Nanostructuri pe bază de magnetită utilizate în tratamentul cancerului [303846]

Nanostructuri pe bază de magnetită utilizate în tratamentul cancerului

Studentă: Diana Oana SAVA

Rezumat (lb. romana)

Nanoparticulele magnetice sunt materiale avansate ce prezintă un real interes în domeniul biomedical. Datorită aplicațiilor foarte bine dezvoltate a nanoparticulelor magnetice în domeniul biomedical, o mare atenție a fost acodată în pregătirea a diferite tipuri de particule.

Această lucrare constă în prepararea și studiul proprietățiilor nanoparticulelor de magnetită funcționalizată cu doxorubicină în scopul formării de nanostructuri utilizate pentru tratamentul cancerului. A [anonimizat] o serie de aplicații biomedicale ( [anonimizat], nivel ridicat de acumulare în organism). [anonimizat]. Tratamentul se bazează pe faptul că o crestere a temperaturii, pentru un interval de o [anonimizat] 40°C si 45°C induce moartea celulelor tumorale.

[anonimizat], biodistrubuției si a calității materialului utilizat pentru tratarea cancerului.

Abstract (lb. engleza)

The magnetic nanoparticles are advenced materials that show a real interest in the biomedical field. Due to the well developed aplications of the magnetic nanoparticle in the biomedical area, a big part of attention was given to the training of different tipes of particles.

This project is about the preparation and study of the magnetic particles functionalised with doxorubicin in the purpouse of forming nanostructure for the treatment of cancer. [anonimizat] (toxicity, biocompatibility, a high lever of acumulation in the organism).[anonimizat]. The treatment is based on the high level of temperature for an hour or must between 40C and 45 C that induces the death of tumor cells.

[anonimizat] a [anonimizat].

CUPRINS

I. STADIUL ACTUAL AL DEZVOLTĂRII ÎN DOMENIU 6

1. INTRODUCERE 8

2. MAGNETITA 9

2.1. Aplicații biomedicale 11

2.1.1. Aplicații in vivo 12

2.1.2. Aplicații in vitro 15

2.2. [anonimizat] 16

2.2.1. Structura cristalină a magnetitei 16

2.2.2. [anonimizat] 16

2.3. Metode de obținere a magnetitei 18

2.3.1. Metoda coprecipitarii 18

2.3.2. Feritizare pe cale umedă 19

2.3.3. Reacții la temperatură ridicată ( termoliza) 20

2.3.4. Metode hidrotermale 20

2.3.5. [anonimizat] 21

2.3.6. Microemulsii apă în ulei cu surfactanți ionici 21

2.3.7. Microemulsii apă în ulei cu surfactanți neionici 22

2.3.8. Magnetoferitina 22

2.3.9. Magnetolipozomi 22

3. [anonimizat] 23

3.1. Factorii de producere ai cancerului 25

3.2. Aplicatiile magnetitei in tratamentul cancerului 27

4. DOXORUBICINĂ 28

II.ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ 32

1. MATERIALE ȘI METODE 32

1.1. Materiale 32

1.2. Sinteză 33

1.3. Metode de caracterizare 33

1.3.1. Difracție de Raze X (XRD) 33

1.3.2. Spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier (FT-IR) 35

1.3.3. Analiza termogravimetrică (TGA) 36

1.3.4. Microscopia electronică de baleaj (SEM) 36

1.3.5. Microscopie Electronica prin Transmisie (TEM) 37

1.3.6. Difracție de electroni pe arie selectată (SAED) 38

1.3.7. Teste in vitro pe culturi de celule tumorale 39

1.3.8. Determinarea biocompatibilității și biodistribuției in vivo a nanostructurilor 40

1.3.9. Determinarea biocompatibilității și biodistribuției in vivo a nanostructurilor în model experimental pe membrana corioalantoidiană a embrionului de pui (chick embryo chorioallantoic membrane [CAM]) 42

2. REZULTATE ȘI DISCUȚII 46

2.1. Microscopia electronică de baleiaj 46

2.2. Microscopia electronică de transmisie 47

2.3. Difracție de raze X ( XRD) 48

2.4. Spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier (FT-IR) 49

2.5. Testele in vitro pe culturi de celule tumorale 50

2.6. Analiză termogravimetrică (TGA) 51

2.7. Determinarea biocompatibilității și biodistribuției in vivo a nanostructurilor 52

2.8. Determinarea biocompatibilității și biodistribuției in vivo a nanostructurilor în model experimental pe membrana corioalantoidiană a embrionului de pui (chick embryo chorioallantoic membrane [CAM]) 55

CONCLUZII 60

Referințe Bibliografice 62

I. STADIUL ACTUAL AL DEZVOLTĂRII ÎN DOMENIU

INTRODUCERE

În ultimii ani au existat interese majore în domeniul tehnologiei materialelor nanostructurate. Nanomaterialele magnetice oferă avantaje datorită dimensiunii lor nanometrice (≤ 100 nm), dar și a proprietăților structurale și magnetice unice. Datorită aplicațiilor pe scară largă a nanoparticulelor magnetice în domeniu biomedical, biotehnologiec, inginerie și știința materialelor, o mare atenție a fost acordată în pregătirea a diferite tipuri de particule.

O categorie de nanoparticule cu largă aplicabilitate este reprezentată de nanoparticulele cu structură spinelică de oxizi de fier, cum ar fi magnetita ( Fe3O4 ). Utilizarea acesteia în scopuri biomedicale, cum ar fi în imagistica bazată pe rezonanță magnetică (RMN) ca agenți de contrast, în marcarea țesuturilor canceroase, în tratament prin hipertermie magnetică, în transport și eliberare controlată magnetic de substanțe medicamentoase, a dus la o contribuție majoră la evoluția tehnologiei și a tratamentelor medicale.

Tema aleasă privind nanostructurile pe bază de magnetită în hipertermia magnetică este de actualitate în cercetarea internațională datorită aplicațiilor sale în biomedicină, hipertermia fiind metoda care a dus la obținerea de rezultate semnificative în tratamentul multor afectiuni printer care și al cancerului. Hipertermia se face prin încălzirea țesuturilor canceroase la o temperature cuprinsă între 41 și 45°C, a fost demonstrat pentru a îmbunătăți eficacitatea terapiei cancerului, atunci când este utilizată împreună cu iradiere sau chimioterapia. La începutul secolului XX o serie de investigatori au arătat că fragmente de tumori își pierd abilitatea de a se dezvolta dacă sunt încălzite la temperaturi de 42-47șC pentru scurte perioade de timp.

MAGNETITA

Magnetita este un minereu natural. Există chiar si o legendă care menționează o regiune din Macedonia numită Magnesia, unde s-ar fi descoperit magnetită. Grecii sunt cei care au descoperit magneții naturali din magnetită în Turcia. Magnetita există sub forma de zăcăminte pe tot lobul, depozitele cele mai mari găsinduse, insa, in Peninsula Scandinavica.

Vikingii au fost cei care au folosit pentru prima dată magnetismul acestui minereu ca “busola”, pentru a strabate mările si oceanele, pentru a invada Anglia sau pentru a cuceri lumea noua. Oamenii Nordului au deținut monopolul asupra busolei mai bine de 500 de ani.

Cea mai veche documentație despre busolă datează in jurul anului 1213. Cu siguranță, există in folosință din perioada anilor 800-100 A.D

Figura 2.1. (a) :Busolă primitivă chinezească ; (b) Busolă moderna

Magnetismul este o proprietate intrinseca a fiecărui atom care are o profundă infulență asupra organismelor vii, hemoglobina din sangele nostru fiind un complex magnetic de fier.

Magnetismul si materialele magnetice, in particular magnetita, joacă un rol primordial în viata organismelor vii, de la bacterii și pana la vertebratele superioare. Prin existența oxidului de fier, magnetita, a fost pusă în evidență atât în organismele primitive cum sunt bacteriile, cât și organismele evoluate, ca de exemplu algele euglenoide și chiar în organismul uman .

Bacteriile magnetotactice generează cristale magnetice intracelulare de magnetită si tiomagnetită, cu dimenisiuni mai mici de 100nm care sunt folosite drept “busolă internă” pentru orientarea celulelor în mediile acvatice .

Prima publicație mai amplă privind bacteria megnetotactică a aparut în 1975, în revista Science, și aparține microbiologului Richard Blakemore, de la Woods Hole Oceanographic Institution . Acesta a observant un grup de bacterii capabile de a se orienta singure într-o singură directie. Blakemore a realizat că aceste mocroorganisme se orientează în directia câmpului magnetic al Pamantului, de la Sud la Nord, și le-a numit bacterii magnetotactice.

Pană în prezent au fost evidențiate câteva tipuri de bacterii magnetotactice care diferă între ele prin formă, prin număr si structura “particulelor magnetice bacteriene” pe care acestea le contin. Bacteriile magnetotactice pot fi împarțite în două categorii, în funcție de natura particulelor magnetice pe care le produc : cele care produc magnetita și cele care produc greigita, deși există cateva specii capabile să produca ambele tipuri de material magnetic .Magnitudinea momentului magnetic al magnetitei este de trei ori mai mare decat cea a greigitei .

A fost avanjată ideea că bacteriile magnetotactice și-au început evoluția din Proterozoicul timpuriu, ca urmare a creșterii cantitații de oxigen atmosferic și implicit a reducerii cantitașii de fier dizolvat în apele oceanice. Organismele au inceput să înmagazineze fier in anumite forme si apoi s-au dezvoltat mecanisme care au transformat acest fier intracelular în magnetozomi pentru magnetotaxie.

Bacteriile magnetotactice cunoscute sunt numai Gram-negative. Ele posedă două membrane : o membrană externă și una internă citoplasmatică în care există “spatial periplasmatic”. Acest spațiu este absent în cazul bacteriilor Gram-pozitive ceea ce sugerează faptul ca acestea poat juca un rol important in formarea magnetozomilor .

Ipoteza magnetite a fost descoperită cu atât mai mult, cu cât se bazează pe descoperirea existenței unor cristale de magnetită in țesutul animal. Cel mai concludent exemplu îl constituie cristalele de magnetită extrase din țesutul osului etmoid al somonului .

Trebuie subliniat că acumularile de particule magnetice s-au pus în evidență în abdomenul albinelor , al liliecilor, în abdomenul unei specii de furnici migratoare, ca si in abdomenul si toracele unor specii de termite .

Magnetita a fost descoperită și în creierul uman, în inima ,în splină și ficat . În anul 1992, J.L. Kirschvink și colaboratorii descoperă particule de magnetită biogenă in creierul uman . Ei demonstreaza, prin analize TEM, de difractie electronic si determinari magnetice .

Aplicații biomedicale

Particulele magnetice cu dimensiuni variind între 1nm și 1µm se folosesc pe scară tot mai largă în aplicațiile biomedicale. Tocmai aceste dimensiuni care pot fi controlabile și care sunt comparabile cu cele ale celulelor, ale virusurilor, ale proteinelor sau ale genelor le fac interesante din punct de vedere biologic .

Cele mai importante proprietăți ale acestor particule magnetice pentru aplicațiile medicale sunt :

Lipsa de toxicitate;

Biocompatibilitatea;

Injectabilitatea;

Nivelul ridicat de acumulare în țesutul țintă sau organ ;

În ultimii 10 ani s-au realizat cercetări pe gama variată a nanoparticulelor magnetice feri- si superparamagnetice (maghemita sau magnetite monodomeniu cu dimensiuni cumprinse intre 5-20 nm ). Între acestea s-a dovedit că magnetita este un canditat foarte promițător intrucât biocompatibilitatea și lipsa de toxicitate sunt deja bine cunoscute .

