Șef lucr. dr. SESĂRMAN Alina [302043]
UNIVERSITATEA „BABEȘ-BOLYAI” CLUJ-NAPOCA
Facultatea de Biologie și Geologie
Specializarea Biologie Medicală
LUCRARE DE DISERTAȚIE
Conducător științific:
Șef lucr. dr. SESĂRMAN Alina
Absolvent: [anonimizat] 2017
UNIVERSITATEA ,, BABEȘ-BOLYAI’’ CLUJ -[anonimizat], ȚINTĂ ÎN TERAPIA ANTICANCEROASĂ
Conducător științific:
Șef lucr. dr. SESĂRMAN Alina
Absolvent: [anonimizat] 2017
CUPRINS
INTRODUCERE 4
1. PROTEINELE 5
1.1. Definiție și funcții 5
1.2. Asocierea cu cancerul 5
2. [anonimizat] 6
2.1. Modificări necovalente în cancer 7
2.1.1. Plierea proteinelor 7
2.2. Modificări covalente în cancer 8
2.2.1. Acetilarea 9
2.2.1.1. Proteine acetilate 9
2.2.1.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 9
2.2.2. Fosforilarea 13
2.2.2.1. Proteine fosforilate 13
2.2.2.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 14
2.2.3. Glicozilarea 17
2.2.3.1. Proteine glicozilate 17
2.2.3.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 19
2.2.4. Metilarea 21
2.2.4.1. Proteine metilate 21
2.2.4.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 24
2.2.5. Nitrarea 25
2.2.5.1. Proteine nitrate 25
2.2.5.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 27
2.2.6. Ubiquitinarea 31
2.2.6.1. Proteine ubiquitinate 31
2.2.6.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă 34
2.2.7. Lipidarea 37
2.2.7.1. Proteine lipidate 37
2.2.7.2. Țintire în terapia anticanceroasă 38
2.3. Metode de analiză și identificare a proteinelor modificate în cancer 40
2.3.1. Spectrometria de masă 41
2.3.2. Imunohistochimia 42
2.3.3. Microarray de Proteine 43
CONCLUZII 45
BIBLIOGRAFIE 46
INTRODUCERE
Cancerul reprezintă una dintre cele mai necruțătoare boli din întreaga lume. În ultimii ani, s-au facut mari eforturi pentru a [anonimizat], dar și în dezvoltarea de metode eficiente de țintire anticanceroasă.
Scopul acestei lucrări reprezintă o încercare de a [anonimizat], ce roluri au aceste modificări în progresia cancerului și ce tehnologii pot fi aplicate prevenirii sau detectării clinice a cancerului, de asemenea, s-a [anonimizat]. Toate aceste abordări sunt organizate în două capitole.
[anonimizat] ,, Proteine‘’și conține o [anonimizat].
[anonimizat] ,,[anonimizat]‘’ conține o clasificare a [anonimizat] (necovalente, covalente), [anonimizat] (fosforilarea, acetilarea, glicozilarea, metilarea, nitrarea, ubiquitinarea, respectiv lipidarea ) unde este prezentată natura dinamică a proceselor de semnalizare pe care celulele le manifestă în timpul transformării lor pentru a deveni celule canceroase (neoplazice). [anonimizat], dar și metodele de țintire în terapia anticanceroasă. Tot în acest capitol, sunt prezentate câteva metode clinice de detecție a proteinelor modificate în cancer.
PROTEINELE
Definiție și funcții
Proteinele sunt cele mai instabile macromolecule din sistemele vii și sunt constituite dintr-un set de 20 de aminoacizi diferiți, legați prin legături peptidice. Acestea îndeplinesc funcții esențiale în ceea ce privesc toate procesele biologice: funcționează ca și catalizatori, sunt implicate în transportul și stocarea altor molecule precum oxigenul, conferă protecție imună și suport mecanic, transmit semnale în diferite celule, țesuturi și organe pentru a coordona procesele biologice.
[Berg și colab., 2002]
Asocierea cu cancerul
Genele controlează activitatea celulelor prin proteine specifice ce au rol de mesageri pentru celulă. Cancerul este o boală asociată cu modificări ale exprimării genelor (supraexprimări, pierderi ale exprimării) care duc la formarea de proteine anormale, care au capacitatea de a determina ca celulele să se înmulțească necontrolat și astfel să devină canceroase. Aceste modificări ale genelor pot fi declanșate de mutații ale genelor care codifică proteinele implicate în
repararea deteriorărilor ADN, semnalizarea celulară, dezvoltarea celulară, care la rândul lor sunt mutate și pot fi identificate în diferite celule canceroase, rearanjări ale cromozomilor etc.
[Sager 1997; Cooper 2000]
MODIFICĂRILE POST-SINTETICE ALE PROTEINELOR
Proteomul uman este dinamic și ca urmare acțiunii unor stimuli, acesta suferă modificări, iar modificările post-sintetice, ce au loc la unul sau mai mulți aminoacizi dintr-o proteină după ce proteina a fost tradusă de ribozom, sunt necesare pentru a reglementa activitatea celulară. Aceste modificări post-sintetice modifică forma, structura, conformația, afinitatea de legare a proteinelor și sunt frecvent mediate de activitatea unor enzime precum kinaze, fosfataze, transferaze, ligaze. Proteinele pot fi modificate post-sintetic în orice etapă din ciclul celular, pentru a se determina plierea corectă a proteinelor sau pentru direcționarea proteinelor nou formate spre alte compartimente celulare (nucleu, membrană). De asemenea, pe lângă afectarea funcțiilor proteinelor, aceste modificări post-sintetice duc și la degradarea lor, prin legarea la molecule-țintă.
[www.thermofisher.com; www.uniprot.org]
Modificările post-sintetice ce apar la proteine se clasifică în modificări necovalente (ce afectează structura lor prin procesul de pliere, adăugarea de cofactori ) și modificări covalente care includ, fosforilarea, acetilarea, glicozilarea, metilarea, nitrarea, ubiquitinarea, sumoilarea, lipidarea, hidroxilarea respectiv sulfatarea.
Proteinele supuse acestor forme de modificare post-sintetice sunt implicate în aproape toate evenimentele celulare (Tabel 1) ce contribuie la diversitatea și complexitatea funcției lor biologice.
Tabel 1. Implicații ale proteinelor modificate post-sintetic în evenimentele celulare
Modificări necovalente în cancer
Plierea proteinelor
Un proces la fel de important care trebuie întreprins pentru menținerea funcției proteinelor, este plierea acestora într-o conformație tridimensională. Deși plierea și replierea proteinelor au un rol esențial în ceea ce privește funcția proteinelor, modificarea aminoacizilor contribuie în mod semnificativ la diversitatea și funcția proteinelor.
În mediul celular, proteinele care sunt nou sintetizate prezintă un risc mare de pliere și de agregare greșită, ce pot duce la formarea unor specii cu potențial toxic. În scopul de a preveni sau de a reduce aceste ,,efecte” negative, celulele prezintă o rețea de șaperoane, care facilitează procesul de pliere a proteinelor (Fig. 1).
Șaperoanele, mai sunt denumite proteine de șoc termic (HSPs) sau proteine de stres; numărul lor crește în condiții de stres, indus de temperaturile ridicate și acționează ca niște catalizatori prin faptul că asistă la procesul de asamblare a proteinelor, însă nu fac parte din acel complex asamblat. Șaperoanele funcționează prin legarea și stabilizarea polipeptidelor nepliate sau parțial pliate, împiedicând astfel agregarea incorectă, permițând astfel lanțului polipeptidic să se plieze în conformația sa corectă. Șaperoanele stabilizează de asemenea, lanțurile polipeptidice nepliate în timpul transportului lor în organitele celulare, de exemplu, în timpul transferului proteinelor în mitocondriile din citosol (Fig. 2).
