MAROSVÁSÁRHELYI ORVOSI ÉS GYÓGYSZERÉSZETI EGYETEM [304327]

MAROSVÁSÁRHELYI ORVOSI ÉS GYÓGYSZERÉSZETI EGYETEM

GYÓGYSZERÉSZETI KAR

IPARI GYÓGYSZERÉSZET ÉS GYÓGYSZERÉSZETI MENEDZSMENT TANSZÉK

FENOFIBRÁT TARTALMÚ NANOSZÁLAK ELŐÁLLÍTÁSA ÉS VIZSGÁLATA

Témavezetők:

Dr. Sipos Emese egyetemi tanár

Dr. Szabó Zoltán-István egyetemi adjunktus

Készítette:

Csatári Tamás-Dániel

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

TÎRGU MUREȘ

FACULTATEA DE FARMACIE

DISCIPLINA DE INDUSTRIA MEDICAMENTULUI ȘI MANAGEMENT FARMACEUTIC

PREPARAREA ȘI ANALIZA UNOR NANOFIBRE CU CONȚINUT DE FENOFIBRAT

Coordonatori științifici:

Prof. dr. Sipos Emese

Șef Lucr. dr. Szabó Zoltán-István

Absolvent: [anonimizat]ári Tamás-Dániel

Cuprins

1 PARTEA GENERALĂ 2

1.1 Fenofibrat – Generalități 2

1.1.1 Introducere 2

1.1.2 Fenofibratul – [anonimizat] 2

1.1.3 Caracteristici farmacocinetice și farmacologice 3

1.2 Solubilitate și creșterea solubilității 3

1.3 Creșterea solubilității prin utilizarea nanofibrelor 4

2 [anonimizat] 6

2.1 Materiale și metode 6

2.2 Rezultate și discuții 8

2.2.1 Determinarea morfologiei nanofibrelor 8

2.2.2 Rezultatele analizelor DSC 8

2.2.3 Dozarea substanței active din nanofibre 9

2.2.4 Rezultatele testelor de dizolvare in vitro 10

2.2.5 Concluzii 12

[anonimizat]. Aceste medicamente sunt utilizate pentru reducerea concentrațiilor de grăsimi (lipide) [anonimizat], grăsimile cunoscute sub denumirea de trigliceride.

Fenofibratul – [anonimizat] (logP=5,3), neavând grupări ionizabile în structură( Figura 1.1.2.1). Fenofibratul este practic insolubil în apă (0.3 µg/ml 25 °C), [anonimizat], Tween, Span, dimetilsulfoxid și dimetilformamidă.

Figura 1.1.2.1 – Structura fenofibratului

Dozarea substanței active se poate efectua spectrofotometric în UV (de obicei la 290 nm) sau prin metode cromatografice.

Caracteristici farmacocinetice și farmacologice

Indicațiile fenofibratului include: hipercolesterolemie, [anonimizat], hiperlipidemie (hipertrigliceridemie) endogenă și hiperlipemie mixtă ([anonimizat], III, IV și V)

Mecanism de acțiune: [anonimizat] a profilului lipidic prin mediarea receptorului PPARα (Peroxisome Proliferator Activated Receptor type α). Ca urmare a [anonimizat] a moleculelor bogate în trigliceride prin activarea lipoprotein lipazei și prin scăderea sintezei de apoproteină C III. De asemenea se induce și o creștere a sintezei apoproteinelor A I și A II. Aceste efecte menționate ale fenofibratului asupra lipoproteinelor determină o scădere a fracțiilor lipidice cu densitate mică și foarte mică (LDL și VLDL) care conțin apoproteina B și o creștere a fracțiunii de lipoproteine cu densitate mare (HDL), care conține apoproteinele A I și A II.

Farmacocinetica: Concentrațiile plasmatice maxime (C max) sunt atinse după 4-5 ore de la administrarea orală. [anonimizat]. Absorbția fenofibratului este crescută în cazul administrării cu alimente.

Solubilitate și creșterea solubilității

Solubilitatea reprezintă valoarea concentrației unei soluții saturate în care substanța dizolvată este în exces. Aceasta este o caracteristică fizico-chimică importantă a substanțelor active care afectează absorpția, dizolvarea și biodisponibilitatea acestora.

Fenofibratul face parte din categoria a II-a din sistemul BCS ( clasificare biofarmaceutică, în engleză Biopharmaceutical Classification System), fiind caracterizat de o solubilitate scăzută și capacitate bună de penetrare a membranelor biologice. Biodisponibilitatea scăzută și altfel absorpția limitată a fenofibratului sunt consecințe directe a solubilității scăzute a acestuia, iar o creștere a solubilității ar putea îmbunătăți biodisponibilitatea acestui medicament.

Creșterea solubilității prin utilizarea nanofibrelor

În literatura de specialitate putem găsi numeroase metode pentru creșterea solubilității substanțelor active. Unul dintre metodele mai noi, introduse și în această arie de cercetare sunt utilizarea unor structuri nanofibroase.

Pentru a crește solubilitatea și rata de dizolvare a fenofibratului am ales metoda electrostatică (electrospinning), care este probabil și cea mai utilizată tehnică pentru obținerea nano- respectiv microfibrelor. Metoda necesită un dispozitiv simplu care constă din: seringă, ac, colector(de obicei o folie de aluminiu), pompă de seringă și o sursă de curent continuu.

Soluția sau topitura utilizată trebuie să aibă proprietăți vîsco-elastice pentru ca metoda să funcționeze. Această soluție, împreună cu subtanța activă se introduce într-o seringă prevăzută cu ac, iar la o distanță predeterminată se așează colectorul. Între acești doi poli se aplică o tensiune electrică care va inițializa și va susține procesul de electrofilare.

Din cauza posibilității de amorfizare a principiilor active, respectiv datorită suprafeței specifice mari, nano- și microfibrele sunt foarte des folosite ca vectori medicamentoși pentru substanțe active greu solubile. În tabelul 1.3.1 am enumerat parametrii care pot afecta morfologia acestor fibre, inclusiv procesul de formare de perle și diametrul lor.

Tabelul 1.3.1 – Parametrii care pot afecta morfologia fibrelor

PARTEA EXPERIMENTALĂ – CONTRIBUȚII PROPRII

Solubilitatea scăzută a fenofibratului, împreună cu o variabilitate foarte mare în absorbție a fenofibratului ne-a îndemnat la cercetarea unor forme farmaceutice care ar oferi o biodisponibilitate mai mare pentru substanța activă și ar implica probabil și reducerea dozei agentului hipolipemiant.

Fiindcă dispun de o suprafață specifică mare, nanofibrele polimerice influențează în mod favorabil viteza de dizolvare a substanțelor active, pe lângă proprietatea lor de a amorfiza și stabiliza această formă. Astfel, lucrarea experimentală de față a fost concepută pentru a încorpora fenofibratul într-o structură nanofibroasă pe bază de polivinilpirolidonă pentru a crește solubilitatea substanței active și rata de dizolvare a acestuia care ar duce la o absorbție mai bună.

Materiale și metode

Tabelul 2.1.1 – Materiale utilizate în formarea nanofibrelor

Ca prim pas în formarea nanofibrelor, am dizolvat 0,2 g de fenofibrat în 0,5 Tween 80, apoi am adăugat 2,4 g de PVP și 6 ml de metanol. Am lăsat 15 minute într-un agitator magnetic la 500 rpm pentru a obține o soluție omogenă.

Soluția obținută am turnat-o în seringă, între ac și colector am aplicat o tensiune electrică (20 kV) și după 15 minute am luat de pe colector fibrele produse. Distanța ac-colector a fost de 7,5 cm, iar debitul soluției era de 0,7 ml/oră. Probele obținute au fost desprinse de pe folia de aluminiu, au fost măsurate și au fost păstrate la temperatura camerei.

Studiul comparativ de dizolvare

Am efectuat două studii de dizolvare, una în soluție de 25 mM dodecilsulfat de sodiu (metoda propusă de FDA pentru comprimate cu fenofibrat) și una în apă. Condițiile de dizolvare au fost următoarele: Erweka DT-80 App.1(cu coșulețe), s-a cântărit aproximativ 120 mg de nanofibre, mediul de dizolvare: 500 mL, 25 mM dodecilsulfat de sodiu (sau apă), 100 rpm. Prelevarea probelor: câte 5 mL la 1, 3, 5, 10, 20, 30 min. Soluția a fost filtrată printr-un filtru cu membrană de 1,0 microni, iar cantitatea dizolvată a fost măsurată spectrofotometric în UV, la 289,3 nm.

Analiza termală (DSC)

Din nanofibre am luat câte o probă reprezentativă care a fost supusă unor analize prin DSC. Pe lângă probe am analizat atât substanța activă cât și polimerul. Analizele au fost efectuate între 30-160 ° C, cu o viteză de încălzire de 5 °C/min.

