Microscopia holografică digitală [302082]
Universitatea “Politehnica” [anonimizat]. Marian VLĂDESCU Ing. Alexandra Cătălina
CAPĂTĂ
2017
[anonimizat] – Charge-[anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – [anonimizat] – Holografia digitala de defazare
INTRODUCERE
Lucrarea de față iși propune să prezinte principalele aspecte teoretice și practice în domeniul microscopiei holografice digitale. Conținutul lucrării prezintă ce este o hologramă, [anonimizat], precum și aplicații în domeniul microscopiei holografice digitale. [anonimizat] o [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat], medicină și inginerie.
[anonimizat]. [anonimizat] a hologramei înregistrate. Astfel, [anonimizat], se face numeric cu ajutorul calculatorului și poate furniza informații tridimensionale ale suprafeței obiectului sau datele grosimii optice.
CAPITOLUL 1 – Introducere in holografia digitală
1.1 [anonimizat], în 1947. Cuvântul de “ hologramă” este derivat din cuvintele grecești “holos”, care înseamnă “întreg” sau “complet” și “gram”, care înseamnă “mesaj”. Teoria holografiei a [anonimizat]. Teoria sa a avut la origine intenția sa de a crește rezoluția microscoapelor electronice. Dennis Gabor a demonstrat teoria sa cu fasciculul de lumină nu cu ajutorul fasciculului electronic. Rezultatul a fost prima hologramă care a fost realizată vreodată. [anonimizat], deoarece acesta nu a avut la dispoziție o [anonimizat] a realiza o imagine contrastantă, o [anonimizat] n-a folosit fascicul în afara axei fasciculului de referință. Ar fi avut nevoie de o alta sursă de lumină și anume: laser-ul, care a devenit operațional în 1960.
1.2 Principii generale ale holografiei digitale
Conceptul de hologramă digitală înregistrată este ilustrat în figura 1.1(a). [anonimizat] (Dispozitiv cu cuplaj de sarcină). Holograma rezultată este electronic înregistrată și păstrată. Obiectul este în general un corp tridimensional cu o suprafață reflectatându-se difuz, localizat la o distanță de la CCD.
În reconstucția optică imaginea virtuală apare la poziția originală a obiectului și imaginea reală este formată tot la distanță , dar în direcția opusă de la CCD, vezi figura 1.1(b).
Difracția undei de lumină la o deschizătură (în acest caz o hologramă) care este montată perpendicular pe fascicolul produs este descris de integrala Fresnel/Kirchhoff.
(1.1)
Cu
(1.2)
Unde este funcția hologramei și este distanța dintre un punct în planul hologramei și un punct în planul reconstruit. Cantitățile geometrice sunt explicate în figura 1.2. Factorul de înclinare este setat 1, deoarece unghiurile și sunt aproximativ 0. Acesta este valabil pentru toate algoritmele reconstruite numeric.
Pentru unda planului de referință este dată simplu de amplitudinea reală:
(1.3)
Modelul de difracție este calculat la o distantă în spatele planului CCD, ceea ce înseamnă că se reconstruiește amplitudinea complexă în planul imaginii reale.
Ecuația (1.1) este baza pentru reconstruirea hologramei numerice. Deoarece planul undei reconstruite este o funcție complexă, ambele intensități ca și faza pot fi calculate. Acesta este în contrast cu cazul reconstruirii hologramei optice, în care doar intensitatea este facută vizibilă. Această interesantă proprietate a holografiei digitale este utilizată în interferometria holografică digitală.
Figura 1.1 Holografia digitală
Înregistrarea
Reconstruirea cu unda de referință
Reconstruirea cu unda conjugată de referință
Figura 1.2 Sistemul de coordonate pentru reconstruirea hologramei numerice.
Reconstrucția unei imagini reale nedistorsionate în holografia digitală este necesară pentru a insera în loc de în ecuația 1.1:
(1.4)
(1.5)
Această schemă de recontruire este arătată în figura 1.1(c). Imaginea reală apare în acea poziție, unde obiectul a fost localizat în timpul înregistrării. Trebuie menționat că pentru planul de referință a undei definit în ecuația 1.3 ambele formule de reconstruire, ecuația (1.1) și (1.4) sunt echivalente deoarece .
Configurarea din figura 1.1 cu planul de referință a undei care influențează perpendicular pe CCD este deseori utilizat în holografia digitală.
Reconstruirea imaginii virtuale este de asemenea posibilă prin introducerea proprietățile imaginii a unor lentile în procesul de reconstrucție numerică. Aceste lentile corespund cu lentilele de ochi a unui observator care privește printr-o reconstruire optică a hologramei. În cel mai simplu caz aceste lentile cu distanța focală sunt considerate de un factor complex:
(1.6)
Figura 1.3 Reconstruirea imaginii virtuale
Pentru o mărire de 1 a distanței focale de trebuie sa fie utilizată.
Lentilele descrise de ecuația (1.6) cauzează aberări ale fazei, care pot fi corectate înmulțind planul undei reconstuite cu un factor:
(1.7)
Formula completă pentru recontruirea printre lentilele virtuale cu este deci:
(1.8)
Reconstruirea hologramei digitale se realizeaza cu ajutorul aproximării Fresnel.
Pentru valorile și precum și pentru valorile și , care sunt mici comparate cu distanța dintre planul de recontruire și CCD, expresia ecuației (1.5) poate fi dezvoltată în serii Taylor:
(1.9)
Al patrulea termen poate fi neglijat, dacă este mic în comparație cu lungimea de undă:
(1.10)
Sau
(1.11)
Atunci distanța constă în termeni liniari și pătratici :
(1.12)
Cu aproximarea adunată prin înlocuirea numitoruluiîn 1.4 de în expresia următoare rezultă pentru reconstruirea imaginii reale:
(1.13)
Dacă înmulțirile în argumentul exponențialei de sub integrală sunt scoase, una e:
(1.14)
Această ecuație se numește Aproximare Fresnel sau Transformare Fresnel datorită similarității matematice cu Transformata Fourier. Este necesară reconstruirea câmpul undei în planul din spatele hologramei, în acest caz în planul imaginii reale.
Intensitatea este calculată prin ridicarea la pătrat:
(1.15)
(1.16)
Re este partea reală și Im partea imaginară.
Formula de reconstruire pentru imaginea virtuală în aproximarea Fresnel este:
(1.17)
Pentru digitalizarea trasformării Fresnel ecuația (1.14) următoarele subtituiri sunt introduse:
(1.18)
Ecuația (1.14) devine :
(1.19)
O comparație a ecuației (1.19) cu definiția bidimensională a trasformatei Fourier arată ca aproximarea Fresnel până la un factor de fază sferică este Transformata inversă Fourier a funcției
:
(1.20)
Funcția poate fi digitalizată dacă funcția hologramei este eșantionat pe un raster dreptunghiular de puncte, cu pași și de-a lungul coordonatelor. și sunt distanțele dintre pixelii vecini pe CCD în direcția orizontală și verticală. Cu aceste valori discrete a integralei din (1.19) sunt convertite în sume finite:
(1.21)
Pentru
Conform teoriei Transformatei Fourier alături de și urmatoarea relație există:
(1.22)
După resubstituire:
(1.23)
Utilizând aceste ecuații (1.21) se convertesc în:
(1.24)
Aceasta este trasformata Fresnel discretă. Matricea este calculată prin înmulțirea lui cu și și aplicând inversa transformatei Fourier discrete produsului. Calculul făcut cel mai eficient utilizând algoritmul Trasformatei Fourier Rapidă(FFT). Factorul din fața sumei doar afectează faza globală și poate fi neglijat, dacă doar intensitatea conform ecuației (1.15) este cea mai importantă. Aceasta de asemenea în cazul diferenței de fază dintre hologramele înregistrate cu aceași lungime de undă trebuie să fie calculate .
Formula discretă corespunzătoare pentru reconstruire în direcția lentilelor virtuale cu (Ecuația 1.17) este:
(1.25)
O hologramă digitală tipică este aratată în figura 1.4. A fost înregistrat cu geometria figurii 1.1. Obiectul este plasat departe de matricea CCD-ului de 1024 pixeli cu distanțe între pixeli de de . Lungimea de undă este 632.8nm. Reconstruirea numerică conform ecuației (1.14) respectiv (1.24) este demonstrată în figura 1.5. Imaginea reală a unui zar utilizat ca obiect este observabilă. Partea mai luminată din centre este unda reconstruită nedifractată și corespunde cu primul termen din partea dreapta a ecuației (1.6). Deoarece geometria în afara axei imaginii este spatial separată de la ordinea termenului zero. Cealaltă imagine (virtuală) este în afara focalizării în aceasta reconstrucție.
O proprietate interesantă a holografiei este aceea că fiecare parte din hologramă conține informații despre întregul obiect. Acest lucru este ilustrat de hologramele din figurile 1.6 și 1.8, unde maști negre acoperă aproape jumătate din suprafețele hologramei. În ciuda faptului acesta întregul cub este vizibil în reconstruirile fără obstacole, figurile 1.7 si 1.9. Maștile sunt vizibile ca niște umbre în odinul temenului zero. Reducerea numărului efectiv de pixeli duce la reducerea rezoluției în imaginile reconstruite. Acesta corespunde măririi petei datorită reducerii deschizăturii în reconstruirea hologramei optice.
Conform ecuației1.23 distanțele pixelilor în imaginea reconstruită și depind de distanta de reconstruire aleasă pentru reconstruirea numerică. Acest lucru se întâmplă deoarecere ecuația (1.23) corespunde rezoluției limitate a difracției sistemelor optice: holograma este deschizătura unui sistem optic cu lungimea laterală . Conform teoriei difracției a unui model difractat se dezvoltă într-o distanță în spatele hologramei. Unde este deci jumătate de diametru din discul aerisit sau diametrul petei în planul imaginii reconstruite, care limitează rezoluția. Acest lucru poate fi privit ca un algoritm de „măsurare naturală”, setând rezoluția imaginii, reconstruite cu o transformare Fresnel discretă, totdeauna la limita fizică.
Figura 1.4 Hologramă digitală
Figura 1.5 Reconstruirea numerică
Figura 1.6 Hologramă digitală mascată
Figura 1.8 Holograma digitală mascată
Figura 1.7 Reconstruirea
Figura 1.9 Reconstruirea
CAPITOLUL 2 – Descrierea microscopiei holografice digitale
2.1 Principiul de bază a microscopiei holografice digitale
O instalare de bază pentru microscopie holografică digitală (MHD) constă dintr-o sursă de iluminare, un interferometru, o cameră de digitizare și un calculator cu programe necesare. Cel mai adesea, un laser este utilizat pentru iluminarea cu coerența necesară pentru a produce interferențe. Au fost utilizate toate tipurile de lasere, de la laserele He-Ne și laserele pompate prin diode, până la laserele YAG dublate (adesea denumite pur și simplu ca un laser în stare solidă solidă), laserele cu argon, lasere cu colorant acordabile și Ti: Safir laser in femtosecunde. Pentru tehnicile cu lungimi de undă multiple, două sau mai multe lasere diferite pot fi cuplate la un interferometru, sau poate fi folosit un laser tunabil.
Există, de asemenea, tehnici de coerență redusă, în scopul reducerii petelor si a zgomotului de interferență, sau generarea de contur sau a imaginilor tomografice.
Fig 2.1 (a)Interferometru Michelson pentru microscopia holografică digitală a specimenului reflectorizant;
(b) Interferometru Mach-Zehnder pentru microscopia holografică digitală a specimenului transmisiv.
BS: Divizor de fascicul luminos; L: lentile.
Poate fi utilizat un laser cu impulsuri scurte (picosecunde sau femtosecunde), sau un laser tunabil poate fi transformat într-o sursă de bandă largă prin eliminarea elementului de reglare. Chiar și un LED are de obicei o lungime de coerență de aproximativ 10 μm, care poate fi suficientă pentru microscopia holografică. DHM utilizând un laser cu infraroșu de 10,6 μm CO2 [33], cu radiații moi profilate UV (193 nm), [34] și 32-nm [35].
