Contribuții la studiul unor complecși cu argint ai fluorochinolonelor și la dezvoltarea unor metode de electroforeză capilară pentru substanțe de… [303077]

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE TÎRGU MUREȘ

ȘCOALA DE STUDII DOCTORALE

TÎRGU MUREȘ 2017

TEZĂ DE ABILITARE

Contribuții la studiul unor complecși cu argint ai fluorochinolonelor și la dezvoltarea unor metode de electroforeză capilară pentru substanțe de interes farmaceutic

Aura Rusu

Dedicație

Familiei mele

LISTA DE PUBLICAȚII REPREZENTATIVE

Rusu A, Hancu G, [anonimizat] V. Development perspectives of silver complexes with antibacterial quinolones: Successful or not?. JOURNAL OF ORGANOMETALLIC CHEMISTRY 2017; 839: 19-30. FI: 2,184

Rusu A, Hancu G, Tóth G, Toma F, [anonimizat] A, [anonimizat] V. Synthesis, characterization and microbiological activity evaluation of two silver complexes with norfloxacin. FARMACIA 2016; 64: 922-932. FI: 1,348

Rusu A, Hancu G, Tóth G, Vancea S, Toma F, [anonimizat] A, [anonimizat] V. New silver complexes with levofloxacin: Synthesis, characterization and microbiological studies. JOURNAL OF MOLECULAR STRUCTURE 2016; 1123: 384–393. FI: 1,753

Rusu A, Hancu G, Uivaroși V. [anonimizat], and bacterial resistance. ENVIRONMENTAL CHEMISTRY LETTERS 2015; 13: 21-36. FI: 2,918

Rusu A, Hancu G, Völgyi G, Tóth G, Noszál B, Gyéresi A. Separation and Determination of Quinolone Antibacterials by Capillary Electrophoresis. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHIC SCIENCE 2014, 52: 919-925. FI: 1,36

Hancu G, Cârcu-Dobrin M, Budău M, Rusu A. Analytical methodologies for the stereoselective determination of fluoxetine: an overview. BIOMEDICAL CHROMATOGRAPHY 2017; Jul 3. doi: 10.1002/bmc.4040. [Epub ahead of print]. FI: 1,613

Hancu G, [anonimizat] A. Chiral Separation of the Enantiomers of Omeprazole and Pantoprazole by Capillary Electrophoresis. CHROMATOGRAPHIA 2015; 78: 279-284. FI 1,332

Cârcu-Dobrin M, Budău M, Hancu G, Gagyi L, Rusu A, Kelemen H. Enantioselective analysis of fluoxetine in pharmaceutical formulations by capillary zone electrophoresis. SAUDI PHARMACEUTICAL JOURNAL 2017; 25: 397–403. FI: 2,302

Rusu A, Sbanca M-A, Todoran N, Vari C-E. Letrozole Determination by Capillary Zone Electrophoresis and UV Spectrophotometry Methods. ACTA MEDICA MARISIENSIS 2016; 62: 95-101. CNCIS B+

Rusu A, Popescu G-C, Imre S, Ion V, Vancea S, Grama A-L, Kelemen H, Hancu G. A [anonimizat], ACTA MEDICA MARISIENSIS, 2016; 62: 192-198, CNCIS B+

CUPRINS

ABREVIERI

REZUMAT

Teza de abilitare cu titlul “Contribuții la studiul unor complecși cu argint ai fluorochinolonelor și la dezvoltarea unor metode de electroforeză capilară pentru substanțe de interes farmaceutic”, reprezintă o sinteză a activității de cercetare după finalizarea studiilor doctorale (2013 – 2017). Cele mai importante direcții de cercetare abordate în această lucrare au fost o continuare firească a [anonimizat] a tezei de doctorat cu titlul “[anonimizat] a derivaților de chinolonă prin metode de analiză optimizate”, susținută în decembrie 2012. Lucrarea este structurată în mai multe părți distincte prezentate succint în continuare.

În capitolul dedicat realizărilor științifice sunt structurate și descrise sintetic direcțiile de cercetare abordate: obținerea de noi compuși cu proprietăți biologice și cu potențial terapeutic; dezvoltarea și optimizarea de noi metode de electroforeză capilară cu aplicabilitate în domeniul farmaceutic.

În prima parte a tezei de abilitare sunt cuprinse studii originale cu obiectivul principal de obținere și caracterizare a unor complecși ai argintului cu liganzi din clasa fluorochinolonelor antibacteriene. Procesul de coordinare al unui ion metalic cu un ligand organic (compus cu activitate farmacologică) poate conduce la obținerea de compuși, de cele mai multe ori, cu efecte biologice superioare liganzilor. Liganzii selectați din clasa fluorochinolonelor au fost norfloxacina, ofloxacina și levofloxacina iar argintul a fost ionul selectat pentru obținerea de combinații complexe cu potențial biologic. În urma studiilor efectuate au fost obținute mai multe combinații complexe ale argintului cu cei trei liganzi selectați. Pe lângă activitatea antibacteriană pe diverse specii de bacterii, a mai fost testată și activitatea antifungică.

Cercetările efectuate au fost susținute de fondurile unui proiectul individual câștigat prin competiție, de tip grant intern, în anul 2014. Rezultatele au fost publicate in extenso în trei reviste cotate ISI și o revistă indexată în baze de date internaționale BDI și de asemenea, prezentate la manifestări științifice naționale și internaționale.

Cea de a doua direcție de cercetare s-a conturat încă din timpul studiilor doctorale fiind o continuare firească a experienței deja acumulate. Astfel, am participat în calitate de prim autor/autor principal sau coautor la o serie de studii care au urmărit dezvoltarea de tehnici d electroforeză capilară și testarea aplicabilității lor în industria farmaceutică dar și dezvoltarea de abilități practice personale. Aceste studii sunt împărțite pe două planuri de cercetare: dezvoltarea și optimizarea de metode în scopul enantioseparării compușilor optic activ importanți din terapie și dezvoltarea, optimizarea și validarea de metode cu aplicabilitate în industria farmaceutică.

Un aspect de actualitate este faptul că industria farmaceutică produce medicamente care pot avea în conținut susbtanțe active cu particularități stereochimice, fiind comercializate ca amestecuri racemice sau ca enantiomeri puri, care pot avea efecte farmacologice diferite. Tendințele actuale la nivel internațional susținute de entitățile de reglementare sunt de a se utiliza în terapie doar enantiomerul pur avantajos terapeutic. O alternativă rentabilă economic pentru determinarea enantioselectivă a substanțelor optic active este metoda electroforezei capilare, în care prin utilizarea de selectori chirali, se pot separa enantiomerii moleculei optic active.

În lucrarea de față, compușii analizați din punct de vedere stereochimic și enantioseparați cu ajutorul tehnicii electroforezei capilare sunt din mai multe clase de medicamente, importante terapeutic: inhibitori de pompă de protoni, betablocante, antidepresive, antihistaminice H1, diuretice, blocanți ai canalelor de calciu și analgezice opioide.

În cel de al doilea plan al acestui domeniu de cercetare s-a situat dezvoltarea, optimizarea și validarea unor metode ale electroforezei capilare destinate mai multor tipuri de compuși importanți utilizați în terapie. Printre acești compuși se numără inhibitori de aromatază, antibiotice din clasa cefalosporinelor, compuși din clasa antituberculoaselor, statine, antihistaminice H1.

Rezultatele cercetării postdoctorat sunt evidențiate prin proiecte de cercetare (1 proiect – director, 3 proiecte – membru), o serie de publicații – 30 de articole in extenso (17 articole vizibile în fluxul ISI WOS, 13 articole în baze de date internaționale, BDI) și premii obținute; factorul de impact cumulat este 26,947, cu 65 de citări și indicele Hirsch 5.

Planul de evoluție și de dezvoltare a carierei, prezentat în cadrul tezei de abilitare, are mai multe direcții, respectiv activitatea didactică, creșterea competențelor didactice și de dezvoltare personală și activitatea de cercetare științifică.

Obiectivele de dezvoltare în ceea ce privește activitatea științifică presupun continuarea proiectelor de cercetare și valorificare rezultatelor, dar și abordarea unor teme de cercetare noi:

– continuarea studiilor care au ca temă sinteza și studiul proprietăților biologice ale complecșilor metalici ai fluorochinolonelor și ale altor clase de compuși cu proprietăți chelatoare; testarea a mai multor tipuri de metale, liganzi și efecte biologice;

– dezvoltarea de noi metode de analiză sensibile; dezvoltarea și validarea de noi metode de analiză a substanțelor farmaceutice optic active ca urmare a adaptării industriei farmaceutice la proprietățile stereochimice ale medicamentelor;

– aprofundarea proprietăților fizico-chimice ale compușilor de interes farmaceutic și interacțiunea lor cu receptorii farmaceutici prin inițiere în modelare moleculară și design computational.

Activități conexe direcțiilor de cercetare sunt: publicarea de articole în zona galbenă și roșie de premiere UEFISCDI, diseminarea rezultatelor științifice la manifestări științifice naționale și internaționale, depunerea și câștigarea unor granturi/proiecte, participarea la proiecte interdisciplinare și interuniversitare, colaborarea cu agenți economici, studiul unor noi tehnici analitice conexe domeniului de cercetare sau specializarea în tehnicile deja cunoscute de analiză.

Alte deziderate ale activității profesionale sunt: căutarea și dezvoltarea continuă a unor noi direcții de cercetare corelate cu selectarea unor teme de actualitate, îndrumarea studenților spre cercetare, participarea la manifestările științifice, orientarea către alte forme de studiu postuniversitare (master, doctorat) și încurajarea în accesarea de burse de studiu; obținerea calității de membru în colectivele redacționale ale revistelor de specialitate.

Aceste obiective sunt permanente și concură la dezvoltarea personală în plan academic și consecutiv la creșterea calității în actul educațional care va conduce la formare de absolvenți valoroși și profesioniști în domeniul farmaceutic.

REALIZĂRI ȘTIINȚIFICE, PROFESIONALE ȘI ACADEMICE

Pagină liberă

Direcții de cercetare

Teza de abilitare cuprinde două mari direcții de cercetare:

Obținerea de noi compuși cu proprietăți biologice și cu potențial terapeutic

În această direcție de cercetare sunt cuprinse studii de cercetare originale care au avut drept scop obținerea și caracterizarea unor complecși ai argintului cu reprezentanți ai clasei fluorochinolonelor antibacteriene: norfloxacina, ofloxacina și levofloxacina.

Dezvoltarea și optimizarea de noi metode ale electroforezei capilare cu aplicabilitate în domeniul medicamentului

În această direcție de cercetare sunt cuprinse două tipuri de studii de cercetare originale.

Primul tip de studii are ca temă centrală dezvoltarea de noi metode de electroforeză capilară, adecvate separărilor chirale pentru compuși farmaceutici optic activi. Printre aceștia se numără importanți reprezentanți din clasa betablocantelor, antidepresivelor, inhibitorilor de pompă de protoni, antihistaminicelor H1, diuretice, blocanți ai canalelor de calciu și analgezice opioide. Aplicabilitatea unor ciclodextrine ca selectori chirali este verificată și evaluată.

Cel de al doilea tip de studii include dezvoltarea de noi metode de analiză ale electroforezei capilare destinate materiilor prime și produselor farmaceutice din laboratoare de cercetare și industria farmaceutică, dar și probelor biologice din studiile clinice. Printre compușii selectați în aceste studii se numără inhibitori de aromatază, antibiotice din clasa cefalosporinelor, reprezentanți ai antituberculoaselor, statine și antihistaminice H1.

Studiul unor combinații ale argintului cu liganzi din clasa fluorochinolonelor antibacteriene

Introducere – contextul cercetărilor

Chinolonele antibacteriene

Chinolonele antibacteriene sunt o clasă de compuși sintetici, cu o structură chimică de bază 4-oxo-1,4-dihidrochinolonică, care sunt larg utilizați în tratamentul infecțiilor atât în medicina umană cât și cea veterinară.

Clasificarea acestor compuși după structura chimică a nucleului de bază cuprinde mai multe grupe chimice: derivați de naftiridină (acidul nalidixic, gemifloxacina), derivați de cinolină (cinoxacina), derivați de pirido-pirimidină (acidul piromidic, acidul pipemidic), derivați de chinolină (norfloxacina, ciprofloxacina, enrofloxacina, moxifloxacina) care sunt și cei mai numeroși, dar și compuși cu structuri diverse (flumechina, ofloxacina, marbofloxacina, nadifloxacina).

După cum se observă, denumirea generică de “chinolone” antibacteriene care este utilizată în literatura de specialitate este în contradicție cu unele grupe chimice și denumirea exactă a compușilor. Denumirea de “fluorochinolone” a început să fie utilizată după introducerea unui atom de fluor în structura chimică (poziția 6, Figura 2.1), modificare care a crescut semnificativ potențialul terapeutic al acestor compuși [1,2]. Clasificarea după numărul de atomi de fluor din structură cuprinde: monofluorochinolone (norfloxacina, ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, moxifloxacina), difluorochinolone (difloxacina, lomefloxacina, sarafloxacina, sparfloxacina) și chiar trifluorochinolone (fleroxacina, temafloxacina, trovafloxacina) [1].

Mecanismul de acțiune al fluorochinolonelor antibacteriene constă în inhibarea sintezei ADN-ului microbian acționând asupra enzimelor ADN giraza (topoizomeraza II) și topoizomeraza IV [3,4]. În cazul bacteriilor Gram negative principala țintă a fluorochinolonelor antibacteriene este considerată ADN giraza iar în cazul bacteriilor Gram pozitive principala țintă este considerată topoizomeraza IV. Totuși, studii mai recente au demonstrat faptul că există bacterii Gram pozitive în care ținta primară a fluorochinolonelor este AND giraza sau în aceeași măsură, ambele enzime [5].

Cea mai cunoscută și utilizată clasificare a chinolonelor antibacteriene este clasificarea în generații după spectrul de activitate și indicațiile terapeutice (Tabelul 2.1). În ceea ce privește spectrul de activitate, prin trecerea succesivă de la o generație la alta, acesta se extinde, compușii din noile generații fiind considerați compuși cu spectru larg de activitate [1]. Față de alte clase de antibiotice, fluorochinolonele antibacteriene au avut avantajul că instalarea rezistenței bacteriene s-a produs mult mai lent și a fost mai puțin comună [3,6].

Tabelul 2.1. Clasificarea în generații a chinolonelor antibacteriene [1,3,6].

Totuși, în ultima decadă a fost raportată instalarea rezistenței bacteriene chiar și în cazul celor mai noi compuși (ex. moxifloxacina din generația a 4-a) [4,7].

Deoarece dezvoltarea rezistenței bacteriene la majoritatea antibioticelor existente în terapie este o problemă globală de mare actualitate [8] iar sinteza de compuși noi, respectiv clase noi de antibiotice, are în ultimii ani un trend descrescător [9], găsirea de noi compuși cu activitate antibacteriană a devenit o prioritate în acest domeniu de cercetare [10,11].

Complecși metalici ai fluorochinolonelor antibacteriene

Prin introducerea unui atom de fluor și a unui substituent piperazinic pe structura chimică de bază 4-oxo-1,4-dihidrochinolonică a compușilor din clasa chinolonelor antibacteriene, a avut loc un salt important calitativ în ceea ce privește activitatea antibacteriană, prin lărgirea spectrului de activitate (inclusiv pe Pseudomonas aeruginosa și coci Gram pozitivi) și optimizarea parametrilor farmacocinetici [1].

Structura chimică a compușilor fluorochinolonici antibacterieni conferă prin grupările 3-carboxil și 4-oxo proprietăți excelente de chelatare a ionilor metalici (Figura 2.1) [1].

Figura 2.1. Principalele grupări din structura fluorochinolonelor (3-carboxil și 4-oxo) implicate în complexarea ionilor metalici [1].

Prin procesul de coordinare cu un ligand organic, compus cu activitate farmacologică, compusul rezultat are de cele mai multe ori un efect biologic mai mare decât ligandul, cel mai probabil având loc o sinergie între cele două componente. În cazul unor complecși metalici ai fluorochinolonelor au fost demonstrate deja efecte antibacteriene, antifungice, antiparazitare, antivirale, anticanceroase, antiinflamatoare și chiar insulino-mimetice [2,12,13].

Studiile publicate până în prezent cu privire la complexarea ionilor metalici cu fluorochinolone au avut în vedere numeroase elemente chimice din tabelul periodic (Tabelul 2.2) fapt ce demonstrează interesul științific pentru acest tip de compuși [1].

În postura de liganzi se regăsesc numeroși compuși: acidul nalidixic. acidul pipemidic, acidul oxolinic, cinoxacina, flumechina (prima generație); ciprofloxacina, enoxacina, enrofloxacina, lomfloxacina, norfloxacina, ofloxacina, pefloxacina (a doua generație); levofloxacina, sparfloxacina (a treia generație); moxifloxacina, gatifloxacina (a patra generație) [2,12,13].

Tabelul 2.2. Ioni metalici utilizați la obținerea complecșilor metalici ai chinolonelor antibacteriene în studiile publicate în literatura de specialitate [1,2].

Proprietățile argintului și utilizările sale în terapie

În momentul de față sunt cunoscute proprietățile antibacteriene, antiseptice, antiinflamatorii și citotoxice ale ionului de argint. Un compus clasic cu conținut de argint, dezvoltat în anii ´60, utilizat în tratamentul arsurilor, este sulfadiazina argentică. O consecință a succesului acestui compus a fost impregnarea cu argint a numeroase produse utilizate în protecția rănilor (pansamente, tifon, filme etc.) cât și introducerea argintului în produse utilizate în chirurgie (catetere) [14-18].

Alți compuși cu argint utilizați în scop medical sunt argintul coloidal și zeolitul de argint; în studiu se află compuși de tip nanoparticule cu argint combinate cu diverse antibiotice dar și nanocompozite care includ atât argint cât și antibiotice [13].

Complecși cu argint ai fluorochinolonelor

Obținerea unor combinații complexe dintre ionii de argint și derivați din clasa chinolonelor antibacteriene are la bază premiza însumării efectelor biologice ale celor două componente. Ca liganzi au fost utilizați compuși chinolonici antibacterieni din primele generații cât și din generații mai noi: acidul nalidixic, acidul pipemidic (prima generație); ciprofloxacina, enoxacina, enrofloxacina, norfloxacina, pefloxacina (a doua generație); levofloxacina, sparfloxacina (a treia generație); moxifloxacina (a patra generație) [2,12,13].

Studiile complecșilor cu argint ai fluorochinolonelor antibacteriene cuprind, pe lângă metodele de obținere, o serie de metode de analiză care caracterizează structural complecșii obținuți (Tabelul 2.3). Analiza elementală (C,H,N) este utilizată pentru a elucida formula moleculară a complecșilor obținuți. Metodele spectroscopice sunt cele mai utilizate deoarece oferă informații despre structura chimică și modul de complexare între ionul metalic și chinolona antibacteriană. Un set de metode de analiză utilizate în acest scop cuprinde spectroscopia de absorbție atomică – atomic absorbtion spectroscopy (AAS), spectrometria de emisie cuplată cu plasmă inductiv – inductively coupled plasma (ICP) pentru determinarea conținutului de argint, spectroscopia de IR cu transformată Fourier (FT-IR), spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară 1H RMN și 13C RMN combinate cu spectrometria de masă (MS), spectroscopia electronică și spectrofluorimetria, care oferă date structurale despre complecșii obținuți.

Cea mai apreciată metodă de analiză este difracția cu raze X – single-crystal X-ray diffraction (XRD), pentru a determina aranjamentul tridimensional al atomilor în cristalele solide și distanțele interatomice. Totuși, un dezavantaj al acestei metode este faptul că nu este foarte accesibilă pentru cercetători.

Metodele de analiză termice completează caracterizarea complecșilor metalici cu proprietățile termofizice ale acestora.

Teoria funcționalei de densitate – density functional theory (DFT), o metodă a cărei utilizare este în creștere, este potrivită pentru predicția proprietăților moleculelor: structura moleculară, frecvențele vibraționale, energiile de atomizare, energiile de ionizare, proprietățile electrice și magnetice, căile de reacție etc.

Măsurarea conductivității oferă date despre natura electrolitică sau non-electrolitică a complecșilor.

Tabelul 2.3. Metode de analiză adecvate studiului complecșilor argintului cu derivați ai chinolonelor antibacteriene.

Complecșii cu argint au fost raportați a avea un mod particular de coordinare a chinolonei la formarea complexului metalic, spre deosebire de alți complecși metalici ai chinolonelor antibacteriene, respectiv ca ligand monodentat prin atomul N4ʹ-piperazinic (Figura 2.2).

Figura 2.2. Modul particular de coordinare al argintului în complecșii cu chinolone antibacteriene: a) punte cu un ion de argint; b) punte cu doi ioni de argint (R – nucleul central al derivaților chinolonici antibacterieni) [13]

A fost testată activitatea microbiologică (efectele antibacterian și antifungic) pentru majoritatea complecșilor cu argint ai chinolonelor antibacterine, unii dintre aceștia prezentând o activitate superioară liganzilor pe anumite specii de bacterii, respectiv fungi [13]. De asemenea, o nouă direcție de cercetare a fost testarea efectului citotoxic al acestor complecși, dar care, până în prezent ,nu a avut rezultate relevante in vitro [27].

Deși așteptările sunt mari în ceea ce privește obținerea unei activități antibacteriene sau antifungice crescute sau descoperirea de noi efecte biologice, până în momentul de față nici un complex al argintului cu derivați chinolonici antibacterieni nu este autorizat sau în curs de autorizare.

Studiul unor combinații ale argintului cu liganzi din clasa fluorochinolonelor antibacteriene

Obiective generale

Studiul prezintă mai multe obiective:

Sinteza complecșilor argintului cu derivați ai fluorochinolonelor;

Elaborarea unor metode adecvate și accesibile de sinteză a complecșilor argintului cu derivați ai fluorochinolonelor;

Optimizarea metodelor de sinteză în scopul obținerii unor substanțe cu proprietăți fizico-chimice adecvate unui viitor produs farmaceutic.

Caracterizarea preliminară a complecșilor obținuți (proprietăți organoleptice, solubilitate, conductivitate molară);

Stabilirea formulei chimice a complecșilor obținuți;

Caracterizarea fizico-chimică a complecșilor obținuți prin metode spectroscopice, termice și modelare moleculară;

Evaluarea activității microbiologice a complecșilor (activitatea antibacteriană și antifungică).

Metode de sinteză ale complecșilor argintului cu derivați ai fluorochinolonelor

În etapa de sinteză a complecșilor argintului cu derivați chinolonici, am utilizat ca liganzi: ofloxacina, norfloxacina (generația a 2-a) și levofloxacina (generația a 3-a), compuși ale căror caracteristici structurale și fizice sunt cuprinse în (Tabelul 2.4).

Ca sursă de ioni de Ag(I) am utilizat mai multe săruri de argint: azotat de argint, triflat de argint și citrat de argint (Tabelul 2.5).

Am evaluat mai multe metode de obținere simple și accesibile, originale sau care au avut la bază date publicate în literatura de specialitate [13].

Tabel 2.4. Florochinolone antibacteriene luate în studiu [28-34].

Tabelul 2.5. Săruri de argint utilizate ca sursă de Ag(I) în metodele preliminare de obținere a complecșilor cu argint ai fluorochinolonelor selectate [35-37].

Raportul molar metal:ligand. În studiile anterior publicate, în metodele de obținere a fost preferat raportul molar dintre ionul de argint și ligand 1:2 [20,24,27], dar există și studii în care s-a optat pentru raportul molar de 1:1 [21,22,26,25].

Solvenți. Fluorochinolonele selectate, care nu sunt condiționate sub formă de săruri, pot fi dizolvate în mai mulți solvenți [28]:

Ofloxacina/levofloxacina: solubilă în acid acetic glacial, puțin solubilă în cloroform, metanol, apă;

Norfloxacina: puțin solubilă în acetonă, alcool, foarte puțin solubilă în apă.

O altă variantă de metodă de obținere este suspendarea substanței în același solvent în care a fost dizolvată sarea de argint. De asemenea, se poate ajusta pH-ul (slab acid sau neutru) [21,23].

În cercetările personale au fost elaborate metode de obținere care au avut următoarele rapoarte molare ion de argint: ligand și componente ale mediului de reacție:

Raport molar argint: ligand 1:2

0.5 mmoli azotat de argint și 1 mmol ofloxacină dizolvați în 50 ml hidroxid de amoniu 25% și 100 ml apă distilată;

Raport molar argint: ligand 2:1

1,38 mmoli azotat de argint dizolvați în 50 ml apă + 2.76 mmoli ofloxacină/levofloxacină dizolvați în 75 ml metanol, la care se adaugă 25 ml hidroxid de amoniu 25%;

Raport molar argint: ligand 2:1

1,38 mmoli azotat de argint dizolvați în 50 ml apă + 2.76 mmoli ofloxacină dizolvați în 100 ml acid acetic glacial;

Raport molar argint: ligand 2:1

1,38 mmoli triflat de argint dizolvați în 40 ml apă + 2.76 mmoli ofloxacină/levofloxacina dizolvați în 40 ml metanol;

Raport molar argint: ligand 2:1

1,38 mmoli azotat de argint dizolvați în 50 ml apă + 2.76 mmoli levofloxacină dizolvați în 100 ml metanol;

Raport molar argint: ligand 1:2

1 mmol citrat de argint dizolvați în 25 ml acid citric 4M + 2 mmoli levofloxacină dizolvați în 100 ml metanol;

Raport molar argint: ligand 2:1.

10 mmoli azotat de argint dizolvați în 50 ml apă + 5 mmoli norfloxacină la care se adaugă 50 ml acid acetic glacial;

Raport molar argint: ligand 1:2

10 mmoli azotat de argint dizolvați în 50 ml apă + 5 mmoli norfloxacină dizolvați în 50 ml metanol;

Solvenții utilizați în metodele de obținere sunt: metanol, etanol, acetonă, acid acetic glacial, soluție de acid citric 4M, soluție de hidroxid de amoniu 25%, apă distilată.

Condițiile de reacție selectate, în scopul obținerii complecșilor cu argint ai fluorochinolonelor, au fost optimizate pe baza rezultatelor a mai multe experimente efectuate.

Astfel, condițiile de lucru au avut în vedere:

temperaturi de lucru variate (de la temperatura camerei la 100°C);

utilizarea unui refrigerent cu reflux (temperaturi 60 – 100°C);

agitare la temperatura camerei cu un agitator magnetic (timp de 4-8 ore);

concentrarea amestecului cu un rotaevaporator (la 40°C – 60°C , în vid obținut cu trompa de apă),

filtrare (hârtie de filtru, grosimea 0,15 mm, mărimea porilor 10 – 20 µm),

uscare în etuvă la 40°C (între 4 – 24 ore);

păstrarea compușilor obținuți protejați de lumină, în exicator în mediu cu CaCl2 anhidră;

suplimentar, în cazul utilizării citratului de argint ca sursă de ioni de argint, pentru eliminarea excesului de acid citric, s-a efectuat o dizolvare în etanol sau acetonă [28].

Deși metodele de obținere ale complecșilor metalici ai fluorochinolonelor publicate sunt relativ simple, obținerea acestui tip de complecși este o adevărată provocare.

Primele metode experimentate au avut ca parametru temperatura cuprinsă între 80 – 100°C, având ca punct de plecare metode deja publicate în literatura de specialitate [25,26,38,39]. În încercările noastre, utilizarea unei temperaturi de lucru apropiate de 100°C nu au avut succes, cel mai probabil datorită faptului că ionul Ag+ poate genera foarte ușor Ag2O (precipitat negru-brun) care se descompune parțial în Ag și O2 (Ag2O → 2Ag + 1/2O2) (Tabelul 2.6).

Tabelul 2.6. Transformarea Ag+ în Ag2O și/sau Ag în experimentele preliminare de obținere a complecșilor metalici cu argint ai fluorochinolonelor selectate.

Deși au fost publicate metode de obținere a unor complecși ai argintului cu fluorochinolone la temperaturi de 100°C [22,26], în experimentele personale am dezvoltate metode „reci” în care s-au utilizat temperaturi joase, de la temperatura camerei la cel mult 40 – 60°C pentru faza de concentrare și obținere a unui compus solid. Astfel, a fost eliminată transformarea ionului Ag+ în Ag2O, respectiv Ag și O2.

Obținerea și caracterizarea unui complex al argintului cu ofloxacina – studiu preliminar

Ofloxacina este o fluorochinolonă din generația a 2-a, care este utilizată în terapie ca racemic (Tabelul 2.4). Spectrul de activitate al ofloxacinei cuprinde: bacterii Gram pozitive (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae), bacterii aerobe Gram negative (Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhea) și genul Chlamydia [40].

Ofloxacina este autorizată pentru tratamentul infecțiilor tractului respirator inferior, inclusiv bronșite cronice și pneumonie, produse de bacili Gram negativi, tratamentul infecțiilor pelviene, fiind și foarte activă pe gonococi și chlamidii. Este utilizată în tratamentul infecțiilor urinare produse de bacili Gram negativi și a prostatitelor produse de E. coli. O altă utilizare importantă a ofloxacinei este în tratamentul infecțiilor pielii și țesuturilor moi produse de stafilococi, streptococi și bacili Gram negativi [3].

Până în prezent au fost sintetizați mai mulți complecși metalici ai ofloxacinei care au avut în structură ca ion metalic Mg2+, Ca2+, Ba2+, Ni2+, Zn2+, Cu2+, Co2+, Pd2+, Pt2+, și Bi3+. Unii dintre acești compuși au fost testați în ceea ce privește activitatea antimicrobiană (inclusiv activitatea pe Helicobacter pilori și Mycobacterium tuberculosis), legarea de ADN și albumine, iar rezultatele obținute au fost încurajatoare [2,41]. În momentul de față, în afara cercetărilor personale, în literatura de specialitate nu există studii publicate care să aducă în acest domeniu de cercetare un nou complex al argintului cu ligand ofloxacina.