Determinarea diametrului nanofibrelor

Determinarea diametrului nanofibrelor a fost efectuată cu un microscop optic de tip LCD Micro 5 MP, prin măsurarea aleatorie a câte 50 de probe din imaginile capturate cu aparat cu ajutorul software-ului Image J prin utilizarea unor scăli standardizate.

Rezultate și discuții

Determinarea morfologiei nanofibrelor

Cu ajutorul microscopului optic am efectuat determinarea diametrului și a morfologiei fibrelor. Din Figura 2.2.1.1 putem observa că structura nanofibrelor este omogenă și fără perle, care ar indica un proces de electrofilare incomplet. Diametrul mediu al fibrelor a fost de 70.84 ±16.42 nm.

Figura 2.2.1.1 – Structura și dimensiunea nanofibrelor obținute din soluția de 40 % PVP, conținând fenofibrat, obținut la un debit de 0.7 mL/h și la o distanță de 7,5 cm între ac și colector

Rezultatele analizelor DSC

Pentru caracterizarea în stare solidă a nanofibrelor cu conținut de fenofibrat, am analizat separat nanofibrele obținute, polimerul și substanța activă prin analiză termală. Curbele DSC obținute sunt prezentate în Figura 2.2.2.1.

Figura 2.2.2.1 – Curbele DSC obținute

În cazul fenofibratului putem observa un peak endoterm la 85,62 ⁰C, reprezentând procesul de topire a substanței active. În cazul polimerului se poate observa un proces lung de pierdere a apei și dehidratarea polimerului, între cca. 50-110 ⁰C. În cazul nanofibrelor, peak-ul caracteristic fenofibratului cristalin dispare, ceea ce poate indica o trecere a substanței active din formă cristalină în formă amorfă. Totodată trebuie menționat că, s-ar putea ca o cristalinitate reziduală a substanței active să fie mascată de procesul de dehidratare a PVP-ului.

Dozarea substanței active din nanofibre

Tabel 2.2.3.1 – Dozarea fenofibratului din nanofibre

Cum reiese și din Tabelul 2.2.3.1, cantitatea de fenofibrat obținută practic este de 6,55-6,76%, care este 101,54-104,80% din cantitatea calculată teoretic ( 6,45%). Rezultatele sunt în concordanță cu cerințele generale ale agențiilor de medicamente (95-105% de substanță activă).

Din imaginile prezentate în Figura 2.2.3.2 se poate observa că, nanofibrele se dezintegrează instantaneu după ce se umectează, absorbind o cantitate mare de apă, imaginile au fost înregistrate din secundă în secundă.

Figura 2.2.3.2 – Dezagrearea și dizolvarea nanofibrelor cu fenofibrat

Rezultatele testelor de dizolvare in vitro

Rezultatele obținute pentru studiul dizolvării in vitro a nanofibrelor cu fenofibrat sunt redate în Figura 2.2.4.1 și Figura 2.2.4.2. Rezultatele confirmă așteptările cu privire la o dizolvare rapidă și completă a substanței active. Din cauza amorfizării fenofibratului, solubilitatea crește și sistemul nanofibros oferă o solubilitate mult mai mare pentru fenofibrat, comparativ cu forma cristalină.

La dizolvarea în dodecilsulfat de sodiu încă din primul minut s-a dizolvat 92,85% din substanța activă incorporată în nanofibre, iar din fenofibratul micronizat chiar și după 30 de minute am constatat o dizolvare de numai 45,42%.

La dizolvarea în apă am constatat o diferență și mai mare. Din nanofibre încă din primul minut s-a dizolvat 86,94% din fenofibrat, iar din substanța activă pulbere s-a dizolvat numai 7,36%.

Figura 2.2.4.1 – Curbele de dizolvare a nanofibrelor, respectiv a substanței active în SDS

Figura 2.2.4.2 – Curbele de dizolvare a nanofibrelor, respectiv a substanței active în apă

Cu toate că este micronizat, fenofibratul cristalin este solubilizat lent și atinge concentrații de aproape două ori mai mici decât din vectori pe bază de nanofibre la dizolvarea în dodecilsulfat de sodiu și concentrații de aproape doisprezece ori mai mici în dizolvarea în apă.

Concluzii

Fenofibratul, un medicament folosit in hipertrigliceridemie, însă dispunând de o solubilitate scăzută a fost încorporată în structure nanofibroase preparate din soluții de polivinilpirolidonă pentru a-i crește solubilitatea și implicit și absorbția substanței.

Nanofibrele obținute s-au dovedit a fi omogene, cu dimensiuni submicronice, încadrându-se în domeniul 70-80 nm (media a fost de 70,84 nm±16.42).

Studiile DSC au arătat o posibilă tranziție cristalin-amorfă a fenofibratului, care este însă mascată de peak-ul de deshidratare a polimerului.

Studiile de dizolvare in vitro au subliniat trecerea în formă amorfă a substanței active prin creșterea multiplă a solubilității fenofibratului de aproximativ două ori în cazul dizolvării în dodecilsulfat de sodium, respective de doisprezece ori în cazul dizolvării în apă. Totodată, structurile nanofibroase au conferit substanței active o dizolvare rapidă, eliberând substanța activă aproape instantaneu după contactul cu mediul de dizolvare. În comparație fenofibratul cristalin se dizolvă lent și greu.

Rezultatele prezentate confirmă aplicabilitatea nanofibrelor pentru creșterea solubilității și accelerarea dizolvării fenofibratului și pot deschide drumul către o formă farmaceutică care ar ajuta îmbunătățirea biodisponibilității acestui medicament.

ÁLTALÁNOS RÉSZ

Fenofibrát – a nanoszálas rendszer hatóanyaga

A diszlipidémia, mint betegség és kezelése

A diszlipidémia a zsíranyagcsere olyan zavara, mely magas vérzsír- és koleszterinszintekkel jár, és amely hajlamosít az érfalak megvastagodására, elmeszesedésére. A fejlett és fejlődő országokban a diszlipidémia legtöbbször hiperlipidémiát jelent, ami a lipidszintek növekedését jelenti a vérben. Tartósan megnövekedett lipidszintek kardiovaszkuláris betegségekhez vezetnek.[1]

A kardiovaszkuláris betegségek (CVD) a vezető halálokot jelentik világszerte, körülbelül az elhalálozások 40%-ért felelősek. Az Amerikai Egyesült Államokban évente körülbelül 1 millió haláleset van CVD miatt, a lakosság pedig mintegy 25%-a ( körülbelül 62 millió ember) szenved valamilyen kardiovaszkuláris betegségben.[1]

A fibrátok nagy szerepet játszodtak a diszlipidémia kezelésében az elmúlt 20 év során. A csoport legelső képviselőjét, a clofibrátot, 1962-ben fedezte fel Thorp és Waring, az Egyesült Államokban 1967-ben került piacra. A fibrátok más képviselői, mint a ciprofibrát, bezafibrát, etofibrát, beclofibrát és pirifibrát jelen vannak az európai piacon is, ahol gyakrabban írják fel ezeket az anyagokat az orvosok. [1]

A harmadik generációs fibrinsav származék, a fenofibrát, 1975-ben lett szintetizálva és Franciaországban már abban az évben be is lett vezetve a terápiába. A hatóanyag eredeti nevét, a procetofent, később lecserélték fenofibrátra, hogy megfeleljen a WHO nomenklatúra követelményeinek.[1]

A fenofibrát 86 országban van jelen a piacon és a leggyakrabban használt fibrinsav származék a világon, több mint 6 millió páciens-év tapasztalattal. Több mint 80 klinikai vizsgálatot hajtottak végre rajta, több mint 9000 önkéntest bevonva a vizsgálatokba.[1]

Fenofibrát – fizikai-kémiai tulajdonságok

Kémiailag a fenofibrát 2-(4[4-klorobenzoil]fenoxi)-2-metil-propánsav, 1-metiletil észter, a farmakológiailag aktív fibrinsav észtere, prodrog. A vegyület rendkívül lipofil, emelett semleges, fiziológiai körülmények között nem ionizálható. Az összes ismert fibrinsav származék közül, ez rendelkezik a legalacsonyabb oldhatósággal.[2]

1.1.2.1 ábra – Fenofibrát szerkezeti képlete

Összegképlete: C20H21ClO4

Relatív molekulatömege: 360.834 g/mol

LogP: 5,3

pKa: -4.9

λmax: 215 nm, illetve 290 nm körül

Olvadáspont: 80.5 °C

Oldhatóság: vízben nagyon gyengén oldódik(0.3 µg/ml 25 °C-on)

Értékmérés: folyadékkromatográfiás, UV spektrofotometriás [33]

Fenofibrát – farmakológiai hatások

Indikációk: hypercholesterolemia, kombinált dyslipidemia, remnant hyperlipidemia, endogén hyperlipidemia (hypertriglyceridemia), és vegyes hyperlipemia (Frederickson típusú IIa, IIb, III, IV és V dyslipidemia).[1,3]

Hatásmechanizmus: a lipid moduláló hatása a nukleáris transzkripciós faktor peroxiszóma proliferációt aktiváló receptor (PPARα) szelektív aktiválásán alapszik. A PPARα főleg olyan szövetekben expresszálódik ahol magas az aktív szabad zsírsav katabolizmusa (ilyen szövetek például a máj, az izmok, a szív és a vesék), a vaszkuláris endotéliumban, a vaszkuláris simaizomban, illetve a makrofág sejtekben. Aktiváció után a PPAR-ek a sejtmagba migrálnak ahol heterodimért alkotnak a retinsav X receptorával (RXR receptor). Ezek a dimérek DNS specifikus szekvenciákhoz, úgynevezett peroxiszóma proliferáció–válasz elemekhez kapcsolódnak, így stimulálva vagy tompítva a transzkripcióját bizonyos géneknek amelyek részt vesznek a lipidek metabolizmusában.[3]

Interakciók: Epesavkötő gyanták (kolesztiramin): A fenofibrát felszívódását gátolhatják. Az interakció elkerüléséhez, a páciensek legalább 1 óra szünetet kell tartsanak ha előtte veszik be és 4-6 órát ha a fenofibrát után adagolják a gyantát.

