I.O.S.U.D. – Universitatea de Vest Vasile Goldiș din Arad [302598]
I.O.S.U.D. – Universitatea de Vest ”Vasile Goldiș” din Arad
ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE
(pagina 1, nenumerotată)
(Format A4, margini jos și dreapta = 2 cm, margini sus și stânga 2.5 cm
Font Cambria)
Arad, 2016
TEZA DE DOCTORAT
Efectul polifenolilor din plante asupra celulelor canceroase
Doctorand: [anonimizat]: Prof.univ.dr. Daniela Bratosin
PhD THESIS
The effect of plant polyphenols on cancer cells
PhD Student: [anonimizat]: Prof.univ.dr. Daniela Bratosin
(pagina 6, nenumerotată)
Motto sau Dedicație:
………………………………………
(pagina 7, nenumerotată)
Mulțumiri:
………………………………………
(pagina 8, goală, nenumerotată)
CUPRINS
ABREVIERI UTILIZATE ÎN TEZĂ
HPLC high performance liquid chromatography (cromatografie lichidă de înaltă performanță)
DPPH 1,1-diphenyl-picrylhydrazyl (1,1-difenil-dipicrilhidrazil)
CSS cromatografie în strat subțire
GC gas chromatography (cromatografie de gaze)
λ lungimea de undă [nm]
RP-HPLC-[anonimizat](cromatografie de lichide de înaltă performanță cu fază inversă și detecție electrochimică)
LOD limit of detection (limita de detecție)
Rf retention factor (factorul de retenție)
PE Farmacopeea Europeană
ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (acid (2,2-azinobis-(3-etil-benztiazolin-6-sulfonic)))
TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity(capacitatea antioxidantă exprimată în echivalenți Trolox)
FRAP ferric reducing antioxidant power
TPTZ 2,4,6-Tripyridyl-s-Triazine(2,4,6-tris(2-piridil)-1,3,5-triazină)
AE antiradicalic efficiency (eficiența antiradicalică)
EC50 half maximal effective concentration (concentrație la care se produce 50% din efectul maxim)
TEC50 timpul necesar pentru a atinge regimul staționar corespunzător concentrației EC50
A515 absorbanța la 515 nm
CTrolox concentrația soluției de Trolox
R² coefficient of determination (coeficientul de determinare)
VCEAC vitamin C [anonimizat] (acid galic)
GAE gallic acid equivalent (echivalent acid galic)
ROS reactive oxygen species (specii oxigen reactive)
PBS phosphate buffered saline (tampon fosfat salin)
[anonimizat] (sortarea celulelor activate prin fluorescență)
[anonimizat] 2',7'-diclorofluorescein diacetat
H2DCF-DA 2,7-diclorodihydrofluorescein diacetat
DHR 123 dihydrorhodamine 123
DCF 2'7'- diclorofluoresceina
MFI media intensității de fluorescență
RBCs red blood cells (hematii)
HaCat cultured human keratinocyte
MTT bromura de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’smedium (mediu Dulbecco modificat)
FCS fetal calf serum (ser fetal de vițel)
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid (acid etilendiamino tetraacetic)
Bcl-2 B-cell lymphoma 2 (limfom cu celule B)
INTRODUCERE
În ultimele decenii au fost realizate progrese semnificative în înțelegerea bolilor care provoacă mortalitate și morbiditate alarmantă la oameni: [anonimizat]. Cancerul și bolile coronariene sunt cele mai importante dintre acestea. [anonimizat], [anonimizat] a [anonimizat]. Studiile au arătat că multe alimente comune au componente nonnutritive, cunoscute în mod obișnuit ca agenți chemopreventivi, care pot oferi o protecție împotriva unei varietăți de boli, inclusiv a cancerului. O astfel de clasă de agenți este reprezentată de antioxidanții polifenolici.
Obiectivele urmărite în prezenta teză de doctorat sunt enumerate în continuare:
Obținerea și caracterizarea extractelor polifenolice din plante autohtone. În acest sens, au fost alese, din flora autohtonă, plante a caror efect antitumoral nu este pe deplin studiat sau despre care lipsesc date referitoare la activitatea anticanceroasă. Au fost studiate metodele de extracție utilizate până în prezent, pentru obținerea extractelor polifenolice, iar dintre acestea a fost aleasă metoda de extracție care să permită obținerea de extracte bogate în polifenoli și ulterior utilizarea acestor extracte ca suplimente alimentare. În continuare, s-a recurs la studierea metodelor de identificare și cuantificare a compușilor polifenolici utilizate la ora actuală pentru caracterizarea extractelor naturale din plante și la selectarea unei metode simple și rapide care permite caracterizarea și identificarea extractelor polifenolice obținute.
Determinarea capacității antioxidante a extractelor obținute prin utilizarea unor metode chimice de analiză. Astfel, a fost stabilită activitatea antioxidantă a extractelor utilizând metodele DPPH, TEAC(ABTS), FRAP, iar conținutul total de polifenoli al extractelor analizate a fost evaluat utilizând metoda Folin-Ciocâlteu. Au fost de asemenea stabilite relațiile între activitățile antioxidante obținute prin cele trei metode chimice precum și relația dintre conținutul total de compuși fenolici și capacitatea antioxidantă a extractelor stabilită prin cele trei metode: DPPH, ABTS, FRAP.
Determinarea capacității antioxidante a extractelor obținute prin utilizarea citometriei în flux. Extractele care au prezentat o activitate antioxidantă mai mare de 10 mMTrolox/L extract obținută prin metode chimice au fost testate prin citometrie în flux atât ca atare, cât și în diluții seriale, în vederea determinării comportamentului extractelor la diferite concentrații. A fost astfel studiat efectul inhibant al extractelor natural asupra ROS în eritrocitele umane supuse stresului oxidative și demonstrată importanța utilizării extractelor naturale din plantele cercetate în lupta împotriva stresului oxidativ.
Evaluarea acțiunii extractelor obținute asupra proliferării ciclului celular și a efectului citotoxic al acestora. Astfel, a fost determinat efectul antiproliferativ al extractelor vegetale asupra unor linii celulare de melanoma uman A375 și keratinocite HaCat utilizând testul MTT, iar potențialul anticanceros și antimigrator al extractelor vegetale pe linii celulare de melanoma murinic B164A5 și keratinocite HaCat a fost determinat utilizând metoda wound healing assay, demonstrându-se astfel importanța utilizării extractelor naturale din plantele cercetate în lupta anticancer.
STADIUL CUNOAȘTERII IN DOMENIU
CAPITOLUL 1. EFECTUL POLIFENOLILOR ASUPRA SĂNĂTĂȚII OMULUI: PREVENIRE ȘI MECANISME DE ACȚIUNE
1.1. Polifenolii din plante – antioxidanți în domeniul sănătății omului
1.1.1. Noțiuni generale despre polifenoli
Polifenolii sunt compuși naturali care se găsesc în fructe, legume, cereale și băuturi. Fructele în stare proaspătă, cum ar fi strugurii, merele, perele, cireșele și fructele de pădure, conțin până la 200-300 mg polifenoli în 100 de grame produs proaspăt. De asemenea, produsele fabricate din aceste fructe, conțin polifenoli în cantități semnificative. În medie, un pahar de vin roșu sau o ceașcă de ceai sau de cafea conține aproximativ 100 mg de polifenoli. Cerealele, leguminoasele uscate și ciocolata constituie de asemenea un aport de polifenoli [1,2].
Polifenolii sunt metaboliți secundari din plante fiind, în general, implicați în apărarea împotriva radiațiilor ultraviolete sau a agresiunii agenților patogeni [3]. În alimente, polifenolii pot contribui la gustul amar, astringent, la culoarea, aroma, mirosul și stabilitatea oxidativă a acestora. Spre sfârșitul secolului al 20-lea, studii epidemiologice și meta-analize asociate au sugerat că consumul pe termen lung de diete bogate în polifenoli din plante conferă o anumită protecție împotriva dezvoltării mai multor tipuri de cancer, boli cardiovasculare, diabet, osteoporoză și boli neurodegenerative [4,5]. Polifenolii alimentari constituie subiectul a numeroase cercetări științifice, datorită posibilelor efecte benefice asupra sănătății omului, studii care se concentrează pe înțelegerea efectelor biologice ale polifenolilor din alimente și importanța lor în domeniul sănătății umane [1].
1.1.2. Aspecte structurale. Clasificarea polifenolilor
Mai mult de 8000 de compuși polifenolici au fost identificați în diferite specii de plante. Toți compușii fenolici din plante provin de la un intermediar comun, fenilalanina, sau de la un precursor apropiat, acidul shikimic. În general aceștia apar în forme conjugate, cu unul sau mai multe resturi de zaharide legate de grupările hidroxil, putând exista, de asemenea, și legături directe între zahar și un carbon aromatic. Asocieri cu alți compuși, cum ar fi acizii carboxilici și organici, amine, lipide și alți fenoli sunt, de asemenea, posibile [6].
Polifenolii pot fi clasificați în diferite grupe în funcție de numărul de inele fenolice pe care le conțin și pe baza unor elemente structurale care leagă aceste inele între ele. Principalele clase, acizi fenolici, flavonoide, stilbeni și lignani [7], sunt prezentate în figura 1.
Figura 1. Structura chimică de bază a diferitelor clase de polifenoli.
1.1.1.1. Acizi fenolici
Acizii fenolici se găsesc din abundență în alimente și constituie o treime din compușii polifenolici ingerați [2]. Aceștia sunt împărțiți în două clase: derivați ai acidului benzoic și derivați ai acidului cinamic. Conținutul de acid hidroxibenzoic din plantele comestibile este în general scăzut. Doar anumite fructe roșii, ridichea neagră și ceapa, în stare proaspătă, pot avea concentrații de mai multe zeci de miligrame pe kilogram. Acizii hidroxicinamici sunt mai răspândiți și constau în principal dinacid p-cumaric, cafeic, ferulic și sinapic [8].
1.1.2.2. Flavonoidele
Favonoidele sunt cei mai răspândiți polifenoli din alimentație și reprezintă grupul cel mai studiat de polifenoli [2]. Acest grup are o structură de bază comună ce constă din două nuclee aromatice legate între ele prin trei atomi de carbon care formează un heterociclu oxigenat (Figura 1). Au fost identificate mai mult de 4000 de flavonoide, dintre care multe sunt responsabile de culorea florilor, fructelor și frunzelor [9]. În funcție de tipul heterociclului, flavonoidele pot fi împărțite în șase subclase: flavonoli, flavone, flavanoli, flavanone, antociani și izoflavone (Figura 2). Diferențele individuale din cadrul fiecărui grup provin din variația numărului și poziția grupărilor hidroxil și gradul lor de alchilare și/sau de glicozilare.Cele mai comune flavonoide sunt cvercetina, miricetina, catehina, etc. [7].
Figura 2. Structura chimică a subclaselor de flavonoide
1.1.2.3. Stilbeni
Stilbenii conțin două fragmente fenil conectate printr-o punte alcătuită din două grupări metilenice (Figura 1). Prezența stilbenilor în dieta omului este destul de redusă. Majoritatea stilbenilor acționează în plante ca fitoalexine antifungice, compuși care sunt sintetizați numai ca răspuns la infecții sau leziuni. Cel mai studiat polifenol natral cu structură stilbenică este resveratrolul (3,4',5-trihidroxistilben), ce se găsește în cantitate mai mare în struguri. Vinul roșu conține, de asemenea, o cantitate semnificativă de resveratrol [2].
1.1.2.4. Lignani
Lignanii sunt compuși difenolici care conțin o structură de 2,3-dibenzilbutan, formată prin dimerizarea a două resturi de acid cinamic (Figura 1). Unii lignani, precum secoizolariciresinolul, sunt considerați a fi fitoestrogeni. Cea mai bogată sursă alimentară sunt semințele de in, care conțin până la 3,7 g secoizolariciresinol raportat la kg de material uscat, dar și cantități mici de matairesinol[2].
1.1.3. Răspândire. Factori care influențează conținutul de polifenoli din plante
Distribuția compușilor polifenolici în plante la nivel de țesut, celular și subcelular, nu este uniformă. Fenolii insolubili se găsesc în pereții celulelor, în timp ce fenolii solubili sunt prezenți în vacuole [10]. Anumiți polifenoli, cum ar fi cvercetina, se regăsesc în toate produsele vegetale: fructe, legume, cereale, sucuri de fructe, ceai, vin, infuzii etc., în timp ce flavanonele și izoflavonele sunt specifice anumitor produse alimentare. În cele mai multe cazuri, alimentele conțin amestecuri complexe de polifenoli. Straturile exterioare ale plantelor conțin un nivel mai ridicat de polifenoli decât cele situate spre interior [11]. Numeroși factori, precum gradul de coacere la momentul recoltării, factorii de mediu, procesare și depozitare, afectează conținutul de polifenoli din plante. Conținutul de polifenoli din alimente este foarte afectat de factorii de mediu, precum și de factori edafici, cum ar fi tipul de sol, expunerea la soare, ploi, etc. Gradul de maturitate afectează considerabil concentrațiile și proporțiile diferiților polifenoli [12]. Mulți polifenoli, în special acizii fenolici, sunt direct implicați în răspunsul plantelor la diferite tipuri de stres: contribuie la vindecarea zonelor deteriorate, posedă proprietăți antimicrobiene, etc. [13].
Un alt factor care afectează în mod direct conținutul de polifenoli din alimente este depozitarea. Conținutul de polifenoli din alimente se modifică în timpul depozitării, motivul fiind capacitatea acestor polifenoli de a se oxida foarte ușor [12]. În urma reacțiilor de oxidare rezultă substante cu grad diferit de polimerizare, care conduc la modificarea calității alimentelor, în special în ceea ce privește culoarea și caracteristicile organoleptice. Astfel de modificări pot fi benefice, așa cum este cazul ceaiului negru, sau dăunătoare, ca îmbrunirea fructelor. În timpul depozitării făinii de grâu au loc scăderi semnificative ale conținutului de acizi fenolici [14]. În contrast, depozitarea la rece, are un efect nesemnificativ asupra conținutului de polifenoli din mere, pere sau ceapă [15]. Gătitul are, de asemenea, un efect major asupra concentrației de polifenoli. Ceapa și roșiile pierd între 75% și 80% din conținutul inițial de cvercetină după fierbere timp de 15 min, 65% după gătirea într-un cuptor cu microunde, iar 30% după prăjire [16].
1.1.4. Biodisponibilitatea polifenolilor
Termenul de biodisponibilitate se referă la proporția de substanțe nutritive, care sunt digerate, absorbite și metabolizate pe căile normale. Biodisponibilitatea polifenolilor diferă, însă nu există nici o legătură între cantitatea de polifenoli din alimente și biodisponibilitatea lor în corpul uman. În general, agliconii pot fi absorbiți din intestinul subțire, însă cei mai mulți polifenoli sunt prezenți în produsele alimentare, sub formă de esteri, glicozide sau polimeri care nu poate fi absorbiți în formă nativă [17]. Înainte de absorbție, acești compuși trebuie să fie hidrolizați de enzimele intestinale sau de microflora colonului. În cursul absorbției, polifenolii suferă modificări majore. Aceștia sunt conjugați în celulele intestinale și mai târziu în ficat prin metilare, sulfatare și/sau glucuronoconjugare [18]. Prin urmare, formele care ajung în sânge și țesuturi sunt diferite de cele prezente în produsele alimentare și este foarte dificil de a identifica toți metaboliții și de a evalua activitatea lor biologică [19]. Importantă este structura chimică a polifenolilor și nu concentrația acestora care determină viteza și gradul de absorbție și natura metaboliților circulanți în plasmă. Cei mai frecvenți polifenolii din dieta noastra nu sunt neapărat cei care prezintă cea mai mare concentrare de metaboliți activi în țesuturile țintă, în consecință, proprietățile biologice ale polifenolilor diferă foarte mult de la un polifenol la altul. Absorbția lor prin bariera intestinală este demonstrată de creșterea capacității antioxidante a plasmei după consumul de alimente bogate în polifenoli [20,21].
Unii dintre polifenoli sunt bine absorbiți în tractul gastro-intestinal, în timp ce alți sunt bine absorbiți în intestin sau în altă parte a tractului digestiv. În produsele alimentare, toate flavonoidele, cu excepția flavanolilor există în forme glicozilate. Cele mai multe dintre glicozide rezistă, probabil, la hidroliza acidă din stomac și astfel ajung intacte în intestin unde doar agliconii și câteva glucozide pot fi absorbite [22]. Studiile experimentale efectuate pe șobolani au arătat că absorbția la nivel gastric este posibilă pentru anumite flavonoide, cum ar fi cvercetina, dar nu si pentru glicozidele acestora. Mai mult decât atât, s-a demonstrat recent că, la șobolani și șoareci, antocianinele sunt absorbite de stomac [17,23].
S-a sugerat că glucozidele ar putea fi transportate în enterocite și apoi hidrolizate de către o β-glucozidaza citozolică. Cu toate acestea, efectul de glucozilare asupra absorbției este mai puțin clar pentru izoflavone decât pentru cvercetină [12]. Proantocianidinele diferă de ceilalți polifenoli din plante, datorită naturii lor polimerice și greutății moleculare mari. Această caracteristică specială, ar trebui să limiteze absorbția lor prin bariera intestinală și oligomerii superiori trimerilor prezintă o probabilitate mică să fie absorbiți la nivelul intestinului subțire în formele lor native [17,24]. S-a observat că acizii hidroxicinamici, atunci când sunt ingerați în formă liberă, sunt rapid absorbiți de intestinul subțire și sunt conjugate ca și flavonoidele [25]. Acești compuși sunt esterificați în mod natural în produsele vegetale, iar esterificare împiedică absorbția lor, deoarece mucoasa intestinală, ficatul și plasma nu posedă esteraze capabile să hidrolizeze acidului clorogenic pentru a elibera acidul cafeic, iar hidroliza poate fi efectuată numai de către microflora prezentă în colon [26]. Deși cei mai mulți dintre polifenoli se aborb în tractul gastro-intestinal sau în intestin, există unii polifenoli care nu sunt absorbiți în aceste locații. Acești polifenoli ajung în colon, unde microflora hidrolizează glicozidele în agliconi pe care îi metabolizează în diferiți acizi aromatici [27].
Agliconi sunt împărțiti prin deschiderea heterociclului în diferite puncte, în funcție de structura lor chimică, și astfel produc diferiți acizi care sunt metabolizați în continuare la derivați ai acidului benzoic. După absorbție, polifenolii suferă o serie de procese de conjugare: metilare, sulfatare, glucuronoconjugare. Metilarea polifenolior este destul de specifică, apare în general la carbonul C3, dar poate să apară și la carbonul C4', dovadă a acestui fapt, a fost detecția unei cantități notabile de 4'-metilepigalocatehină în plasma, după ingestie de ceai [28]. Sulfo-transferazele catalizează transferul unui fragment de sulfat în timpul procesului de sulfonare. Sulfatarea are loc în principal în ficat, dar încă nu a fost identificată în mod clar poziția grupării sulfat în molecula polifenolilor [29]. Glucuronoconjugarea are loc în intestin și în ficat, iar cea mai mare rată de conjugare se observă la poziția C3 [30]. Mecanismele de conjugare sunt extrem de eficiente și agliconi liberi sunt în general absenți, sau prezenți în concentrații scăzute, în plasmă, după consumul de doze nutritive. Excepție fac catehinele din ceaiul verde, a căror agliconi pot constitui o proporție semnificativă în plasmă [31].
Este important să se identifice metaboliții circulanți, inclusiv natura și pozițiile grupărilor conjugate din structura polifenolilor, pentru că pozițiile pot afecta proprietățile biologice ale conjugaților. Metaboliții polifenolilor circulă în sânge legați de proteine, în special de albumină. Albumina joacă un rol important în biodisponibilitatea polifenoli. Afinitatea polifenolilor pentru albumină variază în funcție de structura lor chimică [32]. Legarea de albumină poate avea consecințe față de gradul de epurare al metaboliților și transportul lor la celule și țesuturi. Este încă neclar dacă polifenolii trebuie să fie în formă liberă pentru a-și exercita activitatea lor biologică, sau chiar și legati de albumina exercită o activitate biologică [17, 33].
Acumularea de polifenoli în țesuturi este cea mai importantă fază a metabolismului polifenolilor, deoarece abia în această fază se poate vorbi despre concentrația biologic activă pentru exercitarea efectelor polifenolilor. Studii au arătat că polifenolii sunt capabili să penetreze țesuturile, în special cele în care sunt metabolizați, de exemplu intestin și ficat. Excreția de polifenoli și derivați ai acestora se realizează la nivel urinar și biliar. S-a observat că metaboliții extensiv conjugați sunt mai susceptibili de a fi eliminați prin bilă, în timp ce conjugații mici, cum ar fi monosulfații, sunt de preferință excretați prin urină. Cantitatea de metaboliți eliminați prin urină poate fi aproximativ corelată cu concentrațiile plasmatice maxime. Procentul excreției urinare este destul de mare pentru flavanonele din citrice și scade de la izoflavone la flavonoli. Astfel, efectele benefice pentru sănătate ale polifenolilor depind atât de cantitatea ingerată cât și de biodisponibilitate [17].
1.1.5. Importanța polifenolilor în prevenția unor afecțiuni
Studiile epidemiologice au arătat în mod repetat o asociere inversă între riscul de boli cronice (cancer, afecțiuni cardiovasculare și neurodegenerative, diabet sau osteoporoză) și o alimentație bogată în polifenoli [1,5,34,35]. Grupările fenolice din polifenoli pot accepta un electron pentru a forma radicali fenoxil relativ stabili, perturbând astfel reacțiile de oxidare în lanț din componentele celulare. Este bine cunoscut faptul că alimentele și băuturile bogate în polifenoli pot crește capacitatea antioxidantă a plasmei. Această creștere a capacității antioxidante a plasmei în urma consumului de alimente bogate în polifenoli poate fi explicată fie prin prezența polifenolilor reducători și a metaboliților acestora în plasmă, prin efectele lor asupra concentrațiilor altor agenți reducători (efecte slabe ale polifenolilor asupra altor antioxidanți endogeni), sau prin efectul lor asupra absorbției unor componente alimentare pro-oxidante, cum ar fi fierul [2,36]. Consumul de antioxidanți a fost asociat cu niveluri reduse de degradare oxidativă a ADN-ului limfocitar [37-39]. În calitate de antioxidanți, polifenolii pot proteja elementele constitutive ale celulelor împotriva degradărilor oxidative și, prin urmare, să limiteze riscul apariției diverselor boli degenerative asociate cu stresul oxidativ[40-42].
1.1.5.1 Efectul antitumoral al polifenolilor
Dezvoltarea cancerului sau carcinogeneza este un proces în mai multe etape distincte și microevolutiv. Cele trei etape majore ale carcinogenezei sunt: inițierea, dezvoltarea și progresia. Inițierea este caracterizată prin apariția unor mutații la nivel celular induse de diverși factori: agenți mutageni de mediu, viruși, radicali liberi endogeni, etc. Celulele astfel inițiate pot suferi transformări spre malignitate dacă urmează dezvoltarea și progresia. Se crede că celulele inițiate pot ramâne în stare latentă perioade îndelungate pâna la acțiunea unor agenți promotori, deoarece multe din aceste celule transformate nu cresc deloc sau cresc foarte lent. Promovarea este afectată de factori care nu modifică secvențele de ADN și se referă la selectarea și expansiunea clonală a celulelor inițiate. Consecințele finale ale etapei de dezvoltare sunt în general leziuni benigne sau focare de celule preneoplazice. Aceste celule trebuie să sufere una sau mai multe modificări ereditare suplimentare în timpul etapei de progresie spre un neoplasm malign. În timpul acestei etape, tumorile își formează propriul sistem de circulație sanguină și dobândește capacitatea de a metastaza [2, 43-45].
Efectul polifenolilor asupra celulelor canceroase este, cel mai adesea, de protecție și induc o reducere a numărului de tumori sau a creșterii acestora. Aceste efecte au fost observate în diverse organe cum ar fi: gură, stomac, duoden, colon, ficat, plămân, glanda mamară sau piele. Au fost testați mulți polifenoli, cum ar fi cvercitina, catechine, izoflavone, lignani, flavanone, acid elagic, polifenoli din vin roșu, resveratrol și curcumina; toate au arătat efecte protectoare în anumite modele, deși mecanismele lor de acțiune s-au dovedit a fi diferite [46-48].
Au fost identificate câteva mecanisme de acțiune în ceea ce privește efectul de chimioprevenție al polifenolilor cum ar fi: activitatea estrogenică / antiestrogenică, antiproliferarea, inducerea întreruperii ciclului celular sau apoptoza, prevenirea oxidării, inducerea enzimelor de detoxifiere, reglarea sistemului imunitar, activitatea antiinflamatorie și modificări în semnalizarea celulară [49].
În primul rând, polifenolii pot acționa ca agenți de blocare în etapa de inițiere. Aceștia influențează metabolismul procarcinogenilor prin modularea expresiei enzimelor citocromului P450 implicate în activarea acestora la agenți carcinogeni. De asemenea, polifenolii pot facilita excreția acestora prin creșterea expresiei enzimelor de faza II (de conjugare). Această inducție a enzimelor de faza II poate fi generată de toxicitatea polifenolilor, aceștia putând forma în organism chinone cu potențial toxic care sunt, ele însele, substraturi ale acestor enzime. Consumul de polifenoli ar putea apoi activa aceste enzime pentru propria lor detoxifiere și, astfel, ar stimula apărarea organismului împotriva xenobioticelor toxice. Polifenolii ar putea chiar să limiteze formarea de celule inițiate prin stimularea reparării ADN-ului [1].
În al doilea rând, polifenolii pot acționa ca agenți de suprimare și astfel să inhibe formarea și creșterea tumorilor din celulele inițiate; aceștia inhibă proliferarea celulară in vitro. S-a demonstrat, de asemenea, ca anumiți polifenoli pot afecta căile de transducție ale semnalelor asociate creșterii prin inhibarea protein kinazei C și a activității transcripționale dependentă de AP-1. Ei inhibă expresia oncogenă precum și activitatea ornitin-decarboxilazei, o enzimă cheie în sinteza de poliamine asociate cu proliferarea celulară. De asemenea, pot stopa proliferarea celulară prin efectul lor asupra metabolismului acidului arahidonic [1].
S-a demonstrat că catechinele din ceaiul verde sub formă de capsule, în cazul administrării la bărbați cu neoplazie intraepitelială de prostată (PIN) de grad înalt, au demonstrat activitate preventivă a cancerului prin inhibarea conversiei leziunilor PIN cu grad ridicat de cancer [50].