Proteinele sunt transportate prin membrana mitocondrială în conformații parțial pliate, care mai apoi sunt stabilizate de șaperoanele din citosol. Pe urmă, șaperoanele din mitocondrie facilitează transferul lanțului polipeptidic pe membrană, după care are loc plierea în organit. [Cooper 2000]
Figura 1. Plierea proteinei cu șaperoane
www.news.berkeley.edu
Figura 2. Transportul lanțurilor polipeptidice în mitocondrie
www.ncbi.nlm.nih.gov
Dintre proteinele de șoc termic, cele din familia Hsp27, Hsp40, Hsp60 și Hsp90 au fost identificate ca urmare a implicării lor în diferite tipuri de cancer (cancerul de sân, cancerul ovarian osteosarcomul, cancerul endometrial, leucemia, adenocarcinom pulmonar, cancerul de piele, cancerul de colo, gliomul, carcinomul hepatocelular, este leucemia mieloidă acută, limfom Hodgkin, carcinoame esofagiene cu celule scuamoase), iar acest lucru indică un prognostic mai puțin favorabil în ceea ce privește supraviețuirea și răspunsul la terapie.
[Ciocca și Calderwood 2005; Jego și colab., 2013, Zoubeidi și Gleave 2012; Mitra și colab., 2009; Capello și colab., 2008; Murphy 2013]
Modificări covalente în cancer
Modificările covalente ale proteinelor sunt responsabile pentru reglarea expresiei genetice, repararea ADN, diviziunea celulară, interacțiunile ce au loc între diferite căi de semnalizare în procesul de transformare a celulelor pentru a deveni canceroase. Astfel de modificări includ fosforilarea, acetilarea, glicozilarea, metilarea, nitrarea, ubiquitinarea, sumoilarea, lipidarea, hidroxilarea respectiv sulfatarea și sunt catalizate enzimatic de către kinaze, acetilaze etc.
Aceste modificări sunt importante nu doar pentru rolul pe care îl au legat de funcțiile celulare normale, ci și pentru că au un mare potențial în ceea ce privește țintirea unor tratamente pentru diferite boli, printre care și cancerul, prin utilizarea ca markeri pentru diagnosticarea bolii sau ca ținte moleculare în dezvoltarea de terapii inovative.
[Dwarakanath și colab., 2008; Jin și Zangar, 2009]
Acetilarea
Proteine acetilate
Acetilarea este una dintre modificările post-sintetice covalente ale proteinelor, având o mare importanță în ceea ce privește structura, funcția și localizarea intracelulară.
Acest proces are loc la capătul N-terminal a lizinei din histonă, este asociat cu menținerea stabilității proteinei și este facilitat de diferite enzime, histon acetilaze (HAT) sau histon deacetilaze (HDAC). Enzimele care catalizează acetilarea proteinelor (adăugarea de grupări acetil) a reziduurilor de lizină sunt denumite lizin (K) acetiltransferaze și sunt notate KAT.. Pentru aceste tipuri de enzime, este necesar acetil- CoA, ca donor de grupări acetil, fiind implicat în reglarea metabolică. În cazul unor modificări ale concentrației de acetil CoA, au loc schimbări cu privire la capacitatea enzimelor de a-și îndeplinii funcțiile.
Pe lângă histone, HDAC deacetilează și non-histone, care sunt diferiți factori nucleari de transcriere (factorul nuclear kB), și proteine (p53, CDK1, Hsp90, Myc, proteina de fuziune bcr-Abl etc)., care sunt implicate în proliferarea, diferențierea și apoptoza celulelor canceroase.
Modificările ce apar în semnalarea procesului de acetilare care rezultă din histon acetilaze și deacetilaze, pot duce la exprimări aberante ale genelor, ce includ activarea de proto-oncogene, suprimarea expresiei genelor supresoare de tumori, ceea ce duce la dezvoltarea cancerului. Cauza acestor exprimări aberante/ modificate poate fi un rezultat al leziunilor genetice care folosesc mecanisme epigenetice ce afectează expresia genetică și exprimarea proteinelor.
[Dwarakanath și colab., 2008; Kuo 2011; Narayan și colab., 2016; Singh și colab., 2010; Culf și Culf 2014]
Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Butiratul de sodiu a fost primul inhibitor utilizat în terapia anticanceroasă, datorită rolului său de a induce acetilarea histonelor. Alți inhibitori ca și, acidul valproic (VA), compusul Trichostatin A (TSA), care este un antibiotic fungic, și SAHA (acidul hidroxamic suberoilanilid) au fost identificați ca inhibitori ai histon deacetilazelor (HDACi). Acești inhibitori au activități anticanceroase puternice și specifice prin faptul că reglează nivelul de exprimare a genelor supresoarelor tumorale (p53, p21), scade nivelul de exprimare a diferitelor proteine apoptotice ca și Bcl-2 și blochează progresia ciclului celular (Fig. 3).
[Singh și colab., 2010; Marchion și Münster 2007; Lakshmaiah și colab., 2014]
Figura 3. Mecanismul de acțiune a inhibitorilor HDAC
Trichostatina A (TSA), este un inhibitor ce blochează proliferarea și declanșează apoptoza în carcinomul hepatocelular, blochează diferențierea celulelor în cancerul ovarian prin schimbarea genei supresoare tumorale p21 și prin legarea ADN la proteina ID1.
[Dwarakanath și colab., 2008]
Eficacitatea inhibitorului SAHA (acidul acidul hidroxamic suberoilanilid)/Vorinostat ca agent anticancer a fost demonstrată pe mai multe linii celulare tumorale, astfel încăt acesta a ajuns să fie utilizat în tratamentul limfomului cu celule T, o formă de limfom non-Hodgkin. Funcția acestui inhibitor este aceea de a inhiba metastaza celulelor canceroase.
În ceea ce privește modul de administrare a acestui medicament antitumoral, s-au creat nanoparticule lipidice (conțin surfactanți lipidici ca Precirol și Capryol, dar și lecitină) solide încapsulate cu Vorinostat (Fig. 4a), după care au fost administrate intravenos la șoareci ce prezentau diferite tumori. Rolul acestor nanoparticule lipidice este de a putea fi mai bine absorbite în celule, pentru a elibera medicamentul în celula canceroasă respectivă, cu scopul de a le distruge, fără a afecta într-un anumit fel, celulele sănătoase, datorită toxicității reduse. În urma acestui studiu, prin administrarea Vorinostatului sub formă încapsulată, s-a constat o reducere eficientă a tumorilor (Fig. 4b), prin scăderea nivelului de exprimare a histon deacetilazelor HDAC1 și HDAC3. Prin această formă încapsulată, eficacitatea Vorinostatului este mai mare decât prin administrarea în formă liberă, datorită faptului că aceste nanoparticule lipidice sunt mai bine reținute în organism, și astfel timpul de eliberare în celule este mai mare.
[Halsall și Turner 2016; Ropero și Esteller 2007; Sawant și Shegokar 2014; Tran și colab., 2014; Kwak și colab., 2015]
Figura 4. Nanoparticule lipidice cu Vorinostat
www.media.springernature.com
În terapia anticanceroasă, pe lângă SAHA și TSA, mai sunt folosiți și alți inhibitori ai HDAC, unii dintre aceștia fiind încă în stadii clinice, care sunt prezentați în Tabelul 2.
Tabel 2. Inhibitori HDAC
[Li și Seto 2016]
De asemenea, în tratamentul cancerului, se mai utilizează și inhibitori ai histon acetilazelor care pot fi naturali sau sintetici, precum curcumina, acidul anacardic din alunele de caju sau diferiți compuși conjugați cu CoA. Funcția acestor inhibitori naturali ai HAT este aceea de a împiedica dezvoltarea celulelor canceroase, prin faptul că generează specii reactive de oxigen care inhibă exprimarea genei p300 în diferite tipuri de cancere (leucemie, limfomul Hodgkin), blochează procesul de hiperacetilare a histonelor și induc astfel apoptoza în celulele canceroase.
