Studiul actual al cercetărilor în domeniul obținerii și separării unor acizi carboxilici produși prin biosinteză [304545]

Partea I

Studiul actual al cercetărilor în domeniul obținerii și separării unor acizi carboxilici produși prin biosinteză

I. 1. Acizi carboxilici obtinuți prin fermentație

Una dintre cele mai importante ramuri ale biotehnologiei are ca scop obținerea pe cale industrială a diverselor produse necesitând participarea nemijlocită a microorganismelor. [anonimizat], variate medii nutritive (solide, lichide, semilichide) și metode de cultivare ([anonimizat], culturi în flux continuu). Biotehnologiile tradiționale sunt utilizate cu succes în industriile alimentară și farmaceutică. [anonimizat] (glucide, [anonimizat], aminoacizi, baze azotate) în condiții aerobe sau anaerobe și formarea produselor intermediare ([anonimizat], [anonimizat], etanol, butanol, propanol, acetonă). La procesele fermentative participă drojdii (fermentația alcoolică), bacterii lactice (fermentația lactică), bacterii butirice (fermentația butirică) și bacterii propionice (fermentația propionică) [1].

[anonimizat] o grupare carboxil. [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], farmacie, polimeri și medicamente. Multe dintre acestea acizii carboxilici pot fi produși în mod natural sau există ca intermediari în căile metabolice primare din unele microorganisme.

Obținerea prin procese fermentative a acizilor organici se efectuează prin:

– blocarea proceselor ce asigură utilizarea produselor intermediare (a acizilor organici)

– influențarea mecanismelor ce controlează procesele de sinteză a substanțelor respective [2].

Unii dintre acești acizi ([anonimizat], [anonimizat], și acid citric) sunt obținuți prin fermentarea aerobă a glucozei pe calea glicolitică. Făina de porumb hidrolizată cu amilaze a [anonimizat], acid butiric și prin fermentare anaerobă. Procesul de fermentare aerobă care să conducă la formarea acizilor organici reprezintă una dintre cele mai bine stabilite căi microbiene de conversie [3].

Cei mai utilizați acizi carboxilici obținuți prin procese de fermentație sunt prezentați în tabelul I.1.

Tabelul I.1. Acizi carboxilici obținuți prin fermentație [1]

În timpul proceselor de biosinteză pe lângă produsul util se mai pot obține și alte produse care se găsesc în lichidul de fermentație. [anonimizat] a [anonimizat]: [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], acid itaconic și alții.

Acidul fumaric este un acid organic natural cunoscut sub diferite denumiri: [anonimizat], acid trans-1,2-etilendicarboxilic, acid 2-butendioic, [anonimizat], [anonimizat]. Este un acid dicarboxilic cu patru atomi de carbon și are următoarea structură:

Figura Structura acidului fumaric

Acidul fumaric a fost prima dată izolat din planta Fumaria officinalis și de aici îi provine și numele. Multe microorganisme produc acidul fumaric în cantități mici deoarece este un intermediar cheie în ciclul de obținere a acidului citric.

Acidul fumaric se poate obține prin diferite metode, fie prin sinteză sau prin biosinteză.

Deoarece prin sinteză, acidul fumaric se obține dintr-un derivat al petrolului și cum prețul petrolului este ridicat, se preferă obținerea acestuia prin biosinteză datorită costului de obținere mai scăzut. Prin fermentație, acidul fumaric se obține utilizându-se microorganisme din specia Rhizopus și anume Rhizopus oryzae. Acest microorganism este un fung filamentos și unul dintre cei mai cunoscuți producători de acid fumaric. Fermentația durează 168 de ore și este un proces aerob.

Acidul citric (acid tricarbo-1,2,3-hidroxi-propanoic C6H8O7) este un acid tricaboxilic care se prezintă ca o pulbere incoloră, cu un gust acru, ușor solubil în apă. Este cunoscut și sub numele de sare de lămâie.

Figura 1. Structura acidului citric

Acidul citric este un compus utilizat în multe domenii, și anume:

– este utilizat pe scară largă în produsele cosmetice pentru ajustarea pH-ului în formulări, ca agent de chelare sau antioxidant

– antioxidant, acidifiant, agent de chelare blând

– pentru dizolvarea carbonatului de calciu în procesul de curățare a cazanelor sau vaselor de bucătărie

– la conservarea produselor alimentare (de exemplu în cazul băuturilor răcoritoare se utilizează sub forma E330)

– ca peptizator folosit la stabilizarea unor suspensii

– reduce sau împiedică coagularea sângelui, de aceea este folosit la conservarea sângelui pentru transfuzii în medicină, în raport de 10:1 sânge/citrat de calciu

– citratul de calciu se utilizează ca hrană pentru câinii cu deficințe de calciu

– citratul de magneziu se folosește în cazul deficiențelor de magneziu din organism

– citratele servesc la reglarea pH-ului unor medicamente

– citratul de sodiu este folosit în construcții ca reglator a vitezei de legare a cimentului

– reduce coroziunea metalelor nobile

Acidul citrica are însă și efecte negative:

– în doze mari are efect negativ scăzând pH-ul în alimente și astfel crește însă incidența cariilor dentare

– un alt efect negativ îl are în alimentația sugarilor, favorizează absorbția în sânge a metalelor grele (cadmiu, plumb)

În prezent, acidul citric este produs în scop comercial prin fermentația submersă a melasei cu ajutorul microorganismului Aspergillus niger. La începutul anului 1893, producția de acid citric prin fermentarea fungică a fost descoperit pentru prima dată (Papagianni, 2007) și de atunci până în 1916 a fost folosită această metodă. Începând cu 1916 s-a constat că Aspergillus niger a crescut bine la un interval scăzut de pH 2,5-3,5 și concentrații mari de zahăr, fapt care determină creșterea producției de acid citric (Soccol et al., 2006).

De atunci, această metodă a devenit predominantă, chiar dacă alte metode, inclusiv sinteza chimică și fermentarea prin drojdii, au fost de asemenea încercate.

În zilele noastre, producția globală anuală de acid citric atinge milioane de tone, China fiind cea mai mare țară producătoare de acid citric, reprezentând aproximativ 40% cantitate oținută la nivel mondial. Cu toate acestea, în ciuda succesului producției utilizând Aspergillus niger, mai multe aspecte, inclusiv elucidarea mecanismului de producere a acidului citric și controlul morfologiei celulare, nu sunt încă abordate complet. [1]

Acidul malic (acid hidroxisuccinic), C4H6O5, este un acid organic slab care se găsește din abundență în sucurile multor plante, dar în mod special în fructe de pădure, în măr și în strugure. În scopuri comerciale este obținut prin sinteză. Este parte din metabolismul fiecărei celule vii, participând ca ion la ciclul Krebs.

Figura 2. Structura acidului malic

În ciclul Krebs, acidul malic rezultă prin deshidratarea acidului fumaric de către fumarază iar mai departe e dehidrogenat la acid oxalilacetic de malat dehidrogenază.

O metodă prin care se poate obtine acidului malic este cataliza enzimatică în care acidul l-malic este produs din acidul fumaric prin imobilizarea celulelor bacteriene (Brevibacterium flavum) care conțin fumarază.

Obținerea prin fermentație a acidului malic a fost, de asemenea, demonstrată cu Aspergillus flavus, atingând un nivel ridicat și având o producție de 113 g/l cu un randament molar de 126% (Battat et al., 1991). Cu toate acestea deoarece Aspergillus flavus produce și niște alfatoxine nu poate fi utilizat ca producător de produse chimice utilizatein industria alimentară.

Cercetările curente își îndreaptă atenția către alte microorganisme, inclusiv asupra unor tulpini care pot fi utilizate în fermentarea acidului malic. [1]

Acidul itaconic este un acid dicarboxilic, solid, de culoare albă, solubil în apă, alcool etilic și acetonă.

Figura 3. Structura acidului itaconic

Producția comercială curentă de acid itaconic din carbohidrați se realizează prin fermentația cu fungi filamentoși utilizându-se ca microorganism producător Aspergillus terreu. Producția de acid itaconic prin fermentație a fost realizată pentru prima dată de Charles Pfizer Co. în Statele Unite în 1955, urmată de mulți producători din Europa, Rusia, Japonia și India, China (Willke și Vorlop, 2001). Mai târziu, datorită pieței limitate interesul pentru producția de acid itaconic a scăzut începând cu anii 1970. Producția curentă este în principal în China. Productivitatea fermentației este relativ scăzută și nu a depășit niciodată 1 g/l·h, iar concentrația produsului final mai mică de 80 g/l. [1]

Acidul succinic cunoscut și ca spirit de chihlimbar, este un acid dicarboxilic. Succinatul joacă un rol biochimic în ciclul acidului citric (ciclul Krebs).

Figura 4. Structura acidului succinic

Acidul succinic este un produs de fermentație și poate fi transformat în acid fumaric prin oxidare.

Datorită randamentului scăzut de bioconversie a substratului în acid succinic, fie a reologiei nenewtoniene și a compoziției complexe a mediului de cultură final, numai tulpinile de Actinobacillus succinogenes și Actinobacillus succiniproducens au fost considerate producători importanți de acid succinic. Aceste microorganisme posedă abilitatea de a converti diverse surse de carbon în acid succinic și alți acizi secundari (acizii formic, acetic, piruvic). Tulpina de Actinobacillus succinogenes a fost cultivată pe medii conținând ca substrat glucoză, zaharoză, melasă, glicerină, amidon, hidrolizate celulozice sau subproduse de morărit. Majoritatea sistemelor de fermentație pentru obținerea acidului succinic au utilizat celule libere de Actinobacillus succinogenes, procesul putând fi afectat de fenomene de inhibiție de substrat și produs. Nu există date în literatură cu privire la utilizarea acestui microorganim sub formă imobilizată, cu excepția informațiilor despre creșterea acestei bacterii sub formă de biofilm pe suporturi inerte de materiale compozite. [2]

Acidul lactic este un acid organic slab, care joacă un anumit rol în anumite procese biochimice. Are un rol decisiv în anumite procese de fermentație, cum ar fi pregătirea silozului pentru animale, sau (în industria laptelui) la producerea produselor din lapte, iaurt, chefir, urdă, brânză, etc.

Figura 5. Structura acidului lactic

Acidul lactic este un acid carboxilic cu formula chimică brută C3H6O3 și formula structurală CH3-CH-(OH)-COOH. Are un grup auxiliar hidroxil atașat grupării carboxilice, ceea ce îl încadrează în categoria acizilor alfa-hidroxilici (uneori cunoscuți ca AAH). În soluție, ca orice acid monobazic, pierde un proton producând ionul lactat, CH3CH(OH)COO−.