Există două tipuri principale de interferometre, interferometrul Michelson pentru obiecte reflectorizante și interferometrul Mach-Zehnder pentru obiecte transmisibile, ele sunt ilustrate în Fig 2.1. În fiecare diagramă, fascicolele verde de lumină reprezintă intrarea de la laser, albastru deschis este calea de referință a fasciculului, iar roșu deschis ilustrează formarea imaginii unui punct de obiect. În ambele modele, obiectul este iluminat cu un plan de undă, iar referința ajunge la planul CCD cu aceeași curbură a frontului de undă ca undă obiect, cu excepția unei deplasări în unghiul de incidență pentru holografia în afara axei. Tipurile de interferometre Mach-Zehnder necesită mai multe componente, dar oferă o mai mare flexibilitate în aliniere, în special atunci când se utilizează optica imagistică microscopică. Interferometrele pot include, de asemenea, diferite deschideri, atenuatoare și optica de polarizare pentru a controla referința și raportul intensității obiectului. Optica de polarizare poate fi utilizată și în scopul explicit al imaginii birefringenței. De asemenea, pot exista diferite tipuri de modulatori, cum ar fi optica montată pe piezo, modulatori de fază cristalină lichidă, modulatori acuso-optici sau electro-optici pentru a stabili semnale modulate. Pentru mărire se pot utiliza tehnici precum configurația holografică Fourier [36] fără lentile [36], dar în practică mărirea realizabilă este limitată și este preferată și necesară o mărire explicită a obiectivelor cu obiectiv microscopic. Un alt obiectiv poate fi utilizat în brațul de referință pentru a se potrivi cu curburile obiectului și a fazelor de referință de referință.
Fig. 2.2 Procesul de microscopie holografică digitală (ținta de rezoluție) FOV(Câmpul de vizualizare)= 200 × 150 μm, 1024 ×768 pixeli:
(a) holograma, cu detaliile prezentate în figură;
(b) spectrul unghiular, cu galben încovoiat zona trece-filtru pentru reconstrucție;
(c) imaginea amplitudinii;
(d) imaginea de fază.
Există multe tehnici versatile în holografia digitală care compensează diferitele tipuri de aberații și imperfecțiuni ale sistemului optic și, prin urmare, în comparație cu holografia convențională, cerințele optice și mecanice pot fi semnificativ mai puțin stricte.
De obicei, pentru captarea și digitalizarea unui model de interferență holografică se foloseste un aparat de fotografiat CCD sau, mai recent, a camerelor CMOS.
Dimensiunea pixelilor acestor dispozitive este de câteva microni cu număr de pixeli de aproximativ 10002. Acești parametri sunt principalii factori limitativi în rezoluția MHD și prescriu gama de aplicații, dar se așteaptă ca aceștia să continue să se îmbunătățească în următorii ani. Modelul de holograme capturat este digitizat de aparatul de fotografiat sau dintr-un dispozitiv de preluare a cadrelor și este introdus în calculator ca o matrice de 2-D de întregi cu rezoluție de 8 biți sau mai mare în tonuri de gri. Sarcina principală a calculatorului este să efectueze difracția numerică pentru a calcula imaginea holografică ca o serie de numere complexe 2-D. În plus, programul de calculator gestionează un număr de alte sarcini, cum ar fi pre și post procesarea imaginilor, redarea și stocarea imaginilor, precum și sincronizare sau alte controale necesare ale aparatului.
Un exemplu de proces MHD este prezentat în Fig. 2.2 folosind o tinta de rezolutie cu camp de vedere (FOV = 200 × 150 μm2). Figura 2.2 (a) este hologramă, cu detaliile afișate în inserție, unde sunt vizibile marginile de interferență. Figura 2.2 (b) este spectrul unghiular (transformarea Fourier), care prezintă picurile de imagine de ordin zero și cele două imagini. Unul dintre termenii gemeni este selectat cu un filtru de banda numeric (cerc galben). Holograma filtrată este apoi utilizată pentru difracția numerică pe o distanță corespunzătoare, ceea ce are ca rezultat imaginea holografică reconstruită ca o matrice 2-D de numere complexe. Imaginile de amplitudine și de fază din 2.2 (c), 2.2 (d), se obțin prin luarea mărimii absolute și a fazei matricei complexe. Imaginea de fază reprezintă un profil de fază al câmpului optic reflectat de suprafața obiectului sau transmis printr-o grosime a unui obiect transparent. Profilul de fază are precizia unei fracții de lungime de undă optică și, prin urmare, prezintă variații nanometrice ale suprafeței sau grosimea optică a specimenului. În Fig. 2.2 (d), un fel de scame minuscule sunt vizibile, aparent o parte din grosimea lungimii de undă, pe care imaginea de amplitudine o pierde complet. Scara de culori a imaginii fazelor este de 2π de la albastru la roșu. Suprafața obiectului este ușor înclinată față de frontul de referință al undei și astfel de aberații pot fi compensate prin tehnici numerice descrise ulterior.
O trăsătură distinctivă a holografiei este conținutul 3-D al informațiilor despre imagine.
În MHD, o singură hologramă este utilizată pentru a reconstrui câmpul optic la orice distanță de hologramă, în limita metodei de aproximare folosită. De exemplu, Fig. 2.3(a) prezintă o hologramă a unui parametric. Din holograma unică, imaginea se calculează la distanțe diferite, care apoi sunt asamblate într-un clip video din 2.3(b). Afișează imaginea parametric care trece printr-o focalizare optimă, precedată și urmată de imagini mai defocalizate, emulate rotirea unui buton de focalizare pe un microscop convențional. În Fig. 2.4(a), sunt capturate o serie de holograme ale unui parameci viu și mai multor euglene. În scenă, parameciu și euglenele înoată nu numai în direcții laterale, ci și în adâncimi variate. În microscopia video convențională, planul focal ar fi fost fixat și orice s-ar întâmpla să se afle în acest plan ar fi înregistrat, dar informațiile despre obiecte care nu se află în planul focal ar fi pierdute definitiv. Cu MHD, filmul holografic este procesat prin calcularea imaginilor în timp ce se ajustează distanțele de reconstrucție pentru a urmări un anumit specimen în timp ce înconjoară în sus și în jos volumul de obiecte 3D.
Filmele imaginilor de amplitudine și de fază astfel calculate sunt prezentate în Fig. 2.4 (b) și 2.4 (c) și respectiv. În realitate, filmul holografic este o înregistrare completă a spațiului 4-D a volumului obiectului.
Fig. 2.3 Focalizare numerică MHD pe parameciu
(a) o singură hologramă capturată de aparatul de fotografiat (FOV = 250 × 250 μm, 464 × 464 pixeli);
(b) video dintr-o serie de imagini holografice calculate la diferite distanțe.
Fig. 2.4 Filme holografice de parameciu și euglenă:
(a) holograme (video);
(b) imagini de amplitudine (video);
(c) imagini de fază (video). (FOV = 250 × 250 μm, 464 × 464 pixeli).
2.2 Microscopia de fază cantitativă
Multe probe biologice microscopice, cum ar fi celulele vii și componentele lor intracelulare, sunt în mare parte transparente și, prin urmare, problematice pentru microscopia cu câmpuri luminoase convenționale. Au fost dezvoltate mai multe tehnici pentru a face vizibile obiecte de fază transparentă [37] care au jucat roluri foarte importante în dezvoltarea biologiei și medicinii moderne.
De exemplu, în microscopia cu câmp întunecat, numai centrele și limitele de împrăștiere contribuie la semnalul imaginii cu un fundal zero. În microscopul cu contrast de fază Zernike, variația fazei este transformată în variație de amplitudine prin utilizarea unei plăci de fază și a unei filtrări spațiale. În microscopia de contrast cu interferență diferențială (DIC), interferența a Două componente de polarizare prin retezare are ca rezultat imagini care au un efect de umbră și astfel oferă o percepție 3-D asupra obiectului. Microscopia cu interferențe, utilizând un obiectiv Michelson, de exemplu, produce bretele de grosime egală cu un obiect transparent. Deși aceste tehnici sunt eficiente în a face vizibile obiecte transparente, conversia de la fază la amplitudine este neliniară și există artefacte semnificative în imagini cum ar fi halo-ul în contrastul fazei Zernike și dispariția contrastului de-a lungul direcției perpendiculare pe retezare în DIC. Aceste tehnici nu produc imagini faze cantitative.
Fig. 2.5 Procesul de microscopie holografică digitală (celule de ceapă) (FOV = 100 × 100 μm, 416 × 416 pixeli):
(a) holograma;
(b) spectrul unghiular;
(c) imaginea amplitudinii;
(d) Imaginea fazei;
(f) imaginea de fază în vizualizarea pseudo-3-D.
Faza optică a luminii transmise prin obiecte transparente poate transmite informații cantitative despre obiect, cum ar fi grosimea fizică și indexul de refracție [38], care la rândul lor sunt funcții de densitate fizică sau proprietăți de concentrare chimică. Măsurătorile de mare precizie ale fazei optice pot evidenția modificări subtile ale acestor parametri care însoțesc procesele celulare. Pentru a obține imagini de fază cantitativă, se poate efectua o măsurare interferometrică a unui fascicul de lumină concentrat asupra unui obiect și se poate scana fasciculul peste obiect în mod raster. Profilele optice bazate pe interferometre de scanare sunt deosebit de potrivite pentru aplicațiile imagistice în știința materialelor, ca în MEMS și nanofabricare, datorită gradului de înaltă precizie obținut și naturii statice a obiectelor care sunt înregistrate [39,40].
Pe de altă parte, constrângerile de viteză și complexitatea mecanică a interferometrelor de scanare pot restricționa în mod semnificativ gama de aplicații în imagistica biomedicală [41], unde este necesar să se facă observații ale proceselor dinamice în medii foarte diferite. S-au înregistrat unele evoluții recente în microscopia cu fază cantitativă 2-D.
În microscopia de interferență cu schimbarea fazelor [42,43], imaginea cantitativă a fazei se obține dintr-o combinație de trei sau mai multe interferograme. Există, de asemenea, o metodă non-interferometrică de extragere a imaginilor de fază cantitativă de la proprietățile de focalizare diferențială ale imaginilor cu intensitate luminoasă în câmp [44,45].
Holografia digitală este un proces foarte eficient pentru obținerea unei microscopii cu fază cantitativă de înaltă precizie. Imaginea de fază este imediat și direct disponibilă de îndată ce se calculează matrice complexă 2-D a imaginii holografice. Este necesară o singură expunere holografică. Nu implică scanarea raster. Cel mai important, imaginea de fază este o reprezentare cantitativă a profilului obiectului cu precizie nanometrică și chiar subnanometrică [20,21,46-48].
Un exemplu de imagistică MHD a unui strat de celule de ceapă este prezentată în Fig. 7, în care Fig. 2.5 (a) este holograma și fig. 2.5 (b) este spectrul său unghiular. Din cauza structurii specimenului, vârfurile spectrale sunt mai difuze comparativ cu Fig. 2.5. Figura 7 (c) este imaginea de amplitudine, analogă cu ceea ce se vede printr-un microscop convențional și Fig. 2.5 (d) este imaginea de fază. Celulele de ceapă au aparent grosimi de câteva microni și, prin urmare, profilul de fază variază de mai multe cicluri de radiani 2π. Un algoritm de dezvelire în fază de domeniu public este utilizat pentru a elimina discontinuitățile 2π din Fig. 2.5 (e) și este redată în perspectiva pseudocolor pseudo-3-D din Fig. 2.5 (f). Figura 2.5 (f) este pseudo-3-D în sensul că profilul înălțimii aparente este profilul grosimii optice care include atât grosimea fizică, cât și variația indexului și trebuie să fim atenți la interpretarea unei astfel de imagini. Figura 2.6 afișează câteva exemple de imagini cu microscopie în fază cantitativă (QPM) prin MHD. Figura 2.6 (a) este un grup de trei bare pe o tinta de rezolutie. Nivelul de zgomot din zona plană a imaginii este măsurat la 3 nm, iar grosimea filmului de crom este măsurată la aproximativ 50 nm, conform estimării producătorului. Figurile 2.6 (b), 8 (c) sunt celulele SKOV-3 ovariene fixe, unde se pot identifica mai multe componente intracelulare cum ar fi membrana nucleară și cromozomii. Figura 2.6 (d) prezintă mai multe celule roșii sanguine, în timp ce în Fig. 2.6 (e) se observă o pliu a celulei epiteliale a obrazului, precum și nucleul și mitocondriile. Figura 2.6 (f) este o imagine a unui cristal mic de cuarț în nisip comun.
