Boala inflamatorie a intestinului. Epidemiologie și tratament. [303590]

CAPITOLUL 1

Introducere

Boala inflamatorie a intestinului. Epidemiologie și tratament.

Boala inflamatorie a intestinului (IBD) se caracterizează prin inflamație cronică neinfecțioasă a tractului gastrointestinal și include în principal boala Crohn (care poate afecta orice segment al tractului gastrointestinal de la gură până la anus), colită ulceroasă (care poate afecta mucoasa colonică) și colită de cauză nedeterminată. În boala Crohn și colita ulcerativă sunt frecvent întâlnite dureri abdominale și diaree. [anonimizat]. Bolile inflamatorii ale intestinului apar de obicei la adulți cu vârsta cuprinsă între 20 și 40 de ani. Bolile inflamatorii ale intestinului pot afecta negativ toate aspectele vieții unei persoane. [anonimizat] a intestinului este un rezultat al răspunsului imun necontrolat la un factor declanșator la persoanele predispuse genetic. [anonimizat], continuă să fie dezbătut.

Boala inflamatorie a intestinului a fost considerată o boală a [anonimizat] s-a observat o schimbare a [anonimizat], [anonimizat] o [anonimizat], Asia și Africa. [anonimizat] a intestinului (IBD), se caracterizează prin inflamații cronice ale tractului gastrointestinal. Cea mai mare prevalență a bolii raportată în 2017 în Europa a fost în Norvegia (505 cazuri de colită ulcerativă la 100 000 de persoane), în Germania (322 cazuri de boală Crohn la 100 000 de persoane) și în America de Nord în SUA (286 cazuri de ulcerative colită la 100000 persoane), precum și în Canada (319 cazuri de boală Crohn la 100 000 de persoane) [1,2]

Scopul tratamentului bolilor inflamatorii intestinale cronice este de a reduce inflamația care declanșează semnele și simptomele. [anonimizat], ci și inducerea și menținerea remisiei pe termen lung ceea ce determină riscuri reduse de complicații. [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat] (sunt ineficienți în menținerea remisiei), imunomodulatorii (in general nu sunt recomandati datorită incetării acțiunii și a toxicității). În unele cazuri de boală Crohn perianala se pot utiliza antibiotice cum ar fi ciprofloxacin si metronidazol împreuna cu alte medicamente.

Tratarea bolii inflamatorii de colon cronice presupune reducerea inflamației care declanșează semnele și simptomele. [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat]. Aminosalicilații, corticosteroizii (sunt ineficienți în menținerea remisiei), imunomodulatoarele ([anonimizat] a toxicității) sunt utilizate ca medicamente. [anonimizat] ciprofloxacina și metronidazol pot fi utilizate în combinație cu alte medicamente [3].

În prezent nu exista strategii terapeutice capabile să modifice semnificativ prognosticul bolii inflamatorii de colon. Terapia nutriționala deține posibilități interesante pentru tratament iar curcumina a câștigat interes datorită acțiunii sale farmacologice și proprietaților sale. Cercetările anterioare au remarcat potențialele beneficii ale utilizării curcuminei în tratarea bolilor intestinale. Principalul mecanism, prin care curcumina mediază aceste efecte este legată de suprimarea factorului nuclear Kappa-light-chain-enhancer (NF-KB). În plus, activitatea curcuminei include suprimarea interleukinei 1 (IL-1) și a factorului necrozei tumorale alfa (TNF-α) două cytokine importante în reglarea răspunsurilor inflamatorii. Pentru aceste activități importante, curcumina este considerată un tratament potențial în boala inflamatorie intestinală [4, 5].

Curcumina.

Istoric și generalități.

Turmeric (Curcuma longa), o plantă perenă aparținând familiei de ghimbir. Este cultivată intens în sudul și sud-estul Asiei tropicale. Rizomii acestei plante sunt cel mai des utilizați în scopuri culinare și medicinale. Componenta biologică activă din turmeric este curcumina, și se găsește în condiment într-un procent care variază între 2% și 5%. Culoarea galbenă caracteristică a turmericului se datorează curcuminoizilor, izolați pentru prima dată de Vogel în 1842.

Curcumina este o pulbere cristalină de culoare galben-portocalie, insolubilă în apă. Structura curcuminei (C21H20O6) a fost descrisă pentru prima dată în 1910 de către Lampe și Milobedeska și s-a arătat a fi diferuloilmetan. Turmericul este utilizat ca și condiment dietetic sau colorant în alimente și textile. Este utilizat pe scară largă în medicina tradițională indiană pentru a vindeca afecțiunile biliare, anorexia, tuse, răni diabetice, tulburări hepatice, reumatism și sinuzită.

Pasta de turmeric în var stins este un remediu popular utilizat în casă pentru tratamentul inflamațiilor și rănilor. Timp de secole, curcumina a fost consumată sub formă de condiment dietetic, în doze de până la 100 mg / zi. Cercetările ample effectuate în ultimele cinci decenii au indicat că curcumina reduce colesterolul din sânge [6].

Turmericul sălbatic este denumit Curcuma aromatica, iar speciile domestice sunt denumite Curcuma longa. În ultimele decenii, au fost effectuate cerectări ample pentru a stabili activitățile biologice și acțiunile farmacologice ale turmericului și ale extractelor sale. Curcumina (diferuloilmetan), principalul component bioactiv al turmericului de culoare galbenă s-a dovedit a avea un spectru larg de acțiuni biologice. Acestea includ activități antiinflamatoare, antioxidante, anticarcinogene, antimutagenice, anticoagulante, antifertilitate, antidiabetice, antibacteriene, antifungice, antiprotozoice, antivirale, antifibrotice, antivenin, antiulcer, hipotensive și hipocolesterolemice. Efectul său anticancer este mediat în principal prin inducerea apoptozei.

1.2.2. Compoziția curcuminei

Turmericul conține proteine (6,3%), grăsimi (5,1%), minerale (3,5%), carbohidrați (69,4%) și apă (13,1%). Uleiul esențial (5,8%) obținut prin distilarea cu aburi a rizomilor conține α-feandandren (1%), sabinen (0.6%), cineol (1%), borneol (0.5%), zingiberen (25%) și sesquiterpine (53%).

Curcuminoizii (diferuloilmetan) (3–4%) sunt responsabili pentru culoarea galbenă și cuprind curcumina I (94%), curcumina II sau demetoxicurcumina (6%) și curcumina III sau bisdemetoxicurcumina (0.3%) . Derivații demetoxi și bisdemetoxi ai curcuminei au fost de asemenea izolați. Curcumina a fost izolată pentru prima dată în 1815 și structura chimică a fost determinată de Roughley și Whiting în 1973. Are un punct de topire la 176-177 ° C; formează o sare brun-roșiatică cu alcali și este solubila în etanol, alcali, cetone, acid acetic și cloroform [7].

Depinzând de originea sa și de condițiile solului unde a crescut, turmeric conține între 2-9 % curcuminoizi – un grup de compuși ce includ curcumina (component major), demetoxicurcumina, bis-demetoxicurcumina și curcumina ciclică (component minor) [8, 9]. Curcumina comercială conține curcumina I (~ 77%), curcumina II (~ 17%) și curcumina III (~ 3%) ca și componente principale ale acesteia.???

1.2.3. Structura curcuminei

În timp ce majoritatea cercetărilor au urmărit aspectele biologice, doar câțiva cercetători au fost interesați de înțelegerea importanței structurii chimice a curcuminei pe lângă activitatea biologică. În chimia organică extragerea și sinteza curcuminei și a noilor derivați sintetici a fost principalul scop al cercetărilor. Chimia anorganică a utilizat abilitatea sa de chelator metalic prin gruparea α, β-diceto pentru a forma noi entități structurale cu modificarea activității biochimice. Fizico-chimia s-a concentrat pe proprietățile spectroscopice foarte sensibile ale curcuminei pentru a studia interacțiunile sale cu structurile microeterogene și biomolecule. Chimia analitică a fost implicată în proprietățile sale unice spectroscopice de absorbție pentru a identifica și estima urmele de elemente [10]. Alte studii chimice folositoare în întelegerea activității biologice a curcuminei sunt reactivitatea sa chimică cu specii reactive de oxigen, reacții de adiție, reacții de degradare și formarea nanoconjugatelor și a formulării lor.

Structura principalilor curcuminoizi este prezentata in Fig. 1.

Figura 1. Structura chimică a principalilor curcuminoizi.

Curcuminoizii exista in doua forme tautomere, dintre care cea bis-cetonica este predominanta in mediu acid sau neutru cât si în stare solidă, pe când cea enolică este predominanta în soluție alcalină. Marele dezavantaj al curcuminei îl constituie insolubilitatea în apă și biodisponibilitatea scăzută în celule [11].

Este aproape insolubilă în apă și ușor solubilă în solvenți polari cum ar fi DMSO, metanol, etanol, acetonitril, cloroform, acetat de etil, etc. Este greu solubilă în solvenți hidrocarbonați cum ar fi ciclohexan și hexan. Este un acid Bronsted slab cu 3 protoni labili și în consecință 3 pKa-uri corespunzând la trei echilibre prototropice. Reactivitatea chimică și solubilitatea cresc la pH bazic. Soluțiile apoase de curcumină pot fi preparate prin adăugarea surfactanților, lipidelor, albuminei, ciclodextrinelor, biopolimerilor, etc. Soluțiile micelare care utilizează surfactanți sunt mai potrivite în prepararea soluțiilor apoase de curcumină la o concentrație ridicată. Când se utilizează soluții apoase cu surfactanți în sisteme biologice, este necesară o grijă suplimentară la efectuarea experimentelor, deoarece surfactanții pot interfera în studiile biologice [9, 12].

1.2.4. Reactivitatea curcuminei

Curcumina are 3 grupe funcționale reactive: o grupare dicetonă și două grupări fenolice. Reacții chimice importante asociate cu activitatea biologică a curcuminei sunt cele de cedare a hidrogenului care conduc la oxidarea curcuminei, adiție reversibilă sau ireversibilă (reacții Michael), hidroliza, degradarea și reacții enzimatice.

1.2.4.1. Reacții cu specii reactive de oxigen

Curcumina s-a dovedit a fi un compus de eliminare excelent al speciilor reactive de oxigen, proprietate care îi conferă activitate antioxidantă în celulele normale. Speciile reactive de oxigen sunt formate din ambii radicali liberi oxidanți și oxidanți moleculari [12-19] Toate cele trei locuri active ale curcuminei pot fi supuse oxidării prin transferul de electroni și captarea oxigenului. Investigații detaliate au confirmat că în timpul reacțiilor cu radicali liberi cel mai ușor se detașează hidrogenul de la gruparea fenol cu formarea radicalilor fenoxil, care sunt stabilizați prin rezonanță de-a lungul structurii ceto-enol. Ca exemplu reacția radicalilor peroxil cu curcumina produce radicali fenoxil care sunt mai puțin reactivi decât radicalii peroxil și prin aceasta comportare determină o protecție față de speciile reactive de oxigen [13, 16, 20] Reacțiile sunt reversibile iar compusul poate reveni la structura chimică inițială prin intermediul antioxidanților solubili în apă cum ar fi acidul ascorbic [20] Literatura menționează reacțiile de eliminare ale altor radicali liberi din speciile reactive de oxigen: radicalii hidroxil, radicalii superoxid, radicalii alcoxi [14-17]. Dintre oxidanții moleculari, reacțiile cu peroxinitril, peroxid de hidrogen sunt cele mai comune. În multe modele biologice, curcumina poate proteja celulele în condiții în care există o producere excesivă a acestor oxidanți moleculari. Există puține rapoarte în literatura de specialitate privind reacția directă a curcuminei cu peroxinitril [18] Constantele de viteză și concentrațiile de inhibare a curcuminei pentru a preveni formarea de nitrotirozină indică faptul că aceasta este un antioxidant puternic împotriva stresului oxidativ [9].

1.2.4.2. Degradarea chimică și metabolism

Curcumina suferă o degradare chimică în soluții apoase-organice, ce se intensifică cu creșterea pH-ului, ceea ce reprezintă o problemă serioasă în aplicațiile sale [13, 21-25]. Degradarea curcuminei au loc prin gruparea nesaturată α, β-diceto, fiind mai puțin intensă în soluții concentrate, când produșii rezultați sunt 6-trans-(4‘hidroxi-3‘-metoxifenil)- 2,4-dioxo-5 hexanal, aldehida felurică, feruloil metan și vanilină. Deși nu este pe deplin înțeleasă se crede că degradarea se efectuează prin intermediul fragmentului diceto. Cu toate acestea, degradarea este redusă în mod semnificativ atunci când curcumina este atașată la lipide: lipozomi, albumină, ciclodextrină, curcubituril, surfactanți, polimeri și alte macromoleculare și microeterogene [13, 26]. Astfel s-a dovedit a fi de mare folos faptul că soluții stabile de curcumină ar putea fi preparate într-un mediu de cultură ce conține 10 % ser fetal bovin, precum și sânge uman. Curcumina suferă o degradare mult mai rapidă atunci când este expusă la lumina soarelui [9, 12, 27]. Produsele identificate în timpul fotodegradării sunt: vanilina, acidul feluric și alți fenoli mai mici indicând o distribuție a produșilor de degradare fotochimică similară cu degradarea chimică în soluție. Unele rapoarte indică faptul că curcumina generează oxigen singlet și alte specii reactive de oxigen în momentul fotodegradării,reponsabile pentru activitatea sa fotobiologică și fotodinamică [28]. Fotodegradarea este accelerată în prezența nanoparticulelor de TiO2, iar această metodă poate fi utilizată pentru a îndepărta petele de turmeric din țesuturile de bumbac [29]. Metabolizarea curcuminei la șobolani și oameni produce diferite produse. Două căi biologice majore au fost identificate pentru metabolizarea curcuminei cum ar fi cea de conjugare cu oxigen și de reducere. Produșii de conjugare cu oxigen sunt glucuronid curcumina și sulfat de curcumină iar cei de reducere sunt tetrahidrocurcumin, hexahidrocurcumin și octahidrocurcumin. Alți produși pot fi: dihidrocurcumin glucuronid, tetrahidrocurcumin glucuronid, acid ferulic și acid dihidroferulic. [9]. Deși s-a raportat că procesele au loc pe cale enzimatică, enzimele implicate în toate aceste produse de reacție specifice sunt încă un subiect de dezbatere. Reacțiile enzimatice specifice sunt probabil, mult mai rapide și nu permit degradarea hidrolitică lentă, prin urmare, procesul hidrolitic nu poate concura cu reacțiile enzimatice [30].

1.2.4.3. Reacții de adiție nucleofilă

Gruparea nesaturată α, β-diceto din curcumină participă la reacția de adiție nucleofilă (adiția Michael), cu anioni de –OH, -SH, -SeH ca donori. Această reacție a fost raportată ca fiind utilă pentru a explica chimia și activitatea biologică a curcuminei în celulele vii [21, 31-36].

Un interes deosebit a primit reacția tiolilor biologici, cum ar fi glutation ce conține grupări –SH [33, 34]. Conjugatele curcumină-glutation au fost izolate din diferite sisteme biologice. Formarea acestui produs de adiție ar conduce la epuizarea nivelurilor de glutation în celule, conducând astfel la reducerea apărării antioxidante. Cu toate că unele rapoarte sugerează că acestă reacție este reversibilă, teoria nu este încă confirmată încă în celulele vii. O reacție similară a fost observată în timpul inhibării tioredoxin reductazei, de către curcumină [35]. Centrul activ al acestei enzime este selenocisteina. Selenol din 40 selenocisteină fiind puternic nucleofil la pH fiziologic este supus ușor reacției de adiție 1,4 cu curcumina, formând diferite specii legate covalent. Se speculează că această reacție este responsabilă pentru inhibarea enzimei tioredoxin reductaza de către curcumină. Hidrogenul metilenic al fragmentului diceto/enol a curcuminei poate acționa ca și un nucleofil și să participe la reacții de adiție Michael cu electrofilie puternică, dar acestea nu pot avea o semnificație în sisteme biologice [37]. Derivații de curcumină obținuți prin modificare chimică au fost preparați prin reacții de condensare și adiție, cum ar fi, de exemplu, derivații de semicarbazonă și derivații oximă ai curcuminei. Aceste produse stabile, preparate independent au fost examinate pentru activitatea anticancer. În cele mai multe dintre studii s-a raportat că acești derivați sunt mai citotoxici pentru celulele canceroase decât curcumina liberă [38, 39].

1.2.4.4. Interacțiune cu ioni metalici

Curcumina formează complecși puternici cu majoritatea ionilor metalici cunoscuți. Gruparea nesaturată α, β-diceto a curcuminei este un agent de chelare excelent. Curcumina este considerat un ligand monobazic bidentat și formează complecși stabili cu aproape toate metalele și non-metalele, obținându-se structuri stabile la un raport stoechiometric curcumină: ion metalic de 2:1. Există foarte puține studii pentru raportul 3:1. A fost raportat un complex octaedral cu Fe3+ [40]. Coordinarea curcuminei cu metalul are loc prin gruparea enolică. Există mai multe lucrări privind complecșii de curcumină cu metale tranziționale cum ar fi Fe3+, Mn2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Cd2+, Ru3+, Re3+ și multe altele. Există complecși cu metale netranziționale și ioni rari cum ar fi: Al3+, Ga3+, Sm3+, Eu3+, Dy3+, Y3+, Se2+ , precum și oxizi metalici cum ar fi VO2+. Structura și proprietățile fizice ale acestor complecși depind de natura ionului metalic precum și de stoechiometria condițiilor de reacție care la rândul lor decid stabilitatea și reactivitatea lor. Complecșii metalici nu modifică numai proprietățile fizice ale curcuminei dar afectează și reactivitatea biologică a metalelor. În general s-a observat că complexarea cu curcumină reduce toxicitatea metalelor și unele complexe de curcumină cu metale cum ar fi Cu2+, Mn2+ acționează ca antioxidanți [41-48]. Datorită reacției reversibile de transfer de electroni cu ionul superoxid, complecșii de Cu2+, Mn2+ ale curcuminei acționează ca o enzimă ce mimează superoxid dismutaza. Complecșii metalici ai curcuminei au o mare semnificație în ceea ce privește patologia bolii Alzheimer, în cazul căreia s-a constatat că datorită naturii lipofile, curcumina poate trece de bariera hemato-encefalică și ionii metalici chelați sunt toxici pentru neuroni. S-a observat, de asemenea, că incidența bolii Alzheimer este redusă în mod semnificativ în rândul persoanelor care sunt cunoscute a consuma în mod frecvent curcumină. Curcumina formează complecși stabili cu toate metalele implicate în boala Alzheimer [48-50]. Interacțiunea Al3+ cu curcumina, anterior considerată a fi responsabilă pentru apariția bolii a fost studiată extensiv. Curcumina formează trei tipuri diferite de complecși cu Al3+, în funcție de stoechiometria reacției. Raportul stoechiometric curcumină: Al3+ de 1:1 a prezentat o afinitate mai mică la legarea ADN-ului decât Al3+ liber, care a fost atribuită abilității sale de reducere a incidenței bolii Alzheimer [49, 50]. Au fost raportate numeroase alte aplicații ale complecșilor metalici cu curcumina. Complexele de Ga3+ cu curcumină au fost concepute pentru materiale bioceramice inovative [51]. Complexul de curcumină cu zinc a prezentat efecte anticancer, gastroprotective și antidepresive la șobolani [52,53]. Complecșii de curcumină cu aur au arătat o activitate antiartritică la testele in vivo [54]. Complecții vanadil-curcumină au prezentat activitate antioxidantă și antireumatică [55]. Prin formarea complecșilor metalici cu curcumină se reduce toxicitatea metalelor grele cum ar fi Hg2+, Cd2+, Pb2+ unde stresul oxidativ indus de metalele grele este redus semnificativ prin formarea complexului [56-60]. Datorită sarcinii pozitive complecșii metalici ai curcuminei se pot leaga de ADN [61]. Unele rapoarte afirmă faptul că aceștia induc deteriorarea ADN-ului și prin urmare prezintă un efect pro-oxidant. Ca urmare, ei sunt explorați ca agenți antitumorali mai buni decât curcumina în sine [62, 63].Evaluarea biologică a acestor complecși este mai dificil de efectuat in vivo, deoarece biodisponibilitatea lor este foarte scăzută iar experimentele sunt dificil de efectuat datorită solubilității scăzute în solvenți organici cum sunt DMSO sau în fluidele biologice. Cu toate acestea fără nici o îndoială această complexare in vivo a curcuminei cu metalele joacă un rol semnificativ în reducerea toxicității induse de metale. Curcumina poate complexa cu diferiți liganzi. Complecșii cu punți de porfirină cu Cu2+, Ni2+ și Zn2+ prezintă o îmbunătățire a activității fotodinamice în modele de ADN plasmidic [64]. Complecșii cu 4,4 bipiridină și Zn2+sunt mai eficienți decât curcumina pentru a distruge celulele de neuroblastom. Cei cu terpiridin lantanida (La3+) au arătat o creștere în fototoxicitate în celulele HeLa [65]. Complecșii de bipirdin-curcumină cu Pd2+ inhibă formarea celulelor canceroase de prostată [62].

1.2.5. Studii farmacologice efectuate pe curcumină

Insolubilitatea în apă și biodisponibilitatea scăzută a curcuminei în celule au determinat dezvoltarea de noi formulări pe bază de substanțe organice biocompatibile: lipozomi, biopolimeri, hidrogeluri [66-68]. Pentru a crește biodisponibilitatea și a obține o circulație mai eficientă, o permeabilitate mai bună și rezistență la procesele metabolice au fost preparate mai multe formulări ce includ nanoparticule, lipozomi, micele și complexe fosfolipidice. Studiile farmacologice relevă faptul că curcumina este sigură și eficientă, ceea ce a determinat să fie utilizată în tratamentul și prevenirea unei game largi de boli umane. Cu toate acestea, datele acumulate au arătat că curcumina are o biodisponibilitate relativ scăzută și o slabă solubilitate în soluții apoase. Pentru prima dată Wahlstrom și Blennow (1978) au raportat faptul că după administrarea orală a 1 g curcumină/kg la șobolani concentrațiile de curcumină care s-au găsit în plasmă au fost neglijabile, fapt care se poate datora slabei absorbții din intestin [69]. Într-un studiu în care curcumina a fost administrată oral la o doză de 2 g/kg la șobolani, o concentrație serică maximă de 1.35 μg/ml a fost observată la un interval de timp de 83 h, în timp ce la oameni la aceeași doză, cantitatea de curcumină este nedectabilă sau foarte redusă în concentrațiile serice (0.006 ) [70]. Un alt studiu efectuat pe șobolani a arătat că administrarea per os a curcuminei 500 mg/kg a condus la o biodisponibilitate de 1% în plasmă; s-a observat faptul că administrarea orală a curcuminei (1000 mg/kg) la șobolani a prezentat o concentrație plasmatică de 15 ng/ml după 50 min [71]. Spre deosebire de administrarea la rozătoare, administrarea a 4-8 g de curcumină la om au arătat nivele plasmatice maxime de 0.41-1.75 μM după o oră de la administrare [72]. Într-un alt studiu efectuat pe voluntari umani sănătoși, 3,6 g curcumină administrată oral a fost regăsită la nivel plasmatic într-o concentrație de 11,1 μmol/l, după o oră de la administrare [73]. S-a constatat că 10 mg/kg curcumină administrată intravenos la șobolani a atins nivelul seric maxim în curcumină de 0.36 μg/ml, în timp ce o doză de 50 de ori mai mare administrată pe cale orală a dat o concentrație doar de 0.06 0.01 μg/ml în nivelele serice ale șobolanilor [74]. Sun și colab. au arătat că administrarea intravenoasă a curcuminei libere 43 la șobolani prezintă o mai bună biodisponibilate in plasma sangvină. Concentrația a fost de 6.6 μg/ml în sânge cand s-au administrat 2 mg/kg curcumină intravenos [75]. Aceste studii sugerează rolul căii de administrare pentru atingerea nivelelor serice ale curcuminei și, de asemenea, comparația între nivelele serice la rozătoare și oameni.

1.2.6. Efecte adverse ale curcuminei

Dezavantajul major al curcuminei este insolubilitatea sa în apă și, prin urmare, biodisponibilitatea scăzută în celule [68]. Studiile clinice au arătat că, curcumina este bine tolerată de organism în doze de până la 8 g/zi. Efectele secundare apar atunci când se administrează mai mult de 4 g/zi. Reacțiile adverse dependente de doză raportate au fost: (a) tulburări gastrointestinale (b) infertilitate (c) inhibarea sintezei de Hepcidin (d) chelator pentru fier-determină scăderea nivelului de fier din organism, poate conduce la apariția anemiei, (e) creșterea tranzitorie a enzimelor hepatice (f) suprimarea agregării plachetare, (g) dermatită de contact și urticarie atunci când este administrat în formulări topice.

