Numele candidatului: [303566]

Ameliorarea genetică a speciilor forestiere

Curs pentru învățământul la distanță

Conf. univ. dr. Liviu FĂRTĂIȘ

Anul universitar: 2009-2010

UNIVERSITATEA „ȘTEFAN CEL MARE” SUCEAVA

FACULTATEA DE SILVICULTURĂ

Departamentul de Învățământ la Distanță

CUPRINS

I. CAPITOL INTRODUCTIV

1.Ameliorarea arborilor. Definiție și specificul disciplinei…………………………………

1.2 Scurt istoric……………………………………………………………………………….

II. OBIECTIVELE AMELIORĂRII ARBORILOR

2.1. Trăsături genetice specifice arborilor…………………………………………………… 2.2. Obiective cantitative…………………………………………………………………….

2.3. Obiective calitative……………………………………………………………………… 2.3.1. Obiective calitative extrinseci……………………………………………………….

2.3.2. Obiective calitative intrinseci……………………………………………………….

III. METODE CLASICE DE AMELIORARE FORESTIERĂ

3.1. Selecția……………………………………………………………………………………

3.1.1. Principii fundamentale ale ameliorării prin selecție…………………………………

3.1.2. Formele selecției artificiale………………………………………………………….. 3.1.3. Determinarea efectelor selecției………………………………………………………

3.1.4. [anonimizat]…………………………………………..

3.1.4.1. Ciclul de selecție și ciclul de ameliorare…………………………………………

3.1.4.2. Repetarea ciclurilor de selecție…………………………………………………..

3.1.5. Limitele selecției……………………………………………………………………..

3.1.5.1. Limite genetice și biologice………………………………………………………

3.1.5.2. Limite metodologice……………………………………………………………..

3.1.6. Strategii de selecție…………………………………………………………………..

3.1.7. Etapele principale ale unui program de selecție……………………………………..

3.1.7.1. Alegerea proveniențelor………………………………………………………….

3.1.7.2. Identificarea populațiilor semincere…………………………………………….. 3.1.7.3. [anonimizat], plantaje……………….

3.2. Hibridarea……………………………………………………………………………25…..

3.2.1. Principii generale privind aplicarea tehnicilor de hibridare………………………25…

3.2.2. Criterii și modalități concrete de hibridare………………………………………26…..

3.2.3. Particularități ale reproducerii sexuate la arbori……………………………………27..

3.2.3.1. Aspecte teoretice și practice asupra înfloririi și fructificației la arbori………27…..

3.2.3.2. Fenomenul de incompatibilitate interspecifică în ameliorarea forestieră……27…..

3.2.3.3. Explicarea fenomenului de androsterilitate…………………………………….28… IV. METODE MODERNE DE AMELIORARE FORESTIERĂ ……..29

4.1. Mutageneza și implicațiile practice în ameliorarea forestieră…………………………30…

4.1.1. Interesul obținerii de varietăți poliploide la speciile forestiere…………………30…… 4.1.2. Obținerea de poliploizi la rășinoase………………………………………………30….

4.1.3. Obținerea de poliploizi la rășinoase………………………………………………31….

4.1.4. Mutații genice și cromozomiale la speciile forestiere……………………………33….. 4.2. Cultura in vitro de celule și țesuturi vegetale……………………………………34……….

4.2.1. Specificul activității în cadrul unui laborator de culturi in vitro…………………35…..

4.2.2. Aclimatizarea în seră și repicajul în pepinieră……………………………………38….

4.2.3. Rezultate obținute la speciile forestiere…………………………………………38…..

4.3. Inducerea și obținerea de haploizi……………………………………………………39….

4.3.1. Obținerea de haploizi prin androgeneză…………………………………………49….

4.3.2. Obținerea de haploizi prin ginogeneză………………………………………41……… 4.3.3. Importanța genetică a haploizilor………………………………………………41……

4.4. Cultura de embrioni sexuați in vitro………………………………………………42…….

4.5. Embriogeneza somatică și semințele artificiale………………………………42………… 4.5.1. Embriogeneza somatică…………………………………………………………42…..

4.5.2. Tehnologia obținerii semințelor artificiale……………………………………43……..

4.6. Obținerea și cultura protoplaștilor. Hibridarea celulară (somatică)………………44…….

4.6.1. Obținerea de protoplaști…………………………………………………………45…..

4.6.2. Fuzionarea protoplaștilor………………………………………………………46……

4.7. Transferul de gene și obținerea plantelor transgenice………………………………48…..

4.7.1. Obținerea pe cale biologică (indirectă) a ADN-ului recombinant………………49…..

4.7.2. Transferul de gene la arbori cu ajutorul plasmidelor Ti și Ri……………………52….

4.7.3. Transferul direct de gene (transfecție)…………………………………………53……

4.7.4. Strategii sens și antisens…………………………………………………………54…..

4.7.5. Realizări în sectorul agricol……………………………………………………55…….

4.7.6. Realizări în silvicultură…………………………………………………………55……

4.7.7. În loc de concluzii…………………………………………………………………57… V. PRINCIPIILE SILVICULTURII CLONALE

5.1. Tehnici de multiplicare vegetativă…………………………………………………60……

5.1.1. Altoirea…………………………………………………………………………60…….

5.1.2. Marcotajul………………………………………………………………………61……

5.1.3. Drajonarea…………………………………………………………………………61…

5.1.4. Butășirea…………………………………………………………………………61…..

5.1.5. Micropropagarea……………………………………………………………………63..

5.2. Utilizarea clonelor………………………………………………………………………. 63

5.2.1. Modele de silvicultură clonală…………………………………………………63…….

5.2.2. Tentative noi în silvicultura clonală………………………………………………63…

5.2.3. Riscuri și limite în silvicultura clonală………………………………………………64

VI. CONSERVAREA RESURSELOR GENETICE FORESTIERE (RGF)

6.1. Definiții, generalități și grupe principale de resurse genetice la principalele specii forestiere………………………………………………………………………………………

6.2. Importanța studiului diversității biologice în perspectiva identificării, conservării și utilizării durabile a RGF………………………………………………………………………

6.3. Conservarea germoplasmei forestiere……………………………………………………

6.3.1. Conservarea in situ a RGF……………………………………………………………

6.3.1.1. Crearea de parcuri și rezervații naturale…………………………………………

6.3.1.2. Rezervațiile de semințe…………………………………………………………

6.3.1.3. Interzicerea accesului și exploatărilor preferențiale…………………………….

6.3.2. Conservarea ex situ a RGF…………………………………………………………. 6.3.2.1. Arboretum-urile și parcurile dendrologice……………………………………

6.3.2.2. Culturile comparative de proveniențe și hibrizi…………………………………

6.3.2.3. Parcurile de clone……………………………………………………………….

6.3.2.4. Livezi de semințe……………………………………………………………….

6.3.2.5. Băncile de gene………………………………………………………………….

I. CAPITOL INTRODUCTIV

1.1.Ameliorarea arborilor. Definiție și specificul disciplinei

În sens strict genetic, ameliorarea este disciplina care se ocupă cu îmbunătățirea calităților plantelor cultivate și animalelor domestice, în sensul ameliorării eredității acestora în direcția dorită de către om (ameliorator).

Deși multă vreme (secole sau chiar milenii) a fost realizată empiric (de bază fiind selecția fenotipică pentru nevoi imediate), ameliorarea plantelor și animalelor s-a impus treptat, cu timpul devenind o știință, prin apariția lucrărilor fundamentale ale unor mari savanți din domeniul științelor biologice precum Darwin, Mendel, Morgan, de Vries, Vavilov etc. În ceea ce privește ameliorarea speciilor forestiere trebuie ținut cont de specificitatea biologică a arborilor în raport cu alte specii vegetale, de rolul lor structural și funcțional fundamental în cadrul ecosistemelor forestiere și, nu în ultimul rând, de faptul că sunt specii “sălbatice” foarte vechi (gimnospermele au apărut încă din era primară, cu apogeu în mezozoic) ce posedă sisteme genetice complexe și foarte greu de modificat (Stănescu, 1983). De asemenea, arborii sunt plante perene, policarpice, cu maturitate târzie, au cicluri de viață foarte lungi și o lentă manifestare fenotipică a caracterelor legate de structurile lor genetice. Dacă mai adăugăm și dimensiunile mari pe care le realizează, precum și o foarte redusă accesibilitate la flori și fructe, putem alcătui un tablou complet privind dificultățile ce apar pe linia întreprinderii unor cercetări de genetică forestieră teoretică și aplicată.

Cu toate acestea, în ultimele decenii, cercetările și activitățile specifice domeniului ameliorării forestiere s-au perfecționat și extins extrem de mult, astfel încât în tot mai multe țări există și se derulează programe foarte complexe pe linia ameliorării forestiere. În acest mod sunt atinse tematici vaste ce pornesc de la studiul proveniențelor și selecția de populații valoroase și se încheie cu abordarea celor mai noi și performante tehnici moderne specifice biologiei și geneticii moleculare.

1.2 Scurt istoric

Încă din neolitic au existat preocupări de a se obține forme mai productive la plantele cultivate și, în acest sens, oamenii din acele timpuri au utilizat o formă empirică de selecție și o depozitare a semințelor pentru scurte perioade de timp.

Referitor la speciile de arbori, aceste preocupări au fost mult mai recente, când spre sfârșitul secolului al XVIII-lea s-au efectuat primele recoltări și utilizări de semințe aparținând celor mai frumoase exemplare de arbori, inclusiv pentru speciile forestiere exotice (Stănescu, 1983). La mijlocul secolului al XVIII-lea, Amiralitatea suedeză recomanda recoltarea de semințe de pin silvestru de la cei mai drepți arbori din nordul țării și cultivarea lor mai la sud pentru a constitui o sursă de materie primă mai apropiată, în vederea construirii navelor (Lucău, 1998).

Au trecut mai bine de două secole de când Duhamel de Monceau, unul dintre fondatorii conceptului de silvicultură, a semnalat existența unor diferite rase în cadrul speciilor lemnoase și, la inițiativa sa, se înființează în Franța primele plantații comparative de pin silvestru cu semințe din Rusia, Scoția sau Europa de sud.

Tot în Franța, între anii 1823-1850, Philippe Andre de Vilmorin a experimentat primele teste comparative de proveniențe la pinul silvestru, având în vedere rectitudinea tulpinii, forma coroanei, dispoziției ramurilor pe trunchi, etc. Cu această ocazie, în regiunea împădurită a Parisului se realizează multe altoiri pe pin silvestru cu material biologic provenit din Corsica de Pinus laricio pentru aclimatizarea acestei specii în condițiile mai nordice specifice capitalei franceze.

În a II-a jumătate a secolului XIX-lea, prin intensificarea studiilor asupra diferitelor rase de arbori, în mod deosebit în Germania, s-au putut pune bazele stabilirii unei taxonomii mai aproape de realitate a unor grupuri intraspecifice

Începutul secolului XX a coincis cu redescoperirea legilor lui Mendel privind ereditatea și punerea bazelor teoriei mutaționiste de către Hugo de Vries. În domeniul forestier, o importanță deosebită a avut-o Correns van Tschermak, creîndu-se o adevărată efervescență și emulație în rândul specialiștilor forestieri care erau destul de dezamăgiți de recentele eșecuri în ceea ce privește rezultatele unor vaste acțiuni de reîmpădurire în Franța, Belgia sau Germania. Rezultatele mediocre obținute s-au datorat, în principal, utilizării unui material seminal de origine incertă sau de slabă calitate, ca cel de larice de Alpi, pin silvestru din zona Haguenau (Franța) în Germania și, invers, material originar din Darmstadt (Germania) în Franța. Sensibilizarea specialiștilor forestieri s-a manifestat și exprimat concret în cadrul primei reuniuni internaționale asupra originii materialului seminal de pin silvestru (1906) dar, mai ales, în cadrul Congresului internațional IUFRO (Uniunea internațională a instituțiilor de cercetare forestieră) de la Bruxelles (1910)(Nanson, 2005). O parte a populațiilor semincere actuale de pin silvestru și duglas din Belgia reprezintă consecința directă și benefică a acțiunilor întreprinse în acea perioadă.

După primul război mondial, urmează o perioadă de regres în genetica forestieră și, din păcate, mulți dintre cei angrenați în domeniu nu au dat atenția cuvenită greșelilor și eșecurilor anterioare. În consecință, prin neglijarea provenienței semințelor, a crescut numărul de populații semincere mediocre, cu exemplare neperformante ce prezentau ramuri groase și care erau devastate adesea de boli produse de Rhabdocline pseudotsugae sau Phaeocryptopus gaeumannii (Nanson, 2005).

Cu toate acestea, în unele țări din Europa Centrală și de Vest au fost create bazele privind crearea unui cadru legislativ și instituțional pe linia cercetării agricole, în general, precum și a celei forestiere, în special. Astfel, în Belgia a luat ființă, în anul 1929, Stațiunea de Cercetări a Apelor și Pădurilor, cu sediul la Groenendaal, lângă Bruxelles, cu scopul principal de a reda pieții semințe cunoscute ca proveniență și de bună calitate. De asemenea, Delevoy a început instalarea experiențelor comparative de proveniențe. În Danemarca, Syrach Larsen a creat, cu adevărat, o disciplina autonomă de genetică și ameliorare a arborilor forestieri, iar în 1926 a efectuat prima cartare seminologică și o sistematizare a populațiilor semincere. De asemenea, el a pus la punct tehnici clonale și de polenizare artificială la arbori, a realizat primul program complet de ameliorare și selecție a arborilor plus, de creare a primelor livezi de semințe și teste de descendență. În mod independent, în Suedia, Langlet a efectuat în 1936 primele observații în legătură cu variabilitatea geografică a pinului silvestru în funcție de climat, deschizând calea viitoarei genetici ecologice, cu mult înainte de Stebbins (1950). Geneticianul Nilsson-Ehle a descoperit exemplare de plop triploid (Populus tremula var. gigas), inițiind astfel șirul unor lucrări de referință în domeniul poliploidiei.

În ciuda acestor realizări cu totul remarcabile, se pare că ele nu au avut un impact major în practica forestieră mondială și nu puțini silvicultori (unii chiar și în prezent) au rămas la convingerea că dezvoltarea arborilor și a pădurii ar depinde numai de mediu (Nanson, 2005).

În perioada interbelică, grație marilor descoperiri în domeniul geneticii, încep să se elaboreze și să se aplice primele programe sistematice pe linia ameliorării diferitelor specii forestiere. În acest sens se evidențiază programul propus și inițiat de către Fabricius, în Germania, o amplă acțiune de ameliorare bazată pe introducerea practicilor de autofecundare, de selecție, hibridare și sistem clonal de înmulțire. Tot în această perioadă, în Statele Unite ale Americii, ia ființă un institut de genetică forestieră la Placerville (California), în timp ce în mai multe țări din Europa (Germania, Danemarca, Suedia, Canada, Italia) apar numeroase și importante organizații, comitete și asociații în domeniul ameliorării genetice a arborilor (Stănescu, 1983).

După cel de-al II-lea război mondial, un nume de referință ce s-a impus în dezvoltarea ameliorării speciilor forestiere a fost cel al suedezului Lindquist (1948), al cărui concept era ca programele în domeniu să urmeze filiera: populații semincere, arbori plus și livezi de semințe. Acest concept avea să prezinte un mare ecou până în Statele Unite și în Japonia.

După 1950, în urma apariției unor discipline de mare importanță precum genetica evolutivă și cea a populațiilor, bazate pe lucrările de excepțională însemnătate științifică ale lui Dobzansky, Stebbins și Mayr, s-a putut descifra rolul fundamental ce-l deține variabilitatea intra și interpopulațională în cadrul ameliorării genetice forestiere. Ca urmare, s-a putut trece la o selecție sistematică a primelor populații semincere în Europa (ex. în Belgia), înființarea primelor livezi de semințe în sistem clonal (Scandinavia, Germania și Statele Unite) cu material provenit de la arbori plus aparținând populațiilor locale, populații care s-au dovedit a fi cele mai productive și mai bine adaptate. Ulterior, prin dezvoltarea studiilor de proveniență, s-a dovedit că ecotipurile locale nu sunt întotdeauna cele mai bune. Tot în această perioadă sau înființat primele parcuri de clone cu genotipuri dintre cele mai valoroase și s-au creat metode statistice eficiente în vederea stabilirii unor comparații precise și elocvente între diferite populații de arbori.

Apariția geneticii cantitative după 1960 (Falconer și Lerner), coroborată cu dezvoltarea studiilor de variabilitate intraspecifică la arbori, a permis perfecționarea și ajustarea criteriilor de selecție a indivizilor performanți necesari în activitatea de ameliorare. În acest sens, în mai multe țări din Europa (mai ales în Belgia și Franța) s-a mărit semnificativ aria de culturi comparative de proveniențe, plantațiile respective fiind ulterior repetate în mai multe regiuni, în condiții ecologice din cele mai diverse. De asemenea, în Statele Unite, Noua Zeelandă și Australia au luat amploare aceste culturi, aplicându-se tot mai mult aceste metode ale genetice cantitative. Rezultatele obținute au stat la baza definitivării și delimitării celor mai valoroase arborete surse de semințe și, în consecință, la elaborarea unei legislații clare în domeniul provenienței, transferului și utilizării materialului biologic provenit din aceste formațiuni forestiere.

După anul 1970 s-au perfecționat și a luat amploare utilizarea tehnicilor biochimice, respectiv metode de electroforeză privind determinarea unor indici biochimici ca izoenzimele, terpenele și taninuri. Acestea au permis caracterizarea genotipurilor și populațiilor de arbori și o estimare rapidă și precisă a gradului de variabilitate intra și interpopulațională. În paralel, în unele țări precum Franța, a luat amploare multiplicarea vegetativă în masă prin utilizarea unor metode moderne specifice culturilor in vitro, respectiv micropropagarea.

După 1980, descoperirile de mare performanță în domeniul biologiei moleculare, specifice analizelor de ADN (RFLP, RAPD, AFLP, marcheri QTL microsateliți) și ale ingineriei genetice (hibridare somatică și transfer de gene), au stat la baza apariției biotehnologiilor moderne cu mare impact și în cercetările de ameliorare genetică arborilor. Utilizarea acestor tehnici de mare performanță și-au găsit o tot mai largă aplicabilitate și, în prezent, contribuie din plin la elucidarea unor importante aspecte privind refugiile și migrările postglaciare, structura genetică a populațiilor de arbori și gradul acestora de heterozigoție.

În țara noastră, primele preocupări sistematice în domeniul ameliorării genetice a arborilor sunt relativ recente și cercetători silvici ca Zaharia Przemețki, Anton Rădulescu, Petre Grunau, Marian Petcuț, Marin Rădulescu, Sergiu Pașcovici au adus primele contribuții concrete în metodologia de ameliorare forestieră bazată pe selecție. Pe această linie, la inițiativa lui Zaharia Przemețki se promovează studiile de proveniențe și alegerea ecotipurilor în culturile forestiere, prin aceasta reducându-se semnificativ ciclurile de producție (Stănescu, 1983).

Odată cu înființarea I.C.A.S. București, în anul 1948, s-au organizat și întreprins primele lucrări sistematizate de selecție, hibridare și instalare de culturi comparative de proveniențe.

Între anii 1950-1960 s-au pus la punct și aplicat primele experimente privind stimularea fructificației la cvercinee, elaborându-se totodată primele instrucțiuni și îndrumări de selecție a arborilor și arboretelor în vederea stabilirii rezervațiilor de semințe de stejar.

În deceniul următor, la inițiativa și pe baza cercetărilor efectuate de către colectivul coordonat de V. Enescu, s-a derulat o acțiune extrem de importantă, respectiv s-a introdus primul sistem specific de cartare seminologică pe baza căruia s-au identificat și delimitat cele mai reprezentative arborete surse de semințe de la noi din țară. Astfel, între anii 1962 – 1965, s-au identificat peste 5000 de arborete semincere, totalizând o suprafață de peste 120 000 ha, din care peste 2/3 specii de rășinoase. Toate aceste formațiuni forestiere au fost descrise și clasificate în funcție de valoarea lor seminologică și s-au stabilit totodată măsurile specifice de îngrijire și transformare a celor mai valoroase arborete în rezervații de semințe.

După 1970 s-a intensificat ritmul selecțiilor și hibridărilor între cei mai valoroși arbori în cadrul ameliorării unor specii, astfel încât s-a extins destul de mult aria plantajelor de semințe (peste 200 ha), majoritatea suprafeței fiind ocupată cu specii de rășinoase (larice, pin, duglas etc.). Înființarea primelor colecții de clone a dat un impuls și activității de conservare a resurselor genetice forestiere concretizate prin genotipuri de mare valoare la unele dintre cele mai importante specii de arbori. În paralel, s-au intensificat cercetările și observațiile în domeniul sistematicii și variabilității la mai multe specii forestiere importante (pin, larice, stejar, molid) sau de stabilire a cariotipului la molid, pin etc.

În cadrul activității de ameliorare a unor specii forestiere se pot aminti câteva realizări deosebite în ceea ce privește utilizarea unor clone de plop de mare productivitate, începând cu anul 1976, precum și obținerea unor clone selecționate de salcie și răchită, ambele categorii manifestând creșteri semnificative pe unitate de timp și suprafață.

II. OBIECTIVELE AMELIORĂRII ARBORILOR

În esență, prin ameliorarea forestieră se urmărește obținerea unor exemplare de arbori mult mai performante ca productivitate și calități tehnologice, mai bine adaptate la mediu în sensul creșterii rezistenței la acțiunile nocive ale factorilor biotici (boli, dăunători) sau abiotici (inclusiv accidente climatice), în scopul satisfacerii unor cerințe economice mereu crescânde. În ultima perioadă sunt avute în vedere și cerințe ecologice – reconstrucția ecologică a zonelor distruse sau calamitate, împădurirea unor zone aride, soluri sărăturoase sau amenințate cu deșertificarea.

Paleta obiectivelor cantitative și calitative urmărite în activitatea de ameliorare a arborilor este extrem de diversă, ținând cont de complexitatea acestor organisme vegetale (în special complexitatea structurii genetice), de ciclurile lor de viață lungi și foarte lungi, maturitate târzie și fructificația extrem de abundentă. De aici se pot defini câteva trăsături genetice specifice care deosebesc fundamental arborii de restul speciilor vegetale.

2.1. Trăsături genetice specifice arborilor

Arborii sunt posesorii unei uriașe rezerve de variabilitate genetică, în sensul că în structura lor genotipică predomină, într-o proporție covârșitoare, heterozigoția pentru multe caractere. Această trăsătură a fost pusă în evidență prin efectuarea mai multor teste și investigații și prin utilizarea unor tehnici de vârf ca marcheri genetici, biochimici, inclusiv “amprentele genetice”. Marea diversitate genetică inter și intrapopulațională a arborilor se datorează faptului că aceste specii au evoluat, de-a lungul timpului, în cele mai diverse nișe ecologice și, pe de altă parte, panmixia atinge în arboretele naturale cotele cele mai ridicate datorită alogamiei și capacității enorme de înflorire și fructificare.

O trăsătură extrem de importantă și cu largi implicații în procesul de ameliorare forestieră o reprezintă marea frecvență a sistemelor poligenice și polialelice, arborii caracterizându-se printr-un număr mare de caractere de ordin cantitativ (bioacumulări) rezultate din multiple și complexe interacțiuni genice alelice și nealelice. Această caracteristică prezintă o mare importanță speciilor forestiere și în plan ecologic, conferindu-le o mai mare plasticitate și capacitate sporită de adaptabilitate.

Spre deosebire de alte specii de plante (cele cultivate sau chiar din flora ierboasă spontană), arborii au un echipament genetic mult mai stabil, format dintr-un număr mai mare de cromozomi și, în general, de mai mici dimensiuni, aceasta reprezentând o consecință a vechimii acestor specii (mai ales gimnospermele) și evoluției lor îndelungate în nișe ecologice foarte variate.

În ciuda structurii lor genetice complexe, a ciclurilor lungi de viață și a maturității târzii, arborii manifestă o accentuată susceptibilitate la diferiți factori de mediu. De aceea, în cadrul diferitelor etape ale procesului de ameliorare forestieră bazate pe selecție și hibridare, problema interacțiunii dintre genotipul unui arbore și mediu să prezinte o foarte mare importanță pentru amelioratori în sensul utilizării eficiente a unor metode de testare și ameliorare a diferitelor caractere.

Pronunțatul caracter de sociabilitate a arborilor este demonstrat de însăși modul lor de existență, aceștia edificând, în majoritatea cazurilor, populații extinse, comunități largi, în care selecția naturală a acționat sistematic în condițiile specifice mediului de viață. În populațiile alogame de arbori s-a creat o constelație bogată și specifică de gene, supuse unui flux panmictic intensiv, acest fenomen datorându-se existenței unor suprafețe de schimb de gene foarte mari (cantități uriașe de polen, inflorescențe la partea superioară a coroanei, etc.). De aceea, aceste populații naturale constituie adevărate centre de germoplasmă utilă pentru activitatea de ameliorare dar și cea de conservare a unui fond genetic extrem de valoros prin varietate și o mare capacitate de recombinare.

Tot la arbori, mai ales în interiorul populațiilor mari, homeostazia genetică se manifestă cu deosebită intensitate, fapt explicabil prin prezența masivă a heterozigoților care mențin heterogenitatea populațiilor respective. Acest fapt face posibilă menținerea echilibrului și fluxului constant de gene chiar și în interiorul unor colectivități de arbori relativ restrânse și izolate (ex. cele de fag din nordul Dobrogei). Mecanismele stabilității genetice, ale rezistenței la schimbările structurale profunde, sunt, în acest caz, cu mult mai puternice decât efectele consangvinizării sau derivei genetice care, în cazul altor specii, s-ar manifesta mult mai pregnant.

Izolarea reproductivă poate cauza totuși întreruperi din arealul unei specii și duce la apariția unor diferențieri genetice ca urmare a reducerii fluxului panmictic și a influențelor mediogene cu puternice efecte selective. Acest fenomen stă la baza apariției unor populații locale, ecotipuri sau rase geografice, dar, chiar și în aceste condiții, se păstrează constelația de bază a genelor, fără modificări bruște ale structurii genofondului și, în consecință, aceste formațiuni restrânse rezistă destul de bine la puternice și bruște variații de mediu.

2.2. Obiective cantitative

În cadrul acestei categorii sunt incluse toate caracteristicile legate de creșteri și bioacumulări, respectiv producția de masă lemnoasă, capacitate de fructificare și producere de semințe. Aceste trăsături sunt supuse controlului unui număr mare de gene (gene minore), precum și interacțiunilor între genele alele și nealele. În acest caz, influența factorilor de mediu este mare, iar eritabilitatea (în ce măsură se transmite un caracter de la părinți la urmași) este redusă.

Obiectivul prioritar urmărit în ameliorarea caracterelor cantitative la arbori îl reprezintă producția de masă lemnoasă, respectiv producția totală în volum pe unitate de suprafață și timp sau maximul creșterii medii anuale exprimată în m3 / ha / an. Productivitatea totală a unei populații este aproape în exclusivitate determinată de condițiile de mediu specifice fiecărei stațiuni pe de-o parte, dar și de materialul genetic utilizat, pe de altă parte. Tratamentele aplicate, în special cele privind gradul de intensivitate a răriturilor, nu au un efect direct semnificativ asupra producției totale. Condițiile de mediu reprezintă un factor fix și, de cele mai multe ori, defavorabil ameliorării în populațiile naturale. În cadrul plantațiilor, dimpotrivă, silvicultorii pot alege mult mai ușor și cu costuri mult reduse cel mai potrivit material biologic pentru viitoarele generații și pot prognoza mult mai ușor evoluția regenerării naturale a materialului plantat.

În ceea ce privește producția de biomasă, speciile forestiere se caracterizează printr-o eritabilitate relativ redusă a caracterelor de creștere care sunt controlate de un număr foarte mare de gene, fiind implicate, de asemenea, multiple și complexe interacțiuni alelice și nealelice. De aceea, pe linia ameliorării producției totale de biomasă, selecția în favoarea exemplarelor cu cele mai mari creșteri dimensionale (înălțime dominantă) poate să nu conducă întotdeauna la rezultatele scontate și, în consecință, geneticienii amelioratori ar trebui să o aplice cu precădere în perioada de juvenilitate a arborilor selectați. În cazul unor specii, cum ar fi de exemplu la molid, în cadrul culturilor comparative, diferențele dintre proveniențele cele mai bune fenotipice și cele mai slabe au înregistrat valori spectaculoase în ceea ce privește producția totală de biomasă, acestea atingând pragul de aproape 300%. Totuși, cea mai recomandabilă măsură ar fi promovarea unor genotipuri polivalente, cu caracteristici calitative remarcabile, cu largă adaptabilitate ecologică, rezistente la maladii și la condiții climatice neprielnice (Stănescu, 1984).

Este cunoscut faptul că producția totală de materie uscată este mai mare decât producția economică și nu toată cantitatea de lemn ce se poate recolta se poate utiliza economic. De aceea, în relația dintre producția biologică (Ybiol) și cea economică (Yec) este introdus indicele de recoltă net (IRnet) care exprimă procentul de lemn, în greutate și volum, recoltat din pădure și utilizat. Deci, în anumite condiții de mediu, dinamica relațiilor dintre cele două producții este:

Yec = Ybiol x IR

Un factor favorizant privind reușita ameliorării producției de biomasă ar fi existența unor variații genetice la cel puțin unul din factorii de care aceasta depinde. Pe de altă parte, indicele de recoltă net variază cu specia, proveniența și chiar la biotipuri diferite din cadrul aceleași populații. Nu în ultimul rând, producția biologică mai depinde de o serie de caractere fixate ereditar dar și de influența, uneori însemnată, a mediului în realizarea lor.