Fig. 2.6 Exemple de microscopie de fază cantitativă prin holografie digitală:
(a) tinta de rezoluție (25 × 25 μm, 452 × 452 pixeli);
(b) celulele ovariene SKOV-3 (60 x 60 pm, 404 × 404 pixeli);
(c) celula ovariană SKOV-3 (60 × 60 pm, 404 × 404 pixeli);
(d) celulele roșii din sânge (50 × 50 μm, 404 × 404 pixeli);
(e) celula epitelială a obrazului (60 × 60 μm, 404 × 404 pixeli);
(f) cristal de cuarț de nisip (60 × 60 μm, 404 × 404 pixeli).
2.3 Comparații ale microscopiei holografice analogice și digitale
Există o serie de diferențe semnificative între hologramele analogice (AH-Analogic Holograms) și digitale(DH – Digital holograms). Cel mai evident, DH nu implică procesarea fotochimică. Prin urmare, DH este ordine de mărime mai rapidă și poate fi efectuată la rate video. Hardware-ul suplimentar necesar în DH este camera CCD și un computer, în timp ce nevoia de facilități camere întunecate și o sursă de produse chimice nu este necesară. Mai mult, datorită sensibilității ridicate a CCD în comparație cu emulsia fotografică, timpul de expunere este redus cu ordine de mărime. De exemplu, o zonă a pixelilor CCD de 100 μm2 poate detecta cât mai puțini fotoni, în timp ce o zonă similară a unei plăci fotosensibile de înaltă sensibilitate necesită milioane de fotoni.
Timpul scurt de expunere la rândul său implică o mult mai redusă cerință privind stabilitatea mecanică a aparatului. Mesele optice grele cu izolare prin vibrații nu sunt adesea critice. Pe de altă parte, problema principală a DH este rezoluția redusă. Un pixel tipic CCD este de mai multe microni, iar granulele pe o emulsie fotografică pot fi de 2 ordine de mărime mai fine. Acest lucru limitează frecvența spațială a marginilor și, prin urmare, mărimea unghiulară a obiectului la câteva grade pentru DH, în timp ce pentru AH este posibil un maxim de 180 de grade. Efectul parallax familiar al hologramelor de afișare ale AH nu este în prezent posibil în DH [49]. Cu toate acestea, rezistența reală a DH este întreaga gamă de tehnici numerice puternice care pot fi aplicate odată ce holograma intră într-un computer. Un exemplu simplu, dar semnificativ, se referă la Fig. 2.1 unde o lentilă este utilizată pentru a mări holograma FOV pentru a se potrivi dimensiunii CCD. Odată ce computerul citește holograma într-o matrice, trebuie doar să specificați dimensiunea FOV și lungimea de undă și să procedați pentru a calcula difracția numerică. Cu toate acestea, în AH, pentru a citi în mod corespunzător holograma mărită sau demagnificată, lungimea de undă trebuie, de asemenea, să fie redusă proporțional, o sarcină foarte greoaie și cea mai puțin posibilă în majoritatea cazurilor. Un alt exemplu este interferometria holografică utilizând mai multe lungimi de undă. În interferometria AH, hologramele multiple sunt produse și repoziționate exact și, în mod ideal, fiecare hologramă trebuie să fie iluminată cu o lungime de undă diferită, care poate fi fizic imposibil. Cel mai adesea hologramele suprapuse sunt iluminate cu o singură lungime de undă, iar aberațiile rezultate sunt inevitabile. Cu toate acestea, în DH, suprapunerea constă pur și simplu dintr-o adăugare de mai multe matrice numerice. Nu există nicio limitare a numărului de tablouri și, în plus, există modalități de preprocesare a rețelelor pentru a compensa aberațiile cromatice și alte aberații dacă sunt prezente. Mai multe exemple de putere de prelucrare numerică în DH vor deveni evidente în următoarele discuții.
Datorită sensibilității sale și a versatilității tehnice, microscopia în fază cantitativă este o zonă foarte importantă și activă de cercetare și aplicații în holografia digitală [20,21,46]. Aberațiile sau alte deformări ale flancurilor de undă pot fi ușor compensate prin utilizarea unui val de referință de potrivire [22,50,51]. Afisarea în fază optică în mai multe lungimi (vezi secțiunea 6.3) permite imagistica nanometrică de fază de precizie pe o gamă de micrometri fără multe probleme asociate cu metodele obișnuite de desfacere a software-ului [23,52]. Aplicația de microscopie biomedicală este o zonă care poate beneficia în mod semnificativ de noile capabilități ale holografiei digitale
Prin furnizarea unor metode de evidentiere a unor modificari subtile in stările fizice si fiziologice ale celulelor si tesuturilor [19,47,53-55], fara etichetari, minim invaziva si extrem de sensibile. Materialele și tehnologiile MEMS pot utiliza, de asemenea, holografia digitală în caracterizarea și testarea diferitelor structuri [56-61].
CAPITOLUL 3 – Difracția numerică
3.1 Metode de difracție numerică
Există o serie de metode diferite pentru calcularea numerică a câmpului de difracție. Precursorii holografiei digitale [13,62] au implicat holografia Fourier și, prin urmare, au necesitat o singură transformare Fourier pentru reconstrucție. Acest lucru a fost semnificativ din cauza limitărilor privind puterea computațională. Mai multe abordări comune în holografia digitală au fost metodele de transformare Fresnel și Huygens, precum și, mai recent, metoda spectrului unghiular [27,63]. Aceste metode sunt strâns legate între ele, iar terminologia nu este uniformă. Metoda de transformare Fresnel este o traducere digitală directă a formulei de difracție Fresnel și, prin urmare, se poate face o comparație directă a datelor digitale.
Rezultate cu expresii analitice, care sunt în mare parte dezvoltate folosind aproximarea Fresnel.
Metodele de convoluție și spectru unghiular Huygens par foarte asemănătoare din punct de vedere analitic, însă implementarea lor digitală duce la diferențe semnificative, după cum se descrie în continuare. Dintre cele trei metode, numai metoda spectrului unghiular nu necesită o distanță minimă de reconstrucție și are alte avantaje. Alte metode de difracție numerică includ abordarea wavelet sau Fresnelet [64,65], transformarea fourieră fracționată pentru sisteme extrem de astigmatice [66-69] și ferestre prin analiza Fourier [70]. Diagrama spațială Wigner este utilizată pentru analiza spațiului-lățime de bandă a formării imaginii holografice [71-73]. Funcția de transfer optic 3-D (OTF) pentru MHD este dată în Ref. 74.
3.1.1 Transformarea Fresnel
Sub aproximația Fresnel, propagarea propagării câmpului optic dintr-un plan ∑0 0 la z = 0 la un alt plan ∑ de-a lungul axei z este dat de ecuatia. (1):
(1)
(2)
Metoda de transformare Fresnel implică, prin urmare, o singură transformare Fourier și poate fi implementată eficient prin utilizarea transformării Fourier rapide (FFT) [14, 27, 46, 75-80]. Pentru calculul numeric, o zonă X0 × Y0 a câmpului de intrare E0 (x0, y0) este probată pe o matrice Nx × Ny cu dimensiunea pixelilor δ x0 × δ y0. Câmpul de ieșire este apoi o altă matrice Nx × Ny cu suprafața X × Y și mărimea pixelilor δx × δy. Un exemplu de difracție numerică prin metoda de transformare Fresnel este prezentat în Fig. 3.1, unde modelul de intrare la z = 0 este litera "F" într-un ecran opac cu o suprafață de 100 × 100 μm2 cu 256 × 256 pixeli, iar lungimea de undă se presupune a fi λ = 0,633 μm.
Fig. 3.1 Difracția numerică prin metoda de transformare Fresnel. Fiecare cadru este de 100 × 100μm2 cu 256 × 256 pixeli. Rândul superior este imaginea de amplitudine, iar fundul este imaginea de fază, la distanțe 10, 30, 50, 100 și 200 μm și λ = 0,633 μm.
Fig. 3.2 Comparația metodelor de difracție numerică pentru propagare pe o gamă de z = 0 ~ 250 μm:
(a) transformarea Fresnel
(b) convoluția Huygens
(c) metodele de spectru unghiular. Rândul superior este profilul de amplitudine, iar rândul inferior este profilul de fază.
Rândul superior arată amplitudinea câmpului difracționat la distanțe de la z = 10, 30, 50, 100 și 200 μm. Rândul de jos prezintă modele de fază corespunzătoare. În imaginile de fază, factorul exp (-ikz) a fost înmulțit pentru a elimina variația fazei rapide din cauza propagării globale a z. Un pixel în E (x, y; z) corespunde cu , care în ∑-plan corespunde unde X0 este dimensiunea planului ∑0.
(3)
Adică dimensiunea pixelului și mărimea planei plane cresc liniar cu distanța, așa cum este evident în Fig. 3.1. De fapt, câmpul de vedere la cele cinci distanțe este de 16, 48, 81, 160 și 320 μm. Există metode pentru a aborda problema rezoluției pixelilor neconstante, este evidentă prezența unei distanțe minime pentru a obține un model de difracție valid. Pentru a evita aliasing [81], planul de ieșire ∑ Trebuie să fie cel puțin la fel de mare ca și planul de intrare ∑0, ceea ce duce la . Figura 3.2 (a) prezintă o secțiune transversală yz a propagării într-un interval de z = 0 ~ 250μm de-a lungul unei linii verticale indicate de săgeata albastră din Fig. 3.1. Locația = 62μm este indicată cu o săgeată roșie în Fig. 3.2 (a), iar la distanțe mai scurte se observă împachetarea și aliasingul imaginii de ieșire calculate.
Fig. 3.3 Difracția numerică prin metoda spectrului unghiular, cu același set de parametri ca în Fig. 3.2.
3.1.2 Convoluția Huygens
Difracția poate fi, de asemenea, calculată ca o integrală a convoluției:
(4)
(5)
Astfel, convoluția Huygens este calculată cu trei transformări Fourier [18,27,76,82,83]. Difracția numerică prin convoluția Huygens utilizând același set de parametri ca în Fig. 3.1 este prezentat în fig. 3.2 (b) și 3.3. Comportamentul pe distanțe scurte este semnificativ mai bun decât metoda Fresnel. De asemenea, rețineți că se poate utiliza Fresnel PSF SF ca o aproximare a SH și obținerea de rezultate cu calități similare. O astfel de aproximare, cu toate acestea, nu este cu adevărat necesară.
3.1.3 Spectrul unghiular
Difracția este calculată prin metoda spectrului unghiular în conformitate cu care necesită două transformări Fourier [19,63,84-89].
(6)
Pentru microscopia holografică planul imaginii, unde câmpul de intrare E0 poate fi de fapt o imagine mărită a unui obiect microscopic, dimensiunea efectivă a pixelilor poate fi mai mică decât lungimea de undă, iar argumentul rădăcinii pătrat din Ecuatia. (6) poate deveni negativ în părți ale domeniului spectral, iar apoi este necesară funcția de cerc.
Difracția numerică prin spectrul unghiular folosind același set de parametri ca în Fig. 3.1 este prezentat în fig. 3.2 (c) și 3.4. Această metodă oferă imagini de difracție valide la distanțe scurte, până la zero.
3.2 Compararea metodelor
Referindu-ne la Fig. 3.5, metoda spectrului unghiular se bazează pe propagarea undelor plane. Eșantionarea undelor plane de către pixelii discreți ai CCD nu variază în funcție de distanță și, prin urmare, metoda spectrului unghiular nu are nici o limitare a distanței. Pe de altă parte, metoda de transformare Fresnel se bazează pe propagarea sfericelor de sferice (sau aproximari parabolice).
Fig. 3.4 Propagarea (a) undelor plane și (b) undelor sferice în spațiul numeric digitizat.
Fig. 3.5 Difracția numerică prin metoda de convoluție Huygens, cu același set de parametri ca în Fig. 3.1.