Cea mai bună complianță a pacienților a fost atunci când s-au administrat 2-4 g pe zi deoarece numărul mare de capsule sau creșterea în dimensiune a capsulelor devine clinic nepractică, în special la populația în vârstă. Datele epidemiologice sugerează o incidență scăzută a cancerului gastric în India datorită consumului ridicat de curcumină. Doza de curcumină estimată în dieta celor care consumă zilnic cantități mari de turmeric este de 0.15 g/zi. În lipsa studiilor clinice pe termen lung, această doză poate fi considerată potrivită atunci când curcumina este utilizată pentru perioade lungi de timp. Această doză de curcumină este similară cu cea recomandată de World Health Organization dar este de 10 ori mai mica decât cea recomandată în general în suplimente [76, 77]. Curcumina standard se utilizează în general împreună cu piperina (un extract din piperul negru) pentru a crește biodisponibilitatea acesteia. Studiile anterioare de cercetare privind efectele secundare ale piperinei au arătat că aceasta poate conduce la tulburări gastrice, conduce la efecte negative dovedite asupra fertilității și poate inhiba efectul terapeutic al unor medicamente daca se administrează simultan [76, 78, 79].

Atenuarea sau eliminarea acestor dezavantaje a fost încercată prin pregătirea formulărilor pe bază de micelele, lipozomi, nanoparticule polimerice, complexe, emulsii [80, 81].

Matricele polimerice pot proteja curcumina de condițiile adverse de mediu; îmbunătățește timpul de înjumătățire al compusului bioactiv, crescând astfel biodisponibilitatea acestuia atât in vitro cât și in vivo [82].

Un număr crescut de studii raportează încapsularea / încorporarea curcuminei în nanoparticule pe baza de polimeri naturali, cum ar fi chitosanul, guma ghatti sau polimerii sintetici: poli (etilenglicol), poli (acid lactic), poli (N-vinil pirolidon), poli (acid glicolic lactic-co-acid) pentru a obține diverse formulări farmaceutice [83-87].

Sisteme de eliberare controlată pe bază de polizaharide

Un polimer ideal utilizabil pentru imobilizare și transport de compuși biologic activi trebuie să prezinte trei caracteristici:

-să fie biocompatibil și biodegradabil.

-produșii de degradare ai polimerului trebuie să fie netoxici și să nu creeze răspuns inflamatoriu din partea organismului [88]

-degradarea polimerului trebuie să se producă într-o perioadă rezonabilă de timp [89].

Alegerea suportului polimeric ține seama de următoarele criterii:

masa moleculară și distribuția maselor moleculare [90, 91]

structura : liniară sau ciclică, ramificată, reticulată, etc.

relația polimer – principiu biologic activ:

tipul de legătură: covalentă, ionică sau complex

încapsularea în matricea polimeră;

localizarea unității farmacologic-activă în polimer: în lanț sau ca ramificație

fenomene stereochimice [92]

natura chimică a polimerului [93].

compoziția chimică;

solubilitatea în sisteme apoase;

încărcarea ionică;

solubilitatea în fluidele corpului.

Polizaharidele îndeplinesc condițiile cerute pentru imobilizarea unui principiu biologic activ: sunt lipsite de toxicitate, inerte farmacologic, nu conțin impurități sau aditivi și compuși reziduali ai proceselor de reticulare sau polimerizare, prezintă structură chimică bine precizată. În plus, pot fi cu succes utilizate ca suporturi pentru imobilizare deoarece reacționează cu substanțele biologic active formând compuși stabili. Atunci când moleculele principiului biologic activ nu conțin grupe complementare cu cele ale polimerului, acesta din urmă poate fi funcționalizat.

Abilitatea polizaharidelor de a forma hidrogeluri chiar și la concentrații foarte mici reprezintă una dintre cele mai importante proprietați funcționale ale acestora. Formarea structurilor tridimensionale oferă o cale de creștere a stabilitații chimice și mecanice a sistemului. Amestecurile de polizaharide obținute natural și gelurile binare pot fi utilizate ca modele pentru structuri celulare complexe.

Datorită proprietăților pe care le posedă, unele hidrogeluri polizaharidice au fost introduse în domeniul materialelor inteligente cu posibile aplicații în realizarea de țesuturi artificiale, sisteme de eliberare controlată a principiilor biologic active. Principiile biologic active sunt fixate de către macromolecule fie prin procese analoage absorbției, fie prin procese chimice care duc la formarea de complecși. În cazul polizaharidelor grupele hidroxil și carbonil pot lega direct principiul activ.

Polizaharidele sau moleculele polimerice de carbohidrați sunt lanțuri lungi de monozaharide legate prin legături glicozidice. Materialele care au la bază polimeri naturali sunt utilizați pe scară largă în aplicații biomedicale.

Importanța sistemelor de eliberare controlată a medicamentelor pe bază de polizaharide

Eficacitatea clinică a chimioterapicelor cu masa moleculară mica și a macromoleculelor biologice funcționale (adică proteine și oligonucleotide) este adesea limitată de o serie de obstacole cum ar fi: solubilitatea scăzută, pierderea structurii bioactive înainte de a ajunge la locul țintă, absorbția celulară inadecvată, timpul mic de injumătățire în plasma determinat de clearance-ului renal sau de degradarea enzimatică, rezistența organismului la medicamente determinat de supraexprimarea transportatorului de efflux și a efectelor adverse nedorite ale medicamentelor citotoxice determinate de efectul “off target” în timpul chimioterapiei [94-98].

Dezvoltarea unui sistem inteligent de eliberare a medicamentelor de dimensiuni nanometrice a atras atenția cercetătorilor pentru a rezolva nu numai aceste probleme menționate mai sus ci și pentru a ajuta la dezvoltarea nanomedicinei în bolile neinfecțioase, în special cancerul [99-103].

Nanosisteme de administrare a medicamentelor cu dimensiune și structură controlată pot fi realizate în mod corespunzător pentru a traversa cel mai mic perete capilar și au capacitatea de a evita în același timp clearance-ul prin intermediul sistemului mononuclear de fagocite (sistemul fagocitar mononuclear), ceea ce determină o durată prelungită de staționarea a lor în fluxul sangvin. Datorită efectului de permeabilitate și retenție crescut (EPR), macromoleculele și nanoparticulele de dimensiuni mai mari pot fi mai bine prinse în țesuturile tumorale decât moleculele cu masă moleculară mică și nanoparticulele de mici dimensiuni [104-106].

Pe de altă parte, moleculele bioactive cu masă moleculară mare (de exemplu citokine, factori de creștere) au utilizări limitate determinate de instabilitatea lor la eliberarea in vitro și in vivo, precum și datorită imunogenității reduse și a timpului scurt de înjumătățire [107].

Pentru a depăși aceste limitări, tehnologiile moderne de obținere a medicamentelor au facilitat de abilitățile cercetătorilor pentru a crea așa numita „a doua generație de medicamente” proteice. Pe baza proprietăților fizico-chimice ale macromoleculelor cum ar fi: masa moleculară, structrura secundară și disponibilitatea grupelor funcționale de suprafață, au fost utilizate în obținerea conjugatelor polimer-proteină sau proteină-proteină. Cu toate acestea structura proteinei poate fi alterată prin procesul de modificare [108]. Prin urmare, există o mare necesitate de a dezvolta sisteme de eliberare a medicamentelor, ceea ce poate determina îmbunătățirea timpului de înjumătățire și imunogenitate scăzută. Această strategie poate fi apoi utilizată în zone farmaceutice care utilizează proteinele ca și agenți terapeutici.

Cercetările efectuate pe parcursul ultimelor decenii au condus la dezvoltarea unor nanosisteme standard utilizate pentru eliberarea agenților terapeutici cum ar fi: lipozomi, micele, conjugate polimerice, nanoparticule anorganice ș.a. Printre acestea polizaharidele sunt cele mai cunoscute biomateriale, fiind derivate din polimeri naturali carbohidrați. În general sunt considerate sigure și sunt utilizate pe scară largă în industria alimentară [109]. De asemenea, au fost utilizate ca excipienți în diferite formulări de medicamente. Practic polizaharidele sunt carbohidrați care conțin mai mult de două molecule de zahăr legate covalent prin legături glicozidice. Pe lângă polizaharide, în definiția carbohidraților există și monozaharidele și dizaharidele.

Polizaharidele oferă o gamă largă de funcționalități versarsatile și diversitate structurală datorită masei moleculare variabile și a grupărilor funcționale abundente (grupări amino, carboxil, carbonil și hidroxil) pe catena principală [110].

Polizaharidele există la diferite specii de plante (celuloza), animale (chitosan, de origine naturală obținut prin deacetilarea chitinei provenite din crustacee și insecte exoscheletice), alge (alginat) și microorganisme (dextran). În comparație cu alți polimeri sintetici hidrofobi, polizaharidele dețin un număr mare de grupări hidroxilice sau alte grupări hidrofile, cum ar fi grupările carboxilice din alginat și gelan, grupările amino din chitosan, ceea ce determină o solubilitate crescută în apă și consolidează caracteristicile lor de bioaderare și biorecunoaștere (ex. Interacțiuni electrostatice între țesuturile biologice și polizaharide) [111]. De exemplu, chitosanul, singura polizaharidă cu sarcină negativă este capabil să se atașeze de straturile mucoaselor încărcate negativ prin interacțiuni electrostatice [112]. În mod similar acidul hialuronic poate recunoaște și lega antigenul glicoproteinei CD44 de pe suprafața membranelor celulare [113].

Mai mult de atât, fragmentele lor funcționale intrinseci pot servi ca punți de atașare a chimioterapicelor, a sondelor imagistice și a agenților de țintire prin modificări chimice facile [114-116], cum ar fi PEG-ilarea și conjugarea anticorpilor, pentru a se asigura o circulație sistemică prelungită și posibilitatea de acumulare a chimioterapicelor la locul țintă din organism.

Datorită proprietăților lor biochimice asemănătoare cu matricele extracelulare umane, polizaharidele sunt ușor de recunoscut și metabolizat de către organism [117]. Cercetările efectuate anterior eu evidențiat implicarea lor în multe procese biologice, inclusiv în recunoașterea sistemului imunitar și semnalizarea celulară [118], responsabile de activarea răspunsurilor antimicrobiene și antiinflamatorii [119]. În plus acești biopolimeri suferă o degradare enzimatică și hidrolitică in vivo conducând la produse secundare de degradare inofensive care pot fi reutilizate în sistemele biologice sau pot fi eliminate de sistemul imunitar [120]. Pe baza caracteristicile menționate anterior, polizaharidele ar putea fi utilizate pentru dezvoltarea sistemelor terapeutice de administrare a medicamentelor.

Obiectivele eliberării controlate a medicamentelor din sisteme de administrare pe bază de polizaharide

Biomaterialele obținute din polizaharide au fost exploatate de către cercetători datorită capacității lor de eliberare controlată a agenților bioactivi (chimioterapice, antibiotice, proteine, peptide, acizi nucleici) utilizând diferite căi de administrare [121]. Progresele recente în dezvoltarea nanomaterialelor pe bază de polizaharide au determinat apariția unor tendințe pentru obținerea unor sisteme multifuncționale complexe pentru transportul și eliberarea controlată a substanțelor active terapeutice, care vor marca un pas important în medicina teranostică și regenerativă, sistemele de administrare având profiluri terapeutice îmbunătățite cum ar fi eficacitatea terapeutică, proprietățile mecanice și siguranța.

În general obiectivele eliberării controlate sunt următoarele:

Pentru a proteja medicamentul împotriva degradării.

Această proprietate este extinsă și pentru protecția biomoleculelor pe bază de proteine, cum ar fi citokinele și factorii de creștere, care conțin o structură secundară sofisticată care poate fi degradată în timpul eliberării [122].

Pentru a crește timpul de înjumătățire și biodisponibilitatea unor medicamente.

Un exemplu obișnuit este administrarea pe cale parenterală de insulină după fiecare masă. Au fost obținute nanoparticule de dextran cu insulină imobilizată pentru a crește timpul de înjumătățire al insulinei iar administrarea să se efectueze mai rar [123].

Pentru îmbunătățirea efectelor terapeutice și pentru a reduce din efectele secundare ale medicamentelor

Acest obiectiv este des întâlnit în dezvoltarea sistemelor de administrare al medicamentelor utilizate în terapia cancerului, unde chimioterapia și radioterapia afectează condiția organismului pacienților.

Pentru scăderea costului cercetărilor privind identificarea unei noi ținte moleculare terapeutice.

Costurile pentru cercetările efectuate în scopul de a identifica o nouă moleculă de medicament sau pentru a descoperi o nouă cale de semnalizare intracelulară eficientă în terapie sunt enorme. Prin urmare cercetătorii identifică unele molecule de medicament deja existente, care au fost deja utilizate în terapie (profilul lor farmacologic fiind cunoscut) și utilizează tehnici noi de administrare pentru a direcționa medicamentul la locul țintă din organism unde va fi eliberat controlat. În acest mod farmacocinetica medicamentului este îmbunătățită iar costurile pentru cercetarea fundamentală și pentru cercetarea clinică vor fi mai mici [124].

Există numeroase principii de bază utilizate pentru dezvoltarea sistemele de administrare a medicamentelor care nu se limitează doar la sisteme obținute din polizaharide.

Mecanismele de eliberarea a medicamentelor

Mecanismele de eliberare a medicamentelor conduc la elaborarea de sisteme de administrare versatile pe bază de polizaharide utilizând diferite modificări chimice și cele mai importante principii care trebuie respectate atunci când se proiectează un astfel de sistem pentru o eliberare eficientă componentelor bioactive încorporate sunt următoarele:

Dimensiunea ochiurilor rețelei polimerice poate controla difuzia moleculelor de medicament [125].

Hidrogelurile sunt contituite dintr-o rețea de polimeri reticulati și spații deschise (adică ochiuri) între lanțurile polimerice; ochiurile permit difuzia lichidului și substanței active de masa moleculară mica. Dimensiunea ochiurilor rețelei variază între 5 și 100 nm pentru hidrogeluri și există diferite metode pentru determinarea diametrului lor. Din cauza eterogenității rețelei și a polidispersității, majoritatea hidrogelurilor au o distribuție largă a dimensiunilor ochiurilor de rețea [126, 127].

Când diametrul ochiului rețelei polimerice este de trei ori mai mare decât diametrul moleculei de medicament, difuzia este factorul dominant pentru eliberarea medicamentului. Ecuația Strokes-Einstein este utilizată de obicei pentru a determina difuzabilitatea (D), care depinde de dimensiunea (raza) moleculei de medicament (ydrug) și vâscozitatea soluției (η) [128].

(1)

Unde R este constanta ideală a gazului iar T este temperatura absolută.

Când ochiurilor rețelei au raza similară cu a moleculei de medicament, difuzia medicamentului va fi oprită de împiedicările sterice [125]. Prin urmare, controlul domensiunii porilor rețelei polimerice devine important în elaborarea sistemelor de eliberare. Dimensiunea porilor poate fi ajustată în matricea polimerică prin ajustarea concentrației de polimer, a concentrației de agent de reticulare și a stimulilor externi cum ar fi temperatura și pH-ul.

Eliberarea controlată a medicamentelor prin degradarea rețelei

O strategie de a controla eliberarea de molecule de medicament inițial prinse într-un hidrogel este de a controla degradarea rețelei. Dimensiunea ochiurilor rețelei cresc pe măsură ce rețeaua se degradează, permițând medicamentelor să difuzeze din hidrogel. Degradarea poate să apară în catena principală a polimerului sau la legăturile formate prin reticulare și este de obicei mediată de hidroliză [129-131] sau activată enzimatic [132-134].

Legăturile de esterice suferă o hidroliză lentă și au fost folosite pentru a forma o clasă de hidrogeluri obținute din poli(etilenglicol) (PEG) biodegradabile, iar eliberarea de proteine imobilizate în acest tip de hidrogeluri este extrem de lentă având timpul de înjumătățire până la 17 zile [131]. Legăturile oligo-peptidice sunt scindabile cu metaloproteinaze matriceale (MMPs) [133]. Un exemplu de utilizare a acestor legături este încorporarea unei peptide scindabilă cu metaloproteinaze matriceale (GGRMSMPV) într-un hidrogel de acid hialuronic care a fost utilizat pentru a elibera un inhibitor tisular recombinant al metaloproteinazei matriceale într-un model porcin de infarct miocardic [135]. Acest studiu prezintă un hidrogel sensibil la biomolecule care se poate degrada ca răspuns la metaloproteinaza matricială și eliberează medicamente pentru tratamentul infarctului miocardic.

În plus față de hidrogelurile cu răspuns la metaloproteinaze matriceale, există și alte sisteme de scindare care răspund la biomoleculele prezente în organism, cum ar fi hidrogelurile cu răspuns la glucoză pentru eliberarea insulinei [136, 137] și hidrogelurile cu răspuns la trombină pentru a controla coagularea sângelui [138, 139]. Degradarea poate fi, de asemenea, declanșată în timp real, cu stimuli externi. De exemplu, condițiile acide accelerează de obicei hidroliza [140]

Lumina ultravioletă (UV) poate declanșa degradarea microgelurilor care conțin fragmente de o-nitrobenzil eter (NBE) datorită datorită scindării o-nitrobenzil eter, însoțită de eliberarea factorului de creștere de transformare beta 1 încapsulat (TGF-β1) [141].

Pierderea masei polimerului prin degradarea hidrogelului, cunoscută și sub denumirea de eroziune, poate avea loc simultan în tot hidrogelul sau în mod preferențial pe suprafața hidrogelului; eroziunea in tot hidrogelul și de suprafață poate fi utilizată pentru a controla diferențial eliberarea de medicamente. Multe hidrogeluri suferă o eroziune în masă, deoarece rețeaua este permeabilă la apă sau la enzime care mediază degradarea; dacă viteza de difuzie a acestor agenți este rapidă în comparație cu viteza de degradare a legăturii, degradarea va avea loc simultan in toată masa de gel [142]. Hidrogelurile constituite din polizaharide oxidate (de exemplu, alginat și chitosan oxidate cu periodat de sodiu) suferă de obicei o eroziune în toată masa, iar viteza de degradare poate fi mediată de gradul de oxidare [143, 144]. Poliesterii hidrofobi, cum ar fi poli(caprolactona) (PCL) și poli(lactida) (PLA) care se degradează prin hidroliză sunt adesea utilizați prin copolimerizare cu polietilenglicol hidrofil (PEG), ceea ce determină o degradare în masă a hidrogelurilor [145].
Acești copolimeri sunt adesea utilizați cu o concentrație ridicată de polimer (20-30% în greutate), ceea ce permite eliberarea substanțelor bioactive controlată de degradare; de exemplu, un copolimer triblock de PCL-PEG-PCL a determinat eliberarea BSA timp de două săptămâni. În schimb, eroziunea de suprafață rezultă când viteza de scindare a legăturilor este mai mare decât viteza de difuzie a enzimei sau a apei din exterior în cea mai mare parte a hidrogelului [146].

Hidrogelurile reticulate care utilizează asociate grupări hidrofobe (de exemplu, între β-ciclodextrină și colesterol) pot inhiba intrarea apei, conducând la o erodare mai mare a suprafeței hidrogelului. Pierderea de masă poate fi liniară în timp pentru gelurile erodate la suprafață, ceea ce poate determina o eliberare de ordinul zero a medicamentelor încapsulate [147]. Pentru o varietate de hidrogeluri, se poate reacția de degradare și mecanismul de eroziune pot fi controlate pentru a obține cinetica de eliberare dorită cuprinsă între săptămâni și luni, permițând astfel o eliberarea prelungită. Cu toate acestea, trebuie să avem în vedere că produsul de degradare trebuie să fie netoxic și suficient de mic pentru eliminarea sa naturală.

Comportamentul de umflare a materialului ar putea determina eliberarea controlată a moleculelor de medicament.

Particulele de hidrogel pe bază de polizaharide se umflă pentru a absorbi apa iar dimensiunea structurii poroase va fi mărită iar medicamentul încapsulat va fi eliberat. Gradul de umflare a unui hidrogel reprezintă echilibrul între forțele care comprimă deformarea rețelei și osmoza care determină absorbția apei [148, 149]. Diverși factori au fost intens studiați cum ar fi pH-ul, temperatura, puterea ionică, câmpurile electrice, lumina și glucoza și pot influența gradul de umflare [125].

Umflarea hidrogelurilor dependentă de pH este deosebit de importantă pentru sistemele de administrare a medicamentelor pe cale orală și în terapia cancerului. În această aplicație, umflarea hidrogelurilor în mediul acid din stomac este de obicei minimă și astfel medicamentul este protejat prin încapsulare fizică. Pe măsură ce particulele de hidrogel traverseză tractul intestinal unde pH-ul este neutru, rețeaua polimeră poate fi elaborată să se umfle dramatic, permițând difuzia rapidă a medicamentului. Astfel au fost elaborate hidrogeluri utilizând polimeri diferiți cu grupări funcționale acide sau bazice; dintre polizaharide alginatul este cel mai des utilizat. În condiții acide, hidrogelul pe bază de alginat este atât de compactat încât medicamentele nu pot fi eliberarte; atunci când pH-ul devine neutru, grupările de acid carboxilic de pe alginat sunt deprotonate și generează acidul carboxilic se grupează pe alginat deprotonează și generează o osmoză considerabilă, ceea ce determină umflarea rețelei polimere și eliberarea substanței bioactive imobilizate [150]. Declanșarea eliberării în funcțe de pH poate determina țintirea și eliberarea medicamentelor în tumorile solide în care mediile extra- și intracelulare sunt mai acide decât în țesuturile normale [151].

Alte mecanisme care determină umflare hidrogelului au fost, de asemenea, exploatate pentru direcționarea eliberării medicamentelor încapsulate. De exemplu, un nanogel sensibil la temperatură a fost utilizat pentru a elibera un medicament chimioterapic cisplatin celulelor canceroase de sân, în care temperatura a fost puțin mai ridicată decât temperatura normală a corpului [152]. O limitare a sistemelor în care eliberarea medicamentului este controlată de umflare este că răspunsul la stimuli este relativ lent pentru hidrogelurile macroscopice datorită difuziei lente a apei. Pentru particulele de hidrogel de 1 mm, modificările în urma procesului de umflare și eliberarea controlată a medicamentelor ar trebui să necesite zeci de minute. Pentru a obține un răspuns rapid la stimul, se poate reduce distanța de difuzie prin reducerea dimensiunii particulelor de hidrogel sau modificarea structurii prin construirea de macropori interconectați în interiorul hidrogelului. Ca alternativă la modificarea structurii hidrogelului, au fost studiate utilizarea diferitelor straturi superficiale care se pot umfla rapid pentru a controla difuzia medicamentelor încapsulate [153].

Eliberarea controlată prin deformare mecanică

O ultimă abordare pentru eliberarea moleculelor de medicament încapsulate în matricea polimeră este de a deforma mecanic rețeaua, deoarece dimensiunile ochiurilor rețelei polimere pot crește prin schimbarea structurii rețelei polimere și declanșarea fluxului convectiv în rețea. Această strategie poate genera tipare de eliberare pulsatilă cu un control fin asupra vitezei de eliberare instantanee [154]. Eliberarea pulsatilă poate imita unele modele biologice de semnalizare, de exemplu, în administrarea insulinei în urma consumului de alimente [155]. Deformarea rețelei polimere poate fi realizată abordând diferite metode, inclusiv deformarea pur mecanică sau utilizarea deformațiilor induse de ultrasunete și de câmpul magnetic. S-a demonstrat că deformarea mecanică directă determină eliberarea controlată a unui factor de creștere utilizat pentru a intensifica vascularizarea tisulară [156]. Un câmp magnetic poate deforma rețeaua polimeră a unui hidrogel care conține nanoparticule magnetice [157, 158], iar includerea unor macropori are ca rezultat o deformare extinsă și rapidă a structurii, ceea ce determină îmbunătățirea eliberarii de moleculelor medicament [159].

Ultrasunetele pot perturba temporar structura hidrogelului iar aceasta deformare este avantajoasă datorită rezoluției spațiotemporale ridicate și a difuziei profunde în țesuturi [160]. Eficacitatea ultrasunetelor pentru a asigura o eliberare de medicamente pulsatilă a fost demonstrată cu o serie de medicamente, inclusiv insulină și ɣ-interferon [161]. O potențială problemă care are legătură cu deformarea mecanică este deteriorarea cumulativă a hidrogelurilor, ceea ce determină defecte mecanice în structura hidrogelului. Această problemă poate fi rezolvată prin utilizarea de hidrogeluri care au capacitatea de autovindecare. De exemplu, hidrogelurile pe bază de alginat reticulate reversibil cu cationii divalenți se pot vindeca în condiții fiziologice în urma încetării acțiunii ultrasunetelor, permițând eliberarea repetată (pulsatilă) de molecule mici, proteine și oligonucleotide condensate (compactate) [154]

Există multe posibile abordări de clasificare a polizaharidelor: în funcție de compoziția chimică, de structură, solubilitate și de surselor de unde provin. În funcție de compoziția chimică polizaharidele pot fi clasificate în două categorii: homopolizaharide sau homoglicani (conțin un singur tip de monozaharide; ex chitina sau chitosanul, amidonul, celuloza) și heteropolizaharide sau heteroglicani (sunt constituite din mai multe tipuri de monozaharide; ex. Alginații, glucozaminoglicanii, acidul hialuronic și pectina). O altă clasificare a polizaharidelor este în funcție de sarcina electrică și acestea pot fi polizaharide cationice (chitosanul care conține gruparea aminică cu sarcină pozitivă) și polizaharide anionice (alginații, gelanul conțin gruparea carboxilică cu sarcină negativă). Moleculele cu aceleași grupări funcționale pot fi similar modificate chimic. În plus, metodele utilizate în prepararea biomaterialelor sunt comparabile și pot fi abordate pentru obținerea unor sisteme utilizate pentru eliberarea controlată a medicamentelor [162].