S-a dovedit, de asemenea, că polifenolii din ceai negru (teaflavine și tearubigine) au proprietăți puternice anticancer. Polifenolii din ceaiul negru inhibă proliferarea și cresc apoptoza în celulele carcinomului de prostată Du 145. S-a constatat că un nivel mai ridicat al factorului de creștere de tip insulinic 1 (IGF-1) poate fi asociat cu un risc ridicat de dezvoltare a cancerului de prostată. Legarea IGF-1 de receptorul său este o parte căii de transducție a semnalului care provoacă proliferarea celulelor. Adaosul de polifenoli din ceai negru blochează progresia celulelor indusă de IGF-1 în faza S a ciclului celular la o doză de 40 mg/ml în celulele carcinomului de prostată [51].
Cvercetina a demonstrat, de asemenea, proprietăți antitumorale în cazul carcinogenezei pulmonare indusă la șoareci [52], în cazul neuroblastomului [53], cancerului cervical [54] sau cancerului de sân [55].
Resveratrolul previne toate stadiile de dezvoltare a cancerului și s-a dovedit eficient în cele mai multe tipuri de cancer: pulmonar, de piele, de sân, de prostată, gastric [56] și colorectal [57]. S-a demonstrat, de asemenea, că suprimă angiogeneza și metastaza. Cercetări extinse pe culturi de celule umane indică faptul că resveratrolul poate modula multiple căi implicate în creșterea celulară, apoptoză și inflamații. Efectele anticancerigene ale resveratrolului par să fie strâns legate de activitatea lui antioxidantă și s-a dovedit că inhibă ciclooxigenaza, hidroxiperoxidaza, protein-kinaza C, fosforilarea proteinei Bcl-2, Akt, kinaza de adeziune focală, NFkB, metaloproteinaza matriceală 9 și regulatori ai ciclului celular [58]. Acestea și alte studii in vitro și in vivo oferă un argument în sprijinul utilizării polifenolilor în dietă pentru chimioprevenția cancerului într-o abordare combinată fie cu medicamente chimioterapice fie cu factori citotoxici pentru tratarea eficientă a celulelor tumorale refractare la medicamente [2].
1.1.6 Apoptoza și cancerul
Apoptoza este o moarte celulară foarte bine programată, cu căi biochimice și genetice distincte, care joacă un rol critic în ceea ce privește reglarea homeostazia și morfogeneza celulelor mamiferelor [59]. Se presupune că dereglări produse în aceste căi, pot conduce la dezvoltarea unor boli, în particular a cancerului, de unde și mecanismul de acțiune al multor agenți antitumorali, specific țintit să regleze calea apoptotică astfel încât moartea celulară programată să mențina o homeostazie normală. Cu toate că apoptoza a fost descrisă încă din anii ’70, ea rămâne unul din cele mai investigate procese în cercetarea biologică [59].
Un alt concept acceptat este importanța consumului unei varietăți de „alimente colorate” cu puternice proprietăți antioxidante. Deși încă nu se cunoaște beneficiul nutrițional exact al acestor compuși bioactivi, este demonstrat științific rolul acestora în prevenția cancerului [59].
Dezvoltarea cancerului, un proces dinamic și pe termen lung, implică mulți factori complecși cu o progresie etapizată, ce în final conduce la o răspandire necontrolată precum și la o dezvoltare a celulelor canceroase în tot corpul, fenomen denumit metastază. Există trei etape critice în acest proces pentru mai multe tipuri de cancer, inițiere, dezvoltare și progresie. Există studii epidemiologice care au demonstrat că acest proces poate fi afectat de anumite particularități din dietă [59]. A fost de asemenea demonstrată eficacitatea unui număr mare de compuși biologic activi naturali, în prevenția cancerului [60] dar și a altor boli cronice [61,62]. Mai mult, mulți constituenți din alimente, au demonstrat proprietăți antimutagenice și anticarcinogenice [63]. Astfel de evidențe oferă un suport puternic utilizării compușilor bioactivi din alimente ca agenți chemopreventivi. Apoptoza este considerată un mecanism prin care acești compuși și-ar putea exercita proprietățile antitumorale, mai ales că un număr mare de compuși naturali au indus, in vitro, apoptoza în celule maligne [63]. Astfel, apoptoza ar putea fi un mecanism de acțiune important, prin care medicamentele antitumorale sau agenții chemopreventivi își manifestă efectul [64]. Chemoprevenția, o strategie promițătoare de prevenire a cancerului, este definită ca utilizarea substanțelor naturale sau sintetice cu scopul de a bloca, a anula sau a retarda carcinogeneza și poate fi realizată prin inducerea apoptozei de către fitocompuși, rezultând în acțiuni combinate sau sinergice ale amestecului de compuși bioactivi din dietă [59].
CONTRIBUȚIA PERSONALĂ
CAPITOLUL 2. OBȚINEREA ȘI CARACTERIZAREA UNOR EXTRACTE POLIFENOLICE DIN PLANTE AUTOHTONE
2.1. Obiective
În vederea obținerii și caracterizării extractelor polifenolice din plante autohtone au fost stabilite urmatoarele obiective:
alegerea, din flora autohtonă, a unor plante, a caror efect antitumoral nu este pe deplin studiat sau despre care chiar lipsesc date referitoare la activitatea anticanceroasă;
studiul metodelor de extracție utilizate până în prezent, pentru obținerea extractelor polifenolice;
gasirea unei metode de extracție care să permită obținerea de extracte bogate în polifenoli, metodă care permite ulterior utilizarea acestor extracte ca suplimente alimentare;
caracterizarea extractelor polifenolice obținute;
studiul metodelor de identificare și cuantificare a compușilor polifenolici utilizate la ora actuală pentru caracterizarea extractelor naturale din plante;
selectarea unor metode simple și rapide care permit caracterizarea și identificarea extractelor polifenolice.
2.2. Materiale și metode
2.2.1. Material vegetal luat în lucru
Aristolochia clematitis (mărul lupului) – parte aeriană
Arnica montana (arnica) – radacină
Chelidonium majus (rostopasca) – plantă întreagă cu flori
Hypericum perforatum (sunătoarea) – parte aeriană
Lycopodium clavatum (pedicuța) – spori
Melissa officinalis (roinița) – parte aeriană
Salix alba (salcia) – coajă
Salvia officinalis (salvia) – frunze
Thymus vulgaris (cimbrul de câmp) – parte aeriană
Tillia tomentosa (teiul) – flori
Vaccinium myrtillus (afinul) – fructe
Viola tricolor (trei frati patati) – parte aeriană
Viscum album (vâscul) – parte aeriană cu fructe
2.2.2. Reactivi utilizați
etanol SC Coman Prod SRL
metanol Chem Lab, Germania
n-propanol Titolchimica, Italia
butanol International Laboratory, Polonia
toluen International Laboratory, Polonia
n-hexan Lab-scan, Germania
pentan Merck, Germania
acetonitril Merck, Germania
cloroform Lachner, Cehia
acetat de etil Lachner, Cehia
eter etilic Lachner, Cehia
eter de petrol Chemical, Polonia
eter izopropilic Merck, Germania
eter diizopropilic Merck, Germania
acid clorhidric concentrat Barta, Cehia
acid sulfuric Chemical, Polonia
acid acetic International Laboratory, Polonia
acid formic Lachner, Cehia
acid cromotropic Merck, Germania
acid trifluoroacetic Merck, Germania
amoniac concentrat Barta, Cehia
hidroxid de sodiu Chemical, Polonia
hidroxid de potasiu Lachner, Cehia
clorura de sodiu Lachner, Cehia
clorură de aluminiu Fluka, Germania
clorura ferica Merck, Germania
clorura de stibiu Merck, Germania
clorură de mercur (II) Merck, Germania
iodură de potasiu Honywell, USA
sulfat de sodiu Merck, Germania
acetat de sodiu Chemical, Polonia
carbonat de sodiu Lachner, Cehia
nitrat bazic de bismut Merck, Germania
difenilborat de aminoetil Merck, Germania
difenilboriloxietilamina Merck, Germania
sare albastra B Merck, Germania
cloramină T Fluka, Germania
anisaldehida Fluka, Germania
dimetilaminobenzaldehida Merck, Germania
dichlorchinonclorimida Merck, Germania
polietilenglicol 400 Roth, Germania
macrogol 400 Roth, Germania
iod Alfa Aesar, Germania
amidon Merck, Germania
roșu de metil Merck, Germania
magneziu Roth, Germania
plăci SilG F254 Merck, Germania
microfiltru de 0,45 μm Millipore, USA
etaloane
hiperozid Phytolab, Germania
acid cafeic Roth, Germania
rutin Roth, Germania
borneol Roth, Germania
acetat de bornil Roth, Germania
citral Merck, Germania
acid galic Fluka, Germania
cineol Merck, Germania
hipericină Phytolab, Germania
papaverina Roth, Germania
colchicina Fluka, Germania
vanilina Titolchimica, Italia
scopoletin Phytolab, Germania
(+)-carvona Roth, Germania
timol Roth, Germania
acid aristolohic I Phytolab, Germania
galben de metanil Merck, Germania
khelin Roth, Germania
clorhidrat de berberină Fluka, Germania
2.2.3. Aparatura utilizată
Densitometru digital Anton Paar DMA 35, Austria.
Etuvă MEMMERT GWG65, Memmert Germania.
Balanță analitică KERN ABJ 220-4M cu imprimantă, Kern Germania
Lampă UV cu aparat de fotografiat digital REPROSTAR CABINET II, Camag Elveția
2.2.4. Metode utilizate
Extracția alcoolică
Materialul vegetal, proaspăt sau uscat, se mărunțește cu un cutter de laborator și se extrage cu etanol 90% (V/V). Raportul solvent/material vegetal (tabelul I) a fost stabilit în conformitate cu Farmacopeea Europeană (PE), (Preparate homeopatice – Metodele 1.1.2, 1.1.3, 1.1.4) [65]. Extracția se realizează la temperatura camerei (nedepășind 20° C), prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, urmată de presare. Se lasă în repaus 5 zile într-un recipient închis, iar apoi se filtrează [65].
Densitatea relativă
Densitometrul determină direct densitatea în g/mL și indică temperatura lichidului. Se realizează transformarea în densitate relativă și corecția de temperatură.
Reziduul uscat
S-a determinat prin evaporarea în etuva, la 105 – 110°C, timp de 2 ore, a 3,000 g extract [65].
Concentrația alcoolică
25 mL lichid la 20±0,1 °C se introduce în balonul de distilare. Se diluează cu 100 – 150 mL apă purificată și se adaugă câteva bucăți piatră ponce. După atașarea refrigerentului se colectează minim 90 mL distilat într-un balon cotat de 100 mL. Se răcește și se verifică temperatura la 20 ± 0,1 °C și se diluează la 100 mL cu apă purificată. Se determină densitatea relativă la 20±0,1 °C folosind densimetrul digital. Se corelează densitatea relativă cu concentrația alcoolică cu ajutorul tabelelor alcoolmetrice [65].
2.3. Rezultate și discuții
2.3.1. Materialul vegetal
Materiale vegetale (din flora spontană sau cultivate) au fost colectate în 2013, din județul Cluj (Transilvania, România) în perioada de înflorire (mai-august), cu excepția Salix alba (martie-aprilie), Lycopodium clavatum (august) și Viscum album (noiembrie-decembrie) (tabelul 1). Plantele au fost identificate, autentificate, o serie de specimene fiind depozitate în Ierbarul Laboratorului de Control al Calității, Laboratoarele Plantextrakt, Rădaia, România.
Tabelul I. Informații cu privire la plantele selectate
Tabelul I (continuare)
În tabelul II este prezentată descrierea botanică a plantelor autohtone luate în studiu.
Tabelul II. Descrierea botanică a plantelor studiate [66]
Tabelul II (continuare)
Tabelul II (continuare)
Tabelul II (continuare)
Tabelul II (continuare)
Tabelul II (continuare)
Plantele selectate în acest studiu, alături de activitățile lor biologice, compușii activi și utilizările fitomedicinale ale acestora sunt prezentate în tabelul III.
Tabelul III. Utilizarea în medicină a plantelor selectate
Tabelul III (continuare)
Tabelul III (continuare)
Tabelul III (continuare)
2.3.2. Metode de extracție utilizate în obținerea diferitelor extracte de compuși polifenolici
Extracția compușilor fenolici din materialele vegetale depinde de natura lor chimică, de mărimea particulelor probei, de condițiile și timpul de păstrare, precum și de prezența substanțelor cu care pot interfera. Natura chimică a compușilor fenolici din plante variază de la foarte simplă la substanțe cu grad înalt de polimerizare care includ proporții variabile de acizi fenolici, fenilpropanoide, antociani și taninuri. De asemenea, ei se pot prezenta sub formă de complecși cu carbohidrații, proteinele sau alte componente ale plantelor; unii fenoli cu masă moleculară mare și complecșii lor pot fi destul de insolubili. De aceea, extractele fenolice ale materialelor din plante sunt întotdeauna un amestec de diferite clase de compuși fenolici care sunt solubili în sistemul de solvenți folosit. Pot fi necesare etape suplimentare pentru îndepărtarea compușilor fenolici nedoriți și a substanțelor nefenolice de tipul cerurilor, grăsimilor, terpenelor și clorofilelor. Tehnicile de extracție în fază solidă (SPE) și fracționările bazate pe aciditate sunt cel mai des folosite pentru îndepărtarea fenolilor nedoriți și a substanțelor nefenolice [104].
Solubilitatea compușilor fenolici depinde de polaritatea solventului utilizat, de gradul de polimerizare al compușilor fenolici, la fel și de interacțiunea compușilor fenolici cu alți constituenți ai alimentelor și formarea complecșilor insolubili. De aceea, nu există o procedură satisfăcătoare unitară sau completă potrivită pentru extracția tuturor compușilor fenolici sau a unei clase de fenoli din plante. Cel mai des folosiți pentru extracție sunt metanolul, etanolul, acetona, apa, acetat de etil și, în măsură mai mică, propanol, dimetilformamidă sau combinații ale acestora. Pentru extracția polifenolilor din semințele de struguri din care au fost îndepărtate uleiurile, a fost folosit un amestec supercritic de CO2 și alcool, metanolul fiind mai potrivit pentru CO2 decât etanolul. Recent, a fost dezvoltată o extracție secvențială a semințelor de struguri din care au fost îndepărtate uleiurile, prin care au fracționat compușii fenolici în fenoli monomeri și procianidine. S-a mai folosit și CO2 modificat cu metanol pentru extracția catechinelor și epicatechinelor, iar cu metanol pur s-au extras procianidinele din semințe. S-au extras până la 80% din catechinele și epicatechinele prezente în semințe cu CO2 modificat cu 40% metanol [104].
Timpul de extracție poate varia între 1 si 24 de ore. Un timp de extracție mai mare crește riscul oxidării compușilor fenolici dacă nu se introduc în sistem agenți reducători. Timpul optim de extracție pentru compușii fenolici din păstăi uscate este de 50-60 minute. Au fost extrasi acizi fenolici liberi și esterificați din semințe uleioase utilizând un amestec de metanol-acetonă-apă (7: 7: 6, v/ v/ v) la temperatura camerei. Compușii fenolici liberi au fost extrași cu eter etilic din suspensia acidă apoasă a extractului fenolic, iar apoi suspensia în apă a extractului a fost tratată cu NaOH 4M în atmosferă de N2 pentru eliberarea acizilor fenolici esterificați. Hidrolizatul a fost acidifiat și acizii fenolici au fost extrași cu eter etilic. Reziduul rămas după extracția exhaustivă cu un amestec de metanol-acetonă-apă a fost tratat cu NaOH 4M în atmosferă de N2 pentru eliberarea acizilor fenolici insolubili [104].
Hidroliza alcalină poate avea loc cu pierderi importante de derivați ai acidului hidroxicinamic. Recent, s-a arătat că adăugarea acidului ascorbic (1%) și a acidului etilendiaminotetraacetic (EDTA, 10mM) previne degradarea acizilor fenolici în timpul hidrolizei alcaline. Alți solvenți, cum este cazul etanolului, acetonei sau cloroformului au fost de asemenea utilizați în diferite proporții cu apa. Pentru extracția compușilor fenolici din pereții celulelor s-a folosit o hidroliză alcalină secvențială. Materialul din peretele celular a fost izolat inițial din țesuturile plantelor și a fost apoi extras în mai multe etape cu NaOH 0.1M (1h, 25°C), NaOH 0.1M (24h, 25°C), NaOH 1M (24h, 25°C) și NaOH 2M (24h, 25°C). Fiecare extract alcalin a fost acidifiat cu HCl până la pH≤2 și apoi extras de 3 ori cu AcOEt pentru recuperarea fenolilor liberi [104].
Flavonoidele sunt de obicei extrase din plante cu metanol, etanol, apă sau combinațiile acestora, cu mențiunea că în unele cazuri acești solvenți sunt acidifiați. De aceea, extractele sunt deseori tratate cu HCl în atmosferă de N2 pentru a hidroliza glicozidele flavonoidelor în agliconi înainte de analiza HPLC. Au fost extrase flavonoide din plante cu metanol aq 62,5% (v/v). După acidifiere extractului cu HCl 6M (extract: acid= 1: 4, v/v), hidroliza glicozidelor flavonoidelor are loc în atmosferă de N2 la 90°, timp de 2 ore. polifenolii din ceai au fost extrasi prin adăugarea frunzelor de ceai în apă care fierbe timp de 30 de minute. Infuzia a fost filtrată și analizată prin HPLC. Pe de altă parte, au fost obținute extracte de polifenoli din ceai aplicând o extracție multiplă cu 80% (v/v) metanol și apoi cu metanol 80% care conține 0,15% HCl [104].
Randamentul extracției și al activității antioxidante a extractelor din plante depinde de polaritatea solventului, care determină calitativ și cantitativ compușii antioxidanți extrași. Cele mai mari randamente se obțin de obicei cu etanol, metanol și amestecuri ale acestora cu apă. S-au mai folosit și alți solvenți pentru extracție, dar cu randamente mai scăzute (acetat de etil, acetonă). Cel mai frecvent folosiți sunt apa și etanolul datorită toxicității lor scăzute și randamentului de extracție mare, având și avantajul modelării polarității prin folosirea amestecurilor etanol: apă în diverse proporții. Principalul dezavantaj al extracției apoase îl reprezintă randamentul scăzut în antioxidanți cu polaritate scăzută sau antioxidanți liposolubili, cum sunt de exemplu carotenoizii. Solubilitatea polifenolilor depinde în principal de prezența grupelor hidroxil și de mărimea catenei de C [105].
Conform rezultatelor extracției speciilor Rosa rubiginosa și Gevuina avellana, există o legătură între polaritatea solventului și randamentul extracției compușilor polifenolici: AcOEt, care este cel mai nepolar solvent folosit, a avut un randament al extracției scăzut și o activitate moderată de inhibare a DPPH, în timp ce EtOH, care este mai polar, a fost cel mai bun solvent de extracție. Solvenții cu polaritate mai mare, cum sunt MeOH și apa, nu au dus la obținerea celor mai bune extracte deoarece principalul neutralizator de radicali a fost acidul trans-retinoic. Din aceste motive, se folosesc deseori pentru extracții amestecuri etanol-apă și se controlează variabile cum sunt temperatura, timpul de extracție și raportul lichid-solid [105].
Reducerea mărimii particulelor crește viteza de extracție a polifenolilor, precum și randamentul extracției. Acest efect apare de obicei prin mărunțire și prin tratament enzimatic. Tratamentul enzimatic crește de obicei randamentul extracției polifenolilor, dar nu întotdeauna acest efect este urmat de o creștere a activității antioxidante [105].
2.3.3. Obținerea extractelor alcoolice din plantele cercetate
Am ales ca procedeu de obținere a extractelor naturale din cele 13 specii de plante autohtone, macerarea, deoarece este cel mai simplu procedeu de extracție și care permite obținerea unor extracte etanolice, ce ulterior pot fi utilizate ca suplimente alimentare. Macerarea constă în amestecarea fazei solide cu solventul urmată de filtrarea soluției obținute. Acest procedeu necesită o dispersare cât mai accentuată a substanței solide prin adăugare repetată de solvent și agitare continuă. Dacă este cazul, extracția poate continua în aparatură specială (extractoare Soxhlet) în care, de obicei, solventul proaspăt este furnizat prin fierberea extractului, urmând identificarea extractelor prin cromatografie în strat subțire CSS.
În continuare sunt prezentate, pentru fiecare plantă în parte, specificațiile utilizate în obținerea extractelor.
Aristolochia clematitis – Planta aeriană, proaspătă, recoltată în luna august, zona Cluj, se supune operației de mărunțire. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 0,7 părți solvent. Extracția se realizează la temperatura camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Arnica montana- Radacina uscată, recoltată în luna august, zona Marisel, se supune operației de mărunțire. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 10 părți solvent. Extracția se realizează la temperatura camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Chelidonium majus – Planta întreagă cu flori, proaspată, recoltată în luna mai-iunie, zona Cluj, se supune operației de mărunțire. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 1,4 părți solvent. Extracția se realizează la temperatura camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Hypericum perforatum – Planta întreagă înflorită, proaspătă, recoltată în luna iulie, zona Cluj, se supune operației de mărunțire. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 1,4 părți solvent. Extracția se realizează la temperatura camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Lycopodium clavatum – Sporii uscați, recoltați în luna august, zona Cluj, se supun operației de mărunțire prin triturare cu nisip. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 10 părți solvent. Extracția se realizează la temperatură camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Melissa officinalis – Mlădițele cu frunze proaspete, recoltate în luna iulie, zona Cluj, se supun operației de mărunțire. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 1,4 părți solvent. Extracția se realizează la temperatura camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Salix alba – Scoarța proaspătă, recoltată în lunile martie-aprilie, zona Cluj, se supune operației de mărunțire. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 1,4 părți solvent, înainte umectând scoarță cu 0,5 părți solvent. Extracția se realizează la temperatura camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Salvia officinalis – Frunzele proaspete, recoltate în luna iulie, zona Cluj, se supun operației de mărunțire. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 1,4 părți solvent. Extracția se realizează la temperatură camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Thymus vulgaris – Planta aeriană, proaspătă, recoltată în luna iulie, zona Cluj, se supune operației de mărunțire. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 1,4 părți solvent. Extracția se realizează la temperatura camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Tilia tomentosa – Florile proaspete, recoltate în luna iulie, zona Cluj, se supun operației de mărunțire.Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 1,2 părți solvent. Extracția se realizează la temperatură camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Vaccinium myrtillus – Fructele proaspete, recoltate în luna august, zona Cluj, se supun operației de mărunțire. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 1,4 părți solvent. Extracția se realizează la temperatură camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Viola tricolor – Planta aeriană înflorită, proaspătă, recoltată în luna mai, zona Cluj, se supune operației de mărunțire. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 0,7 părți solvent. Extracția se realizează la temperatura camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Viscum album – Mlădițele cu frunze și fructe proaspete, recoltate în lunile noiembrie-decembrie de pe Măr și Păr, zona Cluj, se supun operației de mărunțire. Extracția se face cu alcool etilic 90 % vol. în raport 1 parte plantă proaspătă la 0,7 părți solvent. Extracția se realizează la temperatura camerei, prin macerare cu agitare repetată timp de 10 zile, presare, repaus 5 zile și filtrare.
Extractele au fost caracterizate prin aspect, densitate relativă, reziduu uscat și conținut de etanol. Aspectul a fost determinat prin observare, densitatea relativă a fost determinată utilizând un densitometru digital Anton Paar DMA 35. Reziduul uscat s-a determinat prin tratament termic, în etuvă. Conținutul de etanol a fost determinat prin distilare și prin corelarea densității distilatului cu datele din tabelele alcoolmetrice. Toate aceste caracteristici au fost determinate conform PE [65].
Parametrii de calitate ai extractelor sunt prezentați în talelul IV.
Tabelul IV. Caracteristicile extractelor alcoolice
În continuare sunt prezentate proprietățile organoleptice ale extractelor analizate.
Extractul de Aristolochiaclematitis:
Lichid limpede, brun închis.
Extractul de Arnica montana:
Lichid limpede, galben, cu miros iute, caracteristic.
Extractul de Chelidonium majus:
Lichid limpede, brun, cu miros plăcut și gust amar.
Extractul de Hypericum perforatum:
Lichid limpede, brun-roșcat, cu miros și gust caracteristic.
Extractul de Lycopodium clavatum:
Lichid limpede, galben deschis, fără miros caracteristic.
Extractul de Melissa officinalis:
Lichid limpede, verde la brun-verzui, cu miros și gust caracteristic.
Extractul de Salix alba:
Lichid limpede, brun – roșcat, cu miros plăcut și gust astringent.
Extractul de Salvia officinalis:
Lichid limpede, verde-crud, cu miros aromat și gust amărui.
Extractul de Thymus vulgaris:
Lichid limpede, brun, cu miros și gust aromat.
Extractul de Tilia tomentosa:
Lichid limpede, brun-portocaliu, cu miros și gust caracteristic.
Extractul de Vaccinium myrtillus:
Lichid limpede, brun-roșcat, cu miros slab aromat, cu gust dulceag – de iarbă.
Extractul de Viola tricolor:
Lichid limpede, galben-verzui la galben-brun, cu miros slab caracteristic.
Extractul de Viscum album:
Lichid limpede, brun-gălbui la brun-roșcat, cu miros slab aromat și cu gust slab amar.
În plus, în cazul plantelor pentru care PE prevedea și demonstrarea identității extractului prin reacții de identificare sau dozare, acestea au fost realizate.
Extractul de Aristolochia clematitis:
I. Reacții de identificare
Se amestecă 3 mL produs cu 0,5 mL clorură de fier (III) 10 %. Amestecul se colorează în brun închis cu tentă verzuie.
Corespunde
II. Dozarea acidului aristolohic
Se exprimă în acid aristolohic I.
Proba: 1 g produs se aduce la sec sub vid. Reziduul se reia cu 5 mL acetonitril, pe baie de ultrasunete. Soluția se filtrează prin microfiltru de 0,45 μm, primii 2 mL se aruncă.
Etalonul : se dizolvă 10,0 mg acid aristolohic I se dizolvă în 100 mL acetonitril, pe baie de ultrasunete. 5 mL soluție se diluează la 10 mL cu acetonitril. Soluția se filtrează prin microfiltru de 0,45 μm, primii 2 mL se aruncă.