Când centrul de curbură este prea aproape de matricea CCD, local frecvența de franjuri pe planul CCD poate fi mai mare decât frecvența Nyquist. Aceasta se întâmplă atunci când distanța este mai mică decât ., care în exemplul nostru este de 72 μm.
Comportamentul câmpului de difracție calculat prin cele trei metode într-un interval de z = 0 ~ 250 μm este arătat în Fig. 3.2. Mai mult, există, de asemenea, o distanță maximă care oferă modele de difracție corecte pentru metoda de transformare Fresnel. Pentru distanțe destul de mari, perioada de margine devine mai mare decât întreaga matrice CCD, fără înregistrarea informațiilor de difracție. Aceasta se întâmplă atunci când distanța este mai mare decât . care, pentru exemplul nostru numeric, este de 7900 μm. Spectrul obișnuit nu are nici această limitare. Trebuie remarcat faptul că terminologia și aproximările relevante ale diferitelor metode din literatura de specialitate nu sunt uniforme, iar compararea rezultatelor, cum ar fi distanțele minime și maxime, trebuie făcută cu puțină grijă [90].
3.3 Eșantionarea digitală a hologramelor
Dimensiunea finită și eșantionarea discretă de către matricea CCD modifică proprietățile imagistice holografice pe care le-am obținut în Sec. 2.2 [[73,76,80,91-94]. Să presupunem că dimensiunea matricei CCD este X0 × Y0 cu pixeli Nx × Ny, astfel încât pitchul pixelului să fie δx0 × δy0 = (X0 / Nx) × (Y0 / Ny). Să presupunem, de asemenea, că aria sensibilă a unui pixel CCD este γxδx0 × γyδy0, unde γx și γy sunt factorii de umplere.
(7)
Funcția de eșantionare CCD este scrisă ca [93,95-97] unde din nou abreviem termenii y și, de asemenea, renunțăm la indicele γ. Funcția de pieptene (x / δx) este o serie de funcții delta cu intervale δx, iar funcțIa rectangulara a dreptunghiului (x / a, y / b) are o valoare de unu în interiorul dreptunghiului cu dimensiunea a × b și zero în exterior.
(8)
Considerăm formarea imaginii holografice prin surse punctuale și multiplicăm funcția de eșantionare P (x0, y0) în interiorul integratului de difracție Fresnel.
Efectul funcției de eșantionare asupra integratului este, pentru o funcție f (x0),
(9)
De asemenea, rețineți că la poziția imaginii holografice z = Z ± și integrarea și sumarea sunt ușor de realizat.
(10)
Linia inferioară a Ecuația (10) arată efectul eșantionării digitale [76]. Funcția sinc are o lățime de între primele zero. Pentru un factor mic de umplere γ → 0, imaginea este uniformă în amplitudine în planul imaginii. Pe de altă parte, integrarea pe suprafața pixelilor cu un factor de umplere mai mare are drept rezultat vignetarea, în special pentru distanța mai mică a imaginii Z±. Factorul sine-peste-sine al Ecuația (10) dă rezoluția laterală a unei imagini punctuale , care arată dependența așteptată de diafragma numerică a matricei camerei [32]. De asemenea, rețineți că imaginea punctuală se repetă pe o perioadă de . Această perioadă trebuie să fie mai mare decât dimensiunea
A matricei camerei [81], care conduce la distanța minimă zmin = X ± 22λN, așa cum se vede în Sec. 3.1.
Pentru a estima rezoluția axială, să presupunem că toate cele trei puncte sursă sunt pe axa z. Apoi, câmpul construit de-a lungul axei z este dat de:
(11)
Fig. 3.6 Holografia Fresnel în afara axei. Albastrul reprezintă fascicule de referință, iar roșu reprezintă propagarea dintr-un punct pe obiect: (a) înregistrarea și (b) reconstrucția.
Suma integrală este aproape de zero, cu excepția cazului în care faza exponenței variază lent în intervalul X0, ceea ce conduce la o rezoluție axială de 2λ.
Pentru o configurare de microscopie holografică cu un obiectiv obiectiv, așa cum este ilustrat în Fig. 2.1, punctul de sursă E1δ (x – x1, y – y1, z – z1) se poate referi de fapt la un punct de obiect imaginat și mărit de obiectiv. În acest caz, E1 este un punct în interiorul PSF al imaginii, iar descrierea urmează ca mai înainte. Alternativ, și echivalent, E1 se referă la un punct de obiect real și matricea CCD se referă la imaginea sa proiectată în volumul obiectului prin lentila obiectivului. În acest caz, matricea CCD este demagnificată de către obiectiv și un punct de obiect este răspândit de un PSF demagnificat, de asemenea.
CAPITOLUL 4 – Configurări digitale ale holografiei
4.1 Holografia Fresnel în afara axei
Se prezintă o prezentare generală a principalelor tipuri de configurații de interferometru utilizate în holografia digitală. În primul rând, holografia Fresnel se referă la o configurație în care obiectul este o distanță finită de planul hologramei și referința este de obicei un val de plan. Apoi, imaginile se formează la poziția obiectului și poziția sa în oglindă în raport cu holograma, cu mărirea unității, așa cum se arată în Fig. 3.6. Pentru a evita suprapunerea referinței și a imaginilor, undele de referință și de obiect sunt decalate de un unghi, așa cum a fost inițial realizat de Leith și Upatnieks [6]. Poziția și mărirea imaginii pot fi manipulate prin utilizarea unor referințe, altele decât unda plan. Plasarea la o distanță suficient de mare și utilizarea transformării Fresnel permit imaginarea unui obiect mai mare decât dimensiunea matricei CCD, cum ar fi aplicațiile metrologice macroscopice [[14,77,98,99]]. De asemenea, o lentilă de imagine poate fi utilizată pentru a forma o imagine mărită [46] sau demagnificată a obiectului, care apoi se propagă în planul hologramei. De exemplu, în Ref. 77, o lentilă negativă este utilizată pentru a forma o imagine demagnificată a unui obiect mare, reducând astfel lărgimea de bandă a frecvenței spațiale.
4.2 Holografia Fourier
După cum este bine cunoscut, câmpul din planul focal spate este transformarea Fourier a câmpului de obiect la planul frontal focal. Holograma este înregistrată cu o undă de referință plană [Fig 4.1 (a)]. În reconstrucție, o undă de referință plană și o lentilă produc transformarea inversă, adică imaginea [Fig. 4.1 (c)]. Alternativ, holografia Fourier fără lentile este posibilă prin plasarea unei referințe a sursei punctului la planul obiectului [Fig. 4.1 (b)], iar reconstrucția se desfășoară în același mod ca înainte [36,94]. Dar în holografia digitală, reconstrucția este deosebit de simplă, deoarece necesită doar o singură transformare Fourier a hologramei înregistrate [13,62]. În primul experiment digital de microholografie Fourier din Ref. 62, o picătură de glicerol plasată lângă specimenul de pe un diapozitiv de microscop a acționat ca lentila de focalizare pentru a forma referința sursei punctului în fața obiectivului Fourier. De asemenea, a fost introdus un obiectiv numeric pentru a focaliza imaginea la diferite distanțe. Microscopia cu rezoluție înaltă este posibilă folosind o configurație relativ simplă [100,101], si o analiză detaliată a formării imaginii în holografia digitală Fourier fără lentilă este dată în Ref. 91. În microholografia Fourier fără lentilă, obiectul poate fi plasat aproape de senzor, ceea ce mărește deschiderea numerică și îmbunătățește rezoluția [102]. Dar aceasta introduce aberații în reconstrucție din cauza încălcării cerinței frecvenței Nyquist. Holograma este extinsă și interpolată, urmată de înmulțirea unei funcții de transfer, înainte de transformarea Fourier, pentru a obține o imagine de înaltă rezoluție fără aberație. Ref. 98 face o comparație a diferitelor configurații de interferometru în contextul aplicațiilor metrologice macroscopice.
Fig. 4.1 Holografia Fourier și Fourier fără lentilă:
(a) înregistrarea hologramei Fourier utilizând o lentilă;
(b) înregistrarea cu hologramă Fourier fără lentilă;
(c) reconstrucția prin transformarea Fourier reprezentată cu lentila Fourier.
4.3 Holografia planului imaginii
Obiectul poate fi plasat aproape de planul hologramei, astfel încât z1 ≈ 0. Apoi Z± ≈ z1 și X± = ∓x1, astfel încât imaginea se formează în apropierea planului hologramei la poziția obiectului. În holografia spațiului real, acest lucru este util pentru crearea de holograme care pot fi văzute cu lumină scăzută a coerenței, deoarece distanța imaginii nu este foarte mare în comparație cu lungimea coerenței. În holografia microscopică, acest lucru nu ar fi util pentru că nu există o mărire, dacă nu se utilizează un microscop pentru a vizualiza holograma. Pe de altă parte, o lentilă obiectivă poate fi utilizată pentru a forma în apropierea planului hologramei o imagine mărită a obiectului, iar imaginea holografică
Reconstrui imaginea mărită [Fig. 16 (a)]. Imaginea va reproduce corect profilul de amplitudine al obiectului, dar nu și profilul de fază. Alternativ, obiectivul obiectiv poate fi utilizat pentru a forma o imagine mărită a interferenței holografice, incluzând atât obiectul, cât și referința de scriere [Fig. 16 (b)]. În holografia spațiului real, o reconstrucție care utilizează aceeași lungime de undă din holograma mărită ar avea ca rezultat o imagine nemagnificată a dimensiunii obiectului original. Pentru a menține mărirea, ar trebui să folosiți o lungime de undă mai lungă de același factor de mărire, dar o astfel de lungime de undă lungă ar fi în infraroșu sau cuptor cu microunde.
În microscopia digitală holografică, această configurație este deosebit de flexibilă pentru că
O holograma dobândită poate fi scalată numeric în funcție de dimensiunile fizice ale obiectului, indiferent de dimensiunea imaginii pe CCD. De fapt, o matrice CCD demagnificată este plasată în apropierea poziției obiectului.
Fig. 4.2 Înregistrarea hologramelor planului imaginii prin proiecția unei imagini mărite a obiectului pe planul hologramei, suprapuse cu un val de referință plane (a) sau (b) o undă de referință corespunzătoare valorii de undă.
Odată ce interferența holografică mărită este introdusă în calculator, este doar o chestiune de atribuire a dimensiunii originale a cadrului microscopic și a lungimii de undă corecte
Care a fost folosită pentru crearea interferențelor holografice. Imaginea reconstruită numeric va reprezenta corect amplitudinea și faza spațiului original de obiecte microscopice.
Nicio hologramă digitală de tip hologramă digitală a fost utilă într-o serie de domenii de aplicare diferite, inclusiv în microscopia biologică [47,103], unde este important să se poată monitoriza specimenul viu imaginat. Este, de asemenea, avantajos pentru îmbunătățirea eficienței colectării luminii în velocimetria particulelor [104]. Pentru DHM care utilizează lumină de coerență scăzută, una funcționează neapărat în apropierea configurației planului imaginii [83,105,106].
4.4 Holografie in linie
O holografie în afara axei este necesară pentru a evita suprapunerea imaginilor de ordin zero și holografic. Însă acest lucru reduce în realitate conținutul informațional al hologramei la un sfert din numărul de pixeli, ceea ce este o premieră în holografia digitală. Cu o holografie in linie, câmpul de obiect este în general aliniat cu fasciculul de referință și este utilizat întregul număr de pixeli holograma, ceea ce conduce la distanțe minime mai scurte pentru reconstrucția Fresnel și rezoluție mai mare a imaginii rezultate [107] (Fig. 4.3). Un număr de metode au fost propuse și demonstrate pentru a reduce sau elimina efectul imaginii de ordin zero și gemene, după cum se descrie mai târziu (vezi Sec.5.1).
Termenul de ordin zero (sau dc) poate fi suprimat parțial prin simpla scădere a intensității medii a întregii holograme sau, alternativ, prin preluarea transformării Fourier a hologramei și aplicarea unui filtru de trecere în apropierea frecvenței zero. Eficacitatea filtrării înalte depinde de conținutul spectral al obiectului.