[Zhang și colab., 2015; Folmer și colab., 2010; Haery și colab., 2015]
O altă abordare în ceea ce privește terapia anticanceroasă (ex. cancerul de sân, mielomul multiplu etc.) este, pe lângă utilizarea inhibitorilor HAT și HDAC, terapia epigenetică, care implică utilizarea unor liganzi epigenetici multiplii (epi-ML), ce sunt practic niște compuși cu structuri chimice care acționează împotriva mai multor tipuri de modificări de natură epigenetică, cum sunt modificări ce afectează ADN, structura cromatinei, prin modificări ale histonelor, ce implică activarea/ inactivarea sau nivelul de exprimare a unor gene asociate cu diferite tipuri de cancer.
Funcția acestor liganzi multipli este de a acționa simultan asupra mai multor modificări de natură epigenetică și de a induce apoptoza în celulele canceroase. Astfel de compuși epigenetici sunt psammaplinele din bureți de mare, în special Psammaplin A, ce acționează ca inhibitori ai enzimelor modificărilor epigenetice (ex. HDAC1) în diferite tipuri de cancere (ex. cancerul ovarian, cancerul de plămâni etc.).
[Di Cerbo și Schneider 2013; Issa și colab., 2017; Reuter și colab., 2011; Kanwal și Gupta 2012; Medina 2016; Charkie 2014]
Fosforilarea
Proteine fosforilate
Fosforilarea, ca modificare post-sintetică, reprezintă una dintre cele mai frecvente modificări reversibile într-o celulă și constă în adăugarea unei grupări fosfat de către o anumită kinază după care este îndepărtată de o fosfatază specifică (Fig. 5)
Figura 5. Mecanismul de acțiune a fosforilării
(PK-protein kinaza, PP-protein fosfataza)
www.ncbi.nlm.nih.gov
Protein kinazele (PK) sunt enzime care fosforilează resturi de serină, treonină și tirozină ale proteinelor specifice din celule. Prin fosforilare, este astfel reglată activitatea enzimatică a proteinelor, interacțiunea acestora cu alte proteine sau molecule, modul în care acestea sunt degradate prin intermediul proteazelor. Modificările ce au loc în căile de semnalizare a protein kinazelor, prin afectarea funcției kinazei, au ca și efect transformarea malignă a celulelor.
Protein tirozin kinazele (PTK) reprezintă o categorie de oncogene, sunt implicate în proliferarea celulară, ciclul celular, apoptoză, iar prin dereglări ale exprimării lor, duc la dezvoltarea mai multor tipuri de cancere umane. Tirozin kinazele sunt împărțite în două mari clase: receptori tirozin kinazici (RTK), de exemplu EGFR (receptorul pentru factorul de creștere epidermică), FGFR (receptorul pentru factorul de creștere fibroblastică), IR (receptorul pentru insulină), VEGFR (receptorul pentru factorul de creștere endoteliului vascular), și non-receptori tirozin kinazici (NRTK), de exemplu SRC, ABL etc.
[Adjei și Hidalgo 2005; Vlahovic și Crawford 2002]
Leucemia cronică mieoloidă este un sindrom al tulburării celuleor stem hematopietice mielodisplazice, datorată translocării între cromozomul 9 și cromozomul 22 (Cromozomul Philadelphia). Această translocație are ca rezultat juxtapunrea genei tirozin kinazei ABL1 (Abelson), care este implicată în reglarea ciclului celular, de pe cromozomul 9 lângă gena BCR (Breakpoint Cluster Region), de pe cromozomul 22, ce duce la formarea unei gene noi de fuziune (BCR-ABL) cu activitate kinazică mare (Fig. 6), ce transformă celulele stem hematopoietice și este asociată cu gradul de dezvoltare a bolii.
[Baccarani și colab., 2012; Shchemelinin și colab., 2006]
Figura 6. Cromozomii 9 si 22 normali – translocatia (9,22). Gena de fuziune BCR-ABL
www.synevo.ro
Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Tirozin kinazele au un impact în ceea ce privește patogeneza diferitelor tipuri de cancere, prin faptul că sunt potențiale ținte în medicamentele anticanceroase. Inhibitorii tirozin kinazelor (ITK), reprezintă o clasă de medicamente utilizate în chimioterapie, ce au rolul de a preveni și bloca căile vitale prin direcționarea moleculelor de semnalizare care sunt necesare pentru supreviețuirea celualară. Imatinibul (Gleevec) este un inhibitor al tirozin kinazei ce blochează receptorul kinazei de a se lega de ATP, împiedicând astfel fosforilarea care ar putea aduce beneficii celulei canceroase și favorizând astfel diviziunea celulară (Fig. 7). Acesta țintește proteina de fuziune BCR-ABL și este folosit în terapia leucemiei mieloide cronice, dar și alte tipuri de cancere (ex. cancerul de sân, glioblastom etc.)
Figura 7. Mecanismul de acțiune a inhibitorului Gleevec
(LMC-Leucemia mieloidă cronică)
www.leukd.blogspot.ro
Pentru o administrare cât mai bună a agenților terapeutici, pentru combaterea cât mai eficientă a tumorilor canceroase, s-au dezvoltat sisteme biodegradabile mici (de ex. nanoparticule/microsfere) care înglobează agentul terapeutic. Aceste nanoparticule sunt mai apoi eliberate în organism, preluate de celulele tumorale care recunosc liganzii țintă specifici, iar în urma eliberării agentului chimioterapeutic celulele sunt distruse, fără efecte secundare pentru celulele normale. Printre agenții chimioterapeutici care sunt încapsulați în astfel de sisteme, este și agentul terapeutic Imatinib, ce inhibă proteina de fuziune BCR-ABL din fosforilarea altor proteine în leucemia mieloidă acută, sau în alte tipuri de cancer (ex. cancerul de sân, glioblastom etc.).
Imatinib, este încapsulat în nanocapsule (Fig. 8 ) formate din acizi poli lactici și glicolici (PLGA), după care au fost administrate intravenos șoarecilor. S-a constat faptul că, prin administrarea de nanoparticule cu Imatinib, a fost inhibată proliferarea celulelor canceroase și angiogeneza (în cazul tumorilor craniene), dar și o scădere a gradului de toxicitate a agentului atunci când este administrat liber.
[Marslin și colab., 2015; Ylmaz și colab., 2012]
Figura 8. Microsfere cu Imatinib
www.researchgate.net
Vatalanibul este un inhibitor selectiv a tirozin kinazelor VEGFR (VEGFR-1 și VEGFR-2) și acționează direct asupra mielomului multiplu. Acesta este utilizat ca agent singur sau în asociere cu chimioterapia, la pacienții cu cancer colorectal, metastaze hepatice, cancerul de prostată, cancerul renal avansat.
Există și alți inhibitori ai tirozin kinazei care sunt utilizați în terapia anticanceroasă, prezentați în următorul tabel.
Tabel 3. Inhibitori tirozin kinazici
*PDGFR- receptorul pentru factorul de creștere derivat din plachete
Astfel, prin înțelegerea ciclului celular și a căilor moleculare de semnalizare, acești inhibitori ai kinazelor reprezintă o evoluție în tratamentul molecular anticanceros, față de metodele clasice. Acest lucru permite crearea unor tratamente specifice pentru un anumit tip de cancer, cu scopul de a reduce deteriorarea celulelor sănătoase și astfel crește rata succesului tratamentului respectiv.
[Arora și Scholar 2005; Bari și colab., 2012; Dervisis și Klahn 2016]
Glicozilarea
Proteine glicozilate
Glicozilarea reprezintă cel mai complex proces de modificare a proteinelor și este definit de procesul de adăugare a lipidelor și carbohidraților la proteine; astfel se formează lanțurile oligozaharidice, cunoscute sub denumirea de glicani, și se găsesc atât în multe proteine. Tipurile majore de modificări ale glicozilării proteice afectează structurile N-glicozidice și O-glicozidice, în funcție de locul de atașare a lanțului lateral de carbohidrați (Fig. 9).