În procesele fermentative, acidul lactic se obține cu ajutorul microorganismelor din clasa bacteriilor lactice Bacillus, Lactobacillus și Pediococcus.

Bacteriile lactice sunt homofermentative și heterofermentative și pot produce atât stereoizomerul L (+) cât și D (−) sau mixul racemic al acidului lactic. Avantajul semnificativ, dicolo de cel al sintezei chimice, îl reprezintă posibilitatea de a produce acid lactic prin metode biologice și posibilitatea utilizării de substraturi ieftine ca: zer, melasă, reziduu de amidon, sfeclă, trestie de zahăr, suc de lucernă sau alte surese bogate în carbohidrați și nutrienți esențiali pentru dezvoltarea bacteriilor (Anuradha și colab., 1999; Ritcher și Berthold, 1998; Tsao și colab., 1999; Vishnu și colab., 1998, 2000; Vodnar și colab., 2010).

Acidul acetic este un acid slab, cel mai simplu acid din clasa acizilor carboxilici, având formula brută C2H4O2 și formula chimică CH3-COOH. Numit și acid etanoic, acidul acetic este un lichid incolor cu miros pătrunzător și iritant.

Figura 6. Structura acidului acetic

Acidul acetic este produs la nivel industrial atât prin fermentare bacteriană, cât și prin sinteză chimică. La ora actuală, doar 10% din producția mondială de acid acetic se face pe cale biologică, cea care rămâne de bază pentru obținerea oțetului, cu atât mai mult cu cât legislația multor țări impune ca oțetul de uz alimentar să fie de origine naturală. Se poate obține prin fermentație anaerobă și oxidativă.

Pentru o lungă perioadă a istoriei omului, acidul acetic, sub formă de oțet, a fost produs cu ajutorul bacteriilor din genul Acetobacter. În condițiile prezenței abundente de oxigen, aceste bacterii pot produce oțet pornind de la o largă varietate de alimente fermentabile.

Unele specii de bacterii anaerobe, incluzând pe unele din genul Clostridium, pot transforma zaharidele direct în acid acetic, fără utilizarea etanolului ca produs intermediar. Reacția generală determinată de aceste bacterii se poate scrie:

C6H12O6 → 3 CH3COOH

Capacitatea bacteriilor din genul Clostridium de a utiliza direct zaharidele sau de a produce acid acetic din materii prime mai ieftine demonstrează că acestea ar putea produce acid acetic mai eficient decât oxidanții etanolului ca Acetobacter. Totuși, bacteriile Clostridium sunt mai puțin tolerante la mediu acid decât Acetobacter. Chiar si cele mai tolerante la acid dintre sușele de Clostridium nu pot produce decât un oțet de o concentrație de doar câteva procente, comparativ cu unele sușe de Acetobacter care pot produce un oțet de o concentrație de până la 20%. La ora actuală rămâne mai rentabilă producerea oțetului cu ajutorul sușelor de Acetobacter decât prin fermentarea anaerobă urmată de concentrare. [3]

I. 2. Microorganisme utilizate în fermentații

Utilizarea microorganismelor într-o lume a sintezelor chimice poate fi apreciată prin aceea că, numeroși compuși utili activității umane se obțin mai eficient prin fermentație decât prin sinteză chimică.

Avantajele utilizării microorganismelor în industria de biosinteză sunt următoarele:

– aria interfacială de contact dintre celule și mediu este ridicată ceea ce conduce la un consum mai rapid a elementelor nutritive din mediu și conduce în același timp și la atingerea unor viteze mari ale proceselor metabolice și de biosinteză

– varietate mare a reacțiilor care pot fi biocatalizate de microorganisme

– posibilitatea adaptării acestora la o gamă largă de medii

– ușurința manipulării genetice, atât în vivo, cât și în vitro în scopul creșterii productivității, a modificării structurii și activității microbiene

– abilitatea de a biosintetiza enantiomeri specifici [4].

Microorganismele deși se prezintă într-un număr foarte mare și sunt foarte răspândite, ele prezintă anumite particularități (numărul de cromozomi din celulă, forma nucleului, existența mitocondriiolor, prezența peretelui celular etc.) care au condus la clasificarea acestora în două grupe principale, conform schemei următoare:

Figura 7. Clasificarea tipurilor de microorganisme

Bacteriile sunt microorganisme unicelulare, sporulate sau nesporulate cu o structură foarte simplă, care se înmulțesc prin diviziune celulară directă. Bacteriile se dezvoltă aerob sau anaerob în toate mediile iar prin acțiunea enzimelor proprii asigură echilibru biochimice în natură.

Bacteriile sunt utilizate pe scară largă în industria de biosinteză în obținerea antibioticelor, vitaminelor, alcoolilor, acizilor carboxilici, aminoacizilor, proteinelor și enzimelor, în industria alimentar, pentru obținerea derivatelor din lapte, în medicină etc.

Actinomicetele din punct de vedere morfologic se situează între bacterii și fungi. Compoziția peretelui celular și absența membranei nucleare determină plasarea acestor în categoria bacteriilor iar structura filamentoasă, cu celule ramificate prin care formează hife asemănătoare fungilor le plasează în categoria fungilor.

Se utilizează în general în obținerea unor antibiotice cu activitate superioară folosite în controlul infecțiilor microbiene la om, animale și plante.

Levuri sau drojdiile sunt microorganisme eucariote unicelulare saprofite sau parazite din clasa actinomicetelor, utilizate în industria fermentativă, în industria de biosinteză în scopul obținerii proteinelor furajelor, pentru obținerea pâinii, berii, vinului, alcoolului etilic și a altor produse.

Fungii sau mucegaiurile sunt microorganisme care se prezintă sub formă filamentoasă, cu diverse dimensiuni și care formează un miceliu care produce degradarea mediului în care se dezvoltă. Aceștia au capacitatea ridicată de adaptare la condițiile de mediu în care dezvoltă iar nutriția lor este de tip heterotrof ceea ce le permite să metabolizeze glucide, alcooli, acizi, proteine, săruri de amoniu, nitrați.

Tabel 1. Fungi de interes practic

Toți acești fungi de interes practic sunt aerobi și necesită cantități mari de oxigen.

De asemenea, au o capacitate mare de mutație, ceea ce le oferă posibilități biosintetice ridicate, putând sintetiza pe căi metabolice acizi organici, antibiotice, pigmenți, lipide, enzime etc. [4]

Acidul fumaric se obține în cantități importante utilizând microorganisme de tipul fungilor, clasa Phycomycetes, genul Rhizopus.

În domeniul producției de acid fumaric prin fermentație, există multe aspecte care determină productivitatea procesului de fermentație, dar în special se ține cont de tulpina microbiană utilizată și morfologia sa.

Chiar dacă studiul de mai jos implică doar utilizarea tulpinilor de Rhizopus a fost luată în considerare și folosirea bacteriilor cum ar fi Lactobacillus și Escherichia coli în obținerea acidului fumaric, însă acest fapt necesită mai multe metode de prelucrare pentru obținerea în final a acestui acid dar poate fi o nișă de cercetare.

După descoperirea producției de acid fumaric cu ajutorul genului Rhizopus nigricans de Felix Ehrlich în 1911, Foster și Waksman (1938) au analizat 41 de tulpini de la opt genuri diferite încercând să identifice tulpinile producătoare de acid fumaric. Pentru producerea acestuia au fost luate în considerare următoarele specii de fungi Rhizopus, Mucor, Cunninghamella, și specie Circinella. Dintre toate speciile, Rhizopus (nigricans, arrhizus, oryzae, and formosa) a fost cel mai productiv, producând acid fumaric atât în condții aerobe, cât și anaerobe (Foster și Waksman 1938; Rhodes și colab., 1959; Kenealy și colab. 1986; Cao și colab. 1996; Carta și colab. 1999).

Tabel 2. Tipuri de microorganisme utilizate în obținerea acidului fumaric

Așa cum se observă mai sus tulpinile R. arrhizus NRRL 2582 și R. oryzae ATCC 20344 au productivitatea și randamentul cele mai mari în comparație cu celelalte tulpini [5].

Prin urmare, se va alege ca microorganism producător R. oryzae. Însă, nu toate tulpinile de Rhizopus oryzae sunt și producătoare de acid fumaric, acestea clasificându-se în două tipuri.

Primul tip de tulpină (I) – R. oryzae ATCC 20344 produce acid fumaric dar poate produce în cantități mici sau chiar deloc și acid lactic. Al doilea tip de tulpină (II) – R. oryzae ATCC 52918 produce acid lactic și poate produce sau nu acid fumaric. De aceea, la scară industrială se utilizează și se lucrează cu tipul I de tulpină pentru că doar acesta produce în cantități mari acid fumaric.

Morfologia microorganismelor

Morfologia microorganismului este un factor important care trebuie controlat pentru obținerea unei productivități crescute și a unui randament ridicat.

Fungii prezintă trei tipuri de morfologii și anume: filamentoasă, peleți și smocuri. Morfologia fungilor este dificil de controlat și este influențată de pH, agitare, forțele de forfecare, temperatură, modul de preparare a inocului sau presiunea osmotică.

Figura 8. Diferite tipuri de morfologii ale fungilor

Fungii sub formă de smocuri cauzează limitări interne ale oxigenului în celule care afectează scăderea producției de biomasă (etapa de creștere) și prin urmare și scăderea producției de acid fumaric (etapa de producere). Această formă este foarte puțin utilizată în procesele de fermentație.

Forma filamentoasă crește odată cu ramificarea miceliului și este favorabilă pentru producerea unor enzime ca amilaze, pectinaze, celulaza sau xilanaze și este preferată atunci când se folosește Rhizopus oryzae cu amidon ca sursă de carbon. Dezavantajul filamentelor este creșterea vâscozității mediului de fermentație.

Dintre cele trei forme morfologice, utilizarea peleților conduce creșterea randamentului procesului de biosinteză a acidului fumaric. Dimensiunea peleților este de asemenea un aspect important, eficiență ridicată onținîndu-se atunci când în procesul de fermetație se folosesc peleții cu dimensiune mai mică de 1 mm.

Un alt avantaj al peleților este vâscozitatea lor scăzută în mediu în comparație cu forma filamentoasă. Formarea peleților poate fi împărțită în două categorii: agregate și neagregate.

Forma agregată este datorată de multiplicarea sporilor și formarea agregatelor pornind de la mai mulți spori care se formează mai apoi în peleți, în timp ce forma neagregată este rezultatul formării peleților pornind de la un singur spor [6].

