Generarea și caracterizarea unei linii imortalizate de celule stromale mezenchimale umane derivate din ƫesut adipos [304482]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific: Conf. Univ. Dr. Elena Ionică

Îndrumător științific: Dr. Irina Titorencu

Absolvent: [anonimizat] 2020

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Generarea și caracterizarea unei linii imortalizate de celule stromale mezenchimale umane derivate din ƫesut adipos

Coordonator științific: Conf. Univ. Dr. Elena Ionică

Îndrumător științific: Dr. Irina Titorencu

Absolvent: [anonimizat] 2020

[anonimizat] (MSC) au câștigat o [anonimizat]. [anonimizat], acestea par a fi în prezent cele mai relevante pentru utilizare terapeutică. [anonimizat], precum angiogeneza și imunomodularea. [anonimizat]. [anonimizat]-urile au fost studiate pe scară largă pentru evaluarea beneficiilor terapeutice așteptate în aplicațiile clinice.

[anonimizat], [anonimizat] 2006, care au fost rezumate de Dominici și colaboratorii săi (Dominici și colab., 2006). Aceasta lucrare se axează pe celulele stromale mezenchimale derivate din țesutul adipos (ADSC) subcutanat uman care au atras o [anonimizat] a acestora, ușurința de recoltare și de menținere în cultură. [anonimizat]-urilor din diferite eșantioane (lipoaspirate, țesutut adipos subcutanat) se poate dovedi a fi o opțiune fezabilă din punct de vedere clinic.

[anonimizat] o variantă care ar putea evita mai multe dintre limitările abordărilor bazate pe celule. Însă, pentru a optimiza izolarea și eficacitatea acestuia este nevoie de o sursă stabilă și continuă de celule. S-a [anonimizat]. Variabilitatea secreției proteinelor sugerează faptul că aceste celule reprezintă o populație heterogenă care conține subtipuri distincte funcțional.

Astfel, ne-am propus să expandăm cultura primară de ADSC de la un singur pacient: [anonimizat] a [anonimizat]. Pe parcursul realizării pasajelor in vitro se poate observa o scădere a ratei de proliferare care este asociată cu senescența celulară care duce la imposibilitatea utilizării acestora pe termen lung. [anonimizat] a [anonimizat] o variabilitate crescută a rezultatelor. O modalitate de a [anonimizat]-se o sursă de celule utilizabile pe o periodă de timp nedefinită, care să își mențină proprietățile și să ofere rezultate concordante în urma experimentelor. În acest context, scopul acestei lucrări a fost de a genera o linie imortalizată de ADSC prin inducerea expresiei ectopice a genei hTERT (componenta catalitică a telomerazei), care să prezinte potențial proliferativ ridicat in vitro, menținând în același timp caracteristicile definitorii ale celulelor stromale mezenchimale primare.

Pentru atingerea scopului formulat anterior, obiectivele urmărite în lucrarea de față au fost următoarele: izolarea ADSC-urilor din țesutul subcutanat uman, imortalizarea ADSC-urilor prin transducție cu gena hTERT, selecția unei populații clonale derivate dintr-o singură celulă și caracterizarea liniei celulare din punct de vedere al prezenței markerilor de suprafață specifici, al potențialului de diferențiere adipogenă, osteogenă și condrogenă, respectiv al potențialului proliferativ in vitro.

Capitolul 1. Aspecte teoretice

1.1. Celulele stromale mezenchimale

1. Caracteristicile celulelor stromale mezenchimale

Celulele stromale mezenchimale (MSC) constituie un grup heterogen de celule progenitoare nespecializate, cu formă fibroblast-like (fusiformă) și aderente la plastic în condiții de cultură standard, capabile să se auto-reînnoiască prin diviziune și să se diferențieze în mai multe linii celulare (Wei și colab., 2013). Nomenclatura a fost recomandată de Societatea Internațională pentru Terapie Celulară, întrucât nu se cunosc date care să susțină desemnarea MSC-urilor ca fiind celule stem funcționale biologic (Horwitz și colab., 2005).

Aceste celule au fost raportate pentru prima dată în măduva osoasă, fiind izolate și caracterizate de către Alexander Friedenstein și colaboratorii săi în anul 1976 și de atunci s-au utilizat în multe studii (Friedenstein și colab., 1976), măduva osoasă fiind de altfel cel mai bine studiat țesut drept sursă de MSC. Totuși, recoltarea celulelor măduvei osoase este o procedură dureroasă, cu randament scăzut de MSC-uri, acestea reprezentând o fracție minimă, mai exact de 0.001-0.01% din celulele nucleate existente (Pittenger și colab., 1999). Aceste limitări au condus la căutarea unor căi alternative de obținere a acestor celule, precum ar fi recoltarea de la nivelul țesutului adipos sau din alte surse de țesut, ca de exemplu sângele cordonului ombilical, sângele periferic, creierul, plămânul, ficatul, dermul și mușchiul scheletic (Keating, 2006; Eom și colab., 2011), existând defapt aproape în toate organele și țesuturile post-natale celulele cu caracteristici ale celulelor stromale mezenchimale (Bydlowski și colab., 2009). Cu toate acestea, sunt preferate sursele care permit proceduri minim invazive și izolarea unor cantități abundente de celule.

În general, celulele stem mezenchimale umane (hMSC) izolate din diverse țesuturi au într-o mare măsură aceleași caracteristici biologice, existând unele diferențe în materie de morfologie, imunofenotip, capacitate proliferativă, potențial de diferențiere, profil de expresie genică, proteom, activitate imunomodulatoare și utilitate pentru aplicațiile medicale specifice (Strioga și colab., 2012 ).

Celulele stromale mezenchimale se caracterizează prin plasticitate ridicată, având, pe lângă proprietăți de auto-reînnoire, capacitatea de a se diferenția. Inițial, exista presupunerea că celulele stromale specifice țesutului adult sunt capabile să se diferențieze numai către liniile celulare ale țesutului de origine, însă s-a constat apoi că sunt multipotente. Acestea se diferențiază cu ușurință in vitro către liniile celulare mezenchimale: linia osteogenă, adipogenă, condrogenă (Dominici și colab., 2006). S-a raportat însă și un potențial de diferențiere endodermică și ectodermică a MSC, printr-un proces ce se numește transdiferențiere, diferențiindu-se de exemplu către linia neurogenă, miogenă și hepatogenă, atunci când sunt cultivate cu factori specifici, însă in vivo acest proces este controversat (Uccelli și colab., 2008). Potențialele de diferențiere a MSC sunt prezentate în figura 1.1, care în general pot fi evidențiate in vitro prin cultivarea în medii ce conțin factori inductori specifici. Astfel, diferențierea MSC-urilor le conferă o posibilă utilitate în diverse aplicații, de exemplu pentru repararea defectelor mezodermice și pentru gestionarea diverselor boli (Aust și colab., 2004).

Figura 1.1. Reprezentarea schematică a multipotenței celulelor stromale mezenchimale: auto-înnoire, diferențiere și trandiferențiere (după Uccelli și colab., 2008).

În ceea ce privește fenotipul, MSC prezintă markeri de suprafață celulară specifici, majoritatea regăsiți sub forma clusterelor de diferențiere (CD): CD105 (cunoscut și sub numele de endoglină), CD73 (ecto-5′-nucleotidază), CD44, CD90 (Thy-1), CD71 (receptorul pentru transferină), gangliosida GD2 și CD271 (receptorul pentru factorul de creștere nervos cu afinitate scăzută) și markerul STRO-1 (cel mai cunoscut marker al celulelor stromale mezenchimale). Acești markeri sunt exprimați în niveluri variabile, observându-se că apar diferențe în funcție de specie, sursele de țesut și condițiile de cultură (Uccelli și colab., 2008). De asemenea, MSC-urile nu exprimă markerii hematopoietici minimali CD34, CD45, CD14 or CD11b, CD19 or CD79α, and HLA-DR (Dominici și colab., 2006) sau moleculele co-stimulatoare CD80, CD86 și CD40 (Uccelli și colab., 2008). Deși au fost evidențiați opt markeri de suprafață pentru identificarea MSC-urilor (enunțați mai sus), Societatea Internațională de Terapie Celulară susține că identificarea markerilor CD105, CD73 și CD90 și absența markerilor hematopoietici (CD45, de exemplu), este suficientă pentru imunofenotiparea MSC (Dominici și colab., 2006).

Astfel, conform Societății Internaționale pentru Terapie Celulară, există trei cerințe minime pentru ca o populație de celule să fie clasificată drept MSC. Prima este că acestea sunt izolate pe baza aderenței lor la suprafața plastică atunci când sunt în cultură, dintr-o populație de celule mononucleare. A doua cerință este că în mai mult de 75% din celulele cultivate trebuie să fie detectată expresia CD105+, CD73+ și CD90+, în timp ce CD34, CD45, CD14 sau CD11b, CD79 sau CD19 și HLA-DR nu trebuie să fie exprimate. În cele din urmă, celulele trebuie să se poată diferenția în osteoblaste, adipocite și condrocite (Horwitz și colab., 2005). Aceste trei criterii sunt, de asemenea, sintetizate și în tabelul 1.1.

Tabel 1.1. Sintetizarea criteriilor minime pentru identificarea MSC (după Dominici și colab., 2006).

_____________________________________________________________________________

1. Aderența la plastic în condiții de cultură standard

2. Fenotip Markeri Positivi (≥ 95% +) Markeri Negativi (≤ 2% +)

CD105 CD45

CD73 CD34

CD90 CD14 sau CD11b

CD79a sau CD19

HLA-DR

3. Diferențierea in vitro către osteoblaste, adipocite și condroblaste (demonstrată prin colorarea in vitro a celulelor)

Potențialul de diferențiere adipogenă

MSC-urile se diferențiază către adipocite, adoptând proprietățile fenotipice, biochimice și funcționale ale acestora. Astfel, aceste celule sunt caracterizate prin acumularea intracelulară a picăturilor lipidice, precum și prin transcrierea genelor specifice. Caracteristicile și mecanismele moleculare care stau la baza diferențierii adipocitelor au fost cercetate pe larg, constatându-se că aceasta este determinată de mai multe procese biologice, cum ar fi proliferarea celulară, modificările morfologice, expresia markerilor specifici de linie și acumularea lipidelor (Fink și Zachar, 2011).

În ciuda unei înțelegeri cât de cât sporite a biologiei MSC, dar și a existenței unui interes deosebit în studiul diferențierii adipogene a acestor celule, standardizarea tehnicilor realizate in vitro lipsește însă. Consultând literatura din domeniu, un mediu standard de diferențiere adipogenă constă în Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplimentat cu 10% ser fetal bovin, dar cu componente suplimentare variate, trei dintre acestea fiind întâlnite în majoritatea cazurilor: insulina, dexametazona și IBMX (3-izobutil-1-metilxantina) (Scott și colab., 2011). Insulina este utilizată pe scară largă pentru a induce proliferarea și diferențierea preadipocitelor (Ailhaud, 1982), dexametazona este o moleculă anti-inflamatorie care stimulează atât diferențierea osteogenă cât și pe cea adipogenă într-o manieră dependentă de concentrație (Salasznyk și colab., 2005), iar IBMX în combinație cu dexametazona reglează PPARγ, promovând adipogeneza. IBMX este un inhibitor competitiv, neselectiv al fosfodiesterazei, care crește concentrația de AMPc intracelular și protein-kinaza A (PKA) (Gurriarán-Rodríguez și colab., 2011). Calea de semnalizare PKA este necesară pentru activarea transcripțională a PPARγ și, prin urmare, stimulează adipogeneza (Kim și colab., 2010). Au mai fost utilizate și alte componente speciale pentru a induce/accelera adipogeneza, unul dintre cele mai frecvent studiate fiind rosiglitazona (agonistă PPARy), evidențiindu-se într-un studiu că poate chiar induce diferențierea fără a fi nevoie de alți factori (Ninomiya și colab., 2010).

Potențialul de diferențiere osteogenă

Diferențierea osteogenă a MSC presupune apariția osteoblastelor, printr-un proces care este reglat în diferite etape. Din osteoblastele mature derivă osteocitele, care sunt înconjurate de matrice extracelulare secretată. Acestea reglează activitatea osteoblastului și a osteoclastului și, în consecință, mențin homeostazia osoasă (Valenti și colab., 2016).

Diferențierea osteogenă a MSC este indusă in vitro în prezența dexametazonei, a acidului ascorbic și a β-glicero-fosfatului (Jaiswal și colab., 1997) într-o perioadă de aproximativ o lună, fiind prezente osteoblaste diferențiate. Aceasta poate fi detectată prin colorația depozitelor extracelulare de fosfat de calciu care încep să se acumuleze la sfârșitul celei de-a doua săptămâni și devin din ce în ce mai dense ulterior (Hanna și colab., 2018).

În primele două săptămâni se remarcă existența markerilor specifici osteoblastelor (precum fostataza alcalină), prelucrarea procolagenului de tip I în colagen de tip I sub efectul acidului ascorbic și depunerea progresivă a unei matrici extracelulare de colagen (ECM). Mai târziu, pot fi detectați alți markeri osoși, cum ar fi osteocalcina, osteopontina, sialoproteina osoasă și osteonectina, iar depozitele de hidroxiapatită marchează faza finală a dezvoltării fenotipice a osteoblastului (Quarles și colab., 1992). ECM este un element esențial pentru diferențierea osteogenă ce se acumulează după maxim o săptămână de cultură, fiind secretată de MSC-urile care se diferențiază și conține factori de creștere și multe proteine, cum ar fi fibronectina, vitronectina, laminina, osteopontina și osteonectina (El-Amin și colab., 2003), iar după două săptămâni de cultură, începe mineralizarea ECM. S-a constatat că proliferarea celulară existentă înainte de mineralizare este un proces critic pentru creșterea masei osoase (Quarles și colab., 1992).

Potențialul de diferențiere condrogenă

Condrogeneza este un proces complex ce este inițiat la nivelul celulelor progenitoare condrogene care suferă proliferare, condensare mezenchimală și diferențiere în condrocite (Hall și Miyake, 2000). Diferențierea condrogenică a MSC poate fi indusă in vitro prin adăugarea diferitelor suplimente și factori de creștere la mediul bazal. În această privință, factori precum ar fi TGF- β1 și TGF-β 3 (factorii de creștere transformanți beta 1 și 3), BMP 4 (proteina morfogenetică osoasă 4) și bFGF (factorul de creștere de bază al fibroblastul) prezintă un potențial condrogenic ridicat (Stromps și colab., 2014).

Deși TGF-β este un cunoscut inhibitor al ciclului celular, acesta are un rol crucial în creșterea celulară, diferențierea și funcția imunitară (Cortez și colab., 2016). Efectul său general asupra proliferării condrocitelor in vitro este unul stimulator, superfamilia TGF-β fiind una dintre cele mai investigate substanțe active biologic din domeniul ingineriei de țesut cartilaginos. S-a observat că tratamentul cu TGF-β crește sinteza matricei cartilajului, în special sinteza de aggrecan (Li și colab., 2005). În multe studii, precum ar fi cel realizat de către Li și Xu, s-a observat că diferențierea condrogenică a MSC a avut loc cu succes folosind TGF-β1, desigur într-o manieră dependentă de doză (Li și Xu, 2005). Ambele izoforme au fost observate influențând diferite etape de diferențiere condrogenă in vitro, însă TGF-β3 a crescut semnificativ proliferarea celulelor mezenchimale (James și colab., 2009). În urma stimulării cu TGF-β3 in vitro a celulelor stromale mezenchimale derivate din țesutul adipos cultivate în sediment, metodele histologice și imunohistochimice au arătat depunerea componentelor tipice ale matricei extracelulare, iar analiza RT-PCR a genelor care codifică proteine ale matricei (cum ar fi colagenul de tip II și aggrecanul) au confirmat diferențierea condrogenă (Hashemibeni și colab., 2008).