Premizele acestui studiu personal au fost de a obține și caracteriza fizico-chimic un complex al argintului cu ofloxacina, care prezintă potențialul de a însuma proprietățile antibacteriene ale ofloxacinei cu argintul și poate fi testat și pentru alte efecte biologice.

Obținerea complexului. Metoda de obținere a complexului vizat este o metodă adaptată, simplificată, după metoda descrisă de Li Y.-X. și colaboratorii [26]. Raportul molar metal: ligand în mediul de reacție a fost stabilit de 1: 2. Astfel, 1 mmol de ofloxacină și 0.5 mmoli de azotat de argint au fost dizolvați în 50 ml amoniac 25% și 100 ml apă distilată. Amestecul a fost menținut pe o baie de apă la care s-a montat un refrigerent cu reflux timp de 8 ore. A rezultat o soluție limpede, de culoare galbenă, care a fost concentrată pe baia de apă, apoi a fost uscată în etuvă la temperatura de 80°C timp de 3 ore. Compusul obținut a fost păstrat în exicator cu CaCl2 anhidră, ferit de lumină [42].

Caracteristicile legate de aspect și solubilitate ale compusului obținut sunt următoarele: este o substanță solidă, cristalină, de culoare brună (Figura 2.3), solubilă în amoniac concentrat, apă distilată, la fierbere, puțin solubilă în soluție de HCl 10%, foarte puțin solubilă în DMSO, DMF, insolubilă în soluție de NaOH 10%, etanol, metanol și acetonă. Amoniacul în mediu de reacție se pare că a influențat pozitiv formarea complexului, cel mai probabil, formându-se [Ag(NH3)2]NO3. O altă variantă experimentată a metodei de obținere descrisă mai sus, fără amoniac, a fost fără succes (nu s-a confirmat ulterior, prin metode analitice, obținerea complexului cu argint) [42].

Figura 2.3. Aspectul cristalin al complexului metalic al Ag(I) cu OFL – captură cu microscopul ML-4IOR /camera video VCAM820 (400 x1000).

Complexul sintetizat a fost caracterizat prin metode spectroscopice (spectrometrie de masă MS, spectroscopie FT-IR și spectrofotometrie UV) și termice (calorimetria de scanare diferențială, DSC/analiza termogravimetrică, TGA).

Dintre metodele spectroscopice, cele care au adus dovezi relevante în susținerea formării unui complex al argintului cu ofloxacina au fost spectrometria de masă (MS) și spectroscopia FT-IR.

Analiza MS. Cu ajutorul MS a fost obținut unul dintre cele mai relevante rezultate și anume faptul că în condițiile de reacție a avut loc complexarea ionulu Ag+ cu ofloxacina. În spectrul de masă înregistrat se evidențiază ionul Ag(ofloxacina)2+ (m/z 830,9) care corespunde raportului molar metal:ligand de 1:2 și ionul ofloxacinei libere cu m/z 362,1 (Figura 2.4) [42].

Analiza spectroscopică FT-IR. Au fost înregistrate spectrele FT-IR ale complexului cu argint comparativ cu ofloxacina.

Din Tabelul 2.7. se poate observa că gruparea carboxil nu este implicată în coordinarea ionului Ag+ deoarece vibrațiile de întindere date de gruparea C=O din gruparea carboxil nu au suferit modificări relevante în cazul spectrului complexului. Cel mai probabil coordinarea are loc în zona atomului de azot N4 piperazinic, deoarece vibrațiile de întindere date de N-H au dispărut în cazul spectrului complexului. În plus, în spectrul complexului valorile 1395 cm-1 și 1033 cm-1 pot fi atribuite vibrațiilor grupării (N=O), sugerând faptul că gruparea NO3ˉ ar face parte din structura complexului [22,43].

Figura 2.4. Spectrul de masă tip full scan al complexului argintului cu ofloxacina (raport molar metal:ligand 2:1).

Tabelul 2.7. Frecvențele IR (cm‐1) înregistrate ale ofloxacinei și complexului argintului cu ofloxacina [42].

Analiza DSC/TGA. Curbele termice înregistrate arată diferențe notabile în ceea ce privește comportamentul compusului obținut comparativ cu ligandul și azotatul de argint (Figurile 2.5.-2.6) susținând formarea unui complex al argintului cu ofloxacina.

Figura 2.5. Curbele DSC ale ofloxacinei (A), AgNO3 (B) și complexului cu argint (C) [42].

Figura 2.6. Curbele TGA/DTG ale ofloxacinei (OFL), AgNO3 și complexului cu argint [42].

Figura 2.7. Structura chimică propusă pentru complexul cu argint al ofloxacinei [42].

Astfel, pe baza metodelor spectroscopice și termice, enumerate anterior, a fost demonstrat faptul că este posibilă obținerea unui complex al argintului cu ofloxacina, propunându-se și o structură chimică a acestuia (Figura 2.7.).

Acest studiu a făcut parte din proiectul de tip Grant Intern al Universității de Medicină și Farmacie din Tîrgu Mureș, Nr. 2/23.12.2014.

Obținerea, caracterizarea și evaluarea microbiologică a unor complecși ai argintului cu levofloxacina

Levofloxacina este o fluorochinolonă din generația a treia, izomerul levogir al ofloxacinei (racemic), care s-a dovedit a avea activitate superioară acesteia. Izomerul S(-) este mult mai activ decât izomerul R(+), respectiv de 8 – 125 de ori, în funcție de specia bacteriană [3]. Spectrul de activitate al levofloxacinei este larg și cuprinde o serie de bacterii Gram pozitive și Gram negative și organisme atipice [44]. Astfel, levofloxacina este utilizată în tratamentul mai multor tipuri de infecții, inclusiv cele produse de speciile de bacterii penicilin sensibile și specii rezistente de S. pneumonia. În SUA, levofloxacina a fost aprobată și pentru tratamentul pneumoniiilor nosocomiale și a prostatitelor bacteriene cronice, iar pe termen scurt, în doze mari pentru tratamentul pneumoniilor comunitare dobandite [45].

Mai mulți complecși metalici ai argintului cu levofloxacina au fost sintetizați [46-55] dar nici unul nu este un complex al argintului. Deoarece fenomenul rezistenței bacteriene la fluorochinolone este în creștere [56,57], o alternativă la această clasă de compuși, poate fi reprezentată de combinațiile complexe cu argint.

În scopul obținerii de complecși ai argintului cu levofloxacina, s-au selectat metode care nu necesită o temperatură ridicată. Raportul molar argint:ligand a fost 2:1 pentru toate cele trei metode de obținere.

Obținerea complexului 1. S-a utilizat o soluție obținută din 1,38 mmoli de azotat de argint și 50 ml de apă care a fost adăugată într-o soluție obținută din 2.76 mmoli de levofloxacină și 75 ml metanol. Apoi, în amestecul obținut, s-au adăugat 25 ml de amoniac 25%. Acest amestec a fost agitat timp de 4 ore cu ajutorul agitatorului magnetic, într-un balon cu fundul plat, închis și protejat de lumină. A fost obținută o soluție limpede, de culoare galben deschis, care a fost lăsată în repaos la temperatuta camerei, de pe o zi pe alta. În continuare, soluția obținută a fost concentrată cu un rotaevaporator la 40°C (sub vacuum creat de trompa de apă) iar ultimii 20 ml de soluție concentrată au fost lent deshidratați în etuvă la 40°C, timp de 24 de ore. Compusul solid a fost păstrat în exicator peste CaCl2 anhidră, protejat de lumină [20].

Obținerea complexului 2. Metoda de obținere a complexului 2 este o variantă a metodei de obținere a complexului 1, fără amoniac. O soluție obținută din 1,38 mmoli de azotat de argint și 50 ml de apă a fost adăugată într-un amestec de 2,76 moli de levofloxacină și 100 ml metanol. Acest amestec a fost agitat timp de 8 ore cu ajutorul agitatorului magnetic, într-un balon cu fundul plat, închis și protejat de lumină. Soluția obținută a fost concentrată cu un rotaevaporator la 40°C (sub vacuum creat de trompa de apă) până s-a obținut o suspensie de 20 ml. Suspensia a fost filtrată, obținându-se un precipitat alb, care a fost spălat cu apă distilată. Precipitatul a fost uscat lent în etuvă, la 40°C, timp de 24 de ore. Compusul solid a fost păstrat în exicator peste CaCl2 anhidră, protejat de lumină [20].

Obținerea complexului 3. În cazul celei de a treia metode de obținere a unui complex metalic s-a utilizat ca sursă de ioni de argint, citratul de sodiu. 1 mmol de citrat de argint dizolvat în 25 ml acid citric 4M a fost adăugat într-un amestec de 2 mmoli de levofloxacină și 100 ml metanol, rezultând o soluție de culoare galben-cenușie. Soluția a fost agitată timp de 8 ore cu ajutorul agitatorului magnetic, într-un balon cu fundul plat, închis și protejat de lumină și lăsată în repaos la temperatura camerei, peste noapte. Soluția obținută a fost concentrată cu un rotaevaporator la 45°C (sub vacuum creat de trompa de apă) până s-a obținut o suspensie vâscoasă de aproximativ 20 ml. Aceasta a fost lent uscată în etuvă la 40°C timp de 24 de ore. Compusul solid a fost păstrat în exicator peste CaCl2 anhidră, protejat de lumină. În scopul eliminării excesului de acid citric, compusul rezultat a fost dizolvat în acetonă (sau etanol), apoi suspensia obținută a fost filtrată și uscată lent în etuvă, la 40°C ,timp de 24 de ore. Compusul obținut a fost păstrat în exicator peste CaCl2 anhidru, protejat de lumină [20].

Proprietățile fizice ale celor trei complecși sunt diferite de ale liganzilor, respectiv sărurilor utilizate ca surse de argint [20]. Astfel, complecșii obținuți sunt compuși amorfi care au puncte de topire mai mari, diferite de ale liganzilor, cu valori ale conductivității molare care le confirmă natura non-electrolitică. În plus, din punct de vedere al solubilității, complecșii sunt solubili în dimetilsulfoxid (DMSO) și dimetilformamidă (DMF), asemănător altor complecși metalici ai fluorochinolonelor [22,39].

Rezultatele analizei elementale (C, H, N) combinate cu rezultatele conținutului de argint (%), obținute prin spectrometrie de absorbție atomică și de emisie atomică în flacără (FAAS) au sugerat raportul molar metal:ligand și formula moleculară a celor trei complecși obținuți.

Complecșii 1 și 2 prezintă un raport molar metal:ligand de 1:2, iar complexul 3 prezintă un raport molar metal:ligand de 1:1.

Formulele moleculare posibile pentru cei trei complecși sunt următoarele: complexul 1 – C36H40AgF2N7O11 cu masa moleculară 892, care corespunde formulei Levofloxacina2Ag(NO3), C37H44AgF2N7O12 cu masa moleculară 924 care corespunde formulei Levofloxacina2Ag(NO3)(CH3OH) și C24H33AgFN3O14 cu masa moleculară 714 care corespunde formulei LevofloxacinaAg(C6H6O7)3H2O. Complexul 1 și complexul 2 sunt similari, diferența fiind dată de o moleculă de metanol în cazul complexului 2; complexul 3 conține trei molecule de apă de hidratare.

Înregistrarea spectrelor FT-IR ale levofloxacinei și celor trei complecși ai argintului cu levofloxacina a adus dovezi în ceea ce privește modul de coordinare al ionului de argint cu levofloxacina (Tabelul 2.8). Astfel, deplasările benzii (C=O)carb (alocată grupării carboxil), fără a exista deplasări ale benzii (C=O)pir (alocată grupării oxo piridonice), este pusă pe seama formării unor legături de hidrogen care stabilizează forma protonată a ligandului [30,33,58,59]. În schimb benzile de la 3000–2700 cm– 1 care sunt caracteristice vibrațiilor de întindere a radicalului metil de la atomul de azot piperazinic și/sau vibrațiilor grupărilor metilen din ciclul oxazinic apar deplasate la 3040/3041 cm-1 (slab) și 2750-2763 cm-1(umăr) (Figura 2.8).

Figura 2.8. Spectrele IR ale complecșilor 1, 2 și 3 (roșu) și ale levofloxacinei (albastru).

Tabelul 2.8. Benzile FT-IR alocate pentru levofloxacină și complecșii (1), (2), și (3) [52,60-62].

s, strong (puternic); w, weak (slab); m, medium (mediu); v, very (foarte); ν, stretching (întindere); δ, deformation (deformare); Ar, aromatic (aromatic).

Prin metoda spectrofotometrică în domeniul UV, utilizând soluții echimolare obținute din ligand și complecși, s-au înregistrat absorbanțele (Tabelul 2.9.) și s-a pus în evidență raportul molar metal:ligand de 1:2 pentru complecșii 1 și 2 și raportul molar 1:1 pentru complexul 3 (Figura 2.9).

Tabelul 2.9. Absorbanțele înregistrate prin spectrofotometrie UV pentru levofloxacină și cei trei complecși ai argintului cu levofloxacina 1, 2 și 3, în DMSO (2.5∙10-3 mM).

De asemenea, spectrele electronice înregistrate în stare solidă subliniază diferențele structurale între complecșii obținuți și levofloxacina (Figura 2.10).

În cadrul analizei MS cu ionizare în electrospray (ESI) spectrele de masă obținute conțin fragmente de ioni m/z care corespund complecșilor argintului cu levofloxacina și fragmentelor acestora (m/z 831, 785, 776 și 723) (Figura 2.11). Fragmentul m/z 362 al levofloxacinei apare în toate cele trei spectre.

Analiza spectrelor RMN-1H și-a propus să pună în evidență eventuale deplasări ale protonilor din ciclul piperazinic. Datele analizate din spectrele RMN-1H ale complecșilor prezintă mici deplasări ale acestor protoni, comparativ cu levofloxacina, cel mai probabil ca o consecință a implicării atomilor de azot piperazinici din structura chimică a levofloxacinei în complexarea ionului de argint (Figura 2.12, Tabelul 2.10).

Figura 2.9. Spectrele UV ale levofloxacinei (LEV) și complecșilor (1), (2) și (3) în DMSO (2.5∙10-3 mM).

Figura 2.10. Spectrele electronice în stare solidă ale levofloxacinei (LEV) și complecșilor (1), (2) și (3).

Figura 2.11. Schema propusă pentru fragmentarea complexului 1.

Figura 2.12. Numerotarea atomilor din structura chimică a levofloxacinei din spectrele RMN-1H.

Tabelul 2.10. Deplasările chimice din datele RMN-1H (ppm) pentru levofloxacină și complecșii cu argint ai levofloxacinei (1), (2), și (3).

Analiza DSC a complecșilor metalici comparativ cu levofloxacina a relevat diferențe comportamentale pe curbele termice înregistrate. Toți complecșii au prezentat de la două la patru faze pe curbele DSC (Figurile 2.13-2.16).

Figura 2.13. Curba DSC a levofloxacinei.

Figura 2.14. Curba DSC a complexului 1.

Figura 2.15. Curba DSC a complexului 2.

Figura 2.16. Curba DSC a complexului 3.

De remarcat este faptul că aspectul curbei DSC a complexului 3 este diferit de aspectul curbelor complecșilor 1 și 2, cel mai probabil datorită metodei de obținere cu utilizarea unei alte surse de ioni de argint.

Structurile probabile ale celor trei complecși ai argintului cu levofloxacina sintetizați în acest studiu sunt prezentate în Figura 2.17.

Figura 2.17. Structurile propuse pentru complecșii 1, 2, și 3.

Structura propusă pentru complexul 1 constă în două molecule de liganzi (levofloxacină), care sunt neutru monodentați și coordinează ionul de Ag+ prin atomul de azot N4´ piperazinic, asemănător cu complexul norfloxacinei obținut de Li Y.-X. și colaboratorii [26]. Corelând datele obținute prin metodele de analiză enumerate anterior, grupările 4-oxo și 3-carboxil, cel mai probabil nu sunt implicate în coordinarea ionului de Ag+. Astfel, acest tip de coordinare este fără precedent pentru levofloxacină, compus care conține un ciclu N4´-metilpiperazinic în structura chimică.

Calculele cu ajutorul teoriei funcționalei de densitate (DFT) au avut ca rezultat geometriile optimizate ale ligandului și complecșilor 1 și 3, care sunt prezentate în Figurile 2.18 – 2.19. Unghiurile legăturilor selectate, densitatea sarcinii, energia totală și momentul total de dipol sunt prezentate în Tabelele 2.11-2.12. Astfel, în structura optimizată a complexului 1, atomii de azot piperazinici N22 și N48 sunt legați de ionul de Ag+, ca și O94 și O95, atomii de oxigen care aparțin ionului nitrat (Figura 2.18). Sfera de coordinare din jurul centrului metalic al complexului 3 (Figura 2.19) este alcătuită din atomii N22 (azot piperazinic), O19 și O20 (atomi de oxigen care aparțin ionului citrat). Gruparea organică care nu este implicată în coordinare este îndoită pentru a ușura impedimentarea sterică.

Tabelul 2.11. Rezultatele din calculele DFT: parametrii geometrici unghiurile legăturilor (°), densitatea sarcinii, energia totală și momentul total de dipol ale levofloxacinei.

Tabelul 2.12. Rezultatele din calculele DFT: parametrii geometrici unghiurile legăturilor (°), densitatea sarcinii, energia totală și momentul total de dipol ale complexului 1.

Figura 2.18. Structura optimizată a levofloxacinei la nivelul B3LYP al teoriei (6-31G(d) baza); conține lungimea legăturilor (Å) selectate în fază gazoasă.

Figura 2.19. Structura optimizată a complecșilor 1 și 3 la nivelul B3LYP al teoriei (6-31G(d) baza); conține lungimea legăturilor (Å) selectate în fază gazoasă.

Pornind de la ipoteza de lucru prin care este posibilă obținerea unor complecși ai argintului cu levofloxacina cu proprietăți antibacteriene dar și antifungice superioare, cei trei complecși obținuți și caracterizați din punct de vedere fizico-chimic au fost testați microbiologic (activitatea antibacteriană pe specii Gram pozitive și Gram negative de bacterii și activitatea antifungică pe specii de Candida).

Activitatea antibacteriană a fost analizată în acord cu standardul CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) utilizând metoda microdiluțiilor [20] și șase specii bacteriene.

A fost determinată concentrația minimă inhibitoare (CMI) pe următoarele tipuri de bacterii:

bacterii Gram pozitive:

Staphylococcus aureus ATCC 29213;

Staphylococcus aureus MRSA ATCC 43300;

Enterococcus faecalis ATCC 29212.

bacterii Gram negative:

Escherichia coli ATCC 25922;

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603;

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Valorile CMI obținute ale activității antibacteriene sunt prezentate în Tabelul 2.13.

Tabelul 2.13. Valorile CMI (μg∙ml-1) ale activității antibacteriane: levofloxacina și complecșii 1, 2 și 3.

În pofida potențialului antibacterian al complecșilor de argint sintetizați care ar putea să fie superior ligandului, valorile CMI ale complecșilor sunt similare cu ale levofloxacinei, fără diferențe notabile. Cea mai mare activitate antimicrobiană a celor trei complecși este împotriva celor două specii de stafilococ.

Activitatea antifungică a fost analizată utilizând aceeași metodă ca și în cazul determinării activității antibacteriene [20] pe patru tipuri de specii de Candida. A fost determinată CMI pe următoarele tipuri de specii de fungi Candida spp.:

Candida albicans;

Candida krusei;

Candida guilliermondii;

Candida parapsilosis.

Valorile CMI obținute ale activității antifungice sunt prezentate în Tabelul 2.14.

Activitatea antifungică obținută pentru cei trei complecși, conform valorilor CMI obținute, este modestă; în cazul activității antifungice pe specia Candida krusei rezultatele nu au fost concludente.

Tabelul 2.14. Valorile CMI (μg∙ml-1) pentru activitatea antifungică a levofloxacinei și complecșilor 1, 2 și 3.

Rezultatele modeste în ceea ce privește activitatea microbiologică testată poate fi corelată cu o influență negativă a solventului DMSO. Deși complecșii au un conținut mare de Ag (12 – 15 %), aceștia nu au cedat ioni Ag+ astfel încât să apară o activitate antibacteriană superioară levofloxacinei.

Este posibil ca ionul Ag+ să fie puternic legat de moleculele de liganzi prin legăturile coordinative create. Pe de altă parte, aceste rezultate obținute in vitro pot fi diferite de rezultatele in vivo. Pornind de la aceste considerații sunt necesare mai multe investigații în ceea ce privește acești complecși ai argintului cu levofloxacina.

Acest studiu al complecșilor argintului cu levofloxacina a făcut parte din proiectul de tip Grant Intern al Universității de Medicină și Farmacie din Tîrgu Mureș, Nr. 2/23.12.2014.

Obținerea, caracterizarea și evaluarea microbiologică a unor complecși ai argintului cu norfloxacina

Norfloxacina este o fluorochinolonă dn generația a 2-a, sintetizată în anul 1978 (Kyorin) care, în evoluția acestei grupe de compuși sintetici antibacterieni, a adus pentru prima dată ca element de noutate structural, un substituent piperazinic în poziția 7 (Figura 2.20).

Figura 2.20. Structura chimică a norfloxacinei și numerotarea atomilor.

Acest substituent piperazinic a contribuit semnificativ la îmbunătățirea proprietățile terapeutice, prin lărgirea spectrului de activitate și optimizarea parametrilor farmacocinetici [1]. Astfel, norfloxacina este o fluorochinolonă eficientă pe bacteriile aerobe Gram pozitive și are o activitate superioară pe bacteriile Gram negative, comparativ cu compușii din prima generație (acidul nalidixic, acidul pipemidic etc.). Norfloxacina este indicată în tratamentul infecțiilor urinare produse de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, specii de Proteus indol-pozitive (inclusiv P. vulgaris), Providencia rettgeri, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis și streptococi din grupa D. În general, norfloxacina nu este eficientă împotriva bacteriilor anaerobe [3].

Norfloxacina inhibă sinteza ADN-ului bacterian, având ca ținte cele două ezime cheie din sinteza ADN-ului bacterian, ADN giraza (enzima țintă din bacteriile Gram negative) și topoizomeraza IV (enzima țintă din bacteriile Gram pozitive) [63].

Mai multe studii au avut ca direcție de cercetare obținerea unor complecși metalici al căror ligand a fost norfloxacina, cu proprietăți farmacologice superioare (creșterea activității antibacteriene, lărgirea spectrului de activitate, de ex. activitatea pe Trypanosoma cruzi) sau cu efecte noi farmacologice (interacțiuni cu ADN-ul și albuminele, citotoxicitate). Ionii metalici utilizați în obținerea acestor complecși sunt foarte numeroși: Mg2+, Ca2+, Ba2+, Al3+, Bi3+, Fe3+, Ru3+, Au3+, Y3+, La3+, Ce3+, Ni2+, Mn2+, Cu2+, Co2+, Pd2+, Pt2+, Zn2+, Cd2+, Hg2+, ZrO2+, UO22+, W0 [64-71].

Până în momentul de față, complecșii argintului cu norfloxacina sintetizați și analizați au făcut obiectul a două studii axate în principal pe structura chimică și legătura coordinativă formată, doar unul dintre cele două studii publicând și testarea activității antibacteriene a compușilor doar pe trei specii de bacterii (Escherichia coli, Bacillus subtilis și Pseudomonas aeruginosa) și activității antifungicce, tot pe trei specii de fungi (Aspergillus flavus, Fusarium solani și Penicillium verrcosum) [22,26].

Pentru a obține complecși ai argintului cu norfloxacina s-au selectat două metode diferite de obținere, în care s-a avut în vedere un raport molar metal:ligand 2:1. Și în acest studiu experimental au fost preferate temperaturi de lucru până la 60°C (metoda de obținere a complexului 1) sau evitarea încălzirii amestecului de reacție (metoda de obținere a complexului 2).

Obținerea complexului 1. O soluție obținută din 10 mmoli azotat de argint și 50 ml apă distilată a fost adăugată într-un amestec format din 5 mmoli norfloxacină și 50 ml acid acetic glacial. Amestecul obținut a fost menținut la 60°C, cu refrigerent cu reflux, apoi soluția obținută a fost concentrată cu rotaevaporatorul, la 40°C (sub vacuum obținut cu trompa de apă). Suspensia obținută a fost filtrată și apoi uscată lent într-o etuvă, la 40°C; compusul final a fost păstrat în exicator în prezența CaCl2 anhidră, protejat de lumină [72].

Obținerea complexului 2. O soluție obținută din 10 mmoli azotat de argint și 50 ml apă distilată a fost adăugată într-un amestec format din 5 mmoli norfloxacină și 50 ml metanol. Amestecul obținut a fost agitat cu un agitator magnetic timp de 6 ore, într-un balon cu fundul plat, închis și protejat de lumină. Suspensia obținută a fost filtrată și apoi uscată lent într-o etuvă, la 40°C; compusul final a fost păstrat în exicator în prezența CaCl2 anhidră, protejat de lumină [72].

Proprietățile fizice ale celor doi complecși ai argintului cu norfloxacina sunt diferite de cele ale norfloxacinei, respectiv ale azotatului de argint. Cei doi complecși sunt subtanțe solide, amorfe, complexul 1 fiind de culoare gri-strălucitor iar complexul 2 de culoare brun deschis. Punctele de topire înregistrate (256°C pentru complexul 1 și 236°C pentru complexul 2) sunt mai mari decât punctul de topire al norfloxacinei (vezi anterior Tabelul 2.4).

Solubilitatea complecșilor.

Complexul 1 este puțin solubil în DMSO și DMF, foarte puțin solubil în soluție de acid clorhidric 10%, insolubil în apă distilată, metanol, etanol, acetonă, acetonitril, clorură de metilen. Se dizolvă în soluție de hidroxid de sodiu 10%, cu formarea unui precipitat negru (Ag2O).

Complexul 2 este solubil în DMSO, DMF și soluție de amoniac 25%, insolubil în apă distilată, metanol, etanol, acetonă, acetonitril, clorură de metilen, soluție de acid clorhidric 10%, acid acetic glacial. De asemenea, se dizolvă în soluție de hidroxid de sodiu 10%, cu formarea unui precipitat negru (Ag2O).

S-a determinat conductivitatea molară a celor doi complecși ai argintului cu norfloxacina și valorile obținute sugerează natura electrolitică a celor doi complecși, între 80 – 90 -1 cm2 mol-1 (electrolit 1:1).

Rezultatele analizei elementale (C, H, N) au sugerat raportul molar metal:ligand de 3:1 pentru complexul 1 și raportul molar 1:1 pentru complexul 2 (Tabelul 2.15).

Tabelul 2.15. Rezultatele analizei elementale ale complecșilor argintului cu norfloxacina, 1 și 2 (M – masa moleculară).

S-au comparat spectrelele FTIR înregistrate ale norfloxacinei cu spectrele complecșilor sintetizați ai argintului cu norfloxacina și s-au observat mai multe aspecte legate de structura chimică a acestora.

Benzile de absorbție atribuite ν(NH2+) în forma amfionică din spectrul norfloxacinei au apărut deplasate sau chiar au dispărut în cazul complecșilor; această deplasare sugerează implicarea atomilor de azot piperazinic în coordinarea ionului de argint.

Spectrul FTIR al norfloxacinei nu prezintă banda de absorbție caracteristică vibrațiilor grupării carboxil ν(C=O)carb cel mai probabil datorită legăturilor intramoleculare de hidrogen dintre gruparea 3-carboxil și gruparea 4-carbonil care stabilizează forma protonată a grupării carboxil, fapt semnalat și în alte studii. O altă cauză poate fi hidratarea norfloxacinei, molecule de apă fiind încorporate în structura cristalină, fenomen care produce modificarea vibrațiilor grupării carboxil ν(C=O)carb [73,74]. Această din urmă supoziție a fost confirmată de termograma DSC a norfloxacinei care a prezentat un proces de deshidratare la 108°C. Deplasarea benzilor de vibrație alocate grupării ν(C=O)pir în cazul complexului 1 (1631 cm-1 față de 1621 cm-1 în spectrul norfloxacinei) sugerează că această grupare este implicată în coordinarea ionului de argint. În cazul complexului 1 nu apare deplasarea benzilor de vibrație alocate grupării ν(C=O)pir.

Benzile de vibrație atribuite grupării (NO3ˉ) se regăsesc la 1366 cm-1 pentru complexul 1 și la 1374 cm-1 pentru complexul 2, sugerând faptul că aceasta face parte din complecși. În plus, o bandă putenică este observată la 1462 cm-1 (spectrul complexului 1) și la 1464 cm-1 (spectrul complexului 2) care este considerată a fi alocată vibrațiilor de întindere ν(N=O) [22].

Tabelul 2.16. Alocările benzilor de absorbție FTIR pentru norfloxacină și cei doi complecși cu argint, 1 și 2 (s, strong – puternic ; w, weak – slab; m, medium – mediu; v, very – foarte; ν, stretching – întindere; δ, deformation – deformare) [22,25,39,52,60,61,62,65].

Pentru a demonstra implicarea sau non-implicarea grupării piperazinice în coordinarea ionului de argint s-a utilizat analiza RMN 1H (Tabelul 2.17).

Tabelul 2.17. Deplasările chimice din spectrele RMN1H (în ppm) ale norfloxacinei, complexului 1 și 2.

Datele obținute din spectrele RMN 1H au demonstrat formarea complecșilor metalici și au adus informații legate de modul de coordinare. Protonii piperazinici au prezentat deplasări care indică modul de coordinare al argintului la atomii de azot piperazinici în cazul ambilor complecși. În cazul complexului 1 este posibilă și o complexare la nivelul grupărilor 3-carboxil și 4-piridonice. Date similare au fost publicate în cazul unor complecși cu aur ai fluorochinolnelor [51].