I. 3. Metode de separare a acizilor carboxilici

Scopul proceselor de fermentație îl reprezintă fie obținerea biomasei microbiene, fie a metaboliților primari (aminoacizi, acizi organici, etanol, butanol, vitamine, acetonă etc), și a metaboliților secundari (antibiotice, alcaloizi, hormoni de creștere, substanțe tumorale etc), a enzimelor microbiene (proteaze, amilaze, lipaze, pectinaze, catalaze, invertaze etc), a polizaharidelor microbiene (xantani, dextrani etc). Produsele menționate mai sus se pot găsi în faza lichidă sau în interiorul celulelor.

Din aceste motive, procedeele de separare utilizate în tehnologiile de biosinteză se pot clasifica în două grupe principale:

– procedee de separare a fazei solide (masa microbiană), care se folosește apoi ca atare sau se prelucrează pentru separarea produselor utile intracelulare

– procedee de separare a metaboliților, enzimelor, polizaharidelor, microbiene etc. din soluția apoasă

Alegerea procedeului de separare a fazei se face în funcție de proprietățile fizice, chimice sau biologice ale mediului, precum și de cantitatea de mediu care trebuie prelucrată.

În cazul produselor de metabolism atât primar cât și secundar, biomasa se usucă, se macină prin diferite procedee, în scopul distrugerii membranei celulare, după care se supune extracției cu solvenți.

Separarea produselor utile din soluția rezultată de la fermentație, după îndepărtarea fazei solide, constituie o problemă majoră din cauza labilității structurale a produselor biosintetizate.

După cum afirmă Michaels în 1992, în domeniul biotehnologiilor există patru direcții principale de studiu:

– biosinteza

– caracterizarea și controlul structurii

– controlul proceselor chimice și biochimice

– separarea și purificarea produselor de biosinteză

Pentru separarea produselor utile din faza lichidă rezultată de la fermentație, se pot aplica următoarele tehnici:

– extracția fizică cu solvenți

– extracția reactivă în solvenții organici cu diferiți extractanți

– extracția cu fluide supercritice

– extracția în sisteme apoase bifazice

– sorbția pe schimbători de ioni

– distilarea

– cromatografia

– separarea și concentrarea prin tehnici membranare (ultrafiltrare, osmoză inversă, electrodializa)

– complexarea produsului biosintetizat cu reactivi specifici, distrugerea complexului și extracția cu solvenți

– precipitarea etc. [4]

Separarea acizilor carboxilici reprezintă un domeniu de mare interes datorită numeroaselor aplicații și utilizări ale acestora în diferite ramuri, cum ar fi: industria chimică, farmaceutică, alimentară, o atenție deosebită acordându-se metodelor de separare prin extracție reactivă. În cele ce urmează se vor prezenta câteva dintre metodele menționate mai sus prin care se pot separa acizii carboxilici.

I. 3. 1. Separarea cu ajutorul schimbatorilor de ioni

Acizii carboxilici (compuși carboxilici) sunt acizi organici care conțin în molecula lor o grupă funcțională carboxil (-COOH), formată din un atom de carbon legat dublu de un atom de oxigen și legat simplu de o grupă hidroxil (-OH), scrisă de obicei ca -COOH. Prin urmare, datorită prezenței grupei hidroxil, acești compuși pot face parte ușor din reacții de dublu schimb ionic.

Reacțiile de schimb ionic fac parte din categoria reacțiilor de dublu schimb care pot avea loc în sistemele eterogene solid-lichid sau lichid-lichid. În acest caz, ionii din soluție sunt preluați de schimbătorii de ioni, aceștia cedând soluției ioni de același semn:

R-H+ + M+X- ↔ R-M+ + H+X-

R+OH- + M+X- ↔ R+X- + M+OH-

Schimbătorii de ioni se împart în două categorii:

– cationiți (R-H+) sau schimbători de cationi

– anioniți (R+OH-) sau schimbători de anioni

Regenerarea schimbătorilor de ioni, cu refacerea structurii inițiale și retrecerea ionilor reținuți în soluții, se realizează diferit și este în funcție de tipul ionului:

– cationiții se tratează cu soluții acide (HCl, H2SO4)

RM + HCl ↔ RH + MCl

– anioniții se tratează cu soluții alcaline

RX- + MOH ↔ ROH +MX

Separarea prin schimb ionic este o operație care se realizează printr-o succesiune de mai multe etape:

1. Reținerea ionilor din soluția supusă separării

2. Eluția ionilor reținuți pentru retrecerea lor în soluție

3. Spălarea schimbătorilor de ioni pentru îndepărtarea eluentului reținut fizic

4. Regenerarea schimbătorilor de ioni

5. Spălarea schimbătorilor regenerați

6. Afânarea stratului de schimbători de ioni (pentru rășini depuse în strat fix) [7].

În funcție de structura chimică, schimbătorii de ioni se clasifică în organici, anorganici și rășini schimbătoare de ioni.

Schimbătorii organici de ioni, numiți și rășini schimbătoare de ioni, sunt caracterizați prin două componente structurale principale: suportul rășinei, care este de natură organică polimerică, pe care sunt grefate grupările funcționale care participă la procesul de schimb ionic. Structura polimerică asigură stabilitatea mecanică a schimbătorului de ioni și stabilitatea chimică față de mediul solvatant.

Grupările funcționale, cu caracter acid sau bazic, care la rândul lor pot fi cu caracter tare sau slab, asigură interacțiunea electrostatică cu ioni de semn contrar din vecinătate. Ele vor interacționa atât cu speciile ionice din vecinătatea sa, cât și cu specii moleculare neutre, cum este apa, prin interacții ion-ion sau ion-dipol.

Rășinile schimbătoare de ioni sunt compuși macromoleculari sintetici care conțin grupări polare ionizabile ce favorizează schimbul ionic. Rășinile schimbătoare de ioni pot fi sub formă de particule solide sau geluri.

Rășinile solide permit difuzia intern a ionilor din soluția unui electrolit, proces facilitat de caracterul hidrofil al acestor ioni.

Rășinile sub formă de gel nu posedă o porozitate reală, ionii difuzând prin structura gelului către centrii de schimb ionic.

Adsorbția pe schimbători de ioni este utilizată intesiv și cu succes pentru recuperarea acizilor carboxilici.

Pentru extracția acestor acizi organici se utilizează ca mediu extractant o soluție de acid percloric, iar după extracție acesta trebuie îndepărtat din probă dacă analiza se va face prin cromatografie de ioni. Eliminarea sa din probă se face prin trecerea acesteia printr-o coloană umplută cu anionit puternic (de exemplu, SAX).

Acizii carboxilici pot fi recuperați prin adsorbție pe adsorbant solid.

I. 3. 2. Separarea prin electrodializă

Electrodializa este un proces de recuperare în care membranele cu schimb de ioni sunt

utilizat pentru îndepărtarea ionilor dintr-o soluție apoasă aflată sub forța câmpului electric.

Această metodă se bazează pe următoarele principii generale:

– cele mai multe săruri dizolvate în apă sunt ionice încărcate cu sarcini pozitive sau negative

– ionii sunt atrași de electrozi cu sarcină electrică de semn contrar

– pot fi confecționate membrane care să permită trecerea selectivă a anionilor sau cationilor

La proiectarea unei instalații de electrodializă trebuie să se țină cont de niște paramentri ca temperatura, puritatea produsului, pH și alții [8].

Nomura și Hongo au propus posibilitatea dializei electrolitice in situ pentru recuperarea acidului lactic pentru a reduce efectele inhibițieie de produs în fermentația în șarje. Cantitatea de acid lactic obținută a fost de 5,5 ori mai mare decât cantitatea de acid produsă într-un proces de fermentație cu pH controlat.

I. 3. 3. Separarea prin extracția reactivă

Cea mai utilizată metodă pentru separarea acizilor carboxilici obținuți prin biosinteză este extracția.

Principalele etape ale extracției sunt următoarele:

– contactarea soluției inițiale cu solventul (amestecarea)

– solubilizarea și difuzia solutului în faza solventului (transferul de masă al solutului)

– separarea celor două faze rezultate (extractul – faza solventului care conține solutul și rafinatul – soluția inițială epuizată)

– recuperarea solventului atât din extract cât și din rafinat

Extracția reactivă reprezintă un proces care îmbină procesele chimice, respectiv reacția dintre solut și extractant, și procesele fizice de difuzie și solubilizare a compusului format în urma reacției chimice.

I. 3. 3. 1. Clasificarea și mecanismul extracției reactive

Clasificarea sistemelor de extracție reactivă

Clasificarea sistemelor de extracție reactivă este dificilă, datorită diveristății și a faptului că acestea nu prezintă diferențe nete în ceea ce privește condițiile de extracție, mecanismul reacțiilor implicate etc.

Diferența dintre extracția fizica și cea reactivă este prezentată în figura următoare:

Figura 9. Clasificarea procedeelor de extracție lichid-lichid [].

Așa cum se observă în figura de mai sus, extracția reactivă presupune utilizarea unor solvenți de extracție, solubili fie în solvent, fie în faza apoasă. Extractanții numiți și agenți purtători pot fi solubili atât în faza apoasă, cât și în faza organică dar este esențial ca produsul format în urma reacției dintre aceștia și solutul să fie puternic hidrofob.

Extracția fizică necesită utilizarea unui solvent cu o miscibilitate cât mai redusă cu solventul din soluția supusă separării, solvent care să ofere o selectivitate ridicată și inerție chimică față de solut, în scopul diminuării pierderilor la recuperare.

Comparativ, extracția reactivă impune adăugarea în solvent a unui agent de extracție sau extractant, capabil să reacționeze cu solutul, formând un compus miscibil cu solventul, mărind capacitatea de reținere a acestui [].

