utile în ameliorarea și vindecarea stărilor de greață (mai ales la gravide) și de vomă datorită efectelor antiemetic și antidiareic pe care le prezintă mentolul și taninurile din compoziția chimică a acestora.

Cu toate acestea, spectrul de activități medicale ale mentei este mult mai complex. Menta poate avea efecte lipolitice, folosindu-se pentru menținerea în limite normale a greutății corporale și mai ales în tratamentul obezității.

De asemenea, poate fi utilizată și în igiena orală, a cavității bucale și a dinților, prevenind afecțiunile buco-dentale. Astfel, pudra de frunze de mentă a fost folosită mult timp în perioada Evului Mediu pentru albirea dinților. Frunzele proaspete de mentă sunt utilizate pentru tratamentul unor arsuri ale gurii prin mestecarea lor, iar sub formă de decoct este folosit realizarea de spălături bucale pentru a se reduce durerile gingivale. Unele studii au demonstrat că extractul din frunzele de mentă contribuie direct la prevenirea cariilor și a plăcii dentare, prin crearea unui mediu nevaforabil dezvoltării bacteriilor. Mai mult, prin aplicarea de produse terapeutice locale pe bază de mentă pe gingiile copiilor între 1-3 ani poate ajuta la curățarea și protejarea dinților, iar aceste produse pot fi folosite și pentru adulți în cazul tratării unor afecțiuni dentare specifice (gingivită, parodontită). De aceea, izma este utilizată pentru producerea de paste de dinți, proteze dentare sau ape de gură, ce corijează mirosul urât al halenei, împrospătează respirația, realizează cu succes igiena orală și a dinților.

Menta, datorită mentolului existent la nivelul extractului din frunze sau uleiului volatil, prezintă efecte antipruriginoase, astfel utilizată sub forma preparatelor topice, este utilă pentru diminuare pruritului și reducerea secreției mucoaselor.

Izma se poate asocia alături de suplimente alimentare pe bază de Ca2+ și vitamina D3 deoarece are efect de întărire a oaselor, fiind utilă în tratarea durerilor reumatice, articulare sau osoase.

Ceaiul (infuzia) de mentă prezintă pe lângă acțiunile tipice tratamentului afecțiunilor gastro-intestinale, și acțiuni diuretice, putând fi folosit în tratamentul bolilor ușoare de la nivelul aparatului genito-urinar. Acest produs, la fel ca uleiul volatil de mentă, prezintă efecte antimicrobiene bune (antibacteriene, antifungice și activitate asupra virusului herpes), putând fi folosită pentru tratamentul răcelilor, gripei și a altor afecțiuni infecțioase respiratorii, inclusiv a simptomelor specifice reprezentate de constipație, febră și slăbiciune generală. Ceaiul se prepară deobicei prin tratarea la cald a 1,5 g produs vegetal mărunțit cu 150 ml apă fiartă, produs aflat în repaus timp de 10 minute în vas acoperit, urmată apoi de filtrare. Ar trebui să se bea o ceașcă de infuzie proaspăt preparată și caldă, de 3-4 ori pe zi, între mese, pentru ameliorarea și vindecarea bolilor gastro-intestinale și pentru stimularea miocardului (efect cardiotonic), infuzie rece înainte de mese, pentru efectul antiemetic, și sub formă de ceai cald administrat de 1-2 ori pe zi, după mese, pentru tratamentul răcelii.

Planta se poate folosi sub formă de infuzie (ceai) ce poate fi administrată ca atare sau sub forma unor combinații (ceai gastric, antidiareic, hepatic), sub formă de extracte ale drogului Menthae folium sau de ulei volatil sau componente ale acestuia în preparate medicamentoase industriale, pentru efecte colagoge și benefice biliar ( Rowachol, Colebil, etc. ), pentru tratarea problemelor digestive (Ulcerotrat, Gastricard, etc.), hepatice, hipnotic-sedative ( Esberi-Nervin ) și respiratorii ( Inhalant, Mentorin ). Toate formele de produse vegetale terapeutice prezintă o acțiune comună de relaxare a sfincterului esofagian, cu echilibrarea presiunii între stomac și esofag.

Fiecare specie din genul Mentha are propriile sale acțiuni și indicații terapeutice, care unele pot fi comune între ele, acestea fiind trecute în următorul tabel:

Tabel 2: Indicațiile terapeutice ale diferitor specii de mentă, în funcție de diferitele zone ale lumii

Izma, pe lângă multiplele efecte fitoterapeutice pe care le deține, prezintă și alte proprietăți de altă natură, precum cele culinare. De aceea, egiptenii în perioada antică foloseau această plantă pentru aromatizarea mâncărurilor și a vinului. În prezent, mai multe țări din Orientul Mijlociu și Îndepartat, cu preponderență în rândul celor arabe, utilizează menta pe post de condiment al produselor alimentare reci sau calde. Astfel, planta se folosește în combinație cu roșiile, cartofii, morcovii, precum și în dressing-urile salatelor de fructe. Aceasta determină aromatizarea deserturilor de fructe, iaurturilor, diferitelor băuturi răcoritoare sau dulciuri(ciocolata), dând o anumită senzație plăcută și puternică de prospețime.

Frunzele de mentă, deoarece au o aromă puternică, sub formă de extracte dizolvate în soluții se utilizează pentru îndepărtarea șoarecilor, ale altor animale dăunătoare, precum și a insectelor nedorite(țânțari, muște, furnici, albine și viespi), putând fi folosite și ca neutralizante de miros.

Planta aceasta este, de asememea, mult întrebuințată pentru producția industrială a produselor cosmetice, dermato-cosmetice și de îngrijire corporală, precum loțiuni, geluri, creme de corp sau de față, deodorante, șampoane sau geluri de duș datorită efectului său răcoritor și pentru beneficiile aduse trupului.

CAPITOLUL II: ULEIURILE VOLATILE-GENERALITĂȚI ȘI METODE DE OBȚINERE

II.1. GENERALITĂȚI

Uleiurile volatile sunt produși ai metabolismului secundar vegetal secretați de celule specializate în acest scop, fiind un amestec de constituienți lipofili volatili ( solubili în grăsimi) cu proprietăți terapeutice, majoritatea lor fiind repartizați în diferite organe precum frunzele, parțile aeriene (tulpinile), rizomi, fructe, semințe, lemnul tulpinilor sau în țesuturile de scoarță. Însă se pot găsi și în unele ciuperci producătoare de lactone sesquiterpenice azulonegene (Bazidiomycete) și sesquiterpene volatile (Ascomycete), în alge ce elaborează sesquiterpene halogenate și în plantele Bryophitae specializate în lactone sesquiterpenice.

Uleiurile esențiale sunt depozitate în vacuole, pungi sau canale secretorii sau în peri glandulari, sub formă de lichide uleioase, volatile, care au miros plăcut și aromat. Deși uleiurile esențiale sunt puțin solubile, solubilitatea apoasă a componentelor individuale variază în funcție de polaritate (activitatea magnetică).

În general uleiurile esențiale sunt substanțe cu mai multe grupe polare cu solubilități diferite.

Definiția specifică a uleiului volatil poate fi un subiect de discuție între persoanele interesate de domeniul lor, inclusiv de oameni de știință, persoane specializate în aromaterapie sau oameni obișnuiți. De aceea, Organizația Internațională pentru Standardizare (ISO) definește un ulei volatil ca fiind un „ produs obținut din materie primă natural fie prin distilare cu apă și abur, fie din epicarpul citricelor prin prelucrare mecanică, fie prin distilare uscată. “

Cea mai acceptată denumire a produselor uleioase este cea de „ uleiuri volatile “ deoarece proprietatea de volatilitate este specifică uleiurilor la temperatura camerei (20-25 oC). Alte denumiri pe care aceste tipuri de ulei le pot avea sunt în general improprii, astfel: termenul de „esențe“ sau „uleiuri esențiale“ se aplică tuturor principiilor mirositoare degajate de substanțe, iar cel de „uleiuri eterice“ caracterizează doar amestecurile de eteri sau de substanțe volatile care prezintă în compoziția lor și alți constituienți care nu fac parte din clasa chimică a eterilor. Uleiurile volatile se diferențiază de cele grase prin utilizarea denumirilor în limba latină, aetherolea pentru cele descrise dintâi și olea pingun pentru cele din urmă.

Aromaterapia reprezintă folosirea plantelor medicinale ce conțin uleiuri volatile, cunoscute și sub denumirea de plante aromatice sau doar a acestor uleiuri extrase din plante, cu scopul de ameliorare sau de vindecare a bolilor infecțioase și psihice. Acest tip de terapie se practică de mii de ani și a evoluat în mai multe etape de dezvoltare.

Plantele aromatice se foloseau la început mai mult sub formă prezenței substanțelor mirositoare de care este legată de noțiunea de acțiune terapeutică.

Acțiunile terapeutice au început prin: infuzii (ceaiuri), decocturi sau fumigații, iar apoi prin vinuri din plante – obținute prin macerare sau digestie și uleiuri vegetale obținute prin distilare .

Perioada modernă este bazată pe cunoașterea multor aspecte legate de constituenții chimici ai uleiurilor esențiale în ceea ce privește activitatea lor chimică, biochimică, fizică și terapeutică.

Țara din lume cu cea mai bogată floră medicinală este India, unde mai mult de 7 milioane dintre indieni cunosc si utilizează apele aromatice extrase din plante.

Parfumurile erau folosite destul de mult în trecut atât pentru ceremoniile religioase (busuiocul, una dintre plantele folosite în majoritatea procesiunilor religioase ale multor credințe, este considerat sacru în India), cât și în medicină (fiind recomandate atât în tratamentul afecțiunilor corporale, cât și celor spirituale).

Brahmanii au adunat de-a lungul timpului rugăciuni adresate plantelor terapeutice între anii 2000-1500 î.Hr. în Rig-Veda și printre acestea, sunt înscrise și multe preparate pentru băi și masaje în care intră coriandrul, scorțișoara, mira, cardamomul, ghimbirul și alte numeroase plante. În Pakistan s-a descoperit un alambic de pământ ars, confecționat în anul 5000 î.Hr., reprezentând o dovadă a obținerii uleiurilor volatile și apelor aromatice sub forma unor preparate alcoolice prin distilare. O inscripție descoperită în Mesopotamia, având peste 4000 de ani, menționează utilizarea uleiurilor volatile în ceremonii religioase și în combaterea epidemiilor. Pentru tratarea bolilor psihice și îndepartarea epidemiilor, în Babilon s-au folosit fumigații de chiparos și diferite alte plante aromatice existente în flora proprie a statului respectiv.

II.2 METODE DE OBȚINERE A ULEIURILOR VOLATILE

Uleiurile volatile se pot obține prin diverse metode de extracție din produse vegetale, care se aleg în funcție de cantitatea de ulei volatil conținute de acestea, de localizarea uleiului în organele plantei și de proprietățile fizico-chimice ale uleiurilor, îndeosebi volatilizarea la presiunea atmosferică și temperatură normală, precum și solubilitate în solvenți volatili neapoși și în substanțe grase.

Procedeele principale de extracție a uleiurilor sunt:

distilarea și antrenarea cu vapori de apă;

extracția cu solvenți apolari volatili;

extracția cu grăsimi lichide sau solide (solvenți nevolatili);

extracția cu gaze supercritice;

presarea.

În ceea ce privește produsele vegetale ce pot fi folosite pentru extracție, acestea pot fi atât uscate, cât și proaspete, fragmentate sau întregi (frunze, ierburi), concasate (organe subterane) sau sub formă de rumeguș (precum lemnul).

II.2.1 Distilarea simplă cu vapori de apă în circuit închis

Reprezintă cea mai ușoară metodă de extracție a uleiurilor volatile, principiul metodei constând în fierberea produsului vegetal mărunțit cu apă (adus într-un vas de distilare) și distilarea uleiului împreună cu aceasta. Din hidrodistilat, ce reprezintă dispersia ulei volatil/apă, este separat uleiul de la sine, după care este necesară un repaus de 24-48 de ore, colectarea acestuia fiind realizată în vase florentine. De asemenea, separarea uleiului se mai poate face și prin intermediul procedeului de salefiere cu NaCl crescând densitatea mediului de dispersie și grăbindu-se separarea uleiului volatil, fiind urmată de extracție cu solvent polar. Legat de vasele florentine, acestea reprezintă tipuri de recipiente cu tub lateral în partea superioară sau inferioară, în funcție de densitatea supra-sau subunitară a uleiurilor. Această metodă, cu toate că este simplă, are o serie de dezvantaje ce influențează negativ calitatea unui ulei esențial. Astfel, compușii volatili obținuți se carbonizează datorită temperaturii crescute, esterii pot hidroliza, hidrocarburile se pot cicliciza, iar alcoolii, aldehidele și cetonele se pot oxida. De asemenea, se pot realiza racemizări sau izomerizări și antrena și alți compuși volatili (precum cumarinele), ce nu fac parte dintre constituienții uleiului volatil.

Cea mai veche descriere autentică a unui ulei volatil obținut printr-o metodă asemănătoare cu cea a distilării simple a fost realizată de Arnald de Villanova undeva la sfârșitul secolului XII sau începutul secolului XIII ( 1235–1311 d.Hr. ). Înainte de aceasta totuși, au fost descrise de vechii romani și greci, în primul secol d.Hr., detalii privind existența unei prime forme primitive de distilare folosită pentru a se obține terebentina și camforul .

Figura 7: Exemplu de aparat de distilare simplă pentru extracții și componentele sale

Cu toate astea, deoarece nu s-a mai extras niciun alt ulei esențial în acest mod în acea perioadă, nu este încă sigur dacă acele detalii pot fi considerate ca fiind dovezi palpabile ale extracției de ulei esențial la acea vreme. Deși există semne clare că a fost folosită o formă de tehnologie de distilare primitivă începând cu anul 400 î.Hr. (aparat de distilare cu teracotă, acum păstrat în Muzeul Taxila din Pakistan) până în secolul al IX-lea, această metodă a fost în primul rând folosită pentru realizarea de apă distilată, în care se găseau deseori uleiuri esențiale fracționate, cum ar fi camforul ca produs secundar. Folosind o astfel de hidrodistilare primitivă, apele distilate sau „hidrosolii” puteau fi obținute fără nici o dificultate, dar uleiurile esențiale intacte nu ar putea să fie separate de ape fără un sistem modern, ce utilizează metode care permit răcirea aburului la temperaturile mai mici necesare. Astfel, numai uleiul esențial ar putea fi păstrat sub formă de componente cu puncte de fierbere mai mari, cum ar fi camforul. Tehnologia de distilare a fost îmbunătățită în secolul al IX-lea de oamenii de știință arabi din acel timp, dar din nou, nu este clar dacă într-un mod veridic au folosit această tehnologie pentru producerea în mod deliberat de uleiuri volatile sau dacă s-a pus accentul doar pentru obținerea de ape aromatice.

II.2.2 Distilarea în circuit închis cu aparat Neo-Clevenger

Prin acest tip de distilare se poate obține într-un mod direct orice ulei volatil. Iar pentru uleiurile volatile vâscoase sau mai dense ca apa, colectarea lor se poate efectua într-un solvent apolar nevolatil, cu densitate mică (toluen, xilen).