Expunerile separate ale grinzilor de referință și ale obiectului și scăderea lor de la holograma înainte de filtrarea cu comandă zero îmbunătățește rezultatul. Îndepărtarea imaginii gemene este mai puțin simplă [79,108] și necesită tehnici speciale cum ar fi metoda multiexpoziției care schimbă faza. Pe de altă parte, metoda de filtrare cu trecere înaltă
Poate fi eficient atunci când natura dinamică a obiectului exclude metoda de schimbare a fazelor.
Fig. 4.3 Holografia in-line: (a) suprapunerea în linie a grinzilor de obiect și de referință și (b) reconstrucția imaginilor suprapuse și a celor de tip twin.
Fig. 4.4 Holografia Gabor:
(a) înregistrarea prin suprapunere a referinței și a componentei sale împrăștiate dintr-un obiect punct;
(b) reconstrucția unei imagini punctuale și a gemului ei defocalizat.
4.5 Holografia Gabor
În holografia Gabor, obiectul este iluminat cu o singură rază de lumină și nu există un val de referință separat (figura 4.4). Partea luminii care este împrăștiată de obiect este valul obiectului, iar restul care nu suferă acțiuni de împrăștiere ca val de referință. Metoda este mai eficientă cu cât obiectul este mai mic, astfel încât referința nu este deranjată excesiv.
Din cauza acestei constrângeri și datorită simplității configurației optice, holograma Gabor este utilă în special pentru analiza imaginii particulelor [109-111], precum și pentru fibrele subțiri [112]. Holografia digitală Gabor (DGH) poate oferi noi posibilități pentru aplicații mai largi ale acestei configurații simple [113-115]. De exemplu diferența dintre două holograme consecutive dintr-un film holografic scade complet fundalul în timp ce dezvăluie mișcarea particulelor sau a microbilor. Pentru particulele microscopice, problema imaginii gemene este adesea neglijabilă, deoarece chiar și la distanțe relativ scurte starea Fraunhofer este satisfăcută, iar imaginea gemenei este complet defocalizată. Inspecția simplă a profilurilor de intensitate printr-o particulă a permis o estimare a coordonatelor poziției 3D a particulei într-un interval de
Acuratețea câtorva sute de nanometri. Când a fost derivată derivatul unui polinom de ordinul doi montat la profilurile de intensitate, coordonatele X, Y și Z ale particulelor pot fi determinate în limita a 50 nm. Un dispozitiv subacvatic a utilizat DGH pentru a investiga particule, bacterii, parametri și alți microbi de înot [117,118], iar câmpul de flux detaliat al copepodului de alimentare a fost măsurat folosind DGH [119]. Configurația DGH este, de asemenea, in-line, dar în această revizuire holografia in-line se referă la una cu un val de referință separat. Cu DGH, obiectul
Trebuie să umple doar o mică parte a câmpului, în timp ce holografia în linie cu referințe nu are o astfel de constrângere. În configurația in-line, scăderea termenilor de ordin zero și twin este importantă, în timp ce cu DGH acești termeni au probabil un efect neglijabil.
4.6 Holografia digitală de schimbare a fazelor
Configurația în linie utilizează numărul total de pixeli pentru formarea imaginii holografice, dar termenii de ordin zero și cei doi gemeni se suprapun pe imagine. O metodă foarte eficientă de eliminare a acestor termeni a fost introdusă de Yamaguchi și Zhang [24], unde câmpul complex la hologramă este obținut prin interferometrie de schimbare a fazei. Din câmpul complex la planul hologramei, inclusiv informațiile amplitudinii și fazei, câmpul optic din orice alt plan poate fi obținut prin una din metodele de difracție numerică.
Fig. 4.5 Holografie digitală schimbătoare de faze. PZT: oglindă piezomontată pentru modularea fazei de referință.
Pentru simplitate, presupuneți că referința este o undă plană incidentă în mod normal pe planul hologramei: ER (x, y) = ER exp (iψ). Valoarea obiectului are distribuțiile amplitudinii EO (x, y) și faza φ (x, y), astfel încât:
(12)
Apoi, intensitatea interferenței este:
(13)
In patru etape holografia digitala de defazare (PSDH), patru holograme cu defazări ψ = 0, π / 2, π, 3π / 2 sunt achiziționate, de exemplu printr-o oglindă de referință montat piezo (fig.4.5.):
(14)
Care sunt apoi combinate numeric pentru a extrage profilurile de amplitudine și de fază, astfel încât
(15)
Aceasta definește complet câmpul optic complex EO (x, y; 0) al obiectului la nivelul hologramei și teoria difracției poate fi utilizată pentru a calcula câmpul optic EO (x, y; z) la orice distanță z de la hologramă . O procedură similară este dată în Ref. 120. Aceste proceduri elimină complet contribuțiile din termenii de ordin zero și gemeni. Numărul de expuneri holograme necesare este redus cu un PSDH în trei trepte [76] cu deplasări de fază ψ = 0, π / 2, π:
(16)
Este posibilă și o metodă în două etape [121,122]
(17)
Care necesită două expuneri la trecerea de fază plus expuneri separate ale intensității obiectului și ale referinței. Recent, a fost introdusă o metodă în două etape, fără a fi necesară expunerea separată a intensității referințelor sau obiectelor [123]. Sunt disponibile, de asemenea, metode de extracție în faze cu schimbări de fază necunoscute sau aleatorii [124,125].
Principiul general de schimbare a fazelor se aplică în alte configurații diferite. De exemplu, schimbarea de fază este introdusă pe o porțiune a spectrului Fourier prin proiectarea unui modulator de fază aperturată pe planul focal al lentilei imagistice, care amintește de microscopia cu contrast de fază Zernike. Obiectul este poziționat pe planul focal, iar CCD dobândește trei sau patru holograme Fourier cu schimbări de fază corespunzătoare, ceea ce elimină componentele spectrale zero și cele două. Există o altă metodă de extragere a profilului de fază de la o singură interferogramă prin montarea sinusoidelor peste intensitatea interferențelor variabilă încet.
Metoda se numește metoda de deplasare fazică a spațiului purtător sau metoda de montare sinusoidală [98,127], care necesită o singură expunere la interferograme, dar în detrimentul rezoluției spațiale. Funcționează pe marginile de interferență la nivelul imaginii și nu necesită transformare Fourier. Este valabil dacă faza se schimbă încet peste câțiva pixeli, așa că:
(18)
Unde I (x, y) este modelul de interferență, k0 este frecvența franjelor purtătoare și
X este pasul pixelului. O metodă mai generală care funcționează pentru undele de referință curbate, precum și undele plane a fost introdusă în Ref. 128. Referința 104 descrie câteva metode diferite de schimbare a fazelor. Eroarea în schimbarea de fază în reconstrucție în raport cu schimbarea de fază în înregistrare poate duce la anularea incompletă a termenilor dc și conjugat [129]. O modalitate de a estima și de a corecta eroarea este prin minimizarea erorii imaginii de amplitudine reconstruită comparativ cu obiectul [121]. Metode mai generale sunt date în Recomandări. 130,131 și 132, în care transferul de fază între două expuneri este calculat pe baza unei considerații statistice a interferogramei, iar corecția pentru instabilitatea intensității este de asemenea dată [133]. În Ref. 134, o frecvență diferențială între obiect și fasciculele de referință a fost stabilită folosind modulatori acousto-optici, astfel încât trecerea de fază între cadrele CCD consecutive să poată fi controlată cu precizie și să atingă sensibilitatea finală a unui zgomot fotoelectron per pixel – numit și holografie digitală heterodyne. O analiză a zgomotului și sensibilității PSDH a fost făcută în Ref. 135. Conceptul de schimbare a fazei pentru holografia convențională a fost inițial introdus de Gabor și Goss [136], dar complexitatea sistemului opto-mecanic a fost substanțială, în timp ce prin implementarea digitală, manipularea algebrică a diferiților termeni nu prezintă o astfel de dificultate. Prin urmare, tehnica găsește aplicații în multe domenii diferite, inclusiv în microscopie [137],
De măsurare a formei de suprafață [138] și holografie color [139]. PSDH poate fi aplicată cu configurații Fresnel pentru imagistică macroscopică [24] sau pentru configurarea planului imaginii pentru microscopie [98].
CAPITOLUL 5 – Tehnici numerice pentru microscopia holografică digitală
5.1 Suprimarea termenilor de imagine DC și Twin
Termenul DC, care include intensitățile câmpului de referință și obiect, poate fi redus prin scăderea valorii medii din matricea hologramă. Deoarece obiectul și câmpurile de referință au variații spațiale, componenta DC are o cantitate finită de propagare spectrală în jurul frecvenței zero. Un efect de filtrare cu trecere înaltă a fost obținut prin împărțirea unui cartelă de 3 × -3 pixeli a frecvenței zero din spectrul te [78]. O abordare mai eficientă este aplicarea unui filtru numeric sau a unei măști direct pe spectrul Fourier (sau unghiular) al hologramei în afara axei, așa cum a demonstrat mai întâi Cuche, Marquet și Depeursinge [140].
Metoda poate fi folosită nu numai pentru a suprima termenul DC, ci și pentru a selecta unul din termenii de ghilimele de ordinul întâi, precum și a elimina componentele spectrale falsificate din cauza reflexiilor parazite și a interferențelor, îmbunătățind astfel calitatea imaginii reconstituite. Un efect similar poate fi realizat fizic prin plasarea unei măști adecvate în planul Fourier al unei configurații de lentile 4f, dar metoda numerică oferă o flexibilitate și o versatilitate semnificative. De exemplu, masca spectrală numerică poate fi ușor de configurat cu o funcție de fereastră netezită pentru a reduce fringing-ul în imaginea reconstruită.
Achiziționarea și scăderea separată a intensităților de referință și a obiectului de la holograma poate fi utilă [107], chiar și cu filtrarea numerică în afara axei, permițând lărgimea de bandă mai mare a filtrului. Rețineți că holograma filtrată numeric poate avea valori pozitive și negative ale pixelilor cu media apropiată de zero, caracteristică care nu este posibilă într-o hologramă în spațiu real.
Componenta DC este filtrată prin aplicarea unui filtru de trecere în spectrul Fourier al unei holograme în linie. Termenul de imagine dublă este redus, dar nu este eliminat, prin imagistica numerică a diafragmei și prin suprimarea zgomotului de conjugat afară în afara deschiderii. Alternativ, cu o deschidere la un plan Fourier, imaginea diafragmei este suprimată și partea conjugată este utilizată pentru a reconstrui imaginea conjugată a obiectului. Combinațiile a două sau mai multe holograme cu schimbări stochastice în obiectele de tip obiect între ele au condus la eliminarea termenilor dc și twin [79,141]. Holograma digitală cu schimbare de fază elimină foarte eficient termenii de imagine dc și twin, așa cum este descris mai înainte.
5.2 Controlul rezoluției pixelilor în metoda de transformare Fresnel
În metoda de transformare Fresnel de difracție numerică, dimensiunea pixelilor variază liniar cu distanța, ca . Prin urmare, câmpul vizual al planului imaginii crește cu distanța și, prin urmare, obiecte mai mari decât matricea CCD pot fi înregistrate utilizând transformarea Fresnel dacă obiectul este la o distanță suficient de mare. Pe de altă parte, acest lucru poate cauza probleme atunci când mai multe imagini holografice cu distanțe diferite de imagine trebuie combinate pentru interferometria holografică. De asemenea, rezoluția pixelilor variază în funcție de lungimea de undă, ceea ce poate cauza probleme pentru metodele de holografie cu lungimi multiple, cum ar fi holografia colorului sau desfacerea fazei optice.
O modalitate de a aborda problema este prin interpolarea pixelilor. Imaginile de amplitudine pot interpola corect, dar imaginile de fază probabil nu ar fi datorate fazei înfășurate la multipli de 2π. O soluție mai bună este oferită de padding-ul zero [142], unde holograma este căptușită cu pixeli cu valoare zero în jurul limitei, astfel încât mărimea efectivă a hologramelor = N’δx crește liniar cu distanța de reconstrucție z și rezoluția pixelilor la imagine Planul rămâne constant.