Coloană: silicagel – C18 (5 μm), cu lungime 0,25 m, cu diametrul interior 4 mm.
Temperatura: 40 °C.
Debit: 0,5 mL/ min.
Faza mobilă:
faza mobilă A: acid trifluoroacetic – acetonitril (0,1 : 99,9 v/v)
faza mobilă B: acid trifluoroacetic – apă (0,1 : 99,9 v/v)
Volum de injectare: 20 µL.
Detector: spectrofotometric la 254 nm.
Sensibilitatea sistemului: timpul de retenție pentru acidul aristolohic I este la aproximativ 20 min.
Timpul de retenție pentru acidul aristolohic I din probă este la aproximativ 20 min., iar acidul aristolohic II la aproximativ 17 min.
Formula de calcul:
C % =A1 x m1 x P/A2 x m1 x 100
unde:
A1 –suma ariilor picurilor acidului aristolohic I și a acidului aristolohic II, din soluția de analizat;
A2 –aria picurilui acidului aristolohic din soluția de referință;
m1 –masa prodului luat în lucru, în grame;
m2 –masa acidului aristolohic I, în grame;
P –procentul conținut de acid aristolohic conținut de acidul aristolohic I RH.
Rezultat: 0,014%
Extractul de Arnica montana:
I. Reacții de identificare
0,5 mL produs se amestecă cu 5 mL apă purificată, soluția devine albăstrui opalescent. Soluției se adaugă 0,1 mL hidroxid de sodiu 10 %. Amestecul se colorează în galben.
Corespunde
3 mL produs se aduce pe baie de apă, aproape la sec. Reziduul se reia cu 0,2 mL acid sulfuric concentrat. Amestecul se colorează după câteva minute în violet.
Corespunde
Extractul de Chelidonium majus:
I. Reacții de identificare
1 mL produs se evaporă pe baia de apă. Reziduul se reia cu 5-6 picături acid clorhidric 10 % și se adaugă câteva picături de iodură mercuropotasică (se dizolvă 1,35 g clorură de mercur (II) în 50 mL apă purificată, se adaugă 5 g iodură de potasiu). Se obține un precipitat brun.
Corespunde
La 1 mL produs se adaugă 1 mL alcool etilic 50 % v. și 3 mL hidroxid de potasiu 30 %. Se formează lent un precipitat floconos.
Corespunde
La 2 mL produs se adaugă 2 mL cloramină T 10 %. Se obține o colorație galbenă.
Corespunde
La 1 mL produs se adaugă 10 mL apă purificată și 1 mL amoniac concentrat. Se extrage cu 10 mL eter etilic. Faza organică prezintă la 365 nm o fluorescență albastră.
Corespunde
II. Dozarea alcaloizilor
Proba: 20,0 g probă se încălzește până se evaporă alcoolul. Se adaugă 10 mL acid sulfuric 10 % și se încălzește pe baie de apă timp de 20 minute. Soluția rămasă se aduce la 20,0 g cu apă purificată și se filtrează. 15,0 g filtrat se introduc într-o pâlnie de separare, se alcalinizează cu o soluție hidroxid de sodiu 42 % și se extrage cu 3 x 20 mL eter etilic. Fazele eterice reunite se usucă pe sulfat de sodiu anhidru și se concentrează la câteva mililitri. Se adaugă 20 mL acid sulfuric 0,01 N. Se elimină eterul etilic prin evaporare, se adaugă 10 mL apă purificată și se titrează excesul de acid sulfuric cu hidroxid de sodiu 0,01 N în prezență de roșu de metil.
La 1 mL acid sulfuric 0,01 N corespunde 3,5336 mg alcalozi exprimați în chelidonină.
Formula de calcul:
% alcaloizi exprimați în chelidonină = 3,5336 x (20 x fa –Vbx fb) / 10 x m
unde:
fa – factorul acidului sulfuric 0,01 N,
fb – factorul hidroxidului de sodiu 0,01 N,
Vb – volumul hidroxidului de sodiu 0,01 N folosit la titrare,
m – masa filtratului, în grame.
Interval de admisibilitate: 0,015 – 0,050 %
Rezultat: 0,030%
Extractul de Lycopodium clavatum:
I. Reacții de identificare
0,5 mL produs se aduce la sec pe baie de apă. La reziduu se adaugă 0,2 mL acid sulfuric concentrat. Soluția se colorează din galben în violet.
Corespunde
La 1 mL produs se adaugă 0,2 mL hidroxid de sodiu 8,5%. Soluția prezintă o fluorescență albastră, care la acidulare dispare.
Corespunde
Extractul de Melissa officinalis:
I. Reacții de identificare
Se amestecă 1 mL produs cu 0,5 mL hidroxid de sodiu 10 %. Se obține o colorație închisă.
Corespunde
Extractul de Salix alba:
I. Reacții de identificare
La 1 mL produs se adaugă 2 mL amestec format din formaldehidă – acid clorhidric concentrat (2:1,v/v). Se formează un precipitat brun – ruginiu.
Corespunde
La 2 mL produs se adaugă câteva picături de soluție alcalină de iodură mercuropotasică (reactiv Nessler). Se formează un precipitat brun închis.
Corespunde
La 1 mL produs se adaugă câteva picături de soluție de clorură ferică 10 %. Se obține o colorație brun – verde închis.
Corespunde
Extractul de Thymus vulgaris:
I. Reacții de identificare
La 1 mL produs se adaugă 50 mL apă purificată și 0,1 mL clorură de fier (III) 9,5 %. Se obține o colorație verde.
Corespunde
La 0,5 mL produs se adaugă 10 mL apă purificată, 0,1 mL carbonat de sodiu 10,5 %, 0,1 mL diclorchinonclorimidă 2 % în alcool etilic 96 % vol. Se observă o colorație albastră.
Corespunde
Extractul de Tilia tomentosa:
I. Reacții de identificare
Se amestecă 1 mL produs cu câteva picături de soluție de clorură ferică 10 %. Se obține o colorație verde închis.
Corespunde
Se amestecă 1 mL produs cu câteva bucăți de magneziu și 1 mL acid clorhidric concentrat. Se obține o colorație roșie.
Corespunde
Extractul de Viola tricolor:
I. Reacții de identificare
0,5 mL produs se amestecă cu 10 mL apă și se agită. Se obține o spumă persistentă minim 30 minute.
Corespunde
2 mL produs se amestecă cu 2 mL dimetilaminobenzaldehidă (0,125 g dimetilaminobenzaldehidă dizolvat sub răcire în 35 mL apă și 65 mL acid sulfuric concentrat, la această soluție se adaugă 0,1 mL clorură ferică 5%). Se obține un inel verde deschis între faze și faza inferioară se colorează în verde.
Corespunde
Toți parametrii de calitate impuși de PE au fost în totalitate respectați, valorile obținute încadrându-se în limitele prevăzute.
2.3.4. Metode cromatografice de caracterizare a extractelor naturale
2.3.4.1. Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC)
În vederea determinării conținutului de antocianine din extracte vegetale și nu numai, au fost implementate multe proceduri analitice relevând modalități variate de conducere a analizelor. În unele cazuri, profilarea conținutului de antocianine este necesară pentru a examina variabilitatea compoziției acestora, iar cuantificarea reprezintă scopul final al determinării. În alte cazuri, se urmărește izolarea și determinarea unor compuși noi cu structură antocianinică. Procedura analitică depinde foarte mult de scopul urmărit în timpul analizei. Spre exemplu, atât în studiile de identificare și cuantificare, cele mai pline de success abordări au fost bazate pe metodele cromatografice. În aceste cazuri este obligatorie utilizarea unei tehnici cu rezoluție înaltă datorită numărului și diversității mari de antocianine. Din acest motiv, și pentru că elimină necesitatea de derivatizare, metoda HPLC joacă un rol deosebit. Când se urmărește identificarea, metodele spectrometrice sunt mai potrivite, dar adesea cuplate cu HPLC sau GC.
Cromatografia lichidă de performanță înaltă se caracterizează prin separarea eficientă a componenților amestecului, și reproductibilitatea înaltă a rezultatelor. Aparatajul HPLC permite trecerea concomitentă a 2 sisteme de eluenți prin coloana cromatografică. Se relatează că, eluția în gradientul concentrațiilor este mai eficientă, decât cea izocratică pentru separarea amestecurilor complexe cum sunt cele obținute din plante[106]. Timpul destul de îndelungat (zeci de minute) al analizei HPLC necesită ca eluanții, sau cel puțin unul dintre ei să aibă un caracter acid. Evident, că în aceste condiții antocianii se separă în forma sărurilor de flaviliu. Identificarea compușilor separați cu ajutorul HPLC, se face în diferite moduri. Metoda cea mai frecvent utilizată constă în aplicarea unei rețele formate din fotodiode. Antocianii se detectează după picul în domeniul vizibil la λ = 520 nm. Pentru identificarea agliconilor se folosește maximumul de absorbție cu extincția de 2 ori mai mare în zona ultravioletă a spectrului electronic, la 260 nm. Însă la aceasta lungime de undă pot fi detectați și fenolii incolori din alte clase, de exemplu, acizii cinamici [107]. Din această cauză maximumul la 520 nm va fi considerat principal anume pentru antociani. Metoda foarte sofisticată, dar și extrem de informativă de cercetare, include detectarea la 370 și 520 nm, separarea automată a fracțiilor, urmată de analiza spectroscopică de masă, realizată de asemenea în mod automat [108]. HPLC oferă unica posibilitate de a separa proantocianidinele oligomerice. În acest caz, în mod natural, timpul de reținere depinde direct de gradul de polimerizare [109]. О altă aplicare extrem de importantă a HPLC este separarea preparativă a componenților în stare pură [110]. Această metodă poate fi utilizată pentru obținerea antocianilor curate din extractul crud, evitând separarea prealabilă a altor substanțe. Trebuie însă de menționat, că metoda HPLC este foarte costisitoare, din care cauză prezintă interes analitic și de cercetare, dar nu poate fi utilizată pentru obținerea substanțelor individuale pe scară industrială.
Prin analiza HPLC-DAD a unor extracte uscate din florile plantei Delonix regia au fost identificate trei antocianine majore, cianidin 3-O-glucozida, cianidin 3-O-rutinozida si pelargonidin 3-O-rutinozida [111].
Cercetătorii japonezi au studiat conținutul în antocianidine și antociani din petalele florilor de L. Senno de o culoare roșu intens. Compoziția relativă a antocianidinelor în petalele florilor de L. Senno rezultată în urma analizei HPLC este: cianidină – 83,4 %, peonidină – 1,7%, pelargonidină – 14,9% [112].
Antocianinele, compuși flavonoidici prezenți in struguri și vinuri, au fost determinați prin cromatografie de lichide de înaltă performanță cu fază inversă și detecție electrochimică (RP-HPLC-ED). Metoda utilizată a constat în eluția cu gradient cu detecție voltametrică folosind un electrod transparent de carbon, dupa ce componentele au fost separate pe o coloană analitică Inertsil ODS-3V. Au fost separați șase antociani diferiți: cianidin-3,5-di-O-glucozida (cianina), cianidin-3-O-glucozida (kuromanina), malvidin-3-O-glucozida (ocnina), malvidin-3,5-di-O-glucozida (malvina), delfinidin-3-O-glucozida (mirtilina), peonidin-3-O-glucozida (peonidina). Toți acești antociani prezintă proprietăți antioxidante, putând fi separați într-o singura analiză, prin injectare directă. Limita de detecție (LOD) pentru acești compuși a fost mai mică de 0,3 mM. Această metodă poate fi folosită la analiza acestor compuși din vinuri roșii precum și din pielea sau pulpa de struguri roșii, atâta vreme cât acești antioxidanți sunt electroactivi [113].
Tomatele (Lycopersicon esculentum) în general, nu sunt menționate ca făcând parte din plantele ce conțin antociani. Culoarea roșie a tomatelor se datorează carotenoidului, licopen. Există totuși, specii de tomate, spre exemplu LA 1996, modificată cu gena Aft (Anthocyanin fruit), ce conțin antociani. Compoziția în antociani a acestei specii a fost realizată utilizând cromatografia de înaltă performanță (HPLC). Culoarea purpurie a LA1996 se datorează antocianidinelor glicozilate petunidină, malvidină și delfinidină, fapt demonstrat prin compararea timpilor de retenție a antocianidinelor cu cei ai standardelor. Dintre acestea, predominante sunt petunidina și malvidina. Cele trei picuri majore a antocianinelor saponificate nu au fost identificate cu siguranță, dar se pare că ar corespunde 3,5-diglicosidelor, cum ar fi petunidin 3-(p-coumaril)rutinozid-5-glucozida [114].
A fost determinată compoziția calitativă și cantitativă a antocianinelor din afine (Vaccinium myrtillus L.) culese din diferite zone, utilizând cromatografia de înaltă performanță. Conținutul de antocianidine a fost determinat după ce a fost, în prealabil, realizată hidroliza acidă a glicozidelor antocianinelor. În toate probele analizate, cianidina a fost compusul majoritar (0.053 mg/mL), delfinidina și petunidina regăsindu-se în cantități de 2,5 ori mai mici. Conținutul de malvidină și peonidină a fost raportat ca fiind cel mai mic. Doar în afinele culese în Suedia, malvidina a fost găsită ca și compus majoritar [115].
Șase pigmenți antocianinici au fost găsiți responsabili de culoarea roșie a sucului de rodii. Acesta a fost analizat prin cromatografie de înaltă performanță, atât din punct de vedere calitativ cât și cantitativ. Antocianinele depistate sunt delfinidin 3-glucozida și 3,5-diglucozida, cianidin 3-glucozida și 3,5-diglucozida, și pelargonidin 3-glucozida și 3,5-diglucozida. În general, s-a constatat o creșterea pigmentării sucului odată cu coacerea fructelor. În fazele de început ale coacerii, delfinidin 3,5-diglucozida era compusul majoritar, fiind urmată de cianidin 3,5-diglucozida. În fazele terminale ale dezvoltării fructului, conținutul în 3-glucozida cianidinei și delfinidinei a crescut considerabil. Derivații de pelargonidină sunt prezenți întotdeauna în cantităti prea mici, câteodată dificil de cuantificat [116].
Fructe înghețate ale diverselor specii de afine, procurate din comerț, precum și sucuri concentrate ale acestora au fost analizate in vederea determinării conținutului în antocianine. Fructele au fost omogenizate în etanol 90% (H2SO4 0,1%) și supuse agitarii peste noapte la temperatura camerei. După centrifugare, supernatantele au fost filtrate și aplicate pe o coloană de absorbent polymeric neionic, urmată de spălare cu apă. Fracțiunile de antocianine au fost apoi colectate cu etanol apos (acid citric 0,05%). Conținutul de antocianine a fost determinat folosind LC/PDA/ESI-MS [117].
Un total de 18 probe diferite de pudră din știuleți de porumb de culoare violet (Zea mays L.), cultivat în condiții diferite, puse la dispoziție de Universidad Nacional Agraria (La Molina, Peru), au fost analizate prin HPLC în vederea determinării profilului antocianic [118]. Într-un alt studiu, s-a încercat limitarea reziduului de porumb violet, care prezintă o solubilitate limitată datorită conținutului mare de macromolecule, modificând condițiile de extracție. Astfel în extractul din știuleți, bogat în antocianine, preparat fie prin extracție în acetonă 70% sau în apă fierbinte. Aceștia au fost identificați anterior ca fiind cianidin-3-glucozida, pelargonidin-3-glucozida, cianidin-3-malonylglucozida, peonidin-3-glucozida, cianidin-3-(6”- maloilglucozida), pelargonidin-3- (6”-maloilglucozida), pelargonidin-3-malonilglucozida, peonidin-3-malonilglucozida, peonidin-3- (6”-maloilglucozida). Profilul de antocianine în cele două extracte este similar, cu excepția picului 8 (peonidin-3-malonilglucozida) care în extractul apos este mai puțin intens [118].
Antocianinele totale din diferite culturi de dude au fost măsurate și calculate ca cianidin 3-glucozidă, fiind cuprinse între 147,68 și 2725,46 mg/L suc. Extracția și purificarea cu rezine macroporoase s-au dovedit a fi metode potențiale eficiente pentru producția industrială de antociani din dude drept coloranți alimentari. Cromatogramele au fost monitorizate la 530 nm și înregistrate, iar concentrațiile relative de pigmenți individuali au fost calculate din aria picurilor [119].
Metodele de extracție fracționată și de precipitare, din păcate, nu permit separarea completă a antocianilor de substanțele-balast și obținerea lor în stare pură. Realizarea acestor obiective a devenit posibilă doar cu ajutorul metodelor cromatografice, care sunt simple, eficiente și diverse după natura adsorbantului și a eluentului utilizat, a tehnicilor de cromatografiere, iar dintre acestea tehnica HPLC este larg utilizată.
2.3.4.2. Cromatografia în strat subțire și pe hârtie
Pigmentarea proprie a antocianilor face extrem de utilizabilă metoda cromatografiei în strat subțire, deoarece cromatogramele în cele mai dese cazuri nu necesită developare suplimentară. Eluenții folosiți au preponderent mediul acid, ceea ce denotă faptul, că antocianii se separă în forma sărurilor de flaviliu. Cromatografia în stratul subțire se folosește până în prezent nu numai pentru identificarea, dar și pentru separarea preparativă a antocianilor. Solvenții cel mai frecvent utilizați pot fi împărțiți în 2 grupe: “butanolici”, considerați apolari (BAW și Bu·HCl) și “apoși”, evident, mai polari. Dependența valorilor Rf de structura antocianilor are unele particularități esențiale. În solvenții din ambele grupe valorile Rf se micșorează cu hidroxilarea inelului B a nucleului fenilbenzopirilic, și se măresc în cazul metoxilării lui. Glucozidarea contribuie la creșterea valorilor Rf în solvenți apoși și micșorarea lor în solvenți butanolici. Această tendință se inversează pentru antocianinele acetilate: Rf crește în solvenți butanolici, și scade în solvenții apoși [120, 121].
2.3.5. Identitatea extractelor alcoolice polifenolice demonstrată prin metoda CSS
1. Extractul de Aristolochia clematitis
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 13 cm.
Distanța de migrare: 100 mm.
Eluentul: toluen – metanol (60:40, v/v).
Proba: 5 mL produs se concentrează sub vid până nu se mai simte mirosul alcoolului etilic. Reziduul se amestecă cu 10 mL apă purificată și 0,1 mL acid clorhidric 25 % și se extrage cu 3×5 mL eter etilic. Faza organică se usucă pe sulfat de sodiu anhidru și se filtrează. Se aduce filtratul la sec sub vid și reziduul se reia cu 0,5 mL metanol. Se aplică 30 µL din probă.
Etaloane: galben de metanil – 1 mg/mL, khelin – 5 mg/mL, soluție în metanol. Se aplică 10 µL din soluția amestecului de etaloane.
Vizualizare:
După uscarea plăcii, cromatograma se vizualizează în fluorescență la 365 nm și în lumină vizibilă.
Descrierea cromatogramei:
a) În fluorescență :
Cromatograma etaloanelor prezintă: în treimea mediană o bandă ocru pentru galben de metanil, între treimea mediană și cea superioară o bandă galbenă pentru khelin.
b) În vizibil :
Cromatograma etaloanelor prezintă: în treimea mediană o bandă galbenă pentru galben de metanil.
Cromatograma probei prezintă: în dreptul galbenului de metanil o bandă galbenă.
2. Extractul de Arnica montana
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 20 cm.
Distanța de migrare:150 mm.
Eluentul: metanol – eter etilic – ciclohexan (10:20:70, v/v).
Proba: produsul. Se aplică 20 µL din probă.
Etaloane: anetol – 1mg/mL, timol – 1mg/mL, soluție în metanol. Se aplică 10 µL din soluția amestecului de etaloane.
Vizualizare:
După uscare placa se pulverizează cu reactiv anisaldehidă, se încălzește la 110-120°C timp de 8-10 minute. Se vizualizează cromatograma în 20 minute în lumină vizibilă.
Descrierea cromatogramei:
Cromatograma etaloanelor prezintă: în treimea mediană o bandă portocalie pentru timol, iar în treimea superioară o bandă violetă pentru anetol.
Cromatograma probei prezintă: la mijolcul distanței dintre start și timol două benzi violete, sub nivelul timolului poate prezenta una sau două benzi violete, deasupra nivelului timolului o bandă violetă, între nivelele etaloanelor o bandă roșu-violet, în jurul anetolului o bandă roșu-violet, deasupra nivelului anetolului două benzi albastru-violet.
3. Extractul de Chelidonium majus
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 13 cm.
Distanța de migrare:100 mm.
Eluentul: butanol – acid acetic – apă purificată (40:10:10; v/v)
Proba: produsul. Se aplică 20 µL din probă.
Etalon: clorhidrat de berberină 1 mg/mL, soluție alcool etilic absolut. Se aplică 10 µL din soluția de etalon.
Vizualizare:
După uscarea plăcii la temperatura camerei, cromatograma prima dată se vizualizează în fluorescență la 365 nm, după care se pulverizează cu iodobismutat de potasiu (reactiv Dragendorff : se amestecă 0,85 g nitrat bazic de bismut cu 40 mL apă purifictă și 10 mL acid acetic glacial, se adaugă 8 g iodură de potasiu dizolvat în 20 mL apă purificată). Se vizualizează în lumină vizibilă.
Descrierea cromatogramei:
– În fluorescență:
Cromatograma etalonului prezintă: în treimea mediană o bandă galben-verzui pentru clorhidratul de berberină.
Cromatograma probei prezintă: în treimea inferioară o bandă albastră și o bandă galben – verzuie, sub clorhidratul de berberină o bandă galben viu, în dreptul clorhidratului de berberină o bandă galben-verzuie, în treimea superioară o bandă albastră, o bandă roșu – brună și o bandă roșie.
– În lumină vizibilă, după pulverizare:
Cromatograma etalonului prezintă: în treimea mediană o bandă portocalie pentru clorhidratul de berberină.
Cromatograma probei prezintă: sub, în dreptul și deasupra clorhidratului de berberină câte o bandă portocalie, poate o bandă portocalie în partea inferioară a treimii superioare.
4. Extractul de Hypericum perforatum
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 13 cm.
Distanța de migrare: 100 mm.
Eluentul: acid formic anhidru – apă purificată – acetat de etil (6:9:90, v/v).
Proba: produsul. Se aplică 20 µL din probă.
Etalon: rutin (1 mg/mL), hipericină ( 0,2 mg/mL), hiperozid (1 mg/mL), soluție în metanol. Se aplică 10 µL din soluția de etalon.
Vizualizare:
După uscare plăcii 10 minute la 100 – 105°C se pulverizează placa încă caldă cu difenilborat de aminoetanol 1 % în metanol și cu soluție polietilenglicol 400 5 % în metanol. Cromatograma se vizualizează în fluorescență la 365 nm după 30 de minute.
5. Extractul de Lycopodium clavatum
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 13 cm.
Distanța de migrare: 100 mm.
Eluentul: acid acetic glacial – eter etilic – eter de petrol (5:35:60, v/v).
Proba: produsul. Se aplică 10 µL din probă.
Etaloane: vanilină – 3 mg/mL, scopoletin 1 mg/mL, (+)-carvonă 3 µL /mL, soluție în metanol. Se aplică 10 µL din soluția amestecului de etaloane.
Vizualizare:
După uscare placa se ține în vapori de iod până când apar benzi brune, după care se pulverizează cu amidon 1 % și apar benzi albastre. Cromatograma se vizualizează în lumină vizibilă.
Descrierea cromatogramei:
Cromatograma etalonului prezintă: în treimea inferioară o bandă pentru scopoletin, în treimea mediană o bandă pentru vanilină, între superioară o bandă pentru (+)-carvonă.
Cromatograma probei prezintă: deasupra scopoletinului o bandă, chiar sub vanilină 1-2 benzi slabe, nu bine separate, între vanilină și (+)-carvonă 1-2 benzi nu bine separate, în dreptul (+)-carvonei o bandă, sub front o bandă.
6. Extractul de Melissa officinalis
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 13 cm.
Distanța de migrare: 100 mm.
Eluentul: hexan – acetat de etil (90:10, v/v), developare dublă.
Proba : 25 mL produs se extrage cu 1 mL hexan, faza hexanică fiind proba. Se aplică 10 mL din probă.
Etaloane: borneol – 1mg/mL, acetat de bornil – 1mg/mL, citral – 1gL/mL, soluție în metanol. Se aplică 10 mL din soluția amestecului de etaloane.
Vizualizare:
După uscare placa se pulverizează cu reactiv anisaldehidă și se încălzește la 105-110°C timp de 5-10 minute. Se vizualizează cromatograma în lumină vizibilă în 10 minute.
Descrierea cromatogramei:
Cromatograma etaloanelor prezintă: în treimea mediană, partea inferioară o bandă brun-verzui pentru borneol, în treimea superioară, partea mediană o bandă albastru închis pentru citral, în treimea superioară o bandă brun-verzui pentru acetat de bornil.
Cromatograma probei prezintă: până la nivelul borneolului două benzi violet închis și o bandă roșu-violet, în dreptul citralului poate fi o bandă albastră, slabă, deasupra nivelului acetatului de bornil o bandă violet închis, intensă.
7. Extractul de Salix alba
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 4 x 13 cm. Două plăci.
Distanța de migrare: 100 mm.
Eluentul: cloroform – acetat de etil – acid formic anhidru – apă purificată (20 : 25 : 5 : 1, v/v).
Proba: produsul. Se aplică 30 L pe placă.
Vizualizare:
După uscarea plăcii la temperatura camerei, cromatograma prima dată se vizualizează în fluorescență la 365 nm, după care se pulverizează cu o soluție de sare albastră B (50 mg sare albastră se dizolvă în 10 mL apă purificată), se încălzește 10 minute la 100-105°C și se vizualizează în lumină vizibilă.
O a doua placă developată în mod identic se pulverizează cu o soluție de clorură de stibiu (30 g clorură de stibiu se spală de 2 ori cu câte 15 mL clorofom. Soluția de spălare se decantează total. Cristalele spălate se dizolvă imediat în 100 mL cloroform liber de etanol sub încălzire slabă. Soluția obținută se păstrează cu 1 g de sulfat de sodiu anhidru) și se încălzește placa 10 minute la 100-105°C. Se vizualizează în fluorescență la 365 nm.