Tipuri de polizaharide utilizate în obținerea sistemelor de eliberare controlată

1.3.4.1.Gelanul

Gelanul, exopolizaharid polianionic de cultura microbiana, a devenit un polimer extrem de important pentru bioaplicații odata cu aprobarea sa, in anul 1992, de catre FDA ca aditiv alimentar. Gama aplicatiilor sale s-a extins rapid in domeniul farmaceutic, cosmetic, alimentar, medical, inginerie tisulara, biotehnologii etc. Este un polimer anionic, liniar cu secvențe de tetrazaharide care se repetă și sunt constituite din două reziduuri de de β-D-glucoză, unul de acid β-D-glucuronat și unul de α-L-ramnoză (fig. 1) intr-un raport 2:1:1. [163, 164]

Fig. Unitățile de tetrazaharide care se repetă ale gelanului deacetilat (sunt indicate locurile unde substituenții gliceril si acetil sunt atașati în gelanul bogat in grupe acil) [163, 164]

Polizaharida nativă cum este biosintetizată, are un substituent L-gliceril pe O(2) de la al 3-lea reziduu de glucoză legat de secvența de tetrazaharide și, în cel puțin câteva unități care se repetă o grupă acetil la O(6) al aceluiasi reziduu.[165]

În producția comercială obișnuită ambele tipuri de substituenți sunt îndepărtați prin tratarea masei de fermentație cu alcali fierbinți. Polimerul deacetilat rezultat este cunoscut ca și “guma gelan” sau prin numele comercial Kelcogel (pentru aplicații alimentare) sau Gelrite (pentru aplicații nealimentare). Este comercializat și gelanul bogat în grupe acil. Gruparile acil pot fi păstrate prin utilizarea procedurilor de extracție mai blânde. Catenele ramificate au fost vizualizate direct prin microscopie de fortă atomică pentru o rețea formată prin uscarea soluțiilor diluate de gelan pe mică prospăt macinata. Lungimea segmentelor liniare între punctele de formrte a microgrefelor variază considerabil, dar în general este de 150 nm. Macromoleculele de gelan se asociaza cate doua, intr-o structura de dublu helix (fig. 2). Cele doua lanțuri polimerice sunt paralele unul față de celălalt și sunt imbinate exact la jumătate (cu o rotație a lanțului de 180ș), în așa fel încat distanța care se repetă a helixului este jumătate din catena individuală, un aranjament similar cu cel observat pentru caragenan. [166].

Gelanul este exopolizaharidă microbiană anionică, solubilă în apă, cu masa moleculară cuprinsă între 1-2x 106 Da pentru gelanul bogat în grupe acil și 2-3 x105 Da pentru gelanul deacetilat [167]. Gelanul acetilat este solubil în apă caldă în timp ce gelanul deacetilat sau cel care conține puține grupe acil (deacetilat) este solubil atât în apă caldă cât și în apă rece. Proprietățile gelanului depind de numarul de grupe acil/mol [168, 169].

Încălzirea la 85-95șC a gelanului bogat în grupe acil este suficientă pentru solubilizarea sa în apă. Când dispersia de gelan bogat în grupe acil este încălzită la 40-50șC, se umflă și formează o suspensie sub formă de pastă. Continuând încălzirea, această suspensie dispare brusc și solubilizarea este completă. Prin răcire, macromoleculele suferă o schimbare conformațională de la o formă neregulată la una regulată, elicoidală. Agregarea structurii elicoidale este limitată în prezența grupelor acetil, când se formeaza geluri moi, elastice. Gelurile acetilate nu manifestă sinereză sau histerezis termic. Gelurile de gelan bogat în grupe acil au o vâscozitate joasă; comportamentul la gelifiere al gelanului bogat în grupe acil este similar cu cel al xantanului și locust bean. [170].

În cazul gelanului deacetilat sau cu puține grupe acil hidratarea depinde de tipul și concentrația ionilor, el fiind solubil în apă deionizată la temperatura camerei, la fel ca și sarea sa de sodiu. Prin adăugarea unei concentrații foarte mici de ioni în soluția de gelan aceasta se schimbă în hidrogel la modificarea temperaturii. În comparație cu alte geluri de polizaharide gelul de gelan este mai rezistent la temperatură și mai puțin sensibil la pH [171].

Gelifierea gelanului a fost investigată de mulți cercetători, constatându-se ca este un proces în două etape. În prima etapă are loc o schimbare conformațională de la o conformație dezordonată la o conformație ordonată de dublu helix și în a doua etapă are loc agregarea dublului helix și formare punctelor de joncțiune [172].

Gelifierea gelanului depinde de concentrația solutiei de polimer, temperatură și de prezența în soluție a cationilor monovalenți sau bivalenți. Gelanul formeaza un helix ordonat din catene duble la temperaturi scăzute, în timp ce la temperaturi înalte apare o singură catenă de polizaharidă, ceea ce reduce semnificativ vâscozitatea soluției. Temperatura de tranziție pentru transformare de fază sol-gel este de 35șC dar poate varia între 30-50 șC. Sub această temperatură se formează gelul de gelan. Mecanismul de gelifiere constă în formarea unor zone de joncțiune dublu elicoidale, urmată de agregarea segmentelor dublu elicodale pentru a forma o rețea tridimensională prin complexare cu cationi și prin legături de hidrogen cu apa [173].

S-a sugerat că mecanismul de gelifiere a gelanului deacetilat (sau gelanul care conține puține cu grupe acil) în prezența ionilor bivalenți este diferit de mecanismul de gelifiere care are loc în prezența ionilor monovalenți [172]. În prezența cationilor monovalenți, gelifierea apare cu agregarea ulterioară a dublu helixului și la o temperatură mai scăzută decât cea la care apare tranziția de la o structură neregulată la structura ordonată de dublu helix. În schimb, se presupune ca în cazul cationilor bivalenți aceștia ar interacționa imediat cu segmentele de lanț din gelan atunci cand are loc răcirea, formând o structură ordonată specifică la o temperatură mai ridicată decât temperatura de tranziție. Rețelele de gel astfel formate devin foarte stabile la temperatură după adăugarea progresivă de cationi [174].

Cationii monovalenți scad repulsia electrostatică prin legarea lor la structura elicoidală în locurile specifice din jurul grupelor carboxilice ale polimerului. Puterea legăturii crește cu creșterea razei ionice (Li+< Na+< K+< Rb+< Cs+). Sunt necesare concentrații mai mari de cationi monovalenți pentru obținerea unor geluri de gelan cu o tărie optimă în timp ce sunt necesare concentrații de cationi bivalenți mult mai mici pentru obținerea unui gel cu aceeasi tărie [172, 175]. Agregare și gelifierea cu cationii bivalenți apare direct în zonele de legare din helixul dublu al ionilor bivalenți. Concentrații mari de sare sau de acid cauzează agregarea excesivă și în consecință scade tăria gelului. Aceste structuri ordonate devin extrem de stabile la temperatură prin adăugarea progresivă de cationi bivalenți, mai eficienți decât cei monovalenți 51. Cationii bivalenți ai metalelor tranziționale (Zn2+, Cu2+ și Pb2+) dau geluri mai puternice decât metalele din grupa II [176]. Utilizând pentru reticularea gelanului săruri ce conțin cationii Ca2+ și Mg2+ s-a observat, prin comparare, că gelurile care conțin cationii Ca2+ sunt de 1.1-1.4 ori mai puternice decat cele care conțin cationii Mg2+ la aceeași concentrație de sare. [172]. Potențialul de gelifiere a gelanului este îmbunătățit prin adăugarea de cationi monovalenți sau bivalenți în timpul procesului de răcire ceea ce duce la creșterea numărului de punți de sare din zona de joncțiune. S-au facut cercetări asupra mecanismului de agregare a lanțurilor de gelan în timpul gelifierii și asupra proprietăților reologice ale soluțiilor de polimer și ale gelurilor pentru a elucida relația dintre structura macromoleculelor și cationi. Pentru a observa schimbările conformaționale ale lanțurilor de gelan în timpul gelifierii de la o structură dezordonată la o structură ordonată dublu elicoidală s-a utilizat spectrometria de dicroism circular. O valoare maximă a elipticității molare a apărut la 201 nm și temperatura la care tranziția conformațională a avut loc devine mai mare cu creșterea concentrației de cationi. Au fost inregistrate si spectre RMN pentru a monitoriza schimbările în mobilitatea lanțurilor de gelan în timpul transformării de fază (tranziției sol-gel) în prezența cationilor monovalenți sau bivalenți, observandu-se legăturile de hidrogen care se formează [177]. Metodele reologice reprezintă o cale de monitorizare a procesului de gelifiere a fluidului vâscoelastic, deoarece vâscoelasticitatea soluției de polimer se schimbă mult la punctul de gel. Temperatura de gelifiere creste cu cresterea concentrației de cationi [178-180].

Studiile reologice și de microscopie confocală laser de baleiaj demonstrează că soluțiile cu concentrații de gelan între 0.005-0.05 %, în prezența a 10 mM CaCl2 duc la formarea unei rețele de gel. La concentrații mai mici de gelan, spectrul mecanic arată un comportament de gel iar observațiile microscopice indică formarea unei rețele tridimensionale chiar dacă vâscozitatea soluției este redusă semnificativ. Creșterea progresivă a concentrației de gelan determină un caracter elastic al sistemelor de gel obținute dar imbunătățirea proprietăților gelului depinde de concentrația de cationi. [181, 182].

Aplicatii in farmacie

Polimerul a fost utilizat inițial ca ingredient alimentar dar datorită proprietăților sale funcționale este tot mai mult utilizat și pentru crearea de noi sisteme de transport pentru medicamente. Gelurile de gelan sunt termoreversibile și au o temperatură de topire de 50șC, depinzând de concentrație și de prezența cationilor care il stabilizeaza, determinand astfel cresterea acestei proprietati [183].

Pacientii au arătat o complianță ridicată la sistemele de eliberare pe bază de gelan datorită formării in situ a gelului și de aceea el a fost investigat pentru obținerea de sisteme polimerice de administrare a medicamentelor oftalmice eliberate controlat în globul ocular. Gelul de gelan prezintă o vâscozitate scăzută în absența cationilor iar în momentul administrării picăturilor de soluții oftalmice ce conțin gelan și substanță activă medicamentoasă (fără a conține cationi), în prezența lichidului lacrimal are loc tranziția sol-gel. Biodisponibilitatea medicamentului depinde de tăria gelului. Studiile in vivo au arătat ca numai atunci când tăria gelului este între anumite limite se obține o biodisponibilitate oculară optimă. Timpul de contact al gelului cu globul ocular crește cu creșterea concentrației de gelan. Procesul de autoclavare care se utilizează pentru sterilizarea soluțiilor de gelan poate duce la o scădere semnificativă a tăriei gelului în produsul final ca urmare a ruperii lanțului polimeric, fiind proporționala cu timpul de autoclavare [184, 185]. Gelurile formate cu soluție hipotonică (ser fiziologic) își mențin integritatea căteva ore. Gelurile de gelan pot fi formate in lichidul lacrimal cand concentrația polimerului este foarte mică, iar sodiul s-a dovedit a fi un ion adecvat pentru formarea in situ a gelului [186].

Gelanul a fost de asemenea testat in vivo pentru administrare nazală cu formarea gelului in situ. Shi-lei Cao și colab. 2009 [187], au creat un nou gel de gelan cu formare in situ pentru eliberarea controlată a furoatului de mometazonă administrabil pe cale nazală. Acest medicament (din clasa corticosteroizilor) este eficient în inhibarea simptomelor asociate rinitei alergice Testele in vivo au arătat că 20 μg/zi de furoat de mometozonă sunt suficiente pentru a reduce numărul de strănuturi la șobolani [188, 189].

Pentru comparatie, medicamentul a fost administrat la șobolani atat ca suspensie simplă cat si încoporat în soluția de gelan. S-a dovedit ca eficiența medicamentului din gelul ce se formează in situ este superioară medicamentului liber, efectele sele fiind mult îmbunătățite. Vâscozitatea sistemului are o importanță majoră; la început el are vâscozitatea unui fluid ce poate fi pulverizat si apoi, în prezența cationilor se formează gelul care trebuie sa-și mențină integritatea structurală pentru a facilita eliberarea susținută a medicamentului pe o perioadă prelungită fără a se eroda sau dizolva repede. Gelanul necesită cantități mici de ioni pentru a se transforma în gel; vâscozitatea acestuia crește cu creșterea concentrației de polizaharid. Pentru formularea sistemului de transport al medicamentului s-au utilizat xantan (agent de suspendare), gelan 0.5% și furoatul de mometazonă. Prin testele in vivo efectuate s-a demonstrat ca efectele terapeutice ale medicamentului pot fi îmbunătățite dacă acesta este încorporat în sistemul polimeric special formulat pentru gelifiere in situ; gelul format are un caracter pseudoplastic și a prezentat siguranță pe tot parcursul studiului [187].

Au fost elaborate microparticule de gelan care conțin clorhidrat de metoclorpramid prin metoda pulverizare-uscare, pentru administrare intranazală. Metoda de obținere nu este dependentă de caracteristicile de solubilitate a medicamentului și a polimerului. Microparticulele de gelan și clorhidrat de metoclopramid nu sunt toxice pentru mucoasa nazală. Dimensiunea particulelor a variat între 9.38-10.67 μm, fiind potrivită pentru administrarea nazală. După pulverizarea microsferelor se formează un gel pe mucoasa nazală datorita proprietăților lor mucoadezive, prin retragerea apei de pe mucoasa nazală și prin interacțiunea cu cationii prezenți. Eliberarea medicamentului din microparticule a fost controlată moderat, fiind atribuită formării hidrogelului. Rezultatele studiilor in vitro sunt promițătoare și arată ca metoda pulverizare-uscare utilizată pentru formarea microparticulelor de gelan cu clorhidrat de metoclopramid ar putea fi utilizată pentru elaborarea de sisteme cu administrare intranazală. Sunt necesare încă studii farmacocinetice și de farmacodinamie înainte de administrarea nazală la oameni [190].

Gelanul a fost de asemenea testat pentru administrarea orală a medicamentelor.

Au fost efectuate cercetări pentru obținerea unui sistem de gelifiere in situ pentru eliberarea controlată a naproxenului. Naproxenul este un medicament antiinflamator nesteroidian, cu efect antipiretic și antiinflamator. Se leagă de albumina din plasmă, prezintă toxicitate gastrică și ar fi mai eficient dacă doza de medicament ar fi eliberată controlat pe o perioadă prelungită.

S-au utilizat trei tipuri de polimeri care au proprietăți de gelifiere: alginat de sodiu, pectină și gelan. Ca agenți de reticulare s-au utilizat clorura de calciu și citrat de sodiu de o anumita concentratie, pentru fiecare polimer in solutie. O concentrație de medicament de 2.5% a fost inclusă în fiecare din soluțiile de polimer [191].

Gelifierea in situ a fost testată prin adăugarea soluțiilor de polimer sub formă de picături în fluidul gastric simulat la un pH=1.2 [192]. S-a urmărit efectul diferitelor concentrații de CaCl2 și citrat de sodiu asupra proprietăților de gelifiere. Concentrațiile minime care mențin fluiditatea soluțiilor înainte de administrare și cele care determină gelifierea soluțiilor în fluidul gastric sunt de 0.25% (m/v) citrat de sodiu, respectiv de 0.075% (m/v) CaCl2. Cresterea concentrației de CaCl2 cu 0.1% (m/v) ( păstrând aceeași cantitate de citrat de sodiu) cauzează gelifierea formulării înainte de contactul cu fluidul gastrointestinal simulat. De asemenea, eliberarea naproxenului din geluri este afectată de tipul și concentrația agenților de gelifiere [191].

Metoda de gelifiere ionica este cunoscută și s-a studiat efectul diferiților cationi și a concentrației de polimer asupra eficienței de încapsulare a medicamentului precum și asupra vitezei de eliberare a acestuia la locul țintă din tractul gastrointestinal. Particulele au fost testate in vitro și in vivo și au arătat rezultate promițătoare în eliberarea controlată pe o perioadă mai mare de timp, reducerea efectelor secundare, creșterea biodisponibilității și o complianță mai bună a pacienților datorită reducerii frecvenței administrării [193, 194].

Anurag Verma și Jazant K Pandit, 2011 [195] au studiat efectul calciului și a concentrației de polimer asupra eficienței în încorporarea și eliberarea medicamentului. Au utilizat particule flotabile de gelan în care a fost încorporat rifabutin (medicament utilizat în tratamentul infecțiilor rezistente ale stomacului cum este și infecția cu bacteria Helicobacter Pyloris). Particulele au fost preparate prin gelifiere ionotropică cu ioni de calciu în mediu acid. Particulele sunt sferice, au o suprafață rugoasă, iar secțiunea transversală evidentiaza un interior foarte poros. Încapsularea medicamentului în particule variază între 40.3% si 60.7%. Creșterea concentrației de calciu crește eficiența de încapsulare a medicamentului. Proprietățile de flotabilitate depind mult de concentrația de NaHCO3. Eliberarea medicamentului descrește cu creșterea concentrației de calciu. În faza inițială eliberarea a fost rapidă, ulterior aceasta devenind lentă. Chiar daca concentrația de gelan a variat, nu a fost observată vreo diferență în eliberarea medicamentului, in prima oră eliberandu-se 48-69% din acesta. Eficiența scăzută în imobilizare a medicamentului se poate datora utilizării NaHCO3 ca agent generator de gaz care în reacție cu acidul acetic (din baia de extrudere a particulelor) eliberează CO2. Dioxidul de carbon rămâne blocat în rețeaua de gel, în acest fel crescând porozitatea particulelor și scazand rezistența peretelui particulei. Ca rezultat medicamentul difuzează ușor în lichidul de gelifiere. Studiul demonstreaza faptul că eficiența încorporării cu medicament poate fi controlată prin reglarea factorilor procesului. Particulele astfel preparate pot fi utilizate ca sisteme particulate polimerice pentru eliberarea controlată a rifabutinului, fiind administrate oral pentru tratarea diverselor infecții rezistente ale stomacului [195]. Amit Kumar Nayak și colab.au elaborat noi particule de gelan din semințe de tamarind și gelan pentru eliberarea controlată a clorhidratului de metformin cu administrare orală. Semințele de tamarind sunt necancerigene, biocompatibile și au o stabilitate excelentă la pH acid [196].

Ele au. de semenea și proprietăți mucoadezive gasindu-și utilizare în eliberarea medicamentelor [197]. Ca metodă de preparare a particulelor a fost aleasă gelifierea ionică. Ca agent de reticulare în formularea particulelor sferice de gelan cu semințe de tamarind a fost utilizat CaCl2. Clorhidratul de metformin este utilizat pentru scăderea glicemiei în diabetul de tip II neinsulino-dependent. Are timpul de injumătățire de 1.5-1.6 h și absorbție în intestinul superior [198, 199]. Biodisponibilitatea sa orală a fost de 50-60% [197].

Particulele sferice mucoadezive au fost optimizate printr-un model factorial 32 și analizate prin RSM (response surface methodology). A fost observată o creștere a eficienței încapsulării cu medicament cu scăderea raportului de gelan-semințe de tamarind cat și cu reducerea concentrației de CaCl2. O scădere în eliberarea medicamentului a fost observată cu scăderea raportului de gelan-seminte de tamarind și cu creșterea concentrației de CaCl2. Eficiența de încapsulare este de 95.73 4.02 % iar eliberarea medicamentului în primele 10 ore este de 61.22 3.44%. Particulele au fost caracterizate prin analize SEM și FTIR. Particulele astfel formulate prezinta un grad de umflare dependent de pH, au o bună mucoadezivitate la mucoasele membranei biologice iar testele in vivo pe șobolani au arătat o bună activitate hipoglicemiantă .Particulele sferice astfel formulate ar putea fi utilizate pentru eliberarea controlată, prelungită a clorhidratului de metformin pentru menținerea nivelului optim de glucoză din sânge și pentru o bună complianță a pacienților. Astfel de particule mucoadezive ar putea fi utilizate și pentru încapsularea altor medicamente care necesită eliberare controlată pe o perioadă mai lungă de timp, pentru îmbunătățirea biodisponibilității și a eficienței lor terapeutice [200].

Amit Kumar Nayak și colab.,2014 [201] au elaborat și particule de gelan cu mucilagii de ispaghula (tărâte de psyllium) în care au încorporat clorhidratul de metformin. Ca și în studiul anterior, metoda de obținere a fost gelifierea ionica iar ca agent de reticulare s-a utilizat CaCl2. Particulele sferice mucoadezive au fost optimizate printr-un model factorial 32 și analizate prin RSM (response surface methodology). Eficiența în încapsulare a fost de 94.24 4.18 % iar eliberarea medicamentului în primele 10 ore este de 59.13 2.27 %. Particulele mucoadezive care conțin clorhidratul de metformin sunt indicate pentru eliberarea controlată a medicamentului pe o perioadă lungă de timp. Ele au proprietăți antidiabetice demonstrate prin administrarea la șobolani cărora li s-a indus diabetul cu aloxan și dupa o administrare prelungita a particulelor s-a observat ca nivelul optim de glucoză din sânge este menținut și complianța pacienților este imbunătățită [201]. Particule sferice de gelan preparate prin metoda de gelifiere ionica au fost utilizate pentru eliberarea controlată a cefalexinului. S-a urmărit efectul parametrilor de formulare în eficiența încapsulării, si eliberarea controlată a medicamentului. Dispersia de gelan care conține cefalexin a fost extrusă într-o baie ce conține o soluție cu ioni de calciu și zinc. Variabilele pentru optimizarea procesului, cum ar fi pH-ul soluției în care are loc extruderea și cantitatea de cefalexin din solutia de polimer extrusă, au fost modificate pentru a obține o imobilizare eficientă a medicamentului, o eliberare controlată pe o perioada prelungită, o dimensiune și o morfologie optimă a particulelor sferice. Particulele preparate în mediul acid au o structură poroasă, în timp ce cele preparate în mediu bazic au o suprafață netedă. Caracterizarea particulelor s-a facut prin spectroscopie FTIR, DSC și difractie laser. Particulele sunt de formă sferică, cu un diametru mediu variind intre 925 si 1183 μm. A fost obținută o eficiență în încapsulare de 69.24%. Eficienta de eliberare a medicamentului a fost mai mare atunci cand o cantitate mai mare de medicament a fost imobilizată în particule. Particulele preparate în mediu acid elibereaza cu viteza mai mare. Testele in vitro au fost efectuate în 0.1N HCl sau în mediu de soluție tampon fosfat la pH 7.4, dar nu a fost observată o diferență semnificativă. Studiul demonstrează ca prin combinarea ionilor de calciu cu zinc se obțin particule de gelan de dimensiune uniformă ce au proprietăți de eliberare controlată a medicamentelor [202].

Shiv Sankar Bhattacharya și colaboratorii [203] au preparat microparticule de gelan, prin tehnica de reticulare ionică utilizând ca agent de reticulare clorura de aluminiu și au imobilizat în interiorul microparticulelor acidul tranexamic. Acidul tranexamic este un medicament antifibrinolitic, are un timp de înjumătățire de 1.9-2.7 h și biodisponibilitatea de 39%; de aceea necesită administrări repetate pentru a se menține la nivelul terapeutic optim. Particulele au fost preparate prin tehnica de reticulare ionică. Caracterizarea bilelor a fost efectuată prin microscopie electronică de baleiaj, spectroscopie FTIR, difracție cu raze X, DSC și HPLC. Eficiența în încapsulare scade de la 89.12 % la 71.15 % prin variația concentrației solutiei de gelan de la 0.75 % la 1.25 %. Particulele sunt sferice și au dimensiunea de la 8.11×102 μm până la 9,11×102 μm. Diametrul lor crește cu creșterea concentrației de polimer. Între polimer și medicament nu există interacțiuni, acest lucru fiind pus în evidență prin spectroscopie FTIR. Microparticulele au un grad de umflare scăzut în mediul acid dar acesta crește considerabil în mediul bazic. Cu cât gradul de umflare a polimerului este mai mare cu atât este mai mare viteza de eliberare a medicamentului din microparticule. Eliberarea completă a medicamentului a fost atinsă în mediu alcalin în diferite perioade de timp și depinde de mai mulți factori cum ar fi concentrația de polimer și concentrația de reticulant. Rezultatele acestui studiu au evidențiat faptul ca microparticulele de hidrogel încărcate cu medicament pot fi utilizate pentru a minimiza eliberarea acidului tranexamic în mediu acid și pot fi utilizate pentru a modela eliberarea medicamentului în mediul bazic, ceea ce ar ajuta la scăderea pierderii de medicament și la creșterea biodisponibilității. Testele in vivo au arătat o eliberare lentă și prelungită dar sunt necesare mai multe studii clinice [203].

