STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIU [303001]

STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIU

I.1. IDENTIFICAREA DE PERSOANE PRIN AMPRENTA GENETICĂ

I.1.1. Importanța amprentei genetice

Identificarea unui individ într-o [anonimizat]-un mod analog cartării scrisorilor de către Serviciul Poștal[]. Populația României are aproximativ 20 [anonimizat], orașul, strada, [anonimizat]. [anonimizat]. Dacă markerii x, y, z etc., [anonimizat]. Certitudinea identificării crește odată cu creșterea numărului de markeri genetici.

Progresele rapide făcute în cercetarea genomului uman și deosebitul potențial aplicativ i-au determinat pe oamenii de știință să considere genetica una dintre cele mai importante discipline ale secolului XXI.

Genetica este știința care studiază fenomenele eredității și variabilității în organismele vii iar amprenta genetică este studiată și stabilită în baza acestei discipline. [anonimizat], domeniul judiciar (genetica judiciară), bioarheologia, [anonimizat], s.a.

Analiza genetică a devenit o [anonimizat]. Până în 1985, studierea moleculei de ADN nu a constituit o preocupare majoră pentru criminalistică. Alec Jeffreys și colegii săi de la Universitatea din Lancaster (Anglia) [anonimizat] o persoană la locul săvârșirii infracțiunii. Identificarea ADN a constituit pentru științele criminalistice una dintre cele mai mari descoperiri. Astfel, amprenta genetică reprezintă un al doilea mijloc foarte puternic de identificare a [anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat][]:

identificarea infractorilor în toate tipurile de infracțiuni (omor, viol, furt, tâlhărie etc.) după urmele acestora lăsate la locul faptei sau asupra victimelor;

identificarea victimelor în cazul omorurilor și pruncuciderilor;

excluderea suspecților care nu au participat la comiterea infracțiunii;

[anonimizat], [anonimizat];

elucidarea cauzelor unor accidente aviatice și rutiere pornind de la urmele și microurmele biologice remanente;

elucidarea unor cazuri de răpiri și sechestrări de persoane, a traficului ilegal de persoane și de organe;

identificarea autorilor de agresiuni fizice;

identificarea persoanelor cu identitate necunoscută și a cadavrelor cu identitate necunoscută;

soluționarea cazurilor de paternitate;

soluționarea cazurilor de maternitate (schimburi accidentale sau voite de copii în maternități, copii abandonați sau pierduți, etc.);

rezolvarea cazurilor de imigrație (reîntregirea familiilor);

identificarea feților concepuți prin fertilizare in vitro sau a mamelor surogat;

stabilirea unor relații de descendență biologică în scopul aflării adevărului istoric sau din interese politice;

stabilirea unor relatii de înrudire la cererea societăților de asigurare.

Materialul genetic supus investigării criminalistice prin metoda genotipării ADN este reprezentat de urmele biologice lăsate la locul faptei sau transferate prin contact direct ori prin stropire, care se prezintă sub formă de pete, stropi, depozite, particule, lichide, cruste. Dintre urmele biologice recoltate cu ocazia cercetării infracțiunilor, îndeosebi a celor îndreptate împotriva vieții, integrității corporale și sănătății persoanei, sunt cunoscute: sângele, sperma, saliva, transpirația, firele de păr, diverse secreții, fragmente de țesut și oase, etc.

Au fost dezvoltate metode care oferă posibilitatea de genotipare a microurmelor biologice (celule epiteliale) remanente pe diverse tipuri de suporturi: pe corpul sau hainele unei persoane sau pe obiecte manevrate de persoane.

În general transferul materialului biologic (ADN) se poate face prin depunerea directă (transfer direct) a materialului biologic sau prin transferul secundar (transferul indirect) al acestuia.

De cele mai multe ori în criminalistică ne întâlnim cu cantități foarte mici de material biologic pretabil a fi recoltat. Mai mult, există cazuri care necesită o abordare diferită de analiză genetică clasică precum acelea care implică prezența unor probe biologice aflate într-un stadiu avansat de degradare[] sau a unor probe biologice cu inhibitori.

Genotiparea judiciară utilizează pe scară largă markerii STR (short tandem repeats). Analiza genetică folosind markerii STR multiplex se realizează cu un randament optim și implicit cu obținerea unor rezultate de calitate într-un interval relativ îngust de valori ale cantității de ADN initial, respectiv 0,5 – 2,0 ng[].

O celulă haploidă conține 3 pg ADN, respectiv o celulă diploidă 6 pg ADN. Continuând raționamentul reiese că 1 ng ADN corespunde unei cantități de ADN ce provine de la 152 celule diploide, iar unei cantități de ADN matriță mai mici de 500 pg îi corespund aproximativ 76 celule diploide[].

I.1.2. Procesul de amplificare PCR

„Laboratoarele de profilare ADN au beneficiat foarte mult de descoperirea reacției de polimerizare în lanț – PCR. Descrisă pentru prima dată în anul 1985 de Kary Mullis, de la firma Cetus Corporation, Grupul de genetică umană, PCR a revoluționat biologia moleculară prin crearea posibilității de a se realiza milioane de copii ale unei anumite secvențe ale ADN într-un timp de numai câteva ore. Impactul metodei PCR a fost atât de mare încât realizatorul ei, Kary Mullis, a primit premiul Nobel în 1993.

Fără capacitatea de a multiplica o probă de ADN, multe din probele criminalistice ar fi imposibil de analizat. Probele de ADN ridicate de la fața locului sunt limitate cantitativ și calitativ și de aceea obținerea unei probe mai pure și mai concentrate este extrem de importantă.

Analiza genetică a unui număr foarte mic de celule nucleate, respectiv a unei cantități foarte mici de material biologic, se face printr-o abordare diferită față de situațiile uzuale și are ca scop generarea prin reacția de amplificare a unei cantități suficiente de copii ale fragmentelor de ADN pentru a se obține un profil genetic valorificabil.

Cea mai utilizată tehnică a analizei genetice judiciare este cunoscută ca fiind „Short Tanden Repeat” – genotiparea fragmentelor scurte repetitive de un anumit număr de ori, localizate in zonele neinformaționale ale genomului. Astfel, din fiecare urmă sau microurmă biologică umană care conține celule nucleate se extrage ADN ce urmează a fi supus unei reacții de amplificare – „Polymerase Chain Reaction” – un proces enzimatic prin care regiunile sunt replicate (multiplicate) de 28-34 ori, generându-se cca. un bilion (109) copii”[1]. Această tehnică evidențiază numărul de repetări ale unităților de bază și le transformă în valori alfanumerice, cunoscute ca profile genetice. Această reacție de multiplicare a regiunilor ADN țintă (se utilizează primeri specifici pentru zonele de interes) este extrem de importantă în obținerea unei cantități suficiente de ADN pentru determinarea de identificări pe bază de profile genetice. De aceea în această etapă este foarte importantă atât cantitatea inițială de ADN cât și calitatea acestuia respectiv lipsa inhibitorilor PCR sau a ADN-ului degradat în vederea obținerii unei multiplicări eficiente.

I.1.2.1. Markeri genetici STR, țintele amplificării PCR

Pricipiul de bază al obținerii de profile genetice umane constă în analiza fragmentelor de ADN multiplicate, corespunzătoare locilor (markerilor genetici) respectivi. Locii STR (short tandem repeats) sunt secvențe ADN-repetitive în tandem, ușor multiplicabile prin reacția polimerizării în lanț (PCR-polymerase chain reaction) și cu un înalt grad de polimorfism. În același timp, alelele locilor STR (forme alternative ale aceleiași gene) prezintă o mare stabilitate în decursul generațiilor. Aceste caracteristici fac din locii STR markeri valoroși în procesele de identificare de persoane [].

Markerii STR (short tandem repeat) sunt secvențe compuse din 2 până la 6 perechi de baze repetate în tandem. Markerii STR sunt răspândiți în genomul uman, întâlnindu-se în medie la fiecare 10000 nucleotide.

STR au devenit markeri răspândiți ai ADN deoarece se amplifică ușor prin reacția de polimerizare în lanț, fără diferențieri în funcție de alelă. Aceasta se explică prin faptul că alelele unui individ heterozigot au dimensiuni apropriate, deoarece dimensiunea blocului repetitiv este mică. Numărul blocurilor repetitive la markerii STR are o mare variabilitate individuală, ceea ce îi face eficienți pentru identificare[1].

Datorită răspândirii randomice în întreg genomul uman, a dimensiunilor relativ mici și a variabilității ridicate la nivelul indivizilor unei populații, aceste secvențe au devenit instrumente genetice importante pentru numeroase aplicații cum ar fi identificarea de persoană, realizarea harților genetice, localizarea genetică a unor boli, filogenie, etc.

Pentru determinarea profilului genetic al unei persoane se folosesc mai mulți markeri genetici sau loci, localizați pe minisateliți ai diferiților cromozomi. Cu cât sunt utilizați mai multi markeri cu atât mai mică este probabilitatea ca doi indivizi să posede genotipuri identice.

Nomenclatura Markerilor STR

a) Secvențe ADN Intronice – denumire derivată din denumirea genei în care se găsește segmentul intronic Ex: TH01 – secvența repetată în tandem localizată în intronul unu al genei pentru tirozin-hidroxilază;

b) Secvențe ADN Intergenice – denumire standard de tipul Dn1Sn2, unde D – macromolecula de ADN, n1 – numărul cromozomului, S – o singura copie în întreg genomul și n2 – numărul locusului pe cromozomul respectiv, ex: D5S818.

Nomenclatura Alelelor

Conform recomandărilor Societății Internaționale de Hemogenetică (ISFH) din 1994 și 1997, alelele markerilor STR trebuie denumite ținând cont de numărul unităților repetitive ale markerului în cauză, iar atunci când există alele care se abat de la unitatea repetitivă completă, se ia în considerare numărul unităților repetitive complete, urmat de punct și numărul de nucleotide din unitatea repetitivă incompletă[].

Exemplu: Alela 9 a markerului TH01 prezintă secvența AATG repetată de 9 ori: [AATG]9

În ceea ce privește direcția de citire a macromoleculei de ADN se folosește pentru STR intronic – direcția de codificare, iar pentru STR intergenic – prima secvență descrisă în literatura de specialitate (Genbank), respectiv prima secvență care definește unitatea repetitivă.

Aceste măsuri au fost luate în urma confuziilor care se creau în momentul în care se comparau markerii STR (și respectiv unitățile repetitive ale acestora) în literatura de specialitate. Existau autori care publicau markerul TH01 cu secvența „AATG”, pe când alți autori publicau același marker, folosind catena complementară, etichetând ca unitate repetitivă secvența „TCAT”[].

I.1.2.2. Amplificarea markerilor STR prin metoda PCR

Markerii STR sunt stabili și polimorfici, ei variind ca dimensiune (număr de unități repetitive) de la o persoană la alta. Cantitatea de STR produși după amplificare este proporțională cu cantitatea inițială de secvență țintă, reacția PCR decurgând cu un număr limitat de cicluri. Numărul optim de cicluri se evaluează în scopul obținerii, la persoanele normale heterozigote, a două picuri cu activitate fluorescentă corespunzătoare prezenței a două alele diferite la fiecare locus țintă[]. Dacă markerul STR este înalt polimorfic, doar câteva persoane normale ar putea fi homozigote și să apară un singur pic la locusul respectiv (o alelă). La persoanele cu trisomie ADN-ul amplificat se va prezenta fie cu două picuri, unul dintre ele fiind de două ori mai mare decât celălalt (dialelic) sau cu un al treilea pic la un locus (trialelic).

Proiectarea primerilor pentru markerii secvențelor repetitive scurte (STR) prezintă unele dificultăți suplimentare. Primerii trebuie astfel ajustați în funcție de markeri pentru a se realiza o rezoluție bună pentru separarea locilor marcați cu același colorant fluorescent.

În plus primerii trebuie să conducă la o amplificare puternică, cu amplitudine bine echilibrată atât între diferitele locusuri cât și față de produșii de amplificare nespecifică, ce pot interfera cu interpretarea corectă a profilului probei.

Markerii STR pot fi amplificați prin metoda PCR monoplex sau multiplex. Datorită dimensiunilor relativ mici, tendința generală este aceea de a amplifica acești markeri în sisteme multiplex. Această tendință este dictată de nevoia acută din genetica judiciară (identificarea de persoană) de a avea un număr suficient de markeri încât probabilitatea de regăsire a unei persoane cu un profil genetic identic pentru un set de markeri să fie foarte mică, dar și de diminuarea costurilor de analiză.

I.1.3. Electroforeza capilară – oglinda amplificării PCR (eficientă sau eșuată)

Vizualizarea ampliconilor rezultați în urma amplificării PCR a markerilor STR

Vizualizarea ampliconilor rezultați în urma amplificării markerilor STR, s-a realizat inițial folosind electoforeza în gel de agaroză, apoi electroforeza în gel de poliacrilamidă (tehnica PAGE) dar odată cu mărirea numărului de markeri amplificați (sistem multiplex) era necesară o nouă metodă mult mai sensibilă în detectarea ampliconilor similari ca mărime în perechi de baze. Ținând cont de această cerință, au fost creați primeri marcați fluorescent care permiteau în gel de poliacrilamidă decelarea între ampliconi. Mai mult decât atât, între secvența primer si fluorocromi s-au interpus secvențe non-nucleotidice numite „linkeri” care accentuează alături de fluorescența emisă diferențierea secvențelor ampliconice apropiate ca număr de perechi de baze, făcând posibilă amplificarea în sistem multiplex.

Metoda scanării gelurilor de poliacrilamidă cu ampliconi marcați cu fluorocromi a fost depășită de o metoda mult mai rapidă si mai eficientă din punct de vedere al calității rezultatelor, al reproductibilității și al rapidității cu care se realizează – Electroforeza Capilară (realizată cu aparatele ABI Prism 310, 3100, 377 sau 3500).

Electroforeza capilară folosește un tub capilar îngust umplut cu soluție de polimer, în locul gelului, pentru a se realiza separarea dimensională a ADN-ului. Raportul mare suprafață/volum de la tubul capilar are ca efect disiparea eficientă a căldurii generate în procesul de electroforeză, ceea ce permite folosirea unei tensiuni mari pentru separare. Timpii de separare în electroforeza capilară sunt în domeniul 5-30 minute, în comparație cu timpii de ordinul a câteva ore necesari la sistemele de gel plan, deoarece se pot folosi tensiuni mari [1].

Deși analiza unei probe prin electroforeza capilară este rapidă, procesul este secvențial (se analizează câte o singură probă), iar timpul per probă nu este mai bun decât atunci când se procesează simultan mai multe probe. De aceea productivitatea este de același ordin de mărime, sau chiar mai mică, decât în cazul metodelor electroforetice convenționale. Pentru a înlătura acest inconvenient, au fost dezvoltate sisteme cu șiruri de capilare, cu 96 de capilare în paralel, care măresc mult productivitatea analizelor. Probele de ADN sunt încărcate în capilar prin aplicarea unei tensiuni electrice asupra fiecărei probe pentru o perioadă definită de timp sau prin aplicarea unei presiuni asupra probei și dislocarea prin aceasta a unei cantități de probă în capătul de intrare al capilarului. În cazul ABI Prism 310 se folosește numai aplicarea unei tensiuni, adică modul „electrocinetic” de injectare a probelor.

Avantajele utilizării markerilor STR față de alte metode/tehnici de tipizare ADN

La ora actuală, markerii STR sunt cei mai folosiți în domenii precum genetica judiciară, paleogenetică, genetica populațiilor umane, etc., datorită următoarelor avantaje[]:

Ușurința în amplificare;

Ambele alele în cazul heterozigoților se amplifică bine;

Număr de repetiții cu înaltă variabilitate;

Foarte utili în cazuri de identificare;

Răspândire randomică în întreg genomul uman;

Rezultate bune în cazul probelor de ADN degradat.

Putem spune că o amplificare PCR a fost una reușită dacă în urma rezultatelor furnizate prin electroforeză s-au obținut următoarele:

– profil genetic complet la toți markerii STR utilizați;

– înălțimi RFU ale alelelor peste standardul minim analitic;

– echilibru între alele la fiecare marker heterozigot.

Obstacole în procesul de amplificare PCR și implicit în identificarea prin amprenta genetică:

Cantitate insuficientă de ADN matriță;

ADN degradat;

Inhibitori PCR;

Probleme legate de contaminare.

I.1.4.Inhibitori ai procesului de amplificare PCR

Inhibitorii ADN cunoscuți includ hemul din sânge[], colagenul din țesuturi[], acidul humic din sol și plante[], colorantul indigo din denim[], melanina din păr și piele[], ionii de calciu din lapte și oase[] etc.

I.1.4.1. Efecte și mecanisme ale inhibitorilor PCR

O amplificare PCR cu markeri STR a unui extract ADN cu inhibitori se reflectă în primul rând în rezultatele obținute: profil parțial sau incomplet pentru numărul de markeri STR utilizați, rezultate eronate (marker fals homozigot sau marker heterozigot cu diferențe mari între înălțimile celor două alele constituiente) sau rezultate nule (ADN-ul de interes nu s-a amplificat deloc). Aceleași rezultate se obțin și în cazul probelor degradate, motiv pentru care, de multe ori, probele ADN cu inhibitori sunt confundate cu cele degradate [1].

Dacă se cunosc efectele inhibitorilor PCR, mecanismele lor de acțiune sunt adesea neclare. În urma unor experimente Real Time PCR cu variația temperaturilor de topire, a secvențelor primerilor și a lungimilor ampliconilor, s-a determinat că unii primeri cu temperatură mai mare de topire sunt mai rezistenți la inhibitori[]. Cercetările mecanismelor de acțiune ale inhibitorilor asupra componentelor PCR s-au canalizat mai mult asupra polimerazelor. Polimeraza poate fi denaturată de detergenți sau fenol[], degradată de proteinaze[] sau poate fi inhibată prin blocarea situsului activ de către inhibitori, cum ar fi hemul din sânge[]. Cationii divalenți (Ca2+, Mg2+) exercită un efect inhibitor mărit asupra polimerazelor față de cei monovalenți (K+,Na+); pentru polimerazele AmplitaqGOLD și Taq, cele mai utilizate în kiturile de amplificare pentru identificare umană, ionul de Ca2+ are efectul inhibitor cel mai mare[]. S-a dovedit astfel că o concentrație a Ca2+ mai mare de 3mM are efect inhibitor asupra polimerazei AmplitaqGOLD, posibil datorită competiției cu ionii de Mg2+ din mediul de reacție. Această problemă poate fi rezolvată prin adăugarea unei cantități mai mari de Mg2+ în amestecul de reacție. De asemenea o concentrație a ionilor de K+ mai mare de 75mM inhibă total reacția de amplificare cu polimeraza AmplitaqGOLD[] iar o concentrație a ionilor de Mg2+ mai mare de 15 mM inhibă activitatea polimerazei Taq DNA. Acidul humic în concentrație de 0,08 mg/mL inhibă și cea mai sensibilă Taq polimerază iar 0,5-17 mg/mL acid humic inhibă enzimele de restricție[]. Acizii humici și taninurile se oxidează formând chinone care se leagă covalent la polimeraza ADN și o inactivează, funcție de cantitatea acestora prezentă în probă. De exemplu concentrații mai mari de 1,4 ng/ 25 mL taninuri duc la inhibarea completă a enzimei TaqMan real time PCR[]. Colagenul și hemul din sânge inhibă Taq polimeraza în timp ce taninul are acțiune inhibitoare atât asupra moleculei de ADN legându-se covalent de aceasta cât și asupra polimerazei.

În orice caz, inhibiția PCR este mai evidentă la extractele cu ADN degradat (oase vechi, țesuturi în putrefacție) comparativ cu cele care conțin ADN modern[]. Pentru acestea din urmă de cele mai multe ori sunt suficiente metodele de purificare bazate pe silica (membrane sau particule magnetice) sau se poate efectua o reextracție cu silica pentru îndepărtarea totală sau parțială a inhibitorilor.

În afară de indigo, ftalocianinele nesubstituite împreunnă cu ftalocianinele de cupru (II) mono- și polisulfonate sunt utilizate frecvent ca pigmenți de bază pentru denim (reactivul Blue 15, reactivul Blue 21[], Reactivul Blue 38[] și C.I. Direct Blue 199[]).

Oameni de știință din domeniul medical au afirmat că ftalocianina, colorant obișnuit din denim, poate fi folosită pentru eliminarea celulelor canceroase datorită proprietății acesteia de distrugere a celulelor; cercetările efectuate în ultimii ani cu privire la proprietățile ftalocianinelor au demonstrat că acestea formează complecși cu ADN-ul mono- și dublucatenar și pot fi utilizate ca inhibitori pentru stoparea înmulțirii celulelor canceroase. Ftalocianinele anionice inhibă activitatea telomerazei chiar și cu ADN dublucatenar în exces datorită legăturilor selective cu telomerul G-guadruplex[] formate prin interacții de tip π–π stacking și legături electrostatice. De asemenea derivați cationici ai ftalocianinelor, solubili în apă, s-a demonstrat a fi inhibitori puternici ai activității telomerazei prin legarea lor la G-guadruplex și blocarea sintezei ADN în timpul procesului de amplificare[].

Telomerazele sunt constituite din secvențe repetitive bogate în guanină (TTAGGG). Ele constituie porțiunea finală a cromozomilor la eucariote și au un rol semnificativ în imortalizarea celulelor canceroase[]. ADN telomeric conține la capătul 3’ o prelungire a catenei bogate în guanină, la capătul cromozomului. Lungimea telomerului scade cu fiecare diviziune celulară în celulele somatice normale. Prin urmare, această descreștere progresivă limitează potențialul proliferativ al celulelor[]. În contrast cu celulele normale, 80-85% din celulele tumorale umane au telomeraza funcțională, responsabilă de elongarea telomerului ADN. Formațiunea ADN G-guadruplex inhibă activitatea telomerazei deoarece nu poate funcționa ca substrat pentru această enzimă[]. Ca urmare creșterea liganzilor formațiunii G-guadruplex, care inhibă activ telomerazele pe calea inducerii sau stabilizării acestei formațiuni, a devenit un domeniu de mare interes[]. G-guadruplex influențează carcinogeneza prin modularea transcripției oncogenelor (C-MYC, C-KIT, H-RAS, K-RAS) deoarece se leagă în regiunea promotoare a acestora.

Acest proces se exploatează cu succes în oprirea dezvoltării celulelor canceroase în domeniul medicinei[] dar în domeniul geneticii judiciare și a medicinei legale bazate pe identificare prin profilele unice ADN ftalocianinele reprezintă doar inhibitori ai reacției PCR care trebuiesc îndepărtați.

Interesant este că efectul inhibitor al ftalocianinelor se cunoaște și se exploatează în prezent doar în domeniul medical pe porțiunea invariabilă a moleculei de ADN uman (>99%). În domeniile care se ocupă de identificare pe baza ADN din porțiunea variabilă a acestuia (<1%), responsabilă pentru unicitatea fiecărui individ, efectul inhibitor al ftalocianinelor încă nu a fost studiat. Acest subiect va fi cercetat în această teză, împreună cu metodele necesare îndepărtării acestor substanțe din extractele ADN, fără a distruge sau deteriora molecula de ADN.

I.1.4.2.Depistarea inhibitorilor PCR prin metoda de cuantificare RT-PCR

Prezența inhibitorilor în probele supuse analizelor genetice conduce în primul rând la rezultate eronate în etapa de cuantificare. În funcție de aceste rezultate se reglează cantitatea de extract care urmează să fie amplificată. Dacă la cuantificare nu s-au obținut rezultate corecte, acest lucru se va oglindi în profilele genetice obținute: vor exista alele drope-aut (neamplificate) ducând la obținerea de loci fals homozigoți, diferențe considerabile de înălțimi (RFU) la locii heterozigoți, pikuri splitate și alele off-scală (în afara scalei alelice). În plus, pentru că probele criminalistice conțin adesea puțin ADN, acesta trebuie utilizat optim.

Kiturile comerciale de cuantificare din ultimii ani, în special cele bazate pe metoda Real Time PCR (cele mai frecvent utilizate) conțin totuși un control intern PCR sau control intern pozitiv – IPC (internal positive control) care avertizează prezența inhibitorilor prin intermediul unui parametru – CT (cycle treshold) care reprezintă ciclul la care fluorescența ampliconului de interes depășește cu mult nivelul de background și care se exprimă printr-o valoare numerică; în cazul existenței inhibitorilor acest parametru are valori mari comparativ cu celelalte probe respectiv controale. Aceasta se explică prin faptul că în prezența inhibitorilor PCR, reacțiile trec pragul de detecție (CT) la cicluri ulterioare datorită unei scăderi a pantei atât la curba fazei exponențiale, cât și la curba fazei liniare într-un plot de amplificare[].

În general extractele ADN au valoarea CT -ului cuprinsă între 28-31 iar la cele cu inhibitori valoarea CT este peste 31. De exemplu s-au cuantificat probe cu același conținut de ADN și acid humic de diferite concentrații prin metoda Real Time PCR iar rezultatele au fost diferite în funcție de concentrația de inhibitor. Cele cu conținut mai ridicat de acid humic nu au putut fi determinate cantitativ. De asemenea valorile CT ale controlului intern PCR au fost și de 37 iar unele nu s-au putut determina. S-a utilizat pentru acest studiu kitul Quantifiler human DNA Quantification de la compania Applied Biosystems[].

În plus, nu toate secvențele ADN țintă sunt la fel de susceptibile la inhibiție astfel că efectele asupra IPC nu pot fi foarte previzibile.