Descrierea cromatogramei:
Prima placă:
a) În fluorescență la 365 nm:
Cromatograma probei prezintă: o bandă brună în treimea mediană (la Rf 0,45) și poate o bandă brună în treimea superioară (la Rf 0,85).
b) În lumină vizibilă, cu sare albastră:
Cromatograma probei prezintă: în treimea inferioară până în partea inferioară a treimii mediane 3-4 benzi roze (Rf între 0,10 – 0,40), o bandă roșie închisă în treimea mediană (la Rf 0,45) și poate să apară de la mijlocul cromatogramei până sub frontul eluentului o succesiune de spoturi roz foarte slabe (Rf între 0,50 – 0,95).
A doua placă:
c) În fluorescență la 365 nm, cu clorură de stibiu:
Cromatograma probei prezintă: în treimea inferioară până în partea inferioară a treimii mediane 2 benzi roze (Rf între 0,05 – 0,40), o bandă brună – violetă în treimea mediană (la Rf 0,45), sub frontul eluentului o bandă roz intensă (la Rf 0,95).
8. Extractul de Salvia officinalis
Placa cromatografică: placã cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 15 cm.
Distanța de migrare: 100 mm.
Eluentul: toluen – eter diizopropilic (80:20, v/v).
Proba: 10 mL produs se extrage cu 3 x 5 mL pentan. Faza organică se filtrează peste sulfat de sodiu anhidru și se aduce la sec. Reziduul se reia cu 1 mL metanol. Se aplică 10 μL pe placă.
Etaloane: borneol (1 mg/mL), cineol (3 µL/mL), acetat de bornil (2 µL/mL), soluție în metanol. Se aplică 10 µL din soluția amestecului de etaloane.
Vizualizare:
După uscare placa se pulverizează cu o soluție de anisaldehidă sulfurică, se încălzește 10 minute la 105-110 °C. După 10 minute se vizualizează cromatograma în lumină vizibilă.
9. Extractul de Thymus vulgaris
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 20 cm.
Distanța de migrare: 150 mm.
Eluentul: toluen – acetat de etil (93:7, v/v).
Proba: la 5 mL produs se adaugă 2 mL soluție saturată de clorură de sodiu, 5 mL hexan și se agită puternic. Faza superioară este proba. Se aplică 20 µL din probă.
Etaloane: borneol (0,5 mg/mL), timol (0,5 mg/mL), soluție în metanol. Se aplică 10 µL din soluția amestecului de etaloane.
Vizualizare:
După uscare, placa se pulverizează cu reactiv anisaldehidă, se încălzește 5-10 minute la 105-110 °C. Cromatograma se vizualizează în 10 minute în lumină vizibilă.
Descrierea cromatogramei:
Cromatograma etaloanelor prezintă: în treimea inferioară o bandă brun-violetă pentru borneol, în treimea mediană o bandă roșie pentru timol.
Cromatograma probei prezintă: deasupra startului 2 benzi violete, deasupra borneolului o bandă albastru-violetă, în dreptul timolului o bandă roșie, care trebuie să fie măcar atât de intens ca și timolul din etalon, între timol și front o bandă gri-albastru intensă.
10. Extractul de Tilia Tomentosa
Prima placă:
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 13 cm.
Proba: produsul. Se aplică 20 mL din probă.
Etaloane: rutin (1 mg/mL) soluție în metanol. Se aplică 10 mL din soluția de etalon.
Distanța de migrare: 100 mm.
Eluentul: acetat de etil – acid formic anhidru – apă purificată (80:10:10, v/v).
Vizualizare:
După uscarea plăcii se vizualizează cromatograma în fluorescență la 365 nm. După aceea placa se pulverizează cu o soluție de difenilboriloxietilamină 1 % în metanol. Se vizualizează cromatograma în fluorescență la 365 nm.
Descrierea cromatogramei:
a) În fluorescență la 365 nm, înainte de pulverizare:
Cromatograma etalonului prezintă: în treimea inferioară (la Rf 0,25) o bandă brunurie pentru rutin.
Cromatograma probei prezintă: o bandă brunurie în dreptul rutinului (la Rf 0,25), între treimea inferioară și cea mediană (la Rf 0,30) o bandă albastră, la mijlocul comatogramei (la Rf 0,50 și 0,65) două benzi brunurii, sub front o bandă albastră (la Rf 0,90), o bandă ocru (la Rf 0,95), și o bandă roșie în front.
b) În fluorescență la 365 nm, după pulverizare:
Cromatograma etalonului prezintă: în treimea inferioară (la Rf 0,25) o bandă portocalie pentru rutin.
Cromatograma probei prezintă: o bandă portocalie în dreptul rutinului (la Rf 0,25), la mijlocul comatogramei (la Rf 0,50 și 0,65) două benzi portocalii, sub front o bandă portocalie (la Rf 0,95).
A doua placă:
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 4 x 13 cm.
Proba: 10 mL produs se extrage cu 3x 10 mL eter de petrol. Fazele organice reunite se usucă pe sulfat de sodiu anhidru și se filtrează. Filtratul se aduce la sec sub vid. Reziduul se reia cu 0,5 mL metanol. Se aplică 20 µL din probă.
Distanța de migrare: 100 mm.
Eluentul: toluen – eter izopropilic (40:10, v/v).
Vizualizare:
După uscare placa se pulverizează cu o soluție de anisaldehidă sulfurică, se încălzește 10 minute la 100-105 °C. și se vizualizează cromatograma în lumină vizibilă.
Descrierea cromatogramei:
c) În lumină vizibilă:
Cromatograma probei prezintă: în treimea inferioară o bandă verde-brună (la Rf 0,15), o bandă violetă (la Rf 0,20), o bandă violaceu (la Rf 0,25), o bandă roz-violaceu (la Rf 0,30), sub front o bandă violetă (la Rf 0,90).
11. Extractul de Vaccinium Myrtillus
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 13 cm.
Distanța de migrare: 100 mm.
Eluentul: acetat de etil – acid formic – apă purificată (80:10:10, v/v);
Proba: produsul. Se aplică 50 µL din probă.
Etaloane: hiperosid – 1 mg/mL; acid galic – 1 mg/mL; soluție în metanol. Se aplică 10 µL din soluția amestecului de etaloane.
Vizualizare: după uscarea plăcii în aer cald, se pulverizează cu soluție metanolică 1 % de difenilborat de aminoetanol, apoi cu o soluție de macrogol 400 (50 mL/L) în metanol, cromatograma se vizualizează în fluorescență la 365 nm, după 30 de minute.
12. Extractul de Viola tricolor
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 20 cm.
Distanța de migrare: 150 mm.
Eluentul: acid formic – apă – acetat de etil (17,5:17,5:65, v/v).
Proba: produsul. Se aplică 20 µL din probă.
Etaloane: acid cafeic – 0,25mg/mL, rutin – 1mg/mL, soluție în metanol. Se aplică 10 µL din soluția amestecului de etaloane.
Vizualizare:
După uscare placa se pulverizează cu difenilborat de aminoetanol 1 % în metanol și PEG 400 5% în metanol. Se vizualizează cromatograma după 30 minute în fluorescență la 365 nm.
Descrierea cromatogramei:
Cromatograma etaloanelor prezintă: în treimea mediană o bandă portocalie pentru rutin, iar în treimea superioară o bandă verde-albăstruie pentru acid cafeic.
Cromatograma probei prezintă: sub nivelul rutinului o bandă galbenă și una galben-verzuie, în dreptul rutinului poate fi o bandă portocalie, deasupra nivelului rutinului o bandă galbenă la galben-verzuie, în dreptul acidului cafeic o bandă albastru-violet, iar deasupra nivelului acidului cafeic o bandă galbenă la galben-verzuie.
13. Extractul de Viscum album
Placa cromatografică: placă cu silicagel cu indicator de fluorescență la 254 nm, cu grosimea de 0,25 mm, dimensiunile plăcii: 7 x 13 cm.
Distanța de migrare: 100 mm.
Eluentul: acetat de etil – apă purificată – acid formic anhidru (80:10:10, v/v).
Proba: 10 mL produs se amestecă 10 mL apă și 1 mL soluție saturată de clorură de sodiu, apoi se extrage cu 2 ori 15 mL acetat de etil. Faza organică se separă și se usucă pe sulfat de sodiu anhidru. Soluția se aduce la sec și se reia reziduul cu 1 mL metanol. Se aplică 20 µL din probă.
Etaloane: hiperozid (1 mg/mL), acid cafeic (1 mg/mL), rutin (1 mg/mL), soluție în metanol. Se aplică 10 µL din soluția amestecului de etaloane.
Vizualizare:
După uscarea plăcii în aer cald, se pulverizează cu difenilborat de aminoetanol 1 % în metanol și cu soluție polietilenglicol 400 5 % în alcool etilic absolut. Cromatograma se vizualizează în fluorescență la 365 nm.
Descrierea cromatogramei:
Cromatograma etaloanelor prezintă: în treimea inferioară o bandă portocalie pentru rutin, în treimea mediană o bandă portocalie pentru hiperozid, în treimea superioară o bandă verde-albastru pentru acid cafeic.
Cromatograma probei prezintă: chiar deasupra rutinului o bandă portocalie și una verde, sub și în dreptul hiperozidului 2 benzi albastre nu bine separate, undeva în dreptul acidului cafeic pot fi alte benzi portocalii și albastre.
2.4. Concluzii
În urma unui studiu de literatură, au fost alese, din flora autohtonă, 13 specii de plante, a căror efect antitumoral nu este pe deplin studiat sau despre care chiar lipsesc date referitoare la activitatea anticanceroasă;
A fost realizat un studiu de literatură al metodelor de extracție utilizate până în prezent, pentru obținerea extractelor polifenolice;
Pentru obținerea extractelor a fost aleasă ca metodă de extracție macerarea care permite obținerea de extracte bogate în polifenoli, metodă care permite ulterior utilizarea acestor extracte ca suplimente alimentare;
Extractele polifenolice obținute au fost caracterizate conform PE, rezultatele obținute fiind în concordanța cu prevederile PE;
A fost realizat un studiu al metodelor cromatografice de identificare și cuantificare a compușilor polifenolici utilizate la ora actuală pentru caracterizarea extractelor naturale din plante;
Pe baza studiului de literatură și a prevederilor PE, a fost selectată ca metodă de identificare a extractelor, cromatografia în strat subțire, o metoda simplă și rapidă care permite caracterizarea și identificarea extractelor polifenolice.
CAPITOLUL 3. EVALUAREA CAPACITĂȚII ANTIOXIDANTE A EXTRACTELOR POLIFENOLICE PRIN METODE CHIMICE ȘI DETERMINAREA CONȚINUTULUI TOTAL DE POLIFENOLI
3.1. Obiective
În vederea determinării capacității antioxidante a extractelor obținute, în primă fază, a fost propusă determinarea activității antioxidante prin utilizarea unor metode chimice de analiză.
Astfel, au fost stabilite o serie de obiective principale:
Determinarea activității antioxidante utilizând metoda DPPH;
Determinarea activității antioxidante utilizând metoda TEAC (ABTS);
Determinarea activității antioxidante utilizând metoda FRAP;
Evaluarea conținutului total de polifenoli al extractelor analizate utilizând metoda Folin-Ciocâlteu;
Stabilirea relațiilor între activitățile antioxidante obținute prin cele trei metode chimice;
Stabilirea relației dintre conținutul total de compuși fenolici și capacitatea antioxidanta a extractelor stabilită prin cele trei metode: DPPH, ABTS, FRAP.
3.2. Materiale și metode
3.2.1. Reactivi utilizați
etanol Sigma-Aldrich, Germania
metanol Sigma-Aldrich, Germania
carbonat de sodiu Sigma-Aldrich, Germania
acetat de sodiu Sigma-Aldrich, Germania
persulfat de potasiu Sigma-Aldrich, Germania
reactiv Folin-Ciocâlteu Sigma-Aldrich, Germania
1,1-difenil-dipicrilhidrazil Sigma-Aldrich, Germania
acid galic Sigma-Aldrich, Germania
acid 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilic Sigma-Aldrich, Germania
clorură de fier (III) Sigma, Germania
2,4,6-tris(2-piridil)-1,3,5-triazină Sigma, Germania
acid 2,2’-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonic) Sigma, Germania
acid clorhidric Merck, Germania.
3.2.2. Aparatura utilizată
spectofotometru Jasco V 530 UV – Vis
3.2.3. Metode utilizate
Metoda DPPH
Proba (extractul) se diluează corespunzător cu metanol. 0,1 mL de soluție metanolică se adaugă la 2,9 mL soluție ~9·10-5 mol/L DPPH în metanol. Inhibiția radicalului DPPH se urmăreste prin monitorizarea scăderii absorbanței la 515 nm timp de 2 ore cu ajutorul unui spectrofotometru.
Metoda TEAC (ABTS)
Pentru a prepara 50 mL reactiv ABTS se procedează astfel: 1. se dizolvă 0,18 g acid (2,2-azinobis-(3-etil-benztiazolin-6-sulfonic)) în 10 mL soluție tampon de acetat de sodiu în apă cu concentrația de 20 mmol/L (pH=4,5); 2. se dizolva 0,033 g persulfat de potasiu în 10 mL soluție tampon de acetat de sodiu; 3. cele două soluții se amestecă și se aduc la 50 mL cu soluție tampon de acetat de sodiu; 4. soluția astfel obținută se incubează 12-16 h, la temperatura camerei și la întuneric; 5. soluția se dilueaza corespunzator până la o absorbanță de 1.0±0.02 la 734 nm.
Se amestecă 0,1 mL extract (diluat corespunzator cu metanol) și 2,9 mL reactiv ABTS. Amestecul se spectrofotometrează la 734 nm timp de 2 h, fața de apa bidistilată.
Metoda FRAP
Pentru a prepara 30 mL reactiv FRAP se procedează astfel: 1. se prepară soluție tampon de acetat de sodiu în apă de pH 3,6; 2. se dizolvă 0.3257 g FeCl3 în apă bidistilată și se aduce la 100 mL; 3. 0,3124 g TPTZ se dizolvă sub încălzire la 50°C în soluție HCl 40 mmol/L; 4. Se amestecă 25 mL soluție tampon de acetat de sodiu cu 2,5 mL soluție TPTZ și 2,5 mL soluție FeCl3. Soluția rezultată se diluează cu 2 volume de apă bidistilată și se incubează la 37°C timp de 30 minute.
Se amestecă 0,1 mL extract (diluat corespunzător cu metanol) și 2,9 mL reactiv FRAP. Amestecul se păstrează la temperatura camerei și la întuneric timp de 2 h apoi se citește absorbanța la 593 nm fața de apă bidistilată.
Metoda Folin-Ciocâlteu
Se amestecă 200 μL extract (diluat in prealabil 1:10 cu apă bidistilată) cu 15 mL apă bidistilată și 1 mL reactiv Folin-Ciocâlteu. Amestecul se incubează 5 minute la temperatura camerei, după care se adaugă 3 mL soluție de carbonat de sodiu în apa 20% și se aduce la 20 mL cu apă bidistilată. După incubare timp de 2 ore la temperatura camerei, se citește absorbanța la 765 nm față de martor (reactiv Folin-Ciocâlteu preparat cu apa bidistilată).
3.3. Rezultate și discuții
3.3.1. Metode de evaluare a activității antioxidante
În ultimii ani au fost dezvoltate o serie de metode analitice pentru determinarea activității antioxidante a produselor naturale. Aceste metodologii se referă la teste care vizează măsurarea capacității unei substanțe de a inhiba specii radicalice [122], metodologii care se bazează, în general, pe reacția dintre o specie antioxidantă și un compus cromogen.
3.3.1.1. Metoda DPPH
Principiile de bază ale acestei metode au fost introduse de către Blois (1958) și Brand-Wiliams et al. (1995) [123, 124] a adus îmbunătățiri față de metoda inițială. În cadrul acestei metode, are loc reducerea radicalului cromogen 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), de culoare violet, de către un compus antioxidant/reducător (substanță care poate dona un atom de hidrogen) obținându-se hidrazina corespunzătoare de culoare galben pal. Capacitatea antioxidantă este evaluată prin monitorizarea descreșterii absorbanței la 515-528 nm timp de 30 minute sau până la rămânerea constantă a acesteia [124] sau prin rezonanța electronică de spin [125, 126]. Milardović et al. (2006) [127] a propus o altă variantă pentru determinarea activității antioxidante bazată pe reducerea amperometrică a radicalului DPPH utilizând un electrod de carbon vitros.
Activitatea antiradicalică a fost definită ca fiind cantitatea de antioxidant necesară pentru a reduce concentrația inițială a DPPH cu 50% iar rezultatele sunt exprimate ca EC50 (Concentrație Eficientă) în (mol/L) antioxidant/(mol/L) DPPH [124]. Sánchez-Moreno et al. (1998) [128] propune un nou parametru pentru caracterizarea compușilor antioxidanți ”Eficiența antiradicalică (AE)” pentru calculul căreia ia în considerare efectul a doi parametrii EC50 și TEC50: AE = 1/EC50•TEC50. TEC50 reprezintă timpul necesar pentru a atinge regimul staționar corespunzător concentrației EC50 și se calculează din curba cinetică.
Metoda DPPH reprezintă o tehnică simplă dar care prezintă unele dezavantaje care limitează aplicabilitatea acesteia. Principala limitare în determinarea lui EC50 este aceea că procentul de radical consumat este dependent de concentrația inițială a radicalului DPPH. Din acest motiv, pentru evaluarea capacității antioxidante este mai precisă utilizarea variației în absorbanță decât procentul de radical consumat [129]. Un alt inconvenient poate fi reprezentat de durata reacției care poate fi prea mare [124].
Accesibilitatea sterică a radicalului DPPH este determinantă pentru reacție, și deci moleculele mici prezinta accesibilitate mai mare si deci o capacitate antioxidantă mai mare. Nu puțini sunt compușii antioxidanți cu greutate moleculară mare, reacționează lent sau pot fi chiar inerți în aceată metodă, deoarece reacționează rapid cu radicalii peroxil [126]. Compușii care absorb la lungimea de undă specifică metodei sau turbiditatea probei pot afectata determinările spectrofotometrice [126], alternativa în acest caz putând consta în detecția electrochimică propusă de Milardović et al. (2006) [127].
În pofida dezavantajelor acestei metode, DPPH este unul din cei mai stabili radicali organici care nu necesită o generare anterioară ca și în cazul radicalului ABTS+, iar faptul că este o metodă facilă, putând fi utilizată pentru măsurarea capacității antioxidante a compușilor puri dar și pentru probe complexe, recomandă folosirea acesteia în practică.
3.3.1.1.1. Determinarea activității antioxidante a extractelor obținute prin metoda DPPH
Protocolul de lucru utilizat pentru evaluarea capacității antioxidante a extractelor a fost conform metodei descrise de Brand-Wiliams et al. (1995) [124] cu mici modificări. Această metodă se bazează pe măsurarea spectrofotometrică a pierderii de culoare a radicalului DPPH cauzată de consumarea acestuia de către speciile antioxidante prezente în proba de testat.
Radicalul DPPH este caracterizat ca fiind un radical liber stabil datorită delocalizării electronului liber peste întreaga moleculă. Această delocalizare determină apariția culorii violet puternice, caracterizată de un maxim de absorbție în jurul valorii de 520 nm [130]. Radicalul liber DPPH de culoare violet este redus în reacție cu specii donoare de hidrogen la hidrazina corespunzătoare de culoare galben pal (figura 3). Această metodă a fost testată pentru măsurarea activității antioxidante a sucurilor și extractelor de fructe și legume [131], dar prezintă aplicabilitate foarte bună în cazul particular studiat, evaluarea activității antioxidante a extractelor de plante medicinale.
2,2-difenil-1-picrilhidrazil (radical liber) 2,2-difenil-1-picrilhidrazină (nonradical)
(violet) (galben)
Figura 3. Reacția radicalului DPPH cu un antioxidant
Pentru realizarea măsurătorilor spectrofotometrice s-a utilizat un spectrofotometru UV-Vis Jasco V 530 prevăzut cu cuve de cuarț cu drum optic de 1 cm cu dimensiunile 1 cm x 1 cm x 4,5 cm.
Trolox a fost utilizat drept compus de referință cu caracter antioxidant.
Pentru trasarea curbei de etalonare (Trolox), s-au preparat 5 soluții standard prin diluție în metanol cu concentrații cuprinse în domeniul 0,2 ÷ 1 mmol/L și s-a procedat la măsurarea absorbanței la lungimea de undă de 515 nm pentru fiecare soluție standard. Curba de etalonare reprezentând inhibitia DPPH de către Trolox (A515) funcție de concentrația soluției de Trolox (CTrolox) este prezentată în figura 4. Ecuația de regresie obținută s-a utilizat pentru calculul activității antioxidante a extractelor testate:
y = 78.2179x + 2.8842 (R² = 0.9976)
Figura 4. Curba de etalonare Trolox (metoda DPPH)
Pentru evaluarea activității antioxidante a extractelor s-a recurs la diluarea acestora cu metanol (1:10-1:40). Probele au fost preparate conform procedurii prezentate în subcapitolul 3.2.3. Fiecare probă a fost analizată în triplicat.
În figura 5 sunt prezentate curbele inhibiției radicalului DPPH în prezența extractelor.
Figura 5. Curbele cinetice de reducere a radicalului DPPH
Tabelul V. Activitatea antioxidantă determinată prin metoda DPPH
3.3.1.2. Metoda TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity)
Metoda TEAC se bazează pe generarea radicalului cation cromofor 2,2’-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat) (ABTS+) cu maxime de absorbție la 414, 645, 734 și 815 nm. Metoda TEAC originară [132] se bazează pe activarea metmioglobinei cu apă oxigenata cu generarea radicalului de ferilmioglobina, care apoi reacționează cu ABTS cu formarea radicalului cation ABTS+. Proba era adăugată anterior formării ABTS•+ si reducea radicalii ABTS+ formați cu măsurarea decalajului care corespunde timpului de întârziere în formarea radicalului. Metoda a reprezentat primul kit standardizat de măsurare a activității antioxidante în ser sau plasmă fiind comercializată la prețuri ridicate [133, 126].
Deoarece putea conduce la supraestimarea capacității antioxidante, metoda a fost modificată, fiind introdusa o etapa de decolorare pentru a preveni interferența compușilor antioxidanți cu formarea radicalului, obținându-se astfel o metodă mai fiabilă. În cazul noii metode, proba se adaugă după generarea unei anume cantități de radical cation ABTS+ și se cuantifică concentrația de ABTS+ rămasă după reacția cu compusul antioxidant [134].
Valoarea absorbanței este proporțională cu concentrația de ABTS+ remanent, fiind măsurată după un timp. Rezultatele se exprima ca echivalenți Trolox [126]. În loc de Trolox se poate utiliza drept compus de referință și acidul ascorbic, rezultatele fiind exprimate ca masă de acid ascorbic per 100 g sau per 100 mL de probă testată (metoda VCEAC – vitamin C equivalent antioxidant capacity) [135, 136].
TEAC reprezintă o metodă spectrofotometrică cu o tehnică simplă, cu utilitate în teste de screening și determinări uzuale, putând fi aplicată pe un domeniu larg de pH. Un alt avantaj este acela că radicalul ABTS+ fiind solubil în apă și solvenți organici permite determinarea capacității antioxidante a unor probe de compuși hidrofili dar și lipofili. Rezultatele obținute prin această metodă sunt și ele dependente de timpul analizei. Un alt dezavantaj constă în faptul că orice compus cu potențial redox mai scăzut decât al ABTS+-ului poate reacționa cu acesta [126].
3.3.1.2.1. Determinarea activității antioxidante a extractelor obținute prin metoda TEAC (ABTS)
Aceasta metodă permite măsurarea activității antioxidante a compușilor naturali, sintetici, puri sau în amestec, determinată de pierderea de culoare a ABTS•+ (figura 6), prin măsurarea reducerii radicalului cationic exprimată ca procentaj al inhibiției absorbanței la 734 nm.
Figura 6. ABTS și produsul său de oxidare, ABTS•+.
Pentru realizarea măsurătorilor spectrofotometrice s-a utilizat un spectrofotometru UV-Vis Jasco V 530 prevăzut cu cuve de cuarț cu drum optic de 1 cm cu dimensiunile 1 cm x 1 cm x 4,5 cm.
Trolox a fost utilizat drept compus de referință cu caracter antioxidant.
Pentru trasarea curbei de etalonare (Trolox), s-au preparat 5 soluții standard prin diluție în metanol cu concentrații cuprinse în domeniul 0,2 ÷ 1 mmol/L și s-a procedat la măsurarea absorbanței la lungimea de undă de 734 nm pentru fiecare soluție standard. Curba de etalonare reprezentând inhibiția ABTS de către Trolox (A734) funcție de concentrația soluției de Trolox (CTrolox) este prezentată în figura 7. Ecuația de regresie obținută s-a utilizat pentru calculul activității antioxidante a extractelor studiate:
y = 82,1453x + 4,9327 (R² = 0,9967)
Figura 7. Curba de etalonare Trolox (metoda ABTS)
Pentru evaluarea activității antioxidante a extractelor s-a recurs la diluarea acestora cu metanol (1:10-1:40). ABTS, radicalul cationic al acidului [2,2’-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonic)] a fost generat în reacția dintre ABTS și persulfat de potasiu [137], rezultând soluția radicalului stabil, de culoare albastru închis-verde. Probele au fost preparate conform procedurii prezentate în subcapitolul 3.2.3. Fiecare probă a fost analizată în triplicat.
În figura 8 sunt prezentate curbele inhibiției radicalului ABTS în prezența extractelor.
Figura 8. Curbele cinetice de reducere a radicalului ABTS
Tabelul VI. Activitatea antioxidantă determinată prin metoda ABTS
3.3.1.3. Metoda FRAP (Ferric reducing antioxidant power)
Metoda FRAP constă în reducerea, în mediu acid, a complexului feric 2,4,6-tripiridil-s triazină [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ la complexul feros [Fe(II)-(TPTZ)2]2+ de culoare albastru intens în prezența speciilor antioxidante. Astfel, se compară modificarea absorbanței la 593 nm pentru probele antioxidante cu absorbanța soluțiilor de concentrație cunoscută de ionii feroși [138].
De menționat este faptul că, orice compus, chiar în absența proprietăților antioxidante, dar care are un potențial redox mai mic decât al perechii redox Fe(III)/Fe(II), poate reduce teoretic Fe(III) la Fe(II), și astfel, rezultatele sunt compromise [126]. Unele clase de substanțe reacționează mai lent fiind necesari timpi de reacție mai mari pentru a putea obține o cuantificare totală [139]. Un alt dezavantaj al metodei se poate constata în cazul compușilor care absorb la lungimi de undă în jurul valorii de 593 nm, putea interfera cauzând o supraestimare a valorii FRAP [126].
