În prezent lucerna este cultivată pe suprafeţe întinse, în majoritatea ţărilor cu climat temperat, atât în emisfera nordică câ [303864]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ

VETERINARĂ A BANATULUI TIMIȘOARA

NR CONTRACT: 33370/21.07.2004

NR. TEMA 13

COD CNCSIS: 30

VALOARE 13000 RON

RAPORT FINAL

Tema: [anonimizat]:

Șef lucrări dr. MIHACEA SORINA

2004-2005

1. [anonimizat], atât în emisfera nordică cât și în cea sudică. Extinderea culturilor de lucernă se datorează posibilităților multiple de utilizare (Lesin și colab., 1979). Folosirea lucernei ca plantă furajeră ocupă însă primul loc ca și importanță. [anonimizat] a nutrețului și capacitatea de a [anonimizat] a fi reînsămânțată.

Lucerna este apreciată ca o cultură valoroasă nu numai pentru nutrețul pe care îl produce ci și datorită rolului pe care îl are în rotația culturilor. [anonimizat] a solurilor grele și tasate (Varga și colab., 1973; Puia și colab., 1994); [anonimizat] "fixatoare de azot" și plantele leguminoase.

În cazul lucernei rata de fixare biologică a azotului este de aproximativ 250kg/ha/an, comparativ cu 100kg/ha/[anonimizat], [anonimizat], substanțele nutritive din sol și umiditatea (Werner și colab., 1991; Pamfil, 2000).

Prezența în sol a unor poluanți chimici are un efect negativ asupra procesului de fixare biologică a azotului. Dintre poluanții chimici o importanță deosebită o [anonimizat], [anonimizat] a eliminării plumbului din benzina etilată o dată cu gazele de eșapament ale automobilelor. [anonimizat] a plumbului. [anonimizat], dotorită proceselor pedogenetice care au stat la baza formării solurilor.

[anonimizat] a azotului prezintă o importanță deosebită.

[anonimizat] a acestora (Wood, 1995; Butnaru și colab., 2000; Jurcă și colab., 2002).

[anonimizat], care sunt bistraturi fosfolipidice. Astfel, [anonimizat]. Transportorii transmembranari posedă un domeniu extracelular de legare la care ionii se atașează chiar înainte de transport și o structură transmembranară. Domeniul de legare este responsabil pentru specificitatea transportului iar domeniul transmembranar facilitează transferul ionilor din spațiul extracelular prin mediul hidrofobic al membranei în celulă (Lasat și colab., 1998).

În sol, ionii metalici aderă la rădăcini, dar numai o parte sunt absorbiți în celule. O fracțiune semnificativă este adsorbită fizic la pereții celulelor rădăcinii și nu poate fi transferată spre organele aeriene. O altă fracțiune traversează membranele celulelor rădăcinii, urmând apoi două căi: o parte este imobilizată în vacuole, iar altă parte trece în sistemul vascular al rădăcinii, fiind transferată spre organele aeriene (Peterson și colab., 1983; Lasat și colab., 1998).

Metalele grele prezente la nivelul rădăcinilor pot să interacționeaze cu semnalele chimice schimbate între cei doi parteneri ai simbiozei și totodată cu sistemul enzimatic care asigură degradarea pereților celulari în vederea pătrunderii bacteriilor fixatoare de azot.

Se cunoaște că o suprafață specifică din rădăcina plantei, situată între meristemul apical și zona perișorilor absorbanți secretă un exudat care are rolul de a atrage bacteriile și totodată de a induce exprimarea genelor specifice nodulației (genele nod) în acestea. La rândul lor, bacteriile secretă compuși specifici, care conduc la deformarea și curbarea perișorilor absorbanți (Franssen și colab., 1991; Downie și colab., 1999; Stougaard și colab., 2000). Compușii chimici produși de fiecare partener al asocierii asigură condițiile pentru inițierea simbiozei. Exudatele secretate de către plante sunt compuși din grupul flavonoizilor, specifici fiecărei specii în parte.

După ce a avut loc schimbul de semnale chimice între cei doi parteneri ai simbiozei, bacteriile se atașează la suprafața perișorilor absorbanți, în zona vârfului de creștere. Acumularea bacteriilor la locul de atașare are loc treptat, iar celula perișorului absorbant răspunde printr-un proces de deformare și curbare. Se formează astfel un spațiu semiînchis, care cuprinde bacteriile aproape în totalitate (Werner și colab., 1991).

După acumularea bacteriilor în spațiul format prin curbarea perișorului absorbant are loc o degradare a peretelui celular vegetal și totodată o invaginare a membranei celulare.

Pătrunderea efectivă a bacteriilor în interiorul celulei perișorului absorbant se produce prin invaginarea plasmalemei. În jurul invaginației se formează un canal de infecție care înaintează spre cortexul interior al rădăcinii. Acesta este alcătuit din compuși similari celor care formează peretele celular vegetal.

La un anumit moment, canalul de infecție se degradează și bacteriile sunt eliberate în interiorul celulelor rădăcinii, prin endocitoza membranei celulare. Apoi, în jurul celulelor bacteriene se dezvoltă un înveliș specific, denumit membrană peribacteroidă (PBM). Celulele bacteriene, împreună cu membrana peribacteroidă și spațiul peribacteroid alcătuiesc o unitate funcțională denumită simbiosom În interiorul simbiosomilor bacteriile se diferențiază în forma lor endosimbiotică – bacteroizii și încep fixarea azotului (Downie și colab., 1999).

În plante, metalele grele inhibă biosinteza proteinelor și favorizează hidroliza acestora. De asemenea inhibă activitatea enzimelor care metabolizează azotul: nitrat reductaza, glutamat dehidrogenaza, glutamin-sintetaza (Kastori, 1997). Nitrat reductaza (azoferedoxina) face parte alături de nitrogenază (molibdoferedoxina) din complexul enzimatic care catalizează fixarea biologică a azotului, denumit sistemul nitrogenazic. Are rol în transferul de electroni și în procesul de hidroliză a ATP-ului. Glutamin sintetaza este o enzimă specifică asimilării amoniacului produs în bacteroid, codificată de o genă nodulin târzie. Se evidențiază astfel efectul plumbului asupra procesului de reducere a azotului molecular și asupra asimilării amoniacului (Haaker și colab., 1984; Lehlinger și colab., 1992).

În prezența unor concentrații mari de plumb valoarea nutritivă a produselor este redusă datorită scăderii conținutului de proteină brută, calciu și fosfor (Avram și Medrea, 1994).

Metalele grele au un efect specific atât asupra procesului de fotosinteză cât și a conținutului de pigmenți. Conținutul fotosistemului I și II este redus și sunt inhibate: reacția Hill, degajarea de O2, transportul electronilor și fosforilarea oxidativă a glucidelor și lipidelor. De asemenea, concentrațiile mari de metale grele inhibă reacțiile ciclului Calvin la plantele C3 iar la plantele C4 este inhibată carboxilarea fosfoenol-piruvatului (Maciejwska și colab., 1997; Kastori, 1997).