De asemenea, în urma evaluării histologice a culturii induse spre diferențiere prin colorația cu Alcian Blue s-au evidențiat proteoglicanii și glicozaminoglicanii din matricea extracelulară. Totodată, pot fi observate și lacunele condrocitare (reprezentate de cavități din matrice) care conțin lichid extracelular și care se formează pe măsură ce condroblastele secretă matrice și fibre (de exemplu fibre de colagen de tip II). Condroblastele sunt prinse în interiorul acesteia, maturizându-se ulterior în celule numite condrocite. Condrocitele rămân responsabile pentru sinteza unor volume mari de matrice extracelulară. Fiecare lacună conține în general o singură celulă, dar în timpul diviziunii celulelor poate conține două, patru sau opt celule (Archer și Francis-West, 2003).

Figura 1.2. Reprezentarea schematică a condroblastului și a condrocitelor prezente într-o lacună condrocitară.

În plus, MSC-urile dețin caracteristici imunomodulatoare și imunosupresive care extind posibilitățile de utilizare terapeutică. Acestea secretă o mare varietate de molecule bioactive: citokine pro și anti-inflamatorii și factori de creștere, prin intermediul cărora asigură modularea răspunsului inflamator, atenuând afecțiunile imunitare, refacerea alimentării vasculare și repararea țesuturilor și contribuind astfel la homeostaza tisulară și imunologică. De asemenea, pot induce secreția factorilor solubili de către alte celule prezente în nișa respectivă, care să stimuleze diferențierea acestora, favorizând procesul de reparare (Monteiro și colab., 2010). Terapia celulară cu MSC este astfel o alternativă terapeutică promițătoare, dar înțelegerea proprietăților acestor celule este încă în proces de dezvoltare.

S-a observat că MSC dețin un rol critic în vindecarea leziunilor tisulare (Chen și colab., 2008), de exemplu rănile cutanate. Vindecarea rănilor este un proces complex care presupune migrare celulară, inflamație, angiogeneză, formarea țesuturilor de granulație, reepitelializare și remodelare a matricei extracelulare. Astfel, MSC-urile au un rol activ în acest proces și s-a observat că utilizarea terapeutică a acestora îmbunătățește rezultatele (Lee și colab., 2016). Walter și colaboratorii au demonstrat că MSC-urile obținute din măduva osoasă au crescut rata de închidere a rănii prin creșterea migrării in vitro a fibroblastelor și a keratinocitelor (Walter și colab., 2010). Constatări similare au fost raportate și de către Smith și colab., care au descoperit că vindecarea unei răni într-un ritm accelerat s-a datorat migrării crescute de fibroblaste, în prezența MSC-urilor derivate din măduva osoasă (Smith și colab., 2010).

Celulele stromale mezenchimale derivate din țesutul adipos

La mamifere, după cum se cunoaște, există trei tipuri de țesut adipos: țesutul adipos alb, țesutul adipos din măduva osoasă și țesutul adipos brun. Țesutul adipos alb este cel mai abundent țesut conjunctiv întâlnit la om și este distribuit în principal sub formă de grăsime subcutanată și viscerală (Gesta și colab., 2007). Acesta este derivat din stratul mezodermic al embrionului, ca și măduva osoasă, dezvoltându-se atât prenatal cât și postnatal și deține o stromă de susținere care este ușor de izolat – fracția vasculară stromală (Gonda și colab., 2008). În ultimii ani, pe baza acestui fapt, s-a evidențiat că țesutul adipos nu este doar o sursă de energie, ci reprezintă o sursă de celule stromale mezenchimale multipotente (ADSC). Acestea au fost izolate și caracterizate pentru prima dată de Zuk și colaboratorii săi în anul 2001 (Zuk și colab., 2002) și, de atunci, au fost studiate pe scară largă.

Digestia enzimatică a țesutului adipos eliberează un mix heterogen de celule, fracția vasculară stromală (SVF), care conține populația de celule stromale (Gimble și Guilak, 2003). Aceste celule pot fi izolate în număr semnificativ, frecvența acestora în țesutul adipos fiind după unii autori de aproximativ 100 de ori mai mare (Sakaguchi și colab., 2005) sau după alții de aproximativ 500 de ori (Fraser și colab., 2006), în comparație cu măduva osoasă, aproximativ 300.000 celule/ml (Zhu și colab., 2008) și prezintă o cinetică stabilă de creștere și de proliferare în cultură (Aust și colab., 2004). De asemenea, țesutul adipos poate fi obținut prin proceduri chirurgicale mai puțin invazive decât alte țesuturi.

Similar cu alte tipuri de MSC, este cunoscut faptul că ADSC-urile umane exprimă markerii de suprafață CD73, CD44, CD90 și CD105, dar nu și markerii hematopoietici CD11c, CD31, CD34, CD45, CD80 și CD86 (Dominici și colab., 2006; Tárnok și colab., 2010).

De asemenea, s-a dovedit că ADSC-urile prezintă o plasticitate impresionantă, incluzând abilitatea de a suferi o diferențiere către mai multe linii celulare, cât și capacitatea de auto-reînnoire. Acestea pot fi diferențiate în diverse tipuri de celule, ca răspuns la compușii inductivi. În timpul procesului de diferențiere, acestea își reduc rata de proliferare și suferă modificări morfologice. Astfel, una dintre cele mai importante utilizări ale ADSC ar fi înlocuirea țesutului adipos, problemele de la nivelul țesuturilor moi fiind frecvente în urma traumatismelor, arsurilor și a rezecțiilor oncologice (Tremp și colab., 2011). Cu toate acestea, sunt necesare numeroase studii înainte ca ADSC-urile să poată fi utilizate clinic.

Există astfel studii care demonstrează efectele diferiților factori de creștere secretați de ADSC asupra vindecării rănilor. Kim și colaboratorii săi au demonstrat că ADSC-urile accentuează procesul de vindecare al rănilor în experimente in vitro și in vivo. De asemenea, aceștia au observat că mediul condiționat provenit de la ADSC a stimulat migrarea fibroblastelor dermice după rănire. În plus față de dovezile in vitro, procesul de vindecare a rănii a fost de asemenea verificat și in vivo, demonstrându-se că administrarea de mediu condiționat provenit de la ADSC a redus semnificativ dimensiunea plăgii și a accelerat reepitelializarea la periferia acesteia (Kim și colab., 2007). Prin urmare, atât ADSC, cât și factorii solubili secretați reprezintă mijloace promițătoare pentru vindecarea rănilor.

Prin urmare, comparativ cu MSC-urile din măduva osoasă, ADSC-urile au avantaje pentru utilizarea potențială în ingineria tisulară și în diverse aplicații clinice, țesutul adipos reprezentând o sursă abundentă și accesibilă de celule stromale mezenchimale, acestea din urma fiind ușor recoltate, izolate și selectate. Există însă și un dezavantaj, și anume acela că expansiunea in vitro ar putea reduce potențialul replicativ și de diferențiere, promovând senescența celulară.

1.1.3. Secretomul celulelor stromale mezenchimale

MSC-urile pot fi extrem de eficiente pentru aplicații în medicina regenerativă, acționând, pe lângă capacitatea acestora de a înlocui țesutul deteriorat prin diferențierea în anumite fenotipuri, și prin alte mecanisme. De exemplu, MSC-urile pot secreta mediatori solubili care favorizează repararea unui țesut, astfel încât diferențierea celulară nefiind necesară. Există chiar și o ipoteza ce susține faptul că nu celulele în sine promovează regenerarea țesuturilor, ci factorii produși de MSC care acționează într-un mod paracrin (Wobma și colab., 2018). Aceasta ipoteză a apărut ca urmare a existenței studiilor care demonstrează că nivelul de grefare a MSC în organele afectate este adesea neglijabil (mai puțin de 1%) (Tögel și colab., 2005).

Proteinele ​​solubile împreună cu veziculele extracelulare secretate formează secretomul. Proteinele sunt reprezentate de factori activi biologici, cum ar fi citokinele, chemokinele și factorii de creștere, iar veziculele extracelulare prezintă membrană, diametrul acestora variind între 30-150 nm și includ microvezicule și exozomi. În timpul formării lor, diverse proteine ​​transmembranare și componente citosolice sunt încorporate în invaginările membranei, fiind apoi eliberate în spațiul extracelular (Driscoll și Patel, 2019). În figura 1.3 se poate observa reprezentarea schematică a componentelor secretomului.

Figura 1.3. Prezentarea schematică a componentelor secretomului MSC (adaptă după Driscoll și Patel, 2019).

Datorită secreției acestei game largi de molecule bioactive (diferite citokine, chemokine și factori de creștere), MSC-urile pot stimula migrarea celulele stem rezidente într-o zonă deteriorată, proliferarea și diferențierea acestora (Kalinina și colab., 2015; Lopatina și colab., 2014).

Analiza extinsă a microveziculelor eliberate de MSC a evidențiat existența a peste 900 de proteine. Alături de setul de proteine ​​celulare, microveziculele pot conține, de asemenea, o varietate de lipide și diferite tipuri de ARN-uri (ARNm, microARN, ARNt, ARN necodant). În microveziculele derivate din MSC, s-au descoperit markerii caracteristici pentru acestea, și anume antigenele CD73, CD90 și CD105 (Dominici și colab., 2009).

S-a descoperit că MSC-urile pot produce cantități mai mari de exozomi în comparație cu alte celule și, la fel ca în cazul microveziculelor, aceștia prezintă în general moleculele specifice de țesut/celulă, în funcție de situsul în care apar (Yeo și colab., 2013).

Până în prezent, efectul regenerator al factorilor secretați de MSC a fost investigat în ceea ce privește multe condiții, inclusiv regenerarea inimii, sistemului nervos central, rinichilor, țesutului muscular și în vindecarea rănilor, sugerând astfel că secretomul MSC poate fi la fel de eficient precum celulele în sine (Mitchell și colab., 2019). În plus, avantajul evident al folosirii mediilor condiționate (care conțin factori secretați) pentru o eventuală terapie clinică este reprezentat de faptul că pot fi manipulate și gestionate mai ușor decât celulele. Totodată, evitarea administrării directe a celulelor limitează în mare parte probleme precum tumorigeneza sau respingerea imunologică de către organism (Pawitan, 2014).

MSC-urile interacționează cu stimuli locali, cum ar fi citokine inflamatorii, liganzi ai receptorilor Toll-like (TLRs) și în prezența condițiilor hipoxice, care le pot stimula să producă o cantitate mare de factori de creștere, care îndeplinesc funcții multiple în regenerarea țesuturilor. Mulți dintre acești factori sunt importanți mediatori în cazul angiogenezei și în prevenirea apoptozei celulare, cum ar fi factorul de creștere endotelial vascular (VEGF), factorul de creștere asemănător insulinei (IGF-1), factorul de creștere a hepatocitelor (HGF), IL-6 și CCL-2 (Chen și colab., 2008).

În cazul existenței unei leziuni, hipoxia locală, inflamația și speciile reactive de oxigen pot activa celule stem transplantate, celule stem rezidente și tipuri de celule lezate, dupa cum se poate observa și în figura 1.4. Celulele stromale mezenchimale pot oferi protecție, prin efectele benefice asupra matricei extracelulare, a celulelor stem rezidente și a celulelor lezate învecinate. VEGF, HGF și FGF2 sunt factori de semnalizare care promovează angiogeneza. TGF β, IL-10 și IL-13 pot fi componente paracrine importante care suprimă inflamația locală. Semnalele anti-apoptotice pot juca un rol în supraviețuirea celulelor stem autocrine, precum și a celulelor rănite vecine. Mecanismele mediate paracrin de către celulele stem s-au dovedit a potența angiogeneza, a remodela matricea extracelulară, precum și a reduce apoptoza, inflamația și dimensiunea infarctului, în cazul unei leziuni experimentale (Crisostomo și colab., 2008).

Figura 1.4. Reprezentare schematică a mecanismelor paracrine potențiale ale celulelor stem (adaptată după Crisostomo și colab., 2008).

Astfel, acționând prin semnalizare paracrină, MSC accelerează închiderea rănilor de la nivelul pielii, cresc angiogeneza, reduc inflamației, reglează pozitiv remodelarea matricei extracelulare (determină expresia crescută de colagen de tip III, fibronectină și elastină) și, astfel încurajează regenerarea pielii (structura și funcția normală). S-a observat de către Jeon și colaboratorii săi că fibroblastele izolate din piele umană, cultivate în prezența mediilor condiționate provenite de la MSC-uri din sânge ombilical uman au prezentat o capacitate migratorie crescută semnificativ (Jeon și colab., 2010). Totodată, s-a dovedit că în hipoxie crește eficacitatea MSC-urilor, prezentând un potențial puternic de vindecare a rănilor. În acest context, folosind hMSC-uri într-un model de vindecare a rănilor murine, Jun și colaboratorii au constatat că MSC-urile cultivate în condiții hipoxice, în comparație cu cele cultivate în condiții normoxice, prezentau viabilitate și proliferare crescută, precum și o expresie crescută de VEGF (Jun si colab., 2014). Astfel, Lee și colaboratorii, revizuind rezultatele multiplelor studii, au putut observa o dezvoltare în timp a terapiilor de vindecare a rănilor bazate pe MSC, cercetarea fiind continuă în acest domeniu (Lee și colab., 2016).

Întrucât ADSC-urile reprezintă o sursă promițătoare pentru terapia celulară și ingineria tisulară, secretomul lor a fost analizat în numeroase studii, folosindu-se diverse abordări calitative și cantitative de cercetare a conținutului acestuia (Kupcova, 2013). Prin urmare, s-a observat că secretomul ADSC-urilor cultivate ar putea fi o alternativă pentru terapia celulară, moleculele care predomină fiind reprezentate de factorul de creștere endotelial vascular (VEGF), factorul de creștere al hepatocitelor (HGF), factorul de creștere transformant-beta (TGF-β), factorul-1 derivat din celulele stromale (SDF-1α) și interleukinele 6 și 8 (IL-6, IL-8), dar totuși aceste proteine ​​reprezintă doar un mic procent din întregului secretom al ADSC (Kilroy și colab., 2007). Moleculele acestea reglează o varietate de activități celulare, esențiale în regenerarea țesuturilor, cum ar fi proliferarea, angiogeneza și modularea inflamație (Aggarwal & Pittenger, 2005).

Astfel, secretomul MSC poate fi împărțit în mai multe categorii de factori în funcție de implicarea acestora în diverse procese biologice: angiogeneză, imunomodulare, neuroprotecție, proliferare, migrare și chimiotaxie.

2. Senescența celulară

Deși ADSC-urile ar putea reprezenta o categorie importantă de celule utilizate în terapia celulară, acestea prezintă o durată de viață limitată in vitro, ca orice tip de celulă somatică normală. Există studii care arată că utilizarea clinică a hMSC-urilor poate fi limitată după un anumit număr de diviziuni celulare în condițiile actuale ale cultivării in vitro, fenomen denumit senescență celulară sau replicativă (Stenderup și colab., 2003). De exemplu, Banfi și colaboratorii săi au observat că hMSC-urile pot atinge un maxim de 24-40 de dublări ale populației (PD) in vitro, înainte de a-și pierde potențialul de proliferare, capacitatea de adaptare și de diferențiere (Banfi și colab., 2000).