Cele mai importante componente biologice ale producției economice sunt înălțimea valorificabilă, suprafața de bază fără coajă, factorul de formă, factorul calității tulpinii, factorul calității lemnului și densitatea arboretului.

2.3. Obiective calitative

Modificarea zestrei ereditare a arborilor ar crea largi posibilități și în ceea ce privește ameliorarea a numeroase și extrem de importante caractere calitative, caractere supuse controlului unui număr restrâns de gene (uneori fiind implicată chiar o singură genă), mult mai puțin sau chiar deloc influențate de condițiile de mediu.

În general, se pot delimita două mari categorii de trăsături calitative, respectiv caractere extrinseci (exterioare) cum ar fi forma trunchiului, a fusului sau forma ramurilor și caractere intrinseci (interioare) ca cele legate de calitatea lemnului (fig.1).

2.3.1. Obiective calitative extrinseci

A. Rectitudinea tulpinii

O bună rectitudine (dacă ar posibil până la mugurele terminal) crește proporția de lemn utilizabil prin raportul la volumul de lemn brut total, pe când defectele de formă la nivelul tulpinii reduc în bună măsură calitatea lemnului. Cilindricitatea și rectitudinea tulpinii reprezintă principalii factori ai indicelui de zveltețe care se exprimă prin raportul dintre diametrul și lungimea fusului. Tot legat de calitatea tulpinii, se preferă formele fără înfurciri și dacă totuși acestea apar în mod repetat, se pare că ar fi un indiciu al predispoziției individuale.

De asemenea, este dorită absența unor defecte vizibile ca fibre torse, caneluri, gelivuri, etc.

B. Calitatea ramurilor

În procesul de ameliorare forestieră se urmărește obținerea de exemplare de arbori cu ramuri cât mai subțiri (noduri mai puțin profunde) și cu inserția cât mai apropiată de unghi drept și fără înfășurare pe tulpină.

Lungimea ramurilor se corelează cu lungimea coroanei și a tulpinii. Arborii cu ramuri mai scurte și cu o coroană îngustă rezistă mult mai bine la rupturile provocate de căderi masive de zăpadă moale. De asemenea, în urma elagajului, rănile sunt mai mici și superficiale iar procesul de cicatrizare este mult mai rapid.

Figura 1. Arbori plus într-o populație seminceră de molid (după Nanson, 2005)

2.3.2. Obiective calitative intrinseci

A. Însușirile lemnului

Preocupările privind calitatea lemnului au trezit un tot mai accentuat interes al specialiștilor amelioratori și prin aceea că îmbunătățirea însușirile tehnologice a căpătat o semnificație practică tot mai profundă.

Densitatea lemnului este corelată cu randamentul în pastă, calitatea pastei și a hârtiei, cu lungimea și diametrul fibrelor, cu grosimea pereților celulari și procentul de celuloză. Un grad redus de albire sau un conținut mare de compuși chimici în lemn poate reduce randamentul de producere a hârtiei, precum și calitatea acesteia.

La unele specii importante economic (pin), variabilitatea intraspecifică crescută a însușirilor lemnului, în raport cu originea geografică a proveniențelor, prezintă o importanță deosebită pentru ameliorare.

B. Rezistență și adaptare

Este vorba, în principal, despre rezistența și adaptabilitatea la unele categorii de agenți: a) climatici:

ger timpuriu autumnal, profund hibernal și târziu de primăvară

zăpadă moale

vânt

uscăciune;

b) biologici:

boli (micoze, bacterioze, viroze)

atacuri de insecte;

c) antropici:

– poluare atmosferică (CO2, SO2, NOX, O3, F, HF) – animale domestice, vânat.

Creșterea rezistenței biologice a speciilor forestiere la dăunătorii biotici și abiotici reprezintă un obiectiv cu mare valoare practică, iar eritabilitatea caracterelor legate de rezistență este foarte mare.

După Zobel (1995), majoritatea caracterelor intrinseci ale lemnului depind în mare măsură de trăsăturile extrinseci. În consecință, canalizarea eforturilor în direcția ameliorării celor din urmă prezintă urmări favorabile și importante și asupra caracterelor intrinseci.

III. AMELIORAREA ARBORILOR PRIN METODE CLASICE

În cadrul populațiilor naturale, cât și în unele populații artificiale sau plantații, ameliorarea diferitelor specii de arbori se poate face fără a se modifica rapid (“forțat”) structura genotipică a indivizilor, ci treptat, prin selecție sau hibridare a genotipurilor existente. Aceste metode se încadrează în categoria metodelor clasice (convenționale) de ameliorare genetică a arborilor și se aplică în strategii privind obținerea unor forme cu productivitate superioară (ex. selecția) sau a unor exemplare mai rezistente la atacuri masive de boli sau insecte (ex. hibridarea). În cazul existenței unei variabilități accentuate în cadrul unei populații de arbori, selecția poate avea efecte spectaculoase pentru caracterele cantitative specifice bioacumulărilor.

În cazul obținerii unor rezultate rapide în activitatea de ameliorare a arborilor, rezultate ce depind de aplicarea unor tehnici energice dar și de mare finețe asupra structurii intime a materialului genetic, sunt utilizate metodele moderne (neconvenționale), pornind cu mutageneza și terminând cu tehnicile de mare precizie și randament specifice ingineriei genetice (fuziunea de protoplaști, semințe artificiale, culturi in vitro, tehnici de electroforeză – cromatografie și până la marcheri genetici moleculari ca PCR, RFLP și amprente geneticesecvențe de ADN).

Alegerea și aplicarea diferitelor metode în procesul de ameliorare a diferitelor specii de arbori depind de obiectele urmărite în cadrul ameliorării, de strategiile adoptate, de specificul eco-biologic al speciei și, nu în ultimul rând, de posibilitățile concrete avute la dispoziție (dotare și personal calificat de specialitate). Deși aceste metode se pot aplica de sine stătător (mai ales selecția), programele tot mai complexe de ameliorare forestieră reclamă utilizarea integrată a tehnicilor și operațiilor specifice, în funcție de perspectiva evoluției unei anumite populații dar și de cerințele de moment ce apar în anumite faze ale programului. Astfel, selecția se poate aplica ușor în diferite subetape pe parcursul derulării unui program de ameliorare forestieră, prin faptul că deține largi posibilități de acționare. Pe de altă parte, mutageneza, culturile in vitro și, mai ales, micropropagarea pot scurta semnificativ perioade foarte lungi ale procesului de ameliorare, fapt cu implicații practice deosebite, ținând cont de longevitatea mare și foarte mare a speciilor de arbori.

3.1 Selecția

În sens strict genetic, selecția reprezintă o regrupare într-un număr redus de exemplare de arbori, a unor gene sau combinații valoroase de gene cu efect favorabil pentru obiectivul de ameliorare urmărit (Lucău 1998). Din păcate, în cadrul arboretelor naturale sunt foarte mici șanse ca să existe astfel de exemplare de arbori datorită faptului că acțiunea selecției naturale se exercită cu intensități variabile asupra diferitelor caractere și, în plus, majoritatea caracterelor (mai ales cele cantitative, legate de bioproductivitate) sunt supuse unui control genetic extrem de complex având un pronunțat determinism poligenic. Genele implicate în manifestarea fenotipică a caracterelor menționate au o largă răspândire în cadrul unei populații datorită unei ample panmixii, iar, pe de altă parte, aceste sisteme poligenice sunt extrem de dificil de identificat astfel încât doar exemplarele purtătoare ale acestor combinații să poate fi identificate și analizate.

Prin dezvoltarea tehnicilor specifice geneticii cantitative și o interpretare a acțiunii genelor implicate prin extrapolare la caracterele fenotipice, ar fi, în prezent, posibilă o selectare a unor exemplare de arbori posesori de combinații deosebit de utile în cadrul ameliorării și efectuarea, în continuare, de hibridări între indivizii selectați în scopul realizării unui cumul de gene favorabile la un număr mai mic de arbori.

Selecția fenotipică ar consta în alegerea dintr-o populație a unor arbori bine dotați după simpla observare a manifestării unor caractere exterioare.

Selecția genotipică constă în selectarea unor exemplare valoroase scopului urmărit în ameliorare numai în urma efectuării unui amplu studiu privind valoarea ereditară a unor caractere, studiu ce ar avea la bază analize și testări comparative.

Înainte de a prezenta selecția ca metodă clasică de ameliorare forestieră, vom menționa câteva dintre cele mai importante principii ce stau la baza inițierii și derulării oricărui program de ameliorare a arborilor bazat pe această importantă metodă.

3.1.1. Principii fundamentale ale ameliorării prin selecție

Cele mai sigure garanții privind eficacitatea unui program de ameliorare forestieră bazat pe selecție sunt oferite de alegerea și utilizarea celor mai bune proveniențe. Prin termenul de proveniență se înțelege locul în care se găsește o populație artificială (furnizor de material reproducător), având ca origine locul unde se găsește populația naturală, sinonimă, în acest caz, cu un ecotip (Nanson, 2005). De exemplu, duglasul ca proveniență Darrington (statul Whashington ,USA) furnizează semințe din populația autohtonă din această regiune, având rezultate excelente la acțiuni de reîmpădurire aproape peste tot: se poate afirma că Darrington reprezintă o bună proveniență.

În ciuda longevității mari a arborilor comparativ cu alte specii vegetale, selecția și efectele ei, în limita posibilităților, trebuie urmărită pe parcursul mai multor generații. Culturile comparative de proveniențe, în acest caz, pot avea un rol extrem de important și determinant în ceea ce privește depistarea mai rapidă a efectelor selecției. Pe de altă parte, utilizarea micropropagării la culturile in vitro poate scurta semnificativ, la unele specii de arbori, perioadele lungi de timp ce se scurg între cicluri succesive de selecție.

Numărul de caractere urmărite în cadrul unui ciclu de ameliorare prin selecție este de preferat să se limiteze la 2, cel mult 3, situație în care câștigul genetic este superior atât în cazul caracterelor cantitative, cât mai ales în cazul celor calitative unde eritabilitatea (proporția în care un caracter este transmis la descendență) este maximă.

Selecția artificială nu poate să fie dirijată pe traiectul selecției naturale, întrucât cea din urmă cu greu poate fi depășită privitor la unele caractere și adaptări formate într-un lung proces grevat pe însăși evoluția unei populații în cadrul unei anumite stațiuni. De aceea, în cadrul inițierii și derulării unui proces de ameliorare forestieră bazat pe selecție trebuie ținut cont de specificul fiecărei populații locale și de condițiile staționale ce au stat la baza evoluției acesteia.

Întotdeauna, demararea oricărui program de ameliorare forestieră prin selecție se va face în cadrul unor populații mari și foarte mari de arbori, acest fapt certificând existența unei foarte largi baze genetice printr-un grad mare de heterozigoție. În acest mod este evitată apariția efectelor nedorite ale consangvinizării, fenomen coroborat cu diminuarea semnificativă a bazei genetice inițiale.

În cele mai multe cazuri, rezultatele cele mai rapide ale acțiunii selecției sunt remarcate în cadrul regenerărilor artificiale în comparație cu populațiile naturale de arbori, deoarece, la acestea din urmă, nu este posibilă și o testare a descendențelor, aceasta reprezentând o condiție obligatorie în practica ameliorării forestiere.

În general, înainte de inițierea unui program de ameliorare forestieră se recomandă efectuarea unei inventarieri a populațiilor existente și a unor proveniențe remarcabile, precum și o estimare a gradului de variabilitate intraspecifică generală existent atât pentru speciile autohtone, cât și pentru cele exotice din cultură (Stănescu, 1983).

3.1.2. Formele selecției artificiale

Marea diversitate a formelor selecției a făcut necesară o diferențiere a acestei metode pe mai multe tipuri de criterii.

Astfel, în funcție de valoarea relativă a exemplarelor, care constituie obiectul direct al activității în munca de ameliorare a diferitelor specii de arbori, se disting:

selecția pozitivă, în situația în care sunt selectați numai arborii de calitate (de regulă numai arbori plus cu creșteri excepționale și calități deosebite), în timp ce restul de arbori sunt îndepărtați total sau parțial, în funcție de priorități, acest procedeu fiind caracteristic răriturilor selective;

selecția negativă, ce se practică în arboretele surse de semințe din care se extrag arborii slab dotați, defectuoși și al căror fond slab de gene nu ar trebui să participe la perpetuarea speciei, conservându-se arborii valoroși din punct de vedere biologic și economic. În final, selecția negativă are efecte pozitive și este practicată la lucrările de îngrijire de igienizare și stimulare a regenerării naturale.

După natura caracterelor urmărite în ameliorare, există selecția fenotipică și selecția genotipică, despre care s-au făcut precizările potrivite în subcapitolul anterior.

În funcție de gradul de intensivitate al lucrărilor, putem avea:

selecție în masă practicată mai ales în cadrul executării unor lucrări de îngrijire în cadrul arboretelor surse de semințe. În acest caz se trece la alegerea unui număr relativ mare de arbori valoroși de la care se recoltează semințe amestecate, rezultate în urma unui proces de fecundare liberă, iar evoluția descendenței nu este urmărită individual.

selecția individuală se execută în cadrul familiilor unde arborii se înmulțesc sexuat (din sămânță) sau în sistem clonal (multiplicare vegetativă). În cazul aplicării acestui tip de selecție, exemplarele valoroase de arbori sunt urmărite individual și în descendență, evoluția fiecărui individ interesând amelioratorii prin prisma unor hibridări și selecții viitoare.

După efectele avute asupra structurii genetice a populațiilor se disting trei tipuri de selecție:

selecția stabilizatoare prin a cărei acțiune sunt eliminate formele de la periferia unei populații, care sunt mai puțin adaptate, dar și exemplarele cu valoare scăzută de reproducere și supraviețuire. În acest mod sunt conservate și promovate fenotipurile cu capacitate mare de adaptare și reproducere în cadrul populației, acestea fiind cantonate,de regulă, în partea de mijloc (fig.2.1). Când condițiile de mediu sunt relativ constante, între acțiunea factorilor specifici măririi variabilității genetice (recombinarea, mutația, migrația) și acțiunea selecției naturale se ajunge la un echilibru, în structura genetică a populației fluxul genelor și a genotipurilor rămânând constant pe o anumită perioadă de timp (homeostazie genetică);

selecția disruptivă reprezintă opusul selecției stabilizatoare, în sensul că acțiunea acesteia favorizează câteva fenotipuri (în funcție de specificul acțiunii și optimul fiecărui fenotip), restul fenotipurilor intermediare fiind defavorizate în mod discriminator (fig. 2.2). În acest mod răspunsul populației pe ansamblu la acest tip de acțiune se va caracteriza, printre altele, prin apariția unei pronunțate discontinuități în ceea ce privește variabilitatea. Astfel sunt evidente manifestările unui pronunțat polimorfism genetic, materializat prin apariția a numeroase forme distincte în cadrul fiecărui optim și, în final, o tendință clară de divergență și izolare, respectiv apariția unor subpopulații adaptate local. Efectele acestui tip de selecție sunt foarte rar aplicate în practică și numai în cazul unor caractere supuse unui puternic control genetic. Intervențiile neraționale, uneori iresponsabile, în viața pădurii pe de o parte, sau efectul catastrofal al unor calamități naturale, pe de altă parte, nu pot avea alt efect decât distrugerea sau alterarea unor ecosisteme forestiere întregi și o reducere dramatică a diversității genetice a populațiilor și a variabilității intraspecifice la arbori.

selecția direcțională se caracterizează prin acțiune sa alternativă asupra unor forme aflate la periferia unei populații, prin care sunt promovate fie unele forme superioare sub aspectul unor caracteristici fenotipice (așa numitele plusvariante), caz în care avem o selecție direcțională progresivă (fig.2.4), cu efecte pozitive și asupra fenotipurilor comune, sau asupra unor exemplare mai puțin valoroase (minusvariante), respectiv selecție direcțională regresivă (fig.2.3). Evident, în practica silvică interesează cel mai mult efectele selecției progresive prin faptul că se urmărește o înmulțire constantă a numărului de arbori de valoare, cu mult peste media populației prin prisma dimensiunilor, volumului total, etc. În anumite situații (mult mai rar), este promovată în ameliorarea forestieră și selecția regresivă, mai ales când sunt urmărite unele minusvariante utile în anumite condiții specifice zonei (ca de ex. arbori cu ramuri subțiri și coroane înguste preferați celor cu lemn de calitate) (fig. 2).

În funcție de natura genotipurilor din populație, promovate sau eliminate prin selecție, se diferențiază: selecție în favoarea sau împotriva homozigoților dominanți (a genelor aditive), selecție în favoarea sau împotriva heterozigoților, selecție în favoarea sau împotriva homozigoților recesivi. Având în vedere mărimea coeficienților de selecție care se folosesc, adică intensitatea selecției, aceste tipuri de intervenție pot fi parțiale sau totale (Stănescu, citat de Lucău,1998).

3.1.3. Determinarea efectelor selecției

Eficiența unui program de ameliorare forestieră este concretizată prin gradul de rentabilitate a metodei (în cazul nostru este vorba de selecție), legat de parametri specifici și tehnologia utilizată, dar și de natura speciei care face obiectul activității de ameliorare.

Figura 2. Forme ale selecției după structura genetică a populației (după Lucău 1998)

Este evident faptul că scopul oricărei inițiative privind derularea unui program de ameliorare bazat pe selecție îl constituie realizarea unui câștig de producție ce se estimează prin calcularea câștigului genetic (ΔG), parametru exprimat prin relația:

ΔG = ih2σF

în care:

i – reprezintă intensitatea selecției și este dată de raportul n/N (n – nr. de arbori selecționați și N – nr. total de arbori); este factorul ce poate cel mai mult influențat de către silvicultor; h2 – reprezintă eritabilitatea unui caracter urmărit în ameliorare și este un factor fix

asupra căruia silvicultorul nu poate interveni în nici un fel; σF – este ecartul tip fenotipic sau rădăcina pătrată a varianței fenotipice ce poate estima gradul de variabilitate al caracterului respectiv și acesta poate varia de la o stațiune la alta sau de la un caracter la altul.

Câștigul genetic poate fi calculat în valori absolute, respectiv în unități de măsură specifice caracterului considerat sau în valori relative, cu ajutorul raportului dintre termenii ecuației de mai sus și valoarea genotipică medie (G) (Stănescu, citat de Lucău,1998):

ΔG ih2σF

G G

Procentul de arbori promovați din efectivul total al unei populații ne precizează dimensiunea reală a proporționalității directe dintre câștigul genetic și intensitatea selecției (i). Pe de altă parte, intensitatea selecției, oricât de mare ar fi la nivelul unei populații de arbori, nu poate genera un câștig genetic substanțial atunci când existentă o slabă eritabilitate (h2) a caracterului urmărit în ameliorare. În sfârșit, câștigul genetic este influențat și de ecartul de tip fenotipic (σF), prin aceea că există o mult mai mare posibilitate de a depista prin selecție genotipuri valoroase prin prisma existenței unei mari variabilități la un anumit caracter urmărit în procesul ameliorării.

Întotdeauna, în cadrul arboretelor surse de semințe, chiar și în condițiile aplicării unui sistem intensiv de selecție, câștigul genetic va fi extrem de mic, în primul rând datorită existenței unui coeficient de eritabilitate redus pentru majoritatea caracterelor. În urma efectuării selecției în masă a indivizilor rezultați prin polenizare liberă, câștigul genetic este detectabil și crește pe măsura aplicării unor rărituri ce favorizează arborii cei mai valoroși. O cu totul altă situație se înregistrează în cadrul livezilor semincere de descendențe materne în care, în urma selecției celor mai bune familii și a celor mai valoroși indivizi, câștigul genetic crește semnificativ. Cele mai spectaculoase creșteri ale câștigului genetic se înregistrează în cadrul livezilor semincere de descendențe biparentale, în care exemplarele plantate rezultă întotdeauna din încrucișarea controlată a 2 genitori cunoscuți (tab.1).

Tabelul 1

Câștiguri genetice relative obținute la diferite forme ale selecției, după eritabilitate (după

Wright, 1963, citat de Lucău, 1998)

3.1.4. Ameliorarea prin selecție – etape generale

3.1.4.1. Ciclul de selecție și ciclul de ameliorare

A. Obținerea de informații și calculul parametrilor genetici pentru stabilirea căilor optime de selecție

O ameliorare genetică, cu adevărat eficientă, se poate îndeplini numai atunci când toate caracterele urmărite sunt controlate genetic și prezintă în cadrul populației stabilite un suficient grad de variabilitate. Pe de altă parte, este foarte important de cunoscut gradul de legătură existent între caractere, cunoscut fiind faptul că selecția pentru o anumită trăsătură poate antrena și modificarea altei trăsături datorită existenței fenomenelor de pleiotropie și linkage.

Controlul genetic și manifestările fenotipice ale diferitelor caractere ale organismelor depind foarte mult de factorul genetic, de factorul mediu, cât și de interacțiunea acestora:

F = G + M + GM

în care, F – valoarea fenotipică, G – structura genotipică și M – influența mediului.

Factorul genetic rămâne, pentru majoritatea caracterelor, factorul determinant și, în funcție de modul său de acțiune, se manifestă sub două forme de bază:

gene cu efect aditiv (A), ce se transmit prin reproducere pe bază de hazard, sunt independente față de alte gene și au efect propriu asupra manifestării anumitor caractere;

gene complexe care, de regulă, interacționează alelic și nealelic (I) cu multe alte gene, cu efect de dominanță (D) în cadrul caracterelor specifice bioacumulărilor (cantitative), acestea reprezentând efectul neaditiv (fig. 3).

Figura 3. Efectele interacțiunii dintre alela A2 și alte alele, fie din același locus fie din loci

diferiți (după Kremer, citat de Lucău, 1998)

Prin urmare, efectele de ansamblu al tuturor genelor implicate (G) asupra unui caracter (ex. volumul unui arboret) s-ar rezuma prin relația:

G = A + D + I

Este deja cunoscut faptul că efectele aditive (D și I ) dețin ponderea cea mai însemnată în ceea ce privește exprimarea fenotipică a celor mai importante caractere urmărite într-un program de ameliorarea genetice, numai că aceste efecte nu pot fi calculate individual, ci numai estimate global.

Referitor la existența unui anume grad de variabilitate fenotipică pentru diferite caractere, se poate afirma că în populațiile forestiere există un grad foarte mare de variabilitate, ceea ce, comparativ cu plantele cultivate (caracterizate de existența unei înguste variabilități genetice) reprezintă un avantaj enorm privind eficiența unor metode de selecție practicate într-un program de ameliorare. Astfel, prin aplicarea selecției pe termen scurt a unor exemplare de mare valoare și multiplicarea în masă a acestora, pe cale sexuată sau în sistem clonal, prezintă o deosebită utilitate în practica silvică. Estimarea gradului de variabilitate în cadrul unei populații forestiere este astăzi din ce în mai precisă, grație metodelor tot mai precise și performante, cu precădere cele bazate pe marcheri biochimici și moleculari.

Datorită existenței numeroaselor legături de ordin genetic între diferite caractere urmărite în ameliorare, selecția poate avea efecte diferite, în funcție de natură legăturilor existente. În funcție de aceasta, pot exista trei situații:

selecție fără eficiență, atunci când există legături defavorabile între anumite caractere urmărite a fi ameliorate;

selecție relativ eficientă, atunci când sunt legături puțin defavorabile între caracterele urmărite;

selecție simultană foarte eficientă, dacă între caracterele vizate nu există legături sau acestea sunt favorabile.

Din păcate, legăturile ce aparțin primei categorii sunt cele mai multe într-o populație de arbori și, de aceea, stabilirea unei metodologii adecvate de selecție implică mari riscuri și creează multiple probleme amelioratorilor. Evitarea sau reducerea la minimum a apariției acestor riscuri implică apelarea la metode specifice geneticii cantitative, respectiv evaluarea unor parametrii statistici ca eritabilitatea unui anumit caracter, ecartul tip fenotipic sau coeficientul de corelație genetică pentru legăturile dintre anumite caractere. Populația de arbori destinată culegerii și interpretării acestor date și în care se realizează încrucișări libere sau controlate între indivizi reprezintă populația de informare (I).

Cunoașterea acestor parametri ar crea posibilitatea efectuării unei evaluări a eficacității selecției, eficacitate exprimată concret prin calcularea câștigului genetic dar și estimarea valorii genotipice a unui arbore, plecând de la valorile sale fenotipice.

B. Stabilirea celor mai valoroase genotipuri

Selecționarea celor mai valoroși arbori, pe baza trăsăturilor lor fenotipice, se face pe parcursul lucrărilor de îngrijire în pădure. Totuși, pentru îndeplinirea unui program riguros de ameliorare, este necesară evaluarea exemplarelor selecționate și din punct de vedere al valorii lor genotipice, inclusiv a valorii aditive. Acele populații care sunt formate din grupuri de arbori, potențiali candidați la selecție, și din care sunt adunate informații și date privind valorile fenotipice specifice selecției, constituie populațiile de evaluare (E).

În funcție de datele culese, valorile estimate și, ținând cont și de legăturile dintre caractere, se poate definitiva acțiunea de selectare a celor mai valoroase genotipuri. Ansamblul de exemplare rezultat în urma selecției constituie populația de ameliorare. C. Încrucișările dintre genotipurile selecționate

În acest stadiu al populației de ameliorare, selecția se poate opri, iar exemplarele cele mai valoroase pot fi multiplicate intensiv (mai ales în sistem clonal), aceasta constituind sursa de bază în programe de reîmpăduriri. Pe de altă parte, populația de ameliorare constituită poate reprezenta un punct de plecare pentru o nouă ameliorare, această populație devenind practic o nouă populație sălbatică. În urma încrucișărilor care se efectuează între indivizii populației de ameliorare au loc noi recombinări de gene, rezultă noi genotipuri, posesori a noi constelații de gene, ce pot servi la realizarea altor obiective urmărite în ameliorare. În acest stadiu, cea mai importantă operațiune este cea de realizare a încrucișărilor controlate. Sistemul vegetativ ar fi acum cu totul contraindicat pentru realizarea unui spor al câștigului genetic, deoarece nu este valorificat potențialul ereditar al noilor forme selectate.

Cele trei operații prezentate (A,B,C) stau la baza formării unui ciclu de selecție, fiecare etapă având ca suport specific următoarele formațiuni (fig. 4):

– dispozitive experimentale cu diferite populații de arbori; – teste de descendențe (pentru populații de informare și evaluare); – parcuri de clone (pentru populații de ameliorare) (Lucău, 1998).

Figura 4. Ciclul de selecție (I – populație de infirmare, E – populație de evaluare)

3.1.4.2. Repetarea ciclurilor de selecție

În funcție de obiectivele urmărite în cadrul unui program de ameliorare forestieră, dar și de dispozitivul experimental utilizat, vor evolua și tehnicile de selecție, urmarea firească fiind separarea populației inițiale în mai multe subpopulații. Acest fapt se datorează urmăririi în ameliorare a mai multor obiective, cantonate, în primă fază, într-un singur dispozitiv experimental. De aceea, principiul de bază în cadrul programelor moderne de ameliorare se referă la repetarea ciclurilor de selecție prin care câștigurile genetice se acumulează pe parcursul derulării întregului program de ameliorare. De remarcat faptul că pentru fiecare nou ciclu de selecție, populația de plecare este de fapt populația de ameliorare a ciclului precedent. Acest tip de selecție se numește selecție recurentă intrapopulațională și constituie metoda curentă de ameliorare prin selecție a principalelor specii forestiere dar care fixează numai efectele aditive (proprii genelor ce controlează anumite caractere) (fig. 5)

O alternativă mai completă a acestui tip de selecție este reprezentată de selecția recurentă reciprocă, în urma căreia populația de ameliorare inițială este subdivizată în 2 subpopulații, A și B, ameliorate independent prin selecție recurentă normală. Acest subtip de selecție permite valorificarea completă și a efectelor neaditive, acestea din urmă constituind baza realizării unor câștiguri genetice reale în ameliorarea forestieră. Acest proces este asigurat prin încrucișarea controlată, la un moment dat, a celor mai bune exemplare din cadrul celor două subpopulații, iar rezultantele ar putea fi purtătoare a celor mai interesante combinații de gene ce controlează caractere urmărite în ameliorare. Un exemplu concludent în acest sens îl constituie pinul maritim, specie la care s-a observat că aplicarea selecției recurente la 2 subpopulații separate (cea olandeză viguroasă dar cu formă defectuoasă și cea corsicană mai slab viguroasă dar cu formă bună) a dus la obținerea unor proveniențe constituite din arbori cu cele mai bune rezultate la încrucișările dirijate (Kremer citat de Lucău 1998).

Figura 5. Repetarea ciclurilor de selecție – selecția recurentă intrapopulațională (după Lucău, 1998)

3.1.5. Limitele selecției

Există două categorii principale de limite ce pot apărea pe măsura repetării ciclurilor de selecție, respectiv limite genetice și limite metodologice, fiecare categorie având un anume grad de impact asupra variabilității populației de ameliorare sau asupra gradului de dificultate al metodologiei utilizate în cadrul programelor de ameliorare forestieră.

3.1.5.1. Limite genetice și biologice

Limitele genetice se fac simțite atunci când se face o repetare a ciclurilor de selecție timp de mai multe generații și, în consecință, apare pericolul scăderii, uneori drastice, a bazei genetice, în sensul reducerii gradului de heterozigoție și creștere a celui de consangvinizare la nivelul populațiilor de ameliorare și de producție. Creșterea gradului de înrudire între exemplarele supuse încrucișărilor controlate, în acest caz, devine tot mai evidentă, pe măsura reducerii numărului de indivizi. Instalarea unui început de depresiune consangvină este de nedorit și, pentru acest fapt, se pot lua unele măsuri de contracarare, ca de exemplu:

alegerea unei populații de plecare cu un efectiv numeros și un grad mare de heterozigoție;

urmărirea precisă a pedigreului în cursul generațiilor – măsură destul de dificil de realizat dar absolut necesară, mai ales în cazul populațiilor reduse numeric.