Figura 9. Legarea lanțurilor laterale de carbohidrați la glicoproteine
The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition
Glicozilarea structurilor N-glicozidice presupune atașarea covalentă a unei oligozaharide la resturile de asparagină din lanțurile polipeptidice și este implicată în procesele de pliere a proteinelor, dezvoltare și migrare a tumorilor. Astfel de proteine N-glicozilate sunt apoliproteina B-100, α-1-antichimiotripsina, ceruloplasmina, iar supraexprimări sau modificări ale structurii acestora sunt identificate în mai multe tipuri de cancere, de exemplu, cancerul de sân, cancerul pancreatic, cancerul de plămân, cancerul de colon etc.
[Watson și colab., 2015; Vasconcelos dos Santos și colab. 2015; Sheta și Bachvarov 2014]
Glicozilarea structurilor O-glicozidice implică atașarea de N-acetilgalactozamină la oricare dintre resturile de serină sau treonină din proteine. Cea mai abundentă clasă de O-glicani o reprezintă mucinele (MUC), niște glicoproteine mari, în care sunt înglobate multe resturi de serină și treonină, iar modificări în structura lor sunt asociate cu diferite tipuri de cancere (gastric, ovarian, pancreatic, de sân etc.) (Fig. 10)
[Tucillo și colab., 2014]
Figura 10. Exprimarea mucinelor
Prin dereglările apărute în exprimare, există câteva tipuri de glicotransferaze (GALNACT), care sunt exprimate în diferite tumori maligne. Astfel, GALNT1 este exprimat în cancerul de vezică urinară; GALNT2 este supraexprimat în carcinomul cu celule scuamoase, dar mai este implicat și în carcinomul hepatocelular, prin modificări ale glicozilării EGFR ( receptorul pentru factorul de creștere epidermică), GALNT3 este supraexprimat în cancerul pancreatic; GALNT6 este identificat în carcinoamele gastrice; GALNT7 este implicat în progresia cancerului de col uterin și a carcinomului esofagian; GALNT9 este asociat cu neuroblastomul; GALNT10 este exprimat în cancerul gastric; GALNT11 este identificat în leucemia limfocitară cronică, iar mutațiile ce au loc în GALNT12 duc la dezvoltarea cancerului de colon.
[Sheta și Bachvarov 2014; Dall'Olio și Trinchera 2017; Ho și colab. 2016]
Dintre glicoproteinele transmembranare, CD44 aparține unei clase de receptori de adeziune celulară și este implicată în metastază. CD44 se leagă de acidul hialuronic (HA), fiind responsabil de semnalizarea celulară, dar și de declanșarea răspunsului imun inflamator. Aceste glicoproteine de suprafață celulară se întâlnesc în leucocite, limfocite T, în celulele stem canceroase (CSC) și pot corela cu dezvoltarea tumorală și metastază. La om, familia CD44 este codificată de o singură genă și prezintă mai multe izoforme cu diferite variante (v) (Fig. 11), în funcție de tipul de celulă stem canceroasă. Spre exemplu, CD44v6, este exprimat în limfoamele umane non-Hodgkin, cancerul colorectal, cancerul de sân însă cel mai frecvent, CD44 este exprimat în carcinomul ovarian epitelial.
[Basakran 2015; Martin și colab., 2013]
Figura 11. Structura CD44
(s-standard; v-variante)
www.smj.org.sa
Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Glicozilarea aberantă a glicoproteinelor din celulele canceroase, este abordată pentru dezvoltarea unor terapii bazate pe glicani, cum ar fi, inhibitori ai glicoziltransferazei, crearea de vaccinuri anticanceroase complet sintetice pe bază de glicani împotriva mai multor tipuri de cancer, de exemplu, vaccinurile pe bază de glicopeptide MUC1 cu diferite molecule (peptid T helper, receptor Toll-like etc.) sunt utilizate în tratarea cancerului de sân.
[Li și colab., 2010; Ho și colab., 2016]
Celulele stem din celulele canceroase, cum sunt cele din ficat, au dovedit rezistență la metodele clasice de terapie chimioterapie și radioterapie, ducând astfel la recidive. De aceea, s-a încercat o abordare nouă în ceea ce privește terapia, prin crearea de nanoparticule cu medicamente terapeutice pentru țintirea directă și eficientă a celulelor canceroase. Practic, aceste nanoparticule eliberează medicamentele terapeutice în celula canceroasă respectivă, și sunt preluate de celulele stem canceroase.
În terapia cancerului hepatic, este utilizat doxorubicina, un antibiotic cu toxicitate mare. De aceea, pentru a reduce gradul de toxicitate a doxorubicinei și pentru a crește eficiența sa, s-au realizat studii asupra unor șoareci ce prezentau diferite tumori, prin încapsularea doxorubicinei în lipozomi, urmând ca acești lipozomi să fie injectați. Conform studiilor, concentrația antibioticului a crescut, decât dacă era injectat liber, acest lucru având o eficiență mai mare prin faptul că, acele tumori au scăzut în volum. (Fig. 12)
[Watson și colab., 2015; Lu și colab., 2016; Rivankar 2014]
Figura 12. Terapia cu doxorubicină în lipozom
www.sciencedirect.com
Pentru pacienții care suferă de cancer ovarian, pancreatic, de plămâni, s-a explorat ca țintă terapeutică glicoproteina CD44, exprimată de celulele canceroase. Prin capacitatea sa de biodegrabilitate și prin afinitatea la CD44, acidul hialuronic, poate fi utilizat pentru administrarea specifică de agenți terapeutici (doxorubicină, paclitaxel, mitomicina, 5-fluoroacil etc.) pentru celulele canceroase, prin diferite nanoformulări, ce pot fi administrate eficient organelor și celulelor canceroase țintă, cu scopul de a îmbunătăți eliberarea specifică a medicamentelor antitumorale. Agentul chimioterapeutic, 5-fluoroacil a fost încărcat în nanoparticule din chitosan, care au fost conjugate cu acid hialuronic, ceea ce a dus modificarea dimensiunilor acestor nanoparticule (nanoparticulele s-au mărit) (Fig. 13b). Mai apoi, nanoparticulele cu HA au fost injectate în coada șoarecilor. Prin faptul că, nanoparticulele au fost conjugate cu HA, 5-fluoroacil a fost eliberat în celulele canceroase în concentrații mai mari, decât administrat liber, datorită gradului mare de toxicitate, dar și a timpului redus de eliberare, pe care îl are acest agent terapeutic. Totodată, s-a constat o diminuare considerabilă a tumorilor, prin inducerea apoptozei în celulele canceroase ale gliobastomului, ale plămânilor.
Practic, a fost îmbunătățită eficiența agentului antitumoral, printr-o distribuție uniformă la celulele țintă, datorită afinității acidului hialuronic la CD44, exprimat de celulele canceroase.
[Yadav și colab., 2010; Wang și colab., 2017]
O altă peptidă, A6 este implicată în inhibarea migrației, invaziei și metastazelor celulelor canceroase, a fost asociată cu legarea la CD44. Această peptidă, este utilizată în tratamentul la cancerului ovarian.
[Sacks și Barbolina 2015; Misra și colab., 2011; Yan și colab., 2015; Piotrowicz și colab., 2011]
Figura 13. Nanoparticule cu acid hialuronic
www.researchgate.net
Metilarea
Proteine metilate
Metilarea proteinelor este o modificare post-sintetică covalentă ce implică transferul unei grupări metil la resturile de lizină și arginină și este catalizată de o familie de enzime numite protein metiltransferaze (PMT) care utilizează S-adenozilmetionina ca donor de resturi metil (SAM).
[Petsko și Ringe 2004; Poulard și colab., 2016]
Lizina și arginina sunt supuse procesului de metilare în mod diferit, astfel, lizina este metilată ca monometil-, dimetil- și trimetil-lizină (Fig. 14b); fiecare fiind metilată de anumite protein lizin metiltransferaze (HMT/KMT). Arginina este, de asemenea, metilată în trei forme diferite: monmetil-arginină, dimetil-arginină asimetrică și dimetil-arginină simetrică (Fig. 14a) și sunt metilate de arginin metiltransferaze (PRMT).