Metoda aceasta poate fi folosită și pentru a determina conținutul în ulei volatil al produselor vegetale.

II.2.3 Antrenarea cu vapori de apă în circuit deschis

Este o metodă care constă în trecerea de vapori de apă care obținuți într-un generator, peste organul vegetal terapeutic mărunțit, ce este amplasat într-un recipient încălzit. Se va obține astfel un hidrodistilat, iar din acesta se va separa ulei volatil, care este superior calitativ celui obținut prin distilare, prin tehnicile prezentate anterior la distilarea cu vapori de apă în circuit închis ori prin centrifugare sau alte procedee (cohobația). Cohobația reprezintă distilarea repetată a hidrodistilatelor până când se separă uleiul volatil.

II.2.4 Extracția cu solvenți apolari

Tipul acesta de extracție se practică pentru produsele vegetale ce au un conținut scăzut de ulei volatil sau când uleiul este ușor alterabil. În mod curent pentru extracție se folosesc solvenți așa cum sunt hidrocarburile alifatice (hexan, eter de petrol, propan sau butan lichid) și uneori derivații halogenați ai metanului și etanului (cei clorurați și fluorurați). Iar pentru purificare se folosește în general alcoolul etilic.

Dezavantajul procedeului descris mai sus îl reprezintă lipsa de selectivitate, astfel alături de uleiul volatil se extrag și alți compuși lipofili (așa cum sunt substanțele grase, fosfolipidele, carotenoidele, rezinele, alcaloizii, agliconii, etc.).

Se pot folosi ca aparatură de laborator aparate Soxhlet sau aparate de refluxat, iar în industrie se utilizează extractoare metalice de inox ce sunt prevăzute cu manta de încălzire, vană de evacuare a extractului, capac pentru materialul vegetal, coș pentru sită de sârmă unde ajunge produsul vegetal ambalat în saci de pânză, un sistem de introducere și distribuire a solventului și un alt sistem de evacuare vaporilor lichizi înspre refrigerent.

Această metodă presupune realizarea extracției într-un mod simplu, multiplu sau în contracurent.

În urma obținerii extractului, din acesta solventul se va distila, iar reziduul rămas va purta numele de concret, concret solid sau esență concretizată atunci când s-a realizat extracția din plante proaspete sau rezinoid în cazul extragerii din produse uscate. Acesta se va purifica prin solubilizare în etanol și prin răcire la temperaturi foarte scăzute de 10-15 oC pentru a se depune: grăsimile, cerurile, stearoptenul și rezinele. În urma distilării, se va filtra la temperaturi de 40-45 oC până se va ajunge la o anumita concentrație de ulei volatil, iar ceea ce se va obține va purta numele de esență de flori sau extract sau se va ajunge la obținerea uleiului cu denumirea de absolut.

Figura 8: Componentele de bază ale unui extractor Soxhlet folosit pentru extracțiile cu solvenți apolari

II.2.5 Extracția cu solvenți nevolatili

Extracția de solvenți nevolatili se realizeză prin două procedee: macerarea și digestia, în urma cărora se pot extrage grasimile animale, benzoatul de benzil și grăsimile vegetele.

Macerarea produselor vegetale cu grăsimi solide (extracția la rece) se folosește pentru obținerea de uleiuri volatile de cea mai bună calitate(având aplicații practice în industria de parfumuri). Ea este realizată printr-un sistem de sașiuri așezate unul deasupra celuilalt, în stive și plasate în camere răcoroase. Pe fundul de sașiu din sticlă este depus un strat de grăsime solidă, animală sau de sinteză, cu grosimea maximă de 1 cm, peste care se aștern flori proaspete (ce sunt recoltate deobicei înainte de polenizare), ce se lasă la macerat între 12-72 de ore. În timpul acesta aerul din spațiile șasiurilor este saturat în produșii volatili degajați și ei sunt absorbiți de stratul de grăsime și astfel atmosfera devine nesaturată ce va permite degajarea de cantități noi de compuși volatili. În final se instalează un echilibru ce corespunde epuizării produsului vegetal. Extracția se realizează în urma difuziunii spre corpul gras.

Digestia sau extracția la cald presupune să fie făcută imersia produsului ambalat în saci de pânză, în recipiente cu dizolvanți specifici ca uleiul vegetal, grăsimea de animal sau alți solvenți uscați, deprotenizați la temperaturi între 60-70 oC, timp de 12-24 de ore. Extractul care se va obține va purta numele de pomadă florală.

II.2.6 Extracția cu gaze supercritice

Aceasta metodă constă în utilizarea CO2 lichid ca solvent, fiind un produs natural, inert din punct de vedere chimic și neinflamabil. Astfel poate determina obținerea de extracte ce prezintă o compoziție cat mai apropiate de produsele naturale și este permisă o separare selectivă, în funcție de temperatură și de presiune. Tipul de extracție bazat pe gaze supercritice, în stare de agregare lichidă s-a dezvoltat foarte mult în ultimul timp, aplicându-se pentru obținerea de esențe picante (paprica), de uleiuri esențiale și arome, deterpenate sau ce nu conțin anumiți substituenți, cum este cazul esenței de Absinth fără tuionă. Se poate folosi în același scop și azotul lichid, metoda extinzându-se în ultimul timp și asupra altor fluide supercritice.

II.2.7 Extracția prin metode mecanice, de presare

Metoda presării manuale sau hidraulice pentru extracție se aplică tuturor produselor vegetale roaspete care au un conținut crescut de ulei volatil, așa cum este de exemplu pericarpul fructelor citrice din speciile de plante ale familiei Rutaceae. În urma folosirii acestei metode se obține un amestec de suc celular și ulei volatil, care se separă prin decantare, urmată apoi de deshidratare( pe NaSO4 sau CaCl calcinată ) și într-un final filtrare.

În ceea ce privește uleiurile volatile preformate care se găsesc sub formă de glicozide, acestea se extrag prin antrenare cu vapori de apă sau distilare, în urma supunerii la fermentație sau hidroliză enzimatică în prealabil. Uleiurile volatile decantate se vor supune unor operații de decolarare, de neutralizare și rectificare.

II.3 COMPOZIȚIA ULEIURILOR VOLATILE

Deși în principiu toate organele plantelor cu principii aromatice conțin uleiuri volatile, compoziția acestora variază foarte mult în funcție de organul în care se află. Un exemplu concludent ar fi specia de portocal amar cu denumirea științifică de Citrus aurantium, din care se pot obține 3 tipuri de ulei volatil: esență de Curaçao (Aurantii aetheroleum), prin realizarea presării pericarpului proaspăt, esență de de Neroli (Neroli aetheroleum), în urma distilării cu vapori de apă a florilor imature și esență de portocal amar („ petit grain “), prin distilarea cu vapori de apă a frunzelor, ramurilor și fructelor imature proaspete. Compoziția acestor uleiuri este diferită datorită organelor diferite în care se găsesc.

Conținutul în ulei volatil al plantelor aromatice se situează în general în jurul valorilor de sub 1%, rareori putând atinge până la 15% sau chiar mai mult, în produsul vegetal uscat al speciei de plantă Eugenia caryophillus.

Uleiurile volatile se găsesc sub formă de amestecuri complexe (5000-7000 constituienți chimici), în care se află în concentrațiile cele mai ridicate amestecurile monoterpenice și sesquiterpenice, dar și compuși aromatici, dintre care cele fenil-propanice într-un mod frecvent;

Substanțele care se întâlnesc foarte rar în uleiurile volatile sunt diterpenele (precum sclareol din Salcia sclarea). În ceea ce privește compușii terpenici, aceștia pot fi hidrocarburi, derivați oxigenați (așa cum sunt oxizii, acizii, cetonele, alcoolii, aldehidele) sau produși de reacție ai acestora (esteri, eteri).

Dintre compuși, alcoolii monoterpenici există de obicei sub formă liberă sau esterificată în uleiurile volatile pe care le conțin. S-au izolat în ultimul timp o serie de derivați fenil-propanici sub formă heterozidică (așa cum sunt glucozidele ale nerolului, ale eugenolului, geraniolului, acidului neric și celui geranic) sau monoterpenoide în Mellisa officinalis, Hyssopus officinalis și în specii de plante ale genului Mentha, dar și esteri iridioici, care sunt întâlniți sub formă glicozidată.

Principalele clase de uleiuri volatile care se găsesc în organele plantelor aromatice sunt descrise mai jos.

II.3.1 Monoterpenele (derivați de 3,7-dimetiloctan) – vezi figura 9

Figura 9: Structuri chimice ale hidrocarburilor monoterpenice conținute de uleiurile volatile

Monoterpenele pot fi clasificate în:

Hidrocarburi nesaturate – reprezintă constituienți aproape constanți ai uleiurilor volatile și pot fi de tip aciclic (ocimen, mircen, allo-ocimen) sau ciclic, dintre care: monociclice: (+) și (-) limonen, (+) limonen=dipenten, α- și γ-terpinen, α- și β-felandren, p-cimen; și biciclice: α- și β-pinen, camfen, caren, sabinen (valențele libere corespund radicalilor –CH3 sau –CH2–);

Aldehide (vezi figura 11) – ele pot fi: aciclice (geranial, neral, netral);

Cetone (vezi figura 11) – pot fi: aciclice (tagetonă, mircenonă, ocimenonă) și ciclice, dintre care: monociclice (mentonă, piperitonă, pulegonă, carvonă) și biciclice (camforă, verbenonă, pinocamfonă, pinocarvonă, tuionă, fenchonă);

Acizi – ei pot fi: aciclici (citronelic, geranic);

Peroxizi (vezi figura 11) – ca ascaridiolul;

Alcooli (vezi figura 10)- aceștia pot fi: aciclici (geraniol, nerol, citronelol, linalol) și ciclici astfel: monociclici (mentol, piperitol, α-terpineol, terpinen-1-ol-4) și biciclici (borneol, mirtenol, tuiol, sabinol, fenchol).

Figura 10: Structuri chimice ale alcoolilor monoterpenici conținuți de uleiurile volatile

Eteri – precum 1,4- și 1.8-cineol, mentofuran și linalol-oxid;

Esteri – substanțe ce se clasifică în aciclici (acetat sau propionat de linalil, acetat de piperitil), iar alții sunt biciclici (acetat sau izovalerianat de bornil sau izobornil, acetat de mirtenil).

Figura 11: Structuri chimice ale aldehidelor și cetonelor monoterpenice și ale oxizilor și peroxizilor conținuți de uleiurile volatile

II.3.2 Sesquiterpenele (vezi figura 12)

Sesquiterpenele pot fi clasicate în:

Hidrocarburi – constituienții aceștia pot fi: aciclice (α-, β-farnesen) și ciclice, precum: monociclice (α-cadinen, β-cariofilen);

Alcooli – ei pot fi: aciclici (farnesol, nerolidol) și ciclici, astfel: monociclici (bisabolol, elemol), biciclici (β-santalol, guaiol, carotol) și triciclici (viridiflurol, cedrol, globulol, patchulol, vetivenol, spatunelol);

Cetone – așa cum este: β-vetivona;

Aldehide – ca: sinesali ;

Oxizi – α-bisabolol-oxid de A și B;

Esteri – acetat de edril.

Figura 12: Structuri chimice ale compușilor sesquiterpenici conținuți de uleiurile volatile

II.3.3 Compușii aromatici

Compușii chimici aromatici sunt mult mai răspândiți decât compuși terpenolici și se găsesc sub formă de alil sau propenil-fenoli (uneori aldehide, cetone sau acizi specifici uleiurilor volatile din Apiaceae și Araceae, unele specii din Lauraceae, Myristicaceae și Lamiaceae) și mai rar sub formă de hidrocarburi cu atomi de carbon din seria C1-C6 (antranilat de metil, aldehidă și acid anisic).

Fenoli – din care fac parte: timol, carvacrol (din seria terpenoidelor), eugenol și chavicolul (din seria fenil-propionică);

Eteri și oxizi – precum: apiol, safrol, miricistină;

Aldehide – ca: cuminaldehida (din seria terpenoidelor), anisaldehida (ce face parte din seria de hidrocarburi C1-C6) și cinaldehida (din seria C3-C6);

Cetone – așa cum este cetona anisică;

Acizi – acid cinamic și cel anisic;

Fenoli metil-eteri – aceștia fiind timol și carvacrol metil-eteri (ce fac parte din terpenoidică), izoanetol, anetol, eugenol metil-eter, izoeugenol metil-eter, chavicol metil-eter (estragol), azaronă și elemicină (făcând parte din seria fenil-propanoică).

1.3.4 Substanțe chimice diverse

Uleiurile volatile mai pot conține, în funcție de modul de extracție, diferiți compuși alifatici cu masă moleculară mică, care se pot distila cu apă precum: alcooli, aldehide, cetone, senevoli, lactone, esteri, acizi cu 3-10 atomi de carbon și hidrocarburi (lineare sau ramificate, saturate sau nesaturate).

CAPITOLUL III. CONSTITUENȚII SPECIILOR DE MENTĂ – MENTHA PIPERITA VARIETATEA RUBESCENS

III.1. ULEIUL VOLATIL DE MENTĂ (MENTHAE AETHEROLEUM)

În frunzele de mentă (Menthae folium) se găsesc mai multe clase și tipuri de componenți chimici, fitoterapeutici, dintre care cel mai important component din conținutul acestor produse vegetale este uleiul volatil (care se găsește în proporție de 0,5-4%), a cărei compoziții chimice diferă în funcție de o serie de factori interni și externi precum: soiul de mentă, provienență, varietate, condițiile pedoclimatice existente pentru îngrijirea plantei medicinale și momentul recoltării sale (astfel în cele mai multe cazuri, dacă prima recoltare s-a făcut în al 2-lea an de vegetație, atunci produsul vegetal reprezentat de frunze va determina obținerea celui mai bun ulei volatil din punct de vedere calitativ și cantitativ, extras din acesta vreodată).

Principalele clase de principii active care se găsesc în compoziția uleiului volatil de mentă sunt reprezentate de: compușii terpenici, dintre care monoterpenele se găsesc în proporție de 52%, iar sesquiterpenele în proporție de 9%; aldehide (9%), hidrocarburi aromatice (9%), lactone (7%), alcooli (6%) și diverse alte substanțe (8%). În ceea ce privește conținutul sesquiterpenelor, acesta poate să crească în situația în care menta ar fi supusă unui stres intens în timpul cultivării acesteia, iar sesquiterpenul principal, aflat în concentrația cea mai mare este β-cariofilena (1,6-1,8%).

Din clasa compușilor terpenici, cel mai important component din punct de vedere cantitativ și terapeutic este mentolul (35-60%), fiind urmat de mentona (2-44%), acetat de mentil (0,7-23%), 1,8-cineol sau eucaliptol (1-13%), menthofuran (0,3-14%), izomenton (2-5%), neomentol (3,4%) și limonen (0,1-6%).