Clorura de aluminiu a fost utilizată pentru studiul încapsulării glipizidei în particule de gelan acetilat pentru eliberarea controlată și prelungită a medicamentului. Metoda utilizată pentru prepararea particulelor a fost gelifierea ionotropică urmată o reticulare covalentă cu aldehidă glutarică. Glipizida este un medicament care scade glicemia, utilizat în tratamentul diabetului de tip II [204].

Absorbția orală este rapidă, uniformă și completă cu o biodisponibilitate de aproape 100 % [205].

Încapsularea în particule de polimer ar putea avea ca efect creșterea eficienței sale terapeutice având în vedere ca timpul de înjumătățire al medicamentului este mic, de aproximativ 3.4 h și necesită administrări repetate [206]. A fost obținută o eficiență în încapsulare de 97.67%. Prin tratament cu aldehida glutarică eficiența în încapsulare a fost redusă cu 11.89 %. Viteza de eliberare a medicamentului a fost de 10% în mediu acid în 2h; în mediu alcalin ea a fost de 38 – 47% pentru particulele de gelan retyculate ionic cu Al3+ și de 15% pentru particulele tratate cu aldehidă glutarică. Eliberarea medicamentului a fost corelată și în acest caz cu gradul de umflare, la fel ca în studiul efectuat de Shiv Sankar Bhattacharza și colab. Utilizarea aldehidei glutarice ca reticulant chimic a dus la scăderea vitezeide eliberare a medicamentului. Medicamentul se eliberează controlat pe o perioadă prelungită. Aceste particule au potențial pentru a fi utilizate în aplicații de eliberare controlată și ar putea minimiza frecvența de administrare a dozei dar și efectele secundare asociate cu medicamentul [207].

Metoda coacervării complexe este bazată pe interacțiunile electrostatice dintre polimeri anionici și cationici rezultând capsule insolubile sferice.

Chitosanul poate forma complecsi polielectrolitici prin interacțiuni electrostatice cu polianionii și polizaharidele cu grupele COO- sau SO4- [208, 209]. Gelanul a fost testat pentru încapsularea componenților biologic activi în complexul de poliioni format cu chitosan de masă moleculară joasă în soluție apoasă, cercetările conducand la concluzia ca acest complex polielectrolitic nu poate fi încărcat cu o cantitate mare de medicament datorită naturii acide a mediului de gelifiere, iar eliberarea medicamentului este rapidă datorită mediului acid din stomac [210]. Anurag Verma și colab.,2012 [211], au ales un sistem polimeric format din chitosan și gelan pentru transportul piroxicamului urmărindu-se eliberarea controlată a medicamentului în stomac, eficientizarea încapsulării, creșterea stabilității medicamentului, complianța pacienților și evitarea dezavantajelor asociate cu particulele de gel formate în emulsie pe bază de ulei. Particulele sunt formate dintr-un complex de polielectroliți pe bază de gelan și chitosan, prin tehnica coacervării complexe, fără a utiliza nici un reticulant chimic. Gelucire (39/01 și 50/13) este utilizat ca fază de lipide datorită biocompatibilității, biodegradabilității, conține cantități foarte mici de acid și previne iritarea gastrică, formând un înveliș în jurul medicamentului.44 Diametrul particulelor obținute variază între 1.09-1.3 mm; ele prezintă o bună flotabilitate, o eficiență a încapsulării crescută (medicamentul este încorporat în particule într-o proporție de 93-98%). Elaborarea particulelor flotabile utilizând complexul polielectrolitic poate avea rezultate eficiente în eliberarea controlată a antiinflamatoarelor nesteroidiene (AINS) administrate oral pentru un efect terapeutic optim, reducerea efectelor secundare (reduc iritația gastrică) și pentru o bună complianță a pacienților [211].

Alte studii au fost efectuate pentru prepararea microsferelor obținute prin metoda reticulării în emulsie utilizând ca polimeri gelan și polia(lcoolul vinilic) iar ca agent de reticulare aldehida glutarică, pentru încapsularea unui medicament antihipertensiv [212].

Rezistența mecanică a fost îmbunătățită atunci când s-a utilizat o retea interpenetrată de polimeri (IPN) față de microsferele obținute prin reticulare ionică. Particulele obținute au formă sferică și prin creșterea densității de reticulare se obțin dimensiuni mai mici datorită formării unei rețele polimerice mai dense. În schimb creșterea concentrației de gelan duce la o dimensiune mai mare a microsferelor cu formarea mai multor matrici cristaline. Microsferele IPN rezultate au arătat o rezistență la tracțiune mai mare față de microsferele obținute doar dintr-un singur polimer. S-au efectuat studii in vitro pentru a se stabili viteza de eliberare a medicamentului din microsfere și s-a stabilit că aceasta este mai mare la microsferele care conțin cantități mai mici de gelan. Eficienta de eliberare a medicamentului din microsfere depinde și de mediul de difuzie și de solubilitatea medicamentului în diferite medii [213].

O rețea interpenetrată de polimer s-a utilizat în obținerea microcapsulelor de gelan și albumină din ou în care sunt înglobate un complex răsină-diltiazem pentru eliberarea controlată a medicamentului. Diltiazem clorhidrat, un medicament solubil în apă, a fost legat de Indion 254 – o rășină schimbătoare de cationi. Metoda utilizată pentru obținerea microcapsulelor de gelan cu albumină a fost gelifierea ionotropică combinata cu reticularea chimică covalentă. Agentul de gelifiere ionic utilizat este clorura de calciu iar cel de reticulare chimică este aldehida glutarică. Caracterizarea microcapsulelor obținute s-a realizat prin analize SEM, DSC, TGA, XRD și FTIR. Microcapsulele au formă sferică, cu o suprafață aspră (rugoasă) iar diametrul variază între 841 și 1118 µm. Dimensiunea particulelor reticulate ionic descrește odată cu a doua reticulare (cu aldehida glutarică) și ar putea fi atribuită contractarii rapide a matricei IPN datorită reticulării covalente între lanțurile polimerului. Cu creșterea concentrației de aldehidă glutarică scade dimensiunea microcapsulelor datorită creșterii densității de reticulare. Cu creșterea cantității de rezinat, particulele își măresc diametrul datorită ocupării spațiului interstițial între segmentele polimerului. Eficiența de încapsulare a fost de 68.02-89.06 %. Cu creșterea concentrației de CaCl2 descrește eficiența în încapsulare. Eficiența de încapsulare a microcapsulelor obținute doar prin reticulare ionică a fost mai mare decat cea în care microcapsulele au fost dublu reticulate. Pe de altă parte, eficiența de încapsulare a medicamentului in microcapsulele preparate cu cantități mici de aldehidă glutarică a fost mai mică decât atunci când s-au utilizat cantități mai mari de aldehidă glutarică. Eliberarea medicamentului a fost studiată in vitro în fluidul gastric simulat pH=1.2 și în fluidul gastric intestinal pH= 7.4. Medicamentul simplu (clorhidratul de diltiazem) prezintă o dizolvare rapidă și completă în 60 min. Eliberarea medicamenbtului din rezinat a durat 3h dar din microcapsulele IPN a fost mai lentă [214].

S-au făcut cercetări pentru obținerea de filme pe bază de gelan pentru aplicații dermatologice în care să fie incluse principii active medicamentoase și să le elibereze controlat.

Ming-Wei și colab., 2010 [215] au studiat prepararea, caracterizarea și proprietățile biologice ale gelanului reticulat cu 1-etil-3-(3-dimetilpropil) carbodiimida utilizată ca activator al reactiei de reticulare. S-au utilizat filme cu grosimea de 26 μm de gelan care reacționează cu agentul de reticulare în etanol (40%), cu aplicații medicale în vindecarea rănilor postoperatorii. Au fost efectuate teste de biocompatibilitate in vivo și in vitro și s-a constatat că filmul de gelan este compatibil cu celulele fibroblaste L929 și cu sângele. Prin implatare subcutanată filmul cauzează o ușoară inflamație în primele zile după operație , dar nu apare nici o fibroză sau reacție stromală. Un astfel de film are potențial de a fi utilizat în aplicații cutanate [215].

C.Cencetti și colab. [216] au preparat și caracterizat un pansament antimicrobian pe bază de argint, gelan, poli(alcool vinilic) și borax. Crearea unui pansament în care argintul este încorporat trebuie sa asigure activitate antimicrobiană locală, cu avantajul unei eliberări controlate a argintului și schimbarea pansamentului la un interval mai mare de timp. Acest tip de pansament trebuie să asigure un mediu umed, nu trebuie ca din pansament să iasă fire textile (să se destrame), deshidratarea și aderența la locul rănii. În acest studiu este descrisa prepararea unui nou pansament (nețesut) pe bază de gelan tratat cu un amestec de poli(alcool vinilic) și borax capabil sa crească capacitatea de încapsulare a argintului și pentru a modela eliberarea sa. Noul pansament arată o creștere a capacității de absorbție a apei (o proprietate fundamentală pentru absorbția exudatelor plăgii) și o viteza scăzută de deshidratare. Argintul este eliberat controlat pe o perioadă mai lungă de timp, activitatea sa antibacteriană fiind testată pe Staphylococcus aureus si Pseudomonas aeruginosa [216].

Un nou hidrogel pe bază de gelan și acid hialuronic sulfat a fost raportat de C.Cencetti și colab. [217] cu scopul de a forma o barieră în formarea cicatricilor epidurale apărute după operații chirurgicale. Noul hidrogel are în compoziția sa gelan 2% (m/v) și acid hialuronic sulfat 1% (m/v). Prezența polimerului sulfat induce proprietăți hidrofile și, prin intersectarea cu zonele de joncțiune ale gelanului, se obține un hidrogel cu proprietăți mecanice și reologice îmbunătățite, și mult mai ușor de extrudat [217].\

S-au efectuat cercetări pentru obținerea unui sistem polimeric utilizat în eliberarea controlată a ciprofloxacinei cu potențiale aplicații dermice, format din derivați de gelan ce conțin grupe de amoniu cuaternar. Acestia au fost obținuți prin substituție nucleofilă la grupele hidroxil primare din gelan a clorurii de N-(3-cloro-2-hidroxipropil)- trimetil amoniu în prezența alcalilor, în anumite condiții de reacție specifice, utilizând diverse rapoarte molare gelan/ N-(3-cloro-2-hidroxipropil)-clorură de trimetil amoniu. Caracterizarea s-a făcut prin spectroscopie 1H RMN, FT-IR și titrare conductometrică cu AgNO3 pentru determinarea gradului de cuaternizare; analiza termogravimetrică a fost utilizată pentru investigarea comportamentului termic. Au fost formulate particule pe bază de gelan cuaternizat și chitosan cu reținerea activității antibacteriene a fragmentelor de amoniu cuaternar. Studiile in vitro s-au efectuat pe piele de șobolan în soluție tampon fosfat (pH=7.43). Ciprofloxacina a fost eliberată în 24 h, confirmând faptul că particulele astfel obținute pot fi utilizate ca sisteme pentru eliberarea controlată a medicamentelor cu aplicații dermice locale [218].

Aplicații medicale

În ultimii ani, transplantarea celulelor terapeutice a jucat un rol tot mai important în medicina regenerativă. Un rol determinant pentru un tratament adecvat și care să funcționeze îl reprezintă cantitatea și calitatea celulelor.Suporturile polimerice sunt utilizate ca vehicule pentru transportul și eliberarea controlată a celulelor terapeutice la un loc țintă din corp. Ele au, de asemenea, rolul de a menține viabilitatea celulară și fenotipul celular trebuie să rămână intact în timpul transportului [219, 220].

Au fost efectuate studii pentru obținerea de noi sisteme polimerice capabile sa poată transporta și elibera celule pentru tratarea diverselor afecțiuni cu utilizare în medicina regenerativă tisulară. Chunming Wang și colab.,2008 [221] au obținut un suport polimeric de hidrogel pe bază de gelan, utilizat ca vehicul pentru transportul și eliberarea controlată a celulelor care ajută la regenerarea diverselor țesuturi. Obținerea microsferelor de gelan se realizează prin metoda emulsiei apă în ulei, urmată de o serie de tratamente de reticulare redox. Pentru a îmbunătăți adeziunea celulară, un strat de gelatină va acoperi suprafața microsferelor, rezultând un suport gelatină-grefat-gelan pentru transportul celulelor. Celulele care au fost imobilizate pe acest suport au fost fibroblaste dermice umane și osteoblaste fetale umane. Prin microscopie optică și microscopie electronică de baleiaj s-a putut observa că celulele fibroblaste sunt uniform răspândite și populează rapid suprafața microsuportului de gelatină și gelan. În cazul celulelor osteoblaste ce sunt imobilizate pe acelasi tip de suport, viabilitatea celulară și potențialul lor pentru osteogeneză sunt demonstrate prin teste de fluorescență și prin indicații histologice și biochimice specifice. Aceste microsfere de gelan și gelatină ar putea fi utilizate pentru transportul celulelor pentru aplicații în medicina regenerativă tisulară [221].

În aplicațiile ingineriei tisulare, cartilajul articular, datorită funcției sale în mobilitate și locomoție este considerat cel mai important cartilaj. Traumatismele și bolile degenerative (osteoartrita, artrita reumatoidă) pot crea stări de invaliditate,conduc la apariția durerii și scad calitatea vietii. Au fost încercate multe tratatmente dar rezultatele nu sunt satisfăcătoare și din această cauză s-au făcut cercetări în domeniu pentru dezvoltarea altor tehnici pentru tratarea acestor afecțiuni [222].

Au fost studiate suporturi biopolimerice pentru încorporarea celulelor și pentru formarea unui țesut cartilaginos funcțional [223].

Sistemele injectabile de hidrogel pot fi aplicate printr-o tehnică foarte puțin invazivă și datorită capacității acestora de a gelifia in situ în condiții fiziologice au fost utilizate în cercetările pentru aplicații în regenerarea cartilajului [224].

Gelanul a fostunul dintre biopolimerii propusi pentru aplicații în ingineria tisulară.

În studiul efectuat de J. T. Oliveira și colab., 2010 [225] a fost testat un hidrogel injectabil de gelan care conține celule autologe pentru regenerarea cartilajului articular afectat la iepure. Celulele încapsulate în hidrogelul de gelan au fost condrocite articulare umane. Hidrogelul împreuna cu celulele au fost introduse prin injectare în locul defect din cartilajul articular, iar gelifierea a avut loc in situ, in condiții fiziologice. Dupa 8 saptasmani de actiune au fost efectuate teste histologice, biochimice, moleculare și imunologice . Rezultatele au prezentat o distribuție celulară uniformă și condriocitele în matrice au o formă rotundă [225].

Un alt studiu efectuat de Jiabing Fan și colab. [226] utilizează, de asemenea, hidrogeluri injectabile de gelan în care sunt încorporate celule stem mezenchimale-sinoviale (CSMS) prelevate de la iepure. Sistemul astfel format a fost testat in vitro pentru aplicații în ingineria tisulară a cartilajului. Condrogeneza CSMS de iepure cu hidrogelul injectabil de gelan a fost testată in vitro utilizând culturi condrogenice. Rezultatele au arătat formarea unui țesut cartilaginos prin tratarea culturilor de celule cu TGF-β1, TGF-β2 sau BMP-2, ceea ce conduce la concluzia că CSMS încorporate în hidrogelul injectabil de gelan prezintă un mare potențial de formare a construcțiilor cartilaginoase. Aceste studii reprezintă o bază pentru studii viitoare in vivo [226].

Datorită temperaturii înalte de gelifiere și lipsei de rezistență mecanică, utilizarea gelanului în ingineria tisulară este limitată. Au fost efectuate cercetări și pentru imbunătățirea acestor proprietăți și a fost obținut un nou biomaterial pe bază de gelan și chitosan cu posibile aplicații în ingineria tisulară. Gelanul a fost mai intai oxidat și amestecat apoi cu carboximetil chitosan ceea ce a dus la obținerea unui hidrogel complex format dintr-o rețea dublă. S-a observat o îmbunătățire a temperaturii de gelifiere care este mai mică de 42 șC, s-a observat o creștere a modulului de comprimare de 278 kPa și după comprimare poate reveni la forma inițială. În acest nou hidrogel format au fost încapsulate condriocite iar testele in vitro au arătat ca acestea proliferează și au o viabilitate crescuta. Acest hidrogel pe bază de gelan și carboximetil chitosan este un material care ar putea fi utilizat în aplicații ale îngineriei tisulare a cartilajului [227].

Gelanul poate fi modificat prin metacrilare; în acest mod se poate utiliza o metodă alternativă pentru obținerea hidrogelului, fotopolimerizarea. Utilizarea fotopolimerizării conduce la obținerea de hidrogeluri cu caracteristici structurale și mecanice imbunătățite [228].

Obținerea de hidrogeluri cu rezistență mecanică mare este un obiectiv major în aplicatii ale ingineriei tisulare. Pentru atingerea acestui obiectiv, o strategie ar fi crearea unei rețele duble de hidrogel în care celulele să poată fi încapsulate. S-au efectuat studii în acest sens și s-a creat un hidrogel format din rețele duble prin fotoreticulare în două etape utilizând ca polimer metacrilat de gelan pentru prima rețea rigidă și fragilă, respectiv gelatina metacrilamidă pentru a doua rețea moale, și elastică. Proprietățile mecanice ale fiecărei rețele au fost obținute prin controlul gradului de metacrilare a fiecărui polimer. Reteaua dublă este formată prin fotoreticularea gelanului metacrilat, difuzarea gelatinei metacrilamidă în prima rețea, și fotoreticularea gelatinei metacrilamidă pentru a forma a II-a rețea. Rezistența la compresiune a hidrogelurilor obținute prin această metodă a fost de până la 6.9 Mpa, o valoare ce este apropiată de rezistența cartilajului. Raportul masic al polimerilor influenteaza rezistența mecanica a hidrogelurilor. În aceste rețele au fost încapsulate celule fibroblaste iar testele au arătat compatibilitate celulară și viabilitatea celulelor nu a fost afectată de condițiile de prelucrare a hidrogelului [229].

S-au făcut teste ale hidrogelului de gelan din punct de vedere al potențialului angiogenic pentru aplicarea sa în regenerarea nucleului pulpos. Hidrogelurile pentru regenerarea nucleului pulpos trebuie să aibe proprietăți nonangiogenice sau chiar antigiogenice. Datorită capacității hidrogelurilor de gelan de a realiza suporturi pentru încapsularea de celule cu proprietăți mecanice optime și datorită lipsei de toxicitate, acestea pot fi utilizate ca și înlocuitori (substituenți) pentru nucleul pulpos în diferite strategii acelulare sau celulare. Testul pe membrană corioalantoică s-a efectuat pentru a stabili dacă hidrogelurile de gelan au răspuns angiogenic. Pentru acest s-au utilizat discuri de hidrogel de gelan, respectiv metacrilat de gelan reticulat ionic și metacrilat de gelan fotoreticulat. Acest test demonstrează că hidrogelurile de gelan nu au nici nici un răspuns angiogenic, nu inhibă și nici nu induc formarea de noi vase de sânge. Testele histologice și imunohistochimice efectuate au arătat ca hidrogelurile sunt nepermisive în refacerea celulelor endoteliale. Hidrogelul pe baza de metacrilat de gelan reticulat ionic sau fotoreticulat nu provoacă nici un răspuns inflamator acut. Angiogeneza este un proces asociat puternic cu deteriorarea progresivă a nucleului pulpos și aceasta ar putea fi prevenită prin utilizarea hidrogelului de metacrilat de gelan reticulat ionic sau fotoreticulat deoarece hidrogelul ar putea contribui la regenerarea țesutului deteriorat al discului intervertebral. Datorită proprietăților sale funcționale și foarte adaptabile, precum și datorită abilității sale de a controla infiltrarea de celule și invazia vaselor de sânge, hidrogelurile pe bază de gelan au potențial de a fi utilizați ca înlocuitori pentru nucleul pulpos [230].

S-au efectuat cercetări și pentru regenerarea și repararea defectelor osteocondrale. Ele apar după o traumă, cancer sau disfuncții metabolice. Defectele osteocondrale necesită regenerarea cartilajului și a osului subcondral în același timp, ceea ce implică utilizarea unor construcții bistratificate [231]. Construcții bistratificate, reprezentate printr-o structură structură cartilaginoasă și una osoasă au fost propuse de către J.M. Oliveira. Sistemele combină construcțiile bifazice, biomimetice și sunt compuse din hidroxiapatită și chitosan [232].

Hidrogelurile au atras atenția în tratarea defectelor osteocondrale. Gelanul formează hidrogeluri ce pot gelifia in situ. Datorită structurii lor caracteristice își găsesc aplicații in regenerarea țesutului cartilaginos. În cercetările recente făcute de Diana R. Pereira și colab.66, gelanul slab acilat a fost utilizat pentru construcțiile bistratificate din hidrogel în ingineria tisulară osteocondrală. Construcțiile bistratificate au fost obținute din soluție apoasă de 2 % gelan slab acilat (pentru structura cartilaginoasă) și dintr-o soluție de 2 % gelan slab acilat în care se adaugă diferite cantități de hidroxiapatită (5- 20%), în acest mod obținându-se o structură osoasă. Bioactivitatea a fost analizată in vitro prin imersarea construcțiilor de hidrogel într-o soluție ce simulează fluidul din corp timp de 14 zile. Analizele pentru construcțiile de hidrogel obținute, prin microscopie electronică de baleiaj, spectroscopie FT-IR, difracția cu raze X au demonstrat că formarea apatitei este limitată de stratul cu structură de os. Testele de bioactivitate prezintă un comportament diferit în ambele structuri. Structura de os este bioactivă (un strat de apatită a fost format în contact cu fluidul simulat al corpului) pe cand structura cartilaginoasă nu a arătat o natură bioactivă. Prezența hidroxiapatitei induce nucleația apatitei și ionii de calciu accelerează nucleația apatitei în stratul cu structură de os. Construcțiile de hidrogel de gelan bistratificat au un potențial major de a fi utilizate în ingineria tisulară [233].

Regenerarea limitată a cartilajului articular a condus la diverse cercetări conceperea de noi tratamente și investigarea de noi tehnici medicale pentru atingerea acestui obiectiv. Încorporarea celulelor stem, a celulelor precursoare impreună cu factorii de creștere în diverse suporturi pe bază de hidrogeluri de polizaharide reprezintă o abordare în regenerarea cartilajului articular [234].

Rigiditatea substratului poate influența comportamentul celular și poate susține diferențierea celulară in diferite fenotipuri de celule [235-237].

Substraturi mai moi au tendința să promoveze diferențierea neurogenă, adipogenă și condriogenă, în timp ce substraturile mai rigide s-au dovedit că sprijina miogeneza și osteogeneza în funcție de compoziția specifică a mediilor de cultură [236, 238, 239].

Mark Ahearne și Daniel J Kelly [240] au comparat hidrogelurile de fibrină, agaroză și gelan ca vehicule sub formă de microsfere pentru transportul și încorporarea celulelor stem și a factorilor de creștere utilizate în aplicații de regenerare a cartilajului. Gelatina MSs a fost utilizată pentru a controla factorul de creștere TGF-β3 și celulele precursoare (progenitoare) extrase din lipidele infrapatellare ale genunchiului s-au utilizat pentru a determina capacitatea celor trei hidrogeluri de a susține formarea țesutului cartilaginos hialin. Studiile au fost efectuate in vitro. Cel mai înalt nivel al AND-ului a fost observat în hidrogelurile de gelan care conțin factorul de creștere TGF-β3 și eliberează MSs. Este necesară optimizarea raportului dintre concentrația de gelan și concentrația de CaCl2 pentru a obține un hidrogel cu o temperatură de gelifiere potrivită, dat fiind faptul că utilizarea gelanului este limitată de gelifiarea rapidă a hidrogelului la temperaturi scăzute [240].

Capacitatea de regenerare a țesutului adult accidentat (deteriorat) din sistemul nervos central este foarte limitată. Leziunile traumatice ale măduvei spinării pot duce la pierderea permanentă a funcțiilor motorii și senzoriale precum și la alte complicații. Abordările medicamentoase sunt limitate și se bazează pe utililizarea medicamentelor antiinflamatoare cum ar fi metilprednisolon [241]. Transplantul de celule stem ar putea fi o strategie de regenerare a acestor țesuturi, dar celulele au o rată mică de supraviețuire, (sub 1 %). Pentru a crește viabilitatea acestor celule, ele pot fi imobilizate într-o matrice biopolimeră care poate să le asigure un mediu favorabil de supraviețuire după transplant. Gelanul a fost ales ca biomaterial pentru transportul celulelor, dar pentru creșterea adeziunii celulare gelanul a fost modificat cu o peptidă sistemică derivată din fibronectină. Gelanul modificat a avut un efect profund asupra morfologiei și proliferării celulelor stem neuronale precursoare, diferit de efectul gelanului nemodificat cu aceleași celule. Acest studiu demonstrează că gelanul modificat de această peptidă utilizat ca biomaterial și încapsularea de celule stem în acest biomaterial ar putea avea beneficii în tratarea leziunilor din măduva spinării [242].