[Bedford și Richard 2005; Zhang și colab., 2012; Poulard și colab., 2016]
Figura 14. Formele metilate ale lizinei și argininei
Există și metiltransferaze care catalizează resturi de lizină în proteinele non-histonice sau factori de transcripție (p53, ERα *, NFkB*, pCAF*, Rb*, VEGFR*), care sunt esențiale pentru modificările epigenetice ce au loc în cromatină, și pot fi implicate în cancer.
* ERα,- receptorul alfa pentru estrogen; * NFkB- factorul nuclear kapa B; * pCAF- factorul coactivator transcripțional, asociat cu proteina p53; * Rb- proteina retinoblastomului, * VEGFR- receptorul pentru factorul de creștere endoteliului vascular
[Zhang și colab., 2012; Karve și Cheema 2011]
Dereglările epigenetice apărute în procesul de metilare a proteinelor, prin diferite mutații sau exprimări aberante, duc la multe afecțiuni, printre care și cancerul. Astfel de dereglări apar în funcție de gradul de metilare ce au loc în gene diferite (hipo/hipermetilări), care sunt implicate în dezvoltarea cancerului. ADN genomic este supus metilării, prin intermediul unor enzime, denumite ADN metiltransferaze (ADNMTS), care sunt exprimate în nivele crescute în mai multe tipuri de cancer, de exemplu, cancerul ovarian, de sân, colon, pancreatic,gastric etc. (Fig. 15)
[Lewandowska și Batoszek 2011; ]
Figura 15. ADN metilat în cancer
www.nccri.ncc.go.jp
Nivele ridicate ale supraexprimării sau ale modificărilor în activitatea eznimatică ale arginin metiltransferazelor au fost identificate în diferite tipuri de cancer. (Tabel 4)
Tabel 4. Exprimări ale PRMT în cancerul uman
Poulard și colab. 2016; Hamamoto și Nakamura 2016
Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Rolul pe care îl au dereglările epigenetice în dezvoltarea cancerului a dus la crearea de terapii ce vizează acest tip de modificări. Inhibitorii arginin metiltransferazelor, ca allantodapsonă și stilbamdină și ai ADN ca azacitidină, decitabină și zebularină sunt în prezent cele mai utilizate medicamente în terapia cancerelor (ex. leucemie, cancer de sân) ca urmare a modificărilor epigenetice, prin faptul că inhibă genele supresoare tumorale. Pentru ca acești agenți terapeutici să poată acționa ca și inhibitori ai ADNMT, trebuie să fie integrați în ADN în timpul sintezei. Această integrare implică faptul că, acești agenți terapeutici suferă modificări chimice, înglobează ADN metiltransferaza, înlocuiește citozina și creează un complex între ADN metiltransferază și ADN-ul înlocuit de substanța respectivă, unde acestea sunt degradate. (Fig. 16)
[Kim 2015; Lewandowska și Bartoszek 2011; Gnyszka și colab., 2013; Morettin și colab., 2015]
Figura 16. Acțiunea azacitadinei în terapia cancerului
www.vidaza.net
Pentru o administrare cât mai bună a agenților terapeutici, pentru combaterea cât mai eficientă a tumorilor canceroase, s-au dezvoltat sisteme biodegradabile mici (de ex. nanoparticule/microsfere) care înglobează agentul terapeutic, care odată eliberate în organism țintesc celulele tumorale și sunt distruse, fără efecte secundare pentru celulele normale.
Deși marea majoritate a acestor tip de sisteme de înglobare a agenților terapeutici (lipozomi, nanoparticule, nanocapsule et.) sunt administratți intravenos, există studii care au încercat să schimbe modul de administrare a acestora. Un exemplu, sunt nanoparticulele ce înglobează agentul terapeutic decitabina, un inhibitor al ADNMT, utilizat în tratamentul leucemiei cronice și acute, cancerul de sân, cancere declanșate de gene care sunt suprimate de metilarea aberantă a ADN. Administrarea nanoparticulelor a fost pe cale orală, pe șoareci, cărora le-a fost indusă leucemia. (Fig. 17). Aceste nanoparticule sunt formate din acizi poli lactici și glicolici (PLGA), pentru a proteja decitabina de degradarea acizilor din stomac, și pentru a putea străbate mai ușor prin circulația sanguină. Scopul administrării orale a medicamentelor antitumorale prin formă încapsulată, este de a îmbunătății calitatea vieții pacientului, dar și o creștere a eficienței tratamentelor chimioterapeutice, dat fiind faptul că decitabina este instabil, administrat oral și este degradat rapid în ficat. S-a constatat o scădere a proliferării celulelor canceroase în leucemie, comparativ cu administrarea medicamentului liber sau în combinație cu alte medicamente antitumorale.
[Jain și colab., 2016; Neupane și colab., 2014]
Figura 17. Nanoparticule încărcate cu decitabină
www.rjpbcs.com
Nitrarea
Proteine nitrate
Nitrarea proteinelor face parte din modificările oxidative ale proteinelor, la contactul cu agenți de nitrare (peroxinitrit) sau în cazul unor nivele crescute de stres oxidativ, și constă în atașarea de grupări de nitriți (-NO2), la resturile de tirozină din proteine de către speciile reactive de nitrogen.
[Karve și Cheema 2011; Vannini și colab. 2015]
Oxidul nitric (NO), este un compus liber ce străbate membranele celulare și interacționează cu moleculele țintă, fără a avea nevoie de transportatori sau receptori speciali.
NO se formează din oxidarea aminoacidului l-arginină, sub activitatea catalitică a sintetazelor (NOS) care necesită NADPH și O2 ca și cosubstrate, pentru a produce NO și l-citrulină ca și produși finali (Fig. 18). Oxidul nitric este generat de trei tipuri de sintetaze: neuronal (nNOs sau NOS1), inductibil (iNOS) și endotelial (eNOS sau NOS3).
Dintre cele trei enzime NOS, iNOS produce mai mult NO decât celelalte enzime și este implicat în transformarea malignă, angiogeneza și metastază.
[De Sanctis și colab., 2014;Vannini și colab., 2015]
Figura 18. Formarea oxidului nitric
www.ncbi.nlm.nih.go
Pe lângă implicația sa în diferite procese biologice (traducere, procesarea ARNm etc.), oxidul nitric în asociere cu speciile reactive de oxigen/nitrogen, mai este implicat și în dezvoltarea unor tipuri de cancer, prin modificările ce au loc în genele supresoare tumorale (deteriorări/ supraexprimări), dar și prin modificarea nivelului de stres oxidativ.
Cancerul pulmonar poate fi inițiat atunci când o celulă normală din plămân suferă mutații genetice, astfel se formează tumorile, care se pot răspândi în alte zone din plămâni. Fumul de țigară, unul dintre factorii declanșatori al acestui tip de cancer (Fig. 19), conține diferiți compuși cancerigeni (nitrozamine, hidrocarburi), care, în exces, pot inflama căile respiratorii prin acumularea de specii reactive de oxigen și nitrogen (ROS/RNS).
[Wiseman și Halliwell, 1996; Masri 2010]
Figura 19. Cancerul pulmonar
www.erj.ersjournals.com
Nivele mari de oxid nitric au fost identificate și în țesuturile cancerului de sân, dar și în celulele carcinomului mamar. Exprimările NOS sunt asociate cu tipurile de hormoni secretați (estrogen, progesteron), dovedind implicarea NOS, ca și compuși liberi, în dezvoltarea cancerului de sân.
Celulele cervicale produc oxid nitric. Nivele crescute de NO au fost depistate la pacienții cu cancer de col uterin, indicând astfel implicația sa în progresia cancerului de col uterin. De asemenea, NO este asociat cu acest tip de cancer și prin infecțiile cu virusul papilloma (HPV), în condițiile în care au loc supraexprimări ale izoformelor eNOS și iNOS, și astfel, este stimulată dezvoltarea celulară a celulelor infectate cu acest tip de virus.