În următorul tabel sunt publicate compozițiile chimice ale uleiurilor volatile, ce aparțin diferitelor specii de mentă existente la nivel mondial, în perioada actuală:

Tabel 3: Compoziția chimică a uleiurilor volatile ce aparțin diferitelor specii de mentă descrise în literatura de specialitate, din diferite țări ale lumii

La nivel global, uleiurile esențiale de mentă sunt considerate printre cele mai importante și mai valoroase uleiuri, iar valorile lor depășesc, de exemplu, 400 de milioane de dolari în SUA. De aceea, sunt cultivate mai multe specii de mentă în intreaga lume. Iar fiecare ulei volatil extras din organele vegetale ale diferitelor specii de izmă este special datorită conținutului lor diferit de principii active între acestea. De exemplu, Mentha canadensis produce ulei volatil bogat în l(-)-mentol, în timp ce Mentha pulegium produce un ulei deosebit, cu denumirea de „ulei de busuiocul cerbilor“, care este bogat în pulegoni.

Uleiul esențial de mentă (Menthae aetheroleum) se caracterizează, astfel, printr-un conținut de principii active variabil, care este dependent atât de momentul de recoltare a frunzelor în cadrul perioadei de vegetație, de ora de zi (modificările în compoziție putându-se realiza datorită unor variații circadiene), dar și de gradul de iluminare la care au fost expuse. În condiții de iluminare scăzută, menta va sintetiza predominant mentofuranul și pulegona, iar în cazul condițiilor de iluminare prelungită se va realiza o sinteză de mentol și de esteri ai mentilului de catre organele vegetale ale plantei. În cazul existenței unei concentrații prea mari de mentofuran va fi scăzută calitatea uleiului volatil, astfel i se va conferi un gust amărui. De asemenea, și conținutul prea ridicat de esteri de mentil și a unei foarte mici de jasmonă va afecta calitățile olfactivo-gustative ale uleiului volatil (gustul și mirosul).

Există cazuri speciale în care conținutul uleiurilor volatile ale organelor vegetative din care se extrag variază în funcție de vârsta plantelor astfel: în frunze tinere se găsesc în cantități ridicate mentona, mentofuranul și pulegona, iar în cele mature sau vârstnice acetatul de mentil și mentona.

Un ulei esențial de mentă care poate fi considerat de bună calitate trebuie să îndeplinească o serie de criterii precise cu privire la gust, miros și alte aspecte importante ale uleiului precum:

un conținut crescut de mentol (40-45%);

un raport cât mai convenabil între mentol și mentilesteri (de 5:1 sau de 6:1);

un conținut scăzut de mentonă (10-20%) și nu mai mult de 40%;

un conținut sub 5% în mentofuran;

lipsită de pulegonă și carvonă.

Mentolul, principalul element activ al uleiului, se găsește sub formă cristalizată, fiind obținută prin extracție din uleiurile esențiale ce conțin o cantitate crescută de acest compus terpenic, prin răcire la temperatură foarte joasă de -22 oC, prin semisinteză sau prin sinteză totală. Acesta poate fi natural, sub formă levogiră, sau sintetizat din pulegonă, timol, mentonă, piperitonă, pinen sau citronelal, sub formă racemică.

Figura 13: Compușii terpenolici conținuți de uleiul volatil de mentă

Uleiul volatil de mentă se caracterizează prin faptul că prezintă multe proprietăți farmacoterapice, de aceea este utilizată pentru diferite întrebuințări terapeutice. Acesta prezintă acțiuni spasmolitice, carminative, coleretice, antiseptice, analgezice, antiinflamatoare și anestezice locale, mai ales datorită prezenței în cantitate ridicată în compoziția chimică a mentolului.

Acțiunea sa spasmolitică este explicată datorită efectului de relaxare a musculaturii netede de la nivelul tubului digestiv, fiind datorată atât mentolului, cât și celorlalte substanțe active, componente ale uleiului esențial. Datorită acestei acțiuni, dar și a celor carminative și coleretice, uleiul volatil de mentă este utilizat sub forma diferitelor preparate farmaceutice, orale, pentru tratamentul discomfortului crampelor abdominale, a celor menstruale, în sindromul colonului iritabil, în disfuncții ale canalului biliar și diferite alte afecțiuni gastro-intestinale. Având acțiune antiseptică, antipruriginoasă și antimicrobiană (fiind antibacteriană, antifungică și antivirală asupra virusului herpetic), produsul aromatic este utilizat sub forma unor creme sau unguente de uz topic în tratamentul diferitelor afecțiuni dermatologice ale pielii sau a rănilor și arsurilor provocate la nivel local. Iar datorită acțiunii analgezice și antiinflamatoare, uleiul se folosește sub formă de creme de uz extern pentru tratamentul inflamațiilor și durerilor ușoare la nivel muscular.

Uleiul de mentă, prelucrat sub formă de apă de mentă (Aqua Mentae) și făcând parte din compoziția produselor farmaceutice de uz intern, se utilizează în tratamentul stărilor de greață și vărsături, în special al gravidelor, având acțiune antiemetică, care este explicată de cea anestezică locală, la nivelul mucoasei gastrice.

Acest ulei se poate regăsi sub forma preparatelor ORL (instilații nazale, badijonaje) și prezintă efecte de reducere a secrețiilor mucoaselor și decongestionant respirator, fiind astfel utile în ameliorarea simptomelor afecțiunilor din această sferă.

La nivel digestiv, uleiul prezintă și alte efecte benefice, astfel sub forma unor picături sau capsule gelatinoase administrate oral, stimulează peristaltismul intestinal, crește irigarea parenchiumului hepatic favorizând efectul colagog și stimulează secreția biliară. Aceste efecte terapeutice se datorează acțiunii mentolului și mentonei din compoziția uleiului.

Uleiul volatil prezintă și alte întrebuințări decât cele terapeutice, de aceea alături de constituienții săi derivați este folosit ca agent aromatizant la nivel global în industria alimentară, farmaceutică, cosmetică și a tutunului. Astfel, uleiul de mentă prezintă o istorie destul de vastă în ceea ce privește folosirea acestuia pentru îmbunătățirea multor tipuri de produse alimentare, precum cele de cofetărie, de patiserie, bomboane, înghețate, gume de mestecat și băuturi.

III.2. COMPONENTELE CHIMICE SECUNDARE ALE FRUNZELOR DE MENTĂ (MENTHAE FOLIUM)

În frunzele de mentă (Menthae folium) se mai găsesc și alte principii active pe lângă cele principale, precum compușii fenolici, aceștia fiind metaboliți secundari care includ un grup numeros de substanțe medicinale, cu peste 8000 de molecule, dintre care unele mai mici, iar altele mai mari și mai complexe și prezintă cel puțin un inel aromatic cu una sau mai multe grupări hidroxil atașate. Acești compuși apar deseori în frunzele multor specii de mentă precum esterii și glizozidele.

Despre diversele specii din genul Mentha s-au raportat în numeroase studii de specialiate că ar conține o gamă crecută de componente, așa cum sunt acizii cinamici și agliconii lor, glicozizii și/sau flavonoizii acilați. După alte studii, s-a menționat că extractele apoase de mentă (Aqua menthae) obținute din diferite specii, hibrizi, varietăți sau culturi conțin esteri ai acizilor fenolici, derivați ai flavonoidelor, flavonoizi hidroxilați în pozițiile 3 și 5, eritrocitina, luteolin-7-O-glucozida, naringenin-7-O-glucozida, izorhoifolina, eriodictiolul, luteolina și apigenina.

Pe lângă acizii fenolici existenți în compoziția chimică a produsului vegetal, genul de plante Mentha este într-un mod particular bogat în acid cafeic și derivați și acizii clorogenic și rosmarinic, aceștia din urmă reprezentând 60-80% din compușii fenolici conținuți. De asemenea, în unele specii de mentă a fost raportată și existența a 7 acizi salvianolici, precum acidul salvianolic H/I, acidul salvianolic E, acidul salvianolic B și acidul izosalvianolic A (trimeri cafeați).

Plantele din genul Mentha mai sunt și bogate în flavonoizi, în mod particular în flavone și flavanone, dintre care într-un mod particular sunt descriși luteolina și derivații săi. Într-un alt studiu mai vechi, s-ar fi menționat extragerea flavonoizilor lipolitic metilați din frunzele uscate ale speciilor Mentha aquatica, Mentha spicata, Mentha x piperita și Mentha citrata. De asemenea, ar fi

fost identificați 20 de flavonoizi, dintre care 5,6-dihidroxi-7,8,3′,4′-tetrametoxiflavona (pebrelinul) reprezentând flavonoidul major al plantelor Mentha spicata și Mentha piperita, iar 5-hidroxi-6,7,8,4′-tetrametoxiflavona (gardenina B) reprezentând flavonoidul major al plantelor Mentha citrata și Mentha aquatica.

De-a lungul timpului, au fost caracterizate și cuantificate diferite clase de compuși în multe specii de mentă. Astfel, au fost găsite diferite urme de substanțe chimice în specii ca Mentha piperita și Mentha citrata.

Oamenii de știință Maffei și Scannerini au studiat variabilitatea triglicerolului, diaglicerolului și acizilor grași liberi în unele specii de mentă. Ei au găsit un nivel ridicat de acizi grași cu lanț lung, dintre care 3 se găsesc în frunzele plantelor Mentha longifolia, Mentha crispa și Mentha sachalinensis. Cu toate astea, majoritatea componentelor găsite în frunzele de Mentha piperita sunt reprezentate de acizi grași ca cel linoleic, linolenic și palmitic. În plus, recente studii au identificat 2 noi ceramide din extractul metanolic ai speciei Mentha longifolia, acestea fiind longifoamidele A și B.

Triterpenoizii și steroizii au fost, de asemenea, izolați din plante ale genului Mentha. Deci, 2 triterpenozi, acidul ursolic, acidul uvaolic și 3 steroizi reprezențati de formiatul de stigmast-5-en-3-β-il, stigmast-5-en-3-ona și β-sitosterolul s-au izolat părțile aeriene de specie Mentha longifolia, subspecia noeana.

Pe de altă parte, diferiți pigmenți au fost identificare și cuantificate în diverse specii de mentă. Analizele provenite din produsele vegetale de Mentha spicata au relevat prezența pigmenților xantofilici (neoxantina, violaxantina, zeaxantina și luteina), carotenodici(α-carotenul) și clorofilici (clorofilele A și B). Dintre aceștia, carotenoizii ( luteina și izomerii β-carotenului) au fost identificați în frunzele uscate de mentă de grădină și doar luteina a fost găsită și în infuzie (ceai). Iar vitaminele, α-tocoferolii și acidul ascorbic au fost și ele identificate în organele vegetale medicinale de specii de mentă.

CAPITOLUL IV. IPOTEZE DE LUCRU/OBIECTIVE

Este cunoscut faptul că atât conținutul în ulei volatil de mentă, cât și compoziția chimică a uleiului variază de la o specie la alta, precum și în funcție de stadiul de dezvoltare a plantelor sau de tipurile de produse vegetale medicinale, folosite pentru extracția uleiului (frunze uscate sau proaspete).

Având în vedere aceste aspecte, mi-am dorit să realizez prin această lucrare științifică un studiu fitochimic, comparativ al fracțiunilor de ulei volatil extrase atât din produs uscat, cât și din produs vegetal proaspăt, obținute din specia de mentă Mentha piperita varietatea palescens. Pentru acesta, am realizat o analiză fitochimică, calitativă („on screening“) a principiilor active conținute de probele de ulei volatil de mentă, extrase prin metoda antrenării cu vapori de apă (distilării) cu ajutorul aparatului Neo-Clevenger, folosind metoda gaz-cromatografiei asociată cu spectrometria de masă (G-C cu M-S) și metoda de eșantionare a probelor, având denumirea de microextracție în fază solidă (solid-phase microextraction sau SMPE). De asemenea, am înfăptuit și o analiză microscopică și macroscopică a frunzelor de mentă, pentru a identifica particularități farmacognostice, deosebite ale acestor organe de plante și pentru a verifica dacă există deosebiri concludente între diferitele tipuri de produs vegetal (frunze proaspete mature sau aflate la jumătatea dezvoltării lor și frunze uscate), legate de aspectele anatomo-morfologice ale organelor.

CAPITOLUL V. MATERIALE ȘI METODE

V.1. RECOLTAREA PRODUSULUI VEGETAL

Plantele medicinale și aromatice, așa cum este specia de plantă folosită de mine pentru analize fitochimice și farmacognostice, menta de grădină (Mentha piperita varietatea palescens), se pot obține atât în urma procesului de cultivare, cât și din flora spontană. Aceste tipuri de plante necesită în ambele situații îndeplinirea a acelorași condiții de recoltare, cu excepția faptului că în cazul florei spontane, ar trebui să fie evitată recoltarea în exces, pentru a putea fi prevenită dispariția acesteia.

Recoltarea plantei medicinale sau a diferitelor organe ale unei plante de acest tip reprezintă prima dintre cele mai importante etape ale prelucrării primare a produsului vegetal, în care acesta este pregătit pentru a putea fi folosit pentru diferite scopuri (terapeutice, cosmetice, alimentare, etc.) și în diferite ramuri de activitate (industria farmaceutică, alimentară, dermato-cosmetică, etc.). În general, recoltarea ar trebui să fie realizată în condiții optime deoarece are o importanță hotărâtoare în ceea ce privește obținerea de materie primă de calitate sau atingerea unui randament de prelucrare ridicat. Iar în condițiile unor recoltări necorespunzătoare a organelor vegetale cu importanță, prematură sau tardivă se poate ajunge la compromiterea lor și a întregii plante.

Recoltarea plantelor sau produselor vegetale se face de regulă în momentul în care acestea conțin o cantitate maximă de principii active, astfel că momentul ideal de recoltare ține foarte mult de stadiul de dezvoltare a plantei. Însă în contextul folosirii produselor vegetale pentru extragerea de ulei volatil din acestea (așa cum este cazul mentei), se poate realiza recoltarea plantelor atunci când plantele sunt înflorite în proporție de 50-75%.

Pentru realizarea experiențelor practice, de natură fitochimică și farmacognostică, care vor fi descrise în următoarele capitole ale lucrării de față, am recoltat o cantitate de 5 kilograme de plante întregi de mentă de grădină (Mentha piperita varietatea palescens) din cultură proprie aflată în municipiul Galați, din județul Galați, din care am folosit pentru extracția de fracțiuni de ulei volatil doar frunzele ca produse vegetale specifice. Recoltarea mentei am realizat-o respectând cerințele principale ale literaturii de specialitate astfel: am efectuat o recoltare manuală, prin tăierea tulpinilor, la granița dintre aceștia și stoloni, la o distanță de 7-10 cm. față de sol o singură dată, în urma segmentării transversale a plantei. Această operație a fost realizată dimineața, după ce roua s-a luat complet, pe vreme caldă, uscată, lipsită de precipitații, dar totuși ușor innorată, pentru a se evita volatilizarea uleiurilor din componența frunzelor și tulpinilor. Înainte de recoltare, am irigat culturile cu moderație, aplicând de la 3 la 5 udări, și am repetat acest procedeu chiar și după recoltare, pentru a ajuta planta să nu se usuce și deshidrateze, menta fiind o plantă care prezintă o toleranță scăzută la condiții de secetă. Apoi am lăsat plantele recoltate să se zvânte pentru a nu se periclita conținutul maxim de uleiuri volatile conținute de frunze. Operația de recoltare a mentei din culturile proprii a fost realizată primăvara, în perioada de puțin dinainte și pe durata înfloririi acesteia.

b.

c.