Pentru a aduce informații noi legate de structura chimică a celor doi complecși obținuți s-a utilizat și analiza UV-VIS spectrofotometrică. Informații mai relevante au fost obținute în cazul înregistrării spectrelor electronice în stare solidă. Maximul de absorbție de la 248,5 nm din spectrul norfloxacinei este atribuit tranzițiilor n-*, în timp ce maximele de absorbție care apar la 320 și 349,5 nm corespund tranzițiilor –*. Aceste benzi sunt deplasate batocromic în spectrele UV-VIS ale ambilor complecși ( ~ 20 nm pentru peak-ul de la 248.5 nm și ~ 30 nm pentru banda cu maximul de la 349,5 nm) (Figura 2.21).

Figura 2.21. Spectrele electronice în stare solidă ale norfloxacinei (a), complexului 1 (b) și 2 (c).

De asemenea, interesant este faptul că în domeniul vizibil ale spectrelor electronice ale complecșilor apare o nouă bandă la aproximativ 450 nm care este alocată transferului de sarcină de la metal la ligand (metal to ligand charge transfer, MLCT) sau tranzițiilor –* ligand centrale, interacțiunilor metal-metal. Spectrele electronice ale celor doi complecși sunt similare.

Analiza spectrelor de fluorescență a compușilor în stare solidă, la temperatura camerei, a relevat faptul că la aceeași lungime de undă de excitație, 271 nm, atât norfloxacina cât și complexul 1 manifestă o puternică bandă de emisie fotoluminiscentă, emisia benzii fiind mai intensă în cazul complexului 1 (Figura 2.22).

Figura 2.22. Spectrele electronice de emisie în stare solidă la λex 271 nm ale norfloxacinei (a) și complexului 1 (b).

Observații asemănătoare pot fi făcute la lungimea de undă de excitație 266 nm pentru norfloxacină și complexul 2 (Figura 2.23).

Figura 2.23. Spectrele electronice de emisie în stare solidă la λex 266 nm ale norfloxacinei (a) și complexului 2 (b).

În contrast cu fenomenele observate anterior, la λex 271 nm, norfloxacina a prezentat o intensitate mare a emisiei comparativ cu cu cei doi complecși (Figurile 2.24, 2.25).

Figura 2.24. Spectrele electronice de emisie în stare solidă la λex 271 nm ale norfloxacinei (a) și complexului 1 (b).

Figura xx. Spectrele electronice de emisie în stare solidă la λex 271 nm ale norfloxacinei (a) și complexului 2 (b).

Banda de emisie generată prin excitație la aproximativ 450 nm poate fi dată de legătura intraligand (–*) în starea de excitare a norfloxacinei și este drastic redusă după coordinarea argintului [72].

Pe baza datelor obținute cu ajutorul analizei elementale și a metodelor spectroscopice, este cel mai probabil ca în complexul 1 coordinarea liganzilor la ionul de argint să fie făcută într-un mod particular, prin intermediul atomilor de azot piperazinici, dar și clasic prin intermediul grupărilor 3-carboxil și 4-piridonică. În cazul complexului s-a stabilit formula moleculară C18H21FN5O11Ag3, dar pentru a emite o structură ipotetică mai sunt necesare investigații aprofundate și prin alte metode de analiză. Complexul 2 corespunde unui dimer, cu formula moleculară [(Norfloxacina)2Ag2](NO3)2 în care norfloxacina este un ligand monodentat iar complexarea ionului de argint are loc la susbtituentul piperazinic (Figura 2.26). Acest complex este similar cu cel raportat de Refat M.S (2007) [22] dar este diferit de cel obținut de Li Y.-X. și colaboratorii (2003) [26].

Figura 2.26. Structura chimică probabilă a complexului 2.

Până la studiul personal descris în această lucrare [72] doar unul dintre complecșii argintului cu norfloxacina sintetizați și publicați a fost caracterizat sumar din punct de vedere al activității antibacteriene (Escherichia coli, Bacillus subtilis și Pseudomonas aeruginosa) și al activității antifungice (Aspergillus flavus, Fusarium solani și Penicillium verrcosum) [22,26].

Astfel, cei doi complecși obținuți au fost caracterizați din punct de vedere fizico-chimic și testați microbiologic (activitatea antibacteriană pe specii de bacterii Gram pozitive și Gram negative și activitatea antimicotică pe specii de Candida).

Metoda utilizată a fost metoda microdiluțiilor în acord cu standardul CLSI. Astfel, a fost determinată CMI pe următoarele tipuri de bacterii:

specii de bacterii Gram pozitive: Staphylococcus aureus ATCC 29213; Staphylococcus aureus MRSA ATCC 43300; Enterococcus faecalis ATCC 29212.

specii de bacterii Gram negative: Escherichia coli ATCC 25922; Klebsiella pneumoniae ATCC 700603; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Au fost calculate valorile CMI obținute ale activității antibacteriene care sunt prezentate în Tabelul 2.18. Valorile CMI ale complecșilor sunt similare cu ale norfloxacinei, fără diferențe notabile.

În mod similar a fost analizată activitatea antifungică împotriva a trei tipuri de specii de Candida (Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis), obținându-se valorile CMI descrise în Tabelul 2.19.

Tabelul 2.18. Valorile CMI (μg∙ml-1) pentru activitatea antibacteriană a norfloxacinei și complecșilor 1 și 2.

Analizând valorile obținute activitatea antifungică exprimată în CMI pentru cei doi complecși este modestă.

Tabelul 2.19. Valorile CMI (μg∙ml-1) pentru activitatea antifungică complecșilor 1 și 2.

Deși teoretic cei doi complecși obținuți au potențialul de a îmbina activitatea biologică atât a ligandului cât și a ionului de argint, aceștia nu au prezentat o activitate antibacteriană superioară norfloxacinei. Este posibil ca să existe un impediment structural legat de cedarea ionului de argint in vitro; de asemenea, solventul aprotic DMSO utilizat în metodă poate influența atât cedarea ionului de argint cât și activitatea antibacteriană și antifungică a microrganismelor luate în studiu [75,76]. Totuși, trebuie luat în considerare faptul că aceste rezultate obținute in vitro pot fi diferite de rezultatele in vivo.

În concluzia acestui studiu, în ideea de a obține compuși cu activitate biologică superioară norfloxacinei, au fost sintetizați doi complecși ai argintului cu norfloxacina (denumiți complexul 1 și 2), prin două noi metode, simple și accesibile, care evită temperaturile mari de lucru. Compușii au fost caracterizați fizico-chimic, li s-a determinat formula elementară, iar în urma analizei prin metode spectroscopice și termice, s-a propus și o structura probabilă pentru complexul 2. În ceea ce privește activitatea antibacteriană testată pe șase tipuri de bacterii, atât Gram pozitive cât și Gram negative, cei doi complecși ai argintului cu norfloxacina au prezentat activitate similară ligandului. De asemenea, s-a pus în evidență și activitatea antifungică dată de componenta ionului de argint, dar în termeni de CMI, este modestă. În continuare sunt necesare studii mai aprofundate pentru a elucida structura chimică a complexului 1, dar și factorii care contribuie la rezultatele modeste ale activității microbiologice.

Studiul complecșilor metalici ai argintului cu norfloxacina a făcut parte din proiectul de tip Grant Intern al Universității de Medicină și Farmacie din Tîrgu Mureș, Nr. 2/23.12.2014.

Rezultatele au fost publicate in extenso, în trei reviste cotate ISI (factor de impact cumulat 5,285), o revistă indexată în baze de date internaționale, BDI, și prezentate la manifestări științifice (Congresul Național de Farmacie 2016, Conferința Națională a Doctoranzilor și Postdoctoranzilor 2015, The 15th International Symposium and Summer School on Bioanalysis 2015 – CEEPUS, Sesiunea științifică a cadrelor didactice 2015).

Studii de tip review: poluarea mediului, rezistența bacteriană și considerații privind complecșii cu argint ai fluorochinolonelor antibacteriene

Studiul 1

Într-un prim studiu cu titlul “Fluoroquinolone pollution of food, water and soil, and bacterial resistance”[77], realizat în colaborare (calitatea de prim autor), tema abordată a fost fenomenul îngrijorător de creștere a rezistenței bacteriene la fluorochinolone la nivel mondial, una dintre cauze fiind poluarea cu mediului cu acești compuși.

Utilizarea irațională a antibioticelor în medicina umană dar și cea veterinară, în special în unitățile de producție animaliere, a condus la apariția unei probleme globale, și anume poluarea mediului cu antibiotice. Antibioticele utilizate pentru tratamentul diverselor tipuri de infecții la oameni sau animale sunt eliminate ca atare sau metabolizate parțial, după care, prin mecanismele de excreție, ajung în apele reziduale și în sol. Morbiditatea și mortalitatea ridicată la pacienții critici este strâns legată de bacteriile multirezistente.

Seria sintezelor de derivați chinolonici antibacterieni, pornind de la modelul acidului nalidixic (un derivat de naftiridină) a continuat în anii '70 cu noi compuși (acidul pipemidic, acidul oxolinic și cinoxacina) în scopul ameliorării toleranței nesatisfăcătoare și a spectrului limitat de activitate. Din anul 1980, mai mult de 10.000 de fluorochinolone au fost sintetizate și testate din punct de vedere al activității antibacteriene.

Ciprofloxacina este cea mai prescrisă fluorochinolonă din lume, urmată de ofloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, norfloxacina, sparfloxacina. O fluorochinolonă de uz veterinar, autorizată în anul 2011 în Uniunea Europeană de către European Medicines Agency (EMA), este pradofloxacina (Veraflox – Bayer), fluorochinolonă încadrată în generația a treia.

Unii compuși au fost special dezvoltați pentru medicina veterinară: enrofloxacina, difloxacina, danofloxacina, marbofloxacina, orbifloxacina și sarafloxacina. Cantități semnificative de compuși (deoarece majoritatea chinolonelor nu sunt metabolizate) și metaboliți pot ajunge în sol prin urină, materii, dejecții animale.

Fluorochinolonele sunt printre cele mai persistente clase de antibiotice în sol, timp de luni întregi după fertilizarea cu materii biosolide, prezentând astfel un mare risc de dezvoltarea a rezistenței bacteriene.

Compușii respectivi ajung în principal în compoziția nămolurilor rezultate din dejecții, precum și în apa râurilor. Nămolurile sunt utilizate de cele mai multe ori ca fertilizant al solurilor pentru creșterea diverselor plante. Aplicarea de tratamente în crescătoriile de pește este o altă cale de poluare cu fluorochinolone, peștele comercializat fiind poluat cu fluorochinolone sau compușii lor de metabolizare.

Producătorii de medicamente contribuie într-o mai mică măsură la poluarea cu fluorochinolone deoarece există reglementări stricte și controale în acest domeniu. Totuși, colateral, calea medicamentelor neutilizate sau expirate care sunt deținute de pacienți nu poate fi monitorizată și cuantificată, dar este considerată mai puțin relevantă din punct de vedere al poluării. Reziduurile fluorochinolonelor în alimentele de origine animală pot pune în pericol consumatorii prin apariția rezistenței bacteriene la aceste antibiotice.

Apele dizolvă antibioticele din surse industriale care sunt legate de diverse matrice ale mediului. Legarea de particulele solului întârzie biodegradarea, dar este cunoscut faptul că solul înlătură antibioticele din apă, prin asociere cu elementele sale constituiente.

Un real pericol îl reprezintă inducerea fenomenului de rezistență care apare prin alimentele de origine animală contaminate cu acești compuși, inclusiv produși de degradare care ajung în mediul înconjurător. Utilizarea antibioticelor în tratamente antiinfecțioase sau chiar în scop de prevenire a infecțiilor este mult crescută. Îngrijorător este faptul că în crescătoriile de animale se folosesc cantități uriașe de antibiotice în scop non-terapeutic, ci doar pentru promovarea creșterii vitelor, porcilor, păsărilor. Sunt create astfel condiții favorabile pentru selecția, răspândirea și persistența bacteriilor rezistente la antimicrobiene.

Deși inițial s-a crezut că rezistența bacteriană apare doar în mod excepțional la această clasă, totuși, de-a lungul timpului, aceasta s-a instalat în special la derivații chinolonici din primele generații. Sudiul descrie pe larg mecanismele de instalare a rezistenței bacteriene cunoscute la ora actuală.

Autoritățile internaționale (printre care Organizația Mondială a Sănătății – OMS/World Health Organization – WHO și Organizația Mondială pentru Sănătate Animală – OMSA/World Organisation for Animal Health – OIE) sunt deja îngrijorate de dezvoltarea rezistenței antimicrobiene la oameni și animale. Ultimele date disponibile arată că rezistența la fluorochinolone în unele regiuni din Europa este prezentă și în creștere. De aceea, administrarea de fluorochinolone la animale prin alimentație, alături de antiparazitare sau insecticide, pentru alte motive decât tratamentul bolii diagnosticat clinic, ar trebui să fie reconsiderată. Totuși, nu există date centralizate care să cuantifice utilizarea derivaților chinolonici la animale, iar informațiile cu privire la dezvoltarea rezistenței bacteriene nu sunt disponibile în toate statele (inclusiv cele din UE).

În aceste condiții, controlul reziduurilor de antibiotice în probele de mediu devine o necesitate. UE a început să reglementeze acest fenomen. Prin Regulamentul 2377/90/EEC au fost stabilite planuri de alertă și de control în scopul detectării unor substanțe și a reziduurilor lor, potențial toxice pentru consumatori; noțiunile de reziduu și limitele reziduale maxime (RLM) ale antibioticelor au fost stipulate.

În SUA se aplică un document legiferat de către FDA, actualizat în anul 2006, respectiv Ghidul pentru industrie nr.3, Principii Generale pentru evaluarea siguranței compușilor utilizați în unitățile de producție animaliere.

Tot la nivel internațional, Comisia Codex Alimentarius adoptă mai multe documente (coduri și ghiduri) și alte recomandări privitoare la monitorizarea reziduurilor, metodele oficiale de analiză, principii și ghiduri de analiză a riscului.

În România, prin Ordinul nr. 95 din 2 aprilie 2007, privind Aprobarea Normei sanitar veterinare și pentru siguranța alimentelor privind măsurile de supraveghere și control al unor substanțe și a reziduurilor acestora la animalele vii și la produsele de origine animală, sunt legiferate măsuri concrete pentru monitorizarea reziduurilor, în care este inclusă și clasa antibioticelor.

Pentru determinarea acestor poluanți este necesar a fi utilizate metode sensibile și selective, deoarece matricele de mediu sunt complexe, iar concentrațiile antibioticelor în acestea sunt mici. Nu există reglementări pentru concentrații limită de antibiotice în probe de mediu. În schimb, Directiva 2377/90/EEC a UE stabilește RLM în alimente pentru șapte fluorochinolone. Acest număr este însă mult prea mic, în terapia animalelor fiind utilizați mulți alți derivați fluorochinolonici. În ceea ce privește metodele de analiză, UE a emis Decizia 657/2002/EC prin care pot fi utilizate metode care nu sunt standardizate. Tot în această decizie sunt stipulate criterii de performanță, limite și condiții care trebuie să fie îndeplinite de către aceste metode de analiză.

O etichetă de mediu a început a fi introdusă și pentru aceste chimioterapice tocmai pentru a facilita selecția tratamentului care este mai prietenos cu mediul (Tabelul 2.20) [77].

Deși anual se organizează întâlniri naționale și internaționale, workshop-uri și grupuri de lucru, apar numeroase rapoarte în literatura de specialitate și comunicate de presă, toate dedicate poluării mediului cu antibiotice, acestea au totuși un impact limitat, datorită, în special, lipsei de convergență.

Tabelul 2.20. Clasificarea unor fluorochinolone după impactul lor asupra mediului corelat cu următoarele caracteristici: persistența, toxicitatea, abilitatea de a rezista la îndepărtarea din mediu sau degradare în mediul acvatic, biocumulare și acumulare în țesutul adipos al organismelor acvatice și potențialul de a otrăvi organismele acvatice (Consiliul Orașului Stockholm 2012).

Reducerea poluării mediului cu fluorochinolone impune măsuri urgente la nivel global și armonizarea legislației în vigoare [77].

Studiul 2

În cel de al doilea studiu cu titlul “Development perspectives of silver complexes with antibacterial quinolones: Successful or not?”[13], realizat tot în colaborare (calitate de prim autor), obiectivul principal a fost sintetizarea rezultatelor publicate la ora actuală în domeniul de cercetare al complecșilor argintului cu chinolonele antibacteriene și o evaluare critică a acestora, inclusiv din perspectiva utilizării în terapie a acestor complecși metalici.

La nivel mondial o amenințare tot mai puternică este creșterea rezistenței bacteriene la fluorochinolone. Tot mai mulți cercetări sunt implicați în descoperirea de noi molecule sau optimizarea celor existente în scopul obținerii unui efect antibacterian puternic. În această zonă de interes se află și complecșii metalici ai fluorochinolonelor, care pot fi o alternativă în lupta împotriva creșterii rezistenței antibacteriene.

Studiul debutează cu informații actualizate despre clasa chinolonelor antibacteriene și mecanismul lor de acțiune.

Complexarea chinolonelor antibacteriene cu metale a fost menționată pentru prima dată în anul 1985, când a fost publicat primul studiu despre administrarea concomitentă a ciprofloxacinei cu antiacide care conțin magneziu, calciu și aluminiu; co-administrarea derivatului chinolonic cu ionii metalici respectivi a condus la pierderea completă a activității antibacteriene a ciprofloxacinei.

Ionii metalici pot influența acțiunea mai multor medicamente. Datorită procesului de coordinare la un ion metalic, efectele biologice ale moleculelor active sunt de cele mai multe ori crescute, comparativ cu moleculele active luate în studiu. Activitatea farmacologică crescută poate fi pusă pe seama efectului sinergic al moleculei active și ionului metalic. Sunt deja cunoscuți complecși metalici care au activitate antibacteriană, antifungică, antivirală și anticanceroasă. Astfel, s-au sintetizat complecși metalici ai chinolonelor antibacteriene cu activitate antimicrobiană egală sau superioară ligandului corespunzător. Cercetarea complecșilor metalici ai fluorochinolonelor a relevat și alte efecte biologice: antifungic, antiparazitar, anticancerigen, antiinflamator, antioxidant și chiar insulino-mimetic.

Ionul de Ag+ este unanim recunoscut ca agent antibactericid, antiseptic, antiinflamator și citotoxic. De aceea sinteza și activitatea unor complecși organo-metalici ai argintului a fost raportată în numeroase studii actuale. Studiul sintetizează și noutăți despre mecanismul complex de acțiune al argintului dar și date îngrijorătoare despre apariția rezistenței bacteriene la argint, în special dacă produsele cu conținut de argint sunt utilizate frecvent.

Începând cu anul 1981 și până în prezent au fost publicate mai multe studii ale căror obiective centrale erau obținerea unor complecși metalici ai chinolonelor antibacteriene, caracterizarea fizico-chimică și testarea în ceea ce privește diverse efecte biologice, printre cele mai importante regăsindu-se activitatea antibacteriană, activitatea antifungică și efectele citotoxice.

Coordinarea liganzilor la ionul de argint presupune în majoritatea complecșilor cu fluorochinolone, implicarea în mod particular a atomilor de azot din substituentul piperazinic/piperidinic (vezi azabiciclul moxifloxacinei) și nu implicarea grupărilor 3-carboxil și 4-piridonică. Astfel, sunt comentați toți liganzii din clasa chinolonelor antibacteriene care au fost utilizați de-a lungul timpului la obținerea de complecși ai argintului și modul lor de coordinare.

Metodele de obținere ale complecșilor argintului cu derivați chinolonici antibacterieni publicate până acum sunt relativ simple. Pe lângă liganzii selectați de autori, toate metodele utilizează ca sursă de ioni de Ag+, AgNO3 (în soluție apoasă, etanolică sau metanolică).

Raportul molar între ligand și ionul de argint variază; este preferat în majoritatea metodelor raportul molar de 1:1. Derivatul chinolonic utilizat ca ligand poate fi dizolvat în diverși solvenți (apă, etanol, metanol, acetonă) sau este utilizată suspensia într-un anume solvent, în care este dizolvată sarea de argint. În unele metode este preferată și o ajustare de pH, de exemplu pH 5.1 sau 6-7, acestea fiind valori situate în zona de pH slab acid către neutru.

Amestecurile de reacție obținute în unele metode sunt agitate cu agitatorul magnetic timp de 10 minute sau 1 oră, dar în majoritatea metodelor nu sunt agitate preliminar unui proces de încălzire a amestecului de reacție. Refluxarea la 100°C este cea mai comună metodă, cu un timp variabil de la 4 la 24 ore. În anumite metode, cercetătorii au preferat temperaturi mai mici (50°C) și timp de reacție mai lung (12 ore) sau dimpotrivă, temperaturi mai mari (155°C) și timp de reacție și mai lung (6 zile). În obținerea complecșilor metalici cu argint ai derivaților chinolonici s-a subliniat faptul că este necesară o anumită temperatură la care să fie menținut amestecul de reacție și aceasta trebuie să fie pe o durată de cel puțin de 2 ore. Răcirea amestecului de reacție este relativ similară tuturor metodelor, respectiv o răcire lentă, la temperatura camerei, care poate merge ca durată chiar până la 3 zile.

După această etapă urmează o filtrare a amestecului de reacție, spălarea precipitatului cu diverși solvenți (apă distilată, apă distilată fierbinte, acetonă, după care urmează o etapă de uscare în exicator cu vacuum sau nu, în prezența CaCl2 anhidre. Există și excepții, în care se menține amestecul de reacție (cu apă și etanol) de exemplu, după etapa de refluxare, încă o zi la 105°C, după care urmează o răcire lentă la temperatura camerei.

O notă critică la aceste studii deja publicate este faptul că, în cazul majorității, nu au fost depuse mai multe eforturi pentru determinarea masei moleculare a compușilor sintetizați, deși au fost utilizate mai multe metode de analiză combinate. Pe baza maselor moleculare publicate până acum, putem afirma despre complecșii cu argint sintetizați că au mase moleculare mari, în funcție de structura obținută (monomer, dimer, structură helix etc.).

Proprietățile fizice ale complecșilor argintului cu fluorochinolonele nu sunt prezentate complet în majoritatea studiilor publicate. Unele aspecte sunt importante deoarece sunt corelate cu proprietățile farmacocinetice ale complecșilor sintetizați. Astfel, aspectul compușilor obținuți diferă de la studiu la studiu, în termeni de culoare, formă cristalină sau amorfă, solubilitate sau proprietăți electrochimice.

Majoritatea complecșilor metalici ai argintului cu derivați chinolonici antibacterieni sunt non-electroliți. La modul general sunt solubili în special în DMSO sau DMF. Un aspect negativ al acestor studii este lipsa informațiilor despre stabilitatea complecșilor.

Punctele de topire ale complecșilor sunt diferite de ale liganzilor, de asemenea, comportamentul pe care îl adoptă sub influența temperaturii (în metodele termice de analiză) este diferit, acest fapt relevând o structură chimică diferită de a liganzilor.

În scopul determinării structurii chimice, structurii cristaline, compoziției chimice precum și a proprietăților fizico-chimice este utilizat un set complex de metode adecvate acestor complecși organo-metalici. Printre cele mai importante se află:

– analiza elementală (C,H,N) este utilizată pentru a elucida formula moleculară a complecșilor obținuți;

– metodele spectroscopice oferă informații despre structura chimică și modul de complexare între ionul metalic și fluorochinolonă: spectroscopia de absorbție atomică – atomic absorbtion spectroscopy (AAS), spectrometria de emisie cuplată cu plasmă inductiv – inductively coupled plasma (ICP) pentru determinarea conținutului de argint, spectroscopia de IR cu transformată Fourier (FT-IR), spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară RMN 1H și RMN 13C combinate cu spectrometria de masă (MS), spectroscopia electronică și spectrofluorimetria care oferă date structurale despre complecșii obținuți.

– difracția cu raze X – single-crystal X-ray diffraction (XRD), care determina aranjamentul tridimensional al atomilor în cristalele solide și distanțele interatomice;

– metodele de analiză termice completează caracterizarea complecșilor metalici cu proprietățile termofizice ale acestora;

– teoria funcționalei de densitate – density functional theory (DFT), o metodă prin care sunt determinate proprietățile moleculelor la nivel teoretic: structura moleculară, frecvențele vibraționale, energiile de atomizare, energiile de ionizare, proprietăți electrice și magnetice, căile de reacție etc.

Studiul analizează și efectele biologice studiate și importanța lor pentru utilizarea în terapie a complecșilor metalici cu argint ai fluorochinolonelor. Majoritatea studiilor pornesc de la premiza însumării efectelor celor două componente ale complecșilor metalici ai fluorochinolonelor. În urma cercetărilor există doar câteva studii în care activitatea antibacteriană a complecșilor este superioară liganzilor sau cel mult similară liganzilor. În cazul activității antifungice rezultatele obținute sunt diferite de cele așteptate. Doar câțiva complecși au prezentat activitate antifungică, relativ modestă, pe specii de Candida sau Aspergillus.

Lipsa de succes în ceea ce privește activitatea microbiologică poate avea mai multe explicații. O ipoteză în acest sens este o posibilă influență negativă a solventului utilizat la determinări (DMSO). De asemenea, stabilitatea complecșilor obținuți poate fi corelată cu activitatea microbiologică determinată. Conform teoriei de chelare a lui Tweedy este posibil ca delocalizarea electronilor π să crească penetrarea complexului prin membranele lipidice și să blocheze legarea metalului de situsurile de legare ale enzimelor microorganismelor. A fost studiat și efectul citotoxic al unor complecși dar nu a fost obținut un răspuns semnificativ. Pe lângă aceste efecte biologice unele studii au demostrat interacțiunea complecșilor cu ADN-calf timus.

Deoarece complecșii argintului cu derivați chinolonici antibacterieni rămân în continuare promițători în ceea ce privește potențialul terapeutic, studiile în acest domeniu de cercetare sunt departe de a fi încheiate, multe aspecte importante urmând a fi clarificate, atât în ceea ce privește proprietățile fizico-chimice, mecanismul de acțiune cât și în ceea ce privește paleta de efecte biologice. Aceste cercetări sunt mai mult decât necesare reprezentând o alternativă în combaterea fenomenului îngrijorător, în creștere, al apariției rezistenței bacteriene la antibioticele existente în terapie [13].

Contribuții la dezvoltarea de metode electroforetice de analiză a unor compuși de interes farmaceutic

Metode de electroforeză capilară (EC) optimizate pentru separări chirale

Tipuri de EC adecvate separărilor chirale

Electroforeza capilară (EC) este o metodă de analiză oficială în Farmacopeea Europeană, fiind tehnica electroforetică utilizată pentru separarea speciilor încărcate cu sarcini electrice, dar și pentru separarea speciilor neîncărcate, când se introduc aditivi potriviți sau se utilizează numai deplasarea electroosmotică [28].

EC este o metodă analitică care se pretează la mai multe tipuri de analize cum ar fi analize chimice, farmaceutice, biomedicale și biochimice. Începând cu anii ʹ80, în paralel cu dezvoltarea de sisteme de electroforeză capilară, au apărut primele studii în care se utiliza EC în analiza farmaceutică. EC a fost considerată o tehnică complementară și alternativă la cromatografia de lichide de înaltă performanță, High Performance Liquid Chromatography (HPLC).

EC are numeroase avantaje, cele mai importante fiind:

– timpul scurt de analiză;

– utilizarea de volume mici de probă (1 – 50 nl injectate);

– utilizarea de cantități mici de reactivi (costuri scăzute față de tehnicile cromatografice); în consecință, a devenit adecvată și pentru determinările care până acum erau costisitoare și mari consumatoare de timp (peptide, proteine, acizi nucleici, substanțe farmaceutice, compuși chirali);

– mod de lucru automatizat;

– prezintă numeroase modalități de a varia selectivitatea;

– are aplicabilitate în numeroase zone de interes;

– are aplicabilitate atât pentru macro- cât și pentru micromolecule, analiți neutri sau încărcați electric;

– detecția are loc în interiorul capilarului, care poate fi efectuată cu detectori moderni (detector de fluorescență, diode array detector – DAD, spectrometru de masă – MS detector etc.).

EC poate fi utilizată pentru:

– confirmarea identității substanțelor;

– determinarea impurităților înrudite din substanțele farmaceutice;

– separări chirale;

– determinări cantitative ale ionilor anorganici, substanțelor farmaceutice cât și ale excipienților [78-80].

Electroforeza capilară zonală (ECZ) se mai numește și electroforeză în soluție liberă (Free Zone Capillary Electrophoresis, FZCE) și se realizează într-un capilar umplut cu o soluție de electroliți. Separarea se efectuează în funcție de mobilitatea electroforetică a analiților, la care se adaugă sau se scade fluxul electroosmotic (FEO) (Electroosmotic Flow – EOF).

ECZ are aplicabilitate pentru toate substanțele purtătoare de sarcini electrice. Cationii migrează către catod, deplasarea (mobilitatea) lor fiind accelerată de FEO care se deplasează în același sens (deci, se însumează). Anionii minerali, dar și cei organici, încărcați negativ ar trebui să migreze spre anod, dar cum FEO este mai mare decât deplasarea electroforetică, anionii sunt antrenați tot către catod, deci separarea lor derivă din rezistența lor la FEO (Figura 3.1). Moleculele neutre, deși antrenate de FEO, nu se separă prin metoda ECZ.

Figura 3.1. Migrarea electroforetică a cationilor, anionilor și a moleculelor neutre și ordinea pe electroforegramă în funcție de timpul de migrare.

Electroforeza capilară micelară (ECM) sau Micellare Electrocinetic Capillary Chromatography (MEKC), se mai numește și electroforeză în soluție micelară sau cromatografie capilară electrocinetică. Separările de acest tip au loc în prezența substanțelor micelare. La BGE se adaugă agenți tensioactivi în concentrație mai mare decât concentrația lor micelară critică. Se formeză agregate sferice, purtătoare de sarcini electrice, numite micele, în care grupările hidrofobe sunt orientate în interior, iar grupările hidrofile sunt orientate în exterior [81-83].