Din păcate, încă nu este posibilă o calculare precisă a taliei unei populații de plecare, întrucât acest lucru depinde de o multitudine de factori, dintre care cei mai importanți sunt legați de numărul și natura criteriilor de selecție, de numărul și frecvența genelor implicate în ameliorare și de timpul necesar derulării programului de selecție.

Limitele biologice se fac simțite doar în corelație cu o serie de caracteristici biologice specifice arborilor ca perenitatea sau lungimea generațiilor și, cel mai adesea, îngreunează efectuarea unei evaluări și caracterizări mai rapide a genotipurilor existente. În al doilea rând, acest tip de limite afectează rotația generațiilor, în sensul prelungirii perioadelor de succesiune.

3.1.5.2. Limite metodologice

De cele mai multe ori, în stabilirea unei strategii de ameliorare forestieră este luată în calcul însemnătatea economică a unei anumite specii de arbore urmărită în programul de ameliorare, precum și evoluția utilizării varietăților obținute în acest program.

Datorită faptului că pe timpul derulării activității de ameliorare pe bază de selecție pot apărea, în diferite etape ale programului, noi obiective conexe și contingențe exterioare, se recomandă ca la inițierea oricărui program să se pornească cu o paletă cât mai largă privind metodele de lucru, fapt ce poate asigura atât o anumită suplețe a programului pe ansamblu, cât și continuitatea acestuia.

Aceste deziderate pot fi atinse în cadrul unui program complex de ameliorare forestieră dacă se pornește cu un efectiv numeros de exemplare în populația inițială, coroborat cu o intensitate moderată a selecției, precum și o divizare a acestei populații în mai multe subpopulații în care să se realizeze independent selecția recurentă. Acest din urmă aspect ar permite o acțiune de regionalizare a programului de ameliorare, în funcție de anumite zone ecologice specifice, cu efect benefic asupra unor genotipuri ce prezintă o instabilitate intrinsecă accentuată.

3.1.6. Strategii de selecție

A. Strategii pe termen lung

Acest tip de strategii este potrivit pentru unele specii forestiere importante, cu cicluri lungi și foarte lungi de viață, utilizate pe scară largă în activități de împădurire și reîmpădurire (stejari, molid sau fag). În cadrul adoptării acestor strategii, se practică selecția de tip recurent în cadrul unor populații de ameliorare cu un efectiv de pornire de cel puțin câteva sute de indivizi, cu pondere majoritară deținută de arborii “plus”. Derularea acestor strategii de ameliorare la speciile menționate se face pentru mai multe generații succesive, cu înființare de livezi de semințe și realizarea unor varietăți policlonale deosebit de valoroase, situație ce permite și o acumulare însemnată a câștigului genetic.

B. Strategii pe termen mediu

Aceste strategii sunt potrivite pentru specii de arbori cu cicluri de viață mai scurte dar care sunt utilizate,de asemenea, în activități de împădurire și reîmpădurire. Aici, cele mai potrivite specii de arbori sunt cele care au un efectiv ceva mai redus în populațiile de plecare (pin, cireș sau larice), selecția, în acest caz, urmărind caracterizarea exemplarelor sub aspectul capacității lor de încrucișare dar și prin eficacitatea în sistem clonal, mai ales în ciclul inițial de selecție. Diferitele varietăți obținute (hibride, sintetice sau policlonale) asigură, de asemenea, acumularea câștigului genetic de la prima generație (Lucău, 1998).

C. Strategii pe termen scurt

În condițiile unui climat cu influențe marine sau oceanice, aceste strategii se aplică la unele specii utilizate în acțiunea de împădurire și reîmpădurire (ex. cedrul) și, în care, selecția conduce la identificarea celor mai valoroase populații din cadrul unor teste comparative de proveniențe, în vederea decelării acumulării câștigului genetic.

În funcție de specie sau de cerințele economice de moment, apărute în cadrul derulării unui anumit program de ameliorare forestieră, este posibil ca o strategie de durată medie sau chiar scurtă de timp să evolueze întruna de lungă perioadă. În acest caz, este posibil ca o populație de ameliorare de la o strategie de termen scurt să se transforme întruna de plecare la o strategie de termen lung.

3.1.7 Etapele principale ale unui program de selecție

Orice program de ameliorare forestieră bazat pe selecție va include obligatoriu parcurgerea unor etape importante, după cum urmează:

alegerea proveniențelor;

identificarea de populații semincere; – crearea populațiilor de producție.

3.1.7.1. Alegerea proveniențelor

În cadrul selecției, alegerea proveniențelor este prima și poate cea mai importantă etapă, întrucât o ameliorare bazată exclusiv pe proveniențele locale ar avea un inconvenient major și anume, cel al desfășurării ameliorării într-un ritm mult prea lent, cu creșteri mari ale costurilor. Pe de altă parte, nu întotdeauna proveniențele locale sunt cele mai productive și cel mai bine adaptate. În aceste condiții, este extrem de utilă existența unei solide baze de date (bănci de date) privind inventarierea completă a celor mai valoroase proveniențe de la o specie sau alta de arbori.

Operațiuni specifice

A. Crearea de plantații comparative de proveniențe

În cadrul acestei operațiuni apar 3 probleme importante ce trebuie rezolvate:

Eșantionajul proveniențelor reprezintă operațiunea cea mai dificilă deoarece este extrem de dificil de a se stabili cu exactitate zonele de delimitare (unde începe și unde se termină arealul unei proveniențe), cu atât mai mult cu cât, la cele mai importante specii de arbori din punct de vedere economic, arealul natural este foarte întins. În cadrul acestor areale continue, variațiile majorității caracterelor sunt gradate (variații clinale) și, din acest punct de vedere, este foarte dificil de a se fixa exact limitele fiecărei proveniențe. În aceste condiții, numărul de proveniențe fiind foarte mare, este necesară realizarea unui eșantionaj al acestora, în final, alegându-se câte o proveniență din fiecare regiune.

Stabilirea siturilor experimentale se face cu precădere în regiunile reproducătoare cele mai importante dar și în acele zone în care există posibilități de apariție a unor interacțiuni pedoclimatice puternice. De exemplu, fagul, în această privință, este extrem de sensibil la modificări de la nivelul substratului și manifestă puternice interacțiuni, după natura calcaroasă sau silicioasă a substratului, fapt dovedit de existența unor ecotipuri specifice substratului calcaros.

Alegerea proveniențelor se face după câteva criterii, dintre care cel mai important este cel al adaptării. Capacitatea de adaptare se apreciază în funcție de rata de supraviețuire, de rezistența la atacuri de boli și dăunători sau la factori abiotici nefavorabili (căderi masive de zăpadă, vânt, ger, arșiță, etc.).

Pe lângă estimarea capacității de adaptare, în alegerea proveniențelor se mai ține cont de vigoarea de creștere, dar și de calitatea lemnului. De asemenea, se va avea în vedere plasticitatea, în acest sens preferându-se proveniențele mai puțin interactive și care sunt mai ușor adaptabile la situri experimentale diverse.

B. Alegerea proveniențelor în lipsa culturilor comparative

În cazul unor specii autohtone sau exotice ale căror culturi sunt relativ bine adaptate, se pot alege proveniențele locale care sunt deja bine adaptate și corespund întrutotul principalului criteriu de selectare a proveniențelor. În acest caz nu se mai pune problema apariției unor eșecuri în ceea ce privește eficiența acțiunii de ameliorare prin selecție și, în subsidiar, în cadrul arealului natural al speciei se realizează conservarea unui fond valoros de germoplasmă.

C. Introducerea de specii exotice

Sunt destul de numeroase situații când are loc introducerea de specii lemnoase exotice în diverse culturi forestiere, însă aici se pune problema efectuării unor testări prealabile pentru a se putea determina gradul de compatibilitate a noilor forme la noile locații. Efectuarea acestor operațiuni prezintă adesea riscuri foarte mari și pierderi pe măsură și, de aceea, este obligatorie efectuarea acestor testări, chiar și atunci când condițiile din regiunea de origine sunt foarte asemănătoare cu cele din regiunea de introducere.

În acest mod au fost introduse în Europa mai multe specii lemnoase aduse din Asia sau America, în scopul reîntregirii fondului european de specii lemnoase serios afectat de ultima glaciațiune. Astfel s-au introdus mai multe specii de pin, de salcâm, platan negru, nuc negru, etc.

D. Evaluarea proveniențelor

Identificarea precisă și evaluarea eficientă a proveniențelor și a variabilității genetice a arborilor s-au putut realiza doar în urma punerii la punct a metodelor moderne de utilizare a marcherilor biochimici și genetici, în acest fel putându-se delimita cu precizie diverse populații și caracteriza proveniențele aparținând diverselor specii forestiere. Analizele complexe de electroforeză au permis ca, pe baza studiului izoenzimelor, să se identifice și să se inventarieze numeroase populații de arbori, precum și originea proveniențelor. Stabilirea riguroasă și precisă a gradului de variabilitate genetică existent în cadrul acestor forme a putut fi realizată în urma perfecționării tehnicilor de vârf ale tehnologiilor specifice ingineriei genetice. Polimorfismul genetic (al macromoleculei de ADN) s-a putut identifica cu ajutorul metodologiei de analiză a secvențelor ADN (amprente genetice), analiză ce a permis identificarea unui foarte mare număr de loci genici.

3.1.7.2. Identificarea populațiilor semincere

Arboretele surse de semințe sau populațiile semincere sunt reprezentate de comunități de arbori pure sau de amestec, majoritatea naturale, care se caracterizează prin calitate și productivitate (masă lemnoasă și fructificare) net superioare altor tipuri de arborete, dar și prin capacitate deosebită de adaptare la condițiile pedoclimatice ale diferitelor tipuri de stațiuni. Aceste formațiuni forestiere conțin un număr mare de arbori plus și constituie sursa principală pentru inițierea și dezvoltarea programelor de selecție forestieră bazate pe selecție, reprezentând așa numitele populații de plecare.

În urma derulării amplului program de cartare seminologică la principalele specii forestiere din țara noastră, program inițiat și coordonat de către reputatul cercetător silvic Valeriu Enescu în perioada 1965 – 1970 și reactualizat între anii 1972 – 1973, s-au identificat și selecționat peste 4100 de arborete surse de semințe. Dintre acestea, peste 3000 aparțin mai multor specii de rășinoase (molid, brad, pin, larice), iar restul, de peste 1100, la diferite foioase (fag, cvercinee, plop alb, anin negru, frasin, tei, salcâm, etc.).

În funcție de origine, proveniență, compoziție, clasă de producție, categorii de calitate, elagaj, starea fitosanitară, vârstă și suprafață ocupată, populațiile semincere din țara noastră se împart în două mari categorii:

arborete surse de semințe de categoria A (plus) care sunt cele mai valoroase populații surse de semințe și conțin cel mai mare număr de arbori plus. Aceste formațiuni forestiere, care constituie și cele mai valoroase surse de germoplasmă forestieră, au un fond genetic intact și deosebit de valoros, sunt excluse de la tăieri și produc mari cantități de semințe elite a căror valoare genetică este din plin confirmată prin culturi comparative de proveniențe și teste de descendențe. Aceste populații ocupă suprafețe limitate, totalizând cca. 10.000 ha, din care 7000 ha la rășinoase și cca. 3000 ha pentru foioase;

arborete surse de semințe de categoria B (normale) reprezentate de formațiuni forestiere ce conțin populații de arbori cu semințe netestate și ocupă aproximativ 100.000 ha, din care 75.000 ha pentru rășinoase și cca. 25.000 ha la foioase.

Arboretele din prima categorie se pot transforma în rezervații de semințe, cu condiția ca aceste populații să fie izolate de surse de contaminare cu polen aparținând unor arbori de calitate inferioară. Izolarea se poate face prin crearea unei benzi de izolare, cu o lățime cuprinsă între 300 și maximum 1000 m. Dacă acest lucru, din diverse motive, nu se poate înfăptui, atunci se procedează la extragerea și îndepărtarea exemplarelor de arbori deficitari ca formă sau care produc cantități scăzute de semințe și de slabă calitate (selecție negativă). În interior se mai pot executa și lucrări de îngrijire sau răriri adecvate și de refacere.

3.1.7.3. Crearea populațiilor de producție (plantații semincere, plantaje)

Materialul biologic obținut în urma aplicării programului de selecție constituie un material deosebit de valoros din punct de vedere genetic și se impune multiplicarea masivă a acestuia pentru obținerea populațiilor de producție de semințe sau de butași. Aceste tipuri de formațiuni forestiere sunt principalii furnizori de material biologic (semințe, butași, altoaie) forestier de calitate necesar reîmpăduririi.

Principalele tipuri de livezi de semințe din țara noastră au fost și sunt înființate în funcție de sistemul de reproducere utilizat, respectiv reproducere sexuată prin care semințele determină o mărire considerabilă a frecvenței genelor cu efect favorabil sau sistem clonal (în special butași) ce asigură o păstrare integrală a genotipurilor valoroase selectate. Acest ultim sistem se aplică însă la un număr limitat de specii (unele foioase cu o predilecție intrinsecă pentru producerea de butași sau drajoni) și la un număr redus de indivizi (fig. 8).

În figura de mai jos sunt redate schematic cele mai reprezentative tipuri de livezi de semințe, în funcție de sistemul de reproducere care stă la baza creării acestor populații forestiere.

1. Livezi de semințe în sistem vegetativ (plantaje în sistem clonal)

Livezile de clone (parcuri de clone) sunt plantaje formate din mai puține exemplare (se instalează cu densitate mică de 200 până la max. 500 arbori/ha) și rezultă din butași sau grefe recoltate de la indivizi extrem de valoroși (arbori plus), selecționați în funcție de valoarea lor fenotipică și genotipică. Este recomandat ca la înființarea unei astfel de arboret să se pornească cu material clonal provenit de la minimum 30 de surse neînrudite, în scopul menținerii unui grad cât mai mare de heterozigoție și de a se evita, în acest fel, apariția oricărui semn al presiunii de consangvinizare.

Livezi de clone pentru hibridare (livezi de semințe biclonale) sunt livezi instalate pentru a se obține hibrizi interspecifici, prin polenizări libere sau controlate, arbori cu o puternică manifestare a fenomenului de heterozis. Exemplarele donatoare de material clonal sunt selecționate dintre cele care au dovedit, în prealabil, o deosebită capacitate de combinare și au semințe performante și în ceea ce privește capacitatea de germinație.

Figura 6. Tipuri de livezi de semințe (după Lucău, 1998)

2. Livezi de semințe în sistem de reproducere sexuată

Tipurile de livezi de semințe din această categorie au în compoziția lor un număr mare și foarte mare de indivizi, la instalarea acestora pornindu-se cu densități cuprinse între 2500 și 4000 de arbori/ha.

Livezi de descendențe materne (plantaje de semifrați) sunt acele livezi în care indivizii provin din semințe recoltate de la arbori plus și sunt rezultatul unei polenizări libere, cunoscându-se numai genitorul de pe linie maternă. Este recomandată înființarea acestui tip de livezi de semințe pentru unele specii de arbori la care polenizarea controlată este dificil de realizat (arțari, stejari).

Livezi de familii cu repetiții sunt plantaje ce conțin în compoziția lor indivizi ce

provin din polenizări dirijate.

Livezi de descendențe biparentale (plantaje de frați buni) sunt plantajele cele mai performante pentru unele specii importante (molid, pin silvestru, larice, brad, mesteacăn, plopi) și, la care, polenizarea controlată se realizează destul de ușor. Aici, arborii provin din încrucișări controlate între părinți cunoscuți atât pe linie maternă, cât și pe linie paternă.

3.2. Hibridarea

În sens strict genetic, hibridarea reprezintă procesul prin care se realizează contopirea a două informații ereditare diferite în urma unirii gameților la fecundare (Băra, 1996). Hibridarea poate fi intraspecifică, atunci când descendența apare prin încrucișarea unor indivizi aparținând la rase, soiuri sau populații diferite ale aceleași specii sau interspecifică, în situația când descendența rezultă în urma încrucișării dintre indivizi aparținând unor specii diferite. În cazuri mult mai rare, descendența apare în urma încrucișărilor între indivizi ce aparțin la genuri diferite și, în acest caz, avem tipul de hibridare intergenerică. La aceste ultime două tipuri de hibridare, descendenții rezultați au diferite probleme legate în special de fertilitate dar, mai ales, de viabilitate scăzută, situație întâlnită cel mai frecvent la hibrizii intergenerici. Acest impediment se datorează, în principal, unor cauze de ordin genetic, dintre care cele mai importante sunt:

complex de gene care provoacă o dezvoltare anormală;

diferențe între cromozomii proveniți de la cei doi părinți îndepărtați taxonomic și filogenetic;

factori citoplasmatici care compromit dezvoltarea normală și fertilitatea hibrizilor.

3.2.1. Principii generale privind aplicarea tehnicilor de hibridare

Pe baza celor prezentate mai sus și ținând cont de complexitatea trăsăturilor genetice ale arborilor, în practica ameliorării silvice bazată al cărui program include și lucrări de hibridare se va ține cont și se vor respecta, în mod obligatoriu, unele norme și principii, fapt ce poate asigura succesul acestui program.

Evaluarea posibilităților de hibridare interspecifică între diferite specii de arbori este foarte necesară întrucât, din totalul hibrizilor interspecifici, doar max. 20% produc semințe fertile. În cazul majorității speciilor de arbori, hibridarea interspecifică este imposibil de realizat deoarece, din cauza distanței de ordin taxonomic, există mari diferențe de structură ale aparatelor reproducătoare și neconcordanțe ale perioadelor de receptivitate maximă în maturarea elementelor sexuale ale inflorescențelor mascule și femele. Toate acestea constituie elemente care stau la baza manifestării fenomenului incompatibilității la nivelul florilor sau al polenului.

Studiul repartiției naturale a speciilor de arbori este extrem de util, cu atât mai mult cu cât sunt cazuri destul de numeroase când două specii care ocupă aceiași stațiune nu hibridizează între ele. Același fenomen se constată și în situația când două specii diferite sunt învecinate sau parțial suprapuse, susceptibilitatea la polenizare fiind foarte redusă.

Efectuarea unei selecții foarte riguroase a exemplarelor parentale înaintea oricărei polenizări este foarte necesară, întrucât există pericolul ca la hibridări să participe și polen nedorit ce ar aparține unor exemplare cu unele caractere defavorabile.

Efectuarea testelor de pepinieră și de teren a hibrizilor rezultați este imperios necesară pentru a se efectua un control timpuriu asupra rezultatelor și de a se urmări comportarea ulterioară a hibrizilor naturali sau artificiali obținuți.

Selectarea și multiplicarea intensivă a celor mai valoroși hibrizi se poate face prin refacerea celor mai performante hibridări și înmulțirea ulterioară (în sistem clonal intensiv) a descendenței valoroase rezultate sau o combinare a celor două modalități.

3.2.2. Criterii și modalități concrete de hibridare I. După modul în se produc:

hibridarea naturală – reprezintă calea cea mai răspândită prin care se realizează polenizarea și care se produce fără intervenția dirijată a omului. Acest tip de hibridare este specifică, în primul rând, speciilor alogame și reprezintă fecundarea încrucișată caracteristică multor specii forestiere importante (rășinoase, fagacee).

hibridarea artificială – se face cu intervenția omului în cadrul lucrărilor de ameliorare forestieră și se practică prin efectuarea de polenizări controlate (dirijate) la specii autogame și alogame.

II. După tipul de polenizare a exemplarelor materne

hibridarea liberă – se efectuează la specii auto dar și la cele alogame. La primele are loc, în prealabil, operațiunea de castrare (îndepărtarea mecanică a inflorescențelor mascule la exemplarele stabilite drept componente materne). Polenul provenit de la una sau mai multe forme paterne este purtat și depus cu ajutorul vântului sau a insectelor polenizatoare. În livezile de semințe create și amenajate pe spații mai mari, acest tip de hibridare s-a dovedit a fi cel mai eficient în obținerea unor varietăți sintetice.

hibridarea semiliberă – are loc în condițiile izolării plantei mamă, cu flori castrate și sub un cort special, cu polen recoltat de le exemplarul patern și care este împrăștiat liber sub cortul de izolare.

hibridarea forțată – se realizează prin polenizarea forțată a inflorescențelor femele de pe exemplarul matern, operațiune urmată imediat de acoperirea și izolarea cu pungi de hârtie sau plastic a inflorescențelor polenizate.

III. După numărul și natura genitorilor care iau parte la hibridare

hibridarea simplă – se produce atunci când are loc polenizarea între doi indivizi (părinți homozigoți). La arbori, situația este mult mai complexă, în sensul că, spre deosebire de speciile cultivate, indivizii genitori sunt heterozigoți pentru majoritatea caracterelor, dar și în acest caz, descendenții din prima generație manifestă un grad deosebit de heterozis. (AXB)

hibridarea dublă – are loc atunci când hibridul provine din fuziunea gameților ce aparțin la doi hibrizi simpli, însă fenomenul de heterozis este mai puțin accentuat decât în cazul precedent. (AXB)X(CXD).

hibridarea repetată (backcross) – mai este cunoscută și sub numele de încrucișare repetată și are loc atunci când se încrucișează un hibrid din F1 cu una din formele parentale. Acest tip de hibridare s-a dovedit extrem de util și eficient în cazul când se urmărește creșterea rezistenței la atacul unor boli și chiar dăunători dar și în de îndepărtare a unei trăsături nedorite de la o formă valoroasă obținută în cadrul procesului de ameliorare. AXB=AB, ABXA=(AB)A1.

hibridarea reciprocă – se produce între două forme parentale care pot fi, pe rând, fie forme paterne, fie forme materne. De menționat faptul că hibrizii care rezultă nu sunt identici datorită influenței factorilor ereditari extranucleari (citoplasmatici) de la gameții femeli. A(F)X

B(M)=AB, B(F)X A(M)=BA, AB≠BA.

hibridarea ciclică – constă în încrucișarea unei forme parentale (considerată ca

analizator) cu toate celelalte forme. BXA, CXA, DXA, etc.

hibridarea dialelă – este o formă de hibridare utilizată și în practica silvică, în care mai multe forme parentale, cu constituție genetică diferită, sunt încrucișate în toate combinațiile posibile. Acest tip de încrucișare se dovedește extrem de utilă în cazul când se urmărește ameliorarea caracterelor cantitative, deoarece se scurtează mult timpul necesar alegerii genitorilor. AXB, AXC, AXD, AXE; BXC, BXD, BXE; CXD, CXE; DXE.

hibridarea complexă – reprezintă încrucișarea între o formă materne cu amestec de

polen aparținând mai multor genitori paterni. A(F) X (B+C+C+D+E).

3.2.3. Particularități ale reproducerii sexuate la arbori

3.2.3.1. Aspecte teoretice și practice asupra înfloririi și fructificației la arbori

Țesutul meristematic nediferențiat din care se va forma floarea este situat în axila frunzelor și dezvoltarea acestuia va depinde, în mare măsură, de influența unor factori externi sau interni.

În prima categorie, temperatura și lumina joacă un rol de primă însemnătate. Primăveri și veri mai calde sau mai răcoroase, ori o intensitate mai mare sau mai mică a luminii, vor determina creșterea sau, dimpotrivă, scăderea capacității de înflorire și de fructificare la majoritatea speciilor de arbori.

În cadrul celei de-a II – a categorii, aplicarea unor tratamente externe experimentale cu fitoregulatori de creștere (auxine și gibereline), în diferite concentrații, la exemplare aparținând mai multor specii de conifere (Larix, Tsuga, Picea, Pinus), a condus la obținerea unor rezultate promițătoare, cu condiția ca aplicarea acestor tratamente să fie într-o strictă concordanță cu fazele de dezvoltare ale fiecărui exemplar, cu vârsta, precum și în funcție de condițiile specifice climatice în anii de studiu.

3.2.3.2. Fenomenul de incompatibilitate interspecifică în ameliorarea forestieră

Factorii care limitează sau fac imposibilă polenizarea artificială între exemplare aparținând unor specii diferite de arbori sunt legați în primul rând de diferențele de ordin morfologic la nivelul florilor. După cum se cunoaște, la gimnosperme, ovulul este la vedere și, în faza de receptivitate maximă (destul de scurtă, de doar 2,3 zile), polenul purtat de vânt este colectat și poate avea loc polenizarea. Dificultățile intervin la efectuarea polenizării artificiale la 2 specii diferite, la care nu se suprapun perioadele de receptivitate (ex. specii de pin și larice). În acest caz, este necesar ca polenul uneia dintre cele două specii să fie colectat și păstrat în condiții care să asigure menținerea viabilității materialului pentru perioade limitate de timp.

Mecanismul incompatibilității propriu-zise încă nu este elucidat pe deplin, dar cunoștințe destul de avansate în domeniu sunt semnalate la unele specii de angiosperme. Astfel, la plop se cunosc mult mai în detaliu mecanismele intime (semnale biochimice) ale acestui fenomen, respectiv prezența unor molecule de pe suprafața polenului și a stigmatului. Aceste molecule se constituie într-un adevărat “decodor” biochimic prin care polenul depus pe stigmat este respins sau, dimpotrivă, acceptat. În acest din urmă caz, polenul germinează și se poate realiza fecundarea ovulului.

S-au semnalat situații (ex. la teste de hibridare între două specii de plop) când germinarea grăunciorilor de polen s-a oprit la jumătatea stilului. Tot de incompatibilitate putem vorbi și în situația avortării bruște a embrionilor abia rezultați în urma unor fecundări interspecifice.

Toate aceste constatări au determinat pe specialiștii în domeniul ameliorării genetice forestiere să efectueze o serie de cercetări, iar primele rezultate încurajatoare pe linia eliminării efectelor acestui fenomen nedorit au apărut la sfârșitul deceniului 7, secolul trecut. În acest sens, cea mai notabilă realizare experimentală în domeniu s-a înregistrat la efectuarea unor teste pe diferite specii de plop, cea mai cunoscută fiind efectul Mentor. Tehnica este destul de simplă și pornește de la două probe inițiale de polen, unul compatibil dar cu nuclei spermatici inactivați și, cea de-a II-a, cu polen incompatibil dar cu nuclei spermatici normali. Amestecul celor două probe de polen a fost depus pe stigmatul unei flori femele, iar germinarea polenului compatibil a determinat formarea tuburilor polenice și la nivelul materialului incompatibil. Evident, până la urmă, fecundarea s-a realizat doar din direcția polenului incompatibil, întrucât numai acesta prezenta nuclei spermatici normali.

La gimnosperme, aplicarea acestei metode nu a dus la obținerea unor rezultate promițătoare ca în cazul plopului și, de aceea, s-au încercat și alte variante experimentale în vederea suprimării efectului de incompatibilitate ce apare frecvent la polenizările interspecifice. Una dintre cele mai utilizate tehnici a fost aceea de aplicare a unor solvenți organici pe suprafața stigmatului. Rezultatele însă au fost mult mai modeste și, în rarele cazuri de reușită (ex. hibridări între unele specii ale genului Pinus), semințele rezultate au fost în mare măsură sterile sau, în alte cazuri, tuburile polenice nu ajuns decât până la un punct intermediar al țesutului femel. La molid, doar prin aplicarea efectului Mentor, s-au obținut unele rezultate pozitive în realizarea de hibridări interspecifice.

3.2.3.3. Explicarea fenomenului de androsterilitate

Asemenea multor specii de plante din flora ierboasă (spontană și cultivată) și la diferite specii lemnoase apare frecvent fenomenul de androsterilitate, respectiv forme fără polen sau cu polen steril. Cauza majoră a manifestării acestui fenomen se poate explica prin defectele apărute în formarea unor elemente la nivelul organelor florale mascule (antere deformate, vide, indehiscente, producere de polen neviabil) sau prin absența anterelor. Aceste exemplare s-au dovedit însă extrem de utile în practica ameliorării forestiere prin faptul că acești indivizi, în calitate de genitori materni, pot produce descendenți (hibrizi) cu un pronunțat fenomen de heterozis, evitându-se operații complicate și stresante de castrare.

În ceea ce privește stabilirea originii acestui fenomen, cercetătorii în domeniu au căutat să elucideze și să dea mai multe explicații, pornind de la teoria conform căreia androsterilitatea are cauze genetice și ar depinde de gene localizate în nucleu, (recesive), în citoplasmă dar și în urma unor interacțiuni nucleo-citoplasmatice.

Pornind de la această premiză, de-a lungul timpului s-au formulat mai multe teorii (ipoteze) cu privire la apariția și manifestarea fenomenului de androsterilitate.

Ipoteza apariției spontane se bazează pe explicația instabilității eredității extranucleare, iar plantele (inclusiv arbori) androsterile sunt menținute în interiorul unei populații.

Ipoteza apariției în momentul efectuării încrucișărilor este susținută prin apariția unor exemplare androsterile în cadrul unor încrucișări interpecifice sau intergenerice (între grâu și secară).

Ipoteza apariției la inducerea mutagenezei care este demonstrată prin apariția de indivizi androsterili în urma efectuării de tratamente prealabile cu diferiți factori mutageni (chimici/colchicină sau fizici/radiații) a exemplarelor selectate.

Ipoteza virală se bazează pe faptul că la o serie de plante androsterile (ex. la exemplare aparținând genului Vicia) au fost descoperiți corpusculi mici cu două molecule de ARN. Prin marea lor asemănare cu virusurile, aceste particule sferice au și fost denumite pseudovirusuri, fiind depistate în număr mare în țesuturile androsterile.

Ipoteza mitocondrială este, se pare, teoria cea mai avansată și se bucură, în prezent, de o tot mai largă credibilitate în domeniu. După cum bine se cunoaște, mitocondria joacă un rol decisiv în etapa de formare a gameților, prin energia ce o pune la dispoziția întregului proces de gametogeneză. În urma efectuării unor cercetări mai aprofundate, s-a putut întocmi o listă de argumente științifice ce susțin această ipoteză.