Metoda FRAP, deși reflectă doar indirect activitatea antioxidantă este o metodă simplă si ieftină de determinare a activității antioxidante [126].
3.3.1.3.1. Determinarea activității antioxidante a extractelor obținute prin metoda FRAP
Aceasta metodă are la bază măsurarea activității antioxidante a compușilor naturali, puri sau în amestec, determinată de pierderea de culoare a complexului feros al tripiridil-triazinei, de culoare albastru intens, in prezenta speciilor antioxidante. Se compară modificarea absorbanței la 593 nm pentru probele antioxidante cu absorbanța soluțiilor de concentrație cunoscută de ionii feroși [138].
Pentru realizarea măsurătorilor spectrofotometrice s-a utilizat un spectrofotometru UV-Vis Jasco V 530 prevăzut cu cuve de cuarț cu drum optic de 1 cm cu dimensiunile 1 cm x 1 cm x 4,5 cm.
Trolox a fost utilizat drept compus de referință cu caracter antioxidant.
Pentru trasarea curbei de etalonare (Trolox), s-au preparat 5 soluții standard prin diluție în metanol cu concentrații cuprinse în domeniul 0,3 ÷ 1 mmol/L și s-a procedat la măsurarea absorbanței la lungimea de undă de 593 nm pentru fiecare soluție standard. Curba de etalonare reprezentând absorbanta FRAP + Trolox (A593) funcție de concentrația soluției de Trolox (CTrolox) este prezentată în figura 9. Ecuația de regresie obținută s-a utilizat pentru calculul activității antioxidante a extractelor testate:
y = 1,3543x – 0,0348 (R² = 0,9997)
Figura 9. Curba de etalonare Trolox (metoda FRAP)
Pentru evaluarea activității antioxidante a extractelor s-a recurs la diluarea acestora cu metanol (1:10-1:40). Probele au fost preparate conform procedurii prezentate în subcapitolul 3.2.3. Fiecare probă a fost analizată în triplicat.
Tabelul VII. Activitatea antioxidantă determinată prin metoda FRAP
3.3.2. Determinarea conținutului total de compuși polifenolici
Metoda Folin-Ciocâlteu este folosită pentru determinarea conținutului total de compuși fenolici din plante.
Analizele efectuate prin metoda Folin–Ciocâlteu (FC) conduc deseori la valori numerice mult diferite ale absorbției față de cele obținute prin alte metode propuse pentru determinarea conținutului total de fenoli. Cu toate acestea, valorile relative se corelează bine între metode atunci când se compară probe similare. Corelarea poate fi uneori iluzorie și nu se regăsește între categorii foarte diferite de probe din cauza calității și particularității amestecului de reactanți pozitivi diferiți ce nu este chiar constant în probele unui produs dat. Considerând heterogenitatea fenolilor naturali și posibilitatea de interferență cu alte substanțe ușor oxidabile, nu este surprinzător faptul că unele metode au fost utilizate pentru determinarea conținutului total de fenoli și nu au fost corespunzatoare [140].
Printre metodele care se compară cu FC, se numară: titrarea cu permanganat, colorimetria cu saruri de fier și absorbția în ultraviolet. Standardizarea oxidării cu permanganat de potasiu reprezintă un subiect de discuții între diferiți analiști, datorită interferențelor mari, generate mai ales de zaharuri. Câteva comparații directe între metoda FC și metoda cu KMnO4, au demonstrat superioritatea metodei FC. Colorimetria cu săruri de fier prezintă o problemă din punct de vedere al determinării conținutului total de fenoli: monofenolii în general nu reacționează și în anumite condiții, difenolii și trifenolii vicinali dau culori diferite. Datorită unei interferențe aparent mai mică a dextrinelor, melanoidinelor și proteinelor, colorimetria feroasă este adesea folosită pentru analizele de bere, în particular pentru berea neagră. În aproape toate cazurile de comparare directă, metoda FC a fost preferată. Absorbția în ultraviolet este dificil de aplicat în determinarea conținutului total de fenoli, nu numai din cauza potențialelor interferențe cu alți compuși care absorb la maxime similare, dar și pentru că fenolii naturali individuali prezintă diferențe atât la lungimea de undă unde au absorbție maximă cât și la valoarea absorbanței lor molare. Folin și Denis (1912) au propus inițial un reactiv: hetero-poli-fosfowolframat-molibdat de sodiu (FD) care reacționează cu tirozina și dă o culoare albastră, proporțională cu conținutul de proteine. Utilizarea acestui reactiv este ocazional deranjată de apariția unui precipitat alb, care interferă în colorimetrarea directă. Precipitatul poate fi îndepartat prin filtrare, dar hârtia afectează colorația albastră prin adsorbție. Îmbunătățirile aduse de metoda FC constau în creșterea proporției de molibdat și prevenirea precipitării prin adăugarea la reactiv a sulfatului de litiu. Comparând cele doua metode, procedura FC determină creșterea sensibilității și a reproductibilității analizelor. Dezavantajele metodei constau în faptul că reactivul nu este unul specific, și detectează toate grupele fenolice găsite în extracte, inclusiv cele din proteinele extractibile, precum și posibila interferență cu substanțe reducătoare de tipul acidului ascorbic [140].
3.3.2.1. Determinarea conținutului total de compuși polifenolici din extractele studiate prin metoda Folin – Ciocâlteu
Conținutul total de fenoli a fost determinat conform metodei Folin-Ciocâlteu [141] folosind acid galic ca standard. Acest test se bazează pe reducerea chimică a reactivul Folin-Ciocâlteu, un complex phosphowolframat fosfomolibdat, la produse de culoare albastră cu compuși fenolici. Intensitatea culorii albastre este proporțională cu concentrația de compuși fenolici.
Curba de etalonare a acidului galic (GA) a fost obținută utilizând 10 soluții etalon în intervalul de concentrație 50-550 mg/L. Conținutul total de fenoli din extracte a fost calculat din curba de etalonare (absorbanta la 765 nm soluție acidă vs. acid galic) (Figura 10) folosind următoarea ecuație determinată prin regresie liniară:
A = 0,0012 c – 0,0505 (R² = 0,9972)
Figura 10. Curba de etalonare a acidului galic
Conținutul total de fenoli exprimat ca mg echivalent acid galic/litru de extract de plante (mg GAE/L) este prezentat în tabelul VIII. Toate probele au fost analizate în triplicat.
Tabelul VIII. Conținutul total de fenoli din plantele selectate
Cantitatea totală de fenoli, măsurată prin testul Folin-Ciocâlteu, variază considerabil în materialele vegetale, de la 1023,694 – 5853,650 mg GAE/L extract (tabelul VIII). Cel mai mare conținut de fenoli a fost găsit în Salix alba, iar cel mai mic a fost în Lycopodium clavatum.
Thymus vulgaris (4770,485 mg GAE/L extract) și Viscum album (4239,746 mg GAE/L extract), de asemenea, au prezentat niveluri foarte ridicate de fenoli. Alte plante cu un nivel ridicat de fenoli au fost Vaccinium myrtillus (2965,459 mg GAE/L extract), Salvia officinalis (2899,860 mg GAE / L extract), Hypericum perforatum (2825,880 mg GAE / L extract), Melissa officinalis (2774,810 mg GAE/L extract) și Tilia tomentosa (2745,083 mg GAE/L extract).
Viola tricolor (2268,260 mg GAE/L extract) și Aristolochia clematitis (1863,380 mg GAE / L extract) au prezentat un nivel relativ scazut de fenoli, în timp ce în Chelidonium majus (1282,916 mg GAE/L extract), Arnica montana (1188,402 mg GAE/L extract) și Lycopodium clavatum (1023,694 mg GAE extract/L de plante) continutul total de fenoli a inregistrat cele mai mici valori.
În familia Lamiaceae, cu 3 reprezentanți în acest studiu, cel mai mare conținut în fenoli a fost obținut în cazul Thymus vulgaris, celelalte două, Salvia officinalis și Melissa officinalis fiind, de asemenea, printre plantele cu un nivel ridicat de fenoli.
3.3.3. Compararea rezultatelor obținute pentru activitatea antioxidantă prin cele trei metode chimice. Relația activitate antioxidantă-conținut total de polifenoli.
În figura 11 sunt prezentate comparativ valorile activităților antioxidante obținute prin cele trei metode, DPPH, ABTS, FRAP. Variatia conținutului total de fenoli din plantele selectate este prezentat în figura 12.
Figura 11. Compararea activităților antioxidante ale extractelor studiate prin cele trei metode
Se poate observa că speciile de plante evaluate prin metoda TEAC (FRAP) indică variații mari de valori în activitatea antioxidantă.
Activitatea antioxidantă evaluată prin metoda DPPH, variază în intervalul 0,928-31,425 mM Trolox/L extract. Evaluarea prin metoda TEAC (ABTS) a condus la valori ale activității antioxidante între 0,402 și 34,856 mM Trolox/L extract, iar cea prin metoda FRAP la valori în intervalul 1,111-31,869 mM Trolox/L extract.
Salix alba prezintă cea mai mare activitate antioxidantă (DPPH: 31,425 mM Trolox/L extract; ABTS: 34,856 mM Trolox/L extract; FRAP: 31,869 mM Trolox/L extract, urmată de Thymus vulgaris, etc. S-a constatat că 7 din cele 13 specii de plante luate în studiu prezintă o activitate antioxidantă mai mare de 10 mM Trolox / L extract, doar 3 dintre ele având valori mai mici de 3 mM Trolox / L extract.
Rezultatele experimentale au arătat că speciile românesti studiate au o bună activitate antioxidantă măsurată prin diferite metode chimice. Aceste plante, bogate în elemente constitutive fenolice, ar putea fi o sursă bună de antioxidanți naturali.
Figura 12. Conținutul total de fenoli din plantele selectate
În ceea ce privește relația dintre activitatea antioxidantă și conținutul total de compuși fenolici (figura 13) s-a constatat că, în general, există o bună corelație între cele două (DPPH: R2 = 0,9170; ABTS: R2 = 0,9436; FRAP: R2 = 0,9626), ceea ce demonstrează că constituenții fenolici sunt responsabili pentru activitatea antioxidantă a plantelor. Rezultatele obținute sunt în concordanță cu cele raportate de Djeridane et al. (2006) [142] și Katalinic et al.(2006) [143] cu privire la această liniaritate. Singura excepție este în cazul Melissa officinalis, când conținutul fenolic este mai mic în comparație cu activitatea antioxidantă. Acest lucru poate fi explicat prin faptul că cei mai puternici compuși cu caracter antiradicalic gasiți în Melissa officinalis sunt aldehidele și cetonele monoterpenice (neral/geranial, citronelal, izomentonă, și mentonă) și hidrocarburi mono- și sesquiterpenice (E-cariofilene) [90], care, pe lângă compușii fenolici, contribuie la capacitatea antioxidantă a plantei.
Figura 13. Corelația dintre activitatea antioxidantă și conținutul total de compuși fenolici
Rezultatele obținute pentru activitatea antioxidantă prin toate cele trei metode se corelează foarte bine (Figura 14) iar valorile TEAC au fost aproape similare (ABTS-DPPH: R2 = 0,9933, FRAP-ABTS: R2 = 0,9904, FRAP-DPPH: R2 = 0,9739). Wojdyło et al. (2007)[144] au studiat capacitatea antioxidantă și conținutul total de polifenoli al unor plante poloneze, cinci dintre acestea fiind prezentate în acest studiu. Ei au susținut mari diferențe în capacitatea totală antioxidantă măsurată prin metoda FRAP, comparativ cu cele obținute cu DPPH și ABTS și o bună corelație între conținutul total de compuși fenolici și capacitatea lor antioxidantă doar în cadrul unei familii de plante. Aceste variații pot fi datorate diferitelor caracteristici ale materialului vegetal, parametrilor de extracție și modului de exprimare al activității antioxidante.
3.4. Concluzii
Pe baza testelor efectuate pentru determinarea capacității antioxidante și a conținutului total de polifenoli, au fost desprinse următoarele concluzii:
Rezultatele experimentale au arătat că speciile românești studiate sunt bogate în compuși fenolici și au demonstrat o bună activitate antioxidantă măsurată prin 3 metode chimice diferite, DPPH, ABTS, FRAP.
Mai mult de jumătate din plantele studiate au prezenatat o activitate antioxidantă mai mare de 10 mM Trolox/L extract, iar dintre acestea Salix alba a avut cea mai mare activitate antioxidantă, fiind urmată de Thymus vulgaris. Cele două specii au prezentat și cel mai mare conținut total de polifenoli.
Cei trei reprezentanți din familia Lamiaceae s-au situat printre plantele cu un nivel ridicat de polifenoli, cel mai mare conținut de polifenoli fiind obținut în cazul Thymus vulgaris, urmat de Salvia officinalis și Melissa officinalis.
Aceste plante, bogate în elemente constitutive fenolice, ar putea fi o sursa bună de antioxidanti naturali.
Datele obținute au dovedit o corelație liniară între conținutul total de compuși fenolici și capacitatea antioxidantă a extractelor stabilită prin cele trei metode: DPPH, ABTS, FRAP. De asemenea, există o bună corelație între datele de activitate antioxidantă obținute prin aceste trei metode.
Rezultatele confirmă importanța compușilor fenolici în comportamentul antioxidant al extractelor din plante și contribuția semnificativă la capacitatea antioxidantă totală.
Extractele alcoolice de Salix alba și Viscum album au demonstrat un efect antiradicalic excepțional, putând fi considerați ca potențiali antioxidanți fenolici naturali.
CAPITOLUL 4. DETERMINAREA CAPACITĂȚII ANTIOXIDANTE A EXTRACTELOR POLIFENOLICE PRIN CITOMETRIE ÎN FLUX
4.1. Obiective
În vederea determinării capacității antioxidante a extractelor obținute, în a doua fază a experimentelor, a fost propusă determinarea activității antioxidante prin utilizarea citometriei în flux.
Astfel, au fost stabilite o serie de obiective principale:
Testarea prin citometrie în flux a tuturor extractelor care au prezentat o activitate antioxidantă mai mare de 10 mM Trolox/L extract obținută prin metode chimice;
Realizarea unor diluții seriale care să fie testate în vederea determinării comportamentului extractelor la diferite concentrații;
Studiul efectului inhibant al extractelor naturale asupra ROS în eritrocitele umane supuse stresului oxidativ;
Demonstrarea importanței utilizării extractelor naturale din plantele cercetate în lupta împotriva stresului oxidativ.
4.2. Materiale și metode
Ansamblul cercetărilor din prezentate în cadrul acestui capitol s-a derulat utilizând următoarele materiale și metode generale.
4.2.1. Produse biologice
Sângele uman folosit în experiențe a fost obținut de la donatori sănătoși și furnizat de Centrul de Transfuzii din Arad. Sângele a fost prelucrat la maximum 1 h după colectare.
4.2.2. Materiale utilizate
bicromat de potasiu Sigma, Germania
H2SO4 concentrat Sigma, Germania
H2DCFH-DA Sigma Aldrich, SUA
tampon fosfat salin Dulbecco Sigma, Germania
NaCl Sigma, Germania
KCl Sigma, Germania
Na2HPO4 Sigma, Germania
KH2PO4 Sigma, Germania
Dimetilsulfoxid Sigma, Germania
4.2.3. Aparatura utilizată
citometru FACScan Becton Dickinson dotat cu soft CellQuest Pro pentru achiziția și analiza rezultatelor
centrifugă SIGMA 2-16K.
4.2.4. Metode utilizate
Metoda de evaporare a alcoolului din extracte
Extractul etanolic cântarit în prealabil se introduce în balon, se fixează temperatura în baia de apă la 50°C, se pornește vidul și se începe distilarea. Se urmărește timpul pentru fiecare evaporare în parte. După evaporare, extractul se cântarește din nou și apoi se verifică dacă întreaga cantitate de alcool a fost îndepărtată.
Reacția de identificare a alcoolului
Prepararea soluției etalon
La 1 mL etanol se adaugă 2 picături de K2Cr2O7 2% și o picătură de H2SO4 concentrat. Se obține o soluție de culoare verde-albăstrui.
Identificarea etanolului în extracte
La 1 mL extract se adaugă 2 picături de K2Cr2O7 2% și o picătură de H2SO4 concentrat. Proba se compară cu etalonul. Apariția unei colorații verde-albastrui certifică prezența alcoolului în probă.
Prelucrarea probelor biologice
Eritrocitele umane au fost sedimentate prin centrifugare (1000 g, 4°C, 5 min) pentru eliminarea plasmei leucocitelor și plachetelor sanguine prin aspirare împreuna cu o mică cantitate de hematii. Sedimentul eritrocitar a fost ulterior spălat de 3 ori cu o soluție tampon fosfat salin Dulbecco pH 7,4 (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4și 1,5 mM KH2PO4).
Protocol de lucru pentru citometria în flux
Se prepară o soluție stoc 100 mM de H2DCFH-DA (50 mg H2DCFH-DA în 1mL DMSO) care se conservă la -20° C
În momentul analizei se prepară o soluție de lucru 500 µM H2DCFH-DA în H2O distilată
(1µL solutie stock în 199 µl H2O distilată)
Se prepară o suspensie celulară de eritrocite umane de aprox. 106 celule/mL
Se incubează suspensia obținută cu 20 µL soluție de lucru 500 µM H2DCFH-DA pentru o oră la 37° C, în condiții de obscuritate (concentrație finală: 10 µM)
Se prepară în condițiile descrise mai sus un eșantion care va servi de martor pozitiv, producerea de ROS fiind indusă cu H2O2 și care va fi în continuare tratat astfel:
a. Se centrifughează 5 minute la 2 000 rpm pentru îndepărtarea supernatantului
b. Se adaugă 1mL H2O2 2 mM în tampon fosfat salin (PBS) (1µL H2O2 30% în 4410µL PBS)
c. Se incubează o oră la 37° C în condiții de obscuritate
d. Se analizează la FACS, servind drept martor pozitiv pentru analiză.
Se analizează direct prin citometrie în flux pentru fluorescenta verde în FL1.
4.3. Rezultate și discuții
4.3.1. Noțiuni de citometrie în flux
Măsurătorile celulare prin citometrie în flux constituie un pas important spre înțelegerea atributelor individuale într-o populație de celule. Citometria în flux (CMF) este o tehnică des utilizată pentru a măsura diferiți parametrii ai celulelor individuale și este aplicată în diverse domenii precum imunologie, genetică, cercetare fundamentală și clinică, biologie vegetală.
Scopul acestei tehnici este de a analiza, într-un timp foarte scurt și pe un număr mare de celulele, mai mulți parametrii. Pentru aceasta, celulele aflate în soluție trec cu o viteză foarte mare (aproximativ 10.000 celule/secundă) printr-un vas capilar și sunt analizate cu ajutorul unei raze laser. Celulele traversează un injector și sunt analizate de către laser, una câte una, la ieșirea din injector. Parametrii ce pot fi analizați simultan sunt mărimea celulei și conținutul în granule intracelulare, respectiv parametrii biologici legați de emisia unuia sau mai multor fluorocromi ce au fost în prealabil fixați pe celule. Acești fluorocromi sunt excitați de către laser și emit o lumină fluorescentă intrinsecă de o lungime de undă mereu superioară celei de laser [145].
Lumina difuzată în ax este recuperată de către o celulă fotoelectrică iar cea difuzată la 90° și emisiile fluorescente sunt recuperate de o rețea optică și apoi trimise către diferiți fotomultiplicatori. Aceștia transformă fotonii în fotoelectroni care, odată amplificați, sunt transformați în semnale digitale cu ajutorul unui sistem electronic. Sistemul informatic va trata semnalele și le va reprezenta sub diferite forme permițând astfel efectuarea de măsurători statistice pe populațiile studiate.
Aplicațiile citometriei în flux constau înmăsurarea viabilității celulare, studiul constituenților celulari (ADN, cromatina, cromozomi), studiul ciclului celular, studiul morții celulare (apoptoza / necroza), studiul membranelor celulare, măsurarea schimburilor ionice, citoenzimologie, măsurarea activității de oxido-reducere, măsurarea pH-ului intracelular, analiza subpopulațiilor limfocitare, diagnosticul hemopatiilor maligne, biologie celulară, determinarea unor autoanticorpi, diagnosticul, evoluția, prognosticul tumorilor maligne solide, microbiologie [145].
4.3.1.1. Măsurarea activității oxidative prin citometrie în flux
În citometria în flux analizele sunt realizate în cea mai mare parte a cazurilor marcând celulele cu coloranți fluorescenți. În cazul măsurării reacțiilor de oxido-reducere, coloranții sunt non fluorescenți. Substratele utilizate pentru măsurarea activității oxidative sunt numite fluorogene deoarece ele capătă această proprietate după unul sau mai multe clivaje enzimatice, în funcție de activitatea oxidativă. Cele mai utilizate substrate sunt: 2',7'-diclorofluorescein diacetat (DCFH-DA) sau 2,7-diclorodihydrofluorescein diacetat (H2DCF-DA), hydroethidin și dihydrorhodamine 123 (DHR 123), cu o sensibilitate de aproximativ 6 ori superioară celei prezentate de DCFH-DA [145].
CM-H2DCFDA sau chloromethyl derivatul de dichlorodihydrofluorescein diacetat (5-(si-6)-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat) este mult mai bine reținut în celule înainte sau după stimulare, dând o sensibilitate mai mare analizelor efectuate. DCFH-DA, un produs non-fluorescent este clivat într-o primă etapă de esterazele celulare tot într-un produs non-fluorescent (DCFH) care apoi este oxidat de ROS (reactive oxygen species) sau de către peroxidaze într-un produs fluorescent verde (DCF) ce poate fi analizat prin citometrie în flux. Producerea DCF permite în consecință urmărirea metabolismului oxidativ (măsurarea reducerii oxigenului), dar acest fapt depinde mai întâi de activitatea esterazică, ceea ce nu este cazul pentru DHR 123. Datorită proprietăților sale, DCFH-DA este utilizat din ce în ce mai mult pentru analiza stresului oxidativ, prin măsurarea producției de ROS, atât în studiul apoptozei cât și în studiul anumitor patologii celulare. Speciile de oxigen reactiv (ROS) care posedă un electron nepereche sunt produse în mod continuu în celulă ca produși secundari ai metabolismului și pot oxida diverse molecule conducând la moarte celulară și afectare tisulară. Se cunoaște deasemenea că speciile de oxigen reactiv pot contribui în numeroase cazuri la patogeneza unor boli ereditare [145].
Ïn general măsurarea ROS este extrem de dificilă pentru că ei au o durată de viață scurtă, iar metodele curente folosite sunt complicate, insuficient de sensibile, putând furniza rezultate eronate atunci când populația celulară studiată este heterogenă. Citometria în flux oferă și de această dată numeroase avantaje printre care abilitatea de a examina cantitativ caracteristicile unui mare număr de celule individuale, a unor subpopulații, fără a se limita la măsurarea mediei populației totale. Ea a fost utilizată pentru a măsura stresul oxidativ în numeroase tipuri celulare [145].
4.3.2. Determinarea activității antioxidante a extractelor naturale din plante
Extractele alcoolice au fost supuse evaporării în vederea îndepărtării etanolului, folosind rotavaporul.
Toate cele 7 extracte evaporate au fost testate pentru identificarea alcoolului și s-a constatat că nu mai există alcool în probe, obținându-se o culoare brună, comparativ cu etalonul care este verde-albastrui, după cum se poate observa în figura 15.
Figura 15. Reacția de identificare a etanolului în extracte
Dacă până în aceasta etapă a fost evaluată activitatea biologică a speciilor de plante autohtone utilizând metode in vitro, determinarea activității antioxidante utilizând citometria în flux, o metoda ex vivo, face trecerea la posibilitatea evaluării in vivo a extractelor studiate.
Potrivit rezultatelor obținute anterior, din totalul de 13 plante studiate, au fost alese plantele ce au demonstrat cea mai mare activitate antioxidantă și cel mai mare conținut de polifenoli. Astfel, 7 plante (tabelul IX) au fost în continuare testate pe celule vii, în vederea determinării proprietăților antioxidative, utilizând o tehnică revoluționară, citometria în flux.
Tabelul IX. Extractele naturale studiate prin citometria în flux
În aceasta etapă, eritrocite umane au fost preincubate în prezența sau în absența extractelor din care în prealabil a fost evaporat alcoolul (subcapitolul IV.2.), după care acestea au fost supuse tratamentului cu H2O2 (subcapitolul IV.2.).
Comportamentul extractelor luate în lucru poate fi evaluat pe baza mediei intensității de fluorescență (MFI) în FL1 a produsului fluorescent DCF rezultat din clivarea substratului non fluorescent DCFH-DA de către esterazele celulare și oxidat de speciile reactive de oxigen (ROS), măsurată prin citometrie în flux (tabelul X). Cu cât MFI are valori mai mici cu atât activitatea antioxidantă este mai mare.
Tabelul X. Efectul extractelor naturale asupra nivelului ROS în eritrocite umane supuse unui stres oxidativ indus cu H2O2
S-a constatat o creștere de 22 ori a intensității fluorescenței diclorofluoresceinei (DCF) în cazul celulelor supuse stresului oxidativ (RBCs + H2O2) (tabelul X). Nivelul intracelular de peroxid de hidrogen a scazut semnificativ în cazul celulelor coincubate cu diferite extracte (figura 16). Astfel, la diluția(P-a), cantitatea de peroxid de hidrogen intracelular a fost redusă până la 5,30% în cazul coincubării cu extract de Melissa officinalis, până la 5,56% în cazul extractului de Salvia officinalis, cea mai mică scădere obținându-se în cazul utilizării extractului de Salix alba (21,73%).
Figura 16. Media intensității de fluorescența (MFI) obținută pentru extractele (E1-E7) testate prin citometrie în flux pe eritrocite umane supuse unui stres oxidativ indus cu H2O2 pentru 5 diluții seriale ale fiecărui extract (P-a–>P-e).
Pentru o mai bună reprezentare a activităților antioxidante s-a recurs la calculul procentului de inhibiție al extractelor studiate prin citometria în flux (tabelul XI), care se calculează raportând valorile MFI corespunzatoare extractelor studiate la valoarea MFI a probei de RBCs supusă stresului oxidativ indus cu H2O2.