Immunszupresszánsok (ciclosporin vagy takrolimus): vesefunkció csökkenés észlelhető.

K vitamin antagonisták (warfarin): A vérzés rizikója megnő, a plazmafehérjékért való versengés miatt.

Statinok: Rhabdomyolysis és myopathya rizikója megnő

Mellékhatások: fejfájás, hátfájás, nasopharyngitis, hányinger, myalgia, ízületi fájdalom, hasmenés, felső légúti fertőzések veszélye megnő.

Adagolás: 200 mg-os kapszula esetén napi egy fenofibrát kapszulát kell bevenni egy főétkezés során.

A romániai piacon a 145,160,200 mg-os mikronizált fenofibrát tabletták találhatóak meg, Fenolip, Lipanthyl Supra és Nano, Pravafenix, Lipivim, illetve különböző generikum név alatt.

Farmakokinetika, farmakodinámia

A fenofibrát legnagyobb hátránya az alacsony biohasznosulása volt éhgyomorra való alkalmazással. A gyártók ajánlása szerint napi egy fenofibrát kapszulát kell bevenni egy főétkezés során. Továbbra is be kell tartani a diétás megszorításokat és rendszeresen ellenőrizni kell a plazma lipidszinteket, különösen a kezelés kezdetekor. Noha a fenofibrát kezelést rendszerint gyors szérum lipidszint csökkenés követi, a kezelést csak akkor kell abbahagyni, ha három hónap elteltével sem jelenik meg hatás A felszívódását nagyban segíti az étkezés közbeni adagolás. Ezen a problémán valamelyest segített a fenofibrát mikronizált formájának a bevezetése. [4,5]

Per os adagolás után gyorsan átalakul hidrolízissel fenofibrin savvá, plazma koncentrációja 6-8 óra után éri el a maximumot. Az egyensúlyi állapot koncentrációt 5 nap után éri el és akkumuláció nem volt megfigyelhető egészséges önkénteseken. [4,5]

A fenofibrin sav erősen kötődik a plazmafehérjékhez (99%), főleg az albuminhoz, az eloszlási térfogata pedig 0,89 L/kg. Metabolizációját a CYP 450 3A4 izoenzim végzi, a felezési ideje 20 óra ezért elegendő naponta egyszer adagolni. [4]

Az oldhatóság fogalma, oldhatóság növelése

Az oldhatóság azt a koncentrációértéket jellemzi, amely telített oldatot képez akkor, ha az anyag feleslegben van és befolyásolja az oldódás sebességét, a felszívódást, illetve az anyag biológiai hasznosíthatóságát. Az oldhatóság az anyag minőségére jellemző érték, az anyag szerkezetéből eredő molekuláris tulajdonság. [6,7]

A szervezet vízterei a poláris anyagok számára kedvező oldószerek, tehát a felszívódáshoz és a kiürüléshez a gyógyszermolekuláknak hidrofil tulajdonságokkal kell rendelkezniük. [6,7]

A membránokon való átjutáshoz viszont lipofil tulajdonságra van szükség. Az ideális gyógyszermolekulák tehát mind zsíroldékony, mind vízoldékony tulajdonsággal rendelkeznek. Hiába van egy olyan molekula amely gyorsan képes áthaladni a biológiai membránokon, ha rossz a hidrofilitása és a szilárd gyógyszerformából való elégtelen kioldódása határt szab a felszívódott mennyiségnek. [6,7]

A hatóanyag gyomor-bél rendszerből való felszivódásának mértékét egyaránt befolyásolja a permeabilitásának mértéke és az oldhatósága. Amidon és munkatársai 1995-ben ezen biofarmáciai tulajdonságok job átláthatósága érdekében bevezették a Biofarmáciai Osztályozási Rendszert (Biopharmaceutical Classification System, BCS), mely alapján a hatóanyagokat négy osztályba sorolhatjuk (1.2.1 Táblázat). [9]

A fenofibrát egy BCS II-es besorolású hatóanyag, ami azt jelenti hogy jó penetrációs képességgel rendelkezik (könnyen átjut a biológiai membránokon), viszont rossz az oldhatósága. [9]

1.2.1 táblázat – Biofarmáciai osztályozási rendszer ( BCS osztályok)

Az oldhatóság növelése nagyon régóta fennálló technológiai probléma, így a formulálási technikák között újnak számító szálképzési eljárásokon kívűl is találunk erre megfelelő módszereket. [8]

Az elméletében legegyszerűbb módszer az őrlés, ha a hatóanyag szilárd fázisa lassan oldódik, a részecskeméret csökkentésével a fajlagos felület akár nagyságrendekkel növekedhet, ily módon a kémiailag változatlan hatóanyag oldódási sebessége jelentősen növelhető, az Ostwald – Mosley egyenlet szerint:[8]

Cs – az oldódó részecske felületén kialakuló telítési koncentráció

Cs0 – az oldott anyag sík felületen megjelenő telítési koncentrációja

M – részecskét alkotó molekula molekulatömege

– folyadék-szilárd határfelületi feszültség

ρ – részecske sűrűsége

r – oldódó részecske görbületi sugara

R – Regnault-állandó

T – hőmérséklet

Az őrlési módszereknek egész családja alakult ki a hagyományos, hétköznapi életben is alkalmazott száraz őrléstől, az együtt őrlésen át(co-milling) a nedves közegű őrlési technikákig. Az oldódási sebesség növelése nemcsak őrléssel érhető el, gyakran használunk kémiai módosítást (sóképzést), illetve különböző oldószeres vagy olvasztásos módszereket, mint például porlasztva szárítást, fagyasztva szárítást, olvadékos granulálást vagy extrúziót. ( 1.2.2 ábra)[8]

1.2.2 ábra – Lehetőségek az oldhatóság növelésére

A fenti technikákkal általában a hatóanyag kristályformáját, morfológiáját változtatjuk meg, így a részecskeméret-csökkentés során létrejövő amorf állapotú anyagok magas energiatartalmuk miatt jobb oldékonysággal jellemezhetők, mint kristályos formáik.

Az 1.2.3 ábra összefoglalja a különböző szálképzési módszereket. [8]

1.2.3 ábra – A szálképzési technikák általános csoportosítása [8]

Amikor a hatóanyag szilárd fázisa lassan oldódik, akkor részecskeméretének csökkentésével a fajlagos felülete nagyságrendekkel megnő, így a kémiailag változatlan anyag oldódási sebessége kiugróan megnő. Ennek termodinamikai összefüggéseit a Noyes-Whitney egyenlet mutatja be: [8]

w – az oldott anyag mennyisége t időpillanatban

D – a diffúziós együttható

A – a diffúziós határréteg felülete

c – az oldott anyag koncentrációja

x – a diffúziós rétegvastagság

Oldhatóság növelés nanoszál képzéssel

A gyógyszerészeti iparágak fejlődésével sok új molekuláris célpont,

potenciális vezérmolekula, lehetséges hatóanyag jelenik meg. A nemrég felfedezett hatóanyagok többsége azonban valamely fizikai vagy kémiai jellemzője nem megfelelő, több mint valószínű soha nem válhatnának gyógyszerré, ha az új molekulák felfedezése nem járna ilyen nagy kiadásokkal. Azonban, az iparág alkotói válságának köszönhetően, a világ vezető cégei elkezdik felvállalni ezeket a problémás molekulákat, elég komoly szakmai megpróbáltatás elé állítva a technológusokat. [10]

Az említett új hatóanyagok nagyon gyakran rossz hidrofilitással rendelkeznek, levegőre és nedvességre érzékenyek, több polimorf módosulatuk van, amelyek jelentősen különböznek egymástól mind oldhatóságukban, mind farmakológiai hatásukban. [10]