Caracterul biocompatibil al gelanului determina utilizarea sa in numeroase aplicatii in care acest polizaharid lucreaza in contact sau chiar in interiorul organismului. Putand fi formulat ca particule, filme, hidrogeluri mai mult sau mai putin fluide, gelanul constituie un transportor ideal pentru medicamente, administrabil oral, transdermal, pe caile respiratorii, instilat in sacul conjunctival al ochiului etc, si avand capacitatea de a determina o eliberare sustinuta, controlata a principiilor active pe care le contine. De aici aplicatiile numeroase in medicina, in formulari farmaceutice, in cosmetica sau in ingineria tisulara. Acestea se adauga la aplicatiile numeroase in domeniul alimentar – fie in biotehnologii (imobilizarea de enzime, celule de drojdie de bere etc.) fie in realizarea de alimente functionale -, ca mediu de cultura pentru tesuturi de plante, s.a.

Chitosanul

Chitosanul este un material promițător pentru o gamă largă de aplicații biomedicale. Chitosanul este produsul principalul obținut prin procedeul de deacetilare alcalină a chitinei, (β-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucoză); este un polimer liniar natural semi-cristalin, semi-sintetic, policationic din familia polizaharidelor cu structură liniară, compus din unități (1→4)-2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucan(N-acetyl-D-glucozamină) și (1→4)-2-amino-2-deoxi-β-D-glucan (D-glucozamină) [243]. In literatura de specialitate sunt raportate cercetări intense cu privire la morfologia sa, [244] datorită faptului că acesta deține proprietăți excelente cum ar fi: biodegradabilitate, biocompatibilitate, netoxicitate, mucoadezivitate, grupări amino și hidroxilice reactive ideale pentru modificarea chimică [245, 246].

Sursa de proveniență a chitosanului este determinantă pentru proprietățile sale fizice, astfel că polimerul obținut din ciuperci este preferat în locul celui obținut din crustacee din punct de vedere al alergogenității, al distribuției grupelor deacetilate și a masei moleculare, fiind mult mai indicat pentru utilizările în aplicațiile biomedicale. Denumirea de chitosan este atribuită chitinei care are peste 60% resturi D-glucozaminice, ceea ce corespunde unui grad de deacetilare de 60%. [247]

Proprietățile reactive, datorate grupărilor hidroxil și grupărilor aminice primare în concentrație mare permit chitosanului să reacționeze cu multe substanțe obținându-se micro/nanosfere, micro/nanocapsule, derivați cu un spectru larg de utilizări. Încorporarea principiilor active conduce la obținerea de produse farmacologice noi cu diverse aplicații. Pe lângă faptul că este o resursă regenerabilă și există din abundență, chitosanul iese în evidență datorită proprietăților sale chimice, fizice și biologice unice ca biocompatibilitatea, biodegradabilitatea, mucoadezivitatea, caracteristicile anti-bacteriene, antitumorale, hemostatice, toxicitate și imunogenitate scăzută [248]. caracterul fungic, analgezic, precum și caracteristici peliculogene. Toate aceste proprietăți au atras cercetări cu privire la numeroase bioaplicații cum ar fi: agent antibacterian pentru bandajele (pansamentele) utilizate la oprirea sângerarilor, ingineria tisulară ca înlocuitor temporar de piele, suturi resorbabile, transport de medicamente. Având la bază chitosanul găsim raportate și elaborate în literatură matrici cu rol de vehicule transportoare de principii active, sub formă particulată, lipozomală, membrane osmotice, structuri spongioase, hidrogeluri, filme etc. În aplicațiile oftalmologice chitosanul înlocuiește cu succes polimerii sintetici datorită proprietăților sale caracteristice, cum ar fi claritatea optică, stabilitatea mecanică adecvată, corecția optică suficientă, higroscopicitate și compatibilitate. Un alt avantaj îl reprezintă faptul că poate modificat chimic ușor, iar matricile pe bază de chitosan se pretează la furnizarea eficientă a medicamentelor polare prin diferite bariere biologice ale corpului [249, 250].

Figura 5. Structura chimică (a) chitină, (b) chitosan distribuția eterogenă a grupelor acetil pe lanț [250].

Caragenanul

Caragenanul aparține familiei de galactani hidrofili liniari sulfatați cu o masă moleculară mare, fiins format din unități alternante de D-galactopyranoză și 3,6-anhidro-galactoză (3,6-AG) unite prin legături alternative alternante de α-1,3 și β-1,4- glicozidice. Tipurile de caragenan cum ar fi λ, κ, ι, ε, μ, θ au un conținut de 22-35 % grupe sulfat, clasificare realizată în funcție de solubilitatea acestora în clorură de potasiu [251].

În procesul de obținere a caragenanilor, pe lîngă galactoză și sulfat, pot exista și alte reziduuri de carbohidrați: xiloza, glucoza, acizi uronici și substituienți cum ar fi grupe de metil eteri și piruvat [252]. Proprietățile caragenanilor sunt influențate în principal de numărul și poziția grupelor de ester sulfat și de asemenea de conținutul de 3,6-anhidro-galactoză(3,6-AG) Conținutul de grupe ester-sulfat pentru kappa-caragenan este în jur de 25-30% și 28-35 % grupe 3,6-anhidro-galactoză, iotta-caragenan conține grupe sulfat în jur de 28-30% și 25-30 % grupe 3,6-anhidro-galactoză, iar lambda-caragenan conține grupe ester-sulfat în jur de 32-39 % și nu conține nici o grupă 3,6-anhidro-galactoză.

Masa moleculară medie a caragenanilor diferă în funcție de natura sa; spre exemplu caragenanul nativ ar avea o valoare a masei moleculare medii de la 1.5 × 106 la 2 × 107 g/mol, iar cel de calitate alimentară o valoare de 100.000–800.000 g/mol sau 200.000– 400.000 g/mol, pe când caragenanul degradat (poligeenan) are o masă moleculară medie de 20.000–30.000 g/mol.

Domeniul de toleranță a pH-ului pentru caragenani este cuprins în intervalul 4-10, în mediu acid acestia având o stabilitate slabă. Caragenanii sunt sensibili la depolimerizarea realizată prin hidroliză acidă, pentru că o temperatură ridicată și un pH scăzut conduc la pierderea completă a funcționalității lor. Studiile au relevat că acesta este netoxic și neiritant, este sigur de utilizat în industria alimentară nefiind stocat în organele animalelor testate (șoareci, maimuțe, iepuri, porcușori), și nu este nici cancerigen; de asemenea toxicitatea depinde de masa moleculară și nu de grupele sulfat. [251]

Stabilitatea caragenanilor

Soluțiile de caragenan sunt destul de stabile la pH neutru sau alcalin. La pH mic stabilitatea soluțiilor scade, în special la temperaturi ridicate, datorită hidrolizei care conduce la pierderea capacității de vâscozitate și de gelifiere; în cazul în care gelul este deja format nu mai intervine procesul de hidroliză acesta fiind stabil chiar și la pH 3,5 – 4. Datorită limitărilor caragenanului în condiții acide pentru aplicațiile practice este de dorit evitarea prelucrării soluțiilor lor la pH mic și temeraturi ridicate pe o perioadă mai îndelungată de timp. [253]

Metode de obținere a sistemelor de eliberare

Înțelegerea avansată a chimiei materialelor și a tehnicilor de inginerie facilitează multiple strategii de fabricare a sistemelor de eliberare a medicamentelor pe bază de polizaharide. În această secțiune, discutăm elementele de bază ale chimiei asociate cu legătura de reticulare în cadrul sistemelor de polizaharide și tehnicile de inginerie utilizate pentru fabricarea sistemelor de administrare a medicamentelor.

Forțe intra și intermoleculare în sistemele de de eliberarea a medicamentelor pe bază de polizaharide

Legăturile covalente

Pentru creșterea stabilității nanoparticulelor pe bază de polizaharide și pentru a evita dizolvarea lanțurilor/segmentelor de polimeri hidrofili în faza apoasă, se realizează, de obicei, o reticulare chimică, menținând în același timp biodegradabilitatea materialelor (figura 2). Reticularea chimică este procesul de legare a lanțurilor polimerice prin legături covalente, obținându-se rețele tridimensionale care reduc mobilitatea structurii și îmbunătățește de obicei proprietățile mecanice, de barieră și cele de rezistență la apă. Cei mai comuni agenți de reticulare sunt compuși bifuncționali simetrici cu grupe reactive cu specificitate pentru grupele funcționale prezente pe macromolecule.

Fig. 2 Schematic illustration of different intra- and intermolecular

forces in polysaccharide systems. A) Covalent cross-linking. B) Metal–

polymer coordination. C) Electrostatic interactions. D) Hydrophobic

interactions.

Legăturile chimice din structura matricei polimere sunt de obicei concepute fie pentru a fi biodegradabile, fie pentru a răspunde stimulilor în condiții specifice endogene și exogene [254-256].

Deși legăturile reticulate covalente reprezintă principala interacțiune între macromolecule, există și alte interacțiuni necovalente (de exemplu, legăturile de hidrogen și interacțiunile hidrofobe) care ar putea fi de asemenea implicate în formarea matricei polimerice, în funcție de tipul de polizaharid utilizat și de modificările chimice efectuate. În general, legăturile labile, incluzând legăturile peptidice (reacții mediate de carbodiimidă), legăturile esterice (esterificarea mediată de anhidridă) și legăturile disulfidice (oxidarea grupărilor tiol) facilitează în mod obișnuit reticularea intramoleculară a polizaharidelor [255,257].

Reacții de coordinare metal-polimer

Spre deosebire de reticularea covalentă, reacția de coordinarea metal-polimer formează legături mai puternice între lanțurile de polizaharide prin legături coordinative-covalente (chelatizare) între cationii metalici (de exemplu, calciu, cupru, fier, zinc) și fragmentele de ligand cu sarcină negativă ale polizaharidelor [258-260].

Aceste legături intramoleculare permit formarea reversibilă și facilă a nanocompozitelor metal-polizaharid, [261] cum ar fi hidrogelurile cu proprietăți fizico-chimice variabile, care depind de dimensiunea și valența metalelor, precum și de gradul de modificare chimică și de concentrația polimerului [261, 262]. În plus, legăturile coordinative metal-polimer sunt în general sensibile la pH, proprietate care favorizează utilizarea lor în aplicații biomedicale ca sisteme pentru eliberarea controlată a medicamentelor, deși această proprietate poate provoca și instabilitatea rețelei polimere reticulate [263]. Alginatul este un exemplu binecunoscut de polizaharidă care poate fi reticulat prin interacțiuni cu diferiți ioni metalici divalenți, în principal ionii Ca2+[264]. Acești ioni de calciu pot fi coordinați cu grupările carboxilice din unitățile de acid α-l-guluronic ale alginatului [265]. Drept urmare, se formează rețeaua polimerică de hidrogel. Particulele de hidrogel pe bază de alginat pot fi preparate la temperatura camerei și la pH fiziologic; astfel, ele sunt utilizate pe scară largă pentru imobilizarea celulelor vii și eliberarea controlată a proteinelor [266].

Interacții electrostatice

Pe lângă sistemele de eliberare obținute pe baza polizaharidelor anionice reticulate prin coordonare cu ioni metalici, pot fi obținute sisteme de eliberare obținute prin complexare polielectrolitică (PEC) formate prin interacțiuni electrostatice între polizaharidele de sarcini opuse [267, 261]. Complexele polielectrolitice asigură o legătură fizică reversibilă și necovalentă, fără a utiliza alți agenți reactivi sau catalizatori pentru imobilizarea substanțelor active terapeutice. Complexele polielectrolitice sunt obținute din macromolecule de sens opus polianioni și policationi cum ar fi acizii nucleici (de exemplu, pADN, siARN), proteine (de exemplu, albumină, colagen, gelatină), polizaharide (de exemplu, chitosan, acid hialuronic, alginat) și polimeri sintetici cu sarcină pozitivă și negativă (de ex. , polietilenimină, acid poliacrilic) [262, 268] Complexitatea, stabilitatea și proprietățile fizice (de exemplu, permeabilitatea, umflarea) complexelor polielectrolitice sunt determinate de mai mulți factori, inclusiv proprietățile intrinseci ale complexelor polielectrolitice (de exemplu, rezistența ionică, densitatea sarcinii, masa moleculară, flexibilitatea) și mediul fizico-chimic în care are loc reacția (de exemplu, temperatura și pH-ul soluției, tipul solventului, gradul de interacțiune dintre polimeri), precum și ordinea și durata de interacțiune a polimerilor in amestec pentru obținerea complexelor polielectrolitice [121, 255, 256, 268, 269].

Printre polizaharidele existente, chitosanul este polizaharida cationică cel mai frecvent utilizată în aplicații pentru a forma complexe polielectrolitice datorită caracteristicilor sale biocompatibile și datorită solubilității în apă [256], în timp ce acidul hialuronic, [270] sulfatul de dextran, [271] alginatul, [272] acizii nucleici, [273] și câteva peptide / proteine bogate în acid aspartic și glutamic sunt utilizate ca polielectroliți anionici [274, 275]. În plus, polizaharidele anionice pot forma complexe polielectrolitice cu peptide / proteine încărcate pozitiv, cum ar fi polilizina, care este o peptidă încărcată pozitiv care se combină electrostatic cu alginatul pentru a forma nanoparticule obținute prin complexare polielectrolitică [274].

Interacții hidrofobe

Hidrogelurile, prin definiție, absorb o cantitate mare de apă, iar natura lor hidrofilă face problematică încapsularea și eliberarea medicamentelor hidrofobe. Separarea pe faze între medicamentele hidrofobe încapsulate și hidrogel poate deteriora, de asemenea, stabilitatea și rezistența hidrogelului. Aceste probleme au motivat dezvoltarea de hidrogeluri care conțin polimeri hidrofobi sau componente hidrofobe pentru a servi drept locuri de legare pentru medicamente hidrofobe [276].

Abordările tipice pentru a include domenii hidrofobe în hidrogeluri includ copolimerizarea monomerilor hidrofobi și încorporarea moleculelor hidrofobe (de exemplu, ciclodextrina și colesterolul). Lanțurile alifatice hidrofobe au fost încorporate în peptide care s-au autoasamblat în nanoparticule pentru a forma un sistem pentru eliberarea medicamentelor anticancer hidrofobe [277, 278].

Tiocolesterolul a fost încorporat într-un hidrogelpe bază de alcool polivinil pentru administrarea de medicamente hidrofobe [279].

Cu toate acestea, încorporarea domeniilor hidrofobe poate reduce semnificativ absorbția de apă în hidrogeluri și poate modifica proprietățile fizice și biochimice ale acestora. În acest scop, includerea ciclodextrinelor în hidrogeluri este avantajoasă deoarece nu schimbă hidrofilicitatea generală a hidrogelurilor. Aceste oligozaharide macrociclice conțin atât un caracter hidrofil extern cât și o cavitate hidrofobă interne la care se pot asocia medicamentele hidrofobe. În astfel de sisteme, eliberarea medicamentului este controlată în principal de compartimentarea relativă a medicamentelor solubilizate între hidrogel și mediul de eliberare și este independentă de dimensiunea ochiurilor rețelei de hidrogel [280].

Este esențial să recunoaștem că hidrogelurile oferă adesea numeroase posibilități pentru crearea interacțiunilor cu medicamentele, ceea ce poate permite, să hibridizarea mai multor interacțiuni într-un singur hidrogel [281]. Controlul eliberării medicamentelor prin interacțiuni chimice oferă adesea un grad în plus de libertate în elaborarea sistemelor polimerice. Totuși, acest avantaj potențial trebuie cântărit împotriva problemelor potențiale legate de impactul modificărilor chimice asupra biocompatibilității medicamentului sau hidrogelului. Modificările chimice ale unui medicament în apropierea unui situs activ sau a unei regiuni din vecinătatea unei proteine care determină o schimbare conformațională determinând reducerea efectului medicamentului [282, 283].. De exemplu, unele enzime își pierd bioactivitatea atunci când sunt PEGilate prin intermediul grupării ε-amino din reziduurile de lizină [284].

Metode și tehnici de obținere a sistemelor de eliberare

Sistemele de încapsulare care sunt utilizate în alimente includ lipozomi, coacervate, particule, geluri si complecși de incluziune moleculară [285, 286].

Deși polimerii sunt des utilizați pentru a crea hidrogeluri pentru aplicații farmaceutice și biomedicale, mulți nu sunt permiși în alimente și băuturi. [287].

În locul polimerilor sintetici, polizaharidele și unele proteine alimentare pot fi utilizate pentru a crea hidrogeluri de tip alimentar. Există un număr de tehnici pentru a forma particule de hidrogel. Multe se bazează fie pe ruperea matricei continue de gel pentru a forma particule de hidrogel sau formarea picăturilor dispersate care apoi sunt gelifiate printr-un mecanism specific cum ar fi schimbarea temperaturii (gelifierea prin încălzire sau la rece ), prin adăugarea unei enzime sau prin adăugarea de ioni, cum ar fi calciul [288, 289].

În acord cu Mc Clements principalele metode pentru a crea particule de hidrogel sunt următoarele: ruperea gelului macroscopic, coacervarea simplă, injecția si emulsionarea. În scopul de a elabora sisteme de eliberare potrivite, nutraceuticele și suplimentele nutritive pot fi clasificate în componente hidrofile, lipofile și amfifile și componente care nu sunt solubile nici în ulei nici în apă (ex. probiotice). Cele hidrofile pot fi transportate într-o matrice formată din biopolimeri, în timp ce componentele lipofile sunt în general transportate într-un sistem pe bază de emulsie. [289]

4.1. Metoda extruderii este cea mai utilizată pentru imobilizarea celulelor microbiene și a principiilor active [290-292]. Ea are loc în condiții blânde care permit ca încapsularea să se producă fără a distruge microorganismele [293].

Metoda implică un dispozitiv simplu având unul sau mai multe capilare prin care suspensia cu microorganisme în soluție de polimer este extrudată în picături mici. Producția la scară industrială prin această metodă este dificil de realizat și nepractică chiar dacă s-a încercat îmbunătățirea ei prin introducerea unor dispozitive cu jet de aer și dispozitive vibraționale, deoarece apar probleme operaționale prin blocarea capilarei, apar dificultăți la curățare și probleme sanitare [294, 295].

Particulele obținute prin această metodă sunt de dimensiuni mari, de aproximativ 1 mm în diametru [296, 297].

Microsferele sunt în general preferate pentru încapsularea celulelor microbiene pentru a forma microbioreactoare datorită dimensiunii mici și suprafeței mari raportată la unitatea de volum pentru un transfer de masă eficient [298].

Dispozitive de extrudere cu capilare mai fine pot produce particule mici, dar înfundarea orificiilor este des întâlnită mai ales atunci când se produc particule mai mici de 100 μm [299, 300].

4.2. Metoda emulsiei

O altă tehnică de încapsulare alternativă este procesul de emulsifiere care a fost dezvoltat pentru a preîntâmpina această problemă [301]. Multe studii au pornit de la imobilizarea medicamentelor prin emulsifierea unei soluții apoase ce formează un gel într-o fază nemiscibilă compusă dintr-un solvent organic sau ulei [302]. Prin metoda emulsifierii se obțin microsfere de dimensiuni mici, cu un diametru ce variază de la câțiva microni la aproape 1 mm. Polidispersitatea dimensională este largă în comparație cu a particulelor produse prin metoda extruderii [303].

Emulsionarea se realizează, de regulă, într-un vas unde soluția cu materialul de încapsulat și polimerul sunt dispersate într-o fază organică nemiscibilă, prin utilizarea unui rotor de viteză mare. [302]. Picăturile dispersate sunt stabilizate prin adăugarea unui amestec de surfactanți [304]. Microsferele sunt formate prin gelifierea picăturilor folosind diferite metode care depind de natura polimerului. Microîncapsularea prin emulsionare necesită un control strict al unor parametri cum ar fi concentrația de polimer, tipul și cantitatea de surfactanți [305]. Dimensiunea picăturilor dispersate prin emulsionare va determina dimensiunea microsferelor produse. Pe lângă surfactanți, dimensiunea particulelor este influențată de viteza de agitare și de vâscozitatea soluției de polimer [302]. Caracteristicile microsferelor sunt influențate de structura chimică și de masa moleculară a polimerului utilizat pentru imobilizarea celulelor microbiene.

4.3. Coacervarea soluțiilor polimerice

Coacervarea este o metodă fizico-chimică de microîncapsulare. Termenul de coacervare provine de la cuvântul latin cuacervus care înseamnă gramadă sau teanc. Coacervarea reprezintă procesul de formare a unor agregate macromoleculare ca urmare a separării de fază ce are loc într-o soluție omogenă de polimer, la adăugarea unui nesolvent.

Coacervarea este de două tipuri:

► coacervarea simplă

► coacervarea complexă

4.3.1. Coacervarea simplă are loc ca rezultat al interacțiunii dintre soluția unui polimer și a substanței micromoleculare (medicamentoase).

Coacervarea prin interacțiunea dintre doi polimeri se numește compusă sau complexă.

În prezent procedeul coacervării compușilor macromoleculari este considerat ca formarea unui sistem bifazic în urma stratificării.

În coacervarea simplă, coacervatele se obțin prin adăugarea unui agent de coacervare peste o dispersie apoasă a unui biopolimer. Agentul de coacervare acționează ca un nesolvent pentru biopolimer.Coacervatele formate se absorb la suprafata picăturilor de ulei în care se află componentul activ. Pentru formarea peretelui microcapsulei se adaugă un agent de reticulare (aldehida glutarica, taninuri, etc). Prin coacervare simplă se pot încapsula substanțe medicamentoase solide, insolubile în apa (sulfanilamide, antibiotice etc).

4.3.2. Coacervarea complexă se referă la separarea fazelor de un precipitat lichid, sau faza în care soluțiile a doi coloizi hidrofili sunt amestecate în condiții adecvate. Ea se poate aplica la o arie foarte largă de componente: compuși de aromă,vitamine, fitosteroli, coloranți, substanțe medicamentoase, etc. Prin coacervarea complexă se obțin microcapsule simple, mononucleare, cu diametrul de 30 – 800 μm și un conținut de substanță încapsulată de 80 – 90 %. Păstrate în condiții de umiditate de peste 70 % capsulele se umflă și permit eliberarea substanței încapsulate.

Coacervarea compusă este însoțită de acțiunea dintre incărcăturile pozitive și negative a doi polimeri și este inițiată de obicei de schimbul de pH.

Un coacervat este o picatură mică,sferică, de molecule organice care sunt deținute impreună de forțele hidrofobe de la un lichid care le inconjoară.

Coacervatul reprezintă un ansamblu de molecule mari, cum ar fi proteinele, lipidele, acizii nucleici care formează o unitate coloidală stabilă cu proprietați care seamănă cu materia vie. Multe sunt acoperite cu o membrană lipidică și conțin enzime care sunt capabile de conversie pentru substanțe ca glucoza, în molecule mai complexe, cum ar fi amidonul. Coacervatele au mărimi cuprinse între 1 și peste 100 micrometri, au proprietăți osmotice și se formează în mod spontan de la anumite soluții organice diluate [305, 306].

Complexul de coacervare implică separarea unei soluții compusă din cel puțin două macromolecule în două faze nemiscibile: o fază bogată în ambele macromolecule și o altă fază constând într-o fază de echilibru. Cele două macromolecule implicate în complexul de coacervare sunt în general de sarcini opuse ( spre exemplu o proteină și o polizaharidă). În funcție de puterea de interacțiune dintre cele două macromolecule ar putea apare coacervarea sau precipitarea. Precipitarea apare atunci când polielectroliți puternici interacționează. Precipitatele sunt complecși destul de denși, care tind să se separe din soluție sub formă solidă [307, 308].

Structura coacervatelor în comparație cu precipitatele este mai ordonată și sunt mai puțin predispuse la agregare și sedimentare. Pentru aceste motive, coacervarea este de obicei preferată în locul precipitării pentru încapsularea ingredientelor bioactive. Pentru încapsularea substanțelor active uleioase în interiorul coacervatelor și pentru a forma particule de biopolimeri care conțin componenti bioactivi lipidici, în primul rând uleiul este dispersat într-o soluție de doi polielectroliți care au abilitatea de a forma coacervate. Condițiile ( temperatură, pH, viteză de agitare etc) sunt ajustate astfel încât coacervarea să fie favorizată și uleiul dispersat să fie încapsulat în interiorul noilor complexe formate. Pentru a obține o încapsulare maximă pH-ul trebuie ajustat la o valoare optimă.

Coacervatele disociază și se rup în momentul ajustării pH-ului sau atunci când tăria ionică este reglată; coacervatele sunt, de asemenea, susceptbile la fuziune. Pentru a îmbunătăți stabilitatea coacervatelor unul sau ambii polielectroliți prezenți trebuie să fie reticulați chimic, enzimatic sau printr-un tratament termic [289, 308].

4.4. Uscarea prin pulverizare este cea mai utilizată metodă în industrie pentru formarea particulelor. Este un proces rapid într-un singur pas utilizând un pulverizator pentru uscare. Este o metodă potrivită pentru o gamă largă de aplicații în diferite industrii cum ar fi cele biomedicale, alimentare și farmaceutice.