Caracteristica cheie a senescenței în cazul celulelelor care se divid este reprezentată de o perioadă lungă de proliferare normală, urmată de încetarea proliferării și, în cele din urmă, de moartea celulară. Acest proces a fost descris pentru prima dată în anul 1961 de către Leonard Hayflick, care a a descoperit că fibroblastele umane aveau o capacitate proliferativă limitată în cultură (Hayflick, 1965). Senescența reprezintă astfel starea metabolică activă și stabilă a celulelor, atât in vitro, cât și in vivo, caracterizată prin arestarea ireversibilă a proliferarii celulare și prin apariția de modificări dramatice în ceea ce constă morfologia, metabolismul, expresia genică și fenotipul secretor al celulelor (Dulic, 2013). Spre deosebire de celulele apoptotice, celulele senescente sunt viabile. Acestea secretă un panou de enzime proteolitice bioactive, citokine inflamatorii, factori de creștere și specii ROS, care pot contribui la procesul de îmbătrânire (Campisi și d'Adda di Fagagna, 2007).

Astfel, celulele senescente sunt caracterizate morfologic de forma aplatizată și neregulată, cu generarea de numeroase vacuole și debriuri celulare, dupa cum se poate observa și în figura 1.5.

Figura 1.5. Fenotipul reprezentativ a MSC la pasajul precoce (P3) – stânga și senescent (P12) – dreapta (Wagner și colab., 2008).

Apariția senescenței, care este un proces complex, este datorată anumitor fenomene care apar de-a lungul duratei de viață a celulelor, însă mecanismele moleculare care stau la baza acestora nu sunt bine cunoscute. Hayflick afirmă că senescența replicativă poate să fie rezultatul unui program genetic sau, mai degrabă, este evocată de evenimente stochastice sau întâmplătoare, accidentale (Hayflick, 1965). Cel mai probabil, însă, există o interacțiune a ambelor mecanisme. De asemenea, s-a observat într-un studiu din anul 2008 că anumite gene implicate în ciclul celular, în replicarea ADN-ului și în mitoză au fost semnificativ mai puțin exprimate în celulele senescente. Acest lucru consolidează ipoteza conform căreia senescența urmează un program în care genele implicate în proliferare sunt inhibate (Wagner și colab., 2008). După cum este precizat anterior, factorii cauzali care pot media acest proces nu sunt încă bine cunoscuți, dar ar putea include și modificări succesive de natură epigenetică (Noer și colab., 2007). Pe de altă parte, nu este exclusă posibilitatea ca acumularea de defecte celulare (de exemplu, stres oxidativ, scurtarea progresivă a telomerelor sau deteriorarea ADN-ului) să activeze un program specific pentru senescență. S-a evidențiat de către Wagner și colaboratorii faptul că modificările moleculare cresc succesiv cu fiecare pasaj și că nu sunt limitate la sfârșitul duratei lungi de cultură in vitro, de asemenea caracteristicile MSC schimbându-se aproape nedetectabil pe parcurs (Wagner și colab., 2008).

S-a arătat în studiul realizat de către Hayflick că o serie de schimbări în ceea ce privește parametrii fiziologici, funcționali și moleculari au avut loc în timpul culturilor pe termen lung, iar aceste modificări includ: scurtarea telomerelor care este cunoscută sub numele de fenomen tipic Hayflick de îmbătrânire celulară (,,limita lui Hayflick’’), potențial de proliferare în scădere treptată, și deteriorarea funcțiilor (Hayflick, 1965). ADN-ul de la nivelul telomerelor (structurile terminale ale cromozomilor), se scurtează în timpul fiecărei faze S a ciclului celular datorită incapacității ADN-polimerazei de a completa replicarea catenei de ADN. Prin urmare, scurtarea telomerelor acționează ca un ,,ceas mitotic’’ care determină senescența replicativă (Shay și Wright, 2000). În general, celulele senescente sunt blocate ireversibil din punct de vedere al diviziunii celulare în faza G1 a ciclului celular, dar fiind însă capabile de multe alte funcții celulare.

Pe de altă parte, senescența celulară prematură este cauzată și de alți factori decât lungimea critică a telomerelor, printre ele numărându-se lipsa de nutrienți și contactele intercelulare , radiațiile UV, speciile reactive de oxigen, chimioterapia, structura modificată a cromatinei și activitatea oncogenelor. Totusi, deși sunt descrise mai multe mecanisme de senescență, reducerea lungimii telomerilor este cea mai detaliat studiată (Legzdina și colab., 2016).

Scurtarea telomerelor

Scurtarea progresivă a telomerelor care duce la defecte în integritatea și stabilitatea cromozomilor a fost asociată cu senescența replicativă, deși este puțin probabil ca acest mecanism să fie singura cauză a acestui fenomen. În acest context, anumite studii arată că senescența MSC este datorată procesului de scurtare a telomerelor în timpul expansiunii in vitro (Kveiborg și colab., 1999; Baxter și colab., 2004; Parsch și colab., 2004).

Telomerele sunt secvențe scurte de ADN repetitive situate la capetele cromozomilor, fiind sintetizate cu ajutorul enzimei numite telomerază, având rol în menținerea lungimii acestora (Blackburn și Gall, 1978). Când celulele somatice adulte se divid în faza S a ciclului celular, are loc replicarea ADN-ului, iar telomerele se scurtează cu aproximativ 50 pb pe diviziune datorită incapacității ADN-polimerazei de a completa replicarea catenei de ADN ,,întârziate’’. (O'Hare și colab., 2001). Într-un studiu in vitro s-a evidențiat faptul că viteza de scurtare a telomerelor a fost de 100 bp la fiecare două pasaje (Bonab și colab., 2006). Prin urmare, scurtarea telomerelor acționează ca un ,,ceas mitotic’’ care determină senescența replicativă (Hayflick, 1965).

Mecanismul prin care scurtarea telomerelor induce fenotipul senescent nu este pe deplin cunoscut însă, dar se pare că este adesea atribuit lipsei telomerazei funcționale. Telomeraza este o enzimă, mai precis un complex ribonucleoproteic ce este alcătuit dintr-o matriță ARN, o subunitate catalitică esențială cu activitate de transcriptază inversă, care în cazul telomerazei umane este denumită hTERT și este absentă în celulele somatice adulte și componente proteice asociate (Counter și colab., 1998a). În absența hTERT, telomerele se scurtează în timpul diviziunii celulare deoarece complexul de replicare nu poate copia complet ADN-ul telomeric. Atunci când telomerele din unul sau mai mulți cromozomi ating o lungime critică apare senescența celulară și arestarea creșterii. Cu toate acestea, s-a observat menținerea lungimii telomerelor în celulele germinale, în unele celule stem și în celule maligne datorită activării acestei enzime (Kolquist, 1998). Dar deși hTERT este exprimat în celulele stem din mai multe țesuturi (Harrington, 2004), s-a observat că hMSC-urile cultivate in vitro nu prezintă nicio activitate a telomerazei, ceea ce sugerează că hMSC-urile pierd expresia acesteia în timpul expansiunii în condiții de cultură in vitro (Schieker și colab., 2004). Astfel, lungimea telomerelor în ceea ce privește hMSC-urile cultivate in vitro este similară cu cea din alte tipuri de celule somatice (Parsch și colab., 2004), iar extinderea culturii de hMSC duce la scurtarea continuă a telomerelor, ceea ce contribuie în cele din urmă la apariția senescenței.

Există o varietate de biomarkeri care pot fi studiati pentru a caracteriza senescența MSC. Printre aceștia, cei mai intalniti sunt asociati cu modificări morfologice și proliferative, expresia crescută a β-galactosidazei, pierderea potențialului de diferențiere catre cele trei linii mezodermice, arestarea ciclului celular, diverse modificări epigenetice, stresul oxidativ, scurtarea telomerelor și deteriorarea ADN-ului sau activarea genelor supresor tumorale p53, RB1 și p16 INK4 (Legzdina și colab., 2016).

Imortalizarea celulară

Există mai multe metode de imortalizare a celulelor în condiții de cultură, care presupun utilizarea de virusuri lentivirale, retrovirale și adenovirale recombinante care exprimă antigene EBV, HPV-16 E6/7 și SV40 LT (antigenele T al virusului Simian 40), hTERT, p53 și siARN și mutantele ras și myc (Katakura și colab., 1998).

O abordare mai recentă a imortalizării celulare constă în expresia proteinei TERT (Transcriptaza inversă a telomerazei, în special pentru celulele care sunt cele mai afectate de lungimea telomerelor (cele umane de exemplu) (Fridman și Tainsky, 2008). Astfel, lipsa activității telomerazei (care este inactivă în majoritatea celulelor somatice) poate fi depășită prin expresia ectopică a hTERT (Bodnar și colab., 1998). Folosind această abordare, expresia stabilă a hTERT previne senescența replicativă în hMSC (Simonsen și colab., 2002), cu o prelungire a perioadei de cultură pentru mai mult de 3 ani după unii autori, fiind menținută funcția acestora, inclusiv capacitatea de a se diferenția în mai multe linii celulare in vitro și in vivo (Abdallah și colab., 2005). Simonsen și colaboratorii au arătat că MSC-urile transduse cu hTERT prezentau activitate a telomerazei (lungimea telomerelor fiind mai mare decât în cazul celulelor control) și, de asemenea, acestea au continuat să prolifereze și după 260 de dublari de populație (PD), pe când celulele control încetând să prolifereze după 26 de PD. Totodată, acestea și-au menținut potențialul de diferențiere osteogenică, nu au format tumori și au prezentat cariotip normal (Simonsen și colab., 2002).

Deși activitatea funcțională a telomerazei poate fi reconstituită prin expresia ectopică a hTERT, este controversat însă faptul că doar gena hTERT poate avea rol în menținerea fenotipului imortalizat al celulelor somatice umane adulte (Counter și colab., 1998b).  Spre exemplu, Counter și colaboratorii săi au folosit pe lângă hTERT, antigenul LT al virusului simian 40 (SV40) înainte de transformarea lor prin intermediul genei ras, pentru a imortaliza fibroblastele umane și celulele renale embrionare (Counter și colab., 1998b), iar Kiyono și colaboratorii săi au descoperit că imortalizarea keratinocitelor neonatale și a celulelor epiteliale mamare adulte a necesitat inactivarea căii pRB/p16INK4, precum și prezența telomerazei funcționale (Kiyono și colab., 1998). Multe studii, însă, arată că expresia hTERT este suficientă pentru a imortaliza celule (Bodnar și colab., 1998; Ouellette și colab., 2000).

Imortalizarea prin expresia ectopică a hTERT este însă limitată și de constatarea că aceste celule ar suferi o transformare neoplazică (Burns și colab., 2005; Serakinci și colab., 2004). Cu toate că s-a observat că există o legătură puternică între expresia telomerazei și multe tipuri de cancer, telomeraza este enzima critică în depășirea limitărilor de creștere datorate disfuncției telomerelor, dar nu provoacă dereglarea creșterii. Există zeci de tipuri de celule normale care au fost imortalizate cu telomerază fără a se evidenția semne de transformare malignă și fără a fi modificată capacitatea de diferențiere (Harley, 2002).

În același timp, pe lângă faptul că celulele imortalizate cu hTERT au un cariotip normal, menținând în același timp caracteristicile fenotipice ale celulelor primare, mențin și controlul ciclului celular, răspund normal la ser și mitogeni, nu sunt maligne, prezintă inhibiție de contact și depind de ancorarea la substrat (Ouellette, 2000).

Transducția lentivirală

S-a constat în anumite studii faptul că menținerea în cultură pe termen lung a MSC-urilor adulte transduse cu ajutorul retrovirusului a condus la transformare neoplazică (Burns și colab., 2005; Serakinci și colab., 2004). În alt studiu, în care s-a utilizat transfer lentiviral de gene, nu s-a observat transformarea malignă a hMSC-urilor transfectate cu hTERT. Atât populațiile heterogene, cât și cele care provin dintr-o singură celulă, nu au pierdut inhibiția de contact in vitro și nu au format tumori in vivo (Böcker și colab., 2008).

Lentivirusurile fac parte din familia Retroviridae și reprezintă o categorie complexă de retrovirusuri, fiind similare structural cu acestea, genomul fiind însă mai complex (cuprinde pe lângă genele structurale gag, pol și env, două gene esențiale reglatoare- tat și rev – precum și alte gene accesorii care nu sunt critice pentru creșterea virală in vitro, dar sunt esențiale pentru replicarea in vivo și pentru patogeneză) (Ke și Liu, 2014). Lentivirusurile care au fost denumite de la cuvântul latin „lenti”, făcându-se referire la boala neurologică prototipică progresivă, lentă a oilor cauzată de virusul maedi visna (Pfeifer și Verma, 2001). Acestea sunt particule împachetate cu un diametru de 80-100 nm care conțin homodimeri ai genomului liniar ARN monocatenar, mai precis două copii de ARN monocatenar (Denning și colab., 2013). Pentru a sintetiza produse genice funcționale, virusul conține, de asemenea, o enzimă (revers-transcriptază inversă), care produce ADNc liniar dublu catenar. Astfel, atunci când o celulă endocitează o particulă de lentivirus, ARN-ul este eliberat în citoplasmă și reverstranscriptaza produce ADNc. ADN-ul este apoi translocat activ în nucleu, unde se integrează în genomul gazdă, într-un mod aleatoriu, la nivelul situsurilor de integrare active transcripțional. ADN-ul viral se replică odată cu genomul celulei gazdă, existând în ambele celule fiice, fiind apoi transcris pentru a sintetiza atât ARN, cât și proteine ​​virale necesare pentru producerea virusului descendent. Pentru a-și dobândi membrana lipidică, lentivirusurile formate astfel trec prin membrana plasmatică a celulei gazdă (O'Connor, 2017).

Lentivirusurile se aseamănă astfel cu vectorii γ-retrovirali și se integrează stabil în genomul celulei gazdă, permițând expresia persistentă a genei de interes (Carter și Shieh, 2015). Cu toate acestea, spre deosebire de retrovirusuri, care infectează numai celulele care se divid, lentivirusurile pot infecta atât celulele care se divid cât și pe cele care nu se divid, deoarece complexul lor de preintegrare poate pătrunde în membrana nucleară intactă a celulei țintă (la nivelul porilor nucleari). Astfel, după internalizarea virusului în celula țintă, genomul retroviral este prezent într-un complex de preintegrare, care este transportat activ la nucleul celulei țintă printr-un proces care necesită ATP, dar este independent de diviziunea celulară (Mátrai și colab., 2010). Acest proces permite lentivirusului să realizeze transducția celulelor precum ar fi limfocitele, celulele dendritice, neuronii, macrofagele, celulele stem hematopoietice, fotoreceptorii retinieni și celulele musculare și hepatice, la care metodele anterioare de terapie genică nu au putut fi aplicate cu succes (Ke și Liu, 2014).