A szálképzési technikák közül az elektrosztatikus szálképzés (electrospinning) tekinthető a legnépszerűbbnek, bár széleskörű alkalmazása csak az utóbbi húsz évben kezdett el kibontakozni. A technika őrzi prioritását a nano- és mikroszálas alapú gyógyszerészeti alkalmazások területén is. A szálak előállítása oldatból, diszperzióból vagy olvadékból történik. A szálakat nagyfeszültségű egyenáram által keletkező elektrosztatikus erők hozzák létre. Az technika során egy elektromosan vezető vékony kapillárist nagy feszültség alá helyeznek, amelyen a polimer oldatot jól meghatározott hozammal áramoltatják keresztül. A kapilláris tengelyére merőlegesen egy szintén elektromosan vezető gyűjtő lemezt helyeznek el, amelyet általában földelnek. ( 1.3.1 ábra) [11]

1.3.1 ábra – Elektrostatikus szálképzés [13]

Elektrosztatikus szálképzésre általában elektromosan vezető folyadékok, elektrosztatikusan feltölthető polimerek alkalmasak. A szálak keletkezésénél az elektrosztatikából ismeretes jelenségek érvényesülnek, a kapilláris hegyére érkező csepp gömb alakú geometriai testként értelmezhető, de alakját az elektrosztatikus tér átalakítja, a deformáció pedig a töltések nem homogén eloszlását eredményezi a keletkezett csepp felületén. A csepp legnagyobb görbületű pontján, a kialakuló kitörési pontokból, az ún. Taylor-kúpokból, ionizált anyagáramlás indul meg a kollektor felé. Megfelelő felületi feszültséggel rendelkező oldatok esetében az elektromosan feltöltött anyag kilép a csepp felszínéről. Egyszerre sok szál is képződhet, amelyek mozgásuk során folyamatosan elvékonyodnak. A szál vastagságát az alkalmazott feszültség és a gyűjtők távolsága határozza meg, illetve annak a folyadéksugárnak a stabilitása, amelyből keletkezik. [12,13]

A stabilitásért a felületi feszültség, míg a nyújtásért az elektrosztatikus erő a felelős. A Rayleigh-féle hasadási indexet úgy kapjuk meg,hogy az előbbi két adatot elosztjuk. Eléggé nagy felületi feszültség esetén a szál nyújtásakor a folyadéksugár nem törik meg, így hosszú szálakat kapunk. A sugár által megtett út során az oldószer nagy része elpárolog vagy az olvadék eléggé lehűl, valamint a töltések is elvezetődnek a levegő ionizációja közben, így kialakul a szilárd forma. Mivel a párhuzamosan keletkező szálak azonos töltéseket hordoznak, így taszításuk révén spirális pályákat írnak le, egymásba kapaszkodva rendezetlen szerkezetet hoznak létre. Ez egy fontos jellemzője az elektrosztatikus szálképzésnek, hiszen elkerülhetetlen a szálak közötti kapcsolódási pontok kialakulása. A kollektoron végeredményként egy szövetszerű, orientáció nélküli szálas szerkezetű lapocskát kapunk. [12,13]

A nanoszálak gyógyászati felhasználása

Az utóbbi években az oldékonyság növelés mellett más területeken is elkezdtek kísérletezni a nanoszál technológiával. A Freudenberg Nonwovens már több mint 20 éve gyárt nanoszál alapú szűrőket, melyek akár a 0.5 µm-nél is kisebb részecskéket fel tudnak fogni. [14]

A biotechnológia terén is nagyon izgalmas témának szamítanak a nanoszálas rendszerek, lehetőség nyílik orvosi protéziseket, szövet sablonokat készíteni vagy akár sebek gyógyulásának elősegítését is meg lehet oldani. A nanoszálas szerkezetű membránok átlagos pórusátmérője 500 nm- 1 µm között mozog, amely elegendő hogy a sebet védje a bakteriális fertőzésektől, a nagy felület (5–100 m2/g) pedig remek hordozónak minősíti folyadék abszorpció és dermális rendszerek terén. [14]

Ugyanakkor ezek a rendszerek védőruházatként is használhatóak, főleg a hadsereg számára fejlesztenek olyan védőruházatot amely segíthet maximalizálni a katona túlélési lehetőségeit és javítani tudja harci képességeit. [14]

A nanoszálak vizsgálati módszerei

A kristályosság kimutatása a szilárd diszperzióban

A hatóanyag különböző szerkezetei a szálas szerkezetű mátrixban szilárd diszperzióként vannak jelen. Az amorf és a kristályos forma megkülönböztetésére több analitikai módszer is alkalmazható, melyek közül a továbbiakban kifejtek párat:

Röntgen-pordiffrakció: a hosszútávon rendezett anyagok minőségi ellenőrzésére alkalmas. A nemrégiben kifejlesztett röntgenkészülék félkvantitatív, alapja a röntgensugárzás atomokon és atomi síkokon történő szóródása. Az alkalmazott difraktométerek alkalmasak arra, hogy a készítménybe beágyazott hatóanyag kristályszerkezetét megállapítsuk, illetve nyomon kövessük az esetleges amorf-kristályos átalakulást. [15,19]

Termoanalízis: alkalmas technika a bomlással vagy az oldószer elpárolgásával járó folyamatok követésére. A valódi amorf anyagok esetén kimutatja az üvegesedési folyamatot, a nanokristályos anyagok esetén viszont cask olvadás várható. [19]

Egy nagyon gyakran használt technika a differenciális pásztázó kalorimetria (DSC). A mintákat állandó fűtési sebességen melegítik és az ehhez szükséges energia mennyiséget detektáljuk. DSC-vel azokat a hőmérsékleti tartományokat detektáljuk amikor termális jelenségek lépnek fel. Ilyen jelenségek lehetnek: (újra)kristályosodás, üveg-gumi átmenet, olvadás vagy bomlás. Az olvadási és (re)krisztallizácós energia mennyisége meghatározható. Az olvadási energia használható a kristályos anyag mennyiségének kimutatására, míg a (re)krisztallizácós energia felhasználható az amorf anyag mennyiségének meghatározására. [15,19]

Mikrokalorimetria: Nagyon érzékeny módszer, amellyel követni lehet kémiai reakciókat és fázis- és szerkezetátalakulások sebességét valamint mértékét. Ha egy mintát nagyobb relatív nedvességtartalmú térbe helyezünk, az anyag amorf részei átkristályosodhatnak. Az átkristályosodási hő mérése az átkristályosodási entalpia révén lehetővé teszi az amorf rész mennyiségi meghatározását. [19]

Infravörös spektroszkópia (IR): Az infravörös spektroszkópia használható a hatóanyag és a mátrix közötti kölcsönhatások energiaeloszlásának változásának mérésére. Az éles vibrációs sávok a kristályos formát jelzik. Ahhoz hogy még pontosabb méréseket végezzünk, Fourier transzformációs infravörös spektroszkópiát (FT-IR) használhatunk, amellyel detektáljuk a kristalyosságot 1-99%-ig tiszta anyagban. Ugyanakkor, a karakterisztikus jelek felhasználhatóak bizonyos funkcionális csoportok azonosítására, valamint a polimer és a hatóanyag között kialakuló esetleges kötésekre is fényt deríthet. [15,19]

Közeli infravörös (NIR) spektroszkópia: A kristályosság fokának mérésére közeli infravörös (NIR) spektroszkópia is használható, ezért e technika is hasznosnak bizonyult a polimorfia tanulmányozására. Egy NIR-spektrum fizikai és kémiai információkat egyaránt tartalmaz. Mivel e módszer noninvazív, nondestruktív, és szobahőmérsékleten is alkalmazható, értékes eszközt jelent az amorf és kristályos átalakulások értékelésében.[19]

Morfológiai vizsgálati módszerek

A leggyakoribb módszerek a morfológiai sajátosságok meghatározására a pásztázó elektronmikroszkópia (SEM) és az optikai mikroszkópia (OM). Segítségükkel meghatározható a szálak átmérője, a pórusmérete és a porozitása. [16]

A pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) olyan elektronoptikai eszköz, amely a vizsgált tárgy felszínének meghatározott területét irányított vékony elektronnyalábbal pontos minta szerint végigpásztázza, az elektronsugár és a tárgy kölcsönhatásából származó jeleket erre alkalmas detektorral érzékeli, és ezeket megfelelően feldolgozva, az elektronsugár mozgásával szinkronizálva képileg (esetleg más formátumban, például spektrum) kijelzi (1.5.2.1 ábra). A mikroszkóp fontosabb egységei az elektronágyú, a pásztázótekercsek, az objektívlencse, a detektor és a mintatartó. A vizsgálathoz elektromosan vezető anyagra van szükség, máskülönben a rávitt elektronok miatt töltés halmozódik fel a mintában. Ez a töltés torzítja a képet, különösen a másodlagos elektronokkal létrehozott kép esetében. Ha a minta alapból vezeti az áramot, akkor vezető ragasztóval rögzítjük a földelt mintatartó asztalhoz. A rögzítés céljára kaphatók szén- vagy ezüstpaszták, amelyek elektromosan vezetnek, rögzítik a mintát, ugyanakkor viszonylag egyszerűen megoldható az eltávolításuk is. Rögzítés céljára kapható kétoldalasan ragasztós vezető szalag is. A pásztázó elektronmikroszkópban a volfrám vagy lantán-hexaborid (LaB6) katód elektronjait termikusan kibocsátják majdgyorsítják az anód fele. Az elektronsugár kölcsönhatásba lép a mintával egy úgynevezett körte-alakzatú térfogatban, ezáltal lecsökken az elektronok energiája az ismételt szóródás illetve elnyelés által. Ezt a körte alakú térfogatot nevezzük kölcsönhatási (interakciós) térfogatnak, amely 100 nm-től körülbelül 5 μm-ig terjedő mélységig terjed a felületen. [16,22]