Nanoparticulele magnetice pot fi acoperite cu molecule bioactive care pot să interactioneze cu anumite entitati biologice sau cu anumite situs-uri receptoare din organism, monitorizand transportul și eliberarea acestora la țintă. Ele se pot constitui astfel, în transporturi de medicamente .

Datorită proprietăților mezoscopice fizice, chimice, termice și mecanice unice, nanoparticulele superparamagnetice de magnetită oferă un potențial uriaș pentru aplicațiile biomedicale .

Folosirea cu success a nanoparticulelor magnetice depinde de o serie de factori :

mărimea particulelor trebuie să se situeze în intervalul 6-15 nm; particulele sub dimensiunea critica se constituie în monodomeniu ;

să prezinte superparamagnetism (proprietate legată de dimensiunea nanoparticulelor ) ;

suprafața nanoparticulelor magnetice să poată fi funcționalizată pentru diferite aplicații;

Aplicațiile biomedicale ale nanoparticulelor magnetice se pot clasifica în :

Aplicații in vivo

Transportul și eliberarea medicamentelor

Dezavantajul major al administrării medicamentelor este legat de specialitatea lor relativ scazută. În majoritatea cazurilor , aceste medicamente sunt administrate intravenos, ceea ce conduce la o distribuție simetrică ce poate produce și vătamarea celulelor sănătoase.

De exemplu, efectele cauzate de medicamente cu acțiune anti-inflamatorie asupra pacientilor cu artrite cronice pot determina întreruperea tratamentului. Daca medicamentul ar putea fi localizat direct la nivelul articulației, atunci acesta ar putea fi administrat in mod continuu .

Nanoparticulele magnetice pot transporta un medicament către un organ țintă și acolo il pot elibera. Marimea, sarcina și chimia suprafeței particulelor magnetice joacă un rol foarte mare. Ele pot influența atat circulația sângelui, cât si viabilitatea particulelor in corp . Localizarea medicamentului se bazează pe compențita dintre forta exercitata asupra particulelor magnetice de sistemul sanguine și forța magnetic generată de câmpul extern aplicat . Cand forța magnetică depășește viteza de deplasare a sângelui în artere sau în capilare particulele magnetice sunt localizate la “țintă” si pot fi internalizate prin celulele endoteliale .

Eficiența aceste terapii este dependentă de o serie de paramentrii fizici cum ar fi tăria câmpului si proprietățile magnetice ale nanoparticulelor.

În anul 1995, Arnon si colaboratorii, au obținut un transport prin cuplarea complexului cis-platinic la nanoparticule magnetice modificate cu carboximetil-dextran ( CM-dex-CDDP). Citotoxicitatea acestui transport s-a dovedit a fi de patru ori mai scazută decât a medicamentului propriu-zis .

Cercetatorii chinezi reușesc să prepare două transporturi magnetice ai CDDP folosind alginatul de sodiu , respectiv N-alcoilsarcosina drept agent de legatură .

Succesul obținerii unor medicamente cu acțiune în terapia cancerului a încurajat cercetarile privind posibilitatea de legare a unor noi clase de medicamente cum ar fi cele cu acțiune antiinflamatoare : indometacin, diclofenac, etc. .

S-a reusit prepararea și testarea cu rezultate promițătoare a două tipuri de transporturi magnetice pe bază de nanoparticule de magnetită modificată cu polimeri biodegradabili, respectiv albumina :

nanomagnetita incapsulată în acid poliacetic care leagă indometacinul ;

microsfere de magnetită modificată cu albumina care leagă diclofenacul ;

Testele au aratăt că ambele tipuri de transporturi pot fi orientate către ținta in vivo, prin aplicarea unui câmp magnetic extern și pot elibera medicamentul într-o perioadă de timp prelungită .

Avantajul folosirii nanoparticulelor magnetice funcționalizate cu hidroxiapatita este acela că acumularea acestora in țesutul osos poate fi monitorizată prin imagistica RMN și astfel, activitatea medicamentului poate fi controlată .

Hipertermia magnetică

Hipertermia este un procedeu terapeutic folosit pentru a ridica temperatura într-o regiune a corpului afectată de boală. Se aplică de la inceputul secolului XX în tratarea tumorilor canceroase, pentru a limita evoluția acestora și implicit progresul cancerului . Procedeul se bazează pe creșterea temperaturii in zona țesutului canceros la aproximativ 43 °C și menținerea acestei temperaturi 20 – 60 min . Temperatura într-un țesut tumoral crește mai ușor decât într-un țesut normal deoarece țesutul tumoral prezintă o sensibilitatea mai mare față de caldură.

După metoda de încalzire, hipertermia se împarte în trei mari categorii:

Hipertermia întregului organism;

Hipertermia regional;

Hipertermia locală;

Temperatura necesară în hipertermie poate fi obținută prin diferite procedee: radiofrecvență, microunde, ultrasunete, infraroșu.

Creșterea temperaturii particulelor de magnetită cu câmpul magnetic aplicat este procedeul preferat în hipertermia locală. Injectate în vasele de sânge , nanoparticulele magnetice sunt transportate , sub acțiunea unui camp magnetic extern la tumoră și pot realiza încalzirea locală prin pierderea de histerezi .

Pentru a fi folosite in hipertermie , nanoparticulele magnetice trebuie să îndeplinească două condiții esențiale : pe langă o distribuție de dimensiuni cât mai stransă și o magnetizare mare , trebuie să fie biocompatibile și să nu prezinte efecte toxice .

Aplicarea hipertermiei magnetice în terapia cancerului reprezintă o oportunitate în nanomedicină . Această tehnică poate fi folosită singură sau în combinații cu alte metode de tratament , cum ar fi chimioterapia sau radioterapia .

Hipertermia celulara în combinație cu radioterapia, chimioterapia si imunoterapia au reprezentat calea spre succesul terapeutic realizat in tratarea cancerului testicular, cunoscut în lumea medicală sub denumirea de “efectul Lance Armstrong”.

Succes remarcabil s-a înregistrat și în terapia tumorilor osoase prin hipertermie , folosind bioceramice magnetice pe bază de magnetită .

Aplicații în diagnoză ( imagistica RMN )

Dezvoltarea imagisticii RMN pentru diagnoza clinică a contribuit la apariția unei noi clase de produți farmaceutici, așa numiții magneto-farmaceutici . Transportul și eliberarea la țintă a unor agenți de contrast reprezintă o strategie dorită, în sensul creșterii eficienței a reducerii toxicitații și efectelor adverse locale. Administrarea acestor medicamente conduc la creșterea contactului dintre imaginea țesutului bolnav și a celui sănatos, facilitând stabilirea modului de funcționare a unui organ sau a sistemului sangvin .

Aplicații in vitro

Separare si selecție

Procesele de izolare, separare și marcare a moleculelor specifice se folosesc pe scară largă atât în cercetarea biomedicală, cat și în biotehnologie.

În procesele de separare/purificare , ca și în imunoteste s-au utilizat o gamă largă de nanoparticule magnetice . Trierea magnetic celulară s-a aplicat în terapia celulara . Aparatele de purificare AND/ARN există deja în dotarea laboratoarelor.

Separarea în fază solidă (SPE) este o metodă de separare a unor componente dintr-o soluție dată , o alternativă la metoda de concentrare prin extracția lichid-lichid. Separarea și concentrarea unui compus dintr-o soluție diluată presupune un consum foarte mare de timp , de aceea folosirea unor absorbanți magnetici și magnetizabili a suscitat un interes deosebit .

Magnetorelaxometria

Magnetorelaxometria s-a introdus ca procedeu de evaluare a imunotestelor. Aceasta este o tehnică ce se bazează pe proprietațile magnetice ale ansamblului de nanoparticule .

Principiul metodei constă în determinarea vâscozității magnetice , cu alte cuvinte relaxarea momentului magnetic net al unui sistem de nanoparticule magnetice după indepărtatea câmpului magnetic .

Într-o măsuratoare de magnetorelaxometrie , proba ce conține particule magnetice este magnetizată in câmp magnetic o anumită perioadă de timp . După îndepărtarea câmpului magnetic , se determină scăderea magnetizării probei, cu ajutorul unui magnetometru SQUID .

Magnetorelaxometria este o tehnică prin care se poate realiza cuantificarea masei relative de nanoparticule magnetice în țesut .

Ingineria țesuturilor

Ingineria țesuturilor reprezintă pentru cercetatori o provocare de viitor. Se testează folosirea nanoparticulelor magnetice pentru “repararea” corpului uman prin transplantul organelor, prin înlocuirea cu unele părți artificiale sau protezate .

O contribuție deosebită la dezvoltarea cercetărilor în domeniu o au lucrările grupului de cercetători japonezi coordonat de Akiro Ito . Întrucât celulele marcate cu nanoparticule magnetice pot fi manipulate cu un magnet, Ito și colaboratorii săi propun o nouă metodă de inginerie a țesutului folosind nanoparticule magnetice funcționalizate . Ito folosește nanoparticule de magnetită modificate cu lipozomi cationici (MCLs) pentru marcarea keratinocitelor umane. Keratinocitele marcate magnetic sunt orientate pentru amplasarea precisă la locurile țintă și accumulate cu ajutorul uni magnet , în scopul realizarii “unei constructii 3D “ de țesut uman .

Structura cristalină și proprietățile fizico-chimice alea magnetitei

Structura cristalină a magnetitei

Magnetita are structura cristalină de spinel invers cu o unitate celulara cubică cu fețe centrate constituită din 56 de atomi: 32 anioni O2- , 16 cationi Fe3+ si 8cationi de Fe2+ .

Structura de spinel invers este astfel aranjată încat jumatate din ionii de Fe3+ sunt coordinate tetraedric, iar cealaltă jumatate și toți ionii de Fe2+ sunt coordinate octaedric.

Proprietatile fizico-chimice ale magnetitei

Stabilitatea magnetitei

Magnetita se oxidează rapid in aer si are un raspuns magnetic redus. Acest proces poartă numele de maghemitizare și are loc la suprafata cristalelor. Centrele cristalelor sunt si ele oxidate, procesul realizându-se prin difuzia ionilor Fe2+ din interiorul cristalelor la suprafață, unde sunt convertite la Fe3+ . Viteza cu care este produsă oxidarea este determinată de viteza de difuzie a ionilor Fe2+ și de distanța pană la suprafață .

Chimia suprafeței magnetitei

Proprietpțile și chimismul suprafeței nanoparticulelor de magnetită sunt importante în diferitele aplicații ale acestui material. Atomii de fier de la suprafața magnetitei coordinează la moleculele de apa care disociază rapid rezultând magnetite functionalizată la suprafață cu hidroxil. Grupările OH de la suprafață au caracter amfoter , deci pot reacționa fie cu acizi , fie cu baze .

Proprietățile magnetice

În secolul XIX , magnetismul și electricitatea au fost combinate pentru prima dată într-o teorie a electromagnetismului în lucrarile lui Faraday si Maxwell. Ideea comform căreia un curent electric poate genera un câmp magnetic, a fost foarte utilă pentru a explica originile magnetismului în material.

Materialele magnetice se clasifică în șase categorii:

Diamagnetice ;

Paramagnetice ;

Feromagnetice ;

Antiferomagnetice ;

Ferimagnetice ;

Superparamagnetice .