Formarea micelelor este un proces dinamic, micelele dezagregându-se (relaxându-se) și refăcându-se continuu, alcătuind o fază pseudostaționară, care poate îngloba analiți hidrofobi pe care îi antrenează în migrarea lor electroforetică (Figura 3.2).

În ECM coexistă două faze, una apoasă și alta micelară. Astfel, la mobilitatea electroforetică a substanțelor existente se adaugă un factor suplimentar de separare datorat distribuției substanțelor între faza apoasă și cea micelară (de fapt în interiorul fazei micelare) iar retenția substanțelor în această fază crește cu hidrofobicitatea lor.

Figura 3.2. Reprezentarea schematică a migrării electroforetice în mediu micelar [84].

ECM se aplică atât compușilor purtători de sarcini cât și celor lipsiți de sarcină, neutri. A fost utilizată pentru prima dată la începutul anilor ʹ90 de către Shigeru Terabe care astfel a extins aplicabilitatea metodei EC [84]. Aparatura în acest tip de tehnică de electroforeză este identică cu cea din ECZ. Avantajul acestei metode este evident în separarea unui amestec care conține atât compuși ionizați cât și neutri [82,83].

Multe produse farmaceutice sunt administrate ca amestecuri racemice. În cele mai multe cazuri există diferențe farmacologice în ceea ce privește efectele fiecărui enantiomer. În plus, cei doi enantiomeri pot prezenta diferențe mari în ceea ce privește farmacocinetica datorită stereoselectivității în procesele de absorbție, distribuție, metabolizare și eliminare. Alegerea între a utiliza în terapie un amestec racemic sau un enantiomer pur depinde de avantajele terapeutice, reacțiile adverse dar și de costurile de producție. Instituțiile de reglementare Food and Drug Administration (FDA) și European Medicines Agency (EMA) pun accent din ce în ce mai mare pe puritatea enantiomerică a compușilor optic activi și solicită mai multe studii farmacocinetice [85,86].

Posibilitatea separării celor doi enantiomeri este o mare provocare în industria farmaceutică. Astfel, metoda EC, prin adăugarea de selectori chirali în electrolitul de bază, a creat posibilitatea separării chirale a moleculelor active, devenind din ce în ce mai atractivă datorită avantajelor menționate mai sus [87].

Un număr mare de selectori chirali sunt utilizați în tehnica electroforezei capilare, printre cei mai importanți fiind: ciclodextrinele (CDs), eterii coroană chirali, surfactanți chirali, complecși cu schimbător de ligand, proteine, polizaharide liniare, antibiotice (glicopeptide, polipeptide, ansamicine, aminoglicozide, macrolide, lincosamide) [78,88,89].

Toate experimentele EC, care sunt descrise în capitolele următoare, au fost efectuate cu aparatul Agilent 1600CE echipat cu detector DAD iar rezultatele au fost procesate cu softul Chemstation 7.01 (Agilent).

Separarea enantiomerilor omeprazolului și pantoprazolului prin ECZ

Studiul abordează o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, fără a fi o temă proprie de cercetare, la publicarea rezultatelor având calitatea de autor principal. Obiectivul general al studiului este dezvoltarea unei noi metode electroforetice de separare a enatiomerilor a doi compuși din clasa inhibitorilor de pompă de protoni (IPP), omeprazolul și pantoprazolul, care să fie simplă, rapidă, precisă și accesibilă cu aplicabilitate în industria farmaceutică [90].

Omeprazolul și pantoprazolul se numără printre cei mai prescriși IPP în terapia de reducere a producției de acid gastric. Din punct de vedere structural sunt derivați ai 2-piridilmetil-sulfinil-benzimidazolului (Figura 3.3, Tabelul 3.1).

Figura 3.3. Structura generală a derivaților IPP (*-marchează atomul chiral).

Tabelul 3.1. Substituenții specifici omeprazolului și pantoprazolului din structura generală a derivaților IPP [91].

Ambii compuși prezintă un atom de sulf chiral, astfel, moleculele respective pot exista sub forma a doi izomeri optici, (S) și (R).

În terapie omeprazolul este utilizat ca racemic dar și ca enantiomer pur (S-omeprazol); pantoprazolul este utilizat doar ca racemic, deși izomerul pur, S-pantoprazolul, are mai multe avantaje terapeutice. Ambii compuși au caracter slab bazic (omeprazol – pKa 4,1 și pantoprazol – pKa 3.95) și sunt hidrofobi.

În etapele preliminare experimentale au fost testați mai mulți electroliți de bază (Background Electrolyte, BGE) cu diferite valori de pH și s-a constatat că atât omeprazolul cât și pantoprazolul pot fi detectați în limite largi de valori de pH (pH 2 – 11). Apoi au fost introduse în BGE cantități mici din mai multe tipuri de CDs, în concentrații de 10 mM pentru CDs neutre și 5 mM pentru CDs încărcate electric. La începutul optimizării metodei analitice s-a selectat concetrația optimă de BGE, respectiv acid fosforic 50 mM pentru toate determinările.

În mod similar au fost testate mai multe concentrații de CDs. Astfel, β-ciclodextrina metilată aleator (RAMEB) a fost cea mai adecvată pentru separarea enantiomerilor omeprazolului iar sulfobutileter-β-ciclodextrina (SBE-β-CD) a fost cea mai adecvată pentru pantoprazol.

Au fost selectați parametri optimi care țin de sistemul electroforetic, și anume: tensiunea aplicată +20 kV, temperatura din caseta capilarului 15°C, presiunea de injectare 50 mbar/1 s. Datorită degradării rapide a celor doi compuși, determinările au fost efectuate imediat după dizolvarea substanțelor în mediu acid. Astfel, în aceste condiții determinate a fi optime, s-a obținut separarea celor doi enantiomeri ai ambilor compuși, stabilindu-se și ordinea de migrare cu ajutorul unei soluții de enatiomer pur (Figurile 3.4 – 3.5).

Metoda optimizată a fost validată (precizie, acuratețe, sensibilitate și robustețe), apoi i s-a testat aplicabilitatea pe diferite produse farmaceutice. Ecuațiile de regresie au avut un coeficient de corelație mai mare de 0,99 și au fost următoarele: y = 0,1232x – 1,2907 pentru R-omeprazol și y = 0,142x – 1,9499 pentru S-omeprazol; y = 0,0809x – 1,32 pentru R-pantoprazol și y = 0,0854x – 1,2522 pentru S-pantoprazol. Valorile LOD și LOQ sunt cuprinse în Tabelul 3.2.

Figura 3.4. Electroforegrama separării enatiomerilor omeprazolului. Condiții de separare: BGE acid fosforic 50 mM + RAMEB 20 mM, pH 2,5, tensiunea aplicată +20 kV, temperatura din caseta capilarului 15°C, presiunea de injectare 50 mbar/1 s, capilar 48,5 cm lungime totală (40 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrația omeprazol 10 µg/ml, λ 300 nm.

Figura 3.5. Electroforegrama separării enatiomerilor pantoprazolului. Condiții de separare: BGE acid fosforic 50 mM + SBE-β-CD 5 mM, pH 7,0, tensiunea aplicată +20 kV, temperatura din caseta capilarului 15°C, presiunea de injectare 50 mbar/1 s, capilar 48,5 cm lungime totală (40 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrația pantoprazol 10 µg/ml, λ 300 nm.

Utilizându-se această metodă optimizată și validată pentru determinarea enantiomerilor celor doi compuși IPP din produse farmaceutice comercializate, recuperarea substanțelor active a fost între limitele 95 – 105%, în concordanță cu concentrațiile declarate de producători.

Tabelul 3.2. Valorile LOD/LOQ pentru separarea chirală a enantiomerilor omeprazolului și pantoprazolului (domeniul de concentrații 5 – 100 µg/ml)

Concluzia acestui studiu este că s-a reușit cu succes dezvoltarea unei noi metode ECZ de separare chirală pentru doi compuși din clasa IPP, omeprazolul și pantoprazolul. Metoda dezvoltată este relativ simplă, rapidă și accesibilă, folosindu-se două tipuri diferite de CDs care nu au mai fost raportate în literatura de specialitate, și este adecvată determinărilor de rutină pentru analiza celor doi compuși, în industria farmaceutică.

Separarea enantiomerilor fluoxetinei prin ECZ

Studiul reprezintă o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, dar care nu a constituit o temă de cercetare proprie, la publicarea rezultatelor având calitatea de coautor. Studiul are ca obiectiv dezvoltare unei metode alternative, simplă și rapidă, de separare chirală a enantiomerilor fluoxetinei utilizând metoda ECZ și o serie de CDs ca și selectori chirali [92]. Procesul de optimizare a urmărit pe lângă rezultatul separării celor doi enantiomeri ai fluoxetinei și un minim de experimente efectuate prin modificarea simultată a mai multor parametri de lucru.

Fluoxetina sau (±)-N-metil-3-fenil-3-[4-(trifluorometil)fenoxi]propan-1-amina (Figura 3.6) este un inhibitor al recaptării serotoninei utilizat în tratamentul depresiei, tulburării obsesiv-compulsive, anxietății, bulimiei, tulburării premenstruale disforice.

Figura 3.6. Structura chimică a fluoxetinei (*-marcare atom de carbon chiral).

Având în structura chimică o amină terțiară, fluoxetina este un analit cu caracter bazic (pKa 9.8). Preliminar, mai multe tipuri de BGE în concentrație de 25 mM au fost utilizate la diferite valori de pH (interval de pH 2 – 11). De asemenea, ca selectori chirali s-au testat mai multe CDs (concentrații de 10 mM pentru CDs neutre și 5 mM pentru celelalte tipuri). În urma acestui screening preliminar, s-a selectat o beta-ciclodextrină, heptakis(2,3,6-tri-O-metil)-beta-ciclodextrina (TRIMEB) și un BGE fosfat la pH 5.

A fost testat un design experimental ortogonal, cu 18 experimente în total, în care au fost luați în calcul șase factori experimentali (concentrația BGE, pH-ul BGE, temperatura din caseta capilarului, concetrația TRIMEB, tensiunea aplicată și presiunea de injectare), pe trei nivele diferite; acest design a fost utilizat în scopul de a reduce numărul de experimente (un studiu electroforetic clasic are un număr mare de experimente și este consumator de timp) [92].

Astfel, rezoluția optimă a celor doi enantiomeri ai fluoxetinei a fost atinsă cu următorii parametri: BGE acid fosforic 50 mM + 10 mM TRIMEB, pH 5,5, temperatura 15°C, curentul aplicat +20 kV, presiunea de injectare 50 mbar/s. Separarea celor doi enantiomeri pe linia de bază a avut rezoluția Rs 1,90 și factorul de separare α = 1.04 (Figura 3.7). Ordinea de migrare a fost determinată cu ajutorul unei soluții standard de enantiomer pur S.

Figura 3.7. Separarea chirală a enantiomerilor fluoxetinei în condiții experimentale optimizate prin metoda ECZ (BGE acid fosforic 50 mM + 10 mM TRIMEB, pH 5,5, temperatura 15°C, tensiunea aplicată +20 kV, presiunea de injectare 50 mbar/s, capilar cu lungimea totală 48 cm/lungimea efectivă 40 cm și diametru intern 50 µm, concentrația fluoxetină 25 µg/ml, λ 230 nm).

Metoda optimizată de separare a celor doi enantiomeri ai fluoxetinei a fost validată (repetabilitate, precizie, liniaritate, sensibilitate și acuratețe).

Tabelul 3.3. Valorile curbelor de calibrare și LOD/LOQ pentru separarea chirală a enantiomerilor fluoxetinei (domeniul de concentrații 2,5 – 50 µg/ml)

S-a determinat aplicabilitatea metodei în cazul a două produse farmaceutice (Prozac, Fluoxin) cu rezultate foarte bune. Nu s-au constatat interferențe ale excipienților pe electroforegrame.

În concluzie, în acest studiu s-a dezvoltat o nouă metodă ECZ de separare chirală pentru fluoxetină, simplă, rapidă și accesibilă, folosindu-se pentru prima dată o ciclodextrină derivatizată neutră, TRIMEB, și BGE acid fosforic cu un timp de analiză mai mic de 5 minute, foarte avantajos în determinările de rutină din industria farmaceutică [92].

Utilizarea captisolului ca selector chiral

Această lucrare abordează o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, fără a fi o temă proprie de cercetare, la publicarea rezultatelor având calitatea de coautor. Obiectivul principal al lucrării este investigarea Captisol® utilizat ca selector chiral în cazul a nouă compuși optic activi selectați din mai multe clase farmacologice de compuși terapeutici. Compușii respectivi sunt carvedilol, propranolol și sotalol (β-blocante), cetirizina și prometazina (antihistaminice H1), amlodipina (blocant al canalelor de calciu), fluoxetina (inhibitor de recaptare a serotoninei), indapamida (diuretic) și tramadol (analgezic opioid) [93].

Din marea clasă a CDs, sulfobutileter-β-ciclodextrinele sunt derivați anionici ai β-CDs, care sunt utilizate cu succes în separarea chirală a diverși compuși optic activi. Diferența între tipurile uzuale de sulfobutileter-β-ciclodextrine o face gradul de substituție. Captisol® este o sulfobutileter-β-ciclodextrină care a început a fi utilizată recent ca selector chiral. Are o structură particulară cu 6-7 grupări sulfobutileter în moleculă, permițând o extensie a cavității CD. Datorită acestei structuri poate apare o legătură puternică între molecula activă și Captisol® (diferit de alte CDs), interacțiuni ionice cu moleculele încărcate pozitiv.

A fost realizat un screening complex al mai multor tipuri de BGE în care au fost introduse cantități mici de Captisol® dar și de alte CDs neutre, β-CD și hidroxipropil-β-CD (HP-β-CD). În ceea ce privește pH-ul, Captisol® este un selector chiral eficient peste valoarea de pH 5. Concentrația optimă de Captisol® a fost stabilită la 5 mM iar concentrația de BGE de 25 mM (acid fosforic 25 mM, dihidrogenofosfat de sodiu 25 mM, monohidrogenofosfat de sodiu 25 mM – dihidrogenofosfat de sodiu 25 mM 1:1, tetraborat de sodiu 25 mM). În urma mai multor experimente, tensiunea aplicată a fost stabilită la + 25 kV iar temperatura în caseta capilarului la 15 °C. Parametrul presiunea de injectare a fost stabilit la 50 mbar / 1 s. Detectarea (detector UV) a fost efectuată la maximele de absorbție ale fiecărui compus. Datele obținute în urma experimentelor separărilor sunt cuprinse în Tabelul 3.4.

Tabelul 3.4. Datele separărilor chirale ale compușilor model selectați: tipul și concentrația de CD, pH-ul BGE, timpii de migrare ai enantiomerilor (T1 și T2), rezoluția – R și factorul de separare – α.

Din aceste date se observă eficiența separărilor cu selectorul chiral Captisol®, opt din nouă compuși separându-se pe linia de bază. Excepția dintre compușii model a fost separarea enantiomerilor fluoxetinei, obținându-se doar o ușoară despicare a peak-ului racemic. Rezoluția cea mai bună și timpul de migrare scurt au fost obținute cu Captisol® atât la pH neutru cât și bazic (al BGE-ului), comparativ cu selectorii chirali β-CD și HP-β-CD, care sunt CDs neutre.

În concluzie, în urma experimentelor efectuate, selectorul chiral Captisol® poate fi cu succes utilizat la separarea enantiomerilor a mai multor tipuri de molecule optic active din diverse clase farmacologice. Metodele dezvoltate pot fi utilizate cu succes la determinarea purității enantiomerilor unui număr mare de substanțe farmaceutice cu o rezoluție bună și un timp scurt de analiză [93].

Separarea enantiomerilor cetirizinei prin ECZ

Acest studiu este centrat pe o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, fără a fi o temă proprie de cercetare, la publicarea rezultatelor având calitatea de coautor. Obiectivul principal propus în acest studiu a fost dezvoltarea unei noi metode electroforetice de separare a enantiomerilor cetirizinei, un antihistaminic H1 din generația a 2-a [94]. În continuare sunt prezentate succint rezultatele acestui studiu.

Cetirizina sau acidul (R,S)-[2-[4-[(4clorofenil)fenilmetil]-1-piperazinil]etoxi] acetic (Figura 3.8), este un compus optic activ, enantiomerul R, fiind cunoscut a avea o afinitate față de receptori de 30 de ori mai mare decât enantiomerul S. În consecință, controlul enantiomeric al produselor farmaceutice care conțin cetirizină este o necesitate.

Metoda propusă în acest studiu s-a bazat pe testarea unui număr de șase CDs, atât native cât și derivatizate ca selectori chirali.

Figura 3.8. Structura chimică a cetirizinei (*-marchează atomul de carbon chiral).

Cetirizina prezintă trei valori pKa1 2,2 pKa2 2,9 și pKa3 8,0 deoarece are trei grupe ionizabile în structură. Astfel, în funcție de pH, poate adopta o formă anionică, cationică sau amfiionică. Utilizându-se mai multe tipuri de BGE, compusul poate fi detectat pe întregul interval de pH testat, între valorile 2,5 – 11. BGE optim a fost alcătuit din hidrogenofosfat disodic 25 mM și dihidrogenofosfat monosodic 25 mM (1:1). Aditivii organici care au fost testați, metanolul și acetonitrilul, nu au influențat pozitiv separarea. Dintre CDs utilizate preliminar doar SBE-β-CD a interacționat chiral cu cetirizina la pH 7,0. Concentrația optimă de CD a fost selectată 5 mM.

Metoda ECZ a fost optimizată prin varierea și selectarea parametrilor sistemului electroforetic cei mai importanți: tensiunea aplicată, temperatura în caseta capilarului și presiunea de injectare.

O separare eficientă a fost obținută cu următoarele condiții de lucru selectate: injectare hidrodinamică, tensiunea aplicată +20 kV, temperatura 20°C, presiunea de injectare 50 mbar/ 1 s, concetrația de cetirizină 5 µg/ml, detecția UV la lungimea de undă, λ 230 nm) (Figura 3.9).

Ordinea de migrare a enantiomerilor a fost determintă prin injectarea amestecului racemic îmbogățit cu enantiomerul pur, primul semnal aparținând enantiomerului R.

Performanțele analitice ale metodei au fost evaluate în termeni de liniaritate, precizie și limite de detecție (Tabelul 3.5).

Tabelul 3.5. Valorile curbelor de calibrare și LOD și LOQ pentru separarea chirală a enantiomerilor cetirizinei (domeniul de concentrații 2,5 – 50 µg/ml).

Repetabilitatea (3 zile, 6 experimente) și precizia intermediară (3 zile, 6 experimente), au avut valori DSR% calculate cuprinse între 0,75 și 1,90.

Figura 3.9. Electroforegrama separării enatiomerilor cetirizinei. Condiții de separare: hidrogenofosfat disodic 25 mM și dihidrogenofosfat monosodic 25 mM (1:1) + SBE-β-CD 5 mM, pH 7,0, tensiunea aplicată +20 kV, temperatura din caseta capilarului 20°C, presiunea de injectare 50 mbar/1 s, capilar 48 cm lungime totală (40 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrația cetirizină 5 µg/ml, λ 230 nm.

Metoda de determinare a enantiomerilor cetirizinei a fost testată și pe un produs comercial (comprimate de 10 mg); conținutul acestora s-a determinat a fi între 9,85 ± 0,20 mg (media ± DS, 6 determinări), în concordanță cu concentrația de pe eticheta.

Această metodă optimizată a demonstrat potențialul electroforezei capilare pentru separarea cantitativă a compușilor optic activi în industria farmaceutică. În același timp subliniază adecvarea SBE-β-CD ca selector chiral în separarea cetirizinei [94].

Separarea enantiomerilor sotalolului prin ECZ

Lucrarea este o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, fără a fi o temă proprie de cercetare, la publicarea rezultatelor având calitatea de coautor. Obiectivul propus în acest studiu a fost dezvoltarea unei noi metode electroforetice de separare a enantiomerilor sotalolului, unui compus din clasa β-blocantelor, frecvent prescris în terapie [95].

Sotalolul este (N[4-[(1RS)-hidroxi-2-[(1-metiletil)amino]etil]fenil]-metansul-fonamida (Figura 3.10), un β-blocant non-selectiv hidrofilic, care este oficial în Farmacopeea Europeană în vigoare sub formă de sare (clorhidrat) și care, adesea este catalogat ca antiaritmic din clasa a III-a de antiaritmice, deși efectele îl încadrează în clasa a II-a de antiaritmice, așa cum sunt încadrate uzual β-blocantele.

Figura 3.10. Structura chimică a sotalolului (*-marchează atomul de carbon chiral).

Sotalol este un amestec racemic ai cărui enantiomeri prezintă proprietăți farmacologice diferite: enantiomerul S(+) este asociat cu scăderea ritmului inimii în timp, având o afinitate de 30-60 de ori mai mică față de receptorii β-adrenergici fiind un blocant al canalelor de potasiu; acțiunea enantiomerului R(-) este blocarea efectelor care contribuie la scăderea frecvenței cardiace prin prin efectul β-blocant al receptorilor β-adrenergici dar și prin blocarea canalelor de potasiu. Astfel, enantiomerul R(-) al sotalolului ar fi mult mai eficient în terapie ca izomer pur, decât amestecul racemic.

În experimentele preliminare au fost testați mai mulți BGE, la diferite valori de pH. A fost selectat un BGE acid, respectiv 25 mM acid fosforic, care a fost și oconsecință a celor două valori pKa ale sotalolului (pKa 8,3 pentru substituentul sulfonamidic și pKa 9,8 pentru gruparea amino secundară).

Pentru separarea celor doi enantiomeri s-a optat pentru utilizarea de CDs. Astfel, după testarea a diferite CDs a fost considerată adecvată ca selector chiral β-ciclodextrina metilată aleator, RAMEB, în concentrație de 30 mM. S-a verificat eficența separării electroforetice în diferite condiții de pH, selctându-se o valoare de pH 2,5. Creșterea concentrației BGE și adăugarea de adititivi organici (metanol, acetonitril) nu a condus la îmbunătățirea separării. În scopul optimizării metodei s-au variat și parametrii sistemului electroforetic și anume: tensiunea aplicată, temperatura în caseta capilarului și presiunea de injectare.

O separare eficientă a fost obținută cu următoarele condiții de lucru selectate: injectare hidrodinamică, BGE acid fosforic 25 mM + RAMEB 30 mM, pH 2,5, tensiunea aplicată +25 kV, temperatura 15°C, presiunea de injectare 50 mbar/ 2 s, concetrația de sotalol 10 µg/ml, lungimea de undă λ 232 nm) (Figura 3.11.).

Performanțele analitice ale acestei metode ECZ au fost verificate (Tabelele 3.6-3.7), utilizându-se S-propanol ca standard intern.

Figura 3.11. Electroforegrama separării enatiomerilor sotalolului. Condiții de separare: BGE acid fosforic 25 mM + RAMEB 30 mM, pH 2,5, tensiunea aplicată +25 kV, temperatura din caseta capilarului 15°C, presiunea de injectare 50 mbar/2 s, capilar 48 cm lungime totală (40 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrația sotalol 10 µg/ml, λ 232 nm.

Tabelul 3.6. Valorile curbelor de calibrare și LOD/LOQ pentru separarea chirală a enantiomerilor sotalolului (domeniul de concentrații 2,5 – 50 µg/ml).

Tabelul 3.7. Valorile timpilor de migrare și valorile DSR% pentru separarea chirală a enantiomerilor sotalolului (domeniul de concentrații 2,5 – 50 µg/ml) (DSR – deviația standard relativă)

S-a testat aplicabilitatea metodei și pentru determinarea enantiomerilor sotalolului dintr-un produs farmaceutic. Recuperarea substanței active a fost între 98,5 -101,5%, demonstrându-se că această metodă poate fi utilizată cu succes în analizele din industria farmaceutică.

Metoda ECZ dezvoltată și optimizată pentru determinarea și separarea enantiomerilor sotalolului, cu ajutorul selectorului chiral RAMEB, este o metodă electroforetică relativ simplă, rapidă, specifică și accesibilă, care poate fi utilizată cu succes în analizele de laborator ale sotalolului din industria farmaceutică [95].

Utilizarea ciclodextrinelor în separarea enantiomerilor unor β-blocanți

Studiul este centrat pe o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, la publicarea rezultatelor având calitatea de coautor. Obiectivul principal al acestui studiu a fost dezvoltarea de metode rapide, simple și eficiente pentru separarea chirală a unor compuși utilizați frecvent în terapie, din clasa β-blocantelor, printr-un screening sistematic al mai multor tipuri de CDs, care au fost alese ca selectori chirali [96]. Sunt aduse în prim plan trei aspecte esențiale și anume: structura chimică a analitului, efectele produse prin modificarea parametrilor sistemului electroforetic și structura chimică a selectorului chiral.

Clasa β-blocantelor este o clasă particulară din punct de vedere stereochimic, deoarece majoritatea reprezentanților sunt compuși optic activi și prezintă cel puțin un atom de carbon asimetric în structură. Există și reprezentanți care au în structura chimică doi atomi de carbon asimetrici și în consecință au 4 stereoizomeri, de exemplu labetalol, compus care este cuprins în acest studiu.

În total au fost selectați ca analiți un număr de 9 compuși din clasa β-blocantelor: (R,S)atenolol, (R,S)fumarat de bisoprolol, (R,S)carvedilol, (R,R´,S,S´)clorhidrat de labetalol, (R,S)tartrat de metoprolol, (R,S)clorhidrat de oxprenolol, (R,S)pindolol, (R,S)clorhidrat de propranolol și (R,S)clorhidrat de sotalol. Cinci dintre compușii enumerați mai sus au avut și enantiomeri puri pentru studiu: (S)atenolol, (S)carvedilol, (R)propranolol, (S)clorhidrat de sotalol, și (S)tartrat de metoprolol.

Selectorii chirali au fost mai multe tipuri de CDs: native neutre (α-CD, β-CD și γ-CD), derivatizate neutre (HP-β-CD și RAMEB), anionice (carboximetil-β-CD sare de sodiu, CM-β-CD și SBE-β-CD sare de sodiu). Preliminar au fost stabilite prin experimente de încercare BGE-urile și valorile de pH adecvate fiecărui compus, fără adaos de CD, apoi a fost selectat un singur BGE la care au fost adăugate cantități mici de CDs. Astfel, au fost adecvate pentru șase compuși HP-β-CD (atenolol, carvedilol, labetalol, oxprenolol, propranolol, sotalol) și RAMEB pentru toți cei nouă compuși luați în studiu.

În experimentele cu CDs anionice la pH puternic acid nu au fost detectate semnalele analitice ale compușilor; fluxul electroosmotic (FEO) prea slab nu a compensat mobilitatea electroforetică negativă a CDs încărcate electric care interacționează puternic cu β-blocantele. CDs anionice au demonstrat că sunt selectori chirali eficienți doar la un pH cu valoarea mai mare de 5, cele mai bune rezultate fiind obținute la pH 7,0. Interacțiunile stereoselective au fost observate la pH 7,0, în cazul a opt compuși (atenolol, bisoprolol, carvedilol, metoprolol, oxprenolol, pindolol, propranolol, sotalol) când a fost utilizată CM-β-CD, și doar în cazul a șase compuși (bisoprolol, carvedilol, labetalol, metoprolol, oxprenolol, sotalol), când a fost utilizată SBE-β-CD.

Optimizarea metodelor electroforetice a constat în selectarea concentrației optime de 50 mM a BGE, selectarea concentrației CDs (în funcție de compus), tensiunea aplicată de +25 kV, temperatura de 15°C și presiunea de injectare de 50 mbar/1 s. Rezultatele obținute în termeni de rezoluție și factor de separare sunt cuprinse în Tabelul 3.8.

Tabelul 3.8. Datele separărilor chirale ale compușilor β-blocanți selectați: tipul și concentrația de CD, pH-ul BGE, timpii de migrare ai enantiomerilor (T1 și T2), rezoluția – R și factorul de separare – α.

Așa cum era de așteptat, compușii similari structural au avut interacțiuni similare cu CDs. Având patru stereoizomeri, labetalolul nu a fost enantioseparat în nici una din condițiile studiate, rezultând doar două semnale analitice.

Ordinea de migrare a enentiomerilor a fost determinată cu ajutorul enantiomerilor puri. Nu totdeauna ordinea de migrare a enantiomerilor a fost identică (exemplu compușii carvedilol și sotalol au avut o ordine de migrare a izomerilor diferită de propranolol, metoprolol și atenolol).

Separarea chirală este direct corelată cu interacțiunile care au loc între diferitele tipuri de CDs și cei doi enantiomeri, sau mai mulți enantiomeri ai analitului. Astfel, cu cât afinitatea CD este mai mare, cu atât va fi mai mică mobilitatea electroforetică a enantiomerului. Un timp de migrare scurt al unui enantiomer indică faptul că acesta a avut interacțiuni minime cu selectorul chiral, spre deosebire de cel de al doilea enetiomer, ale cărui interacțiuni cu selectorul chiral sunt mult mai puternice.

Dezvoltarea de noi metode analitice enantioselective este strâns legată de dezvoltarea moleculelor optic active în industria farmaceutică. Metoda EC aduce numeroase avantaje în strategia de separare chirală analitică a unor reprezentanți importanți din clasa β-blocantelor, prin flexibilitatea în ceea ce privește selectorii chirali, tipurile de BGE și parametrii interni ai sistemului electroforetic. În mod particular, ECZ demonstrează că este o metodă rapidă, specifică, sigură și economică, ce poate fi utilizată cu succes în analizele stereochimice calitative și cantitative ale compușilor din clasa β-blocantelor [96].

Studiu de tip review: considerații analitice asupra enantioseparării fluoxetinei

În acest studiu cu titlul “Analytical methodologies for the stereoselective determination of fluoxetine: an overview”[97], realizat în colaborare (calitatea de autor principal), obiectivul principal a fost de a realiza o sistematizare a tehnicilor analitice utilizate pentru determinările chirale ale fluoxetinei și norfluoxetinei.