Astfel:

există diferențe notabile în ceea ce privește cantitățile unor constituenți membranari de la nivelul mitocondriilor între exemplarele androsterile și cele normale;

s-a descoperit o rearanjare a secvențelor ADN-ului mitocondrial de la plantele androsterile, comparativ cu cel de la exemplarele normale;

în cadrul fuziunii protoplaștilor are loc un transfer al androsterilității prin asociere cu un anumit segment al ADN-ului mitocondrial;

s-a demonstrat existența unor diferențe între catenele polipeptidice (sintetizate in vitro) de la plante androsterile și cele fertile.

Este evident faptul că, separat, o teorie sau alta nu poate elucida acest fenomen și, prin urmare, determinismul androsterilității este încă departe de a fi complet lămurit. Numai descifrarea tuturor mecanismelor de la nivel molecular ar putea crea o bază certă privind elaborarea unei viitoare teorii complete asupra acestui fenomen.

IV. METODE MODERNE (NECONVENȚIONALE) DE AMELIORARE FORESTIERĂ

Înainte de a fi prezentat pe larg acest capitol, trebuie precizat faptul că problematica ameliorării forestiere în prezent dar, mai ales, în viitor este recomandabil să se raporteze și la elemente specifice problematicii resurselor genetice forestiere. Aceste aspecte sunt în concordanță cu ultimele reglementări naționale și internaționale și constituie, în prezent, elemente de bază în cadrul unor etape distincte ale programelor de ameliorare pentru cele mai importante specii forestiere.

Utilizarea poliploizilor naturali sau artificiali a constituit obiectul unor studii intense efectuate în Suedia (Ekebo) sau în Germania (Hamburg), în perioada 1930 – 1960 (Nanson, 2005). Experiențele privind iradierea unor plante tinere cu radiații ionizante puternice (β, α, γ) au condus însă la obținerea unor rezultate extrem de nefavorabile, fapt ce a determinat abandonarea, în foarte mare măsură, a utilizării acestor tehnici experimentale în genetica forestieră. Măsura s-a dovedit pe deplin justificată, cu atât mai mult cu cât majoritatea speciilor de arbori dețin o variabilitate naturală la cote foarte înalte și au cicluri de viață foarte lungi comparativ cu speciile ierboase.

Începând cu anii `90 ai mileniului trecut, cercetările în domeniul ingineriei genetice și punerea la punct a diverselor tehnici moderne de explorare a variabilității au creat posibilități concrete de modificare a garniturii genetice și încorporarea de transgene la unele specii de arbori (ex. specii de plop), noile forme putând fi ulterior multiplicate în sistem vegetativ. Recentele dezbateri privind necesitatea și oportunitatea extinderii utilizării unor varietăți transgenice (organisme modificate genetic – OMG) și în practica silvică suscită încă multiple controverse, ținând cont de complexitatea structurii arborilor (inclusiv structura echipamentului genetic) și de ciclurile lor lungi de viață. Totuși, trebuie recunoscut interesul enorm pe care îl manifestă cercetătorii în acest nou domeniu, acesta putând oferi oportunități încă nebănuite în ceea ce privește realizarea unor forme de arbori cu caractere excepționale pentru practica de ameliorare silvică.

4.1. Mutageneza și implicațiile practice în ameliorarea arborilor

În prezent, inducerea experimentală a mutagenezei este încă pe larg utilizată în practica ameliorării speciilor cultivate și în pomicultură. În zootehnie, procedeul este mult limitat datorită unei mult mai mari rigori privind determinismul cromozomial al sexelor și a complexității structurale a organismelor animale.

4.1.1. Interesul obținerii de varietăți poliploide la speciile forestiere

În sens larg, poliploizii sunt indivizi posesori a mai mult de 2 seturi cromozomiale (3n – triploizi, 4n – tetraploizi, etc.) și, la anumite specii vegetale, această “stare” legat de noua garnitură cromozomială oferă un optim fiziologic adaptiv și productiv acestor varietăți (ex. Triticum sp.).

La arbori, în marea majoritate a cazurilor, optimul fiziologic este conferit de starea normală de diploidie (2n) (în special la rășinoase). Totuși, în urma cercetărilor efectuate în experimente de inducere a mutagenezei, s-a ajuns la concluzia că la unele specii de foioase (ex. plop tremurător), crearea facilă a unor forme triploide s-a dovedit a fi un real câștig pe linia ameliorării acestor specii, mai ales în privința acumulărilor bioproductive și a ritmului de creștere.

Obținerea de forme poliploide la unele specii forestiere este posibilă prin aplicarea unor metode experimentale, dintre care cele mai utilizate sunt cele chimice și biologice. Metodele biologice presupun regenerări de ramuri sau tulpini după tăierea lor sau aplicarea unor tratamente speciale cu diferiți paraziți pe vârfurile de creștere. Aceste tehnici au totuși un caracter mai restrictiv, rezultate notabile fiind înregistrate mai mult în pomicultură.

Mult mai pe larg utilizate sunt tratamentele chimice, în acest sens, cel mai intens aplicat agent chimic fiind colchicina, alcaloid extras din brândușa de toamnă (Colchicum autumnale). Aceasta se prepară sub formă de soluții, de diferite concentrații (acestea nu depășesc însă 0,5%), care se aplică pe vârfuri de creștere. O altă modalitate mult mai comodă și eficientă este cea de imersare a semințelor, pe diferite perioade de timp, în soluția de colchicină.

Recunoașterea exemplarelor poliploide rezultate se face prin înregistrarea anumitor particularități morfologice (după specie) dar, mai ales, după efectuarea unor teste și observații citogenetice (analize microscopice).

4.1.2. Obținerea de poliploizi la rășinoase

Ca și în cazul utilizării altor metode moderne privind modificarea structurală și funcțională a echipamentului genetic, rășinoasele răspund, în general, mult mai greu la aplicarea tratamentelor chimice specifice, comparativ cu multe dintre speciile de foioase.

În cadrul inducerii experimentale a mutagenezei, la tratamentele cu soluții de colchicină aplicate semințelor (imersare la concentrație de 0,2%, umectare în faza de germinație a semințelor la o concentrație de 0,4%, respectiv cultură de embrioni pe medii cu colchicină) s-au obținut, cu relativă dificultate, serii de poliploizi și unele exemplare de mixoploizi la specii ale genurilor Abies și Pinus. Indivizii poliploizi obținuți au prezentat însă creșteri mult mai slabe, comparativ cu indivizii normali diploizi (un evident fenomen de nanism), noile forme având ramuri groase și ace mai scurte. Adesea, la aceste exemplare se remarcă și lipsa înfloririi. Puieți colchicinizați s-au mai obținut și la molid, însă numărul acestora a fost mult mai redus.

După cum se cunoaște, rășinoasele, comparativ cu foioasele, sunt specii lemnoase mult mai vechi, cu o mare dezvoltare în mezozoic (au o vechime de peste 300 milioane de ani) și, în consecință, structura lor genetică este de foarte mult timp stabilizată. Din acest motiv, gimnospermele au optimul metabolic și adaptiv în stare de diploidie, pe când poliploizii acestora sunt pitici, nu înfloresc și adesea nici nu supraviețuiesc.

În concluzie, se poate afirma că inducerea poliploidiei la specii de rășinoase nu prezintă interes din punct de vedere economic al ameliorării forestiere, puținele forme poliploide obținute interesând doar din punct de vedere estetic și ornamental.

4.1.3. Obținerea de poliploizi la foioase

La o serie de specii foioase de arbori, inducerea mutagenezei a atins o înaltă cotă privind performanțele cantitative și calitative și, în consecință, în practica de ameliorare a acestor forme și varietăți, mutageneza dovedește mari disponibilități și practici extrem de performante. Astfel, cazul plopului tremurător a devenit, de ceva vreme, de mare notorietate, pornind de la utilizarea formelor naturale de poliploizi sau de inducere și obținere artificială a triploizilor cu mare randament de creștere și potențial de adaptare. De exemplu, în Suedia, în cadrul unor populații de plopi tremurător, exemplarele de triploizi depășesc indivizii normali (2n) cu cca. 14% la înălțime și cu peste 50% în volum.

Producerea de plopi tremurători triploizi

1) Plecând de la triploizi naturali

În cadrul unei populații, plopii tremurători triploizi produc gameți n și 2n (mai rar 3n) și se încrucișează cu indivizi diploizi care produc numai gameți n, rezultând descendenți diferiți ca grad de ploidie (2n, 3n și mai rar 4n) (fig. 7). Indivizii tetraploizi sunt de mică înălțime și fără vigoare, ceea ce indică faptul că s-a depășit optimul de 3n. Totuși, acești indivizi sunt utilizați la încrucișarea cu exemplare normale diploide, în vederea obținerii de noi triploizi. Aceștia sunt autotriploizi, deoarece provin din indivizi aparținând aceleași specii.

Figura 7. Producerea artificială de triploizi la plopul tremurător (după Nanson, 2005)

2) Plecând de la triploizi artificiali

Indivizii triploizi naturali sunt destul de rari și au o fertilitate scăzută, aceste manifestări fiind datorate probabil garniturii cromozomiale relativ instabile. Acest lucru i-a determinat pe cercetătorii din Suedia, de exemplu, să recurgă la producerea artificială și utilizarea tetraploizilor prin tehnica colchicinizării (fig. 7). În acest sens, semințe de plop diploid au fost așezate în plăci Petri, pe hârtie de filtru impregnată cu soluție de colchicină 0,2% În urma aplicării acestui tratament, a rezultat un număr redus de plantule tetraploide de plop și un anumit procent de plante mixoploide (indivizi diploizi ce conțin în structura lor anumite țesuturi tetraploide). Cel mai important aspect este ca, la final, țesuturile generatoare de flori să fie tetraploide. După creștere, înflorire și selecție, părinții tetraploizi se încrucișează cu exemplare diploide, rezultând triploizi în sistem regulat.

În Germania, Froelich și Illies au obținut triploizi, reușind încrucișarea între exemplare 4n de Populus tremula și indivizi 2n de Populus tremuloides (specie americană). În acest fel au fost obținuți alotriploizi, indivizi ce se caracterizează prin creșteri rapide, vigoare deosebită, precum și o bună rezistență la boli și dăunători. Din aceste motive, formele obținute au fost trecute într-un sistem clonal intensiv de multiplicare, utilizându-se experimental micropropagarea (multiplicarea în masă in vitro). (fig. 8).

Extinderea metodologiei utilizării și obținerii de poliploizi s-a materializat prin aplicarea acestei tehnici și la alte specii de foioase, cum ar fi, în principal, la alun și mesteacăn.

Astfel, după Gathy, pe la mijlocul anilor ´50 ai secolului trecut, în pădurile din Suedia au fost depistate 5 exemplare de mesteacăn triploid, unul dintre ele măsurând cca. 26 m în înălțime, la o vârstă de 25 ani.

Exemplarele tetraploide, obținute în urma încrucișării dintre indivizi 2n și 4n (max. 1% din descendență), sunt mai puțin viguroase și cu numeroase defecte de formă, comparativ cu triploizii din aceeași generație. În natură, acești indivizi sunt eliminați rapid prin acțiunea selecției naturale, de unde și explicarea absenței acestora în păduri, la vârste mai înaintate. În schimb, exemplarele triploide au dovedit cam aceeași vigoare și capacitate de creștere ca și în cazul diploizilor normali.

Figura 8. Hibrizi alotriploizi “Astria”de Populus tremuloides x Populus tremula (vitro-

plante în pepinieră) (după Nanson, 2005)

În cazul genului Alnus, s-a dovedit faptul că formele de alotriploizi, rezultate în urma încrucișării dintre Alnus rubra 2n și Alnus glutinosa 4n, au avut o creștere excelentă. O situație asemănătoare s-a observat și în cazul unor autotriploizi de Betula verrucosa.

4.1.4. Mutații genice și cromozomiale la speciile forestiere

Din experiența destul de vastă acumulată în practica ameliorării speciilor cultivate sau ierboase, mutațiile genice și cromozomiale (deleții, inversii, duplicații sau translocații) sunt destul de frecvente, însă depistarea acestora la speciile forestiere este foarte dificil de realizat. În acest sens, există extrem de puține realizări și date atât în ceea ce privește depistarea unor mutante, cât și inducere experimentală a acestor tipuri de mutații. De exemplu, apariția unor exemplare cu deficiențe ale sistemului clorofilian ar fi, se pare, datorată unor mutații cromozomiale.

Pe de altă parte, în natură au fost identificate câteva situații punctuale referitor la apariția unor mutanți naturali, cum ar fi la brad (mutanți cu coroană piramidală), la duglas (mutanți cu ramuri în formă de mătură) sau la salcâm (forme mutante cu tulpini târâtoare). De asemenea, la alte specii lemnoase s-au identificat forme mutante cu frunze variegate.

În general, mutațiile sunt mai ușor de depistat la formele haploide, naturale sau obținute experimental prin andro și ginogeneză, deoarece aceste forme au în structura lor ereditară doar o singură garnitură cromozomială, iar în fenotip, efectele se manifestă în prima generație, inclusiv în cazul mutațiilor recesive.

În multe situații, exemplarele mutante și-au dovedit din plin utilitatea în cadrul procesului de ameliorare a diferitelor specii și varietăți lemnoase, indivizii în cauză constituind un valoros material de plecare în cadrul unor cicluri mai ample de selecție și hibridare. Prin utilizarea acestor forme se scurtează foarte mult durata de timp necesară derulării acestor etape importante ale procesului de ameliorare. De asemenea, prin utilizarea unor mutanți se pot obține mai ușor indivizi mai rezistenți la acțiunea nocivă a diferiților factori biotici și abiotici.

AMELIORAREA ARBORILOR PRIN BIOTEHNOLOGII ȘI INGINERIE GENETICĂ

Conceptul de inginerie genetică reflectă, la modul cel mai sintetic, dezvoltarea impetuoasă a domeniului de vârf în genetica și biologia modernă, urmare firească a marilor descoperiri efectuate în ultimele decenii în domeniul biochimiei și geneticii moleculare. Pe de altă parte, nevoile crescânde ale societății umane privind sporirea și diversificarea permanentă a gamei de produși alimentari, precum și necesitatea găsirii de noi și tot mai eficiente tratamente legate de profilaxia multor maladii genetice grave, inclusiv a cancerului, constituie motivații extrem de puternice privind avântul spectaculos al acestui nou domeniu.

La modul cel mai concret posibil, ingineria genetică poate fi definită ca un ansamblu de metode și tehnici care poate face posibilă manipularea materialului genetic la nivel molecular, în sensul modificării structurii macromoleculei de ADN, respectiv de izolare, sinteză artificială și transfer de gene la alte organisme, unele foarte îndepărtate din punct de vedere taxonomic și filogenetic. În acest mod, se poate trece foarte ușor peste aceste bariere și se poate obține rapid un nou organism, pornind de la o singură celulă, țesut sau fragment de organ.

Unele dintre aceste metode, datorită eficienței și rapidității extraordinare de dezvoltare, au putut fi trecute în regim industrial, acestea constituind noile ramuri ale biotehnologiilor. Ne referim aici, mai cu seamă, la tehnica micropropagării (multiplicarea in vitro a celulor și țesuturilor vegetale), la obținerea de protoplaști și hibridarea somatică a organismelor vegetale, sau obținerea la scară industrială de semințe artificiale, inclusiv pentru specii forestiere.

Trebuie menționat faptul că și silvicultura (mai ales în domeniul ameliorării) a adoptat unele dintre metodele și tehnicile acestui nou domeniu, în scopul îmbunătățirii însușirilor ereditare ale celor mai importante specii forestiere. Una dintre cele mai utilizate tehnici în domeniu o constituie cultura “in vitro” de celule și țesuturi vegetale.

4.2. Cultura in vitro de celule și țesuturi vegetale

Prin cultura in vitro de celule și țesuturi vegetale se înțelege detașarea unei celule sau a unui meristem apical (explant) de pe o plantă donatoare, cultivarea acestora pe un mediu sintetic aseptic (în condiții controlate de temperatură și lumină) și obținerea de noi organisme, precum și multiplicarea acestora.

Reușita acestei metode se bazează pe totipotența celulei vegetale, în sensul că explantul (celula sau țesutul meristematic) este o unitate vie, independentă de locul de origine, care deține întreaga cantitate de informație genetică preluată de la planta mamă și poate regenera o nouă plantă. Faptul că într-un timp relativ scurt (în mai puțin de un an) se pot obține prin micropropagare milioane de exemplare (copii fidele ale plantei donatoare), forme care în condiții obișnuite s-ar obține foarte greu sau nu ar putea supraviețui, reprezintă un câștig enorm privind eficiența și implicațiile practice ale acestei metode în ameliorarea multor și importante specii forestiere. De asemenea, prelevarea și cultura “in vitro” de meristeme asigură obținerea și multiplicarea unui material biologic sănătos, liber de viruși.

34

4.2.1. Specificul activității într-un laborator de culturi in vitro

Laboratorul propriu-zis este încăperea unde se prepară mediile de cultură. În acest scop, această încăpere trebuie să fie suficient de spațioasă și iluminată corespunzător, cu instalații de apă și canalizare curentă, rețea de electricitate și gaz. Camera de creștere este încăperea cea mai importantă și caracteristică oricărui laborator de culturi in vitro, în care explantele inoculate pe medii sintetice aseptice cresc și se dezvoltă pentru multiplicare. În acest scop, camerele de creștere sunt dotate cu sistem automatizat de climatizare, asigurându-se un regim controlat de temperatură (20-25oC) și umiditate (5060%). Iluminatul (3200-5000 lx) este furnizat de lumina albă și rece a tuburilor fluorescente, montate la partea superioară a etajerelor pe care sunt așezate culturile (la cca. 40 cm deasupra) (fig. 9). Menținerea la lumină a culturilor se face prin poziționarea lor verticală sau ușor înclinată. Fotoperioada optimă de16 ore lumină și 8 ore întuneric pe zi este necesară stimulării progresive adecvate a caulogenezei și rizogenezei “in vitro” la explantele majorității speciilor vegetale.

Zona aseptică sau camera sterilă este încăperea în care se execută sterilizarea, prelevarea, inocularea explantului pe mediu de cultură și multiplicarea (micropropagarea) materialului biologic obținut. Toate aceste operațiuni se execută la hota cu flux laminar de are steril (fig. 10). Pe cât posibil, această încăpere va fi cât mai izolată de restul camerelor laboratorului și este indicat să fie așezată în apropierea zonei de preparare a mediilor.

În reușita cultivării explantelor vegetale pe medii aseptice, un rol foarte important revine mediilor de cultură, prin compoziția lor chimică, natura elementelor chimice din substrat și proporția acestora, epuizarea preferențială a unor compuși sau concentrarea altora.

Fig. 9. Cameră de creștere (după Nanson, 2005)

Figura 10. Hotă cu flux laminar de aer steril (original)

Mediile de cultură conțin în compoziția lor substanțe anorganice și organice. Elementele chimice din componenta anorganică pot fi accesibile celulei vegetale sub forma unor anumite tipuri de compuși sau soluții și sunt împărțite în macroelemente și microelemente. Din acest punct de vedere, cel mai utilizat tip de mediu de cultură este mediul Murashige-Skoog (tab. 2).

În cadrul componentei organice a mediului de cultură se includ vitamine (inozitol, tiamină, pantotenat de calciu, ac.nicotinic, ac.ascorbic), fitoregulatori de creștere (auxine, citochinine și gibereline), substrat de carbon (zaharoză) și agar (când se prepară mediu solid).

Fitoregulatorii sunt din cei aparținând celor 3 mari grupe, respectiv auxine, gibereline și citochinine, iar agarul (un polizaharid extras din alge roșii) reprezintă agentul solidificator al mediului de cultură.

Alegerea explantelor la speciile forestiere depinde de metoda de multiplicare utilizată. De regulă, se recoltează mugurii axilari (se au în vedere meristemele apicale caulinare situate la baza frunzelor), deoarece utilizarea unor explante mai mari (noduri de 2-5 cm lungime) ar crește considerabil riscul perpetuării contaminărilor microbiene secundare.

La speciile lemnoase care sunt multianuale, o problemă practică foarte importantă este cea a reîntineririi unor organe de pe care urmează să fie prelevate meristeme apicale. Explantele sau butașii prelevați de pe astfel de plante își pierd capacitatea de înrădăcinare. De aceea, la arbori aplicarea prealabilă culturii in vitro a unor metode de reîntinerire a materialului biologic prin butășiri sau microbutășiri “in vitro”, altoiri de apexuri de plante adulte pe tinere plantule (formate din semințe), tăieri, altoire repetată sau simplă, etc.

Alegerea celei mai potrivite metode de dezinfectare a explantului trebuie să țină seama de natura organelor, profunzimea țesuturilor care vor deveni explante, de finețea tegumentelor și a epidermei.

Inocularea reprezintă operațiunea de detașare și așezare a explantului (meristemul apical caulinar) pe mediul de cultură aseptic. Datorită fragilității și dimensiunilor foarte mici ale explantului (un meristem are diametrul, în medie, de 0,1-0,2 mm), această operație este extrem de delicată și dificilă și se efectuează, obligatoriu, sub lupa binoculară amplasată în incinta hotei cu flux laminar de aer steril. De asemenea, tot instrumentarul se sterilizează în alcool și se flambează la becul de gaz din incinta hotei, înaintea și după fiecare inoculare.

Tabelul 2

Mediul Murashige-Skoog (MS,1962) (după Cachiță-1987)

M – macroelemente; m – microelemente

Îndepărtarea primordiilor foliare se poate face cu minibisturie mai mari sau cu ace spatulate. Primordiile foliare se detașează complet pentru ca meristemul să fie cât mai bine expus și individualizat. Rapiditatea efectuării acestei operațiuni preîntâmpină apariția riscului deshidratării meristemului detașat în contact prelungit cu instrumentarul flambat. Imediat, recipientele se vor acoperi cu folie de polietilenă sterilizată în alcool de 70o, după care, culturile vor fi trecute în camera de creștere pentru incubarea, pasarea și creșterea inoculilor.

Primele săptămâni de menținere a culturilor “in vitro” în camera de creștere reprezintă perioada de incubare, care se întinde ca durată în funcție de natura explantului, de specie sau de condițiile climatice. În primele zile după inoculare se fac trierile, îndepărtându-se flacoanele contaminate. Pe mediile solide, mucegaiurile sau coloniile bacteriene apar, cel mai adesea, la suprafața mediului, mai aproape sau mai departe de explante.

Inducerea proceselor regenerative la explantele speciilor lemnoase este mai lentă decât la inoculii plantelor ierboase sau speciile cultivate, aceste procese manifestându-se după cca. 45-60 de zile. Procesul de organogeneză “in vitro” debutează cu formarea primilor lăstari și mugurași (caulogeneza “in vitro”), după care are loc formarea primelor rădăcinițe (rizogeneza “in vitro”). Culturile care prezintă o încetinire evidentă a creșterii explantelor, fenomen datorat epuizării mai timpurie a substanțelor nutritive din mediu, vor fi pasate pe mediu de cultură proaspăt și steril. Stadiul final al etapei de organogeneză in vitro îl constituie formarea plantulelor din cultura primară.

Înmulțirea in vitro a plantelor poartă denumirea de micropropagare

(micromultiplicare sau microînmulțire). Este o formă de multiplicare vegetativă și asigură un randament net superior, în comparație cu alte procedee practicate, până în prezent, în horticultură și silvicultură. Micropropagarea se face prin minibutășire in vitro, atunci când plantulele din culturile primare sunt bine dezvoltate, cu rădăcinițe, tulpinițe și frunzulițe bine individualizate și viguroase. Minibutașii rezultați sunt trecuți, în condiții aseptice, pe medii de cultură noi și vor forma culturile secundare.

4.2.2. Aclimatizarea în seră și repicajul în pepinieră

Multe vreme, din păcate, mulți și foarte buni specialiști în activitatea de laborator au neglijat adesea aspectul privind aclimatizarea în seră a materialului biologic obținut in vitro, respectiv trecerea la condițiile de vegetație in vivo, acest fapt fiind considerat secundar ca importanță. Multiplele eșecuri apărute au determinat o reconsiderare a acestei atitudini și, în consecință, eforturile specialiștilor s-au concentrat și în această direcție, ceea ce a determinat luarea de măsuri adecvate asigurării condițiilor propice de a se obține plante adecvate și perfect aclimatizate.

Odată obținută aclimatizarea, plantele pot fi trecut în pepiniere, loc în care personalul calificat îl va supune operației de repicaj normal asemenea și celorlalte tipuri de plante. Plantele obținute în laborator sunt denumite în limbajul de specialitate ca vitroplante (fig. 11).

Figura 11. Seră amenajată pentru aclimatizarea vitro-plantelor de Prunus avium (după Nanson, 2005)

4.2.3. Rezultate obținute la specii forestiere

La specii ale unor importante genuri de foioase (Prunus avium, Populus sp., Betula, Quercus robur, Q. petraea, Eucalyptus, etc) s-au înregistrat rezultate pozitive sub aspect tehnic, însă din punct de vedere al eficienței economice, realizări notabile au fost obținute doar la cireșul sălbatic. De altfel, în Franța au fost inițiate și dezvoltate programe complexe privind cultura și multiplicarea in vitro la Prunus avium.

Referitor la specii de rășinoase, s-au obținut unele rezultate sub aspect tehnic doar la câteva specii cum ar fi Picea abies, Pseudotsuga menziesii sau Larix eurolepis. De asemenea, unele experimente privind cultura in vitro, parțial reușite, au fost efectuate la Sequoia sempervirens, în Statele Unite, sau Pinus radiata, în Noua Zeelandă.

La speciile agricole cultivate, unde variabilitatea genetică este mult îngustată, micropropagarea constituie și un mijloc de a genera variații somaclonale, opțiune care la speciile forestiere nu s-a urmărit în mod deosebit datorită existenței unei variabilități genetice naturale în limite încă largi.

4.3. Inducerea și obținerea de haploizi

Acest proces interesează și practica silvică în domeniul ameliorării genetice, mai ales în perspectiva obținerii de indivizi homozigoți pentru toate genele, respectiv linii pure prin dublarea ulterioară a garniturii cromozomiale haploide.

La unele specii forestiere, obținerea de exemplare haploide interesează în cel mai înalt grad specialiștii, datorită ușurinței cu care se obțin aceste forme și marii lor utilități în cadrul diferitelor programe de ameliorare. În acest sens putem aminti specii aparținând genurilor Populus, Prunus, Ribes etc.

4.3.1. Obținerea de haploizi prin androgeneză

Prin conceptul de androgeneză se înțelege dezvoltarea partenogenetică a unui embrion, respectiv a unei plante haploide, pornind de la un nucleu haploid al microsporului sau grăunciorului de polen (Raicu, 1980).

Primele experimente și rezultate concrete au fost menționate în 1964, când Guha și Maheswari au cultivat antere de Datura innoxia pe mediu artificial, obținând embrioizi haploizi. Prin cultura in vitro, programul normal de dezvoltare a microsporului (microsporogeneza) este deviat și, în urma unor diviziuni de tip mitotic repetate, rezultă embrioizi care ulterior se vor transforma în plante haploide. În cazul androgenezei indirecte, în urma diviziunilor se formează mai întâi un țesut nediferențiat de tip calus, după care, în condiții favorabile de mediu, temperatură și lumină, acest țesut se va diferenția în organe și, în final, în plante haploide.

În cazul angiospermelor, în urma primei diviziuni meiotice, rezultă tetrade de microspori uninucleați haploizi. Aceștia vor suferi, în continuare, diviziuni de tip mitotic prin care din fiecare microspor vor rezulta două celule diferite ca mărime și nuclei inegali (stadiul timpuriu al grăunciorului de polen). Din nucleul mare va rezulta nucleul generativ, care va mai suferi o diviziune după polenizare și vor rezulta doi nuclei spermatici. Aceștia vor participa la dubla fecundare, prin care unul va fecunda oosfera și va rezulta zigotul, iar celălalt va fecunda nucleul secundar al sacului embrionar și va rezulta endospermul

(fig.12).

Cultura in vitro a anterelor în condiții controlate de mediu, temperatură și lumină, va devia traiectul normal al microsporogenezei, în sensul că, în urma primei diviziuni de tip mitotic, se vor forma două celule egale, iar microsporul se va dezvolta pe calea embriogenă. (fig. 13). În această situație, celula generativă degenerează și nu participă la formarea viitorului organism haploid.

Figura 12. Dezvoltarea normală a microsporilor la angiosperme (după Raicu, 1980)

În reușita acestei operații concură mai mulți factori, factori legați de planta donatoare (vârsta anterelor, poziția lor pe butonul flora, sezonul de recoltare) pe de o parte, factori legați de aplicarea unor pretratamente cu efect pozitiv (șocuri termice la +30C sau temperaturi ridicate de până la +350C), de mediu de cultură (cu factorul de solidificare – agar sau diferite combinații și concentrații ale fitoregulatorilor de creștere), pe de altă parte. Mai este utilizată și aplicarea unor tratamente cu diverse substanțe chimice.

Figura 13. Obținerea de haploizi prin androgeneză directă și via calus (după Raicu, 1980)

4.3.2. Obținerea de haploizi prin ginogeneză

Dacă devierea prin cultura in vitro a anterelor a devenit deja o operație facilă și de rutină, în cazul culturii de celule ovariene ca noi surse de obținere a plantelor haploide condițiile sunt mult mai dificil de realizat, fapt datorat mai ales încă necunoașterii complete a efectelor diferitelor tratamente fizice sau chimice privind devierea gametofitului femel normal și obținerea de haploizi.