Figura 14: Imagini ale culturilor proprii de mentă de grădină (Mentha piperita

varietatea rubescens) folosite pentru analizele fitochimice și farmacognostice

efectuate pentru această lucrare

V.2. USCAREA PRODUSULUI VEGETAL

Pentru realizarea studiului fitochimic și farmacognostic, comparativ atât a produselor vegetale terapeutice (frunzelor) ale speciei de mentă recoltate de mine aflate în diferite stadii de dezvoltare (stadiul tânăr, aflat la jumătatea dezvoltării sale și cel matur) sau în diferite stări de procesare (stare proaspătă sau uscată), cât și a fracțiunilor de ulei volatil extrase din acestea, în așa fel încât studiul să fie cât mai amplu și mai concludent, am decis ca o parte din culturile de mentă recoltate de mine să le supun procesului de uscare, una dintre operațiile specifice de prelucrare a plantelor medicinale.

Uscarea produselor vegetale ale plantelor este una dintre operațiile cele mai avantajoase pentru păstrarea calităților fitoterapeutice ale acestora, fiind realizată imediat după recoltarea acestora. Aceasta are rolul de a stabiliza organele vegetale specifice în urma inactivării enzimelor ce se află în interiorul lor, ce degradează principiile active conținute de produse. Astfel, se îndepărtează excesul de apă care favorizează dezvoltarea enzimelor și activitatea lor degradativă, iar comform literaturii de specialitate, un procent de 10-15 % de umiditate a produselor va păstra compoziția chimică intactă și va împiedica realizarea reacțiilor specifice, degradative de către enzime. În urma uscării, organele vegetale terapeutice vor avea volumul și greutatea lor mai scăzute decât inițial, iar forma lor va fi schimbată (de exemplu, frunzele, în special cele subțiri, se încrețesc).

Uscarea produselor vegetale se poate realiza prin 2 modalități: cea naturală, care se poate realiza prin expunerea la soare, la temperatura camerei sau la umbră, sau cea artificială, prin intermediul unor cuptoare sau etuve speciale.

În cazul de față, am ales să usuc o parte din culturile de mentă ce au fost folosite pentru analiza experimentală, într-un mod natural, astfel: le-am aranjat în straturi cât mai subțiri, așezate pe foi de hârtie cerată, într-o încăpere semi-umbroasă, prin care treceau raze de soare în interior, destul de călduroasă, la o temperatură în jur de 30-35 oC, la o distanță convenabilă între culturi pentru ca acestea să fie manipulate și aerisite. Am lăsat plantele să se usuce într-o perioadă de 3-7 zile, expunându-le în multe momente ale zilei și la acțiunea razelor solare, în perioade scurte de timp. Încăperea unde s-a realizat uscarea era uscată, bine aerisită, fără praf sau insecte, pentru a nu fi afectate plantele și principiile active conținute, fiind un aspect care este prevăzut în literatura de specialitate. Uscarea plantelor s-a făcut lent pentru a se evita apariția modificări chimice și structurale ale clorofilelor și uleiurilor volatile din conținutul frunzelor. Iar intervalul de timp dintre momentul finalizării recoltării și începerea operației de uscare a fost foarte scurt, de 2-3 ore, pentru a evita cât mai mult cu putință să se deșfășoare procesele degradative fizice și chimice ale plantelor, care pot afecta în mare măsură uleiurile volatile și alte principii active.

Figura 15; Imagine cu o parte din culturile de mentă de grădină (Mentha piperita varietatea rubescens) uscate folosite pentru analizele fitochimice și farmacognostice, experimentale

V.3. SORTAREA PRODUSULUI VEGETAL

Înainte de a realiza uscarea unei părți de culturi de mentă de grădină, în vederea obținerii de produse vegetale medicinale (frunze), uscate în mod corespunzător și de bună calitate, pentru analizele experimentale, am efectuat operația de sortare, una dintre operațiile farmacognostice specifice, de pregătire a produsului vegetal. Aceasta constă în îndepărtarea corpurilor straine și a altor impurități de natură fizică (pământ, nisip sau alte formațiuni sau corpuri de natură minerală). Astfel, am spălat acele culturi de plante prin spălarea lor la un curent puternic de apă rece, pentru îndepărtarea mizeriei și a pământului. Rostul spălării plantelor sub acțiunea unui curent de apă rece este de a evita dizolvarea unor principii active (precum uleiurile volatile) în apă, în cazul în care aceasta ar fi fost încălzită. Iar în cazul frunzelor, principalele organe vegetale folosite pentru analize, se vor îndepărta cele înnegrite sau pătate și/sau atacate de insecte, cele mucegăite sau putrezite și care prezintă corpuri străine pe suprafața lor, precum și resturile de ramuri din jurul lor.

Sortarea produselor vegetale terapeutice se poate realiza atât înainte de uscarea lor, dar și imediat după acest procedeu.

V.4. EXAMENUL MACROSCOPIC ȘI CHIMIC AL PRODUSULUI VEGETAL

În vederea realizării unei analize experimentale mai ample și mai interesante, din punctul de vedere al rezultatelor și al contribuțiilor aduse studiului asupra frunzelor de mentă de grădină și fracțiunilor de ulei volatil extrase din aceste organe vegetale medicinale, am decis să efectuez și cele 3 tipuri de analize farmacognostice, specifice, reprezentate de examenul macroscopic, cel chimic și cel microscopic de produs vegetal. Aceste analize au fost efectuate asupra mai multor tipuri de produs vegetal, reprezentate de frunze proaspete, atât mature, cât și tinere, aflate la jumătatea dezvoltării lor, de frunze uscate, pulverizate și de fragmente de frunze proaspete, obținute prin clivare, indiferent de stadiul de dezvoltare al acestora.

a.

b.

Figura 16: Imagini cu mostre de frunze de mentă, folosite pentru analiza macroscopică, chimică și microscopică

În ceea ce privește examenul macroscopic al unui produs vegetal, acesta are rolul de a stabili caracterele morfologice și biologice ale acestuia, ce sunt, de regulă, observate cu ochiul liber sau cu lupa, precum și acelea care pot fi determinate prin perceperea mirosului și a gustului.

În funcție de natura organelor vegetale din care sunt constituite, de diferitele varietăți prin care se prezintă acestea (sub formă proaspătă sau uscată, tânără sau matură), dar și de modul de prezentare (întregi, fragmentate sau sub formă de pulberi), există anumite particularități în ceea ce privește realizarea controlului macroscopic al lor.

Astfel, în cazul produselor vegetale întregi, reprezentate în contextul lucrării actuale de frunze de mentă de grădină, controlul macroscopic are rolul de a stabili forma și dimensiunile acestora, prezența sau absența pubescenței pe ambele fețe, grosimea nervurilor conținute, prezența sau absența proeminenței sau invaginației acestora pe suprafața superioară și inferioară a frunzei, culoarea ambelor fețe ce este corelată cu pubescența, mirosul și gustul frunzelor analizate.

În ceea ce privește forma și dimensiunile organelor vegetale medicinale, studiate (frunzele), acestea se determină prin umectarea acestora și întinderea lor pe o placă de sticlă, în cazul frunzelor subțiri. Iar în cazul frunzelor groase sau coriacee nu se supun umectării deoarece ele își păstrează forma inițială, chiar și dupa ce s-au uscat. Frunzele subțiri se umectează în urma introducerii de apă încălzită la o temperatură aproximativă de 50 oC, într-un flacon de sticlă, fiind ținute în aceste condiții timp de câteva minute, urmând ca apoi să fie întinse pe o placă de sticlă.

Pentru determinarea mirosului frunzelor întregi de mentă studiate, se va proceda astfel: se vor freca între degete acestea, emanându-se astfel un miros specific lor. Acest procedeu se aplică și în cazul produselor vegetale fragmentate sau pulverizate.

Iar pentru determinarea gustului frunzelor întregi de mentă, se va efectua aceasta pe un fragment de produs vegetal umectat sau pe decoctul de concentrație de 10 % al acestuia, obținut anterior. Astfel, dacă aceste produse ar avea avea un gust amar, atunci ar releva posibilitatea existenței unor alcalozi, a unor anumite glicozide sau principii amare în compoziția chimică a acestora. De asemenea, în cazul în care aceste produse ar avea un gust aromat, acest aspect ar fi atribuit prezenței unor uleiuri volatile sau balsamuri, reprezentând principiile active ale lor; gustul astrigent al produselor ar sugera prezența taninurilor, iar cel dulce ar sugera prezența glucidelor în compoziția lor chimică.

Pentru studiul meu macroscopic, am folosit 2 tipuri de probe de frunze proaspete de mentă de grădină, dintre care o probă de frunză dintr-o plantă care se află în stadiul matur, iar o altă probă de frunză dintr-o plantă care se află în stadiul tânăr, la jumătatea perioadei sale de dezvoltare.

Figura 17: Probă de frunză proaspătă, matură, întreagă (examen macroscopic)

Figura 18: Probă de frunză proaspătă, tânără, întreagă (examen macroscopic)

În cazul produselor vegetale fragmentate, controlul macroscopic al acestora se efectuează prin aplicarea de procedee similare cu cele folosite în cazul produselor întregi, având de fiecare dată rolul de a stabili forma și dimensiunea fragmentelor. În general, fragmentele de produs variază ca formă și dimensiuni, dar cu toate acestea, pentru a nu se obține rezultate eronate, lungimea acestora ar trebui să se încadreze, comform Farmacopeii Române, Ediția a X-a, între 2 și 10 mm.. Pentru acest caz, am folosit o probă de frunză proaspătă, fragmentată în mai multe părți.

Figura 19: Probă de frunză proaspătă, fragmentată (examen macroscopic)

Iar în contextul produselor vegetale pulverizate, prin controlul macroscopic al lor se stabilește culoarea, mirosul, gustul și gradul propriu de mărunțire. Astfel, pentru a realiza controlul macroscopic din acest caz, am folosit o probă de frunză uscată, pulverizată foarte fin. Pentru determinarea gustului și mirosului acestui organ prezentat în această formă, am procedat la fel ca în produselor vegetale întregi, respectând aceiași pași care se aplică și pentru celelalte tipuri de produse vegetale.

Figura 20: Probă de frunză uscată, pulverizată (examen macroscopic)

De asemenea, controlul macroscopic poate fi însoțit adesea, cu scopul identificării unui anumit produs vegetal, de un control chimic prin care pot fi evidențiate anumite substanțe fitochimice, terapeutice foarte importante din compoziția organelor vegetale studiate. Această examinarea constă în presarea unor probe de pulbere de organ vegetal pe o hârtie de filtru sau orice tip de hârtie, pentru a se demonstra prezența acestor substanțe.

V.4. EXAMENUL MICROSCOPIC AL PRODUSULUI VEGETAL

În ceea ce privește examenul microscopic al unui produs vegetal, acesta are ca scop stabilirea anumitor tipuri de țesuturi și elemente anatomice, caracteristice, de dimensiuni foarte mici ale unui anumit tip de produs vegetal (în contextul lucrării, frunzele de mentă de grădină). Acesta permite stabilirea poziției taxonomice a plantelor de la care provin, examinându-se prezența sau absența perilor glandulari, tipurile de stomate prezente și alte trăsături anatomice, proprii, de dimensiuni foarte mici. Comform prevederilor din Farmacopeea Română, Ediția a X-a, acest tip de examen se realizează diferit, în funcție de modul de prezentare al produsului vegetal (frunză proaspătă, întreagă sau mărunțită, sau uscată, sub formă pulverizată).

În contextul produselor vegetale proaspete, se pot realiza 2 tipuri de analize microscopice astfel: pe secțiune transversală (în cazul frunzelor întregi) sau pe suprafață (în cazul frunzelor mărunțite).

Cu privire la analiza microscopică realizată asupra frunzelor proaspete, întregi, pe secțiune transversală, trebuiesc efectuate următoarele operații: produsele vegetale trebuie să fie aduse la o consistență corespunzătoare, necesară pentru analiză, în urma fierberii sau macerării cu apă distilată sau cu un amestec de volume egale de reactivi de alcool concentrat (R) și glicerol (R) și se pot secționa cu ajutorul unei lame, brici sau unui microtom, dacă s-ar ști că ar putea conține mucilagii. După ce se vor obține anumite preparate de laborator, acestea se vor clarifica fie cu apă de Javel (R), fie cu cloral hidrat de concentrație 800 g/l (R). În cazul clarificării cu apă de Javel (R), produsul vegetal secționat va fi adus într-un cristalizor ce va conține apă de Javel (R), se va acoperi cu o sticlă de ceas și se va lăsa în soluție într-un interval de timp între 15 minute și câteva ore, în funcție de natura tipului de produs vegetal folosit (întreg sau fragmentat). Soluția obținută se va îndepărta, iar secțiunea de organ vegetal se va spăla în mai multe rânduri cu apă, până când nu se va mai percepe niciun fel de miros de clor. În cazul clarificării cu cloral hidrat de concentrație 800 g/l (R), organul vegetal terapeutic supus analizei, secționat se va aduce pe o lamă de microscop pe care s-au pus câteva picături de cloral hidrat de concentrație 800 g/l (R). Preparatul de laborator astfel obținut se va încălzi ușor și se va trece lama din sticlă pe care se află repede, de 2-3 ori, prin flacăra unui bec de gaz. Se va obține o secțiune de preparat, care se va colora diferit, în funcție de natura țesutului sau țesuturilor studiate, cât și a altor elemente morfologice, microscopice de pe suprafața secțiunii. În cazul frunzelor și a foliolelor, controlul microscopic al unei secțiuni stabilește caracterele epidermei, făcând referire mai ales la perii tectori și glandulari și a stomatelor, la prezența sau absența țesuturilor secretoare, a celor mecanice și a incluziunilor cristalizate, a structurii fasciculului libero-lemnos, etc..

În ceea ce privește analiza microscopică efectuată asupra frunzelor proaspete, fragmentate, pe suprafață, se procedează astfel: fragmentele de produs vegetal se vor clarifica cu cloral hidrat de concentrație 800 g/l (R) sau se vor fierbe cu hidroxid de sodiu (R) de concentrație 50 g/l (R). După ce clarifică, se va obține un preparat de laborator care se va spăla de 3-4 ori cu apă, se va aduce pe o lamă de microscop, se va secționa în două fragmentele și se va întoarce una dintre jumătăți. Astfel, cele 2 jumătăți vor fi puse pe câte o lamă din sticlă, se vor pune câteva picături de apă distilată încălzită sau glicerol (R), se vor acoperi cu o lamelă și se pot astfel examina ambele suprafețe.

Pentru cele 2 cazuri explicate mai sus, am realizat 6 probe de analiză, dintre care 2 s-au efectuat asupra frunzelor proaspete mature, una dintre ele fiind reprezentată de secțiunea dorsală, iar cea de-a doua pe secțiunea ventrală a acestora, alte 2 au fost efectuate asupra frunzelor proaspete tinere, aflate la jumătatea dezvoltării lor, sub forma celor 2 tipuri de secțiuni descrise anterior, și alte 2 au fost realizate pe fragmente de frunze proaspete, atât pe fața ventrală, cât și pe fața dorsală.