Fluoxetina sau (±)-N-metil-3-fenil-3-[4-(trifluorometil)fenoxi]propan-1-amina (Figura 3.12), un inhibitor al recaptării serotoninei, este unul dintre cele mai prescrise medicamente din lume pentru tratamentul depresiei [92].

Într-o primă parte introductivă sunt prezentate date relevante legate de intrarea fluoxetinei în terapie, mecanismul de acțiune, date farmacocinetice, dar și despre proprietățile stereochimice (Figura 3.6).

Figura 3.12. Enantiomerii fluoxetinei și metabolitului său, norfluoxetina..

Este subliniat faptul că în terapie, fluoxetina este utilizată în produsele farmaceutice sub formă de amestec racemic, deși potența celor doi metaboliți activi ai norfluoxetinei, enantiomeri, este diferită. S-norfluoxetina este un enantiomer mult mai potent decât R-norfloxetina. Rata metabolică și clearence-ul, timpul de înjumătățire ale celor doi enantiometaboliți sunt diferite. Polimorfismul enzimelor CYP2C9 și CYP2D6 are probabil un rol important în cinetica stereoselectivă a enantiomerilor fluoxetinei.

Pe baza diferențelor exprimate de cei doi enantiomeri și enantiometaboliți s-a conturat necesitatea analizei stereochimice a acestor compuși, atât în studiile farmacocinetice cât și în industria farmaceutică. Paleta de metode stereoselective cunoscute până în prezent include metodele HPLC, gaz cromatografia (GC) și EC, care sunt raportate în peste 60 de referințe bibliografice.

Metodele de separare chirală HPLC, care fac parte din numeroase studii publicate în ultimii douăzeci și cinci de ani, au fost comentate din punct de vedere al performanțelor, avantajelor și dezavantajelor. Sintetic (formă tabelară), au fost prezentați parametrii de separare ai tuturor metodelor publicate, începând cu anii ´90: fazele mobile, faza staționară chirală, agenții de derivatizare, modul de detecție, tipul de probă, analitul determinat (fluoxetina și/sau norfluoxetina).

Un subcapitol este dedicat metodelor lichid cromatografice cuplate cu spectrometria de masă (LC-MS); aceste metode sunt preferate în analizele chirale deoarece sunt foarte sensibile și robuste, utile pentru determinările calitative și cantitative ale enantiomerilor fluoxetinei din studiile farmacocinetice și toxicologice.

Metodele de separare chirală cu utilizarea GC sunt întâlnite în special în studiile farmacocinetice, au loc pe faze staționare chirale capabile de a forma legături de hidrogen, coordinare sau incluziune, sau utilizând un agent de derivatizare chiral. Un dezavantaj pentru aceste metode este faptul că, atât fluoxetina cât și metabolitul său norfluoxetina, sunt compuși non-volatili.

Metodele EC de separare chirală s-au dezvoltat considerabil în ultimii douăzeci de ani, deoarece reprezintă o alternativă mult mai atractivă prin prisma avantajelor enumerate în capitolul 2.3.1. Cei mai utilizați selctori chirali sunt CDs și derivații acestora, selectori utilizați și în cercetările enumerate anterior (capitolele 3.1.2 – 3.1.6). O sinteză a condițiilor optime electroforetice de separare chirală a fluoxetinei, pe baza studiilor publicate până în prezent, a fost realizată sub formă tabelară și cuprinde: parametrii electroforetici (BGE, pH, tensiune aplicată, temperatură, presiune de injectare, tipul de detecție), selectorii chirali, tipurile de probă, analiții urmăriți.

În concluzia studiului s-a subliniat faptul că separarea enantiomerilor fluoxetinei este o temă de actualitate pentru domeniul de cercetare farmaceutic și deja este recunoscut faptul că activitatea biologică și biodisponibilitatea enantiomerilor (inclusiv ai metabolitului principal) este diferită.

Majoritatea metodelor dezvoltate pentru determinarea cantitativă stereoselectivă a fluoxetinei/norfluoxetinei din probe biologice sunt reprezentate de tehnicile de separare cromatografice, HPLC (inclusiv LC-MS) și GC. Aceste tehnici cromatografice permit determinarea simultană a fluoxetinei dar și a metabolitului activ, norfluoxetina, cu specificitate și sensibilitate înaltă, și sunt adecvate pentru aplicațiile din studiile clinice și toxicologice. Metoda EC a devenit o alternativă pentru unele aplicații deoarece aduce o eficiență bună a separării, timp scurt de analiză și costuri reduse (probe, selectori chirali, reactivi, solvenți).

Astfel, atât metodele cromatografice cât și cele electroforetice sunt adecvate pentru enantiosepararea fluoxetinei/norfluoxetinei din diferite tipuri de probe (formulări farmaceutice, probe de mediu, probe biologice). Separările chirale EC sunt mai puțin costisitoare decât separările chirale HPLC, în care în primul rând coloanele de separare sunt scumpe și cu o durată de viață limitată; în plus, în HPLC sunt necesare volume mari de solvenți. În metodele EC selectorul chiral se adaugă direct în BGE iar volumele probelor și volumele BGE sunt foarte mici. Totuși, metodele de separare chirală HPLC versus metodele EC, sunt mult mai sensibile și în general oferă o bună rezoluție a enantioseparării [97].

Optimizarea și validarea unor metode de electroforeză capilară

O direcție de cercetare proprie a fost dezvoltarea, optimizarea și validarea unor metode de analiză EC destinate mai multor tipuri de compuși de interes farmaceutic, care pot fi utilizate cu succes în analiza calitativă și cantitativă.

Determinarea unor inhibitori de aromatază prin ECZ

Studiul abordează o temă de cercetare proprie, care se află în proces de publicare (under review). Obiectivul principal al studiului este elaborarea unei metode noi, simple, rapide și accesibile de ECZ pentru determinarea a trei inhibitori de aromatază (anastrozol, letrozol și exemestan) cu aplicații în determinarea compușilor din produse farmaceutice și probe biologice. Astfel, o metodă simplă, validată de ECZ poate fi utilă și în analiza produselor contrafăcute cu inhibitori de aromatază, utilizate de atleții care se dopează.

Anastrozol și letrozol sunt inhibitori de aromatază nesteroidieni, aromataza fiind enzima implicată în sinteza hormonilor estrogeni. Exemestan este un inhibitor de aromatază ireversibil cu structură steroidiană. Acești compuși sunt utilizați în tratamentul cancerului de sân [98], dar și off label în tratamentul infertilității masculine produsă de deficiența de LH (obezitatea morbidă și hipogonadismul indus de steroizi anabolizanți) [99-101].

Cei trei inhibitori de aromatază selectați sunt incluși pe lista substanțelor interzise a Agenției Mondiale Anti-Doping (World Anti-Doping Agency, WADA) [102]. De asemenea, sunt utilizate în combinație cu steroizi anabolizanți pentru a preveni instalarea ginecomastiei prin exces de estrogeni; inhibitorii de aromatază sunt utilizați de atleții dopați, ca terapie post-ciclu, pentru a produce refacerea integrității axei hipotalamo-pituitare-testiculare [103,104].

Structurile chimice și principalele caracteristici fizice sunt prezentate în Tabelul 3.9.

Tabelul 3.9. Structura chimică și proprietăți fizice ale inhibitorilor de aromatază luați în studiu [3, 32,109-112].

Mai multe metode electroforetice au fost publicate pentru determinarea unor inhibitori de aromatază cu alți compuși, dar în principal prin ECM (MEKC), până acum nefiind publicate metode electroforetice care să se adreseze celor trei compuși simultan [105-108].

În toate experimentele din acest studiu a fost preferată injectarea hidrodinamică a probei (injectarea probei la capătul anodic al capilarului cu detecția la capătul catodic). Detectarea semnalelor analitice s-a înregistrat la lugimile de undă 219 nm, 240 nm, 247 nm și 270 nm, valori care sunt maximele de absorbție înregistrate ale analiților (anastrozol, letrozol și exemestan) și a standardului intern (ciprofloxacina).

La începutul fiecărei zile capilarul a fost condiționat cu soluție de NaOH 1M (30 minute), apă deionizată (5 minute) și BGE (20 minute). Înainte de fiecare experiment capilarul a fost precondiționat cu apă deionizată (1 minut) și BGE (2 minute).

Soluțiile stoc ale celor trei compuși au fost preparate zilnic prin dizolvarea substanței în metanol, obținându-se concentrația de 1 mg·ml-1. În timpul zilei au fost păstrate în frigider, la temperatura de +4°C, apoi diluate în concentrațiile necesare experimentelor.

Probele proaspete de urină și plasmă au fost obținute de la diferiți voluntari sănătoși; o probă clinică de urină a fost obținută de la un voluntar bărbat (45 ani) căruia i-a fost administrat un comprimat de 5 mg letrozol, apoi urina a fost colectată timp de 10 ore. Urina și plasma au fost îmbogățite cu letrozol din soluție stoc, centrifugate (4800 rotații/minut, 10 minute) iar supernatantul filtrat (filtru Whatman 0,45 µm). Proba clinică de urină a fost concentrată cu rotatevaporatorul la 40 °C sub vacuum, centrifugată (4800 rotații/minut, 10 minute) iar supernatantul filtrat. Procentul de solvent (metanol) a fost identic în toate probele de urină, în raportul solvent:urină de 1:4 (volume).

În studiile experimentale preliminare, care s-au bazat și pe informații din studii anterior publicate, a fost selectat ca BGE, tetraboratul de sodiu 25 mM (pH 9,3) [105-108] după care s-a trecut la etapa de optimizare a metodei electroforetice prin utilizarea de aditivi care s-au adăugat în BGE: solvenți organici, surfactanți, β-CDs. Adăugarea de cantități mici de solvenți organici (metanol, acetonitril, n-propanol, DMF) în BGE a crescut timpul de migrare al analiților fără să apară o îmbunătățire a rezoluției.

De asemenea, adăugarea de dodecilsulfat de sodiu (DSS), un surfactant anionic, nu a crescut rezoluția. Cei trei analiți, deși se află în forma neutră, au migrat cu aceeași mobilitate electroforetică. Au fost testate mai multe tipuri de CDs, native și derivatizate, ca aditivi în BGE: β-CD, HP-β-CD, CM-β-CD și SB-β-CD. Adăugarea acestor CDs (în concentrații de 5 -15 mM) în BGE a îmbunătățit separarea celor trei compuși. Datorită experimentelor încurajatoare s-au testat inclusiv sisteme duale cu CDs. Combinarea unei CDs cu DSS nu a crescut eficiența separării anastrozolului, letrozolului și exemestanului. Cele mai bune rezultate au fost obținute cu CM-β-CD în concentrație de 5mM.

Concetrația optimă a BGE stabilită în prezența CM-β-CD a fost setată la 100 mM. În metoda ECZ pH-ul BGE este foarte important pentru că afectează ionizarea analiților și mobilitatea lor electroforetică. Toate microspeciile majore ale celor trei compuși se află în forma neutră în limitele de pH 4- 13, după calculele efectuate cu MarvinSketch 17.1.2 (ChemAxxon)[113]. Variind valoarea pH-ului BGE între limitele 8,3 -10,4 nu au fost observate modificări semnificative.

A fost optimizată și influența celor mai importanți parametri interni ai sistemului electroforetic. Tensiunea aplicată a fost selectată ca optimă la +25 kV și temperatura în caseta capilarului la 25°C. Presiunea de injectare cea mai adecvată a fost la 20 mbar/ 2 s. Astfel, cei trei inhibitori de aromatază, anastrozol, letrozol și exemestan, au fost separați în mai puțin de 10 minute (Figura 3.13). Confirmarea identității semnalelor a fost efectuată prin compararea timpilor de migrare individuali ai analiților și compararea spectrelor UV obținute cu detectorul DAD UV ale sistemului electroforetic cu cele date de soluțiile standard.

Este cunoscut faptul că mobilitatea electroforetică este strâns legată de sarcina electrică și masa moleculară (μpH vs. q/Mα). Metode semiempirice descriu această relație care diferă prin valoarea lui α (α este 1/3 în legea lui Stoke și 2/3 în legea lui Offord [114]. Masele moleculare ale celor trei compuși sunt foarte apropiate, o diferență notabilă fiind structura chimică steroidiană a exemestanului. Este cunoscut deja faptul că exemestanul formează complecși cu derivați de β-CD [115-117]. De aceea, este foarte probabil ca exemestanul, în condițiile electroforetice date, poate forma un complex mai solubil cu CM-β-CD adăugată în BGE, explicându-se timpul de migrare mai lung.

Deși anastrozolul și letrozolul sunt compuși similari structural, există diferențe în ceea ce privește forma moleculară și abilitatea de a se asocia cu CM-β-CD [118].

Tabelul 3.10. Parametri de separare electroforetici ai celor trei inhibitori de aromatază selectați

(T – timpul de migrare, A – aria, H – înălțimea, Sim. – simetria, R – rezoluția, Sel. – selectivitatea).

Figura 3.13. Separarea anastrozolului, letrozolului și exemestanului prin metoda ECZ pentru ei trei inhibitori de aromatază (parametri de separare: BGE tetraborat de sodiu 100 mM + CM-β-CD 5 mM, tensiunea aplicată +25 kV, temperatura 25°C, presiunea de injectare 20 mbar/ 2 s, capilar 60 cm lungime totală/52cm lungime efectivă, 50 µm diametru intern); ANA – anastrozol, LET – letrozol, EXE – exemestan, EOF – flux eletroosmotic.

Metoda optimizată a fost validată (parametrii de validare: specificitatea, liniaritatea și limitele de detecție și precizia); ca standard intern a fost utilizată ciprofloxacina, o fluorochinolonă antibacteriană, un compus stabil în BGE-ul selectat [119]. Metoda permite detectarea celor trei inhibitori de aromatază dintr-un amestec prin măsurarea cantitativă a unui parametru (aria semnalului obținut). Cei trei compuși nu interferează cu alte componente prezente în sistemul electroforetic.

Ecuațiile liniare de regresie au fost calculate utilizând șase nivele de concentrații cu trei replicate pe concentrație. Coeficientul de corelare a fost mai mare de 0,99, demonstrând o foarte bună liniaritate a metodei. Valorile LOD și LOQ au fost calculate pe baza erorii standard a regresiei ecuației de calibrare Sy/x, prin interceptul ecuației de calibrare când ecuația dobândește formula LOD = 3 Sy/x / b, iar LOQ = 10 Sy/x / b, unde b este panta ecuației de regresie (arie pic = b x concentrație + c) (Tabelul 3.11) [120].

Tabelul 3.11. Linearitatea medodei – parametri statistici (T = timpul de migrare, A = aria).

Precizia a fost estimată pe baza repetabilitații și preciziei intermediare pentru timpii de migrare ai celor trei compuși în acord cu standardul ICH [120]. Măsurătorile au fost efectuate repetând șase injectări a trei concentrații diferite, trei zile consecutiv, pentru anastrozol, letrozol și exemestan (Tabelul 3.12).

Tabelul 3.12. Precizia în cursul unei zile (intra-day) și între zile (inter-day) a metodei ECZ

(T = timpul de migrare, A = aria), n = numărul de repetări.

Aplicabilitatea metodei ECZ dezvoltate pe probe biologice s-a bazat pe datele de biotransformare ale letrozolului. Letrozolul este eliminat prin urină aproximativ 70% nemetabolizat din doza administrată (6,0 ± 3,8%) sau ca glucuronat al metabolitului inactiv carbinol (CGP44645) (64,2 ± 22,7%) [121,122]. Date similare au fost obținute la administrarea unei singure doze de letrozol (2,5 mg) marcată cu C14 iar în două săptămâni radioactivitatea recuperată din urină a fost 88,2 ± 7,6% (5,0 ± 2,4% letrozol nemetabolizat, 63,2 ± 11,2% glucuronat de carbinol și aproximativ 8% alți metaboliți) [123]. Performanțele analitice ale metodei au fost evaluate din urină obținută de la voluntari sănătoși, la care s-a adăugat standard de letrozol. Astfel, letrozolul poate fi cuantificat din probele de urină îmbogățite cu letrozol fără a fi interferat de alte componente (Figura 3.14).

Liniaritatea și limitele de detecție pentru aceste probe sunt redate în Tabelul 3.13. Ecuația liniară de regresie a fost calculată utilizând șase nivele de concentrații și trei repetări ale experimentului fiecărei concentrații. Coeficientul de corelație a fost mai mare de 0,99 demonstrând o foarte bună liniaritate a metodei.

Tabelul 3.13. Linearitatea metodei – parametri statistici la determinarea letrozolului din probe de urină cu adaos de standard de letrozol.

Datele care susțin precizia metodei sunt redate în Tabelul 3.14.

Tabelul 3.14. Precizia în cursul unei zile (intra-day) și între zile (inter-day) a metodei ECZ pentru determinarea letrozolului din probe de urină cu adaos de letrozol

(T = timpul de migrare, A = aria), n = numărul de repetări.

Deși rezultatele determinării cantitative a letrozolului din urină, respectiv plasmă cu adaos de letrozol au fost încurajatoare, determinarea letrozolului dintr-o probă clinică (probă concentrată de urină) nu a avut succes datorită sensibilității prea scăzute a metodei (Figura 3.15).

Notabil este faptul că metoda dezvoltată, optimizată și validată este acceptabil performantă în ceea ce privește selectivitatea și mărimea timpului de migrare al analiților, din perspectiva unei metode de EC. În consecință, sunt necesare studii care să obțină îmbunătățiri ale acestor parametri precum și a prelucrării probelor biologice.

În cazul probelor de plasmă la care s-a adăugat exemestan, electroforegramele au prezentat interferențe date de componenții plasmei (Figura 3.16).

Figura 3.14. Electroforegramele letrozolului (LET) din soluție stoc (stock), urină îmbogățită cu standard de letrozol (spiked urine)(200 µg ml-1) și martor de urină (blank urine) prelucrat în condițiile probei îmbogățite, cu parametri electroforetici optimizați; EOF – fluxul electroosmotic.

Figura 3.15. Electroforegramele letrozolului (LET) din proba clinică (urină concentrată, concentrated urine) comparativ cu proba de urină cu adaos de letrozol (spiked urine) (200 µg ml-1) utilizând parametrii electroforetici optimizați; EOF – fluxul electroosmotic.

S-a testat și aplicabilitatea metodei din produse farmaceutice. Pentru determinarea celor trei compuși din produse farmaceutice, un număr de 20 de comprimate au fost cântărite și triturate din fiecare produs. În cazul anastrozolului și letrozolului, un echivalent a 10 mg substanță activă a fost cântărit cu precizie și transferat într-un balon cotat de 100 ml, în care s-au adăugat 50 ml metanol. Balonul a fost introdus în baia de apă cu ultrasunete, timp de 30 de minute, adus la semn cu metanol și apoi conținutul a fost filtrat, obținându-se o soluție de concentrație 100 µg·ml-1 [124].

Figure 3.16. Electroforegramele exemestanului (EXE) din soluție stoc (stock), plasma cu adaos de exemestan (spiked plasma)(0,67 mg ml-1) și proba de plasmă martor (blank plasma), prelucrată în condițiile probei de plasmă cu adaos de exemestan, utilizând parametri electroforetici optimizați. EOF – fluxul electroosmotic.

În cazul exemestanului, din pulberea obținută, un echivalent de 400 mg a fost cântărit cu precizie și transferat într-un balon cotat, similar preparării soluțiilor cu conținut de anastrozol și letrozol. S-a calculat conținutul celor trei compuși și DS (Tabelul 3.15). Pe baza acestor rezultate putem afirma că metoda ECZ dezvoltată și optimizată poate fi utilizată pentru determinarea celor trei compuși luați în studiu din produse farmaceutice.

Tabelul 3.15. Recuperarea anastrozolului, letrozolului și exemestanului din produse farmaceutice

(media a trei determinări).

În concluzie, metoda ECZ dezvoltată și validată din acest studiu, poate fi utilizată pentru separarea, identificarea și determinarea cantitativă a unor compuși importanți din clasa inhibitorilor de aromatază: anastrozol, letrozol și exemestan.

Metoda este simplă, sigură, utilizând un BGE particular, tetraborat de sodiu cu o CD ca aditiv, respectiv CM-β-CD. Utilizând această nouă metodă ECZ se pot cuantifica anastrozolul, letrozolul și exemestanul din produse farmaceutice; o aplicație posibilă este determinarea celor trei compuși din produse contrafăcute.

În plus, această metodă prezintă și potențial pentru analiza probelor biologice. Astfel, cu această metodă ECZ s-a determinat letrozolul din probe de urină cu adaos de letrozol, fără a fi supuse unui tratament special, un pas încurajator care demonstrează că această metodă poate fi optimizată și pentru analizele din probe biologice.

Dezvoltarea de metode de analiză a inhibitorilor de aromatază face parte din tema de cercetare a proiectului de tip Grant Intern al Universității de Medicină și Farmacie din Tîrgu Mureș, Nr. 17/23.12.2014.

Metode validate de determinarea a letrozolului (ECZ și spectrofotometrie UV)

Studiul abordează o temă de cercetare proprie, ale cărui rezultate au fost publicate, având calitatea de prim autor. Obiectivul principal al studiului este elaborarea unor metode, simple, rapide și accesibile de ECZ și spectrofotometrie UV pentru determinarea letrozolului din produse farmaceutice și probe biologice [125].

Date privind importanța letrozolului în terapie, apartenența la clasa de inhibitori de aromatază precum și proprietăți fizico-chimice ale acestei molecule active au fost abordate în capitolul anterior (3.2.1). Metabolizarea și eliminarea letrozolului sunt prezentate schematic în Figura 3.17.

A) Determinarea letrozolului prin metoda ECZ

Prepararea soluției stoc și a probelor biologice este similară cu cea din capitolul (3.2.1).

Considerații preliminare în ceea ce privește caracterul acido-bazic al letrozolului.

Pentru a dezvolta o metodă de analiză EC este necesară cunoașterea valorii pKa a letrozolului. Deoarece nu există valori pKa publicate ale acestei molecule active în literatura de specialitate, s-au luat în calcul valorile oferite de editorul MarvinSketch 17.1.2 (ChemAxon) [113,126] și anume pKa = 1,89. Letrozolul poate accepta protoni la atomii de azot din ciclul triazolic. Totuși, majoritatea microspeciilor în domeniul de pH 5- 13 sunt neutre (în proporție de 100%).

Deja se cunoaște faptul că pentru metoda convențională ECZ, un BGE de tip acid (acid fosforic) sau bazic (tetraborat de sodiu) poate fi considerat adecvat pentru experimentele preliminare, deoarece nu absoarbe lumină UV la lungimea de undă de detecție [127].

Figura 3.17. Schema metabolizării letrozolului (-O-Gluc rest de acid glucuronic) [125].

BGE-ul acid fosforic 25 mM testat a fost eliminat deoarece semnalul letrozolului era slab (valoare mică a ariei și înălțimii peak-ului). A fost selectat BGE-ul standard, tetraborat de sodiu 25 mM pe baza observațiilor experimentale dar și a studiilor de EC publicate anterior [105-108].

Dezvantajul constatat a fost faptul că timpul de migrare al letrozolului era foarte aproape de timpul la care apărea FEO. În astfel de situații, acest dezavantaj este eliminat prin adăugarea unui surfactant în BGE. La adăugarea de DSS în BGE nu s-a observat o modificare a timpului de migrare versus FEO.

În scopul îmbunătățirii performanțelor metodei s-au optimizat parametrii externi caracteristici (concentrația BGE și pH-ul BGE) precum și parametrii interni specifici sistemului electroforetic (tensiunea aplicată, temperatura, presiunea și timpul de injectare). Concentrația optimă a BGE tetraborat de sodiu a fost selectată ca fiind 90 mM, la această valoare obținându-se cea mai bună înălțime, arie și simetrie a peak-ului analitului. Valoarea de pH optimă a fost setată la 9,36. Tensiunea optimă aplicată a fost stabilită la +20 kV iar temperatura din interiorul casetei capilarului a fost setată la 50°C. Modul de injectare utilizat a fost hidrodinamic cu o presiune mare de injectare de 50 mbar / 2 s, care s-a dovedit cea mai adecvată, evitându-se spargerea sau lățirea peak-ului (presiunea de injectare are rol în forma peak-ului înregistrat pe electroforegramă). În aceste condiții optimizate determinate, letrozolul poate fi determinat foarte rapid, în mai puțin de două minute (Figura 3.18), în prezența standardului intern, ciprofloxacina.

Figura 3.18. Letrozol – determinare prin metoda ECZ (standard intern ciprofloxacina). Condiții de separare: BGE tetraborat de sodiu 90 mM, pH 9,36, tensiunea aplicată +20 kV, temperatura din caseta capilarului 50°C, presiunea de injectare 50 mbar/2 s, capilar 32,5 cm lungime totală (24,5 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrația letrozol 62,5 µg/ml (concentrație ciprofloxacină 125 µg/ml) , λ 240 nm (LET – letrozol, CIP – ciprofloxacina).

Tabelul 3.16. Parametrii de validare ai metodei ECZ de determinare a letrozolului (domeniul de concentrație: 5 – 875 μg·ml-1, standard intern ciprofloxacina) (T = timpul de migrare, A = aria și H = înălțimea peak-ului, n = număr de repetări).

Figura 3.19. Letrozol – determinare prin metoda ECZ din probă de urină cu adaos de letrozol (standard intern ciprofloxacina). Condiții de separare: BGE tetraborat de sodiu 90 mM, pH 9,36, tensiunea aplicată +20 kV, temperatura din caseta capilarului 50°C, presiunea de injectare 50 mbar/2 s, capilar 32,5 cm lungime totală (24,5 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrația letrozol 25 µg/ml (concentrație ciprofloxacină 50 µg/ml) , detecție UV la λ 240 nm și 279 nm (LET – letrozol, CIP – ciprofloxacina).

S-a validat metoda și s-au calculat parametrii de validare (Tabelul 3.16).

Rezultatele obținute demonstrează că metoda dezvoltată poate fi aplicată pentru identificarea și determinarea cantitativă a letrozolului din materia primă, cu aplicabilitate în industria farmaceutică. Până în prezent metoda ECZ nu a mai fost utilizată pentru analiza letrozolului, fiind utilizată doar varianta ECM (MEKC) [105-108].

S-a testat această metodă ECZ și pentru determinarea letrozolului dintr-un produs farmaceutic. Modul de obținere a soluției de analizat este similar cu modul descris în capitolul (3.2.1). Cantitatea de letrozol din comprimate precum și DS au fost calculate utilizând ecuația de regresie a curbei de calibrare [124].

Recuperarea substanței active din comprimate (%) a fost de 99,63 ± 1,51 (media a trei determinări). Astfel, metoda ECZ dezvoltată are potențial de a pune în evidență dar și de a determina letrozolul din medicamente contrafăcute. Performanțele analitice ale metodei au fost testate și în condițiile în care s-a determinat letrozolul din probe de urină, de la voluntari sănătoși, în care s-a adăugat standard de letrozol. Nu au existat interferențe între letrozol și alți componenți din urină (Figura 3.19).

Metoda a fost validată, verificarea parametrilor de validare fiind redată în Tabelul 3.17.

Tabelul 3.17. Parametrii de validare pentru determinarea letrozolului din probe de urină la care s-a adăugat letrozol, standard intern ciprofloxacina (T = timpul de migrare, A = aria și H = înălțimea peak-ului, n = număr de repetări).

B) Determinarea letrozolului prin metoda spectrofotometrică în domeniul UV

Pentru a compara rezultatele obținute anterior la punctul A) s-a dezvoltat și o metodă simplă, spectrofotometrică în domeniul UV, de determinare a letrozolului, utilă în special pentru analiza formulărilor farmaceutice.

S-au preparat două soluții stoc de letrozol, stoc I (1m/ml) și stoc II (100 µg/ml). Spectrul UV înregistrat în metanol al letrozolului a fost în concordanță cu spectrele publicate anterior în literatura de specialitate [124, 128-130]. Valoarea max a fost determinată la 240 nm. Domeniul de detecție a fost stabilit între 1 – 30 µg/ml.

Concentrațiile care au redat absorbanțele pentru trasarea curbei de calibrare au fost între 5 – 20 µg/ml. În Tabelul 3.18 sunt redate datele care susțin performanțele metodei. Metoda UV spectrofotometrică, așa cum era de așteptat, este o metodă mult mai sensibilă decât metoda ECZ, dezvoltată anterior.

Tabelul 3.18. Parametri metodei de dozare spectrofotometrice în domeniul UV pentru letrozol

(n = număr de determinări).

S-a testat și această metodă din punct de vedere al aplicabilității în determinările de rutină adresate produselor farmaceutice. Recuperarea substanței active din produsul farmaceutic Letrozol (comprimate 2,5 mg; producător Teva) a fost de 97,8 ± 0,098 (media a trei determinări ± DS). Excipienții din comprimate nu au influențat determinările.

În concluzia studiului, metoda ECZ dezvoltată a demonstrat că este o metodă simplă, rapidă și adecvată pentru a identifica și cuantifica letrozolul, un inhibitor de aromatază important în terapie, din materia primă, produse farmaceutice și probe de urină la care s-a adăugat letrozol.

Pentru o comparație a rezultatelor s-a dezvoltat și o metodă spetrofotometrică în domeniul de detecție UV care are aplicabilitate în identificarea și determinarea substanței active din produsele farmaceutice. Aceste metode simple și rapide pot fi utile în analiza letrozolului în industria farmaceutică, studii clinice și au potențial în identificarea produselor contafăcute comercializate on-line, utilizate de atleții care se dopează.

Dezvoltarea celor două metode de analiză a letrozolului, un inhibitor de aromatază, face parte din tema de cercetare a proiectului de tip Grant Intern al Universității de Medicină și Farmacie din Tîrgu Mureș, Nr. 17/23.12.2014.

