Drd. Roxana ULĂREANU [304423]

Universitatea din București

Facultatea de Biologie

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator știintific:

Conf. Dr. Dana CUCU

Îndrumător științific:

Drd. [anonimizat]: [anonimizat]-Alexandra TUDOR

2018

Universitatea din București

Facultatea de Biologie

STAREA DE GLICOZILARE A CANALULUI IONIC TRPA1 ÎN CELULELE TUMORALE

Coordonator științific:

Conf. Dr. Dana CUCU

Îndrumător științific:

Drd. [anonimizat]: [anonimizat]-Alexandra TUDOR

2018

[anonimizat] – [anonimizat] – Brefeldina A

C-terminal – Carboxi-terminal

Ca2+ – [anonimizat] – Casein kinaza 2

Cys – Cisteină

E1 – Domeniul extracelular 1

Ets – E26 transformation-[anonimizat] – N-[anonimizat] – acid glucuronic

GlcNAc – N-[anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat]2+ – Ion bivalent de magneziu

N-terminal – Amino-terminal

Neu5Ac -Acid N-acetilnuraminic/[anonimizat] A

PKC – Protein kinaza C

PKG- Protein kinaza G

CaMKII – Protein kinaza II calmodulin dependentă

S – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat], selectiv, [anonimizat]. O [anonimizat], se datorează funcționării greșite ale canalelor ionice (Hinard et al., 2016).

Superfamilia canalelor ionice TRP joacă un rol central în traducerea diverșilor stimuli senzoriali la Eucariote. [anonimizat] (Palovcak et al., 2015). [anonimizat], relaxarea, proliferarea, diferențierea și moartea celulară (Yue et al., 2015), însă mecanismele prin care acționează nu sunt complet elucidate. [anonimizat] o [anonimizat], [anonimizat] (Han și Yi, 2014), [anonimizat], diabet, [anonimizat] , [anonimizat], tulburări dermatologice (Kaneko și Szallasi, 2014). [anonimizat], deci în apariția metastazelor (Nielsen et al. 2014). Așadar, aceste canale pot fi țintele unor medicamente.

Canalele TRP reprezintă o [anonimizat], grupate în șapte subfamilii: TRPC, TRPV, TRPM, TRPN, TRPA, TRPM și TRPML. [anonimizat], [anonimizat], stări de închidere/deschidere modulate de agoniști și antagoniști și o [anonimizat]ice, sau direcționarea subcelulară. Printre aceste modificări se numără glicozilarea, fosforilarea și atașarea covalentă a compușilor care se leagă reversibil de resturi de cisteină (Voolstra și Huber, 2014).

Glicozilarea produce diverși glicani celulari care sunt atașați frecvent la proteine și lipide. Glicanii participă în multe procese biologice cheie, precum adeziunea celulară, activarea receptorilor, traducerea semnalului, endocitoză, trafic molecular (Ohtsubo și Marth, 2006). Glicozilarea este considerată în ultimul timp un tip de modificare epigenetică și poate contribui, pe lângă mutații, la dezvoltarea bolilor neoplazice. Alterări ale glicozilări pot avea efecte directe asupra creșterii și viabilității celulare și, de asemenea, pot facilita apariția metastazelor (Stowell et al. 2015)

Canalele TRP sunt frecvent modificate cu N-glicani, care contribuie la funcția proteică. Studiile arată că N-glicanii influențează expesia suprafeței celulare, sensibilitatea la agonist, sensibilitatea la temperatură și reglarea activității (da Costa et al., 2010).

Lucrarea de față face parte dintr-un proiect de cercetare mai amplu, desfășurat împreună cu Institutul Clinic Fundeni București, care are ca obiectiv principal studiul canalelor TRP în celule izolate din adenocarcinom pancreatic (ADK) și țesut tumoral prelevat de la pacienți.

În acest context, experimentele desfășurate au avut ca scop determinarea expresiei canalului ionic TRPA1 în celulele ADK din liniile celulare Panc-1, MIA PaCa, BxPC3 și PK-9. În plus, am urmarit proprietățile acestei proteine atât în stare glicozilată, cât și în stare neglicozilată prin tratare cu brefeldină, un metabolit fungal care blocheză procesul de glicozilare la nivelul aparatului Golgi, determinând astfel implicările glicozilării în viabilitate și în migrație celulară.

CAPITOLUL I. ASPECTE TEORETICE PRIVIND CANALUL IONIC TRPA1 ȘI IMPLICAREA LUI ÎN CANCER

CANALELE IONICE

Date generale

Transportul moleculelor de mici dimensiuni prin membrana celulară se realizează prin difuzie facilitată și este mediat de proteine. Acestea sunt fie proteine carrier (purtătoare), fie proteine care formează pori membranari (canale ionice). Astfel, se manifestă permeabilitatea selectivă a plasmalemei și se controlează compoziția citoplasmei.

Proteinele carrier asigură trecerea glucidelor, aminoacizilor și nucleozidelor prin membrană, în timp ce lipidele pot traversa bistratul fosfolipidic prin difiuzie simplă.

Canalele ionice permit traficul moleculelor polare și încărcate electic nu numai între celulă și mediul extracelular, ci și intercelular. Au fost evidențiate canale pentru apă, numite acvaporine și canale ionice (Alberts et al., 2002). Canalele ionice pot fi selective, existând canale permeabile pentru Na+, K+, Ca2+ și Cl- . Viteza transportului acestora este de aproximativ 1.000.000 ioni/secundă. Închiderea și deschiderea lor este mediată de ”porți”. Ele se deschid fie sub acțiunea unor molecule semnal specifice (canalele ligand-dependente), fie datorită schimbarii potențialului membranei celulare (canale ionice voltaj-dependente), fie fluctuează constitutiv între starea închis și deschis (Alberts et al., 2002).

O categorie de canale ionice foarte studiate este reprezentată de superfamilia canalelor TRP. Interesul în ceea ce le privește pornește de la implicarea lor într-o multitudine de boli, devenind astfel ținte terapeutice (Kaneko și Szallasi, 2014).

Superfamilia canalelor ionice TRP

Canalele ionice TRP de la diferite specii reprezintă cel mai mare grup de receptori pentru stimulii nocivi. Sunt importante pentru vedere, olfacție, gust, osmoreglare și termosenzație. Astfel, acestea pot fi ținte bune pentru analgezice (Patapoutian et al. 2009), precum și derivații pirazolinici (Nassini et al., 2015), resolvin D1, D2, E1 (Sousa-Valente et al., 2014), paracetamolul (Benemei et al., 2014).

Primul canal TRP a fost descris la Drosophila melanogaster și tot atunci a fost sugerată implicarea lui în transducția senzorială ca și receptor. Numele canalului ionic este dat de musculița mutantă care afișează un răspuns tranzitoriu în loc de un răspuns susținut la lumina puternică (Patapoutian et al., 2009).

Superfamilia canalelor TRP cuprinde un număr mare de canale cationice neselective. La mamifere există 28 de canale proteice TRP, care sunt grupate în șase familii: TRPA (Transient Receptor Potential Ankyrin), TRPC (Transient Receptor Potential Canonical), TRPM (Transient Receptor Potential Melastatin), TRPML(Transient Receptor Potential Mucolipin), TRPP(Transient Receptor Potential Polycystin), TRPV(Transient Receptor Potential Vanilloid) (da Costa et al., 2010). La viermii Caenorhabditis elegans, la muștele genului Drosophila, la peștele zebră (Danio rerio) (Venkatachalam și Montell, 2007) și la broasca africană cu gheare (Xenopus laevis) (Shin et al., 2005) mai este întâlnită o familie de canale TRP, și anume, TRPN (Transient Receptor Potential no mechanoreceptor potential C/nompC) (Venkatachalam și Montell, 2007). Nu se cunosc foarte multe informații legate de caracteristile funcționale ale acestor canale (Venkatachalam și Montell, 2007).

În familia canalelor TRPC sunt încadrate proteine înrudite cu primul canal identificat al familiei TRP, la Drosophila, numit acum TRPC1. Funcțional, familia TRPC a fost implicată în diverse categorii de boli, precum hipertensiunea, inflamația vasculară, hipertrofia cardiacă și insuficiența renală progresivă (Han și Yi, 2014).

Canalele TRPV de la mamifere sunt termo- și chemosensibile. Familia TRPV este compusă din 6 membrii. Dintre aceștia, TRPV1 este cel mai bine caracterizat. Acesta poate fi activat de stimuli diverși, printre care depolarizarea membranei, caldură nocivă, vaniloid și compuși endocannabionoizi, protoni extracelulari și mediatori inflamatorii. A fost observat că TRPV1 joacă un rol important în durere și inflamație neurogenică (Han și Yi, 2014).

Canalele TRPM expun o permeabilitate foarte variabilă pentru ionii de Ca2+și Mg2+ . De exemplu, canalele TRPM4 și TRPM5 sunt impermeabile pentru Ca2+, în timp ce TRPM6 și TRPM7 sunt foarte permeabile atât pentru Ca2+, cât  și pentru Mg2+. Deși canalele TRP nu au fost caracterizate complet din punct de vedere funcțional, TRPM1 pare să funcționeze ca un supresor tumoral, iar TRPM3 este posibil să fie implicat în etiologia sclerozei laterale amiotrofice (Han și Yi, 2014).

Familia canalelor TRPP are 3 membri: TRPP2, TRPP3 și TRPP5 (Han și Yi, 2014). Mutațiile genelor care codifică aceste proteine sunt întâlnite în boli are rinichilor, precum boala polichistică renală (Premkumar, 2014).

Singurul membru al familiei TRPA, și anume, TRPA1, a fost recunoscut ca fiind o țintă terapeutică pentru inflamațiile și durerile viscerale cronice (Han și Yi, 2014), printre medicamente numărându-se și paracetamolul (Benemei et al., 2014). Canalul este considerat critic pentru senzația chimică nocivă, semnalizarea inflamatorie și senzația de durere fiziologică și fiziopatologică (Cvetkov et al., 2011).

Familia canalelor TRPML cuprinde 3 membri, care sunt în primul rând proteine intracelulare în compartimentele citosolice. Se caracterizează printr-o buclă externă (E1) largă (între segmentele S1 și S2) cu numeroase situsuri de N-glicozilare. Toate canalele TRPML au cozi citosolice scurte (între 61 și 72 aminoacizi) (Han și Yi, 2014).

Canalele TRP prezintă o varietate de mecanisme de deschidere și de selectivitate cationică. Acestea pot fi deschise prin legarea directă a ligandului, de semnalul cuplării cu proteina G sau de depolarizarea membranei (Han și Yi, 2014). Ele răspund la elementele fundamentale de semnalizare celulară cum ar fi ionii de Ca2+, la temperatură și presiune osmotică, precum și la modificările de mediu care pot fi benefice sau dăunătoare (Zheng, 2013). Pot fi activate de stimuli intracelulari sau extracelulari, care pot fi atât de natură fizică cât și de natură chimică. Printre stimulii de natură fizică se numără temperatura, presiunea osmotică sau stresul mecanic, iar cei chimici pot fi pH-ul, presiunea O2, specii radioactive de oxigen (ROS), neurotransmițători, factori de creștere (Nielsen, Lindemann și Schwab, 2014).