Legat de analiza microscopică efectuată asupra pulberii de organ vegetal terapeutic, pentru realizarea ei se urmează următorii pași: pulberea vegetală omogenizată se va aduce pe o lamă de microscop, care se va clarifica fie cu cloral hidrat de concentrație 800 g/l (R), fie cu un amestec de volume egale de alcool concentrat (R) și glicerol (R), încălzindu-se în condițiile prezentate anterior, fie cu glicerol (R) sau cu un amestec de volume egale de glicerol (R) și alcool (R). După clarificare, peste preparatul de laborator obținut se va pune o lamelă și acesta se va examina la microscop.

Pentru acest caz particular, am obținut o probă de analiză de pulbere de frunză uscată de mentă de grădină (Mentha piperita varietatea palescens), asupra căreia s-a efectuat examen microscopic, respectându-se metoda descrisă mai sus.

Figura 21: Lame din sticlă cu probele de analiză microscopică a tipurilor de frunze studiate:

proba 1- frunză uscată, pulverizată; proba 2- frunză proaspătă, matură (secțiune transversală, anterioară);

proba 3- frunză proaspătă, fragmentată (secțiune posterioară); proba 4- frunză proaspătă, fragmentată (secțiune anterioară); proba 5- frunză proaspătă, tânără (secțiune transversală, anterioară); proba 6- frunză proaspătă, tânără (secțiune transversală, posterioară);

proba 7- frunză proaspătă, fragmentată (secțiune transversală, posterioară)

Pentru realizarea tututor examinărilor de probe s-a folosit un microscop electronic perfomant, numit “Optika”, ce este fabricat în Italia. Acest microscop electronic, la fel ca și altele, este alcătuit din următoarele componente caracteristice acestui tip de aparat: oculare, tub, lentila observatorului, capul, rotilă (sau buton) de focusare a imaginii într-un mod fin, focalizator, braț cu înclinare, șurub de blocare, focalizator, turet rotativă, obiectiv, lentile, scala Vernier, cleme de poziționare a preparatelor din sticlă de analizat, platforma, lama pentru microscop, condensatorul, braț, diafragma aperturii, diafragma disc, rotilă de deplasare pe axa X-Y, iluminatorul sau oglinda și baza.

Figura 22: Părțile componente ale unui microscop electronic

Microscopul electronic este un tip de microscop ce utilizează electroni pentru a ilumina preparatul microbiologic ce trebuie analizat pe o placă din sticlă, transmițând o imagine mărită a acestuia. Prețul acestui tip de microscop este foarte ridicat, de regulă trecând de suma de 80000 de euro, având o rezoluție superioară microscoapelor clasice, cu lumină, pentru a face examinări de mare finețe a unor probe de organe sau țesuturi a unor animale sau plante, ce urmează a fi studiate mai în amănunt. Se poate ajunge la măriri de peste 50000x, putându-se examina la un specimen aspecte morfologice, compoziționale, topologice și multe alte detalii mărunte.

V.6. EXTRAGEREA FRACȚIUNILOR DE ULEI VOLATIL DIN PRODUS VEGETAL AL SPECIEI DE MENTĂ DE GRĂDINĂ (MENTHA PIPERITA VARIETATEA PALESCENS), PRIN METODA DISTILĂRII CU APARAT NEO-CLEVENGER

Una dintre obiectivele principale ale prezentei lucrări de licență este de realizare a unui studiu fitochimic, calitativ și comparativ asupra mai multor probe de fracțiuni de ulei volatil de mentă de grădină (Menthae aetheroleum), ce sunt extrase din frunze care se pot găsi în mai multe forme (sub formă proaspătă matură sau tânără, aflată la jumătatea dezvoltării sale și/sau sub formă uscată).

Pentru realizarea extracției probelor de ulei volatil de mentă, s-au îndeplinit următorii pași: am recoltat o cantitate mare de mentă de grădină, în jur de 1 kilogram, din care am separat o cantitate de 50 g de frunze uscate, 170 g de frunze proaspete din culturi de plante mature și 123 g de frunze proaspete din culturi de plante tinere, aflate la jumătatea stadiului lor de dezvoltare.

Figura 24: Frunze proaspete de mentă din culturi mature, folosite pentru extracția de ulei volatil

Figura 25: Frunze proaspete de mentă din culturi tinere, aflate la jumătatea stadiului lor de dezvoltare,

folosite pentru extracția de ulei volatil

Figura 26: Frunze uscate de mentă folosite pentru extracția de ulei volatil

Din aceste aceste tipuri de produse vegetale am obținut 3 probe de fracțiuni de ulei volatil de mentă, care au fost extrase prin metoda antrenării cu vapori de apă (distilării) speciale, cu ajutorul aparatului Neo-Clevenger.

Figura 27: Probă de ulei volatil de mentă obținută din extracția sa din frunzele culturilor mature, de mentă de grădină

Figura 28: Probă de ulei volatil de mentă obținută din extracția sa din frunzele culturilor tinere, aflate la jumătatea stadiului lor de dezvoltare, de mentă de grădină

Figura 29: Probă de ulei volatil de mentă obținută din extracția sa din frunzele uscate, de mentă de grădină

Această metodă de distilare (antrenare cu vapori de apă) specială, în care se folosește aparatul Neo-Clevenger, are același principiu de funcționare ca și distilarea simplă realizată cu ajutorul aparatului Kjeldahl, cu deosebirea că uleiul volatil se separă direct de apa aromatică, obținându-se ca atare și nu se va obține sub forma amestecului de hidrodistilat cu apa aromatică ca în cazul metodei de distilare simplă. Principiul antrenării cu vapori de apă constă în fierberea produsului vegetal, ce conține principiile active de extras, cu apă, fiind în prealabil mărunțit sau fragmentat, pentru a intra cu ușurință în balonul cotat cu fund rotund al aparatului folosit pentru distilare. Diferența majoră între distilarea simplă cu aparat Kjeldahl și cea specială cu aparat Neo-Clevenger este că în cel de-al doilea caz, obținerea uleiului volatil se realizează direct prin separarea de apa aromatică cu ajutorul unui tub despărțitor legat de tubul principal al aparatului. În primul caz, se obține un hidrodistilat, format din uleiul volatil și apa aromatică, separarea lichidelor între ele realizându-se de la sine, urmată apoi de o perioadă de repaus între 24 și 48 de ore și de colectarea lor în recipiente din sticlă speciale. De asemenea, lichidele se pot separa din hidrodistilat și prin operația de salefiere cu NaCl pentru a fi crescută densitatea mediului de dispersie și a fi grăbită separarea uleiului volatil de apa aromatică, fiind urmată apoi de extracția cu solvent apolar (de tip toluen sau xilen).

Metoda de distilare specială, cu ajutorul aparatului Neo-Clevenger, poate fi folosită și pentru determinarea conținutului de ulei volatil dintr-un produs vegetal (precum frunzele).

Aparatul Neo-Clevenger, prin intermediul căruia se realizează acest tip de distilare, este alcătuit din următoarele elemente componente prezentate in figura nr. 30.

Fig.30: Componentele unui aparat Neo-Clevenger. (A)-regulator de alimentare de curent electric; (B)-balon de încălzire cu fund rotund ce conține apă aromatică și resturi de produs vegetal; (C)-recipient din sticlă principal care readuce hidrosolul în stare de repaus și care menține faza de ulei esențial, dar care se aplică numai pentru uleiuri esențiale care au o densitate mai scăzută decât a apei și ,de aceea, ele plutesc; (D)-Condensator

Figura 31: Imagini cu aparatul Neo-Clevenger folosit de mine în laborator și componentele sale principale: regulator de alimentare de curent electric (1), balon de încălzire cu fund rotund ce conține apă aromatică și resturi de produs vegetal (2), recipient din sticlă principal care readuce hidrosolul până la starea de repaus și care separă faza de ulei volatil, fiind prevăzut în acest caz cu un tub mic despărțitor legat de tubul principal, pentru separare (3) și plită electrică (4)

V.7. ANALIZA CHIMICĂ, CALITATIVĂ A COMPOZIȚIEI PROBELOR DE ULEI VOLATIL REALIZATĂ PRIN METODA GAZ-CROMATOGRAFIEI ASOCIATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ (G-C CU M-S) ȘI PRIN METODA DE EȘANTIONARE DE PROBE CU DENUMIREA DE MICROEXTRACȚIE ÎN FAZĂ SOLIDĂ (SOLID-PHASE MICROEXTRACTION SAU SMPE)

V.7.1. Aspecte generale

Principalul obiectiv al lucrării de licență prezentate constă în realizarea unei analize chimice, calitative („ on screening “) și comparative a compoziției de principii active principale și secundare, asupra a 3 probe de ulei volatil de mentă de grădină (Mentha piperita varietatea palescens), care sunt provenite din 3 forme de produs vegetal specific: frunze proaspete, provenite din culturi mature, frunze proaspete, provenite din culturi tinere, aflate la jumătatea dezvoltării lor și frunze uscate. În vederea înfăptuirii acestei analize, s-a recurs la metoda de eșantionare de probe denumită microextracție în fază solidă (solid-phase microextraction) și metoda gaz-cromatografiei, cuplată cu cea a spectrometriei de masă (G-C cu M-S).

Gaz-cromatografia sau metoda cromatografiei de gaze (G-C) este o metodă fizico-chimică de separare cromatografică a compușilor chimici dintr-un amestec gazos, în care faza mobilă este reprezentată de un gaz (gaz-purtător), ce poate conține una sau mai multe substanțe chimice componente, iar faza staționară este reprezentată de o substanță solidă sau lichidă, cu care este impregnat un suport solid care este inert din punct de vedere chimic sau unul lichid, ce este repartizat uniform pe pereții unei coloane capilare. Astfel, în ceea ce privește faza staționară, aceasta se află într-o coloană cromatografică, care, deobicei, se poate confecționa din oțel inoxidabil sau din sticlă. Iar legat de faza mobilă, ea se deplasează continuu prin coloană, astfel că la zona de ieșire, gazul-purtător va trece prin detector.

Principiul de funcționare a acestei metode de analiză cromatografică constă în deplasarea cu o viteză constantă a gazului-purtător, în preluarea probei de analiză de către acesta și introducerea ei în coloana cromatografică, unde se realizează separarea componentelor chimice din amestecul gazos. Iar la zona de ieșire din coloana cromatografică, gazul-purtător va trece împreună cu componentele separate prin detector și va emite un semnal electric direct proporțional cu concentrația componentei din faza gazoasă. Astfel, detectorul fiind conectat la sistemul de înregistrare, rezultatele se vor prezenta sub formă de grafic semnal-timp. Deoarece probele de analizat care sunt dizolvate, în prealabil, într-un solvent trebuie aduse în stare de vapori, camera de evaporare trebuie să fie încălzită la o temperatură suficient de ridicată, încât să asigure o evaporare rapidă, fără să producă o degradare termică a probelor de analiză.

În timpul determinării, trebuie să rămână constantă temperatura coloanei cromatografice sau să crească, dacă este necesar, după un anumit program prestabilit.

Prin gaz-cromatografie se pot analiza toate tipurile de amestecuri de substanțe lichide, solide sau gazoase, substanțele aflate în stările de agregare cele din urmă putându-se transforma fizic în gaze, iar aceste amestecuri nu se vor descompune la încălzire în alte specii chimice. Modul cel mai tipic de analiză a acestor amestecuri, prin această metodă, ar fi ca acestea, aflându-se în stare lichidă, să-și modifice starea de agregare în cea gazoasă prin evaporare.

Analiza cromatografică de gaze prezintă un singur caz de restricție, care se aplică substanțelor a căror temperatură de vaporizare este mai ridicată decât temperatura de descompunere a substanțelor ce urmează a fi analizate, obținându-se alți compuși decât cei care sunt supuși analizei. Astfel că înainte de a fi introdusă proba în cromatograf, se mai pot obține niște derivați (compuși chimici) noi, volatili, prin folosirea anumitor reacții chimice specifice, procedeu ce poartă numele de derivatizare.

Principalele avantaje ale acestei metode sunt: ușurința cu care se pune la punct o analiză nouă, sensibilitatea sa foarte ridicată, posibilitatea de automatizare și posibilitățile de aplicare a metodei în multe domenii de activitate (industria farmaceutică, petrochimică, biochimie, analiza aromelor, etc.) și pentru diverse studii.

În trecut cromatografia cu gaze era strâns legată de coloanele de umplutură, în care se realiza transferul de substanțe gazoase, după ce inițial erau evaporate într-un mod spontan într-un injector încălzit. În prezent, cromatografia de gaze se realizează exclusiv doar cu coloane de umplutură, deosebindu-se astfel 2 tipuri: cromatografia de gaze pe faze staționare solide (cromatografia de absorbție) și cromatografia de gaze pe faze staționare lichide (cromatografia de repartiție).

Cromatografia de gaze pe fază staționară solidă sau cromatografia de absorbție se bazează pe faptul că retenția speciilor chimice de analizat din amestecul gazos se realizează în urma absorbției fizice pe peretele interior al coloanelor cromatografice, ce prezintă diametre interioare de ordinul zecimilor de milimetri și lungimi semnificative de zeci de metri. Această tehnică este utilizată destul de rar datorită reproductibilității slabe a rezultatelor, în urma unor absorbții ireversibile, și se aplică numai substanțelor cu puține molecule în structură.

Croma tografia de gaze pe fază staționară lichidă sau cromatografia de repartiție are ca principiu de funcționare repartiția substanței chimice ce urmează a fi analizată între faza mobilă gazoasă și o fază lichidă, inertă pe peretele interior al coloanei cromatografice și este tipul de cromatografie de gaze folosit în exclusivitate în timpurile noastre.

În vederea realizării cromatografiei de gaze se utilizează mai multe tipuri de aparate, din ce în ce mai complexe, acestea variind în funcție de destinația proiectată. Cu toate acestea, anumite părți componente principale rămân comune pentru toate aparatele cromatografice. Astfel, în general, un cromatograf de gaze este alcătuit din următoarele componente principale: sursa de gaz (1), dispozitiv de reglare și măsurare a debitului de gaz-purtător (2), dispozitiv-injector pentru introducerea probei de analizat, reprezentată de de substanță aflată în fază lichidă (3), cameră de vaporare sau cuptor termostatat de încălzire (4), coloană cromatografică (5), aparat detector de semnal (6) și înregistrator (7), care este alcătuit, de obicei, dintr-un amplificator electronic, sistem electronic de achiziție, prelucrare și afișare a datelor înregistrate, calculator și imprimantă.

Figura 32: Componentele principale ale unui gaz-cromatograf, în general, reprezentate de: sursa de gaz (1), dispozitiv de reglare și măsurare a debitului de gaz-purtător (2), dispozitiv-injector pentru introducerea probei de

analizat (3), cameră de vaporare sau cuptor termostatat de încălzire (4), coloană cromatografică (5), aparat detector de semnal (6) și înregistrator (7)

În ceea ce privește amestecul de gaz ce joacă rolul de gaz-purtător, acesta trebuie să fie inert din punct de vedere chimic, fără să reacționeze cu vreun component al probei de analizat sau cu faza staționară, și să nu afecteze viteza de desfășurare a analizei. De aceea, în componența gazului-purtător pot intra gaze inerte precum hidrogenul, azotul, dioxidul de carbon sau heliul. Alegerea naturii gazului utilizat depinde de tipul de detector folosit, iar alegerea unui anumit tip depinde mai mulți factori, îndeosebi de clasa de substanțe analizate. Gazele purtătoare de înaltă performanță sunt depozitate în prealabil, în butelii speciale de înaltă presiune, care sunt prevăzute, de regulă, cu reductoare de presiune, asigurându-se astfel presiuni de intrare cuprinse între 1,5 și 3 atm.. Însă aceste presiuni pot fi produse și pe loc cu generatoare speciale, pe bază de hidrogen sau azot.