Prezența metalelor grele în citoplasmă și mitocondrii inhibă respirația celulară. În citoplasmă este inhibată activitatea enzimelor care determină oxidarea glucozei. În mitocondrii sunt inhibate reacțiile ciclului Krebbs și transportul electronilor în procesele de fosforilare oxidativă (Kastori, 1997).

Metalele grele reduc plasticitatea, elasticitatea pereților celulari și hidratarea celulară și în mod frecvent inhibă diviziunea celulară. Concentrațiile foarte mari de metale grele pot fi mutagenice (Kastori, 1997; Butnaru și colab., 2000).

In cadrul prezentului proiect s-a urmărit atât influența pe care o are plumbul asupra partenerilor simbiozei Rhizobium meliloti – Medicago sativa, cât și asupra sistemului simbiotic însuși. S-a urmărit astfel efectul plumbului asupra bacteriei Rhizobium meliloti și a plasmidelor pe care se află genele specifice nodulației. A fost analizat ADN total, care conține si plasmidele deoarece în cazul speciei Rhizobium meliloti, genele specifice procesului de simbioză sunt localizate pe cele două plasmide extrem de mari. De asemenea a fost stabilit efectul plumbului asupra germinației semințelor și primelor faze ontogenetice la lucernă, deoarece acestea au cea mai mare sensibilitate la acțiunea factorilor epigenetici.

Numărul nodozităților și dinamica apariției acestora au evidențiat efectul plumbului fixat la nivelul rădăcinilor. În scopul stabilirii modificărilor induse de prezența plumbului asupra sintezelor proteice și eventualul caracter mutagen al acestuia au fost utilizate plante dezvoltate in vitro.

Au fost aplicate metode biochimice clasice și totodată metode moderne de biologie moleculară, care au fost adaptate și îmbunătățite în vederea obținerii unor rezultate corespunzatoare.

Markeri RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

In cadrul prezentului proiect a fost aplicată tehnica RAPD deoarece este o metodă rapidă, relativ ieftină și bine adaptată pentru obținerea unei amprente genetice neradioactive.

Metoda RAPD utilizează un singur primer constituit din aproximativ zece nucleotide va identifica secvențe omoloage în ADN analizat și va determina amplificarea unor diferite regiuni ale genomului.

Această metodă se bazează pe tehnica PCR.

În timpul reacției PCR vor fi generate un set de fragmente de diferite mărimi, iar în urma amplificării va exista suficient ADN pentru a putea fi vizualizat prin colorare cu bromura de etidiu. În general, pentru un genom de mărime medie, vor fi generate între 5 și 10 fragmente.

Fragmentele amplificate de ADN sunt supuse electroforezei într-un gel de agaroză, ele separându-se în funcție de greutatea moleculară. Colorarea se face cu bromură de etidiu, iar vizualizarea benzilor de ADN se face prin expunerea gelului ce conține ADN marcat la o sursă de radiații UV.

Metoda este utilizată îndeosebi pentru identificarea diversității genetice și studiilor de filogenie.

2. MATERIALE SI METODE DE LUCRU

2.1 Material vegetal și microbiologic:

În experimente au fost utilizate semințe din specia Medicago sativa, soiul Irisz și Rhizobuim meliloti, tulpina Rm 41, provenite de la Centrul de Cercetări Biologice Szeged, Ungaria

2.2.Metode de lucru utilizate

2.2.1. Determinarea efectului plumbului asupra viabilității bacteriei

Metoda rondelelor

În scopul evaluării inițiale a efectului plumbului asupra bacteriei Rhizobium meliloti s-a utilizat metoda rondelelor.

Astfel, cultura bacteriană dezvoltată în mediu TA (Tabelul 2.1) lichid timp de 6 ore la 320 C, cu agitare continuă, s-a distribuit pe mediu solid, în vase Petri utilizând metoda inundării. Apoi discuri de hârtie cu diametrul de 6 mm au fost imersate în soluții cu diferite concentrații de plumb și dispuse pe plăcile inoculate. Discuri imersate în apă distilată au fost utilizate ca martor. Experimentele s-au efectuat în trei repetiții. După 24, 48 și 72 de ore au fost măsurate diametrele suprafețelor de letalitate. Suprafața letală a fost determinată cu formula:

A= [(D/2)2 – (d/2)2]

unde D = diametrul suprafeței pe care cultura bacteriană a fost omorâtă

d = diametrul discului de hârtie.

Datele obținute au fost prelucrate statistic.

Tabelul 2.1 Compoziția mediului TA (1l ) (Sambrook, 1989)

Metoda spectofotometrică

Un volum de 10µl dintr-o cultură bacteriană Rhizobium meliloti a fost inoculat în 5 ml de mediu TA, suplimentat cu diferite concentrații de plumb: 50, 100, 500 și 1000 ppm.

Cultura s-a dezvoltat la 320 C, cu agitare continuă. După 48 ore s-a determinat densitatea optică a culturilor obținute, comparativ cu varianta martor. Măsurătorile s-au efectuat la lungimea de undă de 600 nm, luând ca etalon mediul de cultură utilizat; experimentele s-au efectuat în 5 repetiții, iar datele au fost prelucrate statistic.

2.2.2 Evaluarea efectului plumbului asupra plasmidelor purtătoare ale genelor specifice nodulației

Extragerea ADN din celulele bacteriene

Dezvoltarea culturii bacteriene a avut loc la o temperatură de 32C, timp de 48 ore, cu agitare continuă (225 rot/min); apoi, soluția bacteriană a fost introdusă în două tuburi sterile (1.5 ml) și s-a centrifugat timp de 2 min (13000 rot/min); s-a îndepărtat supernatantul, iar sedimentul obținut s-a suspendat în 50l soluție TGE (25mM Tris, 10mM EDTA, 50mM glucoză suplimentată cu lizozim în concentrație de 2mg/ml), printr-o agitare ușoară, după care soluțiile obținute s-au transferat într-un singur tub. Amestecul s-a menținut în gheață timp de 10 min.

S-au adăugat apoi 200l soluție NS (0.2M NaOH, 1.0% SDS), s-a agitat ușor, apoi amestecul a fost incubat în gheață timp de 5 minute; s-au adăugat 150 l soluție acetat de potasiu (K-CH3COOH 3-5M, pH 5.5), răcită în prealabil în gheață, s-a agitat ușor și amestecul a fost incubat din nou în gheață timp de 10 minute. Amestecul obținut a fost centrifugat timp de 10 minute (15000rot/min) la temperatura de 4șC iar supernatantul (aproximativ 450 l) a fost transferat într-un tub curat.