Studiile au arătat că metoda de uscare prin pulverizare poate fi aplicată pentru a încapsula medicamente [309], proteine [310], celule de drojdie și alte microorganisme [311].

Uscarea prin pulverizare a fost, de asemenea, utilizată pentru acoperirea materialelor magnetice utilizate în aplicații terapeutice [312] și obținerea de microparticule încărcate cu medicament pentru eliberare controlată.

Procesul de uscare prin pulverizare începe cu atomizarea lichidului de alimentare pentru a forma picături fine în camera de uscare. Picăturile pot fi produse prin utilizarea diferitelor tipuri de atomizoare rotative sau tip duză. Picăturile sunt uscate prin evaporarea umidității, prin adăugarea de aer fierbinte în camera de uscare cu controlul temperaturii și a debitului de aer. Picăturile fine au o suprafață specifică mare care facilitează uscarea rapidă.

Particulele fine produse sunt evacuate continuu din camera de uscare și colectate prin intermediul unui ciclon sau a unui sac de filtrare.

.

REZULTATE ORIGINALE

Obiective

Obiectivul principal al tezei îl constituie obținerea unor sisteme micro/nanoparticulate cu caracter de hidrogel, pe bază de polizaharide reticulate ionic și complexate polielectrolitic, destinate imobilizării de polifenoli cu potențiale aplicații biomedicale.

Realizarea obiectivului principal a presupus îndeplinirea mai multor obiective specifice, precizate în cele ce urmează.

Elaborarea unei metode de includere a curcuminei in micro/nanoparticule de chitosan reticulate ionic cu Na2S04 pentru a îmbunătăți stabilitatea și biodisponibilitatea principiului activ.

Elaborarea unei metode de obținere a microparticulelor complexe pe bază de gelan sau gelan în amestec cu caragenan cu micronanoparticulele de chitosan cu curcumină imobilizată prin metoda gelifierii ionice și a complexării polielectrolitice destinate administrării pe cale orală și eliberării curcuminei în colon pentru a trata boala inflamatorie intestinală.

Caracterizarea fizico-chimică a sistemelor de eliberare obținute prin spectroscopie FT-IR, difractometrie laser, microscopie electronica de baleiaj, cinetica gradului de umflare.

Testarea activității antioxidante a curcuminei libere și a curcuminei imobilizate în particulele de polizaharide.

Studiul procesului de eliberare in vitro a curcuminei din particulele de polizaharide

MATERIALE, TEHNICI EXPERIMENTALE, METODE DE CARACTERIZARE

În acest capitol vor fi prezentate materialele care au stat la baza microparticulelor de hydrogel pe bază de polizaharide cu curcumină imobilizată cu aplicații biomedicale, al tehnicilor experimentale precum și al metodelor de caracterizare utilizate.

Materiale

Biopolimeri utilizați în obținerea microparticulelor de hidrogel pe bază de polizaharide cu curcumină imobilizată

Pentru obținerea microparticulelor de hidrogel cu curcumină imobilizată au fost utilizate trei polizaharide gelanul, i-caragenanul și chitosanul. Aceste polizaharide au fost selectate datorită lipsei de toxicitate, sunt biocompatibile, pot forma ușor geluri în prezența ionilor multivalenți și complexe polielectrolitice. În plus, utilizarea gelanului are ca scop obținerea particulelor gastrorezistente deoarece acesta este rezistent la pH și la diferite enzime prezente în mediul gastric și intestinal dar se degradează în prezența unei enzime prezente în colon-galactomanans.

Gelanul este un biopolimer anionic liniar cu secvențe de tetrazaharide care se repeat formate din două reziduuri de β-D-glucoză, un reziduu de acid β-D-glucuronic și unul de α- L-ramnoză într-un raport 2:1:1. Structura chimică a gelanului este prezentată în figura 4. Gelanul deacetilat utilizat pentru obținerea particulelor de hidrogel a fost procurat de la Kelkogel și are masa moleculară cuprinsă între 2-3 × 105 Da.

I-Caragenanul aparține familiei de galactani hidrofili liniari sulfatați cu o masa moleculară mare, fiind format din unități alternante de D-galactopiranoză și 3,6 anhidro-galactoză (3,6-AG) unite prin legături alternante de α-1,3 și β-1,4- glicozidice. Structura i-caragenanului este prezentată în figura 9(b). I-caragenan (Car), conține 2 grupari –HOSO3- /mol (464 Da). A fost procurat de la Sigma Aldrich.

Chitosanul reprezintă produsul principalul obținut prin procedeul de deacetilare alcalină a chitinei și este un polimer cationic liniar natural semi-cristalin, policationic, cu structură liniară, compus din unități (1→4)-2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucan (N-acetil-D-glucozamină) și (1→4)-2-amino-2-deoxi-β-D-glucan (D-glucozamină) [354]. Structura chitosanului este prezentată în figura 8(b). Chitosanul utilizat este procurat de la Sigma Aldrich, are o masă moleculară medie și un grad de deacetilare de 75% fiind procurat de la Sigma Aldrich.

Agenții de reticulare utilizați:

Acetat de magneziu tetrahidrat: M=214.45 g/mol, Procurat de la Sigma Aldrich Figura

Fig. Structura acetatului de magneziu

Sulfatul de sodiu: Na2SO4, M=142,04 g/mol, procurat de la Sigma Aldrich Figura 14:

Fig. Structura chimică a sulfatului de sodiu

Compuși biologic activi utilizați pentru imobilizare:

Curcumina este un compus activ extras din planta Curcuma longa și se găsește într-un amestec de curcuminoizi, curcumina. demetoxicurcumina, bisdemetoxicurcumina și curcumina cicclică. Curcumina este componentul majoritar și poate fi intâlnită în două forme tautomere. Are formula chimică C21H20O6 și masa moleculară, M=368,38 g/mol. Structura sa chimică este prezentată în figura 1. Curcumina a fost procurată de le Sigma Aldrich.

Alte materiale utilizate

Albumina serică bovină are masa moleculară de aproximativ 66 kDa. A fost achiziționată sub formă de pudră de la Sigma Aldrich. Este utilizată pentru determinarea adsorbției de proteine prin metoda Lowry.

Tween 20 este un tensioactiv non-ionic cu masa moleculară 1228g/mol și balanța hidrofil-lipofil de 16.7. A fost utilizat pentru stabilizarea emulsiilor și pentru a crește solubilitatea curcuminei în medii apoase. A fost procurat de la Sigma Aldrich.

Fig. Structura chimică pentru polietilen glicol sorbitan monolaurat

Fosfat disodic, Na2HPO4·12H2O, M = 358.14 g/mol, Chemical Company.

Fosfat monosodic, NaH2PO4·2H2O, M = 156.02 g/mol, Chemical Company.

Acetat de sodiu, M= 82.0343g/mol, Chemical Company

Reactiv Folin Ciocâlteu  NaOH, M=40 g/mol

CuSO4

Tartrat dublu de sodiu și potasiu

DPPH utilizat pentru determinarea activității antioxidante

Na2CO3

Solvenți

Apă bidistilată produsă în laboratoarele proprii;

Alcool etilic C2H5-OH, M= 46.07g/mol, achiziționat de la Chemical Company

Acid acetic glacial, M=60.05 g/mol, Chemical Company.

Tehnici experimentale

In acest subcapitol sunt prezentate toate tehnicile de caracterizare pentru particulele de hidrogel pe bază de curcumină obținute.

Prepararea microparticulelor de hidrogel conținând curcumină imobilizată în matrici de polizaharide

Metoda se bazează, pe formarea unui complex polielectrolitic fiind prezentată schematic în figura , si presupune parcurgerea a două etape pentru obținerea microparticulelor.

Fig. Prezentarea metodei de preparare a microparticulelor de gelan ce conțin micro/nanoparticule de chitosan cu curcumină imobilizată

În prima etapă, au fost preparate particulele de chitosan cu curcumină imobilizată astfel: se prepară o soluție obținută din 40 ml chitosan de concentrație 0.05% în acid acetic 0.06 M și 16 ml soluție de Na2SO4 de concentrație 0.1 %. Soluția de agent de reticulare ionic (Na2SO4 de concentrație 0.1%) a fost adăugată peste soluția de chitosan. Apoi, 200 mg de curcumină au fost dizolvate în 20 ml de etanol absolut sub agitare și soluția de curcumină obținută a fost adăugată în picături în soluția de chitosan preparată anterior, în timpul ultrasonicării (utilizînd o sondă cu ultrasunete Sonics and Materials sonicator, Vibra Cell). Au fost utilizate diferite durate de ultrasonicare: 4 minute, 8 minute și 12 minute pentru a obține diferite dimensiuni ale particulelor de chitosan cu curcumină imobilizată.

Suspensia obținută conținând microparticule de chitosan de diferite dimensiuni încărcate cu curcumină a fost menținută la temperatura de 40 °C pe o baie de ultrasunete timp de 1 oră pentru evaporarea alcoolului și pentru a dispersa micro / nanoparticulele formate iar apoi a fost menținută la aceeași temperatură pe o plită magnetică (250 rpm) până când etanolul a fost complet evaporat. Particulele de chitosan cu curcumină imobilizată au fost separate prin centrifugare, au fost spălate de trei ori cu apă bidistilată iar apoi au fost resuspendate în 100 ml apă bidistilată. Dacă suspensia cu nanoparticule nu este utilizată imediat, aceasta se poate păstra la 4⁰C, la întuneric în recipiente închise.

În a doua etapă, gelanul sau gelan în amestec cu 10%, 20% sau 30% i-carrageenan a fost dizolvat în 20 ml apă bi-distilată la 80 ° C pentru a obține o soluție de polimer de concentrație de 2%. Soluția a fost răcită la 40 °C iar apoi au fost adăugat un volum de 20 ml din suspensia de particule de chitosan încărcate cu curcumină (preparate în etapa anterioară) în picături, sub agitare puternică (6000 rpm) folosind un omogenizator Ultraturrax. Această suspensie a fost apoi extrusă cu ajutorul unei seringi și a unui ac cu dimensiunea de 23 Gauge în 100 ml soluție de acetat de magneziu de diferite concentrații. În aceste condiții, are loc atât formarea instantanee a complexului polielectrolitic la suprafața particulelor de chitosan care conțin curcumină, cât și reticularea ionică a gelanului (sau a amestecului gellan / i-carragenan). Particulele complexe obținute au fost păstrate timp de 3 ore în soluția de reticulare pentru stabilizare și apoi au fost separate prin filtrare, uscate la 25 °C (temperatura camerei) pe hârtie de filtru, în vase Petri iar apoi au fost depozitate în recipiente bine închise, la temperatura de 4 °C, la întuneric până când vor fi efectuate alte caracterizări. Codificarea probelor, programul experimental utilizat și eficiența de încapsulare a curcuminei în particulele complexe obținute sunt prezentate în tabelul 1.

Tabel 1. Programul exeperimental și eficiența de încapsulare

* Compoziția particulelor complexe de polizaharide a fost: 89% gelan și 11% chitosan; volumul soluției de acetat de magneziu a fost de 100 ml.

** Compoziția particulelor complexe de polizaharide a fost: 26.7% i-caragenan, 62.3% gelan și 11% chitosan; volumul soluției de acetat de magneziu a fost de 100 ml.

*** Compoziția particulelor complexe de polizaharide a fost: 17.8% i-caragenan, 71.2% gelan și 11% chitosan; volumul soluției de acetat de magneziu a fost de 100 ml.

**** Compoziția particulelor complexe de polizaharide a fost: 8.9% i-caragenan, 80.1% gelan și 11% chitosan; volumul soluției de acetat de magneziu a fost de 100 ml.

Tehnici de caracterizare

Spectroscopia FT-IR

Spectrele FT-IR au fost înregistrate pentru curcumina liberă, chitosan, gelan, particulele de chitosan cu curcumină imobilizată, precum și pentru particulele complexe obtinute de gelan sau gelan în amestec cu diferite concentrații de i-caragenan în care curcumina a fost imobilizată. Spectrele au fost înregistrate pe un spectrofotometru Bruker Vertex FT-IR pe un interval de frecvență de 4.000-400 cm-1 la o rezoluție de 2 cm-1.

Fig.. Spectrofotometru FT-IR VERTEX 70v

Analiza dimensiunii particulelor prin difractometrie laser

Diametrul mediu al particulelor de chitosan cu curcumina imobilizată și distribuția lor dimensională a fost analizată prin difractometrie laser utilizând difractometrul SHIMADZU-SALD 7001. Măsurătorile au fost efectuate pentru suspensiile de micro / nanoparticule de chitosan în apă bi-distilată după 24 de ore de la preparare. Suspensiile au fost sonicate înainte de măsurători pe o baie de sonicare Bandeli Sonorex timp de 10 minute la temperatura camerei. Precizia rezultatelor a fost asigurată, de asemenea, prin sistemul propriu de agitare din celula de măsurare a dispozitivului, care menține particulele în suspensie, precum și prin efectuarea mai multor determinări consecutive. Au fost efectuate trei determinări pentru fiecare probă.

Microscopie electronică de scanare (SEM)

Particulele complexe încărcate cu curcumină au fost caracterizate prin microscopie electronică de baleiaj (SEM) pentru a determina morfologia lor și pentru a demonstra că particulele de chitosan încărcate cu curcumină au fost imobilizate în matricea gelan sau gelan / i-caragenan. Particulele complexe au fost uscate, tăiate în secțiune, metalizate cu aur folosind un dispozitiv de pulverizare catodică și au fost analizate utilizînd un instrument Vega Tescan (Fig.).

Fig. Microscop electronic de baleiaj tip Vega Tescan

Gradul de umflare

Particulele complexe obținute au un caracter hidrogel, de aceea s-a considerat util să se determine capacitatea lor de reținere a apei – de obicei cuantificată prin gradul de umflare (Q,%). Această caracteristică este esențială, deoarece apa determină creșterea dimensiunii ochiurilor rețelei formate pe de o parte prin gelifierea ionotropă a chitosanului cu sulfat de sodiu și pe de altă parte a matricei de gelan sau gelan / i-caragenan cu ioni de magneziu. Acestă caracteristică este foarte importantă, deoarece ea determină difuzia mai mult sau mai puțin intensă a curcuminei din matricea de hidrogel. Pentru particulele complexe obținute valorile Q (%) au fost determinate gravimetric.

Au fost utilizate trei soluții, care simulează fluidele fiziologice: soluție tampon fosfat (PBS) la pH = 6.8 (simularea lichidului intestinal) și la pH = 7.4 (simularea pH-ului sângelui sau pH-ului fluidului din colon) și o soluție care simulează lichidul gastric la pH = 2, care a fost obținut din acid clorhidric 0.1 N, NaCl 10 mM și apă bi-distilată.

O cantitate precis cântărită (0.05 g) de particule complexe uscate (Mdry) a fost imersată în 5 ml de agent de umflare, la 37 °C. Periodic, agentul de umflare a fost îndepărtat prin filtrare și suprafața particulelor a fost tamponată cu hârtie de filtru pentru a îndepărta excesul de soluție. Greutatea particulelor complexe umflate (Mswollen) a fost determinată. Cantitatea de agent de umflare reținut de particulele complexe de hidrogel (agentul Mswelling) a fost diferența dintre greutatea particulelor complexe umflate (Mswollen) și cea a particulelor complexe uscate (Mdry). După cântărire, probele au fost reintroduse în agentul de umflare utilizat (întotdeauna 5 ml) și operația a fost repetată până la atingerea echilibrului. Gradul de umflare a fost exprimat ca raportul dintre cantitatea de agent de umflare prezent în particulele complexe la fiecare interval de timp și cantitatea de particule complexe complet uscate (ecuația 1).

Determinarea gradului de umflare s-a efectuat în triplicat. Datele sunt prezentate ca valoarea medie ± intervalul de confidență de 95%.

Eficiența de încapsulare

Curba de calibrare a curcuminei în etanol a fost traasată utilizând soluții cu concentrații cuprinse între 1 și 5 μg/ml. Absorbanța acestor soluții a fost înregistrată cu un spectrofotometru BOECO-S22, UV-Vis la lungimea de undă de 425 nm (Figura).

Fig. Curba de calibrarea (etalonare) a curcuminei în etanol

Curcumina a fost extrasă în etanol (V = 10 ml) dintr-o cantitate cunoscută de particule complexe. Pe baza curbei de calibrare, a fost determinată cantitatea de curcumină din probe. În acest caz, eficiența încapsulării a fost:

Ei (%) = mcf / mi x 100 (2)

Unde mcf este cantitatea de curcumină din particulele complexe determinată spectrofotometric și mi este cantitatea inițială de curcumină. Au fost efectuate trei determinări pentru fiecare probă, iar erorile au fost de ± 3%.

Determinarea activității antioxidante (articol 2)

Metoda cu unele modificări a fost descrisă anterior de L. L. Mensor și colab., 2001 [313] și de C. W. Choi și colab., 2002 [314]

Soluția stoc de curcumină a fost preparată prin dizolvarea a 25 mg de curcumină în 50 ml de metanol. Pentru testarea activității antioxidante au efectuate mai multe diluții iar concentrațiile finale ale soluției de curcumină au fost: 10, 40, 60, 80, 100, 150, 200 și 250 μg / ml. În eprubete au fost adăugat 1 ml din fiecare concentrație de probă. Peste soluția de curcumină din eprubete s-au adăugat 3 ml soluție DPPH de concentrație 0.1 mM. Probele astfel preparate au fost vortexate timp de 20-30 de secunde. Absorbanța probelor a fost citită după 40 de minute cu ajutorul unui spectrofotometru UV la o lungime de undă de 515 nm. Acidul ascorbic a fost utilizat ca standard. Valorile absorbanței au fost transformate în procent de activitate antioxidantă (procentul de inhibare a radicalilor liberi din DPPH) folosind următoarea formulă:

IC 50 va fi calculat din graficul I% vs. Concentratie si reprezintă concentrația probei care poate capta 50% din radicalii liberi din DPPH.

Pentru calibrarea spectrofotometrului s-a utilizat metanol. As reprezintă valoarea absorbanței soluțiilor de diferite concentrații care conțin 3 ml soluție DPPH. Ca și blank (Ab) s-a utilizat o soluție preparată din 3 ml metanol și 1 ml din soluțiile de curcumină de diferite concentrații (absorbanța blankului a fost măsurată pentru fiecare concentrație). Soluția pentru control a fost preparată utilizând 3 ml soluție DPPH și 1 ml metanol. Determinările au fost efectuate la temperatura camerei.

Pentru determinarea activității antioxidante a curcuminei încorporate in particulele complexe au fost utilizate probe iradiate cu UVA la 365 nm pentru 30 minute și neiradiate UV. Curcumina din particule a fost extrasă în metanol. Practic o cantitate cunoscută de particule a fost imersată în 25 ml metanol și au fost menținute sub agitare, în pahare Ernemeyer, pe o baie de apă la temperatura de 37⁰C pentru 24 h in recipiente inchise, la la întuneric. Cantitatea de curcumină extrasă din probe a fost determinată spectrofotometric pe baza curbei de calibrare. Dupa determinarea cantității de curcumină din fiecare probă, au fost efectuate diferite diluții, concentrațiile finale ale soluțiilor de analizat fiind 10, 40, 60, 80, 100, 150, 200 și 250 μg / ml (ca și la curcumina liberă). A fost determinat procentul de inhibare a radicalilor liberi din DPPH (metoda descrisă anterior) și pe baza rezultatelor obținute, a fost calculat IC50 atât pentru curcumina extrasă din particule iradiate UV, cât și pentru curcumina extrasă din particule neiradiate. Toate determinările au efectuate în triplicat.

Adsorbția de proteine

A fost studiată în trei medii de pH diferit: pH = 2 (soluție preparată folosind NaCl 10mM și HCl 0.1 N simulând pH-ul mediului gastric), PBS la pH = 6.8 (specific pentru mediul intestinal) și pH = 7.4 (specific pentru sânge și fluidele din colon). Proteina folosită ca model a fost albumina serică bovină (BSA). Au fost preparate trei soluții de BSA cu o concentrație de 4 mg/ml prin dizolvarea la temperatura camerei sub agitare ușoară a 100 mg BSA într-un volum de 25 ml soluție de diferite pH-uri. O cantitate cunoscută de particule complexe au fost imersate într-un ml soluție de BSA. Recipientele care conțin soluția de BSA împreuna cu probele au fost acoperite și menținute la 37 °C timp de 2 ore iar apoi particulele au fost separate prin filtrare și spălate de trei ori cu apă bidistilată. Soluția de BSA a fost amestecată cu apa de spălare a particulelor, a fost determinat volumul total al soluției și pe baza curbei de calibrare, cantitatea de BSA din soluție a fost determinată spectrofotometric, utilizând metoda Lowry la o lungime de undă de 660 nm. Cantitatea de proteină adsorbită de particule a fost calculată ca diferența dintre cantitatea inițială de proteină din soluția de BSA și cantitatea de proteină determinată prin metoda Lowry, după efectuarea testului.

Rezultatele au fost exprimate în mg de albumină adsorbită / g particule și în eficiența de adsorbție (AE%).

AE% = (Cantitatea totală de BSA adsorbită) / (Cantitatea inițială de BSA dintr-un ml soluție) × 100 (3)

Toate determinările au fost făcute în triplicat, rezultatele reprezentând valoarea medie a adsorbției de proteine .

Cinetica de eliberare a curcuminei din particulele complexe

A fost studiată în trei medii de pH diferite, cum ar fi PBS (pH = 7.4 specific sângelui și fluidelor din colon, pH = 6.8 specific mediului intestinal) și pH = 2 (soluție preparată din NaCl 10 mM și HCl 0,1 N, simulând pH în mediul gastric). În acest studiu, o cantitate cunoscută de particule complexe uscate a fost imersată în 20 ml de soluție la pH = 7.4, pH = 6.8 sau pH = 2 sub agitare ușoară (150 rot/min) la 37 °C, la întuneric, în recipiente închise și cantitatea de curcumină eliberată a fost determinată la o lungime de undă de 425 nm (BOECO-S22, spectrofotometru UV-Vis).

Deoarece curcumina este o substanță hidrofobă și este foarte puțin solubilă în medii apoase, a fost adăugat 1% Tween 20 în soluția în care se realizează cinetica de eliberare [315]. Pe baza curbelor de calibrare a curcuminei libere în soluții la pH = 7.4, pH = 6.8 și pH = 2 care conțin 1% Tween 20, a fost determinată periodic cantitatea de curcumină din mediul de eliberare.

Ecuațiile acestor curbe au fost următoarele:

-pentru curba de calibrare a curcuminei la pH = 7.4: y = 0.1201x (R2 = 0.9987)

-pentru curba de calibrare a curcuminei la pH = 2: y = 0.0856x (R2 = 0.999).

-pentru curba de calibrare a curcuminei la pH = 6.8: y = 0,1089x (R2 = 0.9977)

Pentru a determina dacă cea mai mare cantitate de curcumină din particulele complexe ar putea fi eliberată în mediul din colon la pH = 7.4, s-a studiat și cinetica de eliberare cu aceleași probe în medii de pH diferit: timp de 2 ore la pH = 2, apoi timp de 3 ore la pH = 6.8 și după 4 ore la pH = 7.4. Pentru această analiză, o anumită cantitate de particule complexe uscate a fost cântărită și apoi imersată în mediul de eliberare la pH = 2 timp de 2 ore. După 2 ore, probele au fost filtrate, spălate de trei ori cu apă bi-distilată și apoi imersate în mediul de eliberare la pH = 6.8 timp de 3 ore și în final la pH = 7.4 timp de 4 ore. Periodic a fost determinată cantitatea de curcumină eliberată la fiecare valoare a pH-ului. Determinarea eficiența de eliberare a curcuminei din particule a fost efectuată în triplicat. Datele sunt date ca valoare medie ± interval de confidență de 95%.

(b)

(c)

Fig. Curbele de calibrare a curcuminei în soluții de pH diferit la (a) pH = 2, (b) pH = 6.8 și (c) pH = 7.4

Capitol

Particule complexe pe bază de polizaharide cu curcumină imobilizată. Obținerea și caracterizarea fizico-chimică a particulelor.

Curcumina, (1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione, cu formula chimică C21H20O6 și masa moleculară de 368.38 g/mol, este un compus extras din Curcuma Longa (turmeric) cu beneficii foarte importante pentru organismul uman. Depinzând de originea sa și de condițiile solului unde a crescut, turmeric conține între 2-9 % curcuminoizi – un grup de compuși ce includ curcumina (component major), demetoxicurcumina, bis-demetoxicurcumina și curcumina ciclică (component minor) [9, 316].