Canalele ionice TRP au toate o structură asemănatoare. O proteină TRP tipică este alcătuită din șase segmente transmembranare (S1-S6) cu un por, formând o buclă între S5 și S6. Capetele amino terminal și carboxil terminal intracelulare pot avea lungimi diferite (Nilius și Owsianik, 2011). În figura 1 este prezentată structura generală a unei subunități a canalelor TRP.

Canalele TRP pot fi implicate într-o multitudine de boli (Kaneko și Szallasi, 2014), printre care și cancerul (Lehen’Kyi și Prevarskaya, 2011).

Inițierea și progresia tumorilor implică expresia sporită sau diminuată a unuia sau mai multor proteine TRP, în funcție de natura cancerului. Canalele al căror rol în această patologie a fost menționat sunt TRPM8, TRPV6, TRPM1, TRPV1, TRPC1, TRPC6, TRPM4, TRPM5 (Lehen’Kyi și Prevarskaya, 2011)

Canalele ionice TRP suferă modificări post-translaționale, printre care glicozilarea, care oferă proteinelor membranare, printre care și canalelor TRP, rigiditate, protecție împotriva denaturării și proteolizei, orientare corectă în interiorul membranei plasmatice (Voolstra și Huber, 2014). Canalele TRP care suferă această modificare sunt TRPC3, TRPC6, TRPM4, TRPM8, TRPV1, TRPV2, TRPV4, TRPV5, TRPV6 (Voolstra și Huber, 2014), TRPP2 (Hofherr et al., 2014), însă se pare că și TRPA1 este glicozilat (Egan et al., 2016). Glicozilarea influențează activitatea acestor canale, permeabilitatea și sensibilitatea la agonist și antagonist (Woo et al., 2013)

Canalul ionic TRPA1 – structură și funcții

Structura canalului TRPA1

TRPA1 este unul din cei 28 de membri ai superfamiliei de canale TRP și unicul membru al familiei TRPA (Cvetkov et al., 2011).

TRPA1 de la om a fost identificat în screening-ul unor gene cu un nivel scăzut de exprimare, urmărind transformarea oncogenică a fibroblastelor. Inițial, singurul membru al familiei TRPA a fost numit ANKTM1, pentru că proteina prezintă în structura ei numeroase domenii repetate N-terminale ankyrin (Venkatachalam și Montell, 2007).

Asemenea tuturor canalelor TRP, TRPA1 are structură tetramerică cu un singur por prezent pe axa centrală. Fiecare subunitate conține șase helixuri transmembranare (S1-S6) și domeniile N-terminal și C-terminal intracelulare. Așa cum se observă în topografia canalului, prezentată în figura 2, porul este poziționat între helixurile transmembranare S5 și S6. Caracteristic pentru TRPA1 este faptul că are o repetare ankyrin foarte lungă în domeniul N-terminal. Numărul de repetări variază în funcție de specie (de la 14 până la 18 repetări) (Chen și Hackos, 2015).

Canalul TRPA1 este unic față de restul canalelor TRP deoarece posedă o modalitate specifică de activare electrofilică și anumite caracteristici structurale distinctive: capătul amino-terminal (N-terminal) este neobișnuit de lung iar dommeniul porului exterior conține 2 helixuri în loc de unul singur, cum se întamplă în TRPV1, TRPV2 și în canalele pentru potasiu voltaj-dependente înrudite cu familia canalelor TRP (Marsakova et al., 2017).

Resturile reactive de Cys și Lys se comportă ca niște situsuri pentru legarea covalentă reversibilă a compușilor electrofili care prezintă grupări sulfhidril-/aminio- reactive. Legarea covalentă reversibilă a acestor resturi reprezintă mecanismul prin care compușii pungenți precum AITC și CA activează canalul TRPA1 (Egan et al., 2016).

Funcțiile canalului TRPA1

TRPA1 este un canal ionic neselectiv, permeabil pentru ionii de Ca2+. Datorită capacității sale de a răspunde la o mare varietate de compuși chimici, TRPA1 este considerat critic pentru senzația chimică nocivă, semnalizarea inflamatorie și senzația de durere fiziologică și fiziopatologică (Cvetkov et al., 2011).

Canalul TRPA1 este exprimat în celulele nervoase și cu precădere în nociceptori, fiind implicat în senzația dureroasă. Astfel, TRPA1 este întâlnit în ganglionii rădăcinilor dorsale ale nervilor spinali, în ganglionul nodos al nervului vag (perechea X de nervi cranieni), în ganglionul nervului trigemen (perechea III de nervi cranieni), în ganglionul cervical superior, neuronii mienterici din intestinul subțire și din intestinul gros. Canalul TRPA1 mai este exprimat și într-o multitudine de alte tipuri de celule, fiind, așadar, implicat în numeroase funcții biologice, în afară de senzația dureroasă. Proteina este întâlnită în celulele betha din pancreas, unde activarea sa duce la eliberare de insulină. În piele, este TRPA1 este exprimat în fibroblaste, keranocite, melanocite. Acesta poate avea rol în reglarea procesului de diferențiere al keranocitelor și în inflamația de la nivelul pielii. TRPA1 mai este exprimat la nivelul plămânului, în celulele epiteliului alveolar, în fibrele musculare netede, fibroblaste. La nivelul tractului urinar, canalul este întâlnit în celulele epiteliale, putând avea, astfel, rol în micțiune (Chen și Hackos, 2015).

Canalul este activat chimic de factori iritanți din mediul extern și compuși pungenți, precum wasabi, hrean, izotiocianații (AITC) din uleiul de muștar, alicina din usturoi, cinamaldehida (CA) din uleiul de scorțișoară, tetrahidrocannabinolul din marijuana și acroleina din gazul lacrimogen (Venkatachalam și Montell, 2007), mediatorii inflamatori, carvacrolul, lumina UV, frigul sau stimulii mecanici (Hasan et al., 2017 ).

Modul de activare al canalului depinde de natura agonistului. Compușii electrofili, precum AITC și mediatorii inflamatori endogeni deschid canalul prin modificarea covalentă resturilor de Cys. Substanțele non-electrofile, precum carvacrolul, se leagă direct de canal (Hasan et al., 2017 ).

Ca2+ , mesager secundar, joacă un rol important în reglarea funcțională a proteinei TRPA1. Pe de-o parte, Ca2+ poate activa sau potența răspunsul canalului la diverși stimuli, precum mediatorii inflamatori (histidina), lumina UV, frigul sau stimulii mecanici. Aceștia cresc concentrația intracelulară a Ca2+. Pe de altă parte, concentrațiile ridicate de Ca2+ inactivează rapid TRPA1, imediat după activare, proces numit ”desensibilizare”. În acest fel, este prevenită o stare de activare de lungă durată a canalului, care at putea leza celulele și țesuturile (Hasan et al., 2017).

Strudii recente arată că TRPA1 are rol în detectarea și răspunsul la produșii bacterieni nocivi, precum lipopolizaharidele sau endotoxinele produse de bacteriile Gram negative. Acestea provoacă activarea rapidă a nociceptorilor care duc la eliberarea de neuropeptide, cauzând durere, inflamație și vasodilatație. Astfel, este pus în acțiune sistemul imunitar al gazdei. Mecanismul molecular prin care lipopolizaharidele activează canalul TRPA1 este, însă, necunoscut (Viana, 2016).

Pentru că este exprimat în nociceptori și pentru că are capacitatea de a traduce o gamă largă de stimuli chimici nocivi în potențiale de acțiune, TRPA1 prezintă un interes deosebit ca țintă pentru medicamente, precum derivații pirazolinici (Nassini et al., 2015), resolvin D1, D2, E1 (Sousa-Valente et al., 2014), paracetamolul (Benemei et al., 2014).

TRPA1 este implicat în respirație și în bolile sistemului respirator. Este exprimat în rădăcina dorsală a nervilor senzoriali periferici și în fibrele nervului vag care inervează căile respiratorii. Agenții iritanți, oxidanți sau alergenii excită acesti nervi, cauzând astfel strănut, tuse, obstrucție nazală. Alți compuși iritanți din aer, care pot declanșa astmul, fumul de țigară, activează canalul TRPA1 și excită fibrele nervoase (C-). Acest lucru duce la eliberarea locală de neuromediatori, printre care substanța P (P de la engl. pain = durere), neurokinina A (substanța K), declanșându-se inflamația neurogenică, contracția mușchilor netezi ai tractului respirator, edem bronșic, sau secreție de mucus (H. Jiang et al., 2011).

Un studiu realizat pe șoareci, în anul 2009, de către Caceres și colab. evidențiază faptul că TRPA1 poate fi o țintă terapeutică pentru hiperreactivitatea bronșică și inflamația căilor respiratorii asociate astmului. Șoarecilor le-a fost administrat HC-030031, antagonist al canalului TRPA1 și s-a observat o diminuare semnificativă a simptomelor (Caceres et al., 2009).

Alți agonsiti ai canalului TRPA1 utilizați în terapie sunt: HC-030031 (acetamidă), gadolinium, rutheniu, camfor, AP18, 1E, 3E (H. Jian et al., 2011).

MODIFICĂRI POST-TRANSLAȚIONALE ALE CANALELOR TRP

Modificări post-translaționale

Modificările post-translaționale reprezintă prelucrarea unei proteine, ca urmare a biosintezei sale și cuprinde proteoliza limitată a lanțului polipeptidic, atașarea coenzimelor și modificări covalente ale resturilor de aminoacizi. Modificările post-translaționale cresc variabilitatea proteomului unui organism, generând un număr mare de proteine diferite. Aceiași proteină poate suferi numeroase modificări care pot avea efecte opuse funcției proteinei. Multe sunt reversibile și au rol reglator. Spre exemplu, pot fi reglate interacțiunile dintre proteine sau localizarea subcelulară (intracelulară) a acestora. Modificările post-translaționale afectează stabilitatea proteinei, reglarea activității unor enzime sau a unor canale ionice. Printre acestea, se numără fosforilarea, glicozilarea, nitrozilarea, metilarea, acetilarea (Voolstra și Huber, 2014).

Canalele TRP suferă modificări covalente post-translationale care le influențează proprietățile biofizice, stările de închidere și/sau deschidere ale canalului sau direcționarea subcelulară. Printre modificările suferite de canalele ionice TRP se numără: N-glicozilarea, fosforilarea și atașarea covalentă a compușilor care se leaga reversibil de resturi de cisteină (Voolstra și Huber, 2014).

Fosforilarea și defosforilarea proteinelor sunt modificări post-translaționale comune, reversibile, care pot regla structura și funcționarea canalelor ionice. Astfel, se poate modifica activitatea canalului și, prin urmare, proprietățile electrofiziologice ale celulelor excitabile și neexcitabile (Yao, Kwan și Huang, 2006). Fosforilarea proteinelor este catalizată de enzime numite protein kinaze, care adaugă o grupare fosfat (PO43−) unei grupări hidroxil (-OH) a resturilor de aminoacizi serină (Ser), treonină (Thr) și tirozină (Tyr). Defosforilarea proteinelor este catalizată de fosfataze, care hidrolizează gruparea PO43− (Voolstra și Huber, 2014).