In tabelul 1 sunt prezentate cele mai importante mărimi si unități de masură uitlizate in magnetism .

Table 1 : Mărimi si unități de masură utilizate in magnetism

Cantitate Simbol Unități gaussiene Factor de conversie Unitati in SI

Densitate de flux magnetic B Gauss (G) 10-4 Tesla (T)

Intensitatea campului H Oersted (Oe) 103/4 π Amper/metru magnetic

Flux magnetic   Φ Maxwell (Mx) 10-8 Webwe

Magnetizare de volum 4 πM G 103 /4 π A/m

Magnetizare de masa M emu/g 1 A * m2 /kg

Moment magnetic m emu 10-3 A * m2

Moment magnetic de dipol j emu 4 π * 10-10 Wb * m

Susceptibilitate de volum X adimensionala 4 π adimensionala

Susceptibilitate de masa Xp cm3/g 4 π * 10-3 m3 / kg

Proprietățile magnetice ale unui material sunt guvernate de structura electronică a atomilor care constituie materialul respctiv. Materialele magnetice variază de la foarte slab magnetice la permanent magnetice . Cea mai importantă proprietate a unui material magnetic este susceptibilitatea magnetică .

Metode de obținere a magnetitei

Există diferite metode de obținere a nanoparticulelor de magnetită și maghemită. Procedeele descrise nu sunt specific pentru magnetită, adesea obtinandu-se amestecuri de magnetită si maghemită . Cei doi oxizi ai fierului pot fi diferențiați pe baza culorii sau utilizand spectroscopia de difracție de electroni si spectroscopia de difracție de raze X .

Sintetic , magnetita se poate obține prin mai multe metode chimice cum ar fi : metoda coprecipitării, metoda sol-gel, metoda sonochimică, reacțiile hidrotermale, oxidarea, electrodepunerea, injecția in flux, hidroliza si termoliza precursorilor. Dintre toate acestea, metoda cea mai comună si cea mai utilizată este metoda coprecipitarii sărurilor de Fe2+ si Fe3+ .

Metoda coprecipitarii

Metodele de obținere a magnetitei, bazate pe coprecipitarea sărurilor hidratate de Fe2+ si Fe3+ datează din anul 1900 .

Tehnica coprecipitării este probabil cea mai eficientă și cea mai simplă metodă de obținere a particulelor magnetice. Aceasta constă în amestecarea a doua săruri de Fe2+ si Fe3+ în raport stoechiometric 1:2, în mediu apos . Ecuația reacției chimice de formare a magnetitei poate fi scrisă astfel :

Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH- Fe3O4 + 4H2O (1)

Ținând cont de termodinamica reacției, precipitarea completă a magnetitei ar trebui să se producă la un pH cuprins intre 8 si 14, într-un mediu neoxidativ, deoarece magnetita nu este foarte stabilă și este sensibilă la oxidare, transformându-se în prezența oxigenului în maghemită. În funcție de pH-ul suspensiei poate avea loc transferuri de electroni sau de ioni :

Fe3O4 + 2H+ γFe2O3 + Fe2+ + H2O (2)

În mediu acid și anaerob, ionii Fe2+ de la suprafață sunt deosebiți ca hexaacva complexi in soluție , în timp ce în mediu bazic , are loc oxidarea ionilor Fe2+ care este întotdeauna corelată cu migrarea cationilor din interiorul retelei către exterior.

Principalul avantaj al acestei metode este cantitatea mare de nanoparticule ce pot fi sintetizate .

Feritizare pe cale umedă

La sfârșitul anilor ’70 , cercetătorii propun un procedeu de obținere a feritelor pe care il numesc “coprecipitare neconvențională”. Procedeul presupunea formarea feritelor direct in mediul reactive .

Această metodă a fost preluată și diversificată de cercetătorii japonezi , Sato și Saito care i-au pus denumirea de “feritizare pe cale umedă”. Sub această denumire a fost prezentată la Prima Conferință Internațională de Ferite de la Tokio .

Procesul de feritizare pe cale umedă se poate realiza prin două procedee:

Neutralizare :

2Fe3+ + M2+ + ROH MFe2O4

MII =  FeII, CoII, NiII, CuII, ZnII, MgII

Oxidare :

2Fe2+ + M2+ + ROH M1-x Fe2+xO4

MII =  FeII, CoII, MnII

Principiul variantei oxidării constă în formarea feritelor în soluție puternic alcalină (pH = 12-14) conținând ionii Fe2+/M2+ în raport 2:1 .

La începutul anilor ’80, un gurp de cercetători români reușesc să prepare magnetită prin ambele variante ale feritizării pe cale umedă și o testează, dându-i denumirea de ”paste/pulberi magnetice” (Figura 2)

Figura 2.2. Pulbere de magnetita

Reacții la temperatură ridicată ( termoliza)

Nanoparticulele cu grad înalt de monodispersie și controlate în ceea ce privește dimensionalitatea, se pot obține prin descompunerea la temperatură ridicată a precursorilor metal-organici cum ar fi Fe(Cu)3, Fe(Co)5, în cazul în care se utilizează solvenți organici și surfactanți .Dimensiunea și morfologia nanoparticulelor poate fi dirijată prin controlul timpului de reacție , al temperaturii, raportul molar al reactanților, precursorilor, concentrației, adăugării germenilor de cristalizare .

S-a demonstrat că magnetita cu dimensiuni cuprinse între 4 si 20 nm, poate fi sintetizată prin reducerea acetilacetonatului de Fe(III), la temperatură ridicată , în prezenta acidului oleic și oleilaminei ca stabilizatori de dispersie .

Metodele bazate pe termoliza pot fi realizate și în medii apoase, utilizând pulsuri ultrasonic pentru a creste rapid temperatura solutiei .

Metode hidrotermale

Metodele hidrotermale constau în încălzirea la 200°C, la presiune înaltă, a solutiilor utilizate. În aceste conditii, viteza cu care se produce hidroliza, este mult mai accelerată, permitând propagarea rapidă a nucleației particulelor.

Există două căi de obținere a feritelor în conditii hidrotermale: hidroliza și oxidarea sau neutralizarea amestecului de hidroxizi metalici. Cele două procedee sunt asemanatoare, singura diferență constînd ân faptul că, în primul caz, se porneste de la sărurile de fier .

Dimensiunile particulelor de magnetită cresc cu creșterea timpului de reactiv și cu conținutul de apă din amestecul de reacție. La temperaturi mari, nucleația se produce mai rapid decât creșterea cristalelor determinând o reducere a dimensiunilor particulelor .

Reacții sol-gel

Aceasta este o metodă modernă, folosită din ce în ce mai des, pentru obținerea nanocristalelor oxidice . Aceasta constă în hidroxilarea și condensarea unor precursori moleculari în solutii care dau naștere unui “sol” de particule nanometrice. Condensarea și polimerizarea anorganică conduce la formarea unei rețele tridimensionale de material oxidic, cunoscută sub denumirea de gel umed. Datorită faptului că aceste procese se desfașoara la temperatura camerei, este necesar un tratament termic pentru a se obține faza cristalină finală .

Avantajele acestei metode sunt:

Posibilitatea de a obține material cu structura prestabilită în funcție de condițiile experimentale;

Posibilitatea de a obține faze amorfe pure ;

Omogenitatea produsilor de reacție ;

Posibilitatea de incapsulare a nanoparticulelor în diverse tipuri de molecule care îsi mentin proprietptile și sunt stabile în interiorul matritei sol-gel.

Microemulsii apă în ulei cu surfactanți ionici

Microemulsii apă în ulei se realizează folosind surfactanți amfoteri. Exemple de surfactanți folosiți în aceste procedee sunt: bis(2-etilhexil) sulfosuccinat de sodiu , dodecil sulfat de sodium. Aceste miezuri micelare servesc ca nanoreactoare care constrâng formarea nanoparticulelor de anumite dimensiuni prin coprecipitarea sărurilor de Fe(III) si Fe(II) în soluție apoasă.

Microemulsii apă în ulei cu surfactanți neionici

Utilizarea surfactanților neionici în realizarea unui nanoreactor de tip micelă inversă înlatură inconvenientul produs de prezența grupărilor funcționale , și anume, formarea speciilor complexe. Surfactanții neionci constau din segmente hidorfile de polietilenglicol terminate cu grupări hidroxil atașate la catene hidrocarbonate hidrofobe. Un exemplu de astfel de surfactant este Igepal CO-520 ( poliexietilen(5)nonilfenil eter, 4-(C9H19)C6H4(OCH2CH2)nOH, n~5) .

Magnetoferitina

Un concept similar micelei inverse îl reprezintă utilizarea cavității feritinei în scopul obținerii feritelor în miezul unor proteine care stochează fier . Feritina este o polipeptidă sferică cu diametrul extern de ~ 12nm, două subcanale interne și o cavitate interioară cu diametrul de ~ 8nm .

Magnetolipozomi

O alta metodă de obținere a magnetitei într-un nanoreactor biologic utilizează membrane fosfolipidice numite lipozomi pentru a obține particule de oxid de fier . Nanoparticulele astfel sintetizate se numesc magnetolipozomi și pot mima acțiunea membranelor biologice, deci pot avea aplicații în domeniul biomedicinei .

Noțiuni generale – CANCER

Nu există o definiție simplă și exactă a cancerului. Etimologia cuvantului provine din limba greaca KARKINOS, ceea ce înseamna crustaceu. În general termenul de cancer se refera la un grup de afecțiuni caracterizate prin cresterea anormală și necontrolată a unui grup de celule, care invadează țesuturile înconjuratoare și care se pot raspândii la distantă de țesutul sau organul de origin .

În imagina de mai jos se pot obsevra celulele canceroase în diviziune (Figura 3.1.).

Figura 3.1. Celule canceroase în diviziune

Cancerul este rezultatul multiplicării dezordonate a celulelor.  Corpul uman este alcătuit din diferite țesuturi fiecare din ele fiind formate din milioane de celule. Acestea sunt dispuse într-o manieră ordonată, fiecare țesut în parte având propria sa structură și arhitectură celulară. Ele se supun unor reguli generale care permit funcționarea normală a organismului.

Cercetarea publică în percepția cancerului susține că de multe ori acesta pare a fi “laudat” mult mai negativ decât alte boli grave, cum ar fi bolile de inima .

După o cercetare realizată de Institutul National de Cancer, s-a ajuns la concluzia că în anul 2010 costurile medicale de îngrijire de cancer în Statele Unite au depășit 124 miliarde de dolari. Cu toate acestea, în ciuda cheltuielilor enorme pentru tratarea cancerului, multe tipuri de cancer sunt înca fatale iar rata de supraviețuire a rămas neschimbată de-a lungul mai multor decenii .

În proporție de 90% cancerul apare la nivelul țesutului epitelial, deși preponderent în corpul uman este țesutul conjunctiv. Țesutul epitelial este țesutul care formează la suprafața corpului epiderma și căptuțește cavitățile interne ale organismului, formând mucoase sau foițe epiteliale. Epiteliile sunt alcătuite din unul sau mai multe straturi de celule epiteliale, așezate pe o membrană bazală continuă și rezistentă, de natură conjunctivă. Ele nu sunt vascularizate, de aceea hrănirea lor se realizează datorită difuziei selective a substantelor prin membrana bazală și printre celulele epiteliale .

Aparitia și evoluția cancerului se relizează în mai multe etape:

Transformarea malignă;

Formarea tumorii primare;

Metastazarea;

Formarea tumorii secundare;

Moartea organismului.