Pe de altă parte sistemul Quantifiler utilizează un control intern pozitiv în combinație cu două matrițe ADN autozomal pentru punerea în evidență atât a inhibitorilor cât și a ADN-ului degradat[]. Informațiile suplimentare date de astfel de kituri de cuantificare, legate de prezența inhibitorilor respectiv a ADN-ului degradat, permit personalului din laboratoare să facă cele mai bune alegeri privind procesarea ulterioară a probelor, respectiv prin alegerea celei mai eficiente metode de amplificare PCR cu cel mai potrivit număr de cicluri. Kiturile de cuantificare sunt cu mult mai ieftine față de cele de amplificare și uneori, cea mai bună alegere pentru probele cu cantitate insuficientă de ADN sau ADN degradat, este să se oprească procesarea lor, pentru a nu se face cheltuieli mari inutile.

Există mai multe metode de cuantificare a ADN-ului printre care cele bazate pe spectrofotometrie UV, fluorimetrie dar cea mai utilizată este metoda Real Time PCR dearece reflectă atât cantitatea cât și calitatea ADN-ului din probe.

I.1.4.3. Metode de îndepărtare a inhibitorilor PCR

Inhibitorii PCR e de preferat să fie eliminați în etapa de purificare/extracție sau izolare a ADN-ului din probe dar încă nu este posibil ca toți aceștia să fie îndepărtați în timpul acestui proces.Uneori materiale cum ar fi coloranții textili sau hemoglobina din hematii pot rămâne împreună cu moleculele ADN de-a lungul procesului de purificare a probei și pot interfera cu polimeraza sau pot bloca amplificarea PCR. Ca rezultat al amplificării unei probe de ADN conținând astfel de inhibitori, este pierderea alelelor locilor cu dimensiuni mari. Rezultatele sunt similare cu cele de la probele de ADN degradat.

În ideea de a obține profile genetice într-un timp cât mai scurt, câțiva cercetători au încercat generarea de profile genetice direct din amplificare, fără etapa de extracție. În acest sens au folosit probe biologice de contact de la persoane voluntare, pe diferite suporturi: bumbac alb, poliester colorat, nylon și denim (alb și negru). Procedura de prelevare s-a desfășurat în felul următor: voluntarii s-au spălat pe mâini cu apă și săpun pentru a îndepărta materiile celulare străine și după o oră au strâns în mână suporturile textile timp de câte 5 secunde. Au fost apoi tăiați câte 2mm2 din fiecare suport și băgați direct în tuburi de amplificare. Rezultatele au fost extraordinare, în sensul că renunțându-se la etapa de extracție s-au evitat contaminarea și pierderea din cantitatea de ADN, obțnându-se pentru majoritatea probelor profile întregi. Însă, pentru proba cu denim s-a obținut un profil genetic parțial, cu mai puțin de jumătate din alele, datorită efectului inhibitor al indigoului pentru procesul de amplificare[]. Se observă încă o dată necesitatea eliminării coloranților din denim înainte de amplificare, eventual în etapa de extracție. Reproductibilitatea a fost testată repetând procedura pe 3 voluntari diferiți, de 5 ori fiecare, utilizând kitul powerplex 16 (tabel nr. 4 – pentru unul din voluntari):

Tabel nr. 4 – Rezultatele cu numărul de alele obținute pentru unul din voluntari, utilizând kitul Powerplex 16.

ADN polimeraza este foarte rezistentă la inhibiție[]. Printre cele mai sensibile polimeraze la inhibiție este ADN Polimeraza GOLD, standardul în kiturile STR multiplex comerciale[]. Kitul de amplificare AmpFISTRIdentifiler care s-a utilizat în această cercetare, conține de asemenea ADN Polimeraza GOLD.

Unul dintre inhibitorii cunoscuți, greu de îndepărtat în analizele genetice de laborator este indigoul, colorantul de bază al denimului. Probele biologice fixate pe materiale textile și în special pe denim, constituie un procent majoritar în probele criminalistice ridicate de la locul faptei. S-au încercat variate metode de extracție a ADN-ului din acest tip de probe cu eliminarea indigoului din extract iar rezultatele au fost limitate de cantitatea de indigo prezentă în denim: la denimul de culoare albastru deschis unele metode au avut succes dar acest lucru nu a avut același efect și în cazul denimului albastru închis până la negru[]. Ca urmare, rezultatele pentru probele ADN fixate pe denim negru au fost nule deoarece amplificarea PCR a eșuat complet.

I.1.4.3.1. Metode clasice

În procesul de purificare intervin, în funcție de natura inhibitorului și a urmei biologice, o serie de etape prin care sunt îndepărtați inhibitorii din soluție, astfel încât să nu fie afectată molecula de ADN.

Până acum câțiva ani inhibitorii PCR puteau fi îndepărtați sau efectele lor puteau fi diminuate prin folosirea câtorva metode[]:

Matrița ADN genomic se putea dilua, însemnând de asemenea și diluarea inhibitorului ADN iar ulterior se trecea la reamplificare, în prezența unei concentrații mai scăzute de inhibitor. Această metodă poate fi eficientă în cazul probelor biologice cu conținut ridicat de ADN.

O altă soluție era și încă mai este adăugarea unei cantități mai mari de polimerază pentru a se compensa efectul inhibitorului. Prin această operație o fracțiune din Taq polimerază se leagă de moleculele inhibitorilor și le îndepărtează astfel din mediul de reacție, iar Taq polimeraza rămasă poate amplifica matrița ADN.

Adăugarea de albumina serică de bovină (BSA) împiedică sau diminuează inhibarea reacției PCR.

tratarea ADN cu hidroxid de sodiu.

Introducerea unei etape de separare înaintea amplificării pentru a se separa ADN extras de compușii inhibitori prin utilizarea de filtre Centricon-100 și Microcon-100.

Utilizarea combinată a ultimelor două metode prin tratarea cu 0,4 mM NaOH și filtru Microcon-100. Inhibitorii tind să se lege și să stabilizeze ADN-ul dublucatenar și au o dimensiune moleculară mai mică decât ADN-ul. Tratarea ADN-ului cu 0,4 mM NaOH denaturează ADN-ul eliberând inhibitorii în soluție și apoi, trecând soluția prin filtrul Microcon-100, se păstrează ADN-ul pe membrană și moleculele mai mici trec în substanța dizolvată.

De notat este că tratarea extractelor ADN cu NaOH nu este recomandată în cazul probelor Low Copy Number (cu conținut scăzut de ADN) deoarece acest procedeu implică o pierdere semnificativă de cantitate ADN[].

Izolarea ADN-ului este prima etapă imporantă în analizele probelor criminalistice și a celor medicale. Principalele metode de extracție a ADN-ului, utilizate de toate laboratoarele în domeniu, sunt cele manuale – metoda organică cu fenol-cloroform, metoda chelex și metoda cu hârtie FTA – și tehnicile de extracție în fază solidă (pe membrane de silicagel sau cu particule magnetice de silica)[1] care pot funcționa și manual și automat.

Metoda de extracție organică este cea mai veche și este cunoscută sub denumirea de extracție cu fenol-cloroform[]. Ea este potrivită și în prezent pentru probele biologice cu cantitate mare de ADN, respectiv cele constituite din sânge lichid și țesuturi moi. Această metodă implică mai mulți reactivi, în mai multe etape: SDS și proteinază K pentru liza membranelor celulare și a proteinelor legate de ADN. Amestecul de fenol-cloroform se adaugă ulterior pentru separarea proteinelor de ADN iar ultima etapă este cea de precipitare cu etanol, destinată îndepărtării inhibitorilor din sânge (hem). Ultima etapă este înlocuită de unele protocoale de extracție cu dializă și concentrare pe Centricon-100. Prin metoda organică se obține ADN dublucatenar. Dezavantajele acestei metode sunt legate în primul rând de toxicitatea reactivilor utilizați, numărul mare de transferuri în tuburi (risc crescut de contaminare), de pierderi în cantitate ADN și de durată.

Extracția chelex utilizează o rășină schimbătoare de ioni, în formă de suspensie de concentrație 5% care se adaugă în tubul cu proba biologică. Clelexul este un copolimer stiren-divinilbenzen cu perechi de ioni iminodiacetat care acționează ca grupări chelatoare pentru ionii metalici polivalenți, cum ar fi Mg2+, pentru inactivarea nucleazelor și implicit protejarea moleculei de ADN[]. Rășina funcționează optim la pH bazic cuprins între 9 și 11. Această metodă are la final o etapă de fierbere pentru câteva minute, obținându-se astfel ADN monocatenar, potrivit tehnicii PCR. Se folosește din 1991 și a devenit cea mai populară metodă de extracție ADN, în special în domeniul judiciar. Față de metoda organică prezintă avantajul reducerii riscului de contaminare deoarece nu necesită transferuri de tuburi, este economică, îndepărtează mare parte din inhibitori și durează mai puțin.

I.1.4.3.2. Metode moderne

O altă metodă rapidă de extracție ADN numită RGDE (rapid genomic DNA extraction) se bazează pe un agent puternic denaturant, un buffer de liză împreună cu proteinaza K, o metodă cu rezultate bune pe probele de sânge, țesuturi și chiar oase, într-un timp foarte scurt: 10 minute pentru sânge și țesuturi[].Această metodă, deși este concepută pentru probele biologice criminalistice, cu conținut scăzut de ADN, nu folosește particule paramagnetice pentru purificare. Tamponul de liză conține Tris-HCl, sucroză, MgCl2 și Triton X-100 și nu lizează celulele în interiorul masei tisulare, de aceea este necesară pretratarea cu proteinază K. Pe lângă faptul că este o metodă rapidă, este și economică și nu necesită echipamente de laborator scumpe. Singurul inconvenient este că necesită multe manevrări care duc implicit la risc crescut de contaminare dar, dacă metoda se utilizează în regim automat, acest impediment dispare.

Ulterior, au fost studiate și dezvoltate mai multe metode bazate pe purificare cu kituri speciale de îndepărtare a inhibitorilor. Acestea au fost introduse pe piață în paralel cu liniile de extracție ADN automată, care au luat amploare din ce în ce mai mult în ultimii ani.

Metoda de extracție magnetică automată a acizilor nucleici (ADN) implică folosirea unui sistem-platformă robotizat în scopul efectuării și eficientizării principalelor etape ale protocoalelor de extracție a acizilor nucleici (ADN) realizate manual . În acest sens se procesează un număr mare de probe biologice per unitate de timp, în sistem unitar, într-un spațiu steril/izolat, în care contactul uman cu probele analizate este mult redus.

Comparații între metodele de extracție

Există studii de comparații între metode clasice și moderne de îndepărtare a inhibitorilor PCR. De exemplu s-au comparat patru astfel de metode – kitul de purificare Power Clean DNA Clean up, sistemul DNA IQ, extracția organică cu fenol-clororm și extracția Chelex-100 – pe probe biologice cu opt dintre inhibitorii PCR comuni, incluzând melanina, acidul humic, colagenul, hematina, ureea și indigoul[]. Pe baza rezultatelor obținute s-a ajuns la concluzia că s-au obținut profile genetice mai complete cu kitul de purificare Power Clean DNA Clean up și sistemul DNA IQ față de cele două metode manuale clasice de extracție. Totuși din probele biologice cu indigo nu s-au obținut profile genetice complete cu niciuna dintre cele patru metode.

S-au făcut sudii de comparație între extracția cu chelex clasică, manuală și extracția cu kitul QIAGEN DNA Investigator utilizat manual și automat cu robotul QIAcube[]. S-au utilizat aceleași tipuri de probe, sânge și salivă, prelevate identic. Eficiența celor trei metode a fost testată pe două căi: prin cuantificarea ADN-ului din extractul rezultat și prin numărul de markeri genetici obținuți împreună cu media înălțimilor alelelor (tabelul nr. 5). Cuantificarea a fost efectuată prin metoda Real time PCR iar rezultatele au fost în favoarea metodei chelex, urmând metoda de extracție automată cu robotul QIAcube și kitul QIAGEN DNA Investigator. În ceea ce privește profilele genetice obținute la final, acestea depind atât de cantitatea cât și de calitatea ADN din exctacte, astfel că, după acest criteriu, metoda de extracție chelex 100 a fost cea mai slabă, în sensul că media înălțimilor alelelor a fost cea mai mică; profile genetice complete s-au obținut prin toate cele trei metode pentru ambele tipuri de proba (sânge și salivă). Explicația constă în faptul că se pierde mai puțină cantitate de ADN prin metoda chelex dar calitatea acestuia este mai bună prin celelalte două metode în urma cărora se obțin extracte de ADN mai pure.

Tabel nr. 5 – compararea rezultatelor obținute prin metoda de extracție chelex 100 și metodele de extracție cu QIAGEN DNA Investigator kit -manual și automat

De asemenea s-au comparat toate metodele de extracție ADN manuală existente până în prezent din punct de vedere al timpului total necesar pentru fiecare, al numărului de deschidere a tuburilor pentru adăugare sau scoatere de reactivi, al numărului de vârfuri de pipete necesare și al numărului de centrifugări până la obținerea extractului final (tabelul nr. 6)[]. Cu cât sunt mai multe manevrări de tuburi, vârfuri de pipete și spălări sau centrifugări, cu atât riscul de contaminare este mai mare și se pierde din cantitatea de ADN inițială.

Tabel nr. 6 – comparații între metodele manuale de extracție ADN

Au fost comparate de asemenea trei kituri de izolare și purificare a ADN-ului din punct de vedere al purității și cantității de ADN din extractele rezultate, din punct de vedere a timpului întregului proces și nu în ultimul rând al costului per probă (tabelul nr. 7)[]. Probele biologice au fost identice, fiecare pornind de la 200µL sânge uman.

Tabelul nr. 7 –performanțele a trei kituri de extracție de la trei companii diferite

Conform acestei analize kitul QIAamp DNA Investigator este cel mai eficient și totodată cel mai scump. Acest kit este potrivit probelor criminalistice cu cantitate scăzută de ADN. Pentru probele biologice de referință sau cu conținut inițial suficient de ADN cel mai potrivit ar fi, conform acestor rezultate, kitul ZR Genomic DNA care de altfel este și cel mai ieftin și cel mai rapid, potrivit astfel pentru analiza simultană a mai multor probe.

De asemenea s-au comparat rezultatele obținute din urme biologice (sânge) depuse pe airbag-uri în cazul unor accidente rutiere pentru identificarea persoanelor care au condus autovehiculele respective în momentul impactului[]. De menționat este că sângele era vizibil în cantitate suficientă, însă, în compoziția airbag-urilor sunt în general prezente substanțe ce pot interfera în una sau mai multe etape ale analizelor genetice. S-au utilizat două metode de extracție: metoda chelex manuală și metoda de purificare automată cu kitul QIAamp DNA Investigatorla instrumentul QIAsimphony. Datorită prezenței inhibitorilor specifici pe airbag-urile analizate, în ciuda faptului că s-a pus în evidență sânge uman (cu ajutorul pretestelor de laborator), prin metoda chelex nu au fost obținute rezultate valorificabile în vederea identificării de persoane. Din contră, prin purificare automată, rezultatele au dus la obținerea unui profil complet pentru identificarea autorului accidentului.

I.2. METODE DE DEGRADARE A COLORANȚILOR TEXTILI, POSIBILI INHIBITORI AI REACȚIEI PCR

Introducere

Coloranții sunt acei compuși colorați care, în cantități mici, își pot transfera culoarea altor compuși. Din punct de vedere structural, aceștia conțin atât grupări cromofore (C=C, C≡C, C=O, C=S, C=N, N=N), cât și grupări polare (ușor polarizabile) numite grupări auxocrome care pot fi acide (-COOH, -SO3H, -OH) sau bazice (-NH2, -NHR, -NR2, benzen).

Industria coloranților este în strânsă legatură cu industria textilă, majoritatea coloranților fiind utilizați pentru colorarea fibrelor textile (bumbac, in, poliester). Ca urmare a dezvoltării masive a industriei textile, și industria coloranților s-a dezvoltat foarte mult, existând un număr impresionant de coloranți sintetici.

După structura chimică, coloranții sintetici se pot clasifica în funcție de gruparea cromoforă în coloranți azoici, nitrozo, nitro, azometinici, aril-difenil/trifenil-metanici, xantenici, ftalocianine, antrachinonici, indigoizi, etc.

În funcție de utilizare, coloranții textili pot fi clasificați în coloranți disperși (insolubili în apă care se folosesc pentru colorarea prin dispersie a fibrelor hidrofobe: nylon, celuloză, fibre acrilice), coloranți direcți (solubili în apă cu afinitate mare pentru fibrele de celuloză), coloranți de cadă (VAT) (insolubili, care se aplică pe fibrele celulozice în băi alcaline), coloranți sulfurici (existenți în forma leuco insolubilă, se coloreaza prin reducere cu sulfit de sodiu), coloranți bazici (solubili în apă, utilizați pentru hârtie, nylon și poliesteri modificați), coloranți acizi (solubili în apă, utilizați pentru nylon, lână, mătase, piele, hârtie, cerneluri tipografice, alimente și cosmetice) și coloranți pentru solvenți (insolubili în apă dar solubili în solvenți organici, utilizați pentru materiale plastice, uleiuri, ceară)[].

Datorită numărului foarte mare de coloranți, există un sistem de clasificare unic, numit index de culoare – CI (colour index). Fiecare colorant are un cod de tipul C.I. Nume generic, culoare și un număr din 5 cifre dependent de structura acestuia. De exemplu ftalocianinele sunt clasificate ca C.I. Pigment blue 15 sau C.I. 74160.

Coloranții prezintă proprietăți tinctoriale, adică se realizează transferul culorii unui colorant din faza apoasă sau de dispersie apoasă asupra unui material de vopsit, la suprafața de contact dintre ele, când apar interacții dipol-dipol, Van der Waals, de hidrogen, electrostatice sau covalente.

Coloranții reactivi sunt o clasă importantă de coloranți textili utilizați (aproximativ 50%) dintre care mare parte o constituie ftalocianinele[], pentru nuanțele de albastru și verde.

Pantalonii tip blue-jeans au fost și continuă să fie cele mai populare obiecte vestimentare de către oamenii din întraga lume. Pentru colorarea acestora se utilizează indigoul și ftalocianinele specifice culorilor albastru și verde, coloranți de tip azo etc.

În urma utilizării colorantilor, în apele reziduale rămâne o cantitate destul de mare de coloranți, care au toxicitate semnificativă, de aceea este necesară îndepărtarea acestora.

Decolorarea se referă la procesul de îndepărtare a culorii prin modificarea grupării cromofore într-o grupare necromoforă, în timp ce biodegradarea presupune descompunerea moleculei de colorant (substrat) printr-un proces biologic. În literatură sunt prezentate diferite metode fizice și chimice de tratare a apelor ce conțin coloranți[].

Se știe că este dificilă degradarea coloranților, care sunt molecule recalcitrante, astfel că au apărut numeroase metode de tratare a apelor reziduale. Exista patru tipuri de metode de îndepartare a coloranților din apele reziduale: fizice, chimice, biologice si electrochimice.

I.2.1. Metode fizice

Metodele fizice sunt aplicate în cazul degradării coloranților proveniți din industria textilă, metode care produc o mare cantitate de reziduuri. Dintre metodele cele mai întâlnite menționăm:

a) Adsorbția este operația de separare a unui component sau a unui flux de componenți dintr-un amestec gazos sau dintr-o soluție prin reținerea acestora pe suprafața unui solid (numit adsorbant). Fenomenul de eliminare a adsorbitului (desorbție) se realizează în scopul recuperării componentului adsorbit, dacă acesta este important, și pentru regenerarea adsorbantului. Procesele de separare prin adsorbție au largi aplicații în rafinarea petrolului, în industria petrochimică și în industria chimică.[]

b) Sedimentarea este procesul fizic de separare, din apele uzate, a particulelor solide organice sau anorganice prin depunere gravimetrică în spații cu regim hidraulic controlat. Această operație se mai numește și decantare sau, în funcție de rolul procesului în tehnologia de epurare, clarificare sau îngroșare; sedimentarea este foarte des folosită în industria alimentară[].

c) Flotația este un procedeu de depoluare utilizat pentru tratarea solurilor și apelor contaminate. Gama poluanților extractibili prin flotație este foarte largă și cuprinde în particular hidrocarburile, compușii organoclorurați, compușii cianhidrici și metalele grele. Extracția prin flotație a poluanților din solurile contaminate se bazează pe diferența dintre proprietățile superficiale ale mineralelor din sol, pe de o parte, și ale substanțelor poluante, pe de altă parte. Utilizarea flotației ca procedeu de depoluare a apelor contaminate a oferit rezultate bune la separarea substanțelor grase emulsionate, a materialelor fibroase și a metalelor grele [].

d) Coagularea este o etapă intermediară esențială în procesul fizico-chimic de tratare a apelor reziduale, fiind rezultatul aderării reactivilor chimici la particulele suspendate în apă, când particulele coloidale dispersate se unesc în agregate mai mari, denumite flocoane sau microflocoane. Practic, coagularea reprezintă primul pas în eliminarea particulelor coloidale, funcția sa principală constând în destabilizarea particulelor. Această destabilizare este reprezentată prin neutralizarea sarcinilor electrice prezente pe suprafața particulelor, ceea ce înlesnește aglomerarea coloizilor.[]

e) Osmoza este procesul prin care două soluții de concentrații diferite sunt separate printr-o membrană semipermeabilă. Procesul normal de osmoză poate fi inversat (osmoza inversă) dacă asupra soluției concentrate se exercită o presiune mai mare decât presiunea osmotică (presiunea osmotică se referă la presiunea hidrostatică exercitată asupra soluției mai concentrate, în sensul atingerii echilibrului). Osmoza inversă poate elimina în mod eficient și stabil sărurile dizolvate, dar și substanțele organice dizolvate în apele reziduale (trihalometani, chimicale agricole, etc.). Așadar, este ideală pentru o arie largă de aplicații (de la producerea de apă ultrapură până la desalinizarea apei de mare).

f) Ultrafiltrarea este procesul de separare a componenților unei soluții lichide prin membrane caracterizate printr-o permeabilitate selectivă, sub influența unei diferențe de presiune. Prin acest proces pot fi îndepărtate din apă bacterii, amidon, proteine sau pigmenți.