Fosforilarea are un rol important în reglarea funcției canalelor TRP, în special a membrilor familiilor TRPC, TRPM, TRPP și TRPV (Yao, Kwan și Huang, 2006).

Toate canalele TRPC, cu excepția canalului TPRC1 sunt inhibate de protein kinaza C (PKC) și de protein kinaza G (PKG). Canalul TRPC1 este activat de PKC (Ahmmed et al., 2004). Canalul TRPC3 este activat de kinazele src (Vazquez et al., 2004), iar TRPC6 de protein kinaza II calmodulin dependentă (CaMKII) (Hisatsune et al., 2004) și de kinazele src (Yao, Kwan și Huang, 2006).

În cazul familiei TRPV, au fost evidențiate efecte ale acțiunii kinazelor pentru canalele TRPV1, TRPV2, TRPV4, TRP5 și TRPV6 (Yao, Kwan și Huang, 2006). Pentru activarea canalului TRPV1 de către caspacină (agonist al canalului) este necesar CaMKII (Jung et al., 2004), iar protein kinaza A(PKA) și PKC sensibilizează răspunsul acestuia la căldură, capsacină și anandamină (Vellani et al., 2001). De asemenea, PKA potențează răspunsul la căldură al canaluilui TRPV2 (Stokes et al., 2004). Canalul TRPV4 este activat de PKC (Xu, Satoh și Iijima, 2003), iar TRPV5 este activat de Ser/Thr kinaze (Embark et al., 2004). Canalul TRPV6 este activat de kinaza src (Sternfeld et al., 2005), iar PKC reduce inactivarea acestuia (Niemeyer et al., 2001).

Dintre membrii familiei TRPM, a fost studiată fosforilarea la TRPM4 și TRPM7. PKC sensibilizează răspunsul canalului TRPM4 la Ca2+ (Nilius et al., 2005), iar PKA activează canalu TRPM7 (Aarts et al., 2003).

Canalul ionic TRPP2 este reglat de către casein kinaza 2 (CK2), care sensibilizează răspunsul acestuia la Ca2+ (Cai et al., 2004).

În ceea ce privește fosforilarea proteinei TRPA1, se pare că PKA sensibilizează răspunsul acesteia la agonistul AITC (Meents, Fischer și McNaughton, 2017).

Modificarea covalentă reversibilă a resturilor de Cys din structura canalelor TRP este indusă de către agoniști, rezultând astfel activarea acestora (Voolstra și Huber, 2014). Spre exemplu, în cazul canalului TRPA1, legarea covalentă reversibilă a compușilor electrofili cu grupări sulfhidril-/amino- reactive, de resturile reactive de Cys și Lys, reprezintă un mecanism de activare al canalului de către compusii pungenți, precum AITC și CA (Egan et al., 2016). Printre resturile de Cys implicate se numără: Cys-415, Cys-422, Cys-622, Cys-642, Cys-666, Cys-174, Cys-193, Cys-634, Cys-859 (Wang et al., 2012).

Glicozilarea

Glicozilarea este reacția de adiție a zaharurilor la lipide sau proteine, catalizată enzimatic (Voolstra și Huber, 2014). Majoritatea proteinelor membranare și serice sunt glicozilate, cu puține excepții, precum hormonii peptidici mici, insulina, glucagonul și albumina serică. Din cei 20 de aminoacizi esențiali, 9 pot fi glicozilați cu un monozaharid, sau chiar cu lanțuri alcătuite din sute de monozaharide. La mamifere, de obicei sunt comprimate în blocuri 10 monozaharide; acestea sunt: glucoza (Glc), galactoza (Gal), manoza (Man), fucoza (Fuc), xyloza (Xyl), acidul sialic/acid N-acetilnuraminic (Neu5Ac), N-acetilglucozamina (GlcNAc), acid glucuronic (GlcA), acid iduronic (IdoA), N-acetilgalactozamină (GalNAc) (Stowell, Ju și Cummings, 2015).

Glicozilarea proteinelor este implicată într-o multitudine de procese biologice, precum: interacțiunea receptorilor, răspunsul imun, secreția și transportul proteinelor. De semenea, afectează proprietățile proteinelor precum solubilitatea, stabilitatea și plierea (Clerc et al., 2015), protejează proteinele împotriva proteolizei, este implicată în direcționarea intracelulară a proteinelor și potențează funcțiile îndeplinite de proteine, după cum este prezentat în figura 3 (Scott și Panin, 2014).

Glicozilarea poate fi diferită între persoane, dar este stabilă la nivel individual. Când starea de homeostazie se modifică, prin stilul de viață sau prin prezența unor boli, atunci pot apărea modificări. Studii făcute pe un număr mare de indivizi, mii de indivizi, au demonstrat că glicozilarea este corelată cu vârsta, sexul și stilul de viață. În același timp, studii bazate pe un număr mai mic de indivizi au arătat modificări ale glicozilării în diferite boli, inflamație și de asemenea în cursul gestației. Astfel, apare posibilitatea de a utiliza glicanii ca biomarker pentru anumite boli (Clerc et al., 2015).

Proteinele pot fi glicozilate la gruparea hidroxil a resturilor de aminoacizi Ser și Thr, când glucidul se leagă de oxigen (O-glicozilare). Acest tip de glicozilare are loc în aparatul Golgi la celulele eucariote și mai este întâlnită în organisme din domeniile Archeae și Bacteria . Proteinele mai pot fi glicozilate la gruparea resturilor de Asn, când glucidul se leagă de azot (N-glicozilare). În acest caz, secvența de aminoacizi este Asn-X-Ser, unde X poate să fie orice aminoacid, în afară de Pro (Voolstra și Huber, 2014).

N-glicozilarea reprezintă modificarea covalentă a proteinelor la organismele eucariote. Printre numeroasele funcții îndeplinite, se numără direcționarea subcelulară a proteinelor, protecția lor împotriva denaturării și proteolizei, oferă rigiditate proteinelor, ajutându-le pe cele membranare să aibă orientarea corectă în dublul strat fosfolipidic (Voolstra și Huber, 2014).

În cazul N-glicozilării, un oligozaharid, constituit din 14 monozaharide (2 acetilglucozamine, 9 manoze și 3 glucoze) este sintetizat de membrana reticulului endoplasmatic. Blocurile de monozaharide sunt adăugate succesiv la un lipid cărăuș aflat în membrana reticulului endoplasmatic. Ulterior, această oligozaharidă este transferată la o proteină țintă de către enzima oligozaharil transferaza, care recunoaște secvența de aminoacizi Asn-X-Ser. Ulterior, oligozaharida este tăiată lăsând o oligozaharidă de bază compusă din două N-acetilglucozamine și trei resturi de manoză (Voolstra și Huber, 2014).

Pentru a obține o mare varietate de modele de glicozilare, oligozaharidele de bază sunt modificate de glicoziltransferaze și glicozidaze în reticulul endoplasmatic și în aparatul Golgi. Glicoziltransferazele catalizează adăugarea unui glucid la o oligozaharidă specifică, iar glicozidazele catalizează hidroliza anumitor zaharuri de la o oligozaharidă specifică. Adăugarea sau îndepărtarea unei anumite monozaharide generează substratul pentru urmatoarea enzimă care catalizează îndepărtarea sau adăugarea unei alte monozaharide. Celulele mamiferelor recurg la nouă blocuri de monozaharide diferite (Voolstra și Huber, 2014).

Implicarea glicoizlării în cancer

În cursul transformării maligne a celulelor, apar și modificări ale glicozilării proteinelor, ceea ce influențează creșterea și supraviețuirea celulelor, facilitează imunomodularea indusă de tumoră, modificarea comunicării intercelulare și apariția metastazelor. Aceste modificări ale proteinelor pot apărea devreme în cursul dezvoltării maligne, sau mai târziu. În figura 4 am prezentat modul în care pot fi modificați glicanii în cursul transformării maligne a celulelor (Stowell, Ju și Cummings, 2015).

Modificările în ceea ce privește expresia genei pentru glicoziltrnasferaze alterează structura glicanilor. Spre exemplu, gena care codifică glicoziltransferaza este foarte puțin, sau deloc exprimată în celulele glandei mamare sănătoase. În cancerul de sân, însă, s-a observat că exprimarea aceastei gene este reglată pozitiv de către factorul transcripțional Ets (E26 transformation-specific) pe calea receptorului pentru factorul de creștere epidermal uman HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor), rezultând structuri inalt ramificate de N-glicani pe suprafața celulelor tumorale. (Stowell, Ju și Cummings, 2015).

Canale TRP glicozilate

Canalele ionice TRP suferă modificări post-translaționale, printre care glicozilarea. Glicozilarea oferă canalelor TRP rigiditate, protecție împotriva denaturării și proteolizei, orientare corectă în interiorul membranei plasmatice. Canalele TRP care suferă acest tip de modificare post-translațională sunt TRPC3, TRPC6, TRPM4, TRPM8, TRPV1, TRPV2, TRPV4, TRPV5, TRPV6 (Voolstra și Huber, 2014), TRPP2 (Hofherr et al., 2014), TRPM5 (Syam, Rougier și Abriel, 2014), însă se pare că și TRPA1 este glicozilat (Egan et al., 2016).

Din familia canalelor TRPC, atât canalul TRPC3, cât și canalul TRP6 sunt glicozilate la nivelul domeniului extracelular E1, situat între segmentele transmembranare S1 și S2. În plus, TRPC6 mai este glicoziat la nivelul domeniului extracelular E2, dintre segmentele transmembranare S3 și S4 (Dietrich et al., 2003). Canalul TRPV1 posedă un singur situs de glicozilare, la restul Asn din poziția 604. TRPV3, 4, 5 și 6 sunt glicozilate la resturile Asn din pozițiile 418, 651, 358, respectiv 347 (Voolstra și Huber, 2014).

Din familia canalelor TRPM sunt glicozilate TRPM4, TRP5 și TRPM8. TRPM4 este glicozilat la nivelul restului Asn din poziția 992, iar TRPM 5 la nivelul restului Asn din poziția 932. Acestea sunt situate între segmentele transmembranare S5 și S6 (Syam, Rougier și Abriel, 2014). Proteina TRPM8 este glicozilată la restul Asn situat în poziția 934, în domeniul extracelular dintre segmentele transmembranare S5 și S6, aproape de por. Studii publicate în anul 2012 de către Pertusa și în anul 2017 de către Ulăreanu evidențiază importanța N-glicozilării în cazul canalului ionic TRPM8.

Pertusa și echipa sa au utilizat expresiile heterologe ale canalelor recombinate în celule HEK293 și au observat ca mutantul TRPM8, N934Q, prezintă un prag diferit față de tipul sălbatic în ceea ce privește activarea la temperatură și un răspuns redus la mentol și stimuli reci. Pentru a demonstra că lipsa N-glicozilării afectează funcția canalelor ionice TRPM8 native într-un mod asemănător cu cele exprimat în heterologii HEK293, cercetătorii au tratat neuroni trigemeni senzoriali cu tunicamicină și brefeldina A pentru a preveni N-glicozilarea. Ei au observat schimbarea pragului și un răspuns redus la mentol și stimuli reci al canalelor TRPM8. Așadar, această modificare pot-translațională este importantă pentru reglarea funcției de receptor a canalelor TRPM8 (Pertusa et al., 2012).