Clasificarea sistemelor de extracție reactivă au la bază diferite criterii, cele mai importante fiind:

Natura compușilor care se extrag:

Solut nemodificat chimic (extracție fizică);

Chelați;

Compuși obținuți prin solvatare;

Săruri;

Perechi de ioni;

După natura extractantului utilizat:

Extractanți de chelatizare: utilizați pentru extracția reactivă a metalelor;

Extractanți de tipul acizilor organofosforici: utilizați pentru extracția reactivă a metalelor, a acizilor carboxilici, a aminoacizilor;

Extractanți de solvatare:

– derivați organofosforici neutri

– alcooli, cetone, eteri, esteri, sulfoxizi

Utilizați la extracția reactivă a metalelor, a acizilor minerali, a aminoacizilor, a derivaților fenolici, a acizilor carboxilici;

Amine cu masa moleculară mare și derivați ai acestora: utilizați pentru extracția reactivă a metalelor, acizilor minerali, acizilor carboxilici, aminoacizilor;

Extractanți cu structură macrociclică:

– eteri coroană

– calixarene

Caracterizați printr-o selectivitate mare, utilizați la extracția reactivă a metalelor și a unor compuși organici

Alți derivați

Mecanismul general al extracției reactive

Mecanismul general al reacției reactive chiar dacă prezintă anumite particularități, este prezentat în figura de mai jos:

Figura 10. Mecanismul general al extracției reactive

S – solut, A – agent de extracție

Mecanismul general prezentat presupune parcurgerea următoarelor etape:

– difuzia extractantului la interfața de separare dintre cele două faze

– difuzia solutului la interfața de separare dintre cele două faze

– reacția interfacială dintre solut și extractant

– difuzia compusului rezultat în urma reacției interfaciale în faza extract [].

În unele cazuri, în funcție de solubilitatea componenților sistemului de extracție în cealaltă fază, locul de desfășurarea a reacției dintre solut și extractant poate fi situat fie în vecinătatea interfeței, fie în faza apoasă. Luându-se în considerare etapele care intervin în desfășurarea separării, viteza procesului global poate fi controlată de două tipuri de rezistențe: difuzia și reacția chimică. În funcție de condițiile de operare, precum și de viteza reacției dintre solut și agentul de extracție, procesul poate fi limitat difuzional sau cinetic.

Domeniul difuzional constă în limitarea vitezei procesului global către difuzia componenților sistemului și corespunde creșterii continue a gradului de extracție sau transfer de masă, cu intensitatea amestecării fazelor. Atingerea unui nivel constant de variație al parametrului urmărit indică trecerea în domeniul cinetic de desfășurare a extracției reactive, în care procesul este controlat de reacția chimică.

I. 3. 3. 2. Agenți de extracție utilizați în extracția reactivă

Principalele clase de agenți de extracție care se utilizează pentru separarea produselor de biosinteză prin extracția reactivă sunt prezentați mai jos.

a) Derivați organofosforici

Acești compuși au fost intens studiați în ultimele decenii datorită capacității lor de a realiza extracții cu viteze și randamente ridicate. Cercetările efectuate asupra posibilităților de utilizare a derivaților organofosforici ca agenți de extracție au fost impulsionate de aplicarea cu succes la nivel industrial a tri-n-butilfosfatului la recuperarea prin extracția reactivă a uraniului, thoriului și ceriului din apele reziduale provenite din industria combustibililor nucleari.

Cea mai importantă clasificare a agenților de extracție din clasa derivaților organofosforici este aceea bazată pe structura chimică a acestora:

– acizi organofosforici: acidul di-(2-etilhexil)fosforic (D2EHPA)

– esteri neutri ai acidului fosforic: tri-n-butilfosfatul (TBP) și tri-n-octilfosfatul (TOP)

– fosfinoxizi: tri-n-hexilfosfinoxid (THPO) și tri-n-octilfosfonoxid (TOPO)

-alți derivați.

b) Amine cu masă moleculară ridicată

Acești agenți de extracție se clasifică după structura chimică în amine și săruri ale aminelor:

– amine primare: n-actilamina, n-decilamina, n-dodecilamina, trialchil-metilamina

R-NH2

– amine secundare: di-n-octilamina, di-laurilamină, lauril-trialchilmetilamina, di-tridecilamina

R-NH-R1

– amine terțiare: tri-n-hexilamina, tri-n-octilamina, tri-i-octilamina etc.

– amine aromatice: n-octil-aminopiridina

– săruri de amoniu: clorura de metil-tri-n-octilamoniu (TOMAC)

Aminele utilizate în extracția reactivă au fost selectate pe baza câtorva criterii:

– capacitate ridicată de extracție

– hidrofobicitate ridicată

– solubilitate ridicată în solvenți organici

– să formeze cu solutul compuși puternic hidrofobi

– separarea rapidă a fazelor

– stabilitate chimică

Datorită bazicității pronunțate, pe care se bazează extracția reactivă cu derivați aminici, acești agenți de extracție fac parte din categoria anioniților lichizi. Utilizarea aminelor este mai avantajoasa față de cea a sărurilor datorită hidrofobicității superioare. Dintre amine, bazicitatea maximă o manifestă aminele secundare, acești extractanți fiind adecvați separării acizilor.

c) Compuși macrociclici de tip eteri-coroană sau derivați ai calixarenelor

Compușii macrociclici au aplicații numeroase datorită capacității de a solubiliza o serie de compuși anorganici în solvenți organici și de a cataliza un număr ridicat de reacții chimice.

Din categoria acestor compuși utilizzați fac parte derivații de tipul eterilor coroană și derivați ai calixareanelor.

Extractanți de tipul eterilor-coroană

În aceste cavități pot fi reținute specii chimice ionice sau moleculare, formându-se combinații complexe cu solubilitate ridicată, stabilitate care este determinată de raportul dintre mărimea ciclului și cea a speciei chimice extrase.

Extractanții macrociclici sunt utilizați pentru separarea metalelor și a aminoacizilor.

I. 3. 3. 3. Extracția reactivă a produșilor de biosinteză

Reacțiile chimice implicate în procesul de extracție sunt cu formare de perechi ionice, de schimb ionic, sau cu formarea de aducți acizi sau aminici. Natura reacțiilor este determinată de tipul agentului de extracție și a solutului. Pentru evidențierea particularităților sistemelor de extracție cu amine, în continuare va fi abordată distinct separarea compușilor obținuți prin biosinteză în funcție de structura chimică de bază a acestora.

I. 3. 3. 3. 1. Extracția reactivă a aminoacizilor

Prezența în molecula aminoacizilor a uneia sau mai multor grupări ionice, alături de gruparea carboxil, modifică semnificativ mecanismul reacției interfaciale cu agentul de extracție. Mecanismul extracției, precum si valoarea pH-ului necesar obținerii unor randamente sporite, este determinată de natura extractantului.

Astfel, extracția cu amine decurge cu formarea la interfață a unor perechi ionice hidrofobe, cu participarea aminoacidului protonat (pH-ul fazei apoase mai mic decât pH-ul punctului izoelectric al aminoacidului respectiv), a unui anion existent în soluție și a extractantului din solventul organic:

Reextracția aminoacidului cu regenerarea aminei, se face cu o soluție de carbonat de sodiu.

În schimb, extracția cu săruri ale aminelor necesită existența aminoacidului în forma anionică în soluția apoasă (la un pH mai mare ca pH-ul punctului izoelectric, pHi), în sistem stabilindu-se următoarele echilibre:

– disocierea aminoacidului în faza apoasă

– extracția reactivă a anionului aminoacidului printr-o reacție interfacială de schimb ionic

– coextracția grupei HO- sau a altui anion mineral prezent în soluția apoasă

HO- (aq) + QCl (o) ↔ Q+HO-(o) + Cl- (aq)

Pentru reextracție se folosește o soluție de acid clorhidric.

În timpul extracției aminoacizilor cu săruri de amoniu, la valori ridicate ale pH-ului, este posibilă extracția în paralel a anionilor existenți în lichidul de fermentație (SO42-, CO32-, PO43), ceea ce reduce eficiența extracției. Din acest motiv, este recomandată îndepărtarea anionilor anorganici înaintea extracției. Chiar și în aceste condiții, nu poate fi evitată coextracția ionului HO-.

I. 3. 3. 3. 2. Extracția reactivă a antibioticelor

Antibioticele sunt metaboliți secundari, produși de către microorganisme, în general, în lichidul extracelular. Numeroși astfel de produși sunt separați de lichidul de fermentație cu sau fără filtrarea prealabilă a biomasei, prin extracție fizică la o anumită valoare a pH-ului, dictată de caracterul acid sau bazic al acestora.

Antibioticele β-lactamice constituie cea mai importantă clasă a antibioticelor de biosinteză, datorită spectrului larg de acțiune antibacteriană. La nivel industrial, separarea penicilinelor din lichidele de fermentație, filtrate, se realizează prin extracția fizică cu acetat de butil. Extracția în solvent decurge cu randamente maxime numai în condițiile în care aceste antibiotice se găsesc în soluția apoasă supusă extracției în forma nedisociată, deoarece solvenții nepolari sau cu polaritate scăzută pot solubiliza numai compușii nepolari.

În prezent se acordă un deosebit interes cercetărilor privind separarea antibioticelor β-lactamice prin extracția reactivă, studiile evidențiind avantajele majore oferite. Unul dintre cei mai utilizați agenți de extracție a penicilinelor G și V este tri-alchil-metil-laurilamina, denumit comercial Amberlit LA-2.

Mecanismul general al reacției chimice interfaciale a penicilinelor cu acești extractanți este redat prin echilibrul următor:

P-COO- (aq) + H+(aq) + A(o) ↔ P-COOH.A(o)

Principalii factori care influențează pocesul sunt următorii:

– valoarea pH-ului fazi apoase inițiale

– concentrația agentului de extracție în solvent

– timpul de contactare a fazelor

– concentrația antibioticului în soluția apoasă inițială

Studiindu-se influența pH-ului fazei apoase inițiale, s-a constatat că în cazul extracției reactive a penicilinelor G și V cu Amberlite LA-2, eficiența separării este în jur de 97-98% până la pH=5, scăzând apoi, astfel la pH=7,5 gradul de extracție este de cca. 20%.

Faptul că extracția reactivă a penicilinelor G și V decurge cu randamente maxime chiar la valori ale pH-ul de 5 reprezintă principalul avantaj al acestei tehnici chimice.

I. 3. 3. 3. 3. Extracția reactivă a acizilor carboxilici

a) Extracția reactivă a acizilor carboxilici cu amine

Puttemans s.a (1984) studiind extracția reactivă a acizilor monocarboxilici cu amine, au evidențiat următoarele echilibre succesive care stabilesc în sistem (Q – extractantul aminic):

– disocierea acidului carboxilic în faza apoasă

R-COOH(aq) ↔ R-COO-(aq) + H+(aq)

– extracția fizică a acidului carboxilic nedisociat

R-COOH(aq) ↔ R-COOH(o)

– extracția reactivă a acidului carboxilic prin formarea unui complex cu amina Q la interfață

R-COO-(aq) + H+(aq) + Q(o) ↔ R-COOH. Q(o)

– extracția reactivă cu formarea unor aducți aminici la interfață

R-COO-(aq) + H+(aq) + nQ(o) ↔ R-COOH. nQ(o)

– extracția reactivă cu formarea unor aducți acizi la interfață

R-COO-(aq) + H+(aq) + Q(o) + mR-COOH(o) ↔ Q.R-COOH.mRCOOH (o)

– în unele cazuri, dimerizarea complexului în faza organică

2 R-COOH.Q(o) ↔ R-COOH2.Q(o)

Regenerarea solventului și eliberarea solutului se realizează prin tratarea fazei organice cu o soluție bazică de hidroxid, carbonat de sodiu sau potasiu.