I.2.2. Metode chimice

Metodele chimice constau în modificarea structurii colorantului și transformarea acestuia prin oxidare sau reducere în fragmente mai mici, ducând până la mineralizare.

a) Reducerea se poate face cu diverși agenți: ditionit de sodiu în mediu alcalin[] sau borohidrură de sodiu[], metode care au dat rezultate bune la degradarea indigoului și a indigoizilor.

b) Oxidarea chimică este una din cele mai promițătoare metode de degradare a poluanților din apele reziduale. Deși majoritatea compușilor organici sunt instabili din punct de vedere termodinamic în raport cu reacția de oxidare, totuși oxidarea în fază condensată nu este un proces foarte frecvent utilizat în distrugerea contaminanților organici din apă sau din apele reziduale. Aceasta se datorează faptului că procesele oxidative sunt limitate cinetic, iar substanțele organice țintă reacționează foarte încet cu oxidanții obișnuiți, chiar și cu ozonul, care are un potențial redox favorabil. Astfel, substanțele care nu constituie ținta pot consuma cantități inacceptabile de oxidant, în aceste condiții necesarul de oxidant este prea ridicat pentru a face procesul rentabil. În ciuda acestor limitări, degradările oxidative constituie o perspectivă atrăgătoare pentru tratarea apelor reziduale. Utilizarea oxigenului din aer la presiuni și temperaturi obișnuite poate constitui o alternativă mai simplă și mai economică, dar oxigenul, neavând o reactivitate semnificativă în aceste condiții, necesită o activare catalitică. În scopul depășirii problemelor curente asociate proceselor de înlăturare a poluanților organici din apele reziduale, cele mai recente studii s-au focalizat asupra utilizării enzimelor, izolate în prealabil de organismul părinte.[,,] Clorul este un oxidant puetnic care poate fi folosit sub formă de hipoclorit de calciu și de sodiu și este utilizat cu succes la coloranții solubili în apă; cei insolubili în apă (indigo, ftalocianină) sunt rezistenți la acest proces[].

c) Oxidarea fotochimică simplă sau în prezența unor oxidanți și/sau catalizatori duce la degradarea compușilor organici cu randamente foarte bune și obținerea unor produși cu toxicitate redusă, mergând chiar până la mineralizare []. În general, utiliazrarea doar a radiației UV duce la randamente scăzute de decolorare (10-20%), dar în combinație cu peroxid se poate ajunge la o creștere a decolorării de până la 90%. Prin această metodă (oxidare fotochimică) s-au degradat coloranții textili Direct Blue 199, o ftalocianină de Cu sulfonată, și un colorant azo – Acid Black 1[]. Direct Blue 86 (DB86), un derivat al ftalocianinei de Cu, utilizat adesea în colorarea textilelor, a fost degradat în proporție de 96% și mineralizat 87% printr-un procedeu fotocatalitic cu lampă UV și catalizator din particule de TiO2. Aceste rezultate s-au obținut la pH 4, temperatura 400 C și concentrația TiO2 40 mg/L în 120 de minute. S-a obținut o degradare a colorantului și prin fotoliză, doar cu lampă UV, dar în procent mai mic; de exemplu, la pH 6,38 și T 200 C DB86 a fost degradat fotocatalitic 66% iar prin fotoliză colorantul a fost degradat doar 45%, în același interval de timp, 120 de minute. Pe de altă parte, fără radiații UV, doar cu TiO2, nu s-a redus concentrația de colorant. Observăm că și aici un rol foarte important îl joacă pH-ul soluției. Experimentele au avut loc în intervalul de pH 2-10 și cele mai bune rezultate s-au remarcat la pH 4 (acid)[].

d) Oxidarea avansată (AOP) este procesul care implică simultan mai multe procese de oxidare, având în vedere că uneori un singur sistem de oxidare nu este suficient pentru descompunerea totală a coloranților. Aceste reacții implică producerea aceelerată de radicali liberi hidroxil și includ tehnici ca oxidarea cu agent Fenton, fotoliză UV și sonoliză. Aceste tehnici sunt capabile să degradeze coloranții la temperaturăși presiune ambiante[65]. O altă variantă a AOP este procesul de oxidare chimică utilizând ozon, ozon combinat cu peroxid și combinații cu UV ca UV/peroxid de hidrogen, UV/ozon și UV/oxidare în aer umed și oxidare catalitică în aer umed[]. De asemenea combinația reactiv Fenton/UV s-a dovedit eficientă în tratarea apelor uzate cu coloranți. Fotocataliza este și ea o metodă bună de degradare a coloranților. Sistemul UV-vis/H2O2/complecși feroxilați poate fi utilizat pentru eliminarea coloranților utilizați în industria textilă, ducând în anumite condiții la reducerea COD la mai mult de 80% și a TOC la peste 65%[69]. Utilizarea catalizatorilor în reacțiile de oxidare a coloranților oferă multe avantaje incluzând costuri mici, conversie mare, timpi scurți de reacție și implicarea unor agenți netoxici. În plus, reacțiile de degradare oxidativă catalizate sunt de 15-20 ori mai rapide decât aceleași reacții necatalizate[].

e) Oxidarea enzimatică implică utilizarea enzimelor în locul catalizatorilor. Metoda oferă avantajul de a lucra în condiții blânde de mediu și cu randamente teoretice foarte mari. Cu toate acestea, cataliza enzimatică are și dezavantaje: enzimele sunt scumpe, ceea ce duce la creșterea prețului tehnologiei de epurare și de asemenea, enzimele sunt foarte sensibile la prezența inhibitorilor ce se găsesc în apele reziduale[]. Cele mai utilizate enzime sunt cele din clasa oxidazelor, care pot utiliza ca și cosubstrat oxigenul dizolvat în apă sau alt oxidant (apă oxigenată). Dintre acestea, lacazele (EC1.10.3.2, p-difenol: dioxigen oxidoreductaze) s-au dovedit a fi enzime potrivite pentru aplicații biotehnologice. Lacazele sunt glicoproteine monomerice, dimerice sau tetramerice, cu patru atomi de cupru (de tip 1, 2 sau3) per monomer localizate în situl catalitic. Cuprul de tipul 1 (T1) este responsabil de oxidarea substratului. Lacazele folosesc oxigenul molecular pentru a oxida o varietate de donori de hidrogen aromatici și non-aromatici printr-un mecanism ce implică radicali. Stabilitatea lacazelor este de obicei mai mare la pH acid dar temperaturile optime pentru activitate și stabilitate variază considerabil în funcție de sursa de proveniență a lor[, , ]. Se pot obține randamente de decolorare mai mari în cazul adăugării de surfactanți neionici (Merpol)[] , polietilenglicol sau solvenți organici [] sau mediatori redox care măresc puterea de oxidare a lacazelor în cazul unor substraturi complexe unde aceste enzime nu fac față singure iar acești mediatori pot fi uneori toxici pentru a fi utilizați la scară industrială[]. Cercetările în decolorarea cu lacază si mediatori redox au avut rezultate excelente[]. DeniLite, o lacază comercială preparată în Danemarca și propionat de fenotiazină ca mediator, au fost folosite în procesul de fabricare a pantalonilor tip blue jeans, la decolorarea indigoului. În 2001 compania Zytex din India a dezvoltat de asemenea o metodă de degradare a indigoului bazată pe sistemul lacază-mediator. De asemenea există studii de utilizare a lacazei imobilizată pe granule de γ-Al2O3 într-un reactor petru decolorarea eficientă a indigoului și a altor coloranți de tip azo, antrachinonic și trifenilmetanic. Această metodă, cu enzima imobilizată, a fost mai bună comparativ cu metoda de decolorare cu enzima liberă datorită ambelor efecte: de adsorbție pe materialul imobilizator și de oxidare enzimatică[]. O altă enzimă cu potențial mare de utilizare în degradarea coloranților recalcitranți este peroxidaza. Degradarea coloranților textili de tip azo cu peroxidaza HRP liberă și imobilizată a fost studiată pentru alegerea parametrilor optimi ai procesului cum ar fi faza apoasă, pH-ul, doza de H2O2 și concentrațiile de colorant și enzimă, pe toată perioada procesului de degradare[]. Reactivul blue 21, o ftalocianină de Cu sulfonată, utilizat des în industria texlilă, a fost îndepărtat din soluție complet și rapid (o jumătate de oră) cu peroxidază și apă oxigenată la pH 3,3, cu ruperea inelului ftalocianinic și formarea de sulfoftalimidă, ca produs principal . Această degradare enzimatică s-a dovedit a fi foarte dependentă de pH-ul soluției: activitatea enzimei crește foarte mult între valorile 2 și 3 de pH, se menține aproximativ constantă între 3 și 5, dupa care descrește până la aproape 0 la pH 8. Ca produși de reacție au mai fost identificați în soluție și ioni de Cu 2+ și amoniu. Același colorant, reactivul blue 21, a fost decolorat tot cu peroxidază (extrasă din gulie) și apă oxigenată dar la pH neutru iar gradul de decolorare nu a depășit 58% în 50 de minute . După acest interval de timp nu s-a mai observat nicio modificare, chiar și după adaosuri suplimentare de apă oxigenată. Și în acest studiu s-a pus în evidență ruperea scheletului cromogen și eliberarea ionului de Cu2+ toxic în soluție.

Înlocuirea proceselor chimice de reducere și oxidare existente cu tehnologii enzimatice poate fi o alternativă foarte atractivă din punct de vedere ecologic[]. De asemenea este atractivă economic datorită posibilității de reducere în costul de tratare a efluentului. Majoritatea avantajelor ale reacțiilor catalizate de enzime sunt temperaturile medii necesare, absența produșilor secundari și faptul că procesele enzimatice sunt prietenoase cu mediul înconjurător. Majoritatea dezavantajelor în procesele enzimatice sunt dependența activității enzimei de pH și temperatură, și toxicitatea unora dintre ele.

I.2.3. Metode biologice

Metodele biologice sunt cele mai utilzate metode de epurare, pe scară largă, a apelor reziduale cu coloranți. Un număr mare de specii au fost utilizate pentru decolorarea și mineralizarea diferiților coloranți. Metoda oferă avantaje considerabile precum costul scăzut și produși netoxici. Procesul poate fi aerobic, anaerobic sau combinat [65].

a) Tratare aerobă: fungiile si bacteriile sunt cele 2 grupuri de microorganisme care au fost pe larg studiate pentru abilitatea lor în tratarea apelor reziduale cu coloranți. În condiții aerobe, enzimele secretate de bacterii fragmentează compușii organici. Tulpinile de fungi, capabile să decoloreze coloranții azo și trifenilmetan au fost studiate de mulți cercetători. Diverși factori cum ar fi concentrația poluanților, concentrația colorantului, pH -ul inițial și temperatura efluentului, afectează procesul de decolorare. Totuși, tratarea cu fungi se potrivește pentru unii coloranți, mulți dintre ei fiind recalcitranți la degradarea biologică sau ramân neschimbați în condiții aerobe .

b) Tratare anaerobă: Într-un studiu al lui Razo-Flores (1997) s-a descoperit că doi coloranți azo, mordant orange 1 și azodisalicilat, pot fi reduși și decolorați în condiții anaerobe utilizând nămol metanogenic granular. Alt studiu a demonstrat fezabilitatea aplicației de decolorare a 20 coloranți azo, în condiții anaerobe cu nămol granular.

Sistemele anaerobe par o alternativă mai ieftină comparativ cu cele aerobe.

c) Tratarea combinată aerobă-anaeroba: avantajul unui asemenea sistem este mineralizarea completă care este adesea obținută datorită acțiunii sinergice a diverse organisme. Pe de altă parte, reducerea legăturii azo poate fi obținută în bioreactoare anaerobe și aminele aromatice incolore rezultate pot fi mineralizate în condiții aerobe. Astfel, o decolorare anaerobă urmată de post tratare aerobă este recomandată pentru tratarea apelor reziduale. În general, factorii care influențează procesul de decolorare sunt concentrațiile coloranților, pH-ul inițial și temperatura efluentului.

De obicei biodegradarea coloranților azo parcurge două etape: prima etapă presupune ruperea legăturilor azo în urma căruia se produce delocorarea dar cu conținut de amine aromatice periculoase. Reducerea coloranților azo necesită de obicei condiții anaerobe întrucât biodegradarea bacteriană a aminelor aromatice este un proces aproape exlusiv aerob.

Deși această metodă este cost-competitivă și tratările biologice sunt potrivite pentru coloranți variați, există unele dezavantaje: biodegradarea scăzută a coloranților, flexibilitatea scăzută în proiectare și operare, necesitatea de spații mari și timpi lungi pentru procesul de decolorare-fermentare, făcând astfel incapabilă tratarea biologică pentru sisteme de efluenți continue[]. Doi coloranți ftalocianinici, respectiv Reactive Blue15 (o ftalocianină cu Cu) și Reactive Blue 38 (o ftalocianină cu Ni) și trei coloranți azo, respectiv Reactive Violet 5, Reactive Black 5 și Reactive Orange 96, utilizați frecvent în industria textilă, au fost biodegradați cu succes cu ajutorul unor tulpini fungice: B. Adusta și T. versicolor. Aceste tulpini erau inițial cunoscute pentru capacitatea de degradare a lignincelulozei și derivaților de lignină. S-au realizat culturi cu aceste tulpini, în anumite condiții: mediu de glucoză, soluție de sulfat de amoniu și soluție de sulhat de potasiu la Ph 5,5, minerale și vitamine. Produșii enzimatici obținuți au fost păstrați la 300C până la utilizarea lor la degradarea coloranților enumerați mai sus. Reacția enzimatică a fost urmărită comparativ cu și fără peroxidază. S-a obținut o biodegradare în procent mare (peste 90% pentru toți coloranții testați), cu scăderea toxicității în soluțiile obținute față de cele inițiale (monitorizată prin metoda testului Vibrio fischeri), în prezența apei oxigenate. Dezavantajul acestei metode constă în faptul că durează mult timp, aproximativ 4 zile[].

I.2.4. Metode electrochimice

Metodele electrochimice sunt din ce în ce mai des utilizate pentru îndepărtarea coloranților din ape. În general, procesul poate fi separat în tratamente de reducere și de oxidare. Tratamentul de reducere catodic conceput pentru a elimina grupările azo din cromofori este deja în uz în zilele noastre dar efectul de decolorare este limitat de coloranții care pot fi distruși prin transferul de electroni la catod. Decolorarea poate fi produsă de asemenea prin electro-oxidare cu anozi insolubili sau prin electrocoagulare utilizând materiale consumabile. Anozii din fier de exemplu au fost folosiți cu succes în electro-degradarea unor coloranți textili cu structuri diferite (alături de bromofenol albastru, poly R-478, fenol roșu, indigo, metil orange, fucsină, metil verde și cristal violet)[].

Electrochimia pare să ofere o metodă de reducere care poate minimiza consumul de chimicale. Procesul electrochimic este mediat de un purtator de electron prin care reducerea are loc între suprafețele separate ale electrodului și moleculele de colorant insolubil și nu prin contactul direct între cele două suprafețe. Mediatorii sunt sisteme redox reversibile care reduc colorantul și care la rândul lor sunt oxidați în proces. După conversia înapoi la forma redusă, la catod, mediatorii sunt apți pentru a reduce mai departe colorantul. În orice caz, reducerea cantității totale de indigo necesar pentru colorare necesită cantități enorme de energie electrică și suprafețe electrodice mari. Un mare avantaj al acestei tehnici este că procesul poate fi monitorizat prin măsurarea potențialului redox. După reducere și anterior procesului de colorare, mediatorul trebuie să fie separat de colorantul leuco solubil prin ultrafiltrare, iar concentrația mediatorului în filtrat este mărită prin nanofiltrare. Acest tip de filtrare crește considerabil costurile pentru procesul de colorare și introduce câteva probleme tehnice cum ar fi presiunea mare pe durata filtrării și pericolul constant de blocare a reactorului (celulei electrochimice)[]. Metoda poate fi folosităși pentru decolorarea ftalocianinei de Cu: electrooxidare, electrocoagulare și procesul electro-Fenton[]. S-a constatat că procesul electro-Fenton, cu adăugare de apă oxigenată, la pH 3, a avut cel mai mult succes întrucât s-a obținut o degradare completă de 100% a colorantului în 15 minute. Pe de altă parte, o decolorare de 100% s-a obținut și prin electrocoagulare cu electrozi de Al într-un timp mai scurt (2-4 minute) dar fără degradarea colorantului, acesta rămânând în precipitatul de Al(OH)3. Electrocoagularea a avut loc la pH inițial 6,4 și densitate de curent 2,5 – 5mA/cm2. După electrooxidarea directă și indirectă a ftalocianinei de Cu, cu electrozi de Ti/Pt și grafit, la 10mA/cm2, culoarea soluției a rămas aproape neschimbată, chiar și după 90 de minute. Electrooxidarea a avut loc în mediu acid, cu Na2SO4 ca electrolit și apă oxigenată.

Un alt studiu de îndepărtare a ftalocianinelor din soluții s-a bazat pe o metodă combinată – electrochimic și biologic[]. S-a folosit o celulă electrochimică cu RuO2–IrO2–TiO2 la anod și Ti la catod și NaCl ca electrolit. S-a obținut o decolorare de 41,3% doar electrochimic. În momentul când s-a cuplat metoda cu tratare bilogică cu o bacterie degradantă din petrol – Pseudomonas sp. Consortium, în 5 minute s-a obținut o decolorare de 96% și în încă 10 minute, soluția s-a decolorat 100%. Potențialul la anod a variat între 1,45-1,8 și la catod 1,5-1,71. Intensitatea de curent utilizată – 10 mA/cm2 iar pH-ul optim pentru îndepărtarea culorii în aceste condiții s-a constatat a fi 6.

Din toate aceste studii se observă că cele mai bune rezultate pentru îndepărtarea coloranților din soluții se obțin la valori mici de pH, între 0,5 și 3, indiferent de metoda folosită: chimică, enzimatică, electrochimica etc. Acest lucru este inconvenabil pentru aplicațiile urmărite de noi (izolarea ADN-ului din soluții cu coloranți inhibitori) întrucât în etapa de izolare a ADN-ului pH-ul este de preferat să aibă valori bazice, între 9 și 11, în special daca se utilizează metoda clasică chelex. Pentru moleculele de ADN pH-ul acid este distructiv. Pe de altă parte, în procesele enzimatice, temperatura la care enzimele au activitate optimă nu depășește 400 C ceea ce ne împiedică să îndepărtăm colorantul printr-o astfel de metodă pe durata izolării ADN-ului, proces care are loc la 55-560 C.

I.2.5. Degradarea coloranților textili cu permanganat de potasiu

Permanganatul de potasiu este un agent de oxidare puternic, având avantaje adiționale față de alți agenți de oxidare: ușor de mânuit, un solid ușor solubil și, așa cum s-a demonstrat pentru anumiți contaminanți, o mare eficiență în tratarea apei și a solului. Există mai multe studii privind decolorarea diferitelor clase de coloranți cu permanganat de potasiu, la diferite pH-uri și temperaturi[].

În urma experimentelor pe 10 tipuri diferite de coloranți s-a observat influența pH-ului soluției astfel: când valoarea pH-ului este mai mică de 1,5 eficiența decolorării este mare, peste 80%. Când valoarea pH-ului a fost mai mare de 4, decolorarea soluției este total ineficientă, reacțiile desfășurându-se cu o îndepărtare a culorii de mai puțin de 5%. Aceasta înseamnă că eficiența decolorării scade cu creșterea pH-ului. pH-ul determină de asemenea dacă oxidarea are loc prin schimbul de 1,3 sau 5 electroni și viteza reacției.

MnO4- + 2H2O + 3e- → MnO2 + 4OH- +0,59V (E0) (1)

MnO4- + 8H+ + 5e- → Mn2+ + 4H2O +0,59V (E0) (2)

Ecuația (1) se aplică în condiții alcaline și neutre și ecuația (2) în condiții acide. Potențialul de oxidare crește cu descreșterea pH-ului astfel că potențialul în soluții acide este mult mai mare decât în soluții alcaline. Cu alte cuvinte, cu cât soluția este mai acidă cu atât puterea de oxidare a permanganatului de potasiu este mai mare. Cea mai bună îndepărtare a culorii poate fi obținută în soluție puternic acidă. Concentrația de permanganat de posasiu are un efect semnificativ asupra eficienței decolorării. Îndepărtarea culorii a crescut cu creșterea concentrației de permanganat de potasiu. S-a obținut o decolorare mai mare de 85 % când s-a folosit KMnO4 de concentrație 3 mM.

Temperatura de reacție este de asemenea foarte importantă, eficiența decolorării crescând cu creșterea temperaturii. Valorile TOC au fost cuprinse între 8% și 19%. Rezultatele indică faptul că soluțiile de coloranți au fost degradate incomplet de permanganatul de potasiu. Permanganatul de potasiu poate distruge strucura de cromofor dar nu poate degrada coloranții complet 2 și H2O. De fapt coloranții sunt adesea degradați incomplet chiar și în prezența agentului Fenton.

Coloranții din apele textile devin biodegradabili după decolorarea cu permanganat de potasiu – moleculele mari în formă inițială devin fragmente mici, biodegradabile. De aceea se recomandă oxidarea cu permanganat ca pretratament urmat de o tratare biologică.

Un studiu similar cu cel de mai sus a fost efectuat pe alți 4 coloranți de tip azo[]. Ca și în experimentul anterior, rezultatele au demonstrat îndepărtarea completă a culorii și o mineralizare parțială pentru fiecare soluție de colorant. De asemenea s-a urmărit eficiența decolorării soluțiilor funcție de pH, temperatură, concentrația inițială de colorant și concentrația de permanganat de potasiu. Valorile de pH au un efect semnificativ asupra eficienței decolorării: la pH în jur de 1,5 și temperatura camerei, se obține o decolorare de 100% pentru toți cei patru coloranți în nu mai mult de 20 s. Eficiența decolorării scade drastic la valoarea pH = 2 – 4. Pe parcursul decolorării, în cele mai bune condiții operaționale, cel mult 5 % din soluțiile de coloranți pot fi mineralizate. S-au înregistrat absorbanțele la lungimile de undă maxime corespunzătoare coloranților studiați în intervalul de pH 1-8 și nu s-a observat nicio variație, ceea ce duce la concluzia că moleculele au aceeași structură chimică. Descreșterea eficienței decolorării la pH >3 se datorează particulelor de MnO2 coloidal format în timpul reacției. Degradarea eficientă a coloranților a fost consolidată prin creșterea cantității de permanganat de potasiu. Oricum, după 24 de ore de tratare cu permanganat de potasiu în exces, nu s-a obținut o mineralizare completă a soluțiilor de coloranți. S-a ajuns la concluzia, ca și în studiul anterior, că această metodă poate fi folosită ca o pre-tratare pentru mineralizarea soluțiilor de coloranți azo. Poate fi combinată cu o altă metodă de degradare completă a apelor reziduale. Aceste rezultate prezintă un mare interes deoarece cu ajutorul lor costurile de tratare a apelor reziduale cu coloranți pot fi reduse.

I.2.6. Oxidarea cu permanganat de potasiu – mecanisme

Permanganatul este un agent oxidant versatil și se folosește pentru studiul cineticii de oxidare a multor substraturi organice. Mecanismele pentru diferite substraturi organice sugerate de diferiți autori nu sunt similare, indicând aceea că sunt posibile o varietate de mecanisme, depinzând de natura speciilor de mangan reactiv, mediul de reacție și natura substratului.

Un proces redox implică transfer de electroni între un oxidant și un reducător. Permanganatul, un oxidant important în multe reacții redox organice și anorganice, implică atomul Mn(VII) care este renumit pentru versatilitatea lui[]. Procesul de oxidare cu permanganat este eco-prietenos și a câștigat importanță în chimia verde.

În ionul permanganat magneziul are starea de oxidare +7. Ionul de permanganat are o geometrie tetraedrică cu legături π extinse. Este stabil în medii neutre sau ușor alcaline dar într-un mediu puternic alcalin se disproporționează sau reacționează cu ionul hidroxid pentru a forma mangan în starea de oxidare +5 (hipomanganat) sau +6 (manganat). În consecință, la valori de pH înalte este dificil câteodată să se verifice dacă o oxidare se desfășoară prin unul sau două procese electronice.

Soluțiile de permanganat sunt intrinsec instabile, descompunându-se încet dar vizibil în mediu acid (ecuația 1):

4MnO4- + 4H+ → 3O2 + 2H2O + 4MnO2 (1)

În soluții neutre sau slab alcaline, la întuneric, descompunerea este cu mult mai înceată. Oricum este catalizată de lumină. În soluții bazice permanganatul funcționează ca un agent oxidant puternic (E0 = 1,23V) (ecuația 2):

MnO4- + 2H2O + 3e- → MnO2 + 4OH- (2)

În mediu puternic bazic și cu un exces de permanganat se formează ionul manganat (E0 = 0,56V) (ecuația 3):

MnO4- + e- → MnO42- (3)

În soluții acide permanganatul este redus 2+ de un exces de agent de reducere (E0 = 1,51V) (ecuația 4):

MnO4- + 8H+ + 5e- → Mn2+ + 4H2O (4)

Întrucât MnO4- oxidează ionul Mn2+ (E0 = 0,46V) produsul în prezența unui exces de permanganat este MnO2 (ecuația 5):

2MnO4- + 3Mn2+ + 2H2O → 5MnO2 + 4H+ (5)

Cea mai mare stare de oxidare a manganului corespunde numărului total de electroni 3d și 4d. Această stare de oxidare VII corespunde compușilor oxo MnO4-, Mn2O7 și MnO3F. Mn (VII) este redus (II) pe durata procesului de oxidare prin mai multe specii de mangan cu diferite stări de oxidare cum ar fi Mn (VI), Mn (V), Mn (IV) și Mn (III). Apariția acestor stări de oxidare intermediare depinde de condițiile de reacție, tipurile de substrat și stabilitatea lor. Câțiva compuși ai speciilor de Mn (V) sunt frecvenți ca intermediari în reducerea permanganaților. Totuși, Mn (II) este starea de oxidare cea mai stabilă și este oxidat ușor în soluție alcalină.

Reacțiile permanganatului într-un proces de oxidare sunt funcție de pH-ul mediului de reacție, respectiv trecerea ionului de mangan prin stările de oxidare de la +2 la +7 depinde foarte mult de acest parametru[]. În mediu puternic alcalin produsul de reacție stabil este MnO42-, după ce manganul trece prin stările de oxidare VII, V și VI. Culoarea soluției se schimbă de la violet la albastru si apoi verde. Culoarea violet se formează din combinația culorii roz a permanganatului cu cea albastră a hipomanganatului iar culoarea verde închis aparține Mn6+.

Mn7+ → Mn5+ → Mn6+

Violet Albastru Verde

La pH > 12, după un timp mai mare de reacție, Mn6+ trece în Mn4+ care dezvoltă încet o turbiditate de culoare galbenă. Precipitatul care se depune încet în timp se consideră a se datora formării de specii polimerice.

Reacția care are loc în mediu bazic este[]:

MnO4ˉ + 2H2O + 3eˉ→ MnO2 + 4HOˉ

Decolorarea coloranților azo- cu KmnO4 a fost urmărită funcție de timp (30 min), temperatură și pH. La pH acid, sub 3, rata decolorării este mare iar dupa 3 până la 4 scade brusc; pe măsura ce pH-ul crește, se ajunge încet la o decolorare de peste 80 % la pH = 11. Temperatura a fost variată de la 15 la 600 C, temperatura optimă pentru decolorare fiind stabilită la 500 C[]. Absorbanța mare la începutul reacției poate fi atribuită formării de MnO2, ducând parțial la eliminarea colorantului din soluție.

MnO2 este o pudră solidă, de culoare neagră care se găsește în natură. KMnO4 este o sare care nu se găsește în natură ci se obține din MnO2 și KOH astfel:

2MnO2 + 4KOH + O2 → 2K2Mn4O + 2H2O (1)

2MnO42- + Cl2 → 2MnO4- + 2Cl- (2)

KMnO4 este solubil în apă și se descompune în alcool și solvenți organici. KmnO4 este cunoscut ca oxidant al dublei legaturi C=C de la alchene, de la gruparile aromatice[].Conform diagramei oxizilor de mangan funcție de pH în mediu bazic, manganul poate fi în următoarele forme: MnO2 (identificat și în mediu acid), MnO4-, MnOOH, MnO42-, Mn(OH)2, Mn(OH)3.

La oxidarea K-carrageenan (compus organic poliglicozidic) cu KMnO4 la pH ≥12 s-au pus în evidența, prin metoda spectrofotometrică, 2 produși intermediari cu viață scurtă[] ce conțin hipomanganat (Mn5+) și manganat (Mn6+). Ionul MnO4- dispare progresiv în timp la 525 nm (absorbanța lui maximă) și se formează noi intermediari care absorb la lungimile de undă 606, 435, 350 și 315 nm. Lungimea de undă 606 corespunde Mn6+O42-. Și aici schimbarea de culoare se vede cu ochiul liber, de la violet (Mn7+), la albastru (Mn5+), apoi la verde (Mn6+) și galben (Mn4+) ceea ce face posibilă ipoteza că în prima fază a oxidării se formează hipomanganatul care absoarbe la ƛ = 700 nm. Această formă poate dispare în una din cele două variante:

2Mn5+ = Mn6+ + Mn4+

Mn5+ + Mn7+ = 2Mn6+

Se consideră că se formează Mn4+ ca produs final și stabil împreună cu MnO2 coloidal. Acesta din urmă poate fi îndepărtat din amestecul de reacțtie cu NaF sub agitare continuă pe parcursul oxidării.