La angiosperme, în urma meiozei a I-a rezultă 4 macrospori haploizi, din care unul va suferi noi diviziuni de tip mitotic ce vor duce la formarea sacului embrionar cu 8 celule haploide (fig. 14).

În ceea ce privește eficacitatea acestei metode, comparativ cu androgeneza, se situează la cote mult mai scăzute, rezultând un număr redus de haploizi la 100 de ovule cultivate.

Figura 14. Macrosporogeneza și formarea sacului embrionar la angiosperme (după Șerbănescu și Toma, 1980)

4.3.3. Importanța genetică a haploizilor obținuți prin androgeneză

Rezultatele mai mult decât încurajatoare obținute la tot mai multe specii de plante, inclusiv specii forestiere, confirmă pe deplin justețea teoriei totipotenței celulei vegetale, enunțată de către Haberlandt la începutul sec. al XX-lea.

Plantele haploide sunt pure din punct de vedere genetic datorită fenomenului de hemizigoție, existând o corespondență totală între genotip și fenotip.

Plantele haploide obținute prin androgeneză experimentală sunt și foarte variate genotipic, datorită faptului că în meioza a I-a are loc recombinarea genetică, ceea ce constituie un mare avantaj pentru ameliorarea bazată pe selecție.

La haploizi se pot selecta foarte ușor cei cu mutații recesive, acestea fiind foarte greu decelabile la diploizi.

Utilizarea haploizilor în ameliorarea plantelor conduce la o reducere semnificativă (cca. 7-8 ani) a timpului necesar obținerii unor linii pure și, pe de altă parte, pentru studierea diferitelor caractere în procesul de ameliorare este necesar un număr mult mai redus de indivizi. În acest din urmă caz, se reduce considerabil și volumul de muncă, mărindu-se totodată șansele de a se selecționa mai rapid și mai precis homozigoții importanți în ameliorare.

4.4. Cultura de embrioni sexuați in vitro

În cadrul activității de ameliorare a diferitelor specii de arbori, la efectuarea hibridărilor interspecifice, în majoritatea cazurilor, hibrizii rezultați avortează sau sunt sterili. Aceste fenomene nedorite sunt, cel mai adesea, puse pe seama incompatibilității dintre țesuturile embrionare și cele ovariene dar și a sensibilității deosebite a embrionilor interspecifici rezultați.

Laboratoarele moderne din institutele de specialitate sunt dotate cu echipamente și aparatură ce permit cultura in vitro a acestor embrioni, condiții în care se pot dezvolta și viitoarele plante hibride.

Dublul avantaj al utilizării acestei metode biotehnologice este conferit de faptul că acestor embrioni li se poate induce o dezvoltare normală dar, mai ales, este posibilă o accelerare a vitezei de selecție. Embrionii pot fi recoltați imediat după fecundare și nu mai este necesară parcurgerea etapei de maturare a semințelor, ceea ce pentru ameliorarea majorității speciilor forestiere, specii caracterizate printr-o longevitate mare și maturare târzie, reprezintă un foarte important câștig. Reducerea acestor intervale de timp, face posibilă totodată și introducerea mai rapidă a unui nou caracter într-o nouă varietate. De asemenea, obținerea mult mai rapidă de linii pure, în urma efectuării anuale a mai multor cicluri de autofecundare, reprezintă un alt mare avantaj în ceea ce privește inițierea și aplicarea acestei biotehnologii.

4.5. Embriogeneza somatică și semințele artificiale

Pe plan european, ca urmare a unor eșecuri în ceea ce privește aplicarea și extinderea culturii și multiplicării in vitro la unele specii importante de arbori, cercetările sau orientat către adoptarea unor noi tehnici biotehnologice, cum ar fi embriogeneza somatică și obținerea de semințe artificiale.

4.5.1. Embriogeneza somatică

Tehnica embriogenezei somatice urmărește multiplicarea indivizilor, plecând de la embrioni imaturi sau chiar maturi (la anumite specii). Un scop asociat acestei tehnici îl constituie obținerea de semințe artificiale.

Embrionii imaturi sunt extrași de la semințele aflate încă în stadiul de formare. Materialul biologic prelevat este fragmentat și cultivat pe mediu de cultură aseptic adecvat. În cazul reușitei, fragmentele de material secționat se transformă treptat în proembrioni. Aceștia trebuie separați cu ajutorul microtomului și repicați pe un mediu de cultură în care se pot dezvolta și atinge maturitatea, cu timpul devenind plantule înrădăcinate. În acest stadiu, materialul biologic este scos din mediul de cultură și apoi este repicat în sere sau pepiniere, devenind embrio-plante (fig. 15 ).

Această tehnică s-a dovedit fezabilă pentru molid, nuc și alte specii lemnoase. De exemplu, în Belgia s-a reușit crearea mai multor embrio-plante, plecând de la embrioni imaturi recoltați din livezi semincere. Un caz foarte interesant a fost semnalat când s-a obținut o embrio-plantă trizomică, ceea ce conferă o oarecare notă de risc în utilizarea acestei tehnici prin faptul că pot rezulta și mutanți somatici, uneori periculoși pentru practica silvică. Pe de altă parte, costurile prohibitive legate de tehnicile in vitro pot constitui, de asemenea, un factor limitativ puternic privind utilizarea pe scară largă a acestei biotehnologii.

Figura 15. Seră de aclimatizarea a embrio-plantelor de Picea abies (după Nanson, 2005)

4.5.2. Tehnologia obținerii semințelor artificiale

În ultima perioadă, ca urmare a avântului deosebit înregistrat în domeniul biotehnologiilor, s-a trecut la o propagare în sistem intensiv (industrial) a unor varietăți și biotipuri extrem de valoroase cu o constelație de gene de mare performanță, dar care, prin reproducerea sexuată, nu s-ar putea obține, în timp relativ scurt, cantități suficiente de material biologic de valoare și performant economic. Rezolvarea problemei a venit odată cu punerea la punct a tehnicii de obținere a semințelor artificiale și trecerea acesteia în fază industrială.

Condiția de “defect zero” la semințele naturale (care germinează 100% și rezultă numai plante viguroase) nu poate fi niciodată atinsă, chiar dacă se fac unele intervenții la polenizare, la fecundare sau chiar la formarea semințelor. Afectarea membranelor în condiții de deshidratare, apărute în timpul germinării, va conduce invariabil la producerea unor daune, în sensul că se va pierde o parte a substanțelor de rezervă (de exemplu, unele proteine absolut indispensabile unei bune germinații). De asemenea, pot apărea mari probleme în perioada de stocare a semințelor diferitelor specii, datorită faptului că sunt afectate ireversibil mai multe sisteme enzimatice responsabile de rezistența la efectele negative ale oxigenului și derivaților acestuia. În timpul manipulării stocurilor de semințe (livrări, schimburi, etc.) este foarte probabilă apariția de leziuni, daune sau chiar distrugeri, mai ales la speciile lemnoase ale căror semințe dovedesc o deosebită fragilitate.

În noua tehnologie de obținere și producere a semințelor artificiale, sistemul de culturi in vitro utilizează anumite tipuri de material biologic, în general țesuturi foarte tinere (cu caracter embrionar), cele mai potrivite fiind inflorescențe, părți de cotiledoane, sau axe hipocotile. Tehnologia semințelor artificiale se realizează, de fapt, prin înglobarea acestor țesuturi în medii nutritive și învelirea acestor ansambluri cu pelicule permeabile și biodegradabile. Culturile pentru obținerea semințelor artificiale se realizează în bioreactoare de diferite capacități, similare celor utilizate în industria fermentativă sau cea a produșilor microbieni. La sfârșitul procesului tehnologic, embrionii sunt foarte fragili și expuși și, de aceea, sunt imediat înveliți într-o peliculă care le permite menținerea în viață pentru o perioadă relativ scurtă de timp (în funcție de cantitatea de mediu de sub înveliș).

Membrana protectoare va avea de îndeplinit 3 funcții importante:

de protecție, prin care noul embrion din interior, aflat într-o stare similară dormanței, va fi ferit de șocurile termice sau hidrice din exterior, putând, în aceste condiții, să fie transportat și păstrat o anumită perioadă de timp;

de nutriție, în urma căreia viitoarea plantulă are posibilitatea să se hrănească din microrezerva de mediu de cultură aflată sub membrana de protecție;

de apărare și revigorare, prin aceea că embrionul are asigurată o protecție fitosanitară minimă împotriva diferiților agenți patogeni.

În ciuda costurilor relativ ridicate privind producerea la scară industrială a semințelor artificiale, trebuie remarcat totuși interesul tot mai mare manifestat de către specialiștii din agricultură, pomicultură și, mai recent, în silvicultură. Acest fapt este justificat de marea problemă privind înmulțirea dificilă (uneori chiar imposibilă) pe cale naturală (prin sămânță) a unor varietăți hibride extrem de performante.

Tehnologia producerii semințelor artificiale este încă la început dar se bucură, deja, de un interes crescând atât în silvicultură, cât și în agricultură. Semințele artificiale sunt, în mod evident, mai scumpe decât cele naturale dar ele prezintă avantaje incontestabile care fac ca producerea și utilizarea lor să devină rentabilă. Este deja cunoscut faptul că unele varietăți hibride performante se reproduc foarte greu, sau chiar deloc, prin sămânță (sterilitate sau meioze neregulate). Pe de altă parte, la unele varietăți de gimnosperme (pin, larice, molid), tehnologia producerii de semințe artificiale constituie unica posibilitate de multiplicare și difuzare în masă a unui material deosebit de valoros obținut în cadrul unor etape distincte ale proceselor de ameliorare.

În S.U.A., de exemplu, la molidul comun s-au obținut rezultate promițătoare încă pe la mijlocul anilor 80, creându-se la scară industrială forme cu rezistență crescută la diverse maladii sau cu toleranță deosebită la diferiți produși chimici.

4.6 Obținerea și cultura protoplaștilor. Hibridarea celulară (somatică)

Primele metode cu adevărat eficiente de obținere și izolare a protoplaștilor (celule vegetale fără peretele celular) au fost puse în aplicare în deceniul al VII-lea al secolului trecut, îndepărtarea peretelui rigid celulozo-pectic făcându-se prin perfecționarea tehnicilor enzimatice. Primele experimente și totodată realizarea primelor regenerări de plante întregi au fost obținute de către francezul J. P. N i t s c h, în anul 1971. El a reușit regenerarea unor plante de tutun, pornind de la cultura pe mediu artificial a unor celule nude, complet separate unele de altele. Ulterior s-a reușit izolarea și obținerea de protoplaști și la alte specii vegetale (soia, morcov, petunie, mazăre, bob), inclusiv la specii lemnoase și de arbori (plop, pin, ienupăr, măr).

Suspensiile monocelulare ale protoplaștilor pot fi obținute practic din orice tip de țesut vegetal, aceste ansambluri permițând efectuarea unor studii extrem de avansate și de mare finețe în vederea elucidării a numeroase și complexe procese biologice la nivel celular și molecular. În acest sens, obținerea protoplaștilor și, mai ales, fuzionarea acestora deschid perspective dintre cele mai largi asupra procesului de manipulare a structurii și informației genetice cantonată într-o celulă și, în final, de elucidare a fenomenului de omnipotență celulară și mecanismele de reglare adiacente.

Un aspect practic extrem de important este reprezentat de posibilitatea acestor celule vegetale nude de a-și reface peretele celular după fuziune, de a se divide și de a forma noi țesuturi și ulterior organisme autonome.

4.6.1. Obținerea de protoplaști

Obținerea și izolarea protoplaștilor este posibilă prin prelevare de la aproape toate organele plantelor superioare, respectiv rădăcini (inclusiv nodozități radiculare), frunze, fructe, tuberculi, endosperm, etc. Totuși cel mai potrivit țesut vegetal, furnizor de protoplaști de bună calitate (cu un grad mare de omogenitate), este parenchimul frunzelor tinere. În general, recomandabil este ca prelevarea de celule surse de protoplaști să se facă de la țesuturi tinere, întrucât va rezulta o bună proliferare ulterioară a țesuturilor în cultură.

La speciile lemnoase (plop, ienupăr, măr, pin), eficiența metodei de extragere și izolare a protoplaștilor este foarte mare, în sensul că dintr-un gram de țesut din frunze tinere verzi se pot obține cca. 2 milioane de protoplaști identici genetic.

În prezent, în laboratoarele de specialitate se practică în mod curent 2 metode principale de obținere a celulelor vegetale nude, viitori protoplaști:

metoda mecanică este o metodă mai veche care constă în aplicarea tehnicii de microdisecție a celulelor vegetale plasmolizate în vederea îndepărtării peretelui celulozopectic rigid. În ultima vreme, această metodă este din ce în ce mai puțin utilizată din cauza randamentului net inferior comparativ cu alte metode (număr redus de protoplaști în timp mai scurt), precum și datorită imposibilității aplicării metodei la un număr mai mare de specii;

metoda enzimatică, în schimb, este mult mai accesibilă în urma stabilirii unor combinații optime de fermenți specifici (pectinaze care disociază celulele și celulaze care atacă peretele celular). Randamentul extrem de ridicat, precum și accesibilitatea metodei la un număr mult mai mare de specii de plante, reprezintă avantaje de necontestat privind utilitatea acestei metode (fig.16).

Figura 16. Obținerea de protoplaști pe cale enzimatică și regenerarea plantelor

(după Raicu, 1980)

4.6.2. Fuziunea protoplaștilor

Datorită absenței peretelui celular, celulele vegetale nude pot fuziona între ele, proces ce reprezintă hibridarea celulară sau somatică, tehnică de înaltă performanță ce face posibilă fuziunea între celule provenite de la organisme îndepărtate din punct de vedere taxonomic și filogenetic.

Fuziunea poate să se desfășoare spontan în cadrul suspensiei celulare (celule în mediu lichid) sau mediată de unele substanțe (mediatori chimici ca polietilenglicolul sau ioni de Ca++) și pe baza încărcăturii electrice negative a protoplaștilor. Pe baza celor menționate și în condițiile unui pH ridicat, protoplaștii vor intra în stare de agregare, fenomen favorabil fuziunii celulare (fig. 17).

O metodă mai perfecționată și mai eficientă de inducere a fuziunii celulare este cea a electrofuziunii În primă fază se aplică un câmp electric alternativ neuniform asupra suspensiei. Prin conductivitatea electrică a suspensiei se creează un efect electroforetic asupra protoplaștilor care vor migra și se vor alinia, asemenea șiragurilor de perle, pe liniile câmpului, fenomenul purtând numele de dielectroforeză. În faza imediat următoare se aplică un puls electric de foarte mare intensitate, pe o durată extrem de scurtă de timp, fapt ce va determina ruperea membranelor celulelor aflate în contact și va favoriza fuziunea celulară.

O problemă foarte importantă în definitivarea întregului program de obținere, în final, a plantelor hibride dorite este eficiența selectării celulelor hibride rezultate, celule care sunt relativ puține și se găsesc în amestec cu celulele nefuzionate în mediul de cultură. Procedeele cele mai folosite, în acest sens, sunt cele bazate pe efectuarea de diferențieri fenotipice și de creștere, după care celulele fuzionate sunt selectate și trecute în sistem de cultură în micropicătură (așa numitele culturi doică).

Figura 17. Principalele etape ale hibridării somatice la plante (după Raicu, 1980) Obținerea, fuzionarea și cultura celulelor hibride reprezintă operațiuni de o foarte mare importanță în cercetările de genetică, în general, și pentru cele de ameliorare genetică a diferitelor specii vegetale, în special (fig. 18).

Figura 18. Diferite utilizări ale protoplaștilor (după Raicu, 1980)

Marea eficiență privind obținerea protoplaștilor, înclusiv la specii forestiere, oferă practic posibilități nelimitate de înmulțire vegetativă a unor genotipuri foarte valoroase.

Pe de altă parte, este posibilă obținerea unor hibrizi celulari între organisme îndepărtate filogenetic (acestea nu se pot încrucișa sexuat) și, nu în ultimul rând, prin hibridarea citoplasmei celor 2 celule, este valorificată din plin variabilitatea extranucleară care la reproducerea sexuată este transmisă doar uniparental.

Prin fuzionarea protoplaștilor aparținând aceleași specii se pot obține exemplare cu diferite grade de ploidie, procedeu greu realizabil prin mutageneză.

4.7. Transferul de gene și obținerea de plante transgenice

În sens strict teoretic, ingineria genetică reprezintă în esență introducerea unor gene sau grupe de gene străine în genomul unui anumit individ. Aceste gene, de regulă, provin de la specii îndepărtate taxonomic (chiar la regnuri diferite: microorganisme, plante, animale).

Manipulările genetice s-au dezvoltat extrem de rapid în ultimele decenii, începând cu anul 1983, când s-a creat prima plantă transgenică la tutun și crearea, în anul 1994, a primei varietăți transgenice (cu maturitate prelungită) la tomate, varietate deja comercializată în S.U.A.

În prezent, în genomul porumbului este posibil de a se introduce fragmente de cromozom bacterian rezistente la o serie de pesticide sau insecte fitofage.

Una dintre cele mai strălucite realizări în domeniul transferurilor de gene în terapeutica umană este aceea că seturi de gene umane, izolate din celule specializate ale pancreasului (insulele Langerhans), producători naturali ai insulinei, au fost introduse cu succes în genomul unor bacterii care produc apoi hormonul la scară industrială. De remarcat faptul că noul produs este extrem de eficient și nu provoacă nici un fel de reacții alergice, fiind foarte bine suportat de către bolnavii de diabet (fig. 19).

Foarte recent s-a dat publicității faptul că geneticienii au descoperit gena care provoacă metastaza, pornind de la cancerul de sân. Gena SATB1, supranumită de cercetătorii americani ca „arbitrul șef”, poate transforma rapid circa 1000 de celule, în celule canceroase. Atunci când sunt supraactivate, celulele canceroase se înmulțesc, însă când gena este neutralizată, celulele nu se mai divid și nici nu mai migrează.

Figura 19. Schema obținerii insulinei umane

Cercetătorii sunt de părere că SATB1 va putea constitui un punct țintă în dezvoltarea unor terapii eficace pentru vindecarea cancerului și, în perspectivă, chiar apariția pe piață a unor medicamente care să prevină sau să trateze metastaza în cazul cancerului de sân. În prezent este dificil să se determine cu claritate dacă celulele canceroase dintr-o tumoare pot invada țesuturile vecine sau să circule liber prin sânge și să formeze alte tumori în organism.

Cert este faptul că descoperirea noii gene ușurează enorm cercetările ulterioare, de acum știut fiind faptul că activarea unei tumori prin gena incriminată înseamnă a deschide calea spre metastază. O dificultate în plus însă în inițierea noilor cercetări o reprezintă faptul că gena SATB1 are și un rol pozitiv foarte important în organismul uman, respectiv acela de a activa sistemul imunitar. Cercetătorii în domeniu intenționează să pună la punct o terapie prin care gena să fie dezactivată doar în zona tumorilor, acolo unde este hiperactivă. Cercetările făcute pe șoareci au arătat că la exemplarele în care a fost suprimată activitatea genei, numărul nodulilor metastazici era între zero și cinci, spre deosebire de cei netratați, care aveau între 125 și 160 de noduli.

Tot în S.U.A., în ultimii 20 de ani, cu precădere în domeniul agricol, s-au dezvoltat extrem de rapid aceste tehnici de mare performanță, multe forme și varietăți transgenice fiind deja introduse în producția agricolă largă. În Europa, în acest domeniu, se manifestă încă o mare rezervă (chiar ostilitate din partea mișcărilor și organizațiilor ecologiste), inclusiv la nivel de guverne, privind acceptarea și introducerea pe scară largă a acestor biotehnologii de vârf pentru crearea și utilizarea de organisme modificate genetic (OMG).

4.7.1. Obținerea pe cale biologică a ADN-ului recombinant – transferul indirect

ADN-ul recombinant (ADN hibrid) rezultă prin îmbinarea in vitro a unor fragmente de ADN ce provin de la alte specii sau sintetizate în laborator (așa numite gene “himere”), iar noua macromoleculă de AND va avea o structură deosebită ce va conține un mesaj genetic modificat.

I) Izolarea pasagerului

Gena de interes, denumită și pasager, este compusă din trei segmente de bază, și anume:

promontorul, alcătuit dintr-o secvență cu un număr limitat de nucleotide și având rolul de inițiator dar și în a determina expresia genei de interes;

secvența mediană sau codificatoare, care reprezintă parte cea mai consistentă a pasagerului și care trebuie mai întâi identificată, apoi izolată și secvenționalizată. Pentru identificarea celulelor transformate ale plantei în vederea selectării, este necesară utilizarea unor gene marquer care, pe lângă rezistența la antibiotice (sursă: Escherichia coli la șoarece) sau la ierbicide (surse: specii ale genului Streptomyces sau Arabidopsis thaliana), pot face posibilă și reperarea secvenței codificatoare

terminatorul, compus din secvențe (triplete de nucleotide nonsens) ce încheie lanțul structural al pasagerului.

Izolarea unei gene de interes din genomul unei specii vegetale se poate face cu ajutorul unor enzime specifice, denumite enzime de restricție, urmând ca gena izolată să fie recunoscută și pregătită de a fi preluată de un vector.

II) Izolarea, deschiderea și pregătirea vectorului

Sub denumirea de vector se înțelege o moleculă de ADN capabilă de autoreplicare, de a accepta gena de interes, de a fi acceptată de nouă celulă gazdă în care să se multiplice și să se exprime odată cu noua genă transferată.

Cel mai potrivit vector care poate îndeplini toate aceste cerințe este un plasmid, formațiune genetică independentă de cromozomul bacterian, capabil de autoreplicare, izolat din bacterii (Agrobacterium sp.) sau chiar din viruși (ex. bacteriofagul λ din virusul SV-40) și care, în majoritatea cazurilor, are formă circulară (fig. 20).

Introducerea genei de interes (pasagerul) în structura ADN-ului plasmidial se face după deschiderea prealabilă a celui din urmă într-un singur loc, cu ajutorul enzimelor de restricție care pot fragmenta molecula în puncte de recunoaștere. Fiind vorba de același tip de enzimă de restricție, ca în izolarea genei de interes, atunci sunt mari șanse ca să existe un mare grad de coezivitate între capetele celor două fragmente de ADN (plasmidial și al pasagerului). Acest fenomen se datorează complementarității bazelor azotate ale nucleotidelor de la capete și a punților de H+.

Figura 20. Etapele formării ADN-ului recombinant (după Popa și Repanovici, citat

de Lucău, 1998)

III) Transferul genei de interes

Noua moleculă de ADN care se prefigurează își desăvârșește constituirea sub acțiunea unei alte enzime specifice – ADN ligază ce determină formarea legăturilor covalente. Aceste legături vor asigura stabilitatea noii molecule de ADN, în acest mod, creându-se condiții propice integrării în genomul gazdei și manifestării expresiei genice ulterioare.

Din regiunea transformabilă și transferabilă a plasmidului (vectorul), respectiv ADN-t, genele de interes pentru transfer (pasagerul) substituie genele proprii ale bacteriei sau virusului. Urmează procesul de eliminare a genelor de virulență, pornind de la fragmentul transformabil și transferabil ADN-t. În urma acestui proces rezultă așa numiții vectori „dezarmați”, iar noua moleculă de ADN (ADN recombinat) este gata pentru a se integra în celula gazdă și să se multiplice.

Introducerea noului material genetic se produce prin fenomenul de transformare a celulei care va căpăta așa numita stare de „competență”, în urma efectuării unor tratamente cu ioni de Ca2+ și polietilenglicol (PEG).

După transformarea celulelor receptoare, în mod obligatoriu, se fac testările prin culturi in vitro pentru a se verifica dacă transformarea a avut loc la nivelul diferitelor țesuturi.

În general, procesele de integrare și transformare a celulelor receptoare de echipament genetic modificat (genele modificate sunt foarte sensibile) au o eficiență scăzută și, de aceea, se aplică tehnica specifică de amplificare a secvențelor de ADN (PCR- Polymerase Chain Reaction). Puterea de multiplicare este foarte mare, astfel încât, după cca. 30 cicluri de amplificare a unui segment de ADN, cuprins între 2 secvențe considerate ca „normale” (matrice), fragmentul în cauză de ADN se poate distinge deja pe un gel agarizat. Odată transgena integrată în genomul celulei gazdă, se trece la detectarea și identificarea ARN-urilor mesager (din procesul transcripției) și a proteinelor cu acțiune specifică (în cadrul procesului de translație).

În final, expresia genei de interes (inclusiv in situ) se realizează prin utilizarea unei gene marquer a cărei expresie se poate repera prin efectuarea unor teste complexe specifice – citoenzimologice, imunocitochimice, de fluorescență, etc.

Din cazuistica experimentală obținută până în prezent, se poate concluziona că dicotiledonatele răspund mai ușor la aplicarea metodei indirecte de transfer de gene (mai ales la plop), comparativ cu monocotiledonatele sau gimnospermele care sunt mult mai recalcitrante.

4.7.2. Transferul de gene la arbori cu ajutorul plasmidelor Ti și Ri

a) Transferul de gene cu ajutorul plasmidei Ti

Poate cel mai intens utilizat vector în cadrul procesului de transfer indirect de gene la plante (inclusiv la arbori) îl reprezintă plasmida Ti (tumor inducing) de la Agrobacterium tumefaciens. Această bacterie induce tumori la plantele dicotiledonate și numai la unele monocotiledonate, iar acest proces de infecție are la bază de fapt un proces natural de transformare genetică, proces ce poate servi ca un model ideal în realizarea transferului de gene pe cale biologică.

Responsabilitatea patogenității microorganismului o deține o mică porțiune a plasmidului (așa numitul ADN-t), constituită din numai 6 gene (cărora li se cunoaște succesiunea dar nu și structura exactă) și care determină apariția de tumori la locul unor leziuni de la nivelul coletului plantelor. Boala este specifică atacului bacterian și este cunoscută sub numele de gală de colet (crown gall)(fig. 21).

Pornind de la acest proces natural de infecție, s-a descoperit că aceste gale pot fi cultivate și în absența microorganismelor generatoare, precum și în absența substanțelor de creștere. În zona țesuturilor atacate au fost izolate și identificate anumiți substanțe – denumite opine – care lipsesc în celelalte țesuturi normale ale plantei. Este cert faptul că bacteria, prin cele 6 gene specifice de la nivelul plasmidului (ADN-t), determină o deviere a metabolismul plantei gazdă, rezultând producerea în țesutul vegetal a unei substanțe metabolizabile numai de microorganismul respectiv.

Figura 21. Gala de colet produsă de Agrobacterium tumefaciens (INRA, 1991 citat de

Lucău, 1998)

Fragmentul din ADN-ul plasmidian, respectiv ADN-t, a fost depistat nucleul țesuturilor tumorale ale plantei gazdă. În prezent, mecanismul transferului nu este încă pe deplin lămurit, dar este sigură posibilitatea integrării de gene străine în segmentul ADN-t al plasmidei Ti ce se vor putea transmite la celulele vegetale, concomitent cu celelalte gene din secvența specifică segmentului (fig. 22).

b) Transferul de gene cu ajutorul plasmidei Ri

Un alt vector eficient în transferul indirect de gene la plante îl constituie plasmida Ri de la bacteria Agrobacterium rhyzogenes. Având o structură similară vectorului prezentat anterior, plasmidei Ti. provoacă un proces natural de infecție ce determină apariția perișorilor radicelari, rezultând o proliferare excesivă a rădăcinilor la mai multe specii de dicotiledonate. Ca și în cazul prezentat anterior, plasmidul bacteriei are o regiune ADN-t ce se poate transfera în celulele vegetale gazdă.

După integrarea în genomul gazdei, segmentului ADN-t al plasmidului Ri, având încorporată și gena de interes, se poate exprima datorită transformării genetice naturale. Ulterior, prin culturi in vitro pe celule în suspensie, se pot regenera, în final, plante transgenice ce posedă noi trăsături.

.

Figura 22. Transferul de gene cu ajutorul plasmidului Ti în celula vegetală

4.7.3. Transferul direct (transfecție)

În acest sens au fost elaborate tehnici fizice sau chimice de transfer direct al genelor pasager, din care vom menționa doar cele mai importante.

Tratamentul cu polietilenglicol conduce la destabilizarea structurală a membranei celulare cu ajutorul polietilenglicolului (PEG). În urma acestei operații, gena de interes poate migra spre nucleu, putându-se integra în genomul gazdei. În acest mod se poate efectua transferul direct al genei pentru rezistență la kanamicină, genă situată pe o plasmidă de la Escherichia coli, rezultând plante rezistente la antibiotic și care transmit caracterul la descendenții sexuați. Tehnica prezentată are totuși un randament destul de scăzut, puține gene de interes integrându-se în genomul gazdei.

Fuziunea protoplaștilor cu lipozomi. Lipozomii sunt microformațiuni celulare protejate la exterior cu un strat dublu fosfolipidic, iar în interior se găsește un mediu apos ce conține unele molecule de interes (inclusiv ADN de transfer) pentru a fi transferate în diferite celule țintă. Fuziunea este mediată de polietilenglicol, iar conținutul lipozomilor se amestecă în citoplasmă. S-a reușit regenerarea de plante transformate, însă randamentul scăzut al tehnicii nu justifică extinderea metodei la o producție de rutină de plante transformate.

Electroporarea constă în aplicarea unui câmp electric, de slabă intensitate și un timp foarte scurt, asupra unei suspensii de protoplaști ce conțin ADN de transferat. Acțiunea câmpului se va finaliza cu producerea de pori în membrana protoplaștilor care vor primi cel puțin o copie a genei străine, integrate sau nu în genom. Exprimarea genelor pasager integrate în genomul gazdei se va realiza rapid, fapt ce oferă posibilități semnificative de extindere a acestei tehnici.