Celălalt studiu, efectuat de către echipa din departamentul DAFAB, în care s-a desfășurat această lucrare, au utilizat pentru experiment celule izolate din ADK, și anume Panc-1 și heterologii HEK293. Ei au demonstrat faptul că celulele Panc-1 exprima proteina membranară TRP, însă în stare neglicozilată. În această formă, canalul ionic împiedică proliferarea și migrația celulelor canceroase (Ulăreanu et al., 2017).

După cum se poate observa în topografia canalului ionic TRPA1 în formă glicozilată, prezentată în figura 5, la mamifere, TRPA1 conține două situsuri de glicozilare, înalt conservate,expuse spre lumen, de-a lungul domeniului extracelular E1: Asn747 și Ans753. Absența N-glicanilor reduce sensibilitatea canalaluilui ionic TRPA1 la concentrații mai mici ale agoniștilor săi (Egan et al., 2016).

IMPLICAREA CANALELOR IONICE TRP ÎN CANCER

Cancer-date generale

Cancerul reprezintă un grup de maladii complexe, care implică dezvoltarea anormală a celulelor, cu potențialul de a invada sau de a se răspândi în alte părți ale organismului (WHO, 2017) . Este una dintre principalele cauze ale decesurilor din lume. În ciuda progreselor în ceea ce privește diagnosticarea în stadii incipiente și îmbogățirea arsenalului terapeutic, există încă o lipsă de strategii terapeutice eficiente (Gautier et al., 2014). Printre metodele utilizate în tratarea cancerului se numără intervențiile chirurgicale, chimioterapia și radioterapia, însă pacienții prezintă, în majoritatea cazurilor, numeroase efecte secundare, scăzând astfel calitatea vieții. În plus, există posibilitatea de recidivă a bolii (Huang și Jan, 2014).

Principalele cauze ale apariției cancerului sunt genetice. Mutațiile pot fi moștenite sau dobândite în timpul vieții din cauza expunerii la factorii predispozanți, printre care se numără: radiațiile (ultraviolete, ionizante) unele substanțe chimice din alimente și țigări sau virusuri (de exemplu HPV). Genele implicate în apariția cancerului sunt oncogenele (responsabile pentru diviziunea celulară), genele supresor-tumorale (opresc diviziunea celulară), genele reparatorii (”corectează” mutațiile dobândite) sau genele implicate în apoptoză (responsabile de moartea programată a celulei, atunci când este prea deteriorată sau bătrână). Atunci când o mutație afectează astfel de gene, iar celulele sistemului imunitar nu recunosc celula/ celulele implicate ca fiind non-self, apare o tumoră (Cancer Research UK, 2014).

Celulele tumorilor maligne au șase caracteristici principale: proliferare intensă, evitarea supresorilor creșterii, imortalitate replicativă, resistență împotriva apoptozei, inducerea angiogenezei și activarea invaziei și metastazelor (Hanahan și Weinberg, 2011). Migrația celulelor tumorale este influențată de micromediul acestora, dar și de celulele stromale, ale organului respectiv, precum: celulele endoteliale, fibroblaste sau celulele sistemului imunitar (Nielsen, Lindemann și Schwab, 2014).

În celulele canceroase, homeostazia ionilor de Ca2+ este alterată. Aceștia sunt mesageri secundari pentru reglarea genelor, proliferare, migrație și moarte celulară. Canalele TRP sunt permeabile pentru ionii Ca2+, iar la stimulare, generează schimbări în concentrația intracelulară a acestora. Așadar, canalele ionice TRP sunt implicate în schimbările apărute în celulele canceroase (Cui et al., 2017).

Adenocarcinomul pancreatic ductal

Cancerul pancreatic este pe locul 7 ca frecvența în Europa, reprezentând a cincea cauză de deces asociat cu cancerul. Incidența acestei boli este mai mare la femei decât la bărbați. La femei reprezintă 3,2% dintre cazule de cancer, iar la bărbați 2,8%. Cele mai multe cazuri sunt diagnosticate după vârsta de 65 de ani, incidența crescând odată cu vârsta. Din punct de vedere histologic există mai mutle forme de cancer pancreatic: adenocarcinom pancreatic ductal, carcinomul cu celule acinare, tumori neuroendocrine. Adenocarcinomul pancreatic ductal este forma cea mai întâlnită. Reprezintă 80% dintre tipurile de cancer pancreatic (Ducreux et al., 2015).

Adenocarcinomul pancreatic ductal este asociat cu o morbiditate și o mortalitate semnificativă. De asemenea, se caracterizează printr-o durere cu un puternic impact asupra calității vieții, scurtând timpul de supraviețuire. Invazia și metastazarea pe cale neuronală și inflamația neurogenică caracterizează malignitatea cancerului de pancreas. Sudii făcute pe animale arată că inflamația cronică a pancreasului produce hipertrofia și hipersensibilizarea fibrelor nervoase senzoriale și acestea pot provoca, la rândul lor, inflamație prin intermediul mecanismelor neurogenice (Stopczynski et al., 2014).

Cauzele și factorii de risc sunt numeroși. Diabetul, obezitatea, fumatul, consumul excesiv de alcool, pancreatita se numără printre factorii favorizanți apariției adenocarcinomului pancreatic ductal. În plus, poate fi vorba și despre o predispoziție genetică. Persoanele afectate pot avea rude, de gradul întâi până la al treilea, care au suferit și/sau riscă să dezvolte această maladie. Printre genele implicate în acest tip de cancer se numără BRCA1, PALB2 și BRCA2. Acestea mai sunt, însă implicate si în alte tipuri de cancer, precum cel ovarian, de sân și de prostată (Wolfgang et al., 2013).

Diagnosticarea acestei boli este complicată și de cele mai multe ori este făcută târziu, din cauza localizării profunde a pancreasului și lipsei simptomelor până în stadii foarte avansate. Printre cele mai eficiente metode de diagnosticare ale adenocarcinomului pancreatic ductal se numără: endoscopia ultrasonografică, colangiopancreatografia prin rezonanță magnetică, colangiopancreatografia endoscopică retrogradă, însă există și biomarkeri specifici (de natură genetică și proteică) ce pot fi utili. În ceea ce privește tratamentul, abordarea chirurgicală este, în prezent, singura variantă folosită (Laeseke et al., 2015).

În cancerul pancreatic, aberații ale glicozilării proteinelor au un rol esențial în tumorigeneză, apariția metastazelor, răspunsul imun, chimiorezistență și influențează micromediul tumoral. S-a observat o creștere globală a N-glicozilării în numeroase glicoproteine din cazul țesutului adenocarcinomul pancreatic ductal, comparativ cu pancreasul sănătos. Proteinele asociate cancerului pancreatic sunt: MUC5AC, molecula de adeziune celulară 5 a antigenului carcinoembrionar, proteina de legare 3 a factorului de creștere insulin-like, catepsina D, antigenele CD (Cluster of Differentiation), printre care și CD44, și integrine. Toate acestea prezintă cel puțin o N-glicopeptidă supraexprimată în cancerul pancreatic, dar și în cazul pancreatitei cronice. Acest lucru denotă legătura moleculară dintre cele două maladii. Astfel, este luată în calcul glicozilarea aberantă asociată cancerului ca țintă de diagnostic (Pan, Brentnall și Chen, 2016).

Canalele TRP în cancer

Canalele ionice TRP sunt implicate în schimbările apărute în celulele canceroase (Cui et al., 2017). Inițierea și progresia tumorilor poate să implice expresia sporită sau diminuată a unuia sau mai multor proteine TRP, în funcție de natura cancerului. Canalele al căror rol în această patologie a fost menționat sunt TRPM8, TRPV6, TRPM1, TRPV1, TRPC1, TRPC6, TRPM4, TRPM5 (Lehen’Kyi și Prevarskaya, 2011) și TRPA1 (Gautier et al., 2014). Acestea au rol în numeroase procese canceroase, printre care: proliferarea celulară, apoptoza, migrația și invazia celulară (Gautier et al., 2014).

Canalul TRPV6 este puternic exprimat în cancerul de prostată, în carcinomul de colon, de sân, tiroidian și ovarian. Expresia crescută a canalului TRPV 1 a fost întâlnită, de asemenea, în cancerul de prostată, de colon, pancreatic și de vezică urinară (Prevarskaya, Zhang și Barritt, 2007). Supraexpresia eronată canalelor TRPV poate oferi celulelor maligne resistentă împotriva apoptozei, poate favoriza proliferarea celulară, angiogeneza, migrația și invazia, având, așadar, rol în progresia tumorală (Santoni, Farfariello și Amantini, 2011).

Un studiu făcut în anul 2013 de către Jiang și echipa sa, evidențiază rolul canalelor TRPC1, TRPC3, TRPC4 și TRPC 6 în celule izolate din cancer pulmonar non-microcelular. Proteinele TRPC prezintă un nivel de exprimare mai mic în cancerul de plămân mai puțin diferențiat, comparativ cu cel mai bine diferențiat. În țesutul sănătos sunt puternic exprimate. Prin blocarea acestor canale în linia celulara A549, s-a observat o scădere semnificativă a proliferării celulare, în timp ce supraexpresia canalelor a sporit proliferarea și, implicit migrația celulelor (Jiang et al., 2013). Așadar, canalele TRP împlicate în cancer pot reprezenta markeri importanți pentru identificare stadiului bolii. În plus, cum multe sunt exprimate în neuroni senzitivi, mai pot fi țintă în terapia durerii asociate acestei maladii (Prevarskaya, Zhang și Barritt, 2007).

Proteina TRPM8 este puternic exprimată în celulele cancerului de prostată, de colon, de sân, de plămân si de piele. TRPM1 poate fi considerat un marker pentru identificarea stadiului melanomului la om. Acesta prezintă un nivel ridicat de exprimare în țesutul benign, un nivel scăzut în melanomul incipient, iar în stadii avansate asociate cu apariția metastazelor, ARNm al TRPM1 este nedetectabil (Prevarskaya, Zhang și Barritt, 2007). Nivelul de exprimare al canalului TRPM4 este crescut în cancerul de prostată (Berg et al., 2015).

În cancer, canalele TRP pot fi implicate în motilitatea celulelor. În anul 2014, Cucu și colaboratorii au analizat rolul canalului TRPM8 în celule izolate din ADK. Utilizând tehnica western-blot și analiza imunocitochimică au comparat celulele tumorale cu celule epiteliale sănătoase, izolate din pancreas uman. Utilizând metoda patch-clamp au investigat modul de funcționare al proteinei, măsurând curenții ionici, iar prin scratch-wound au observat cum influențează canalul TRPM8 migrația celulară. Astfel, au evidențiat faptul că celulele izolate din ADK exprimă această proteină, răspund la agoniști precum mentolul sau ilicina și la antagoniști precum benzamida. În plus, au observat faptul că prezența canalului TRPM8 inhibă motilitatea celulelor canceroase (Cucu et al., 2014).