[Vahora și colab., 2016; Choudhari și colab., 2013]
Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Oxidul nitric, prin izoformele sale, este implicat în dezvoltarea anumitor tipuri de cancer. De aceea, pentru a încetini dezvoltarea tumorală, pentru a îmbunătății eficiența terapiilor convenționale (chimio/radioterapia), se cercetează diferite metode de dezvoltare de inhibitori NOS (în funcție de tipul de cancer și gradul de evoluție), dar și de potențiali compuși cu activitate anticanceroasă care generează și donează NO. Scopul acestor compuși este de a inhiba procesele de dezvoltare a tumorilor, metastazare celulară, angiogeneză.
[Choudhari și colab., 2013; Hickok și Thomas 2010]
Statinele (de exemplu simvastatină, fluvastatină, pravastatină, lovastatină) sunt agenți de scădere a nivelelor colesterolului, care inhibă HMG-CoA reductaza (3- hidroxi-3-metilglutaril coenzima A). Aceasta, la rândul său, catalizează conversia HMG-CoA în mevalonat și astfel este limitată biosinteza colesterolului (Fig. 20). Statinele au dovedit a avea activitate antitumorigenă și apoptotică care este mediată de inducerea iNOS, împotriva multor tipuri de cancer, inclusiv carcinomul de sân.
www.medscape.org
Figura 20. Acțiunea statinelor
În terapia anticanceroasă cu statine, au fost dezvoltate sisteme de dimensiuni mici (lipozomi, micelii, nanoparticule etc.) care înglobează acești agenți și o transportă la locul țintă, în celula canceroasă și astfel este limitată acumularea agenților terapeutici în celulele/țesutul sănătos.
[Pandey și colab., 2016; Romana și colab., 2014]
O abordare nouă în terapie, este utilizarea statinelor sub formă de nanocristale, deoarece, comparativ cu celelalte tipuri de sisteme, acestea nu au nevoie de alți compuși (substanțe polimerice etc.), astfel sub această formă, pot avea o eficiență mai mare în terapie, pentru că se pot dizolva mai rapid în organism, decât administrate oral. (Fig. 21 )
Figura 21. Cristale de simvastatină
www.innovareacademics.in
Un alt tip de sistem utilizat în terapia cu statine, sunt nanoparticulele, care apar sub formă de nanocapsule, care prezintă o membrană realizată din polimeri, care limitează eliberarea medicamentului la locul țintă. De exemplu, agenții terapeutici fluvastatină și simvastatină, au fost înglobați într-un astfel de sistem, realizat din PPSu (poli-propilen-succinat). Scopul realizării de astfel de sisteme, este de a se reduce doza de fluvastatină în cazul administrării orale, dar și a posibilelor efecte adverse ce pot apărea în cazul unor supradozaje. (Fig. 22)
Figura 22. Nanoparticule de simvastatină
www.researchgate.net
Datorită proprietăților antiinflamatoare a statinelor, s-a cercetat activitatea acestora în celule canceroase, prin înglobarea în sisteme de tip lipozomi (vezicule lipidice, care protejează agenții terapeutici împtriva degradării). De exemplu, agentul terapeutic, pravastatina, a fost utilizat în astfel de lipozomi. Cercetările in vivo, pe șoareci, au demonstrat faptul că, în cazul administrării de lipozomi cu pravastatină, eficiența în tratarea tumorilor a fost mai mare, comparativ cu tratamentul clasic de pravastatină, datorită capacității de a inhiba proteinele care sunt implicate în declanșarea inflamației.
Statinele administrate sub formă de nanocristale, nanoparticule, lipozomi sunt utilizate în tratamentul diferitelor forme de cancer, cum este cancerul de sân, cancerul ovarian, cancerul de prostată, melanom.
[Romana și colab., 2014; Wu și colab., 2015]
Agenții chimio-preventivi de cancer (Tabel 5) care au activitate antitumorală au fost cercetați în scopul inducerii inhibiției iNOS. Cel mai cunoscut agent chimioterapeutic 5-fluorouracil (5-FU) a indus iNOS și apoptoza în celulele canceroase hepatice, datorită compusului l-arginină, care a îmbunătățit sensibilitatea celulelor la 5-FU. De asemenea, medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene dononare de NO , precum aspirina și ibuprofenul, au demonstrat a avea funcții anti-proliferative, anti-apoptotice în celulele canceroase (ale cancerului de sân, de prostată), prin faptul că au activitate inhibitorie a ciclooxigenazei 2 (COX-2), care se găsește supraexprimată în diferite tipuri de cancer, dar și împotriva prostaglandinelor, care se produc în cazul inflamațiilor.
[Vannini și colab., 2015; Rayburn și colab., 2009; Roxburgh și McMillan 2014]
Tabel 5. Agenți chimio-preventivi din alimentație
[Vahora și colab., 2016]
Ubiquitinarea
Proteine ubiquitinate
Ubiquitinarea este o modificare post-sintetică ce este coordonată și catalizată enzimatic și vizează proteinele pentru degradare și reciclare. Acest tip de modificare are un rol important în celulă, fiind implicată în ciclul celular, transcriere, diferențiere celulară, răspunsul la deteriorarea ADN și dezvoltarea cancerului.
[Wei și Lin 2012; Shi și Grossman 2010]
Proteinele care sunt supuse degradării sunt marcate de o atașare covalentă a unei proteine reglatoare la resturi de lizină, denumită ubiquitină (Ub) și implică activarea acesteia cu ajutorul unor enzime cu diferite funcții: enzime de activare (E1), de conjugare (E2), ligaze (E3) ce recunosc substratele țintă, dar și enzime de dezubiquitinare (DUB), ce au rolul de înlătura ubiquitina din substratele țintă și o reciclează în citosol. (Fig. 23)
Figura 23. Procesul de ubiquitinare a proteinelor
www.ncbi.nlm.nih.gov
Prin faptul că multe proteine implicate în ciclul celular, proliferare celulară, apoptoză sunt ubiquitinate, de cele mai multe ori, astfel de evenimente celulare sunt modificate în cancer, prin exprimări aberante ale enzimelor ubiquitinării, acestea fiind asociate ca oncogene sau supresoaare tumorale în diverse tipuri de cancer.
Enzimele de conjugare (E2), au funcția de a transfera ubiquitina diferitelor substrate ale proteinelor țintă, transferul fiind mai mare atunci când sunt asociate cu o ligază de tipul E3, sunt implicate în reglarea progresiei ciclului celular, a inflamației și sunt supraexprimate în mai multe tipuri de cancer. De exemplu, enzima de conjugare a ubiquitinei E2N (UBE2N), este supraexprimată în diverse tumori, precum cea de sân, pancreas, prostată etc. iar cofactorul ei, UBE2V1 (varianta 1), se găsește la nivel ridicat în cancerul de sân și cel colorectal, și este asociată cu creșterea migrării celulor canceroase în ambele tipuri de cancer dar și cu creșterea tumorală.
[Gallo și colab., 2017; Kar și colab., 2013]
Ligazele E3 sunt implicate în reglarea proliferării celulare, oprirea ciclului celuar și apoptoză. Acestea pot fi supresoare tumorale sau oncogene, în funcție de capacitatea lor de a degrada fie oncogena, fie proteina supresoare tumorală. Ubiquitin ligazele de tip 3 sunt de mai multe tipuri, în funcție de domeniul catalitic conservate: RING- contribuie la transferul direct al ubiquitinei la substratul proteinei țintă, HECT (Homology to E6AP Carboxy Terminus)- se leagă de ubiquitină înainte să fie transferată ulterior și contribuie la degradarea proteinei supresoare p53 și familia de proteine omoloage UFD2 (U-box).