Analiza comportamentului electroforetic și determinarea unor cefalosporine prin metodele ECZ și ECM

Studiul abordează o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, fără a fi o temă proprie de cercetare, la publicarea rezultatelor având calitatea de coautor.

Obiectivul principal al studiului este dezvoltarea unei metode generale rapide, simple și eficiente pentru separarea simultană a unor reprezentanți din clasa cefalosporinelor (cefaclor, cefadroxil, cefalexina, cefuroxima, ceftazidima și ceftri- axona) [131].

Cefalosporinele fac parte dintr-o clasă de antibiotice foarte utilizată la nivel mondial, în tratamentul a diverselor infecții cu germeni susceptibili (bacterii Gram pozitive și Gram negative), având numeroși reprezentanți în terapie. Din punct de vedere structural sunt antibiotice semisintetice, derivate de la structura cefalosporinei C, compus natural obținut prin biosinteză din specia Cephalosporium acremonium. Nucleul de bază al acestor compuși β-lactamici este acidul 7-aminocefalosporanic (cefemă) substituit (Figura 3.20). Diferențele structurale apar prin substituenții R1 și R2, care sunt diferiți de la compus la compus (Figura 3.21).

Figura 3.20. Structura generală a cefalosporinelor.

Cei șase compuși selectați în acest studiu sunt diverși: fac parte din prima generație, fiind cefalosporine de uz oral (cefalexina, cefadroxil și cefaclor), din cea de a doua generație, de uz parenteral (cefuroxima) și din cea de a treia generație, de uz parenteral (ceftazidima și ceftriaxona).

Figura 3.21. Structurile chimice și denumirile chimice ale cefalosporinelor luate în studiu [132].

Pentru acești compuși reprezentativi selectați s-a dorit dezvoltarea unei metode alternative de analiză diferită de HPLC, mai avantajoasă și mai rapidă. La momentul începutului acestui studiu erau publicate mai multe metode electroforetice care au vizat un număr mai mic sau mai mare de compuși din această clasă de antibiotice β-lactamice, care au fost citate [131]. Deoarece din punct de vedere structural cefalosporinele sunt relativ diferite (nucleul de bază fiind același), uneori, chiar în cadrul aceleiași generații, determinarea simultană a mai multor compuși a reprezentat o adevărată provocare analitică deoarece mobilitățile electroforetice sunt similare.

Experimentele preliminare au vizat mai multe tipuri de BGE (tetraborat, citrat, fosfat) și diferite valori de pH. Cele mai bune rezultate au fost obținute cu BGE tetraborat de sodiu 100 mM la valoarea de pH aproximativ 7. Totuși, curentul din sistemul electroforetic a depășit 100 μA iar rezoluția separării celor șase compuși era nesatisfăcătoare. De aceea, pentru a crește rezoluția separării s-a optat pentru un BGE mixt: hidrogenfosfat disodic (3,55 g/l) și tetraborat de sodiu (5,03 g/l).

S-a testat degradarea în soluție a cefalosporinelor luate în studiu. Este binecunoscut faptul că cefalosporinele hidrolizează cu desfacerea ciclului β- lactamic, de aceea, s-a utilizat un standard intern – clorhidrat de ciprofloxacina în mai multe experimente și s-a stabilit că degradarea compușilor a fost insignifiantă timp de 4 ore de la dizolvare.

Optimizarea metodei ECZ s-a realizat prin manipularea unor parametri externi (concentrația BGE, pH-ul BGE) dar și interni ai sistemului electroforetic (tensiunea aplicată, temperatura în caseta capilarului, presiunea și timpul de injectare). În experimentele cu un BGE mixt, acid fosforic 25 mM – borax 25 mM, și la pH 6,8 s-a realizat separarea celor șase compuși luați în studiu în mai puțin de 10 minute (Figura 3.22).

Figura 3.22. Separarea cefalosporinelor cefadroxil (CFD), cefalexina (CFL), cefaclor (CFC), cefuroxima (CFR), ceftazidima (CZI) și ceftriaxona (CTR) prin metoda ECZ. Condiții de separare: BGE acid fosforic 25 mM – borax 25 mM, pH 6,8, tensiunea aplicată +25 kV, temperatura din caseta capilarului 25°C, presiunea de injectare 50 mbar/3 s, capilar 56 cm lungime totală (48 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrația cefalosporine 25 µg/ml, detecție UV la λ 270 nm.

Rezoluția cea mai mică a prezentat-o grupul de cefalosporine din prima generație, și anume cefadroxil, cefalexina și cefaclorul, cel mai probabil datorită similitudinii structurale. Pentru a elimina acest neajuns, s-a optat pentru utilizarea unui surfactant anionic ca aditiv în BGE, respectiv DSS, modificându-se astfel tipul de EC: separarea analiților are la bază partiția analiților într-un sistem bifazic, faza mobilă apoasă și faza micelară pseudo-staționară. Concentrația optimă de DSS s-a selectat a fi 50 mM. Astfel, modificând BGE prin adaosul de DSS s-a reușit separarea celor șase cefalosporine (Figura 3.23).

Figura 3.23. Separarea cefalosporinelor cefadroxil (CFD), cefalexina (CFL), cefaclor (CFC), cefuroxima (CFR), ceftazidima (CZI) și ceftriaxona (CTR) prin metoda ECM. Condiții de separare: BGE acid fosforic 25 mM – borax 25 mM – DSS 50 mM, pH 6,8, tensiunea aplicată +25 kV, temperatura din caseta capilarului 25°C, presiunea de injectare 50 mbar/3 s, capilar 56 cm lungime totală (48 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrația cefalosporine 25 µg/ml, detecție UV la λ 270 nm.

Pe baza rezultatelor au fost discutate aspecte importante legate de comportamentul electroforetic al compușilor luați în studiu, corelat cu structurile chimice, încărcarea electrică, interacțiunile cu BGE și DSS.

Performanțele analitice ale metodei ECM au fost evaluate (Tabelele 3.19-3.20).

Tabelul 3.19. Valorile timpilor de migrare, mobilităților electroforetice, DSR(100%) pentru timpii de migrare și ariile peak-urilor: cefadroxil (CFD), cefalexina (CFL), cefaclor (CFC), cefuroxima (CFR), ceftazidima (CZI) și ceftriaxona (CTR) prin metoda ECM (Tm – timp de migrare, A – aria peak-ului)

Tabelul 3.20. Ecuațiile de regresie, coeficienții de corelație și valorile limitelor de detecție ale metodei ECM.

Această tehnică electroforetică reprezintă o metodă adecvată pentru analiza cefalosporinelor, ușor de pus în practică. Studiul a adus noutăți în ceea ce privește comportamentul electroforetic al reprezentanților selectați ai cefalosporinelor, informații care pot fi utile în analiza de laborator sau în industria farmaceutică.

Deși în terapie cefalosporinele nu sunt administrate simultan în număr mare, studiul a urmărit dezvoltarea unei metode de analiză generală, care să fie aplicabilă mai multor compuși din această clasă importantă de antibiotice β-lactamice. Pe baza optimizărilor parametrilor specifici, metodele ECZ și ECM (MEKC) pot fi utilizate cu succes la identificarea și determinarea cefalosporinelor din materii prime și produse farmaceutice [131].

Determinarea izoniazidei și rifampicinei prin ECM

Această lucrare are o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, fără a fi o temă proprie de cercetare, la publicarea rezultatelor având calitatea de coautor. Obiectivul principal al cercetării de față este dezvoltarea unei metode de determinare simultană a celor mai uzuale antituberculoase, respectiv rifampicina și izoniazida.

Având în vedere utilizarea extinsă a rifampicinei și izoniazidei (Figura 3.24) în protocoalele de tratament a tuberculozei, dezvoltarea de noi metode analitice, care simultan să se adreseze celor doi compuși, a devenit o necesitate în industria farmaceutică dar și în laboratoarele de cercetare [133].

După experimentele preliminare și testarea unui sistem electroforetic de ECZ, într-o primă etapă s-a reușit separarea izoniazidei de rifampicină. Deoarece izoniazida are o structură chimică particulară cu trei valori pKa (pKa1 specifică atomului de azot hidrazinic, pKa2 specifică atomului de azot piridinic și pKa3 specifică grupării grupării carboxil acide), a avut o migrare electroforetică slabă sau aproape de FEO, la valori de pH ale BGE mai mari de 5. La pH 9,3, în BGE tetraborat de sodiu 25 mM s-a obținut separarea redată de electroforegrama din Figura 3.25.

Figura 3.24. Structurile chimice ale rifampicinei și izoniazidei.

Pe baza acestor rezultate s-a optat pentru folosirea tehnicii de separare ECM (MEKC), cu utilizarea unui aditiv surfactant anionic, DSS. Pentru optimizarea metodei s-au selectat parametrii externi adecvați (concentrația BGE, pH-ul BGE) și s-au setat parametrii interni ai sistemului electroforetic (tensiunea aplicată, temperatura în caseta capilarului, presiunea și timpul de injectare). Astfel, s-a realizat separarea simultană a izoniazidei și rifampicinei, cu un timp de migrare foarte scurt (sub trei minute) (Figura 3.26).

Figura 3.25. Separarea izoniazidei și rifampicinei prin metoda ECZ. Condiții de separare: BGE tetraborat de sodiu 25 mM, pH 9,3, tensiunea aplicată +20 kV, temperatura din caseta capilarului 25°C, presiunea de injectare 50 mbar/1 s, capilar 38,5 cm lungime totală (30 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrație analiți 10 µg/ml, detecție UV la λ 230 nm.

Au fost testate și performanțele analitice ale metodei (Tabelele 3.21- 3.22).

Metoda are aplicabilitate și pentru determinarea celor două substanțe active din produse farmaceutice, de tip combinație (Tabelul 3.23).

Figura 3.26. Separarea izoniazidei și rifampicinei prin metoda ECM. Condiții de separare: BGE tetraborat de sodiu 25 mM – DSS 25 mM, pH 9,3, tensiunea aplicată +20 kV, temperatura din caseta capilarului 25°C, presiunea de injectare 50 mbar/1 s, capilar 38,5 cm lungime totală (30 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrație analiți 20 µg/ml, detecție UV la λ 230 nm.

Tabelul 3.21. Ecuațiile de regresie, coeficienții de corelație și valorile limitelor de detecție ale metodei ECM de separare a izoniazidei și rifampicinei.

Tabelul 3.22. Precizia separării izoniazidei și rifampicinei prin metoda ECM

(n = număr de determinări).

Tabelul 3.23. Recuperarea substanțelor active izoniazida și rifampicina din produse farmaceutice de tip combinație cu metoda optimizată ECM.

În concluzie, ECM este o tehnică de separare versatilă, fiind adecvată determinării simultane a izoniazidei și rifampicinei și poate fi utilizată pentru determinarea celor două substanțe active din produsele farmaceutice [133].

Determinarea unor statine prin ECM

Acest studiu preintă o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, fără a fi o temă proprie de cercetare, la publicarea rezultatelor având calitatea de coautor. Studiul a avut ca obiectiv principal dezvoltarea unei metode generale de determinare simultană a celor mai uzuale statine utilizate în terapie [134].

Sub denumirea generică de „statine” sunt grupați mai mulți compuși, derivați naturali sau sintetici, inhibitori de 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductaza (inhibitori de HMG-CoA reductaza), enzima responsabilă de conversia HMG-CoA la acid mevalonic, etapă importantă din sinteza colesterolului (Figura 3.27).

Figura 3.27. Structura chimică a statinelor luate în studiu.

Compușii selectați în acest studiu sunt: atorvastatina, fluvastatina, lovastatina și simvastatina. Deși au fost publicate în ultima decadă mai multe metode EC pentru analiza acestor compuși, în acest studiu s-a propus dezvoltare unei metode generale electroforetice care să fie simplă, rapidă, eficientă și economică pentru determinarea celor mai importante statine.

Studiul a decurs după mai multe etape: setarea condițiilor electroforetice experimentale de start, setarea lungimii de undă la care se vor detecta analiții, experimente preliminare (setarea BGE și a zonei de pH adecvate). Valorile pKa ale celor patru statine sunt cuprinse între 4,2 și 4,6. În BGE-ul selectat alcalin (tetraborat de sodiu 25 mM) atorvastatina și fluvastatina sunt în forma anionică (au o grupare –COOH în structura chimică); lovastatina și simvastatina se află în forma neutră lactonică, fără a avea mobilitate electroforetică. De aceea, în soluțiile stoc ale celor doi compuși s-a adăugat soluție de NaOH 0,1M în raport de 1:1 cu metanol, pentru a avea loc procesul de hidroliză a grupărilor lactonice (Figura 3.28).

Figura 3.28. Desfacerea legăturii lactonice în mediu bazic pentru lovastatină și simvastatină.

Utilizând parametrii experimentali preliminari, în condiții specifice metodei ECZ, pot fi separate doar atorvastatina și fluvastatina. Pentru a fi separate lovastatina și simvastatina s-a utilizat metoda ECM, în care s-a adăugat DSS în BGE; această metodă a avut succes doar după hdroliza alcalină a celor doi compuși.

Optimizarea metodei a constat în selectarea concentrației adecvate de BGE (inclusiv aditiv), pH-ul BGE, apoi s-au selectat parametrii interni ai sistemului electroforetic care au condus la cea mai bună separare a compușilor luați în studiu (tensiunea aplicată, temperatura în caseta capilarului, presiunea și timpul de injectare). Astfel, s-a realizat separarea simultană a celor patru statine, cu un timp de migrare foarte scurt (sub trei minute) (Figura 3.29).

Au fost stabilite performanțele analitice în vederea validării metodei: repetabilitatea, liniaritatea, sensibilitatea, robustețea și acuratețea. Principalele date sunt redate în Tabelele 3.24 – 3.25.

Figura 3.29. Separarea celor patru statine selectate prin metoda ECM (Atorvastatina – ATO, Fluvastatina –FLU, Lovastatina – LOV, Simvastatina – SIM. Condiții de separare: BGE tetraborat de sodiu 25 mM – DSS 25 mM, pH 9,3, tensiunea aplicată +25 kV, temperatura din caseta capilarului 25°C, presiunea de injectare 30 mbar/2 s, injectare hidrodinamică, capilar 38,5 cm lungime totală (30 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrație analiți 25 µg/ml, detecție UV la λ 240 nm.

Tabelul 3.24. Ecuațiile de regresie, coeficienții de corelație și valorile limitelor de detecție ale metodei ECM pentru separarea statinelor luate în studiu.

Tabelul 3.25. Precizia separării celor patru statine selectate în studiu prin metoda ECM

(n = număr de determinări).

A fost dezvoltată și optimizată o metodă ECM pentru determinarea simultană a patru reprezentanți importanți din clasa statinelor: atorvastatina, fluvastatina, lovastatina și simvastatina. Astfel, s-a reușit determinarea simultană a celor patru compuși în aproximativ 3 minute. Performanțele analitice obținute au stat la baza validării metodei. Separarea eficientă a celor patru compuși într-un timp de analiză scurt recomandă metoda ECM pentru analizele de rutină din industria farmaceutică [134].

Acest studiu a fost suținut de fondurile proiectului de tip Grant Intern al Universității de Medicină și Farmacie din Tîrgu Mureș, Nr. 6/23.12.2014.

Determinarea loratadinei, desloratadinei și cetirizinei prin ECZ

Lucrarea are o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, fără a fi o temă proprie de cercetare, la publicarea rezultatelor având calitatea de coautor. Obiectivul principal al experimentelor din acest studiu a fost dezvoltarea unei metode generale electroforetice de determinare simultană a trei derivați antihistaminici – loratadina, desloratadina și cetirizina – cu aplicabilitate în industria farmaceutică pentru determinarea compușilor din materii prime și produse farmaceutice [135].

Loratadina sau etil-4-(8-cloro-5,6-dihidro-11H-benzo[5,6]ciclohepta[1,2-b]piridin-11-iliden)-1-piperidincarboxilat este unul dintre cei mai utilizați compuși din clasa antihistaminice H1, generația a doua. Desloratadina sau 8-cloro-11-piperidin-4-iliden-5,6-dihidrobenzo[1,2]ciclohepta[2,4-b]piridina, este metabolitul activ al loratadinei, mai activă de trei-patru ori decât loratatina. Având o afinitate mai mare de receptori, cetirizina tinde să înlocuiască cu succes în terapie loratadina.

Cetirizina sau acidul ((±)-[2-(4-((4-chorofenil)fenilmetil]-1-piperazinil) etoxi)acetic este tot un antihistaminic H1 din generația a doua, dar, din punct de vedere stuctural, este metabolitul hidroxizinei (anxiolitic) (Figura 3.30).

În momentul publicării acestui studiu nu existau publicate metode electroforetice prin care să se determine simultan loratadina și desloratadina, metoda EC fiind o provocare în acest sens.

Etapele preliminare de dezvoltare a metodei au avut în vedere selectarea lungimii de undă pentru detectarea semnalelor analitice, găsirea unui BGE optim (compoziție și pH) pornind de la proprietățile acido-bazice ale celor trei compuși. Selectivitatea în ECZ poate fi controlată prin concentrația BGE, pH-ul BGE, aditivi organici, tensiunea aplicată, temperatura, presiunea de injectare, timpul de injectare, lungimea capilarului.

Loratadina poate fi determinată în domeniul de pH 2 – 5, în timp ce desloratadina și cetirizina pot fi determinate pe un domeniu mai larg de pH (comportamente explicate de particularitățile fizico-chimice). La un pH al BGE-ului cu valorile între 7 – 9, eficiența separării compușilor a fost minimă (semnale cu timpi de migrare apropiați sau chiar similari FEO).

Figura 3.30. Structurile chimice ale celor trei antihistaminice luate in studiu (loratadina, desloratadina și cetirizina); *-marchează atomul de carbon chiral.

Figura 3.31. Separarea loratadinei, desloratadinei și cetirizinei prin metoda ECZ. Condiții de separare: BGE acid fosforic 25 mM, pH 2,5, tensiunea aplicată +25 kV, temperatura din caseta capilarului 20°C, presiunea de injectare 50 mbar/2 s, injectare hidrodinamică, capilar 48 cm lungime totală (40 cm lungime efectivă) cu diametrul intern de 50 µm, concentrație analiți 10 µg/ml, detecție UV la λ 240 nm.

După experimentele preliminare un BGE care conține acid fosforic 25 mM la pH 2,5 a fost selectat ca BGE optim pentru separarea celor trei compuși. Aditivii organici utilizați în compoziția BGE (metanol, acetonitril) nu au adus o îmbunătățire a separării celor trei compuși. În schimb, s-a reușit o optimizare a metodei prin manipularea parametrilor interni ai sistemului electroforetic (Figura 3.31).

Performanțele analitice ale metodei au fost demonstrate (precizia, liniaritatea, sensibilitatea – limitele de detecție, robustețea), rezultatele importante ale parametrilor fiind cuprinse în Tabelele 3.26 – 3.27 . Precizia intra-day (media a 6 măsurători în aceeași zi) și inter-days (media a 6 măsurători timp de 5 zile) la trei concentrații diferite (2,5 µg/ml, 5 µg/ml și 10 µg/ml) a avut valorile DSR(%) între 0,25 și 2,12.

Aplicabilitatea metodei a fost verificată pentru determinarea substanțelor active din produse farmaceutice cu valori ale recuperării cuprinse între 95,5 – 101,5 %; excipienții din produsele farmaceutice nu au produs interferențe în obținerea rezultatelor.

Tabelul 3.26. Ecuațiile de regresie, coeficienții de corelație și valorile limitelor de detecție ale metodei ECZ pentru determinarea celor trei antihistaminice H1 luate în studiu.

Tabelul 3.27. Valorile timpilor de migrare și DSR(100%) pentru timpii de migrare, ariile și înățimea peak-urilor (Tm – timp de migrare, A – aria peak-ului, H – înălțimea peak-ului).

În concluzie, o metodă ECZ cu detecție UV a fost dezvoltată și optimizată pentru determinarea a trei compuși antihistamici H1, frecvent utilizați în terapie, respectiv loratadina, desloratadina și cetirizina. Metoda a fost validată în acord cu criteriile ghidului ICH. În studiul de față este propusă o metodă ECZ adecvată celor trei compuși, robustă, precisă, simplă și utilă pentru determinările din industria farmaceutică [135].

Studiu de tip review: considerații analitice asupra enantioseparării unor acizi grași polinesaturați

În studiul cu titlul “Capillary electrophoresis in the analysis of polyunsaturated fatty acids”[136], realizat în colaborare (calitatea de autor principal), obiectivul principal a fost de a realiza o evaluare completă a metodelor de EC publicate în scopul analizei acizilor grași polinesaturați.

Acizii grași polinesaturați, în special acizii grași ω3 (acidul eicosapentanoic și docosahexanoic) prezintă o importanță specială în procesele fiziologice; fluiditatea membranelor biologice este influențată prin încorporarea acestor acizi în structurile fosfolipidelor. Fiind compuși importanți în diferite procese biochimice și chimice, elaborarea de noi metode de analiză a acizilor grași nesaturați reprezintă o provocare dar și o necesitate pentru analiști.

Metodele EC sunt metode cu rezoluție mare, utilizate în separarea complexelor biologice și a amestecurilor chimice; în analiza acizilor grași polinesaturați EC a devenit un instrument puternic de analiză în ultima decadă. Astfel, EC este o metodă alternativă dar și complementară clasicelor metode HPLC și GC.

Au fost identificate mai multe tipuri de EC care au fost dezvoltate pentru a fi adecvate analizei acizilor grași polinesturați: ECZ, ECM (MEKC) și cromatografia electrocinetică de microemulsie (MEEKC). Detectorii utilizați au fost: detector de tip DAD, detector de fluorescență indusă de laser (laser induced fluorescence, LIF), spectrometru de masă (MS).

Aspectele cele mai importante care sunt luate în considerare la dezvoltarea de metode EC eficiente pentru determinarea acizilor grași polinesturați sunt gradul de ionizare și parametrii electroforetici interni și externi. În BGE se pot adăuga diferiți aditivi (surfactanți, solvenți organici, ciclodextrine) pentru a îmbunătăți eficiența metodei. Designul factorial este o unealtă matematică elegantă care poate optimiza separarea acizilor grași prin EC. Solubilitatea scăzută în apă a acestor compuși este un dezavantaj major care este contracarat de adăugarea unor aditivi în BGE (solvenți organici sau uree).

Metodele EC au un mare potențial în analiza acizilor grași polinesaturați; provocările acestor metode sunt identificarea unui BGE optim și detecția analiților cu sensibilitate mare; depășirea acestor dezavantaje va conduce la utilizarea pe scară largă a EC în controlul calității produselor alimentare, farmaceutice și chimice, precum și a protocoalelor extrem de sensibile de diagnostic din medicină.

Alte studii

Obținerea a doi complecși noi ai ligandului [AsW9) cu cationi de Pd2+ și Pt4+ , caracterizare și testare a activității antibacteriene

Lucrarea are o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, fără a fi o temă proprie de cercetare, la publicarea rezultatelor având calitatea de coautor. În acest studiu obiectivul principal a fost sintetizarea unor complecși noi anorganici cu cationi Pd2+ și Pt4+[137], caracterizarea fizico-chimică a acestora și testarea activității antibacteriene.

În prima parte a studiului au fost sintetizați noi compuși polioxometalați, combinații complexe anorganice, care au avut cationi de platină (Pd2+ și Pt4+) și ligandul [AsW9O33]9- (AsW9). Metoda de obținere a constat în adăugarea directă a soluției cationilor (sărurile PdCl2 și K2PtCl6) la soluția de AsW9. pH-ul mediului de reacție a fost 8,5 iar temperatura de reacție menținută în intervalul 70 – 80°C.

Metodele de analiză utilizate pentru caracterizarea compușilor obținuți au fost spectrofotometria UV-VIS, spectrometria IR, analiza cu difracție cu raze X, metoda analizei termogravimetrice și conductometrie. Formulele moleculare care au rezultat prin corelarea datelor obținute pentru cei doi complecși sintetizați au fost Na12[(AsW9O33)2Pd3]*24H2O (AsW9Pd); Na6[(AsW9O33)2Pt3]*46H2O (AsW9Pt). În plus, structurile complecșilor au fost asociate cu structura Hervè în care trei cationi metalici alternează cu trei atomi de sodiu (pentru stabilizarea structurii; formează o centură centrală într-o structură de tip sandwich); această structură este formată din două unități de AsW9 conectate prin legături în punte O-Pd/Pt-O.

S-au testat cei doi compuși și din punct de vedere al activității antibacteriene; în acest scop s-au selectat două tipuri de bacterii, Staphylococcus aureus ATCC 29213 din clasa bacteriilor Gram pozitive și Escherichia coli ATCC 25922 din clasa bacteriilor Gram negative. S-a utilizat metoda difuziei pe disc în care s-a măsurat diametrul zonei de inhibiție produsă de compuși. Complecșii obținuți au prezentat activitate antibacteriană semnificativă comparativ cu liganzii, inhibând ambele specii bacteriene, cu valori mai mari în cazul bacteriei Escherichia coli.

Determinarea izoniazidei și rifampicinei prin spectrofotometrie UV-VIS

Studiul abordează o temă de cercetare la care mi-am adus contribuția, fără a fi o temă proprie de cercetare, la publicarea rezultatelor având calitatea de coautor. Obiectivul principal al studiului este dezvoltarea de metode spectrofotometrice UV pentru determinarea simultană a două molecule active utilizate în tratamentul tuberculozei, izoniazida și rifampicina [138].

Utilizate concomitent, cele două antituberculoase se numără printre cele mai eficiente combinații din terapia actuală a infecției cu Mycobacterium tuberculosis. Deși au fost publicate până acum mai multe metode spectrofotometrice care să poată estima cele două medicamente din combinații, acest studiu și-a propus dezvoltarea unor noi metode validate, care să fie simple, sensibile și rapide pentru determinarea simultană a izoniazidei și rifampicinei.

Cele două metode spectrofotometrice dezvoltate și descrise în acest studiu sunt metoda ecuațiilor simultane și spectrofotometria derivată de ordinul I. Ca solvent pentru cei doi compuși a fost selectat metanolul. Maximul de absorbție determinat pentru izoniazidă a fost 263 nm și pentru rifampicină 338 nm, maxime utilizate în metoda ecuațiilor simultane.

În cea de a doua metodă spectrofotometrică s-a utilizat derivata de ordinul I în care determinarea analiților s-a efectuat prin tehnica „zero-crossing”; determinarea izoniazidei s-a înregistrat la lungimea de undă 263 nm iar pentru rifampicină la lungimea de undă 290 nm. Legea Lambert-Beer a fost respectată de ambele substanțe în domeniul de concentrații cuprins între 5 – 50 µg/ml. Cele două metode au fost validate prin verificarea parametrilor de validare din cerințele ghidului ICH: selectivitatea, liniaritatea, sensibilitatea, precizia și acuratețea.

Aplicabilitatea metodelor a fost testată la determinarea substanțelor active dintr-o combinație farmaceutică comercială, recuperarea substanțelor active fiind în concordanță cu cantitatea declarată de producător (valori DSR % între 0,56 – 0,92).

Metodele spectrofotometrice dezvoltate sunt simple, rapide și economice. Izoniazida și rifampicina pot fi determinate cu acuratețe și precizie din formulările farmaceutice și pot fi utilizate cu succes în analizele de rutină din industria farmaceutică [138].