ábra – Pásztázó elektronmikroszkóp szerkezete [22]

Az optikai mikroszkóp(OM) vagy fénymikroszkóp felbontóképességét, illetve elérhető nagyítását a fény hullámhossza korlátozza. A legjobb felbontás amelyet elérhetünk egy optikai mikroszkóppal az 200 nm. Általánosságban elmondható, hogy a nanoszálak geometriai tulajdonságai, például a szál átmérője, az átmérő-eloszlás, a szál-orientáció és a szálmorfológia jellemzői meglehetősen nagy pontossággal jellemezhetők akár optikai mikroszkóp segítségével is. [16]

Pozitron annihilációs élettartam spektroszkópia (PALS)

A PALS egy kivételes módszer mivel nagyon érzékeny a mintában fellelhető szabad térfogatra. Alkalmas különböző szerkezetű minták, például folyékony, szilárd, félszilárd, jellemzésére. [8]

A kapott spektrum adatai alapján információt kapunk a vizsgált anyag szupramolekuláris szerkezetéről, amellyel követni tudjuk a változásokat bizonyos gyógyszerhordozókban és gyógyszerformákban. Igy a PALS segítségével vizsgálható a készítmény tárolása során bekövetkező esetleges destabilizáció, a hatóanyagot tartalmazó hordozórendszerek diffúzióra visszavezethető folyamatai (oldódás, duzzadás, nedvesedés, kristályosodás), valamint kiszűrhetők a formuláláshoz nem megfelelő segédanyagok is. [8]

Az élettartam értékek száma és mértéke a különböző mintákra jellemző. Polimereknek, amelyeket a gyógyszeriparban gyakran használnak, az élettartam értékek száma 3-5 között van a 0,1-3 ns tartományban. A legtöbb gyógyszerészetileg hasznos vegyületnek 2-4 között van az élettartam értékek száma és általában a legnagyobb élettartam érték az orto-pozitron (o-Ps) élettartamára vonatkozik. [8]

Kioldódás vizsgálat

A X. Román Gyógyszerkönyvben (X.R.Gy) leírt hivatalos módszer. A kioldódáson azt a hatóanyag mennyiséget érti, amely adott idő alatt felszabadul a vizsgált gyógyszerformából. A hatóanyag monográfiájából, illetve gyógyszerügyi hatóságok honlapjáról(pl. FDA) információhoz juthatunk a megfelelő készülék, a kioldóközeg típusa és koncentrációja, a javasolt fordulatszám és a megfelelő meghatározási módszerre vonatkozóan. A X.R.Gy. két féle készüléket említ a vizsgálat elvégzésére: a forgókosaras és a keverőlapátos berendezést, a mérés 37°C-on zajlik. A mintavétel megadott időközönként történik, melyet szűrés követ [17]

Az Európai Gyógyszerköny a forgókosaras és a keverőlapátos berendezés mellett megemlíti az átfolyásos berendezést is, a mérések ugyancsak 37°C-on zajlanak.[18]

A nanoszálba való ágyazás esetében a kioldódás bizonyítékként szolgálhat arra, hogy a nanoszálképzés egy hatásos formulációs stratégia, amellyel növeljük a hatóanyag oldhatóságát és kioldódását.

KISÉRLETES RÉSZ – SAJÁT HOZZÁJÁRULÁS

Bevezetés és célkitűzések

A fenofibrát 1975 óta alkalmazott, az egyik leggyakrabban felírt fibrinsav származék. A fibrátok csoportjához tartozó hatóanyag, az LDL, VLDL és triglicerid szinteket csökkenti, míg a HDL szinteket növeli. Előnye, hogy elegendő naponta egyszer adagolni, viszont nagy lipofilitása miatt hátrányos az a tulajdonsága, hogy étkezés közben kell adagolni a megfelelő felszívódás érdekében. A fenofibrát abszorpciója 35%-ra növekedik étkezés közben bevont tabletták esetében. [1,3]

A mellékhatások közül említésre méltó a fejfájás, hátfájás, nasopharyngitis, hányinger, myalgia, ízületi fájdalom, hasmenés, illetve a felső légúti fertőzések veszélye megnő. Statinokkal való társítása nem ajánlott, mivel jelentősen megnő az izomkárosodás veszélye, ami rhabdomyolysishez vezethet. [1,3]

Mindezeket szem előtt tartva, előnyös lenne egy olyan fenofibrát tartalmú készítmény, amely megnövekedett orális biohasznosulást biztosít a hatóanyag számára, ezért alacsonyabb dózisokkal adagolható, ennek következtében ugyanolyan hatást érhetnénk el, viszont jelentősen csökkenthetőek lennének a mellékhatások, illetve lehetővé tehetnénk az étkezéstől független adagolást. Mivel a fenofibrát BCS II osztályba tartozik, a hatóanyag felszívódását és ezáltal biohasznosulását az oldhatóság hordozza, az utóbbi növelése pedig biohasznosulás növekedéshez vezet.

Rengeteg stratégiát dolgoztak ki a vízben gyengén oldódó molekulák problémáinak kiküszöbölésére [23]. Fenofibrátra specifikusan több alkalmazható megoldás is született, amely az orális biohasznosulást növeli [24]. Első lépésben a hatóanyag mikronizált formáját fejlesztették ki [25,26], majd később olyan tablettákat fejlesztettek ki, melyekhez hozzáadtak a klasszikus mikronizációs folyamat mellett egy mikrobevonatot és egy oldhatatlan mikrohordozó tablettát [27]. Később megjelentek a nanorészecske formulációk, mint például a nanoszuszpenziók vagy a szilárd lipid nanorészecskék [25]. Habár ez a részecskecsökkentés látszólag pozitív hatással van az orális biohasznosulásra [28], a pontos viselkedését ezeknek a mikro- és nanorészecskéknek a gasztrointesztinális rendszerben még vizsgálni szükséges. Étgyomorra a nagyobb kioldódási sebesség nagyobb plazma koncentrációt eredményez a nanorészecskék esetében összehasonlítva a mikronizált formulációkkal, míg posztprandiális körülmények között mindkét esetben megnőtt a hatóanyag kioldódása, viszont nem volt szignifikáns különbség a plazmakoncentrációk között. [29]

A fenofibrátot megtaláljuk sok lipid-alapú gyógyszerformában is (LBDDS) [30, 31]. Ezeknek az előnyük, hogy csökkentik az egyének közötti, inter-individuális variabilitást [32]. A biodiszponibilitást tehát növelhetjük a fenofibrát oldhatóságának, vagy gyógyszerformájából való kióldódási sebességének a növelése által segédanyagokkal, technológiai módszerekkel vagy a kettőnek a kombinációjával. [19]

A polimer rostok sajátos fizikai-kémiai tulajdonságaiknak köszönhetik népszerűségüket, amelyek jól hasznosíthatók az innovatív gyógyszeradagoló rendszerek megalkotásában. Szálas jellegük és kis átmérőjük miatt nagy fajlagos felület-térfogat aránnyal jellemezhetőek, ami előnyösen befolyásolja az oldódást, mivel a nagyobb felület, gyorsabb oldódási sebességhez vezet. A nagy fajlagos felület-térfogat arány előnyös a kioldódásnál, mivel minél nagyobb a felület, annál gyorsabban oldódik fel az anyag. A magas porozitás és a hatóanyagok amorf állapotban tartásának lehetősége szintén kedvező az oldódási sebesség növelése céljából. Mivel ezeknek a szálaknak az összetétele az extracelluláris mátrixhoz (ECM) hasonlít, ezek potenciálisan alkalmasak szövettani alkalmazásokra is. A felszíni tulajdonságok kritikus szerepet játszanak a gyógyszeradagolásban és a biológiai alkalmazásukban. A biokompatibilitás általában egy kívánt tulajdonság, míg a biológiai lebonthatóság egyes esetekben támogató jellegű lehet. A hidrofil vagy hidrofób jellegen túlmenően a felületi tulajdonságok kiterjednek a rostok felületi funkcionalizációjára is. [20]

Kísérletes munkánk célja az volt, hogy a fenofibrátot polivinil-pirrolidon alapú, nanoszálas szerkezetű hordozóba ágyazzuk, ami által növelni tudnánk a kioldódás sebességét és a hatóanyag oldhatóságát.