Interacțiunea dintre celulele maligne și celulele stromei, prin semnalele continue ale factorilor de creștere, induce formarea micromediului tumoral, producerea unui matrix extracelular, hipoxia și stresul oxidativ, răspunsul inflamator și angiogeneza. Astfel are loc progresia tumorii. În aceste mecanisme sunt implicate și canalele TRP. Stresul oxidativ, ca urmare a hipoxiei, ROS, ADP-riboza sunt caracteristice micromediului tumoral. Canalele TRP pot le recepționa și pot reacționa la acestea prin creșterea expresiei lor și/sau prin medierea răspunsului celular, care adesea implică migrația. Canalele TRP pot recepționa disponibilitatea oxigenului, cum se întâmplă în cazul canalului TRPA1 din nervul X (vag) sau din neuronii senzitivi la șoarece. De asemenea, se poate ca expresia sau funcționarea lor să fie reglate de către presiunea oxigenului. Spre exemplu vasoconstricția hipoxică pulmonară implică activarea canalului TRPC6 (Nielsen, Lindemann și Schwab, 2014).

Cum proteinele TRP suferă modificări post-translaționale, în celulele canceroase se pot observa modificări și din acest punct de vedere. Spre exemplu, canalul TRPM8 nu este glicozilat în celulele canceroase izolate din ADK, lucru evidențiat de Ulăreanu și colaboratorii, în anul 2017. De asemenea, au demonstrat faptul că în această formă, această proteină împiedică proliferarea și migrația celulelor canceroase (Ulăreanu et al., 2017).

Implicarea canalului ionic TRPA1 în cancer

Canalul ionic TRPA1 pare să fie implicat în proliferarea și migrarea celulelor canceroase. Studii făcute pe celule de adenocarcinom de plămân demonstrează acest lucru. În plus, în carnomul pulmonar microcelular uman, izotiocianatul de alil (AITC) (agonist al canalului TRPA1) favorizează supraviețuirea și proliferarea celulară (Gautier et al., 2014).

În anul 2014, Du și colab. au evidențiat rolul canalelor ionice TRPA1 și TRPM8 în cancerul de plămân. Au utilizat 3 linii celulare Lewis lung cancer (LLC): LLC-1, LLC-2 și LLC-3. Prinanaliza Western blot, au observat că în linia celulară LLC-1, TRPM8 este mai mult exprimat față de TRPA1. În linia celulară LLC-3, spre deosebire de prima, proteina TRPA1 este exprimată mai puternic față de TRPM8. În linia celulară LLC-2, însă, ambele proteine au fost exprimate la un nivel asemănător. La acestea din urmă, cercetătorii au observat un timp de dublare mai mare, proliferare și capacitate de invazie mai mare și o scădere a adeziunii, în raport cu celelalte linii celulare (Du et al., 2014).

Canalul TRPA1 mai este implicat și în cancerul de colon. În acest caz s-a observat intensificarea transcrierii genei care codifica pentru această proteină în celulele maligne. De asemenea, este cunoscută implicarea acestui canal în colită, condiție asociată cancerului de colon (Gautier et al., 2014). Un al exemplu care demonstrează rolul canalului TRPA1 în cancer este intensificarea traducerii genei care îl codifică în celulele carcinomului nasofaringian. Reglajul pozitiv al genei este direct proporțional cu agravarea bolii, de la stadiile incipiente până la cele avansate (Wu et al., 2016).

Pe baza acestor date din literatură și a studiilor anterioare publicate de grupul din Departamentul de Anatomie, Fiziologie și Biofizică (DAFAB) (Cucu et al., 2014) (Ulăreanu et al., 2017), am stabilit realizarea unor experimente care să determine:

Expresia canalului TRPA1 în celule izolate din ADK.

Starea de glicozilare a proteinei TRPA1 în celule izolate din ADK.

Implicarea stării de glicozilare în migrația celulelor.

CAPITOLUL II. MATERIALE ȘI METODE

Reactivi și soluții

Am utilizat pentru experimente linii celulare provenite din adenocarcinomul pancreatic ductal, și anume: Panc-1, MiaPaCa-2, BxPc3 și PK-9. Acestea au fost cultivate în mediu DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium) suplimentat cu 10 % ser fetal bovin și 1 % soluție de antibiotic Penicilină-Streptomicină, pe flask-uri de 25 cm2.

S-a folosit soluție 0,25 % tripsină-EDTA (Gibco 25200-056) pentru pasajul celulelor.

Menținerea culturilor celulare

Dezghețarea

Criotubul cu celule se introduce în baia de apă, la 37°C, timp de 1-2 minute. Conținutul acestuia se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, conectată la o pompă, și se pune într-un tub Corning de 15 mL. Pentru neutralizarea DMSO în care au fost înghețate celulele și pentru centrifugarea lor se utilizează 4 mL de mediu de cultură DMEM. Se centrifughează la 1500 rpm, 5 minute, apoi se scoate supernatantul. Se adaugă 1 mL mediu de cultură steril peste sedimentul obținut, se resuspendă și se pune conținutul într-un flask de 25 cm2. Se incubează la 37°C și 5 % CO2.

Hrănirea

Mediul de cultură se schimbă din două în două zile. Utilizând o pipetă Pasteur conectată la o pompă se scoate mediul de cultură din flask. Ulterior, se adaugă 5mL de mediu de cultură steril. Se incubează pentru 48 de ore.

Pasajul

Pentru a efectua un pasaj, celulele trebuie să aibă o confluență de cel puțin 70 %. Este indicat să nu se depășească acest stadiu. Se scoate mediul de cultură din flask și se adaugă 1mL de Tripsină. Se incubează pentru 5-10 minute pentru a se desprinde celulele de substrat. Ulterior, se inactivează tripsina cu o cantitate dublă de mediu de cultură steril, mL. Se resuspendă cu ajutorul pipetei serologice și a pipetorului și se aruncă conținutul. Peste flask se adaugă 5 mL de mediu de cultură steril. Înainte de efectuarea experimentelor, celulele trebuie pasate de cel puțin 3 ori.

Înghețarea

Mediul de cultură din flask este îndepărtat. Se adaugă 1mL de tripsină, apoi se incubează 5-10 minute. După ce s-au desprins celulele, se adaugă 3 mL de mediu de cultură pentru neutralizarea tripsinei și se resuspendă. Se pune tot conținutul flask-ului într-un tub Corning de 15 mL și se centrifughează 5 minute, la 1500 rpm. Supernatantul este îndepărtat, iar peletul se resuspendă în ser fetal bovin. Se adaugă 10 % DMSO. Suspensia celulară este împărțită în criotuburi și ținută la -70°C.

Tratarea cu brefeldina A

Brefeldina A este o lactonă antivirală produsă de fungul Eupenicilliun brefeldianum (Y. J. Wang et al., 2012). Aceasta are capacitatea de a inhiba transportul proteinelor de la reticulul endoplasmatic până la aparatul și implicit glicozilarea proteinelor Golgi (Helms și Rothman, 1992).

Soluția de brefelnină A fost adăugată în mediul de cultură al celulelor cu 20 de ore înainte de experimente. Concentrația de brefeldină utilizată pentru tratarea celulelor a fost de 5g/mL. Flask-urile tratate astfel au fost menținute la incubator la 37°C și 5 % CO2.

Metode utilizate

Tehnica „wound-healing”

Prin tehnica ”wound-healing” se poate studia migrarea celulelor in vitro. Aceasta imită modul de vindecare a rănilor in vivo. (Chen, 2013).

Am utilizat această metodă pentru a observa migrarea celulelor izolate din adenocarcinom pancreatic ductal și cum este acest proces influențat de starea de glicozilare.

Celulele din liniile celulare Panc-1, MiaPaCa-2, BxPc3 și PK-9 ajunse la al treilea pasaj după dezghețare, au fost numărate folosind camera de numărat Burker-Turk. Acestea au fost cultivate în vase Petri cu diametru de 24 mm la o densitate de 3×105 celule/mL. Densitatea aceasta a fost aleasă deoarece celulele trebuie să ajungă într-un timp cât mai scurt la confluența de 100 %.

În momentul atingerii confluenței de 100 %, s-au împărțit vasele cu celule în grupuri de control și în grupuri de tratate cu brefeldina A. A fost trasată o „zgărietură” în mijlocul stratul celular, cu ajutorul unei micropipete de 200 μL. Celulelor din grupul de control le-a fost adăugat 1mL mediul de cultură specific. Celor din grupul de tratate li s-a adăugat 1mL mediu de cultură suplimentat cu brefeldină A. Ulterior, s-au realizat poze folosind un microscop Nikon Eclipse TS100 cu obiectivul 10x și utilizând programul Ueyesetup (uEye Cockpit). S-a monitorizat rata de migrație a celulelor la un interval de 20 de ore.

Pentru datele statistice, s-a măsurat suprafața „zgârieturii” cu ajutorul software-ului Image J (figura 7). S-a determinat procentual modificarea ariei din momentul în care s-a trasat ”zgârietura” până la trecerea celor 20 de ore. Analiza statistică s-a făcut cu software-ul OriginPro8. Prezentarea datelor s-a realizat ca media ± eroarea standard a mediei (SEM). Analiza statistică s-a făcut folosind testul Two-Sample Student’s t-Test.

Western-blot

Western blot, sau imunoprecipitarea, presupune separarea și identificarea proteinelor pe baza unei reacții de tip antigen-anticorp. Amestecul de proteine este separat prin electroforeză, pe baza greutății lor moleculare. Rezultatele sunt transferate pe o membrană nitrocelulozică, rezultând benzile specifice fiecărei proteine. Membrana este apoi incubată cu anticorpii specifici proteinei de interes. Anticorpii nelegați sunt spălați, în timp ce cei legați sunt identificați prin developarea filmului (Mahmood și Yang, 2012).

Fracțiile proteice au fost obținute prin lizarea celulelor în tampon HEPES-CHAPS (2 % CHAPS în 50 mM/L HEPES, 200 mM/L NaCl, pH 7,34; Sigma-Aldrich, Inc) și un mix de inhibitori de proteaze (Roche) și au fost lăsate timp de 30 de minute pe gheață pentru lizare. Ulterior, probele (cate 50 μg și cate 100 μg) au fost supuse electroforezei în gel de poliacrilamidă 8%, după care au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză (Santa Cruz Biotechnology). Membrana nitrocelulozică a fost tratată peste noapte cu o soluție de lapte degresat 10% la temperatura camerei. A doua zi, membrana a fost scufundată într-o soluție conținând anticorpul TRPA1 la o diluție de 1:300 în lapte degresat și PBS și a fost lăsată timp de o oră la incubat pe agitator la temperatura camerei. Ulterior s-a spălat membrana de 4 ori cate 5 minute cu o soluție de PBS-Tween 20. S -a adăugat anticorpul secundar „goat-anti-rabbit” la o diluție de 1:1000 în PBS-Tween 20 și laptele degresat. S-a mai lăsat membrana o oră la incubat pe agitator la temperatura camerei, după care s-a spălat de 3 ori câte 10 minute cu soluția de PBS-Tween 20. În ultima etapă, membrana impregnată cu proteina de interes a fost supusă detecției chemiluminescente pentru a se obține benzile proteice.