O altă metodă este oferită într-o transformare Fresnel în două etape pe distanțele z1 și z2, astfel încât z = z1 + z2 este distanța totală [143] (figura 5.1). Având în vedere dimensiunea cadrului hologramei X0, mai întâi transformarea Fresnel se calculează la un plan intermediar la z1. Dimensiunea cadrului este . Apoi, o altă transformare Fresnel se calculează pe restul distanței z2, astfel încât dimensiunea finală a imaginii este . Prin urmare, dimensiunea finală a cadrului poate fi ajustată prin alegerea corectă a raportului . O variantă a fost introdusă în Ref. 144 utilizând un proces în două etape. Prima difracție la un plan intermediar este calculată utilizând un spectru unghiular, a cărei rezoluție a pixelilor este constantă pe orice distanță. A doua difracție până la final a planului imaginii are rezoluție variabilă. Această metodă se poate ocupa de distanțe mici între holograme și imagini, în timp ce în metoda Fresnel în două etape, dacă distanța este foarte mică în comparație cu distanța minimă de reconstrucție | z | << zmin, atunci raportul nu poate avea prea multe variații.
Cu metoda de transformare Fresnel în două etape, poate exista o pierdere de informații dacă dimensiunea cadrului Fresnel este mai mică decât dimensiunea reală a difracției optice, care depinde de conținutul spectral al obiectului [75]. Pentru a evita distorsionarea imaginii finale datorită pierderii câmpului de difracție, unul dintre etapele Fresnel este înlocuit cu un spectru unghiular sau cu un calcul Rayleigh-Sommerfeld, care acoperă un cadru mai mare decât cadrul Fresnel. Metoda de transformare Fresnel și tigla schimbată a fost utilizată pentru a controla rezoluția pixelilor, precum și dimensiunea matricei, în contextul CGH.
Fig. 5.1 Metoda de transformare Fresnel în două etape.: plan de intrare; : plan intermediar; si : planul de ieșire.
5.3 Desfacerea fazei optice
Imaginile de fază generate de holografia digitală, precum și cele mai multe tehnici de imagistică de fază, suferă de ambiguități modulo 2π. Un obiect a cărui variație a grosimii optice depășește lungimea de undă produce imagini în fază înfășurată, cu discontinuități la fiecare 2π de profil de fază. S-au dezvoltat numeroși algoritmi de dezactivare a fazelor [146,147], dar rămâne o provocare pentru a găsi soluții care să poată aborda eficient toate tipurile de topologii de fază.
Acest lucru se datorează faptului că majoritatea procedurilor de desfacere se bazează pe strategii diferite pentru a găsi discontinuitățile de fază și pentru a face judecăți cu privire la modul de cusătură a regiunilor discontinue.
Cel mai adesea, algoritmii sunt exigenți la calcul și au dificultăți în manipularea diferitelor tipuri de topologii de fază. Faza optică de desfacere (OPU), bazată pe o holografie digitală cu lungimi multiple, oferă o metodă rapidă, eficientă și deterministă.
De exemplu, două holograme ale aceluiași obiect sunt achiziționate utilizând două lungimi de undă diferite λ1 și λ2, iar imaginile de fază φ1 (x, y) și φ2 (x, y) sunt obținute din ele. Fiecare dintre aceste profiluri de fază variază în fază de la 0 la 2π, iar profilurile grosimii optice corespunzătoare ajung până la λ1 și, respectiv, λ2. Acum, scăzând cele două Δφ = φ1 – φ2, urmată de adăugarea lui 2π oriunde Δφ <0, rezultă o nouă imagine a fazei care variază de la 0 la 2π, a cărei lungime de undă efectivă sau lungimea de undă sintetică este dată de:
(19)
Noua imagine de fază se ocupă de variații ale grosimii optice de până la , care pot fi făcute suficient de mari pentru a acoperi variația maximă a grosimii obiectului prin alegerea diferențelor de lungime de undă suficient de mici. Dacă, totuși, imaginile de fază inițială au anumite cantități de zgomot, spune ε · 2π, atunci noua imagine de fază conține aceeași cantitate de zgomot de fază, ceea ce se traduce în zgomot în profilul de grosime optică, în loc de ελ1, Prin același factor ca lungimea de undă sintetică. Zgomotul poate fi redus la nivelul inițial utilizând noua hartă a fazelor ca ghid pentru a decide cum să despachetați hartă φ1. Aceasta este, harta nouă fază este dat de:
(20)
Unde int reprezintă un coeficient întreg. Această schemă funcționează dacă zgomotul amplificat nu depășește lungimea de undă originală ε < <λ1, care stabilește lungimea de undă diferențială minimă și, prin urmare, lungimea maximă de undă sintetică:
(21)
Dacă zgomotul este mai excesiv sau este nevoie de o lungime de undă mai mare de sinteză, se poate continua cu o metodă ierarhică care utilizează trei sau mai multe lungimi de undă după cum urmează [148]. Începeți de la λ1 și alegeți λ2> λ1 astfel încât , adică:
(22)
Zgomotul asociat cu noua hartă de fază a este ε12 = Apoi, alegeți λ3> λ2 pentru a forma:
(23)
Care satisface automat Ecuatia. (21). Utilizați acum și ca cele două noi hărți de fază pentru a forma o nouă combinație
(24)
Astfel încât . Zgomotul asociat cu este ε23 = . În general, lungimea de undă n λn> λn-1 este aleasă pentru a forma:
(25)
Astfel încât , unde . Procesul continuă până când este suficient de mare pentru domeniul z al obiectului.
Metoda de desfacere în fază optică a fost aplicată la microscopia cu fază cantitativă din Refs. 23 și 149. OPU cu două lungimi de undă poate fi obținută prin holografia digitală cu o singură expunere prin multiplexarea unghiulară [21,52,54,59], așa cum se arată în Fig. 5.2. Interferometrul dublu constă dintr-un braț obiect obișnuit și două brațe de referință separate iluminate de două lasere cu lungimi de undă diferite. Bratele de referință sunt aliniate astfel încât marginile celor două lungimi de undă să fie perpendiculare între ele. Pe spectrul unghiular, vârfurile apar ca două perechi distincte, astfel încât imaginile holografice pot fi procesate separat prin selectarea corespunzătoare a vârfului pentru fiecare lungime de undă. Figura 5.3 (d) este un exemplu al unei imagini de fază DHM a suprafeței unei probe de cărbune lustruit, despachetată de OPU, în timp ce Fig. 5.3 (e), 5.3 (f) sunt desfacute de un algoritm software disponibil.
Evident, metoda bazată pe software are dificultăți în a gestiona zone izolate de profil de fază, în timp ce OPU generează profile de fază corecte, indiferent de topologie. OPU constă doar din câteva operații algebrice și booleene și, prin urmare, este foarte rapid și cererea de calcul este scăzută. Metoda este în întregime deterministă și nu depinde de nici o estimare a topologiei unui cartier de pixeli.
Fig 5.2. Interferometru holografic cu două lungimi de undă. Filtrele ND și polarizatoarele P1 și P2 sunt folosite pentru a controla intensitatea fasciculelor laser [59].
Pentru măsurătorile macroscopice cu grosimi în intervalul de centimetri, diferența de lungime de undă trebuie să fie de ~ 10-5λ sau mai multe gigahertzi în diferența de frecvență, care poate fi produsă prin modularea cavității cu laser [150] sau prin modularea electrooptică. Pentru imagistica microscopică a celulelor biologice cu grosimea <50- μm, diferența lungimii de undă trebuie să fie Δλ> 5 nm, ceea ce ar necesita lasere separate sau un laser tunabil. Pentru diferențele de lungime de undă mai mari, formarea imaginii poate fi afectată de aberațiile cromatice ale sistemului. Elementele optice sau obiectul în sine pot avea aberație cromatică, sau în cazul metodei de transformare Fresnel pentru difracția numerică, dimensiunea imaginii reconstruite depinde de lungimea de undă. În DH, este o chestiune simplă de a compensa aberația prin ajustarea distanței de reconstrucție [151] sau prin scăderea hologramelor de referință fără obiect [51]. OPU a fost aplicat și microscopiei de interferență cu trecerea de fază, utilizând trei LED-uri ca surse de lumină. Metoda este suficient de rapidă pentru analiza vibrațiilor în timp real.
5.4 Compensarea aberațiilor
5.4.1 Compensarea undelor
Datorită accesului numeric direct la profilul fazei frontului de undă, cu holografia digitală, este posibilă manipularea profilurilor de fază cu flexibilitate și versatilitate neegalate de orice alte metode imagistice [18,46]. De exemplu, în DHM cu mărire microscopică, utilizarea lentilei obiectivului care corespunde curburii este avantajoasă pentru a reduce frecvența marginilor, dar este inutil și nu este necesar să aliniați precis obiectivele. În schimb, ca în Fig. 23, orice curbură reziduală poate fi compensată prin utilizarea unui val numeric curbat de referință [22,54]. Compensarea aberațiilor sferice a fost demonstrată în Ref. 154 prin înmulțirea funcției de aberație cu holograma și ajustarea fină a parametrilor pentru cel mai bun PSF. În general, o lentilă parametrică numerică este utilizată pentru schimbarea, mărirea și compensarea completă a aberațiilor în Ref. 155 și în Ref. 50, utilizarea polinomului Zernike este folosită pentru a scădea curbură și aberații din fundalul imaginii DHM. În Ref. 156, astigmatismul este corectat prin aplicarea efectivă a două distanțe diferite de reconstrucție pentru axele x și y. Corectarea anamorfismului este demonstrată în Ref. 157. În microscopia holografică Fourier fără lentilă, obiectul poate fi plasat în apropierea senzorului, ceea ce mărește deschiderea numerică și îmbunătățește rezoluție. Dar aceasta introduce aberații în reconstrucție din cauza încălcării cerinței frecvenței Nyquist.
Holograma este extinsă și interpolată, urmată de înmulțirea unei funcții de transfer, înainte de transformarea Fourier. Este obținută o imagine cu rezoluție înaltă fără aberație. În Ref. 159, sunt descrise și comparate mai multe metode de compensare aberației.
Fig. 5.3 Faza optică în două faze de despachetare pe imaginile unui eșantion de cărbune poros: (a) imagine de amplitudine; Fazele cu o singură lungime de undă reconstruite la
(b) λ1 = 532 nm și (c) λ2 = 633 nm; (D) redarea 3D a fazei de fază cu două lungimi de undă; (F) hărți fază dezvelite faza reconstituită la (e) λ1 = 532 nm și (f) λ2 = 633 nm pentru comparație. Toate dimensiunile imaginii sunt de 98 × 98μm2 [59].
5.4.2 Aberație cromatică
Aberarea cromatică poate afecta tehnicile holografice digitale cu lungimi multiple, efectul principal fiind variația poziției și mărirea imaginii. Corecția aberației în microscopia convențională implică proiectarea complexă și costisitoare a lentilelor, optimizată doar pentru o gamă limitată de parametri. În holografia digitală, pe de altă parte, imaginile cu diferite lungimi de undă pot fi calculate la diferite distanțe și mărimi adecvate ajustate pentru cea mai bună aliniere înainte de suprapunerea numerică a imaginilor reconstituite [151]. În Ref. 51, pentru două OPU lungimi de undă, aberația frontală a valurilor este înregistrată separat fără obiectul de interes și este scăzută din imaginea fazei dezvelite a obiectului.
Fig. 5.4 Compensarea curburii la capăt: (a) imaginea de fază cu curbură datorată nepotrivirii de referință și (b) imaginea de fază după compensare [59].
Fig. 5.5 Geometria difracției cu planuri înclinate pentru rotirea numai în jurul axei y: planul de intrare , planurile de ieșire (nerotita) și (Rotita).