[Shi și Grossman 2010; Sun 2006]
Ligaza Mdm2 (murine double minute 2, HDM2 la om) este o ligază de tip E3-RING și este responsabilă de ubiquitinarea și degradarea proteinei supresoare tumorale p53, care prin rolurile sale de a promova invazia celuleor canceroase, metastaza, etc., este implicată în declanșarea cancerului. Această ligază acționează prin faptul că se leagă direct de p53, inhibând astfel din funcțiile p53( apoptoza, deteriorări ADN etc.), reglând nivelul acesteia. (Fig. 24)
[Shi și Grossman, 2010; Huang și Dixit 2016; Micel și colab., 2013]
Mdm2, prin nivele crescute, inactivează funcția p53 și contribuie la progresia metastazelor în diferite tipuri de cancer precum cancerul de sân, cancerul pulmonar, tumori ( limfomul Hodgkin), osteosarcoame.
[Sane și Rezvani, 2017]
Figura 24. Interacțiunea Mdm2-p53
www.researchgate.net
Inhibitorii proteinelor de apoptoză (IAP), fac parte din tipul E3 de ligaze și sunt active în diferite cancere. Aceștia intervin în degradarea mai multor substrate implicate în apoptoză, reglează diferiți factori nucleari (NF-kB) și căi de semnalizare care controlează exprimarea genelor implicate în inflamație, supraviețuirea celulară. IAP sunt exprimați în cancerele hepatice, pulmonare, carcinoamele ovariene, tumori limfoide.
[Shi și Grossman 2010; Owens și colab., 2013]
Proteina BRCA1 este la rândul său o ligază E3; are activitate supresoare tumorală și este implicată în procesul de reparare a ADN. Această proteină este exprimată în mod aberant în cele mai multe cazuri de cancer mamar, dar și în cancerul ovarian. Pentru a avea activitate de tip ligază E3, BRCA1 formează un complex prin asocierea cu o altă proteină numită BARD1, cu domeniu RING, și duce astfel la creșterea activității ubiquitin ligazei pentru suprimarea tumorii.
[Shi și Grossman 2010; Wu și colab., 2008]
O altă ligază E3 implicată în ubiquitinare și degradarea mediată de proteasom, este complexul VHL (von Hippel-Lindau)- cu o proteină cu un domeniu catalitic de tip RING, care este exprimată aberant în sindromul cu aceeași von Hippel-Lindau. Boala este caracterizată prin dezvoltarea unor tumori la nivelul celulelor renale, dar și la pancreas ( se formează chisturi). Unul dintre substrate ale ligazei VHL este HIF-1α (factorul 1α inducibil al hipoxiei) (Fig. 25), care este un mediator esențial al oxigenului și reglator al genelor în angiogeneză. În condiții de hipoxie, se pierde interacțiunea dintre HIF-1α și VHL pentru degradare, și astfel se induc gene ca factorul de creștere endotelial vascular (VEGF) sau alte gene inductibile de hipoxie.
[Shi și Grossman 2010; Kamura și colab., 2000; Robinson și Ardley 2004]
Figura 25. Mecansimul ligazei VHL
www.wikiwand.com
Proteina asociată cu E6 (E6-AP) face parte din familia de ligaze HECT E3 și are funcția de a cataliza ubiquitinarea și de a contribui la degradarea genei supresoare p53 de către proteasom în infecțiile cu papilomavirusuri umane (HPV), în funcție de tipul de HPV. Tipurile de HPV de mare risc, cum sunt cele de tip 16, 18, 31 sunt asociate cu cancerul de col uterin, împreună cu cancerele genitale dar și cele de gât și cap.
[Kar și colab., 2013; Micel și colab., 2013; Spataro și colab., 1998]
Enzimele de dezubiquitinare (DUB) sunt și ele implicate în degradarea proteasomului, în procesele reparatorii ale ADN. Supraexprimarea acestor enzime este asociată cu cancerele umane. De exemplu, USP7/HAUSP este implicată în reglarea funcției genei supresoare p53 dar și în înlăturarea ubiquitinei din Mdm2; este superexprimată în carcinomul de plămâni fără celule mici, cancerul de prostată. O altă enzimă de dezubiquitinare este USP28, care are funcția de a controla activitatea genei c-Myc, care este implicată în dezvoltarea celulelor canceroase, și este exprimată în cancerele de colon și sân.
[Shi și Grossman 2010; Kar și colab., 2013]
Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Se încearcă dezvoltarea de agenți care vizează inhibarea activităților ligazelor E2, E3 și DUB., prin crearea de inhibitori ai enzimelor de dezubiquitinare, pentru țintirea USP7 (Fig. 26), sau inhibitori ca Nutlin-3 și MI-219, cu activitate antitumorală puternică în mai multe tipuri de cancere, printre care osteosarcomul și cancerul de prostată, care stabilizează concentrațiile celulare ale Mdm2, suprimă activitatea complexului Mdm2-p53 prin eliminarea ubiquitinei., astfel s-ar induce apoptoza în celulele canceroase (Fig. 27)
[Gallo și colab., 2017; Shangary și Wang 2008]
Figura 26. Potențialul terapeutic în țintirea USP7
www.cumc.columbia.edu
Figura 27. Acțiunea inhibitorilor (Nutlin-3) în complexul
Mdm2-p53
www.pnas.org
În prezent, se utilizează în terapia antitumorală inhibitori ai proteasomului, care intervin în căile de semnalizare implicate în procesul de formare a tumorilor, precum delanzomib, carfilzomib, oprozomib, moarizomib. Primul inbitor proteasomic utilizat în scop clinic este bortezomib, în tratarea cancerului de prostată, pancreatic, mielom etc.; un compus care mediază degradarea proteică și are un efect citotoxic asupra celulelor mielomului. Pentru a reduce toxicitatea în celule, și pentru a avea o eficiență mai bună în tratatarea mielomului, acești compuși inhibitori ai proteasomul sunt înglobați în lipozomi, în combinație cu alți agenți terapeutici. Desigur, că, pentru crearea de aceste nanoparticule este necesară atenta selecție a polimerilor ce urmează a fi utilizați, în funcție de agentul terapeutic ales.
În acest caz, de tratare a mielomului, s-a folosit ca polimer poli-etilen-glicol (PEG), pentru proprietățile sale în ceea ce privește mărimea nanoparticulei, compatibilitatea cu agenții terapeutici, ușurința cu care aceștia pot fi înglobați, pentru dezvoltarea de lipozomi în care agenții terapeutici precum carfilzomib și dozorubicina sunt încapsulate și mai apoi injectate. (Fig. 28 ).
S-a constatat prin această combinație de medicamente, încetinirea dezvoltării tumorii, studiu realizat pe șoareci, decât în cazul în care agenții terapeutici ar fi fost administrați singular și liber.
[Weathington și Mallampalli 2014; Ashley și colab., 2016]
mct.aacrjournals.org
Figura 28. Nanoparticule ce înglobează carfilzomib și doxorubicină
în tratarea mielomului multiplu
încărcarea cu doxorubicină; b. încărcarea cu carfilzomib;
c. nanoparticula ce ambii agenți terapeutici
2.2.7. Lipidarea
2.2.7.1. Proteine lipidate
Palmitolarea/ lipidarea este o modificare covalenta post-sintetică ce implică adăugarea de acizi grași cu 16 atomi de carbon la resturile de cisteină din membrana celulară și sunt catalizate de către protein aciltransferaze (PAT). Acest tip de modificare este reversibilă, proteinele pot fi și depalmitolate, și are un rol important în asocierea și interacțiunea proteinelor membranare. Mutațiile în aceste enzime sunt asociate cu declanșarea cancerului.
Dintre proteinele care suferă modificări lipidice sunt cele din familia RAS. Aceste proto-oncogene sunt frecvent mutate în cancerele umane și sunt codificate de trei gene : KRAS(cea mai frecventă în cancer), HRAS și NRAS. RAS aparțin familiei de proteine mici G, și sunt implicate în creșterea, proliferarea și supraviețuirea celulară. Proteinele RAS sunt lipidate de către anumite protein aciltransferaze (DHH9, DHH11, DHH17), enzime ce au funcție oncogenică, dereglează căile de semnalizare din cancer și prin acestă lipidare, este afectată interacțiunea membranară a izoformelor RAS. Mutații în căile de semnalizare ale genei RAS (RAS-MAPK) blochează proteina, ceea ce duce la exprimarea aberantă a acesteia și este asociată în multe cancere (Tabel 6).