CAPITOLUL III. REZULTATE ȘI DISCUȚII

Rezultate

În urma experimentelor realizate, datele obținute se referă la expresia canalului TRPA1 în celulele izolate din ADK, precum și asupra rolulului pe care acesta îl are în migrația celulară, atât în stare glicozilată, cât și în stare deglicozilată.

Expresia canalului ionic TRPA1 în celulele ADK

Prin tehnica Western-Blot, am urmărit expresia canalului ionic TRPA1 în linia celulară Panc-1 două condiții: condiția de control, când celulele au fost menținute doar în mediul de cultură specific DMEM și în condiția în care mediul a fost suplimentat cu brefeldina A, inhibitor al glicozilării. În figura 8 este prezentat rezultatul analizei Western-Blot pentru linia celulară pancreatică tumorală Panc-1. În aceste celule s-a observat o expresie puternică a proteinei TRPA1. De asemenea, se observă că în prezența brefeldinei A expresia scade, ceea ce ar pute indica o deglicozilare a proteinei.

Acest experiment s-a realizat în mod similar cu cel făcut în anul 2014 de Cucu și colaboratorii și în anul 2017 de către Ulăreanu și colaboratorii. Ei au urmărit expresia canalului ionic TRPM8 în celulele tumorale ale ADK, utilizând tehnica Western-Blot și demonstrând faptul că acesta se găsește în formă deglicozilată. În acest caz, brefeldina A are efect asupra expresiei proteice, ceea ce indică faptul că TRPA1, spre deosebire de TRPM8, este exprimată în stare glicozilată în celulele Panc-1.

Rolul canalului ionic TRPA1 în migrația celulelor ADK

Scopul experimentului de migrație celulară prin metoda ”Wound-Healing” a fost de a identifica rolul pe care canalul TRPA1 l-ar putea avea, în procesul de tumorigeneză și în apariția metastazelor. De asemenea, am urmărit cum influențează starea de glicozilare a proteinei aceste mecanisme. Pentru a vedea efectele canalului atât în stare glicozilată, cât și în stare deglicozilată, am utilizat brefeldina A, care inhibă această modificare post-translațională. Metoda a fost aplicată pe 4 linii celuare izolate din adenocarcinom pancreatic ductal: Panc-1, MiaPaCa-2, BxPc3 și PK-9. Astfel, pentru fiecare linie celulară în parte am avut două condiții: control (netratate), cand celulele au fost cultivate în mediul lor specific și respectiv tratate, când celulele au fost cultivate în mediu de cultură suplimentat cu brefeldina A 5g/ml timp de 20 de ore.

Am realizat poze pentru monitorizarea migrației imediat după ce s-a facut scratch-ul (la 0 ore), apoi după 20 de ore. Am utilizat programul ImageJ pentru a măsura suprafața „rănii”. Pentru analiza statistică a datelor am folosit programul OriginPro, testul Two-Sample Student T-Test.

Migrația liniei celulare Panc-1

Celulele din linia Panc-1 au fost cultivate în șase vase Petri cu diametrul de 24mm, la o densitate de 3×105 celule/mL. În momentul atingerii confluenței de 100%, s-a trasat cu vârful unei micropipete de 20L o ”zgârietură” în mijlocul ficărui vas. Trei dintre acestea au reprezentat grupul de control (netratate cu brefeldina A), celulele fiind cultivate în mediul de cultură specific. Celelalte trei au reprezentat grupul tratatelor, celulele fiind cultivate în mediu suplimentat cu brefeldina A. Astfel, celulelor din grupul de control le-a fost adăugat 1mL mediul de cultură specific, iar celor din grupul de tratate li s-a adăugat 1mL mediu de cultură suplimentat cu brefeldină A 5g/mL, utilizată pentru deglicozilare.

Pentru monitorizarea migrației celulare, am realizat 968 de poze imediat după trasarea ”scracht-ului” (la 0 ore), apoi după 20 de ore, folosind un microscop Nikon Eclipse TS100 cu obiectivul 10x și software-ul Ueyesetup (uEye Cockpit). S-a observat o diferență între cele două condiții, în ceea ce privește motilitatea celulară, însă nu foarte mare.

În figura 9 am prezentat poze de monitorizare a migrației celulare, pentru a evidenția diferența dintre motilitatea celulelor din grupul control și motilitatea celulelor tratate. Astfel, sunt figurate două experimente de migrație tipice pentru grupul de celule netratate (A) și pentru grupul de celule tratate cu 5g/mL brefeldina A timp de 20 de ore (B).

Încă din acest stadiu al experimentului s-a putut observa o ușoară diferență între motilitatea celulelor care prezintă canalul TRPA1 glicozilat, față de cele care prezintă proteina deglicozilată, dar această diferență nu este semnificativă. În vasul aparținând grupului control, „rana”, sau ”scratch-ul” este acoperit într-o proporție mai mare decât în cele tratate.

În figura 10 am prezentat graficele care ilustrează rezultatele statistice ale experimentelor de migrație realizate pe linia celulară Panc-1. Acestea au fost realizate utilizând software-ul OriginPro8 și testul Two-Sample Student T-Test.

După 20 de ore, scratch-ul din vasele netratate cu brefeldina A a fost acoperit în proporție de 90,09%3,92, iar cel din vasele tratate în proporție de 83,470,20%.

Migrația liniei celulare MiaPaCa-2

Celulele liniei MiaPaCa-2 au fost cultivate în șase vase Petri cu diametrul de 24mm, la densitatea 3×105 celule/mL. Când s-a ajuns la confluența de 100%, cu vârful unei micropipete de 20L s-a realizat ”scratch-ul”. Trei dintre aceste șase vase au reprezentat grupul control, celelalte trei urmând să fie tratate cu brefeldina A 5g/ml. Astfel, celulelor din grupul de control le-a fost adăugat 1mL mediul de cultură specific, iar celor din grupul de tratate li s-a adăugat 1mL mediu de cultură suplimentat cu brefeldină A 5g/mL, utilizată pentru deglicozilare.

Pozele pentru monitorizarea migrației celulare s-au realizat imediat dupa trasarea ”zgârieturii”, la 0h, apoi după 20h folosind un microscop Nikon Eclipse TS100 cu obiectivul 10x și software-ul Ueyesetup (uEye Cockpit).

În figura 11 am prezentat poze de monitorizare a migrației celulare. Se observă două experimente de migrație tipice pentru grupul de celule netratate (A) și pentru grupul de celule tratate cu 5g/mL brefeldina A timp de 20 de ore (B).

Din pozele pentru monitorizarea ratei de migrație a liniei celulare MiaPaCa-2, se poate observa cum ”rana” este acoperită mai mult în vasele control, cu celule netratate, spre deosebire de vasele cu celule tratate.

În figura 12 sunt prezentate graficele care ilustrează rezultatele statistice ale experimentelor de migrație pentru linia celulară tumorală MiaPaCa-2. Acestea au fost realizate utilizând software-ul OriginPro8 și testul Two-Sample Student T-Test.

Dupa 20 de ore, ”rana” din vasele grupului control, cu celule netratate, a fost acoperită în proporție de 25,798,72%, în timp ce în vasele celulelor tratate cu brefeldina A, „rana” a fost acoperită în proporție de 7,511,18%.

Diferența dintre rata migrației celulelor netratate și celulelor tratate cu brefeldina A este mai mare în linia MiaPaCa-2, față de Panc-1.

Migrația liniei celulare PK-9

Celulele din linia PK-9 au fost cultivate în șase vase Petri cu diametrul de 24mm, la o densitate de 3×105 celule/mL. În momentul atingerii confluenței de 100%, s-a trasat cu vârful unei micropipete de 20L o ”zgârietură” în mijlocul ficărui vas. Trei dintre acestea au reprezentat grupul de control, celulele fiind cultivate în mediul de cultură specific. Celelalte trei vase au fost tratate cu brefeldina A, pentru deglicozilare. Astfel, celulelor din grupul de control le-a fost adăugat 1mL mediul de cultură specific, iar celor din grupul de tratate li s-a adăugat 1mL mediu de cultură suplimentat cu brefeldină A 5g/mL.

Migrația a fost monitorizată prin realizarea pozelor la momentul inițial, imediat după trasarea ”scratch-ului”, apoi după 20h, folosind un microscop Nikon Eclipse TS100 cu obiectivul 10x și programul Ueyesetup (uEye Cockpit). Se observă două experimente de migrație tipice pentru grupul de celule netratate (A) și pentru grupul de celule tratate cu 5g/mL brefeldina A timp de 20 de ore (B).

În figura 13 am prezentat poze realizate pentru monitorizarea migreției celulelor PK-9. Se poate observa cum migrația celulelor din grupul control este mai intensă, după 20 de ore acoperindu-se aproape toată „rana”, în timp ce în grupul tratatelor motilitatea celulară este mai redusă.

În figura 14 sunt prezentate graficele care ilustrează datele statistice obținute în urma experimentului de migrație, în linia celulară PK-9. Acestea au fost realizate utilizând software-ul OriginPro8 și testul Two-Sample Student T-Test.

Dupa 20 de ore, ”rana” din vasele grupului control, cu celule netratate, a fost acoperită în proporție de 45,811,49% în timp ce în vasele celulelor tratate cu brefeldina A, „rana” a fost acoperită în proporție de 18,964,92%.

În cazul liniei celulare PK-9, spre deosebire de liniile Panc-1 și MiaPaCa-2, s-a observat o diferența mai mare între rata de migrație a celulelor din grupul control față de cele tratate cu brefeldina A.

Migrația liniei celulare BxPC-3

Celulele din linia BxPC-3 au fost cultivate în șase vase Petri de 24mm, la o densitate de 3×105 celule/mL. Când s-a atins confluența de 100%, s-a trasat cu vârful unei micropipete de 20L o ”zgârietură” în mijlocul ficărui vas.

Cele șase vase au fost apoi îmărțite în două grupuri: control și tratat. Celulele din grupul control au fost cultivate în mediul de cultură specific, în timp celelalte au fost tratate cu brefeldina A 5g/mL, inhibator al glicozilării. Astfel, celulelor din grupul de control le-a fost adăugat 1mL mediul de cultură specific, iar celor din grupul de tratate li s-a adăugat 1mL mediu de cultură suplimentat cu brefeldină A.

Migrația a fost monitorizată prin realizarea pozelor la momentul inițial, imediat după trasarea ”scratch-ului”, apoi după 20h, folosind un microscop Nikon Eclipse TS100 cu obiectivul 10x și programul Ueyesetup (uEye Cockpit). În figura 15 am prezentat poze realizate unui vas din grupul control, cu celule netratate și unui vas cu celule tratete cu brefeldina A.

Din pozele figurii 15 se poate observa cum migrația celulelor din grupul control este mai intensă, după 20 de ore acoperindu-se aproape toată „rana”, în timp ce în grupul tratatelor este mai redusă.