Formarea Mn4+ și/sau Mn5+ ca intermediari cu viață scurtă a fost studiată de mai mulți autori în contextul oxidarii macromoleculelor sau substratelor organice cu permanganat în mediu alcalin[,].

II. PARTEA ORIGINALĂ

INTRODUCERE

În condițiile în care identificarea ADN-ului din probe biologice prelevate de pe materiale textile (în special denim) poate fi îngreunată de prezența coloranților în mediul de extracție, găsirea unei metode de degradare a coloranților este de mare interes. Majoritatea metodelor de oxidare avansată utilizate în industrie se desfașoară însă în condiții de pH acid, care duce și la degradarea ADN-ului[], facând imposibilă identificarea ulterioară a acestuia.

Ca urmare au fost testate câteva metode de oxidare chimică/electrochimică care au loc în mediu neutru sau bazic astfel încât să nu fie afectată structura ADN-ului. După găsirea metodei cele mai eficiente, aceasta a fost testată pe mai mulți coloranți textili și pe mai multe materiale de tip denim pentru a verifica eficiența metodei.

De mare ajutor a fost cuantificarea prin metoda Real Time PCR, care, de câțiva ani, funcție de kitul de cuantificare utilizat, oferă posibilitatea identificării probelor biologice cu inhibitori[37]. Astfel, coloranții utilizați au putut fi testați pentru efectul lor inhibitor prin această metodă. De asemenea, după oxidarea lor prin metoda considarată cea mai eficientă, au putut fi testați din nou pentru a se evidenția dacă mai au sau nu efect inhibitor asupra reacției de amplificare în lanț (PCR).

Mai departe, funcție de rezultatele obținute, metoda s-a aplicat pe probe biologice în prezența coloranților cu efect inhibitor și ulterior, pe probe biologice depuse pe denim, așa cum ajung de obicei în laboratoarele de analize genetice pentru identificări de persoane pe baza ADN-ului.

Colorantul utilizat pentru studiile preliminare a fost o ftalocianină tetrasulfonată de cupru: Heliogen blue A. Acesata a fost aleasă deoarece face parte dintr-o clasă de coloranți foarte rezistenți la degradare și, de asemenea, se leagă de ADN, fiind astfel un inhibitor în procesul de identificare a ADN-ului[50].

Ftalocianinele, datorită stabiltății lor fizice și chimice, fiind insolubile în apă și în majoritatea solvenților[], sunt coloranți puternici utilizați în multe domenii precum fabricarea cernelurilor, pictură, colorarea textilelor, a plasticelor, a ambalajelor pentru mancare[], ca semiconductori, în industria calculatoarelor[]etc. Aceste substanțe sunt folosite de asemenea și la colorarea textilelor pentru nuanțele de albastru și verde, în special a denimului pentru pantalonii tip blue jeans, obiecte vestimentare aproape indispensabile în rândul oamenilor din lumea întreagă[]. Mai târziu s-a descoperit că ftalocianinele sunt capabile să formeze legături cu molecula de ADN mono- și bicatenar[], fiind astfel testate ca fotosensibilizatori în terapia cancerului[]. Relativ recent s-a propus utilizarea lor ca medicamente datorită efectelor lor antitumorale[104].

MATERIALE ȘI METODE

Materiale

Ftalcianina de cupru -3,4′,4″,4″′- tetrasulfonată cu 85 % colorant (βCuPcS4), KMnO4 (puritate ≥ 99 % ACS), NaOH (puritate ≥ 97 % ACS), K2SO4 (puritate ≥97 % ACS) și H2SO4 (puritate ≥ 99 %ACS) au fost achiziționate de la Sigma. Concentrația KMnO4 a fost determinată cu exactitate prin titrare cu soluție de acid oxalic 0,05 M de la Sigma. APG (surfactant neionic alchilpoliglicozidic cu C8–C14, ≤ 1% C16, solutie 51 % (w/w) în apă) a fost procurat de la compania DOW Chemical. Peroxidaza HRP (P6782) cu activitate 1280 U/mg solid (prin metoda ABTS) a fost procurată de la Sigma-Aldrich. Laccaza utilizată a fost obținută de la firma Flucka și este izolată din Trametes versicolor având o masă molară de 66 kDa și o activitate de 26 U/mg. A fost preparată o soluție stoc de enzimă de concentrație 0.01 mM (10-5 M). Coloranții textili Basic violet 14, Direct Red 28, Acid Red 17, Acid Yellow 1, Acid blue 9, Acid blue 64 au fost achizitionați de la DOW Chemicals, Acid black 210, Acid brown 98, Acid red 119 de la Sella, Heliogen blue A și Heliogen Blue K7090 de la BASF. Toți ceilalți reactivi utilizați au fost de puritate analitică.

Rășina Chelex® 100 (forma Na+), proteinaza K și dithiothreitol (puritate ≥ 99.5 %) au fost procurate de la Sigma.

S-au preparat soluții stoc de 5% schimbător de ioni Na+ Chelex® 100, 60 mg/mL DTT și 20 mg/mL proteinază K pentru extracția prin metoda Chelex.

Pentru elctroliză s-au preparat soluții stoc de H2SO4 3M și NaOH 1M.

Pentru prepararea soluțiilor necesare s-a utilizat apă bidistilată și apă ultrapură autoclavată cu Autoclav KSG model 32-2-3 achiziționat de la compania Olching (Germania).

Kitul de cuantificare Investigator Quantiplex a fost achiziționat de la compania QIAGEN.

Kitul de amplificare AmpFlSTR IdentifilerTM PCR cu 16 loci (markeri genetici): (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA și amelogenina) a fost achiziționat de la compania Applied Biosystems, Foster City, CA, USA, împreună cu polimeraza AmpliTaq Gold de concentrație 5 U/mL. De asemenea formamida HI-DI, standardul LIZ și ladderul identifiler (allelic ladder) utilizate la electroforeza capilară au fost achiziționate de la aceeași companie.

Ambele kituri, de cuantificare respectiv amplificare, conțin apă ultrapură fără nucleaze.

O primă problemă apărută a fost insolubilitatea βCuPcS4 în mediu apos; au fost testați mai mulți solvenți și surfactanți; în cele din urmă a fost ales APG ca mediu de dizolvare. S-a preparat soluție stoc de βCuPcS4 (0.26 g/L) prin dizolvarea colorantului pudră în soluție APG 0,01%. Concentrația de APG a fost în toate probele sub concentrația critică micelară de 0,056 %. În aceste condiții se consideră că avem micele cinetice.

Metode experimentale

Reacția de degradare a βCuPcS4 a fost realizată în reactor închis, termosat, cu un volum total de 30 mL. Determinările experimentale au fost realizate folosind un spectrofotometru Jasco V-530. Experimentele au fost efectuate prin urmărirea spectrelor de absorbanție în timp, pe un interval de maxim 24 ore. De asemenea s-a urmărit și vizual schimbarea culorii și a aspectului amestecului de reacție.

Pentru experimentele de degradare electrochimică, celula electrolitică a fost compusă din compartiment anodic, o frită, anod din oțel inoxidabil, catod din oțel inoxidabil, un tub pentru barbotarea aerului, doi conductori și o sursă reglabilă de tensiune continuă.

Pentru identificarea produșilor de reacție, probele finale au fost filtrate, uscate și analizate prin spectrometrie de fluorescență de raze X la un aparat Eagle III, în vid, în următoarele condiții de lucru: sursă de excitație: generator de raze X (Rh); tensiune: 40 kV; intensitate: 150 – 250 A; detector: Si(Li); monocapilar cu spot de 300 m; constanta de timp 17 s.Analiza calitativă și cantitativăs-a efectuat prin metoda multipunct pe suprafața fiecărei probe. De asemenea probele au fost analizate și prin spectrometrie de absorbție în infraroșu, la un aparat FTIR tip Paragon 1000, în domeniul de frecvență 4000-400 cm–1,cu o rezoluție de 4 cm-1.

Pentru testarea efectului inhibitor al coloranților s-au folosit instrumentul QIASimphony și instrumentul Q Rotor Gene de la compania QIAGEN. Ca echipamente specifice s-au utilizat: suport pentru reactivi Reagent Holder 1QS 9018090, plăci de eluție QIA#19588EMTR, suport pentru placa de eluție Elution Microtubes Rack QS 9020730, suport pentru cuantificare RG Strip Tubes 72 QS 9018092, tuburi de cuantificare de 100 µL cu capace – achiziționate de la QIAGEN.

În etapa de izolare a ADN-ului din probele biologice s-au utilizat ca echipamente:

Vortex marca Genie 2;

Agitator magnetic cu plită de încălzire IKA – WERKE RTC BASIC

Termobloc marca HLC;

Centrifugă marca Eppendorf.

Pentru amplificarea extractelor și vizualizarea ampliconilor s-au folosit:

Termocycler Gene Amp 9700de la Applied Biosystems;

hotă HoltenLamin Air 0.9. de la Juan Nordic;

analizor genetic ABI PRISM 3100 de la Applied Biosystems.

Prelucrarea datelor

Din spectrele de absorbție au fost determinate absorbanțele la lungimea de undă unde acestea au valori maxime; din datele absorbanță în funcție de timp au fost estimați mai mulți parametri:

Gradul de decolorare (D %) calculat ca:

(1)

unde Amax și Afin reprezintă valorile absorbanțelor maximă, respectiv finală (la un timp predefinit)

Constantele de viteză de ordin aparent I estimate prin regresie neliniară a datelor A = f(timp) pe ecuația (2), utilizand softul ORIGIN 8.0:

(2)

Timpul de înjumătățire (t1/2) calculat din constantele de viteză de ordin aparent I:

(3)

Cantitatea de ADN și valorile CT ale probelor testate pentru efectul inhibitor au fost obținute cu ajutorul softului RotorGene, versiunea 2.2.3, conform protocolului companiei QIAGEN.

Datele obținute cu analizorul genetic ABI PRISM 3100 au fost prelucrate cu softurile Genescan și Genotyper Versiunea 3.7 de la compania Applied Biosystems.

II.1. DEGRADAREA OXIDATIVĂ A UNOR COLORANȚI TEXTILI

Obiective

Testarea unor metode de degradare oxidativă a unor coloranți textili în condiții compatibile cu identificarea ADN-ului.

Studiul degradării ftalocianinei și a unor coloranți din denim prin electroliză.

Stabilirea parametrilor optimi de oxidare a ftalocianinei cu KMnO4 în mediu bazic.

Studiul degradării oxidative a unor coloranți textili cu KMnO4 în mediu bazic.

II.1.1. Testarea unor metode de degradare oxidativă a unor coloranți textili în condiții compatibile cu identificarea ADN-ului

Ftalocianinele sunt compuși macrociclici aromatici, planari, izoelectronici, cu moleculă de porfirină formată din patru unități de izoindol legate împreună cu atomi de azot[]. Ele sunt tetrabenzo [5,10,15,20] – tetraazoporfirine[] și formează o clasă importantă de compuși macrociclici care nu se găsesc în natură[]. Ftalocianinele sunt analogii pigmenților naturali cum ar fi clorofila și hemoglobina[]. Mai mult, sunt printre primele substanțe macrociclice care au fost sintetizate în laborator. Molecula de ftalocianină are un sistem aromatic cu 18 electroni π cu multiple posibilități de modificare chiar și în interiorul macrociclului prin mai mult de 70 de posibilități de încorporare de metale diferite sau prin inserarea de grupări la părțile periferice ale macrociclului. Mai mult, se pot substitui una sau mai multe grupări izoindol cu alți heterociclii. Există 16 poziții posibile pentru substituții la macrociclu și la cele patru subunități benzoice[109]. Substituția în opt poziții periferice (2,3,9,10,16,17,23 și 24) ale ftalocianinelor cu radicali cu catenă lungă, face ca acestea să fie mai solubile decât ftalocianinele nesubstituite, care sunt insolubile în solvenții organici obișnuiți[]. De asemenea, ftalocianinele pot fi polimerizate. Aceste modificări facilitează modularea comportamentelor electrice și optice ale metaloftalocianinelor. Pe de altă parte ftalocianinele pot prezenta mai multe tipuri de faze condensate: cristale unice, filme policristaline, cristale lichide discotice și filme Langmuir-Blodgett. Acest aspect e foarte important pentru aranjarea ftalocianinelor într-o arhitectură supramoleculară ducând la îmbunătățirea procesabilității compușilor pentru încorporarea lor în dispozitivele moleculare. Macrociclul afișează absorbția intensă a regiunii vizibile (banda Q) și, cu metale adecvate în cavitatea centrală, o emisie de fluorescență bună.

Inițial s-a determinat spectrul de absorbție al ftalocianinei studiate (βCuPcS4) care se prezenta sub formă de pudră de culoare albastră. Pentru aceasta s-au încercat mai multe posibilități de solubilizare a substanței de interes având în vedere că nu este solubilă în solvenții organici obișnuiți[]. S-a observant o solubilizare parțială în dimetilsulfoxid (DMSO) și dodecil-sulfat de sodiu (SDS). Total insolubilă s-a dovedit a fi în HCl 1,5N, etanol, acetonă, hidroxid de sodiu, acid acetic și apă.

O solubilizare mai bună a fost realizată în doi srfactanți: SDS si APG. În ambii surfactanți βCuPcS4 prezintă două maxime de absorbție în domeniul vizibil: unul în jurul valorii de 640 nm și unul în jurul valorii de 720 nm. Banda corespunzatoare lungimii de undă de la 720 nm, cunoscută și ca banda Q, este rezultatul tranzițiilor π – π* ale inelelor []. Banda corespunzătoare lungimii de undă 640 nm se datorează agregării ftalocianiei în soluție ca rezultat al interacțiilor între sistemele de inele adiacente[]. Poziția benzilor de absorbție este influențată de natura ionului, precum și de proprietățile solventului[].

Spectrul βCuPcS4, dizolvată în APG, prezintă două benzi de absorbție în regiunea vizibilă la 615 și 714 nm (figura 2.1).

Figura 2.1. Spectrul de absorbție al βCuPcS4 0.26 g/L dizolvată în APG 0.01 %.

Oxidarea enzimatică a βCuPcS4

S-a încercat o degradare blândă a acesteia cu lacază în prezență de oxigen sau cu peroxidază în prezență de apă oxigenată. Reacțiile au fost urmărite timp de 90 minute. În ambele cazuri, indiferent de cantitatea de enzimă sau agent oxidant, nu se observă o modificare semnificativă a spectrelor de absorbție în timp (figurile 2.2 si 2.3).

000 nm

Figura 2.2. Spectre succesive în timp la oxidarea ftalocianinei (0.026g/L) dizolvată în SDS în prezența lacazei (10-7M).

000 nm

Figura 2.3. Spectre succesive în timp la oxidarea ftalocianinei (0.026g/L) dizolvată în SDS

în prezența peroxidazei (10-7M) cu apă oxigenată (1 mM).

S-au repetat încercările de oxidare blândă a ftalocianinei dizolvată în APG cu cele două enzime (lacază și peroxidază) la diferite temperaturi (25, 35, 38 și 40 0C) și pH (6,5 și 8,5) și s-au obținut aceleași rezultate ceea ce duce la concluzia că metoda nu este bună pentru degradarea acestui tip de colorant.

Oxidarea chimică a βCuPcS4

Deoarece oxidarea enzimatică nu a avut rezultate în ceea ce priveste degradarea ftalocianei, s-au testat alte metode oxidative. Încercarile de a utiliza radicalii HO. generați prin scindarea apei oxigenate în prezența unor săruri ale metalelor tranziționale (fier, mangan, cobalt) sau în prezență de bicarbonat, nu au furnizat rezultate vizibile.

Studiul degradării ftalocianinei βCuPcS4 prin electroliză

Principiul electrolizei:

”Electroliza este procesul de separare și orientare a ionilor dintr-un electrolit cu ajutorul curentului electric continuu. Celula de electroliză conține minim doi electrozi care sunt conectați la o sursă de curent. Electrodul conectat la borna pozitivă a sursei se numește anod și cel conectat la borna negativă, catod. În procesul de electroliză, ionii pozitivi sau cationii sunt dirijați înspre catod (pol negativ), iar ionii negativi sau anionii înspre anod (pol pozitiv) unde își pierd sarcina și se depun sau intră în reacție chimică. La anod se produce un proces de oxidare iar la catod un proces de reducere”[].

Conform datelor recente din literatură, ftalocianina de cupru se poate decolora prin electrooxidare, electrocoagulare și procesul electro-Fenton, acesta din urmă fiind cel mai eficient în prezența apei oxigenate, la pH 3, obținându-se în 15 minute o degradare completă[]. Cu ajutorul unei celule electrochimice formate din RuO2–IrO2–TiO2 la anod, Ti la catod și NaCl ca electrolit, se obține o decolorare a ftalocianinei de doar 41,3% dar în combinație cu tratare biologică prin intermediul unei bacterii din petrol, soluția se poate decolora 100%[].

Schema celulei electrolitice utilizate în această cercetare pentru oxidarea ftalocianinei βCuPcS4, cu componentele aferente, este reprezentată în figura nr.2.4.

S-a încercat oxidarea ftalocianinei prin electroliză în mediu acid, în mediu bazic și cu sulfat de potasiu. Conform principiului electrolizei, oxidarea are loc la anod, motiv pentru care s-au urmărit modificările apărute pe parcursul reacției la acest compartiment.

Electroliza în mediu acid

S-a preparat într-un pahar Berzelius cu capacitate de 500 mL o soluție de H2SO4 24 mM într-un volum de 250 mL în care s-a introdus un vas mic cu 0,017 g/L βCuPcS4 în soluție de H2SO4 0,05M într-un volum total de 30 mL (compartimentul anodic), separate de o frită pentru izolarea produșilor de reacție (H2 respectiv O2). S-a introdus în fiecare vas câte un electrod de inox și s-a utilizat o sursă de curent continuu cu variația intensității între 0,05 – 0,17 A, la o tensiune constantă de 10 V. Potențialul electric s-a aplicat asupra electrolitului prin scufundarea celor doi electrozi de inox (anod și catod) în vasul de electroliză. La electrozi, electronii sunt acceptați sau cedați de către atomi sau ioni care apoi trec în electrolit.

Figura 2.4.Schema electrolizei: 1. Celula de electroliză; 2. Compartiment anodic; 2’. Frită; 3. Anod din oțel inoxidabil; 4. Catod din oțel inoxidabil; 5. Tub pentru barbotarea aerului; 6. Conductori; 7. Sursă reglabilă de tensiune continuă; 8, 9. Reglarea tensiunii și a curentului maxim; 10. Citirea tensiunii nominale; 11. Citirea curentului.

S-a urmărit electroliza timp de 130 minute, cu determinarea absorbanței soluției de la anod din 15 în 15 minute. Pentru a asigura o amestecare mai bună, în amestecul de reacția a fost barbotat aer, pe toată perioada electrolizei. Rezultatele sunt expuse în graficul de mai jos (figura 2.5), unde se observă o scădere progresivă a absorbanței ftalocianinei pentru ambele picuri în aproximativ o oră. Vizual, s-a observat schimbarea culorii de la albastru la verde apoi orange, cu formare de precipitat orange închis și decolorarea supernatantului după chiar 55 min.

Figura 2.5. Degradarea electrolitică a βCuPcS4 în mediu de acid sulfuric. Variatia absorbantei in timp

Se observă că decolorarea ftalocianinei are loc în aproximativ o oră, dupa care absorbanța crește ușor; creșterea poate fi atribuită unor procese secundare de polimerizare a produșilor cu formarea unor specii care absorb la acea lungime de undă. S-a obținut un grad de decoloarare la 90 minute de 89 %. Pentru că scopul final este aplicarea metodei în izolarea ADN-ului cu îndepărtarea colorantului, este necesar ca electroliza să aibă loc în mediu neutru sau bazic.

Electroliza în mediu bazic

S-a pregătit electroliza ca și cea în mediu acid, cu deosebirea că s-a înlocuit soluția de H2SO4 cu o soluție de NaOH. Reacția s-a urmărit timp de 160 min, cu măsurarea absorbanței produsului de electroliză de la compartimentul anodic, din 25 în 25 min. Nu s-a observat nicio modificare în timp a spectrului soluției de ftalocianină (Figura 2.6).

nm

Figura 2.6. Spectre succesive ale ftalocianinei în timpul procesului de electroliză în mediu bazic, timp de 160 minute.

Electroliza în mediu neutru cu K2SO4

S-a introdus în celula de electrolizăo soluție de 0,05 % K2SO4 într-un volum de 250 mL iar la compartimentul anodic 0,05 mg/L βCuPcS4 într-o soluție de 0,05 % K2SO4 la un volum de 30 mL, separate de frită. S-a utilizat aceeași sursă de curent continuu cu variația intensității între 0,05 – 0,15 A, la o tensiune constantă de 10 V. S-a urmărit electroliza timp de 195 minute, cu măsurarea absorbanței produsului de electroliză din compartimentul anodic din 15 în 15 minute. Rezultatele sunt expuse în graficul de mai jos (figura 2.7). Valoarea pH-ului descrește treptat de la 6,5 la 1,5și se observă o scădere progresivă a absorbanței ftalocianinei pentru ambele picuri în aproximativ o oră. Vizual, s-a observat schimbarea culorii de la albastru la verde apoi orange, cu formare de precipitat orange închis și decolorarea supernatantului, la fel ca la electroliza în mediu acid. Totuși scăderea maximă a absorbanței ftalocianineiconcomitent cu decolorarea acesteia s-au înregistrat la 150 minute de reacție. Maximele celor două picuri ale spectrului βCuPcS4 s-au înregistrat la 622 nm și 715 nm.

Figura 2.7. Degradarea electrolitică a βCuPcS4 în mediu neutru cu sulfat de potasiu

Pentru aceste date, se observă că decolorarea are loc în aproximativ 2 ore, cu un grad de decolorare de 90%.

Deoarece pH-ul mediului scade în timp, s-a studiat și variația pH-ului în timp în cazul electrolizei cu K2SO4, fără a adăuga colorant în celula electrochimică. S-au măsurat pH-ul și intensitatea de curent din 15 în 15 min timp de două ore iar rezultatele sunt expuse în tabelul nr. 2.1:

Tabelul nr. 2.1. Modificarea pH-ului și a intensității de curent în electroliza apei cu K2SO4

Electroliza cu K2SO4 cu ajustarea continuă a pH-ului (bazic)

Întrucât pH-ul soluției de electroliză cu sulfat de potasiu scade continuu până la 1,5, s-a încercat ajustarea acestuia în timpul electrolizei cu o soluție de NaOH 1M, treptat, prin picurare, pentru menținerea unui pH bazic de 8,5, potrivit pentru aplicațiile de interes (îndepărtarea ftalocianinei din probele biologice în etapa de extracție a ADN-ului). S-au folosit aceleași soluții de aceleași concentrații ca în experimentul anterior. S-a urmărit electroliza timp de 150 minute, de asemenea cu măsurarea absorbanței produsului de electroliză din 15 în 15 minute. Rezultatele sunt expuse în figura 2.8. Se observă că maximele celor două picuri sunt de data aceasta înregistrate la 627 nm respectiv 719 nm. Formarea precipitatului orange închis și decolorarea vizibilă a soluției din compartimentul anodic, împreună cu scăderea maximă a absorbanței ftalocianinei se înregistrează la 150 minute.

Figura 2.8. degradarea electrolitică a βCuPcS4 cu sulfat de potasiu, cu ajustarea continuă a pH-ului (bazic)

Se observă că are loc decolorarea aproape totală în 150 minute. În prima parte creșterea absorbanței poate fi atribuită formării unui intermediar care absoarbe la aceeași lungime de undă ca și ftalocianina.

Creșterea intensității de curent pe parcursul electrolizei este redată în tabelul nr. 2.2.

Tabelul nr. 2.2.Modificarea intensității de curent în timpul electrolizei ftalocianinei cu K2SO4 la pH 8,5.

Ulterior s-a repetat experimentul cu ajustarea constantă a pH-ului la valoarea 11,5 (în vederea aplicării metodei în extracția chelex a ADN-ului) cu aceeași soluție de NaOH 1M. S-au înregistrat aproximativ aceleași rezultate, cu creșterea intensității curentului conform tabelului nr. 2.3.

Tabelul nr. 2.3 – modificarea intensității de curent în timpul electrolizei ftalocianinei cu K2SO4 la pH 11,5.

S-a urmărit dacă soluția de surfactant neionic poliglicozidic (APG) folosită pentru dizolvarea ftalocianinei are vreo influență asupra procesului de electroliză. S-au înregistrat spectrele soluției în timpul electrolizei din 15 în 15 minute timp de 150 minute iar pH-ul a fost ajustat la valoarea 11,5 la fiecare măsurătoare cu soluție de NaOH 1M. Nu s-a introdus colorant în mediul de electroliză. Soluția a fost preparată direct în vasul de electroliză: s-au introdus 275 ml AD, 5 ml APG 0,01 % și 0,15 g K2SO4 pur. Inițial pH-ul soluției APG a fost de 5, la fel ca și cel al soluției totale de electroliză. Nu s-au evidențiat schimbări de spectru sau culoare. Modificările intensității și pH-ului sunt înregistrate în tabelul nr. 2.4.

Tabelul nr. 2.4 Modificarea intensității de curent și a pH-ului în timpul electrolizei APG cu K2SO4 la pH bazic.

Se observă că de această dată creșterea intensității se produce mai lent iar valoarea finală a acesteia după trei ore este 0,08, aproape jumătate din intensitatea finală măsurată când în soluția de electroliză se introduce ftalocianină. Acest fenomen se poate explica prin desfășurarea unui proces mai complex, în mai multe etape, cu număr mai mare de electroni cedați sau acceptați, respectiv oxidarea ftalocianinei de interes.