Adăugarea în solvent a extractanților din această categorie determină o creștere semnificativă a coeficientului de distribuție, față de extracția fizică.

Cea mai economică tehnică de extracție din lichidul de fermentație în cazul extracția acidului acetic cu amine, o reprezintă extracția reactivă cu Alamine 336. Performanța separării acidului acetic poate fi mărită prin combinarea diferiților extractanți cu solvenți polari.

Acidul acetic se poate separa industrial din lichidul de fermentație prin precipitarea cu Ca(OH)2, CaCO3 și acidulare cu H2SO4, însă principalul dezavantaj al acestui procedeu îl reprezintă formarea precipitatului CaSO4. Din acest motiv a fost experimentată extracția reactivă cu TOA dizolvat în cherosen și acetat de butil.

Extracția reactivă a acizilor dicarboxilici este similară cu cea a acizilor monocarboxilici, mecanismul reacțiilor fiind următorul:

mR(COOH)2 (aq) +pQ(o) ↔ [R(COOH)2]m.Qp (o)

În funcție de raportul molar dintre componenții sistemului și anume acidul dicarboxilic și extractant, se disting trei tipuri de reacții chimice interfaciale prin intermediul cărora se realizează extracția reactivă:

a) Pentru rapoarte molare dintre acidul dicarboxilic și extractant mult mai mici dect 1 (m:p << 1), reacția extractivă decurge cu formarea în faza organică a unor complecși R(COOH)2.Q2(o):

R(COOH)2 (aq) + 2 Q(o) ↔R(COOH)2.Q2(o)

b) Raport molar m:p apropiat 1, la formarea complexului hidrofob vor participa acidul și extractantul în proporție echimolară:

R(COOH)2 (aq) + Q(o) ↔R(COOH)2.Q(o)

c) Dacă se supune extracției în solvenți nepolari acizi carboxilici existenți în concentrații inițiale ridicate în soluția apoasă, există posibilitatea apariției așa numitei a treia fază, care reprezintă o emulsie stabilă, cu un conținut ridicat de complecși acizi, insolubili atât în faza apoasă, cât și în faza organică:

m R(COOH)2 (aq) + Q(o) ↔[R(COOH)2]m.Q(o)

În scopul separării rapide a emulsiei create de apariția celei de-a treia fază, în solventul organic se adaugă un modificator de fază, în general, un alcool alifatic cu catenă lungă (cei mai utilizați fiind n- și i- decanol), component care mărește solubilitatea complexului acid în faza extract. În cazul în care solventul este un compus nepolar, poate acționa el însuși ca modificator de fază.

Acest mecanism a fost verificat de Cașcaval ș.a. (1997) pentru acizii oxalic, malonic, glutari, adipic precum și pentru cel malic.

Extracția acizilor policarboxilici cu amine decurge prin aceleași posibile reacții interfaciale ca și în cazul acizilor dicarboxilici. Însă dacă structura este voluminoasă, în faza organică se vor forma cu precădere săruri de amoniu prin legarea parțială sau în totalitate a grupărilor -COOH de către extractanți [7].

b) Extracția reactivă a acizilor carboxilici cu derivați organofosforici

Extracția acizilor carboxilici cu derivați organofosforici presupune stabilirea următorului echilibru la interfața de separare a fazelor:

RCOOH(aq) + mTOPO(o) ↔ RCOOHmTOPO(o)

m-numărul de solvatare a acidului

Constanta de echilibru se calculează cu următoarea expresie:

Tabel 3. Constantele de echilibru la extracția unor acizilor carboxilici cu TOPO în hexan

Valorile indică dependența puternică a constantei de echilibru de hidrofobicitatea acizilor extrași. Pe lângă acest factor o importanță deosebită o are bazicitatea extractantului. În cazul derivaților organofosforici neutri, bazicitatea crește în ordinea:

TBP < dibutilfosfat < tributilfosfinoxid

Unii acizi cu mai mult de 5 atomi de carbon au fost separați prin extracția reactivă cu amestecuri de fosfinoxizi, cu între 4 și 18 atomi de carbon și TOPO și THPO, obținându-se un efect sinergic.

I. 3. 4. Separarea prin extracție reactivă sinergică

Fenomenul de sinergism a început să fie studiat încă de la începutul anilor 1960 și indică faptul că, capacitatea de extracție a unui amestec de extractant este superioară sumei capacităților de extracție ale fiecărui extractant în parte.

Agenții de extracție care generează acest efect nu reacționează între ei, dar pot să extragă separat solutul sau pot forma cu acesta o combinație complexă puternic hidrofobă.

Sistemele de extracție reactivă sinergică studiate se bazează pe folosirea, în principal a patru tipuri de combinații între agenții de extracție:

– agent de chelatizare + ligand neutru

– acid organofosforic + ligand neutru

– doi agenți de extracție neutri

– doi agenți de extracție cu caracter acid

În principiu, extracția are loc prin intermediul unui complex mixt,care conține solutul și cei doi extractanți. Deși tipul reacțiilor care intervin în proces diferă de la un sistem la altul, s-a observat că întotdeauna efectul sinergic este rezultatul a două fenomene simultane:

– modificarea capacității de extracție individuală a extractanților

– modificarea structurii speciei moleculare extrase

Astfel, unul dintre extractanți complexează solutul iar celălalt mărește hidrofobicitatea complexului format, în condițiile în care configurația structurii extractanților nu generează impiedicări sterile.

Cu cât diferența de polaritate dintre extractanți este mai mare cu atât efectul sinergic este mai puternic. Mărirea eficienței extracției prin folosirea a doi extractanți neurti cu valori foarte diferite ale constantei dielectrice s-ar putea explica prin aceea că derivatul de polaritate mai redusă va solvata solutul, solubilizarea complexului format fiind favorizată de mărirea constantei dielectrice a solventului organic prin adăugarea extractantului cu polaritatea mai ridicată [7].

I. 3. 5. Studii de literatură privind separarea acizilor carboxilici prin extracția reactivă

Cașcaval ș.a. (1997) plecând de la premisa că structura acizilor determină formarea, prin reacții interfaciale a diferiților compuși între acizi și extractanți, care conduc la atingerea anumitor grade de extracție a constatat că în domeniul de fermentație (50 g/l acid citric, 4 g/l acid succinic + acid malic), extracția reactivă cu Amberlit LA-2 în acetat de butil decurge prin formarea următorilor compuși:

– R(COOH)2Q2 pentru acizii succinic și malic

– R(COOH)3Q pentru acidul citric

În condițiile utilizării unui raport molar acizi succinic+malic : extractant de 1, extractantul fiind într-o cantitate deficitară stoechiometric față de conținutul total de acizi din lichidul de fermentație, s-a obținut o extracție în proporție de 95% a acizilor carboxilici secundari și doar de 4% a acidului citric. În plus, adăugându-se 2-octanol ca modificator de fază, diferența dintre gradele de extracție ale celor două grupe de acizi, fiind astfel, posibilă îndepărtarea selectivă din lichidul de fermentație a acizilor succinic și malic.

Partea a II-a

II. 1. Introducere

Biotehnologia are ca scop principal obținerea unor produce utilizând organismele vii.
Tehnologia chimică are ce proces central procesul chimic iar spațiul în care se desfășoară reacția chimică se numește reactor chimic, în schimb tehnologia biologică are ca proces de bază procesul biologic iar spațiul de lucru în acest caz se numește bioreactor.

În ultimii ani, s-a pus accentul foarte mult pe consumul unor produse cât mai naturale și producerea acestora prin metode cât mai lipsite de substanțe chimice dăunătoare sănătății.

Prin urmare, cea de a doua parte a lucrării se axează pe obținerea acidului fumaric printr-un proces biologic, utilizând ca microorganism producător Ryzopus oryzae și apoi separarea acidului din lichidul de fermentație utilizând extracția lichid-lichid.

II. 2. Proprietățile și aplicațiile acidului fumaric

Acidul fumaric este un acid organic natural care a fost descoperit prima dată în planta Fumaria officinalis iar după aceasta a fost pusă denumirea acidului.

Acidul fumaric pur se găsește sub forma unor cristale solide de culoare albă, fără miros și cu un gust ușor acid. Densitatea acestuia este 1,625 kg/m3 și are punctul de fierbere la 286°C.

Are o solubilitate scăzută în apă rece, aproximativ 10g/L iar sărurile acidului fumaric au solubilități diferite în apă. De exemplu, fumaratul de calciu are o solubilitate scăzută în apă, 21,1 g/l la 30°C, în timp de fumaratul de sodiu are o solubilitate mult mai mare, aproximativ 220 g/l la 30°C.

Solubilitatea acidului fumaric în solvenți organici este de asemenea scăzută: 54,4 g/l în etanol 95% și 16,9 g/l în acetonă la 29,7°C, 0,03 g/l în benzen și 0,27 g/l în tetraclorură de carbon la 25°C.

Acidul fumaric este un acid dicarboxilc și un compus intermediar indinspensabil în metabolismul multor microorganisme. Structura sa chimică cu multe grupe funcționale permite transformarea acestuia în multe produse care pot fi apoi utilizate în diferite industrii.

Cea mai mare utilizare a acidului fumaric este de a sintetiza o varietate de rășini, inclusiv rășini de hârtie (35% din producția anuală de acid fumaric), rășini alchidice (6%) și rășini poliesterice nesaturate (15%) (Roa Engel et al., 2008). Deși acidul fumaric este mai scump decât anhidrida maleică ca materie primă pentru aceste rășini, este preferat în industria polimerilor din cauza naturii sale netoxice.

Acidul fumaric a fost folosit ca acidulant în alimente și băuturi încă din anul 1946. Este utilizat în prezent în multe produse alimentare, cum ar fi tortilla de porumb și grâu, aluaturi de biscuiți refrigerate, deserturi gelatinoase, sucuri de fructe, băuturi și vin.

Cercetările arată că acidul fumaric îmbunătățește calitatea și reduce costurile multor băuturi si multor produse alimentare.