Tabelul XI. Inhibiția ROS a extractelor naturale în eritrocite umane supuse unui stres oxidativ indus cu H2O2
În figura 17 este reprezentat procentul de inhibiție al celor 7 extracte în cele 5 diluții studiate. Comparând procentul de inhibiție al peroxidului de hidrogen obținut în cadrul aceleași specii, dar la concentrații diferite de-a lungul diluțiilor seriale, se constată o inhibiție mare chiar și la ultima diluție (P-e) în cazul Melissa officinalis (94,70% (P-a)….85,76 (P-e)), spre deosebire de Salvia officinalis care a demonstrat un procent de inhibiție semnificativ la diluția P-a (94,44%), efect care a scăzut mult până la diluția finală testată (31,76% (P-e)). O evoluție similară cu cea a Melissei officinalis a prezentat extractul de Hypericum perforatum.
Figura 17. Procentul de inhibiție al extractelor naturale (E1-E7) testate prin citometrie în flux pe eritrocite umane supuse unui stres oxidativ indus cu H2O2 pentru 5 diluții seriale ale fiecărui extract (P-a–>P-e).
4.4. Concluzii
În urma analizei extractelor naturale prin citometrie în flux, se pot concluziona urmatoarele:
Toate extractele supuse analizei au demonstrat o capacitate inhibantă semnificativă a ROS în eritrocitele umane supuse stresului oxidativ. Procentul de inhibiție corespunzator diluției P-a se situează în intervalul 78,27-94,70%, iar cel corespunzator diluției P-e, în intervalul 4,40-85,76%;
Extractul de Melissa officinalis a demonstrat o inhibiție mare chiar și la ultima diluție (94,70% (P-a)….85,76% (P-e));
Capacitate inhibantă semnificativă, care se păstrează până la diluția finală, s-a obținut și în cazul utilizării Hypericum perforatum;
Extractul de Salvia officinalis a demonstrat un procent de inhibiție semnificativ la diluția P-a (94,44%), efect care a scăzut mult până la diluția finală testată (31,76% (P-e));
Cea mai mică activitate antioxidantă a fost obținută în cazul Salix alba, aceasta prezentând o inhibiție de 78,27% la prima diluție;
Rezultatele sugerează importanța utilizării extractelor naturale din plantele cercetate în lupta împotriva stresului oxidativ.
CAPITOLUL 5. STUDIUL ACȚIUNII UNOR POLIFENOLI IZOLAȚI DIN PLANTE ASUPRA PROLIFERĂRII CICLULUI CELULAR ȘI APOPTOZEI CELULELOR CANCEROASE. POSIBILE APLICAȚII BIOMEDICALE
5.1. Obiective
În vederea determinării acțiunii extractelor obținute asupra proliferării ciclului celular și a efectului citotoxic al acestora, au fost stabilite o serie de obiective principale:
Evaluarea efectului antiproliferativ al extractelor vegetale asupra unor linii celulare de melanom uman A375 și keratinocite HaCat utilizând testul MTT;
Evaluarea potențialului anticanceros și antimigrator al extractelor vegetale pe linii celulare de melanom murinic B164A5 și keratinocite HaCat utilizând metoda wound healing assay;
Demonstrarea importanței utilizării extractelor naturale din plantele cercetate în lupta anticancer.
5.2. Materiale și metode
Ansamblul cercetărilor din prezentate în cadrul acestui capitol s-a derulat utilizând următoarele materiale și metode generale.
5.2.1. Produse biologice
Liniile celulare de melanom uman A375, melanom murinic B164A5 și de keratinocite HaCat aparțin Facultății de Farmacie din cadrul Universității de Medicină și Farmacie „Victor Babeș” din Timișoara. Liniile celulare de melanom murinic B164A5 și de keratinocite HaCat au fost achiziționate de la ATCC (American Type Culture Collection), iar linia celulară de melanom uman A375 a fost achiziționată de la ECEACC (European Collection of Authenticated Cell Cultures).
Linia celulară B164A5 a fost izolată dintr-un melanom cutanat dezvoltat de șoarecii din rasa C57BL/6 și prezintă caracteristici similare fibroblaștilor. Spre deosebire de celulele A375, celulele B164A5 produc melanină.
5.2.2. Materiale utilizate
mediu Dulbecco’s Modified Eagle’s (DMEM) Sigma, Germania
ser fetal de vițel (FCS) Sigma, Germania
tampon fosfat salin (PBS) Gibco, SUA
amestec de antibiotice Penicilină/Streptomicină Gibco, SUA
kit MTT Roche, Elvetia
soluție de 0,25% tripsină-1 mM EDTA Sigma, Germania
5.2.3. Aparatura utilizată
incubator (SANIO O2/CO2 model MCO-5M)
cameră de numarat (Neubauer)
hotă cu flux laminar (Microflow Advanced Bio Safety Cabinet-Class II)
centrifugă (Boeco Centrifuge S-8)
spectrofotometru (Xmark Spectrophotometer Biorad)
microscop optic (Optika Microscopes Optikam Pro Cool 5 and Optika View)
5.2.4. Metode utilizate
Prelucrarea probelor biologice
Din punct de vedere al siguranței manipulării în laborator a culturilor celulare, liniile celulare A375 și B164A5 sunt incluse în nivelul de siguranță nr. 1 (Biosafety level 1), ceea ce înseamnă că prezintă un risc minim de contaminare pentru personalul care lucrează cu aceste celule.
Celulele se cultivă în mediu de DMEM suplimentat cu 10% FCS și 1% amestec Penicilina/Streptomicină, într-un incubator la temperatura de 37°C într-o atmosferă de CO2 5%. Când celulele ajung la o confluență de 70-80% (la fiecare două sau trei zile) se desprind de pe placă utilizând o soluție de 0,25% tripsină-1 mM EDTA. Celulele se lasă la incubator cinci minute, apoi se adaugă mediu pentru neutralizarea tripsinei. Suspensia de celule se centrifughează 5 minute la 1200 rpm. Celulele sunt apoi recultivate în plăci T75 la o subrată de cultivare de 1:10 pentru a se asigura condiții optime de proliferare. Numărarea celulelor s-a realizat prin intermediul unei camere de numărat.
Toate studiile in vitro au fost realizate în condiții sterile, în interiorul unei hote cu flux laminar, care este dotată cu o lampă care emite radiație UV cu efect germicid la o lungime de undă de 253,7 nm.
Testul MTT
Celulele de melanom uman A375 (pasaj 21) și keratinocitele HaCat (pasaj 24) sunt cultivate pe o placă cu 96 de godeuri la o densitate 6x103celule/godeu în 100 μl mediu/godeu suplimentat cu 10% FCS. După 24 de ore, mediul celulelor este înlocuit, iar celulele sunt stimulate cu 10 µl extract vegetal dizolvat în 90 µl mediu. Probele de celule martor sunt stimulate cu 10 µl apă distilată în 90 µl mediu DMEM. În cea de a 3-a zi, se adaugă 10 μl reactiv MTT/godeu, iar la un interval de 4 ore se adaugă un buffer de solubilizare (100μl/godeu).
Metoda wound healing assay
Un număr de 2×105 celule/godeu se cultivă pe plăci de cultură cu 12 de godeuri cu 24 de ore înainte de începerea experimentului. Celulele sunt păstrate la incubator la temperatură constantă de 37°C și 5% CO2. Se realizează linii sub forma unor zgârieturi în zone bine determinate la nivelul stratului de celule cu ajutorul unei pipete sterile de (10 μl). Celulele detașate în urma procedurii se înlătură prin spălare cu PBS înainte de stimulare. După adăugarea probelor și a mediului, celulele se incubează pentru 24 h la 37°C și 5% CO2.
5.3. Rezultate și discuții
5.3.1. Efectul citotoxic și antiproliferativ al extractelor vegetale studiate
Salvia officinalis
Genul Salvia este unul dintre cele mai importante genuri de plante aromatice aparținând familiei Lamiaceae. Acest gen cuprinde aproximativ 900 de specii de plante răspândite în întreaga lume, incluzând numeroase specii de plante ornamentale, culinare și medicinale [146].
Salvia officinalis, S. miltiorrhiza, S. plebeia și S. Menthaefolia sunt câteva specii de plante care apațin acestui gen recunoscute pentru efectul lor antiproliferativ pe diferite tipuri de celule tumorale [147]. Salvia officinalis este o plantă ierboasă specifică regiunii estice a bazinului mediteranean, fiind foarte utilizată sub formă de condiment în alimentație, tinctură hidroalcoolică și ceai. Este reunoscută în medicina tradițională pentru efectele sale antiinflamatorii, antidiabetice, antioxidante, antimicrobiene. Diferite părți ale plantei, în special rădăcina constuie o sursă bogată de principii active cum ar fi terpenoide, polifenoli și uleiuri esențiale [148].
Efectul citotoxic al salviei se datorează inducerii apoptozei și creșterii activității caspazei 3 și 8 [149]. Un studiu in vitro realizat pe celule DU145 de carcinom uman de prostată a demonstrat că inducerea apoptozei se datorează 5,16-dihidrotansinonelor extrase din Salvia miltiorrhiza. Inducerea apotozei este independentă de Bcl-2 și nu este influențată de hormonii androgeni [150]. Efectul citotoxic al salviei s-a dovedit a fi dependent de concentrație și de timp la nivelul celulelor de leucemie L1210 [151].
Studiul in vitro realizat de Garcia et al. [148] a demonstrat că extractul hidroalcoolic de salvie utilizat în doze cuprinse între 5-625μg/mL-1 a avut efectul inhibitor cel mai pronunțat pe celule A-549 și efectul inhibitor cel mai redus pe celule Hep2. Spre deosebire de acesta, extractul apos de salvie utilizat în doze cuprinse între 5-5000μg/mL-1 a a avut cel mai mare procent de inhibiție la nivelul celulelor A-549. La nivelul celulelor non-tumorale (HEK-293 și MRC-5) cele două extracte de salvie au manifestat o activitate citotoxică selectivă spre deosebire de celulele tumorale (Hep-2, HeLa, HT-29, A-549, A-375). De asemenea, celulele tumorale COLO-205 și de cancer de sân MCF-7 s-au dovedit a fi mult mai sensibile la stimularea cu extract de salvie. Celulele tumorale HCT-116 și MiapaCa-2 au manifestat o rată crescută de inhibiție în urma stimulări cu doze crescute de extract de salvie. Mai mult decât atât s-a dovedit că efectul citotoxic al salviei este specific celulelor tumorale, având un efect inhibitor redus pe celulele normale NIH-3T3 [152].
Salvia dominica and Salvia syriacautilizate în doze de 100 μg/mL au demonstrat un efect citotoxic reprezentativ prin reducerea viabilității celulare a fibroblastelor PLF, spre deosebire de Salvia triloba și Salvia hormiumcare au avut un efect neglijabil pe aceeași linie celulară [146].
Salvia officinalis L. a dovedit un efect inhibitor și asupra celulelor umane de limfom B Burkitt (Raji), de limfom monocitar (U937) și de leucemie acută mielocitică (KG-1A), dar nu a vut efect asupra celulelor normale HUVEC [153].
Melissa officinalis
Melissa officinalis, cunoscută cu denumirea de roiniță este o plantă aromatică, perenă care apaține familiei Lamiaceae și care este cunoscută pentru efectele sale sedative, spamolitice și antibacteriene [154,155].
Conform studiului realizat de Weidner et al. [156], estractul alcoolic de roiniță a inhibat proliferarea celulelor de cancer de colon și a indus apotoza prin producerea speciilor reactive de oxigen. Potențialul antitumoral al roiniței a fost evidențiat și pe celule de cancer de sân (MCF-7, MDA-MB-468 și MDA-MB-231) [157].
Datele obținute în urma studiilor in vitro au arătat că extractul de roiniță are un efect antitumoral mai puternic pe tipurile de cancer hormono-dependente [158].
Conform studiului realizat de Encalada et al. [155], acidul rosmarinic extras din roiniță a dovedit că este responsabil de efectul antiporliferativ al acestei plante la nivelul celulelor umane de cancer de colon HCT-116.
Tillia tomentosa
Tilia sp. este un gen care cuprinde mai multe specii de arbori dintre care cele mai cunoscute sunt: Tilia cordata, Tilia tomentosa, Tilia platyphyllos. Produsele vegetale obținute din speciile de tei, utilizate în scop medicinal sunt florile, frunzele, scoarța și cărbunele de tei. Speciile de tei au fost folosite din cele mai vechi timpuri pentru acțiunea lor anxiolitică și în tratamentul răcelilor, al bronșitelor, a febrei și în procesele inflamatorii.
Extractul de tei conține flavonoizi și rutină responsabili de acțiunea antioxidantă a acestora [159].
Extractul etanolic de tei a dovedit un efect antiproliferativ pe celulele de limfom datorită acțiunii antioxidante a acestuia prin modularea speciilor reactive de oxigen [159]. De asemenea, lignanii prezenți în scoața de tei au dovedit un efect citotoxic asupra liniilor celulare de carcinom pulmonar A 549, cancer ovarian SK-OV-3, melanom de piele SK-MEL-2 și adenocarcinom de colon HCT-15 [160].
Salix alba
Scoarța speciilor de salcie (Salcie sp.) este folosită în medicina tradițională pentru efectul său antiinflamator și analgezic [161].
Extractul etanolic de Salix aegyptiaca poate inhiba proliferarea, motilitatea și poate induce apotoza în cazul celulelor de cancer de colon, datorită conținutului bogat în catechină, catechol și salicină [161]. Efectul antioxidant și chemopreventiv al salciei (Salix caprea) a fost demonstrat și in vivo pe un model animal de cancer de piele [162].
Extractul de scoarță de salcie a dovedit că inhibă proliferarea celulelor de cancer de colon prin inducerea apoptozei dependent de calea p53 și prin inhibarea PI3K/Akt și a MAP kinazei. Efectul anticarcinogenic al extractul de scoață de salcie se presupune că se datorează polifenolilor și a flavonoizilor conținuți [163]. De asemenea, studiul realizat de Enayat et al. [164] a demonstrat că extractul din scoarță de salcie a inhibat creșterea, migrarea și adeziunea celulelor canceroase HCT-116 și HT-29.
Vaccinium myrtillus
Fructele de afin (Vaccinium myrtillus) au efecte benefice asupra sănătății datorită conținutului bogat în polifenoli, în special antocianine [165]. Afinele sunt cunoscute pentru efectele lor hipogliceminate, antiinflamatoare, hipolipemiante și antioxidante, fiind utilizate în prevenția și tratamentul bolilor inflamatorii, a dislipidemiei, a diabetului, a bolilor cardio-vasculare și a cancerului [166].
Afinele inhibă proliferarea și induce apoptoza în cazul celulelor de cancer de sân MCF7 într-o manieră dependentă de concentrație [167]. Conform studiului Svobodova et al. [168], compușii fenolici din afine au diminuat in vitro efectele adverse cauzate de radiațiile UV la nivelul keratinocitelor.
Hypericum perforatum
Hypericum perforatum cunoscută cu denumirea populară de sunătoare este utilizată în medicina tradițională pentru proprietățile sale antiinflamatoare, antidepresive, antivirale, antibacteriene și antiproliferative [169,170]. Principalele substanțe active din această plantă sunt: hipericina, hiperforina, melatonina și alcaloizii. De asemenea, în această plantă au fost identificate și xantone și flavonoizi [170]. Hipericina este o moleculă cu efect multi-target care inhibă angiogeneza și dezvoltarea tumorilor canceroase [171].
Efectul anticancerigen al extractului de sunătoare se datorează atât hipericinei activată prin mecanime dependente de lumină, cât și hiperforinei prin mecanisme indepedente de lumină [172]. Conform studiului Kleeman et al., hipericina a avut un efect inhibitor dependent de doză și de lumină asupra celulelor de melanom pigmentate UCT Mel-1 și a celor nepigmentate A375 [171]. Cu toate acestea, hipericina a avut un efect inhibitor semnificativ mai scăzut decât al cisplatinului pe celulele de cancer de sân MCF-7 [173].
Viscum album
Vâscul (Viscum album) este cunoscut pentru activitatea sa anticanceroasă datorită conținutului său bogat în principii imunoactive, incluzând lectine, viscotoxine, proteine cu greutate moleculară mică, oligozaharide și polizaharide, flavonoizi și triterpene acide [174,175]. Datele obținute in vitro au indicat că extractul de vâsc a indus apoptoza și necroza în funcție de concentrația acestuia [175]. Acțiunea antiinflamatoare a vâscului se datorează scăderii concentrației de citokine implicate în producerea de prostaglandine E2 [176].
Extractul de vâsc a demonstrat efecte citotoxice dependente de concentrație în cazul celulelor de cancer de vezica urinară [177]. Studiile in vivo au indicat o tolerabilitate crescută a extractului de vâsc la pacienții cu diferite tipuri de cancere [178]. Cu toate acestea, studiile cu privire la efectul extractului de vâsc pe diferite tipuri de cancer de piele sunt limitate. Iscador M un extract standardizat de vâsc a demonstratcă are un efect semnificativ și o tolerabilitate crescută la pacienții cu melanom metastatic [179].
5.3.2. Evaluarea efectului antiproliferativ al extractelor vegetale utilizând testul MTT
Pentru evaluarea efectului antiproliferativ al celor 7 extracte vegetale s-a utilizat testul MTT, test de evaluare a viabilității și a proliferării celulare. Acesta se bazează pe reacția de clivare a sării de tetrazoliu (MTT) la formazan de către enzimele reticulului citoplasmatic prezente doar în celulele metabolic active.
Testul MTT este un test colorimetric pentru evaluarea activității metabolice celulare. Oxidoreductazele celulare NAD(P)H-dependente pot reflecta, în condiții definite, numărul de celule viabile prezente. Aceste enzime sunt capabile de a reduce colorantul bromura de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu (MTT) la forma sa insolubilă, formazan, de culoare purpurie:
Probele preparate conform procedeului prezentat în subcapitolul 5.2.4 au fost determinate spectrofotometric la o lungime de undă de 570 nm.
Procentul de inhibiție celulară s-a calculat prin intermediul formulei următoare:
Inhibiție (%)
În tabelul XII este prezentată inhibiția celulelor A375 și HaCat în prezența extractelor testate.
Tabelul XII. Procentul de inhibiție celulară a celulelor A375 și HaCat obținut în urma stimulării acestora cu cele 7 extracte apoase vegetale prin intermediul testului MTT
Figura 18. Procentul de inhibiție a celulelor A375 și HaCat obținut în urma stimulării acestora cu cele 7 extracte vegetale
Așa cum se poate observa în figura 18, celulele A375 s-au dovedit a fi mult mai susceptibile la stimularea cu cele 7 extracte vegetale apoase decât celulele HaCat.
Cea mai mare rată a inhibiției celulare s-a observat în cazul stimularii ambelor tipuri de celulele cu extractul apos de salcie, fiind urmat de extractul apos de tei și de extractul de salvie. Extractul de vâsc nu a inhibat proliferarea celulelor A375 (-40,35%).
În cazul celulelor HaCat, proliferarea acestora nu a fost inhibată în urma stimulări cu extractele de roiniță(-13,22%), afin (-40,61%), sunătoare (-41,4%) și vâsc (-74,14%).
5.3.3. Determinarea potențialului anticanceros și antimigrator al extractelor vegetale testate prin metoda wound healing assay
Capacitatea de migrarea a celulelor de melanom murinic B164A5 (pasaj 32) și a keratinocitelor HaCat (pasaj 26) în cele 7 extracte vegetale a fost testată in vitro folosind metoda wound healing assay [180] (protocol prezentat în subcapitolul 5.2.4).
Acest test este una dintre cele mai vechi metode dezvoltate pentru a studia in vitro migrarea direcțională a celulelor. Această metodă imită migrarea celulară în timpul vindecării rănilor in vivo. Etapele de bază implică crearea unei "răni", într-un monostrat de celule, înregistrarea imaginilor la începutul și la intervale regulate în timpul migrării celulelor pentru a închide rana și compararea imaginilor pentru a cuantifica rata de migrare a celulelor.
Mediul DMEM a fost completat cu apă distilată pentru probele celulare care au servit ca și control. Celelalte probe de celule au fost stimulate cu extractele apoase testate (150 µL extract în 1350 µL mediu). Au fost realizate fotografii ale culturilor celulare la diferite momente, folosind un microscop optic Optika View. Toate analizele au fost realizate în triplicat.
În figura19 sunt prezentate imaginile înregistrate la momentul inițial, după 3 ore și după 24 de ore de la stimularea celulelor de melanom murinic B164A5 cu extractele vegetale studiate.
Figura 19. Efectul antimigrator al extractelor vegetale pe celulele B164A5:control (A: 0h, B: 3h,C:24h), salvie (D: 0h, E: 3h, F:24h), roiniță (G: 0h, H: 3h, I:24h), tei (J: 0h, K: 3h, L:24h), salcie (M: 0h, N: 24h celule cu mediu, O:24h celule fără mediu), afin (P: 0h, Q: 3h,R:24h), sunătoare (S: 0h, Ș: 3h,T:24h), vâsc (Ț: 0h, U: 3h, V:24h)
La momentul inițial efectul anitimigrator al extractului de salvie (Figura 19D) este similar cu cel al solventului (apă distilată) (Figura 19A) în cazul celulelor B164A5.
Extractul de salcie a fost sub forma unei suspensii colorate, ceea ce a împiedicat vizualizarea corectă efectului antimigrator al celulelor stimulate cu extractul respectiv (Figura 19M).
Extractele de tei (Figura 19J), roiniță (Figura 19G), afin(Figura 19P) și vâsc (Figura 19Ț) au avut un efect antimigrator, la momentul inițial, comparabil cu cel al probei martor (Figura 19A).
La3 ore după stimularea celulelor cu extractele vegetale nu s-au observat diferențe semnificative în ceea ce privește migrarea și proliferarea celulelor stimulate cu extractele vegetale față de proba martor.
La 24 de ore de la stimularea celulelor B164A5 cu extractele vegetale, cea mai mare rată a migrării și a proliferării celulare s-a observat în cazul celulelor stimulate cu salvie (Figura 19I) și vâsc (Figura 19V).
În figura20 sunt prezentate imaginile înregistrate la momentul inițial, după 3 ore și după 24 de ore de la stimularea celulelor HaCat cu extractele vegetale studiate.
Extractele vegetale testate au prezentat un efect antiproliferativ și antimigrator mai scăzut pe celulele HaCat decât pe celulele de melanom murinic B164A5, încă de la momentul inițial.
Efectul antimigrator al extractelor a fost redus la 3 ore de la stimularea celulelor cu extractele respective.
La 24 de ore de la stimulare, s-a observat o rată de migrare crescută în cazul celulelor HaCat stimulate cu salvie (Figura 20F), roiniță (Figura 20I), afin (Figura 20Q).
Figura 20. Efectul antimigrator al extractelor vegetale apoase pe celulele HaCat: control (A: 0h, B: 3h,C:24h), salvie (D: 0h, E: 3h, F:24h), roiniță (G: 0h, H: 3h, I:24h), tei (J: 0h, K: 3h, L:24h), salcie (M: 24h celule cu mediu, N:24h celule fără mediu), afin (O: 0h, P: 3h, Q:24h), sunătoare (R: 0h, S: 3h,Ș:24h), vâsc (T: 0h, Ț: 3h, U:24h)
5.4. Concluzii
În urma evaluăriiacțiunii extractelor obținute asupra proliferării ciclului celular și a efectului citotoxic al acestora, au fost desprinse următoarele concluzii:
Celulele de melanom uman A375 au dovedit o sensibilitate mai crescută la stimularea cu cele 7 extracte vegetale apoase (salvie, roiniță, tei, salcie, afin, sunătoare, vâsc) spre deosebire de keratinocitele HaCat.
Cea mai mare rată de inhibiție a proliferării liniilor celulare HaCat (240,85%) și A375 (307,39%) s-a observat în cazul extractului de salcie.
Cele mai crescute rate de inhibiție pe celulele A375 s-au observat în cazul stimulării cu extractele de salcie (307,39%), tei (101,2%) și roiniță (76.69%) iar cele mai scăzute cu extractele de afin (10,27%) și vâsc (-40,35%).
Proliferarea celulelor HaCat nu au fost inhibată în urma stimulării cu extract de roiniță (-13,22%), afin (-40,61%), sunătoare (-41,1%) și vâsc (-74,14%).
Celulele de melanom murinic B164A5 au fost mai susceptibile la stimularea cu extractele vegetale testate în comparație cu celulele HaCat.
Conform metodei wound healing assay, extractele de salvie și vâsc au prezentat efectul antimigrator cel mai redus pe celulele B164A5, iar în cazul celulelor HaCat cel mai redus efect antimigrator s-a observat in cazul stimulării cu extractele de salvie, melisă și afin.