Rezultatele activității științifice și de cercetare

Proiecte de cercetare și participări la alte proiecte

După susținerea tezei de doctorat, începând cu anul 2013, am abordat teme de cercetare individual sau în proiecte de echipă câștigate prin competiție:

Director de proiect câștigat prin competiție – Grant intern de cercetare științifică UMF Tîrgu Mureș – „Cercetări privind obținerea unor compuși cu activitate terapeutică prin complexarea argintului cu reprezentanți ai clasei fluorochinolonelor” Contract de finanțare pentru execuție proiecte de cercetare Nr.2/23.12.2014

Membru în echipa de cercetare a proiectului câștigat prin competiție – Grant intern de cercetare științifică UMF Tîrgu Mureș – colective de cercetare „Noi asocieri de substanțe active în filme pentru terapie dermică și transdermică. Optimizarea prin analize factoriale a cineticii de cedare in vitro (membrane sintetice vs. biologice)” Contract de finanțare pentru execuție proiecte de cercetare Nr 275/6/11.01.2017

Membru în echipa de cercetare a proiectului câștigat prin competiție – Grant intern de cercetare științifică UMF Tîrgu Mureș – colective de cercetare “Inhibitorii de aromatază ca substanțe dopante. Model experimental la șobolanul mascul” Contract de finanțare pentru execuție proiecte de cercetare Nr17/23.12.2014

Membru în echipa de cercetare a Contractului de Cercetare Științifică Nr. 11143/18.09.2013. “Implicarea planului de intervenție personalizat (PIP) în optimizarea standardelor calității vieții, persoanelor cu dizabilități (copii și tineri)”

Alte proiecte câștigate prin competiție:

Membru în echipa proiectului CNFIS-FDI-2017-0588, “Dezvoltarea capacităților antreprenoriale studențești în domeniul medical și farmaceutic” câștigat în competiția de proiecte finanțate din Fondul de Dezvoltare Instituțională destinat universităților de stat – FDI 2017, Domeniul 5: înființarea și susținerea activităților societăților antreprenoriale studențești (SAS) din subordinea universităților (http://www.cnfis.ro/competitia-fdi-2017/)

Publicații

Publicațiile proprii din perioada 2009 – 2017 sunt următoarele (vezi lista de lucrări):

37 lucrări științifice in extenso, în calitate de autor/coautor, cu factor de impact total cumulat – 26,947:

19 lucrări indexate ISI Web of Science from Thomson Reuters (din care 9 în calitate de autor principal)/din care 17 articole postdoctorat

18 lucrări indexate în Baze de Date Internaționale (din care 9 în calitate de autor principal)/ din care 13 articole postdoctorat

6 cărți de specialitate publicate, cu ISBN, publicate la edituri naționale recunoscute CNCSIS:

4 – prim autor (din care 3 postdoctorat)

2 – autor principal (postdoctorat)

1 – autor contributor (postdoctorat)

2 capitole în volum colectiv cu ISBN

1 carte – material didactic, fără ISBN (postdoctorat)

Elemente de recunoaștere a activității științifice

Întreaga activitate științifică (perioada 2009 – 2017) la nivel internațional este cuantificată prin numărul de citări al publicațiilor și indicele Hirsch:

Numărul de citări – Citation Report Thomson Web of Science Core Collection = 65

Indice Hirsch = 5 (la data de 16.08.2017)

ORCID ID 0000-0003-4979-6903

Recenzii articole

În perioada 2014 – 2017, am recenzat articole în calitate de recenzor pentru revistele:

Farmacia (FI 1,348) – 2 articole

Acta Medica Marisiensis (indexată BDI) – 4 articole

World Journal of Analytical Chemistry (indexată BDI) – 1 articol

Scientia Pharmaceutica (indexată BDI) – 1 articol

5.6. Premii obținute

În perioada 2013 – 2017 am obținut următoarele premii:

UEFISCDI – Premierea rezultatelor cercetării, Anul 2014 – Articole_ Lista 6 – http://uefiscdi.gov.ro/userfiles/file/PREMIERE_ARTICOLE/ARTICOLE%202014/ACTUALIZARE%2023_12_2014/LISTA%206%20REZULTATE%20-%20actualizata%20-%2018_12_2014.pdf [Rusu A. Hancu G. Uivaroși V. Fluoroquinolone pollution of food, water and soil, and bacterial resistance, Environ Chem Lett 2014, Online ISSN, 1610-3661, DOI: 10.1007/s10311-014-0481-3, 2015 Print ISSN 1610-3653, 13:21-36, FI: 1.906] zona galbenă

Premiu pentru carte farmaceutică, cartea “Ghidul Farmacistului în comunicarea cu pacientul” – Rusu A., Hancu G., Pașca MD, Gala Farmaciștior ediția a III-a 2013, 4 decembrie, organizată sub egida Colegiului Farmaciștilor din România, București, România

Plan de evoluție

și de dezvoltare a carierei

Activitatea didactică

Activitatea didactică este în continuă dezvoltare, fiind relevată de experiența însumată în cariera academică până în prezent, cu următoarele componente importante:

(1) Predare cursuri /activități de laborator, seminar

Cursuri (2014 – prezent)

1.Chimie farmaceutică / Farmacie III LR, 2014 – 2017, curs de 2 semestre

2.Comunicarea în farmacie / Asistența de Farmacie III, 2014 – 2016, curs de 1 semestru

3.Tehnici de comunicare / Farmacie II LR, 2014 – 2017, curs de 1 semestru

4.Antreprenoriat farmaceutic / Farmacie V LR, 2014 – 2016, curs de 1 semestru

5.Elemente și tehnici de comunicare / Cosmetică Medicală. Tehnologia produsului cosmetic I, 2015-2017, curs de 1 semestru

6.Chimia ingredientelor cosmetice / Cosmetică Medicală. Tehnologia produsului cosmetic II, 2016-2017, curs de 1 semestru

Curs postuniversitar destinat farmaciștilor îndrumători și farmaciștilor supervizori ai stagiului practic pentru studenții anului V Farmacie și anului III Asistență de Farmacie, UMF Tîrgu Mureș, an universitar 2015 -2016, https://www.umftgm.ro/facultatea-de-farmacie/noutati/detalii/articol/612.html

Lucrări practice (2009 – prezent)

1.Chimie farmaceutică / Farmacie III și IV, 2009 – 2017, 2 semestre

2.Comunicarea în farmacie / AF III, 2014 – 2016, 1 semestru

3.Chimia ingredientelor cosmetice / CMTPC II, 2016 – 2017, 2 semestre

4.Elemente și tehnici de comunicare / CMTPC, 2016 – 2017, 1 semestru

(2) Îndrumare studenți Cercul Științific Studențesc al Disciplinei Chimie Farmaceutică

2009 – prezent; permanent (vezi punctul 3, următor);

(3) Coordonare științifică a Lucrărilor de licență (2009 – prezent)

Total: 16 lucrări de licență susținute

Farmacie: 2012 – 1; 2013 – 3; 2014 – 3; 2015 – 4; 2016 – 4

Asistența de Farmacie: 2015 – 1.

(4) Îndrumarea participării studenților Cercului Științific Studențesc la manifestări științifice:

Marisiensis, 2010, 2013, 2014, 2016, 2017 (10 lucrări – autori principali, 1 lucrare – co-autor);

Congresul Național de Farmacie, Ediția a XVI-a, 28 septembrie – 01 octombrie 2016, (1 lucrare – co-autor);

The 8th Conference of PhD Students, The 5th Conference Of Postdoc Fellows in Medicine and Pharmacy, 9-10 December 2015 (1 lucrare – co-autor);

Scientific Session of University Educational Staff, 2012, 2013, 2015 (3 lucrări – co-autor);

The 15th International Symposium and Summer School on Bioanalysis, 13-18 July 2015 (1 lucrare – co-autor);

Congresul Național de Farmacie cu participare internațională, Ediția a XV-a, 24-27 septembrie 2014 (5 lucrări – co-autor);

TimMedica International Congress and Exhibition 4th edition, Timișoara, România, June 16 – 18, 2011 (1 lucrare – co-autor).

(5) Participare în comisii de specialitate

Am participat în numeroase comisii, în organizarea procesului de admitere, licență, rezidențiat, începând cu anul 2009:

ADMITERE:

-22.09.2009 – supraveghetor;

-21.07.2010 – colectiv ducere subiecte în săli;

-25/27.07.2012 – colectiv ducere subiecte săli, 17.09.2012 – colectiv ducere subiecte în săli;

-25/27 iulie 2012 – colectiv ducere subiecte săli (Adresa Rectorat Nr.5950/14.06.2012),

-17 septembrie 2012 colectiv ducere subiecte în săli (x2)

-24 iulie 2013 – responsabil de sală

-26 iulie 2013 – responsabil coli

-17 septembrie 2013 – responsabil coli (Adresa Rectorat Nr.6950/12.06.2013)

-23 iulie 2014 – responsabil sală (Adresa Rectorat Nr.8214/25.06.2014) cu modificare în ziua de admitere

– iulie 2017 – comisia de admitere

EXAMENUL DE FARMACIST SPECIALIST – secretar comisie – 15.03.2010;

LICENȚĂ:

– septembrie 2009 – secretar comisie IV (program de studiu: Farmacie)

– septembrie 2010 – secretar comisie examen proba practică; secretar comisie IV, susținerea lucrărilor de licență (program de studiu: Farmacie)

-12 septembrie 2012: secretar 2 comisii (Farmacie, Asistența de Farmacie) (Hotărârea Senatului din 04.09.2012)

– Participare în Comisia de lucru baza de date examen licență 2014, Hotărârea Consiliului Facultății Nr.3/12 sept. 2013, termen 01 martie 2014)

– 9 septembrie 2014, ducere subiecte în săli

– 13 septembrie 2014 – responsabil sală

– 11 septembrie 2015 – membru comisia de concurs II – susținerea lucrărilor de licență

– 16 septembrie 2016 – membru comisia de concurs VIII – susținerea lucrărilor de licență

REZIDENȚIAT:

-25 noiembrie 2012, responsabil de sală (Adresa Rectorat Nr. 13515 / 13.11.2012)

-17 octombrie 2013 – responsabil de sală (Adresa Rectorat Nr.1472 / 04.11.2013)

-23 noiembrie 2014 – responsabil de sală (Adresa Rectorat Nr.15945/11.11.2014)

Obiectivele generale de dezvoltare a activității didactice au în vedere următoarele direcții:

În ceea ce privește cursurile la forma de învățământ de lungă sau scurtă durată am în vedere următoarele aspecte:

Restructurarea programei analitice, în acord cu strategia de dezvoltare a disciplinei:

– accentuarea conceptelor de bază ale mecanismelor de acțiune ale substanțelor farmaceutice: relații structură chimică – activitate terapeutică; modele fizico-chimice care explică transportul substanțelor farmaceutice prin membrane, solubilitate (în apă, lipide), gradul de ionizare, topologia moleculară, concepte legate de structură, enantioselectivitate; dezvoltarea unei molecule noi, metodele de descoperire a „capului de serie”,

– noțiuni de bază despre modelarea moleculară.

Redactare cursuri/actualizare, în acord cu statul de funcții:

Programul de studii Farmacie: curs Chimie farmaceutică

Programul de studii Cosmetică medicală. Tehnologia produsului cosmetic: cursuri Chimia produsului dermatocosmetic, Elemente și tehnici de comunicare

Propuneri de noi cursuri opționale (Terapia anticanceroasă: noi tehnologii, design și medicina personalizată, Medicația antimicotică)

Elaborare materiale multimedia, accesibile studenților – platforma digitală e-UMF.

Dezvoltarea metodelor și tehnicilor de predare interactive

Analiza feedback-ului studenților (obținut pe bază de chestionar)

Propuneri de cursuri la forma de studii academice postuniversitare – individual/în colaborare (Antibioterapia: provocări și riscuri, Antimicotice moderne, Actualități în medicația antineoplazică)

În ceea ce privește seminariile / lucrările practice de laborator – este necesară actualizarea și corelarea cu necesitățile pieței farmaceutice:

Restructurarea programei analitice: introducerea în programa analitică a unor noi lucrări practice, adresate substanțelor esențiale din practica farmaceutică curentă (partea teoretică corelată cu partea practică și cu posibilitățile materiale ale disciplinei);

Elaborare îndrumătoare noi pentru activitățile practice Chimie farmaceutică (revizuire) și Chimia produselor dermatocosmetice;

Elaborarea lucrărilor practice pentru disciplina Chimia produselor dermatocosmetice (programul de studiu Cosmetică Medicală. Tehnologia produsului cosmetic)

Actualizarea după cerințele Farmacopeei Europene Ediția a 9-a, în vigoare;

Actualizarea tehnicilor de analiză după necesitățile actuale ale domeniului farmaceutic;

Atragerea de fonduri pentru dotarea disciplinei cu aparatură modernă (surse de identificat: donații, competiție de granturi, proiecte);

Atragerea absolvenților valoroși în mediul universitar/creșterea numărului de cadre didactice (preparatori demonstratori, doctoranzi, asistenți universitari).

Publicarea de carte de specialitate va avea în vedere:

Elaborarea de tratate, monografii – în calitate de autor și co-autor cu tematici care vizează capitole importante ale Chimiei farmaceutice, Chimia produsului dermatocosmetic;

Colaborarea cu cadre didactice din alte universități în elaborarea de carte de specialitate.

2. Creșterea competențelor didactice și de dezvoltare personală

Competențele didactice, ca experiență anterioară, însumează următoarele aspecte corelate cu posturile ocupate, cursurile accesate, respectiv participarea la diverse proiecte instituționale:

Preparator/Asistent universitar/Șef de lucrări/Conferențiar – competențele didactice specifice postului;

Curs postuniversitar de pregătire pedagogică, Universitatea „Petru Maior” Tîrgu Mureș, 2010;

Curs Engleză Medicală, nivel intermediar B2, PROFEX, State accredeted language examination certificate, 2010;

Curs English as a Foreign Language / At B2 Level, Elanguest; English Language School, Malta, 2010;

Cursuri non-formale de dezvoltare abilități: Curs Formator de formatori (acreditat de CNFPA), Coaching for Trainers – Train the Trainers Advanced, Train the Trainers, Tehnici de negociere, Tehnici de customer care în unitățile farmaceutice;

Curs Auditor în domeniul calității (2015/2016)/Curs Manager al sistemelor de management al calității (2012);

Master Calitatea Medicamentului, Alimentului și Mediului, UMF Tîrgu Mureș, 2013;

Cursuri postuniversitare (7);

Participări la manifestări științifice cu caracter local, naționale și internaționale – vezi lista de lucrări;

Accesare de Burse Erasmus (5)

Mai 29 – Iunie 02, 2017, LLP/ERASMUS TEACHING STAFF EXCHANGE PROGRAM, Comenius University in Bratislava, Odbojárov 10 SK-832 32 Bratislava, Slovacia

Mai 30 – Iunie 03, 2016, LLP/ERASMUS TEACHING STAFF EXCHANGE PROGRAM, University of Trieste, Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche, P.le Europa 1 – 34127Trieste – Italia

Septembrie 17 – 23, 2014, LLP/ERASMUS TEACHING STAFF EXCHANGE PROGRAM, Universitat de València, Facultad de Farmacia – Planta Baja, Av. Vicente Andrés Estellés s/n, 46100 Burjassot, Valencia, SPAIN

Mai 27 – 31, 2013, LLP/ERASMUS TEACHING STAFF EXCHANGE PROGRAM, Università degli Studi di Parma, Via Università 12, 43121 Parma – Italia

Mai 01 – Iulie 31, 2011, Certificate of Attendance, ERASMUS PROGRAMME, PHD STUDENT MOBILITY at the SEMMELWEIS UNIVERSITY, Faculty of Pharmacy, Pharmaceutical Chemistry Department, Budapest, Hungary

Participare la proiecte

CNFIS-FDI-2017-0588, “Dezvoltarea capacităților antreprenoriale studențești în domeniul medical și farmaceutic”, câștigat în competiția de proiecte finanțate din Fondul de Dezvoltare Instituțională destinat universităților de stat – FDI 2017, Domeniul 5: înființarea și susținerea activităților societăților antreprenoriale studențești (SAS) din subordinea universităților (http://www.cnfis.ro/competitia-fdi-2017/) (membru);

POSDRU/155/1.2/S/141278 „Politici bazate pe evidențe și impactul asupra pieței forței de muncă – INFO-HE”, componenta Studenti, Absolventi si Piata Muncii (SAPM), proiect implementat de UEFISCDI sub coordonarea CNFIS (2015);

POSDRU/18/1.2/G/40067, „Standarde de calitate și indicatori de performanță specifici pentru Învățământul Superior din domeniul Sănătății”, proiect în care UMF Tîrgu Mureș este parteneră (Programul de formare în asigurarea calității, organizat de UMF Iuliu Hațieganu Cluj-Napoca cu sprijinul ARACIS, perioada 11 – 13 septembrie 2013);

POSDRU 86/1.2/S/52422 „Managementul corelării sistemului de învățământ cu piața muncii”, (Activitatea 7. Dezvoltarea și furnizarea programelor de formare pentru persoanele din grupul țintă, din care vor fi recrutați angajații din cadrul departamentului de analiză și gestiune previzională, Subactivitatea 7.2. Organizarea și defășurarea formării, Centrul III Universitatea “Lucian Blaga” Sibiu, 29 octombrie 2012);

POSDRU /86/ 1.2/ S/ 63815„Calitate și competență profesională europeană în educația medicală și în managementul activităților educaționale”, Perioada de implementare: 3 ani (1 ianuarie 2011 – 31 decembrie 2013), Partener lider de proiect: Universitatea de Medicină și Farmacie "Victor Babeș" din Timișoara, partener Universitatea de Medicină și Farmacie Tîrgu-Mureș.

Obiectivele principale de dezvoltare a competențelor didactice sunt următoarele:

a)Activități de pregătire științifică și metodică:

– Dezvoltarea de metode didactice interactive;

– Implicarea activă a studenților în desfășurarea cursurilor și aplicațiilor utilizând metode didactice centrate pe învățarea prin descoperire, învățarea pe echipe și învățarea în grup.

b)Pregătire individuală (autoperfecționare):

– Accesare permanentă a literaturii de specialitate; colectare informații/articole științifice actuale; accesare platforme, baze de date științifice;

– Menținerea legăturilor cu omologii din alte universități, în vederea schimbului de informații de specialitate; crearea de noi oportunități în acest sens.

c)Audierea unor cursuri / module de curs. Parcurgerea unor forme postuniversitare de învățământ în domeniul de activitate sau complementar

– Specializare în tehnici de analiză a substanțelor medicamentoase, inițiere în modelare moleculară;

– Participarea la cursuri formale și non-formale pentru dezvoltarea abilităților de comunicare, time management, prezentărilor multimedia;

– Accesarea unui curs „Manager de proiect”;

– Perfecționarea limbii Engleze – examenul PROFEX pentru nivelul C.

d)Participarea la conferințe, simpozioane, congrese organizate în domeniul de activitate principal sau în domenii interdisciplinare

– Congrese (cel puțin 1 manifestare pe an), conferințe (cel puțin 2 manifestări pe an), simpozioane, organizate la nivel național și internațional.

e)Schimburi academice cu diferite universități din țară și străinătate

– Accesare de burse Erasmus, CEEPUS, altele;

– Invitarea colegilor omologi din străinătate, în vederea facilitării schimbului de experiență;

– Menținerea și dezvoltarea colaborării cu alte centre universitare din țară sau străinătate.

Pe lângă competențele didactice, evoluția academică a avut și o componentă de dezvoltare personală în cadrul vieții academice, care a avut la bază experiența dobândită în munca de echipă din cadrul diferitelor comisii în care am fost numită:

-Membru în Comisia de evaluare a dosarelor pentru obținerea gradațiilor de merit, 2016 (Decizie nr. 1185 din 21.12.2015)

-Membru în Corpul de audit intern (CAI) 2015, 2016, 2017

-Membru în Departamentul de Asigurare a Calității, 2015, 2016, 2017

-Membru în Comisiile de auditare pentru departamente/servicii, 2015: 6 comisii; 2016: 6 comisii

-Comisia de întocmire a Regulamentului de funcționare și Organigrama Centrului de Orientare Profesională și Consiliere Psihologică (CCONS) al UMFTgM; decizie nr. 65 din 05.02.2014

-Comisia de Evaluare și Asigurare a Calității a Facultății de Farmacie (CEAC), UMFTgM 2012, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017

-Membru în Comisia de Orientare și Consiliere în Carieră (COCC) a Facultății de Farmacie, UMFTgM 2012, 2013, 2014, 2015,

-Președinte Comisia de Orientare și Consiliere în Carieră (COCC) a Facultății de Farmacie, UMFTgM 2016, 2017

– Membru în COMISII CONCURSURI OCUPARE POST:

Comisia de Concurs pentru ocuparea postului de conferențiar universitar, la disciplina Chimie terapeutică, poz.10, UMF Iuliu Hațieganu Cluj Napoca (Adresa Nr.2300/26.01.2017)

Comisia de Concurs pentru ocuparea postului de șef de lucrări, la disciplina Industria medicamentului și management farmaceutic (Decizia Nr.35/22.01.2015)

Comisia de Concurs pentru ocuparea postului de asistent universitar, la disciplina Chimie farmaceutică (Decizia Nr.35/22.01.2015)

-Membru în COMISII PENTRU ÎNTOCMIREA DE DOSARE EVALUARE INSTITUȚIONALĂ:

Membru grup de lucru pentru întocmirea dosarului de autoevaluare în vederea evaluării instituționale EUA-IEP 2012-2013

Membru grup de lucru pentru întocmirea dosarului de reacreditare ARACIS 2013

Membru grup de lucru pentru întocmirea dosarului de autoevaluare în vederea evaluării instituționale EUA-IEP 2016-2017

Membru grup de lucru pentru întocmirea dosarului de evaluare instituțională ARACIS 2016

Membru – procesul de autorizare recertificare ISO 9001:2015 al SMC al Universității, noiembrie-decembrie 2016

-Membru în Consiliul Departamentului DSFS, Facultatea de Farmacie (2016-2017)

-Membru în Senat (Cancelarul Senatului), 2013, 2014, 2015

Obiectivele principale de dezvoltare personală în cadrul mediului academic sunt următoarele:

Acumulare de experiență și implicare în acest tip de activități;

Dezvoltarea abilităților de lucru în echipă și în managementul proiectelor;

Dobândirea de experiență în alcătuirea analizelor și raportărilor instituționale;

Dobândirea de experiență în managementul academic și managementul calității;

Creșterea prestigiului profesional.

Activitatea de cercetare științifică

Activitatea personală de cercetare științifică (perioada 2009 – 2017) are la bază următoarele repere din cariera academică:

Elaborarea tezei de doctorat cu titlul CERCETĂRI PRIVIND CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMICĂ A DERIVAȚILOR DE CHINOLONĂ PRIN METODE DE ANALIZĂ OPTIMIZATE, în perioada 2009 – 2012; anul susținerii: 2012 / Conducător științific: Prof. dr. Gyéresi Árpád, Universitatea de Medicină și Farmacie din Tîrgu Mureș

Publicarea de articole științifice cu factor de impact, creșterea prestigiului individual cât și al instituției (vezi lista de lucrări): 37 de articole in extenso (19 vizibile în fluxul ISI WOS, 18 articole BDI)

Comunicări la manifestări științifice naționle și internaționale: 44 de comunicări (publicate în rezumat, în publicații cu ISBN)

Participarea la proiecte de cercetare (4 proiecte de cercetare din care 3 câștigate prin competiție; 1 director de proiect + 3 membru )

Participarea la redactarea și depunerea de proiecte în competiții (3, în calitate de membru)

Revizia de articole științifice (1 revistă cotată ISI și 3 reviste indexate în BDI)

Îndrumarea studenților în elaborarea lucrărilor de licență (total 16 lucrări de licență susținute)

Membru în organizarea de manifestări științifice internaționale/naționale

-CEEPUS, 15th International Symposium and Summer School on Bioanalysis, Tîrgu Mureș, Romania, July 13-18, 2015

-Conferința Națională de Farmacoeconomie și Management Sanitar, 14-17 octombrie, Tîrgu Mureș, 2015

-Congresul Național de Farmacie, Tîrgu Mureș, 13-16 octombrie 2010

Obiectivele de dezvoltare în ceea ce privește activitatea științifică sunt trasate de următoarele direcții de cercetare, care presupun continuarea proiectelor de cercetare și valorificare rezultatelor, dar și abordarea unor teme de cercetare noi:

– continuarea studiilor care au ca temă sinteza și studiul proprietăților biologice ale complecșilor metalici ai fluorochinolonelor (sinteză, studiu, efecte, aplicabilitate terapeutică) dar și ale altor clase de compuși cu proprietăți chelatoare; testarea mai multor tipuri de metale, liganzi și efecte biologice;

– dezvoltarea de noi metode de analiză sensibile pentru determinarea compușilor de mare interes farmaceutic, atât din materii prime cât și din forme farmaceutice moderne (ex. filmele dermice);

– dezvoltarea de noi metode de analiză sensibile pentru determinarea compușilor farmaceutici care devin poluanți, din probe de mediu; dezvoltarea și validarea de noi metode de analiză a substanțelor farmaceutice optic active ca urmare a adaptării industriei farmaceutice la proprietățile stereochimice ale moleculelor active;

– aprofundarea proprietăților fizico-chimice ale compușilor de interes farmaceutic și interacțiunea lor cu receptorii farmaceutici prin inițiere în modelare moleculară și design computational.

Activități conexe direcțiilor de cercetare sunt:

-Publicarea unor articole ISI cu FI / articole BDI, experimentale (tip original research)/ tip Review , în zona galbenă și roșie de premiere UEFISCDI;

-Diseminarea rezultatelor științifice la manifestări științifice naționale și internaționale;

-Depunerea și câștigarea unor granturi/proiecte în calitate de director de proiect/membru;

-Deschidere permanentă pentru:

participarea în granturi/proiecte în calitate de membru începând cu anul 2017 – în colaborare (inclusiv interdisciplinar);

participarea în proiecte interdisciplinare în cadrul Facultății de Farmacie;

participarea în proiecte interfacultăți (Facultățile de Farmacie din alte Universități din țară/străinătate);

crearea unor oportunități de încheiere a unor contracte de cercetare cu agenți economici;

participarea la studii multicentrice naționale și internaționale.

-Inițierea în tehnici noi analitice dar și supraspecializarea în tehnicile deja cunoscute de analiză: electroforeza capilară, spectrometria IR, spectrometria de masa/ de absorbție atomică/ICP, RMN, modelare moleculară;

-Căutarea și dezvoltarea continuă a unor noi direcții de cercetare științifică;

-Îndrumarea lucrărilor de licență ale studenților:

Selectarea unor teme de actualitate cu ancoră în practica farmaceutică;

Selectarea de teme de actualitate cu aplicabilitate practică: dezvoltarea abilităților de cercetare ale studenților/în corelație cu aparatura și dotările necesare; exploatarea mai eficientă a laboratoarelor de licență/cercetare;

Selectarea de teme de actualitate monografice;

Susținerea și îndrumarea studenților către manifestările științifice studențești;

Diseminarea rezultatelor obținute în publicații științifice;

Orientarea absolvenților către alte forme de studiu postuniversitare;

Orientarea și susținerea studenților în accesarea de burse studențești și a schimburilor interuniversități (în țară și în străinătate).

-Îndrumarea doctoranzilor în cercetarea științifică, redactarea tezelor de doctorat;

-Obținerea calității de membru în colectivele redacționale reviste BDI și ISI cu FI.

Concluzii generale

Teza de abilitare “Contribuții la studiul unor complecși cu argint ai fluorochinolonelor și la dezvoltarea unor metode de electroforeză capilară pentru substanțe de interes farmaceutic”, reprezintă o sinteză a activității de cercetare din perioada post studii doctorale (2013 – 2017). Lucrarea este structurată în mai multe părți distincte și anume: realizări științifice, profesionale și academice, planul de evoluție și de dezvoltare a carierei, concluzii generale și referințe bibliografice.

În capitolul realizări științifice, profesionale și academice sunt structurate și descrise sintetic direcțiile de cercetare abordate. Astfel, cercetarea științifică consecutivă perioadei studiilor doctorale a avut două mari direcții de cercetare: obținerea de noi compuși cu proprietăți biologice și cu potențial terapeutic; dezvoltarea și optimizarea de noi metode ale electroforezei capilare cu aplicabilitate în domeniul medicamentului.

Prima direcție de cercetare a avut ca fundament experiența câștigată anterior în perioada studiilor doctorale și a fost o continuare firească a acestora. În această parte a tezei de abilitare sunt cuprinse studii originale care au avut drept scop obținerea și caracterizarea unor complecși ai argintului cu reprezentanți ai clasei fluorochinolonelor antibacteriene. Ipoteza de lucru centrală a acestei direcții de cercetare a fost procesul de coordinare cu un ligand organic – compus cu activitate farmacologică, care conduce la obținerea unui alt compus, de cele mai multe ori cu un efect biologic superior ligandului, cel mai probabil având loc o sinergie între cele două componente. În cazul a diverși complecși metalici ai fluorochinolonelor raportați până în prezent, au fost demonstrate deja efecte biologice promițătoare (antibacteriene, antifungice, antiparazitare, antivirale, anticanceroase, antiinflamatoare și chiar insulino-mimetice).

Compușii selectați din această clasă de fluorochinolone antibacteriene au fost norfloxacina, ofloxacina și levofloxacina iar metalul selectat pentru obținerea de combinații complexe a fost argintul. În urma studiilor efectuate au fost obținuți mai mulți complecși metalici ai argintului cu reprezentanții selectați din clasa fluorochinolonelor antibacteriene. Testarea activității antibacteriene a acestor compuși a venit în ideea obținerii de compuși noi care să suplinească moleculele cu efect antibiotic clasice, la care creșterea alarmantă a rezistenței bacteriane este un proces îngrijorător la nivel mondial. Pe lângă activitatea antibacteriană pe diverse specii de bacterii Gram pozitive și Gram negative a mai fost testată și activitatea antifungică.

Studiile au fost susținute de proiectul câștigat prin competiție, de tip grant intern „Cercetări privind obținerea unor compuși cu activitate terapeutică prin complexarea argintului cu reprezentanți ai clasei fluorochinolonelor” Contract de finanțare pentru execuție proiecte de cercetare Nr.2/23.12.2014, Universitatea de Medicină și Farmacie din Tîrgu Mureș. Rezultatele au fost publicate in extenso, în trei reviste cotate ISI și o revistă indexată în baze de date internaționale, BDI, și prezentate la manifestări științifice (Congresul Național de Farmacie 2016, Conferința Națională a Doctoranzilor și Postdoctoranzilor 2015, The 15th International Symposium and Summer School on Bioanalysis CEEPUS 2015, Sesiunea științifică a cadrelor didactice 2015).

Cea de a doua direcție de cercetare s-a conturat încă din timpul studiilor doctorale, fiind o continuare firească a experienței deja acumulate în domeniul tehnicii EC. În perioada postdoctorală a urmat o aprofundare a tehnicii EC, a aplicabilității sale în domeniul farmaceutic și dezvoltarea de abilități practice. Astfel, o parte semnificativă a cercetării științifice s-a canalizat către dezvoltarea și optimizarea de noi metode ale EC cu aplicabilitate în domeniul medicamentului. În cadrul acestei direcții de cercetare se disting două planuri și anume: optimizarea de tehnici ale EC pentru separarea chirală a compușilor optic activ utilizați în terapie și optimizarea și validarea de metode ale EC cu aplicabilitate în laboratoarele de analiză și în industria farmaceutică.

În industria farmaceutică sunt produse și comercializate numeroase molecule optic active ca amestecuri racemice. Este de notorietate faptul că există diferențe farmacologice în ceea ce privește efectele fiecărui enantiomer. Trendul care se conturează la nivel internațional este susținut și de instituțiile de reglementare, și anume de a se produce și a se utiliza în terapie enantiomerul pur al substanței optic active avantajos terapeutic. Posibilitatea separării celor doi enantiomeri este o mare provocare în industria farmaceutică. Metoda EC, prin adăugarea de selectori chirali în electrolitul de bază, a creat posibilitatea separării chirale a substanței active, devenind din ce în ce mai atractivă datorită numeroaselor avantaje pe care le prezintă, cel mai important fiind costurile reduse.

Compușii analizați din punct de vedere stereochimic și enantioseparați cu ajutorul tehnicii electroforezei capilare sunt din clase de mare importanță terapeutică: inhibitori de pompă de protoni (omeprazol și pantoprazol), betablocante (serie de 9 compuși optic activi), antidepresive (fluoxetina), antihistaminice H1 (cetirizina, prometazina), diuretice (indapamida), blocanți ai canalelor de calciu (amlodipina), analgezice opioide (tramadol).