Transformarea malignă reprezintă procesul prin care celulele normale se transformă in celulele canceroase, care se înmultesc anarchic. Transformarea malignă este cunoscută și sub numele de oncogeneza sau cancerogeneza.

Tumora primară este tumora care se formează la locul în care a avut loc transformarea malignă. Celulele transformate malign se înmultesc fară control modificand structurile vecine normale.

Creșterea tumorală este realizată deasupra barierei reprezentate de membrana bazală, astfel se poate considera ca formarea tumorii primare se desfasoară in trei faze:

Faza preinvazivă reprezintă formarea tumorii primare deasupra membranei bazale;

Invazia locală care reprezintă procesul de distrugere a membranei bazale;

Faza invazivă reprezintă creștere tumorală cu invazia țesutului de sub membrana bazală;

În faza de metastazare celule tumorii primare se desprind de tumoră și se răspândesc în organism (in general pe cale limfatică sau sanguină) formand colonii locale.

În faza de formare a tumorii secundare celulele tumorale pornite în circulație sunt blocate în diferite zone unde se inmulțesc în continuare, formând tumorile secundare .

Factorii de producere ai cancerului

Cancerul poate fi produs de virusuri :

Virusurile sunt de două feluri: AND-virusuri și ARN-virusuri.Virusul Sarcomuluirous a fost primul oncovirus descoperit și produce cancerul puilor de gaina.

Virusurile ARN, pe langă molecula de ARN contin o proteină numită reverstranscriptază. După patrunderea în celulă, ARN-ul viral se transformă, cu ajutorul reverstranscriptazei în AND-ul viral corespunzător care se integrează în AND-ul celulei .

Cancerul produs de radiatii :

În funcție de energia cu care sunt încarcate și în raport cu efectul exercitat de acțiunea lor asupra atomilor si moleculelor, radiațiile pot fi neionizante sau ionizante. Radiațiile neionizante au energie mai mica, dee aceea ele doar excită atomii mutând electronii de pe un orbital pe altul, în cadrul aceluiaș atom. Drumul acestora prin țesuturi este scurt deoarece ele sunt absorbite de țesuturi.

Dintre radiațiile neionizante, ultravioletele prezintă importanță pentru cancerogeneză deoarece pot fi absorbite de ADN, ARN și proteine tulburând echilibrul energetic intramolecular. Se pot induce astfel, mutații genetice și modificări a reacțiilor metabolice din celulă, inducând astfel transformarea malignă. Radiațiile ultraviolete natural sunt absorbite în cea mai mare parte de melanocite, sistemul melanocitar având tocmai acest rol, de protecție împotriva radiațiilor. Sursa principală de radiații ultraviolete sunt razele solare .

Radiațiile ionizante au energie mare. Ele pot proveni din natură, dar cea mai mare parte a radiațiilor care afectează sănatatea oamenilor sunt produse de oameni. Principalele tipuri de radiații ionizante sunt radiațiile X, radiațiile alfa , beta și gamma.

Acționând asupra atomilor și moleculelor, radiațiile ionizante pot produce ionizarea acestora, ceea ce determină o serie de reacții chimice înlănțuite în celulă. Se produc molecule foarte active chimic, anioni, radicali liberi, modificând echilibrul reacțiilor metabolice din citoplasmă, pe de-o parte și, pe de alta parte, produc modificări ale structurilor celulare inclusiv modificări ale structurii ADN-ului. Prin aceste mecanisme se poate induce transformarea malignă deci, se poate produce cancer.

.Cancerul produs prin alimentație :

Agenții cancerigeni chimici pot pătrunde în organism prin alimentație.

Surse de substanțe oncogene:

alimentele în stare naturală pot conține hidrocarburi aromatice, alcaloizi, derivati de forbol ;

tehnicile de preparare a mâncarurilor: afumarea, prelucrare termică la tempreratura înaltă, prăjirea de lungă durată ;

metode de conservare a alimentelor: afumare, conservare cu nitriți/nitrați ;

Tutunul este, de departe, cel mai important drog, depășind alcoolul și stupefiantele, de aceea și implicațiile lui asupra sănătății populației sunt mari.

Numai în domeniul cancerului, spre exemplu, fumatul produce 80-85% dintre cancerele pulmonare. De asemenea, fumătorii fac mai frecvent cancer de laringe, de esofag, de pancreas, de rinichi și de vezică urinară decat nefumătorii.

Cancerul produs de hormoni :

Alături de impulsurile nervoase controlate de sistemul nervos central, hormonii realizează coordonarea tuturor proceselor din organism. Pe langă alte procese celulare, hormonii controlează inducerea diviziunilor celulare. Transformarea malignă poate fi considerată ca o scapare de sub control a diviziunii, astfel unii hormoni pot participa la cancerogeneză .

Aplicatiile magnetitei in tratamentul cancerului

Nanoparticule magnetice (MNPs) sunt o clasă mare de materiale la scară nanometrică, cu potențial ridicat de a revoluționa tehnicile clinice de diagnostic și terapeutice curente. Datorită proprietăților lor fizice unice și capacitatea de a funcționa în interacții biologice la nivel celular și molecular, nanoparticulele magnetice sunt investigate în mod activ ca următoarea generație de imagistică prin rezonanță magnetică (agenți IRM), agenți de contrast și ca purtători de medicamente pentru livrări direcționate. Deși primele cercetări în domeniu au fost datate în urmă cu mai multe decenii, creșterea recentă de interes în domeniul nanotehnologiei și-a extins în mod semnificativ amploarea și profunzimea de cercetare a nanoparticulelor de magnetită. Cu o gamă largă de aplicații în detectarea, diagnosticarea și tratamentul bolilor, cum ar fi cancerul, bolile cardiovasculare și boli neurologice, nanoparticulele de magnetită pot juca în curând un rol important în satisfacerea nevoilor de asistență medical.

Nanoparticulele magnetice sunt utilizate în aplicații biomedicale cum ar fi transportul pentru medicamente,pentru separarea magnetică a celulor,imagistică medicală denumită și (RMI), dar și pentru diagnosticare fiind implicate agenții de contrast.Deși există mai multe tipuri de nanoparticule magnetice,paticulele magnetice de oxid de fier, Fe2O3-magnetită și forma sa oxidă maghemită (γ-Fe2O3) sunt mai importante, deoarece ele sunt non-toxice, iar din punct de vedere termic sunt mai stabile.Acest tip de nanoparticule sunt cele mai studiate materiale pentru aplicații biomedicale.

În prezent, nanoparticule magnetice atrag atenția datorită utilizării lor ca potențiali agenți de contrast pentru imagistica prin rezonantă magnetică (IRM) și mediatori de încălzire pentru termoterapia cancerului (hipertermia).

Hipertermina, încălzirea țesuturilor canceroase intre 40° C si 45° C, a fost demonstrată pentru a imbunătăți eficacitatea terapiei cancerului, atunci când aceasta este utilizată împreună cu iradiere și/sau chimioterapie . Hipertermia reprezintă o metodă care implica încălzirea țesutului tumoral folosind nanoparticule de magnetită care pot fi încălzite la distanță la expunerea unui camp magnetic alternative extern (AMF). Tratamentul hipertermiei locale aplicat la o zonă foarte mica, cum ar fi o tumoră este o metodă bine cunoscută de tratamentul cancerului, care are la bază un principiu foarte simplu: “ Dacă o crestere a temperaturii la 106° F poate fi obtinută intr-o tumoare, atunci celulele canceroase sunt distruse”. Încălzirea întregului corp este folosită pentru a trata cancerul metastatic, care a fost răspândit in tot corpul .

Date pre-clinice extensive au arătat că o combinație de hipertermie cu iradiere și/ sau chimioterapie îmbunătățește eficacitatea tratamentului fără a produce toxicitate sistemică suplimentară .

A fost demonstrat că hipertermia poate produce o crestere a fluxului de sânge, care poate induce hipoxie, acidoză și energie la locul tumorii, crescând astfel eficacitatea terapiei .

În prezent, există un număr de obstacole cu care se confruntă tratamentul hipertermic, inclusiv restricție de încălzire locală a tumorii fara a deteriora tesutul din jur și o incapacitate de a încălzi țesutul canceros la nivel local, fără a utiliza sonde de încălzire invazive și incomode.

DOXORUBICINĂ

Doxorubicina este un antibiotic citotoxic de tip antraciclinic izolat din culturile de Streptomyces peucetius var.caesius. Se consideră că efectul citotoxic al doxorubicinei asupra celulelor maligne și efectele sale toxice asupra diferitor organe sunt legate de acțiunile doxorubicinei de intercalare a bazelor nucleotidice și de legare la nivelul lipidelor membranare celulare. Intercalarea inhibă replicarea nucleotidelor și acțiunea ADN și ARN polimerazelor. Interacțiunea dintre doxorubicină și topoizomeraza II, care are drept rezultat formarea complexelor ADN clivabile pare să fie un mecanism important al activității citotoxice a doxorubicinei.

Doxorubicina este un antibiotic injectabil, de culoare rosie. Un ml de soluție injectabilă conține substanță activă: clorhidrat de doxorubicină – 2 mg și substanțe auxiliare: clorură de sodiu, acid clorhidric, apă pentru injecții.

Pentru nanostructurile pe bază de magnetită folosite în tratarea cancerului, am utilizat doxorubicina, deoarece este un antibiotic rapid care se distribuie rapid în plasmă și țesuturi, deja peste 30 secunde preparatul este răspândit în ficat, plămâni, inimă și rinichi. Volumul de distribuție constituie 20-30 l/kg. Timp de 1 oră după administrare doxorubicina se metabolizează parțial în ficat în metabolitul activ. Nu penetrează bariera hematoencefalică. Timpul de înjumătățire pentru doxorubicină și metabolitul său variază de la 20 până la 48 ore .

Doze și mod de administrare:

De obicei, doxorubicina este administrată intravenos. În funcție de situație, doxorubicina poate fi administrată și intravezical sau intra-arterial. Administrarea intravezicală poate fi utilizată în cazul cancerului superficial de vezică urinară, ca și în profilaxia recurențelor după rezecție transuretrală. Calea intra-arterială poate fi utilizată pentru o acțiune locală eficace pentru reducerea intoxicației generale .

Administrarea intravenoasă:

Doza totală de doxorubicină la o cură de tratament poate să difere în funcție de regimul terapeutic în cadrul căruia este administrată (de exemplu, dacă este administrată ca agent unic sau în asociere cu alte medicamente citotoxice) și în funcție de indicația terapeutică. Doxorubicina trebuie administrată pe aceeași linie cu o perfuzie intravenoasă la discreție (clorură de sodiu 0,9% sau soluție de glucoză 5%) în nu mai puțin de 3 minute și nu mai mult de 10 minute, pentru a reduce la minim riscul de tromboză sau extravazare paravenoasă. Nu se recomandă injectarea directă forțată, ca urmare a riscului de extravazare, care poate apărea chiar în prezența unui flux de retur adecvat sub aspirație pe ac .

Administrarea intravezicală:

Administrarea intravezicală poate fi utilizată pentru tratamentul tumorilor superficiale de vezică urinară sau profilactic în reducerea recurențelor după rezecție transuretrală. Se recomandă instilarea a 30-50 mg în 25-50 ml ser fiziologic. În caz de toxicitate locală (cistită chimică), doza se instilează în 50-100 ml ser fiziologic .