5.5 Difracția cu planurile înclinate
În unele tehnici și aplicații ale holografiei digitale, apar situații în care trebuie să se ia în considerare difracția între planurile care sunt înclinate unul față de celălalt. Un exemplu este examinarea câmpurilor de particule într-un plan orientat arbitrar. Un alt exemplu este microscopia holografică totală de reflexie internă [160], unde geometria sistemului optic dictează reconstrucția holografică pe un plan la un unghi mare în raport cu axa optică (vezi secțiunea 6.6). Dezvoltarea unei optici integrate este o altă zonă în care planul optic pertinent se poate schimba în direcții arbitrare. Au fost dezvoltate mai multe tehnici, principala strategie fiind aceea de a evita integrarea directă a integrării de difracție astfel încât să poată continua să utilizeze transformarea Fourier rapidă. În Ref. 161, difracția este descrisă cu o ecuație integrală Rayleigh-Sommerfeld, unde autorii fac referire la faptul că, în ceea ce privește calculul numeric, nu este necesară aproximarea Fresnel sau Fraunhofer. Se încorporează propagarea între planurile înclinate prin transformarea coordonatelor.
Transformarea este o rotație în domeniul Fourier (figura 5.5). Folosind metoda spectrului unghiular, câmpul optic de intrare este transformat în Fourier pentru a obține spectrul său unghiular. Vectorul de undă al unei valuri plane se transformă în funcție de
(26)
Din cauza rotației, intervalele uniforme ale probelor de frecvență devin neuniforme, iar transformarea inversă Fourier provoacă o problemă numerică. În Ref. 162 și 163, spectrul este interpolat în intervale uniforme. Imaginea finală, obținută prin transformarea inversă Fourier a produsului spectrului unghiular și a factorului de fază de propagare, conține o eroare datorată interpolării.
O hologramă digitală conține informații complete 3-D, ceea ce duce la eventualul surprinzător . Faptul că, în principiu, imaginea poate fi reconstruită pe un plan înclinat într-un unghi arbitrar, până la 90 de grade. Problema este că integrarea difracției nu este direct accesibilă la utilizarea FFT. În Ref. 87, sunt utilizate trei transformări de coordonate pentru a realiza reconstrucția imaginii fără pierderea conținutului de frecvență și cu aceleași dimensiuni ale pixelilor ca și holograma. Primele două transformări sunt rotația și înclinarea planului imaginii, iar ultima este pentru schimbarea unghiului de vizualizare. Include o combinație a interpolației și a transformării Fourier discrete neuniform (NDFT) și obține un timp de calcul redus. În Ref. 164, integrala de difracție este realizată folosind FFT de-a lungul axei netilate, în timp ce axa înclinată este manipulată prin însumarea directă a integrantei.
O metodă conceptuală simplă, dar mai puțin eficientă este de a construi un volum de 3-D de pixeli de imagine reconstruiți (voxeli) și pentru a compune imaginea de-a lungul unui plan orientat arbitrar prin colectarea pixelilor adecvați [113]. Reconstrucția unei imagini holografice cu unghiuri de vizualizare variabile este descrisă în Ref. 49 și 165. O imagine tomografică pe un plan înclinat în volumul de imagine al holografiei de interferență digitală a fost demonstrată în Refs. 166 și 167.
CAPITOLUL 6 – Aplicații și tehnici speciale de microscopie digitală holografică
6.1 Microscopia biomedicală
Holografia digitală oferă o serie de noi capacități pentru microscopia biomedicală. Pentru a vizualiza diferite tipuri de celule, inclusiv celulele ovariene SKOV-3 [47,54], celulele fibroblaste [19], testul amoeba [180] și celulele roșii din sânge [53], s-a aplicat microscopia de fază cantitativă (DH-QPM). Este, de asemenea, folosit pentru a investiga diversele dinamici celulare, cum ar fi modificările induse de medicamente în celulele tumorale pancreatice. MHD este utilizat pentru a monitoriza microchirurgia laser a celulelor roșii din sânge (RBCs), celulele epiteliale ale rinichiului din ratina de șobolan (PTK2) și celulele retinei pentru evaluarea cantitativă a afectării celulare celulare și a reparației în timp real. În Ref. 53, membrana virală a celulelor roșii din sânge (celule roșii din sânge).
Fluctuațiile de 37 nm sunt măsurate și comparate cu celule fixate cu etanol, care au o fluctuație foarte scăzută de 5 nm. Contribuțiile la grosimea optică a grosimii fizice și indicele de refracție sunt decuplate prin maparea fazelor cu două soluții de perfuzie cu indici de refracție diferiți. Indicele de refracție al RBC este măsurat astfel încât să fie n = 1,394 ± 0,008.
Deformarea veziculelor fosfolipide într-un flux microcanal a fost măsurată prin DH-QPM ca un model de celule roșii în fluxul capilar [58]. Elementele de celulă și subcelulară sensibile la timp sunt afișate cu rezoluție submicronică, cu difracție limitată [19]. Filmele de amplitudine holografică și imaginile fagilor ale microbilor și celulelor vii, cum ar fi înotarea parametrică printre alți microbi și celule fibroblaste în procesul de migrare, sunt realizate dintr-o serie de holograme și reconstruite cu focalizare numerică reglabilă.
O altă tehnică notabilă pentru microscopia de fază cantitativă este microscopul Fourier Phase (FPM), care are o configurație asemănătoare cu microscopul de tip Zernike, dar cu filtrul de fază înlocuit cu un modulator de lumină spațială pentru a permite achiziția de schimbare a fazei într-un interferometru de cale comună [ 43], așa cum este ilustrat în Fig. 6.1. Holografia digitală Gabor este excelentă pentru imagistica distribuției 3-D a microbilor particulari. Diferența dintre cadrele consecutive ale unei serii de timp este deosebit de utilă pentru urmărirea mișcării microbilor, care, de asemenea, diminuează efectiv zgomotul de fond. Instrumentele subacvatice au fost construite pentru a monitoriza planctonul și particulele marine. DGH a fost utilizată pentru a investiga câmpul de curgere generat de apendicele de copepod [119]. Un volum de eșantion de apă care conține copepoduri este însămânțat cu particule marker și iluminat cu un laser expandat și colimat HeNe.
Fig. 6.1 Microscop de fază de fază. FL: lentilă Fourier; PPM: modulator de fază programabil
Fig. 6.2 Aranjament optic pentru holograma Gabor imagine dubla [111].
Pozițiile 3-D ale particulelor copepod și trasorului pot fi determinate prin reconstrucția numerică a hologramei, dar rezoluția axială (~ 500μm) este mult mai săracă decât rezoluția laterală (~7,4μm). Disparitatea în rezoluție este depășită prin utilizarea unei oglinzi înclinate pentru a forma imagini duble cu vederi perpendiculare (figura 26), oferind astfel rezoluții izotrope 3-D. Analiza filmelor holografice a evidențiat câmpul de viteză și traiectoriile particulelor antrenate de copepod având un model de recirculare în cadrul de referință al copepodului. Modelul este cauzat de scufundarea copepodului la o rată mai mică decât viteza sa de scufundare terminală, datorită
Forța de propulsie generată de curentul de alimentare. Forța de propulsie generată de apendicele ei de alimentare a fost măsurată la 1,8 x 10-8 N.
Deformarea țesuturilor sub impact mecanic a fost înregistrată utilizând holografia digitală cu dublu puls [183]. Recunoașterea și identificarea celulelor biologice prin holografia digitală a fost studiată [184].
6.2 Holografia campului particulei
Velocimetria imagistică a particulelor (PIV) a fost o zonă de aplicare importantă a holografiei convenționale [185-187], dar mai mulți factori și-au limitat aplicațiile practice mai largi, cum ar fi dificultatea imaginii în timp real și complexitatea instrumentelor. Digitalizarea digitală Gabor poate elimina o mare parte din aceste limitări, permițând monitorizarea în timp real a pozițiilor 3D și distribuția câmpului de particule cu complexitate și întreținere a instrumentelor reduse semnificativ. Problemele fundamentale ale PIV holografice (HPIV) sunt revizuite în Ref. 115 și se observă că HPIV digital poate revitaliza imagistica holografică a particulelor. S-a studiat măsurătorile poziției 3-D ale microsferelor prin DGH și a obținut precizie de 50 nm în toate cele trei direcții [116]. În locul utilizării profilului de intensitate al imaginii reconstruite, minimizarea varianței părții imaginare a amplitudinii complexe a fost
A fost găsită îmbunătățirea măsurării locației planului focal. Setarea cu două fascicule cu două fascicule, ca în Fig. 6.2, a fost utilizat în imagistica generală a particulelor aplicațiile [111] și o sursă de coerență redusă sunt utilizate pentru imagistica de particule în Ref. 106 pentru a reduce zgomotul coerent. Dubois și Grosfils au introdus o holografie digitală de câmp întunecat pentru studierea nanoparticulelor mai mici decât rezoluția optică. DGH este, de asemenea, utilizat pentru măsurarea poziției și orientării 3D a unui segment de microfibră. Aplicațiile imagistice biomedicale cu particule de DGH au fost observate mai devreme.
6.3 Microscopia și metrologia microstructurilor
DHM este deosebit de util pentru caracterizarea MEMS din cauza profilului de suprafață relativ neted și bine definit [60,190]. Grinzile, podurile și membranele microcantilare sunt înregistrate prin holografie fazică cantitativă [22]. Descărcarea în fază optică cu mai multe lungimi de fază a imaginilor în fază produce măsurări de formă și deformare cu precizie submicronă pe un interval de mai multe microni. Diverse tehnici optice, inclusiv holografia digitală, pentru caracterizarea dispozitivelor MEMS.
Microscopia cu fază cantitativă prin DH oferă, de asemenea, un instrument unic pentru monitorizarea proceselor optice neliniare, cum ar fi domeniile cristalului feroelectric [61,192]. O holografie digitală a fost utilizată pentru a măsura modificările indexului de refracție în timpul scrierii cu laser a ghidurilor de undă în sapphire Ti3 + [193], precum și ghidurile de undă scrise în substraturi de sticlă folosind un laser Ti: safir [194]. DH este utilizată în măsurători în unghi de înaltă precizie 3-D prin analizarea spectrului unghiular al interferenței holografice [195]. S-a obținut precizia de 0,005 arc sec. Suprafețele de particule de cărbune lustruite au fost analizate [59]. Cartelele microalaniere lichide reglabile sunt caracterizate prin holografia digitală [57]. În Ref. 196, a doua generație de armonici la suprafața aerului de sticlă a fost studiată prin stabilirea unei interferențe între a doua armonică a undelor de referință și semnalul SHG de la interfață utilizând o iluminare laser focalizată cu femtosecond. Imagistica printr-un mediu neliniar a fost demonstrată în Ref. 197.
Birefringența unui material poate fi înregistrată utilizând două referințe cu polarizări ortogonale [198]. Cele două referințe sunt multiplexate cu unghi, ca în holografia cu două lungimi de undă, pentru a obține două perechi de spectre în domeniul Fourier.
6.4 Tomografia holografică
Deși holografia reproduce câmpul optic 3-D al obiectului, o imagine holografică la o anumită distanță conține nu numai imaginea în focalizare, ci și contribuțiile avioanelor în afara focului. Faza microscopică în fază cantitativă prin DHM profilează, de asemenea, variația fazei acumulate de-a lungul direcției de propagare a luminii. Pe de altă parte, variația amplitudinii sau indicele de refracție a dispersiei 3D față de volumul obiectului prezintă un mare interes în numeroase aplicații în imagistica biomedicală, metrologie, analiza câmpurilor de particule etc. Există două abordări principale pentru realizarea unor astfel de imagini tomografice. Una este prin achiziționarea câmpului optic transmis din numeroase direcții diferite și combinarea proiecțiilor cu un algoritm de propagare înapoi.
Celălalt este prin utilizarea efectelor de interferență cu coerență scăzută pentru a izola interacțiunea luminii cu o secțiune transversală a volumului obiectului. Similar cu tomografia cu raze X (CT) asistată de calculator, tomografia holografică a unei structuri de fază 3-D a fost realizată prin rotirea specimenului celular în volumul obiectului [180,181,199]. Tehnica este demonstrată și pentru profilurile tomografice ale microfibrelor [200,201]. În loc să se rotească complet, unghiul de iluminare este scanat într-un interval finit
În [202,203]. Spre deosebire de proiecția umbrelor în alte metode de tomografie, holografia digitală permite propagarea înapoi care include efecte de difracție pentru o reconstrucție mai precisă și cu rezoluție mai mare – numită și tomografie de difracție optică [204,205].