CONCLUZII GENERALE
În urma unui studiu amplu de literatură și a experimentelor conduse învederea demonstrării efectului benefic al polifenolilor în cancer, pot fi enunțate următoarele concluzii:
13 specii de plante, din flora autohtonă, au fost alese a fi investigate în ceea ce privește efectul antitumoral;
Pentru obținerea extractelor polifenolice, a fost aleasă ca metodă de extracție macerarea care permite obținerea de extracte bogate în polifenoli, extracte care ulterior pot fi utilizate ca suplimente alimentare;
Extractele polifenolice obținute au fost caracterizate conform PE, în ceea ce privește proprietățile organoleptice, densitate relativă, reziduu uscat, conținut de etanol, reacții de identificare sau dozare, rezultatele obținute fiind în concordanța cu prevederile acesteia;
Pe baza unui studiu al metodelor cromatografice de identificare și cuantificare a compușilor polifenolici utilizate la ora actuală pentru caracterizarea extractelor naturale din plante și a prevederilor PE, a fost selectată ca metodă de identificare a extractelor, cromatografia în strat subțire, o metoda simplă și rapidă care permite caracterizarea și identificarea extractelor polifenolice, rezultatele obținute fiind în concordanța cu prevederile PE;
În urma testelor efectuate pentru determinarea capacității antioxidante și a conținutului total de polifenoli, rezultatele experimentale au demonstrat că plantele studiate sunt bogate în compuși fenolici și prezintă o bună activitate antioxidantă măsurată prin 3 metode chimice diferite, DPPH, ABTS, FRAP. O mare parte din plantele studiate au prezenatat o activitate antioxidantă mai mare de 10 mMTrolox/L extract, iar dintre acestea Salix alba a avut cea mai mare activitate antioxidantă, fiind urmată de Thymus vulgaris, cele două specii prezentând și cel mai mare conținut total de polifenoli. Reprezentanții familiei Lamiaceae s-au situat printre plantele cu un nivel ridicat de polifenoli, cel mai mare conținut de polifenoli fiind obținut în cazul Thymus vulgaris;
În ceea ce privește relația dintre activitatea antioxidantă a extractelor stabilită prin cele trei metode: DPPH, ABTS, FRAP și conținutul total de compuși fenolici s-a constatat că, în general, există o bună corelație între cele două, ceea ce demonstrează că constituenții fenolici sunt responsabili pentru activitatea antioxidantă a plantelor. De asemenea, există o bună corelație între datele de activitate antioxidantă obținute prin aceste trei metode;
Extractele alcoolice de Salix alba și Viscum album au demonstrat un efect antiradicalic excepțional, putând fi considerați ca potențiali antioxidanți fenolici naturali;
În urma analizei extractelor naturale prin citometrie în flux, s-a demonstrat că toate extractele au prezentat o capacitate inhibantă semnificativă a ROS în eritrocitele umane supuse stresului oxidativ. Extractul de Melissa officinalis și Hypericum perforatum au demonstrat o inhibiție mare chiar și la ultima diluție, pe când extractul de Salvia officinalis a demonstrat un procent de inhibiție semnificativ la prima diluție, efect care a scăzut mult până la diluția finală testată. Rezultatele sugerează importanța utilizării extractelor naturale din plantele cercetate în lupta împotriva stresului oxidativ;
În urma evaluării acțiunii extractelor vegetale asupra celulelor canceroase a fost determinat efectul antiproliferativ al extractelor asupra unor linii celulare de melanom uman A375 și keratinocite HaCat utilizând testul MTT. În acest caz, celulele de melanom uman A375 au dovedit o sensibilitate mai crescută la stimularea cu cele 7 extracte vegetale spre deosebire de keratinocitele HaCat. Cea mai mare rată de inhibiție a proliferării liniilor celulare HaCat și A375 s-a observat în cazul extractului de Salix alba;
Potențialul anticanceros și antimigrator al extractelor vegetale pe linii celulare de melanom murinic B164A5 și keratinocite HaCat a fost determinat utilizând metoda wound healing assay, demonstrându-se astfel importanța utilizării extractelor naturale din plantele cercetate în lupta anticancer.
BIBLIOGRAFIE
1. Scalbert, A.; Manach, C.; Morand, C.; Remesy, C. Dietary polyphenols and the prevention of diseases. Crit. Rev. Food. Sci. Nutr. 2005, 45, 287–306, DOI: 10.1080/1040869059096.
2. Pandey, K.B.; Rizvi, S.I. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease. Oxid. Med.Cell. Longev. 2009, 2, 270-278, DOI: 10.4161/oxim.2.5.9498.
3. Beckman, C.H. Phenolic-storing cells: keys to programmed cell death and periderm formation in wilt disease resistance and in general defence responses in plants? Physiol. Mol. Plant Pathol. 2000, 57, 101-110, DOI: 10.1006/pmpp.2000.0287.
4. Graf, B.A.; Milbury, P.E.; Blumberg, J.B. Flavonols, flavonones, flavanones and human health: Epidemological evidence. J. Med. Food 2005, 8, 281-290, DOI: 10.1089/jmf.2005.8.281.
5. Arts, I.C.W.; Hollman, P.C.H. Polyphenols and disease risk in epidemiologic studies. Am. J. Clin. Nutr. 2005, 81, 317-325.
6. Kondratyuk, T.P.; Pezzuto, J.M. Natural Product Polyphenols of Relevance to Human Health. Pharm. Biol. 2004, 42, 46-63, DOI: 10.3109/13880200490893519.
7. Spencer, J.P.; Abd El Mohsen, M.M.; Minihane, A.M.; Mathers, J.C. Biomarkers of the intake of dietary polyphenols: strengths, limitations and application in nutrition research. Br. J. Nutr. 2008, 99, 12-22, DOI: 10.1017/S0007114507798938.
8. Shahidi, F.; Naczk, M. Food phenolics: sources, chemistry, effects, applications. Technomic Publishing Co. Inc: Lancaster, PA, USA,1995.
9. de Groot, H.; Rauen, U. Tissue injury by reactive oxygen species and the protective effects of flavonoids. Fundam. Clin. Pharmacol. 1998, 12, 249-255, DOI: 10.1111/j.1472-8206.1998.tb00951.x.
10. Wink, M. Compartmentation of secondary metabolites and xenobiotics in plant vacuoles. Adv. Bot. Res. 1997, 25, 141-169, DOI: 10.1016/S0065-2296(08)60151-2.
11. Simon, B.F.; Perez-Ilzarbe, J.; Hernandez, T.; Gomez-Cordoves, C.; Estrella, I. Importance of phenolic compounds for the characterization of fruit juices. J. Agric. Food Sci. 1992, 40, 1531-1535, DOI: 10.1021/jf00021a012.
12. Manach, C.; Scalbert, A.; Morand, C.; Rémésy, C.; Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am. J. Clin. Nutr. 2004, 79, 727-747.
13. Parr, A.J.; Bolwell, G.P. Phenols in the plant and in man. The potential for possible nutritional enhancement of the diet by modifying the phenol content or profile. J. Agric. Food. Chem. 2000, 80, 985-1012, DOI: 10.1002/(SICI)1097-0010(20000515)80:7<985::AID-JSFA572>3.0.CO;2-7.
14. Sosulski, F.W.; Krygier, K.; Hogge, L. Free, esterified, and insoluble-bound phenolic acids. 3. Composition of phenolic acids in cereal and potato flours. J. Agric. Food Chem. 1982, 30, 337-340, DOI: 10.1021/jf00110a030.
15. Price, K.R.; Bacon, J.R.; Rhodes, M.J.C. Effect of storage and domestic processing on the content and composition of flavonol glucosides in onion (Allium cepa). J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 938-942, DOI: 10.1021/jf9605916.
16. Crozier, A.; Lean, M.E.J.; McDonald, M.S; Black, C. Quantitative analysis of the flavonoid content of commercial tomatoes, onions, lettuce, and celery. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 590-595, DOI: 10.1021/jf960339y.
17. D’Archivio, M.; Filesi, C.; Benedetto, R.D.; Gargiulo, R.; Giovannini, C.; Masella, R. Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann. Ist. Super. Sanità 2007, 43, 348-361.
18. Day, A.J.; Williamson, G. Biomarkers for exposure to dietary flavonoids: a review of the current evidence for identification of quercetin glycosides in plasma. Br. J. Nutr. 2001, 86, S105-S110, DOI: 10.1079/BJN2001342.
19. Setchell, K.D.; Faughnan, M.S.; Avades, T.; Zimmer-Nechemias, L.; Brown, N.M.; et al. Comparing the pharmacokinetics of daidzein and genistein with the use of 13C-labeled tracers in premenopausal women. Am. J. Clin. Nutr. 2003, 77, 411-419.
20. Duthie, G.G.; Pedersen, M.W.; Gardner, P.T.; Morrice, P.C.; Jenkinson, A.M.; McPhail, D.B.; Steele, G.M. The effect of whisky and wine consumption on total phenol content and antioxidant capacity of plasma from healthy volunteers. Eur. J. Clin. Nutr. 1998, 52, 733-736.
21. Young J.F.; Nielsen, S.E.; Haraldsdóttir, J.; Daneshvar, B.; Lauridsen, S.T.; Knuthsen, P.; Crozier, A.; Sandström, B.; Dragsted, L.O. Effect of fruit juice intake on urinary quercetin excretion and biomarkers of antioxidative status. Am. J. Clin. Nutr. 1999, 69, 87-94.
22. Gee, J.M.; DuPont, M.S.; Rhodes, M.J.; Johnson, I.T. Quercetin glucosides interact with the intestinal glucose transport pathway. Free Radic. Biol. Med. 1998, 25, 19–25, DOI: 10.1016/S0891-5849(98)00020-3.
23. Passamonti, S.; Vrhovsek, U.; Vanzo, A.; Mattivi, F. Fast access of some grape pigments to the brain. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 7029–7034, DOI: 10.1021/jf050565k.
24. Halliwell, B.; Zhao, K.; Whiteman, M. The gastrointestinal tract: a major site of antioxidant action? Free Radic. Res. 2000, 33, 819-830, DOI: 10.1080/10715760000301341.
25. Clifford, M.N. Chlorogenic acids and other cinnamates. Nature, occurence, dietary burden, absorption and metabolism. J. Sci. Food Agric. 2000, 80, 1033–1043, DOI: 10.1002/(SICI)1097-0010(20000515)80:7<1033::AID-JSFA595>3.0.CO;2-T.
26. Olthof, M.R.; Hollman, P.C.; Katan, M.B. Chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed in humans. J. Nutr. 2001, 131, 66–71.
27. Kuhnau, J. The flavonoids. A class of semi-essential food components: their role in human nutrition. World Rev. Nutr. Diet. 1976, 24, 117–191, DOI: 10.1159/000399407.
28. Lee, M.J.; Maliakal, P.; Chen, L.; Meng, X.; Bondoc, F.Y.; Prabhu, S.; Lambert, G.; Mohr, S.; Yang, C.S. Pharmacokinetics of tea catechins after ingestion of green tea and (-)-epigallocatechin-3-gallate by humans: formation of different metabolites and individual variability. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2002, 11, 1025-1032.
29. Falany, C.N. Enzymology of human cytosolic sulfotransferases. FASEB J. 1997, 11, 206-216.
30. Spencer, J.P.; Chowrimootoo, G.; Choudhury, R.; Debnam, E.S.; Srai, S.K.; Rice-Evans, C.The small intestine can both absorb and glucuronidate luminal flavonoids. FEBS Lett. 1999, 458, 224-230, DOI: 10.1016/S0014-5793(99)01160-6.
31. Hollman, P.C.; Tijburg, L.B.; Yang, C.S. Bioavailability of flavonoids from tea. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1997, 37, 719-738, DOI: 10.1080/10408399709527799.
32. Dangles, O.; Dufour, C.; Manach, C.; Morand, C.; Remesy, C. Binding of flavonoids to plasma proteins. Methods Enzymol. 2001, 335, 319-333, DOI: 10.1016/S0076-6879(01)35254-0.
33. Dufour, C.; Loonis, M.; Dangles, O. Inhibition of the peroxidation of linoleic acid by the flavonoid quercetin within their complex with human serum albumin. Free Radic. Biol. Med. 2007, 43, 241-252, DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2007.04.009.
34. Vauzour, D.; Rodriguez-Mateos, A.; Oruna-Concha, M.J.; Spencer, J.P.E. Polyphenols and human health: prevention of disease and mechanisms of action. Nutrients 2010, 2, 1106-1131, DOI: 10.3390/nu2111106.
35. Del Rio, D.; Rodriguez-Mateos, A.; Spencer, J.P.E.; Tognolini, M.; Borges, G.; Crozier, A. Dietary (poly)phenolics in human health: structures, bioavailability, and evidence of protective effects against chronic diseases. Antioxid. Redox Signal. 2013, 18, 1818-1892, DOI: 10.1089/ars.2012.4581.
36. Perron, N.R.; Brumaghim, J.L. A Review of the Antioxidant Mechanisms of Polyphenol Compounds Related to Iron Binding. Cell Biochem.Biophys. 2009, 53, 75-100, DOI: 10.1007/s12013-009-9043-x.
37. Duthie, S.J.; Ma, A.; Ross, M.A.; Collins, A.R. Antioxidant Supplementation Decreases Oxidative DNA Damage in Human Lymphocytes. Cancer Res. 1996, 56, 1291-1295.
38. Noroozi, M.; Angerson, W.J.; Lean, M.E.J. Effects of flavonoids and vitamin C on oxidative DNA damage to human lymphocytes. Am. J. Clin. Nutr. 1998, 67, 1210-1218.
39. Fabiani, R.; De Bartolomeo, A.; Rosignoli, A.; Morozzi, G. Antioxidants prevent the lymphocyte DNA damage induced by PMA-stimulated monocytes. Nutr. Cancer 2001, 39, 284-291, DOI: 10.1207/S15327914nc392_19.
40. Luqman, S.; Rizvi, S.I. Protection of lipid peroxidation and carbonyl formation in proteins by capsaicin in human erythrocytes subjected to oxidative stress. Phytother. Res. 2006, 20, 303-306, DOI: 10.1002/ptr.1861.
41. Urquiaga, I.; Leighton, F. Plant Polyphenol Antioxidants and Oxidative Stress. Biol. Res. 2000, 33, 55-64, DOI: 10.4067/S0716-97602000000200004.
42. Mitjavila, M.T.; Morenoo, J.J. The effects of polyphenols on oxidative stress and the arachidonic acid cascade. Implications for the prevention/treatment of high prevalence diseases. Biochem. Pharmacol. 2012, 84, 1113-1122, DOI: 10.1016/j.bcp.2012.07.017.
43. Barrett, J.C. Mechanisms of multistep carcinogenesis and carcinogen risk assessment. Environ. Health Perspect. 1993, 100, 9-20.
44. Aranda-Anzaldo, A. Cancer development and progression: A non-adaptive process driven by genetic drift. Acta Biotheor. 2001, 49, 89-108, DOI: 10.1023/A:1010215424196.
45. Zinoveva,V.N.; Spasov, A.A. Mechanisms of the anticancer effects of plant polyphenols. I. Blockade of initiation of carcinogenesis. Biochem. (Mosc.) Suppl. Ser. B: Biomed. Chem. 2011, 5, 113-123, DOI: 10.1134/S1990750811020181.
46. Johnson, I.T.; Williamson, G.; Musk, S.R.R. Anticarcinogenic factors in plant foods: a new class of nutrients? Nutr. Res. Rev. 1994, 7, 175-204, DOI: 10.1079/NRR19940011.
47. Yang, C.S.; Landau, J.M.; Huang, M.-T.; Newmark, H.L. Inhibition of carcinogenesis by dietary polyphenolic compounds. Annu. Rev. Nutr. 2001, 21, 381-406, DOI: 10.1146/annurev.nutr.21.1.381.
48. Nichenametla, S.N.; Taruscio, T.G.; Barney, D.L.; Exon J.H. A review of the effects and mechanisms of polyphenolics in cancer. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2006, 46, 161-183, DOI: 10.1080/10408390591000541.
49. García-Lafuente, A.; Guillamón, E.; Villares, A.; Rostagno, M.A.; Martínez, J.A. Flavonoids as anti-inflammatory agents: implications in cancer and cardiovascular disease. Inflamm. Res. 2009, 58, 537-552, DOI: 10.1007/s00011-009-0037-3.
50. Khan, N.; Mukhtar, H. Multitargeted therapy of cancer by green tea polyphenols. Cancer Lett. 2008, 269, 269–280, DOI: 10.1016/j.canlet.2008.04.014.
51. Sharma, V.; Rao, L.J.M. A thought on the biological activities of black tea.Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2009, 49, 379–404, DOI:10.1080/10408390802068066.
52. Kamaraj, S.; Vinodhkumar, R.; Anandakumar, P.; Jagan, S.; Ramakrishnan, G.; Devaki, T. The effects of quercetin on antioxidant status and tumor markers in the lung and serum of mice treated with benzo(a)pyrene. Biol.Pharm. Bull. 2007, 30, 2268-2273, DOI: 10.1248/bpb.30.2268.
53. Sugantha Priya, E.; Selvakumar, K.; Bavithra, S.; Elumalai, P.; Arunkumar, R.; Raja Singh, P.; Brindha Mercy, A.; Arunakaran, J. Anti-cancer activity of quercetin in neuroblastoma: an in vitro approach. Neurol. Sci. 2014, 35, 163-170, DOI: 10.1007/s10072-013-1462-1.
54. Vidya Priyadarsini, R.; Senthil Murugan, R.; Maitreyi, S.; Ramalingam, K.; Karunagaran, D.; Nagini, S. The flavonoid quercetin induces cell cycle arrest and mitochondria-mediated apoptosis in human cervical cancer (HeLa) cells through p53 induction and NF-κB inhibition. Eur. J. Pharmacol. 2010, 649, 84-91, DOI: 10.1016/j.ejphar.2010.09.020.
55. Choi, E.; Bae, S.M.; Ahn, W.S. Antiproliferative effects of quercetin through cell cycle arrest and apoptosis in human breast cancer MDA-MB- 453 cells. Arch. Pharm. Res. 2008, 31, 1281–1285, DOI: 10.1007/s12272-001-2107-0.
56. Bishayee, A. Cancer prevention and treatment with resveratrol: from rodent studies to clinical trials. Cancer Prev. Res. 2009, 2, 409-418, DOI: 10.1158/1940-6207.CAPR-08-0160.
57. Juan, M.E.; Alfaras, I.; Planas, J.M. Colorectal cancer chemoprevention by trans-resveratrol. Pharmacol. Res. 2012, 65, 584-591, DOI: 10.1016/j.phrs.2012.03.010.
58. Athar, M.; Back, J.H.; Tang, X.; Kim, K.H.; Kopelovich, L.; Bickers, D.R.; Kim, A.L. Resveratrol: A review of pre-clinical studies for human cancer prevention. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2007, 224, 274-283, DOI:10.1016/j.taap.2006.12.025.
59. Pan, M.-H.; Ghai, G.; Ho, C-T. Food bioactives, apoptosis, and cancer. Mol. Nutr. Food Res. 2008, 52, 43–52, DOI: 10.1002/mnfr.200700380.
60. Sharma, S.; Stutzman, J.D.; Kelloff, G.J.; Steele, V.E. Screening of potential chemopreventive agents using biochemical markers of carcinogenesis. Cancer Res. 1994, 54, 5848–5855.
61. Doll, R. The lessons of life: Keynote address to the nutrition and cancer conference. Cancer Res. 1992, 52, 2024s–2029s.
62. Rogers, A.E.; Zeisel, S.H.; Groopman, J. Diet and carcinogenesis. Carcinogenesis 1993, 14, 2205–2217, DOI: 10.1093/carcin/14.11.2205.
63. Kelloff, G.J.; Crowell, J.A.; Steele, V.E.; Lubet, R.A.; et al. Progress in cancer chemoprevention: Development of dietderived chemopreventive agents. J. Nutr. 2000, 130, 467S– 471S.
64. Nicholson, D.W. From bench to clinic with apoptosis-based therapeuticagents. Nature 2000, 407, 810–816, DOI: 10.1038/35037747.
65. European Pharmacopoeia 8.5; EDQM, Council of Europe: Strasbourg, France, 2015.
66. Ardelean, A.; Mohan, G. Flora medicinală a României; All: București, România, 2008.
67. Arlt, V.M.; Stiborova, M.; Schmeiser, H.H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis 2002, 17, 265-277, DOI: 10.1093/mutage/17.4.265.
68. Crivineanu, M.; Durdun, C.; Nicorescu, I.Antioxidant Activity of Some Polyphenolic Extracts Obtained from Plants with Antitumoral Potential on Linoleic Acid Emulsion. Bull. UASVM, Veterinary Medicine 2009, 66, 359-365.
69. Papuc, C.;Crivineanu, M.;Goran, G.;Nicorescu, V.;Durdun N. Free Radicals Scavenging and Antioxidant Activity of European Mistletoe (Viscum album) and European Birthwort (Aristolochiaclematitis). Rev.Chim. (Bucharest) 2010, 61, 619-622.
70. Samsonova, O.E.; Belous, V.N.; Dudar’, Yu.A. Pharmacological characterization of Aristolochiaclematitis L. growing in the Stavropol region. Pharmaceutical Chemistry Journal 2006, 40, 199-201, DOI: 10.1007/s11094-006-0091-x.
71. Flos Arnicae. In WHO Monograph on Selected Medicinal Plants, Vol. 3; World Health Organization, Geneva, 2007;p. 77-87.
72. Duke, J.A.; Bogenschutz, M.J.;duCellier, J.;Duke P.K.Handbook of Medicinal Herbs, ed. 2, CRC Press: Boca Raton, USA, 2002;p. 37-38 (a), p. 467-468 (b), p. 168-169 (c).
73. Judžentienė, A.; Bŭdienė, J. Analysis of the chemical composition of flower essential oils from Arnica Montana of Lithuanian origin. Chemija 2009, 20, 190-194.
74. EMA/HMPC (2011): Assessment report on Chelidonium majus L., herba. Available online: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-_HMPC_assessment_report/2012/01/WC500120711.pdf
75. EMA/HMPC (2009a): Assessment report on Hypericum PerforatumL., herba. Available online: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-_HMPC_assessment_report/2010/01/WC500059144.pdf
76. Keles, O.; Bkirel, T.; Ak, S.; Alpmar, A. The antibacterial activity of some plants used for medicinal purposes against pathogens of veterinary importance. Folia Veterinaria 2001, 45, 22-25.
77. Vikas, K.; Singh, P.N.; Bhattacharya, S.K. Antiinflammatory and analgesic activity of Indian Hypericumperforatum. Indian J. Exp. Biol. 2001, 39, 339–343.
78. Serkendjieva, J.; Manolova, N.; Zgorniak-Nowosielska, I.; Zawilinsata, B.; Grzybek, J. Anti-viral activity of the infusion (SHS 174) from flowers of Sambucusnigra, aerial parts of Hypericumperforatum and roots of Saponariaofficinalis against influenza and herpes simplex viruses. Phytother. Res. 1990, 4, 97–100, DOI: 10.1002/ptr.2650040305.
79. Ozturk, Y.; Aydin, S.; Baser, K.H.C.; Kirmer, N.; Ozturk, K.N. Hepatoprotective activity of Hypericumperforatum alcoholic extract in rodents. Phytother. Res. 1992, 6, 44–46, DOI: 10.1002/ptr.2650060111.
80. Girzu, M.; Carnat, A.; Privat, A.M.; Fialip, J.; Carnat, A.P.; Lamaison, J.L. Sedative activity in mice of a hydroalcohol extract of Hypericumperforatum. Phytother. Res. 1997, 11, 395–397, DOI: 10.1002/(SICI)1099-1573(199708)11:5<395::AID-PTR114>3.0.CO;2-Q.
81. Gilani, A.H.; Khan, A.; Subhan, F.; Khan, M. Antispasmodic and bronchodilator activities of St John’s wort are putatively mediated through dual inhibition of calcium influx and phosphodiesterase. Fundam. Clin. Pharmacol. 2005, 19, 695–705, DOI: 10.1111/j.1472-8206.2005.00378.x.
82. American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium; St. John’s wort monograph: Scotts Valley, 1997; p. 1–32.
83. Nahrstedt, A.; Butterweck, V. Biologically active and other chemical constituents of the herb of Hypericumperforatum L. Pharmacopsychiatry 1997, 30, 129–134, DOI: 10.1055/s-2007-979533.
84. Duke, J.A. Handbook of phytochemical constituents of GRAS herbs and other economical plants; CRC Press: Boca Raton, USA, 1992; p. 302–303.
85. Herba Hyperici. In WHO Monograph on Selected Medicinal Plants, Vol. 2; World Health Organization, Geneva, 2004; p. 149-171.
86. Banerjee, J.; Biswas, S.; Madhu, N.R.; Karmakar, S.R.; Biswas, S.J.A better understanding of pharmacological activities and uses of phytochemicals of Lycopodium clavatum: A review. J. Pharmacogn.Phytochem. 2014, 3, 207-210.
87. Meletis, C.D.; Barker, J.E. Herbs and Nutrients for the Mind: A Guide to Natural Brain Enhancers; Praeger, Westport, USA,2004; p. 25.
88. Folium Melissae. In WHO Monograph on Selected Medicinal Plants, Vol. 2; World Health Organization, Geneva, 2004; p. 180-187.
89. Moradkhani, H.; Sargsyan, E.; Bibak, H.; Naseri, B.; Sadat-Hosseini, M.; Fayazi-Barjin, A.; Meftahizade, H.Melissa officinalisL., a valuable medicine plant: A Review. J. Med. Plant. Res. 2010, 4, 2753-2759.
90. Ribeiro, M.A.; Bernardo-Gil, M.G.; Esquivel, M.M.Melissa Officinalis, L.: Study of Antioxidant Activity in Supercritical Residues. J. Supercrit. Fluids 2001, 21, 51-60, DOI: 10.1016/S0896-8446(01)00078-X.
91. EMA/HMPC (2013): Assessment report on Melissa officinalis L., folium; Available online: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-_HMPC_assessment_report/2013/08/WC500147187.pdf
92. Cortex salicis. In WHO Monograph on Selected Medicinal Plants, Vol. 4; World Health Organization, Geneva, 2009; p. 309-322.
93. Perry, N.S.L.; Houghton, P.J.; Sampson, J.; Theobald, A.E.; Hart, S.; Lis-Balchin, M.; Hoult, J.R.S.; Evans, P.; Jenner, P.; Milligan, S.; Perry, E.K. In-vitro activity of S-lavandulaefolia (Spanish sage) relevant to treatment of Alzheimer's disease'. J. Pharm.Pharmacol. 2001, 53, 1347-1356, DOI: 10.1211/0022357011777846.
94. Perry, N.S.L.; Bollen, C.; Perry, E.K.; Ballard, C.Salvia for dementia therapy: review of pharmacological activity and pilot tolerability clinical trial. Pharmacol. Biochem. Behav. 2003, 75, 651–659, DOI: 10.1016/S0091-3057(03)00108-4.
95. EMA/HMPC (2009): Assessment report on Salvia Officinalis L., folium and Salvia Officinalis L. aetheroleum. Available online:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-_HMPC_assessment_report/2010/02/WC500070850.pdf
96. Hedges, L.J.; Lister, C.E. Nutritional attributes of herbs, Crop and Food Research Confidential Report No. 1891, A report prepared for Horticulture, New Zealand, 2007, 17-18 (a); 11, 23, 26-27 (b).
97. Herba thymi. In WHO Monograph on Selected Medicinal Plants, Vol. 1; World Health Organization, Geneva, 1999;p. 259-266.
98. EMA/HMPC (2012): Assessment report on Tilia tomentosa Moench, flos. Available online: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-_HMPC_assessment_report/2012/07/WC500129844.pdf
99. Fructus Myrtilli. In WHO Monograph on Selected Medicinal Plants, Vol. 4; Geneva, 2009; p. 210-225.
100. Ștefănuț, M.N.; Căta, A.; Pop, R.; Tănasie, C.; Boc, D.; Ienașcu, I.; Ordodi, V. Anti-hyperglycemic Effect of Bilberry, Blackberry and Mulberry Ultrasonic Extracts on Diabetic Rats. Plant Foods Hum. Nutr. 2013, 68, 378-384, DOI: 10.1007/s11130-013-0380-y.