Administrarea intra-arterială:

Doxorubicina a fost administrată și intra-arterial, în scopul obținerii unei acțiuni locale intense și utilizării unor doze cât mai mici la pacienții cu cancer hepatocelular. Această tehnică este periculoasă, putând determina necroza extinsă a țesutului perfuzat; de aceea administrarea intra-arterială se face numai de către medici cu experiență în această tehnică.

Reacții adverse:

Infecții și infestări: infecții, incluzând sepsis/septicemia;

Tumori benign și maligne: leucemie limfocitară acută, leucemie mieloidă acută;

Tulburări hematologice și limfatice: leucopenie, neutropenie, anemie, trombocitopenie;

Tulburări ale sistemului imunitar: anafilaxie;

Tulburări metabolice și de nutriție: anorexie, deshidratare;

Tulburări ocular: conjunctivită;

Tulburări cardiac: tahicardie sinusală, tahiaritmii, bloc atrioventricular și de ramură, insuficiență cardiacă congestivă;

Tulburări vasculare: bufeuri, flebită, tromboflebită, tromboembolism, șoc;

Tulburări gastro-intestinale: greață/vărsături, mucozită/stomatită, hiperpigmentarea mucoasei orale, esofagită, durere abdominală, eroziuni gastrice, hemoragii digestive, diaree, colită;

Tulburări renale si ale căilor urinale: colorarea în roșu a urinii timp de 1-2 zile după administrare.

Contraindicații:

hipersensibilitate la doxorubicină sau la oricare dintre excipienți, la alte antracicline sau antracendione;

deprimare marcată a funcției hematopoietice medulare ca urmare a chimioterapiei sau radioterapiei precedente (leucopenie, trombocitopenie, anemie);

afecțiuni severe ale sistemului cardiovascular (miocardită, infarct miocardic recent, aritmii severe);

dereglări severe ale funcției hepatice și renale;

tratamente anterioare cu doze cumulative maxime de doxorubicină și/sau alte antracicline și antracendione;

sarcina și perioada de alăptare.

Atenționări și precauții speciale de administrare:

Doxorubicina trebuie administrată numai sub supravegherea unor medici calificați, cu experiență în administrarea citotoxicității.

Înainte de a începe tratamentul cu doxorubicină, pacienții trebuie să nu prezinte manifestări de toxicitate acută (cum sunt stomatita, neutropenia, trombocitopenia și infecțiile generalizate) consecutive unui tratament anterior cu citotoxice.
Se indică cu precauție pacienților cu afecțiuni cardiace (inclusiv în antecedente), varicelă (inclusiv recent suportată sau după contact cu bolnavi), Herpes zoster, alte boli infecțioase acute, gută sau litiază renală (inclusiv în antecedente), la fel pacienților care au urmat radioterapie în regiunea mediastinului sau care au administrat concomitent ciclofosfamidă .

Doxorubicina trebuie administrată numai sub supravegherea unor medici calificați, cu experiență în administrarea citotoxicității.

Memoriu justificativ

Aceasta lucrare dezvoltă un subiect destul de important și bine cunoscut în zilele noasre – cancerul fiind a doua cauză de mortalitate în România și Europa. România are incidența cea mai mare din Europa la trei forme de cancer și anume: cancer de plămân, de col uterin și de creier. Cancerul denumit științific “neoplasm” este o boală; o boală care printr-o diviziune necontrolată de celule, invadează țesutruile din organism. Această invazie se produce printr-o creștere direct a celulelor canceroase în țesuturisau prin migrația celulelor către alte organe.

În scopul tratării cancerului, în acestă lucrare sunt prezentate noțiuni ale hipertermie. Hipertermia a ajuns un tratament cunoscut, fiind un fenomen natural sau artificial care presupune creșterea temperaturii corpului sau a unei anumite regiuni din corp peste temperature stabilită la un anumit moment de către sistemul de termoreglare al organismului. Cele mai studiate nanoparticule magnetice în procesul de hipertermie au fost magnetita și maghemita. Particulele utilizate în hipertermie prezintă proprietăți fero- sau ferimagnetice. A fost demonstrate că particulele magnetice prezintă proprietăți magnetice în absența câmpului magnetic aplicat.

Un subiect destul de important în alegerea acestei lucrări îl prezintă dezvoltarea a mai multor metode de caracterizare. Am avut plăcerea de a utiliza aparate precum difractometru model Shimadzu XRD 6000 în scopul investigării cristalinității nanopulberii de magnetită funcționalizată cu doxorubicină, care a fost realizată prin intermediul tehnicii de difracție a razelor X, deasemenea determinările experimentale ale analizelor termogravimetrice au fost realizate cu ajutorul unui aparat de tipul Shimadzu DTG-TA-50H. În scopul analizării problemor s-a utilizat microscopul electronic de baleaj, respective microscopul electronic prin transmisie. Am avut acordul Comisiei de Bioetică a Universității de Medicină și Farmacie din Craiova, de a lucra pe soricei de rasă BALB/c în scopul determinării biocompatibilității și biodistribuției in vivo a nanostructurilor.

II.ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

MATERIALE ȘI METODE

Materiale

Magnetită (Fe3O4 ) ;

Clorură de fier (FeCl3 ) ;

Sulfat de fier (FeSO4 ) ;

Amoniac ( NH3 ) – concentratie 28 % ;

Doxorubicină ( C27H29NO11 ) .

Materiile prime utilizate au fost de puritate ACS (American Chemical Society).

Sinteză

Pentru obținerea nanoparticulelor de magnetiă s-a folosit metoda coprecipitării.

Pentru soluția 1, intr-un pahar Berzelius se adaugă 1.6g FeCl3, 1g FeSO4 în 300ml de apă. Aceasta repretintă o soluție importantă, ea fiind cea care aduce precursorii, deasemenea soluția 2 este importantă deoarece reprezintă mediu bazic. Pentru Solutia 2, intr-un pahar Berzelius s-au adăugat 0.2g Doxorubicină, 9ml NH3 in 300ml apă. După obținerea acestor soluții, se va picura continutul soluției 1 peste conținutul solutiei 2 cu ajutorul unui sistem de picurare pe baza unei pâlnii de sticlă. Dupa ce soluția finală a fost obținută, sub aceasta a fost pus un magnet care ajută la decantare. După decantare, solutia a fost spalată de trei ori cu apă distilată, după care a fost lasată la uscat, ulterior aceasta a fost mojarată. Nanoparticulele pe baza de magnetită obținute au fost puse in eppendorf-uri pentru a fi analizate.

Figura 3. Sistem de picurare pe baza unei pâlnii de sticlă.

Metode de caracterizare

1.3.1. Difracție de Raze X (XRD)

Difracția de raze X reprezintă procesul prin care radiația , fară ca lungimea de undă sa se modifice, este transformată prin interferența cu rețeaua cristalină intr-un număr mare de „reflexii” observabile cu direcții spațiale caracteristice.

Principiul metodei

Determinarea structurii cristalografice specifică nanopulberii de magnetită obținută a fost posibilă prin tehnica difracției de raze X. În acest sens, radiația X emisă de un tub catodic este filtrată (în scopul obținerii unui fascicul monocromatic), colimată (pentru formarea unui fascicul convergent) și ulterior fiind direcționată către proba ce se dorește a fi analizată, aceasta fiind imobilizată pe un suport rotativ aflat în incinta de difracție. În urma interacției dintre radiația X cu nanopulberea de magnetită, rețeaua cristalografică specifică acesteia din urmă determină difracția radiației incidente într-un mod discontinuu, propagarea radiațiilor difractate fiind influențată de distanța dintre atomii celulei elementare . Dupa interacțiunea celor două, efectul de difracție caracteristic materialului investigat este format prin interferarea pozitivă a difracțiilor individuale ale tuturor atomilor rețelei cristalografice, fenomen realizat în conformitate cu legea lui Bragg. Cu ajutorul acestei legi, prin intermediul condiției n•λ = 2•d•sinθ se stabilește o relație de proporționalitate între lungimea de undă asociată radiației electromagnetice și distanța dintre planele reticulare, respectiv valoarea unghiului sub care radiația X interacționează cu planele probei. Înregistrarea radiației difractate este posibilă datorită contorului Geiger-Müller, aflat pe același ax rotativ cu suportul probei, mișcarea de rotație a acestuia fiind caracterizată de o viteză unghiulară dublă față de cea a goniometrului pe care este poziționată proba. Impulsurile contorului sunt ulterior preluate de către cristalograf ,acesta aplicând semnalelor primite modelul matematic al transformatei Fourier, asigurând astfel conversia și amplificarea impulsurilor, precum și înregistrarea ulterioară a acestora sub forma difractogramelor, unde maximele ascuțite sunt asociate unghiurilor de difracție a radiației X.

Investigarea cristalinității nanopulberii de magnetită funcționalizată cu doxorubicină a fost realizată prin intermediul tehnicii de difracție a razelor X, utilizând în acest sens un difractometru model Shimadzu XRD 6000. Determinările experimentale au fost făcute la temperatura camerei, pentru valori ale unghiului Bragg de 2θ cuprinse între 100 și 800, utilizând radiația Cu Kαcu λ = 1,056 Å (15 mA și 30 kV).

Figura 1.1. Difractometru Shimadzu XRD 6000

1.3.2. Spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier (FT-IR)

Tehnica de analiză spectroscopică în infraroșu cu transformată Fourier este o tehnică folosită pentru a obține un spectru infraroșu de absorbție, emisie, fotoconductie sau împrăștierea Raman de produs solid, lichid sau gazos.

Principiul metodei

În spectrele IR se pot identifica două tipuri de vibrații ale gupărilor funcționale dintr-o moleculă si anume alungirea, respectiv deformarea. Vibrația de alungire (simbolizată prin ν), este mișcarea ritmică de-a lungul axei legăturii covalente astfel încât are loc o variația a distanței interatomice; acestă vibrație se mai numește și vibrație de valență. Vibrația de deformare constă într-o modificare a unghiului dintre două legături covalente, avînd un atom în comun . Grupările funcționale ale moleculelor iradiate cu unde infraroșii prezintă capacitatea de a absorbi radiația electromagnetică doar la anumite valori ale lungimii de undă, ceea ce permite înregistrarea de către interferometru a unor maxime de absorbție în infraroșu caracteristice. Grupările funcționale ale moleculelor iradiate cu unde infraroșii prezintă capacitatea de a absorbi radiația electromagnetică doar la anumite valori ale lungimii de undă, ceea ce permite înregistrarea de către interferometru a unor maxime de absorbție în infraroșu caracteristice . Maximele de absorbție rezultate sunt ulterior analizate la nivelul interferometrului care, prin aplicarea transformatei Fourier semnalului primit, permite prezentarea și înregistrarea informației sub forma spectrală cunoscută, asigurând astfel obținerea unei amprente moleculare unice asociată fiecărui compus chimic analizat

1.3.3. Analiza termogravimetrică (TGA)

Analiza termogravimetrică este o tehnică de analiză termică ce constă în măsurarea schimbărilor masei unei probe odată cu cresterea temperaturii, într-o atmosferă controlată.

Principiul metodei

Pentru analiza pulberii ce se dorește analizată, într-un creuzet confecționat din material cu stabilitate termică, se plasează o cantitate redusă de magnetită funcționalizată cu doxorubicină, ce va fi introdus în incinta de lucru a derivatografului, pentru a fi supus unui tratament termic controlat. Incinta de analiză permite setarea din exterior temperaturii și presiunii la care se efectează măsurările, dar și înregistrarea datelor în aer, atmosferă reactivă (cu conținut scăzut de oxigen) sau în atmosferă de gaz inert (de obicei, argon sau heliu).