La supernatantul separat s-a adăugat un volum de 450 l fenol, iar amestecul a fost centrifugat (13000 rot/min) timp de 5 minute. Supernatantul s-a transferat într-un tub curat.

La supernatantul separat s-au adăugat 400 l amestec cloroform: izoamil alcool 24:1 și amestecul s-a centrifugat 5 minute (13000 rot/min) la temperatura camerei. La supernatantul transferat într-un tub curat s-a adăugat un volum de 800l alcool 96% și amestecul s-a menținut la -20°C, timp de 40min.

Apoi amestecul a fost centrifugat timp de 10 minute (15000 rot/min), la 4°C. Supernatantul s-a eliminat iar precipitatul a fost spălat cu etanol 70% și uscat și dizolvat în 10l apă distilată sterilă.

Analiza ADN bacterian prin tehnica PCR

Analiza PCR a fost realizată pentru a identifica eventualele modificări care apar in structura ADN.

Amestecul de amplificare a fost constituit din ADN, Taq polimerază, solutie tampon, MgCl2, și cei doi primeri specifici pentru gena nif (Tabelul 2.2).

Tabelul 2.2 Compoziția amestecului de amplificare

Condițiile de amplificare au fost următoarele:

A. Denaturare 900 C – 3 minute

B. 35 de cicluri 900 C – 30 secunde

500 C- 1 minut

720 C- 1 minut

C. Sinteza ADN-ului 720 C- 3 minute

Produșii de amplificare au fost analizați prin electroforeză în gel de agaroză 2% si apoi vizualizați prin iluminare UV.

2.2.3 Evaluarea efectului plumbului asupra germinării semințelor la lucernă

Semințele de lucernă, sterilizate în prealabil au fost germinate pe mediu de agar 1% suplimentat cu plumb în două concentrații 50 ppm și 500 ppm, pentru a determina care este gradul de toxicitate al plumbului. Au fost efectuate măsurători asupra rădăcinilor după 24, 48 și 72 ore de la trecerea lor pe mediu

2.2.4.Realizarea testului de nodulație

A. Sterilizarea semințelor

În experiment au fost utilizate semințe care au fost sterilizate după cum urmează:

– spălare cu etanol – câteva secunde;

– imersare în HgCl2 0,1%, timp de 5 min;

– spălare de 5 ori cu apă distilată sterilă;

– menținere în apă distilată sterilă timp de 2 – 5h la 40C ;

B. Transferul semințelor pe mediul de germinare

Pentru germinare s-a utilizat un mediu de agar 1% în apă distilată, sterilizat în prealabil.

Mediul de cultură s-a încălzit până a devenit un lichid omogen și apoi a fost turnat în cutii Petri sterile. După răcirea mediului, semințele sterilizate au fost așezate astfel încât să nu aibă contact una cu cealaltă. Cutia se întoarce în așa fel încât rădăcinile să nu crescă pe mediu.

Semințele sunt menținute la temperatura camerei, în întuneric, timp de 12h pentru germinare.

C. Transferul plantulelor pe mediul de cultură Gibbson

Mediul de cultură Gibbson solid, preparat în prealabil a fost omogenizat prin încălzire și repartizat in tuburi, câte 20 ml/tub (Tabelul 2.3). Mediul de cultură a fost suplimentat cu diferite concentrații de acetat de plumb, realizând astfel variantele experimentale. Tuburile au fost sterilizate prin autoclavare la 121 0 C, după ce s-au confecționat dopuri din vată.

După sterilizare tuburile cu mediu se așează în poziție înclinată și se lasă să se răcească.

Tabelul 2.3 Compoziția mediului de cultură Gibbson (Gibbson, 1983)

Semințele germinate pe agar 1% au fost transferate în tuburile pregătite în prealabil, având grijă ca rădăcinile să nu fie rupte. Plantele sunt menținute apoi în condiții controlate de lumină și temperatură: 18 ore lumină, 6 ore întuneric, temperatura 210 C.

D. Inocularea plantelor cu cultura bacteriană Rhizobium meliloti (Rm41).

O colonie bacteriană Rm 41 a fost inoculată în 20 ml mediu de cultură TA, suplimentat cu streptomicină în concentrație de 200µg/ml (Tabelul 2.1). Incubarea a avut loc timp de 12 – 14h la 320 C, cu agitare continuă.

Cultura bacteriană obținută a fost centrifugată timp de 10 minute, la o viteză de rotație de 6000 rot/min. Supernatantul a fost eliminat, iar sedimentul a fost resuspendat cu grijă în 20 ml soluție NaCl 0,9%. Cultura astfel obținută a fost utilizată apoi pentru inocularea plantelor de lucernă.

După 3 zile de la trecerea plantulelor în tuburi fiecare plantă a fost inoculată cu 200µl cultură bacteriană preparată anterior. Plantele inoculate s-au menținut în condiții controlate de temperatură și iluminare 18 ore lumină, 6 ore întuneric, temperatura 210 C

Creșterea rădăcinilor și dinamica apariției nodozităților au fost urmărite în timp.

2.2.5. Extragerea și purificarea ADN-ului genomic vegetal metoda CTAB (Sambrook, 1989)

Pentru extragerea ADN-ului genomic vegetal a fost utilizat țesut foliar proaspăt recoltat (Tabelul 2.4)

Tabelul 2.4 Reactivii și soluțiile utilizate pentru extracția și purificarea ADN genomic vegetal

Mod de lucru:

Frunzele proaspăt recoltate se introduc într-un tub Eppendorf, se adaugă 200 μl soluție de extracție, și se mojarează până la omogenizare completă. Se adaugă apoi 550 μl soluție de extracție și se agită ușor.

Amestecul se incubează la 65o C (într-o baie de apă) timp de 30 – 120 minute;

Se adaugă 500 μl amestec cloroform: izoamilalcool ( 24:1), se agită bine (prin vortexare)

4. Amestecul obținut se centrifughează timp de 5 minute la temperatura camerei, la o viteză de 10000 rot/min;

5. În urma centrifugării se separă două faze; faza superioară se colectează într-un tub curat și se adaugă 500 μl izopropanol; Amestecul se agită bine, pentru a avea loc precipitarea acizilor nucleici.

6. Amestecul se centrifughează timp de 5 minute la o viteză de 10000 rot/min; se îndepărtează supernatantul;

7. Precipitatul obținut se spală cu 1ml etanol 70% și apoi se usucă timp de 10-15 min, la temperatura camerei.

8. Precipitatul uscat se dizolvă în 50 μl soluție TE;

2.2.6. Amplificarea ADN-ului genomic vegetal

Reactivi și soluții necesare

Primeri RAPD achiziționați de la firma ROTH, cu următoarele secvențe:

5´TGC4CGAGCTG 3´ – 1060

5´GTTGCGATCC 3´ – 3010

5´GTGACGTAGG 3´ – 2998

5´GGGTAACGC 3´- 2999

5´ CACCTGCCGC 3´ – 5

Primerii au fost diluați în 1 ml apă distilată sterilă, rezultând o soluție cu concentrația de 10 pmol/l.