Primii vectori lentivirali au fost derivați de la virusul imunodeficienței umane de tip 1 (HIV-1), care este un lentivirus tipic și rămâne cel mai studiat vector lentiviral până în prezent, și au fost folosiți mai mult pentru cercetare decât pentru terapia genică, având o capacitate de transport de aproximativ 8 kb (Ke și Liu, 2014). De-a lungul timpului, au existat multiple studii care au avut ca scop principal prevenirea producerii unui lentivirus competent în replicare. Astfel, profilul de siguranță al vectorilor virali a fost îmbunătățit de-a lungul mai multor generații. Prima generație de vectori a folosit un sistem de trei plasmide, care despărțea transgenele și genele virale, pentru a limita posibilitatea de a genera un vector competent pentru replicare. A doua generație de lentivirusuri a eliminat genele accesorii din genomul viral, ceea ce a redus potențialul patogenic al vectorului, iar a treia generație de vectori a constat în îndepărtarea genelor reglatoare rev și tat. Rev permite ARNm neprocesat să iasă intact din nucleu, iar Tat are rol în sinteza unor cantități mari de ARNm care cresc nivelul de transcriere a genomului lentiviral. Totodata, Tat și Rev sunt necesare pentru exprimarea eficientă a gag și pol și pentru producerea de noi particule virale. Pentru a elimina gena tat, repetiția terminală lungă virală (LTR) a fost înlocuită cu un LTR dintr-un retrovirus aviar. Gena Rev a fost plasată într-o plasmidă separată. Acest lucru a redus în continuare posibilitatea producerii de lentivirus competent în replicare. A patra generație de lentivirusuri sunt vectori independenți de rev. Cu toate acestea, înlocuirea rev duce la titluri de vectori mai mici decât vectorii produși cu rev (O'Connor, 2017).

În prezent, majoritatea vectorilor lentivirali sunt sintetizați folosind transfecția tranzitorie a plasmidelor de împachetare și a celor vectoriale. Astfel, folosind celulele 293T care sunt susceptibile de transfecție eficientă, se obțin în mod obișnuit titluri de 1 × 109 – 1 × 1010 UI / ml în urma transfecției tranzitorii cu cea mai recentă generație vectorială, urmate apoi de concentrarea particulelor de virus folosind ultracentrifugarea (Verma, 2003). De asemenea, lentivirusul poate fi manipulat înainte de transducție pentru a conține plasmide care exprimă regiuni specifice de codificare a genelor. Aceste secvențe pot codifica o genă de interes specifică, facilitând supraexprimarea acesteia.

Vectorii lentivirali au devenit unii dintre cei mai utilizați vectori în cercetarea biologică fundamentală, fiind de asemenea potriviți pentru transducția diferitelor celule stem/progenitoare, inclusiv celule stem hematopoietice. Aceștia au fost folosiți cu succes în cazul celulelor stromale mezenchimale derivate din maduva osoasă pentru a realiza transducția genei hTERT, prezentând o rată mai mare de tranducție, dar și de expresie a genei de interes (Van Damme și colab., 2006) decât în cazul utilizării retrovirusurilor (Simonsen și colab., 2002). Böcker și colab. au realizat de asemenea transducția genei hTERT într-o clonă de hMSC, observând că aceste celule au prezentat potențial de proliferare ridicat in vitro, menținându-și și capacitatea de diferențiere către linia osteogenă, adipogenă și condrogenă in vitro și in vivo și, de asemenea, nu s-au evidențiat semne ale transformării maligne în ceea ce privește cariotipul. În plus, s-a observat că expresia genelor supresor tumorale Rb, p21 și p53 nu este inhibată, ciclul celular fiind astfel sub controlul proteinelor codificate de acestea (Böcker și colab., 2008).

Capitolul 2. Materiale și Metode

2.1. Izolarea ADSC

Celulele stromale mezenchimale au fost izolate din țesutul adipos subcutanat uman, utilizându-se o metodă enzimatică care se bazează pe un protocol standard (Zuk și colab., 2001), cu excepția unor mici modificări. Proba de țesut adipos a fost prelevată de la un subiect sănătos (P15) prin abdominoplastie, în urma efectuării examenului clinic și a testelor de laborator, dar și a obținerii consimțământului scris, în conformitate cu normele de etică.

Astfel, pentru izolarea celulelor stromale mezenchimale derivate din țesut adipos (ADSC), țesutul a fost prelucrat mecanic prin mărunțire (fig. 2.1) și supus digestiei sub agitație ușoară timp de 30 minute, la 37°C, cu un mix enzimatic care conține colagenază de tip IA (Sigma Aldrich) 0.5 mg/ml, preparat în Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 4.5 ‰. Colagenaza este o enzimă proteolitică care are rolul de a disocia celulele din cadrul fragmentelor de țesut prin degradarea joncțiunilor și a componentelor matricei extracelulare. Pe lângă această enzimă, mixul includea și alte câteva enzime cu același rol, precum proteaze nespecifice și o protează neutră.

Figura 2.1. Prelucrarea mecanică a fragmentelor de țesut adipos subcutanat uman.

Activitatea enzimatică a fost apoi neutralizată prin adăugare de mediu de cultură bazal DMEM 1 ‰ suplimentat cu 15% ser fetal bovin (SFB), în raport 1:1. Suspensia celulară a fost centrifugată la 3200 × g timp de 10 minute, la temperatura camerei, pentru a obține un sediment (fig. 2.2) alcătuit din fracția celulară stromală de înaltă densitate (SVF).

Figura 2.2. Obținerea sedimentului alcătuit din fracția celulară stromală de înaltă densitate după realizarea centrifugării.

Ulterior, sedimentul a fost resuspendat în mediu de cultură DMEM 1 ‰ cu 15% SFB, conținutul rezultat fiind supus filtrării, utilizându-se un filtru tip sită, cu pori de 70 μm. ADSC au fost cultivate în DMEM 1 ‰ suplimentat cu 15% SFB și 1 % antibiotice (300 UI/ ml Penicilină, 300 mg/ml Streptomicină și 150 mg/ml Neomicină), la 37°C, cu atmosferă umedă și cu 5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat (la interval de 2-3 zile), în acest mod celulele neaderente au fost eliminate, iar celulele aderente rămase în placa de cultură fiind ADSC izolate. Acestea au fost subcultivate pentru a se obține un număr suficient de mare de celule.

Subcultivarea ADSC

Când ADSC au atins un grad de confluență de 70%-80% acestea au fost pasate conform protocolului standard (Bunnell și colab., 2008), prin incubare timp de 5 minute cu tripsină 0.25 % ce conține 0.5 mM EDTA și au fost însămânțate la o densitate celulară de 104 celule/cm2.

Înainte de a utiliza aceste celule în cadrul experimentelor s-a efectuat testarea unei eventuale contaminări cu micoplasme folosindu-se kitul de primӑ generație MycoAlert (Lonza), bazat pe analiza activitӑții unor enzime. Eventualele micoplasme viabile sunt lizate, iar enzimele reacționeazӑ cu substratul MycoAlert, catalizând reacția de conversie a ADP la ATP. Astfel, a fost prelevat mediu de la o cultură preconfluentă (2 ml) care a fost centrifugat la 200 × g pentru 5 minute. Peste 100 μl probӑ (supernatant) a fost adӑugat un volum egal de reactiv MycoAlert, incubându-se timp de 5 minute. Pentru detectarea intensitӑții luminoase emise care este echivalentӑ cu concentrația de ADN, probele au fost citite (citirea A) la luminometrul FB12 (Berthold Detection Systems). De asemenea, a fost utilizat și un control pozitiv și unul negativ (tampon). Dupӑ incubarea timp de 10 minute cu substratul a fost din nou cititӑ luminiscența. Interpretarea rezultatelor a fost realizatӑ prin calcularea raportului dintre mӑsurătoarea B și mӑsurătoarea A (mӑsurătoarea B/mӑsurătoarea A). În funcție de aceastӑ valoare a fost stabilitӑ prezența (raport > 1.2) sau absența (raport < 0.9) contaminӑrii cu micoplasme.

De asemenea, pentru a se confirma natura mezenchimală multipotentă a acestor celule, s-a analizat imunofenotipul prin citometrie în flux și potențialul de diferențiere, în conformitate cu criteriile publicate (Dominici și colab., 2006).

2.2. Generarea unei linii imortalizate de ADSC

2.2.1. Obținerea unei cantități mari de ADN plasmidial

Transformarea bacteriană

Transformarea genetică a organismelor procariotelor reprezintă procesul prin care o celulă bacteriană încorporează ADN extracelular liber (cromozomal sau plasmidial) și menține stabilă informația genetică respectivă, exprimând-o. Pentru realizarea acesteia, au fost utilizate bacterii competente Escherichia coli DH5α. Competența este corelată cu modificări ale peretelui celular, existând alterări de suprafață, ceea ce duce la demascarea “receptorilor” de ADN.

Astfel, un mix format din ADN plasmidial și bacteriile competente s-a incubat timp de 30 minute pe gheață, după care a fost supus unui șoc termic (45 de secunde la 42°C) cu rolul de a permite moleculelor de ADN să intre în celule. S-a realizat apoi o incubare timp de o oră cu mediu Luria-Bertani (LB) fără antibiotic, la 37°C sub agitare, urmată de o centrifugare la 1500 × g timp de 5 minute la temperatura camerei, iar sedimentul rezultat a fost resuspendat într-un volum mic de supernatant. Inoculele din tulpina bacteriană recombinată cu fiecare tip de plasmidă au fost însămânțate în plăci folosind tehnica epuizării ansei, în triplicat, utilizându-se mediul solid Lennox LB cu agar. Acest bulion bogat în nutrienți conține peptide, aminoacizi, carbohidrați, vitamine, oligoelemente și o cantitate redusă de sare, fiind potrivit pentru cultivarea selectivă a tulpinilor de E. coli în vederea obținerii plasmidelor ADN prin adăugarea antibioticului adecvat, și anume Ampicilină 50 μg/ml. Plăcile însămânțate au fost menținute peste noapte la incubator la 37°C.

Pentru fiecare transformare bacteriană au fost selectate și inoculate câte 5 colonii într-un volum de 2 ml mediu de cultură Lennox LB lichid conținând antibiotic selectiv (cultura starter), fiind incubate pentru aproximativ 8 ore la 37°C cu agitare puternică. Culturile inițiale au fost însӑmânțate în 250 ml mediu selectiv LB (diluție 1/500) și au fost incubate la 37°C, timp de 12-16 ore sub agitare puternică.

Izolarea și purificarea ADN plasmidial din suspensiile bacteriene

Această etapă oferă un randament bun de ADN plasmidial, de înaltă calitate pentru utilizare în transfecții. Pentru prepararea rapidă a acestuia, la scară medie și extrem de pur, de la tulpinile de Escherichia coli recombinante, s-a utilizat kitul Qiagen Plasmid Midi. Întreaga procedură se bazează pe liza alcalină a celulelor de E. coli, urmată de adsorbția ADN-ului pe silica în prezența unor săruri și constă în trei etape: prepararea și spălarea lizatului bacterian, adsorbția ADN pe coloana Qiagen și spălarea și eluarea ADN plasmidial. Mai precis, ADN plasmidial se leagă selectiv de coloanele încărcate cu o rășină schimbătoare de anioni pe bază de silica, în condiții de pH scăzut. Toți contaminanții, cum ar fi: proteine, ARN, săruri, nucleotide și oligomeri sunt spălați din coloană. În etapa de eluție, încărcarea pozitivă a rășinii este neutralizată printr-o creștere a pH-ului (condiții alcaline), iar apoi ADN plasmidial pur este eluat într-un tampon de eluție ce conține săruri. Toate etapele sunt efectuate fără utilizarea de fenol, cloroform, CsCl, bromură de etidiu și fără precipitații cu alcool și, de asemenea, metoda este una rapidă, fiind nevoie de mai puțin de două ore pentru realizare.

Celulele bacteriene au fost recoltate prin centrifugare la 6000 × g timp de 15 minute la 4°C și apoi resuspendate într-un tampon denumit Buffer P1 (50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA), în care a fost adăugat în prealabil o soluție de RNază A (100 µg/ml). Ulterior a fost adăugat un tampon de liză (NaOH 200 Mm, 1% SDS) și celulele au fost incubate la temperatura camerei (15-25°C) timp de 5 minute. În etapa următoare a fost realizată o incubare timp de 15 minute (pe gheață) cu un tampon de neutralizare (acetat de potasiu 3 M pH 5.5). În urma acestei proceduri a fost obținut un precipitat alb și un lizat puțin vâscos. Materialul precipitat era constituit din: ADN genomic, proteine și resturi celulare. În continuare, a fost realizată o centrifugare la 20000 × g timp de 30 minute la 4°C și s-a recoltat rapid supernatantul care conținea ADN-ul plasmidial. Acesta a fost centrifugat la 20000 × g timp de 15 minute la 4°C și s-a recuperat din nou supernatantul de interes. Supernatantul obținut în pasul anterior a fost încărcat rapid pe coloana Qiagen (echilibrată în prealabil cu un tampon care conține 750 mM NaCl, 50 mM MOPS pH 7.0, 15% izopropanol, 0.15% Triton X-100), pentru a se preveni colmatarea din cauza precipitațiilor suplimentare de proteine. Coloana Qiagen a fost spălată de două ori cu tampon de spălare (NaCl 1 M, 50 mM MOPS pH 7.0, 15 % izopropanol) pentru a elimina contaminanții din preparatele de ADN plasmidial. ADN-ul a fost eluat folosind tampon de eluție (1.25 M NaCl, 50 Mm Tris-Cl pH 8.5, 15% izopropanol), fiind colectat într-un tub de 15 ml. Precipitarea acestuia s-a realizat prin adăugare de izopropanol 100% (echivalentul a 70 % din volumul anterior adăugat) la temperatura camerei, iar apoi s-a efectuat o centrifugare la 15000 × g timp de 30 minute la 4°C (pentru a preveni supraîncălzirea probei). Supernatantul a fost decantat cu atenție, iar sedimentul de ADN a fost spălat cu etanol 70% la temperatura camerei pentru eliminarea sărurilor precipitate. După ce a fost realizată o centrifugare la 15.000 × g timp de 10 minute, supernatantul a fost din nou decantat cu atenție. Sedimentul a fost menținut timp de 5-10 minute la temperatura camerei pentru uscare, ulterior fiind redizolvat ADN-ul într-un volum adecvat de tampon, în condiții ușor alcaline (de exemplu, tampon TE la pH 8.0 sau 10 mM Tris-Cl la pH 8.5). Plasmidele astfel obținute au fost stocate la –20°C. Concentrația de ADN a fost determinată prin spectrofotometria UV la 260 nm, iar plasmidele au fost vizualizate prin electroforeza pe gel de agaroză.

Determinarea spectrofotometrică a purității și concentrației ADN cromozomal izolat

Înainte de a se folosi ADN-ul extras și purificat în diverse manipulări moleculare este necesar să se verifice puritatea și integritatea acestuia. Verificarea purității unei soluții de ADN se realizează de regulă spectrofotometric, întrucât bazele azotate, respectiv nucleotidele sunt ușor de detectat datorită absorbției lor în UV. Spectrul de absorbție în UV depinde de pH. De exemplu, la pH egal cu 7, lungimea de undă la care se înregistrează maximul de absorbție pentru bazele azotate se situează în jurul valorii de 260 nm.