De exemplu, poate reduce pH-ul aluatului de tortilla pentru a crește eficiența unui inhibitor de mucegai (de exemplu, propionat de calciu); poate mări foarte mult porozitatea aluatului de pâine în scopul unei prelucări mai bune; poate oferi mai multă aciditate pe unitate de greutate, în comparație cu alți acidulanți, în băuturile din sucuri de fructe și acidifică vinul fără a afecta aroma; poate prelungi termenul de valabilitate al bomboanelor acoperite cu acid deoarece nu absoarbe umezeala în timpul depozitării și distribuirii (Yang et al., 2011).

Acidul fumaric este utilizat și ca aditiv în hrana animalelor pentru a îmbunătăți eficiența furajelor. Un exemplu, este utilizarea sa ca aditiv în hrana purceilor în timpul perioadei de înțărcare. Adăugarea acidului fumaric și ajustarea valorii pH-ului îmbunătățesc creșterea în greutate, consumul de alimente și rata de conversie a hranei. (Mcginn et al., 2004).

Deoarece este un acid dicarboxilic cu patru atomi de carbon, acidul fumaric poate servi ca materie primă pentru sinteza diferitelor substanțe chimice, cum ar fi acidul maleic, acidul malic, acidul succinic și acidul L-aspartic. De asemenea, esterii acidului fumaric au aplicații bune în multe domenii. Fumaratul de monoetil și fumaratul de dimetil sunt cei mai utilizati esteri în special în inhibarea mucegaiului. Cu toate acestea, recent, fumaratul de dimetil a fost depistat, că în cantități mici poate provoca o eczemă extinsă, gravă, dificil de tratat (Gimenez-Arnau et al., 2009).

O altă utilizare a esterilor acidului fumaric este utilizarea acestora în medicamentul pentru tratamentul psoriazisului, o afecțiune anormală a pielii (Moharregh-Khiabani et al., 2009; Mrowietz și colab., 1998). Persoanele psoriazice iau acid fumaric oral sub formă de fumarat de dimetil sau monoetil ca supliment. Acești esteri pot fi, de asemenea, utilizați pentru a produce medicamente pentru transplant, în special medicamente pentru tratarea, ameliorarea și suprimarea reacțiilor gazdă-grefă (Joshi și colab., 2000).

Nu în ultimul rând, multe medicamente sunt produse comercial sub formă de săruri de fumarat. Fumaratul feros este cunoscut ca supliment pentru prevenirea și tratarea deficiențelor de fier și a anemiei cu deficit de fier. Avantajul este că au un conținut ridicat de fier, au rezistență la oxidare și un efecte secundare reduse (Zlotkin et al., 2001).

II. 3. Obținere și separarea acidului fumaric

Acidul fumaric se poate obține prin diferite metode, atât pe cale chimică, cât și pe cale biochimică.

Una dintre metode este obținerea acidului fumaric prin sinteza chimică, plecând de la izomerizarea acidului malic.

Industrial, acidul maleic este produs din anhidrida maleică [C2H2(CO)2O], care este produsă fie din benzen, fie din n-butan prin oxidare catalitică.

Aceste reacții sunt prezentate mai jos (Lorences et al., 2003):

– Oxidarea n-butanului la anhidrida maleică:

C4H10 + 3,5 O2 → C4H2O3 + 4 H2O

– Hidroliza anhidridei maleice:

C4H2O3 + H2O → C4H4O4

Se observă că acidul fumaric poate fi recuperat ca produs secundar în timpul producerii anhidridei maleice. Acest lucru nu numai că îmbunătățește producția de anhidridă maleică, dar transformă, de asemenea, acidul fumaric din deșeu în produs de valoare. Oxidarea n-butanului utilizează catalizatori pe bază de oxizi de vanadiu și fosfor. Pentru izomerizarea acidului maleic la acidul fumaric s-au dezvoltat diferite tipuri de catalizatori: acizi minerali, compuși care conțin peroxizi cu bromură și bromat și compuși cu un conținut ridicat în sulf cum ar fi tioureea și derivații săi (Bachmann and Scott, 1948).

Pentru a obține un acid fumaric cu o puritate ridicată acesta se supune cristalizării, spălării și uscării (Roa Engel et al., 2008). Cu toate acestea, toxicitatea ridicată a catalizatorilor, condițiile dure de producție și evacuările dăunătoare generate în acest proces provoacă probleme grave de poluare și de sănătate.

O altă metodă de obținere a acidului fumaric este prin fermentarea zaharurilor.

În timpul anilor 1940 și înaintea creșterii industriei petrochimice, acidul fumaric a fost produs prin fermentarea zaharurilor cu Rhizopus arrhizus. (Rhodes et al., 1959; Goldberg et al., 2006)

În general, procesul de fermentație implică două etape: pregătirea culturilor de însâmânțare și producerea acidului. După ce cultura de însâmânțare se dezvoltă aproximativ 24 h, celulele sunt recoltate și transferate în fermentator pentru producerea acidului fumaric. Procesul depinde de agentul de neutralizare utilizat în timpul fermentației. În procesul în care se utilizează ca agent CaCO3, masa de fermentație care conține fumarat de calciu, celule și CaCO3 în exces este acidulată cu H2SO4 până la pH=1,0 și încălzit la 160°C. După filtrare, pentru a îndepărta particulele insolubile (celule și CaSO4), filtratul este răcit la o temperatură sub temperatura camerei pentru a recupera acidul fumaric ca precipitat prin cristalizare.

[Fumaric Acid Fermentation by Rhizopus oryzae with Integrated Separation Technologies,

The Ohio State University, 2012, Kun Zhang, M.S., B.S.]

În ceea ce privește separarea acidului fumaric, există mai multe metode de separare care pot fi utilizate și care sunt prezentate în tabelul de mai jos.

Fumaric Acid Fermentation by Rhizopus oryzae with Integrated Separation Technologies,

The Ohio State University, 2012, Kun Zhang, M.S., B.S.]

II. 4. Tehnică experimentală

II. 4. 1. Echipamente

Aparatura folosită pentru partea practică se împarte în aparatura folosită pentru etapa de fermentație și aparatura folosită în etapa de separare a acidului fumaric.

Fermentația se realizează într-un bioreactor automatizat cu volumul util de 1200 ml (figura 1).

Figura . Bioreactorul și sistemul de control al acestuia (Electrolab FerMac 310)

Bioreactorul Electrolab FerMac 310 este format dintr-un vas cilindric din sticlă , în interiorul căruia se găsesc un agitator cu palete care este acționat de un motor electric, un barbotor deoarece procesul este unul aerob și diferiți senzori cum ar fi cel de O2. Acesta mai conție și un sistem de filtarea și control a aerului care intră în bioreactor. Pentru a menține o temperatură constantă a procesului și pentru a evita pierderile de căldură, se utilizează o manta care este montată pe suprafața exterioară a bioreactorului.

De asemnea, la bioreactor sunt conectate și diferite flacoane din care cu ajutorul unor pompe se adaugă în timpul procesului diferiți compuși (soluții pentru reglarea pH-ului etc) și un flacon în care se prelevează probe la un interval stabil de timp din acesta. Prelevarea probelor din bioreactor se realizează într-un mediu bine controlat, steril pentru a se evita contaminarea mediului din bioreactor.

În bioreactor are loc transformarea materiilor prime în produsul util prin intermediul sistemului metabolic al microorganismului utilizat. Pentru a obține rezultate cât mai bune în produs util, bioreactorul trebuie să asigure condițiile necesare creșterii și dezvoltării microorganismului, pH-ul optim, temperatura, concentrația substratului, concentrația în săruri minerale, concentrația în oxigen și distribuirea uniformă a acestor elemente în sistem cu ajutorul sistemului de agitare.

Toți acești parametri sunt atent măsurați și controlați cu ajutorul unui program software conectat la senzorii din bioreactor (figura 2).

Figura 2. Program pentru monitorizarea principalilor parametri ai fermentatiei (Electrolab Fermentation Manager)

Mediul de cultură și bioreactorul trebuiesc sterilizate pentru ca procesul de biosinteză să se realizeze în condiții cât mai sterile, iar pentru aceasta se utilizează autoclavul.

Autoclavul este un dispozitiv utilizat în sterilizarea echipamentelor și substanțelor utilizate în diferite procese (figura 3). Acesta funcționează cu ajutorul aburului la presiuni ridicate cuprinse între 120-134oC pentru o durată de 15-20 de minute.

Sterilizarea bioreactorului și a mediului de cultură se realizează la 121oC, timp de 20 de minute.

Figura 3. Autoclav

Analizorul de glucoză (LaboTrace) a fost utilizat pentru determinarea concentrației glucozei din lichidul de fermentației, informație importantă pentru stabilirea evoluției procesului de creștere si dezvoltare a microorganismului producător.

Figura . Analizor de glucoză

Pentru realizarea studiilor experimentale care au vizat separarea acidului fumaric obținut prin fermentație s-au utilizat următoarele echipamente: pH-metru pentru măsurarea pH-ului soluțiilor folosite la extracție, coloană de extracție cu agitare vibratorie pentru amestecarea fazei organice și celei apoase în etapa de extracție centrifugă pentru separarea emulsiei formate în urma extracției și spectrofotometru pentru determinarea concentrației acidului fumaric.

(1) (2) (3)

Figura 4 . Echipamente utilizate în etapa de separare a acidului fumaric

(1)-Coloană de extracție cu agitare vibratorie, (2)-pH-metru, (3)-Centrifugă

Experimentele prezentate în raportul de cercetare s-au realizat într-o coloană de extracție cu agitare vibratorie (figura 5), care oferă avantajul unei arii interfaciale de contact dintre faze foarte mari și atingerii rapide a echilibrului. Instalația experimentală constă dintr-o coloană de sticlă cu diametrul interior de 36 mm și înălțimea de 250 mm, prevăzută cu o manta de termostatare, prin care circulă agentul termic (un amestec de apă și etilenglicol) menținut la 25oC cu ajutorul unui termostat. Contactarea fazelor s-a realizat cu un agitator vibrator, alcătuit dintr-un disc perforat cu diametrul de 20 mm și o secțiune liberă de 20%, vibrațiile având frecvența de 50 s-1 și amplitudinea de 4 mm. Poziția agitatorului s-a situat pe interfața de contact dintre cele două faze, durata extracției fiind de 1 min. Emulsia rezultată a fost eliminată pe la baza coloanei de extracție, fiind, apoi, separată într-un separator centrifugal, la o turație de 8000 rot/min.