Kit Taq Polymerase, Promega care cuprinde:

Soluție tampon 10x , cu MgCl2 inclusă

Taq polimeraza 5 U/µl

Nucleotide – amestec dATP, dTTP, dCTP și dGTP, în concentrație de 10 mM

Au fost realizate mai multe amestecuri de amplificare, cu primerii si tipurile de ADN specifice (Tabelul 2.5).

Tabelul 2.5 Compoziția amestecului de amplificare

Condițiile de amplificare au fost următoarele:

A. Denaturare 940 C – 3 minute

B. 45 de cicluri 940 C – 3 minute

360 C- 1,5 minute

720 C- 2 minute

C. Sinteza ADN-ului 720 C- 3 minute

4.2.4. Electroforeza în gel de agaroză

Electroforeza în geluri de agaroză este metoda standard utilizată pentru a separa fragmente de ADN. În urma separării, fragmentele de ADN pot fi vizualizate prin iluminare UV.

Materiale necesare:

agaroza

soluția tampon TEA: 0,04 MTris – acetat; 0,002 M EDTA

bromura de etidium (10mg/ml)

soluție de migrare albastru bromfenol – xilen cyanol 10x (pentru 100 ml soluție: 0,25 g albastru de bromfenol, 0,25g xilen cianol și 30g de glicerină se dizolvă în 100 ml apă distilată.

Mod de lucru:

Pregătirea matriței pentru formarea gelului

1.A fost utilizată o placă pentru electroforeză orizontală, din care cu ajutorul unei benzi adezive impermeabile s-a format o matriță închisă.

2. S-a montat un pieptene care a condus la formarea godeurilor în care vor fi introduse probele de ADN

3. Pentru prepararea gelului s-a cântărit cantitatea necesară de agaroză (0,7g/100ml soluție tampon TEA pentru ADN-ul genomic izolat și purificat; 1,5g/100ml soluție tampon TEA pentru produșii reacției PCR). Amestecul a fost încălzit până ce agaroza este complet dizolvată.

4. Amestecul obținut a fost răcit până la o temperatură de aproximativ 500C, apoi se adăugă 5μl soluție bromură de etidiu. Soluția astfel obținută a fost turnată în matriță.

5. Soluția de agaroză a fost lăsată să se răcească în matriță până la solidificarea completă.

6. După răcirea gelului, a fost îndepărtat piaptănul..

7. Gelul astfel obținut a fost introdus în tancul de electroforeză în care se adaugă soluția tampon TEA până când gelul este acoperit.

8. În fiecare probă de ADN s-a adăugat un volum de 3μl soluție colorant de migrare. Au fost analizate volume de 5μl soluție ADN genomic izolat și 25 μl soluție de produși PCR.

9. Migrarea ADN – ului în gel a avut loc la tensiunea de 80 – 100 V, timp de aproximativ 2 ore.

10. ADN – ul din gel a fost vizualizat cu ajutorul unui transiluminator UV

11. Gelurile au fost fotografiate cu sistemul PHOTODOCUMENTATION SYSTEM Model: DP-001.FDC.

3. REZULTATE ȘI DISCUȚII

3.1. Evaluarea efectului plumbului asupra partenerilor sistemului simbiotic Rhizobium meliloti – Medicago sativa

3.1.1 Determinarea efectului plumbului asupra viabilității bacteriei Rhizobium meliloti prin metoda rondelelor și metoda spectofotometrică

Metoda rondelelor

În prima serie experimentală s-au utilizat următoarele concentrații: Pb 1, 10, 50, 100, 500 și 103 ppm. S-a constatat că în cazul concentrațiilor de Pb 1, 10, 50 și 100 ppm suprafețele de letalitate au fost identice cu cele induse de apa distilată. Concentrațiile de 500 și 100 ppm au avut un efect negativ redus.

De aceea s-a realizat cel de-al doilea experiment în care seria de concentrații a fost extinsă : Pb 1, 10, 50, 100, 500, 103, 104, 5×104 and 105 ppm (Tabelul 3.1).

Tabelul 3.1 Suprafața de letală indusă de plumb (Pb2+) asupra culturii Rhizobium

Concentrațiile de 1, 10, 50 și 100 ppm nu au avut un efect nociv asupra bacteriilor. Aria de letalitate a fost mai extinsă comparativ cu martorul în cazul concentrațiilor mai mari de 100 ppm. Astfel în cazul concentrației de 500 ppm aria de letalitate a crescut cu 83,64%.

Atunci când concentrația plumbului a crescut de 10 ori, de la 103 ppm la 104 ppm aria letală a crescut de două ori. La concentrații mai mari efectul a fost mult accentuat.

În cazul metodei de lucru prezentate mai sus metalul greu a fost prezent în rondelele de hârtie. În timp, acesta a difuzat și a distrus celulele bacteriene pe o suprafață mai mică sau mai mare în jurul rondelei, în funcție de concentrație.

Metoda spectofotometrică

În scopul obținerii unor rezultate cât mai complexe pentru evidențierea efectului plumbului asupra bacteriei Rhizobium meliloti s-a utilizat și o altă metodă, și anume metoda spectofotometrică.

Densitatea optică a fost determinată prin măsurători spectofotometrice la lungimea de undă de 600 nm, pentru toate variantele de lucru (Tabelul 3.2 ; Fig. 3.1).

Tabelul 3.2 Efectul plumbului asupra bacteriei Rhizobium meliloti, determinat prin metoda spectofotometrică

Fig. 3.1. Culturile bacteriene rezultate în urma suplimentării mediului de cultură cu plumb, în diferite concentrații

1 – control

2- Pb 50 ppm

3- Pb 100 ppm

4- Pb 400 ppm

5- Pb 600 ppm

Concentrațiile de 50 și 100 ppm au avut un efect negativ asupra diviziunii celulelor bacteriene, dar efectul nu a fost accentuat. Efectul nociv al plumbului în concentrații de 400 și 600 ppm a fost foarte puternic, densitatea optică a culturilor bacteriene fiind foarte scăzută.

S-a constatat că toxicitatea plumbului se manifestă în măsură mult mai mare atunci când celulele bacteriene sunt cultivate în mediu lichid suplimentat cu plumb, comparativ cu difuzia din rondelele imersate în soluția de plumb.

Efectul plumbului asupra bacteriilor a fost similar cu cel asupra plantelor. Concentrațiile de 50 și 100 ppm au un efect nociv redus, iar concentrațiile mai mari au efecte negative mai accentuate.