Astfel, a fost determinată absorbția în UV a ADN prin citirea unui volum de 1 μl la spectrofotometrul ND-1000 (NanoDrop), obținându-se un semnal la 260 nm. Pentru aprecierea gradului de puritate este necesară calcularea raportului densităților optice la 260 nm/280 nm, raportul optim fiind cuprins între 1.8-2.0. Astfel, se poate stabili gradul de contaminare proteică, iar dacă aceasta este semnificativă, raportul va fi net inferior valorii de 1.8. Un raport mai ridicat în cazul ADN-ului indică o contaminare cu ARN. Pentru o corectitudine în ceea ce privește cuantificarea spectrofotometrică a ADN, citirile A260 ar trebui să fie cuprinse între 0.1 și 1.0, iar concentrația de ADN dublu catenar izolat se bazează pe citirea absorbanței la 260 nm și pe utilizarea următoarei formule: A 260 =1 corespunde la 50 ng ADN dc/μl. De asemenea, este recomandat ca determinarea concentrației ADN să fie corelată și cu aspectul ADN-ului în gel de electroforeză.

Verificarea electroforetică a integrității ADN

Migrarea moleculelor de acizi nucleici în câmp electric în gel de agaroză este o tehnică folosită extrem de frecvent în biologia moleculară, fiind folosită pentru separarea, purificarea și identificarea moleculelor de ADN, inclusiv din amestecuri care nu pot fi separate adecvat prin intermediul altor metode. De asemenea, pentru verificarea integrității ADN-ului plasmidial, precum și pentru estimarea gradului de contaminare cu ARN, extractul este supus unei electroforeze în gel de agaroză în sistem submers, în placă orizontală. Principiul general al electroforezei acizilor nucleici este următorul: la pH alcalin sau neutru, acizii nucleici prezintă sarcină electrică globală negativă, ca urmare, dacă sunt plasate într-un câmp electric, moleculele de acizi nucleici migrează către anod (+). În cazul nostru, migrarea a durat aproximativ 30 minute, la o tensiune constantă de 60 V. Vizualizarea moleculelor de ADN din gelul de agaroză 1% (în tampon TAE 1X) s-a realizat folosind Midori (NIPPON Genetics EUROPE GmbH). Acest fluorocrom este un agent intercalant care se inseră între planurile formate de bazele azotate la nivelul macromoleculei de ADN. Acest compus este unul alternativ pentru bromura de etidiu, nefiind carcinogen. Colorantul a fost introdus direct în tamponul TBE 1X înainte de turnarea acestuia în tancul de electroforeză, iar colorarea s-a realizat, deci, simultan cu migrarea moleculelor de acizi nucleici. În urma excitării acestui compus în lumina UV (λ=490 nm) prin așezarea gelului pe transiluminator se obține o emisie în domeniul vizibil, la aproximativ 530 nm (culoare verde). Se observă existența unor benzi compacte în cazul unor molecule de ADN integre, nefragmentate. Cu cât banda prezintă o grosime mai mare și este mai intensă, cu atât proba de ADN este mai concentrată și mai nefragmentată. ADN-ul plasmidial purificat cu ajutorul kitului Qiagen Plasmid este astfel potrivit pentru utilizare în cadrul tranfecțiilor, crescându-se eficiența procesului.

2.2.2. Transfecƫia lentivirală a ADSC

Pentru a crește siguranța utilizării acestei metode de trasfecție lentivirală, a fost folosit sistemul de generația a III-a, care conține patru plasmide codificatoare pentru producerea virusului: trei plasmide de împachetare și de codificare a anvelopei virale (pMD2.G, pMDLg_pRRE, pRSV-Rev) și o plasmidă care conține gena hTERT (pLV-hTERT-IRES-hygro), care conține și gena de rezistență la higromicină, în vederea selecției ulterioare a celulelor transfectate pentru a obține o linie stabilă (Fig. 2.3). Aceste plasmide au fost furnizate de la AddGene.

Figura 2.3. Harta plasmidelor utilizate pentru imortalizarea ADSC prin transfecție lentivirală.

În prealabil, pentru verificarea sensibilității ADSC la higromicină, s-a realizat o titrare a concentrației de antibiotic, rezultând astfel doza optimă. Higromicina B este un antibiotic din clasa aminoglicozidelor care este folosit pentru selecția unei plasmide de rezistență în numeroase linii celulare, la concentrații între 100 – 1000 µg/mL.

Astfel, celulele însămânțate cu 24 h înainte, la o densitate de ~60 %, au fost tratate cu doze crescătoare de antibiotic: 50µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml, 200 µg/ml și 300 µg/ml. După o săptămână a fost verificată viabilitatea celulară prin tehnica XTT. Metoda este una colorimetrică și se bazează pe activitatea metabolică a celulelor. Tehnica presupune utilizarea hidroxidului de 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino) carbonil]-2H-tetrazoliu (XTT), care este o variantă solubilă de a doua generație a sării de tetrazoliu denumită bromură de 3-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-2,5-difeniltiltrazoliu (MTT).

Clivarea XTT în prezența enzimelor din celulele metabolice active (sistemele mitocondriale succiniloxidază și citocrom P450, precum și flavoprotein-oxidaza) eliberează un produs formazan care este solubil în apă, de culoare portocalie (Altman, 1976). Nefiind deosebit de eficientă bioreducerea XTT de către toate celulele examinate, aceasta poate fi potențată prin adăugarea de agenți de cuplare a electronilor, cum ar fi fenazina metosulfat (PMS). Astfel, după 3 h de incubare cu XTT și PMS la 37°C, s-a determinat absorbanța soluțiilor la 450 nm (lungime de undă de referință 620 nm), folosindu-se un spectrofotometru pentru microplăci Tecan.

Împachetarea lentivirusului s-a realizat cu ajutorul celulelor AD293 (celule embrionare umane de rinichi), care sunt cultivate în DMEM 4.5 ‰, suplimentat cu 10% SFB inactivat termic – la 60șC, în plăci cu 6 godeuri, fiecare godeu având aria de 10 cm2 (2.5×105 celule/godeu), iar volumul de mediul utilizat per godeu fiind de 2 ml. A fost folosit un reactiv de transfecție pe bază de lipide cationice (Felgner și Ringold, 1989), mai exact Lipofectamine 2000. Astfel, complexele Lipofectamine-ADN au fost preparate conform instrucțiunilor producătorului în mediul Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) prin amestecarea celor 4 plasmide cu reactiv de transfecție Lipofectamine 2000, raportul dintre ADN și lipide fiind o variabilă importantă care determină eficiența transfecției și toxicitatea celulară (tabel 1). Înainte de complexare, atât ADN-ul cât și Lipofectamina au fost diluate cu mediu Opti-MEM.

Tabel 2.1. Parametrii și condițiile experimentale de transfecție tranzitorie mediată de lipide în cazul utilizării plăcilor cu 6 godeuri.

Pe scurt, utilizând kitul de transfecție Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), cele 4 plasmide au fost introduse concomitent în celulele AD293, în raport pRSV-Rev: pMDLg_pRRE: pMD2.G: pLV-hTERT-IRES-hygro de 1:2:1:4, producându-se astfel lentivirusul de generația a 3-a.

Complexele ADN-Lipofectamine în raport 1:1 au fost menținute timp de 5 minute la temperatura camerei înainte de a le adăuga peste celule. Astfel, în ziua transfecției, mediul de creștere a fost înlocuit cu 400 μl de Opti-MEM și celulele au fost incubate timp de 30 minute la 37°C, înainte de a adăuga complexele (250 µl/godeu). Celulele au fost incubate la 37°C timp de 3 zile pentru a permite transfecția tranzitorie.

După 3 zile, mediul conținând particulele lentivirale a fost recoltat, filtrat prin filtre cu pori de 0.45 µm și adăugat peste ADSC însămânțate cu 24 h înainte pe plăci de 12 godeuri. Supernatantul care conține particulele lentivirale a fost adăugat în următoarele diluții: 1/1, 1/2, 1/4, 1/6 și 1/10, iar un godeu a fost păstrat drept control pentru a verifica eficiența selecției cu antibiotic. Pentru a crește eficiența transferului de gene mediate de lentivirusuri (de 100 până la 1000 de ori în unele celule) s-a utilizat un compus numit bromură de hexadimetrină, cunoscut sub denumirea comerciala de Polibrene (Sigma Aldrich). Acesta este un polimer cationic ce acționează pentru a neutraliza repulsia de sarcina dintre virioni și acidul sialic de pe suprafața celulelor (Davis și colab., 2002), dar este însă toxic pentru unele linii celulare. ADSC-urile sunt celule accesibile polibrenului, iar concentrația de lucru folosită a fost de 8 μg/ml. După 24 de ore, mediul de transfecție a fost îndepărtat, adăugându-se mediu proaspăt (DMEM 4.5 ‰ suplimentat cu 10% ser fetal bovin inactivat termic) la care s-a adăugat 200 µg/ml higromicină. În absența unui mediu selectiv, există posibilitatea ca transgena integrată să poată fi pierdută prin recombinare. În continuare am ales să menținem celulele în mediu selectiv la o concentrație mai redusă de antibiotic. Astfel, după 3 zile, la schimbarea de mediu s-a utilizat o concentrație mai mică de higromicină, 100 µg/ml (jumătate din concentrația care a fost utilizată pentru selecția inițială), care s-a păstrat în continuare pentru selecția celulelor transfectate stabil.

2.3. Caracterizarea liniei imortalizate de ADSC

2.3.1. Analiza markerilor de suprafaƫă specifici celulelor stromale mezenchimale

Analiza imunofenotipică reprezintă unul dintre parametrii principali pentru caracterizarea ADSC. Expresia moleculelor marker de suprafață în ceea ce privește această linie celulară a fost analizată prin citometrie în flux la pasajul 5 și 31. În cazul controlului (celule netranfectate), analiza markerilor a fost efectuată la pasajul 3. Acest lucru a fost realizat cu ajutorul kitului de la R&D Systems ce presupune utilizarea unui protocol standard de colorare cu anticorpi (fig. 2.4), cuantificându-se intensitatea fluorescenței. Utilizarea acestui kit prezintă mai multe avantaje, printre care se numără: detecția simultană a mai multor markeri specifici pentru a crește încrederea în identitatea MSC, evidențierea heterogenității populațiilor de celule inițiale pentru a reduce variația experimentală și verificarea identității MSC în mai puțin de două ore.

Figura 2.4. Reprezentare schematică a protocolului de analiză a imunofenotipului specific a ADSC prin citometrie în flux, utilizându-se kitul de la R&D Systems.

Astfel, celulele au fost însămânțate la o densitate normală într-o placă de cultură cu suprafața de 20 cm2, iar când au ajuns la subconfluență, acestea au fost detașate prin incubare timp de 5 minute la 37șC cu o soluție de acutază, ce conține enzime proteolitice și colagenolitice, fiind un înlocuitor al soluției de Trypsin-EDTA, dar cu o acțiune mult mai blândă, păstrându-se majoritatea epitopilor pentru analiza ulterioară prin citometrie în flux. S-au numărat celulele folosindu-se o cameră Bürker-Türk și s-au centrifugat. Sedimentul a fost resuspendat în vederea disocierii celulelor într-un tampon ce conține PBS cu 10 % SFB în funcție de numărul de celule (concentrație finală de celule de 1×10 6 celule/ml). Probele au fost menținute 15 minute la temperatura camerei, în vederea blocării receptorilor Fc, minimizându-se legarea nespecifică a anticorpilor. S-au repartizat câte 100 μl/tub de Flow Cytometry de 5 ml, în total existând trei tuburi: un tub conținând doar celule pentru a se determina fluorescența de fond (autofluorescența celulelor), un tub utilizat pentru izotipuri și unul pentru markeri.

Celulele au fost incubate timp de 30 minute cu anticorpi monoclonali ridicați în șoarece (tabel 2), marcați cu fluorocromi: aloficocianină (APC), carboxifluoresceină (CFS), Complexul proteic clorofilic Peridinin (PerCP), respectiv ficoeritrină (PE). Incubarea a fost realizată în tamponul de colorare (PBS cu 10% SFB), folosindu-se o diluție de 1:10 (s-au adăugat câte 10 μl din markeri/izotip). Pe perioada incubării, probele au fost menținute la întuneric, la temperatura camerei.

Tabel 2.2. Prezentarea markerilor pozitivi ai ADSC și a celor negativi din cadrul cocktailului, identificați prin intermediul kitului de la R&D Systems, cât și a izotipurilor (control).

În pasul următor, probele s-au centrifugat la 400 x g, timp de 5 minute, la o temperatura de 4șC, în vederea spălării celulelor cu tampon FACS ce conține 2 % SFB și 2 mM EDTA în PBS. Acest pas s-a repetat de trei ori în vederea îndepărtării anticorpilor necuplați. Datorită prezenței proteinelor din SFB celulele devin stabile, mai puțin sensibile. De asemenea, se folosește EDTA cu scopul de a se limita interacțiunile de tip celulă-celulă și, astfel, se reduce numărul de evenimente de tip dublet.

După ultima centrifugare, sedimentul este resuspendat în aproximativ 400 μl tampon, în vederea detecției markerilor de interes la flowcitometrul Gallios (Beckman Coulter 3). Datele obținute au fost analizate folosindu-se softul Summit v4.3 (Cytomation, Inc).

2.3.2. Evaluarea potențialului proliferativ in vitro

Creșterea pe termen lung a celulelor in vitro a fost monitorizată prin analiza dublărilor de populație cumulate (CPD) pe baza calculării numărului de celule la fiecare pasaj deoarece vârsta reală a unei culturi este înregistrată în dublarea populației (PD). Atât celulele netransduse (ADSC P15), cât și cele transduse (ADSC P 15.1) au fost menținute în cultură timp de mai multe pasaje pentru a se evidenția potențialul proliferativ al acestora. Densitatea de însămânțare a fost în mod constant de 10000 celule/cm2 (2 × 105 au fost însămânțate pe plăci cu o suprafață de 20 cm2). Astfel, atunci când celulele au atins subconfluența, au fost detașate prin incubare cu tripsina 0.25% timp de 3 minute la 37°C, numărate și însămânțate la aceeași densitate, într-o nouă placă. Aceste proceduri au fost repetate până la încetarea creșterii celulare, proces asociat cu senescența celulară.

Dublările de populație (PD) a celulelor obținute la fiecare pasaj au fost determinate folosind următoarea formulă:

PD = ;

unde PD reprezintă numărul de diviziuni celulare care apar în fiecare pasaj, n simbolizează pasajul, iar N numărul de celule. Astfel, N(n) corespunde numărului de celule din ziua în care s-a realizat pasajul (cand au ajuns celulele la subconfluență), iar N(n-1) este numărul inițial de însămânțare a celulelor.

Formula a fost dedusă de la faptul că N(n)= N(n-1) × 2PD, iar pentru a determina CPD, nivelul PD pentru fiecare pasaj a fost calculat și adăugat la nivelurile pasajelor anterioare. S-a realizat astfel o curbă de creștere, pe baza PD cumulativ ce reprezintă suma dublărilor de populație (axa Oy) și a numărului de zile în cultură cumulate (axa Ox).

2.3.3. Analiza expresiei proteinei hTERT prin tehnica Western Blot

Celulele transfectate au fost însămânțate la densitate normală de 10000 celule/cm2, menținute aproximativ patru zile în cultură (până au atins subconfluența). S-a realizat apoi liza celulelor cu tampon Laemmli 2X suplimentat cu un cocktail de inhibitori de proteaze, în vederea extracției proteinelor totale, la o temperatură de aproximativ 95șC, timp de 5 minute, spălându-se în prealabil cu PBS. Tamponul Laemmli conține 4% SDS (dodecil sulfat de sodiu), 20% glicerol, 10% β-mercaptoetanol, 0,004% albastru de bromfenol și 0,125 M Tris HCl, iar pH-ul este aproximativ 6.8. Rolul β-mercaptoetanolului este de a reduce legăturile disulfurice intra și inter-moleculare. Detergentul SDS denaturează proteinele și ii conferă fiecărei subunități o încărcătură totală negativă astfel încât acestea să se separe în funcție de dimensiune. Albastrul de bromofenol are rol în evidențierea frontului colorat care se observă la migrarea electroforetică a proteinelor și contribuie, de asemenea, la ușurarea vizualizarii probei în timpul încărcării în gel, iar glicerolul mărește densitatea probei astfel încât aceasta să se stabilizeze în godeu (Laemmli, 1970).