Figura 5. Coloana de extracție cu agitare vibratorie

1- coloană de sticlă; 2- manta de termostatare; 3- agitator; 4- pH-metru digitalic;

5- termostat.

pH-metru digital CONSORT C 836 (figura 4.2), utilizat pentru măsurarea valorii pH-ului soluțiilor apoase pe durata experimentelor

Pentru partea de analiză a compușilor din probele colectate pe parcursul fermentației și din fazele apoase inițiale și finale din cadrul extracției se utilizează spectrofotometrul UV-VIS model M550.

Spectrofotometru UV- Camspec M550 (figura ), a fost utilizat pentru determinarea concentrației acidului fumaric în faza apoasă inițială și în rafinat. Citirea absorbției soluțiilor de acid s-a efectuat față de proba martor, care a constat din apa distilata, iar determinarea concentrațiilor compușilor analizați s-a realizat pe baza curbelor de calibrare trasate pentru fiecare acid studiat.

Figura 4.5. Spectrofotometru UV- (Camspec M550)

De asemenea, atât pentru etapa de fermentație cât și pentru cea de separare se folosește și sticlăria necesară cum ar fi pipete, cilindri, pahare Berzelius și Erlenmayer, baloane cotate și balanțe.

II. 4. 2. Materiale și reactivi

a) Mediul de cultură

Mediul de cultură joacă un rol foarte important în etapa de producere a produsului dorit deoarece acesta trebuie să asigure atât creșterea și dezvoltarea sușei, cât și obținerea unei productivități maxime. Acesta conține substanțele necesare și care conduc la realizarea obiectivelor de mai sus.

Ca sursă de carbon și energie se folosește glucoza care este foarte utilizată pentru stimularea creșterii microbiene.

Necesarul de azot anorganic este reprezentat de (NH4)2SO4 care mărește viteza de creșterea a microorganismului.

Sărurile minerale furnizoare de oligoelemente și microelemente sunt reprezentate de KHPO4, MgSO4, ZnSO4, FeCl3.

Tabel Componenții mediului de cultură

Procesul fiind unul aerob, pe parcursul fermentației se formează spumă iar acest fapt necesită adăugarea în sistem a unui agent antispumant. Ca agent antispumant se folosește silicon.

Inoculul pregătit conține glucoza, extractul de drojdie, sărurile minerale și cultura microorganismului util sub formă de spori. Condițiile de dezvoltare a inocului sunt temperatura de 35oC, 180 rotații/minut, timp de 24 de ore. Pentru a se asigura o creștere a microorganimelor cu obținerea unor randamente ridicate în produsul util, concentrația inoculului trebuie să fie de 10 % vol. Raportată la volumul final al lichidului de fermentație.

Tabel Compoziția inoculului

b) Acid fumaric, (figura ) []

Figura . Structura acidului fumaric

– sinonime: acid trans-butendioic, acid butenendioic, acid trans-1,2 etilendicarboxilic, acid 2-butenedioic, acid trans-butenedioic, acid allomeleic, acid boletic, acid donitic, acid lichnic, E297

– formulă chimică: C4H4O4

– masa molară: 116,07 g/mol

– stare de agregare: solid

– solubilitate în apă: 4,9 g/L la 20oC

– constanta de aciditate: pKa1=3,03, pKa2=4,44

c) Solvenți

Alegerea solventului pentru procesul de extracție se face în funcție de: solubilitatea analiților de interes, selectivitatea solventului în raport cu analiții de interes și matricea probei, metoda de analiză a probei rezultate, volatilitatea solventului, toxicitatea acestuia sau alți parametri fizici, luați în considerare în cadrul întregului proces analitic de măsură.

De asemenea, se folosește și un solvent cu rol de modificator de fază în etapa de extracție reactivă și anume 1-octanolul, în concentrație de 10% vol.

Tabel . Proprietăți fizice ale solvenților

Extractanți utilizați:

Amberlite LA-2 – lauril-trialchilamină, (figura)

,

unde R1 + R2 + R3 = 11-13 atomi de C

Figura . Structura moleculară a lauril-trialchilmetilaminei (Amberlite LA-2)

masa molară: 353-395 g/mol

stare de agregare: lichid, densitate 0,83 g/l

insolubil în apă, ușor solubil în solvenți organici.

Diferiți reactivi:

– soluții pentru corectarea pH-ului (acid sulfuric 3%, hidroxid de sodiu 3%);

– alcool etilic, alcool metilic.

d) Condiții de lucru

Acidul fumaric este produs printr-un proces de biosinteza, folosindu-se ca microorganism producător Rhizopus oryzae.

Mediul de cultură și bioreactorul se sterilizează în autoclav la o temperatură de 121oC, timp de 20 de minute. Glucoza nu se sterilizează împreună cu ceilalți componenți ai mediului de cultură deoarece pot apărea anumite reacții chimice nedorite, cu formarea unor compuși toxici.

Fermentația se desfășoară la o temperatură de 35oC și un pH = 5. pH-ul se reglează cu o soluție de CaCO3. Fermentația este una aerobă, unde concentrația oxigenului dizolvat ar trebui să se mențină undeva în jurul valorii de 50.

De asemenea, fermentația necesită agitare, turația fiind de 400-450 rotații/minut. Durata fermentației este de 168 de ore.

II. 5. Obținerea acidului fumaric prin fermentație

Acidul fumaric este un acid organic natural cunoscut sub diferite denumiri: acid trans-butendioic, acid trans-1,2-etilendicarboxilic, acid 2-butendioic, acid trans-butenedioic, acid donitic, acid lichenic. Este un acid dicarboxilic cu patru atomi de carbon și are următoarea structură:

Figura Structura acidului fumaric

Acidul fumaric a fost prima dată izolat din planta Fumaria officinalis și de aici îi provine și numele. Multe microorganisme produc acidul fumaric în cantități mici deoarece este un intermediar cheie în ciclul de obținere a acidului citric.

Datorită structurii acestuia și anume prezența a două grupări carboxil și o dublă legătură carbon-carbon, acidul fumaric prezintă numeroase utilizări și aplicații industriale:

Figura Utilizările acidului fumaric

Acidul fumaric se poate obține prin diferite metode, fie prin sinteză sau prin biosinteză.

Prin sinteza chimică, acidul fumaric se poate obține din anhidrida maleică, însă deoarece aceasta este un derivat al petrolului și cum prețul petrolului a crescut foarte mult în ultima perioadă, se preferă obținerea acidulu fumaric prin fermentație și nu prin sinteză, din cauza costului de obținere mult mai accesibil.

Metoda de obținere utilizată și prezentată este obținerea acidului fumaric printr-un proces de biosinteză și anume prin fermentație.

Procesul de fermentație începe prin alegerea microorganismului producător.

Un număr mare de specii microbiene sunt capabile să sintetizeze acidul fumaric, dar numai câteva produc cantități semnificative. Speciile considerate a fi de importanță industrială pentru producerea de acid fumaric aparțin genului Rhizopus. Prin urmare se utilizează Rhizopus oryzae. Acest microorganism este un fung filamentos și unul dintre cei mai cunoscuți producători de acid fumaric. Pentru a avea o producție eficientă trebuie să se pună accentul pe dezvoltarea sușei active, controlul morfologiei acesteia și pe parametrii care pot influența negativ dezvoltarea și capacitatea de producere a microorganismului.

Materialul de însămânțare este reprezentat de inocul care conține cultura de Ryzopus oryzae sub formă de peleți, însămânțată pe un mediu prielnic dezvoltării acesteia: glucoză, extract de porumb, KHPO4, MgSO4, ZnSO4, FeCl3. Acesta se transferă în condiții aseptice în mediul de cultură din bioreactor, utilizându-se flacăra pentru transferul acestuia.

Mediul de cultură specific microorganismului este format din glucoză care reprezintă sursa principală pentru creșterea acestuia, (NH4)2SO4 sursa de azot anorganic, KHPO4, MgSO4, ZnSO4, FeCl3 – săruri minerale furnizoare de minerale și elemente necesare sușei active.

Datorită agitării și faptului că procesul este aerob, în bioreactor se poate forma spumă. Aceasta se diminuează folosindu-se silicon ca agent antispumant.

După ce mediul de cultură și mediul pentru inocul au fost pregătite, aceasta presupunând cântărirea și dizolvarea tuturor substanțelor prezentate mai sus, acestea se pregătesc pentru sterilizare. S-au pregătit 60 ml soluție inocul și 1140 ml soluție mediu de cultură.

De asemenea, pentru sterilizare se pregătește și bioreactorul. Acesta se spală și se curăță foarte bine. Fiecare traseu se verifică și se curăță pentru a se elimina eventualele dopuri formate și rămase din alte fermentații. Clemele, filtrele, microfiltrele, senzorii de pH și temperatură se izolează în folie de aluminiu pentru a se preveni deteriorările din timpul sterilizării.

În autoclav se introduc bioreactorul la care a fost conectat flaconul cu mediul de cultură, flaconul cu soluția de inocul și se sterilizează la 121o C timp de 20 de minute.

Bioreactorul, glucoza și mediul de cultură pregătite pentru sterilizare

După etapa de sterilizare, urmează etapa de fermentație care are o durată 168 de ore.

Producerea acidului fumaric se realizează în două etape.

În prima etapă are loc creșterea biomasei și se consumă o cantitate mare din sursa de azot anorganic responsabilă cu acest fapt. pH-ul în această etapă este relativ scăzut 3-5 față de pH-ul din a doua etapă când acesta este mai crescut, în scopul formării morfologiei necesare.

Obiectivul celei de-a doua etapă este de a produce și a crește cantitatea de acid fumaric care se poate obține. În această etapă cantitatea de glucoză consumată este ridicată, în timp ce cantitatea de azot anorganic este mai mică. pH-ul este foarte important să fie controlat în această etapă deoarece influențează foarte mult cantitatea de acid fumaric obținut.

Figura

Ca agenți de neutralizare care se poate folosi în modificarea pH-ului se poate folosi CaCO3, Na2CO3, NaHCO3, Ca(OH)2, (NH4)2 CO3 însă dintre toate aceste substanțe s-a constatat că soluția de CaCO3 oferă cele mai multe avantaje, și anume:

– η și volumul au fost mai mici atunci când a fost utilizat CaCO3 în comparație cu ceilalți agenți de neutralizare

– acumularea de produși secundari a fost mai mare în prezența altor agenți

– CaCO3 poate furniza CO2 util în fermentație Fumaric acid production by fermentation Carol A. Roa Engel & Adrie J. J. Straathof &Tiemen W. Zijlmans &Walter M. van Gulik & Luuk A. M. van der Wielen, 24 January 2008

Deoarece se folosește ca agent de neutralizare CaCO3, în timpul fermentație se obține fumaratul de calciu care este sare acidului fumaric și care este mult mai stabil sub această formă.