Prin transferarea unei cantități de energie termică spre proba de magnetită, se poate produce o serie de procese fizice și chimice în urma cărora masa probei poate fi modificată. Suplimentar informațiilor legate de variația masei probei, se pot obține date importante privind natura modificărilor suferite de aceasta, prin înregistrarea diferenței de temperatură dintre proba conținută în creuzetul de analizat și unul sau mai multe materiale de referință.

Ulterior, o cantitate redusă de pulbere a fost plasată în creuzetul din alumină, ce a fost introdus în incinta de analiză a derivatografului. Măsurătorile realizate au fost facute în atmosferă de aer, la valori termice cuprinsă între 300C și 5000C, viteza de încălzire a incintei fiind de 10C/minut.

Determinările experimentale au fost realizate cu ajutorul unui aparat de tipul Shimadzu DTG-TA-50H.

1.3.4. Microscopia electronică de baleaj (SEM)

Microscopia electronică de baleiaj, cunoscută și sub denumirea de SEM – Scanning Electron Microscopy – este o tehnica specială care permite observarea și caracterizarea la scară micro și nanometrică a materialelor solide anorganice sau organice.Microscopia electronică de baleaj (SEM) este considerată o tehnică nedestructivă de investigare a morfologiei materialelor, oferind posibilitatea obținerii de informații într-un timp redus și oferind avantajele unei rezoluții spațiale de 50 nm până la 100 nm, respectiv a unei măriri între 20-30.000 de ori a probei de analizat.

Principiul metodei

Proba este bombardată cu un fascicul de electroni, determinând încetinirea vitezei de propagare a fasciculului incident, ca urmare a coliziunilor realizate între electroni și ionii regăsiți în microstructura materialului . În urma acestui impact, energia cinetică a electronilor incidenți este transferată electronilor de pe straturile orbitale ale atomilor probei iradiate, favorizând astfel expuzarea acestora din învelișul electronic în interiorul materialului, sub forma specifică de electroni secundari, caracterizați de energii mai mici de 50 eV . Astfel, se produce transportul prin probă al electronilor secundari rezultați, către suprafața materialului, urmând a fi eliberați la interfața probă-vid . Prin înregistrarea intensităților la care sunt împrăștiați electronii secundari rezultați în urma scanării suprafeței unui material cu un fascicul de electroni, se pot obține imagini virtuale asociate texturii materialului iradiat, în care contrastul imaginii este datorat topografiei probei, astfel încât zonele mai înalte favorizează interacții mai puternice cu fasciculului incident de electroni și emiterea unui număr mai mare de electroni secundari, astfel se asigură o imagine mai luminoasă în zonele “înalte” ale probei .

În scopul investigării morfologiei și dimensiunii straturilor subțiri nanostructurate obținute, probele au fost secționate cu ajutorul unui disc cu diamant, fixate pe un suport și introduse în incinta de analiză a unui microscop electronic de baleaj, imaginile obținute fiind realizate prin înregistrarea unui fasciculului de electroni secundari, cu o energie de 30 keV.

Microscopul electronic de baleaj a fost achiziționat de la comania FEI (Oregon, Statele Unite ale Americii).

1.3.5. Microscopie Electronica prin Transmisie (TEM)

Apariția tehnicilor de microscopie electronică prin transmisie a permis investigarea materiei la rezoluții neîntâlnite până în acel moment, fapt ce a condus la progrese importante ale stiinței materialelor către domeniul nano.

Principiul metodei

Acesta constă în direcționarea unui fascicul de electroni produs cu ajutorul unui tun de electroni și colimat prin intermediul unor lentile magnetice sau electrostatice către proba ce se dorește a fi analizată și obținerea unei imagini virtuale a electronilor ce stăbat probă. Electronii transmiși prin probă sunt focalizați cu ajutorul unei lentile obiectiv și ulterior amplificați prin intermediul unei lentile proiector, care asigură formarea imaginii pe un ecran cu fluorescență . Contrastul imaginii este realizat prin capacitatea diferitelor zone ale probei de a dispersa diferențiat electronii. Cu cât grosimea probei este mai mare și cu cât numarul atomic Z al elementelor dintr-o zonă este mai mare, cu atât dispersia electronilor este mai mare.

În scopul obținerii imaginilor de microscopie electronică prin transmisie, o cantitate redusă din proba de magnetită funcționalizată doxorubicină a fost dispersată în etanol pur și supusă unui tratatment cu ultrasunete, timp de 15 minute. Ulterior, proba a fost amplasată pe o grilă de cupru acoperită cu carbon și lasată să se usuce, la temperatura camerei.

Obținerea imaginilor TEM a fost posibilă prin analizarea probei cu ajutorul unui microscop electronic prin transmisie de înaltă rezoluție de tip TecnaiTM G2 F30 S-TWIN echipat cu SAED, achiziționat de la compania FEI (Oregon, Statele Unite ale Americii).

1.3.6. Difracție de electroni pe arie selectată (SAED)

Difracție de electroni pe arie selectată este o analiză care arată particularitățile rețelei cristaline a unui material. Această tehnică de investigare este similară din punct de vedere al principiului metodei, cu difracția de raze X, dar prezintă totuși cateva deosebiri față de aceasta: radiația incidentă este reprezentată de un fascicul de electroni (spre deosebire cu XRD, care utilizează radiație X) iar analizarea probei este realizată pe zone cu dimensiuni de ordinul nanometrilor (comparativ cu XRD, unde suprafața investigată este de ordinul centrimetrilor) . Distanțele interatomice prezintă valori ceva mai mari decât lungimea de undă a fasciculului de electroni care interacționează cu proba, iar atomii probei iradiate acționează similar unei rețele de difracție pentru electronii incidenți, astfel se asigură împrăștierea acestora și înregistrarea unei imagini caracteristice a undelor difractate, de diferite intensități, sub formă de puncte (spoturi), inele concentrice sau linii. Distribuția specifică a fasciculului de electroni difractat permite obținerea de informații valoroase despre magnetita funcționalizată cu doxorubicină, și anume constatarea naturii cristaline sau amorfe, precum și identificarea sistemului cristalografic și al eventualelor defecte structurale, dar și identificarea compozițională a probei (prin asociere cu structura sa cristalină).

Analiza SAED pentru nanoparticulele de magnetită funcționalizată cu doxorubicină a fost refectuată în câmp luminos cu ajutorul microscopului electronic de înaltă rezoluție model TecnaiTM G2 F30 S-TWIN echipat cu SAED, achiziționat de la compania FEI (Oregon, Statele Unite ale Americii).

Figura 1.2. Microscopului electronic TecnaiTM G2 F30 S-TWIN

1.3.7. Teste in vitro pe culturi de celule tumorale

Măsurarea speciei reactive de oxigen intracelulare (ROS)

Nivelul de ROS intracelular a fost evaluat utilizând 2 ', diacetat 7'-dichlorodihydrofluorescein (H2DCF-DA; Sigma-Aldrich) care este compus din celule permeabile și este hidrolizat de esteraze intracelulare 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein (H2DCF). Aceasta este oxidat prin ROS la un compus puternic fluorescent, 2 ', 7'-diclorofluorescein (DCF). După 48 de ore de expunere la funcționalizarea cu MNPs, celulele cultivate în plăci cu 6 godeuri au fost spălate cu PBS și incubate la 37 ° C cu 10 uM H2DCF-DA în mediu liber de fenol timp de 30 min. Ulterior, celulele au fost spălate și suspendate în PBS pentru a detecta fluorescent, folosind un spectrofluorometru JASCO FP650.

Fosfataza alcalină (ALP)

La sfârșitul celor 48 ore de incubare, celulele au fost spălate cu PBS și fixate în 4% paraformaldehidă timp de 20 minute la 4 ° C. După aceea, celulele au fost permeabilizate și blocate cu 0,5% Triton X-100 – 2% albumină serică bovină în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS, Sigma-Aldrich) timp de 1 oră. Anticorpul primar împotriva fosfatazei alcaline umane (01:50; Santa Cruz Biotechnology) a fost incubat cu celule timp de 2 ore la temperatura camerei. Dupa spalarea de 3 ori cu tampon fosfat salin (PBS), celulele au fot incubate cu anticorpul IgG-FITC (1:100) pentru 30 de minute. Celulele au fost observate cu ajutorul unui microscop cu fluorescență Olympus IX71.

1.3.8. Determinarea biocompatibilității și biodistribuției in vivo a nanostructurilor

Experimentul a fost aplicat în conformitate cu Directiva Consiliului European Nr. 86/609 (24 noiembrie 1986), cu Convenția Europeană pentru Protecția Animalelor Vertebrate utilizate în scopuri experimentale și în alte scopuri științifice (2 decembrie 2005) și cu Legea nr. 43 (11 aprilie 2014) privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice, adoptată de Parlamentul României. Studiul a fost aprobat de către Comisia de Bioetică a Universității de Medicină și Farmacie din Craiova (Raport nr. 118/27.05.2015).

Principiul metodei

Pentru experiment s-au folosit soricei de rasă BALB/c, în vârstă de trei luni,care au fost injectați aseptic cu 100 μl din dispersia de nanostructuri (1 mg/ml), preparată în ser fiziologic și sterilizată în prealabil prin iradiere cu UV timp de 30 minute. Administrarea intravenoasă s-a realizat în vena jugulară stângă, lent, folosind un cateter, sub anestezie generală cu amestec injectabil de ketamină/xilazină administrat intraperitoneal. Șoriceii martor au fost injectați în aceleași condiții cu 100 μl de ser fiziologic. Pe toată durata experimentului, animalele au fost menținute în condiții standard de temperatură, umiditate, iluminat, hrană și apă.

Figura 1.3. Șoricei albi rasa BALB/c, în vârstă de trei luni și anestezierea acestuia prin injectare intraperitoneală

De la inceperea experimentului, la 2 și la 10 zile, animalele au fost eutanasiate, după anestezie generală, în scopul recoltării organelor interne (creier, ficat, miocard, pancreas, plămân, rinichi, splină). Fragmentele de organe au fost spălate în TFS (tampon fosfat salin), pentru îndepărtarea sângelui, conservate în soluție de formaldehidă 10%, la temperatura camerei, timp de 72 de ore și ulterior prelucrate prin includere la parafină, în scopul efectuării studiilor de morfologie microscopică.

Figura 1.4. Contenționarea șoricelului anesteziat și operația acestuia pentru evidențierea venei jugulare stângi

Figura 1.5. Recoltarea organelor interne, la 2 zile și la 10 zile, după sacrificarea șoriceilor sub anestezie generală

Pentru analiza histologică a nanostructurilor, din blocurile de parafină cu probele biologice s-au obținut secțiuni seriale, cu grosimea de 4 μm, folosind un microtom rotativ MICROM HM355s (MICROM International GmbH, Walldorf, Germania) echipat cu un sistem de transfer (STS, microM). Secțiunile transversale au fost plasate pe lame histologice tratate cu poli-L-lizină (Sigma-Aldrich, München, Germania). După aplicarea tehnicii de colorare clasică cu Hematoxilină–Eozină (HE), secțiunile au fost evaluate și fotografiate la un microscop optic Nikon Eclipse 55i echipat cu o cameră video de înaltă definiție Nikon DS–Fi1 CCD (Nikon Instruments, Apidrag, România). Achiziția, stocarea și prelucrarea imaginilor s-a realizat cu ajutorul pachetului de programe Image ProPlus 7 AMS (Media Cybernetics Inc., Marlow, Buckinghamshire, Marea Britanie).