În figura 16 sunt prezentate graficele care ilustrează datele statistice obținute în urma experimentului de migrație, în linia celulară BxPC-3. Acestea au fost realizate utilizând software-ul OriginPro8 și testul Two-Sample Student T-Test.

Dupa 20 de ore, ”rana” din vasele grupului control, cu celule netratate, a fost acoperită în proporție de 54,1316,04%, în timp ce în vasele celulelor tratate cu brefeldina A, „rana” a fost acoperită în proporție de 22,081,29%.

În cazul liniei celulare BxPC-3, spre deosebire de liniile Panc-1, MiaPaCa-2 și PK-9, s-a observat o diferența mai mare între rata de migrație a celulelor din grupul control față de cele tratate cu brefeldina A.

Discuții

Canalul ionic TRPA1, singurul membru al subfamiliei TRPA, participă într-o multitudine de procese celulare, cu implicații mari în starea generală a organismului: senzația chimică nocivă, semnalizarea inflamatorie, senzația de durere fiziologică și fiziopatologică (Cvetkov et al., 2011) și răspunsul la produșii bacterieni nocivi, precum lipopolizaharidele sau endotoxinele produse de bacteriile Gram negative (Viana, 2016).

Canalul ionic TRPA1 pare să fie implicat si în cancer. S-a observat o transcriere a genei care codifică această proteină în celulele maligne ale cancerului de colon (Gautier et al., 2014) și în celulele carcinomului nasofaringian (Wu et al., 2016). În celule izolate din carcinomul pulmonar microcelular, tratamentul cu AITC, agonistul canalului TRPA1, favorizează supraviețuirea și proliferearea celulelor (Gautier et al., 2014).

La mamifere, TRPA1 conține două situsuri de glicozilare, înalt conservate, de-a lungul domeniului extracelular E1: Asn747 și Ans753. Absența glicanilor reduce sensibilitatea canalaluilui ionic TRPA1 la concentrații mai mici ale agoniștilor săi (Egan et al., 2016).

Glicozilarea, modificare post-translațională de adiție a zaharurilor la lipide și proteine, este implicată în procese precum: interacțiunea receptorilor, răspunsul imun, secreția (Scott și Panin, 2014). Printre efectele glicozilării asupra proteinelor se numără: direcționarea subcelulară a proteinelor, protecția lor împotriva denaturării și proteolizei, oferă rigiditate proteinelor, ajutându-le pe cele membranare să aibă orientarea corectă în dublul strat fosfolipidic (Voolstra și Huber, 2014). Glicanii pot potența funcțiile proteinelor. Ei facilitează stabilitatea proteinelor în membrana celulară, consolidează activitatea lor prin modificarea proprietăților biofizice, facilitează le plierea și trecerea la suprafața celulei (Scott și Panin, 2014). Au fost demonstrate modificări ale starii de glicozilare a proteinelor în anumite condiții, precum starea de boală sau gestația, devenind astfel un important marker molecular (Clerc et al., 2015).

În acest studiu am urmărit expresia canalului ionic TRPA1 în celule izolate din ADK și cum poate influența starea de glicozilare a acestuia procesul de migrație celulară. Prin analiza Wstern-Blot am observat faptul că proteina este exprimată în stare glicozilată în linia celulară Panc-1. Cu brefeldina A am deglicozilat canalul TRPA1, iar prin experimente de migrație celulară am putut observa diferențe între rolurile celor două stări ale proteinei în migrație. Astfel, am obținut rezultate conform cărora celulele tratate cu brefeldina A, agent deglicozilant, prezintă o rată de migrație mai mică față de celulele netratate. Între cele patru linii celulare utilizate în experimentele de migrație, am observat diferențe în ceea ce privește rata migrației în vasele cu celule tratate față de cele control. Cea mai mare diferență între control și tratate a fost observață în linia celulară BxPC-3, unde „scratch-ul” a fost acoperit în proporție de 54,13% în vasele cu celule netratate și 19% în vasele cu celule tratate cu brefeldina A. În linia celulară Panc-1 s-a observat cea mai mică diferență între vasele cu celule tratate și vasele din grupul control, în ceea ce privește rata migrației. În vasele control, „rana” a fost acoperită în proporție de 90%, iar în vasele cu celule tratate în proporție de 83,5%.

Așadar, din rezultatele obținute în urma experimentelor de migrație, putem deduce faptul că starea de glicozilare ar putea avea rol în migrația celulară și în apariția metastazelor. Se pare ca această modificare post-translațională sporește migrația celulară.

CAPITOLUL IV. CONCLUZII

În urma acestui studiu, pe baza din literatură și pe baza experimentelor realizate anterior în laborator, în cadrul Departamentului de Anatomie, Fiziologie și Biofizică, se pot rezuma câteva idei și, de asemenea, se pot indica câteva perspective de studiu:

Canalul ionic TRPA1 este exprimat în stare glicozilată în celulele tumoarele ale liniei Panc-1, izolate din adenocarcinomul pancreatic ductal. Modul în care variază nivelul exprimării lui și în alte tipuri de cancer reprezintă un obiectiv pentru studii viitoare.

Canalul ionic TRPA1 este implicat în cancer, în migrația celulară. Această funcție poate fi influențată de starea de glicozilare a proteinei. În celulele tratate cu brefeldina A, agent deglicozilant, s-a observat o scădere a ratei migrației față de cele netratate. Analizarea modificărilor post-translaționale și modul în care influențează funcțiile proteinelor ar putea reprezenta un obiectiv de stiudiu în certare.

În adenocarcinomul pancreatic ductal, proteinele membranare pot reprezenta markeri importanți în ceea ce privește diagnosticarea, stabilirea gradului de dezvoltare a bolii și, de asemenea, ținte terapeutice. În cazul în care se va observa supraexprimarea acestui canal și la pacienții cu ADK, se va putea determina rolul de prognostic al acestei proteine membranare.

BIBLIOGRAFIE

Aarts, M. et al. (2003) „A Key Role for TRPM7 Channels in Anoxic Neuronal Death”, Cell, 115(7), pp. 863-877. doi: 10.1016/S0092-8674(03)01017-1.

Ahmmed, G. U. et al. (2004) „Protein kinase Cα phosphorylates the TRPC1 channel and regulates store-operated Ca2+entry in endothelial cells”, Journal of Biological Chemistry, 279(20), pp. 20941-20949. doi: 10.1074/jbc.M313975200.

Alberts, B. et al. (2002) Molecular Biology of the Cell, Fourth Edition, Molecular Biology. doi: citeulike-article-id:691434.

Benemei, S. et al. (2014) „The TRPA1 channel in migraine mechanism and treatment”, British Journal of Pharmacology, pp. 2552-2567. doi: 10.1111/bph.12512.

Berg, K. D. et al. (2015) „TRPM4 protein expression in prostate cancer: a novel tissue biomarker associated with risk of biochemical recurrence following radical prostatectomy.”, Virchows Archiv : an international journal of pathology. doi: 10.1007/s00428-015-1880-y.

Caceres, A. I. et al. (2009) „A sensory neuronal ion channel essential for airway inflammation and hyperreactivity in asthma”, Proceedings of the National Academy of Sciences. doi: 10.1073/pnas.0900591106.

Cai, Y. et al. (2004) „Calcium Dependence of Polycystin-2 Channel Activity Is Modulated by Phosphorylation at Ser812”, Journal of Biological Chemistry, 279(19), pp. 19987-19995. doi: 10.1074/jbc.M312031200.

Cancer Research UK (2014) „Cancer Research UK Cancer incidence statistics”, CancerResearchUK.

Chen, J. și Hackos, D. H. (2015) „TRPA1 as a drug target – Promise and challenges”, Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology, pp. 451-463. doi: 10.1007/s00210-015-1088-3.

Chen, Y. (2013) „Scratch Wound Healing Assay”, Journal of Chemical Information and Modeling. doi: 10.1017/CBO9781107415324.004.

Clerc, F. et al. (2015) „Human plasma protein N-glycosylation”, Glycoconjugate Journal, pp. 1-35. doi: 10.1007/s10719-015-9626-2.

da Costa, D. S. M. et al. (2010) „The involvement of the transient receptor potential A1 (TRPA1) in the maintenance of mechanical and cold hyperalgesia in persistent inflammation”, Pain, 148(3), pp. 431-437. doi: 10.1016/j.pain.2009.12.002.

Cucu, D. et al. (2014) „Characterization of functional transient receptor potential melastatin 8 channels in human pancreatic ductal adenocarcinoma cells”, Pancreas, 43(5), pp. 795-800. doi: 10.1097/MPA.0000000000000106.

Cui, C. et al. (2017) „Targeting calcium signaling in cancer therapy”, Acta Pharmaceutica Sinica B, pp. 3-17. doi: 10.1016/j.apsb.2016.11.001.

Cvetkov, T. L. et al. (2011) „Molecular architecture and subunit organization of TRPA1 ion channel revealed by electron microscopy”, Journal of Biological Chemistry, 286(44), pp. 38168-38176. doi: 10.1074/jbc.M111.288993.

Dietrich, A. et al. (2003) „N-Linked Protein Glycosylation Is a Major Determinant for Basal TRPC3 and TRPC6 Channel Activity”, Journal of Biological Chemistry. doi: 10.1074/jbc.M302983200.

Du, G. J. et al. (2014) „The combination of TRPM8 and TRPA1 expression causes an invasive phenotype in lung cancer”, Tumor Biology, 35(2), pp. 1251-1261. doi: 10.1007/s13277-013-1167-3.

Ducreux, M. et al. (2015) „Cancer of the pancreas: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up”, Annals of Oncology. doi: 10.1093/annonc/mdv295.

Egan, T. J. et al. (2016) „Effects of N-glycosylation of the human cation channel TRPA1 on agonist-sensitivity”, Bioscience Reports, 36(5), pp. e00390-e00390. doi: 10.1042/BSR20160149.

Embark, H. M. et al. (2004) „Regulation of the epithelial Ca 2+ channel TRPV5 by the NHE regulating factor NHERF2 and the serum and glucocorticoid inducible kinase isoforms SGK1 and SGK3 expressed in xenopus oocytes”, Cellular Physiology and Biochemistry, 14(4-6), pp. 203-212. doi: 10.1159/000080329.

Gautier, M. et al. (2014) „New insights into pharmacological tools to TR(i)P cancer up”, British Journal of Pharmacology, pp. 2582-2592. doi: 10.1111/bph.12561.

H. Jiang, L., Gamper, N. și J. Beech, D. (2011) „Properties and Therapeutic Potential of Transient Receptor Potential Channels with Putative Roles in Adversity: Focus on TRPC5, TRPM2 and TRPA1”, Current Drug Targets. doi: 10.2174/138945011795378568.

Han, H. și Yi, F. (2014) „New insights into TRP channels: Interaction with pattern recognition receptors”, Channels, pp. 13-19. doi: 10.4161/chan.27178.

Hanahan, D. și Weinberg, R. A. (2011) „Review Hallmarks of Cancer : The Next Generation”, Cell, 144(5), pp. 646-674. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013.