Metoda a fost aplicată cu succes și pe o soluție de colorant obținută din 5 cm2 denim albastru închis mărunțit, dizolvat în APG, împreună cu 0,05 % K2SO4 la un volum total de 30 mL. Din spectrul inițial al soluției s-a obținut o absorbanță maximă la 660 nm care corespunde colorantului indigo. Reacția a fost urmărită timp de 270 min (6,5 h), cu determinări ale absorbanței produsului din 15 în 15 min. Rezultatele sunt înregistrate în figura nr. 2.9 iar modificarea intensității de curent în timpul oxidării este conform tabelului nr. 2.5.

Figura 2.9. Degradarea electrolitică a colorantului din denim albastru închis cu sulfat de potasiu la pH 11,5.

Tabel nr. 2.5 Modificarea intensității de curent în timpul electrolizei colorantului din denim albastru închis cu K2SO4 la pH 11,5.

Pentru determinarea constantei de viteză, respectiv a gradului de decolorare corespunzătoare βCuPcS4 prin electroliză, a fost aleasă lungimea de undă de 718 nm, lungime de undă la care au fost realizate și prelucrările prin alte metode oxidative.

Se observă că decolorarea ftalocianinei are loc în maxim două ore. Din datele absorbanță în funcție de timp a fost estimată constanta de degradare prin fitarea ecuației (2) pe datele experimentale.Valorile obținute sunt prezentate în tabelul 2.6.

Tabelul nr. 2.6. Gradele de decolorare și constantele de degradare ale βCuPcS4 și denimului în mediu de H2SO4 și K2SO4, calculate din datele obținute conform figurilor 2.5, 2.7, 2.8 și 2.9.

Rezultatele arată că ambele tipuri de coloranți pot fi degradați prin electroliză, cu menținerea unui pH bazic. Metoda ar putea fi utilizată în laboratoarele de analize genetice, dar are câteva obstacole. În primul rând, ar trebui adaptată și din punct de vedere al temperaturii (55-560C) deoarece dacă s-ar fi introdus și ADN în soluția de electroliză împreună cu colorantul, la temperatura camerei, așa cum a fost studiată metoda, ADN-ul ar fi rămas prins în precipitatul obținut, nu în supernatantul incolor. Sub 500C ADN-ul rămâne în nucleul celulelor; de abia după această temperatură are loc liza celulară cu eliberarea ADN-ului din nucleu. În plus trebuie introdusă în mediul de electroliză și proteinaza K pentru liza celulelor și ruperea membranelor proteice pentru eliberarea ADN-ului. În al doilea rând, în laboratoarele de analize genetice se lucrează cu cantități mici (micro-, nano-) astfel că și echipamentele de analize sunt adaptate la aceste cantități, implicit și o eventuală celulă de electroliză. De asemenea aparatura nouă intrată într-un laborator de analize ADN trebuie să fie avizată, să aibă proceduri standard de lucru și instrucțiuni tehnice bine stabilite, să aibă la bază o metodă validată și nu în ultimul rând să fie sterilă. În astfel de laboratoare se evită orice fel de contaminare cu ADN străin. De aceea personalul poartă în permanență mănuși care se schimbă după fiecare manevrare a probelor și nu se acceptă improvizații sau echipamente aduse din alte laboratoare. De altfel nici în alte laboratoare, de alt profil decât cel de ADN, nu este permis accesul cu probe biologice, cu atât mai mult cu cât acestea nu sunt însoțite de fișe medicale eliberate de centre autorizate.

Acestea sunt motivele pentru care studiile s-au concentrat pe optimizarea metodei de oxidare a coloranților cu permanganat de potasiu în mediu bazic, fiind mult mai fezabilă în laboratoarele ADN deja existente: este nevoie doar de permanganat de potasiu care poate fi achiziționat pur la preț relativ mic iar mediul bazic este asigurat de soluția chelex 5% care face parte din protocolul extracției ADN prin metoda chelex.

II.1.2. Studiul degradării oxidative a βCuPcS4 cu KMnO4 în mediu bazic

Amestecuri de soluții formate din ftalocianine (între 1,8 mg/L și 30 mg/L), permanganat de potasiu în exces (între 0,4 mM și 12 mM) și hidroxid de sodiu (între 30 mM și 100 mM) au fost supuse reacției timp de cel puțin 7 ore la temperaturi cuprinse între 40 și 70o C și pH 10-12.

Amestecurile au fost analizate spectrofotometric la lungimi de undă cuprinse între 200 și 900 nm, la intervale de 15 minute. Rezultatele sunt prezentate în figura 2.10.

Figura 2.10. Modificări spectroscopice apărute în timpul oxidării βCuPcS4 cu permanganat [βCuPcS4] = 18 mg/L, [KMnO4] = 7.6 mM și [NaOH] = 36 mM la 56o C; interval de timp de scanare = 15 min.

Pe parcursul reacției absorbanța crește încet la început, apoi descrește la ambele lungimi de undă (615 și 714 nm), așa cum se observă în figura 2.11.

Figura 2.11. Curbe cinetice extinse pentru oxidarea βCuPcS4 cu permanganat, [βSPc] = 0.018 g/L, [KMnO4] = 5.5 mM și [NaOH] = 0.072 M la 56o C.

În timpul reacției culoarea soluției se schimbă de la albastru la verde, apoi apare un precipitat și soluția devine galben deschis până la incolor (figura 2.12). Timpul necesar decolorării complete a fost între 4 și 24 de ore, în funcție de concentrațiile reactanților.

Figura 2.12 – schimbarea culorii în timpul reacției [βCuPcS4] = 0.018 g/L, [KMnO4] = 5.5 mM și [NaOH] = 0.072 M la 56o C.

S-a studiat dacă hidroxidul de sodiu are vreo influență asupra ftalocianinei. Pentru aceasta s-au adăugat 0, 018 g/L βCuPcS4 și NaOH 1M, s-a încălzit mediul de reacție la 56o C și s-au făcut determinări spectrofotometrice din 15 în 15 minute timp de 120 minute. Nu s-a observat nicio schimbare a spectrului în timp (figura 2.13), ceea ce duce la concluzia că hidroxidul de sodiu separat, în absența permanganatului, nu afectează molecula de ftalocianină.

nm

Figura2.13 – Spectre succesive ale ftalocianinei în prezența hidroxidului de sodiu. Hidroxidul de sodiu nu influențează spectrul ftalocianinei.

Analizele cinetice au fost efectuate la 714 nm deoarece la 615 nm ar putea fi câteva interferențe datorită formării ionului manganat (MnO42-) la 608 nm pe parcursul reacției[].

Curbele cinetice extinse arată o creștere a absorbanței, urmată de o descreștere exponențială. Culoarea este de asemenea mai intensă în perioada creșterii absorbanței.

La 714 nm se observă că în prima parte a reacției absorbanța crește încet pentru toate determinările. Magnitudinea și timpul până la absorbanța maximă depinde în mare parte de temperatură și de cantitățile de permanganat și hidroxid. Se știe că permanganatul de potasiu în mediu alcalin trece prin mai multe stări de oxidare – Mn(VI), Mn(V), Mn(IV) – funcție de pH-ul mediului de reacție. La pH puternic bazic (12-13) produsul de reacție stabil este ionul (MnO42-); la pH sub valoarea 12 se formează manganat (MnVI), hipomanganat (MnV) și apoi Mn(IV) care duce încet la o turbiditate de culoare galbenă și la final se precipită ca MnO2[].

În experimentele noastre valoarea pH-ului a variat între 10 și 12 astfel că putem considera că permanganatul se oxidează formând toate stările de oxidare ale manganului. De asemenea creșterea absorbanței putem considera că depinde de cantitatea de Mn(II) din soluția stoc de permanganat și timpul până când se atinge limita maximă scade cu pH-ul și temperatura.

Putem presupune că reacția are loc în cel puțin două etape consecutive, cu formarea unui intermediar stabil care are o culoare similară cu βCuPcS4. Dacă s-ar lua în considerare cazul a două reacții consecutive de ordinul I:

(1)

Evoluția în timp a concentrațiilor de reactant și intermediar (cAșicB) sunt date de:

(2)

Dacă reactantul și intermediarul au o absorbanță semnificativă (AA și AB) la aceeași lungime de undă, absorbanța totală măsuată (A) este dată de relația:

(3)

unde este absorbția molară a componentului j și l este lungimea de undă.

Se obține în final:

(4)

Ecuația poate fi utilizată pentru estimarea valorilor constantelor individuale și absorbția molară a intermediarului.

Pentru a îmbunătăți calitatea parametrilor estimați, estimarea constantei s-a realizat pe porțiunea de descreștere a curbei absorbție funcție de timp, unde reacția urmează o cinetică de pseudoordin I. Constantele de ordinul pseudo-întâi pentru perioada de descreștere (k2) au fost estimate prin regresia neliniară a ecuației (5) pe baza curbelor cinetice absorbanță funcție de timp.

(5)

Aceste valori obținute au fost utilizate în ecuația (4) pentru estimarea k1 și εB. Rezultatele la 560 C și concentrația inițială de 0.078 g/L βCuPcS4 sunt prezentate în tabelul nr. 2.6:

Tabelul nr. 2.6 – parametrii cinetici pentru oxidarea βCuPcS4 cu permanganat de potasiu în mediu bazic. k2 a fost estimat din ecuația (5) și valorile obținute s-au utilizat în ecuația (4).

Conform tabelului 2.6, coeficientul de extincție estimat al produsului intermediar la 714 nm este de trei ori mai mare decât al ftalocianinei utilizate.

Reacția βCuPcS4 cu permanganat de potasiu în mediu alcalin este o reacție complexă fiind posibilă o varietate de mecanisme în care oxidarea are loc prin intermediul a unu sau 2 electroni. Reacția nu poate fi simplificată la două etape consecutive dar forma curbelor A = f(t) poate fi explicată prin formarea unui produs intermediar care absoarbe lumina la aceeași lungime de undă cu βCuPcS4 (figura2.14).

Figura 2.14 – Rezultatele pentru estimarea k1 și εB

În continuare s-au utilizat doar valorile k2, deoarece furnizează informații cu privire la decolorarea ftalocianinei.

Un parametru important pentru degradarea coloranților este gradul de decolorare (D %) calculat ca:

(6)

Unde Amax și Afin reprezintă valorile absorbanței maxime și celei finale (la timpul stabilit).

Efectul concentrației de permanganat asupra decolorării βCuPcS4

Reacția a fost urmărită la concentrații constante de βCuPcS4 (18 mg/L) și NaOH (0,066 M); concentrația de permanganat a fost între 4,6 și 11,2 mM. Curbele cinetice (figura 2.15) arată un maxim de absorbanță în același timp (1 oră). Intensitatea maximului de absorbție crește cu concentrația de permanganat. Acest fenomen se poate datora creșterii concentrațiilor de Mn(II) conținute de soluția de permanganat, favorizându-se astfel fomarea intermediarului.

Figura 2.15. Curbele cinetice extinse pentru βCuPcS4 degradat la diferite concentrații inițiale de permanganat ([βSPc] = 18 mg/L, [NaOH] = 0.066 M) la 56o C.

Gradul de decolorare (figura 2.16) este foarte mic când concentrația de permanganat este sub 5 mM, apoi crește la valori foarte mari (aproape 100 %); decolorarea atinge un maximum de 98 % când concentrația permanganatului este 7,6 mM.

Figura 2.16. Gradul de decolorarea al βCuPcS4 funcție de concentrația de permanganat

Cea mai mare valoare a gradului de decolorare este corelată cu valoarea constantei k2, care are valoarea maximă tot la concentrația de permanganat 7,6 mM (figura 2.17). Timpul de înjumătățire corespunzător a fost în jur de o oră. Pentru experimentele următoare concentrația de permanganat a fost menținută la 7,6 mM, corespunzătoare celei mai bune decolorări obținute.

Figura 2.17 – valoarea k2 funcție de concentrația de permanganat de potasiu; maximul valorii k2 este la 7,6 mM la fel ca și pentru valoarea maximă a gradului de decolorare.

Efectul concentrației de ftalocianină

Reacția a fost urmărită la concentrații inițiale constante de KMnO4 (7,6 mM) și NaOH (0,066 M); concentrațiile ftalocianinei au variat între 2,6 și 28,5 mg/L. Curbele cinetice prezentate în figura 2.18 prezintă maximele la același timp.

Figura 2.18. Curbe cinetice extinse pentru degradarea βCuPcS4 ([KMnO4] = 7,6 mM, [NaOH] = 0,066 M la 56oC.

Gradul de decolorare calculat la 7 ore este peste 90% pentru toate concentrațiile utilizate și crește până la 98% la cantități mai mari de βCuPcS4 (figura 2.19).

Figura 2.19 – creșterea gradului de decolorarea al fatlocianinei funcție de timp la concentrații constante de permanganat și NaOH

Constantele de ordin pseudounu cresc aproape liniar cu cantitatea de ftalocianină utilizată (figura 2.20); ordinul de reacție estimat din dependența liniară ln(k) = f(ln[βSPc]) este 0,81±0,09.

Figura 2.20 – valoarea k2 funcție de concentrația de ftalocianină

Efectul concentrației de NaOH

Reacția a fost urmărită la concentrții inițiale constante de ftalocianină (18 mg/L) și KMnO4 (7,6 mM) iar concentrația de NaOH a variat între 0,009 și 0,066 M. Curbele cinetice sunt prezentate în figura 2.21. Timpul necesar pentru atingerea absorbanței maxime descrește cu creșterea concentrației de NaOH.

Figura 2.21–curbe cinetice extinse pentru degradarea βCuPcS4 la ([KMnO4] = 7,6 mM, [βCuPcS4] = 18 mg/L cu concentrații variate de NaOH (0,009 și 0,066 M) la 56o C.

Gradul de decolorare crește cu creșterea concentrației de NaOH așa cum se observă în figura 2.22. La exces de NaOH decolorarea este aproape completă.

Figura 2.22 – Reprezentarea gradului de decolorare a ftalocianinei funcție de [NaOH].

Gradul de decolorare este foarte mic la [NaOH] mai mici de 0,02 M. La concentrații ce depășesc 0,03 M, decolorarea este aproape completă (peste 94 % la 7 ore).

Constantele de ordinul pseudounu cresc aproape liniar cu cantitatea de NaOH utilizată; ordinul de reacție estimat este 0.94±0.19 (figura 2.23).

Figura 2.23 – Valoarea k1 funcție de concentrația initială de NaOH

Efectul temperaturii

Reacția a fost urmărită la concentrații inițiale constante de ftalocianină (18 mg/L), KMnO4 (7,6 mM) și NaOH (0,066 M). Curbele cinetice sunt prezentate în figura 2.24. Timpul necesar pentru a atinge absorbanța maximă descrește cu creșterea temperaturii.

Figura 2.24 – curbe cinetice extinse pentru degradarea βCuPcS4 la ([KMnO4] = 7,6 mM, [βCuPcS4] = 18 mg/L și [NaOH] = 0,066 M la temperaturi variate (400 C, 450 C, 560 C, 600 C și 700 C)

Gradul de decolorare crește liniar cu temperatura (figura 2.25).

Figura 2.25 – creșterea gradului de decolorare al ftalocianinei cu creșterea temperaturii, la concentrații constante de permanganat, NaOH și ftalocianină.

Energia de activare a fost estimată prin variația constantei de ordinul pseudoîntâi cu temperatura (figura 2.26), conform ecuației lui Arhennius. A fost obținută o valoare Ea = 38,4 kJ/mol = 9,15 kcal/mol.

Figura 2.26 – Variația constantei de ordinul pseudoîntâi cu temperatura

Degradarea βCuPcS4 în mediu bazic de soluție chelex 5%

Pentru testarea eficienței metode în condiții și mai apropiate de extracția ADN prin metoda chelex convențională, s-a înlocuit hidroxidul de sodiu cu soluție chelex 5% de pH 11, păstrându-se aceeași parametri optimi stabiliți pentru ceilalți reactanți: [βCuPcS4] = 18 mg/L, [KMnO4] = 7,6 mM, la 560C. S-a urmărit reacția timp de aproape 20 de ore până la scăderea absorbanței la 0 și implicit obținerea unui grad de decolorare de 100 % (figura2.27):

Figura 2.27 – curbă cinetică extinsă pentru degradarea βCuPcS4 la ([KMnO4] = 7,6 mM, [βCuPcS4] = 18 mg/L în mediu de soluție chelex 5 % de pH 11 la 56oC.

Degradarea coloranților din denim cu permanganat în mediu bazic la 56oC

Având în vedere că în laboratoarele de analize genetice multe din probele biologice puse la dispoziție sunt fixate pe denim care poate conține ca și coloranți textili ftalocianine sau indigo, metoda a fost testată pe un astfel de material mărunțit și dizolvat în APG. S-au utilizat aceleași concentrații de reactant, pH și temperatură stabilite anterior ca fiind optime și s-a urmărit reacția timp de 150 minute. S-a observat o scădere considerabilă a absorbanței după doar 10 minute, după care aceasta a continuat să scadă dar mult mai lent (figurile 2.28 și 2.29). Soluția își schimbă culoarea de la albastru închis la verde după 10 minute și la încă 10 trece în galben-verzui.

nm

Figura 2.28. Spectre succesive de colorant din denim (indigo) în prezența permanganatului de potasiu, în mediu bazic, la 56oC.

Menționăm că denimul utilizat conține indigo ca și colorant textil, având un maxim de absorbție la 660 nm.

Figura 2.29. Curbă cinetică extinsă pentru degradarea coloranților din denim la ([KMnO4] = 7,6 mM, [NaOH] = 0,066 M la 56oC.

Degradarea diferitelor tipuri de ftalocianine

A fost studiată degradarea βCuPc și Cl-αCuPc utilizând cele mai bune condiții de degradare stabilite pentru βCuPcS4: concentrație ftalocianină (18 mg/L), KMnO4 (7,6 mM) și NaOH (0,066 M), la 56oC – temperatura la care are loc izolarea ADN-ului din probe. Structura ftalocianinelor utilizate sunt prezentate în tabelul nr. 2.7.

Tabelul nr. 2.7 – structura ftalocianinelor βCuPc și Cl-αCuPc utilizate, în concentrație de 18 mg/L, pentru degradare cu KMnO4 (7,6 mM) și NaOH (0,066 M), la 56oC

Spectrele UV-VIS ale ftalocianinelor utilizate (figura 2.30) prezintă două benzi de absorbție în regiunea vizibilă la 615 nm și 715 nm. La Cl-αCuPc benzile sunt mai largi decât la β-ftalocianine.

Figura 2.30. Spectrele ftalocianinelor (18 mg/L în APG)

Pentru toate ftalocianinele studiate, variația absorbanței în timp are același aspect ca și în cazul βCuPcS4 (figura 2.31).

Figura 2.31. Variația absorbanței în timp pentru cele trei tipuri de ftalocianine în condiții optime de oxidare.

Pentru toate ftalocianinele, gradul de decolorare după 7 ore este de peste 80% (Figura 2.32); pentru βPc decolorarea este mai mare decât pentru αClPc.

Figura 2.32 – gradul de decolorare al ftalocianinelor studiate în condiții optime de oxidare: βSPc, αClPc și βPc (18 mg/L), KMnO4 (7,6 mM) și NaOH (0,066 M) la 56oC.

În concluzie putem afirma că sistemul chelex/permanganat de potasiu este unul compatibil și eficient pentru îndepărtarea ftalocianinelor.

Analiza produșilor de reacție

Produșii de reacție (precipitatele) au fost analizați prin spectrometrie FTIR și spectrometrie de fluorescență cu raze X. Analizele calitative și cantitative au fost efectuate prin metoda multi-punct pe suprafața fiecărei probe. În figura 2.33 sunt redate spectrele FTIR pentru cele trei ftalocianine utilizate în stare inițială (pudre albastru intens).

Figura 2.33 – Spectre FTIR pentru ftalocianinele utilizate

În figurile 2.34 și 2.35 sunt prezentate spectrele de absorbție în infraroșu ale ftalocianinelor alfa și beta împreună cu produșii de reacție corespunzători după oxidarea acestora cu permanganat, în mediu bazic, la 560C.

Figura 2.34. Spectre FTIR pentru βPc și produșii de reacție

Figura 2.35. Spectre FTIR pentru αClPc și produșii de reacție

Analizele elementale cu raze X au arătat că în precipitat există o cantitate mare de Mn (77-89%) și Cu aproape deloc, deci în precipitat putem presupune că avem MnO2. De altfel și din spectrele în infraroșu se evidențiază benzi de ftalocianină (posibil un rest de ftalocianină) și benzi corespunzătoare oxizilor (la capătul spectrelor). Spectrele IR și XRF pentru ftalocianinele alfa și beta pot fi vizualizate mai clar în anexele 4-7. S-au analizat produșii de reacție cu aceleași metode și pentru βCuPcS4 oxidată cu permanganat în soluție chelex 5 % (anexa 3) și s-a observat că spectrele sunt foarte asemănătoare cu cei rezultați în mediu bazic de NaOH (anexele1 și 2).

Supernatantul (filtratul) incolor a fost testat analitic cu ferocianură de potasiu în vederea prezenței/absenței ionilor de Cu și Mn, stabilindu-se că aceștia nu mai există în faza apoasă a produșilor de reacție. S-a supus apoi evaporării și reziduul apos a fost testat prin spectrometrie de fluorescență cu raze X iar rezultatele sunt expuse în anexa 8.

Degradarea oxidativă a unor coloranți textili cu permanganat în mediu bazic

Cu parametrii stabiliți pentru ftalocianine, s-a testat degradarea mai multor coloranți textili din clase diferite. Numele și structura acestora sunt prezentate în tabelul nr. 2.8.

Tabelul nr. 2.8 –structura, denumirea și clasa din care fac parte coloranții textili oxidați cu permanganat de potasiu în mediu bazic

Spectre de absorbție UV-VIS inițiale și după reacția cu permanganat în mediu bazic timp de 4 ore la 50 oC, pentru fiecare colorant textil studiat.

Pentru a evita suprapunerea culorii pentru coloranții care absorb în același domeniu cu permanganatul de potasiu, înainte de trasarea spectrelor în soluție a fost adaugată o cantitate fixă de clorhidrat de etanolamină, care are rolul de a distruge permanganatul, fară a influența în vreun fel spectrul de absorbție a colorantului.

nm

Figura 2.36. Spectrul de absorbție al fucsinei în prezența clorhidratului de etanolamină

Fucsina se decolorează în prezență de hidroxid de sodiu, ceea ce înseamnă că în procesul de extragere a ADN-ului cu metoda Chelex, la pH 9-11 se decolorează, neintervenind în procesul de potențială inhibiție a procesului de amplificare. Spectrele inițial și final ale acestui colorant sunt conform figurii nr. 2.37:

nm

Figura 2.37. Spectrele de absorbție ale colorantului fucsină înainte și după oxidare.

Pentru roșu Congo, în timp de 1oră se obține un grad de decolorare de 50 % (figura 2.38).

nm

Figura 2.38. Spectrele de absorbție ale colorantului roșu de Congo înainte și după oxidare.

Pentru roșu Bordeaux în timp de 2 ore se obține un grad de decolorare de 54 % (figura 2.39).

nm

Figura 2.39. Spectrele de absorbție ale colorantului roșu Bordeaux înainte și după oxidare.

Naftol galben se decolorează în procent de 41 % după 4 ore (figura 2.40).

nm

Figura 2.40. Spectrele de absorbție ale colorantului naftol galben înainte și după oxidare.

Brilliant blue se decolorează 56 % dupa doar 15 minute (figura 2.41).

nm

Figura 2.41. Spectrele de absorbție ale colorantului Brilliant blue înainte și după oxidare.

Sellafast black își pierde 73 % din culoare după o oră (figura 2.42).

nm

Figura 2.42. Spectrele de absorbție ale colorantului Sellafast black înainte și după oxidare.

Sellaecht brown se decolorează 63 % într-o oră (figura 2.43).

nm

Figura 2.43. Spectrele de absorbție ale colorantului Sellaecht black înainte și după oxidare.

Sellafast bordeuax red prezintă după o oră un grad de decolorare de 40%.

Graficul cu gradele de decolorare ale coloranților textili testați prin oxidarea fiecăruia în parte cu permanganat de potasiu în mediu bazic, la 50 0C timp de 4 ore se prezintă conform figurii 2.44.

Figura 2.44. Gradul de decolorare al coloranților textili oxidați cu permanganat de potasiu în

mediu bazic la 50 0C.

Din datele obținute pare că metoda de oxidare cu permanganat de potasiu funcționează pentru toți coloranții testați, fiecare degradându-se într-un procent mai mic sau mai mare. Probabil că pentru un grad de decolorare cât mai mare procesul trebuie optimizat cu diferiți parametri de pH, temperatură și concentrație de permanganat de potasiu, pentru fiecare colorant în parte.

Concluzii

Au fost testate mai multe metode de oxidare avansată (oxidare chimică cu HO., oxidare enzimatică, electroliză si oxidare cu KmnO4/NaOH) pentru degradarea unor coloranți textili potențiali inhibitori în identificarea ADN-ului.

Colorantul ales a fost o ftalcianină de cupru -3,4′,4″,4″′- tetrasulfonată (βCuPcS4), care este foarte recalcitrantă la transformările chimice și care este inhibitor în procesul de amplificare a AND-ului.

Dintre toate metodele testate, doar prin electroliză și oxidare cu permanganat în mediu bazic se obțin rezultate rezonabile.

Decolorarea ftalocianinelor are loc în minim două etape succesive, cu formarea unui intermediar destul de stabil care prezintă un maxim de absorbție la aceeași lungime de undă ca și ftalocianina.

Au fost stabilite condițiile optime de oxidare la temperatura de 56 oC (temperatura la care se face și extrația ADN-ului din probe biologice); sistemul oxidant trebuie să fie în mare exces față de colorant (aproximativ 1:100); la un raport molar între permanganat și hidroxid de sodiu de 1:9 se obține un grad de decolorare de aproape 100%.