Impuritățile aflate în compoziția gazului-purtător ar putea induce modificări chimice în faza staționară, de aceea, pentru îndepărtarea lor, este necesar să se instaleze în dispozitivul de reglare și măsurare a nivelului de gaz-purtător niște filtre speciale sau cuptoare de cupru, încălzite la 500 oC.

O condiție obligatorie pentru realizarea analizei gaz-cromatografice într-un mod corespunzător, astfel încât reproductibilitatea timpilor, volumelor și a altor parametri de retenție ai probelor de analizat și ai celor etalon să poate fi aplicată, în vederea comparării între acestea, este să se mențină un debit de gaz uniform. Acest debit constant poate fi obținut cu ajutorul unui reductor de presiune cu membrană, asupra căruia poate fi adaptat un regulator automat de debit sau un ventil cu ac.

Pentru a se măsura debituri de gaz-purtător, care pot fi cuprinse între 10 și 100 ml/min, sunt utilizate fie rotametre, fie debitmetre cu săpun. Deoarece rotametrele nu au o sensibilitate suficient de mare, se utilizează mai des debitmetrele cu săpun, bazate pe măsurarea timpului necesar unui film de săpun să parcurgă o anumită distanță într-un tub calibrat, care limitează un anumit volum.

Dispozitivul-injector ce efectuează introducerea probei de analizat în coloana cromatografică poate asigura în mare parte calitatea analizelor cromatografice, în funcție de caracteristicile sale, acestea fiind responsabile de lățirea de bandă a vărfurilor (peak-urilor) substanțelor analizate. De aceea, un dispozitiv de injecție performant ar trebui să asigure introducerea în coloana cromatografică a unor cantități foarte mici de substanță de analizat, într-un cât mai scurt, pentru a se asigura vârfuri sau peak-uri înguste la bază.

Legat de probele gazoase, acestea se introduc în coloană prin intermediul unor pipete, seringi cu volume diferite sau robinete metalice cu mai multe canale, cu rotor confecționat din teflon.

În ceea ce privește probele lichide, ele sunt tranformate, în prealabil, în stare de vapori. Acestea se extrag cu ajutorul microseringi speciale Hamilton sau Agla speciale, cu dispozitive micrometrice și capacități între 0,5 și 100 μl, care sunt acționate automat, dintr-un minirecipient cilindric de sticlă așezat pe suportul mobil a autosampler-ului. Iar în cazul probelor foarte mici, este recomandată înfiolarea acestora în tuburi capilare, fiind golite direct în fluxul de gaz purtător.

Iar cu privire la probele aflate în stare solidă, fie sunt dizolvate într-un solvent purificat, fie sunt aduse în stare topită, urmând ca apoi să fie injectate cu seringi. În vederea introducerii unor cantități mici de probe solide, sunt utilizate fiole capilare sau capsule metalice confecționate din indiu sau aliaje ușor fuzibile.

În cazul analizei unor substanțe sau uleiuri volatile cu miros puternic parfumat (precum uleiul volatil de mentă) sau în analiza de rutină, pentru o precizie ridicată, este recomandat să fie folosit un dispozitiv auxiliar de injectare automată, care se poate programa în anumite condiții de operare, în funcție de volum, de timp, etc..

Atunci când se manipulează cantități mici de probă de analiză, într-un mod manual, așa cum se obișnuiește în gaz-cromatografie, pot să apară erori importante, de aceea, se recomandă ca dozarea și înjectarea probei să se realizeze prin intermediul unor dispozitive de tip autosampler.

Coloanele de separare în cromatografia de gaze trebuie să fie confecționate din tuburi metalice (cupru, aluminiu, oțel inoxidabil) sau din sticlă. Materialul din care sunt obținute coloanele cromatografice pot interveni la temperaturi crescute în procesul de separare a gazului-purtător de proba de analiză. Diametrul interior al coloanelor cu umplutură ar trebui să fie între 3,18 și 4,6 mm sau mai mici de 1 mm în cazul coloanelor „ micro “. Tipul acesta de coloane este foarte rar folosit în prezent datorită rezoluției slabe pe care o au sau a capacității de separare reduse.

Metalul ca material de confecționare a coloanelor are multe avantaje, precum rezistența mecanică, suprafața netedă și conductivitatea termică crescută. Însă, uneori, poate avea dezavantajul activității catalitice desfășurate sau a interacțiunii chimice cu substanțele analizate (de exemplu, cuprul poate interacționa cu terpenele, acetilenele, aminele, etc.).

În cazul gaz-cromatografiei efectuată la temperaturi mari de lucru, se indică utilizarea coloanelor de sticlă din borosilicat.

Forma coloanelor poate fi variabilă: dreaptă, îndoită, în spirală sau sub formă de U.

Coloanele capilare au lungimi cuprinse între 30 și 200 m și un diametru interior de 0,1-0,5 mm, iar faza staționară acoperă peretele interior al lor cu un strat de aproxmativ 0,5 μm grosime.

Pentru analiza cromatografică de gaze s-au propus să fie utilizate în prezent coloane de tip intermediar, așa cum sunt coloanele cu suport (celite) sau coloanele cu strat poros.

Funcționarea optimă a camerei de evaporare sau cuptorului termostatat de încălzire depinde de un parametru fizic, vital pentru analiza gaz-cromatografică, reprezentat de temperatura coloanei (tc). Acest tip de temperatură provoacă apariția gradientului de presiune ce transportă gazul prin coloană. Cu cât crește temperatura de coloană, cu atât crește exponențial presiunea gazului-purtător (pg), care determină la rândul ei creșterea vitezei de migrare (vm) și reducerea sensibilă a timpului de retenție (tr) . În general, se consideră că o ridicare a temperaturii cu circa 30 oC va duce la o scădere a timpului de retenție la jumătate. În practică, nu este relevantă valoarea vitezei absolute de migrare (va), ci viteza relativă de migrare (vr), reprezentând raportul dintre viteza medie liniară a substanței de analizat (vma) și viteza medie a gazului-purtător (vmg). Legat de valoarea vitezei relative de migrare, aceasta se situează între 0 și 1, ceea ce înseamnă că la valoarea 0 nu va avea loc nici o migrare, temperatura coloanei fiind prea scăzută, iar la valorea 1 nu va avea loc nici o separare, întrucât amestecul de analizat traversează coloana cu aceeași viteză ca cea a gazului-purtător și nu vor fi reținuți diferențiat în timp diferiții componenți chimici. Valoarea intermediară între 0 și 1 a vitezei relative de migrare este considerată a fi optimă și depinde în mare parte de dificultatea separării. În ceea ce privește temperatura optimă a coloanei, aceasta depinde de gradul de separare și temperatura de fierbere, astfel că pentru amestecuri a căror temperatură de evaporare se situează într-un domeniu de valori apropiat, se poate aprecia faptul că o temperatură egală sau puțin mai ridicată decât temperatura medie de evaporare va determina apariția unui timp de eluție în jurul valorilor de 4-30 de minute, acestea fiind considerate valori acceptabile. În contextul unor substanțe de analizat a căror temperaturi de fierbere se situează într-un interval mare de valori, trebuie să fie utilizat un program de temperaturi în care temperatura poate fi crescută fie continuu, fie în trepte. În momentul injectării probei, substanța se găsește la temperatura cea mai scăzută optimă în cazul componentelor volatile, dar care este considerată necorespunzătoare în situația unor substanțe analizate care au o temperatură de vaporizare mare. În timpul analizei probei, temperatura de fierbere crește progresiv până va ajunge la temperatura corespunzătoare susbtanțelor volatile. Însă în cadrul programelor de temperatură nu trebuie să se depășească temperatura care va determina creșteri ale valorii vitezei relative de migrare peste valoarea 1.

Detectorul unui aparat gaz-cromatograf reprezintă una dintre cele mai importante părți ale acestuia deoarece determină sensibilitatea și precizia determinării. Componenta aceasta are rolul de a evidenția substanțele de analizat care sunt separate și eluate în curentul de gaz-purtător, prin emiterea unor semnale electrice direct proporționale cu concentrația acestora. În cadrul analizelor cromatografice de gaze există 2 categorii de detectoare: integrale și diferențiale. În ceea ce privește detectoarele integrale, acestea emit semnale corespunzătoare pentru realizarea însumării masei totale a componenților ce traversează celula de măsură, cromatogramele fiind reprezentate prin curbe în trepte. Iar detectoarele diferențiale, care sunt mai des utilizate în prezent, emit semnale în funcție de variația unei proprietăți a fazei mobile sau substanțelor componente, iar cromatogramele sunt reprezentate de peak-uri (vârfuri) de eluție.

Substanțele chimice analizate separate pe coloana cromtografică se analizează după condensare sau prin intermediul parametrilor de retenție. Mai des, identificarea componenților este bazată pe cercetarea comportamentului cromatografic, care este reprezentat de parametrii de retenție proprii.

În gaz-cromatografie parametrii de retenție trebuie să fie corectați, deoarece în urma compresibilității, volumului gazului-purtător va fi mai mic la intrarea în coloană sub influența presiunii de intrare (pi) decât la ieșirea din coloană sub influența presiunii de ieșire (pe). Astfel, modificarea debitului prin coloană este cu atât mai mare, cu cât raportul dintre presiunea de intrare (pi) și presiunea de ieșire (pe) este mai ridicat. Deoarece există un gradient de presiune în coloană, acest aspect impune considerarea unui factor de corecție numit factor de compresibilitate (j).

Alți parametri de retenție esențiali pentru analiza G-C sunt următorii: presiunea medie prin coloană (pm), viteza lineară medie a gazului-purtător (jv), debitul mediu (jd), volumul de retenție corectat (VoR), volumul sau timpul de retenție ajustați (V’R sau t’R) (care este direct proporțional cu coeficientul de distribuție-D), volumul de retenție specific (Vg), volumul de retenție net VN al substanței per gram de fază staționară la 0oC și volumul de retenție relativ (VR).

La nivelul zonei de ieșire din coloana cromatografică ar trebui să se respecte anumite condiții optime de măsurare aplicate mai multor tipuri de detectoare, deoarece se separă pe rând componenți gazoși puri, cu o diluție ideală realizată de un gaz-purtător. Pentru efectuarea unor identificări calitative, așa cum este și în cazul analizei realizate de mine și descrise în lucrare, se indică utilizarea unor spectrometre la ieșirea din gaz-cromatografe. Cele mai folosite combinații de gaz-cromatografe cu spectrometre sunt: gaz-cromatograful cuplat cu spectrometru de masă (G-C cu M-S) sau gaz-cromatograful cuplat cu spectrometru în infraroșu cu transformată Fourier (G-C cu cu F.T.I.R.).

Spectrometria de masă (M-S) reprezintă o metodă de referință pentru determinarea structurală, la nivel molecular, a unei probe de substanță în diverse laboratoare de analiză chimică, clinică sau de control alimentar. În general, proba de substanță sau substanțe analizate este una complexă și, de aceea, aceasta se separă prin metode cromatografice, precum gaz-cromatografia (G-C) descrisă anterior.

Principiul de funcționare a acestei metode constă în devierea în câmp magnetic a ionilor obținuți prin fragmentarea moleculelor din proba de analizat prin bombardarea în prealabil cu electroni, astfel că speciile chimice din probă sunt ionizate și sortate pe baza raportului masă/sarcină (m/z). Fiecare tip de moleculă va avea un spectru de masă distinct, iar în funcție de acesta se pot realiza determinări calitative și cantitative ale fiecărei specii chimice din probă.

Tipul acesta de analiză spectrometrică poate duce la găsirea de informații cu privire la masa moleculară, structura moleculară, legăturile chimice implicate și abundența ionilor de substanțe chimice de analizat din probă.

Un spectrometru de masă tipic prezintă, în general, indiferent de anumite particularități, următoarele componente principale: sistemul de introducere a probei (1), camera de ionizare (2), camera de accelerare și focalizare a electronilor, analizorul (3) și detectorul de ioni (4).

Figura 33: Componentele principale ale unui spectrometru de masă (M-S), în general, reprezentate de: sistemul de introducere a probei (1), camera de ionizare (2), camera de accelerare și focalizare a electronilor, analizorul (3) și detectorul de ioni (4)

Sistemul de introducere a probei de analiză are ca funcție introducerea probei sub forma unui fascicul fin, aflat în stare de agregare gazoasă, în interiorul camerei de ionizare.

Camera de ionizare reprezintă o încăpere în care moleculele probei de analizat bombardate cu un fascicul de electroni monoenergetici, ce prezintă valori în jur de 300 eV, însă deseori se va alege o energie a electronilor de 70 eV. Prin bombardarea acestor molecule, se vor smulge electroni de legătură și se vor forma, astfel, radicali moleculari pozitivi. În drumul lor spre detector, care va fi parcurs într-un timp de aproximativ 10-5 s, acești radicali moleculari se pot descompune în alți radicali moleculari, ioni pozitivi sau fragmente neutre din punct de vedere electric.

În camera de accelerare și focalizare ajung ionii produși în camera de ionizare, unde vor fi supuși unor tensiuni de accelerare între 2 și 10 kV.

În spațiul analizorului vor ajunge ionii accelerați, aici fiind orientat perpendicular câmpul magnetic de aproximativ 1 Tesla pe direcția vitezei ionilor. Din cauza forței magentice exercitate, ionii vor avea o mișcare circulară, astfel ionii cu masă mai mică sunt mai puternic deviați decât ionii cu mase mai mare.

Detectorul de ioni are rolul de a pune în evidență fiecare tip de ion la o poziție specifică, prin raportul de masă cu sarcina electrică a ionilor (m/z), poziția unui ion fiind determinată cu ajutorul razei traiectoriei fiecăruia, ajuns în detector.

V.7.2. Analiza calitativă

Pentru realizarea analizei chimice, calitative și comparative a celor 3 probe de ulei volatil de mentă menționate anterior am recurs la metoda cromatografiei de gaze (G-C) asociată cu spectrometria de masă (M-S).

Extracția compușilor de uleiuri volatile, înainte de analiză, poate prezenta și dezavantaje, cum ar fi:

tendința compușilor de a se degrada în prezența căldurii sau de a forma compuși care nu există în mod normal;

formarea compușilor de aromă secundari, ca urmare a reacțiilor enzimatice;

recuperarea incompletă a compușilor polari sau semi-volatili.

Tehnica de extracție cu ajutorul fibrei statice S.P.M.E. (extracție în fază solidă) prezintă avantajul că permite atât echilibrarea între faza solidă și faza gazoasă, cât și cea între faza gazoasă și fibra pe care are loc concentrarea compușilor volatili. Analiza este relativ ușor de realizat, nu necesită solvenți și sunt șanse mai reduse de a se forma compuși intermediari de extracție. Limitele metodei sunt date de concentrația în care se găsesc compușii volatili în probă, de presiunea de vapori a compușilor volatili, de temperatură și de matricea alimentului.