Culturile de bacterii dezvoltate în mediu lichid au fost utilizate, după ce s-au efectuat măsurătorile spectofotometrice pentru extracția și purificarea ADN. S-a analizat AND total, care conține și ADN plasmidial deoarece în cazul speciei Rhizobium meliloti, genele specifice procesului de simbioză sunt localizate pe două plasmide extrem de mari, denumite megaplasmide.

Evaluarea efectului plumbului asupra plasmidelor purtătoare ale genelor specifice nodulației la Rhizobium meliloti

Plasmidele prezente în bacteria Rhizobium meliloti au dimensiuni foarte mari (aprox. 1500 kb) și de aceea extracția și purificarea lor a fost dificilă.

A fost necesară efectuarea unui număr de mare de minipreparate, care au fost unificate și purificate împreună.

Din cauza concentrațiilor foarte mici ale probelor de ADN plasmidial obținute nu a fost posibilă evidențierea prin electroforeză în gel de agaroză a fragmentelor rezultate în urma secționării cu enzime de restricție.

De aceea a fost extras și purificat ADN total, care conține și plasmidele.

În cazul variantelor Pb 400 și 600ppm nu a fost posibilă extracția ADN deoarece numărul de celule bacteriene în probe a fost foarte redus (Fig. 3.2).

Fig. 3.2 Analiza prin electroforeză în gel de agaroză 1% a ADN total, extras din culturile bacteriene dezvoltate în mediu suplimentat cu diferite concentrații de plumb

În cazul variantelor martor, Pb 50 și 100 ppm ADN a fost amplificat cu un primer RAPD – 5’ TGCCGAGCTG 3 iar produșii de amplificare au fost analizați prin electroforeză în gel de agaroză și vizualizați prin iluminare UV în prezența bromurii de etidiu. Nu s-au evidențiat diferențe între varianta martor și variantele de lucru.

In continuare, ADN extras din toate variantele experimentale a fost amplificat prin reacții PCR cu primerii specifici genei nif A. A fost analizată această genă deoarece este implicată în sinteza unor componente care alcătuiesc complexul nitrogenazic (azoferedoxina și cofactorul MoFe, din molibdoferedoxina) având un rol esențial în procesul de fixare biologică a azotului.

Produșii formați în urma parcurgerii celor 35 de cicluri de amplificare au fost analizați prin elerctroforeză în gel de agaroză. Deoarece dimensiunile fragmentelor ADN care se formează în urma amplificării sunt reduse, a fost necesară alegerea unui gel de agaroză mai concentrat (2%), comaprativ cu gelul utilizat la analiza ADN total (Fig. 3.3).

Fig. 3.3. Analiza prin electroforeză în gel de agaroză a produșilor rezultați în urma amplificării ADN total cu primerii specifici genei nif A

În cazul variantelor experimentale dezvoltate în prezența plumbului nu a fost posibilă evidențierea produșilor de amplificare. În cazul celor două variante martor au fost evidențiati produșii de amplificare specifici genei nif A.

Se poate spune că situsurile de legare a primerilor, în cazul prezenței plumbului în mediul de cultură au fost modificate, nefiind posibilă amplificarea ADN corespunzător genei de interes.

3.1.3. Evaluarea efectului plumbului asupra germinării semințelor și primelor faze ontogenetice la lucernă

În prima serie experimentală semințele de lucernă au fost germinate pe mediu de agar 1% suplimentat cu plumb în două concentrații 50 ppm și 500 ppm, pentru a determina care este gradul de toxicitate al plumbului. Au fost efectuate măsurători asupra rădăcinilor după 24, 48 și 72 ore de la trecerea lor pe mediu (Tabelul 3.3).

Tabelul 3.3 Influența plumbului asupra creșterii rădăcinilor la lucernă

S-a constatat că în cazul utilizării concentrației de 50 ppm, concentrația întâlnită în solurile din partea de vest a țării, efectul negativ asupra creșterii rădăcinilor a fost redus (d= -0,23 cm).

Concentrația mai ridicată, Pb 500 ppm a avut un efect negativ chiar și după 24 ore. După 72 de ore efectul plumbului a fost accentuat, dar creșterea nu a fost stopată (d= – 1,26).

În continuare au fost testate mai multe concentrații de Pb, deoarece s-a constatat inițial că în primele 24 ore efectul plumbului în concentrație de 50 ppm este neglijabil, iar concentrația de 500 ppm are un efect negativ accentuat, dar nu este letală.

3.2 Evaluarea fenotipică și biochimică a efectului plumbului asupra sistemului simbiotic Rhizobium meliloti – Medicago sativa

3.2.1. Determinarea numărului și dinamicii apariției nodozităților la lucernă, în prezența plumbului în mediul de cultură

Semințele de lucernă, germinate pe mediul de agar 1% au fost transferate pe mediu Gibbson suplimentat cu diferite concentrații de plumb: 50 ppm; 100 ppm și 250 ppm, 400 ppm și 500 ppm. Ca proba martor s-a utilizat mediul Gibbson.

Am ales concentrația de 50ppm pentru că aceasta este concentrația prezentă în mod natural în solurile din partea de vest a țării. Concentrațiile mai mari au fost alese pentru a determina care este concentrația maximă de plumb la care plantele de lucernă pot fi cultivate in vitro și totodată care este concentrația la care apar mutații în genomul acestor plante, mutații care să fie evidențiate cu ajutorul markerilor RAPD.

În scopul verificării rezultatelor obținute experimentul a fost realizat de cinci ori. În cadrul fiecărui experiment au fost realizate 8-10 repetiții repetiții pentru fiecare variantă experimentală. Creșterea plantulelor transferate pe medii suplimentate cu diferite concentrații de plumb a fost urmărită comparativ cu varianta martor. Lungimea rădăcinilor și dinamica apariției nodozităților au fost urmărite din 3 în 3 zile.

Experiment I

În cadrul primului experiment au fost utilizate concentrațiile de plumb de 50, 100, 250 și 500 ppm. S-a observat că plantulele transferate pe mediul suplimentat cu plumb în concentrație de 500 ppm nu s-au dezvoltat, astfel că nu a fost posibilă urmărirea creșterii rădăcinilor. Pentru celelalte variante experimentale a fost urmărită dinamica creșterii rădăcinilor pentru fiecare repetiție, determinându-se apoi media pe fiecare variantă (Tabelul 3.4.; Fig. 3.4).