Efectele sale farmacologice au fost evidențiate de numeroase cercetări, care au subliniat acțiunea sa în prevenția și tratarea unor boli cronice cum ar fi artrita, cancerul, depresia și bolile neurovegetative [30, 31, 317-323]. Au fost raportate mai mult de 100 de ținte terapeutice iar numărul și diversitatea efectelor biologice ale curcuminei este foarte mare variind de la antiinflamator, antioxidant, antiviral la efectele antitumorale [324]

Boala Crohn și colita ulcerativă, cunoscută colectiv ca boală inflamatorie a intestinului, sunt caracterizate de inflamația cronică a tractului gastrointestinal. Cea mai mare prevalență a bolii raportată în 2017 în Europa a fost în Norvegia (505 cazuri de colită ulcerativă la 100 000 de persoane), în Germania (322 cazuri de boală Crohn la 100 000 de persoane) și în America de Nord în SUA (286 cazuri de ulcerative colită la 100000 persoane), precum și în Canada (319 cazuri de boală Crohn la 100 000 de persoane) [325]. Scopul tratamentului bolilor inflamatorii intestinale cronice este de a reduce inflamația care declanșează semnele și simptomele. În cele mai bune cazuri, acest lucru poate duce nu numai la ameliorarea simptomelor, ci și inducerea și menținerea remisiei pe termen lung ceea ce determină riscuri reduse de complicații. Tratamentul IBD implică, de obicei, fie terapie medicamentoasă, fie chirurgie.

În prezent nu exista strategii terapeutice capabile să modifice semnificativ prognosticul bolii inflamatorii de colon. Terapia nutriționala deține posibilități interesante pentru tratament iar curcumina a câștigat interes datorită acțiunii sale farmacologice și proprietaților sale. Principalul mecanism, prin care curcumina mediază aceste efecte este legată de suprimarea factorului nuclear Kappa-light-chain-enhancer (NF-KB). În plus, activitatea curcuminei include suprimarea interleukinei 1 (IL-1) și a factorului necrozei tumorale alfa (TNF-α) doua cytokine importante în reglarea răspunsurilor inflamatorii. Pentru aceste activități importante, curcumina este considerată un tratament potențial în boala inflamatorie intestinală [4, 5].

Marele dezavantaj al curcuminei îl constituie insolubilitatea în apă și biodisponibilitatea scăzută în celule [11]. Atenuarea sau eliminarea acestor dezavantaje a fost încercată prin realizarea de formulări pe bază de micele, lipozomi, nanoparticule, complexe, emulsii [80, 81] Matricile polimere pot proteja curcumina de condițiile de mediu adverse, imbunatatesc timpul de înjumătățire al compusului bioactiv crescand astfel biodisponibilitatea sa atât in vitro cât și in vivo [82].

Printre polizaharidele utilizate în scopul obținerii de imobilizate ale curcuminei, având un rol protector dar si de transport si eliberare controlata a principiului activ se număra chitosanul, gelanul și i-caragenanul.

Chitosanul este un polimer cationic liniar natural semi-cristalin, obținut prin procedeul de deacetilare alcalină a chitinei, fiind compus din unități (1→4)-2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucan (N-acetil-D-glucozamină) și (1→4)-2-amino-2-deoxi-β-D-glucan (D-glucozamină) [326, 327]. Studii anterioare au arătat că prin imobilizarea curcuminei în microparticule de chitosan reticulate cu TPP, stabilitatea, concentrația plasmatică, si biodisponibilitatea curcuminei au crescut [328-330]. Un alt studiu prezintă încapsularea curcuminei în nanoparticule de chitosan care au fost complexate polielectrolitic prin adăugarea lor într-o matrice formată dintr-un amestec de alginat și caragenan, ce a dus la cresterea biodisponibilității compusului bioactiv [331]. Nanoparticulele au eliberat 95% curcumină în 7 ore iar eficiența procesului a depins de raportul dintre polimeri (de cantitatea de caragenan din particule). Au fost formulate cu succes si alte nanoparticule de chitosan conținând curcumină, cu proprietăți mucoadezive, care au avut ca țintă de eliberare colonul. Grupările aminice din chitosan sunt deprotonate in pH alcalin și, prin urmare, este puțin probabil să exercite pe deplin funcționalitatea mucoadezivă pe baza interacțiunilor electrostatice. Cu toate acestea, nanoparticulele încărcate cu curcumină au demonstrat mucoadezivitate semnificativă, ceea ce indică faptul că curcumina contribuie probabil la acest efect, studiul demonstrand că nanoparticulele de chitosan cu curcumină imobilizată au potențial de eliberare în colon [332].

Gelanul este un biopolimer anionic liniar cu secvențe de tetrazaharide care se repetă formate din două reziduuri de β-D-glucoză, un reziduu de acid β-D-glucuronic și unul de α-L-ramnoză într-un raport 2:1:1 [164]. Administrarea ingredientelor pe bază de proteine se face pe cale orală. Acestea au o capacitate redusă de a trece peste bariera intestinală epitelială deoarece sunt sensibile la enzimele din tractul gastrointestinal [333, 334] Sistemele polimerice pot proteja proteinele de aceste enzime. Astfel, absorbția proteinelor și a peptidelor va avea loc în colon și nu în segmentele anterioare ale tractului digestiv [335]. Gelanul este rezistent la enzime cum sunt pectinaza, amilaza, celulaza, papaina și lipaza [336]. O degradare semnificativă se produce în prezența galactomanazei (galactomannanas), ceea ce facilitează eliberarea componenților bioactivi din sistemul polimeric în fluidele din colon [337, 338].

Fei Yang și colab. (2013) au preparat și evaluat particulele sferice obținute din chitosan și gelan prin gelifiere ionotropă și complexare polielectrolitică pentru încapsularea și eliberarea controlată a proteinelor, utilizând clorura de calciu ca agent de reticulare. Albumina a fost încorporată în particulele obținute cu o eficiență ce variază între 65-85%. Eficiența în încapsulare și viteza de eliberare a proteinei depinde de concentrațiile de chitosan, calciu și gelan. Concentrații mai mari de gelan combinate cu uscarea la vid încetinesc eliberarea rapidă a proteinei la pH=1.2, dar se obține o eliberare susținută la pH= 6.8; o eliberare eficientă este observată la pH=7 [339]. Particule de gelan și pectină reticulate cu AlCl3 au fost preparate pentru imobilizarea și eliberarea în colon a resveratrolului. Eficiența în imobilizare a fost de 76% iar cinetica de eliberare a arătat că cea mai mare cantitate de component bioactiv a fost eliberat la pH 6.8 [315].

I-Caragenanul aparține familiei de galactani hidrofili liniari sulfatați cu o masă moleculară mare, fiind format din unități alternante de D-galactopiranoză și 3,6-anhidro-galactoză (3,6-AG) unite prin legături alternante de α-1,3 și β-1,4-glicozidice [251]. Proprietățile caragenanilor sunt influențate în principal de numărul și poziția grupelor de ester sulfat și, de asemenea, de conținutul de 3,6-anhidro-galactoză (3,6-AG). Conținutul de grupe ester-sulfat pentru kappa-caragenan este în jur de 25-30% și 28-35% grupe 3,6-anhidro-galactoză, iotta-caragenan conține grupe sulfat în jur de 28-30% și 25-30 % grupe 3,6-anhidro-galactoză, iar lambda-caragenan conține grupe ester-sulfat în jur de 32-39 % și nu conține nici o grupă 3,6-anhidro-galactoză [252]. Stabilitatea caragenanului in solutii acide este mai scăzută, astfel încat pentru aplicațiile practice este de dorit evitarea prelucrării soluțiilor lor la pH mai puternic acid și temperaturi ridicate pe o perioadă mai îndelungată de timp [253]. Au fost obținute particule care răspund la pH preparate prin complexare polielectrolitică cu caragenan și chitosan pentru eliberarea albuminei și administrarea acestora pe cale orală. O eficiență crescută în eliberare a avut loc la pH 7.5 [340]

Scopul prezentei lucrari il constiutuie prepararea unor noi formulări prin imobilizarea curcuminei în particule de polizaharide pentru a-i crește stabilitatea și biodisponibilitatea. Polizaharidele au fost reticulate ionic cu acetat de magneziu (în cazul gelanului și a i-caragenanului) și cu sulfat de sodiu (în cazul chitosanului). Originalitatea studiului nostru este oferită de natura agenților de reticulare utilizați, de realizarea unor noi particule complexe pe bază de polizaharide prin utilizarea gelanului în amestec cu i-caragenan pentru a obține complexe polielectrolitice cu chitosanul și de asemenea prin imobilizarea curcuminei în microparticulele obținute.

Particulele obținute au fost caracterizate din punct de vedere morfologic prin microscopie electronica de baleiaj și comportamentul lor la umflare a fost studiat în trei medii apoase de pH diferit (la pH = 2, pH = 6.8 și pH = 7.4). A fost evaluată activitatea antioxidantă a curcuminei libere și a curcuminei incluse în particulele obținute utilizând testul cu DPPH și de asemenea a fost analizată capacitatea matricei polimere de a adsorbi proteinelor. Cinetica de eliberare a curcuminei a fost studiată in vitro în trei medii fiziologice: în soluție tampon fosfat (PBS) la pH = 6.8, pH = 7.4 și într-o soluție care simulează fluidul gastric la pH = 2.

Particulele complexe obținute au fost special concepute pentru eliberarea controlată și susținută a curcuminei în colon. Gelanul este rezistent la degradarea enzimatică care apare în stomac și intestin dar este degradat semnificativ în fluidul din colon, în prezența unei enzime galactomannans. I-caragenan a fost utilizat deoarece fiecare unitate structurală conține două grupe ester sulfat și în amestec cu gelan conduce la structuri stabile cu porozitate adecvată. Porozitatea matricei polimere poate fi controlată și prin variația concentrației de agent de reticulare. Prin imobilizarea curcuminei în micro-nanoparticulele de chitosan, biodisponibilitatea sa crește iar chitosanul poate forma complexe polielectrolitice cu amestecul de gelan și i-caragenan, determinând obținerea particule stabile, gastro-rezistente. Pe de altă parte matricea de gelan/caragenan, în care au fost incluse micro/nanoparticulele de chitosan cu curcumină imobilizată, constitue o barieră suplimentară în eliberarea curcuminei, conducând astfel la o eliberare susținută și controlată îmbunătățită.

Rezultate și discuții

Prepararea particulelor complexe pe bază de polizaharide

Doi polianioni (gelan, i-caragenan) și un polication (chitosan) au fost utilizați pentru obținerea matricei polimere, iar selecția lor a fost determinată de faptul că sunt polimeri naturali, netoxici, capabili să formeze complexe polielectrolite. De asemenea, pot forma geluri ușor prin reticulare ionică în prezența ionilor polivalenți (cationi sau anioni), evitându-se astfel utilizarea agenților de reticulare covalenți, cel mai adesea toxici.

Particulele obținute prin gelifiere ionică cu Na2SO4 sunt compuse din chitosan, în care curcumina a fost încapsulată prin co-precipitare. S-a demonstrat deja că încapsularea curcuminei în particule de chitosan este benefică și are ca rezultat o stabilitate și biodisponibilitate îmbunătățită atunci când sunt administrate pe cale orală [326, 341]. Culoarea galben închis a particulelor de chitosan cu curcumină imobilizată este o confirmare vizuală a încapsulării principiului activ. Particulele de chitosan conținând curcumina imobilizată au fost apoi încorporate în matricea de gelan sau gelan / i-caragenan. S-a obținut o soluție vâscoasă din cele două amestecuri de polizaharide și care a fost extrusă într-o baie care conține soluție de acetat de magneziu cu diferite concentrații. Complexul polielectrolitic a fost format prin interacțiuni electrostatice între grupele aminice libere de la suprafața micro/nanoparticulelor de chitosan și grupele carboxilice sau sulfat ale celor două polizaharide anionice. Acetatul de magneziu participă la reticularea ionică a grupelor carboxilat din gelan și, respectiv, sulfat din caragenan. Aceste grupări reticulate cu acetat de magneziu nu fost implicate în complexarea polielectrolitică a particulelor de chitosan, dar contribuie la îmbunătățirea stabilității mecanice a particulelor complexe obținute. Trebuie menționat că încercarea de a lucra cu amestecuri de gelan/i-caragenan în care procentul de i-caragenan depășește 30% a condus la formarea de particule instabile. Cercetările anterioare raportate în literatură au demonstrat că ionii de potasiu sunt eficienți pentru reticularea i-caragenanului. Cu toate acestea, nivelurile ridicate de potasiu nu sunt de dorit în aplicațiile medicale, deoarece pot provoca aritmii severe și slăbiciune musculară din cauza hiperkalemiei [342].

Particulele complexe formate sunt sferice, stabile și au un diametru mediu de 3 mm în stare umflată și de 0.5-1.0 mm în stare uscată. Reprezentarea schematică a particulelor de chitosan încărcate cu curcumină încorporate într-o matrice gelan este ilustrată în figura .

Fig. Reprezentarea schematică a particulelor complexe constituite din micro/nanoparticule de chitosan cu curcumină imobilizată incluse într-o matrice de gelan

Spectrele FT-IR ale particulelor complexe obținute

Figura 3 (a) prezintă spectrele FT-IR pentru chitosan, curcumină și particulele de chitosan încărcate cu curcumină, iar Figura 3 (b) arată spectrele FT-IR pentru particulele complexe, gelan și caragenan.

(a)

(b)

Fig. Spectrele FT-IR pentru (a) chitosan, curcumină și particulele de chitosan încărcate cu curcumină, și (b) pentru particulele complexe (proba P5C), gelan și caragenan.

Fig. 3 (a și b) indică faptul că în spectrul FT-IR al particulelor de chitosan încărcate cu curcumină se găsesc benzile de absorbție caracteristice ale componentelor. Astfel, banda largă de la 3420 cm-1 ar putea fi atribuită absorbției grupelor -OH din chitosan (Fig. 3a), a grupărilor fenol din curcumină, dar poate fi atribuită și absorbției grupei -NH2 de chitosan.

Peak-urile de absorbție care corespund grupelor funcționale din curcumină au fost observate la intensități mult mai mici, cum ar fi 1627 cm-1 (fragment aromatic C = C, vibrație de întindere) și 1513 cm-1 (-C-O- și –C = C- banda de vibrație) care indică faptul că principalele peak-uri de curcumină au fost păstrate atunci când a fost încorporată în micro/nanoparticulele de chitosan, iar aceste schimbări ale intensității peak-urilor sugerează că curcumina a fost încorporată în micro/nanoparticulele de chitosan.

S-a observat, de asemenea, că peak-ul de la 1541 cm-1 al chitosanului a fost deplasat în spectrul micro/nanoparticulelor de chitosan încărcate cu curcumină la 1587 cm-1 și poate fi atribuit interacțiunilor intermoleculare care pot apare între componente. Alte peak-uri de absorbție caracteristice curcuminei sunt ușor deplasate în spectru particulelor de chitosan cu curcumină imobilizată, ceea ce sugerează faptul că unele interacțiuni, cum ar fi legăturile de hidrogen, pot exista între grupările fenolice ale curcuminei și grupele amino ale chitosanului și dovedesc că curcumina a fost imobilizată în matricea polimeră.

În spectrele prezentate în Fig. 3b, incluzând și spectrul probei P5C, s-a observat o bandă de absorbție largă, între 3500 cm-1 și 3600 cm-1, specifică pentru benzilor de absorbție pentru grupele -OH (alcool-din polizaharid) și grupele fenolice (din curcumină) ). Vârful la 1436 cm-1 în spectrul probei P5C este ușor deplasat în comparație cu banda de absorbție specifică curcuminei (1428 cm-1) și dovedește că polifenolul este prezent în compoziția particulelor complexe. Banda intensă la aproximativ 1024 cm-1 în spectrul gelanului, a fost atribuită vibrațiilor de întindere C-O-C (din ciclul glicozidic). S-a constatat că această bandă este ușor deplasată în spectrul caragenananului (1069 cm-1) și în spectrul particulelor complexe P5C la 1042 cm-1, dovedind faptul că compoziția probei P5C conține toate polizaharidele utilizate (această bandă de absorbție nu a fost observată în spectrul curcuminei). În cele din urmă, în spectrul de eșantion P5C, o bandă specifică a grupei sulfat din carragenan este ușor deplasată de la 846.1 cm-1 la 875 cm-1.

Determinarea diametrelor medii ale particulelor prin difractometrie laser

Diametrul mediu și polidispersitatea dimensională pentru micro/nanoparticulele de chitosan încărcate cu curcumină au fost determinate prin difractometrie laser. Au fost analizate trei tipuri de particule obținute în condiții de ultrasonicare la durate diferite, pentru a evalua influența duratei tratamentului cu ultrasunete asupra acestei caracteristici. S-a constatat un efect care era de așteptat, și anume scăderea diametrului mediu al particulelor de chitosan odată cu creșterea timpului de tratamentul cu ultrasunete, în timp ce proba păstrând însă un caracter destul de polispers. Prin urmare, pentru probeleobținute după 4 minute de ultrasonicare, diametrul mediu al particulei a fost în jur de 1.45 µm; după 8 minute de ultrasonicare, diametrul a fost 0.38 µm și după 12 minute a fost 0.15 µm. Tabelul 2 prezintă diametrul mediu al particulelor pentru trei durate de ultrasonicare, precum și deviația standard (analiza a fost realizată în triplicat pentru toate probele). În figura 4, sunt ilustrate curbele de polidispersitate dimensională ale probelor obținute după 4 minute, 8 minute și 12 minute de tratament cu ultrasunete. S-a observat că pe măsură ce timpul de ultrasonicare crește cu atât dimensiunea nanoparticulelor, cât și polidispersitatea dimensională scade, așa cum era de așteptat.

Tabel 2. Diametrul mediu al particulelor de chitosan încărcate cu curcumină obținut după diferite durate de ultrasonicare.

Figura. Curbe de polidispersitate dimensională ale particulelor de chitosan cu curcumină imobilizată determinate prin difractometrie laser, utilizând diferite durate de ultrasonicare.

Morfologia particulelor complexe

Figura prezintă fotografiile realizate utilizând microscopia electronică de baleiaj pentru proba P1C în secțiune transversală.

Fig. Fotografii de microscopie electronică de baleiaj în secțiune transversală pentru proba P1C care conține micro/nanoparticule de chitosan cu curcumină imobilizată (tratamentul cu ultrasunete a fost de 4 minute).

Morfologia particulelor complexe de gelan conținând micro/nanoparticulele de chitosan cu curcumină imobilizată a fost evidențiată prin microscopiei electronică de baleiaj. Matricea de gelan prezintă o structură fibrilară, specifică acestei polizaharide. Spațiile dintre formațiunile fibrilare sunt ocupate de un număr mare de microparticule de chitosan conținând curcumina imobilizată. Microparticulele de chitosan încărcate cu curcumină incluse în matricea gelan își păstrează forma sferică, sunt dispersate în număr mare în matricea gelan în care sunt puternic ancorate, iar dimensiunea lor a fost de aproximativ 2-3 µm. Diametrul lor este însă mai mare decât diametrul determinat prin difractometrie laser (1.445 µm). Explicația constă în faptul că în jurul lor, a fost depus un strat suplimentar de gelan prin complexare polielectrolitică cu microparticulele de chitosan dublându-le practic diametrul.

Comportamentul la umflare în medii apoase

Comportamentul de umflare a particulelor complexe în diferite medii apoase a fost evaluat prin determinarea evoluției în timp a gradului de umflare (Q,%). Evaluarea acestei caracteristici a fost necesară deoarece gradul de umflare determină difuzia principiului activ din particule și astfel influențează cinetica de eliberarea a curcuminei. O valoare a gradului de umflare mai mare, indusă de o densitate de reticulare mai mică și o porozitate mai mare, va conduce la o difuzie mai accentuată a principiului activ din matricea polimerică [343]. Studiul evoluției în timp a gradului de umflare (Q%) determinat gravimetric, a fost efectuat pentru probele P1C, P2C, P3C, P4C, P5C și P6C în PBS pH = 7.4 (simulează pH-ul sângelui și a mediului din colon), pH = 6.8 (simulează mediul intestinal) și pH = 2 (simulează mediul gastric). Aceste rezultate sunt ilustrate în figura .

(b)

(c) (d)

(e) (f)

Fig. Evoluția în timp a gradului de umflare pentru probele P1C, P2C, P3C în (a) PBS, pH = 7.4, (b) PBS, pH = 6.8 (c) și în soluție care simulează fluidul gastric la pH = 2 și pentru probele P2C, P4C, P5C, P6C în (a) PBS, pH = 7.4, (b) PBS, pH = 6.8 (c) și în soluție care simulează fluidul gastric la pH = 2. Rezultatele sunt date ca valoarea medie intervalul de confidența de 95%.

Așa cum era de așteptat, gradul maxim de umflare scade în ordine: P1C> P2C> P3C, efect datorat unui grad de reticulare mai mare obținut prin creșterea concentrației soluției de acetat de magneziu, deci a ionului reticulant. Din figura , se observă că valorile Q % au fost mai mari la pH = 7.4 decât la pH = 6.8 sau pH = 2, deoarece particulele complexe conțin gelan într-o cantitate predominantă (vezi Tabelul 1). Prin urmare, pH-ul bazic induce formarea anionilor carboxilat din grupele acide care nu au participat la reticularea cu ionii de Mg2+, ceea ce determină apariția de repulsii electrostatice între lanțurile polizaharidei și are ca efect relaxarea rețelei care facilitează difuzia unei cantități mai mari de apă. El-Sherbiny și Smyth [344] au raportat concluzii similare pentru nanoparticule de PLGA încărcate cu curcumină, cu PEG grefat cu chitosan sau chitosan [344].

Valoarea pKa a grupelor carboxilice din gelan este de aproximativ 3.5 iar a grupelor sulfat din caragenan este apropiată de 2.6. La un pH mai mare decât valoarea pKa grupele carboxilice sunt deprotonate, legăturile de hidrogen nu se mai formează, apare repulsia electrostatică și crește hidrofilicitatea ceea ce conduce la un grad mare de umflare a hidrogelului și la eliberarea medicamentului [345]. Gradul de reticulare a probei P1C este mai scăzut ceea ce înseamnă că multe grupe carboxilice din gelan sunt libere. La pH=2 există posibilitatea formării unui număr mai mare de legături de hidrogen în proba P1C ceea ce conduce la o adsorbție mai scăzută a soluției în primele 2-3 ore. Aceste forte de atracție intermoleculare conduc predominant la interacțiuni polimer-polimer și nu la interacțiuni mediu-polimer rezultând o cantitate mai mică de mediu absorbit de aceste particule de hidrogel [346]. Temperatura de 37⁰C poate conduce la o absorbție mai mare de soluție la pH=2 iar unele legăturile de hidrogen formate pot fi scindate ca urmare a mișcărilor moleculare [347]. Soluția se abosarbe la suprafața particulelor de chitosan și protonează grupările amino iar absorbția de soluției la pH = 2 crește. Din figura 6c se observă că valorile gradului de umflare pentru probele P2C și P3C (cu un grad mai mare de reticulare) sunt apropiate dar superioare probei P1C în primele ore ale studiului cinetic efect determinat de numărul mai mic de legături de hidrogen formate. Gradul de reticulare mai mare și grupele carboxilice protonate determină o difuzie lentă a soluției în interiorul particulelor de hidrogel in cazul probelor P2C și P3C. Din figura 6c se poate observa că la pH = 2 pentru proba P3C gradul de umflare tinde spre echilibru după aproximativ 2 h, pentru proba P2C gradul de umflare tinde spre echilibru după 5 h iar pentru proba P1C gradul de umflare tinde spre echilibru după aproximativ 5-6 h. Literatura precizează că scindarea legăturilor de hidrogen are loc în timp după o cinetică liniară de ordinul 1 fapt ce poate explica cinetica nespecifică a gradului de umflare la pH=2 pentru proba P1C [347].

Curcumina inclusă în particulele complexe este mai solubilă în soluții alcaline și ar putea permite adsorbția unei cantități mai mari de soluție PBS la pH = 7.4. Chiar dacă la pH = 7.4 particulele pot absorbi o cantitate considerabilă de soluție, acestea nu au început să se dezintegreze și nu au apărut pierderi de masă, efect determinat probabil de interacțiunile dintre polimeri (gelan sau gelan în amestec cu i-carragenan și chitosan), responsabile pentru obținerea particulelor complexe cu o rezistență mecanică suficient de ridicată [348]. Se poate observa că valorile Q% scad la pH = 6.8, comparativ cu cele de la pH = 7.4, deoarece repulsiile electrostatice sunt mai mici, dar rămân relativ ridicate, cu valori cuprinse între 831,25% și 1646%.

În pH acid, ar fi de asteptat obținerea de valori ridicate ale gradului de umflare datorită prezenței chitosanului ale cărui macromolecule trec in forma protonata, provocând, de asemenea, respingeri electrostatice cu distanțarea macromoleculelor, ceea ce ar trebui să permită pătrunderea unor cantități mai mari de apă. Dar particulele de chitosan de dimensiuni reduse si puternic ancorate în matricea de gelan, respectiv gelan/caragenan, nu pot aduce un aport ridicat la valoarea gradului maxim de umflare. În plus, gradul de umflare mai mic poate fi explicat si ca fiind o consecință a formării legăturilor de hidrogen între grupele carboxilice (sau/si sulfonice) și grupările –OH din polizaharidele dominante, efect raportat anterior și de către alți cercetători [349]. Valoarea gradului de umflare pentru probele P4C, P5C, P6C a fost mai mare decât pentru proba P2C datorită prezenței i-carragenanului în matricea polimeră, ceea ce conferă o porozitate mai mare și, prin urmare, difuzia unor cantități mai importante de apă în particulele complexe obținute [344]. Chiar dacă diferențele dintre valorile gradului de umflare ale particulelor complexe care conțin caragenan nu sunt substanțiale, a existat o ușoară tendință a acestora să scadă odată cu reducerea cantității acestui polizaharid în compoziția lor (P6C <P5C <P4C), indiferent de valoarea pH–ului din mediul apos în care a fost determinat.