Fermentația acidului fumaric fiind un proces aerob, în mediu se introduc 2 l aer/h, aer sterilizat și foarte bine monitorizat.

O problemă întâlnită de obicei în fermentațiile în care sunt incluse speciile de Rhizopus, este aceea că fiind fungi filamentoși aceștia se dezvoltă pe pereții bioreactorului, pe barbotor și pe suprafața agitatorului. Acest fapt face dificilă dizolvarea oxigenului și transferul de masă al oxigenului la celule, însă poate fi evitat prin controlul morfologiei fungilor.

Pentru a evita această problemă se recomandă utilizarea speciei de Rhizopus sub formă de peleți cât mai sferici și mici. Zhou și al. în anul 2000 au constatat că peleții de dimensiuni mai mici reduc formarea și aglomerarea sub formă de smocuri în timpul fermentației. Pentru Rhizopus oryzae o valoare inițială scăzută de pH conduce la formarea peleților și la obținerea unor randamente mai bune în acid fumaric.

Pentru a se vedea exact ce se întâmplă în timpul procesul de fermentației, din 4 în 4 ore se iau probe din bioreactor și se analizează glucoza cu ajutorul unui analizor de glucoză. În funcție de rezultatele obținute se mai poate adăuga soluție de glucoză.

Grafic cu evolutia consumului de glucoza pe durata fermentatiei!

Toți parametrii sunt verificați și controlați cu ajutorul bioreactorului automatizat. Bioreatorul include instrumente și senzori pentru controlul și măsurarea pH-ului, a temperaturii, presiunea, a nivelului de lichid, a spumei, a numărului de rotații, a volumului de aer introdus și a oxigenului dizolvat. Toate acestea sunt urmărite cu ajutorul unui program software (Electrolab Fermentation Manager).

După etapa de fermantație, urmează etapa de separare a acidului fumaric din lichidul de fermentație.

Produsele de biosinteză se găsesc în concentrații mici în lichidul final de fermentație însă pe lângă produsul de interes se mai găsesc și alți compuși cu proprietăți și caracteristici fizico-chimice asemănătoare produsului util, de aceea metoda de separare folosită trebuie să fie selectivă și cu precizie ridicată.

Deoarece acidul fumaric este un acid carboxilic, cea mai utilizată și eficientă metodă de separare este extracția lichid-lichid.

Extracția este procesul prin care unul sau mai mulți componenți dintr-un amestec lichid omogen sau dintr-un amestec solid se separă, total sau parțial, pe baza diferenței de solubilitate a acestora în unul sau mai mulți solvenți. Dacă amestecul supus separării este un lichid atunci operația de separare se numește extracție lichid-lichid.

Extracția fizică necesită folosirea unui solvent cu o miscibilitate cât mai redusă cu solventul din soluția supusă separării, solvent care să ofere o selectivitate ridicată și inerție chimică față de solut, în scopul diminuării pierderilor la recuperare. În schimb, extracția reactivă impune adăugarea în solvent a unui agent de extracție sau extractant capabil să reacționeze cu solutul, formând un compus miscibil numai cu solventul, mărind astfel capacitatea de reținere a acestuia.

Extracția reactivă reprezintă procesul care îmbină procesele chimice, respectiv reacția dintre solut și extractant, și procesele fizice de difuzie și solubilizare a compusului format în urma reacției chimice. Dan Cașcaval, Tehnici de separare și concentrare specifice în ingineria biochimică – Procedee de extracție, Tipografia Universitatea Tehnică ”Gh. Asachi”, Iași, 2000, 25-30, 249-256, 34-40, 53, 54.

Principalii parametri care influențează eficiența unui proces de separare lichid-lichid!

Utilizându-se extracția reactivă se va analiza influența pH-ului fazei apoase inițiale asupra eficienței separării acidului fumaric și influența concentrației agentului de extracție asupra eficienței procesului.

II. 6. Influența pH-ului fazei apoase inițiale asupra eficienței separării

Un rol foarte important asupra gradului de extracție a acidului fumaric din soluția inițială îl are pH-ul. Ca metodă de extracție se utilizează extracția fizică și extracția reactivă. Principiul metodei constă în menținerea aceleiași concentrații a solventului și agentului de extracție, însă se variază pH-ul la valorile propuse.

Se lucrează la valori ale pH-ului diferite și anume la valorile: 1, 2, 3, 4, 6.

Concentrația soluției inițiale de acid fumaric este C0 = 5g/L iar pH-ul acesteia este pH = 2,26.

Pentru a ajunge la valorile propuse de pH, în soluție se va adăuga fie acid, fie bază. Ca acid se folosește o soluție de H2SO4 de concentrație 4% iar ca bază o soluție de NaOH de concentrație 4%.

Ca extractant se folosește Amberlit LA-2 de concentrație 20g/L care a fost dizolvat în doi solvenți cu constante dielectrice diferite, n-heptan și diclormetan.

Sistemul de extracție este format dintr-o fază apoasă reprezentată de soluția inițială de acid fumaric și de o fază organică formată, în cazul extracției fizice din solvenți și dintr-un amestec de solvent și extractant în cazul extracției reactive. Raportul molar dintre faza apoasă și cea organică este de 1:1.

(1) (2) (3)

Figura 1-faza organică și apoasă înainte de agitare, 2- faza organică și apoasă după agitare, 3-probele în centrifugă

Modul de lucru presupune amestecarea și extracția a 20 ml soluție de acid fumaric cu pH-ul modificat la valorile corespunzătoare, cu 20 ml soluție de fază organică (Amberlit LA-2, n-heptan și 1-octanol). Acestea se introduc în coloana de extracție cu agitare vibratorie, unde sunt agitate timp de 1 minut. Emulsia rezultată se supune centrifugării timp de 20-25 de minute la 3500-4000 rot/min unde are loc separarea celor două faze în rafinat și extract.

După extracția acidului fumaric și formarea rafinatului (faza săracă în acid fumaric) și extractului (faza care conține acidul fumaric extras), mai departe se lucrează cu rafinatul pentru a se vedea exact ce cantitate de acid fumaric s-a extras.

Figura Rafinatul și extractul după centrifugare

Dozarea acidului fumaric s-a realizat spectrofotometric la lungimea de undă 212 nm cu o diluție a rafinatului de 1:300.

Figura. Influenta valorii pH-ului fazei apoase asupra eficientei separării
acidului fumaric prin extractie fizică

În figura de mai sus este reprezentată influența pH-ului fazei apoase asupra eficiența separarării acidului fumaric prin extracția fizică utilizând doi solvenți diferiți (diclormetan prescurtat DCM și n-heptan).

Din reprezentarea grafică se poate observa ca la valorile de pH 1, 2, 4 și 6, utilizându-se ca solvent diclormetan, gradul de extracție este mai mare comparativ cu rezultatele obținute prin utilizarea n-heptanului.

De asemenea, se mai poate observa că la valoarea de pH=2 s-a obținut cel mai mare grad de extracție atât în cazul diclormetanului cât și în cazul n-heptanului. Însă în cazul diclormetanului, gradul de extracție la pH=2 este de peste 60%.

Prin urmare, prin extracția fizică, cea mai recomandată valoare de pH la care se poate face extracția este valoarea 2 pentru că eficiența separarării este mai ridicată.

Figura. Influența valorii pH-ului fazei apoase asupra eficienței separării
acidului fumaric prin extracție reactivă

În reprezentarea grafică de mai sus, este prezentată influența pH-ului asupra eficienței separării acidului fumaric utilizându-se ca metodă de extracție, extracția reactivă.

Se poate observa că la o concentrație de 5 g/l ALA-2 atât în cazul n-heptanului cât și în cazul diclormetanului, gradul de extracție este sub 20% la toate valorile de pH.

La o concentrație de 20 g/l ALA-2 utilizându-se atât n-heptan cât și diclormetan ca solvenți, cel mai mare grad de extracție se obține la pH=2 și la pH=3, acesta fiind peste 50%.

Cel mai mare grad de extracție utilizându-se extracția reactivă, și anume aproape de 80% se obține în jurul valorii de pH=2. La această valoare de pH se extrage cea mai mare cantitate de acid fumaric din soluția apoasă.

II. 7. Influența concentrației agentului de extracție asupra eficienței procesului

Extracția acidului fumaric se realizează prin extracția reactivă. Ca agent de extracție se utilizează Amberlit LA-2 în diferite concentrații cuprinse între 5 g/L și 80 g/L iar valoarea de pH se menține în jurul valorii de 2.

Principiul metodei constă în menținerea valorii de pH constantă variindu-se concentrația agentului de extracție.

Solventul folosit este n-heptan în concentrație de 20 g/L. Concentrația soluției inițiale de acid fumaric este C0= 5g/L iar pH-ul acesteia citit la pH-metru este pH= 2,26. Pentru a se ajunge la valoarea pH-ului de 2, în soluție se adaugă soluție de H2SO4 de concentrație 4% până când valoarea pH-ului este 2.

Faza apoasă este reprezentată de soluția de acid fumaric cu pH-ul modificat iar faza organică este reprezentată de agentul de extracție în concentrații 20 g/L și 40 g/L și de solventul n-heptan.

După pregătirea soluțiilor, următoarea etapă este extracția.

Raportul molar dintre faza organică și faza apoasă este de 1:1 și anume se vor supune extracției 20 ml fază apoasă și 20 ml fază organică.

Modul de lucru constă în contactarea celor două faze și agitarea lor pentru facilitarea extracției timp de 1 minut în coloana de extracție cu mișcare vibratorie.

După această etapă probele se întroduc în centrifugă, unde sunt centrifugate timp de 20-25 de minute la 3500-4000 rot/min. În urma centrifugării se obține separarea fazelor în extract și rafinat. Mai departe se lucrează cu rafinatul.

Dozarea acidului fumaric s-a realizat spectrofotometric la lungimea de undă 212 nm cu o diluție a probei de 1:300.

Figura. Influența concentrației extractantului asupra eficientei separarii
acidului fumaric prin extractie reactivă (pH-ul fazei apoase = 2)

În reprezentarea grafică de mai sus, este prezentată variația gradului de extracție a acidului fumaric, funcție de concentrația extractantului utilizat și anume Amberlit LA-2, la pH-ul soluției apoase egal cu 2.

Se observă că gradul de extracție crește treptat odată cu creșterea concentrației extractantului.

Cel mai mare grad de extracție a acidului fumaric și anume peste 90% se obține la o concentrație de 80 g/l Amberlit LA-2 utilizându-se ca solvent diclormetan.