În cel de al doilea plan al acestei direcții de cercetare s-a situat dezvoltarea, optimizarea și validarea unor metode de analiză EC destinate mai multor tipuri de compuși de interes farmaceutic, care pot fi utilizate cu succes în analiza calitativă și cantitativă. Printre acești compuși se numără inhibitori de aromatază (anastrozol, exemestan, letrozol), antibiotice din clasa cefalosporinelor (cefaclor, cefadroxil, cefalexina, cefuroxima, ceftazidima și ceftriaxona), compuși din clasa antituberculoaselor (izoniazida, rifampicina), statine (atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, simvastatina), antihistaminice H1 (loratadina, desloratadina, cetirizina).

La finalul părții științifice din acest capitol sunt evidențiate rezultatele activității științifice și de cercetare (proiecte, publicații care însumează un factor de impact cumulat de 26,947, cu un număr de 65 de citări în fluxul ISI Web of Science from Thomson Reuters și indice Hirsch 5, premii obținute).

Un capitol important și relevant pentru cariera academică este planul de evoluție și de dezvoltare a carierei care are mai multe direcții, respectiv activitatea didactică, creșterea competențelor didactice și de dezvoltare personală și activitatea de cercetare științifică. Pentru fiecare direcție s-a sintetizat experiența academică acumulată până în prezent și obiectivele viitoare propuse. Aceste obiective sunt permanente și concură la dezvoltarea personală în plan academic și consecutiv la creșterea calității în actul educațional care va conduce la formarea de absolvenți valoroși și profesioniști în domeniul farmaceutic.

Bibliografia acestei lucrări cuprinde un număr de 138 de referințe relevante și de actualitate, care includ și publicații personale (25 de referințe).

BIBLIOGRAFIE

Rusu A, Uivaroși V., 2013, Chinolone antibacteriene – evoluție și perspective de dezvoltare. Editura Medicală, București, 1-66/133-218.

Uivarosi V. Metal complexes of quinolone antibiotics and their applications: an update. Molecules. 2013 Sep;18(9):11153-97.

Beale Jr JM, Block JH (editors), Wilson and Gisvold’s Textbook of Organic Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2011, 206-213, Appendix.

Aldred KJ, Kerns RJ, Osheroff N. Mechanism of Quinolone Action and Resistance. Biochemistry. 2014 Feb;53(10):1565-1574.

Correia S, Poeta P, Hébraud M, Capelo JL, Igrejas G. Mechanisms of quinolone action and resistance: where do we stand? J Med Microbiol. 2017 May;66(5):551-559.

Sharma PC, Jain A, Jain S. Fluoroquinolone Antibacterials: A Review On Chemistry, Microbiology and Therapeutic Prospects, Acta Pol Pharm. 2009 Nov-Dec;66(6):587-604.

Redgrave LS, Sutton SB, Webber MA, Piddock LJ. Fluoroquinolone resistance: mechanisms, impact on bacteria, and role in evolutionary success. Trends Microbiol. 2014 Aug;22(8):438-45.

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/ (accesat în 10.08.2017)

Chaudhary AS. A review of global initiatives to fight antibiotic resistance and recent antibiotics' discovery, Acta Pharmaceutica Sinica B 2016 Nov;6(6):552–556.

Feio MJ, Sousa I, Ferreira M, Cunha-Silva L, Saraiva RG, Queirós C, et al. Fluoroquinolone-metal complexes: a route to counteract bacterial resistance? J Inorg Biochem. 2014 Sep;138:129-43.

Cars O, Hedin A, Heddini A. The global need for effective antibiotics-moving towards concerted action. Drug Resist Updat. 2011 Apr;14(2):68-9.

Akinremi CA, Obaleye JA, Amolegbe SA, Adediji JF, Bamigboye MO., 2012, Biological activities of some Fluoroquinolones-metal complexes, International Journal of Medicine and Biomedical Research, 1, 1, 24-34.

Rusu A, Hancu G, Munteanu AC, Uivarosi V. Development perspectives of silver complexes with antibacterial quinolones: Successful or not?. J Organomet Chem. 2017 Jun;839: 19-30.

Medici S, Peana M, Nurchi VM, Lachowicz JI, Crisponi G, Zoroddua MA. Noble metals in medicine: Latest advances. Coordin Chem Rev 2015 Feb;284:329–350.

Rai MK, Deshmukh SD, Ingle AP, Gade AK. Silver nanoparticles: the powerful nanoweapon against multidrug-resistant bacteria. J Appl Microbiol. 2012 May;112(5):841-52.

Percivala SL, Bowlera PG, Russell D. Bacterial resistance to silver in wound care. J Hosp Infect. 2005 May;60(1):1-7.

Jenkinson MD, Gamble C, Hartley JC, Hickey H, Hughes D, Blundell M, et al. The British antibiotic and silver-impregnated catheters for ventriculoperitoneal shunts multi-centre randomised controlled trial (the BASICS trial): study protocol. Trials. 2014 Jan;15:4.

Atkinson RA, Fikrey L, Vail A, Patel HC. Silver-impregnated external-ventricular-drain-related cerebrospinal fluid infections: a meta-analysis. J Hosp Infect. 2016 Mar;92(3):263-72.

Soayed AA, Refaat HM, Noor El-Din DA. Metal complexes of moxifloxacin-imidazole mixed ligands: Characterization and biological studies. Inorg Chim Acta. 2013 Sep; 406:230-240

Rusu A. Hancu G. Tóth G. Vancea S. Toma F. Mare A.D. Man A. Nițulescu G.M. Uivarosi V. New silver complexes with levofloxacin: Synthesis, characterization and microbiological studies. J Mol Struct. 2016 Nov;1123: 384–393.

Li M-T, Sun J-W, Sha J-Q, Wu H-B, Zhang E-L, Zheng T-Y. An unprecedented Ag–pipemidic acid complex with helical structure: Synthesis, structure and interaction with CT-DNA, J Mol Struct. 2013 Aug;1045:29-34.

Refat MS. Synthesis and characterization of norfloxacin-transition metal complexes (group 11, IB): Spectroscopic, thermal, kinetic and biological activity. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 2007 Dec 31;68(5):1393-405.

Chen Z-F, Yu L-C, Zhong D-C, Liang H, Zhu X-H, Zhou Z-Y. An unprecedented 1D ladder-like silver(I) coordination polymer with ciprofloxacin. Inorg Chem Commun. 2006 Aug;9:839-843.

Zhong D-C, Chen Z-F, Liu Y-C, Luo X-J, Barta C, Liang H. Syntheses, crystal structures of Ni(II), Ag(I)-enoxacin complexes, and their antibacterial activity J Coord Chem. 2010 Aug;63(18):3146-3154.

Debnath A, Mogha NK, Masram DT. Metal complex of the first-generation quinolone antimicrobial drug nalidixic acid: structure and its biological evaluation Appl Biochem Biotechnol. 2015 Mar;175(5):2659-67.

Li Y-X, Chen Z-F, Xiong R-G, Xue Z, Ju H-X, You X-Z. A mononuclear complex of norfloxacin with silver (I) and its properties. Inorg Chem Commun 2003 Jul;6(7):819-822.

El-Gamel NE. Silver(I) complexes as precursors to produce silver nanowires: structure characterization, antimicrobial activity and cell viability, Dalton Trans. 2013 Jul;42(27):9884-92.

European Pharmacopoeia. 9th ed. Council of Europe, Strasbourg, 2017.

Okeri HA, Arhewoh IM., 2008, Analytical profile of the fluoroquinolone antibacterials. I. Ofloxacin. African Journal of Biotechnology, 7, 6, 670-680.

Rusu A. Tóth G. Szőcs L. Kökösi J. Kraszni M, Gyéresi Á. Noszál B. Triprotic site-specific acid–base equilibria and related properties of fluoroquinolone antibacterials. J Pharm Biomed Anal 2012 Jul; 66: 50– 57.

***Levofloxacin, Tuberculosis, 2008;88(2)119–121.

***Physicians' Desk Reference. 66th edition. PDR Network, 2012, 665, 1514.

Kłosińska-Szmurło E, Grudzień M, Betlejewska-Kielak K, Pluciński F, Biernacka J, Mazurek AP. Physicochemical properties of lomefloxacin, levofloxacin, and moxifloxacin relevant to the biopharmaceutics classification system. Acta Chim Slov. 2014;61(4):827-34.

O'Neil MJ, (editor), 2006,The Merck Index – An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. Whitehouse Station, NJ: Merck and Co., Inc., 1171.

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/361259?lang=en&region=RO (accesat în 12.08.2017)

O’Neil MJ (ed): The Merck Index – An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. 13th Edition. Whitehouse Station NJ Merck and Co Inc, 2001;1526.

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/361259?lang=en&region=RO(accesat în 12.08.2017)

Sarwade SS, Jadhav WN, Khade BC. Characterization of novel complex Ciprofloxacin Ag(I). Arch Appl Sci Res. 2015;7: 36-41.

Soayed AA, Refaat HM, El-Din DAN. Characterization and biological activity of Pefloxacin–imidazole mixed ligands complexes. Inorg Chim Acta. 2014 Sep;421: 59–66.

Al-Omar MA. Ofloxacin, in Brittain HG. (editor), 2009, Profiles of Drug Substances, Excipients, and Related Methodology. Academic Press, Burlington, 265-298.

Golcu A. Ofloxacin Metal Complexes: Synthesis, Characterization, Analytical Properties, and DNA Binding Studies. Syn React Inorg Met. 2014 Jan; 44(10):1509-1520.

Rusu A, Popescu G-C, Imre S, Ion V, Vancea S, Grama AL, et al., 2016,A New Silver Complex with Ofloxacin – Preliminary Study, Acta Medica Marisiensis, 62, 2, 192-198.

Mistry BD., 2009, A Handbook of Spectroscopic Data Chemistry, Oxford Book Company, Jaipur, India, 26-63.

Grillon A, Schramm F, Kleinberg M, Jehl F. Comparative Activity of Ciprofloxacin, Levofloxacin and Moxifloxacin against Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia Assessed by Minimum Inhibitory Concentrations and Time-Kill Studies. Nguyen MH, ed. PLoS ONE. 2016 Jun;11(6):e0156690.

Croom KF, Goa KL. Levofloxacin: a review of its use in the treatment of bacterial infections in the United States. Drugs. 2003;63(24):2769-802.

Drevenšek P, Košmrlj J, Giester G, Skauge T, Sletten E, Sepčić K., Turel I. X-ray crystallographic, NMR and antimicrobial activity studies of magnesium complexes of fluoroquinolones – racemic ofloxacin and its S-form, levofloxacin. J Inorg Biochem. 2006 Nov;100(11):1755–1763.

Li Y, Chai Y, Yuan R, Liang W. Synthesis and Application of a New Copper(II) Complex Containing oflx and leof, Russian Journal of Inorganic Chemistry, 2008 May;53(5)704–706.

Vieira LM, de Almeida MV, Lourenço MC, Bezerra FA, Fontes AP. Synthesis and antitubercular activity of palladium and platinum complexes with fluoroquinolones. Eur J Med Chem. 2009 Oct;44(10):4107-11.

Tarushi A, Polatoglou E, Kljun J, Turel I, Psomas G, Kessissoglou DP. Interaction of Zn(II) with quinolone drugs: structure and biological evaluation. Dalton Trans. 2011 Oct 7;40(37):9461-73.

Patel MN, Gandhi DS, Parmar PA. DNA interaction and in-vitro antibacterial studies of fluoroquinolone based platinum(II) complexes. Inorg Chem Commun. 2012 Jan;15: 248–251.

Gouvea LR, Garcia LS, Lachter DR, Nunes PR, de Castro Pereira F, Silveira-Lacerda EP, et L.Atypical fluoroquinolone gold(III) chelates as potential anticancer agents: relevance of DNA and protein interactions for their mechanism of action. Eur J Med Chem. 2012 Sep;55:67-73.

Sousa I, Claro V, Pereira JL, Amaral AL, Cunha-Silva L, de Castro B, et al. Synthesis, characterization and antibacterial studies of a copper(II) levofloxacin ternary complex. J Inorg Biochem. 2012 May;110:64-71.

Sultana N, Arayne MS, Rizvi SBS, Haroon U, Mesaik MA. Synthesis, spectroscopic, and biological evaluation of some levofloxacin metal complexes. Med Chem Res 2013 Mar;22(3):1371–1377.

Panhwar QK, Memon S. Synthesis, Characterization and Microbial Evaluation of Metal Complexes of Molybdenum with Ofloxacin (Levo (S-form) and Dextro (R-form)) Isomers, Journal of Modern Medicinal Chemistry. 2014; 2, 1-9.

Al-Khodir FAI, Refat MS,. Vital Metal Complexes of Levofloxacin as Potential Medical Agents: Synthesis and Their Spectroscopic, Thermal, Computational, and Anticancer Studies, Russian Journal of General Chemistry, 2015; 85(3):718–730.

Schmitz J, van der Linden M, Al-Lahham A, Levina N, Pletz MW, Imöhl M. Fluoroquinolone resistance in Streptococcus pneumoniae isolates in Germany from 2004-2005 to 2014-2015. Int J Med Microbiol. 2017 Jun;307(4-5):216-222.

Redgrave LS, Sutton SB1, Webber MA, Piddock LJ. Fluoroquinolone resistance: mechanisms, impact on bacteria, and role in evolutionary success. Trends Microbiol. 2014 Aug;22(8):438-45.

Shabaan AKE, Hassan AE, Saadullah GA. Effects of protonation and deprotonation on the reactivity of quinolone: A theoretical study, Chinese Science Bulletin, 2012;57(14):1665-1671.

Park H-R, Kim TH, Bark K-M. Physicochemical properties of quinolone antibiotics in various environments. Eur J Chem. 2002 Jun; 37(6):443-460.

Dorofeev VL. Infrared spectra and the structure of drugs of the fluoroquinolone group, Pharmaceutical Chemistry Journal. 2004 Dec;38(12)693-697.

Coates J. Interpretation of infrared spectra, a practical approach, in: Meyers RA. (editor), 2000, Encyclopedia of Analytical Chemistry, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 10815.

Larkin P(j.). IR and Raman Spectroscopy Principles and Spectral Interpretation, Chapter 6: IR and Raman Spectra-Structure Correlations: Characteristic Group Frequencies, Elsevier, 2011, Amsterdam, The Netherlands, 73-115.

Fàbrega A, Madurga S, Giralt E, Vila J. Mechanism of action of and resistance to quinolones. Microb Biotechnol. 2009 Jan;2(1):40-61.

Al-Mustafa J. Magnesium, calcium and barium perchlorate complexes of ciprofloxacin and norfloxacin. Acta Chim Slov. 2002;49:457−466.

Sadeek SA. Synthesis, thermogravimetric analysis, infrared, electronic and mass spectra of Mn(II), Co(II) and Fe(III) norfloxacin complexes. J Mol Struct. 2005 Oct;753(1-3):1–12.

Shaikh AR, Giridhar R, Yadav MR. Bismuth-norfloxacin complex: Synthesis, physicochemical and antimicrobial evaluation. Int J Pharm. 2007 Mar;332(1-2):24-30. 24–30.

Shaikh AR, Giridhar R, Megraud F, Yadav MR. Metalloantibiotics: Synthesis, characterization and antimicrobial evaluation of bismuth-fluoroquinolone complexes against Helicobacter Pylori. Acta Pharm. 2009 Sep;59(3):259-71.

Breda SA, Jimenez-Kairuz AF, Manzo RH, Olivera ME. Solubility behavior and biopharmaceutical classification of novel high-solubility ciprofloxacin and norfloxacin pharmaceutical derivatives. Int J Pharm. 2009 Apr;371(1-2):106-13.

Golovnev NN, Kirik SD, Golovneva II. Synthesis of norfloxacin compounds with cobalt(II), zinc(II), cadmium(II), and mercury(II). Russ J Inorg Chem. 2009 Feb;54(2):223–225.

Batista DGJ, da Silva PB, Stivanin L, Lachter DR, Silva RS, Felcman J, et al. Co(II), Mn(II) and Cu(II) complexes of fluoroquinolones: Synthesis, spectroscopical studies and biological evaluation against Trypanosoma cruzi. Polyhedron 2011 Jun;30(10):1718–1725.

Patel MN, Joshi HN, Patel CR. Copper(II) complexes with norfloxacin and neutral terpyridines: Cytotoxic, antibacterial, superoxide dismutase and DNA-interaction, Polyhedron. 2012 Jun;40(1):159-167.

Rusu A. Hancu G. Tóth G. Toma F. Mare A.D. Man A. Velescu B.S. Uivarosi V. Synthesis, characterization and microbiological activity evaluation of two silver complexes with norfloxacin. Farmacia. 2016 Apr;64(6):922-932.

Chongcharoen W, Byrn SR, Sutanthavibul N. Solid state interconversion between anhydrous norfloxacin and its hydrates. J Pharm Sci. 2008 Jan;97(1):473-489.

Neugebauer U, Szeghalmi A, Schmitt M, Kiefer W, Popp J, Holzgrabe U.Vibrational spectroscopic characterization of fluoroquinolones, Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 2005 May;61(7):1505-17.

Gurtovenko AA, Anwar J. Modulating the structure and properties of cell membranes: the molecular mechanism of action of dimethyl sulfoxide. J Phys Chem B. 2007 Sep;111(35):10453-60.

Santos NC, Figueira-Coelho J, Martins-Silva J, Saldanha C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects. Biochem Pharmacol. 2003 Apr;65(7):1035-41.

Rusu A, Hancu G, Uivaroși V. Fluoroquinolone pollution of food, water and soil, and bacterial resistance, Environ Chem Lett 2015 Mar;13(1)21-36.

Al Azzam KMM, Saad B., 2012, Determination of Drugs using Cpillary Electrophoresis, LAP LAMBERT Academic Publishing Saarbrücken, Germany, 26-62.

Tagliaro F, Manetto G, Crivellente F, Smith FP. A brief introduction to capillary electrophoresis, Forensic Science International, 1998 Apr;92(2-3):75–88.

Altria KD. 1998, Analysis of Pharmaceuticals by Capillary Electrophoresis, braunschweig/Wiesbaden: Chromatographia CE-Series, Vieweg, 1-66.

Sekhon BS. An overview of capillary electrophoresis: Pharmaceutical, biopharmaceutical and biotechnology applications. J Pharm Educ Res. 2011 Dec;2(2):2-36.

Chen Z, Zhong Z, Xia Z, Yang F, Mu X. Separation of Fluoroquinolones by MEKC Modified with Hydrophobic Ionic Liquid as a Modifier. Chromatographia. 2012 Jan;75(1-2):65–70.

Hancu G, Simon B, Rusu A, Mircia E, Gyeresi A. Principles of Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography Applied in Pharmaceutical Analysis, Adv Pharm Bull. 2013;3(1):1–8.

Terabe S. Capillary Separation: Micellar Electrokinetic Chromatography. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 2009;2:99-120.

http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm072109.pdf

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2010/11/WC500099271.pdf

Boone CM, Waterval JC, Lingeman H, Ensing K, Underberg WJ. Capillary electrophoresis as a versatile tool for the bioanalysis of drugs–a review. J Pharm Biomed Anal. 1999 Sep;20(6):831-63.

Blanco M, Valverde I. Choice of chiral selector for enantioseparation by capillary electrophoresis. Trend Anal Chem. 2003 Jul-Aug;22(7):428–39.

Prokhorova AF, Shapovalova EN, Shpigun OA. Chiral analysis of pharmaceuticals by capillary electrophoresis using antibiotics as chiral selectors. J Pharm Biomed Anal. 2010 Dec;53(5):1170-9.

Hancu G. Papp L.A. Rusu A. Chiral Separation of the Enantiomers of Omeprazole and Pantoprazole by Capillary Electrophoresis. Chromatographia. 2015 Feb;78(3-4):279-284.

Noubarani M, Keyhanfar F, Motevalian M, Mahmoudian M. Improved HPLC method for determination of four PPIs, omeprazole, pantoprazole, lansoprazole and rabeprazole in human plasma. J Pharm Pharm Sci. 2010;13(1):1-10.

Cârcu-Dobrin M, Budău M, Hancu G, Gagyi L, Rusu A, Kelemen H. Enantioselective analysis of fluoxetine in pharmaceutical formulations by capillary zone electrophoresis, Saudi Pharmaceutical Journal. 2017 Mar;25(3):397–403.

Budău M, Hancu G, Szabó ZI, Kelemen H, Rusu A, Muntean DL, Cârje AG. Captisol® as chiral selector in capillary electrophoresis of non-acidic drugs. J Chil Chem Soc. 2017;62(3)3562-3567.

Hancu G, Budău M, Papp LA, Rusu A, Mircia E. Chiral separation of cetirizine enantiomers by cyclodextrin mediated capillary electrophoresis. Indonesian J Pharm. 2014;25(4):223–229.

Hancu G, Sămărghițan C, Rusu A, Mircia E. Sotalol chiral separation by capillary electrophoresis. J Chil Chem Soc 2014;59:2559–2562.

Muntean DL, Hancu G, Kelemen H, Rusu A, Ciurba A. Cyclodextrine Screening for the Chiral Separation of Beta-blocker Derivatives. Rev Chim (București). 2015;66(7):1019-1023.

Hancu G, Cârcu-Dobrin M, Budău M, Rusu A. Analytical methodologies for the stereoselective determination of fluoxetine: an overview, Biomed Chromatogr 2017 Jul; [Epub ahead of print]

Trevor A, Katzung B, Masters S, Knuidering-Hall M, 2012, Katzung & Trevor's Pharmacology Examination and Board Review, McGraw-Hill Education, New York, chapter 40.

DiGiorgio L, Sadeghi-Nejad H. Off label therapies for testosterone replacement. Transl Androl Urol. 2016 Dec;5(6):844-849.

Stephens SM, Polotsky AJ. Big enough for an aromatase inhibitor? How adiposity affects male fertility. Semin Reprod Med. 2013 Jul;31(4):251-7.

Vari CE, Ősz BE, Miklos A, Berbecaru-Iovan A, Tero-Vescan A. Aromatase inhibitors in men – off-label use, misuse, abuse and doping, Farmacia, 2016;64 (6):813-818.

https://www.wada-ama.org/sites/default/files/resources/files/2016-09-29_-_wada_prohibited_list_2017_eng_final.pdf (accesat în 11.08.2017)

El Osta R, Almont T, Diligent C, Hubert N, Eschwège P, Hubert J. Anabolic steroids abuse and male infertility. Basic Clin Androl. 2016 Feb;26:2.

Nieschlag E, Vorona E. Mechanisms in Endocrinology: Medical consequences of doping with anabolic androgenic steroids: effects on reproductive functions. Eur J Endocrinol. 2015 Aug;173(2):R47-58.

Rodríguez Flores J, Berzas Nevado JJ, Castañeda Peñalvo G, Rodríguez Cáceres MI. Micellar electrokinetic capillary chromatographic method for simultaneous determination of drugs used to treat advanced – breast cancer, Chromatographia. 2002 Sep;56(5-6):283-288.

Rodríguez-Flores J, Contento Salcedo AM, Villaseñor Llerena MJ, Muñoz Fernández L. Micellar electrokinetic chromatographic screening of letrozole and its metabolite in human urine: validation and robustness/ruggedness evaluation. Electrophoresis. 2008 Feb;29(4):811-818.

Rodríguez Flores J, Salcedo AM, Llerena MJ, Fernández LM. Micellar electrokinetic chromatographic method for the determination of letrozole, citalopram and their metabolites in human urine. J Chromatogr A. 2008 Mar;1185(2):281-290.

Rodríguez-Flores J, Contento Salcedo AM, Muñoz Fernández L. Rapid quantitative analysis of letrozole, fluoxetine and their metabolites in biological and environmental samples by MEKC. Electrophoresis. 2009 Feb;30(4):624-632.

O'Neil MJ (editor), 2001, The Merck Index – An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. 13th Edition, Whitehouse Station, NJ: Merck and Co Inc, 974.

Wellington K, Faulds DM. Anastrozole: in early breast cancer. Drugs. 2002;62(17):2483-90; discussion 2491-2.

Mandal P, Dan S, Ghosh B, Das A, Das D, Pal TP. Bioanalytical Method Development and Validation of Letrozole by LC-ESI-MS/MS in Human Plasma. J Anal Pharm Res 2017;4(1):00093.

https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/99/20-753_Aromasin_biopharmr_P1.pdf (accesat în 11.08.2017)

MarvinSketch – ChemAxon https://www.chemaxon.com/products/marvin/marvinsketch/ (Accesat la 11.08.2017).

Schmitt-Kopplin P, Fekete A, 2008, Capillary Electrophoresis Methods and Protocols Methods in Molecular Biology, 384, 593.

Yavuz B, Sarisözen C, Vural I, Bilensoy E, Sumnu M. An alternative cyclodextrin based formulation for oral anticancer drug exemestane: In vitro and cell culture studies. J Control Release. 2010 Nov;148(1):e83-4.

Li G, Li F, Deng L, Fang X, Zou H, Xu K, Li T, Tan G. Increased yield of biotransformation of exemestane with β-cyclodextrin complexation technique. Steroids. 2013 Nov;78(11):1148-51.

Shaikh MS I, Derle ND, Bhamber R. Permeability Enhancement Techniques for Poorly Permeable Drugs: A Review, Journal of Applied Pharmaceutical Science 2012;02(06): 34-39.

Wempe MF, Buchanan CM, Buchanan NL, Edgar KJ, Hanley GA, Ramsey MG, et al. Pharmacokinetics of letrozole in male and female rats: influence of complexation with hydroxybutenyl-beta cyclodextrin. J Pharm Pharmacol. 2007 Jun;59(6):795-802.

Rusu A, Hancu G, Völgyi G, Tóth G, Noszál B, Gyéresi A. Separation and determination of quinolone antibacterials by capillary electrophoresis. J Chromatogr Sci. 2014 Sep;52(8):919-25.

http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf (accesat în 11.08.2017).

Pfister CU1, Martoni A, Zamagni C, Lelli G, De Braud F, Souppart C, et al. Effect of age and single versus multiple dose pharmacokinetics of letrozole (Femara) in breast cancer patients. Biopharm Drug Dispos. 2001 Jul;22(5):191-197.

http://www.bccancer.bc.ca/drug-database-site/Drug%20Index/Letrozole_monograph_1April2011.pdf (accesat în 12.08.2017)

http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/97/20726_FEMARA%202.5MG_BIOPHARMR.PDF (Accessed 14 May 2017)

Acharjya SK, Mallick P, Panda P, Kumar KR, Annapurna MM. Spectrophotometric methods for the determination of letrozole in bulk and pharmaceutical dosage forms. J Adv Pharm Tech Res. 2010 Jul;1(3):348-353.

Rusu A, Sbanca M-A, Todoran N, Vari C-E., 2017, Letrozole Determination by Capillary Zone Electrophoresis and UV Spectrophotometry Methods, Acta Medica Marisiensis, 63, 2, 80-86.

***Letrozole – DrugBank data base (https://www.drugbank.ca/drugs/DB01006) (accesat în 11.08.2017)

Orlandini S, Gotti R, Furlanetto S. Multivariate optimization of capillary electrophoresis methods: a critical review. J Pharm Biomed Anal. 2014 Jan;87:290-307.

Mondal N, Pal TK, Ghosal SK. Development and Validation of a Spectrophotometric Method for Estimation of Letrozole in Bulk and Pharmaceutical Formulation, Pharmazie. 2007 Aug;62(8):597-598.

Patil SM, Galatage ST, Choudhary AU. Development of UV spectrophotometric method for estimation of letrozole in pure and pharmaceutical dosage form, Indo American Journal of Pharmaceutical Research. 2013;3:5541-5548.

***UV and IR Spectra, Pharmaceutical Substances (UV and IR) and Pharmaceutical and Cosmetic Excipients (IR), in Dibbern HW, Müller RM, Wirbitzki E(editors), 2002, Editio Cantor Verlag, Aulendor, 873.

Hancu G, Kelemen H, Rusu A, Gyeresi A. Development of capillary electrophoresis method for the simultaneous determination of cephalosporins. J Serb Chem Soc 2013;78(9)1413-1423.

Rusu A, Hancu G, 2016, Chimie farmaceutică. Sulfonamide antibacteriene și antibiotice β-lactamice, Editura University Press, Tîrgu Mureș, 134-202.

Iriminescu D, Cârcu-Dobrin M, Hancu G, Mircia E, Kelemen H, Rusu A, Tilinca M. Simultaneous determination of isoniazid and rifampicin by micellar electrokinetic chromatography, Studia Universitatis "Vasile Goldiș" Seria Științele Vieții (Life Sciences Series). 2016;26(3):353-357.

Mircia E, Hancu G, Rusu A, Cazacu A, Balaci T, Soare R., 2016, Determination of HMG-CoA reductase inhibitors by micellar electrokinetic chromatography, Acta Medica Marisiensis, 62,2,187-191.

Hancu G, Câmpian C, Rusu A, Mircia E, Kelemen H. Simultaneous Determination of Loratadine, Desloratadine and Cetirizine by Capillary Zone Electrophoresis. Adv Pharm Bull. 2014;4(2):161-165.

Hancu G, Tero-Vescan A, Rusu A., 2015, Capillary electrophoresis in the analysis of polyunsaturated fatty acids, Acta Medica Marisiensis, 61, 4, 378-381.

Berța (Grama) L, Boda F, Borodi G, Rusu A, Kelemen H, Man A, et al. Two new sandwich-type compounds based on {AsW9} with Pd2+ and Pt4+ cations – synthesis, characterization and antibacterial activity. Farmacia 2017;65(1):63-68.

Tilinca M, Hancu G, Mircia E, Iriminescu D, Rusu A, Vlad RA, Barabás E. Simultaneous determination of isoniazid and rifampicin by UV spectrophotometry. Farmacia. 2017;65(2)219-224.