Metoda a fost verificată pentru degradarea mai multor coloranți textili și a unor probe de material de tip denim; în toate cazurile s-au obținut grade de decolorare mari, ceea ce înseamnă că metoda poate fi utilizată în laboratorul de identificare ADN în timpul procesului de extracție.

II.2. TESTAREA EFECTULUI INHIBITOR AL PERMANGANATULUI DE POTASIU ȘI A UNOR COLORANȚI TEXTILI ASUPRA PROCESULUI DE AMPLIFICARE ADN PRIN METODA DE CUANTIFICARE REAL TIME PCR

Obiective

Testarea efectului inhibitor al permanganatului de potasiu și al coloranților textili studiați.

Testarea efectului inhibitor al produșilor rezultați din oxidarea coloranților cu permanganat de potasiu în mediu bazic la 56 0C

Principiul metodei:

Metoda Real-Time PCR constă în urmărirea cineticii reacției PCR în timp real prin amplificarea unei singure secvențe ADN țintă folosindu-se în mediul de reacție fluorocromi care se excită și emit cuante de energie la anumite lungimi de undă. Fluorocromii se intercalează între bazele azotate și intensitatea fluorescenței crește direct proporțional cu înmulțirea ampliconilor în timpul reacției PCR[] .

Fazele procesului Real-T ime PCR

Procesul Real-Time PCR se desfășoară în patru faze[]:

– faza liniară care durează aproximativ 10-15 cicluri funcție de cantitatea inițială de ADN țintă în care fluorescența emisă nu depășește valoarea zgomotului (background);

– faza exponențială timpurie în care nivelul fluorescenței atinge un prag (treshold) care depășește cu mult valoarea zgomotului. Ciclul la care fluorescența ampliconului de interes depășește cu mult nivelul de background se numește ”treshold cycle” sau CT și se exprimă printr-o valoare numerică. Această valoare este invers proporțională cu cantitatea inițială de ADN țintă din proba analizată.

– faza logaritmică liniară în care are loc dublarea cantității de amplicon per ciclu în condiții ideale (cantitate și calitate ADN țintă din probă)

– faza de platou în care reactanții sunt limitați și în consecință nu se mai justifică măsurarea fluorescenței.

Practic prin această metodă ampliconul este vizualizat pe parcursul reacției PCR spre deosebire de metoda PCR convențională unde ampliconii sunt vizualizați la sfârșitul procesului enzimatic.

Pentru probele analizate s-a efectuat cuantificarea absolută a probelor prin metoda real-time PCR monitorizându-se derularea procesului reacției de polimerizare în lanț. Datele au fost colectate pe parcursul procesului PCR.Cuantificarea absolută presupune determinarea cantității absolute a unei singure secvențe țintă de ADN dintr-o probă necunoscută[].

Probele au fost cuantificate utilizându-se kitul de cuantificare Investigator® Quantiplex furnizat de compania QIAGEN, adaptat metodei Real-Time PCR, care conține o ADN polimerază specifică pentru o regiune din genomul uman autozomal de 146 perechi de baze. Cuantificarea cu kitul Investigator Quantiplex se realizează pentru cantitatea totală de ADN uman din probele analizate, conform manualului de utilizare a kitului[].

Detectarea produșilor PCR are loc direct la un sistem Q Rotor Gene, furnizat de acceași companie. Cantitatea de ADN este detectată prin canalul verde al instrumentului Q Rotor Gene. Kitul Investigator Quantiplex oferă o sensibilitate < 1 pg/µL și o capacitate rapidă și precisă de cuantificarea a ADN-ului uman < 4,9 pg/µL. În plus, un aspect foarte important pentru cercetările noastre, kitul conține un control intern de amplificare de 200 perechi de baze ce detectează inhibitorii PCR în canalul galben al instrumentului Q Rotor Gene.

Amplificarea are loc prin intermediul unor primeri ”Scorpion” care sunt molecule bifuncționale ce conțin un primer PCR legat covalent de probă. Primerii ”Scorpion” sunt recunoscuți pentru capacitatea lor rapidă de hibridizare la secvența țintă[128]. Fluoroforul din probă interacționează cu un quencher (captator) încorporat tot în probă care reduce fluorescența. În timpul reacției de amplificare, când produșii PCR se leagă la proba de interes, fluoroforul și captatorul se separă și se produce o creștere a fluorescenței, funcție de care se determină cantitatea de ADN din proba analizată.

II.2.1. Testarea efectului inhibitor al permanganatului de potasiu și al coloranților textili studiați la capitolul ii.1, prin metoda Real-Time PCR cu kitul Investigator Quantiplex

Cantități exacte din coloranții testați au fost introduși în godeuri într-o placă de eluție QIA împreună cu cantități cunoscute de ADN din kitul de cuantificare Quantiplex (z1) iar ADN-ul uman total a fost cuantificat utilizând instrumentele QIA Symphony AS pentru pregătirea probelor și Rotor-Gene Q pentru cuantificarea propriu-zisă.

Pregătirea probelor

S-au preparat soluții cu diferite concentrații de ADN, coloranți și permanganat astfel:

Din cei treisprezece coloranți s-au preparat soluții de concentrații în intervalul 18 – 0,72 ng/μL iar din permanganat soluții de concentrații în intervalul 63,2 – 7,9 ng/μL.

S-a utilizat ADN din kitul de cuantificare de concentrație cunoscută, controlul pozitiv “z1” (20 ng/μL) din care s-au preparat soluții de 5, 1,25 și 0,3125 ng/μL utilizând pentu diluții apă ultrapură, fără nucleaze, din kit.

Soluțiile totale (ADN + substanța studiată (colorant sau permanganat)) au fost preparate în tuburi Eppendorf de 2 mL în volume totale de 200 µL/probă. De asemenea au fost pregătite și soluții de colorant respectiv permanganat de potasiu fără ADN pentru a verifica dacă sunt contaminate cu ADN. Din tuburile Eppendorf au fost transferați câte 50 μL din fiecare probă într-o placă de eluție QIA (într-o ordine bine determinată) care a fost apoi introdusă în instrumentul QIASimphony în modulul AS pentru pipetarea automată a probelor împreună cu reactivii din kitul de cuantificare. Probele au fost pregătite conform protocolului de lucru din manualul kitului utilizat[129], utilizându-se un volum de 23 μL Master mix (11,5 μL amestec de reacție și 11,5 μL primeri Quantiplex) și 2 μL din fiecare probă de interes, într-un volum total de 25 μL.

Notă:Instrumentul QIA Symphony este alcătuit din două module: un modul pentru purificarea lizatelor obținute în etapa de pretratare a probelor (QIA SP) și un modul destinat preparării probelor pentru cuantificare și amplificare (QIA AS).

Probele pentru cuantificare se pot pregăti și manual însă fiind vorba de cantități foarte mici probele s-au pregătit automat pentru evitarea erorilor de pipetare care ar putea duce la rezultate incorecte.

Instrumentul de preparare a colectat probele preparate în tuburi de 100 µL care au fost apoi închise cu capace speciale.

Cuantificarea probelor

Tuburile cu probele pregătite la instrumentul QIASimphony au fost introduse în instrumentul Q Rotor Gene în discul cu 72 de poziții din care întotdeauna 15 sunt ocupate cu probe de control pozitiv (z1) din kit destinate efectuării dreptei de calibrare respectiv determinării tresholdului. Controalele se prepară prin diluții seriale pornind de la concentrația inițială de 20 ng/µL până la 0,01953125 ng/µL.

În instrumentul Rotor Gene probele au fost amplificate astfel: 1 min la 95 0C, apoi 40 de cicluri care cuprind fiecare două paliere de temperatură (1 s la 95 0C și 10 s la 60 0C). Prima etapă se numește ”etapa inițială de activare” când se activează ADN polimeraza. Urmează ”denaturarea” 1 s la 95 0C și apoi „cuplarea/elongarea” primerilor specifici când se colectează datele de fluorescență utilizând canalele verde și galben ale instrumentului. Potrivit obiectivului nostru, de testare a efectului inhibitor al reacției PCR pentru fiecare probă cu colorant analizată, s-a urmărit canalul verde pentru verificarea cantităților de ADN introdus și canalul galben pentru valoarile CT. Conform manualului de utilizare a kitului Investigator Quantiplex valorile CT > 31 indică prezența inhibitorilor PCR. Pe de altă parte, probelor cu inhibitori evidențiate prin valoarea CT pe canalul galben, ar trebui să le corespundă o cantitate mai mică de ADN pe canalul verde la sfârșitul procesului R-T PCR față de cantitatea inițială introdusă (diferență input/output). Instrumentul Q Rotot Gene dispune de două comenzi – „Slope Correct” și „Auto-find Threshold” care se activează la sfârșitul run-ului (procesului PCR) și care permit determinarea automată a threshold-ului și calcularea dreptei de calibrare, precum și a valorilor CT și a concentrațiilor probelor în ng/µL.

Curbele de calibrare pentru standarde sunt calculate automat și sunt prezentate sub forma dreptei de regresie y = b+m*x împreună cu coeficientul de regresie liniară R, și coeficientul de determinare R2.

Datele R-T PCR se prezintă sub forma unor grafice de amplificare sigmoidale (la utilizarea unei scale liniare), în care intensitatea emisiei de fluorescență este reprezentată în funcție de numărul de cicluri. CT-ul (threshold cycle) obținut pe canalul verde este utilizat pentru a calcula cantitatea de ADN din fiecare probă analizată și reprezintă ciclul la care este detectată prima creștere semnificativă a intensității emisiei de fluorescență. Threshold-ul optim este dependent de tipul de kit utilizat.

Curba de calibrare reprezintă cea mai bună reprezentare a regresiei liniare pentru diluțiile seriale ale standardului. Ecuația este de forma y = mx + b, unde x este logaritmul concentrației iar y este CT.

Panta m descrie eficiența reacției PCR. O eficiență de 100% este indicată de o valoare a pantei de -3.3 (numărul produșilor de amplificare a fost dublat pentru fiecare ciclu). În mod normal, valoarea pantei este între -3.0 și -3.6.

Intersecția cu ordonata (b) indică CT -ul pentru o probă cu cantitatea 1 (de exemplu, 1 ng/µL).

Rezultatele au fost analizate cu software-ul Rotor Gene Q Series versiunea 2.2.3. iar o parte dintre ele sunt redate în figurile 2.45 și 2.46 și tabelul nr. 2.9.

Toate determinările s-au efectuat în triplicat.

Figura 2.45. Datele de amplificare a ftalocianinelor în cele 40 de cicluri cu creșterea fluorescenței funcție de cantitatea de ADN din probă în canalul verde al instrumentului Q Rotor Gene; probele analizate sunt trasate cu albastru și probele control (15) cu roșu.

Tabelul nr. 2.9. Parametrii cinetici ai reacției de cuantificare pentru probele de ADN cu coloranți

Figura 2.46.Curba de calibrare a cuantificării probelor pe canalul galben al instrumentului Q Rotor Genen – valorile CT obținute; probele analizate sunt trasate cu albastru și probele control (în număr de 15) cu roșu

Probele control sunt probele cu concentrații cunoscute de ADN, de la 20 ng/µL la 0 ng/µL, în număr total de 15, pentru fiecare serie de probe analizate, necesare pentru efectuarea curbei de calibrare. Având în vedere că discul de probe din instrumentul Q Rotor Gene conține 72 de poziții dintre care 15 sunt destinate probelor control, se subânțelege că, pentru testarea tuturor coloranților studiați în toate concentrațiile utilizate pentru fiecare, s-au efectuat mai multe serii de determinări, inclusiv de reproductibilitate.

Din rezultate obținute reies următoarele:

1) Permanganatul nu inhibă reacția de amplificare în niciuna din cocentrațiile utilizate:

– 85 ng/µL permanganat cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 30,7;

– 42,5 ng/µL permanganat cu 5 ng/µLADN – valoarea medie CT = 30,6;

– 21,25 ng/µL permanganat cu 1,25 ng/µLADN – valoarea medie CT = 30,7;

– 10,625 ng/µL permanganat cu 0,3125 ng/µLADN – valoarea medie CT = 30,06.

Rezultatele arată că permanganatul de potasiu nu inhibă amplificarea ADN-ului putând fi astfel utilizat pentru degradarea oxidativă a coloranților textili.

2) βCuPcS4 inhibă reacția de amplificare în toate concentrațiile utilizate:

– 18 ng/µLftalocianină cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 33;

– 9 ng/µLftalocianină cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 32,38;

– 4,5 ng/µLftalocianină cu 1,25 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 32,2;

– 2,25 ng/µLftalocianină cu 0,3125 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 32.

3) βCuPc inhibă reacția de amplificare în primele două concentrații iar în ultimele două valoarea CT este la limita inferioară a valorii ce indică inhibarea PCR:

– 18 ng/µLftalocianină cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 32,3;

– 9 ng/µLftalocianină cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 32,41;

– 4,5 ng/µLftalocianină cu 1,25 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 31,93;

– 2,25 ng/µLftalocianină cu 0,3125 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 31,81.

Observăm că efectul inhibitor al βCuPc și βCuPcS4 descrește cu scăderea concentrației de colorant. De asemenea putem spune, conform rezultatelor obținute, că βCuPcS4 este un inhibitor PCR mai puternic decât βCuPc.

4) Cl-αCuPc, la fel ca și KMnO4, nu este inhibitor PCR, conform valorilorCT obținute:

– 18 ng/µL ftalocianină cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 30,3;

– 9 ng/µL ftalocianină cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 30,4;

– 4,5 ng/µL ftalocianină cu 1,25 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 30,33;

– 2,25 ng/µL ftalocianină cu 0,3125 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 30,28.

5) Fucsina inhibă amplificarea PCR în concentrațiile mai mari dintre cele utilizate:

– 2,3 ng/µL fucsină cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 32,83;

– 1,15 ng/µL fucsină cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 32,63;

– 0,8 ng/µL ftalocianină cu 0,5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 30,7.

6) Rosu Congo nu are efect inhibitor asupra reacției de amplificare:

– 4,825 ng/µL colorant cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 30,15;

– 1,6 ng/µL colorant cu 0,5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 30,38.

7) Rosu Bordeaux a fost testat în două concentrații și conform valorilor CT nu este inhibitor PCR:

– 3,48 ng/µL colorant cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 29,55;

– 1,16 ng/µL colorant cu 0,5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 29,75.

8) Galben naftol de asemenea nu inhibă procesul PCR:

– 2,48 ng/µL colorant cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 28,42;

– 0,82 ng/µL colorant cu 0,5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 29,47.

9) Brilliant blue prezintă valori CT normale care demonstrează că nici acest colorant nu inhibă procesul PCR:

– 2,75 ng/µL colorant cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 28,28;

– 0,85 ng/µL colorant cu 0,5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 29,56.

10) Sellafast black s-a utilizat în două concentrații iar valorile CT obținute nu indică efect inhibitor pentru amplificare:

– 3,24 ng/µL colorant cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 28,74;

– 0,92 ng/µL colorant cu 0,5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 29,17.

11) Sellaecht brown de asemenea nu inhibă procesul de amplificare în cele două concentrații folosite:

– 3,22 ng/µL colorant cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 28,64;

– 0,91 ng/µL colorant cu 0,5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 29,73.

12) Sellafast Bordeaux A s-a utilizat de asemenea în două concentrații:

– 2,33 ng/µL colorant cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 28,98;

– 0,72 ng/µL colorant cu 0,5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 28,15.

13) indigo sintetizat prezintă valori CT la limita dintre inhibiție și non-inhibiție PCR pentru ambele concentrații utilizate:

– 2,11 ng/µL colorant cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 31,02;

– 0,68 ng/µL colorant cu 0,5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 30,9.

14) indigo carmin nu prezintă efect inhibitor în concentrațiile testate:

– 2,74 ng/µL colorant cu 5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 30,2;

– 0,64 ng/µL colorant cu 0,5 ng/µL ADN – valoarea medie CT = 29,92.

Rezultatele pentru efectul inhibitor sunt obținute pe canalul galben al instrumentului Q Rotor Gene. Pe canalul verde se determină rezultatele cu cantitățile de ADN din fiecare probă analizată.

Cantitățile de ADN furnizate de canalul verde pentru probele analizate au fost conforme cu cele introduse, cu o marjă de eroare de maxim 3%. Nu se poate spune același lucru și despre probele în care s-a pus în evidență inhibiția PCR, respectiv cele cu beta-ftalocianina de cupru tetrasulfonată, beta-ftalocianina de cupru și fucsină:

pentru probele cu 5 ng/µL ADN și fucsină, s-a determinat la sfârșitul procesului R-T PCR 3,05 ng/µL ADN (diferență de 40 % ADN input-output);

pentru probele cu 0,5 ng/µL ADN și fucsină, s-a determinat la sfârșitul procesului R-T PCR 0,11 ng/µL ADN (diferență de 80% ADN input-output);

surprinzător, pentru probele cu beta-ftalocianina de cupru și beta-ftalocianina de cupru tetrasulfonată, s-au determinat la sfârșitul procesului R-T PCR cantități cu 40 până la 100 % mai mari. De ex. la o cantitate de 5 ng/µL ADN introdus s-au determinat pe canalul verde al instrumentului 7 ng/µL ADN (diferență 40%) iar la 0,3125 ng/µL ADN introdus, s-au determinat la sfârșitul procesului 0,64 ng/µL ADN (de două ori mai mult).

Aceste erori pot fi explicate prin faptul că cei doi coloranți absorb la aceeași lungime de undă cu fluoroforul de pe canalul verde, amplificându-se mai mult semnalul de fluorescență, funcție de care se determină cantitatea de ADN din probe.

S-au testat acești doi coloranți și fără ADN iar rezultatele au fost conforme (0 ng/µL).

Concluzii

În concluzie, dintre toți coloranții testați, cel mai mare efect inhibitor pentru reacția PCR îl are beta-ftalocianina de cupru tetrasulfonată (figura 2.47), un colorant textil foarte utilizat pentru nuanțele de albastru pe care le poate oferi, în special în colorarea denimului. Multe din probele criminalistice sunt constituite din probe biologice fixate pe denim, un motiv în plus pentru care acest colorant a fost studiat în vederea degradării oxidative, pentru înlăturarea lui din probele biologice.

Următorii coloranți cu valoare CT mare au fost βCuPc (figura 2.47) și fucsina. Având în vedere că fucsina se decolorează în mediu bazic iar extracția prin metoda Chelex are loc la valori de pH cuprinse în intervalul 9-11, putem deduce că acest colorant poate fi îndepărtat cu succes direct prin extracția Chelex, fără etape suplimentare.

Despre indigo se cunoaște de foarte mult timp că este unul din cei mai puternici inhibitori PCR[14], totuși, cel testat de noi (indigo sintetizat) are o valoare CT mai mică decât βCuPcS4. De altfel coloranții din denimul albastru închis sunt inhibitori PCR[] iar indigoul și ftalocianinele fac parte din aceștia.

După rezultatele obținute ne putem pronunța că toți ceilalți coloranți studiați, inclusiv Cl-αCuPc (figura 2.47), nu sunt inhibitori ai procesului de amplificare, atât de important în identificarea prin amprenta genetică. Foarte important este că permanganatul de potasiu, agentul oxidant utilizat pentru toți coloranții mai sus menționați, nu este inhibitor al procesului PCR (figura 2.48).

Figura 2.47.ValorileCT ale controlului intern ADN (IC) din canalul galben pentru probele cu 18 ng/μL ftalocianină (5 ng/µL IC ADN): A) βCuPc B) βCuPcS4 și C) Cl-αCuPc

Figura 2.48. Valoarea CT a controlului intern ADN (IC) din canalul galben pentru probele cu 63 ng/μL permanganat de potasiu și 5 ng/µL IC ADN

II.2.2. Testarea efectului inhibitor al coloranților studiați după oxidarea acestora cu permanganat de potasiu în mediu bazic la 560C prin metoda RT PCR cu kitul Investigator Quantiplex

Toți coloranții testați mai sus pentru efectul inhibitor au fost oxidați cu permanganat de potasiu. Produșii de reacție au fost apoi filtrați pe hârtie de filtru și soluția rezultată din fiecare colorant a fost din nou testată prin metoda de cuantificare R-T PCR.

Pregătirea probelor

Produșii de oxidare ai coloranților împreună cu ADN din kitul de cuantificare (z1) au fost introduși în godeuri într-o placă de eluție QIA, în volum total de 50 µL fiecare.

S-a utilizat ADN în două concentrații: 5 și 0,5 ng/µL și s-au preparat soluții cu coloranți oxidați astfel:

S-au amestecat soluții de ADN 5 ng/µL cu colorant oxidat în raport de volum 1:4;

S-au amestecat soluții de ADN 0,5 ng/µL cu colorant oxidat în raport de volum 1:12.

Placa de eluție cu soluțiile astfel pregătite a fost introdusă în instrumentul QIASimphony, modulul QIA AS unde s-au pipetat automat reactivii din kitul Investigator Quantiplex (23 µL/probă) împreună cu câte 2 µL de probă din fiecare godeu, conform protocolului de lucru al companiei QIAGEN. Probele finale au fost colectate automat în tuburi speciale de 100 µL într-un suport de cuantificare RG Strip Tubes 72 QS 9018092. Tuburile au fost scoase din QIA AS și închise cu capace speciale.

Cuantificarea probelor

Tuburile cu probele pregătite la instrumentul QIASimphony au fost introduse în discul cu 72 de poziții din instrumentul Q Rotor Gene și amplificate astfel: 1 min la 950C, 40 de cicluri de câte o secundă la 95 0C și 10 s la 65 0C. Rezultatele au fost generate cu ajutorul software-ului Rotor Gene Q Series versiunea 2.2.3..Toate determinările s-au efectuat în triplicat.

Și de această dată s-au efectual mai multe serii de determinări care să acopere testările pentru toți coloranții oxidați și testările de reproductibilitate.

O parte din rezultate sunt expuse în figurile 2.49 și 2.50.

Figura 2.49.Curba de calibrare a cuantificării probelor cu coloranți oxidați, pe canalul galben al instrumentului Q Rotor Gene; probele analizate sunt trasate cu albastru și probele control (15) cu roșu

Se observă din figura de mai sus că toate valorile CT sunt sub valoarea 31, ceea ce ne indică faptul că toți coloranții oxidați nu au efect inhibitor PCR, ceea ce demonstrează că metoda de oxidare utilizată este eficientă pentru obiectivele noastre. De asemenea putem deduce că cei patru coloranți care aveau inițial efect inhibitor, conform rezultatelor de la capitolul II.1.1. (βCuPcS4, βCuPc, fucsina și indigo) , după oxidarea lor termică cu permanganat de potasiu în mediu bazic, acesta a fost eliminat cu succes.

Figura 2.50. Datele de amplificare RT –PCR a coloranților oxidați în cele 40 de cicluri cu creșterea fluorescenței funcție de cantitatea de ADN din probă în canalul verde al instrumentului Q Rotor Gene; probele analizate sunt trasate cu albastru și probele control (15) cu roșu

Conform parametrilor cinetici obținuți în raportul final de cuantificare (tabelul nr. 2.10.) procesul R-T PCR s-a desfășurat optim.

Tabelul nr. 2.10. Parametrii cinetici ai reației R-T PCR pentru probele cu ADN și coloranți oxidați.

Valorile medii CT pe canalul galben al instrumentului Q Rotor Gene, pentru coloranții oxidați sunt redate în tabelul de mai jos:

Tabelul nr. 2.11. Valorile medii CT pe canalul galben pentru coloranții oxidați cu permanganat de potasiu. Concentrația c1 reprezintă proba compusă din ADN 5 ng/µL cu colorant oxidat în raport de volum 1:4 și concentrația c2 reprezintă proba compusă din ADN 0,5 ng/µL cu colorant oxidat în raport de volum 1:12.

Cantitățile de ADN obținute pe canalul verde sunt conforme cu cele introduse, cu o diferență la unele dintre ele de maxim 3%.

Figura 2.51. – Efectul inhibitor al coloranților testați asupra reacției PCR, funcție de valorile CT furnizate de canalul galben al instrumentului Rotor Gene.

Concluzii

Dintre coloranții studiați 4 au efect inhibitor asupra reacției PCR (figura 2.51), conform valorilor CT obținute (βCuPcS4, βCuPc, fucsina și indigo);

Permanganatul, agentul oxidant utilizat pentru oxidarea coloranților, nu este inhibitor PCR, ceea ce reprezintă un mare avantaj;

Cei patru coloranți cu efect inhibitor prezintă valori CT normale (aprox. 30) după oxidarea lor cu permanganat de potasiu în mediu bazic la 560C;

Metoda de oxidare a coloranților cu permanganat de potasiu este eficientă în degradarea coloranților inhibitori ai procesului PCR.

II.3. IDENTIFICAREA ADN DIN PROBE BIOLOGICE CU COLORANȚI DIN DENIM

Obiective

Identificarea ADN din probe biologice (salivă) tratate cu permanganat de potasiu în prezența ftalocianinelor – βCuPcS4, Cl-αCuPc și βCuPc

Identificarea ADN din probe biologice (salivă, sânge, celule epiteliale) fixate pe denim

Una din performanțele identificării de personae pe bază de ADN este că se pot obține profile genetice din toate tipurile de urme și microurme biologice umane care conțin celule nucleate: leucocite din sânge, celule epiteliale provenite atât de pe suprafața corpului cât și din zonele interne ale acestuia (salivă, lichid seminal etc.) precum și cele transferate pe haine sau obiecte, spermatozoizi, țesuturi moi și dure (dinți, oase), diverse secreții biologice etc.

Fiecare celulă nucleată din organismul unui individ care conține ADN este o potențială sursă de identificare genetică a acestuia. Acizii nucleici reprezintă moleculele care pastrează, transportă si manipulează informația în orice celulă vie. Codul de scriere a acestei informații este universal valabil, iar mecanismele biochimice implicate sunt pe de o parte complexe si pe de alta parte foarte precise.