Anyagok és módszerek

A felhasznált anyagok

2.2.1.1 táblázat – Az elektrosztatikus szálképzéshez használt anyagok

Egyéb reagensek, amelyeket az előkísérletek és a nanoszálas hordozók jellemzésére használtunk:

Kolliphor RH40

Kollisolv P124

Kolliphor EL

Nátrium dodecil szulfát

Acetonitril

Módszerek

Elektrosztatikus szálképzés

Az oldószeres elektrosztatikus szálképzéshez első lépéseként kimértünk 0.2 g fenofibrátot egy Berzelius pohárba, majd ezt feloldottuk 0.5 g Tween 80-ban, mágneses kevertetés közben (500 rpm). Erre rámértünk 2.4 g PVP-t (Plasdone K29/32) és 6 mL metanolt. Kb. 10-15 percig kevertettük a mágneses keverőn, míg homogén oldatot kaptunk.

Az így kapott oldatot egy 20 mL-es műanyag fecskendőbe töltöttük, amire egy szilikon cső segítségével egy kb. 1.5 mm belső átmérőjű túhöz kapcsoltuk. A szilikoncső feltöltése után, a fecskendőt egy automata pumpán keresztül (Ascor AP 12fecskendő pumpa) az előírt sebességgel folyamatosan adagoltuk. A szálképzés egy az Ipari Tanszéken kialakított készülék-együttessel történt (2.2.2.1.1 ábra).

2.2.2.1.1 ábra – A szálképző készülék együttes

A szálhúzás paraméterei:

Szórófej-kollektor (Al fólia) távolság: 7.5 cm

Adagolási sebesség (fecskendő pumpa): 0.7 mL/h

Futtatási idő: 10-20 perc

Feszültség: kb. 20 kV

A szórófej (tű) illetve a földelt alumínium gyűjtőlemezre nagyfeszültségű áramforrást kapcsoltunk ami kb.20 kV feszültséget generált . Az adagolási sebességet, illetve a szórófej-gyűjtő távolságot az előzőekben bemutatott adatok szerint végeztük. A nanoszálképzés, a készülek 10 – 20 percnyi folyamatos működtetése után fejeződött be. A gyártott mintákat leszedtük az alumínium-fóliáról, megmértük, majd szobahőmérsékleten az illető alumínium-fóliába zárva tároltuk.

Kioldódás vizsgálatok

Két kioldódást végeztünk el:

Az amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság(Food and Drug Administration, FDA) által javasolt módszer

Készülék: Erweka DT-80 (2.2.2.2.1 ábra)

App.1(kosaras), kioldódási közeg: 500 mL, 25 mM nátrium-dodecilszulfát(SDS), 100 rpm forgási sebesség

Mintavétel: 1, 3, 5, 10, 20, 30 perc után

Értékmérés: spektrofotometriásan, UV, 289.3 nm

Az FDA javaslata szerint a feltüntetett anyagokat és paramétereket alkalmaztuk, 3 nanoszál próbát és 3 mikronizált fenofibrát próbát tesztelve.

Kioldódás vízben

Készülék: Erweka DT-80

App.1(kosaras), kioldódási közeg: 500 mL, víz, 100 rpm forgási sebesség

Mintavétel: 1, 3, 5, 10, 20, 30 perc után

Értékmérés: spektrofotometriásan, UV, 289.3 nm

A vízben való kioldódás is hasonló paraméterek között folyt, ugyanúgy 3 nanoszál próbát és 3 mikronizált fenofibrát próbát tesztelve.

2.2.2.2.1 ábra – Erweka DT-80 készülék

Nanoszálak fenofibrát tartalmának meghatározása.Értékmérés

Körülbelül 10 mg mintát mértünk egy 50 mL-es lombikba, majd jelig feltöltöttük 25 mM nátrium-dodecilszulfát oldattal. A szálas hordozó rendszerek fenofibrát tartalmát egy kalibrációs egyenes alapján határoztuk meg.

Shimadzu UV-1601PC spektrofotométert alkalmaztunk, kvarc küvettákba mérve az oldatokat 289,3 nm-es tartományban.

2.2.2.3.1 ábra – Shimadzu UV-1601PC spektrofotométer

DSC vizsgálat

A nanoszálas próbákból 1-1 reprezentatív mintát, a hatóanyagot, a polimerképzőt (PVP) illetve a hatóanyagnélküli szálakat (placebo) DSC analízisnek vetettük alá. Az analízis Shimadzu DSC-60 (2.2.2.4.1 ábra) készülékkel történt, referenciaként Al2O3-at használva. A kimért minták (kb. 5 mg) elemzése Perkin Elmer alumínium mintatartókban történt. A vizsgálatok 30-160 °C között történtek, a fűtési sebesség 5 °C/perc volt.

2.2.2.4.1 ábra – Shimadzu DSC-60 készülék

Morfológiai meghatározások

Az elektrosztatikus szálképzéssel előallított nanoszálakból egy vékony mintát vágtunk, amit egy csípesszel egy tárgylemezre helyeztünk és fedőlemezzel borítottuk. A próbákat egy LCD MICRO 5 MP, BRESSER típusú digitaliskijelzővel rendelkező mikroszkóp (2.2.2.5.1 ábra) alatt vizsgáltuk és annyi felvételt keszítettünk minden egyes próbáról, amely lehetővé tette minimum 50 darab szál-átmérő lemérését.

Az elkészült képeket ImageJ program segítségével dolgoztukfel, egy standardizált skálát használva a szálak átmérőjének a meghatározásához.

2.2.2.5.1 ábra – LCD MICRO 5 MP, BRESSER típusú mikroszkóp

A méréshez a következő eszközöket használtuk fel:

Mikroszkóp (LCD MICRO 5 MP, BRESSER)

Tárgylemez

Fedőlemez

Csípesz

Beosztásos tárgylemez (standardizált skála)

Szétesésvizsgálat

A szétesésvizsgálathoz egy darab nanoszál próbát merítettünk egy óraüvegbe, amelybe 5 mL vizet pipettáztunk. Megmértük a széteséshez és feloldódáshoz szükséges időt.

Eredmények és megbeszélés

Bevezetés

Habár az elektrosztatikus szálképzés (“electrospinning”) elnevezés viszonylag új fogalom ( 1994 körül használták először), az alapötlete már 60 évvel korábban ki lett dolgozva. 1934 és 1944 között Formalas több szabadalmat nyújtott be egy berendezésről mely polimer szálakat tudott képezni elektrostatikus erő segítségével. Cellulóz-acetát oldatot, vezetett be elektromos térbe és polimer szálak keletkeztek a két különböző elektromos töltéssel rendelkező elektród között. Az egyik elektród az oldatban, a másik a kollektoron foglalt helyet. Amint kilépett a fém fonócsőből az elektromosan feltöltött oldat el is párolgott és szálakat képezve lett gyűjtve a kollektoron. A töltésbeli különbség nagyban függött az oldat tulajdonságaitól, mint például a molekulatömegtől és a viszkozitástól. Amikor a távolság a fonócső és a kollektor között rövid volt akkor a szálak sokkal inkabb odaragadtak a kollektorhoz, illetve egymáshoz is. Ez annak tulajdonítható, hogy az oldószer nem párolgott el teljesen. [21]

Az 1980-as évektől kezdve, de főleg az utóbbi években az elektrosztatikus szálképzés újra a figyelem középpontjába került, főleg a nanotechnológia iránt megnőtt érdeklődés miatt. Ezzel a módszerrel könnyen előállíthatóak szubmikronos és nanométeres tartományba eső szálak. Eddigi ismereteink alapján több mint száz különböző polimerből készítettek sikeresen szálakat. Habár az elektrosztatikus szálképzésben remek lehetőségek rejlenek és több évtizede rendelkezésünkre áll a módszer, a hátterében levő fiziko-kémiai folyamatok megértése még mindig nem teljes. [21]

A polimer oldat nanoszálakká való átalakulását több paraméter is befolyásolja. Többek között meg kell említeni:

(a) az oldat sajátosságokat mint pédául a viszkozitás, elaszticitás, konduktivitás és felületi feszültség,

(b) vezető paraméterek mint pédául a hidrosztatikus nyomás, elektromos potenciál vagy a távolság a tű és a kollektor között,

(c) környezeti paraméterek mint például az oldat hőmérséklete, páratartalom és levegő turbulenciák. [21]

Elektrosztatikus szálképzés paraméterei

A fenofibrát nanoszálakba való ágyazásának optimalizálásához először egy előkísérlet sorozatot végeztünk, ahol több változtatható paramétert megvizsgáltunk, mivel maximalizálni szerettük volna a keletkezett szálak minőségét és mennyiségét.

Legelőször az irodalomban levő adatokra hivatkoztunk: 20% PVP oldat etanolban, 15 cm tű-kollektor távolság, 1 mL/h áramlási sebesség, 20 kV feszültség. Ezzel a beállítással képződtek szálak, viszont túl kevés, illetve a szálak zöme nem a kollektoron landolt, hanem körülbelül féltávon. Módosítva a távolságot 7,5 cm-re már megfelelő mennyiségű nanoszál képződött és megfelelő minőségben.