“Tunul” de particule este o tehnică ce face posibilă forțarea penetrării ADN-ului de transfer după ce, în prealabil, a fost fixat electrostatic de o particulă de tungsten sau aur. Noile particule create sunt accelerate și, cu o foarte mare viteză, sunt proiectate în celule țintă. În ciuda faptului că este destul de brutală, această tehnică este mult utilizată datorită randamentului crescut și eficacității deosebite.

Microinjecțiile sunt de asemenea utilizate în transferul de ADN, însă rezultate notabile s-au înregistrat mai mult la celulele animale. În ultima perioadă s-au efectuat încercări și la celule vegetale, cum ar fi grăunciorii de polen în curs de germinare, numai că rezultatele au fost slabe, chiar dezamăgitoare.

e) Încorporarea de organite celulare în protoplaști. Această tehnică a atras atenția specialiștilor, în primul rând, la transferul de cloroplaste de la o specie la alta, în scopul corectării unor sisteme fotosintetizante deficiente.

4.7.4. Strategii sens și antisens

Prin aplicarea tehnologiilor de transfer a unor gene de interes în genomul altor specii de plante are loc integrarea genelor străine în genomul gazdă și crearea practic a unor organisme vegetale cu structura genetică modificată, acest modalitate de transfer constituind strategia sens. De asemenea, prin tehnologia ADN-ului recombinat, se pot crea organisme deosebite, în sensul diminuării unei funcții, respectiv o diminuare a expresiei unui caracter deja existent în genomul inițial, ceea ce constituie strategia antisens.

Strategia antisens reprezintă, de fapt, o modulare a expresiei unei gene prin realizarea și exprimarea unui ARN m complementar celui de bază (rezultat în urma transcripției inițiale). Din punct de vedere funcțional, expresia genei inițiale este diminuată sau chiar suprimată (genă blocată). În acest mod s-au obținut exemplare de petunii albe (necolorate) în urma blocării genei care controlează sinteza de flavonoide cu rol în colorația florilor. De asemenea, printr-un procedeu asemănător, s-a reușit reducerea cantitativă a sintezei de lignină în fibra lemnoasă , proces controlat de așa numita genă „cad”.

Strategia sens, dimpotrivă, conduce la o supraexprimare a expresiei anumitor gene, modificate sau nu.

4.7.5. Realizări în sectorul agricol

Prin intermediul bacteriei Bacillus thuringiensis din sol s-au putut produce cristale proteice foarte toxice pentru mai multe specii de insecte fitofage, respectiv lepidoptere și coleoptere, în stadiul larvar. Genele de transfer au fost realizate în urma modificării câtorva secvențe nucleotidice care au fost apoi amplificate și, în consecință, nivelul de proteine toxice s-a mărit considerabil (cca. 100 ori). Astfel s-au obținut varietăți modificate genetic la specii de tutun, rapiță, tomate, cartof și porumb. Această nouă caracteristică, respectiv de rezistență crescută la insectele fitofage, are un caracter monogenic și, în consecință, există un risc destul de important în ceea ce privește o eventuală depreciere a rezistenței pe verticală la noile varietăți create. Efectele nedorite ale unei astfel de situații sunt totuși mult mai reduse la speciile cultivate, acestea fiind plante cu cicluri scurte de viață (1-2 ani) și care permit modificarea setului genetic într-un timp relativ scurt. În schimb, la arbori, specii forestiere multianuale, posesori ai unor structuri genetice extrem de complexe și stabile, efectele privind afectarea rezistenței pe verticală ar fi devastatoare, întrucât este practic imposibil de a se modifica din mers setul genetic inițial cât, mai ales, a celui modificat.

Gene modificate de origine vegetală pot acționa, de exemplu, ca inhibitori ai sintezei unei enzime foarte importante din categoria proteazei (IP), ceea ce conduce la imposibilitatea efectuării digestiei materiilor ingerate de către insectele fitofage.

În ceea ce privește rezistența la micoze și viroze, sunt semnalate unele rezultate notabile doar la câțiva viruși.

Mult mai avansate și cu rezultate mult mai importante se înregistrează cercetările privind rezistența la erbicide. În acest sens, sunt deja cunoscute realizările privind rezistența cerealelor și a rapiței la Round-upR și BastaR. De notat faptul că marile firme producătoare ale acestor produse investesc masiv în realizarea de cercetări și în acest domeniu al creării de OMG cu rezistențe sporite.

În practica ameliorării agricole, una dintre direcțiile importante de cercetare este legată de interesul obținerii semințelor unor hibrizi puri (100%). În cazul speciilor dioice, acest lucru se poate realiza fără probleme deosebite, însă la speciile monoice situația este mai complicată. Totuși, prin utilizarea unei gene de androsterilitate cu spectru larg, este posibilă obținerea de hibrizi puri 100% și la aceste forme de plante. Acest fapt s-a realizat la porumb prin utilizarea androsterilității (prin gena de androsterilitate) la una din liniile parentale.

Tot cu ajutorul genelor modificate s-au putut prelungi semnificativ perioadele de conservare (păstrare prelungită) a fructelor unor specii (ex. la tomate) prin inhibarea producerii de melanină. De asemenea, pe baza genelor modificate se pot modifica compozițiile inițiale ale unor acizi aminați rari și convertirea lor în lipide speciale, sau se pot obține compuși cu importanță farmaceutică, lignină sau alți produși de interes.

4.7.6. Realizări în silvicultură

Spre deosebire de plantele cultivate, arborii sunt cu mult mai puțin „receptivi” la aplicarea și dezvoltarea tehnologiilor privind transferul de gene datorită complexității lor structural morfologice și genetice, longevității și trăsăturilor fiziologice deosebite.

După cum s-a menționat deja, eventuala prăbușire a rezistenței pe verticală ca urmare a transferului și integrarea în genomul unui arbore a unei gene modificate, cu rezistență crescută la o insectă fitofagă, de exemplu, ar constitui un mare handicap, cu atât mai mult cu cât o modificare a întregului set cromozomial, la nivel de populație, ar fi practic imposibil de realizat într-un interval de relativ scurt de timp, ca în cazul speciilor cultivate. De aceea, la speciile lemnoase orice inițiativă privind introducerea unor astfel de tehnologii de vârf trebuie abordată cu multă chibzuință și discernământ, cu mare prudență de la caz la caz și numai după o temeinică documentare privind existența unor riscuri majore asupra destabilizării structurii ereditare de bază.

Totuși, la unele angiosperme lemnoase (ex. la plop), cu înmulțire vegetativă facilă și cu cicluri mai scurte de producție (25-30 ani), s-au putut obține, relativ ușor, varietăți modificate genetic, pornind de la câteva celule și de la care, ulterior, prin culturi in vitro și micropropagare, s-au edificat formațiuni forestiere monoclonale (fig. 23).

În ceea ce privește obținerea unor varietăți cu rezistență crescută la unele insecticide, cercetările pe această linie nu au înregistrat deocamdată rezultate spectaculoase, dar au fost create varietăți prin modificarea unor gene ce codifică sinteza unor toxine ale bacteriei Bacillus thuringiensis împotriva unor insecte xilofage. Principiul constă în inhibarea sintezei proteazei, enzimă foarte importantă în ceea ce privește digestia produșilor ingerați de către insectele respective.

În prezent, noi programe vizează modificarea cantitativă și calitativă a ligninei din fibra lemnoasă, aplicând o strategie antisens care determină o subexprimare a genei codificatoare a sintezei acestui produs. În acest sens se pot utiliza tehnici directe de transfer a genelor modificate (protoplaști sau “tunul” de particule), dar și cele indirecte prin intermediul plasmidului de Agrobacterium sp.

Figura 23. Cultură de plopi transgenici (după Nanson, 2005)

Raportul diminuat lignină/celuloză, în favoarea celui de celuloză, interesează producătorii de hârtie. Invers, când interesul se manifestă pe linia proprietăților mecanice, atunci contează mai mult conținutul în lignină. În orice caz, pentru ambele scopuri se pot obține, de exemplu, două clone de plop, în ciuda unor inconveniente de ordin economicofinanciar.

În concluzie, utilizarea transferului de gene sau combinații de gene modificate în vederea creării și utilizării OMG în ecosistemele forestiere este privită, în stadiul actual al cunoștințelor, cu rezervă și prudență de către marea majoritate a specialiștilor silvicultori și chiar cu ostilitate de către ecologiști.

4.7.7. În loc de concluzii

La începutul acestui mileniu, presa a fost inundată de articole contradictorii cu privire la utilizarea biotehnologiilor, în special cele privind transferul de gene modificate și crearea organismelor modificate genetic – OMG, în cadrul activității de ameliorare a animalelor domestice și a plantelor de cultură. Urmarea a fost declanșarea unei dispute aprinse între diverși poli ai societății ce includ mișcări și partide ecologiste, companii multinaționale, sectorul agricol și forestier, consumatori. Pe cadrul discuțiilor sunt abordate diverse categorii de probleme ca cele legate de patrimoniul genetic, de securitate alimentară, de apărare a drepturilor consumatorilor, etc.

În domeniul culturilor agricole, marile firme (companii) multinaționale fac uriașe presiuni pentru a se admite pe piață produsele lor cele mai avansate, produse care includ și sunt sub sigla OMG. Mai mult, firmele americane de profil nu vor ca produsele lor să fie etichetate, ceea ce îi împiedică pe consumatori (marii producători agricoli) să achiziționeze cu aceste produse în cunoștință de cauză.

În contradicție cu această poziție, Parlamentul Europei de la Strassbourg susține ideea ca OMG pe piață să nu depășească 0,9% din totalul produselor de profil și acestea să fie menționate și, prin urmare, cunoscute. Sistemul OCDE (Oficiul de Cooperare și Dezvoltare Economică) privind certificarea materialului reproducător (inclusiv forestier) este actualmente în impas deși este recunoscut oficial și de către S.U.A., care însă nu renunță la pretenția lor. Asupra acestor ultime aspecte menționate sunt necesare câteva clarificări.

Pentru început, trebuie menționat faptul că marile firme (în special cele din SUA) investesc sume enorme în cercetarea procesului transferului de gene, obținând varietăți superperformante privind unele trăsături cu impact asupra productivității sau rezistențe și toleranțe deosebite. Prin inducerea autosterilității asupra semințelor, prin tehnici specifice ingineriei genetice, aceste varietăți nu pot fi multiplicate de către agricultorii țărilor care le achiziționează. Acest tip de monopol constituie un impediment serios pentru statele care utilizează acest tip de material biologic, cu atât mai mult pentru țările în curs de dezvoltare. Legat de această problemă, firmele în cauză răspund că această autosterilitate este indusă semințelor varietăților modificate genetic pentru a se evita contaminarea cu polen provenit de la populațiile indigene (problema este cel puțin discutabilă!). Cert este faptul că, sub aspect financiar, noile varietăți obținute și distribuite sunt mai degrabă în avantajul marilor firme producătoare de semințe modificate genetic decât în avantajul consumatorului (producătorii agricoli).

În altă ordine de idei, numeroase discuții și chiar semne de întrebare se pot ridica asupra unor aspecte de ordin strict genetic. Astfel, genele modificate provin adesea de la unele specii total diferite de specia gazdă (prin utilizarea de intermediari aparținând unor viruși, bacterii sau chiar celule animale). De asemenea, căile utilizate pentru transferul de gene sunt, în unele cazuri, nesigure sau brutale (vezi tehnica utilizării “tunului” de particule). În atare situație nu se poate afirma cu certitudine care gene, exceptând cele țintă, sunt aduse (importate) și nici cum acestea se inserează în genomul gazdei. Mai mult, este foarte probabilă instalarea unui dezechilibru datorat apariției fenomenului de epistazie, existând în acest caz o interacțiune complexă cu genele deja existente. Acestea din urmă se pot inactiva sau, din contră, pot intra într-o stare de supraactivare.

Anumite gene (ex. la rapiță, cele legate de rezistență la erbicide) pot migra foarte ușor dintr-un ecosistem agricol în altul prin hibridare în genomul unor buruieni (“ierburi rele”) care aparțin aceleași familii (cazul muștarului de câmp), conferindu-le și acestora o rezistență sporită la erbicide. În consecință, este necesară aplicarea unor cantități mult mai mari de erbicide pentru a le controla și pe acestea din urmă. În acest caz, este indubitabil faptul că avantajele vor de partea firmelor furnizoare de erbicide, iar dezavantajele, din păcate, vor fi de partea agricultorilor și a mediului înconjurător. Fenomenul odată produs are efectele ireversibile datorită faptului că genele deja răspândite, cu greu mai pot fi extrase (eliminate) din populația respectivă.

Nu puțini susțin și ideea că genele modificate și, mai ales, proteinele noi care se sintetizează, în urma ingerării de către consumatori n-ar fi perfect digerate și ar trece accidental în circuitul sanguin. În acest mod ar rezulta maladii grave, de tipul KreutzfeldIacob, ca în cazul sindromului vacii nebune, sau mai ușoare, ca alergii la noile proteine ale căror efecte de acumulare nu sunt previzibile.

În domeniul forestier, cercetătorii pot crea clone cu material genetic modificat, însă cu mare dificultate și aceste formațiuni (de ex. la plop) au dezavantajul de a fi create în sistem monoclonal. Aceste păduri sunt extrem de fragile pentru că n-au variabilitate genetică și, în cazul unor atacuri masive de dăunători sau boli (rugini în special), pot fi foarte ușor distruse, în proporție de 100%. Acest fapt poate cauza adevărate catastrofe ecologice datorită controlului monogenic al rezistenței la un anume dăunător sau parazit dar, în schimb, este complet bulversată rezistența verticală (pe ansamblu) a arboretului.

Pe de altă parte, un program complex de ameliorare forestieră va avea în vedere ameliorarea principalelor trăsături ale arborilor, în acest sens criteriile de selecție în silvicultură sunt cel mai adesea de ordin cantitativ (creșteri), trăsături extrinseci (forma) și intrinseci (calitatea lemnului) sau de rezistență și adaptare. Ori, după cum se cunoaște, în majoritatea cazurilor, aceste caractere sunt supuse controlului unui număr mare de gene, iar un program de ameliorare atât de avansat, la ora actuală este practic imposibil de aplicat în silvicultură.

De aceea majoritatea geneticienilor din silvicultură vor fi obligați să țină cont de toate aceste aspecte și să adopte o atitudine precaută în abordarea și punerea în practică a diferitelor programe de ameliorare forestieră, ținând cont de ciclurile lungi de viață ale arborilor și de complexitatea structurii lor morfologice și ereditare. În silvicultură, lipsa prudenței în ceea ce privește adoptarea unor strategii raționale și eficiente în ameliorare poate crea un dezastru ecologic pe mari suprafețe și cu urmări catastrofale pentru perioade lungi de timp (zeci, chiar sute de ani). Metodele clasice utilizate în ameliorarea forestieră, precum selecția și hibridarea, au făcut de mult dovada eficienței lor și nu prezintă nici un pericol pentru integritatea unei populații dacă sunt practicate rațional și eficient. În acest sens, condiția de bază este de a se menține permanent un grad minimum de variabilitate genetică intra și interpopulațională.

Pe de altă parte nu trebuie, sub nici o formă, abandonate cercetările în acest domeniu de vârf al biotehnologiilor, respectiv transferul de gene modificate, crearea și utilizarea OMG. Este necesară însă aprofundarea acestor studii și cercetări în cadrul universităților și institutelor de cercetare de renume în domeniu, studii ce vor fi axate cu precădere pe aspecte fundamentale pe termen lung legate, în primul rând, de înțelegerea mecanismelor de bază la nivel molecular. Când aceste mecanisme vor fi pe deplin elucidate și înțelese, atunci se va putea face o evaluare corectă a raportului costuri-riscuri / beneficii, înainte ca rezultatele cercetărilor să fie implementate în ameliorarea genetică a arborilor. Deocamdată, acest raport pare a fi unul clar în defavoarea silvicultorilor.

V. PRINCIPIILE SILVICULTURII CLONALE

Multiplicarea vegetativă reprezintă indiscutabil metoda cea mai utilizată în cadrul silviculturii clonale, fapt datorat progresului spectaculos al tehnologiilor în domeniul fiziologiei plantelor (inclusiv la speciile forestiere). Prin urmare, aceste tehnici ocupă în prezent un loc foarte important în practica ameliorării silvice, fiind practic nelipsite din multiplele programe sau etape de ameliorare la cele mai importante specii de arbori.

Înmulțirea vegetativă se bazează pe aptitudinea majorității speciilor de plante de a putea reconstitui un exemplar identic cu el însuși, plecând de la un organ (tulpină, rădăcină, frunze), de la un țesut sau chiar de la o celulă (Lucău, 1998).

5.1 Tehnici de multiplicare vegetativă

În ceea ce privește speciile forestiere, numai câteva se pretează la multiplicarea vegetativă de rutină (eucalipt, sequoia, molid, pin, cireș, plop, sălcie, tei). Restul speciilor de arbori dovedesc o afinitate mult mai redusă în ceea ce privește obținerea facilă de butași, drajoni sau inoculi in vitro. Prin urmare, la acestea din urmă, costurile ridicate și punerea cu dificultate în aplicare a acestor tehnici nu justifică efortul de inițiere și dezvoltare ulterioară a unor programe silviculturale în sistem clonal.

5.1.1. Altoirea

Altoirea este una din cele mai vechi metode (tehnici) horticole, succesul acesteia depinzând de specie, tipul altoaielor și de epoca altoirii. Altoirea în cap este recomandată pentru înființarea de livezi de semințe, în vederea obținerii unor creșteri rapide și armonioase a plantelor, precum și a reducerii timpului necesar de producere a semințelor (Pinus, Picea, etc.).

În cadrul lucrărilor de ameliorare a arborilor, altoirea este intens utilizată la înființarea livezilor semincere de clone.

În efectuarea lucrărilor de altoire trebuie să se țină cont de câteva principii de bază, și anume:

contactul între altoi și portaltoi trebuie să fie cât mai strâns în vederea realizării unei perfecte sudări a țesuturilor, mai ales a cambiului ca zonă generatoare a ambelor componente;

portaltoii trebuie să fie puieți proveniți din sămânță, bine dezvoltați (la rășinoase, diametrul la colet să fie de 6-8 mm iar la foioase de minimum 10-12 mm), sănătoși, să aibă creșteri active, coajă netedă și o bună înrădăcinare;

altoaiele se recoltează, de regulă, în perioada de repaus vegetativ (între octombrienoiembrie și martie-aprilie). Pentru altoirile de vară (luna august), recoltarea altoaielor se face cu maximum 2 zile înaintea lucrării. În funcție de poziția florilor, recoltarea altoaielor se face fie din treimea mijlocie a coroanei pentru un raport echilibrat între inflorescențele mascule și femele (ex. la pin) sau din oricare parte a coroanei la speciile cu flori hermafrodite (ex. la salcâm);

confecționarea altoaielor se face din lujeri viguroși, în vârstă de 1-2 ani, cu o lungime de cca. 20 cm, iar după recoltare, altoaiele se leagă în mănunchiuri de câte 25-30 bucăți cu etichetă; 60

păstrarea altoaielor se va face în încăperi cu suficientă umiditate și o temperatură care să nu le permită intrarea în vegetație, în situația de încălzire a vremii.

Altoirea în seră este mai ușoară și mai sigură decât altoirea în aer liber, beneficiind de unele avantaje cum ar fi: adăpost față de condițiile nefavorabile de mediu, un regim reglabil de intensitate luminoasă temperatură și umiditate si poate fi practicată și iarna. Dezavantajele constau în costurile ridicate privind investiția, încălzirea, materialele și, nu în ultimul rând, riscul apariției unor boli criptogamice. Acest tip de altoire se poate practica la rășinoase și la unele foioase (fag).

Altoirea în aer liber, respectiv în livezile de semințe, prezintă unele mari avantaje, în sensul că este mult mai puțin costisitoare decât altoirea în seră și materialul biologic nu trebuie să suporte atât de multe manipulări ca în cazul precedent. Totuși, acest tip de altoire trebuie să se execute pe timp cu suficientă umiditate atmosferică, cer înnorat, fără vânturi uscate și calde, toate aceste condiții la un loc fiind greu de îndeplinit pentru perioade mai lungi de timp. Anumite specii (duglas) prezintă fenomene de incompatibilitate pe o perioadă mai mare sau mai mică de timp. În acest caz, se selecționează portaltoaie compatibile care vor produse din sămânță sau din butași.

5.1.2. Marcotajul

Marcotajul reprezintă metoda vegetativă prin care este provocată formarea de rădăcini pe un ram nedetașat (în primă fază) de arborele mamă. Dezvoltată inițial în domenii ca horticultura, pomicultura sau horticultura, tehnica inducerii și formării rădăcinilor pe ramuri nedetașate inițial s-a aplicat, treptat și cu bune rezultate, la unele specii de arbori. Operații ca inelarea scoarței și aplicarea unor tratamente cu substanțe rizogene (mai ales cele din categoria auxinelor), precum și crearea mediului necesar dezvoltării rădăcinilor (sub formă de mușuroaie la marcotaj în lăstar sau sub formă de manșon la marcotaj aerian), stau la baza înrădăcinării și separarea noii plante de arborele mamă. Această tehnică este complexă și relativ costisitoare și, în consecință, se recomandă a fi aplicată drept completare sau în caz de eșec la aplicarea altor tehnici vegetative(ex. la nuc).

5.1.3. Drajonarea

Este fenomenul prin care se produc lujeri tineri pe rădăcini. Anumite specii (cireș sălbatic, tei, plopi hibrizi) au capacitatea intrinsecă de a dezvolta aceste formațiuni specifice, rezultând adevărate buchete de drajoni, iar fiecare dintre aceștia reprezentă o clonă. Aceste formațiuni se pot preleva fie în mănunchiuri de 50-100 bucăți (lungime de cca. 8-10 cm) și care se pot instala în seră, fie câte 2-3 lujeri, lungi de 20 cm și care se pot instala în pepinieră. Important este faptul ca acești lujeri să fie recoltați de pe plante tinere, în vederea inducerii rapide și eficiente a procesului de înrădăcinare.

5.1.4. Butășirea

Butășirea reprezintă probabil tehnica cea mai veche dar și cea mai utilizată în silvicultura clonală, aceasta în scopul răspândirii materialului selecționat și ameliorat (molid, pin, cireș, sălcii, plopi). Butașii de calitate se disting mai ales prin capacitatea lor deosebită de înrădăcinare, iar factorii de care depinde calitatea butașilor sunt legați de vârsta arborelui mamă și de starea fiziologică a materialului vegetal, ca factori endogeni, respectiv de condiții de butășire sau aplicare de tratamente – factori exogeni.

Înaintarea în vârstă conduce invariabil la o descreștere a capacității de înrădăcinare a butașilor și, implicit, la scăderea calității materialului. Descreșterea poate fi bruscă (ex. la nuc) sau progresivă (larice sau molid).

Poziția lujerilor pe ramuri poate, de asemenea, influența direct calitatea viitorilor butași. Astfel, lujerii din vârful ramurilor sau cei proveniți de la ramurile aflate la baza coroanei sunt mai tineri și pot furniza butași de calitate superioară, cu un procent superior de înrădăcinare. Ca anotimp, este recomandabil ca la rășinoase, recoltarea să se facă înainte de intrarea în vegetație, pe când la foioase chiar în plin sezon de vegetație, în fază activă de creștere.

Legat de factori exogeni, mediul de butășire poate avea adesea o influență decisivă asupra procesului de formare și dezvoltare a unor rădăcini de bună calitate la butași. Se cunoaște faptul că la duglas, un procent mai mare de pietriș în mediul de butășire induce formarea unor rădăcini groase, puțin ramificate și fragile la repicaj. Dimpotrivă, utilizarea unor medii cu un conținut mai ridicat de turbă favorizează formarea de rădăcini fine, lignificate și ramificate, favorabile repicajului.

Există o relație directă între factorul termic și umiditatea mediului de butășire, în sensul că la o umiditate suficientă, butașii pot înrădăcina destul de bine și la temperaturi mai mari sau mai scăzute, însă optimul termic al mediului este cel cuprins între 21- 24oC. Între aceste limite ale temperaturii, viteza de înrădăcinare este cea mai favorizată.

În ceea ce privește administrarea unor substanțe active (simple sau combinații), pe baza cercetărilor efectuate, se poate afirma că aplicarea acestor produși, în anumite concentrații, combinații sau în anumite etape fiziologice de creștere, au o influență benefică pentru butașii aparținând majorității speciilor forestiere. Cele mai indicate substanțe, în acest sens, sunt cele aparținând grupei auxinelor (AIA, ANA, AIB, etc.) ce au un efect rizogen recunoscut.

Strategii de butășire

Dezvoltarea și aplicarea pe scară tot mai largă a acestei tehnici de înmulțire vegetativă în pomicultură și viticultură au creat premize favorabile stabilirii și adoptării unor programe și chiar strategii de butășire și în silvicultură.

Multiplicarea clonală a arborilor vârstnici. Nu este indicat a se utiliza în mod direct butași prelevați de la arbori vârstnici, deoarece acești butași înrădăcinează foarte greu și, în final, rezultă plante de calitate mediocră. În prezent, sunt puse la punct tehnici de revenire le un anumit stadiu de juvenilitate a zonei de interes la un astfel de arbore Aceste tehnici favorizează dezvoltarea mugurilor inițiați de mai mulți ani dar care au fost menținuți reprimați. În acest scop, se procedează la executarea unor tăieri severe, sau la tăierea puieților aproape de pământ (recepare), aceste operații permițând multiplicarea vegetativă la unele specii importante de rășinoase (pin) sau foioase (stejar, nuc, frasin). De asemenea, rejuvenilizarea se mai poate realiza și prin executarea unor altoiri repetate pe răsaduri tinere (ex. la duglas, pin, eucalipt).

În ciuda faptului că toate aceste tehnici necesită timp și se efectuează cu costuri destul de ridicate, totuși ele sunt dezvoltate în cadrul activităților specifice de înființare a unor parcuri de arbori-mamă de butași sau chiar în anumite etape ale unor programe de ameliorare forestieră.

Multiplicarea cu selecție clonală în pepinieră constituie o importantă metodă pentru multiplicarea materialului juvenil și fost aplicată, prima dată, la molidul comun, în Germania.

Este recomandabil de a se preleva un număr cât mai mare de clone (câteva mii), deoarece este greu a se depista exemplarele valoroase la vârste mai fragede. În plus, definitivarea selecției se realizează pe parcursul mai multor etape ale testelor clonale. Menținerea stadiului de juvenilitate se poate realiza prin butășire ciclică și menținerea clonelor sub formă de nuieliș

Multiplicarea în vrac a proveniențelor constituie o altă variantă strategică în cadrul programelor de silvicultură clonală și depinde de stadiul de avansare a programelor de ameliorare. Sistemul de butășire aplicat la populațiile semincere conduce la obținerea rapidă de plantații foarte performante, permițând totodată și menținerea juvenilă a parcurilor de arbori-mamă. Există posibilitatea ca, la apariția primelor simptome de maturare-îmbătrânire la butași, respectivele exemplare să fie înlocuite cu noi răsaduri obținute din același lot de semințe. Dezavantajul constă în costul ridicat al activității, situație datorită echipamentelor sofisticate necesare creșterii și formarea plantelor, cât și pentru realizarea butășirii (ex. la Picea mariana) (Lucău, 1988).

5.1.5. Micropropagarea “in vitro”

Înmulțirea “in vitro” a plantelor poartă denumirea de micropropagare

(micromultiplicare sau microînmulțire). Este o formă de multiplicare vegetativă și asigură un randament net superior, în comparație cu alte procedee practicate, până în prezent, în horticultură și silvicultură. Micropropagarea se face prin minibutășire “in vitro”, atunci când plantulele din culturile primare sunt bine dezvoltate, cu rădăcinițe, tulpinițe și frunzulițe bine individualizate și viguroase. Minibutașii rezultați sunt trecuți, în condiții aseptice, pe medii de cultură noi și vor forma culturile secundare.

Faptul că într-un timp relativ scurt (în mai puțin de un an) se pot obține, prin micropropagare, milioane de exemplare (copii fidele ale plantei donatoare), forme care în condiții obișnuite s-ar obține foarte greu sau nu ar putea supraviețui, reprezintă un câștig enorm privind eficiența și implicațiile practice ale acestei metode în ameliorarea unor importante specii forestiere. De asemenea, prelevarea și cultura “in vitro” de meristeme asigură obținerea și multiplicarea unui material biologic sănătos, liber de viruși (Fărtăiș, 2002).

5.2. Utilizarea clonelor.

Sistemul de cultură a clonelor, devenit deja de rutină pentru unele specii care butășesc ușor (ex. la plopi și sălcii), a căpătat o nouă dimensiune prin extinderea la tot mai multe specii forestiere.

5.2.1. Modele de silvicultură clonală

Cultura clonelor la salicacee și specii ale genului Criptomeria se practică de mai multă vreme, acestea devenind între timp modele de referință (modele clasice) pentru rezolvarea problemelor apar la alte specii forestiere.

Un modelul mai recent al aplicării culturii clonale, cum este cel adoptat la eucalipt, prezintă o serie de rezultate interesante și încurajatoare prin butășire erbacee și a avut un succes notabil în Congo, țară în unde s-au plantat în sistem industrial cca. 25.000 ha. Pentru reușita acestui program, s-au adaptat pepinierele la cultura de butași erbacei, s-a lucrat în sistem mecanizat, iar ecartamentul plantației a fost mărit de la 3m x 3m, la 4m x 4m. În acest mod, s-a înregistrat loc o creștere considerabilă a câștigului genetic în ceea ce privește producția de lemn și producția de pastă (de 3, respectiv 5 ori).