Microextracția în fază solidă (solid-phase microextraction sau S.M.P.E.) este o tehnică de extracție care implică folosirea unei fibre acoperite cu fază de extracție, ce poate fi reprezentată de un lichid (polimer) sau solid (sorbent), pentru a extrage diferite tipuri de analiți (inclusiv cele volatile și nevolatile) din diferite tipuri de medii, care pot fi în fază lichidă sau gazoasă. Cantitatea de analit extras din fibră este direct proporțională cu concentrația lui în probă. În cazul de față, s-a utilizat trecerea compușilor volatili prin fibra de siliciu acoperită cu o fază polimerică. În timpul extracției, fibra intră în contact cu compușii volatili ai probei prin introducerea pistonului în vial. Compușii sunt adsorbiți pe fibră, care după echilibrare este retrasă din septuum, iar acul este introdus în instrumentul analitic unde compușii sunt desorbiți termic. Desorbția constă în introducerea acului fibrei S.M.P.E. în injector într-o cameră încălzită, unde compușii volatili adsorbiți pe fibră sunt desorbiți termic, urmând ca ulterior aceștia să fie separți pe coloana de separare cromatografică.

V.7.3. Parametrii GC-MS

Pentru detectarea compușilor volatili s-a folosit un aparat gaz-cromatograf (G-C) cuplat cu un spectrometru de masă (M-S) de tip ITQ™ Series GC-Ion Trap MS Systems, având o configurație specifică de captare a ionilor, fiind produsă de către firma Thermo Fisher Scientific, cu una dintre filiale aflate în orașul Bremen din Germania. Aparatul prezintă în alcătuirea și o coloană capilară de spectrometrie de masă (M-S) Hewlett Packard HP-5, de lungime 30 m, lățime 25 mm și cu o grosime a pereților de 0,25 μm. Gazul-purtător folosit a fost He, de puritate 99,999 % și debitul de gaz a fost menținut la o viteză constantă de 1 ml/min. Tensiunea de ionizare a fost setată la 70 eV în modul pozitiv. Temperatura cuptorului a fost menținută la 80 °C timp de 10 min după injecție, apoi a fost programată la 2 °C/min până la 100 °C, care a fost menținută timp de 5 min, apoi la 8 ° C/min la 150 °C, menținută timp de 50 min, urmată de 5 °C/min până la 260 °C și, în final, menținută 10 min (timpul de rulare total fiind de 67 min). Linia de transfer a fost setată la 300 °C, iar sursa ionică la 210 °C. Setările I.T.D. (de dirijare inteligentă a traficului de semnal) au fost următoarele: domeniul de masă să fie de 100–1000 (numai pentru scanare completă), să se utilizeze 3 microscopuri, iar timpul de ionizare maxim să fie de 25 ms. Au fost injectați 5 μl de probă, iar sistemul aparatului de spectrometrie de masă (M-S) a fost reglat înainte de a rula fiecare secvență.

Preluarea probelor se realizează cu sistemul Autosampler Triplus, care permite atât injectarea probelor lichide, cât și a probelor gazoase (headspace). Injectorul permite operarea atât în modul split (cu divizarea probei), cât și în modul splitless (fără divizarea probei), iar domeniul de temperatură al acestuia poate fi reglat între 50-400.

Parametrii Autosampler-ului Tri Plus au fost setați după cum urmează:

parametrii vialului cu proba: viteza acului fibrei în vial -20 mm/s, cu un timp de extracție de 90 min;

etapa de injectare: adâncimea injectorului 20 mm, cu un timp de desorbție de 4 minute.

etapa de incubare: tipul de incubare a fost constant, a durat 20 minute, iar temperatura agitatorului a fost setată la 40

Datele au fost evaluate de browser-ului aparatului Xcalibur 0606 a firmei Thermo Fisher, cu ajutorul bazei de date a spectrelor de masă Wiley.

Condiționarea fibrei s-a realizat prin expunere la intrarea în gaz-cromatograf (G-C) timp de 3 min pentru desorbția termică la 250 oC, înainte de prelevarea spațiului capului. Din fiecare fibră cromatografică s-a sigilat o cantitate de 1 g de probă într-un flacon cu șurub de 10 ml, prevăzut cu capac fenolic și teflon, cu pereți din silicon, fabricat de firma Supeco Inc.

Figura 34: Imagine cu un aparat gaz-cromatograf, cuplat cu un spectrometru de masă (G-C cu M-S) de tip ITQ™ Series GC-Ion Trap MS Systems, ce prezintă o configurație specifică de captare a ionilor, într-un laborator chimic de analiză

CAPITOLUL VI. REZULTATE ȘI DISCUȚII

VI.1. REZULTATE ȘI DISCUȚII PRIVIND ANALIZELE

MACROSCOPICĂ ȘI CHIMICĂ A FRUNZELOR DE MENTĂ DE GRĂDINĂ (MENTHA PIPERITA VARIETATEA PALESCENS)

În urma efectuării examenului macroscopic de natură farmacognostică, aplicată asupra mai multor forme de produs vegetal studiate (frunze uscate, pulverizate, frunze proaspete, provenite din culturi mature, frunze proaspete, provenite din culturi tinere, aflate la jumătatea stării lor de dezvoltare și frunze proaspete, fragmentate), au fost obținute rezultate specifice acestui tip de examinare, care vor fi prezentate mai jos în acest capitol.

Astfel, în ceea ce privește analiza macroscopică realizată asupra organelor vegetale medicinale reprezentate de frunze proaspete, mature, întregi, s-au măsurat dimensiunile unei probe de frunză, stabilindu-se că: lungimea acesteia este de 4,6 cm, iar lățimea sa este de 1,3 cm. Legat de aspectul acestor produse vegetale, acestea prezintă o formă specifică, oval-lanceolată având margini dințate sau serate, cu pubescență (peri secretori de ulei volatil, eteric), o orientare a lor pe tulpină opusă și o nervație penat-compusă, ramificată și proeminentă. Culoarea frunzelor este pe fața anterioară verde-închis și se pot vedea pe suprafața lor nervuri albe, estompate și cu pete maro-roșiatice, iar culoarea pe fața posterioară este verde mai deschis, observându-se în secțiune longitudinală aceleași nervuri albe și pete roșiatice găsite și pe fața anterioară, cu deosebirea că nervurile sunt mai proeminente. Iar gustul și mirosul acestor tipuri de frunze sunt puternic aromate, înțepătoare și împrospătoare, fiind specifice speciei de mentă de grădină (Mentha piperita varietatea palescens).

Asupra probelor de frunză proaspătă, tânără, întregi și frunză proaspătă fragmentată, examenul macroscopic a decurs la fel ca în primul caz expus mai sus, fiind obținute aceleași rezultate în mare parte. Singura deosebire a rezultatelor analizelor celor 2 probe față de proba anterioară, de frunză matură, a fost cea cu privire la dimensiunile lor, astfel: proba de frunză tânără prezintă lungimea de 2,3 cm și lățimea de 1 cm, iar proba de frunză fragmentată prezintă valoarea atât a lungimii, cât și a lățimii, în jur de 2-10 mm.

Ulterior au fost efectuate analize macroscopice și asupra unei probe de frunză uscată, pulverizată, în urma cărora s-au aflat următoarele aspecte: culoarea unei frunze uscate este ușor înverzită, variază spre negru-brun față de celelalte probe de frunze, iar gustul și mirosul acestuia este identic cu cel probelor anterioare, fiind puțin mai scăzută intensitatea lor față de acestea.

De asemenea, a fost realizat și un examen chimic specific, asupra unei probe aleatorie de frunză de mentă de grădină, pulverizată anterior, care a constat în presarea acesteia pe o hârtie de filtru, pentru a se obține pete de substanțe terapeutice, care aparțin, în mod normal, speciilor de mentă, îndeosebi uleiuri volatile. Comform figurii de mai jos, s-au obținut astfel de pete galben-brune, cu nuanțe verzui, demonstrându-se prezența uleiurilor eterice de mentă, care se află în cantități mari în frunze.

Figura 35: Imagine cu petele galben-brune, cu nuanțe verzui lăsate de proba de frunză de mentă, pulverizată pe hârtia de filtru (examen chimic)

VI.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII PRIVIND ANALIZA MICROSCOPICĂ A FRUNZELOR DE MENTĂ DE GRĂDINĂ (MENTHA PIPERITA VARIETATEA PALESCENS)

După ce au fost efectuate analize microscopice, farmacognostice asupra a 7 probe reprezentate de diverse tipuri de frunze (o probă de frunză proaspătă, provenită din culturi mature, o alta de frunză proaspătă, provenită din culturi tinere, ambele sub forma a 2 secțiuni transversale, anterioară și posterioară, 2 probe de frunză proaspătă, fragmentată, sub forma a 2 secțiuni transversale, anterioară și posterioară și o probă de pulbere de frunză uscată), s-au obținut mai multe rezultate caracteristice, care au confirmat apartenența acestor frunze la specia de mentă de grădină (Mentha piperita varietatea palescens). De asemenea, aceste rezultate au prezentat și anumite particularități morfologice și fitochimice, ale acestor organe vegetale de mentă examinate.

Din probele de frunză proaspătă, provenită din culturi mature și cea de frunză proaspătă, provenită din culturi tinere, sub forma unei secțiuni transversale anterioară și unei alteia posterioară, se pot observa următoarele trăsături: pe fața posterioară a frunzei prezintă nervațiuni penate, deschise la culoare, iar cele secundare sunt paralele între ele, cel puțin în zona mediană a limbului foliar. Între aceste nervațiuni se află prezente peri glandulari în număr ridicat, ce prezintă contur circular, de culoare brună, pe un fond verde-deshis al țesutului asimilator. Iar pe fața posterioară, se găsesc nervațiuni mai puțin proieminente și care au peri glandulari în număr foarte mic, ce se află pe un fond verde-închis, al limbului foliar. Se mai pot observa în secțiune mici vacuole incolore, ce ar reprezenta uleiurile volatile, care ar fi eliberate în urma stimulării suprafețelor frunzelor.

a.

b.

Figura 36: Imagini cu proba de analiză reprezentată de frunza proaspătă, matură (secțiune transversală, anterioară)

(examen microscopic)

a.

b.

Figura 37: Imagini cu proba de analiză reprezentată de frunza proaspătă, matură (secțiune transversală, posterioară)

(examen microscopic)

Figura 38: Imagine cu proba de analiză reprezentată de frunza proaspătă, tânără (secțiune transversală, anterioară)

(examen microscopic)

a.

b.

Figura 39: Imagini cu proba de analiză reprezentată de frunza proaspătă, tânără (secțiune transversală, posterioară) (examen microscopic)

a.

b.

Figura 40: Imagini cu proba de analiza reprezentată de frunza proaspătă, fragmentată (secțiune anterioară)

(examen microscopic)

Figura 41: Imagine cu proba de analiză reprezentată de frunza proaspătă, fragmentată (secțiune posterioară)

(examen microscopic)

Figura 42: Imagine cu proba de analiză reprezentată de frunza uscată, pulverizată (examen microscopic)

VI.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII PRIVIND EXTRAGEREA

FRACȚIUNILOR DE ULEI VOLATIL DIN PRODUS VEGETAL

AL SPECIEI DE MENTĂ DE GRĂDINĂ (MENTHA PIPERITA

VARIETATEA RUBESCENS), PRIN METODA DISTILĂRII CU

APARAT NEO-CLEVENGER

După extragerea fracțiunilor de ulei volatil din produs vegetal sub forma a 3 probe de analiză, în vederea realizării analizelor calitative, fitochimice și comparative, acestea au fost supuse măsurării cantității lor, pentru a fi observat un prim aspect important cu privire la diferența cantitativă de ulei între probe.

Astfel, în urma realizării cântăririi fracțiunilor de ulei și a unor calcule specifice, s-a constatat faptul că randamentul de extracție din ulei din frunze uscate este mai mic decât randamentul de extracție din ulei din frunze proaspete. De asemenea, aceste calcule au relevat și diferența dintre randamentul de extracție de ulei din frunze proaspete, mature și cel din frunze proaspete, tinere, care este mai ridicată pentru primul caz. De aici este dedus faptul că organele vegetale terapeutice (frunzele) sunt mai bogate în principii active, precum uleiurile eterice în acest context, atunci când se află în stare proaspătă, imediat sau intr-o perioadă scurtă după recoltare, și când ajung la stadiul matur de dezvoltare, beneficiind de o multitudine complexă de substanțe active secretate în interior și de o cantitate ridicată pe măsură.

Calculele matematice care au ajutat la deducerea acestor observații cu privire la probele de ulei volatil sunt redate mai jos, sub forma a 3 cazuri:

Cazul I: tara flaconului gol, fără dop: 44 g

cântărirea flaconului cu ulei volatil, fără dop: 44,3 g

44 – 44,3= 0,3 g ulei volatil extras din frunze uscate de mentă

50 g frunze uscate de mentă…………………………………………..0,3 g ulei volatil extras

100 g frunze uscate de mentă……………………………………………. x1 % (Cp)

x1= 0,3 x 100/50 = 0,6 % (conc. proc. a uleiului volatil extras din frunze uscate de mentă)

Cazul II: tara flaconului gol, fără dop: 26,61 g

cântărirea flaconului cu ulei volatil, fără dop: 27,565 g

27,565 – 26,61= 0,955 g ≈ 0,96 g ulei volatil extras din frunze proaspete, tinere de mentă

123 g frunze proaspete, tinere de mentă…………………..0,96 g ulei volatil extras

100 g frunze proaspete, tinere de mentă………………………x2 % (Cp)

x2= 0,96 x 100/123= 0,78 % (conc. proc. a uleiului volatil extras din frunze proaspete, tinere de mentă)

Cazul III: tara flaconului gol, fără dop: 26,61 g

cântărirea flaconului cu ulei volatil, fără dop: 28,08 g

28,08 – 26,61= 1,47 g ulei volatil

170 g frunze proaspete, mature de mentă………………….1,47 g ulei volatil extras

100 g frunze proaspete, mature de mentă………………………x3 % (Cp)

x3= 1,47 x 100/170= 0,86 % (conc. proc. a uleiului volatil extras din frunze proaspete, mature de mentă)

Din cele 3 cazuri prezentate ⇒ 0,3 % < 0,78 % < 0,86 % ⇒ x1 > x2 > x3 ⇒

⇒ η1 (randamentul de extracție din ulei din frunze uscate de mentă) > η2 (randamentul de extracție din ulei din frunze proaspete, tinere de mentă) > η3 (randamentul de extracție din ulei din frunze proaspete, mature de mentă).

VI.4. ANALIZA CHIMICĂ, CALITATIVĂ A COMPOZIȚIEI PROBELOR DE ULEI VOLATIL REALIZATĂ PRIN METODA GAZ-CROMATOGRAFIEI ASOCIATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ (G-C CU M-S) ȘI PRIN METODA DE EȘANTIONARE DE PROBE CU DENUMIREA DE MICROEXTRACȚIE ÎN FAZĂ SOLIDĂ (SOLID-PHASE MICROEXTRACTION SAU S.M.P.E.)