Tabelul 3.4 Evidențierea efectului plumbului asupra creșterii plantulelor de lucernă

S-a constatat că diferitele concentrații de plumb influențează negativ creșterea rădăcinilor plantelor de lucernă, astfel:

– La concentrații de 250 ppm creșterea este foarte înceată, înregistrându-se valori de până la 4 cm, în condițiile în care variantele martor ajung la valori de peste 18 cm in același interval de timp ;

– La concentrații de 100 ppm rădăcinile se dezvoltă mai rapid, dar și aceste valori sunt mult sub media martorului, aparatul foliar fiind slab dezvoltat ;

– la concentrații de 50 ppm diferențele sunt mult mai mici, dar totuși semnificative, comparativ cu proba martor.

Analizând rezultatele din prima serie experimentală se poate afirma că prezența plumbului în concentrație de 50 ppm afectează creșterea, având efecte negative asupra dezvoltării plantelor. Concentrația de 100 ppm are un efect foarte semnificativ care se accentuează în timp. La prezența plumbului în mediul de cultură în concentrații de 250 ppm diferențele care apar sunt foarte mari, se accentuează în timp, dezvoltarea plantei fiind puternic afectată.

Astfel, după 6 zile de la inoculare diferența dintre varianta martor și varianta Pb 50 ppm a fost de 2,4 cm, la 9 zile a crescut la 5,4 cm, la 12 zile s-a înregistrat o diferență de 7,5 cm, la 15 zile diferența a crescut la 7,7 cm, urmând ca la ultima citire, la 20 de zile, diferența să fie de 9,1 cm.

Experiment II

Experimentele au fost reluate, utilizându-se medii de reacții suplimentate cu concentrații de 50, 100 și 250 ppm și 400 ppm. Concentrația de 500 ppm a fost înlocuită cu concentrația 400 ppm, în scopul stabilirii dozei letale (Tabelul 3.5; Fig. 3.5).

Tabelul 3.5 Evidențierea efectului plumbului asupra creșterii plantulelor de lucernă

Analiza rezultatelor obținute a evidențiat că la 6 zile de la inoculare diferența între proba martor și plantele crescute pe concentrația de 50 ppm au fost de 2,4 cm. După 9zile diferența a fost 4,22 cm, iar după 12 respectiv 15 zile diferențele s-au accentuat, ajungând la 6,07 cm, respectiv 8,25 cm. La ultima măsurătoare diferența a fost de 9,3 cm.

În cazul variantei 100 ppm s-au înregistrat următoarele diferențe față de martor: la 6 zile – 3,27 cm, la 9 zile – 7,65 cm, la 12 zile – 10,57 cm, la15 zile – 10.74 cm, la 20 zile – 12,37 cm. Din aceste date rezultă că plumbul are un efect negativ asupra plantelor, diferențele fiind semnificative.

În cazul utilizării concentrației de 250 ppm diferențele au fost foarte semnificative: la 6 zile – 4,7 cm, la 9 zile – 9,73 cm, la 12 zile – 14,57 cm, la 15 zile – 15,88 cm, la 20 zile – 17,85 cm. Aparatul foliar a fost foarte slab dezvoltat.

La concentrația de 400 ppm plantele nu au crescut, astfel că nu a fost posibilă determinarea lungimii rădăcinilor, această concentrație fiind considerată a fi letală.

Experimentele III și IV

În continuare au fost realizate încă două serii experimentale, distanțate în timp, în scopul verificării rezultatelor obținute anterior.

Astfel a fost urmărită dinamica creșterii rădăcinilor (Tabelul. 3.6 , Fig. 3.6. , Tabelul 3.7, Fig 3.7)

Tabelul 3.6 Evidențierea efectului plumbului asupra creșterii plantulelor de lucernă (Experiment III)

Cel de-al treilea experiment a evidențiat aceleași diferențe semnificative față de proba control ca și primele două.

Tabelul 3.7 Evidențierea efectului plumbului asupra creșterii plantulelor de lucernă (Experiment IV)

La al patrulea experiment s-au obținut aproximativ aceleași date, fapt ce rezultă și din graficele de mai sus.

Din aceste plante a fost prelevat materialul vegetal pentru izolarea ADN-ului genomic

Fig. 3.8 Evidențierea efectului plumbului asupra creșterii rădăcinilor la

Medicago sativa

1 – Martor

2 – Pb 50 ppm

3- Pb 100 ppm

4 – Pb 250 ppm

Observațiile efectuate pe parcursul celor patru experimente au subliniat următoarele concluzii:

Plantulele transferate pe medii suplimentate cu Pb în concentrații de 400 si 500 ppm nu au supravietuit; concentrația de 400 ppm Pb a fost considerata letală;

La concentrații de 250 ppm creșterea este foarte înceată, înregistrându-se valori de până la 4 cm, în condițiile în care variantele martor ajung la valori de peste 18 cm in același interval de timp;

La concentrații de 100 ppm rădăcinile se dezvoltă mai rapid, dar și aceste valori sunt mult sub media martorului, aparatul foliar fiind slab dezvoltat ;

La concentrații de 50 ppm diferențele sunt mult mai mici, dar totuși semnificative, comparativ cu proba martor.

Nodozitățile au apărut la 12 zile de la inoculare pe varianta control. La citirea următoare s-a observat apariția nodozităților la toate plantele din varianta control și la trei plante crescute pe mediu suplimentat cu 50 ppm plumb. La citirea după 20 de zile de la inoculare,nodozitățile au apărut la patru dintre plantele crescute pe mediu suplimentat cu 100 ppm plumb și pe două dintre plantele crescute pe varianta suplimentată cu 250 ppm plumb. Din aceste observații rezultă că plumbul are efecte negative aspra formării nodozităților, efectul negativ al acestuia crescând odată cu creșterea concentrațiilor plumbului. Totodată s-a observat o corelație pozitivă între lungimea rădăcinilor și apariția nodozităților.

3.2.2 Evaluarea modificărilor induse de prezența plumbului asupra sintezelor proteice – determinarea conținutului de proteine și clorofilă din frunze

Determinarea conținutului de clorofila din frunze

Pentru determinarea conținutului de clorofilă au fost utilizate plante cultivate in vitro, la 14 zile de la inocularea pe medii suplimentate cu diferite concentrații de plumb. Extracția s-a efectuat în acetonă 85%, iar concentrația de clorofilă s-a determinat în funcție de absorbanța extractului la lungimea de undă de 645nm respectiv 663nm. Măsurătorile s-au efectuat cu un spectofotometru UV-vizibil.

Concentrațiile clorofilei a și b au fost calculate cu relațiile de mai jos și sunt prezentate în Tabelul 3.8.

Ca =12,7*A663 –2,69*A645 [g/ml]

Cb =22,9*A645-4,68*A663 [g/ml]

Tabelul 3.8 Concentrația cantității de clorofilă a și b în plantele cultivate in vitro,

la 14 zile de la inoculare [g / g țesut proaspăt]

Rezultatele prezentate evidențiază o scădere a conținutului de clorofilă la variantele cultivate pe medii suplimentate cu plumb, comparativ cu varianta martor, rezultate care sunt confirmate de datele din literatură. Totodată creșterea concentrației de plumb conduce la scăderi mai accentuate ale conținutului de clorofilă.