În domeniul de concentrație, 0,1 – 2,5 ng ADN, vor fi cca. 30 – 833 copii ale fiecărei secvențe ADN[1].

Din fiecare urmă sau microurmă biologică umană identificată ca fiind de interes, se extrage ADN-ul care este apoi purificat și amplificat.

Zonele țintă din genom sunt fragmentele scurte repetitive („Short Tanden Repet” – STR) de un anumit număr de ori, specific fiecărui individ. Acestea, utilizându-se reactivi specifici fluorescenți, sunt supuse unei reacții de amplificare – „Polymerase Chain Reaction” – un proces enzimatic prin care regiunile sunt replicate de 28 -34 ori, funcție de cantitatea de ADN existentă în probă, generându-se cca. un bilion (109) de copii[43]. Produșii de amplificare astfel obținuți sunt analizați prin electroforeză capilară. Rezultatele obținute se prezintă sub formă de electroforegrame (anexele nr. 9 – 12).

Analiza genetică reprezintă din ce în ce mai frecvent o provocare în cadrul laboratoarelor de specialitate, presupunând abordarea unor tehnici adaptate cantității, calității și stării de conservare a materialului biologic pus la dispoziție.

Condițiile de bază pentru obținerea de amprente genetice din diverse probe biologice sunt cantitatea și calitatea ADN-ului din probele analizate: trebuie să existe cantitate suficientă de ADN (0,5-1 ng, funcție de kitul de amplificare utilizat) și din punct de vedere calitativ, ADN-ul să nu fie degradat sau coextras cu inhibitori PCR. Amplificarea unui extract ADN coextras cu coloranți textili poate fi la fel de eșuată ca amplificarea unui extract de ADN degradat[43].

Întrucât dintre toți coloranții testați pentru efectul inhibitor al reacției PCR (vezi cap. II.1) βCuPcS4 are din rezultatele obținute valoarea CT cea mai mare s-a procedat în continuare la verificarea acestei informații prin folosirea acestui colorant în probe cu ADN cunoscut și cantitate suficientă în obținerea de profile genetice.

În paralel s-au efectuat analize genetice și în prezența celorlalte două ftalocianine testate (Cl-αCuPc și βCuPc) pentru comparații.

În analizele genetice efectul inhibitor al unei substanțe se traduce prin obținerea unei amplificări ADN eșuate care presupune: alele exclusesau alele nule, markeri falși homozigoți, adiții non matriță, dezechilibru heterozigot, alele drop out etc.[14].

II.3.1. Identificarea ADN din probe biologice (salivă) tratate cu permanganat de potasiu în prezența ftalocianinelor – βCuPcS4, Cl-αCuPc și βCuPc

Procesarea tuturor probelor biologice s-a efectuat conform procedurilor standard și a instrucțiunilor tehnice de lucru ale laboratorului de analize genetice din cadrul Institutului Național de Criminalistică din România, laborator acreditat RENAR (ISO 17025) din anul 2005.

S-au procesat probe biologice de la persoane cu ADN cunoscut împreună cu ftalocianină (βCuPcS4, Cl-αCuPc sau βCuPc) pentru verificarea efectului inhibitor al acestora în obținerea de profile genetice. S-a urmărit numărul de markeri genetici obținuți din cei 16 utilizați ai kitului AmpFlSTR Identifiler și calitatea acestora (înălțimea medie a picurilor, efectele secundare în cazul amplificărilor eșuate etc.).

De asemenea s-a urmărit dacă adăugarea de KMnO4 peste probele cu colorant în vederea înlăturării acestuia din probe, a condus la obținerea de profile genetice complete.

S-au evaluat rezultatele obținute, respectiv calitatea amplificării markerilor STR, din probele biologice cu ftalocianină oxidată cu permanganat de potasiu comparativ cu probele biologice cu același colorant fără tratare oxidativă cu permanganat.

Pregătirea probelor biologice în vederea izolării ADN-ului

S-au introdus în tuburi Eppendorf sterile de 1,5 mL, etichetate corespunzător, câte 3 μL salivă recoltată de la 3 persoane cu profil genetic cunoscut și 30 μL ftalocianină de concentrație 0.26 g/L.

Izolarea ADN din probele biologice cu colorant

Pentru izolarea AND-ului din probe s-a utilizat metoda convențională de extracție cu chelex[14]. Până nu de mult această metodă de extracție ADN a fost cea mai utilizată în toate laboratoarele de analize genetice din lume deoarece necesită puține transferuri de tuburi (risc minim de contaminare), este economică, îndepărtează mare parte din inhibitori și durează mai puțin[49, ]. De asemenea are un randament mult mai bun față de noile metode de extracție/purificare a ADN-ului însă din punct de vedere al purității extractului obținut aceasta este de un nivel inferior. Totuși metoda este nelipsită și în ziua de azi din laboratoarele de identificare ADN fiind folosită în special când se lucrează cu număr mic de probe sau când este nevoie de rezultate rapide. De aceea ne-am propus să aducem un plus metodei și să îmbunătățim astfel calitatea extractului obținut.

Chelexul este o rășină schimbătoare de ioni cu perechi de ioni iminodiacetat care acționează ca grupări chelatoare pentru ionii metalici polivalenți ca cei de magneziu, cupru, fier și alte metale grele precum și pentru ionii monovalenți ca cei de sodiu și potasiu, în scopul inactivării nucleazelor care degradează ADN-ul. Acționează astfel în mediu bazic la pH 9-11. La pH acid rășina acționează ca schimbător de anioni[].

În tuburile cu probe pregătite ca mai sus s-a introdus soluție de chelex 5% și proteinază K într-un volum total de 425 μL, conform protocolului de lucru descris de Walsh [47]. Proteinaza K este o enzimă cu rol în degradarea proteică nespecifică, ce prezintă activitate optimă la 560C.

Proteinaza K, extrasă din ciuperca Tritirachium album Limber, este cea mai cunoscută endopeptidază serinică cu activitate crescută privind clivarea legăturilor peptidice. Are o masă moleculară cuprinsă între 27000 și 29000, punct izoelectric de 8,9 și pH optim între 7,5 și 10. Se folosește în etapa de extracție pentru îndepărtarea proteinelor celulare de ADN- ul genomic [6].

În jumătate din probe s-a adăugat KMnO4 7,6 mM pentru oxidarea respectiv eliminarea ftalocianinei iar celelalte probe le-am considerat în continuare martor. Mediul bazic pentru degradarea ftalocianinei cu permanganat de potasiu a fost asigurat de soluția chelex care a avut pH 11.

Tuburile cu probe astfel pregătite au fost vortexate și incubate la 56 0C timp de minim 7 ore, până la decolorarea supernatantului din probele cu adaos de permanganat. În tot acest timp probele martor au rămas neschimbate din punct de vedere al culorii (albastru). În tuburile cu probe tratate cu permanganat s-a format la final un precipitat verde închis, ca și în cazul experimentelor preliminare, fără ADN, de la capitolul II.1..

Practic în acest timp are loc liza celulelor care constă în ruperea membranelor celulare și eliberarea conținutului celular, inclusiv a ADN-ului în mediul de reacție. La sfârșitul perioadei de incubare ADN-ul se găsește în supernatant (soluția incoloră pentru probele cu adaos de permanganat de potasiu).

Concomitent cu izolarea ADN-ului are loc și decolorarea ftalocianinelor din probe. Pentru toate cele trei ftalocianine au fost setate aceleași condiții de degradare: 0.018 g/L ftalocianină, 7.6 mM KMnO4 și pH = 11 la 56 oC într-un volum total de 425 μL. Degradarea ftalocianinelor a fost pusă în evidență prin calcularea gradelor de decolorare ale celor trei coloranți. S-au obținut conform rezultatelor din figura nr. 2.52. grade de decolorare de mai mult de 80% în șapte ore de acțiune a permanganatului de potasiu.

Figura .2.52. Gradul de decolorare (D %) a ftalocianinelor după șapte ore de incubare cu rășina Chelex în timpul extracției ADN în prezența permanganatului.[Ftalocianină]0 = 0.018g/L, [KMnO4]0 = 7.6 mM, pH – 11, la 56 oC

După o centrifugare de trei minute la 13000 rpm, pentru depunerea reziduurilor celulare împreună cu precipitatul format în urma degradării colorantului, din fiecare tub s-a scos supernatantul (ce conține ADN-ul eliberat din nucleul celulelor), s-a transferat în alt tub etichetat corespunzător și s-a incubat la 100 0C pentru 8 minute. La această temperatură are loc denaturarea ADN-ului, transformarea lui din dublucatenar în monocatenar, necesară pentru etapele următoare, respectiv cuantificare și amplificare PCR.

La finalul acestei etape extractele ADN erau aproximativ incolore pentru probele cu adaos de permanganat și albastru deschis pentru probele martor, fără permanganat. Menționăm că granulele de chelex au reținut o parte din colorant. În acest moment încă mai pot exista produși cu acțiune inhibitoare asupra reacției de amplificare PCR chiar și în probele cu adaos de permanganat dar acest aspect va fi evidențiat după amplificarea respectiv electroforeza capilară a probelor.

După izolarea ADN-ului din probe este necesară efectuarea cuantificării extractelor ADN obținute pentru a ști ce cantitate de ADN există în fiecare extract și eventual calitatea acestuia respectiv prezența sau absența inhibitorilor funcție de valoarea CT obținută.

3. Cuantificarea probelor

Extractele obținute au fost cuantificate cu kitul Investigator Quantiplex la instrumentul Q Rotor Gene conform instrucțiunilor de lucru ale producătorului (compania Qiagen). Prepararea lor pentru această operație s-a realizat automat cu instrumentul QIASimphony furnizat de aceeași companie. Pentru pregătire s-a preluat din extracte câte 50 μL și s-au introdus în godeuri separate dintr-o placă de eluție QIA.

Rezultatele din canalul verde al instrumentului Q Rotor Gene au furnizat informații despre cantitatea de ADN prezentă în fiecare extract analizat. În funcție de aceste cantități extractele s-au diluat până la obținerea unei cantități de aproximativ 1 ng pentru fiecare probă sau au fost utilizate ca atare (cele cu cantități mai mici) în etapa de amplificare prin metoda PCR. Diluțiile extractelor s-au efectuat cu apă ultrapură din kitul de amplificare utilizat. Cantitățile de ADN din fiecare extract împreună cu diluțiile efectuate unde a fost cazul sunt conform tabelului nr. 2.12.

Tabelul nr. 2.12. – cantitatățile de ADN rezultate din canalul verde al instrumentului Q Rotore Gene, diluțiile efectuate pentru un volum total de 9,5 µL extract (necesar pentru amplificare) și.valorile CT obținute din canalul galben al instrumentului.

ValorileCT din tabelul de mai sus indică faptul că probele cu permanganat nu conțin inhibitori PCR iar dintre celelalte doar cele cu βCuPcS4 și βCuPc par a inhiba reacția PCR.

În continuare a fost efectuată amplificarea extractelor prin metoda PCR.

4. Amplificarea extractelor prin metoda PCR și vizualizarea ampliconilor obținuți prin electroforeză capilară

Amplificarea extractelor este extrem de importantă în obținerea unei cantități suficiente de ADN pentru determinarea de identificări pe bază de profile genetice.

„Polymerase Chain Reaction” este un proces enzimatic care constă în amplificarea unor anumite secvențe de ADN genomic (secvențe țintă), folosind primeri fluorescenți. Produșii PCR pot fi apoi vizualizați și cuantificați funcție de înălțimile sau suprafețele picurilor rezultate, utilizând un soft special[].

Acest proces de fotocopiere moleculară implică încălzirea și răcirea repetată a probelor, conform unei scheme precise care implică de regulă 30 cicluri”[1].

Există până în prezent multe kituri de amplificare ADN uman, cu 9 până la 24 markeri STR, fiecare având paliere diferite de temperaturi per ciclu de amplificare. În prezenta cercetare s-a lucrat cu kitul AmpFISTRIdentifiler care necesită trei paliere de temperatură pentru fiecare ciclu, respectiv 940C, 600C și 720C (figura 2.53), conform manualului de utilizare al producătorului (Apllied Biosystems).

Fig. 2.53.Profilul ciclurilor de temperatură pentru reacția de polimerizare în lanț cu kitul AmpFISTRIdentifiler[1]

”Pe parcursul fiecărui ciclu este generată câte o copie a fiecărei molecule – secvență țintă. Capătul produsului de amplificare este dat de primerii oligonucleotidici complementari cu capătul 3' al secvenței de interes. Teoretic, la o amplificare reușită, după 30 de cicluri se generează cca. 109 copii ale zonei țintă din matrița ADN. Acest produs PCR se numește „amplicon" și se consideră că este în cantitate suficientă pentru a fi analizat prin diverse tehnici”[43]. Practic, dacă extractele supuse amplificării conțin ADN degradat sau inhibitori ai reacției PCR care fie se intercalează în moleculele ADN, fie în ADN polimerază, blocându-i activitatea, se obțin mult mai puține copii sau deloc, rezultând o amplificare eșuată[].

În prezenta cercetare, extractele obținute au fost amplificate în 30 de cicluri de temperatură. La temperatura de 940C, cele două catene ale ADN se separă (are loc „denaturarea"). La 600C, primerii se atașează de matrița ADN, zona țintă fiind aceea care urmează a fi amplificată. La temperatura de 720C ADN polimeraza lungește primerii prin copierea zonei țintă, folosind dezoxinucleotid trifosfații din mediul de reacție. Procesul PCR durează în total 3 ore, fiecare ciclu având 5 minute: câte un minut pentru temperaturile de 940C, 600C și 720C și cca. 2 minute pentru transferul termic între aceste temperaturi. Timpul de denaturare pentru primul ciclu a fost prelungit la 10 minute deoarece s-a folosit polimeraza AmpliTaq Gold, pentru realizarea unui „ start fierbinte" al PCR[].

Componentele PCR

Amestecul de reacție PCR s-a preparat prin amestecarea câtorva componenți și adăugarea de apă ultrapură pentru atingerea concentrației dorite a fiecărui extract ADN conform tabelului nr. 2.12.

Cele mai importante componente ale amestecului de reacție PCR sunt cei doi primeri (primerul „înainte" și primerul „revers"), secvențe scurte de ADN care flanchează zona țintă specifică. Primerul folosește pentru identificare zona din matrița ADN care urmează a fi copiată. Primerul este o oligonucleotidă sintetizată chimic care se adaugă în concentrație mare la matrița ADN pentru a fi inițiată reacția PCR. Este necesară cunoașterea secvenței ADN din zona ce trebuie copiată respectiv markerul STR de interes pentru a se selecta o secvență corespunzătoare pentru primer[43].

Alte componente ale amestecului PCR sunt matrița ADN (extractul), cele patru nucleotide și o polimerază ADN care adaugă nucleotidele la primer într-o ordine corespunzătoare matriței. Unul dintre componenții importanți este ADN polimeraza termic stabilă, care nu își pierde activitatea la temperaturile apropriate de punctul de fierbere, necesare pentru denaturarea ADN. Cel mai mult folosită este polimeraza Taq, care provine de la bacteria Thermus aquaticus, care se dezvoltă în izvoarele termale.

A fost realizată o formă modificată a ADN polimerazei Taq , care necesită activare termică, ceea ce permite ca startul fierbinte să se execute cu tuburile închise. Crearea acestei enzime, denumită AmpliTaq Gold a dus la creșterea specificității amplificării PCR.

ADN polimeraza AmpliTaq Gold este o enzimă modificată chimic astfel încât aceasta este inactivă atât timp cât nu este supusă încălzirii. Pentru activarea AmpliTaq Gold este necesară o preincubare timp de 10-11 minute la 950C (modificarea chimică constă în derivatizarea grupelor e-amino ale resturilor de lizină din molecula enzimei). La pH mai mic de 7 grupările adăugate se desfac și activitatea enzimatică este refăcută. Tamponul Tris folosit în amestecul de reacție are un pH dependent de temperatură, la temperaturi ridicate pH-ul scăzând cu cca. 0,02 unități pH pentru fiecare 10C. Un tampon Tris cu pH de 8,3 la 250C va avea la 950C pH-ul de 6,9. La această temperatură nu numai că matrița ADN este perfect denaturată dar în același timp se activează polimeraza exact în momentul potrivit și nu atunci când poate avea loc ușor formarea de dimeri ai primerilor sau cuplarea nespecifică a primerilor.

Este important de notat faptul că AmpliTaq Gold nu este compatibilă cu pH 9,0 folosit de obicei pentru polimerazele ADN AmpliTaq obișnuite. Aceasta deoarece acest pH nu este suficient de scăzut pentru îndepărtarea moleculelor de derivatizare a TaqGold, și deci enzima rămâne inactivă. Tampoanele Tris cu pH 8,0 – 8,3 la 250C lucrează cel mai bine cu ADN polimeraza TaqGold.

Pentru că s-au amplificat mai multe probe, s-a preparat așa numitul amestec master („master mix") format din amestec de reacție (”reaction mix”) cu cele patru nucleotide și MgCl2 (substanță necesară pentru activarea polimerazei), primeri și polimeraza AmpliTaq Gold și s-a repartizat în cantități egale în tuburile PCR respectiv câte 15,5 µL. Acesta permite realizarea unei uniformități a probelor. Totodată prin prepararea unei cantități mai mari de amestec de reacție se evită pipetarea de volume mici, ceea ce îmbunătățește precizia de măsură a cantității fiecărui component, deci îmbunătățește reproductibilitatea metodei. Toți compușii pentru prepararea acestui amestec se găsesc în kitul de amplificare utilizat, inclusiv apa ultrapură și fără nucleaze.

Peste acest amestec master s-a adăugat câte 9,5 µL din fiecare extract cu un conținut de aproximativ 1 ng ADN, într-un volum total de 25 µL.

Pentru a se monitoriza eficiența reacției de amplificare s-au folosit probe control. Un control „pozitiv" este un indicator valoros pentru a se verifica funcționarea întregului sistem. S-a folosit o matriță cu ADN de calitate bună din kitul de amplificare care a fost amplificată în aceleași condiții cu celelalte probe pentru veificarea calității reacției de amplificare. S-a folosit și o probă control „negativ" – amestec de reacție fără matriță ADN pentru a da indicații privind o eventuală contaminare cu ADN a componenților PCR . S-a utilizat și un blanc de extracție pentru a se verifica dacă reactivii de extracție nu sunt contaminați cu matrițe ADN. Au fost efectuate amplificări în mai multe serii ale probelor de interes și de fiecare dată s-au folosit aceste tipuri de probe control.

Probele au fost procesate în triplicat.

Kitul de amplificare utilizat conține componentele necesare amplificării simultane a 16 markeri STR (figura. 2.54.). Amplificarea simultană a două sau mai multor regiuni ADN este cunăscută sub numele de multiplexare sau PCR multiplex.

Figura 2.54 – Markerii STR incluși în kitul de amplificare multilocus AmpFlstr Identifiler (Applied Biosystems)

„Pentru ca reacția multiplex să decurgă corespunzător, perechile de primeri trebuie să fie compatibile. Cu alte cuvinte temperaturile de cuplare trebuie să fie similare și să fie evitată existența unor regiuni extinse complementare, pentru a se preveni formarea de dimeri, ceea ce ar duce la cuplarea primerilor unul cu celălalt, în locul cuplării cu matrița ADN. Cu fiecare adăugare a unui nou primer la amestecul PCR multiplex crește exponențial probabilitatea interacțiunii primerilor.

Fiecare nouă aplicație PCR necesită stabilirea unor parametri optimi în privința reactivilor și a condițiilor de thermocyclare. Din acest punct de vedere PCR multiplex nu este o excepție. Optimizarea sistemelor multiplex PCR este un obiectiv mai dificil decât în cazul PCR singleplex (cu o singura pereche de primeri), deoarece trebuie să aibă loc foarte multe cuplări simultan fără ca acestea să interfere una cu cealaltă.

Secvențele primerilor, concentrațiile acestora, împreună cu concentrația magneziului, sunt parametri cruciali pentru PCR multiplex. Timpii pentru amplificare din schema de termociclare sunt de cele mai multe ori crescuți la reacțiile multiplex, pentru a se da ADN polimerazei timp pentru copierea tuturor țintelor. Obținerea unei co-amplificări multiplex reușite, cu randamente de produse PCR echilibrate necesită reproiectarea primerilor și experimente dificile pentru ajustarea concentrațiilor primerilor”[6].

Termocyclerul este aparatul care încălzește și răcește probele pentru realizarea PCR. Încălzirea și răcirea precisă sunt esențiale pentru PCR pentru a fi obținute rezultate reproductibile. S-a utilizat un termocycler Gene Amp 9700 de la compania Applied Biosystems care poate încălzi și răci simultan 96 de probe situate pe o placă cu 8×12 godeuri cu o viteză de cca. 10C/sec. În godeurile instrumentului s-au introdus tuburi de 0,2 mL sub formă de șiruri de 8, cunoscute sub denumirea de stripuri în care s-au pregătit amestecurile PCR, închise cu capace.

Vizualizarea ampliconilor

După aproximativ trei ore s-au obținut ampliconii probelor analizate care au fost apoi vizualizați cu ajutorul unui analizor genetic ABI PRISM 3100 de la Applied Biosystems prin electroforeză capilară, conform instrucțiunilor de lucru ale producătorului.

Un mare ajutor în această etapă îl reprezintă primerii marcați fluorescent. În plus, între secvența primer și fluorocromi sunt interpuse secvențe nonnucleotidice numite “linkeri” care accentuează alături de fluorescența emisă diferențierea secvențelor ampliconice apropiate ca număr de perechi de baze, făcând posibilă amplificarea în sistem multiplex[6].

Principiul metodei:

Electroforeza capilară folosește un tub capilar îngust umplut cu soluție de polimer, pentru a se realiza separarea dimensională a ADN-ului. Raportul mare suprafață/volum de la tubul capilar are ca efect disiparea eficientă a căldurii generate în procesul de electroforeză, ceea ce permite folosirea unei tensiuni mari pentru separare. Timpii de separare în electroforeza capilară sunt în domeniul 5-30 minute, deoarece se pot folosi tensiuni mari. Majoritatea metodelor cu ABI folosesc tensiuni de 15000 V, la o lungime a capilarului de 47 cm, adică 319 V/cm[43].

Pregătirea probelor pentru electroforeza capilară:

Amestecuri formate din 1,5 µL din fiecare amplicon împreună cu 10 µL formamidă Hi-Di și 0,15 µL GeneScan 500 LIZ size standard s-au introdus în tuburi de 0,2 mL. În mod similar s-au pregătit și probe cu ladderi Identifiler puși la dispoziție în kiturile de amplificare, necesare pentru interpretarea electroforegramelor. Toate probele au fost supuse denaturării la 950C timp de 10 minute în termocycler și apoi răcirii rapide la -200C în congelator. Aceste operații au fost necesare pentru siguranța existenței ADN din probe în forma monocatenară. Atât reacția de amplificare PCR cât și electroforeza capilară pentru separarea ampliconilor sunt specifice ADN-ului monocatenar. Probele astfel pregătite au fost introduse în analizor.

Instrumentul ABI PRISM 3100 folosește simultan 16 capilare, fiecare pentru câte o probă iar separarea produșilor PCR din acestea se realizează în cca 50 minute. Aparatul utilizează un polimer “POP 4” și soluții tampon speciale furnizate de producător. Probele de ADN sunt încărcate în capilar prin aplicarea unei tensiuni electrice asupra fiecărei probe, adică modul „electrocinetic” de injectare a probelor.

Interpretarea electroforegramelor obținute a fost realizată cu ajutorul software-urilor Genescan și Genotyper, versiunea 3.7 de la Applied Biosystems.

Condițiile minime analitice pentru tiparea alelelor au fost 150 RFU pentru markerii homozigoți și 100 RFU pentru markerii heterozigoți.

Conform electroforegramelor rezultate, din probele de salivă cu βCuPcS4 au fost obținuți doar 5 markeri STR din 16 (figura 2.55), insuficienți pentru identificare pe bază de amprentă genetică. Conform Convenției de la Prum a Consiliului Uniunii Europene, profilele genetice introduse în bazele de date CODIS (Combinated DNA Index System) trebuie să conțină minim 7 loci (marker genetici) împreună cu amelogenina. CODIS aparține FBI si are scopul de stocare și căutare de profile genetice ale suspecților și condamnaților precum și cele neatribuite de la fața locului. Cu cât sunt obținuți mai mulți markeri genetici cu atât identificarea este mai sigură, respectiv atribuirea profilului genetic obținut unei singure persoane[].

Surprinzător, aceleași tipuri de probe, cu aceeași sursă de ADN, în prezența permanganatului de potasiu, au furnizat profile genetice complete pentru kitul de amplificare utilizat. Electroforegramele obținute din probele cu ceilalți doi coloranți ftalocianinici în prezența respectiv absența permanganatului de potasiu sunt prezentate în anexa nr.9.

Calitatea profilelor genetice rezultate este dată de înălțimea medie a picurilor din care sunt constituite. Acestea au fost calculate din totalul înălțimilor picurilor obținute (cu calitate de alelă) măsurate în unități relative de fluorescență (RFU), împărțit la numărul total de alele etichetate (tabelul nr.2.13).