101. EMA/HMPC (2010): Assessment report on Viola tricolor L. and/or subspecies Viola arvensis Murray (Gaud) and Viola vulgaris Koch (Oborny), herba cum flore. Available online: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-_HMPC_assessment_report/2011/10/WC500116274.pdf
102. EMA/HMPC (2012): Assessment report on Viscum album L., herba Available online: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-_HMPC_assessment_report/2013/08/WC500147021.pdf
103. Hegde, P.; Maddur, M.S.; Friboulet, A.; Bayry, J.; Kaveri, S.V. Viscum album exerts anti-inflammatory effect by selectively inhibiting cytokine-induced expression of cyclooxygenase-2. PLoS One 2011, 6, e26312, DOI: 10.1371/journal.pone.0026312.
104. Naczk, M.; Shahidi, F.Extraction and analysis of phenolics in food. J. Chromatogr. A 2004, 1054, 95-111, DOI: 10.1016/j.chroma.2004.08.059.
105. Franco, D.; Sineiro, J.; Rubilar, M.; Sánchez, M.; Jerez, M.; Pinelo, M.; Costoya, N.; Núñez, M.J. Polyphenols from plant materials: extraction and antioxidant power. Electron. J. Environ. Agric. Food Chem. 2008, 7, 3210–3216.
106. Hawrył, M. Gradient elution and computer-assisted method development. In High Performance Liquid Chromatography in phytochemical analysis; Waksmundzka-Hajnos, M.; Sherma, J., Editori; CRC Press: Boca Raton, USA, 2010; p. 211-256.
107. Escarpa, A.; Morales, M.D.; González, M.C. Analytical Performance of Commercially Available and Unavailable Phenolic Compounds Using Real Samples by High-Performance Liquid Chromatography – Diode-Array Detection. Anal. Chim. Acta 2002, 460, 61-72, DOI: 10.1016/S0003-2670(02)00140-X.
108. Mullen, W.; Lean, M.; Crozier, A. Rapid Characterization of Anthocyanins in Red Raspberry Fruit by High – Performance Liquid Chromatography Coupled to Single Quadrupole Mass Spectroscopy. J. Chromatogr. A 2002, 966, 63-70, DOI: 10.1016/S0021-9673(02)00699-4.
109. Putman, L.J.; Butler, L.J. Separation of High Molecular Weight Sorghum Procyanidins by HPLC. J. Agr. Food Chem. 1989, 37, 943-946, DOI: 10.1021/jf00088a025.
110. Kondo, T.; Yamashiki, J.; Kawahori, K.; Goto, T. Structure of Lobelinin A and B, Novel Anthocyanins Acylated With Three and Four Different Organic Acids, Respectively. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 6055-6058, DOI: 10.1016/S0040-4039(01)93853-5.
111. Adje, F.; Lozano, Y.F.; Meudec, E.; Adima, A.; N’zi, G.A.; Gaydou, E.M. Anthocyanin characterization of pilot plant water extracts of Delonix regia flowers. Molecules 2008, 13, 1238-1245, DOI: 10.3390/molecules13061238.
112. Kuwayama, S.; Mori, S.; Nakata, M.; Godo, T.; Nakano, M. Analyses of Anthocyanidins and Anthocyanins in Flower Petals of Lychnis senno and Its Related Species (Caryophyllaceae). Bul. Facul. Agric. Niigata Univ. 2005, 58, 35-38.
113. Kozminski, P.; Brett, A. Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection of Anthocyanins. Anal. Lett. 2006, 39, 2687–2697, DOI: 10.1080/00032710600824805.
114. Jones, C.M.; Mes, P.; Myers, J.R. Characterization and Inheritance of the Anthocyanin fruit (Aft) Tomato. J. Hered. 2003, 94, 449–456, DOI: 10.1093/jhered/esg093.
115. Burdulis, D.; Ivanauskas, L.; Dirsė, V.; Kazlauskas, S.; Ražukas A. Study of diversity of anthocyanin composition in bilberry (Vaccinium myrtillus L.) fruits. Medicina(Kaunas) 2007, 43, 971-977.
116. Melgarejo, P.; Hernández, F.; Martínez, J.; Tomas-Barberan, F.A.; Artes, F. Evolution of pomegranate anthocyanins during the ripening of fruit of three clones: ME16, VA1 and BA1. In Production, processing and marketing of pomegranate in the Mediterranean region: Advances in research and technology; Melgarejo, P.; Martínez-Nicolás, J.J.; Martínez-Tomé, J., Editori; CIHEAM: Zaragoza, Spain, 2000; p. 123-127.
117. Nakajima, J.; Tanaka, I.; Seo, S.; Yamazaki, M.; SaitoK. LC/PDA/ESI-MS Profiling and Radical Scavenging Activity of Anthocyanins in Various Berries. J. Biomed. Biotechnol. 2004, 5, 241–247, DOI: 10.1155/S1110724304404045.
118. Pu Jing, M.S. Purple corn anthocyanins: Chemical structure, chemoprotective activity and structure/function relationships. Dissertation, Ohio State University, Columbus, USA, 2006.
119. Liu, X.; Xiao, G.; Chen, W.; Xu, Y.; Wu, J. Quantification and Purification of Mulberry Anthocyanins with Macroporous Resins. J. Biomed. Biotechnol. 2004, 5, 326–331, DOI: 10.1155/S1110724304403052.
120. Baerle, A. Studiu privind separarea și stabilizarea coloranților antocianici din Aronia Melanocarpa. Thesis, Universitatea Tehnică a Moldovei, Chișinău, Moldova, 2006.
121. Santos-Buelga, C.; Williamson, G. Methods in Polyphenol Analysis; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, UK, 2003.
122. Grigelmo-Miguel, N.; Rojas-Gräu, M.A.; Soliva-Fortuny, R.; Martín-Belloso, O. Methods of Analysis of Antioxidant Capacity of Phytochemicals. In Fruit and Vegetable Phytochemicals: Chemistry, Nutritional Value and Stability; de la Rosa, L.A.; Alvarez-Parrilla, E.; Gonzalez-Aguilar, G.A. , Editori; Wiley-Blackwell: Ames, Iowa, USA, 2010.
123. Blois, M.S. Antioxidant detrminations by the use of a stable free radical. Nature 1958, 181, 1199-1200, DOI: 10.1038/1811199a0.
124. Brand-Williams, W.; Cuvelier, M.E.; Berset, C. Use of a free radical to evaluate antioxidant activity. LWT – Food Sci. Technol. 1995, 28, 25-30, DOI: 10.1016/S0023-6438(95)80008-5.
125. Calliste, C.A.; Trouillas, P.; Allais, D.P.; Simon, A.; Duroux, J.L. Free Radical Scavenging Activities Measured by Electron Spin Resonance Spectroscopy and B16 Cell Antiproliferative Behaviors of Seven Plants.J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 3321-3327, DOI: 10.1021/jf010086v.
126. Magalhães, L.M.; Segundo, M.A.; Reis, S.; Lima, J.L.F.C. Methodological aspects about in vitro evaluation of antioxidant properties. Anal. Chim. Acta 2008, 613, 1-19, DOI: 10.1016/j.aca.2008.02.047.
127. Milardović, S.; Ivekovic, D.; Grabarić, B.S. A novel amperometric method for antioxidant activity determination using DPPH free radical. Bioelectrochemistry 2006, 68, 175-180, DOI: 10.1016/j.bioelechem.2005.06.005.
128. Sánchez-Moreno, C.; Larrauri, J.A.; Saura-Calixto, F. A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols. J. Sci. Food Agric. 1998, 76, 270-276, DOI: 10.1002/(SICI)1097-0010(199802)76:2<270::AID-JSFA945>3.0.CO;2-9.
129. Magalhães, L.M.; Segundo, M.A.; Reis, S.; Lima, J.L.F.C. Automatic method for determination of total antioxidant capacity using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. Anal. Chim. Acta 2006, 558, 310-318, DOI: 10.1016/j.aca.2005.11.013.
130. Molyneux, P. The use of the stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol. 2004, 26, 211-219.
131. Sánchez-Moreno, C. Review: Methods used to evaluate the free radical scavenging activity in foods and biological systems. Food Sci. Technol. Int. 2002, 8, 121-137, DOI: 10.1106/108201302026770.
132. Miller, N.J.; Rice-Evans, C.; Davies, M.J.; Gopinathan, V.; Milner, A. A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clin. Sci. 1993, 84, 407–412, DOI: 10.1042/cs0840407.
133. Cao, G.; Prior, R.L. Comparison of different analytical methods for assessing total antioxidant capacity of human serum. Clin. Chem. 1998, 44, 1309-1315.
134. Re, R.; Pellegrini, N.; Proteggente, A.; Pannala, A.; Yang, M.; Rice-Evans, C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Biol. Med. 1999, 26, 1231–1237, DOI: 10.1016/S0891-5849(98)00315-3.
135. Kim, D.O.; Lee, K.W.; Lee, H.J.; Lee, C.Y. Vitamin C Equivalent Antioxidant Capacity (VCEAC) of Phenolic Phytochemicals. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3713-3717, DOI: 10.1021/jf020071c.
136. Kim, D.O.; Lee, C.Y. Comprehensive study on Vitamin C Equivalent Antioxidant Capacity (VCEAC) of various polyphenolics in scavenging a free radical and its structural relationship. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2004, 44, 253-273, DOI: 10.1080/10408690490464960.
137. Ozgen, M.; Reese, R.N.; Tulio Jr, A.Z.; Scheerens, J.C.; Miller R. Modified 2,2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) method to measure antioxidant capacity of selected small fruits and comparison to ferric reducing antioxidant power (FRAP) and 2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) methods. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 1151-1157, DOI: 10.1021/jf051960d.
138. Benzie, I.F.F.; Strain, J.J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “Antioxidant power”: The FRAP assay. Anal. Biochem. 1996, 239, 70-76, DOI: 10.1006/abio.1996.0292.
139. Pulido, R.; Bravo, L.; Saura-Calixto, F. Antioxidant activity of dietary polyphenols as determined by a modified ferric reducing/antioxidant power assay. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 3396-3402, DOI: 10.1021/jf9913458.
140. Pokorny, J.; Yanishlieva, N.; Gordon, M. Antioxidants in Food, Practical Application; Woodhead Publishing Limited: Abington Hall, England, 2001.
141. Waterhouse, A.L. Unit I1.1. Polyphenolics. Determination of Total Phenolics. In Current Protocols in Food Analytical Chemistry; John Wiley & Sons, Inc.: New York, USA, 2002; p. I1.1.1-I1.1.8.
142. Djeridane, A.; Yousfi, M.; Nadjemi, B.; Boutassouna, D.; Stocker, P.; Vidal, N. Antioxidant activity of some algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds. Food Chem. 2006, 97, 654-660, DOI: 10.1016/j.foodchem.2005.04.028.
143. Katalinic, V.; Milos, M.; Kulisic, T.; Jukic, M. Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols. Food Chem. 2006, 94, 550-557, DOI: 10.1016/j.foodchem.2004.12.004.
144. Wojdyło, A.; Oszmianski, J.; Czemerys, R. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chem. 2007, 105, 940-949, DOI: 10.1016/j.foodchem.2007.04.038.
145. Bratosin, D. Explorarea structurii și funcțiilor celulare prin citometrie în flux; "Vasile Goldiș" University Press: Arad, Romania, 2007.
146. Zihlif, M.; Afifi, F.; Abu-Dahab, R.; Abdul Majid, A.M.; Somrain, H.; Saleh, M.M.; et al. The antiangiogenic activities of ethanolic crude extracts of four Salvia species. BMC Complement. Altern. Med. 2013, 13, 358, DOI: 10.1186/1472-6882-13-358.
147. Tayarani-Najaran, Z.; Asili, J.; Aioubi, E.; Emami, S.A. Growth Inhibition and Apoptosis Induction of Salvia chloroleuca on MCF-7 Breast Cancer Cell Line. Iran J. Pharm. Res. 2013, 12, 789-799.
148. Garcia, C.S.; Menti, C.; Lambert, A.P.; Barcellos, T.; Moura, S.; Calloni, C.; et al. Pharmacological perspectives from Brazilian Salvia officinalis (Lamiaceae): antioxidant, and antitumor in mammalian cells. An. Acad. Bras. Cienc. 2016, 88, 281-292, DOI: 10.1590/0001-3765201520150344.
149. Parsaee, H.; Asili, J.; Mousavi, S.H.; Soofi, H.; Emami, S.A.; Tayarani-Najaran, Z. Apoptosis Induction of Salvia chorassanica Root Extract on Human Cervical Cancer Cell Line. Iran. J. Pharm. Res. 2013, 12, 75-83.
150. Chuang, M.T.; Ho, F.M.; Wu, C.C.; Zhuang, S.Y.; Lin, S.Y.; Suk, F.M.; Liang, Y.C. 15,16-Dihydrotanshinone I, a Compound of Salvia miltiorrhiza Bunge, Induces Apoptosis through Inducing Endoplasmic Reticular Stress in Human Prostate Carcinoma Cells. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2011, 2011, 865435, DOI: 10.1155/2011/865435.
151. Jantova, S.; Hudec, R.; Sekretar, S.; Kucerak, J.; Melusova, M. Salvia officinalis L. extract and its new food antioxidant formulations induce apoptosis through mitochondrial/caspase pathway in leukemia L1210 cells. Interdiscip. Toxicol. 2014, 7, 146-153, DOI: 10.2478/intox-2014-0020.
152. Zhao, Q.; Huo, X.C.; Sun, F.D.; Dong, R.Q. Polyphenol-rich extract of Salvia chinensis exhibits anticancer activity in different cancer cell lines, and induces cell cycle arrest at the G(0)/G(1)-phase, apoptosis and loss of mitochondrial membrane potential in pancreatic cancer cells. Mol. Med. Rep. 2015, 12, 4843-4850, DOI: 10.3892/mmr.2015.4074.
153. Zare Shahneh, F.; Valiyari, S.; Baradaran, B.; Abdolalizadeh, J.; Bandehagh, A.; Azadmehr, A.; Hajiaghaee, R. Inhibitory and cytotoxic activities of Salvia Officinalis L. Extract on human lymphoma and leukemia cells by induction of apoptosis. Adv. Pharm. Bull. 2013, 3, 51-55, DOI: 10.5681/apb.2013.009.
154. de Sousa, A.C.; Alviano, D.S.; Blank, A.F.; Alves, P.B.; Alviano, C.S.; Gattass, C.R. Melissa officinalis L. essential oil: antitumoral and antioxidant activities. J. Pharm. Pharmacol. 2004, 56, 677-681, DOI: 10.1211/0022357023321.
155. Encalada, M.A.; Hoyos, K.M.; Rehecho, S.; Berasategi, I.; de Ciriano, M.G.; Ansorena, D.; et al. Anti-proliferative effect of Melissa officinalis on human colon cancer cell line. Plant Foods Hum. Nutr. 2011, 66, 328-334, DOI: 10.1007/s11130-011-0256-y.
156. Weidner, C.; Rousseau, M.; Plauth, A.; Wowro, S.J.; Fischer, C.; Abdel-Aziz, H.; Sauer, S. Melissa officinalis extract induces apoptosis and inhibits proliferation in colon cancer cells through formation of reactive oxygen species. Phytomedicine 2015, 22, 262-270, DOI: 10.1016/j.phymed.2014.12.008.
157. Saraydin, S.U.; Tuncer, E.; Tepe, B.; Karadayi, S.; Ozer, H.; Sen, M.; et al. Antitumoral effects of Melissa officinalis on breast cancer in vitro and in vivo. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2012, 13, 2765-2770, DOI: 10.7314/APJCP.2012.13.6.2765.
158. Jahanban-Esfahlan, A.; Modaeinama, S.; Abasi, M.; Abbasi, M.M.; Jahanban-Esfahlan, R. Anti Proliferative Properties of Melissa officinalis in Different Human Cancer Cells. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2015, 16, 5703-5707, DOI: 10.7314/APJCP.2015.16.14.5703.
159. Marrassini, C.; Anesini, C.; Ferraro, G. HPLC fingerprint of a flower extract of Tilia x viridis and correlation with antiproliferative and antioxidant activity. Phytother. Res. 2011, 25, 1466-1471, DOI: 10.1002/ptr.3444.
160. Kim, K.H.; Moon, E.; Kim, S.Y.; Choi, S.U.; Lee, K.R. Lignan constituents of Tilia amurensis and their biological evaluation on antitumor and anti-inflammatory activities. Food Chem. Toxicol. 2012, 50, 3680-3686, DOI: 10.1016/j.fct.2012.07.014.
161. Bounaama, A.; Enayat, S.; Ceyhan, M.S.; Moulahoum, H.; Djerdjouri, B.; Banerjee, S. Ethanolic Extract of Bark from Salix aegyptiaca Ameliorates 1,2-dimethylhydrazine-induced Colon Carcinogenesis in Mice by Reducing Oxidative Stress. Nutr. Cancer 2016, 68, 495-506, DOI: 10.1080/01635581.2016.1152379.
162. Sultana, S.; Saleem, M. Salix caprea inhibits skin carcinogenesis in murine skin: inhibition of oxidative stress, ornithine decarboxylase activity and DNA synthesis. J. Ethnopharmacol. 2004, 91, 267-276, DOI:10.1016/j.jep.2003.12.028.
163. Enayat, S.; Ceyhan, M.S.; Basaran, A.A.; Gursel, M.; Banerjee, S. Anticarcinogenic effects of the ethanolic extract of Salix aegyptiaca in colon cancer cells: involvement of Akt/PKB and MAPK pathways. Nutr. Cancer 2013, 65, 1045-1058, DOI: 10.1080/01635581.2013.850966.
164. Enayat, S.; Banerjee, S. The ethanolic extract of bark from Salix aegyptiaca L. inhibits the metastatic potential and epithelial to mesenchymal transition of colon cancer cell lines. Nutr. Cancer 2014, 66, 999-1008, DOI: 10.1080/01635581.2014.936949.
165. Bornsek, S.M.; Ziberna, L.; Polak, T.; Vanzo, A.; Ulrih, N.P.; Abram, V.; et al. Bilberry and blueberry anthocyanins act as powerful intracellular antioxidants in mammalian cells. Food Chem. 2012, 134, 1878-1884, DOI:10.1016/j.foodchem.2012.03.092.
166. Chu, W.; Cheung, S.C.M.; Lau, R.A.W.; Benzie, I.F.F. Bilberry (Vaccinium myrtillus L.). In Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects, ed. 2; Benzie, I.F.F.; Wachtel-Galor, S., Editori; CRC Press/Taylor & Francis: Boca Raton, USA, 2011, Chapter 4.
167. Nguyen, V.; Tang, J.; Oroudjev, E.; Lee. C.J.; Marasigan, C.; Wilson, L.; Ayoub, G. Cytotoxic effects of bilberry extract on MCF7-GFP-tubulin breast cancer cells. J. Med. Food. 2010, 13, 278-285, DOI: 10.1089/jmf.2009.0053.
168. Svobodova, A.; Zdarilova, A.; Vostalova, J. Lonicera caerulea and Vaccinium myrtillus fruit polyphenols protect HaCaT keratinocytes against UVB-induced phototoxic stress and DNA damage. J. Dermatol. Sci. 2009, 56, 196-204, DOI: 10.1016/j.jdermsci.2009.08.004.
169. Franco, P.; Potenza, I.; Moretto, F.; Segantin, M.; Grosso, M.; Lombardo, A.; et al. Hypericum perforatum and neem oil for the management of acute skin toxicity in head and neck cancer patients undergoing radiation or chemo-radiation: a single-arm prospective observational study. Radiat. Oncol. 2014, 9, 297, DOI: 10.1186/s13014-014-0297-0.
170. He, M.; Wang, Y.; Hua, W.; Zhang, Y.; Wang, Z. De novo sequencing of Hypericum perforatum transcriptome to identify potential genes involved in the biosynthesis of active metabolites. PLoS One 2012, 7, e42081, DOI: 10.1371/journal.pone.0042081.
171. Kleemann, B.; Loos, B.; Scriba, T.J.; Lang, D.; Davids, L.M. St John's Wort (Hypericum perforatum L.) photomedicine: hypericin-photodynamic therapy induces metastatic melanoma cell death. PLoS One 2014, 9, e103762, DOI: 10.1371/journal.pone.0103762.
172. Wölfle, U.; Seelinger, G.; Schempp, C.M. Topical application of St. John's wort (Hypericum perforatum). Planta Med. 2014, 80, 109-120, DOI: 10.1055/s-0033-1351019.
173. Mirmalek, S.A.; Azizi, M.A.; Jangholi, E.; Yadollah-Damavandi, S.; Javidi, M.A.; Parsa, Y.; et al. Cytotoxic and apoptogenic effect of hypericin, the bioactive component of Hypericum perforatum on the MCF-7 human breast cancer cell line. Cancer Cell Int. 2015, 16, 3, DOI: 10.1186/s12935-016-0279-4.
174. von Schoen-Angerer, T.; Wilkens, J.; Kienle, G.S.; Kiene, H.; Vagedes, J. High-Dose Viscum album Extract Treatment in the Prevention of Recurrent Bladder Cancer: A Retrospective Case Series. Perm. J. 2015, 19, 76-83, DOI: 10.7812/TPP/15-018.
175. Steele, M.L.; Axtner, J.; Happe, A.; Kroz, M.; Matthes, H.; Schad, F. Use and safety of intratumoral application of European mistletoe (Viscum album L) preparations in Oncology. Integr. Cancer Ther. 2015, 14, 140-148, doi: 10.1177/1534735414563977.
176. Saha, C.; Hegde, P.; Friboulet, A.; Bayry, J.; Kaveri, S.V. Viscum album-mediated COX-2 inhibition implicates destabilization of COX-2 mRNA. PLoS One 2015, 10, e0114965, DOI: 10.1371/journal.pone.0114965.
177. Hunziker-Basler, N.; Zuzak, T.J.; Eggenschwiler, J.; Rist, L.; Simões-Wüst, A.P.; Viviani, A. Prolonged cytotoxic effect of aqueous extracts from dried Viscum album on bladder cancer cells. Pharmazie 2007, 62, 237-238, DOI: 10.1691/ph.2007.3.6765.
178. Bauer, C.; Oppel, T.; Rueff, F.; Przybilla, B. Anaphylaxis to viscotoxins of mistletoe (Viscum album) extracts. Ann. Allergy Asthma Immunol. 2005, 94, 86-89, DOI: 10.1016/S1081-1206(10)61291-4.
179. Kirsch, A. Successful treatment of metastatic malignant melanoma with Viscum album extract (Iscador M). J. Altern. Complement. Med. 2007, 13, 443-445, DOI: 10.1089/acm.2007.6175.
180. Fronza, M.; Heinzmann, B.; Hamburger, M.; Laufer, S.; Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 2009, 126, 463-467, DOI: 10.1016/j.jep.2009.09.014.
LISTA DE PUBLICAȚII(Cambria, 22, Bold, Majuscule)
Articole publicate in extenso ca rezultat al cercetării doctorale(Cambria, 18, Bold, Minuscule)
(Cambria, 12)
1. Evaluation of Antioxidant Activity and Phenolic Content of 13 Selected Herbs from Romania—Ancuta Ioana Isaia(Oarcea),Adina Cata,Neli-Kinga Olah, Mariana Nela Stefanut,Ioana Maria Carmen Ienascu,Daniela Bratosin.—Revista de Chimie in curs de publicare
Study production of free radicals during the accelerated aging– Ancuta Ioana Isaia(Oarcea),Claudiu Morgovan ,Neli-Kinga Olah, Osser Gyongyi,Ioana Maria Carmen Ienascu,Daniela Bratosin.—Revista NOTULAE BOTANICAE HORTI AGROBOTANICI CLUJ – NAPOCA–in curs de publicare
3. Study of cell viability using the best indicator Calcein AM Ancuta Ioana Isaia(Oarcea), Osser Gyongyi,AnamariaPallag ,Daniela Bratosin –INDIAN JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES– in curs de publicare
Conferinte:
1. Ienașcu, I. M. C., Oarcea (Isaia) A. I., Căta, A., Olah, N.K., Ștefănuț, M. N., Bratosin, D., The correlation between the phenolic content and antioxidant activity of some herbs from Cluj county, Romania, 17th DKMT, “Euroregional Conference on Environment and Health”, June 5-6, 2015, Szeged, Hungary. (poster)
2. Ienașcu I.M.C., Oarcea (Isaia) A.I., Olah N.K., Căta A., Ștefănuț M.N., Characterization of some alcoholic extracts obtained from plants belonging to Lamiaceae family, “The Academic Days of Arad, The 25th Edition”, 14-17 May, 2015, Arad, Romania. (prezentare orala)
3. A. I. Isaia, D. Bratosin, N. Olah, I. Ienascu, Plant polyphenols effect on canncer cells, “The Academic Days of Arad, The 25th Edition”, 14-17 May, 2015, Arad, Romania. (prezentare orala)
4. Oarcea (Isaia) A.I., Olah N.K, Bratosin D , Ienașcu, I. M. C, Measurement of flow cytometric oxidative activity of extracts, The Municipality of Arad Culture Center, "Vasile Goldis" Western University of Arad
Autor 1, A.B.; Autor 2, C.D. Titlul Articolului. Numele jurnaluluiAnul, Volumul, paginație (sau număr de pagini), DOI sau alt cod de identificare (dacă este cazul), Factorul de impact pentru articolele ISI sau bazelede date în care este indexată revista în cazul revistelor BDI.
ANEXE
(Dacă este cazul, Cambria, 22, Bold, Majuscule)
(Cambria, 12, Minuscule)
Nulla eu felis maximus, efficitur mauris quis, vestibulum ipsum. Integer lacinia nisl sem, a pulvinar diam lacinia ac.
Nulla eu felis maximus, efficitur mauris quis, vestibulum ipsum. Integer lacinia nisl sem, a pulvinar diam lacinia ac.
Nulla eu felis maximus, efficitur mauris quis, vestibulum ipsum. Integer lacinia nisl sem, a pulvinar diam lacinia ac.
Nulla eu felis maximus, efficitur mauris quis, vestibulum ipsum. Integer lacinia nisl sem, a pulvinar diam lacinia ac.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: I.O.S.U.D. – Universitatea de Vest Vasile Goldiș din Arad [302598] (ID: 302598)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.