Próbálkozásaink voltak bizonyos szolubilizáló anyagokkal is, mint például a Kolliphor RH 40, a Kollisolv P124 és a Kolliphor EL, amelyekkel a fenofibrát megfelelő koncentrációban történő oldatba vitelét szerettük volna elősegíteni. Bár ez több esetben is sikerült, az oldat túlságosan viszkózusnak bizonyult, így az elektrosztatikus szálképzés során csak nagyon kevés szál képződött.

A végső választásunk a Tween 80-ra esett, mivel a fenofibrát oldhatósága igen nagy benne( 102,81 mg/mL), nem toxikus belsőleges használatkor, illetve nem gátolja az elektrosztatikus szálképzés folyamatát.

Összevetve minden próbálkozást az optimális szálképzési paraméterek a következők voltak: szórófej-kollektor (Al fólia) távolság: 7.5 cm, adagolási sebesség (fecskendő pumpa): 0.7 mL/h, futtatási idő: 10-20 perc, feszültség: kb. 20 kV.

A nanoszálak átmérőjének meghatározása

Az előállított nanoszálakat morfológiai analízisnek vetettük alá, amely során optikai mikroszkóppal, 40X nagyításon végzett felvételeket elemeztünk. A szálak átmérőjét ImageJ program segítségével határoztuk meg.

2.3.3.1 ábra – Mikroszkópos felvétel(40X) a 40%-os Fenofibrát-PVP oldat, 0,7 ml/h áramlási sebességgel és 7,5 cm szórófej-gyűjtő távolsággal készült nanoszálakról

Az elkészített felvételeken szépen kivehető a szálak homogenitása, illetve cseppmentessége.

A szálak átmérője a nanotartományba esik, a szálak többsége 70-80 nm átmérővel rendelkezik( az átlagátmérő 70.84±16.42 nm)

2.3.3.2 ábra – Mikroszkópos felvételek(40X) a 40%-os Fenofibrát-PVP oldat, 0,7 ml/h áramlási sebességgel és 7,5 cm szórófej-gyűjtő távolsággal készült nanoszálakról

A DSC vizsgálatok eredményei

A termoanalitika vizsgálatok tárházából, a DSC egy egyszerű és hatékony módszer szilárd fázisban végbemenő változások nyomonkövetésére. Szilárd diszperziók esetében a DSC-t előszeretettel használják a kristályos-amorf fázisátmenetek követésére illetve szilárd fázisban történő kölcsönhatások kimutatására. Nanoszálas gyógyszerhordozók esetében a DSC-t a hatóanyag kristályos módosulatából, amorf módosulatba történő átmenetének a kimutatására illetve az esetleges amorf-kristályos visszaalakulás nyomonkövetésére használják.

Ezekben az esetekben DSC görbéket vesznek fel külön a hatóanyagról, a segédanyagokról, ezek fizikai keverékéről, illetve az előállított gyógyszeres anyaggal töltött nanoszálról is. Az egyes komponensek jellegzetes DSC csúcsainak eltűnése, kiszélesedése, illetve vándorlása, információkat adhat a nanoszálképzés során lejátszódó folyamatokról.

A DSC grafikonra felvettük a fenofibrát, a PVP és a fenofibrát tartalmú nanoszálak görbéit. A fenofibrát esetében megfigyelhető egy erős endoterm csúcs 85,62 ⁰C-nál. A PVP-nél megfigyelhető egy kiszélesedett endoterm sáv 50-90 ⁰C között, ami a polimer dehidratációjának a következménye. A hatóanyaggal töltött nanoszálak esetében megfigyelhető,hogy míg a PVP dehidratációs sávja megmarad, addig a fenofibrát endoterm csúcsa már nehezen kivehető. Ez a jelenség valószínűleg a kristályos-amorf átmenet miatt következett be, bár itt megjegyezendő, hogy a PVP dehidratációs sávja némileg maszkolhatja a fenofibrát endoterm csúcsát.

2.3.4.1 ábra – Differenciális pásztázó kalorimetriás görbék a tiszta komponensek és a fenofibrát tartalmú nanoszálról

Értékmérés

Mint minden gyógyszerforma esetében, úgy a nanoszálas hordozó rendszerek esetében is igen fontos a homogén hatóanyag eloszlás. Éppen ezért, az előállított fenofibrát tartalmú nanoszálas rendszereket hatóanyag tartalmi meghatározásnak vetettük alá. A nanoszálak fenofibrát tartalmát UV spektroszkópiás módszerrel végeztük 289.3 nm-en, négy párhuzamos mérést végezve.

A kapott eredményeket a 2.3.5.1 táblázat összegzi. Amint az eredményekből látható, a nanoszálak fenofibrát tartalma 6.55-6.76% között volt, ez, az elméleti fenofibrát tartalom (6.45%) 101.54-104.80%-a. A kapott értékek alacsony szórást mutatnak, a nanoszálas rendszerek hatóanyag tartalma megfelelő, benne van az általánosan elfogadott 95-105%-os értékmérési határban.

2.3.5.1 táblázat – Az értékmérés elméleti és gyakorlati értékeinek számolása

Szétesésvizsgálat

Az elektrosztatikus szálképzéssel készült nanoszálak oldódási idejének szemléltetésére egy óraüvegbe 5 mL vízet töltöttünk, majd körülbelül egy 7 cm átmérőjű, 50 mg-s, tetszőlegesen kiválasztott fenofibrát tartalmű nanoszál-mintát helyeztünk a vízbe, majd 1 másodpercenként (mp) fotókat készítettünk a próba teljes feloldódásáig.

2.3.6.1 ábra- A fenofibrát tartalmú nanoszálak szétesése és oldódása

A bemutatott képekből jól látszik az előállított nanoszálas gyógyszerhordozók alkalmazhatósága a fenofibrát oldódásának megnövelésére. Amint az már többször volt említve, a nanoszálképzés eredményeképpen észlelt oldhatóság illetve a kioldódás sebességének növelése több faktor együttes hatásával magyarázható. Ezek közül talán a legfontosabb, hogy a szálképzés során a hatóanyag a legtöbb esetben amorfizálódik és a nanoszálak megnövekedett felülete stabilizálja ezt a módosulatot.Összehasonlítva a kristályos formával, az amorf módosulatnak magasabb kinetikus oldhatóság és gyorsabb kioldódást jellemzi. Ezek mellett, a nanoszálas rendszerek kicsi szálátmérője, magas felület-térfogat aránya, illetve magas porozitása, amint látható volt, gyors vízfelvételhez és sok esetben a szálas szövet azonnali feloldódásához vezetnek.

A kioldódás vizsgálatok eredményei

Két különböző in vitro kioldódást végeztünk. Az első esetben az FDA által javasolt módszert alkalmaztuk, amely egy tenzid tartalmú,a nátrium-dodecilszulfát oldattal történik. Ez a módszer lipofil, vízben gyengén oldódó hatóanyagokra lett kidolgozva. A második esetben vízben hasonlítottuk össze a hatóanyag és a nanoszálak kioldódását. Az elvégzett vizsgálatok alapján az előállított szálas mintákból várható volt a gyorsított kioldódás, figyelembe véve a fenofibrát amorfizációját, valamint a szálas minták esetében kialakított különösen nagy fajlagos felületet és magas porozitást.

A)FDA módszer

2.3.7.1 ábra – A nanoszál(kék) és a kristályos anyag(barna) in vitro kioldódási görbéje 25 mM nátrium-dodecilszulfátban

Ezt a módszert főleg a rosszul oldódó hatóanyagokra dolgozták ki, mint például a BCS II osztályba tartozó fenofibrát. A grafikonon jól megfigyelhető, hogy míg a nanoszálakból szinte instant kioldódik a teljes fenofibrát mennyiség (92,85%), addig a mikronizált hatóanyag lassan oldódik ki, még 30 perc után is csak 45,42%-ban oldódott ki. A párhuzamos méréseknél a szórás nagyon alacsony volt mindkét esetben.

B) Kioldódás vízben

2.3.7.2 ábra – A nanoszál(kék) és a kristályos anyag(barna) in vitro kioldódási görbéje vízben

A vízben való kioldódásnál még egyértelműbb a különbség, a mikronizált fenofibrát minimális mennyiségben, csupán 7,36%-ban oldódik ki, a nanoszálak esetében pedig újra nagyon magas, 86,94%-os a kioldódás mértéke. A két kioldódási módszert összehasonlítva látható, hogy míg a mikronizált fenofibrát esetében a tenzid alkalmazása pozitívan hatott a kioldódásra, addig a nanoszálak esetében nem figyelhető meg szignifikáns különbség a két módszer között.