Concentrația proteică totală a fost determinată prin intermediul metodei ce presupune folosirea colorantului Amidoblack, având o sensibilitate de 0.5-10 μg/μl. S-a utilizat această metodă întrucât colorantul nu interferă cu SDS, cu Tris, cu glicerol, cu β-mercaptometanol sau cu bromfenol (Scheffield și colab., 1987). Astfel, s-a realizat o curbă etalon, iar concentrația probelor a fost extrapolatӑ la curba etalon. Metoda constă în colorarea spoturilor aplicate pe hârtia de nitroceluloză timp de 5 minute cu Amidoblack, urmată de dispersia colorantului în soluție de NaOH 0.1 N și de citirea absorbanței la 620 nm.

Electroforeza proteică a fost realizată în condiții de denaturare cu dodecil sulfat de sodiu, conform Laemmli (Laemmli, 1970), în sistem discontinuu pe un gel de separare de poliacrilamidă 10% și un gel de concentrare de poliacrilamidă 5%. Cantități echivalente din lizatele totale (20 μg) au fost încărcate în gelul de poliacrilamidă, în același volum (20 μl), fiind supuse denaturării SDS-PAGE pentru separarea proteinelor în funcție de masa lor moleculară și pentru analiza cantitativă Western Blot a proteinei hTERT printr-un protocol standard de imunoblotare. Expresia β-actinei a fost utilizată în experiment drept control intern pentru cuantificare.

Astfel, sub influența curentului electric are loc migrarea proteinelor dinspre catod (-) spre anod (+), în funcție de masa moleculară a acestora, la 200 V. Ulterior, proteinele din gel au fost transferate pe membrana de nitroceluloză, sub acțiunea curentului electric (30 minute, la 10V). Membranele au fost apoi blocate pentru inhibarea legăturilor nespecifice timp de 1 h folosindu-se o soluție de lapte degresat 5% în PBS ce conține 0.05% Tween 20 și incubate peste noapte, la 4°C cu anticorpi specifici proteinelor de interes: anticorpii primari anti-hTERT oligoclonali (ThermoFisher) ridicați în iepure (0.5 mg/ml), respectiv anti-β-actină monoclonali (Sigma Aldrich) ridicați în șoarece (1 mg/ml). Ambii anticorpi au fost diluați la concentrația optimă folosindu-se lapte degresat 5 % în PBS cu 0.05% Tween 20 (Ac anti-hTERT 1:500, iar Ac anti-β-actină 1:5000). Pentru vizualizarea interacției imune a anticorpului primar cu proteina specifică, după spălarea membranelor de nitroceluloză (lapte degresat 5% în PBS cu 0.05% Tween 20), s-a realizat timp de 1 h la temperatura camerei incubarea cu anticorpii secundari oligoclonali corespunzători de la Thermo-Fisher (anti-șoarece și anti-iepure) cuplați cu peroxidaza din hrean (HRP), realizându-se diluția corespunzătoare 1:10000 în lapte 1% în PBS cu 0.05% Tween 20. După realizarea spălărilor, membranele au fost incubate cu reactiv ECL de detectare Western Blotting (Imobillon) conform instrucțiunilor producătorului, care reprezintă substratul enzimatic chemiluminiscent. Complexele antigen-anticorp au fost vizualizate prin chemiluminiscență, în urma reacției peroxidazei cu substratul. Astfel, au fost detectate benzile obținute în urma acestei reacții cu ajutorul unui sistem de imagistică ce cuprinde analizorul de imagine LAS-4000 și softul Image Reader LAS-4000. Banda specifică proteinei hTERT este prezentă la 130 kDa, iar banda specifică β-actinei este evidențiată la 42 kDa. Intensitățile benzilor au fost cuantificate utilizând softul Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD) pentru analiza densitometriei, nivelurile de proteine ​​fiind exprimate în raport cu β-actina.

2.3.4. Evaluarea potenƫialului de diferenƫiere către linia adipogenică, osteogenică și condrogenică

Potențialul de diferențiere adipogenă

Celulele au fost însămânțate în duplicat la o densitate de 10000 celule/cm2 în plăci cu 4 godeuri. În momentul când celulele au ajuns la confluență (după 3-4 zile), a fost indusă diferențierea adipogenică, mediul de cultură fiind înlocuit cu mediu de diferențiere adipogenică. Acesta este compus din DMEM 1 ‰ ce conține 10 % SFB, 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) 0,5 mM, rosiglitazonă 1μM, dexametazonă 10-6 M și 1% ITS (supliment de insulină-transferină-selenit de sodiu). Suplimentul ITS conține concentrații optimizate de insulină, transferină și selenit și are rolul de a permite proliferarea în condiții scăzute de ser, insulina promovând lipogeneza. Mediul a fost înlocuit la 2-3 zile, iar după 21 de zile celulele au fost fixate cu paraformaldehidă (PFA) 4 % timp de 15 minute. Dobândirea fenotipului adipogenic a fost evaluată prin colorarea celulelor cultivate în monostrat cu soluție de 0.5 % Oil Red O 0.3% (Sigma Aldrich) în 60 % izopropanol timp de 15 minute, la întuneric, la temperatura camerei. După colorare, probele au fost spălate cu PBS și au fost realizate fotografii la microscopul optic inversat cu contrast de fază (Zeiss). Celulele care au suferit o diferențiere adipogenă prezintă numeroase picături lipidice de dimensiuni variabile.

Pentru cuantificarea picăturilor lipidice colorate cu Oil Red O, culturile au fost incubate timp de 15 minute, la temperatura camerei, sub agitare ușoară cu izopropanol 100% (500 μl/godeu). În prealabil, însă, s-a realizat o spălare rapidă cu izopropanol 60 % în vederea îndepărtării colorantului în exces. Au fost transferați câte 100 μl din fiecare probă în triplicat într-o placă cu 96 godeuri pentru citirea densității optice (λ=490 nm) la spectrofotometrul pentru microplăci Tecan iGenios.

Potențialul de diferențiere osteogenă

În vederea inducerii diferențierii către osteoblaste (celule de tip osteoblast-like), ADSC-urile au fost însămânțate în duplicat la o densitate de 10000 celule/cm2 în plăci cu 4 godeuri și din momentul când celulele au ajuns la confluență (după 3-4 zile) au fost menținute în mediul de diferențiere osteogenică ce conține DMEM 1 ‰, 10 % SFB, beta-glicerofosfat de Na 10mM, dexametazonă 10-7 M și acid ascorbic 0.2 mM. Mediul a fost înlocuit la 2-3 zile, timp de 21 de zile. Celulele au fost fixate în metanol 100% rece timp de 5 minute, iar pentru evidențierea depozitelor de fosfat de calciu din matricea extracelulară produse de către osteoblaste (mineralizarea osteogenică) s-a utilizat colorația von Kossa sau Alizarin Red.

În ceea ce privește colorația von Kossa, celulele fixate au fost incubate într-o soluție de AgNO3 5 % la temperatura camerei, la lumina unui bec de 60W. Ulterior, s-a realizat o spălare cu apă distilată și o incubare cu soluție de tiosulfat de Na 5 % pentru două minute. Depunerile de calciu au fost evidențiate sub forma unor precipitate de culoare brună-neagră care s-au observat la microscopul optic inversat.

Pentru realizarea colorației cu Alizarin Red S, s-a procedat în felul următor: după fixare, s-a efectuat o spălare cu PBS, iar apoi s-a realizat incubarea cu Alizarin Red S 2% (pH 4.1-4.3) timp de 5 minute, la temperatura camerei. După ce au fost efectuate 4-5 spălări cu apă distilată, au fost realizate fotografii la microscopul optic inversat (Zeiss). În cazul acestui tip de colorație s-a efectuat și analiza cantitativă, fiind cuantificate depozitele de calciu. Astfel, pentru dizolvarea colorantului a fost realizatӑ o incubare sub agitare timp de 20 de minute cu acid acetic 10%, ulterior stratul de celule a fost detașat prin scrapare și pipetat cu rigurozitate în tuburi Eppendorf de 1.5 ml. Acestea au fost încӑlzite la o temperaturӑ de 85 ̊ C timp de 10 minute, iar apoi au fost menținute pe gheațӑ timp de 5 minute. În etapa urmӑtoare, a fost realizatӑ o centrifugare la 20000 x g timp de 20 minute, supernatantul fiind neutralizat prin adӑugarea de hidroxid de amoniu 10 %. Densitatea optică a fost citită la o lungime de undă egală cu 405 nm, folosindu-se spectrofotometrul pentru microplăci Tecan, iar pentru calcularea concentrațiilor s-a realizat o curbӑ standard (0.031 mM-2 mM).

Potențialul de diferențiere condrogenă

Pentru diferențierea condrogenică, celulele au fost cultivate în sediment (celule sedimentate), întrucât este nevoie o densitate celulară mare care favorizează interacțiunile de tip celulă-celulă și condiții hipoxice pentru producerea matrixului de tip cartilaj-like.

Sedimentele alcătuite din 2.5×10 5 celule au fost cultivate în mediu de diferențiere condrogenă (fig. 2.5), care constă în DMEM 4.5 ‰, suplimentat cu TGF β-3 (factor de creștere transformant β-3) 10 ng/ml care se adaugă înainte de a schimba mediul, dexametazonă 10-7 M, ascorbat 2-fosfat 50 μg/ml, prolină 40 μg/ml și supliment ITS+1 1%.

Figura 2.5. Reprezentarea schematică a protocolului de diferențiere condrogenă a ADSC.

Mediul a fost înlocuit la fiecare 2-3 zile cu grijă pentru a nu perturba sedimentul, pe o perioadă de 21 de zile. Agregatele au fost apoi fixate în PFA 4%, incluse în parafină și secționate la microtom, la grosimea de 5 μm. Secțiunile au fost colorate cu Alcian Blue 3% în acid acetic 3% (pH 2.5), în vederea detectării proteoglicanilor sulfați anionici (mucopolizaharide) și a lacunelor condrocitare. Astfel, secțiunile au fost hidratate în apă distilată, au fost menținute în acid acetic 3% timp de 3 minute, apoi s-a realizat colorarea cu Alcian Blue 3 % timp de 30 minute la temperatura camerei. După colorare, secțiunile au fost spălate cu apă de robinet și clătite cu apă distilată. Pentru evidențierea nucleilor, în pasul următor a fost efectuată o colorare cu Nuclear Fast Red, timp de 5 minute și o spălare cu apă de robinet. După montarea lamelelor, secțiunile s-au analizat la microscopul optic inversat (Zeiss) și s-au realizat fotografii.

2.3.5. Evidenƫierea senescenƫei celulare

Metoda se bazează pe o colorație histochimică care evidențiază activitatea β-galactozidazei asociată senescenței (SA-β-gal), o enzimă lizozomală de tip hidrolază cu activitate optimă la pH 6, care este exprimată în mod specific în senescență, fiind astfel un biomarker al senescenței celulare (arestarea ireversibilă a ciclului celular) (Dimri și colab., 1995). Rolul acesteia este de a cataliza hidroliza β-galactozidelor în monozaharide și este detectată in vitro folosind substratul cromogen artificial 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-galactopiranosidă (X-gal). β-galactosidaza va scinda legătura glicozidică din X-gal și va forma galactoză și 5-brom-4-cloro-3-hidroxindol care dimerizează și se oxidează la 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-indigo, un produs de reacție albastru intens, ușor de identificat (Gary și Ronald, 2005), reacțiile chimice fiind sintetizate în fig. 2.6. Acest lucru se datorează unei supraexpresii și acumulări de β-galactozidază lizozomală, fiind cel mai utilizat biomarker pentru celulele senescente deoarece este ușor de detectat (Lee și colab., 2006).

Figura 2.6. Reacțiile chimice în urma cărora se formează in vitro compusul albastru intens, caracteristic celulelor senescente care prezintă activitate a β-galactozidazei.

Celulele transfectate, cât și cele netransfectate au fost cultivate în plăci cu 4 godeuri până când au ajuns la subconfluență, iar apoi au fost colorate folosind Senescence Cells Histochemical Staining Kit (Abcam). În prealabil, celulele au fost spălate cu PBS și fixate cu soluția de fixare pentru 10-15 minute, la temperatura camerei. Celulele au fost incubate cu amestecul de soluții de colorare (470 μl soluție de colorare, 5 μl supliment de colorare și 25 μl X-gal în DMSO 20 mg/ml) timp de 12 h, la întuneric, la o temperatură de 37șC. Probele au fost spălate apoi de două ori cu PBS și examinate folosind un microscop optic inversat cu contrast de fază (Zeiss), realizându-se fotografii (magnificație 20x). Doar în cazul celulelor senescente se evidențiază precipitatul specific albastru care rezultă în urma clivării substratului cromogen X-Gal, sub acțiunea enzimei SA-β-gal.

2.4. Realizarea selecƫiei clonale prin metoda diluƫiilor și caracterizarea clonelor selectate

Înainte de a iniția această metodă (fig. 2.7), celulele au fost supuse selecției cu Higromicină 100µg/ml, astfel încât totalitatea celulelor din cultură să fie, teoretic, transfectate. Celulele au fost tripsinizate, realizându-se apoi diluții din suspensia celulară care a fost bine omogenizată în prealabil pentru a nu exista aglomerări de celule, însămânțându-se câte o singură celulă în fiecare godeu, în mediu de cultură standard. S-au însămânțat celulele în 3 plăci cu 96 de godeuri, în total existând 288 de godeuri. Plăcile s-au analizat la microscop după 24 h pentru detectarea godeurilor cu o singură celulă. Atunci când coloniile din godeurile selectate au atins 70-80 % confluență, acestea au fost extinse, fiind supuse protocolului de tripsinizare și însămânțate în plăci ale căror godeuri prezintă suprafață mai mare. De asemenea, s-a realizat și selecția cu Higromicină 100µg/ml. Clonele selectate au fost caracterizate din punct de vedere al expresiei markerilor de suprafață specifici, al potențialului de diferențiere, al proliferării celulare și respectiv al evidențierii senescenței replicative.

Figura 2.7. Reprezentarea schematică a protocolului de realizare a selecƫiei clonale prin metoda diluƫiilor.

Capitolul 3. Rezultate și discuții

3.1. Izolarea și caracterizarea ADSC

Conform protocolului de izolare a ADSC detaliat în capitolul de Materiale și Metode, în urma centrifugării suspensiei celulare, s-a eliberat o populație celulară heterogenă cunoscută sub denumirea de fracție vasculară stromală (SVF) care a sedimentat, după cum se poate observa și în figura 3.1. Aceasta este alcătuită din preadipocite, fibroblaste, celule musculare netede, celule precursoare endoteliale, celule endoteliale, celule tumorale de tip epitelial, monocite/macrofage rezidente, limfocite, pericite, precum și din celule stromale mezenchimale (Senesi și colab., 2019).