3.3. Evaluarea eventualului caracter mutagen al plumbului prin amplificarea ADN genomic cu primeri RAPD

3.3.1 . Extracția și purificarea ADN genomic la toate variantele experimentale

Extracția ADN – ului genomic s-a realizat din 50 mg țesut foliar recoltat de la plantele crescute in vitro după aproximativ 1 lună de la germinare. Pentru extracție s-a folosit metoda CTAB (Sambroock, 1989) si metoda CTAB modificata. S-au utilizat aceste metode deoarece permit extracția și purificarea ADN genomic vegetal într-o cantitate și la o calitate corespunzătoare pentru amplificarea prin reacția în lanț a polimerazei ( PCR).

După extracție ADN genomic a fost analizat prin electroforeză în gel de agaroză 0,7% pentru a evalua concentrația acestuia ( Fig 3.10).

Fig. 3.10 Analiza prin electroforeză în gel de agaroză 0,7% a ADN-ului genomic extras de la plantele de lucernă cultivate in vitro, pe medii suplimentate cu diferite concentrații de plumb

3.3.2 Identificarea primerilor RAPD care generează cele mai complexe amprente moleculare

În scopul identificării primerilor care amplifică ADN-ul genomic analizat au fost realizate reacții de amplificare ale unui singur tip de ADN cu 5 primeri RAPD.

Secvențele primerilor utilizați au fost următoarele:

5´ TGCCGAGCTG 3´

5´GTTGCGATCC 3´

5´GTGACGTAGG 3´

5´GGGTAACGC 3´

5´CACCTGCCGC 3´

Condițiile de amplificare au fost: 1. denaturare 940C – 3 min. , 2. 45 de cicluri: 940C – 3 min, 360C- 1,5 min, 720C- 2 minute, 3. Sinteza ADN 720 C- 3 minute

Produșii rezultați în urma parcurgerii celor 45 cicluri de amplificare au fost analizați prin electroforeză în gel de agaroză. Deoarece dimensiunile fragmentelor de ADN care se pot forma în urma amplificării RAPD sunt cuprinse în intervalul 500 pb – 3000pb, a fost necesară alegerea unui gel de agaroză mai concentrat 1,7%, comparativ cu gelul utilizat la analiza ADN genomic (Fig. 3.11 ).

Legendă:

5´ TGCCGAGCTG 3´

5´GTTGCGATCC 3´

5´GTGACGTAGG 3´

5´GGGTAACGC 3´

5´CACCTGCCGC 3´

Fig. 3.11 Analiza prin electroforeză în gel de agaroză a produșilor de amplificare rezultați în urma utilizării a 5 primeri RAPD.

S-a constatat că primerii 1 si 5, cu secvențele 5´TGCCGAGCTG3´ și

5´CACCTGCCGC3´ au generat fragmente de amplificare. Primerul 5 a generat cel mai mare număr de benzi. Ceilalți primeri nu au găsit secvențe complementare în genom, deci nu a fost posibilă inițierea reacțiilor de amplificare.

3.3.3. Evaluarea comparativă a amprentelor moleculare la toate variantele experimentale

În continuare, primerii RAPD care au generat amplificare au fost utilizați pentru a analiza ADN-ul genomic extras și purificat de la plante provenite din toate variantele experimentale. A fost urmat același program de amplificare ca la amplificarea anterioară.

Produșii de reacție au fost analizați prin electroforeză în gel de agaroză (1,7%).

Prima dată a fost utilizat pentru amplificare primerul 5 cu secvența

5´ACCTGCCGC3´, care a generat cel mai mare număr de fragmente atunci când a fost analizat ADN-ul variantei martor ( Fig. 3.12).

Fig. 3.12 Analiza în gel de agaroză a produșilor rezultați în urma amplificării ADN-ului cu primerul RAPD- 5, cu secvența 5' CATCTGCCC 3' .

Se evidențiază diferențieri între amprentele tuturor variantelor experimentale. Toate variantele dezvoltate în prezența plumbului au o bandă suplimentară față de martor, în domeniul greutăților moleculare mici. În domeniul greutăților moleculare medii varianta Pb 50 ppm prezintă o bandă mai intensă comparativ cu toate celelalte variante experimentale.

În continuare s-a realizat amplificarea ADN-ului extras de la toate variantele experimentale cu primerul 1 având secvența 5´TGC4CGAGCTG 3´ (Fig. 3.13).

Fig. 3.13 Analiza în gel de agaroză a produșilor rezultați în urma amplificării ADN-ului cu primerul RAPD – 1, cu secvența 5' TGCCGAGCTG 3'.

În cazul analizei comparative a amprentelor moleculare se evidențiază diferențierile variantelor Pb 100 și 250 ppm, comparativ cu varianta martor.

Varianta Pb 50 ppm are o amprentă identică cu cea a variantei martor. În cazul concentrației de 100 ppm lipsește o bandă în zona greutăților moleculare mari. Aceiași bandă lipsește și în cazul variantei Pb 250 ppm. În cazul din urmă sunt însă prezente și două benzi suplimentare în zona greutăților moleculare mici.

Între fragmentele de ADN separate în urma amplificării cu ambii primeri analizați au fost observate diferențe evidente, ceea ce a dus la concluzia că diferitele concentrații de plumb au dus la apariția mutațiilor între indivizii aceluiași soi. Aceste mutații modifică situsurile de legare pentru primerii utilizați conducând la amplificarea unor fragmente diferite, care pot fi evidențiate în urma separării prin electroforeză în gel de agaroză.

CONCLUZII

Prezența plumbului în mediul de cultură a încetinit creșterea plantelor de lucernă cultivate in vitro și totodată apariția nodozităților

Prezența plumbului în concentrație de 50 ppm, concentrația naturală a solurilor din Banat, a influențat în mod negativ creșterea plantelor;

Efectul inhibitor al plumbului a fost direct proporțional cu concentrația.