În urma analizei GC-MS realizată conform metodei descrise anterior, s-au identificat compușii prezentați în tabelul următor:

Tabelul 4: Substanțe chimice, fitoterapeutice identificate în probele de ulei volatil de mentă de grădină extrase din diferite tipuri de frunze

Cromatogramele reprezentative pentru probele analizate sunt redate în figurile de mai jos:

b.

Figura 43: Cromatograma GC-MS și spectrul de masă pentru proba de ulei volatil obținută din frunza de plantă proaspătă, tânâră

a.

b.

Figura 43: Cromatograma GC-MS și spectrul de masă pentru proba de ulei volatil obținută din frunza de plantă proaspătă, matură

Principii active identificate în uleiurile volatile de mentă se regăsesc în mod majoritar în fiecare probă în parte, cu excepția anumitor substanțe ca 2,5-dietilhidrofuranul, (Z)-ocimenul, α-cariofilenul și octan-3-ol-ul, care sunt prezente sau absente într-o probă sau două, și, de asemenea, pulegona și carvona, care sunt absente din toate probele de ulei volatil, fiind substanțe potențial cancerigene care ar trebui să lipsească în mod curent din compoziția uleiurilor de mentă. În SUA a fost interzisă utilizarea lor ca aditiv alimentar de către instituțiile de reglementare americane (FDA) datorită faptului că acești compuși pot provoca cancerul. De asemenea, comform unor studii realizate de Duke University School of Medicine efectuate asupra unor persoane consumatoare de țigări electronice, mentolate, cu privire la bolile pulmonare care pot fi provocate de acestea, s-a constatat că nivelurile de pulegonă, care constituie substanța cancerigenă aflată în cantitate ridicată în compoziția țigărilor, inhalate de consumatori sunt de 1000 de ori mai ridicate decât cele din țigările mentolate, uzuale, putând avea efecte nocive la un consum regulat.

Din cromatogramele atașate mai sus, se observă picuri mai mari de mentol, acetat de mentil, neomentol și mentofuran în planta matură, ceea ce în mod normal corespunde unor cantități crescute, în timp ce pentru mentonă și izomentonă au fost observate picuri mai mari în planta tânără. Dată fiind lipsa standardelor analitice pentru efectuarea analizei cantitative, aceste observații sunt speculative.

CAPITOLUL VIII. CONCLUZII

Prin această lucrare de licență, s-a urmărit întocmirea unei lucrări complexe, care să cuprindă o prezentare amplă, privind apariția primelor informații istorice despre etimologia cuvântului mentha, precum și despre calitățile acestei plante cunoscută în toată lumea, intrată acum in categoria plantelor medicinale.

Totodată, am încercat să realizez o prezentare a trasăturilor biologice specifice familiei Lamiaceae, ce cuprinde și specia Mentha piperita, și am studiat raspândirea speciilor și subspeciilor plantei mentă pe întreg mapamondul, substanțele extrase și utilizate din această speciilor, și am efectuat o analiză farmacognostică a organelor vegetale a acestei plante.

Din substanțele extrase din mentă am prezentat modul de obținere a uleiurilor volatile, precum și echipamentele tehnice aferente metodelor de lucru.

Pentru a vedea modul de aclimatizare și dezvoltare a speciei Mentha piperita varietatea palescens, care are mediul de dezvoltare în zona montană a centrului Europei (în primul rând, Franța și Germania), am cultivat această specie în România, asupra căreia am efectuat testări macroscopice, microscopice și biochimice.

Testările au fost efectute pe șantioane de plantă în diferite faze de dezvoltare – frunze tinere, frunze mature și frunze uscate.

Din analiza de laborator a cromatogramelor obținute prin metoda gaz-cromatografiei (G-C) asociată cu spectrometria de masă (M-S), cu privire la uleiurile volatile de Mentha piperita varietatea palescens, extrase cu ajutorul metodei distilării speciale cu aparat Neo-Clevenger, s-a constatat că probele de mentă obținute conțin, în mare parte, cam aceleași principii active importante și benefice terapeutic, cu unele mici excepții, și sunt lipsite de aceleași impurități (carvona și pulegona). De aici, se constată că uleiurile volatile de mentă extrase, indiferent de perioada de dezvoltare a plantei, vor avea aceeași puritate și aceeași compoziție fitochimică, astfel vor putea fi folosite în industria farmaceutică (pentru obținerea de noi medicamente fitoterapeutice sau suplimente alimentare) cu succes, fiind la fel de sigure și eficace.

În urma experiențelor efectuate, am demonstrat că specia Mentha piperita varietatea palescens poate fi cultivată cu succes în zona de șes a României, pe suprafețe mari, și poate fi la fel de benefică pentru sănătatea pacienților ca și specia locală de mentă, Mentha piperita varietatea rubescens.

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

Avram R., Andronescu E., Fuzi I. „ Botanica farmaceutică “ , Editura Didactică și Pedagogică, București, 1991, pag. 15

Dumitru Dobrescu, MENTHA D., PharMentha B., „ Fitoterapie pe baza clasificării farmacologice a plantelor medicinale- Herbal ATC index- adoptată de organizația mondială a sănătății/ Plantele izvor de sănătate “, Editura Universitară, București, 2015, pag. 11

David Hoffmann, „ Ghidul complet al plantelor medicinale și al bolilor pe care le vindecă “, traducere facută din engleză de Ianina Marinescu, Editura Lifestyle Publishing, 2016, pag. 3

Gabriela Păun, Oana Gheorghe, Mirela Diaconu, recenzie: Gabriel Lucian Radu, colectiv tehnoredactare: Iris Mateescu, George Roată, Ștefan Popescu, Laura Păun, „ Curs de procesare avansată a plantelor medicinale “ , sub titulatura UE, septembrie 2011, pag. 1

Doctorand Radu Ioan Moldovan și conducător de doctorat prof. dr. Radu Oprean, lucrare de doctorat-„ Studiul fitochimic comparativ al unor specii de Mentha din familia Lamiaceae, cu uleiuri volatile ”, septembrie 2012, pag. 4

Prof.dr. Viorica Istudor, „ Farmacognozie, fitochimie, fitoterapie “, vol.II, Editura Medicală, București, 2001, pag. 2-8, pag. 13-15

Nicholas Sadgrove și Graham Jones, „ A Contemporary Introduction to Essential Oils: Chemistry, Bioactivity and Prospects for Australian Agriculture “, Editura Muraleedharan G. Nair, New England, Australia, martie 2015, pag. 49-51

R. Ramasubramania Raja, Departament of Pharmacognosy, Jagan’s College of Pharmacy, A.P., „ Medicinaly Potential Plants of Labiatae (Lamiaceae) Family: An overview “, pag. 203-204

Fatihna Brahmi, Madani Khodir, Chibane Mohamed and Duez Pierre, „ Aromatic and Medicinal Plants-Back to Nature “, Cap.3 „ Chemical Composition and Biological Activities of Mentha Species “, pag. 47-49, pag. 50-52, pag. 53-56

Silvia Oroian, Manuela Curticăpean, Universitatea de Medicină și Farmacie Târgu-Mureș, Facultatea de Farmacie, „ Botanică farmaceutică- lucrări practice “, 2008, pag. 15-18

Ursula Stănescu, Anca Miron, Monica Hăncianu, Clara Aprostosoaie, „ Plante Medicinale de la A la Z; Monografii ale produselor de interes terapeutic “, volumul I, Editura G.T. Popa , U.MENTHA F. Iași, 2004, pag. 388-392

P. Pushpangadan, S.K. Tewari, „ Handbook of Herbs and Spices “, Volume 3, 2006, pag. 1

Zahra Memariani, Mohammad Hosein Farzaei, „ Phytonutrients in Food “, 2020, pag. 1-5

Viorica Cioroiu, Liana Toma, Valentina Alexandru, Lucia Moldovan, Iris Cristescu, George Roată, Ștefan Popescu, Laura Păun, „ Ghid de utilizări ale plantelor medicinale și aromatice în gastronomie, igienă corporală și aromaterapie “, sub titulatura UE, ianuarie 2012, pag. 9-11

Ecaterina D. Răducanu, „ Terapia naturistă “ , Editura Științifică, București, 1992, pag. 144-145

Florentin Crăciun, Mircea Alexan, Carmen Alexan, „ Ghidul plantelor medicinale uzuale “, Editura Științifică, București, 1992, pag. 222-223

Conferențiar dr. Silvia Robu, „ Farmacognozie “, Editura Zigotto, Galați, pag. 8-13

Ion Pirnă, Emil Voicu, Mircea Radu, Radu Ciupercă, Adriana Muscalu, coordonator lucrare: Ion Pirnă, colectiv tehnoredactare: Iris Mateescu, George Roată, Ștefan Popescu, Laura Păun, „ Ghid tehnologii de recoltare a plantelor medicinale și aromatice din zona Călărași-Silistra “,

sub titulatura UE, ianuarie 2012, pag. 2-4, pag. 15

Articol științific scris de Gheorghe Valentin Roman, „ Menta, o plantă medicinală ușor de cultivat în sistem ecologic. Tehnologia de cultivare a mentei “, 1 august 2011

Leon Sorin Munteanu, „ Tratat de plante medicinale cultivate și spontane “, Editura Risoprint, Cluj-Napoca, 2007, pag. 47-48

„ Farmacopeea Română, ediția a X-a “, Editura Medicală, București, 1993, pag. 1051-1055, pag. 1046-1047

Articol științific intitulat „ Părți componente și informații generale despre microscoape “ de pe site-ul specializat pe activități de laborator „ www.multilab.ro “

Lucrare științifică scrisă de Alina Balaban, „ II. Analiza cromatografică “, pe site-ul

de lucrări științifice „ www.independent.academia.edu “, pag. 4-8

Elena Jercan, „ Analiza cromatografică “, Editura Academiei Republicii Socialiste România, București, 1982, pag. 187-190 și pag. 197-198

Loredana F. Leopold, Carmen Socaciu, „ Chimie Fizică și Coloidală – Îndrumător de lucrări practice “, Editura AcademicPres, Cluj-Napoca, 2015, pag. 27

Terrence A. Lee, „ A Beginner’s Guide to Mass Spectral Interpretation “, Editura Wiley, 1998, pag. 8-10

Agata Spieletun, Michał Pilarczyk, Adam Kloskowski, Jacek Namieśnik, „ Current trends in solid-phase microextraction (SMPE) fibre coatings “, lucrare științifică publicată în Chemical Society Reviews. 39 (11), 2010, pag. 4524-4537

Somenath Mitra, „ Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry “, Editura Wiley-Interscience, 2003, pag. 113

György Vas, Károly Vékey, „ Solid-phase microextraction: a powerful sample preparation tool prior to mass spectrometric analysis “, lucrare științifică publicată în Journal of Mass Spectrometry. 39 (3), 2004, pag. 233-254

Agata Spieletun, Adam Kloskowski, Wojciech Chrzanowski, Jacek Namieśnik,

„ Understanding Solid-Phase Microextraction: Key Factors Influencing the Extraction Process and Trends in Improving the Techniques “, lucrare științifică publicată în Chemical Society Reviews. 113 (3), 2012, pag. 1667-1685

Nathaly Reyes-Garcés, Emanuela Gionfriddo, German Augusto Gómez-Ríos, Nazmul Md. Alam, Ezel Boyaci, Barbara Bojko, Varoon Singh, Jonathan Grandy, Janusz Pawliszyn,

„ Advances in Solid-Phase Microextraction and Perspective on Future Directions “, lucrare științifică publicată în Analytical Chemistry. 90 (1), 2017, pag. 302-360

ANEXE

R. Ramasubramania Raja, Departament of Pharmacognosy, Jagan’s College of Pharmacy, A.P., „ Medicinaly Potential Plants of Labiatae (Lamiaceae) Family: An overview “, tab.1, pag. 204

https://ro.wikipedia.org/wiki/Lamiaceae#/media/Fi%C8%99ier:Lamium_maculatum_top.jpg – poză

https://www.wildflowers-an weeds.com/Plant_Families/Lamiaceae.html – poză

Fatihna Brahmi, Madani Khodir, Chibane Mohamed and Duez Pierre, „ Aromatic and Medicinal Plants-Back to Nature “, Cap. 3 „ Chemical Composition and Biological Activities of Mentha Species “, pag. 49, fig. 1

https://commons.wikimedia.org/wiki/File și https://www.pinterest.com- poze

https://ro.wikipedia.org/wiki/Izm%C4%83_bun%C4%83#/media/Fi%C8%99ier:Mentha_%C3%97_piperita_-_K%C3%B6hler%E2%80%93s_Medizinal-Pflanzen-095.jpg – poză

https://www.vivaipriola.com/mentha-piperita-rubescens/- poză

https://albrigiinherba.com/officinal-plants/peppermint /- poză

Fatihna Brahmi, Madani Khodir, Chibane Mohamed and Duez Pierre, „ Aromatic and Medicinal Plants-Back to Nature “, Cap. 3 „ Chemical Composition and Biological Activities of Mentha Species “, pag. 50-52, tabelul 1

http://kids.britannica.com – poză

Gabriela Păun, Oana Gheorghe, Mirela Diaconu, recenzie: Gabriel Lucian Radu, colectiv tehnoredactare: Iris Mateescu, George Roată, Ștefan Popescu, Laura Păun, „ Curs de procesare avansată a plantelor medicinale “ , sub titulatura UE, septembrie 2011, pag. 14, fig. 1

Prof. dr. Viorica Istudor, „ Farmacognozie, fitochimie, fitoterapie “, vol.II, Editura Medicală, București, 2001, pag. 4, poză

Prof. dr. Viorica Istudor, „ Farmacognozie, fitochimie, fitoterapie “, vol.II, Editura Medicală, București, 2001, pag. 5, poză

Prof. dr. Viorica Istudor, „ Farmacognozie, fitochimie, fitoterapie “, vol.II, Editura Medicală, București, 2001, pag. 6, poză

Prof. dr. Viorica Istudor, „ Farmacognozie, fitochimie, fitoterapie “, vol.II, Editura Medicală, București, 2001, pag. 7, poză

16. Fatihna Brahmi, Madani Khodir, Chibane Mohamed and Duez Pierre, „ Aromatic and Medicinal Plants-Back to Nature “, Cap. 3 „ Chemical Composition and Biological Activities of Mentha Species “, pag. 54, tabelul 2

17. Ursula Stănescu, Anca Miron, Monica Hăncianu, Clara Aprostosoaie, „ Plante Medicinale de la A la Z; Monografii ale produselor de interes terapeutic “, volumul I, Editura G.T. Popa , U.MENTHA F. Iași, 2004, pag. 390, poză

18.

https://www.multilab.ro/microscop/despre_microscoape.html- poză

19. Nicholas Sadgrove și Graham Jones, „ A Contemporary Introduction to Essential Oils: Chemistry, Bioactivity and Prospects for Australian Agriculture “, Editura Muraleedharan G. Nair, New England, Australia, martie 2015, fig.1, pag. 53

20. Elena Jercan, „ Analiza cromatografică “, Editura Academiei Republicii Socialiste România, București, 1982, fig. 5.1., pag. 187

21. Terrence A. Lee, „ A Beginner’s Guide to Mass Spectral Interpretation “, Editura Wiley, 1998, fig. 2.1, pag. 1

22. http://www.andersonmaterials,com/gas-cromatography-mass-spectroscopy-gc-ms.html – poză