Figura 3.1. Aspectul suspensiei celulare după realizarea centrifugării. Se poate observa în partea dreaptă sedimentul care corespunde SVF.

După însămânțare, ADSC au atins confluența după aproximativ 4-5 zile și au prezentat morfologia celulară caracteristică fibroblast-like (fig. 3.2). De asemenea, în urma efectuării testului pentru evidențierea unei eventuale contaminări cu micoplasme, rezultatul a fost negativ, raportul dintre mӑsurătoarea B și mӑsurătoarea A având o valoare sub 0.9.

Figura 3.2. Ilustrarea fenotipului fibroblast-like al ADSCs izolate (pasaj 1). Morfologia tipică a fost observată la microscopul optic inversat cu contrast de fază, la mărime 10x.

Celulele au fost ulterior caracterizate, fiind analizat potențialul de diferențiere către linia osteogenă, adipogenă și condrogenă, cât și markerii de suprafață specifici celulelor stromale mezenchimale.

Analiza potențialului de diferențiere adipogenă

În ceea ce privește potențialul de diferențiere adipogenă, celulele izolate (pasaj 5) au fost cultivate timp de 21 de zile în condiții de cultură specifice. În urma realizării colorației cu Oil Red O au fost evidențiate la microscopul optic cu contrast de fază numeroase picături lipidice care apar colorate în roșu în cazul celulelor menținute în mediu de diferențiere, spre deosebire de control, caz în care celulele nu s-au diferențiat (fig. 3.3).

Figura 3.3. Ilustrarea potențialului adipogen al ADSC prin colorația cu Oil Red O. Imaginile realizate la microscopul optic inversat cu contrast de fază (mărime 20x) evidențiază colorarea picăturilor lipidice acumulate în citoplasma celulelor tratate cu mediul inductor adipogen și lipsa colorării în cazul celulelor cultivate în mediul control.

Analiza potențialului de diferențiere osteogenă

Capacitatea de diferențiere osteogenă a ADSC a fost pusă în evidență prin colorarea nodulilor de calciu din matricea extracelulară (acumulări de calciu) prin tehnica von Kossa (cu nitrat de Argint), după ce celulele au fost menținute în condiții specifice de cultură timp de 21 de zile. Astfel, aceștia au fost colorați în negru, iar nucleul celulelor a fost marcat cu roz folosind colorantul Nuclear Fast Red (fig. 3.4).

Figura 3.4. Ilustrarea potențialului osteogen al ADSC prin colorația Von Kossa. Imaginile realizate la microscopul optic inversat (mărime 40x) evidențiază acumulările de calciu în cazul celulelor cultivate în mediul de diferențiere osteogenă și absența acestora în cazul celulelor cultivate în mediul control.

Analiza potențialului de diferențiere condrogenă

Pentru a evalua potențialul de diferențiere condrogenă a ADSC izolate, acestea au fost menținute în condiții specifice de cultură timp de 21 zile, evidențiindu-se prin intermediul colorației cu Alcian Blue sinteza de mucopolizaharide acide de către celulele diferențiate în condrocite (fig. 3.5).

Figura 3.5. Ilustrarea potențialului condrogen al ADSC prin utilizarea colorației cu Alcian Blue. Imaginile realizate la microscopul optic inversat (mărime 20x – stânga și 40x – dreapta) indică diferențierea celulelor care au fost menținute în condiții specifice timp de 21 zile.

Rezultatele au arătat astfel că ADSC-urile izolate au prezentat capacitate de diferențiere in vitro către cele trei tipuri celulare mezodermice (adipocite, osteoblaste, condrocite), îndeplinind criteriul indicat de către Societatea Internațională de Terapie Celulară pentru a fi considerate celule stromale mezenchimale.

Analiza markerilor de suprafață

Prezența markerilor de suprafață specifici celulelor stromale mezenchimale a ADSCs izolate a fost evaluată prin citometrie în flux (pasaj 2), procentele fiind menționate în cadrul graficelor de tip Dot-plot (fig. 3.6). În urma analizei acestora, relativ similar cu Dominici și colaboratorii (Dominici și colab., 2006), frecvențele expresiilor markerilor CD105, CD73 și CD90 specifici MSC au fost mai mari de 84 % (din totalul celulelor cultivate): 92% dintre celule exprimă CD73, 98% exprimă CD90, iar 84% exprimă CD105. Totodată, celulele sunt caracterizate de prezența markerilor negativi într-un procent destul de scăzut (≤1.5). Aceste rezultate demonstrează că majoritatea ADSC-urilor provenite de la P15 exprimă simultan proteinele ​​marker ale MSC.

Figura 3.6. Analiza prin citometrie în flux a markerilor de suprafață specifici celulelor stromale mezenchimale. Graficele de tip Dot-plot indică procentele de ADSC P15 care exprimă markerii pozitivi și markerii negativi. Se observă că marea majoritate a celulelor este pozitivă pentru markerii specifici (CD 73, CD 90, CD 105) și negativă pentru markerii hematopoietici.

3.2. Generarea unei linii imortalizate de ADSC

3.2.1. Transfecția lentivirală

Pentru testarea sensibilității ADSC la Higromicină s-a realizat o titrare a concentrației de antibiotic, fiind verificată viabilitatea prin tehnica XTT, după 7 zile de la însămânțare. Astfel, s-a observat că ADSC testate au prezentat o sensibilitate crescută la Higromicină (fig. 3.7). Pentru mai multă siguranță însă, s-a ales doza de început de 200 µg/ml, iar cea de continuare a selecției de 100 µg/ml.

Figura 3.7. Curba de testare a sensibilității celulelor la Higromicină în vederea selecției clonelor transfectate cu gena de interes (hTERT).

După o săptămână de selecție a celulelor transfectate, a fost observată moartea celulelor din godeul control în prezența antibioticului, în timp ce în godeurile corespunzătoare diluțiilor 1/1 și 1/2 s-au remarcat celule rezistente (fig. 3.8).

Figura 3.8. Aspectul culturii de ADSC transfectate la o săptămână de la începerea selecției cu antibiotic (magnificație 10x).

După trei săptămâni, celulele transfectate (P15.1 și P15.2) au ajuns la confluență, putându-se observa că după transfecție și-au păstrat fenotipul fibroblast-like (fig. 3.9). Ulterior, aceste celule imortalizate au fost caracterizate.

Figura 3.9. Aspectul celulelor imortalizate după trei săptămâni de selecție cu Higromicină. Se observă fenotipul fibroblast-like al celulelor selectate.

3.3. Caracterizarea liniilor celulare imortalizate de ADSC

3.3.1. Evaluarea potențialulului de diferențiere a celor două linii imortalizate

Atât ADSC transduse (P15.1 și P15.2), cât și cele netransduse, au fost diferențiate în cele trei linii mezodermale (osteoblaste, adipocite și condrocite), iar evaluarea a fost efectuată prin tehnici de histologie, fiind prezentate în capitolul de Materiale și Metode.

Evaluarea potențialulului de diferențiere adipogenă

Prin acestă tehnică a fost observată o creștere a conținutului lipidic intracelular în cazul liniei P15.1, comparativ cu celule incubate în mediu control. Celulele liniei P15.2 însă, au prezentat o diferențiere slabă, aproape inexistentă (fig. 3.10).

Figura 3.10. Ilustrarea diferențierii adipogene a ADSCs transfectate, prin colorația Oil Red O. Imaginile realizate la microscopul optic inversat (mărime 40x) evidențiază celulele celor două linii tranfectate, cultivate în mediul de diferențiere adipogenică și în mediul control, timp de 21 de zile.

Evaluarea potențialulului de diferențiere osteogenă

După inducerea diferențierii osteogene a celor două linii, colorația von Kossa a fost pozitivă (fig. 3.11), evidențiindu-se depozite de calciu abundente în cazul unei linii (15.1), iar în cazul celeilalte (15.2) s-a observat că prezintă potențial de diferențiere scăzut. În ceea ce privește controlul, colorația a fost negativă.

Figura 3.11. Ilustrarea diferențierii osteogene a ADSCs transfectate, prin colorația Von Kossa. Imaginile realizate la microscopul optic inversat (mărime 40x) evidențiază celulele celor două linii transfectate cultivate în mediul de diferențiere osteogenică și în mediul control, timp de 21 zile.

Astfel, o singură linie de ADSC transduse cu gena hTERT și-au menținut caracteristica celulelor stromale mezenchimale și a fost capabilă să se diferențieze către linia osteogenă, adipogenă și condrogenă, și anume linia care a fost denumită P15.1.

3.3.2. Analiza expresiei proteinei hTERT

Totodată, pentru cele două linii transfectate de ADSC, dar și pentru celulele parentale, s-a analizat expresia proteinei hTERT prin Western Blot (pasaj 5), nivelurile fiind raportate în unități arbitrare (u.a.) în graficul de mai jos (fig. 3.12). Astfel, s-a observat că celulele liniei P15.1 prezintă o expresie mai mare de proteină hTERT decât celulele netransfectate, dar fiind însă sub nivelul cuantificat în cazul liniei P15.2.

Figura 3.12. Analiza expresiei proteinei hTERT prin Western Blot în cazul celor două linii transfectate de ADSC și a celulelor parentale.

Analizând aceste rezultate, am decis să continuăm caracterizarea doar a celulelor liniei P15.1, întrucât au menținut potențialul de diferențiere către cele trei linii celulare și, de asemenea, au exprimat și proteina hTERT.

3.4. Caracterizarea liniei selectate de ADSC imortalizate

3.4.1. Evaluarea proliferării celulare

Pentru a confirma faptul că ADSCs care exprimă hTERT au o durată de viață extinsă, au fost monitorizate caracteristicile de creștere ale celulelor (hTERT-ADSC care exprimă hTERT și ADSC netransfectate). Pentru evidențierea dublărilor populaționale, ADSCs transfectate cât și cele netransfectate au fost menținute în cultură timp de mai multe pasaje. Curbele de creștere celulară au arătat că ADSCs imortalizate care exprimă hTERT au proliferat puternic timp de 28 de pasaje, iar cele netransfectate au prezentat o rată mai scăzută de proliferare, îndreptându-se ulterior (pasaj 10-11) către un platou de creștere (fig. 3.19).

Figura 3.13. Curba de creștere a ADSC transfectate cu hTERT (P15.1) și a ADSC netransfectate (P15).

Literatura confirmă potențialul proliferativ ridicat în cultură a ADSC. Într-un studiu realizat de către Zhu și colaboratorii săi s-a observat că aceste celule au reușit să-și păstreze capacitatea proliferativă ridicată, să-și mențină fenotipul și chiar să aibă un potențial de diferențiere puternic chiar și după 25 de pasaje (Zhu și colab., 2008). Totodată, s-a evidențiat însă că poate exista un grad mare de variabilitate între celulele provenite de la donatori diferiți (vârsta sau indicele de masă corporală dețin un rol important în randamentul celulelor) sau în funcție de metoda de izolare, de mediile/condițiile de cultură folosite, remarcându-se diferențe în ceea ce privește capacitatea de proliferare, dar și cea de diferențiere (Fathi și Farahzadi, 2016).

3.4.2. Cuantificarea expresiei proteinei hTERT prin Western Blot în cazul liniei selectate

Analiza Western Blot realizată la pasajul 5 și 10 a relevat faptul că nivelul proteinei hTERT este mai ridicat în cazul celulelor transduse în comparație cu controlul, unde este slab exprimată (fig. 3.18). Aceste rezultate confirmă funcționalitatea genei care codifică subunitatea catalitică a telomerazei umane, implementate în hTERT-ADSC.

Figura 3.14. Analiza expresiei proteinelor hTERT prin Western Blot în celulele transfectate și în cele netransfectate (control), la pasaj 5 și la pasaj 10.

3.4.3. Analiza imunofenotipului prin citometrie în flux

Evaluând fenotipul celular prin citometrie în flux, s-a confirmat că atât celulele parentale (pasaj 3), cât și cele transduse (pasaj 5 și 31) au fost pozitive pentru markerii de celule stromale mezenchimale CD73, CD90 și CD105 și negative pentru markerii hematopoietici CD14, CD34, CD45 și HLA-DR. Procentele de celule pozitive pentru markerii de suprafață celulară au fost determinate după ce s-a realizat delimitarea populației de celule (proces numit ,,gating’’) și excluderea dubletelor, fiind raportate în cadrul fiecărui grafic de tip Dot-plot (Figura 3.17).

Figura 3.15. Caracterizarea fenotipică a ADSC prin citometrie în flux. Dot-plot-urile reprezentative indică procentele de celule (ADSC P15 la pasaj 3 și hTERT ADSC P15.1 la pasaj 5 și 31) care exprimă markerii de suprafață celulară (pozitivi și negativi).

Se poate observa că mai mult de 80 % din ADSC-urile imortalizate cu hTERT au fost pozitive pentru markerii de suprafață specifici, în timp ce pentru markerii hematopoietici aceste celule au fost aproape negative. Aceste rezultate indică faptul că ADSC-urile care exprimă hTERT și-au menținut markerii specifici celulelor stromale mezenchimale în perioadele de cultură extinse.

Totuși, acești markeri nu sunt întâlniți exclusiv la MSC, fiind prezenți și la fibroblaste, care prezintă totodată și morfologie foarte asemănătoare, nefiind observate diferențe semnificative la microscopul optic cu contrast de fază. Denu și colaboratorii au demonstrat acest lucru pe fibroblaste din trei surse diferite de țesut uman, fiind pozitive pentru markerii de suprafață prevăzuți de Societatea Internațională de Terapie Celulară CD73, CD90 și CD105 și negative pentru CD14, CD34, CD45, CD19 și HLA-DR, similar cu MSC-urile izolate din măduvă osoasă și țesut adipos. De asemenea, au fost analizați și markeri suplimentari care sunt caracteristici pentru MSC-uri și s-a constatat că toate fibroblastele erau pozitive pentru CD29 și CD44 și negative pentru CD31 (Denu și colab., 2016). Diferența dintre aceste două tipuri de celule este însă clară în ceea ce constă potențialul de diferențiere a MSC către linia osteogenă, adipogenă și condrogenă, Pittenger și colaboratorii demonstrând că fibroblastele sunt incapabile să se diferențieze în adipocite, condrocite și osteoblaste (Pittenger și colab., 1999).

3.4.4. Evaluarea potențialulului de diferențiere al liniei selectate

Evaluarea potențialulului de diferențiere adipogenă

Prin inducerea diferențierii adipogene a hTERT ADSC P15.1 la mai multe pasaje (pasaj 5, 8 și 20), s-a constatat scăderea capacității de a se diferenția în adipocite pe parcursul menținerii celulelor în cultură. Astfel, după cum se observă și din fig. 3.13, la pasajul 8 diferențierea fost mai puțin evidentă, aproape absentă la pasaj 20.

Figura 3.16. Ilustrarea diferențierii adipogene a ADSC P15.1, prin colorația cu Oil Red O. Imaginile realizate la microscopul optic inversat (mărime 20x) evidențiază celulele liniei transfectate P15.1 la pasajele 5, 8 și 20, cât și celulele parentale (ADSC P15) la pasaj 5, cultivate în mediul de diferențiere adipogenă și în mediul control, timp de 21 de zile.

După realizarea cuantificării picăturilor lipidice colorate cu Oil Red O, a rezultat că nivelul (exprimat în unități arbitrare) este unul ridicat atât în cazul celulelor transfectate la pasaj 5, 8 cât și la 20, cât și în cazul celulelor parentale la pasaj 5 (fig. 3.14).