1.3.9. Determinarea biocompatibilității și biodistribuției in vivo a nanostructurilor în model experimental pe membrana corioalantoidiană a embrionului de pui (chick embryo chorioallantoic membrane [CAM])

Membrana corioalantoidiană a embrionului de pui (chick embryo CAM – chorioallantoic membrane) este o membrană extraembrionară formată prin fuziunea dintre corion și alantoidă. Alantoida este o membrană extraembrionară derivată din mesoderm, în care vasele de sânge primitive încep să se formeze după trei zile de la incubație. După 4–5 zile de la incubație, alantoida fuzionează cu corionul și formează membrana corioalantoidiană .

CAM cuprinde trei straturi:

epiteliul corionic, alcătuit din celule epiteliale derivate din ectodermul corionic;

mezodermul, compus din țesut mezenchimatic puternic vascularizat;

epiteliul alantoidian, derivat din endodermul alantoidian.

Prin rețeaua densă de capilare, CAM are rol de mediere a schimburilor de gaze cu mediul extraembrionar și de transport al calciului de la coaja oului către embrion (pentru formarea scheletului). Până în a opta zi de incubație, capilarele primitive continuă să prolifereze și apoi să se diferențieze într-un sistem arteriovenos. La opt zile de la incubație, embrionii de pui au deja formată membrana corioalantoidiană. Sistemul vascular al CAM continuă să se formeze până în ziua a 11-a, după care, până în ziua a 18-a, chiar înainte de eclozare, atinge gradul maxim de dezvoltare .

Principiul metodei

Pentru testarea in vivo a biocompatibilității suspensiilor de nanoparticule, s-au utilizat loturi de câte cinci embrioni de pui cu vârsta de 11 zile, obținuți din ouă fertilizate de la găini rasa White Leghorn.

Ouăle au fost incubate la o temperatură de 37.50C și o umiditate relativă de 70%. După 72 ore de la incubare, vârful fiecărui ou a fost curățat cu etanol 70%, iar cu un ac fin s-au extras 3–5 ml de albuș pentru a facilita dezlipirea membranei corioalantoidiene (CAM) de coaja oului. Acest lucru a permis decuparea unei ferestre de cca. 0.75 cm2 la vârful oului, sigilată imediat cu bandă adezivă. Ouăle au fost reintroduse în incubator și păstrate încă opt zile în condițiile de temperatură și umiditate menționate anterior, pentru a atinge stadiul de dezvoltare care să permită injectarea în CAM a suspensiei de nanoparticule. Dacă membrana corioalantoidiană nu a fost suficient de dezvoltată sau dacă s-au observat anomalii în evoluția embrionului, oul a fost îndepărtat din experiment .

Figura 1.6. Evidențierea membranei corioalantoidiene a embrionului de pui, pregătire pentru injectarea manuală a suspensiei de nanoparticule (monitorizare la stereomicroscop).

În fiecare ou care prezenta CAM normal dezvoltată, sub microscopul operator, s-au injectat intravascular, aseptic, 100 μl din dispersia de nanostructuri (1 mg/ml), preparată în ser fiziologic și sterilizată în prealabil prin iradiere cu UV timp de 30 minute. Lotul martor, alcătuit tot din cinci embrioni de pui, a fost păstrat în aceleași condiții experimentale, dar fără a interveni asupra CAM. În fiecare etapă de lucru, evoluția CAM a fost examinată și înregistrată zilnic, la un stereomicroscop Zeiss prevăzut cu o cameră DCM 510, până la momentul eclozării .

Figura 1.7. Embrion de pui, dezvoltat normal, la trei zile de la injectarea suspensiei de nanoparticule. Recoltarea materialului biologic s-a realizat în formol tamponat, în vederea prelucrării organelor interne pentru analiza histologică.

După trei zile de la injectarea suspensiei de nanoparticule, câte trei embrioni din fiecare lot au fost recoltați pentru analiza histologică a organelor interne (creier, ficat, miocard, pipotă, plămân, rinichi). Imediat după recoltare, fragmentele de organe au fost spălate în TFS (tampon fosfat salin), pentru îndepărtarea sângelui, conservate în soluție de formaldehidă 10%, la temperatura camerei, timp de 72 de ore și ulterior prelucrate prin includere la parafină, în scopul efectuării studiilor de morfologie microscopică.

Ceilalți doi embrioni rămași din fiecare lot (din lotul tratat cu nanoparticule și, respectiv, din lotul martor) s-au dezvoltat normal și au eclozat la termen, fără a prezenta anomalii de dezvoltare la nivel macroscopic.

Pentru analiza histologică a nanostructurilor, din blocurile de parafină cu probele biologice s-au obținut secțiuni seriale, cu grosimea de 4 μm, folosind un microtom rotativ MICROM HM355s (MICROM International GmbH, Walldorf, Germania) echipat cu un sistem de transfer (STS, microM). Secțiunile transversale au fost plasate pe lame histologice tratate cu poli-L-lizină (Sigma-Aldrich, München, Germania). După aplicarea tehnicii de colorare clasică cu Hematoxilină–Eozină (HE), secțiunile au fost evaluate și fotografiate la un microscop optic Nikon Eclipse 55i echipat cu o cameră video de înaltă definiție Nikon DS–Fi1 CCD (Nikon Instruments, Apidrag, România). Achiziția, stocarea și prelucrarea imaginilor s-a realizat cu ajutorul pachetului de programe Image ProPlus 7 AMS.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Microscopia electronică de baleiaj

Pentru obținerea de informații despre caracteristicile morfologico-texturale ale nanoparticulelor obținute s-au realizat analize de microscopie electronică de baleiaj (SEM).

Din punct de vedere morfologic, nanoparticulele de magnetită funcționalizate cu doxorubicină prezintă un aspect uniform, având o nanodispersie a cărei distribuție a mărimii particulelor este în jur de 10 nm. În imaginile SEM obținute se evidențiază tendința nanoparticulelor de aglomerare (Figura 2.1.).

Figura 2.1. Imagini SEM ale nanoparticulelor de magnetită funcționalizate cu Doxorubicină la mărire de 100000x ,200000x, respective 400000x

Microscopia electronică de transmisie

Pentru a se pune în evidență dimensiunile nanometrice ale particulelor, morfologia și structura materialelor obținute, precum și evidențierea rețelelor cristalografice și a eventualelor defectele structurale de la acest nivel, dar și date privind compoziția probelor, s-au realizat studii prin microscopia electronic de transmisie.

În imaginea prezentată mai jos, se pot observa cristale de magnetită bine conturate cu dimensiunea medie de 5nm ( Figura 2.2.(a) ). Imaginile de microscopie electronică de transmisie pun în evidență aglomerări ale particulelor de magnetită. Tendința de aglomerare a acestor particule este datorată, probabil, dimensiunilor mici ale cristalelor de magnetită (5-7nm) ( Figura 2.2.(b) ).

Figura 2.2. . Imagini de microscopie electronică prin transmisie (TEM) (a) și (b) și imagini de microscopie electronică prin transmisie de înaltă rezoluție ( HR-TEM) (c) ale nanoparticulelor de magnetită funcționalizată cu doxorubicină

Imaginile de difracție de electroni (SAED) evidențiază prezența fazelor cristaline ale magnetitei funcționalizată cu doxorubicină (Figura 2.3.)

Figura 2.3. Imagine de difracție de electroni pe arie selectă caracteristică nanoparticulelor de magnetită funcționalizată cu doxorubicină

Difracție de raze X ( XRD)

Determinarea structurii cristalografice specifică nanoparticulelor de magnetită functionalizată cu doxorubicină obținută a fost posibilă prin tehnica difracției de raze X.

Difracția de raze X reprezintă metoda de investigație cel mai des utilizată pentru a pune în evidență compoziția fazală și caracterul nanocristalin al probei de analizat. Difracția de raze X (XRD) este o metodă de analiză calitativă (dar și cantitativă) nedistructivă, care poate furniza informații structurale și chimice detaliate cu privire la cristalografia unei game largi de materiale anorganice sau organice.

Analizând figura 2.4. se observă ca materialul obținut este cristalin, iar conform fișelor ASTM (American Society for Testing and Materials) și datelor de specialitate consultate, rezultatele obținute în urma XRD corespund planelor de difracție (220), (311), (400) (422) si (511).

Figura 2.4. Difracție de raze X (XRD) efectuată pentru magnetită funcționalizată cu doxorubicină

Spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier (FT-IR)

În figura 2.5. este prezentat spectrul FT-IR al Fe3O4@DoX. . Banda de absorbție foarte intensa de la 561.39 cm-1 corespunde vibrației de întindere a legăturii C-Br. Prezența antibioticelor în rețea se observă prin banda de absorbție de la 1564.97 cm-1 caracteristică legăturii C=C, ceea ce demonstreaza că nanostructura pe bază de magnetită a fost funcționalizată cu succes. NU sunt sigur ca este bine !!!

Figura 2.5. Spectrul FT-IR al Fe3O4@DoX

Testele in vitro pe culturi de celule tumorale

În figura 2.6. este prezentat nivelul intracelular ROS generat de funcționalizarea MNPs și medicamentele anti-tumorale în osteosacromul G292. MNPs funcționalizat induce o crestere a nivelului ROS în osteosacromul uman G292, comparativ cu doxorubicina. Această constatare sugerează că aceste nanostructuri functionalizate cu doxorubicina au fost capabile să declanseze ROS și stresul oxidativ, care poate fi responsabil pentru diferite efecte dăunătoare asupra proteinelor și lipidelor în celulele tumorale.

Figura 2.6. Nivelul intracelular ROS generat de funcționalizarea MNPs și medicamentele anti-tumorale în osteosacromul G292. Rezultatele sunt prezentate ca ± SD (n=3) și prezentate în funcție de control.

Studiile de microscopie de fluorescență prezentate în figura 2.6., au evidențiat o scadere considerabilă declansată de ALP în osteoblastele G292 după expunerea magnetitei funcționalizată cu doxorubicină, sau doar după expunerea doxorubicinei. Acest lucru confirmă acțiunea citotoxică a acestui medicament anti-tumoral și dovedește eficiența anti-proliferativă a Fe3O4@DoX ca un nou sistem de transport de agenti terapeutici antitumorali. Se poate observa localizarea nucleară de doxorubicină în osteoblaste, unde se intercalează ADN-ul și formează aducții ADN. Prin contrast, magnetita funcționalizată cu DOX a fost prezentă atât în nucleu cât și in citoplasmă, și se concentrează în unele zone din jurul nucleului.

Figura 2.7. Micrografii de fluorescență care arată fosfataza alcalină (ALP) colorată în osteoblastele G292, dupa 48h și functionaliyate cu MNPs și medicamente anti-tumorale. Verde: ALP, RosuȘ Doxorubicină, Albastru: Nuclee colorate cu DAPI .

Analiză termogravimetrică (TGA)

Furnizarea de informații cantitative despre proba pulverulentă de magnetită, respectiv magnetită funcționalizată cu doxorubicină obținută este posibilă prin utilizarea metodei de analiza termogravimetrică. Aceasta este o tehnică analitică ce permite obținerea de date privind stabilitatea termică și conținutul compușilor volatili, prin monitorizarea variației masei pulberii ce este supusă unui tratament termic

Analiza TGA a Fe3O4 @DOX a fost realizată cu scopul de a estima procentul de DOX prins pe suprafața de Fe3O4 în raport cu controlul (Fe3O4).