Concentrația de Pb 400 ppm a fost letală pentru toate plantele analizate;

După 34 de zile de la transferul pe mediu de cultură suplimentat cu plumb amprentele moleculare, evidențiate cu ajutorul a doi primeri RAPD, cu secvențele 5´TGCCGAGCTG3´ și 5´CACCTGCCGC3´ au fost diferite la variantele experimentale comparativ cu varianta martor;

Pentru a evidenția existența unor mutații induse de prezența plumbului în mediul de cultură este necesară extinderea cercetărilor și anume se impune amplificarea ADN-ului genomic cu un număr mare de markeri RAPD;

Bibliografie:

Appleby, C.A., Leghemoglobin and Rhizobium respiration, Annu. Rev. Plant Physiol., 35, 443-478 (1984)

Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D.G., Hairy roots of Medicago truncatula as tools for stududying nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbioses. Mol. Plant-Microbe Interact, 14, 693-700 (2001)

Brewin, N.J., Development of the legume nodule. Annu. Rev. Cell. Biol., 7: 191-226 (1991)

Butnaru G., Sîrbovan A., Mihacea S., Heavy metals involvement in cell division running, 4th International Symposium "Metal Elements in Environment Medicine and Biology" Timișoara, România (2000)

Butnaru G., Sîrbovan A., Mihacea S., Zaharie L.,, : Variabilitatea toleranței la Al3+ la genotipuri de Secale cereale, Sesiunea anuală de comunicări și referate științifice, Facultatea de Agricultură, USAMVB Timișoara (2000)

Butnaru, G., Jurca M., Studies concerning the response of Bacillus cereus gram-positive bacterium in the presence of heavy and light metals under conditions of terrestrial gravitz (g=1) and simulated hypogravity, Analele Universității Banatului, Seria Științele solului

Butnaru, G., Jurca, M., Studii privind răspunsul bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative la prezența metalelor grele și metaloizilor, Simpozionul “Cercetarea științifică și Agricultura durabilă”, București (2000)

Cohn, J., Day, R.B., Stacey, G., Legume nodule organogenesis, Trends Plant Science, 3, 105-110 (1998)

Crespi G., Molecular mechanisms in nodule development. J. Plant Growth Regul. 19, 155-166 (2000)

Downie, J.A., Walker, S.A., Plant responses to nodulation factors. Curr. Opp. Plant Biol. 2, 483-489 (1999)

Earl, C.D., Ronson, C.W., Ausubel, F.M., Genetic and structural analysis of the Rhizobium meliloti fixA, fixB, fixC and fixX genes, J Bacteriol., 169, 1127-1136 (1987)

Endre, G., Kereszt, A., Kevei, Z., Mihacea, S., Kalo, P., Kiss, G.B., A receptor kinase gene regulating symbiotic nodule development, Nature, 417, 962-966 (2002)

Franssen, H.J., Vijn, I., Yang, W.C., Bisseling, T., Development aspects of Rhizobium-Legume symbiosis, Plant Molecular Biology, 19, 89-107 (1991)

Gibbson, S., Somerville, C., Isolating Plant Genes, Tibtech, 11, 306-313 (1993)

Gornall .G., Bardawill C.S., David M.M., J. Biol. Chem., 177, 751-753 (1949)

Grozav I., Microbiologie generală – Îndrumător de lucrări practice, Lito IAT, Timișoara (1990)

Gualtieri, G., Bisseling, T., The evolution of nodulation, Plant Mol. Biol., 42, 181-194 (2000)

Haaker, H., Veeger, C., Enzymology of nitrogen fixation, Trends. Biochem. Sci., 108, 188- (1984)

Honma, M.A., Asomaning, M., Ausubel, F.M., Rhizobium meliloti nodD genes mediated host-specific activation of nod ABC, J. Bacteriol., 172, 901-911 (1990)

Jurca, M., Bodogai, M., Butnaru, G., Asemănări în creșterea speciei Spirulina platensis în prezența nanoparticulelor magnetice cu Co și a ionilor liberi de Co, Cercetări științifice seria a VI-a, Biotehnologie și biodiversitate, Ed. Agroprint Timișoara (2002)

Kijne, J.W., The Rhizobium Infection Process in Biological Nitrogen Fixation, edited by Stacey, G, Burris, R.H., Evans, H.J., New York, 349-398 (1991)

Kondorosi, A., Kondorosi, E., John, M., Schmidt, J., Schell, J., The role of nodulation genes in bacterium- plant communication, Genetic Engineering, 13, 115-135 (1991)

Lasat M.M., Baker A.J.M., Kochian L.V., Altered Zn compartmentation in the root symplasm and stimulated Zn absorbtion into the leaf as mechanism involved in Zn hyperaccumulation in Thaspi caerulescens. Plant. Physiol., 118, 875-883

Lehlinger A.L., Mecanismul enzimatic al fixării azotului , Biochimie, Editura tehnică, București, 1992, 109-115 (1992)

Lesin, K.A., Lesins, I., General Key to Medicago Species, în Genus Medicago (Leguminosae). A Taxogenetic Study, Dr. W. Junk Publisher, 86-139 (1979)

Long, S.R. Rhizobium genetics, Annu. Rev. Genet., 23, 483-506 (1989)

Maciejwska A., Effect of organo-mineral fertilizers obtained from brown coal absorbtion of Zn, Pb, Cd by various types of plants, în Metal Elements in Environment, Medicine and Biology, Poceedings of the 2nd International Symposium on Metal Elements in Environment, Medicine and Biology, Timișoara, 1996, Editura Eurobit , 287 (1997)

Nap, J.P., Bisseling, T., Developmental Biology of a Plant-Prokaryote Symbiosis, the Legume Root Noduls, Science, 250, 948-954 (1990)

Pamfil, D., Probleme generale ale microbiologiei solului, în Microbiologie, Editura Genesis, Cluj-Napoca, 130-135 ( 2000)

Peterson P.J., Adaptation to toxic metals. In Metals and Micronutrients: Uptake and Utilization by Plants, eds. DA Robb, Ws Pierpoint, Academic Press, London, 788-795 (1983)

Puia, I., Pavel, C., Bărbulescu, C., Ionel, A., Producerea și păstrarea furajelor, Lucerna, Editura Didactică și Pedagogică, București, 185-202 (1984)

Quiros, C.F., Bauchan, G.R., The Genus Medicago and the Origin of the Medicago sativa complex, în Alfalfa and Alfalfa Improvement, Series Agronomy, 29, 93-121 (1988)

Rolfe, B.G., Genetic Analysis of Legume Initiation, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 39, 297-319 (1988)

Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (2nd edn). Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)

Shiu, S.H., Bleecker, A.B., Receptor -like kinases from Arabidopsis from a monophyletic gene family related to animal receptor kinases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 10763-10768 (2001)

Stougaard, J. Regulators and regulation of legume nodule development. Plant Physiol. 124, 531-540 (2000)

Varga, P., Moga, I., Kellner E., Bălan C., Maria Ionescu, Lucerna, Genetica și Ameliorarea Lucernei, Editura Ceres București, 50-96 (1973)

Werner, D., Physiology of Nitrogen-Fixing Legume Nodules, Compartments DNA Function in Biological Nitrogen Fixation, edited by Stacey G, Burris RH, Evans HJ, New York, 399-431 (1991)

Williams, J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., DNA Polymorphism Amplified by Arbitrary Primers are Useful as Genetic Markers, Nucleic Acids Research, 18, 6531-6535 (1990)