Eficiența de încapsulare

Din tabelul 1, se observă că eficiența de încapsulare a curcuminei (EE%) a fost cuprinsă între 87.23% și 97.25%, pentru particulele complexe cu matricea polimerică formată doar din gelan. În plus, se poate observa faptul că EE% crește odată cu scăderea concentrației de acetat de magneziu, utilizat ca agent de reticulare ionic (P1C-P3C). Astfel, se poate afirma că eficiența de încapsulare a micro/nanoparticulelor de chitosan încărcate cu curcumină în matricea de gelan crește atunci când matricea polimeră are un grad de reticulare mai scăzut, iar ochiurile rețelei sunt mai flexibile, dimensiunile lor sunt mai mari și o cantitate mai mare de micro/nanoparticule de chitosan încărcate cu curcumină pot fi incluse. Odată cu creșterea gradului de reticulare, rețeaua de polimeri devine mai densă, iar cantitatea de micro/nanoparticule de chitosan încărcate cu curcumină încorporate în matricea polimerică pe bază de gelan a fost mai mică. Pentru probele P2C, P4C, P5C și P6C cu același grad de reticulare, dar cu concentrații diferite de i-carragenan, se poate observa că eficiența de imobilizare în aproape toate cazurile scade atunci când cantitatea de i-caragenan crește.

Comparativ cu gelanul, i-caragenanul are două grupe sulfat capabile de gelifiere ionică, la fiecare unitate structurală, iar gelanul doar una. Drept urmare, rețeaua formată în prezența i-caragenanului poate fi mai densă, mai ales ca urmare a reducerii cantității de gelan. Prin urmare, este de așteptat ca eficiența de încapsulare a curcuminei (în micro/nanoparticule de chitosan) să crească odată cu scăderea cantității de caragenan. Eficiența de imobilizare a curcuminei pentru probele P4C, P5C cu 30% și 20% i-carragenan în compoziție a fost mai mică. Conform metodei de preparare a particulelor complexe, după reticularea ionică a matricei de gelan / caragenan care conține micro/nanoparticule de chitosan încărcate cu curcumină, acestea au fost menținute timp de trei ore în mediul de gelifiere (soluție de acetat de magneziu) pentru stabilizare. În această perioadă, o parte din curcumina imobilizată poate difuza în soluția apoasă de acetat de magneziu, iar difuzia a fost mai intensă cu cât porozitatea pariculelor complexe a fost mai mare; această caracteristică morfologică a particulelor complexe fiind corelată cu cantitatea de caragenan din compoziția lor. Porozitatea crește odată cu creșterea cantitatății acestui polizaharid în matrice. Chiar dacă matricea gelan / carragenan a fost mai densă, difuzia curcuminei a fost mai intensă datorită porozității mai mari. În studiile noastre de cercetare anterioare, s-a demonstrat că i-caragenanul induce matricei polimerice o porozitate mai mare, iar difuzia compusului bioactiv imobilizat depinde de aceasta [350].

Determinarea activității antioxidante a curcuminei

Polifenolii sunt sensibili în diverse medii, în timpul procesării alimentelor și în timpul depozitării. Degradarea antioxidanților naturali poate împiedica eficacitatea efectelor lor terapeutice și împiedică utilizarea acestor antioxidanți în aplicațiile alimentare / nutraceutice și farmaceutice [351]. Radiațiile ultraviolete (UV) reprezintă o nouă abordare pentru sterilizarea matricelor polimere biodegradabile [352]. Un sistem de sterilizare cu UVA a fost conceput si pentru apa potabilă și s-a demonstrat că iradierea cu UVA pentru aproximativ 30 de minute poate să distrugă aproape complet bacteriile nepatogene și patogene [353].

Mecanismele care explică efectul stresului produs de diferite radiații UV asupra acumulării fenolilor în plante sunt multiple și complexe. Schimbările în conținutul de fenoli sunt declanșate de speciile reactive de oxigen și etilenă – moleculele de semnalizare care activează calea metabolică fenilpropanoidă în plantele afectate. Radiațiile UV pot fi împărțite în: UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm) și UVC (200-280 nm). UVA reprezintă aproximativ 6% din radiația solară totală și reprezintă cea mai puțin periculoasă parte a radiației UV. UVB poate provoca efecte dăunătoare în plante și reprezintă aproximativ 1.5% din spectrul total. UVC sunt foarte periculoase pentru organisme, dar stratul de ozon filtrează cea mai mare parte din aceste radiații UV [354, 355].

Mecanismele prin care plantele percep radiațiile UV și inițiază răspunsuri fiziologice nu sunt pe deplin înțelese. Majoritatea rapoartelor de cercetare anterioare au fost efectuate utilizând UVB, deoarece se consideră că efectul radiației UVA nu aduce modificări semnificative în plante și cea mai mare parte a radiației UVC a fost utilizată în principal în produsele recoltate ca instrument de extindere a duratei de viață. Producția de specii reactive de oxigen indusă de radiația UV și este declanșată de creșterea respirației mitocondriale și prin ionizare în apă [355]. Conform lui Mackerness și colab. creșterea concentrației de specii reactive de oxigen după expunerea plantelor la UVB ar putea conduce la o creștere a nivelului de acid jasmonic și etilenă. Răspunsurile suprapuse cum ar fi acestea s-au dovedit a se extinde la nivel transcripțional la căile de semnalizare intracelulare care reglează expresia genică [356].

Degradarea curcuminei în prezența radiației UVB (254 nm) a fost studiată și s-a stabilit că după 8 ore de expunere 50 % din curcumina pudră a fost degradată [357].

Activitatea antioxidantă pentru curcumina liberă și pentru curcumina extrasă din probele P2C, P4C a fost evaluată utilizând testul cu DPPH. Particulele au fost expuse la lumină UVA pentru 30 de minute iar curcumina din particule a fost extrasă în metanol. S-au utilizat pentru determinarea procentului de inhibare soluții de curcumină de diferite concentrații (cuprinse între 10 și 130 µg/ml) iar pe baza rezultatelor obținute IC 50 a fost determinat atât pentru curcumina din particulele iradiate UV cât și pentru curcumina din particulele care nu au fost iradiate.

În figura 14 sunt prezentate valorile IC50 (µM) obținute în urma evaluării activității antioxidante utilizând testul cu DPPH pentru acidul ascorbic, curcumina liberă si pentru curcumina extrasă din probele P2C și P4C (s-au utilizat probe neiradiate și iradiate cu lumină UVA pentru 30 minute, λ=365 nm). Cu cât valorile IC50 sunt mai mici cu atat caracterul antioxidat al curcuminei este mai puternic.

Figura 14. IC 50 values on DPPH radical scavenging assay for free curcumin (FC) and for curcumin extracted from P2C, P4C samples before and after exposure to UV light, at 365 nm.

Din figura 14 se observă că valorile IC 50 pentru acidul ascorbic, curcumina liberă, curcumina extrasă din probele P2C și P4C iradiate sau neiradiate UV sunt apropiate ceea ce înseamnă că prin imobilizare curcumina își păstrează proprietățile antioxidante iar matricea polimeră are rol protectiv pentru curcumină. Pentru curcumina liberă expusă la lumină UVA se observă că valoarea IC 50 a fost cu 60.76% mai mare decât valoarea IC50 pentru curcumina liberă care nu a fost expusă la lumină UVA iar procentul de inhibare a radicalilor liberi din DPPH a fost diminuat cu 15% față de curcumina liberă. Din rezultatele obținute putem concluziona că prin expunere la UVA curcumina liberă a fost degradată partial dar își păstrează din activitatea antioxidantă chiar dacă valorile IC50 au crescut. Studiile precedente afirmă că bioactivitatea curcuminei se modifică atunci când este expusă la lumină UVB și 50% din curcumina pudra este degradată după 24 de ore de expunere. Activitatea antioxidantă a curcuminei libere după expunerea la UV poate proveni de la produșii de degradare (acidul ferulic, aldehida ferulică, vanilina și unii compuși ciclici) care contin gruparea activă hidroxil metoxifenil esențială pentru activitatea antioxidantă a curcuminei [357].

Rezultatele obținute pentru probele P2C și P4C inainte și după expunerea la UV sunt în concordanță cu cantitatea totală de fenoli din probe. Astfel pentru proba P4C datorită unei porozități mai accentuate lumina UV poate difuza în particule și activitatea antioxidantă a curcuminei este diminuată. Valoarea IC50 este mai mică cu 20.51% comparativ cu valoare IC50 pentru curcumina liberă.iar procentul de inhibare a radicalilor liberi a scăzut de asemenea cu 15% comparativ cu proba P4C neiradiată UV.

Cantitatea totală de fenoli și flavonoide după iradierea UV a curcuminei libere a fost mai mare comparativ cu curcumina neiradiată UV dar nu determină o activitate antioxidantă îmbunătățită așa cum susțin cercetările anterioare [358, 359].

Prin expunere la UV se generează necontrolat de specii reactive de oxigen care pot duce la acumularea lor provocând stres oxidativ în celule. Prin urmare, celulele plantelor au dezvoltat mecanisme de apărare pentru protecția lor prin producerea unor cantități mai mari de antioxidanți cum ar fi fenolii și flavonoidele, pentru a controla producerea de specii reactive de oxigen. Antioxidanții sunt eficienți deoarece pot dona propriii lor electroni speciilor reactive de oxigen, neutralizând astfel efectele adverse ale acestora din urmă [360]. Există posibilitatea ca speciile reactive de oxigen generate prin expunerea la UV să fie în număr mare iar cantitatea de fenoli sau flavonoide generate de mecanismul de apărare să nu fie suficiente pentru a neutraliza toate ROS produse și astfel cantitatea de antioxidanți rămasă capabilă să capteze radicalii liberi din DPPH să fie mai mică iar valoarea IC50 crește.

Determinarea adsorbției de proteine

Adsorbția de proteine pe suprafața particulelor de biopolimer are o importanță semnificativă în aplicațiile biomedicale, atât in vitro cât și in vivo [361]. În tractul gastrointestinal există diferite proteine și enzime care ar trebui adsorbite pe suprafața particulelor cu medicamente imobilizate. Cercetările anterioare au arătat că mecanismul primar de absorbție a microparticulelor cu medicamente incapsulate in intestinul subțire de șobolan a fost prin endocitoza mediată de clathrin în combinație cu endocitoză și fagocitoză mediată caveolar. Endocitoza dependentă de clathrin necesită proteină adaptor și o proteină care leagă domeniile guanozin trifosfat –GTP (dinamina) în plus față de clathrin [362].

Forțele de interacțiune dintre moleculele de proteine și particulele de polimer pot fi clasificate ca interacțiuni hidrofobe, legături ionice (sau electrostatice), legături de hidrogen și interacțiuni van der Waals [361].

Pentru determinarea adsorbției de proteine am utilizat probele P1C, P2C, P3C și P4C. În figura 15 este prezentată eficiența de adsorbție a proteinelor obținută la diferite pH-uri.

Figura 15. Eficiența de adsorbție a proteinelor pentru probele P1C, P2C, P3C și P4C la pH2, pH 6.8 și pH 7.4

Din figura 15 putem observa că adsorbția de proteine depinde de gradul de reticulare al particulelor, porozitate și pH. Astfel cu cat gradul de reticulare este mai mare cu atât adsorbția de proteine pe suprafața particulelor de polizaharide scade. Probele P4C au cea mai mare eficiență de adsorbție datorită porozității accentuate.

Adsorbția albuminei depinde de pH iar la pH 2 observăm că adsorbția de proteine este maximă indiferent de tipul de particule fiind cuprinsă între 60% și 76.24 %. La pH acid pot avea loc legături electrostatice între grupările carboxilice sau sulfonice nereticulate și gruparile aminice protonate din proteină determinând astfel o adsorbție mai intensă. Valoarea gradului de umflare la pH 7.4 este maximă și astfel o cantitate mai mare de soluție de albumină poate difuza in interiorul particulelor. Curcumina la pH 7.4 devine mai solubilă și poate determina formarea legăturilor de hidrogen cu grupările aminice din albumina conducând astfel la o adsorbție îmbunătățită. Adsorbția de albumină la pH 7.4 pentru probele analizate a fost cuprinsă între 36.26 % și 53.76 %. Eficiența de adsorbție a fost mai mică la pH 6.8 deoarece nu au loc interacțiuni electroctrostatice iar valoarea gradului de umflare este medie. Eficiența de adsorbție a albuminei la pH 6.8 a fost cuprinsă între 7.5% și 20 %.

În concluzie particulele au capacitatea de a adsorbi proteinele și pot fi utilizate pentru eliberarea curcuminei in mediul gastrointestinal.

Cinetica de eliberare a curcuminei

Cinetica de eliberare a curcuminei a fost studiată la temperatură fiziologică (T = 37 ° C), în trei medii de pH diferit: PBS (pH = 7.4 și pH = 6.8) și în soluție care simulează lichidul gastric la pH = 2. Curbele de eliberare a curcuminei din probele analizate și influența diferiților factori asupra eficienței eliberării sunt prezentate în Figura 7, Figura 8 și Figura 9.

Figura 7 arată influența pH-ului și a gradului de reticulare asupra cineticii cu eliberare a curcuminei din probele analizate. Figura 8 arată influența pH-ului și a porozității asupra cineticii de eliberare a curcuminei din probele analizate. Figura 9 arată influența dimensiunii micro / nanoparticulelor încărcate cu curcumină și a pH-ului asupra cineticii de eliberare a curcuminei din probele analizate.

(b)

(c)

Figure 7. Cinetica de eliberare a curcuminei în timp din particule complexe pe bază de gelan pentru probele P1C, P2C, P3C: în PBS la pH = 7.4 (a), în PBS la pH = 6.8 (b) și la pH = 2 ( c). Datele sunt date ca valoare medie ± intervalul de confidență de 95%.

(b)

(c)

Figure 8. Cinetica de eliberare a curcuminei în timp din particule complexe pe bază de polizaharide pentru probele P2C, P4C, P5C, P6C: în PBS la pH = 7.4 (a), în PBS la pH = 6.8 (b) și la pH = 2 (c). Datele sunt date ca valoare medie ± intervalul de confidență de 95%.

(b)

(c)

Figure 9. Cinetica de eliberare a curcuminei în timp din particulele complexe P4C care conțin micro/nanoparticule de chitosan care conțin curcumină obținute la diferite durate de ultrasonicare: în PBS la pH = 7.4 (a) în PBS la pH = 6.8 (b) și pH = 2 (c). Datele sunt date ca valoare medie ± interval de confidență de 95%.

Din figura 7, figura 8 și figura 9, se observă că, independent de tipul de particule, cantitatea maximă de curcumină eliberată, (adică eficiența de eliberare, așa cum este dat în tabelul 3), a fost mai mare în mediu ușor alcalin (pH = 7.4) decât în pH acid (pH = 2) și valorile eficienței de eliberare la pH = 6.8 au fost intermediare.

Acest efect se corelează foarte bine cu valorile gradului de umflare a particulelor complexe analizate, pentru cele trei medii de pH-ului diferit. Evident, la valori ale pH-ului într-un domeniu ușor alcalin, unde umflarea a fost maximă (efect explicat mai sus), cantitatea maximă de curcumină eliberată a fost mai mare comparativ cu cea eliberată în medii mai acide, facilitând difuzia curcuminei din ComPs.

În cazul probelor P1C, P2C, P3C, prezentate în figura 7, eliberarea curcuminei a avut loc cu o viteză mai mare până la 1440 minute după care cantitatea eliberată începe să scadă până la un punct de echilibru la aproximativ 9360 min, rămânând constantă după aceea la pH = 7.4, pH = 6.8 și pH = 2. Mai mult, pentru toate valorile de pH, eficiența de eliberare pentru probele de particule complexe conținând microparticule de chitosan încărcate cu curcumină (P1C, P2C și P3C) crește odată cu scăderea gradului de reticulare. Același comportament este observat și în figura 8 pentru probele P4C, P5C și P6C la pH = 6.8 și pH = 7.4. Eficiența de eliberare mai mare în mediul alcalin a fost consecința a unei umflări mai intense a matricei polimere, ceea ce permite ochiurilor de rețea să-și mărească dimensiunea și, prin urmare, difuzia principiului bioactiv a fost intensificată.

Difuzia curcuminei din particulele P2C, P4C, P5C și P6C (figura 8) depinde de cantitatea de i-carragenan din particule, deci de porozitatea lor. La pH = 2 după 5040 minute, cinetica de eliberare a curcuminei are un comportament diferit în comparație cu cinetica de eliberare a curcuminei la pH = 6.8 sau la pH = 7.4. La pH = 2, după 6420 de minute pentru toateprobele analizate, eficiența de eliberare a curcuminei din particulele complexe a fost aproape similară pentru toate probele. După 9360 minute, s-a observat că eficiența de eliberare a curcuminei a fost maximă pentru proba P2C și scade odată cu creșterea concentrației de caragenan în particulele complexe, astfel încât valoarea minima a eficienței de eliberare a fost observată pentru probele P4C.

Creșterea procentului de i-carragenan în compoziția particulelor complexe are ca efect creșterea gradului de reticulare (vezi explicația anterioară); prin urmare, intensificarea eliberării curcuminei din matricile mai reticulate ar trebui să se desfășoare mai lent. I-Caragenanul, însă, induce o porozitate mai mare matricii polimere în care au fost imobilizate micro/nanoparticulele de chitosan care conțin curcumină, ceea ce are ca efect intensificarea difuziei principiului activ prin pori. Între cele două efecte opuse induse de caragenan, se dovedește că cel datorat creșterii porozității a fost dominant, ceea ce explică rezultatele obținute.

Pe de altă parte, caragenanii sunt susceptibili la depolimerizare prin hidroliză acidă. La temperaturi ridicate și pH scăzut, caragenanii își pierd rapid funcționalitatea [348]. Studiile anterioare de degradare a caragenanului au arătat că doar 0.1% din legăturile glicozidice sunt deteriorate după ce probele de kappa-carragenan au fost menținute timp de 3 ore la pH = 1,2 și 37 ° C [251, 363]

Din figura 9, se observă că eficiența de eliberare a curcuminei depinde de dimensiunea micro/nanoparticulelor de chitosan care conțin curcumină încorporate în matricea gelan sau gelan / caragenan; dimensiunea acestora scade odată cu creșterea duratei de ultrasonicare. Pentru această analiză, a fost utilizată proba P4C în care micro/nanoparticulele de chitosan, obținute cu diferite durate de ultrasonicare – 4 minute, 8 minute și 12 minute au fost încorporate Eficiența de eliberare a curcuminei crește odată cu creșterea pH-ului și cu scăderea dimensiunii particulelor. Astfel, pentru particulele complexe P4C care conțin micro/nanoparticulelor de chitosan cu curcumină imobilizată cu o dimensiune de aproximativ 150 nm (ultrasonicate timp de 12 minute), s-a obținut o eficiență maximă de eliberare a curcuminei independent de pH-ul mediului utilizat. Efectul s-a datorat creșterii suprafeței specifice a micro/nanoparticulelor de chitosan care conțin curcumină, cu creșterea duratei ultrasonicării. Suprafața lor de contact cu mediul de eliberare crește odată cu scăderea diametrului, facilitând eliberarea unei cantități din ce în ce mai mari de principiu activ. Mai multe detalii referitoare la transportul și eliberarea curcuminei din matricea polimerică pot fi obținute folosind modelul cinetic Ritger-Peppas [364].

(3)

Valorile factorului exponențial n sunt enumerate în tabelul 3.

Tabel 3.

Din tabelul 3, se observă că pentru aproape toate probele, din care a fost eliberată curcumina, factorul de difuzie exponențial n prezintă valori egale sau foarte apropiate de 0.5, ceea ce indică o difuzie de tip Fickian. Mai mult, cantitatea de ingredient activ eliberat este direct proporțională cu timpul până când s-a ajuns la o eficiență de eliberare de aproximativ 60% din totalul de medicament eliberat, procent găsit ideal în modelele matematice utilizate pentru a descrie sistemele de eliberare controlată a medicamentelor [365, 366].

Succesul unui sistem de administrare a medicamentului specific pentru colon depinde de proprietățile fizico-chimice ale medicamentului, de tipul sistemului de administrare, de toți ceilalți factori care pot influența timpul de tranzit gastrointestinal și de gradul de interacțiune dintre medicament și tractul digestiv [367, 368]. De asemenea, sistemul de administrare orală trebuie să protejeze medicamentul împotriva eliberării în stomac și în intestinul subțire [367] Colonul poate fi o țintă potențială pentru absorbția sistemică a mai multor medicamente utilizate pentru tratamentul altor afecțiuni decât cele ale colonului [367].

Datele preclinice și clinice privind administrarea orală a curcuminei au evidențiat biodisponibilitatea sistemică scăzută și susceptibilitatea crescută la activitatea metabolică, iar cercetările anterioare au arătat că doar 2.30 ± 0.26 μg / ml curcumină au fost găsite în plasmă după administrarea orală a 10 g de curcumină. Curcumina suferă modificări metabolice extinse în intestin și ficat, ceea ce împiedică preluarea sistemică a curcuminei pentru a trata diferite boli. O varietate de materiale, pe bază de polimeri naturali, sintetici și lipide, au fost utilizate pentru obținerea sistemelor de eliberare care pot depăși eficient epiteliul gastrointestinal și, astfel, curcumina poate ajunge în colon și în circulația sistemică în doze terapeutice [369].

Scopul imobilizării curcuminei în particule complexe pe bază de polizaharide a fost acela de a facilita administrarea orală a curcuminei, asigurându-se depășirea barierei gastrointestinale și, în consecință, eliberarea unei cantități terapeutice de curcumină în colon. Gelanul a fost ales ca polimer predominant cantitativ pentru prepararea acestor particule complexe datorită stabilității sale în mediul puternic acid al stomacului și a rezistenței sale la enzimele din tractul gastro-intestinal. Datorită timpului în general scurt de staționare a alimentelor în stomac (golirea stomacului durează 2-6 ore) și în intestinul subțire (3-5 ore), se asigură depășirea barierei gastroitestinale a particulelor complexe și eliberea unei cantități terapeutice de curcumină în colon.

La trecerea particulelor prin stomac și intestinul subțire, este posibilă eliberarea unei cantități relativ reduse de curcumină, așa cum au demonstrat studiile descrise mai sus. A fost interesant să studiem eliberarea curcuminei din trei tipuri de ComPs, plasându-le secvențial mai întâi într-o soluție la pH = 2 care simulează mediul stomacal, apoi în soluția PBS la pH = 6,8 care simulează lichidul intestinal și apoi în PBS la pH = 7.4 care simulează mediul colonului. Pentru eliberare într-un mediu acid, durata a fost stabilită la 2 ore (comparabilă cu cea de staționare a alimentelor în stomac). Apoi,particulele complexe au fost plasate imediat într-un mediu de eliberare cu pH = 6.8 timp de 3 ore, deoarece aceasta este durata în care 50% din toate alimentele trec din intestinul subțire în colon și apoi particulele complexe au fost plasate într-o soluție la pH = 7.4 pentru 4 ore (timpul de staționare în colon variază între 4-72 ore).

Curbele cinetice obținute sunt prezentate în figura 10, care ilustrează un comportament diferit pentru particulele P2C, P3C și P4C. De fapt, după îndepărtarea particulelor complexe din mediul acid și intestinal și plasarea lor într-un mediu ușor alcalin, eliberarea curcuminei a fost practic intensificată.

Cantitatea totală de curcumină eliberată după aproximativ 10 ore, în cele trei medii succesive, depășește cantitatea maximă de curcumină eliberată din aceleași trei tipuri de particule, după 10 ore, fie în mediu acid, în mediu intestinal sau doar în mediu ușor alcalin (vezi Figurile 7, 8, 9).

Figura 10 Curbe cinetice pentru eliberarea curcuminei în timp din particulele P2C, P3C și P4C în mediu acid la pH = 2 (2 h), în PBS la pH = 6.8 (3 h) și apoi în mediu ușor alcalin în PBS la pH = 7.4 (4 h). Datele sunt date ca valoarea medie ± intervalul de confidență de 95%.

De asemenea, trebuie remarcat faptul că după aproximativ 10 ore în care particulele complexe rămân în tractul digestiv, eliberarea curcuminei din particulele P4C a fost practic completă (peste 60% din curcumina ar putea fi eliberată în colon). Acest rezultat confirmă ipoteza noastră de pornire și demonstrează rolul protector al matricei polimere pentru curcumină în depășirea barierei stomacale; prin urmare, aceste formulări încărcate cu curcumină pot fi potrivite pentru eliberarea acestui principiu active în colon.