5.2.2. Tentative noi în silvicultura clonală

În unele țări ale Europei (ex. Suedia, Franța), molidul constituie obiectul predilect al noilor tentative privind introducerea varietăților policlonale, în acest sens fiind puse la punct unele programe de multiplicare vegetativă (inclusiv in vitro). De asemenea, sunt în plină desfășurare acțiuni vaste de instalare a unor plantații clonale, în sistem industrial, la Sequoia, bazat pe un program sistematizat de introducere, selecție și clonare, cu rotație la 15-18 ani. Cercetări și experimente în acest sens s-au mai întreprins la pin, precum și alte specii de rășinoase.

Tot acest ansamblu de tehnici și programe circumscrise sistemului de cultură clonală permite, în final, multiplicarea în masă a descendenților foarte avantajoși, evitându-se apariția îmbătrânirii prin multiplicarea de răsaduri foarte tinere (Lucău, 1988).

Noi tentative de cultură în sistem clonal sunt aplicate și la multe specii de foioase, la unele dintre acestea înregistrându-se succese notabile. Astfel, în ceea ce privește populicultura în zone hidromorfe din Franța a fost inițiat și pus la punct un amplu program prin care s-au selectat exemplarele cele mai bune din cadrul populațiilor artificiale hibride cu testare în teren. În acest fel, s-au rentabilizat și solurile hidromorfe datorită varietăților adaptate la aceste condiții, varietăți care produc totodată și lemn de derulaj de bună calitate. S-a adoptat, pentru mai multă siguranță privind adaptabilitatea, sistemul culturii în parcele policlonale și cu o densitate mai mare, respectiv de 500-600 exemplare la ha.

În ceea ce privește cireșul sălbatic, tot în Franța, au fost inițiate și perfecționate programe în ceea ce privește micropropagarea, după reîntinerire, prin drajonare. Modelul congolez privind cultura vegetativă în sistem industrial a eucaliptului a fost reluat în Franța, unde s-au instalat cca. 25.000 de ha de parcele monoclonale, în imediata vecinătate a uzinelor de celuloză și hârtie, cu rotație a culturilor de 8-10 ani și producție de cca. 20 t/an/ha.

5.2.3. Riscuri și limite în silvicultura clonală

Adoptarea oricărei strategii sau program de silvicultură în sistem clonal presupune adoptarea unor măsuri prealabile necesare pentru a se evita apariția unor riscuri majore legate mai ales de îngustarea drastică a bazei genetice în cadrul populației de plecare.

Reducerea bazei genetice implică cele mai mari riscuri, deoarece populația în cauză își reduce enorm potențialul de adaptabilitate în cadrul stațiunii respective, dovedind o tot mai mare lipsă de uniformitate în ceea ce privește reacția la acțiunea diferiților factori nocivi biotici și abiotici. Pe această linie, rezistența pe ansamblu a populației diminuează vizibil, iar cele mai expuse pericolului de destabilizare a echilibrului genetic sunt parcelele monoclonale.

Pentru a se preîntâmpina apariția acestor nedorite efecte, este necesar, ca la demararea oricărui program de ameliorare bazat pe sistem silvic clonal, să se țină cont de unele măsuri extrem de utile în acest sens:

alegerea celor mai bune stațiuni și situri mecanizabile;

utilizarea numai a fazei juvenile a creșterii speciilor;

utilizarea de genotipuri cu un grad foarte mare de heterozigote, posedând gene de la mai multe proveniențe sau specii;

asigurarea unei diversități genetice și a unui număr de clone direct proporțional cu suprafața plantată și cu vârsta de exploatabilitate;

selecția inițială în ce privește rezistența orizontală (toleranța poligenică la mai multe adversități);

selecția finală în ce privește rezistența verticală (la un patogen precis și care depinde de puține gene);

ameliorarea genetică permanentă, prin introducerea de noi clone la fiecare rotație, mai performante, mai productive și mai rezistente; – suprafață totală relativ redusă (Lucău, 1998).

VI. CONSERVAREA RESURSELOR GENETICE FORESTIERE

6.1 Definiție, generalități și grupe de resurse genetice la principalele specii de arbori

Resursele genetice vegetale cuprind aproape toate formele de plante superioare (de la cele sălbatice sau primitive până la cele ameliorate), care pot aduce cea mai mare contribuție la sporirea adaptabilității și a rezistenței la agresiunea mereu crescândă a factorilor biotici și abiotici. Toate aceste forme de plante asigură amelioratorilor (creatori de noi soiuri, hibrizi și varietăți) materialul “de plecare“ necesar derulării și realizării cu succes a unor programe complexe și eficiente de ameliorare. Șansele realizării acestor programe cresc cu cât acest material biologic este mai diversificat, mai bine evaluat și, cel mai important, mai bine conservat.

Resursele genetice forestiere (RGF) sunt reprezentate de acele fonduri de gene (germoplasmă forestieră) care pot exprima la nivelul unei populații (unitate de bază în genetica populațiilor) o diversitate genetică intraspecifică largă, însușiri cantitative (auxologice – specifice bioacumulărilor) și calitative deosebite și, nu în ultimul rând, o mare capacitate de adaptare și rezistență sporită la factorii abiotici și biotici. Acest concept cuprinde asociații de arbori – arborete naturale și unele artificiale, cu specii autohtone sau exotice, pe suprafețe mai mari sau mai mici, toate reprezentând culturi forestiere de mare interes științific, economic și practic pentru prezent, dar mai ales pentru viitor.

Valoarea strategică (de perspectivă) a acestor comunități de arbori ce conțin fonduri de gene deosebit de valoroase nu exclude, de multe ori, valoarea practică imediată sau economică. Este cazul unor arborete din care, cu anumite limite, se recoltează periodic anumite cantități de semințe.

La noi în țară, fondul valoros de germoplasmă forestieră ocupă un loc de prim rang în ceea ce privește fondul strategic de perspectivă al continentului european (tab. 3).

Cele mai importante specii forestiere din țara noastră prezintă populații mari de arbori, cu o structură genotipică foarte complexă, relieful carpatic armonios permițând transformări și readaptări continue ale tuturor populațiilor de arbori autohtoni. Prin urmare, aceste arborete sunt deosebit de dotate sub aspectul creșterilor și bioacumulărilor, însușirilor calitative ale tulpinilor, coroanelor și lemnului, capacitate ridicată de regenerare și adaptare la diverse condiții ecologice.

Molidul în țara noastră aparține varietății montana și, din multe puncte de vedere, se prezintă ca o grupă destul de unitară. În mod deosebit, formele din Carpații Orientali se remarcă printr-o vitalitate sporită, o mare capacitate de biosinteză, lemn cu calități deosebite și un mare grad de variabilitate. Capacitatea de regenerare este maximă la molidișurile din Valea Bistriței și Depresiunea Ciucului (Stănescu, 1998).

Tot în Carpații Orientali (Bucovina, Maramureș) dar și în bazinul superior al Mureșului își are exclusivitatea molidul de rezonanță, formă la care lemnul, cu inelele sale regulate și creștere uniformă în direcția longitudinală, posedă proprietăți de ordin acustic excepționale. Manifestarea acestor însușiri ale lemnului de rezonanță este sub control poligenic și este puternic influențată de anumite condiții staționale caracteristice acestei zone.

Tabelul 3

Situația actuală a resurselor genetice la principalele specii forestiere din țara noastră

după Lalu, citat de Stănescu, V., 1998

Deși este relativ unitar sub aspect morfologic, prezența anumitor obstacole ecologice a determinat totuși și la molidul carpatic apariția mai multor forme și ecotipuri de ordin climatic și edafic, ca de exemplu molidul din zona munților Apuseni – rasă climatică specifică unei zone cu climă mai caldă și umedă, molidul din zonele cu discontinuități de areal din Văile Jiului și Oltului (evoluție de natură ecologică) sau molidul cu o oarecare izolare reproductivă din depresiunile intramontane din bazinele superioare ale râurilor Mureș și Olt, aceste regiuni fiind caracterizate de un climat rece, sărac în precipitații și cu înghețuri timpurii frecvente. De asemenea, în zona Carpaților de Curbură, molidul este cantonat în populații reprezentative aflate într-un climat bogat în precipitații și cu ierni lungi.

Bradul (Abies alba Mill.) avea în zona țării noastre un areal mult mai întins în perioada interglaciară, retrăgându-se apoi treptat, astfel că în urma ultimei glaciațiuni să rămână cantonat în regiuni de câmpie sau cu mici și izolate refugii carpatice (Moldova, Muntenia, Transilvania, Banat și Oltenia)(Pop, 1932, citat de Stănescu 1998).

Din punct de vedere morfologic, comparativ cu molidul, bradul prezintă o variabilitate mult mai redusă, deosebindu-se tipuri doar sub aspectul unor caractere distincte ale conurilor, scoarței (cu sau fără ritidom) sau ale lemnului (brad cu lemn roșu sau alb).

Sub aspectul creșterilor active, coroane bine dezvoltate și dimensiuni excepționale, au proveniențele de brad din Maramureș, Bucovina, acestea fiind și cele mai reprezentative.

Ca tipuri ecoclimatice, se remarcă proveniențele de brad din Munții Apuseni, din zona Banatului (forme relativ termofile), din bazinul superior al râului Mureș, din zona Carpaților de Curbură și din vestul țării (Stănescu 1998).

Un caz aparte în problematica identificării și conservării surselor de germoplasmă la rășinoase îl ocupă zâmbrul (Pinus cembra), specie forestieră caracteristică limitei superioare (subalpin) a etajului forestier. Astăzi, această specie ocupă în țara noastră zone foarte restrânse și constituie un relict al glaciațiunii cuaternare. Practic, îl găsim în mici grupuri (populații reduse și izolate) în Munții Călimani și Rodnei din Carpații Orientali dar și în masive din Carpații Meridionali (Bucegi, Retezat, Parâng, Făgăraș). Gradul destul de accentuat de consangvinizare în cadrul acestor grupuri mici și izolate de zâmbru, se caracterizează prin apariția unui mare număr de semințe nefertile și o redusă putere de adaptare la introducerea în culturi în zone mai extinse. Sub acest ultim aspect, mai viguroase se prezintă numai formele de zâmbru cantonate în zona munților Călimani, Rodnei și Retezat, unde specia supraviețuiește pe arii mai extinse.

Înființarea, în ultimii ani, de noi zone (arii) cu statut de rezervații (chiar parcuri naționale, cum este cazul în munții Călimani) va crea posibilitatea ca unele dintre populațiile de zâmbru din zonă să devină surse extrem de valoroase de germoplasmă, utile și nesesare refacerii zonei de limită superioară a pădurilor din arcul carpatic.

Fagul (Fagus sylvatica) reprezintă una dintre cele mai importante specii forestiere de la noi din țară, ocupând unul din cele mai întinse arealuri (aproape egal cu cel al molidului). În sistem de rezervații de semințe, această specie cuprinde peste 3.300 de astfel de arborete (conform datelor cartării seminologice 1976-1978) în care este prioritar sistemul de regenerare naturală (Giurgiu 1978, citat de Stănescu 1998). Acest tip de regenerare naturală “in situ” a condus la păstrarea unui fond genetic foarte puțin (chiar deloc) alterat, la acesta contribuind și lipsa unor culturi artificiale cu surse străine de germoplasmă.

În regim de rezervații sunt conservate numai câteva populații (arborete) cu un înalt grad de reprezentativitate (cca. 5% din fondul forestier la fag) și care trebuie exceptate de la tăieri. Dintre aceste tipuri, se detașează în mod deosebit făgetele din zona de nord a Dobrogei, grupuri restrânse și izolate de arbori ce trebuie să constituie obiectul unor măsuri stricte de conservare.

Stejarul pedunculat (Quercus robur) deține la nivelul întregii țări cca. 3800 ha arborete surse de semințe, aceasta ca urmare a diminuării puternice a suprafețelor arboretelor de stejar din ultimii 40-50 de ani. În aceste condiții, arboretele rămase ar trebui încadrate de urgență în categoria pădurilor de protecție (Giurgiu 1978, citat de Stănescu). Principalele rezervații forestiere de stejar în țara noastră se găsesc în județele Mureș (Mociar), Brașov (Prejmer), Neamț (Vânători), Buzău (Frasin), Tulcea (Letea). Masivele de stejar pedunculat încă existente în Muntenia (Comana-Pitești-Alexandria), partea de nord a Moldovei sau în centrul Transilvaniei, impun luarea imediată a unor măsuri stricte în sensul prelungirii vârstei pentru tăieri spre limita exploatabilității fizice, coroborat cu instituirea unui sistem eficient de regenerare (Giurgiu 1978, citat de Stănescu 1986).

Gorunul (Quercus petraea), în momentul actual, în țara noastră, se întâlnește pe arii ceva mai extinse comparativ cu stejarul pedunculat, fiind catalogate peste 13.500 ha arborete surse de semințe.

Există arborete surse de semințe de categoria A (cu o mare precocitate), cu preponderență în regiunile de deal și coline ale țării noastre. Cele cu caracter marginal sunt reprezentate de populațiile de gorun din zone silvostepice (Moldova de Nord) și populații de altitudine (Harghita, Postăvarul, Perșani sau Munții Dobrogei).

6.2. Importanța studiului diversității biologice în perspectiva identificării, conservării și utilizării durabile a resurselor genetice forestiere

Fondul de gene (gene pool) reprezintă…”totalitatea genelor care există la un moment dat într-o populație și care se găsesc într-un echilibru dinamic” (Dobjansky, 1951).

Genotipul este individul luat ca o unitate în care genele manifestă interacțiuni alelice și nealelice, alelism multiplu, polialelie sau pleiotropie. Pe de altă parte, selecția naturală, acționând asupra fenotipurilor, tinde spre o stabilizare (homeostazie genetică), fenomen cunoscut și sub denumirea de coadaptare a genelor. Prin urmare, genele nu acționează izolat, iar fenotipurile sunt determinate în populație de constelația de gene existentă. Homeostazia genetică nu este altceva decât o problemă de coadaptare a genelor.

Variabilitatea genetică este însă opusul homeostaziei genetice. Având ca sursă primară mutațiile ce se acumulează de-a lungul generațiilor și ca sursă secundară recombinarea genetică (redistribuirea alelelor mutante într-un număr enorm de combinații), variabilitatea genetică se manifestă printr-un număr foarte mare de programe genetice, diferite unul de celălalt. La organismele cu reproducere asexuată, sursa unică de variabilitate genetică o reprezintă mutația.

Fenomenul sexualității și variabilitatea genetică au o importanță cu totul excepțională, ele reprezentând o garanție a adaptării organismelor la condițiile mereu schimbătoare ale mediului înconjurător.

De aceea, studiul variabilității genetice are o importanță covârșitoare în situația când se pune problema inventarierii și mai ales a identificării unor categorii de arborete extrem de valoroase, respectiv clase sau categorii de resurse genetice forestiere de mare valoare (cu o mare capacitate de recombinare).

Pădurile reprezintă surse regenerabile extrem de valoroase, atât ca furnizori de materii prime (lemn dar și produse nelemnoase) cât și pentru o serie de servicii (protecție a mediului ambiant, conservare a biodiversității, odihnă și recreere).

Din păcate, în zilele noastre, tot mai întinse suprafețe împădurite sunt supuse unor uriașe presiuni și amenințări (defrișări, poluări, calamități naturale, atacuri masive de boli și dăunători). De aceea, se impune cu tot mai intensă acuitate problema luării de măsuri cât mai grabnice și hotărâte privind protejarea și conservarea fondului forestier existent, de plantare a noi păduri cu specii de arbori mai productive și mai rezistente, precum și exploatarea ecologică și judicioasă a pădurilor.

O problemă de foarte mare importanță pentru noul mileniu, în care abia am intrat, o constituie aceea privind stabilirea și punerea în aplicare a unei strategii optime comune dintre economie și ecologie, în beneficiul societății umane.

Degradarea accentuată a mediului înconjurător la nivel planetar a constituit un subiect foarte important de dezbatere în numeroase întruniri la nivel internațional.

Fără îndoială, componenta cea mai importantă a naturii o reprezintă vegetația, de această componentă depinzând viața tuturor celorlalte viețuitoare de pe pământ, inclusiv viața omului. Formele de plante sălbatice și cele introduse în vechime în cultură, sub acțiunea permanentă a factorilor de mediu în foarte îndelungatul proces al evoluției, conțin în structura lor ereditară însușiri de adaptare de mare importanță pentru supraviețuire. Toată această biodiversitate vegetală conține surse de gene extrem de valoroase, nu numai pentru supraviețuirea plantelor respective dar și pentru însăși existența omului.

Ecosistemele forestiere trebuie să răspundă deci, la cerințe din cele mai complexe, ele însele constituind ecosisteme foarte complexe care găzduiesc o floră și o faună specifică. Aceste ecosisteme dețin rolul absolut majoritar în ceea ce privește purificarea și păstrarea calității aerului, apelor și solului.

Pe baza acestor considerente, se poate lesne deduce faptul că investigarea variabilității genetice a speciilor forestiere și prezervarea pe termen lung a acestei biodiversități reprezintă, în prezent, o problemă de mare importanță care se ridică în fața silviculturii mondiale.

6.3 Conservarea germoplasmei forestiere

Conservarea resurselor genetice forestiere constituie mijlocul cel mai eficient de a garanta disponibilitatea acestora pentru generațiile prezente și, mai ales, viitoare.

În această sferă este inclus un mare număr de activități specializate cum ar fi prospectarea, colectarea, gestiunea și schimbul de germoplasmă. În situația în care nimeni nu poate prevedea necesitățile viitoare privind mediul înconjurător și ale omului, este foarte important de a se conserva o cât mai largă variabilitate genetică în cadrul fiecărei specii. Cu cât este conservată mai multă variabilitate, cu atât există șanse mai mari de a se găsi, de către utilizatori, caracterele (trăsăturile) necesare dezvoltării unor programe eficiente de ameliorare genetică.

Resursele genetice forestiere se pot conserva în cadrul habitatului lor natural – conservare in situ – sau în afara acestuia – conservare ex situ. Ambele metode de conservare au avantaje dar și inconveniente. De aceea, pentru o sporire a eficienței activității de conservare a resurselor genetice forestiere este necesar de a se asocia metode in situ cu alte metode ex situ.

6.3.1 Conservarea “in situ” a resurselor genetice forestiere

Modalitățile de conservare in situ implică menținerea arborilor și plantelor, în general, în habitatul original sau în sisteme agricole tradiționale. Conservarea in situ este metoda preferată în cazul mai multor esențe forestiere, cu deosebire a celor din zona tropicală. Comparativ cu speciile agricole care cresc în medii destul de bine controlate, majoritatea arborilor se dezvoltă în medii “sălbatice” și au cicluri lungi de viață. În consecință, arborii trebuie conservați ca parte integrantă a ecosistemului stabilit, medii în care se pot adapta și evolua.

Cele mai importante măsuri ce pot lua pe linia unei conservări in situ sigure și eficiente a celor mai valoroase surse de germoplasmă forestieră constau în crearea de parcuri și rezervații naturale, rezervații semincere, interzicerea accesului total neîngrădit sau exploatare preferențială de arbori valoroși din punct de vedere fenotipic și genotipic.

6.3.1.1. Crearea de parcuri și rezervații naturale

Această modalitate de conservare in situ reprezintă, în mod cert, acțiunea de cea mai mare responsabilitate civică pe linia păstrării patrimoniului genetic al unor populații naturale deosebit de valoroase, acțiune care solicită eforturi economice și administrative mari și un imens volum de muncă privind documentarea, cercetarea și evaluarea fondului de germoplasmă existent în cadrul acestor arii protejate.

La noi în țară, Parcul Național Retezat, Parcul Național Munții Rodnei, Parcul Național Călimani și Parcul Național Ceahlău sunt patru dintre cele mai reprezentative arii protejate, cu caracter predominant forestier și o anumită specificitate eco-geografică. Prin specificul și unicitatea lor, aceste zone constituie arii deosebit de valoroase, primele două fiind incluse, încă din anul 1992, în dosarele MAB/UNESCO ca rezerve ale Biosferei (WCMC, citat de Enescu,1997).

A. Parcul Național Retezat, în actuala configurație organizatorică, are o suprafață de peste 38000 ha, din care suprafața aflată sub protecție absolută deține 9503 ha, restul fiind considerată zonă tampon. (fig.7).

Înființat în anul 1935, în urma constituirii Comisiei pentru protecția monumentelor naturii, sub patronajul Academiei Române și pe baza Legii privind protecția Naturii din România, Parcul Național Retezat se întindea inițial pe o suprafață de 13.700 ha, extinderea considerabilă fiind efectuată în ultimele două decenii prin încorporarea unei vaste zone împădurite. Aceste păduri dețin ponderea majoritară în cele trei rezervații ale parcului, respectiv Zlata, Piatra Iorgovanului și Gugu – Piatra Mâțului, toate însumând peste 9000 ha.

Vegetația, prin distribuția și structurarea unităților taxonomice, prezintă mari variații în special pe orizontală, reflectând din plin marea varietate topică a zonei (rocă, expoziție și forme de relief). Pădurile acoperă aproape jumătate din suprafața parcului (48.5%), în timp ce alte formații sunt mai puțin reprezentative (jnepenișuri – 16,9%, pajiști alpine și stâncării – 21,4%) (Botnariuc et al.,1984). Parcul, în general, are aspect de pădure întinsă, iar o schematizare pe verticală a zonei se poate prezenta în linii mari astfel:

făgete pure 700 – 1250 m altitudine;

făgete de amestec cu rășinoase (brad, molid) 1250 – 1450 m altitudine;

molidișuri climax 1450 – 1650 m altitudine;

molidișuri de limită pre și subalpine 1500 – 1780 m altitudine;

jnepenișuri 1780 – 2200 m altitudine;

vegetație ierboasă și tufărișuri boreale 2150 – 2400 m altitudine.

Sub limita de 700 m, în amestec cu făgetele, sunt prezente și amestecuri de pin cu gorun.

Pădurile parcului au fost identificate ca făcând parte din următoarele formații vegetale: 15 făgete, 15 molidișuri, 13 amestecuri de fag cu rășinoase și 3 păduri extrazonale (montane și de lunci înalte), majoritatea aparținând clasei de productivitate mijlocii (Doniță, citat de Enescu 1997).

B. Parcul Național Munții Rodnei, cu cele peste 46.000 de hectare cuprinse în suprafață, reprezintă una dintre cele mai mari arii protejate din țară. Mai mult de 3.300 ha sunt declarate ca rezervație a biosferei, iar parcul, pe ansamblul său, adăpostește multe specii endemice din faună și floră, unele adevărate relicte glaciare.

Din punct de vedere teritorial-administrativ, această arie protejată se situează pe teritorii aparținând județelor Maramureș, Bistrița-Năsăud și Suceava, în grupa de nord a Carpaților Orientali, din care Munții Rodnei au cele mari cele mai mari altitudini (Vf. Pietrosul cu peste 2.300 m) și care păstrează foarte bine urmele ghețarilor din cuaternar (circuri glaciare precum Pietrosu, Buhăescu Mare, Negoescu) (fig.24). Climatul în această zonă prezintă influențe baltice și, datorită marilor altitudini, este destul de aspru, temperatura medie anuală la peste 2.000 m fiind sub limita de îngheț (-1,5oC).

În ceea ce privește vegetația forestieră, în Parcul Național Munții Rodnei se pot delimita câteva formațiuni reprezentative, ținând cont de structura și tectonica munților precum și de evoluția climatică specifică urmărilor glaciațiunilor cuaternare cu platformele de eroziune ce domină relieful actual.

În partea superioară a versanților predomină molidișuri pure iar pe pantele inferioare sunt evidente amestecurile cu fagul, bradul, paltinul de munte, aninul alb și mesteacănul. La limita superioară (cca. 1800 m), destul de frecvent întâlnim jnepenii (Pinus mugo) în asociație cu ienuperii (Juniperus communis var. nana) și mai rar exemplare de zâmbru (Pinus cembra) ca diseminații dar care au atins vârste apreciabile (peste 300 ani) și înălțimi de peste 30 m (Enescu et al.,1997).

Tufărișuri mai mult sau mai puțin compacte de jnepeni și ienuperi au rol extrem de important în menținerea unui echilibru natural relativ stabil în zonă, prin limitarea unor eroziuni excesive ale solului și de atenuare a daunelor provocate de numeroasele avalanșe produse în zonă.

Vegetația, prin distribuția și structurarea unităților taxonomice, prezintă mari variații în special pe orizontală, reflectând din plin marea varietate topică a zonei (rocă, expoziție și forme de relief). Pădurile acoperă aproape jumătate din suprafața parcului (48.5%), în timp ce alte formații sunt mai puțin reprezentative (jnepenișuri – 16,9%, pajiști alpine și stâncării – 21,4%) (Botnariuc et al.,1984).

Figura 24. Configurația actuală a Parcului Național Retezat (după MMGA,2003)

Parcul, în general, are aspect de pădure întinsă, iar o schematizare pe verticală a zonei se poate prezenta în linii mari astfel:

făgete pure 700 – 1250 m altitudine;

făgete de amestec cu rășinoase (brad, molid) 1250 – 1450 m altitudine;

molidișuri climax 1450 – 1650 m altitudine;

molidișuri de limită pre și subalpine 1500 – 1780 m altitudine;

jnepenișuri 1780 – 2200 m altitudine;

vegetație ierboasă și tufărișuri boreale 2150 – 2400 m altitudine.

Sub limita de 700 m, în amestec cu făgetele, sunt prezente și amestecuri de pin cu gorun.

Pădurile parcului au fost identificate ca făcând parte din următoarele formații vegetale: 15 făgete, 15 molidișuri, 13 amestecuri de fag cu rășinoase și 3 păduri extrazonale (montane și de lunci înalte), majoritatea aparținând clasei de productivitate mijlocii (Doniță, citat de Enescu 1997).

B. Parcul Național Munții Rodnei, cu cele peste 46.000 de hectare cuprinse în suprafață, reprezintă una dintre cele mai mari arii protejate din țară. Mai mult de 3.300 ha sunt declarate ca rezervație a biosferei, iar parcul, pe ansamblul său, adăpostește multe specii endemice din faună și floră, unele adevărate relicte glaciare.

Din punct de vedere teritorial-administrativ, această arie protejată se situează pe teritorii aparținând județelor Maramureș, Bistrița-Năsăud și Suceava, în grupa de nord a Carpaților Orientali, din care Munții Rodnei au cele mari cele mai mari altitudini (Vf. Pietrosul cu peste 2.300 m) și care păstrează foarte bine urmele ghețarilor din cuaternar (circuri glaciare precum Pietrosu, Buhăescu Mare, Negoescu) (fig. 25). Climatul în această zonă prezintă influențe baltice și, datorită marilor altitudini, este destul de aspru, temperatura medie anuală la peste 2.000 m fiind sub limita de îngheț (-1,5oC).

În ceea ce privește vegetația forestieră, în Parcul Național Munții Rodnei se pot delimita câteva formațiuni reprezentative, ținând cont de structura și tectonica munților precum și de evoluția climatică specifică urmărilor glaciațiunilor cuaternare cu platformele de eroziune ce domină relieful actual.

În partea superioară a versanților predomină molidișuri pure iar pe pantele inferioare sunt evidente amestecurile cu fagul, bradul, paltinul de munte, aninul alb și mesteacănul. La limita superioară (cca. 1800 m), destul de frecvent întâlnim jnepenii (Pinus mugo) în asociație cu ienuperii (Juniperus communis var. nana) și mai rar exemplare de zâmbru (Pinus cembra) ca diseminații dar care au atins vârste apreciabile (peste 300 ani) și înălțimi de peste 30 m (Enescu et al.,1997).

Tufărișuri mai mult sau mai puțin compacte de jnepeni și ienuperi au rol extrem de important în menținerea unui echilibru natural relativ stabil în zonă, prin limitarea unor eroziuni excesive ale solului și de atenuare a daunelor provocate de numeroasele avalanșe produse în zonă.

Figura 25. Configurația actuală a Parcului Național Munții Rodnei (după

MMGA,2003)

C. Parcul Național Călimani. Masivul Călimani, cel mai extins masiv vulcanic din România, se situează în partea nord vestică a grupei centrale a Carpaților Orientali și este foarte bine conturat ca individualitate geologică prin frecvența deosebit de mare a rocilor eruptive și prezența craterelor vechilor vulcani.

Parcul Național Călimani, cu cele peste 24.000 ha, ocupă aproape întreaga suprafață a masivului muntos Călimani, acest masiv conferindu-i și forma actuală. (fig. 26). Din punct de vedere teritorial administrativ, această arie protejată se situează pe teritoriul a 4 județe, respectiv Suceava, Harghita, Mureș și Bistrița-Năsăud.

În cadrul zonei, cele mai reprezentative și mai importante tipuri de pădure (arborete naturale) sunt cele de amestec de rășinoase cu fag (cu floră de mull) și de molidișuri (cu Vaccinium myrtilis și Oxalis acetosella).

Figura 26. Configurația actuală a Parcului Național Călimani (după MMGA,2003)

O notă aparte și foarte caracteristică în această arie protejată o reprezintă vegetația lemnoasă de limită de altitudine, la peste 1700 m, constituită din arborete naturale de zâmbru (Pinus cembra) sau din amestecuri de molid, jneapăn și zâmbru . Unele dintre aceste suprafețe conțin ecosisteme forestiere amenințate sau periclitate, cum ar fi complexe de rariști cu zâmbru sau tufărișuri subalpine de jneapăn și tufărișuri de smârdar (Rhododendron kotschyi)(Cenușă, 2005).

D. Parcul Național Ceahlăul reprezintă una dintre cele mai importante ariile protejate ale zonei central-nordice din Carpații Orientali datorită bogăției faunei dar mai ales a vegetației ierboase și lemnoase. Frumusețea inegalabilă a peisajelor din zona înaltă a masivului conferă o notă cu totul aparte acestei zone de o inegalabilă frumusețe și neasemuit pitoresc.