În analiza TGA obținută se poate observa ca pulberea de Fe3O4- simplă are o degradare mai lentă, în comparație cu Fe3O4 @DOX care prezintă o pierdere de masă până la valori de sub 400°C. Pana la valoarea de 1000°C se înscriu pierderi nesemnificative, de aici putem deduce că Fe3O4- simplă prezintă o pierdere de – 5.678%, pe când Fe3O4 @DOX are o pierdere de -16.265% ( Figura 2.8. ). Prin scaderea pierderii de masa a Fe3O4 din Fe3O4@DOX putem estima cantitatea de DOX ce interactioneaza cu nanoparticulele, astfel conținutul agentului terapeutic este de aproximativ 11%.

Figura 2.8. Analiza TGA pentru de Fe3O4- simplă, respectiv Fe3O4 @DOX

Determinarea biocompatibilității și biodistribuției in vivo a nanostructurilor

În scopul determinării biocompatibilității și a distribuției nanostructurilor pe bază de magnetită, s-au realizat teste in vivo pe șoricei rasa BALB/c. Probele au fost analizate la 2 zile (Figura 2.9.) și la 10 zile (Figura 2.10.) de la începerea experimentului.

La două zile de la injectare, dupa cum se poate observa în imaginea de mai jos, nanostructurile au fost prezente în ficat, rinichi, splină și plămâni, fiind absente în creier, miocard și pancreas.

La nivel hepatic, la două zile după injectare s-au evidențiat nanoparticule în concentrație scăzută atât în vasele de sânge, cât și în celulele Kuppfer de la periferia capilarelor sinusoide hepatice. În cazul plămânilor au fost evidențiate în principal în macrofagele perivasculare și de la nivelul septurilor interalveolare. La nivel pulmonar, cea mai mare densitate s-a evidențiat în macrofagele perivasculare, iar cea mai mică la nivelul macrofagelor din septurile interalveolare. De asemenea, la nivel sanguin ar putea exista transportori de nanoparticule care să aglutineze în condițiile de lucru de la obținerea preparatelor microscopice ( Figura 2.9. E.).

În vasele sanguine la nivel renal , nanoparticulele au fost identificate în concentrație scăzută ( Figura 2.9. F.).

În splină nanoparticulele se pot observa doar în pulpa roșie, în schimb în pulpa albă nanoparticulele au fost absente ( Figura 2.9. G.). Totuși, se observă hipertrofia pulpei albe, datorită faptului că nanoparticulele au stimulat formarea macrofagelor cu nucleu multilobular. În pulpa roșie, nanoparticulele s-au evidențiat la nivelul celulelor sistemului macrofagic, atât în cordoanele Billroth, cât și în capilarele sinusoide. Nanoparticulele au apărut ca structuri granulare, aglomerate, sferice, de dimensiuni variabile, cu diametrul de până la 3 μm, de culoare cafenie-negricioasă. Densitatea nanoparticulelor a variat de la o celulă la alta, unele celule prezentând o cantitate mai mare de nanoparticule endocitate.

Figura 2.9. Secțiuni transversal prin diferite organe ale șoriceilor ( A. Creier, B. Ficat, C. Miocard, D. Pancreas, E. Plămâni, F. Rinichi, G. Splină ) la 48h după injectare la mărire de 400x

La zece zile de la injectare, nanostructurile au fost prezente doar în splină, fiind absente în celelalte organe.

După zece zile, nanoparticulele s-au evidențiat în pulpa rosie la nivelul splinei în concentrație mai mare decât în proba recoltată la două zile. În pulpa albă, nanoparticulele au fost absente. Și în acest caz se observă hipertrofia pulpei albe, datorită faptului că nanoparticulele au stimulat formarea macrofagelor cu nucleu multilobular. În pulpa roșie, nanoparticulele s-au evidențiat la nivelul celulelor sistemului macrofagic, atât în cordoanele Billroth, cât și în capilarele sinusoide. Nanoparticulele au apărut ca structuri granulare, aglomerate, sferice, de dimensiuni variabile, cu diametrul de până la 3 μm, de culoare cafenie-negricioasă (Figura 2.10. G).

Figura 2.10. Secțiuni transversal prin diferite organe ale șoriceilor ( A. Creier, B. Ficat, C. Miocard, D. Pancreas, E. Plămâni, F. Rinichi, G. Splină ) la 10 zile după injectare la mărire de 400x

Determinarea biocompatibilității și biodistribuției in vivo a nanostructurilor în model experimental pe membrana corioalantoidiană a embrionului de pui (chick embryo chorioallantoic membrane [CAM])

Biocompatibilitatea, biodistribuția și eventualele toxicități a nano(bio)materialelor au fost determinate datorită extinderii rețelei capilare și accesibilității vascularizației a modelului CAM care este utilizat pentru numeroase studii in vivo.

La trei zile de la injectare, pentru proba Fe3O4@DOX, nanostructurile au fost absente în creierul embrionar (scoarță cerebrală, cerebel), fiind prezente în celelalte organe interne (în stadiu embrionar): ficat, miocard, pipotă, plămân, rinichi.

La nivel cerebral (scoarță cerebrală, cerebel), nu s-au evidențiat nanoparticule ( Figura 2.11. )

Figura 2.11. Secțiune transversală prin creierul embrionului de pui tratat cu nanoparticule Fe3O4@DOX. Probă recoltată la trei zile. Nanoparticule absente. Aspecte normale: (A–C) scoarță cerebrală, lob frontal; (D, E) cerebel. Colorație Hematoxilină–Eozină (HE): (A) ×100; (B, D) ×200; (C, E) ×400

La nivel hepatic, nanoparticule s-au evidențiat în principal în celulele Kuppfer de la periferia capilarelor sinusoide hepatice și mai puțin în vasele de sânge. Densitatea nanoparticulelor în celulele Kuppfer a fost variabilă de la o celulă la alta, probabil corelată cu dimensiunea capilarelor sinusoide din parenchimul hepatic embrionar ( Figura 2.12.).

Figura 2.12. Secțiune transversală prin ficatul embrionului de pui tratat cu nanoparticule Fe3O4@DOX. Probă recoltată la trei zile. Nanoparticule prezente. Colorație Hematoxilină–Eozină (HE): (A) ×200; (B) ×400.

În miocardul embrionar, nanoparticulele sunt prezente în mare majoritate la nivelul arterei aorte. În concentrație foarte scăzută, s-au evidențiat nanoparticule și în cardiomiocitele embrionare (fotografiate doar la grosisment ×1000).

Figura 2.12. Secțiune transversală prin miocardul embrionului de pui tratat cu nanoparticule Fe3O4@DOX. Probă recoltată la trei zile. Nanoparticule prezente în principal la nivelul arterei aorte. Colorație Hematoxilină–Eozină (HE): (A, B) ×400; (C, D) ×1000

La nivelul pipotei embrionare, s-au evidențiat nanoparticule mai ales în septurile conjunctivale interglandulare și mai puțin în septurile conjunctivale intraglandulare.

Figura 2.13. Secțiune transversală prin pipota embrionului de pui tratat cu nanoparticule Fe3O4@DOX. Probă recoltată la trei zile. Nanoparticule prezente mai ales în septurile conjunctivale interglandulare. Colorație Hematoxilină–Eozină (HE): (A) ×200; (B) ×400; (C) ×1000

Figura 2.14. Secțiune transversală prin plămânul embrionului de pui tratat cu nanoparticule Fe3O4@DOX. Probă recoltată la trei zile. Nanoparticule prezente în concentrație mare în vasele sanguine. Colorație Hematoxilină–Eozină (HE): (A) ×200; (B) ×400; (C, D) ×1000

Figura 2.15. Secțiune transversală prin rinichiul embrionului de pui tratat cu nanoparticule Fe3O4@DOX. Probă recoltată la trei zile. Nanoparticule prezente atât în vasele sanguine perirenale (A, B, D), cât și în parenchimul renal (E, F, G). Colorație Hematoxilină–Eozină (HE): (A) ×100; (B, D) ×200; (C, E, F) ×4

CONCLUZII

Lucrarea de licență cu titul ” Nanostructuri pe bază de magnetită utilizate în tratamentul cancerului ” prezintă caracterizarea unor nanosisteme cu aplicații în tratamentul cancerului de tip osteosarcom, utilizânduse nanoparticule de tip Fe3O4 ca sisteme de transport intracelular al unor substanțe cu efect anti-tumoral, destinate tratamentului osteosarcomului.

Nanoparticulele de magnetită funcționalizate cu doxorubicină au fost obținute cu succes prin metoda co-precipitării. Identificarea probelor de Fe3O4 a fost realizată prin metode precum difracția de raze X, difracția de electroni pe arie selectată, gradul mare de cristalinitate al probelor fiind evidențiat prin aceleași metode și confirmat prin analizele de microscopie electronică prin transmisie de înaltă rezoluție. Investigațiile morfologice s-au realizat prin microscopie electronică de baleiaj care au demonstrat obținerea unor pulberi fine de magnetită, având dimensiuni cuprinse între 5-7 nm.

Funcționalizarea magnetitei cu substanțele cu efect anti-tumoral a fost pusă în evidență prin analiza termogravimetrică, probele obținute transportând o cantitate de Fe3O4 – 5,678%, respective Fe3O4@DOX-16,265. Efectul anti-tumoral al sistemelor obținute a fost evaluat prin teste in vitro pe culturi de celule tumorale , acest lucru confirmând acțiunea citotoxică a medicamentului anti-tumoral și dovedește eficiența anti-proliferativă a Fe3O4@DoX ca un nou sistem de transport de agenti terapeutici antitumorali.

În scopul determinării biocompatibilității și a distribuției nanostructurilor pe bază de magnetită, s-au realizat teste in vivo pe șoricei rasa BALB/c. La două zile de la injectare, nanostructurile au fost prezente în ficat, rinichi, splină și plămâni, fiind absente în creier, miocard și pancreas, iar dupa 10 zile de la injectare, nanostructurile au fost prezente doar în splină, fiind absente în celelalte organe. Splina este un organ vascularizat, cu rol în depozitarea celulelor sangvine, nanoparticulele fiind transportate aici prin intermediul macrofagelor, existând posibilitatea de disponibilizare a acestora. Deasemenea tot în evidețierea biocompatibilității s-au realizat teste in vivo a nanostructurilor în model experimental pe membrana corioalantoidiană a embrionului de pui. La trei zile de la injectare, pentru proba Fe3O4@DOX, nanostructurile au fost absente în creierul embrionar (scoarță cerebrală, cerebel), fiind prezente în celelalte organe interne (în stadiu embrionar): ficat, miocard, pipotă, plămân, rinichi.

Ca perspective, se dorește realizarea în viitor a unor teste de evaluare a transportului transmembranar al nanoparticulelor funcționalizate, prin microscopie holografică digitală, tehnică non-invazivă, ce permite urmărirea unor procese rapide ce au loc în mediul celular. Scopul ar fi realizarea unor determinări ale variației indicelui de refracție, monitorizat pe diferite intervale de timp, în celule tratate cu nano/micro-transportori, comparativ cu celule netratate, indicele de refracție fiind un indicator al modificărilor chimice intracelulare. De asemenea, se dorește îmbunătățirea procedeului de obținere, prin introducerea unor etape de filtrare a suspensiei de microsfere polimerice, în sensul obținerii unei distribuții restrânse a dimensiunilor, cu valori medii de 500 nm.