Helms, J. B. și Rothman, J. E. (1992) „Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF”, Nature, 360(6402), pp. 352-354. doi: 10.1038/360352a0.

Hinard, V. et al. (2016) „ICEPO: The ion channel electrophysiology ontology”, Database, 2016. doi: 10.1093/database/baw017.

Hisatsune, C. et al. (2004) „Regulation of TRPC6 Channel Activity by Tyrosine Phosphorylation”, Journal of Biological Chemistry, 279(18), pp. 18887-18894. doi: 10.1074/jbc.M311274200.

Hofherr, A. et al. (2014) „N-glycosylation determines the abundance of the transient receptor potential channel TRPP2”, Journal of Biological Chemistry, 289(21), pp. 14854-14867. doi: 10.1074/jbc.M114.562264.

Huang, X. și Jan, L. Y. (2014) „Targeting potassium channels in cancer”, Journal of Cell Biology, pp. 151-162. doi: 10.1083/jcb.201404136.

Jiang, H.-N. et al. (2013) „Involvement of TRPC Channels in Lung Cancer Cell Differentiation and the Correlation Analysis in Human Non-Small Cell Lung Cancer”, PLoS ONE, 8(6), p. e67637. doi: 10.1371/journal.pone.0067637.

Jung, J. et al. (2004) „Phosphorylation of Vanilloid Receptor 1 by Ca2+/Calmodulin-dependent Kinase II Regulates Its Vanilloid Binding”, Journal of Biological Chemistry, 279(8), pp. 7048-7054. doi: 10.1074/jbc.M311448200.

Kaneko, Y. și Szallasi, A. (2014) „Transient receptor potential (TRP) channels: A clinical perspective”, British Journal of Pharmacology, pp. 2474-2507. doi: 10.1111/bph.12414.

Laeseke, P. F. et al. (2015) „Combining in Vitro Diagnostics with in Vivo Imaging for Earlier Detection of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma: Challenges and Solutions”, Radiology, 277(3), pp. 644-661. doi: 10.1148/radiol.2015141020.

Lehen’Kyi, V. și Prevarskaya, N. (2011) „Oncogenic TRP channels”, în Advances in Experimental Medicine and Biology, pp. 929-945. doi: 10.1007/978-94-007-0265-3_48.

Mahmood, T. și Yang, P. C. (2012) „Western blot: Technique, theory, and trouble shooting”, North American Journal of Medical Sciences. doi: 10.4103/1947-2714.100998.

Marsakova, L. et al. (2017) „The First Extracellular Linker Is Important for Several Aspects of the Gating Mechanism of Human TRPA1 Channel”, Frontiers in Molecular Neuroscience, 10. doi: 10.3389/fnmol.2017.00016.

Meents, J. E., Fischer, M. J. M. și McNaughton, P. A. (2017) „Sensitization of TRPA1 by Protein Kinase A”, PLoS ONE, 12(1). doi: 10.1371/journal.pone.0170097.

Nassini, R. et al. (2015) „Transient receptor potential ion channels in primary sensory neurons as targets for novel analgesics”, British Journal of Pharmacology, 172(13), pp. 3397-3411. doi: 10.1111/bph.13129.

Nielsen, N., Lindemann, O. și Schwab, A. (2014) „TRP channels and STIM/ORAI proteins: Sensors and effectors of cancer and stroma cell migration”, British Journal of Pharmacology, pp. 5524-5540. doi: 10.1111/bph.12721.

Niemeyer, B. A. et al. (2001) „Competitive regulation of CaT-like-mediated Ca2+ entry by protein kinase C and calmodulin”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(6), pp. 3600-3605. doi: 10.1073/pnas.051511398.

Nilius, B. et al. (2005) „Regulation of the Ca2+ sensitivity of the nonselective cation channel TRPM4”, Journal of Biological Chemistry, 280(8), pp. 6423-6433. doi: 10.1074/jbc.M411089200.

Nilius, B. și Owsianik, G. (2011) „The transient receptor potential family of ion channels”, Genome Biol, 12(3), p. 218. doi: 10.1186/gb-2011-12-3-218.

Ohtsubo, K. și Marth, J. D. (2006) „Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease”, Cell, pp. 855-867. doi: 10.1016/j.cell.2006.08.019.

Palovcak, E. et al. (2015) „Comparative sequence analysis suggests a conserved gating mechanism for TRP channels”, The Journal of General Physiology, 146(1), pp. 37-50. doi: 10.1085/jgp.201411329.

Pan, S., Brentnall, T. A. și Chen, R. (2016) „Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer”, World Journal of Gastroenterology. doi: 10.3748/wjg.v22.i42.9288.

Patapoutian, A., Tate, S. și Woolf, C. J. (2009) „Transient receptor potential channels: Targeting pain at the source”, Nature Reviews Drug Discovery, pp. 55-68. doi: 10.1038/nrd2757.

Pertusa, M. et al. (2012) „N-glycosylation of TRPM8 ion channels modulates temperature sensitivity of cold thermoreceptor neurons”, Journal of Biological Chemistry, 287(22), pp. 18218-18229. doi: 10.1074/jbc.M111.312645.

Premkumar, L. S. (2014) „Transient receptor potential channels as targets for phytochemicals”, ACS Chemical Neuroscience, pp. 1117-1130. doi: 10.1021/cn500094a.

Prevarskaya, N., Zhang, L. și Barritt, G. (2007) „TRP channels in cancer”, Biochim Biophys Acta. doi: 10.1016/j.bbadis.2007.05.006.

PubChem (2016) PubChem Compound, National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine. doi: CID=445639.

Santoni, G., Farfariello, V. și Amantini, C. (2011) „TRPV channels in tumor growth and progression”, în Advances in Experimental Medicine and Biology, pp. 947-967. doi: 10.1007/978-94-007-0265-3_49.

Scott, H. și Panin, V. (2014) „N-glycosylation in Regulation of the Nervous System”, Advances in Neurobiology, 9, pp. 367-394. doi: 10.1007/978-1-4939-1154-7_17.

Shin, J.-B. et al. (2005) „Xenopus TRPN1 (NOMPC) localizes to microtubule-based cilia in epithelial cells, including inner-ear hair cells.”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. doi: 10.1073/pnas.0502403102.

Sousa-Valente, J. et al. (2014) „Transient receptor potential ion channels in primary sensory neurons as targets for novel analgesics”, British Journal of Pharmacology, pp. 2508-2527. doi: 10.1111/bph.12532.

Sternfeld, L. et al. (2005) „Tyrosine phosphatase PTP1B interacts with TRPV6 in vivo and plays a role in TRPV6-mediated calcium influx in HEK293 cells”, Cellular Signalling, 17(8), pp. 951-960. doi: 10.1016/j.cellsig.2004.11.012.

Stokes, A. J. et al. (2004) „A TRPV2–PKA Signaling Module for Transduction of Physical Stimuli in Mast Cells”, The Journal of Experimental Medicine, 200(2), pp. 137-147. doi: 10.1084/jem.20032082.

Stopczynski, R. E. et al. (2014) „Neuroplastic changes occur early in the development of pancreatic ductal adenocarcinoma”, Cancer Research, 74(6), pp. 1718-1727. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-13-2050.

Stowell, S. R., Ju, T. și Cummings, R. D. (2015) „Protein Glycosylation in Cancer”, Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, 10(1), pp. 473-510. doi: 10.1146/annurev-pathol-012414-040438.

Syam, N., Rougier, J.-S. și Abriel, H. (2014) „Glycosylation of TRPM4 and TRPM5 channels: molecular determinants and functional aspects”, Frontiers in Cellular Neuroscience, 8. doi: 10.3389/fncel.2014.00052.

Ulăreanu, R. et al. (2017) „N-glycosylation of the transient receptor potential melastatin 8 channel is altered in pancreatic cancer cells”, Tumor Biology, 39(10), pp. 1-10. doi: 10.1177/1010428317720940.

Vazquez, G. et al. (2004) „Obligatory role of Src kinase in the signaling mechanism for TRPC3 cation channels”, Journal of Biological Chemistry, 279(39), pp. 40521-40528. doi: 10.1074/jbc.M405280200.

Vellani, V. et al. (2001) „Protein kinase C activation potentiates gating of the vanilloid receptor VR1 by capsaicin, protons, heat and anandamide”, Journal of Physiology, 534(3), pp. 813-825. doi: 10.1111/j.1469-7793.2001.00813.x.

Venkatachalam, K. și Montell, C. (2007) „TRP Channels”, Annual Review of Biochemistry, 76(1), pp. 387-417. doi: 10.1146/annurev.biochem.75.103004.142819.

Viana, F. (2016) „TRPA1 channels: molecular sentinels of cellular stress and tissue damage”, Journal of Physiology, 594(15), pp. 4151-4169. doi: 10.1113/JP270935.

Voolstra, O. și Huber, A. (2014) „Post-Translational Modifications of TRP Channels”, Cells, 3(2), pp. 258-287. doi: 10.3390/cells3020258.

Wang, L. et al. (2012) „Identification of in vivo disulfide conformation of TRPA1 ion channel”, Journal of Biological Chemistry. doi: 10.1074/jbc.M111.329748.

Wang, Y. J. et al. (2012) „Development of macrolide lactone antibiotic brefeldin A fermentation process with Eupenicillium brefeldianum ZJB082702”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 114(3), pp. 262-267. doi: 10.1016/j.jbiosc.2012.04.006.

WHO (2017) Cancer fact sheet, WHO media center – Cancer fact sheet. Valabil la: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/.

Wolfgang, C. L. et al. (2013) „Recent progress in pancreatic cancer”, CA: A Cancer Journal for Clinicians, 63(5), pp. 318-348. doi: 10.3322/caac.21190.

Woo, S. K. et al. (2013) „Complex n-Glycosylation stabilizes surface expression of transient receptor potential melastatin 4b protein”, Journal of Biological Chemistry, 288(51), pp. 36409-36417. doi: 10.1074/jbc.M113.530584.

Wu, Y. T. et al. (2016) „Overexpression of transient receptor protein cation channel subfamily a member 1, confers an independent prognostic indicator in nasopharyngeal carcinoma”, Journal of Cancer, 7(10), pp. 1181-1188. doi: 10.7150/jca.15326.

Xu, F., Satoh, E. și Iijima, T. (2003) „Protein kinase C-mediated Ca2+ entry in HEK 293 cells transiently expressing human TRPV4.”, British journal of pharmacology, 140(2), pp. 413-421. doi: 10.1038/sj.bjp.0705443.

Yao, X., Kwan, H. Y. și Huang, Y. (2006) „Regulation of TRP channels by phosphorylation”, NeuroSignals, pp. 273-280. doi: 10.1159/000093042.

Yue, Z. et al. (2015) „Role of TRP channels in the cardiovascular system”, American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology, 308(3), pp. H157-H182. doi: 10.1152/ajpheart.00457.2014.

Zheng, J. (2013) „Molecular mechanism of TRP channels”, Comprehensive Physiology, 3(1), pp. 221-242. doi: 10.1002/cphy.c120001.