Situat în parte vestică a județului Neamț, la poalele stațiunii Durău la nord, lacul de acumulare Izvorul Muntelui la est și localitatea cu același nume la sud, având zona centrală stabilită ca Parc Național, masivul Ceahlău este format din roci sedimentare, cu gresii și blocuri de calcar în sistem de conglomerate și intercalații (MAPAM, 2003)(fig. 30).

În cadrul ecosistemelor forestiere, predomină tipurile molideto-brădet normal cu floră de mull, molideto-laricet cu Oxalis acetosella, molideto-făget cu floră de mull, brădeto-făget cu floră de mull și amestec normal de rășinoase cu fag.

În ceea ce privește compoziția pe specii lemnoase, molidul deține 45%, fagul 28%, bradul 24%, restul de 3% fiind reprezentat de unele specii de amestec.

Figura 30. Configurația actuală a Parcului Național Ceahlău (după MMGA,2003)

Un loc cu totul aparte în cadrul vegetației lemnoase din Parcul Național Ceahlău îl reprezintă arboretele naturale de larice – Larix decidua var. carpathica, acestea ocupând brânele (polițe) calcaroase însorite de pe versantul sudic al masivului, la circa 1400 m altitudine. Exemplarele de zadă din aceste arborete unicat ating dimensiuni impresionante (peste 30 m înălțime și aproape 1 m în diametru), iar formațiunea (cca. 370 h) s-a constituit în renumitul monument al naturii Polița cu crini, denumirea provenind de la numele local al laricelui.

6.3.1.2. Rezervațiile de semințe

Interesul constant manifestat de către specialiștii din silvicultură în obținerea unor cantități însemnate de semințe ameliorate (capacitate de germinație de peste 60%), necesită luarea unor măsuri de protejare și conservare a arborilor remarcabili, dincolo de vârsta de exploatabilitate economică, până la vârsta de exploatabilitate fiziologică, stadiu apropiat de deperisarea fizică a arborilor. Conservarea acestor arbori deosebit de valoroși se face în cadrul rezervațiilor de semințe – populații superioare a căror conservare în generația următoare se poate face prin regenerare naturală sau chiar prin crearea de plantații conservatoare in situ.

Rezervațiile de semințe sunt arborete pure sau de amestec, preponderent naturale și care, în cadrul aceleași regiuni de proveniență, se deosebesc distinct de celelalte arborete cu aceeași compoziție specifică (Enescu et al, 1997). Lucrările de bază desfășurate în aceste populații sunt cele de igienizare și de curățire, lucrări specifice selecției negative al criteriului valorii relative a arborilor, prin care sunt eliminați arborii mai slab dotați, cei mai buni fiind păstrați și îngrijiți pentru a produce cantități cât mari de semințe de calitate superioară.

Selecția și delimitarea principalelor arborete ca rezervații de semințe la noi în țară s-a efectuat pe baza unui sistem original de cartare seminologică de către specialiști din cadrul ICAS, în perioada 1965-1996. Desfășurarea acestei acțiuni de mare importanță și de o anvergură fără precedent în țara noastră s-a bazat pe respectarea câtorva principii clare, spre exemplu cel privind evitarea de la reproducere a arboretelor slabe ca productivitate și cu semințe de calitate inferioară, acordarea unei priorități absolute proveniențelor locale în inițierea de experimente cu limitarea drastică a transferărilor de material biologic de reproducere și, nu în ultimul rând, prezervarea arboretelor deosebit de valoroase până la limita longevității fiziologice. În urma efectuării acestei acțiuni, la noi în țară au fost delimitate peste 2300 rezervații de semințe care acoperă peste 70.000 ha (peste 32.000 ha rășinoase și peste 37.000 ha foioase) și care includ toate speciile principale forestiere (tabel 4).

Tabelul 4

Rezervațiile de semințe înscrise în catalogul național din 1986

după Enescu, 1986 și adptat

Toate aceste arborete constituie cele mai valoroase fonduri de germoplasmă forestieră de la noi din țară, cu bază ereditară intactă și caracter permanent, cu cel mai mare număr de arbori plus și care sunt excluse de la tăieri. Îndepărtarea exemplarelor de slabă calitate, prin efectuarea de răriri adecvate, conduce la realizarea unei consistențe optime a rezervației (obișnuit 0,7-0.6), consistență care se atinge treptat prin mai multe cicluri de selecție. Aceste populații de arbori reprezintă baza populațiilor de ameliorare, ca arbori seminceri alegându-se exemplarele din categoria arborilor “plus”, exemplare situate întotdeauna în plafonul dominant și considerate drept adevărate „centre de gene” ale speciilor lemnoase (Stănescu, 1984).

6.3.1.3. Interzicerea accesului și a exploatării preferențiale a arborilor valoroși

Aceste măsuri constituie măsuri clasice ce trebuie luate urgent și aplicate imediat, pot avea caracter temporar sau permanent și se aplică în vederea opririi pierderilor genetice, precum și a evitării perturbării unor lucrări extrem de importante cum ar fi, de exemplu, răriturile sau tăierile de regenerare (Lucău, 1998).

Eficacitatea selecției este mult mărită prin aplicarea acestor măsuri și, drept urmare, are loc o reinstalare progresivă a unui patrimoniu genetic valoros, perturbat inițial prin extrageri masive, necontrolate, de arbori valoroși. Tot pe această linie, este recomandabil a se cunoaște, pe cât posibil, limitele eritabilității celor mai importante caractere (calitative și cantitative) și expresia câștigului genetic pe fondul lucrărilor legate de ciclurile de selecție

Mai este de reținut și faptul că, spre deosebire de măsurile menționate anterior, această metodă este mult mai ușor de aplicat, are un caracter imediat, este mult mai puțin costisitoare și contribuie din plin la salvarea integrală a fondului de germoplasmă deținut de rezervația respectivă.

6.3.2 Conservarea “ex situ” a resurselor genetice forestiere

În cadrul acestui concept sunt reunite modalitățile de conservare a fondurilor valoroase de germoplasmă forestieră în afara locului de unde provin, respectiv în afara arealului lor natural. Prin aplicarea acestei metode, de multe ori se încearcă și se reușește reproducerea la o scară redusă a unor populații originale ce conțin o largă variabilitate genetică intraspecifică datorată unei ample panmixii.

În cadrul acestor plantații grupate, producerea controlată de sămânță este relativ ușor de realizat, aceasta facilitând producerea de puieți în masă. Această modalitate s-a dovedit extrem de utilă la unele plantații de molid în afara arealului natural, exemplarele din aceste culturi dovedindu-și din plin valoarea genetică și adaptativă. Tot în categoria de resurse genetice forestiere valoroase conservate ex situ se includ și unele culturi comparative de proveniențe, hibrizi sau clone cu certă semnificație biologică, științifică și practică.

Spre deosebire de conservarea resurselor genetice forestiere in situ, conservarea ex situ preconizează abordarea mult mai multor modalități privind prezervarea celor mai valoroase fonduri de germoplasmă forestieră, pornind de la crearea de arboretum-uri, parcuri dendrologice, colecții de clone sau grădini botanice și terminând cu băncile de gene ce includ colecții de semințe, polen, culturi in vitro și chiar secvențe ADN. Majoritatea acestor activități constituie, în fapt, obiectul a numeroase și complexe programe de ameliorare genetică forestieră, iar faptul că unele se bazează pe durata lungă a vieții arborilor (arboretum-urile sau parcuri dendrologice), aceasta nu face decât să permită și o conservare eficientă a resurselor existente, unele provenind de la populații naturale (așa numitele populații de plecare) cu o foarte largă bază genetică.

6.3.2.1. Arboretum-urile și parcurile dendrologice

Acestea reprezintă plantații grupate care cuprind anumite specii, iar fiecare specie este reprezentată de un număr limitat de indivizi. De regulă, provin dintr-o singură sursă geografică și constituie mijlocul de bază prin care se face selecția unor specii privind capacitatea acestora de a se adapta și de a crește în condiții noi. Este foarte important ca fiecare specie să aibă la bază din cel puțin două proveniențe, cu origine cunoscută și structură ereditară aproape intactă, iar instalarea unei rețele de subarboretum-uri mai mici, perfect adaptate ecologic în nișele respective, ar fi mult mai utilă ca în cazul creării de plantații mari (Bauvarel citat de Enescu, 1997). Aceste subansambluri forestiere, în care o genă rară și valoroasă poate avea o frecvență mai mare decât la specie pe ansamblu, constituie, de fapt, puncte de plecare ale celei mai eficiente metode de selecție în cadrul ameliorării arborilor, respectiv varianta selecției reciproce recurente. Aceasta face posibilă valorificarea efectelor combinațiilor de gene legate de manifestarea diferitelor caractere (creșterea câștigului genetic), precum și gruparea acestor combinații de gene și asociații de caractere într-un genotip (individ) selecționat.

Pe de altă parte, longevitatea vieții exemplarelor din aceste plantații permite și o conservare genetică eficientă a zestrei genetice dobândite și totul ia alura unui proces dinamic, specific ameliorării pe termen lung, dar care, din păcate, necesită și costuri ridicate. Cu toate acestea, arboretum-urile și parcurile dendrologice constituie o formă extrem de eficientă și utilă în cadrul activității de conservare ex situ a fondurilor valoroase de germoplasmă forestieră, iar interesul științific, didactic, cultural și chiar estetic din partea specialiștilor și a publicului larg, în această privință, se manifestă tot mai intens.

6.3.2.2. Culturile comparative de proveniențe și hibrizi

Aceste culturi au un caracter deosebit și o semnificație biologică și științifică multilaterală și se înființează în scopul estimării influenței geografice asupra capacității de creștere, asupra calității lemnului și asupra rezistenței la acțiunea nocivă a factorilor biotici și abiotici. Pe de altă parte, aceste plantații permit testarea diferitelor combinații hibride intra și interspecifice, comparativ cu genitorii.

Pornind de la aceste considerente, cât și pentru faptul că sunt înființate pentru un timp relativ îndelungat, aceste culturi permit conservarea unui material genetic foarte diversificat, creând totodată condiții de conservare și a unor proveniențe rare, pe cale de dispariție sau chiar unicat.

6.3.2.3. Parcurile de clone

Parcurile de clone sunt cultivare ce conțin genotipuri valoroase provenite din material vegetativ, cel mai adesea butași (plop, salcie) sau prin altoire (rășinoase și foioase). În cadrul acestor colecții s-au creat numeroase varietăți multiclonale, de mare productivitate și cu o mare viteză de creștere.

Capacitatea celulei vegetale de a “reconstitui” o nouă plantă, copie fidelă din punct de vedere genetic cu planta mamă (totipotența celulei vegetale) a făcut posibilă includerea în cadrul acestor colecții și a exemplarelor multiplicate in vitro, prin micropropagare intensivă (cireș sălbatic).

Sursa principală de material biologic vegetativ o constituie arborii plus, exemplare din etajul dominant care se deosebesc de vecinii lor prin creșteri excepționale, vigoare deosebită și, nu în ultimul rând, prin fructificație abundentă și semințe cu capacitate de germinație superioară.

În ceea ce privește conservarea genetică, plantajele de clone dețin un fond valoros de germoplasmă prin exemplarele care le alcătuiesc și care sunt copii vegetative, sistemul clonal păstrând intactă zestrea ereditară inițială a populației de origine.

6.3.2.4. Livezile de semințe

Livezile de semințe (plantații de semințe sau plantaje) sunt plantații speciale de arbori (clone sau descendențe selecționate), cât mai bine izolate pentru reducerea la minimum a polenizărilor exogene nedorite, create în scopul producerii frecvente a unor cantități mari de semințe de calitate superioară și ușor de recoltat la vârste cât mai mici.

Exemplarele din aceste culturi sunt de proveniență cunoscută, fiind identificați prin descendența lor sau prin clona de care aparțin. Chiar dacă acești arbori nu ating vârstele exemplarelor din cadrul arboretum-urilor sau parcurilor dendrologice, aceste formațiuni forestiere pot îndeplini și funcția de conservare a unor fonduri valoroase de germoplasmă prin păstrarea unor genotipuri și clone performante și bine adaptate.

6.3.2.5. Băncile de gene

În ultimii 25-30 ani, activitatea de identificare, colectare și conservare a resurselor genetice vegetale, inclusiv a celor forestiere, a cunoscut o tot mai accentuată preocupare. Din ce în ce mai multe state, organisme guvernamentale și nonguvernamentale, instituții și personalități științifice de prestigiu, etc., se implică tot mai activ în această activitate pentru a se evita sau limita pierderile irecuperabile de material genetic extrem de valoros, pierderi catalogate de către biologul J.R. Harlan ca „genetica dezastrului”.

Crearea unei rețele de bănci de gene la nivel mondial, sub coordonarea Institutului Internațional de Resurse Genetice Vegetale (I.P.G.R.I.) și a Comisiei de Resurse Genetice F.A.O., constituie un uriaș succes în ceea ce privește asigurarea unei protecții sigure a surselor de germoplasmă împotriva eroziunii genetice. Aceste instituții, dotate cu echipament modern de conservare și bază completă de date, au fost înființate în scopul prospectării, colectării, evaluării și conservării celor mai valoroase dar și a celor mai amenințate categorii de resurse genetice vegetale. Inaugurarea Băncii de Resurse Genetice Vegetale din Suceava, în anul 1991, se înscrie perfect pe coordonatele imperativului major de salvare și ocrotire a ceea ce a mai rămas valoros din fondul existent de germoplasmă vegetală de la noi din țară, prioritate de top având formele rare sau amenințate cu dispariția (fig. 15).

Metoda cea mai utilizată de conservare a germoplasmei vegetale într-o bancă de gene este cea de prezervare a materialului biologic sub formă de „eșantioane”, mostre de material viu, respectiv probe de semințe cu conținut redus de umiditate (max.6%), stocate la temperaturi scăzute (+4, -20oC).

Conservarea prin culturi de țesuturi

În pofida faptului că încă necesită costuri destul de ridicate, conservarea germoplasmei forestiere, prin culturi in vitro, este o modalitate modernă de conservare, aflată în plină expansiune datorită aplicabilității acesteia la un număr tot mai mare de specii și forme de arbori și arbuști cum ar fi unele varietăți hibride performante dar care se reproduc foarte greu în condiții normale, cele cu înmulțire exclusiv vegetativă sau la specii cu semințe recalcitrante (tropicale și temperate).

La cireșul sălbatic, spre exemplu, datorită aptitudinii sale deosebite de regenerare și micropropagare (minibutășire in vitro), s-au elaborat și sunt în derulare, în Franța, programe interesante de silvicultură clonală (Lucău, 1998).

Trebuie remarcată, în primul rând, eficiența deosebită a acestei metode, concretizată prin faptul că dintr-un singur meristem apical caulinar (material biologic inițial) se pot obține, în mai puțin de 1 an, câteva milioane de copii identice din punct de vedere genetic cu planta mamă donatoare. Pe de altă parte, în lucru este introdus un țesut aproape perfect sănătos (liber de viruși), acest fapt oferind certe garanții asupra calității materialului biologic utilizat și multiplicat prin micropropagare.

În prezent, băncile de gene moderne, pe lângă semințe sau fragmente de plante, conțin și colecții de inoculi cultivați in vitro.

Principiul de bază în crearea și menținerea unei colecții in vitro active este acela că tot materialul biologic (plantule) rezultă dintr-un proces ciclic, ce are la bază multiplicarea culturilor, iar menținerea întregii colecții se face prin operarea de subculturi. Procesele vitale, în acest caz, sunt mult diminuate prin asigurarea unor condiții de creștere lentă (temperaturi pozitive scăzute, iluminat cu intensitate redusă, reducerea la jumătate a concentrației componentei minerale în mediul de conservare și adaos de inhibitori osmotici și de creștere). Tot materialul obținut și conservat este testat și controlat periodic.

Conservarea in vitro, prin menținerea plantulelor în condiții de creștere lentă și operarea de subculturi la intervale cât mai lungi de timp, constituie o tehnică aplicată pe scară largă și la unele specii de arbori și arbuști.

Stocarea surselor valoroase de germoplasmă prin imersarea materialului biologic (semințe, vârfuri de creștere) în azot lichid, la –196oC, are ca rezultat stoparea completă a creșterii culturilor și conservarea acestora pe perioade lungi și foarte lungi de timp (zeci și peste 100 ani) sau chiar pe termen nelimitat.

Conservarea germoplasmei forestiere prin obținerea de embrioni somatici (proces analog embriogenezei zigotice) are la bază procesul de inducere și diferențiere a unei singure celule sau a unui grup restrâns de celule vegetative (axe hipocotile, cotiledoane, părți ale inflorescenței, țesuturi tinere din punctele de creștere) și formarea așa numitelor semințe artificiale. Astăzi este cunoscut faptul că regenerarea prin embriogeneză somatică s-a putut realiza la peste 50 de specii lemnoase, din care 20 angiosperme (ex. la stejar) și cel puțin 30 de gimnosperme (specii ale genurilor Picea, Abies, Pinus, Larix, Pseudotsuga și Sequoia).

Succesul acestei inițiative în silvicultură, în ciuda costurilor ridicate, este garantat în cazul utilizării acestor metode la unele varietăți hibride cu genotip greu de reprodus prin metode clasice, deosebit de performante și foarte greu de obținut pe cale naturală. Aceste genotipuri, de multe ori, se dovedesc extrem de rezistente la factorii nocivi biotici și abiotici sau prezintă o toleranță crescută la produșii chimici acumulați în sol.

Pe de altă parte, la anumite conifere (pin, molid, larice) embriogeneza somatică constituie mijlocul de bază de răspândire în masă a materialului performant rezultat din diferite programe de ameliorare genetică forestieră.

Conservarea polenului pe o durată limitată de timp (câteva săptămâni) nu implică luarea unor măsuri speciale de păstrare, ci important este ca să se asigure păstrarea integrității structurii membranare, formațiuni care adăpostesc majoritatea sistemelor enzimatice cu rol important în declanșarea și evoluția ulterioară a procesului germinativ.

Păstrarea fondurilor de germoplasmă vegetală (inclusiv cea forestieră) prin stocarea ADN sau a secvențelor de ADN (gene responsabile ale manifestării unor caractere extrem de utile în procesul de ameliorare), constituie modalitatea cea mai modernă și, totodată, cea mai performantă în cadrul activității de conservare a resurselor genetice vegetale. Progresul rapid și spectaculos înregistrat în ultimii ani, pe linia perfecționării și utilizării unor tehnici tot mai performante și sofisticate ale biotehnologiei vegetale, este o realitate evidentă în prezent, dar cu un imens potențial pentru viitor.

Tehnicile de secvenționalizare a ADN (principalul deținător al informației genetice), bazate pe funcționarea unor analizoare de mare finețe și extrem de performante precum marquerii genetici ADN (“amprente” genetice) utilizați în cuantificarea variabilității intra și interpopulaționale pentru conservare, reprezintă unele dintre cele mai importante tehnologii specifice celor mai moderne bănci de gene.

Caracterizarea la nivel subcelular (molecular) reprezintă o alternativă ultramodernă la evaluarea morfologică și a caracterelor cantitative, suscitând un interes deosebit al specialiștilor prin faptul că acești indici, pe lângă relevanța și precizia privind exprimarea și interpretarea rezultatelor investigării, sunt foarte puțin influențați de factorii de mediu sau de stadiul de dezvoltare al indivizilor.

Strauss, Bousquet et all. (1992) au stabilit 2 categorii importante de marcheri moleculari: marcheri biochimici, reprezentați de produșii direcți ai activității genelor cum sunt izoenzimele, terpenele ș.a. și marcheri genetici moleculari ca derivați proprii din analiza secvențelor polimorfice de ADN.

Marcherii biochimici

Izoenzimele, definind la modul general, reprezintă acele enzime care diferă ca structură dar catalizează aceeași reacție metabolică. Aceste deosebiri de structură în cazul izoenzimelor sunt rezultatul unui polimorfism alelic. Existența a cel puțin două alele la nivelul locusului specific unei aloenzime, situație întâlnită la indivizii heterozigoți, creează premizele apariției mai multor tipuri de lanțuri polipeptidice, identice însă din punct de vedere funcțional. În acest caz, aloenzimele reprezintă marcheri codominanți.

Tehnica electroforetică în cercetarea forestieră a început să fie aplicată, pe scară largă, la sfârșitul anilor ’70, în Germania (Gőtingen), Suedia și Statele Unite ale Americii.

Apariția mutațiilor la nivelul cromozomilor complică situația în sensul că, în cadrul sistemelor enzimatice, apar benzi duble, triple și în cazul homozigoților, rezultând așa numitele enzime hibride interloci. Prin această tehnică nu se pot evidenția genele nule sau cele „silențioase” din genomul multor specii forestiere, fapt ce denaturează calculul statistic privind frecvența genică și proporția exactă a heterozigoților într-o populație de arbori.

Cu toate acestea, metoda electroforetică privind studiul izoenzimelor prezintă o deosebită importanță pentru genetica populațională, pentru analiza structurii genotipice dar și pentru evaluarea gradului de heterozigoție existent intr-o populație naturală de arbori. De asemenea, se poate face o estimare a ratei autofecundării și, implicit, a fluxului de gene în cadrul unei populații forestiere artificiale.

Terpenele. Studii privind compoziția rășinii la conifere în monoterpene (α și β-pinenul, mircenul, β-felandrenul,etc.), produși cu determinism monogenic și caracter dominant, s-au efectuat în special pe specii ale genului Pinus, în Franța și în Statele Unite ale Americii. Pe baza studiilor privind concentrația de monoterpene în scoarța de Pinus elliotti, s-a putut face o diferențiere a proveniențelor pe axa nord-sud (clinal) și s-a elucidat modalitatea de răspândire postglaciară a speciei Pinus caribaea var. bahamensis în Florida și introgresiunea genetică parțială cu Pinus elliotti.

Efectuarea unor astfel de analize pe diferite ecotipuri naturale de Pinus pinaster a făcut posibilă reconstituirea principalelor căi de recolonizare postglaciară a acestei specii în sudestul Europei. Tot pe baza studiului monoterpenelor, s-a putut estima gradul de contaminare alopolenică în unele livezi de semințe și, de aici, posibilitatea evaluării consecințelor acestui fenomen asupra câștigului genetic.

Marcheri genetici moleculari

După 1990, la concurență cu analizele electroforetice ale marcherilor biochimici, s-au dezvoltat impetuos tehnicile de utilizare a marcherilor genetici moleculari ce pătrund în intimitatea structurii macromoleculei de ADN, secvențele fiind legate de un locus anume al materialului genetic (locus marcher).

Reacția de polimerizare în lanț (PCR – Polymerase Chain Reaction) reprezintă tehnica de multiplicare enzimatică in vitro a unei secvențe din macromolecula de ADN alcătuită din câteva perechi de nucleotide (oligonucleotide specifice – primeri – cu max. 20 de perechi de baze azotate). Enzima specifică acestei reacții este ADN-polimeraza, enzimă termostabilă (+95oC) și denumită Taq polimerază.

Reacția implică parcurgerea câtorva etape importante: denaturarea ADN-ului, fixarea inițiatorului (de la nivelul enzimei) și elongația catenelor. Cele 2 fragmente sunt apoi replicate de foarte multe ori (milioane de copii), pe parcursul mai multor cicluri, fiecare de câte 20-50 de ori. De fiecare dată se dublează numărul copiilor de fragmente, analiza acestora urmând să fie făcută electroforetic.

Această metodă (reacție) stă la baza tuturor celorlalte tehnici mai performante privind marcherii genetici moleculari.

Polimorfismul lungimii lanțurilor de restricție (RFLPs – Restriction Fragment Length Polymorphism) este o tehnică extrem de performantă și de vârf în genetica moleculară, bazată pe hidroliza (digestia) ADN cu ajutorul unei enzime specifice acestei reacții (endonuclează de restricție). Polimorfismul este relevat după o „hibridare” a fragmentului de ADN, deja separat electroforetic, cu o „sondă” marcată cu izotopi radioactivi și transferarea ulterioară pe membrană (tehnica Southern).

Endonucleaza de restricție taie fragmentul din macromolecula ADN până la o secvență de bază de recunoaștere (4-8 perechi de baze azotate). Sunt deja identificate câteva sute de endonucleaze, fiecare cu specificitate proprie legată de recunoașterea secvenței de bază. Numărul și lungimea fragmentelor rezultate depind de numărul și distribuția siturilor de recunoaștere.

Comparativ cu izoenzimele, marcherii RFLP sunt cu mult mai numeroși și, prin aceasta, metoda deschide o arie de investigație mult mai largă în ceea ce privește analiza variabilității genetice în cadrul populațiilor naturale, chiar dacă această tehnică este mai laborioasă și mai costisitoare.

Amplificarea nedirijată de ADN polimorfic (RAPD – Random Amplified

Polymorphic DNA) este o tehnică ce implică utilizarea unui inițiator (primer – oligonucleotid scurt ce include maximum 10 perechi de baze) ce poate începe amplificarea ca și în cazul tehnicii PCR. Amplificarea fragmentelor se face la întâmplare în cadrul unui genom, în urma procesului rezultând cel puțin 10 astfel de fragmente de inițiere (așa-numitele amprente), după care are loc separarea electroforetică pe gel de agaroză sau poliacrilamidă. În final, secvențele rezultate în urma amplificării sunt colorate cu bromură de etidium și pot fi analizate în câmp de radiații UV.

Pe baza acestei tehnici se poate estima gradul de polimorfism existent într-o populație, analiza populației și chiar identificarea indivizilor.

Ca și în cazul RFLP, marcherii RAPD sunt marcheri dominanți și, în principiu, pot rezulta în număr nelimitat. În acest caz, însă, avantajul constă în faptul că nu se utilizează izotopi radioactivi și nu sunt necesari inițiatori (primeri) pentru fiecare specie. Din aceste motive, metoda utilizării marcherilor RADP este mai simplă, mai rapidă și mai puțin costisitoare ca cea a marcherilor RFLP.

Ca dezavantaj menționăm că această tehnică permite numai detectarea genelor dominante, nepermițând determinarea structurii genotipice a unei populații, pe ansamblu (AA, Aa, aa), mai ales în ceea ce privește proporția heterozigoților.

Microsateliții sunt secvențe ale macromoleculei de ADN rezultați în urma repetiției în tandem a unei secvențe simple din întregul genom. Sunt formați doar din două nucleotide, sunt foarte comuni și, totodată, polimorfici. Segmentul care încorporează microsatelitul poate fi replicat, iar lungimea acestuia se va determina electroforetic.

Microsateliții sunt microformațiuni de natură multialelică și codominantă, sunt foarte numeroși și bine repartizați în genom și au un înalt grad de polimorfism. Analiza lor poate fi ușor automatizabilă, nefiind necesară o mare cantitate de material și nici prezența de izotopi radioactivi. Ca dezavantaj ar fi doar faptul că la separarea electroforetică este necesară utilizarea unui gel cu un grad mare de rezoluție (din cauza separării unor fragmente foarte mici), ceea ce implică o mai mare atenție în pregătirea substratului și un cost mai ridicat al operațiunii.

Trebuie remarcat faptul că, prin analiza microsateliților, s-au putut descifra genomurile și stabili majoritatea hărților genetice, aceste microformațiuni constituind marcherii predilecți ai geneticii animale și umane. De asemenea, pe baza analizelor microsateliților, s-a putut efectua studiul complet al introgresiunii genetice între 2 specii forestiere foarte importante, respectiv stejarul și gorunul.

Principalele domenii de utilizare a marcherilor moleculari în ameliorare și conservare genetică sunt:

a) Cuantificarea diversității genetice

Utilizarea marcherilor biochimici și moleculari (izoenzime, produși de metabolism sau marcheri ADN) pentru determinarea gradului de variabilitate genetică în interiorul unei populații sau între populațiile de arbori constituie astăzi, în multe țări, o prioritate în activitățile complexe de evaluare și conservare a resurselor genetice forestiere. De menționat, totuși, că rezultatele acestor studii bazate pe utilizarea de marcheri genetici moleculari trebuie luate în calcul și interpretate cu prudență deoarece, nu de puține ori, s-a constatat un nivel scăzut privind corelația cu variabilitatea unor caractere legate de adaptabilitate, trăsături foarte importante în practica forestieră.

b) Verificarea genotipurilor

Marcherii moleculari sunt foarte mult utilizați în identificarea genotipurilor, în diferite studii taxonomice și biologice (care includ și tehnica „amprentelor” genetice). Este cert faptul că derularea cu succes a diferitelor programe de ameliorare și conservare forestieră presupune existența unei taxonomii clare. De asemenea, prin utilizarea marcherilor biochimici (studiul terpenelor), s-au înregistrat progrese remarcabile în ceea ce privește studiul de dispersie a semințelor sau de împrăștiere a polenului, aceasta pentru dezvoltarea și perfecționarea metodelor de polenizare dirijată (controlată).

Rezultatele diferitelor studii ce utilizează marcheri moleculari au o deosebită însemnătate practică în ceea ce privește reușita unor programe de ameliorare, cu precădere în practica amenajării și gestionării diferitelor populații de arbori sau livezi de semințe (constituite din clone sau răsaduri provenite de la arbori valoroși selecționați), cultivate pentru producții rapide și abundente de semințe de calitate superioară pentru reîmpăduriri. c) Hărți genetice și selecția asistată de marcheri moleculari

Hărțile genetice de linkage se pot folosi pentru a localiza gene răspunzătoare de manifestarea unor caractere cantitative (QTL) cu un deosebit impact economic, precum producția de masă lemnoasă sau cantitatea de pastă. Detectarea QTL din genomul diferitelor specii forestiere presupune constituirea unor hărți genetice bazate pe consegregarea marcherilor (zone identificate prin marcare moleculară ADN) în încrucișări controlate (în generația a doua prin retroîncrucișare).

Studiul de perspectivă al selecției asistate de marcheri moleculari la speciile forestiere presupune, în principal, construirea unei rețele de marcheri polimorfici, repartizați relativ uniform în cromozomi, care să se constituie în hărți genetice.