Evaluarea potențialulului de diferențiere osteogenică

În cazul diferențierii osteogenice a hTERT ADSC pe parcursul a mai multor pasaje (pasaj 5, 8 și 20), prin colorația Von Kossa s-a constatat de asemenea scăderea capacității de diferențiere pe parcursul menținerii celulelor în cultură. Astfel, la pasajul 8 diferențierea fost mai puțin evidentă, aproape absentă la pasaj 20, după cum se poate observa și din figura 3.15.

Figura 3.17. Ilustrarea diferențierii osteogenice a ADSC P15.1, prin colorația Von Kossa. Imaginile realizate la microscopul optic inversat (mărime 40x) evidențiază celulele transfectate (la pasajele 5, 8 și 20), cât și cele netransfectate (pasaj 5), cultivate în mediul de diferențiere osteogenă și în mediul control, timp de 21 zile.

Evaluarea potențialulului de diferențiere condrogenă

În mod similar, după cum se observa și în figura 3.16, în urma evaluării diferențierii condrogene a liniei P15.1, s-a remarcat scăderea capacității celulelor de a se diferenția în condrocite pe parcursul menținerii acestora în cultură (pasaj 8 și pasaj 20).

Figura 3.18. Ilustrarea diferențierii celulelor liniei P15.1, expuse la factori condrogeni timp de 21 de zile, prin utilizarea colorației cu Alcian Blue. Imaginile sunt realizate la microscopul optic inversat, sub mărime 20x.

Coroborând rezultatele prezentate mai sus, s-a constatat că aceste celule nu și-au păstrat capacitatea de diferențiere pe parcursul menținerii celulelor în cultură pe termen lung (pasaj 20). Acest lucru se poate datora heterogenității populației policlonale, selectându-se pe parcurs o singură clonă dominantă, care probabil nu prezintă rată de proliferare ridicată, dar nici potențial de diferențiere semnificativ. Selich și colaboratorii au confirmat acest lucru, menținând în cultură MSC-urile timp de peste 12 pasaje. Aceștia au observat că uneori clonele inițiale dominante sunt înlocuite de alte subpopulații clonale (Selich și colab., 2016).

3.4.5. Evaluarea senescenței in vitro

În urma realizării testului pentru evidențierea senescenței celulare in vitro, linia de ADSC P15.1 este caracterizatӑ de lipsa senescenței la pasajul 28, comparativ cu celulele netransfectate care au fost detectate pozitiv pentru β-gal la pasajul 16 (fig.3.20).

Figura 3.19. Detecția β-galactozidazei asociată senescenței. Imaginile realizate la microscopul optic inversat (mărime 40x) evidențiază celulele β-gal pozitive (colorate în albastru). În cazul celulelor netransfecate (pasaj 16) reacția este relativ puternic pozitivă, iar în cazul celulelor transfectate (pasaj 28) se pot observa doar foarte puține celule colorate.

3.5. Selecția clonală și caracterizarea clonelor selectate

Pentru a evita heterogenitatea ADSC și implicit a mediului condiționat recoltat de la acestea, s-a încercat obținerea unei populații de celule relativ omogene prin selecție clonală.

Selecția clonală

ADSCs P15.1 însămânțate la o densitate celulară de o celulă/godeu au fost analizate după 24h la microscopul optic inversat, realizându-se selecția godeurilor cu o singură celulă (30 de godeuri), după cum este prezentat în capitolul de Materiale și Metode, întrucât existau și godeuri fără nicio celulă (33 godeuri) sau care prezentau două sau chiar mai multe (225 godeuri). Celulele din aceste godeuri (10.41 % din totalul godeurilor) au fost menținute în cultură până au atins un grad de confluență de 70-80 %, moment în care au fost pasate. Pe parcursul acestei perioade, celulele au fost analizate la microscop, realizându-se fotografii la 24h, 3 zile, 6 zile și 10 zile, doar 19 clone având potențial proliferativ, atingând confluența. În fig. 3.21 este evidențiată formarea unei colonii.

Figura 3.20. Aspectul celulelor după efectuarea selecției clonale. Imaginile au fost realizate la microscopul optic inversat (mărime 20x) după o zi, respectiv după 3, 6 și 10 zile de la însămânțare.

Această capacitate de a genera clone dintr-o singură celulă demonstrează caracteristica de auto-reînnoire a celulelor stem (La rocca și colab., 2009).

3.5.2. Evaluarea proliferării celulare

Pentru evaluarea potențialului proliferativ in vitro a celor 19 clone selectate, celulele s-au menținut în cultură timp de mai multe pasaje, până în momentul când s-a observat scăderea dublărilor populaționale. De asemenea, în urma realizării curbelor de creștere celulară (folosind formula prezentată în capitolul de Materiale și Metode) s-a observat că ADSCs imortalizate care aparțin clonelor 1, 5 și 8 au prezentat un potențial proliferativ ridicat inițial, cea mai mare rată de proliferare păstrându-se doar în cazul clonei 1, fiind menținută în cultură timp de 17 de pasaje după selecție. În ceea ce privește celelalte clone, unele au prezentat de asemenea o rată de proliferare ridicată (de exemplu clona 2), însă rezultatele de la Western Blot nu s-au corelat ce cele de față, iar altele au prezentat o rată mai scăzută de proliferare, curbele respective îndreptându-se ulterior către faza de platou (fig 3.22).

Figura 3.21. Curbele de proliferare celulară. Este reprezentată câte o curbă pentru fiecare dintre cele 19 clone, pe axa Ox fiind specificat numărul de zile în cultură, iar pe axa Oy dublările de populație cumulate (CPD).

De asemenea, s-a raportat de către Whitfield și colaboratorii că există diferențe între MSC extinse in vitro în ceea ce privește morfologia și ratele de proliferare (Whitfield și colab., 2013).

3.5.3. Evaluarea expresiei proteinei hTERT prin Western Blot

Expresia proteinei hTERT a fost evidențiată prin tehnica Western Blot la pasajul 5 în cazul a 17 clone selectate și a liniei inițiale P15.1, renunțând la două clone (18 și 19) întrucât au prezentat o rată de proliferare foarte scăzută in vitro, remarcabilă în curbele de creștere din graficul de mai sus (fig. 3.22). Astfel, se poate observa în figura 3.23 nivelurile expresiei proteinei hTERT (u.a.), cele mai ridicate evidențiindu-se în cazul a trei clone (clona 1, 5 și 8), motiv pentru care s-a continuat caracterizarea acestora din punct de vedere al potențialului de diferențiere.

Figura 3.22. Expresia hTERT evaluată prin Western Blot în cazul clonelor provenite din P15.1 (17 clone), la pasajul 5 după selecția clonală.

2.5.4. Evaluarea potențialului de diferențiere

Evaluarea potențialului de diferențiere adipogenă

Cele trei clone au fost evaluate din punct de vedere al potențialului de diferențiere adipogenă la pasajul 5 după selecția clonală, identificându-se prin analiza histologică un rezultat pozitiv, numeroase picături lipidice fiind evidențiate cu Oil Red O (fig. 3.24).

Figura 3.23. Ilustrarea diferențierii celor trei clone de hTERT ADSC (pasajul 5 după selecția clonală) expuse la factori adipogeni timp de 21 de zile, prin colorația cu Oil Red O. Imaginile reprezintă celulele cultivate în mediul de diferențiere adipogenică și în mediul control.

De asemenea, după analiza microscopică, s-a realizat cuantificarea picăturilor lipidice colorate cu Oil Red O în cazul celor trei clone, de unde a rezultat că nivelul (exprimat în unități arbitrare) este unul ridicat, în comparație cu controlul (fig. 3.25).

Figura 3.24. Analiza cantitativă a diferențierii adipogene în cazul celor trei clone provenite prin selecție clonală din P15.1 (pasajul 5 după selecția clonală). Colorantul specific Oil Red O a fost extras cu izopropanol, absorbanța fiind citită la lungime de undă egală cu 490 nm.

Evaluarea potențialului de diferențiere osteogenă

Cele trei clone au fost evaluate din punct de vedere al potențialului de diferențiere osteogenă la pasajul 5 după selecția clonală, identificându-se în fiecare caz depozite de calciu la microscopul optic inversat, la mărime 10x (fig. 3.26), după cultivarea în mediul inductor specific. În cazul celulelor incubate cu mediu control, colorația a fost desigur absentă.

Figura 3.25. Ilustrarea diferențierii celor trei clone de hTERT ADSC (pasajul 5 după selecție) expuse la factori osteogeni timp de 21 de zile, prin colorația cu Alizarin Red S. Imaginile realizate la microscopul optic (magnificație 10x) prezintă celulele cultivate în mediul de diferențiere osteogenă și în mediul control.

După realizarea colorației Alizarin Red S și a analizei microscopice, s-a realizat și cuantificarea depozitelor de calciu, observându-se că nivelul (exprimat în unități arbitrare) este unul ridicat, în comparație cu controlul (fig. 3.27).

Figura 3.26. Cuantificarea depozitelor de calciu după realizarea colorației cu Alizarin Red S, în cazul celor trei clone provenite prin selecție clonală din P15.1 (pasaj 5 după realizarea selecției). Colorantul specific a fost extras cu acid acetic 10%, densitatea optică fiind citită la 405 nm.

Evaluarea potențialului de diferențiere condrogenă

În urma realizării protocolului de inducere a diferențierii condrogenice, matricea extracelulară (secretată de condroblaste) bogată în glicozaminoglicani a apărut, prin vizualizare microscopică, colorată în albastru pentru fiecare dintre cele trei clone selectate, în cazul clonei 1 evidențiindu-se lacune condrocitare (cavități din matrice în care sunt dispuse condrocitele), după cum se poate observa și în figura 3.28. Lacune condrocitare s-au observat și în cadrul experimentelor realizate in vivo, având loc repararea cu succes a unui defect de cartilaj al urechii cu condrocite induse de la MSC-uri derivate din măduva osoasă alogenă provenită de la iepuri (Cheng și colab., 2014).

Figura 3.27. Ilustrarea diferențierii celor trei clone de hTERT ADSC (pasajul 5 după selecția clonală) expuse la factori condrogeni timp de 21 de zile prin utilizarea colorației Alcian Blue. Panourile din partea de sus sunt reprezentate de fotografii realizate la microscop sub mărire 10x, iar cele din partea de jos sub mărire 40x.

Heterogenitatea clonală a fost evidențiată și de către Russell și colaboratorii, MSC care aparțin unor clone diferite prezentând capacități diferite de diferențiere (Russell și colab., 2010). Aceste dovezi indică faptul că ar putea exista heterogenitate nu doar în ceea ce privește MSC derivate de la donatori diferiți și țesuturi diferite, ci și în cazul clonelor sau chiar celulelor diferite ale aceleiași clone.

S-a demonstrat astfel, conform acestor rezultate, capacitatea celor trei clone selectate de a se diferenția către osteoblaste, adipocite și condrocite, după incubarea în medii inductoare specifice.

3.5.5. Evaluarea senescenței celulare in vitro

Pentru evaluarea fenomenului de senescență celulară in vitro, cele trei clone au fost supuse testului pentru evidențierea enzimei SA β-gal, în urma căruia s-a observat faptul că în cazul unei clone existau celule pozitive – colorate în albastru (clona 5) ceea ce indică existența celulelor senescente, iar în cazul celorlalte două neidentificându-se reacția (clona 1 și clona 8), după cum reiese și din fig. 3.29. S-au evidențiat celule pozitive pentru SA β-galactozidază (colorate în albastru) în cazul Clonei 5, ceea ce indică existența celulelor senescente.

Figura 3.28. Detecția microscopică a β-galactozidazei asociată senescenței la pasajul 10 dupӑ obținerea clonelor (magnificație 20x). Se observă reacția pozitivă în cazul clonei 5, unde celulele apar colorate în albastru, fiind absentă în cazul clonelor 1 și 8.

Astfel, rezultatele de față sugerează că linia imortalizată, care este reprezentată de clona selectată (clona 1) derivată din ADSC-urile transfectate cu gena hTERT, este capabilă de auto-reînnoire pe termen lung și multidiferențiere, îndeplinind criteriile unei populații de celule stromale mezenchimale.

Deși puține lucrări au raportat transformarea în cultură a celulelor stromale mezenchimale umane (Wang și colab., 2005), acestea trebuie însă analizate din punct de vedere al existenței stabilității genetice, pentru a evita riscurile de transformare. Cu toate acestea, s-a demonstrat că in vitro sunt induse aberații cromozomiale, care sunt caracteristice cancerului, dar în ciuda rezultatelor conflictuale privind transformarea neoplazică a hMSC, trebuie menționat faptul că nu au existat cazuri de formare de tumori la pacienții umani după tratamentul cu MSC pentru o varietate de afecțiuni – peste 1000 de pacienți tratați până în anul 2012 (Mariani și Facchini, 2012).

În orice caz, ne dorim să efectuăm o analiză a genomului în cazul celulelor clonei selectate. Se pare că nu există indicații internaționale cu privire la aceste evaluările de stabilitate genetică, cariotiparea fiind cea mai frecventă analiză, chiar dacă sensibilitatea acesteia (de ordinul Mb) nu permite detectarea modificărilor moleculare mici, putand fi subestimate posibile anomalii genetice. Analizând cariotipului hTERT-ADSC, se poate observa dacă acestea prezintă același model cromozomial cu celulele parentale, după modificarea genetică efectuată pentru a exprima hTERT exogen.

Concluzii

În lucrarea de față s-a observat că pe parcursul culturii in vitro, ADSC-urile izolate au înregistrat un declin în ceea ce privește rata de proliferare, prezentând o durată de viață limitată, fenomen care este asociat cu senescența replicativă.

Astfel, celulele au fost transfectate cu gena de imortalizare hTERT, folosindu-se un sistem lentiviral de generația a III-a. S-a demonstrat că ADSC-urile transfectate exprimă markerii de suprafațӑ specifici pentru celulele stromale mezenchimale (chiar și la pasaj 31). În plus, după un număr îndelungat de pasaje (28 de pasaje), hTERT-ADSC și-au păstrat potențialul de proliferare.

În ceea ce privește capacitatea de diferențiere, s-a observat că este mai slab evidențiată la pasaje mai mari, ceea ce a condus la hotărârea de a realiza o selecție clonală. A fost obținută astfel o populație clonală de celule transfectate care a prezentat un potențial de proliferare ridicat, fiind menținută în cultură un timp îndelungat (17 pasaje). De asemenea, a fost confirmat potențialul acesteia de diferențiere către linia adipogenă, osteogenă și condrogenă.

Așadar, a fost generată cu succes o linie stabilă hTERT-ADSC cu capacitate de proliferare constantă, fiind depășită limitarea utilizării ADSC-urilor provenite din culturi primare. Acestea pot fi astfel expandate pentru producerea unui număr mare de celule necesar în cadrul diverselor studii, implicit recoltarea de mediu condiționat care va fi utilizat în experimentele ulterioare. Totuși, ne dorim înainte de toate să realizăm și analiza cariotipului hTERT-ADSC, pentru a se observa dacă prezintă același model cromozomial cu celulele parentale după modificarea genetică efectuată pentru a exprima hTERT exogen.

Ca perspectivă, studiul va continua prin evaluarea capacității secretomului provenit de la clona selectată de a promova procesul de vindecare a rănii, urmărind efectele sale în ceea ce privește stimularea proliferării și migrării celulelor implicate (keratinocite, fibroblaste), și procesul de angiogeneză.

Bibliografie