Figura 2.55. Electroforegramele obținute din probele biologice cu βCuPcS4

Tabelul nr.2.13.Calitatea profilelor genetice obținute din probele biologice cu salivă și cei trei coloranți ftalocianinici (βCuPcS4, βCuPc și Cl-αCuPc)

De notat este că nu toate picurile obținute au calitate de alelă iar cele care au formă de alelă trebuie să îndeplinească standardul minim analitic pentru a fi etichetate (100 RFU pentru locii heterozigoți respectiv 150 RFU pentru locii homozigoți). Există mai multe tipuri de artefacte întâlnite în analiza markerilor STR[43]:

Produșii Stutter

Sunt ampliconi cu 4 perechi de baze mai mici sau mai mari decât ampliconul unei alele. (Fig. 2.56). Aceste amplificări nespecifice sunt cauzate de alunecarea – împerecherea greșită a ADN polimerazei, în timpul amplificării PCR. Conform modelului de alunecare – împerechere greșită, în procesul de extensie, într-o regiune a complexului primer – matriță, primer-ul elongat se decuplează de matriță (se distanțează de matriță), ceea ce duce la alunecarea fie a primer-ului, fie a matriței, iar la recuplare matrița formează o buclă pe lungimea unui bloc repetitiv. Consecința acestei bucle, de mărimea unui bloc de secvență repetitivă, este că produsul PCR este mai scurt decât ampliconul primar cu un bloc repetitiv[]. În practică, de multe ori, acești produși Stutter au o înălțime a picului mai mare decât teoretic și pot fi confundați cu alele, mai ales în amestecurile de profile genetice provenite de la mai multe persoane.

Figura 2.56. Alela 15 a locusul D31358 este flancată în stanga de produsul său stutter [43].

b) Adiții non-matriță

Taq Polimeraza folosită în procesul PCR adaugă adesea un nucleotid suplimentar la capătul 3’ al produsului PCR atunci când copiază catena matriță. Această adiție non-matriță este de cele mai multe ori adenozina, de aceea acest proces se numește adenilare, iar produsul – forma plus A a ampliconului. Adiția non-matriță duce la formarea unui produs PCR, care are o pereche de baze mai mult decât secvența țintă. Adiția nucleotidului 3’, A, este favorizată de introducerea unei etape finale de incubare la 60 sau 720C, după parcurgerea etapelor de termociclare PCR[43]. Gradul de adenilare depinde de secvența catenei matriță care în cazul PCR este capătul 5’ a primer-ului revers (Figura2.57).

Figura 2.57 – Alela 15 a locusul D31358 este flancatăîn stânga de un „umăr” rezultat din cauza lipsei unei Adenine. Această lipsă poate face diferența falsa dintre un locus homozigot si unul heterozigot compus dintr-o alelă normală si o microvariantă[43].

Fenomenul de „Pull-up”

În urma excitării laser a fluorocromilor cu care sunt marcați primerii rezultă un fascicul de lumină care este descompus în culorile componente cu ajutorul unor filtre speciale. Această descompunere nu este totală existând un grad de suprapunere între culorile cu lungime de undă apropiată. Dintre cele patru culori folosite cel mai frecvent, albastru și verde au cel mai mare grad de suprapunere (Fig. 2.58).

Aceste suprapuneri fac ca uneori să apară fenomenul de „pull-up” adică întrepătrunderea peak-ului unei alele de pe o culoare pe o alta (Figura 2.59), ceea ce poate duce la atribuirea de alele false (întrucât un pull-up poate corespunde întâmplător unei zone căreia de obicei îi este atribuită o alelă din ladder) în cazul în care nu se compară culorile între ele pentru anumiți loci (în momentul interpretării rezultatelor).

Figura 2.59. Fenomenul de pull-up în dreptul locilor D8S1170, D19S433 și al amelogeninei prin intermediul alelei 16 din locusul D3S1358[43]

Alele dropped out și dezechilibru heterozigot

Aceste fenomene se datorează modificărilor de secvență care pot fi la nivelul a trei regiuni (în raport cu zona de legare a primerului): în zona repetitivă, în zona terminală și în zona de legare a primer-ului (Fig. 2.60). Dacă are loc o schimbare în matrița ADN la zona de legare a primer-ului PCR, hibridizarea primer-ului va fi împiedicată și de aceea, amplificarea nu mai poate avea loc și nu va putea fi detectată alela din matrița ADN. Pe scurt, matrița ADN pentru o anumită alelă există dar nu poate fi amplificată pe parcursul PCR datorită nehibridizării primer-ului. Acest fenomen duce la apariția așa numitelor alele dropped aut sau alele nule[].

Fig. 2.60. Modul de formare al alelelor dezechilibrate (dezechilibru heterozigot) și al alelelor nule sau dropped-aut (marker genetic fals homozigot)[43].

Aceste tipuri de artefacte sunt cu atât mai des întâlnite cu cât cantitatea și calitatea ADN-ului analizat sunt mai reduse.

Concluzii

Analiza electroforegramelor probelor biologice (salivă) cu cei trei coloranți ftalocianinici a confirmat informațiile furnizate de rezultatele procesului de cuantificare din canalul galben al instrumentului Q Rotor Gene (valorile CT):

– probele ADN cu βCuPcS4 și βCuPc au furnizat profile genetice parțiale sau incompatibile cu identificarea ADN chiar și în condițiile în care înălțimea medie a picurilor a fost între 323 – 354 RFU;

– ftalocianina Cl-αCuPc nu exercită un efect inhibitor asupra amplificării ADN – au fost obținute profile genetice complete în acord cu valorile CT < 31;

– toate probele cu permanganat de potasiu au condus la obținerea de profile genetice complete cu o medie mare a înălțimilor picurilor.

Electroforegramele rezultate din genotiparea probelor biologice (salivă) cu ftalocianinele βCuPc și Cl-αCuPc sunt prezentate în anexa nr. 9.

În concluzie, putem afirma că tratarea cu permanganat de potasiu a probelor biologice cu coloranți ftalocianinici, în condițiile de temperatură și pH specifice extracției prin metoda chelex, conduce la îndepărtarea efectului inhibitor al acestui tip de coloranți.

II.3.2. Identificarea ADN din probe biologice (salivă, sânge, celule epiteliale) fixate pe denim

Eficiența sistemului de extracție chelex/permanganat de potasiu a fost testată mai departe pe probe biologice impregnate în denim. Acestea sunt de fapt probele biologice cu care se confruntă laboratoarele de analize genetice judiciare și de medicină legală pentru identificări pe baza amprentelor genetice. În aceste laboratoare, cel mai des sunt analizate probe biologice depuse pe obiecte vestimentare și dintre acestea o pondere foarte mare o au cele din denim ca de exemplu pantalonii tip bluejeans și altele (geci, cămăși etc.).

S-au folosit în acest scop două tipuri de denim: unul de culoare albastru închis (bleumarin) și celălalt de culoare albastru deschis (bleu). Din literatură se cunoaște că denimul albastru închis și cel negru conțin coloranți inhibitori ai reacției PCR[14]. Ambele tipuri de denim testateconțin colorantul ftalocianinic Reactiv Blue 15.

Pregătirea probelor

Au fost tăiate fragmente textile din cele două tipuri de denim de 0,5 cm2 pe care s-au fixat separat cele trei surse de ADN: sânge (5 µL), salivă (5 µL) și celule epiteliale. Celulele epiteliale au fost depuse pe suoprt (denim) prin strângerea în mâini a materialului timp de 20 secunde. Sursele de ADN utilizate au fost recoltate de la 3 persoane cu profile genetice cunoscute.

Au fost procesate în total 80 de probe biologice, divizate în mai multe serii.

II.2.3. Izolarea ADN-ului din probele biologice fixate pe denim

Extracția ADN a fost efectuată prin metoda chelex, utilizându-se pentru liza celulară proteinază K și DTT într-un volum total de 425 µL. Înainte de această operație, probele de sânge au fost supuse câtorva spălări repetate până la eliminarea hemului; se cunoaște din literatură că hemul este la rândul său inhibitor PCR[11].Jumătate din probele de analizat au fost tratate cu permanganat de potasiu iar celelalte au fost considerate probe martor, pentru comparații. Peste probele cu denim albastru închis s-a adăugat o concentrație de 7,6 mM permanganat de potasiu iar peste celelalte, cu denim albastru deschis, având vizibil mai puțin colorant, s-a adăugat 3,8 mM (jumătate).

Timpul de incubare la 560C a variat de la 6 la 24 de ore. Unele probe au necesitat adaos de soluție de permanganat cu prelungirea timpului de incubare la 560C până la decolorarea supernatantului, conform tabelului nr. 2.14.

Tabel nr. 2.14.Variația cantității de permanganat adăugat în probe și a timpului de incubare funcție de tipul de denim și a surselor de ADN utilizate.

Se observă că probele biologice cu sânge fixat pe ambele tipuri de denim au necesitat cantități mai mari de permanganat de potasiu și în consecință timp mai mare de incubare până la decolorarea supernatantului. De asemenea se observă că timpul necesar decolorării crește cu intensitatea culorii denimului utilizat.

După perioada de incubare, colorația probelor martor, fără permanganat de potasiu, a fost diferită, funcție de tipul de denim utilizat: cele fixate pe denim albastru închis au rămas aproximativ la fel de colorate pe toată durata incubării iar cele cu denim albastru deschis s-au decolorat aproape total prin intermediul granulelor de chelex din soluție. Probele tratate cu KMnO4 au format un precipitat verde închis, asemănător cu cel rezultat din probele cu ftalocianine (capitolul II.2.1).

După această etapă tuburile cu probe au fost centrifugate 5 minute la 13000 RPM, iar supernatantele au fost transferate în tuburi noi, notate corespunzător, și supuse denaturarii la 1000C.

Cuantificarea, amplificarea și vizualizarea ampliconilor

Extractele obținute au fost cuantificate prin metoda Real Time PCR cu instrumentul Q Rotor Gene utilizându-se kitul Investigator Quantiplex de la Qiagen. S-a urmărit și de această dată cantitatea de ADN din fiecare extract, rezultată din canalul verde al instrumentului, și valorile CT corespunzătoare furnizate de canalul galben care indică dacă extractul testat conține sau nu inhibitori. Ca și în analizele genetice anterioare, extractele ADN au fost preparate pentru cuantificare cu aparatul QIASimphony, modulul automat AS.

Pentru probele ADN fixate pe denim albastru închis, rezultatele obținute după etapa de cuantificare sunt expuse în tabelul nr.2.15. Se observă că la probele tratate cu permanganat de potasiu valoarea CT este sub 31 iar la cele extrase cu metoda chelex convențională valoarea CT este peste 32, ceea ce semnifică inhibiție PCR.

Tabelul nr. 2.15 Rezultate cuantificare pentru probele biologice fixate pe denim albastru închis:cantitatățile de ADN rezultate din canalul verde al instrumentului Q Rotore Gene, cantitățile de extract și diluțiile corespunzătoare necesare pentru amplificare precum șivalorile CT obținute din canalul galben al instrumentului.

Aproximativ 1 ng din fiecare extract a fost supus amplificării PCR prin utilizarea kitului AmpFISTR Identifiler, la 30 de cicluri de temperatură, într-un termocycler 9700 de la compania Applied Biosystems. S-a utilizat pentru fiecare probă 9,5 µl extract într-un volum total de 25 µl soluție supusă amplificării. Cantitatea de extract respectiv cea de apă ultrapură utilizată pentru diluții (unde a fost cazul) sunt conform tabelului nr. 2.15. Probele au fost efectuate în triplicat.

Ampliconii rezultați au fost separați prin electroforeză capilară utilizând instrumentul ABI PRISM 3100 de la Applied Biosystems. Vizualizarea și interpretarea electroforegramelor obținute s-a realizat cu softurile Genescan și Genotyper ca și pentru probele anterioare.

Rezultatele finale pentru probele biologice impregnate în denimul albastru închis sunt centralizate în tabelul nr. 2.16, iar electroforegramele se pot vizualiza în anexele figurile 2.61, 2.62 și 2.63.

Tabelul nr. 2.16 – Calitatea electroforegramelor obținute prin genotiparea probelor biologice fixate pe denim albastru închis (numărul de loci obținuți și înălțimea medie a picurilor).

Figura 2.61. Electroforegrame pentru probe biologice (salivă) depuse pe denim închis, extrase cu chelex

Figura 2.62. Electroforegrame pentru probe biologice (celule epiteliale) depuse pe denim închis, extrase cu chelex

Figura 2.63. Electroforegrame pentru probe biologice (sânge) depuse pe denim închis, extrase cu chelex

Deși cantitatea de ADN a fost optimă pentru toate tipurile de probe, totuși profile genetice complete s-au obținut doar la cele cu permanganat de potasiu adăugat, confirmându-se astfel și informațiile legate de inhibitori PCR furnizate de valorile CT furnizate de canalul galben al instrumentului Q Rotor Gene expuse în tabelul nr. 2.15.

Conform rezultatelor obținute se observă încă o dată eficiența sistemului chelex/permanganat de potasiu pentru extracția probelor biologice cu coloranți ftalocianinici.

Cuantificarea probele fixate pe denim albastru deschis a furnizat pe canalul verde rezultatele expuse în tabelul nr. 2.17. iar pe canalul galben, valorile CT corespunzătoare, nu au indicat prezența inhibitorilor (valori sub 31, conform aceluiași tabel).

Tabelul nr. 2.17. Rezultate cuantificare pentru probele biologice fixate pe denim albastru deschis: cantitatățile de ADN rezultate din canalul verde al instrumentului Q Rotore Gene, cantitățile de extract și diluțiile corespunzătoare necesare pentru amplificare precum și valorile CT obținute din canalul galben al instrumentului.

Electroforegramele obținute pentru fiecare probă biologică depusă pe denim albastru deschis sunt prezentate în anexele nr 10-12 iar interpretarea datelor este centralizată în tabelul nr. 2.18. Se observă că s-au obținutprofile genetice complete pentru majoritatea probelor iar pentru cele cu celule epiteliale, fiind cantitate mai mică de ADN (vezi tabelul nr. 2.17) s-au obținut profile genetice parțiale.

Tabelul nr. 2.18. Numărul de markeri STR obținuți și calitatea lor pentru probele biologice depuse pe denim albastru deschis

Totuși, la o examinare mai amănunțită a electroforegramelor probelor cu celule epiteliale notate “77” respectiv “78” (anexa nr. 15) se observă că la trei din markerii genetici de pe panelurile ”blue” și“yellow” ale probei “77”, marcați cu roșu, s-a amplificat cîte o singură alelă din două deși înălțimea acestora depășește cu mult 150 RFU (minimul analitic pentru etichetarea unui locus homozigot). Aceștia sunt practic loci falși homozigoți. De altfel se observă că și la majoritatea markerilor cu două alele există un dezechilibru heterozigot între acestea (marcați cu violet). Mai mult, la locusul D3S1358 de pe panelul verde, s-a amplificat un produs stuuter care are înălțime mai mare decât ar trebui teoretic (maxim 17% din alela corespunzătoare – conform instrucțiunilor de lucru corespunzătoare kitului AmpFistrIdentiffiler) și care ar putea fi confundat cu alela 14, marcat în anexă cu negru. Toate aceste artefacte se pot observa în figura 2.64.

Figura 2.64 – Electroforegramele pentru proba biologică (celule epiteliale) notată „77” depusă pe denim albastru deschis. Amplificare eșuată a probei notate „77”: 3 loci fals homozigoți (marcați cu roșu), trei loci cu dezechilibru heterozigot (marcați cu violet) și un produs stutter cu înălțime de alelă (marcat cu negru) – rezultate care nu pot fi luate în considerare pentru identificare ADN.

Pentru efectuarea de comparații prezentăm mai jos electroforegramele probei biologice de referință (figura 2.65).

Figura 2.65. Electroforegramele probei biologice de referință, necesară pentru comparații cu proba „77”.

Având în vedere că aceste rezultate provin de la proba în care nu s-a adăugat permanganat de potasiu putem corela că amplificarea eșuată a avut două cauze: cantitate insuficientă de ADN matriță și prezența inhibitorilor. Dealtfel și înălțimea medie a picurilor este de aproximativ opt ori mai mică decât cea a probei corespunzătoare, tratată cu permanganat de potasiu (proba „78”).

Astfel de efecte secundare ale cantității insuficiente de ADN precum și a prezenței inhibitorilor pot duce la rezultate eronate care pot atrage grave consecințe în genetica judiciară sau medicina legală. De aceea specialiștii și experțiiîn aceste domenii valorifică doar electroforegramele care corespund mai multor criterii de analiză iar probele biologice de referință sunt de o maximă necesitate pentru comparații și certitudinea rezultatelor.

Concluzii

Efectul inhibitor al coloranților textili poate fi înlăturat chiar și prin metoda de extracție convențională Chelex, fără alte etape de purificare, prin oxidarea acestora cu permanganat de potasiu, simultan cu izolarea ADN-ului.

Permanganatul de potasiu nu afectează integritatea moleculelor de ADN.

Reducerea cantității de colorant textil se poate urmări cu ochiul liber prin dispariția în timp a culorii. ADN-ul nu se degradează dacă stă mai mult timp la 560C. În plus, permanganatul de potasiu poate fi adăugat suplimentar, cu prelungirea timpului de incubare, până la dispariția vizibilă a culorii supernatantului care conține moleculele de ADN.

Această combinație de extracție ADN cu purificarea asistată de permanganatul de potasiu, într-o singură etapă, este mai convenabilă din punct de vedere economic și poate mai eficientă pentru probele biologice fixate pe materiale textile decât alte proceduri mult mai scumpe.

CONCLUZII GENERALE

Extracția ADN din diferite probe biologice din analizele criminalistice poate fi o procedură provocatoare de durată, parțial datorită cantităților disponibile scăzute dar cel mai adesea din cauza unor substanțe care inhibă amplificarea ADN pe parcursul reacției PCR. În afara inhibitorilor PCR cunoscuți (hem, melanină, acid humic etc.), mai sunt o parte din coloranții textili care interferă în amplificarea markerilor STR. O amplificare a unui extract ADN cu inhibitori de tipul coloranților textili este la fel de eșuată ca o amplificare a unui extract cu ADN degradat, cu o mulțime de efecte secundare (markeri falși homozigoți, markeri cu dezechilibru heterozigot, produși stutter, alele cu înălțimi sub standardul minim analitic, electroforegrame neinterpretabile etc.). Pentru a obține profile genetice reale și complete, necesare pentru identificări de persoane, este necesară îndepărtarea inhibitorilor din extractele ADN înainte de etapa de amplificare PCR. S-au testat mai mulți coloranți textili, în special cei utilizați în colorarea denimului și s-a ajuns la următoarele concluzii:

Din 14 coloranți textili, testați pentru efectul lor inhibitor asupra reacției PCR, prin metoda Real Time PCR, au fost identificați, funcție de valoarea CT (>31), 3 coloranți cu valoarea CT aprox 33. Dintre cei 3 coloranți, 2 sunt ftalocianinici, insolubili în majoritatea solvenților. S-a reușit în cele din urmă solubilizarea celui mai recalcitrant dintre ei (betaftalocianina de cupru tetrasulfonată) într-un surfactant neionic glicozidic, fiind necesară pentru toate experimentele realizate. Al treilea colorant inhibitor pentru amplificare, fucsina, se oxidează în mediu bazic, mediul de extracție convențională chelex, motiv pentru care nu au mai fost necesare alte studii suplimentare.

Se cunoaște din literatură că ftalocianinele, coloranți sintetici din denim, au o acțiune inhibitoare asupra markerilor genetici tumorali, fiind utilizați în oprirea dezvoltării celulelor canceroase . În această cercetare s-a demonstrat că ele au de asemenea un efect inhibitor și asupra markerilor genetici utilizați în identificare pe bază de ADN, constituind în acest domeniu un impediment în obținerea de profile genetice complete, motiv pentru care s-a căutat o metodă de înlăturare a acestora din probele biologice.

S-au încercat mai multe metode de oxidare ale ftalocianinelor (enzimatică, electrochimică, chimică) în condiții compatibile cu izolarea ADN-ului din probele biologice, iar metoda cea mai bună din punct de vedere al rezultatelor obținute (grad de decolorare mare) a fost oxidarea cu permanganat de potasiu, în mediu bazic, la 560C. Această metodă s-a dovedit a fi și cea mai economică și fără riscuri de contaminare pentru utilizarea ei în laboratoarele de analize genetice.

Un grad mare de decolorare într-un timp relativ bun s-a obținut și prin oxidarea electrolitică utilizând sulfatul de potasiu ca electrolit cu menținerea pH-ului bazic, însă această metodă este mai puțin fezabilă, implicând costuri suplimentare pentru echipamente adaptate cantităților de lucru din astfel de laboratoare (µL, ng).

Cele două metode (chimic cu permanganat de potasiu și electrochimic) au fost testate și pe probe din material de tip denim de culoare albastru închis și s-au obținut rezultate foarte bune.

S-au stabilit parametrii optimi de concentrații reactanți, pH și temperatură pentru oxidarea cu permanganat de potasiu în mediu bazic și s-a încercat aplicarea metodei și pe ceilalți coloranți testați inițial. S-a dovedit că metoda funcționează și pentru aceștia cu un grad de decolorare mai mic sau mai mare, cu posibilități de optimizare a metodei pentru fiecare colorant în parte.

Toți coloranții oxidați prin această metodă au fost din nou testați pentru efectul inhibitor și s-a demonstrat din datele obținute în urma procesului Real Time PCR că probele analizate nu mai conțineau inhibitori demonstrându-se și pe această cale că metoda de oxidare a inhibitorilor PCR din categoria coloranți textili cu permanganat de potasiu este eficientă.

Permanganatul, utilizat pentru oxidarea coloranților, nu este inhibitor PCR, ceea ce reprezintă un mare avantaj. De asemenea nu afectează integritatea moleculelor de ADN.

Colorantul cu cel mai mare efect inhibitor (betaftalocianina de cupru tetrasulfonată) dintre cei studiați a fost testat și pe probe biologice (salivă, sânge și celule epiteliale) și s-a dovedit că dacă nu este înlăturat într-o etapă anterioară amplificării PCR (extracție sau purificare a extractului) exercită efect inhibitor cu obținere de profile genetice parțiale sau electroforegrame nevalorificabile.

Prin aplicarea metodei de oxidare cu permanganat de potasiu în mediu bazic asupra probelor biologice cu conținut de coloranți ftalocianinici, simultan cu extracția ADN prin metoda convențională chelex, se obține înlăturarea coloranților din probe și în final profile genetice complete, prețioase pentru identificări de persoane.

Metoda funcționează la fel de bine și pe probele biologice fixate pe denim cu coloranți ftalocianinici sau indigo, asemenea probelor puse la dispoziție în laboratoarele de identificare pe baza amprentei genetice, obținându-se de asemenea profile genetice complete.

Reducerea cantității de colorant textil prin tratarea cu permanganat de potasiu, se poate urmări cu ochiul liber prin dispariția în timp a culorii, iar permanganatul de potasiu poate fi adăugat suplimentar, cu prelungirea timpului de incubare, până la dispariția vizibilă a culorii supernatantului care conține moleculele de ADN.

Acest sistem de extracție ADN chelex/permanganat, într-o singură etapă, este mai convenabil din punct de vedere economic și poate mai eficient pentru probele biologice fixate pe materiale textile decât alte proceduri, care conțin etape suplimentare de purificare, sunt mai de durată și mult mai scumpe.

Metoda poate fi testată și în alte domenii care necesită îndepărtarea coloranților textili recalcitranți precum epurarea apelor reziduale provenite din vopsitoriile textile.

ANEXE

ANEXA NR. 1

Spectre de absorbție în infraroșu (IR) ale βCuPcS4 – colorant inițial (A) și produs de reacție (B) precipitat după oxidarea cu permanganat în mediu bazic – NaOH, la 560C.

ANEXA NR. 2

Spectrede raze x (XRF) aleβCuPcS4– colorant inițial (C) și produs de reacție (D) precipitat după oxidarea cu permanganat în mediu bazic – NaOH, la 560C.

ANEXA NR. 3

Spectru de absorbție în infraroșu (IR) al βCuPcS4 –produs de reacție (precipitat după oxidarea cu permanganat în soluție chelex 5%, pH 11 la 560C).

Spectru de raze X (XRF) alβCuPcS4 –produs de reacție (precipitat după oxidarea cu permanganat în soluție chelex 5%, pH 11 la 560C).

ANEXA NR. 4

Spectre de absorbție în infraroșu (IR) aleCl-αCuPc – colorant inițial (E) și produs de reacție (F) precipitat după oxidarea cu permanganat în mediu bazic la 560C.

ANEXA NR. 5

Spectre de raze X (XRF) aleCl-αCuPc – colorant inițial (G) și produs de reacție (H) precipitat după oxidarea cu permanganat în mediu bazic la 560C.

ANEXA 6

Spectre de absorbție în infraroșu (IR) ale βCuPc– colorant inițial (I) și produs de reacție (J) precipitat după oxidarea cu permanganat în mediu bazic la 560C.

ANEXA 7

Spectre de raze X (XRF) aleβCuPc– colorant inițial (K) și produs de reacție (L) precipitat după oxidarea cu permanganat în mediu bazic la 560C.

ANEXA NR. 8

Spectru de raze X (XRF) al reziduului apos obținut din evaporarea supernatantului rezultat în urma reacției βCuPcS4 cu KMnO4în mediu bazic, la 560C.

Electroforegrame pentru probe biologice (salivă) amestecate cu βCuPc și Cl-αCuPC extrase cu chelex

ANEXA NR. 10

Electroforegramelepentru probele biologice (salivă) notate „33” și „37”, depuse pe denim albastru deschis

ANEXA NR. 11

Electroforegramele pentru probele biologice (sânge) notate „45” și „49”, depuse pe denim albastru deschis

ANEXA NR. 12

Electroforegramele pentru probele biologice (celule epiteliale) notate „77” și „78”, depuse pe denim albastru deschis. Amplificare eșuată a probei notate „77”: 3 loci fals homozigoți (marcați cu roșu) și trei loci cu dezechilibru heterozigot (marcați cu violet) și un produs stutter cu înălțime de alelă (marcat cu negru) – rezultate care nu pot fi luate în considerare pentru identificare ADN.

BIBLIOGRAFIE