6.5 Holografia cu coerență redusă
Folosirea luminii cu coerență redusă în holografia generală are o istorie îndelungată și a fost aplicată în holografia digitală în principal pentru două scopuri: reducerea zgomotului coerent fals și generarea de imagini tomografice sau topografice. Lungimea coerenței scurte poate fi utilizată în imaginile tomografice sau topografice prin extragerea doar a părții unui obiect care se află în lungimea coerenței în raport cu fasciculul de referință. Primele astfel de demonstrații au fost holografia digitală cu lumină în zbor în Ref. 206 și 207, unde părțile fasciculului de referință au fost întârziate cu cantități diferite, iar imaginea reconstruită a afișat diferite părți ale obiectului cu distanțe diferite. Pentru imagistica tomografică și topografică, rezoluția adâncimii este determinată de lungimea de coerență a laserului. De exemplu, o lățime spectrală laser de 30 nm corespunde unei lungimi de coerență de aproximativ 10 um. Imagistica topografică cu rezoluție de adâncime de 20 μm a fost demonstrată utilizând un laser diod [208]. Spre deosebire de imaginile de interferență cu coerență redusă, holograma sau camera este focalizată la o distanță arbitrară față de planul obiectului, iar imaginea obiectului este reconstruită prin propagare numerică. Prin urmare, imagistica de interferență poate fi considerată un caz special
holografie. Un alt efect util al luminii cu coerență scăzută este reducerea zgomotului de interferență falsă din părțile sistemului optic care nu se află în lungimea coerenței [83]. O sursă de lumină cu o coerență spațială controlată este posibilă prin focalizarea unei lumini laser pe o placă de sticlă difuzor rotativă [105]. Metoda este aplicată analizei câmpurilor de particule [106] și măsurătorilor de concentrație a fluidului [58]. În Ref. 209, mai multe holograme care folosesc lungimi de undă diferite sunt suprapuse pentru a observa reducerea zgomotului de cenușă.
6.6 Reflecția totală internă in microscopia holografică
Microscopia adeziunii celulare este importantă pentru o înțelegere mai profundă a mișcării celulare și a morfogenezei. Instrumentele principale pentru imagistica și studierea acestor procese de suprafață au fost microscopia totală de reflexie internă prin fluorescență (TIRFM) și microscopia de reflexie a interferenței. În TIRFM, câmpul evanescent este utilizat pentru iluminarea selectivă a stratului de contact al celulei. În contrast, în microscopia holografică TIR (TIRHM), interacțiunea câmpului evanescent cu stratul de contact are ca rezultat modularea profilului de fază în lumina reflectată TIR [160,164]. Modularea fazei este apoi detectată și înregistrată prin microscopia de fază cantitativă
Din DHM. Metoda este neinvazivă, nu necesită fluorofori și folosește la maxim iradierea de intrare. Geometria sistemului optic necesită imagistică numerică pe un plan la un unghi de înclinare mare, dar din nou holografia digitală oferă o capacitate unică de reconstrucție pe un plan înclinat, așa cum este descris mai devreme. Observăm că TIR a fost de asemenea utilizat pentru iluminarea obiectului în holografia digitală pentru microscopia cu câmp întunecat [210].
Un aparat TIRHM bazat pe un interferometru Mach-Zehnder este prezentat în Fig. 6.3, și un exemplu de set de imagini amoeba proteus este prezentat în Fig. 6.4.
6.7 Holografia de scanare optică
În locul unei interferențe a câmpurilor de obiect și de referință la holograma, holografia optică de scanare (OSH) iluminează obiectul cu un câmp de interferență creat de suprapunerea a două fascicule coerente, care apoi este scanat peste obiect ( Figura 6.5). Lumina transmisă sau reflectată de obiect este apoi colectată și detectată de un detector de puncte. O descriere teoretică detaliată este dată în Ref. 214 și 215. Lumina detectată poate fi de fapt o emisie secundară, cum ar fi fluorescența, și nu trebuie să fie coerentă. Din acest motiv, OSH are un potențial unic pentru microscopia de fluorescență 3-D. De fapt, modul de detectare poate fi variat astfel încât proprietatea de coerență a procesului de imagistică variază de la liniar în amplitudine la intensitate liniară.
Fig. 6.3 Aparatură pentru TIRHM: (a) BS: separatoare de fascicule; M: oglinzi; A: planul obiectului; H: plan holografic. (B) Detaliu al prismei TIR.
Fig. 6.4 Imagini TIRAM ale amoeba proteus vii: (a) holograma, (b) imaginea amplitudinii și (c) imaginea de fază. FOV = 250 μm (comprimat înclinat) × 125 μm [164]
Fig. 6.5 Modele de zone Fresnel la două distanțe diferite. Scanarea modelelor din punctele P1 sau P2 înregistrează pozițiile 3D ale acestor puncte
Fig. 6.6 Procesul holografic de interferență digitală.
O altă tehnică pentru holografia cu lumină incoerentă, numită holografie spațio-temporală, se bazează pe interferența modulată în timp între valul obiectului și elevul de referință al funcției delta [218]. O serie de timp a imaginilor de interferență este analizată pentru a extrage componenta de frecvență de modulație de la fiecare pixel, care constituie holograma complexă cu bandă laterală [219]. Se demonstrează că se realizează o metodă de închidere cu coerență scăzută pentru a produce imagini tomografice ale unui obiect (o aripă de insecte) în spatele unei sticlă măcinată [220].
6.8 Holografia cu interferențe digitale
Tomografia cu coerență redusă poate fi sintetizată utilizând o diversitate de lungimi de undă [221,222]. În holografia interferențelor digitale (DIH), tomografia unui volum 3-D este construită prin achiziționarea unei serii de holograme în timp ce lungimea de undă este scanată într-un interval [223,224] (Figura 30). Să presupunem că un obiect este iluminat de un fascicul laser cu lungimea de undă λ.Aminime r0 de pe obiect împrăștie lumina într-un wavelet Huygens,
(27)
Unde funcția obiectului este proporțională cu amplitudinea și faza waveletului împrăștiate sau emise de punctele obiect. Pentru un obiect extins, câmpul la “r” este
(28)
Unde integrala este peste volumul obiectului. Amplitudinea și faza acestui câmp
La nivelul hologramei z = 0 este înregistrat de hologramă ca H (xh, yh; λ). Procesul holografic se repetă folosind N lungimi de undă diferite, generând hologramele H (xh, yh; λ1), H (xh, yh; λ2); . . , H (xh, yh, λN). Din fiecare hologramă, câmpul E (x, y, z; λ) se calculează ca o matrice complexă 3D față de volumul din vecinătatea obiectului (figura 30). Apare suprapunerea acestor matrice N-D
(29)
Adică, pentru un număr suficient de mare de lungimi de undă, câmpul rezultat este proporțional cu câmpul de la obiect și nu este zero numai la punctele obiectului. În practică, dacă se folosește un număr finit N de lungimi de undă cu incrementare uniform Δ(1 / λ) a lungimilor de undă inverse, atunci imaginea obiectului A(r) se repetă (alta decât efectul de difracție / defocalizare a propagării) la o lungime de undă Λ=[Δ(1 / λ)]-1, cu rezoluție axială δ = Λ / N. Prin folosirea valorilor corespunzătoare Δ(1 / λ) și N, lungimea de undă a buclei Λ Poate fi potrivită domeniului axial al obiectului, și δ la nivelul dorit de rezoluție axială.
Fig. 6.7 Exemple de imagini de topografie și tomografie DIH. (A), (b) și (c) prezintă randarea în perspectivă a unor date imagine de volum 3-D ale amprentei degetului prin DIH din câteva unghiuri diferite de vizualizare. Volumul imaginii este de 4,86 mm × 4,86 mm × 0,210 mm [225]. (D) și (e) prezintă volumul reconstruit al probei nervului optic uman: (d) secțiunea transversală x-y, FOV = 1100 × 1100μm2; (E) secțiuni transversale y-z, 1100 x 280,35 pm2, la x1, x2 și x3; (F) secțiunile transversale x-z, 280,35 × 1100μm2, la y1, y2 și y3 [226].
DIH a fost aplicat la imagistica tomografică a țesuturilor retiniene [226] și pentru generarea profilurilor 3-D ale amprentei digitale [225] (figura 6.7). Reconstrucția DIH pe un plan înclinat arbitrar a fost demonstrată [166,167]. O diodă superlumuminiscentă (SLD) și un filtru tunibil acousto-optic au fost utilizate ca sursă de lungime de undă variabilă în Ref. 85. S-a demonstrat rezoluția de adâncime tomografică submicronică [227] și a fost utilizată pentru profilarea membranelor eritrocitare de la 3-D [228].
6.9 Holografia heterodinelor
Holografia digitală heterodină este o extensie a holografiei digitale care schimbă faza [229]. Utilizând o pereche de AOM-uri, referința este transmisă frecvent în raport cu fasciculul obiectului cu un sfert din rata cadrelor CCD (fig.6.8), astfel că patru cadre consecutive dobândesc un set de imagini în fază cvadratură. Holografia heterodinelor în configurație în afara axei a fost utilizată pentru filtrarea componentelor reziduale de ordin zero și fals pentru a obține o sensibilitate maximă [179]. Holografia digitală Heterodyne, împreună cu iluminarea TIR, este utilizată pentru a imagina particule de aur sub formă de lungime subwave [210].
Fig. 6.8 Aparat pentru holografia heterodinei. AOM: modulatori acousto-optici; BS: splitter de fascicul; F: frecvențe optice (adaptate din [229]).
În holograma digitală în timp, o suprafață vibrată afișează marginile întunecate la zerourile funcției Bessel J0 (z), unde z este amplitudinea vibrațiilor [92,230]. Pentru vibrațiile cu amplitudine mare, franjurile devin prea numeroase și dificil de rezolvat. Holografia digitală laterală folosește o holografie digitală heterodyne cu decalajul de frecvență al referinței reglate la orice a n-armonie frecvenței vibrațiilor, permițând observarea selectivă a zonelor cu amplitudine mare [231].
CAPITOLUL 8 – Concluzii
Am prezentat o tehnica inovatoare in curs de dezvoltare în holografia digitală, cu accent pe tehnicile și aplicațiile de microscopie. Într-o istorie relativ scurtă, interesele și activitățile au crescut exponențial, după cum arată o scurtă privire la statistici. Un număr din ce în ce mai mare de cercetători – nu numai în domeniul fizicii optice și ingineriei optice, dar și în domenii diverse de aplicații precum microbiologia, medicina, știința marină, analiza particulelor, microelectromecanica și metrologia – realizează noile capabilități ale holografiei digitale.
Mai întâi, prin înlocuirea proceselor fotochimice greoaie cu imaginile optoelectronice, DH permite îmbunătățirea ordinii de mărime a vitezei de achiziție și a sensibilității.
În al doilea rând, reprezentarea numerică a câmpurilor optice produce o serie de interferențe și alte tehnici de manipulare dificile sau imposibil de realizat în holografia spațiului real. În sfârșit, disponibilitatea fazei complexe a câmpurilor optice duce la microscopia cu fază cantitativă într-o manieră directă, extrem de sensibilă și versatilă. Într-adevăr, holografia digitală este considerată a fi un progres care poate revitaliza zona generală a holografiei, a cărei dezvoltare a fost oarecum stagnantă, iar aplicațiile constrânse. Odată cu dezvoltarea continuă a tehnologiilor electronice de imagistică și de calcul, este ușor să vă imaginați un viitor apropiat atunci când, de exemplu, rezoluția pixelilor va fi comparabilă cu media fotochimică și încărcătura computațională nu va deveni o problemă prea mare. Cu astfel de evoluții tehnologice, vor apărea noi capabilități de imagistică holografică care vor fi imaginate conceptual.
Accelerarea progreselor va necesita, de asemenea, reexaminarea multor preconcepții moștenite de la holografia convențională, cum ar fi abordările generale ale configurației aparatelor, comportamentul zgomotului și domeniul de aplicare al aplicațiilor. Acesta este într-adevăr un moment interesant pentru holografia digitală în general și se speră că această revizuire va contribui la explorarea curiozităților studenților și cercetătorilor mai capabili în domeniu.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Microscopia holografică digitală [302082] (ID: 302082)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.