Következtetések

A fenofibrát a koleszterinszint csökkentő gyógyszerek csoportjába tartozó PPARα analóg. Mivel a BCS II osztályba tartozik, a hatóanyag felszívódását és ezáltal biohasznosulását az oldhatóság hordozza, az utóbbi növelése pedig biohasznosulás növekedéshez vezethet.

A polimer-rostok szálas jellegük és kis átmérőjük miatt nagy fajlagos felület-térfogat aránnyal jellemezhetőek, ami előnyösen befolyásolja az oldódást, ugyanakkor a magas porozitás és a hatóanyagok amorf állapotban tartásának lehetősége szintén kedvező a feloldódás fokozására.

Kísérletes munkánk célja az volt, hogy a fenofibrátot polivinil-pirrolidon alapú, nanoszálas szerkezetű hordozóba ágyazzuk, ami által növelni tudnánk a kioldódás sebességét és a fenofibrát oldhatóságát.

A képződött szálakat először megvizsgáltuk mikroszkóp alatt. A mikroszkópos felvételeken jól látszik, hogy mindegyik esetben szálképzés történt, cseppesedés, illetve gyöngyösödés nélkül. A szálak átlagmérete mindegyik esetben a nanotartományba esik.

Az elektrosztatikus szálképzéssel készült nanoszálak DSC görbéit a tiszta komponensek és a hatóanyag nélküli (placebó) nanoszál görbéivel hasonlítottuk össze. A hatóanyaggal töltött nanoszálas szerkezet esetében a fenofibrát éles endoterm csúcsa(85,62 °C), még ha el is tűnik, árnyékolva van a PVP dehidratációs sávja által. Ez a jelenség valószínűleg a hatóanyag, elektrosztatikus szálképzés következtében kialakuló kristályos-amorf átmenetnek tulajdonítható be.

A kioldódás eredmények bebizonyitották, hogy a készült szálak már az első percekben leadják a hatóanyag szinte teljes mennyiségét. Az FDA által javasolt módszer esetében ez az érték 92,85% volt, a hatóanyag esetében pedig csak 45,42%. A vízben való kioldódásnal 86,94% volt a kioldódott fenofibrát mennyiség, míg a hatóanyagnál csupán 7,36%. Az elektrosztatikus szálképzés több mint kétszeresére növeli a hatóanyag oldhatóságát az FDA módszer szerint és majdnem tizenkétszeresére a vízben való kioldódás esetében.

A nanoszálak fenofibrát tartalma 6,65% tesz ki, ami nagyjából megegyezik az elméleti számitásainkkal, továbbá észrevehető az alacsony szórás az értékek között, amit az 1,33-as standard deviáció tanúsít.

A fenofibrát oldhatóságának illetve a kioldódási sebességének növekedését több tényező együttes hatásával magyarázhatjuk. A bemutatott eredmények tehát igazolták, hogy az elektrosztatikus szálképzés alkalmas a fenofibrát, mint rosszul oldódó hatóanyag oldhatóságának növelésére. A kapott eredmények pedig akár hasznosak lehetnek egy új formuláció kialakítására, amivel a fenofibrát gyakorlati problémáit orvosolni lehet.

Bibliográfia

Tziomalos K, Athyros V G – Fenofibrate: a novel formulation (Triglide™) in the treatment of lipid disorders: a review, Int J Nanomedicine. 2006 Jun; 1(2): 129–147.

Pestieau A, Krier F, Brouwers A, Streel B, Evrard B – Selection of a discriminant and biorelevant in vitro dissolution test for the development of fenofibrate self-emulsifying lipid-based formulations, Eur J Pharm Sci. 2016 Sep 20;92:212-9

Staels B et al. – Mechanism of Action of Fibrates on Lipid and Lipoprotein Metabolism, Circulation. 1998;98:2088-2093

Linga H, Luomab J T, Hillemanc D – A Review of Currently Available Fenofibrate and Fenofibric Acid Formulations, Cardiol Res • 2013;4(2):47-55

Miller D B, Spence J D – Clinical Pharmacokinetics of Fibric Acid Derivatives (Fibrates), Clin Pharmacokinet 1998 Feb; 34 (2): 155-162

Baka E – Doktori értekezés: Gyógyszerek oldhatóságának meghatározására alkalmas módszerek vizsgálata és fejlesztése, 2010.

Dévay A, Antal I – A gyógyszeres terápia biofarmáciai alapjai, Medicina Könyvkiadó Zrt., Budapest, 2009, 147-178.

Sebe I – Doktori értekezés: Nano- és mikroszálas gyógyszerhordozó rendszerek formulálása és a szálas struktúra topikális, terápiás alkalmazhatóságának in vitro és in vivo vizsgálata, Budapest, 2017

Amidon GL, Lennernäs H, Shah VP et al – A Theoretical Basis for a Biopharmaceutic Drug Classification: The Correlation of in Vitro Drug Product Dissolution and in Vivo Bioavailability, Pharm Res, 1995, 12: 413–420.

Szabó P – Ph.D. thesis: Applicability of rotary spun hydroxypropyl cellulose microfibers for the formulation of orodispersible tablets of poorly soluble drugs, 2016.

Nagy ZsK – Doktori értekezés: Innovatív gyógyszerhordozó rendszerek fejlesztése folyamatos gyógyszertechnológiai eljárásokkal, 2012.

Sebe I, Szabó P, Szabó KB et al – Incorporating small molecules or biologics into nanofibers for optimized drug release: A review, Int J Pharm, 2015, 494: 516–530.

Sebe I, Petzke M, Zelkó Romána, Szabó B – Nano- és mikroszálas rendszerek előállítása és gyógyszerészeti alkalmazásuk lehetőségei I., Acta Pharmaceutica Hungarica 83. 1-9 2013.

Huanga Z-M,, Zhangb Y-Z, Kotakic M, Ramakrishnab S – A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites, Composites Science and Technology 63 (2003) 2223–2253

Ko FK, Wan Y – Introduction to nanofiber materials, Cambridge University Press, Cambridge, UK, 2014, 101-107

Sipos E, Szabó ZI, Rédai E et al – Preparation and characterization of nanofibrous sheets for enhanced oral dissolution of nebivolol hydrochloride, J Pharm Biomed Anal, 2016, 129: 224–228.

Farmacopeea Română , Editia a X-a, Ed. Medicală, București, 1993.

European Pharmacopoeia, 8th Edition

Aude Pestieau – Selection of a discriminant and biorelevant in vitro dissolution test for the development of fenofibrate self-emulsifying lipid-based formulations, European Journal of Pharmaceutical Sciences 92 (2016) 212–219

Szabó P – Ph.D. thesis: Applicability of rotary spun hydroxypropyl cellulose microfibers for the formulation of orodispersible tablets of poorly soluble drugs, 2016.

Zheng-Ming Huang et al. – A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites, Composites Science and Technology 63 (2003) 2223–2253

http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/SzovettaniEsSejttaniVizsgaloModszerek/ch04s11.html

Kawabata et al. – Formulation design for poorly water-soluble drugs based on biopharmaceutics classification system: basic approaches and practical applications, Int J Pharm. 2011 Nov 25;420(1):1-10

Ling et al. – A Review of Currently Available Fenofibrate and Fenofibric Acid Formulations, Cardiol Res. 2013 Apr; 4(2): 47–55

Hanafy et al. – Pharmacokinetic evaluation of oral fenofibrate nanosuspensions and SLN in comparison to conventional suspensions of micronized drug, Adv Drug Deliv Rev. 2007 Jul 10;59(6):419-26

Miller and Spence – Clinical pharmacokinetics of fibric acid derivatives (fibrates), Clin Pharmacokinet. 1998 Feb;34(2):155-62

Guivarc'h et al. – A new fenofibrate formulation: results of six single-dose, clinical studies of bioavailability under fed and fasting conditions, Clin Ther. 2004 Sep;26(9):1456-69

Sauron et al. – Absence of a food effect with a 145 mg nanoparticle fenofibrate tablet formulation, Int J Clin Pharmacol Ther. 2006 Feb;44(2):64-70

Juenemann et al. – Biorelevant in vitro dissolution testing of products containing micronized or nanosized fenofibrate with a view to predicting plasma profiles, Eur J Pharm Biopharm. 2011 Feb;77(2):257-64

Griffin et al. – Comparison of in vitro tests at various levels of complexity for the prediction of in vivo performance of lipid-based formulations: Case studies with fenofibrate, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 86 (2014) 427–437

O'Shea et al. – Lipidic dispersion to reduce food dependent oral bioavailability of fenofibrate: In vitro, in vivo and in silico assessments, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 96 (2015) 207–216

Verbeeck et al. – The Lidose Hard Capsule Formulation of Fenofibrate is Suprabioavailable Compared to the Nanoparticle Tablet Formulation Under High-fat Fed Conditions, Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 18(1):61-7 · January 2015

Markus Vogt et al. – Dissolution enhancement of fenofibrate by micronization, cogrinding and spray-drying: Comparison with commercial preparations, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics Volume 68, Issue 2, February 2008, Pages 283-288