[Guan și Fierke 2011; Azmi 2016; Planey 2013; Rajasekharan și Raman 2013]
Calea de semnalizare MAPK (protein kinaze activate de mitogen) implică legarea factorilor de creștere (TGF-α, EGF, VEGF, PDGF-α) de receptorii proteinei tirozin kinazei, care activează tirozin kinaza. Prin fosforilarea tirozinei, factorii activatori ai RAS, numiți SOS (son sof sevenless) din membrana plasmatică, se atașează la fosfotirozină prin intermediul proteinelor adaptoare Grb2, care facilitează îndepărtarea GDP de la RAS; RAS se leagă de GTP și fosforilează RAF, MEK și ERK. (Fig. 29).
[Santarpia și colab., 2012; Roberts și Der 2007; Cristea și Sage 2016]
Tabel 6. Tipuri cancere asociate cu RAS
Midgley și Kerr 2002
Figura 29. Calea Ras/Mapk
www.journals.prous.com
Țintire în terapia anticanceroasă
O strategie alternativă în terapia antitumorală ar fi utilizarea unei combinații de inhibitori ai căii de semnalizare Ras/Mapk, de exemplu cu inhibitori RAF, pentru tratamentul melanomului, și tratamentul cu inhibitori ai receptorului de creștere epidermal (EGFR), pentru cancerul pulmonar, fără celule mici (NSCLC) (Fig. 30), sau inhibitori ai histon deacetilazelor (HDAC), ca apicidina; inhibitori ce au funcția de a deregla exprimări ale RAS, dar și a de încetini proliferarea celulelor canceroase.
[Mattingly 2013; Ahronian și Corcoran 2017; Rajasekharan și Raman 2013]
În scopul țintirii terapeutice a oncogenelor RAS, o metodă ar fi asocierea agenților antitumorali cu nanovezicule (ex. lipozomi), pentru a crește eficacitatea lor, dar și pentru a reduce gradul de toxicitate a acestora împotriva celulelor normale. Prin utilizarea de astfel de nanoparticule, șansele ca țesuturile tumorale sau celulele canceroase să fie țintite de către agentul terapeutic este mai mare, față de acțiunea liberă a acestuia.
S-a cercetat acțiunea antitumorală a arsenicului, prin trioxidul de arsen, un compus ce induce apoptoza, inhibă creșterea tumorală și reglează exprimarea K-Ras în diferite tipuri de cancer ( carcinoame pancreatice, cancerul de prostată, leucemie etc.), în care K-Ras este mutant. Nanoveziculele (lipozomi) au fost realizate din polimeri de tip PEG (poli-etilen-glicol). Trioxidul de arsen (ATO) este înglobat în lipozomi, care au fost încărcați în prealabil cu săruri metalice cum sunt acetatul de nichel, cobalt, cupru, zinc etc. cu care trioxidul de arsen fomrează complexe.(Fig. 31). Lipozomii încărcați cu trioxidul de arsen sunt pe urmă injectați, ajung în circulația sangvină unde sunt preluați de către celulele tumorale, nanoparticulele de arsen fiind astfel eliberate din lipozomi, în tumori, la un pH scăzut. Trioxidul de arsen poate fi înglobat în lipozomi ca agent singular, sau mai poate fi asociat și cu alți agenti antitumorali, în funcție de eficiența lor dar și de tipul de cancer în care aceștia sunt utilizați.
S-a constatat prin această metodă eficacitatea terapeutică a arsenului, studiu realizat pe șoareci, prin încetinirea dezvoltării celulelor canceroase, creșterii tumorale în diferite tipuri de cancer (pancreatic, colorectal, leucemie etc.), decât în cazul în care agenții terapeutici/ trioxidul de arsen ar fi fost administrați singular și liber, caz în care gradul de toxicitate ar fi fost prea puternic pentru celulele normale și eficacitatea lor prea scăzută.
[Ahn și colab., 2010; Akhtar și colab., 2017; Printz 2010; Chen și colab., 2006; Antman 2001; Baláz și Sedlák 2010]
Figura 30 . Inhibitori RAS
(ALK-kinaza limfomului anaplazic; PI3K-fosfoinozitid 3 kinaza)
www.genomemedicine.biomedcentral.com
Figura 31. a. nanoparticule de Arsen; b. lipozomi cu arsen în săruri de nichel
lipozomi de arsen în săruri de cobalt
www.spandidos-publications.com
www.researchgate.net
Metode de analiză și identificare a proteinelor modificate în cancer
În diagnosticul și tratamentul cancerului este deosebit de important detectarea precoce
fiindcă acest lucru îmbunătățește șansele de supraviețuire. Cu toate acestea, diagnosticarea inadecvată nu permite detectarea anumitor tipuri de cancer decât în stadii finale.
Proteomica este un domeniu care avansează rapid, datorită evoluțiilor în ceea ce privește spectrometria de masă și tehnologiile asociate cu aceasta. Scopul acestor tehnologii este detectarea precoce a proteinelor modificate post-sintetic,dar și a siturilor lor în cancer și, dacă este posibil, dezvoltarea de terapii.
[Lu și colab., 2007]
În prezent, s-au dezvoltat metode de analiză și identificare a proteinelor modificate , cum sunt cele bazate pe imunohistochimie (IHC), analiza enzimatică legată de imuno-absorbție (ELISA), spectrometria de masă etc.
[Powers și Palecek 2012]
Spectrometria de masă
Spectrometria de masă este utilizată în domeniul diagnosticării cancerului în două moduri diferite, în primul rând, pentru descoperirea de noi biomarkeri în cancer și în al doilea rând, ca instrument de identificare a proteinelor modificate, diagnosticare și imagistică în cancer. Identificarea proteinelor se poate realiza din soluții ce conțin proteine purificate și uneori din amestecuri complexe.
[Van der Merwe și colab., 2007]
Modificările post-sintetice ale proteinelor pot fi identificate prin spectrometria de masă în funcție de tipurile de modificări ce au loc la resturile de aminoacizi specifici modificării post-sintetice respective ( fosforilare, acetilare, lipidare, metilare etc.). Aceste modificări ale resturilor de aminoacizi, duc implicit și la modificarea masei moleculare a proteinei (creșteri/scăderi).
Pentru a identifica proteina de interes, pentru o anumită modificare post-sintetică, este necesară digestia enzimatică a acesteia cu anumite enzime (tripsină sau alte proteaze), ca să fie în fragmente peptidice mici pentru a facilita procesul de analiză, după ce proteinele au fost izolate și separate prin electroforeză pe gel SDS-PAGE. Mai apoi, aceste peptide sunt puse într-o placă de sticlă acoperită cu oxid de indiu, după care se aplică o matrice și se obțin astfel spectre, în funcție de masă și încărcarea electrică a proteinelor ce sunt analizate (spectrometrie de masă de tip MALDI-MS). Spectrele astfel obținute sunt comparate și analizate cu programe bioinformatice, pentru a identifica acele fragmente de peptide ce conțin un anumit tip de modificare post-sintetică, cu masa moleculară schimbată, datorită adiției de grupări chimice specifice tipului respectiv de modificare post-sintetică. De exemplu, acetilarea-42 Da; fosforilarea 80 Da, nitrarea- 45 Da etc.
[Powers și Palecek 2012; Larsen și colab., 2006; Cheng și Zhang 2008; Parker și colab., 2010]
Pe lângă metoda de identificare a proteinelor modificate în funcție de masa lor moleculară modificată, există, la unele tipuri de modificări post-sintetice, de exemplu, la fosforilare, și alte metode de detecție. Datorită faptului că, unele fosfopeptide, se găsesc în cantități reduse, s-a încercat supradozarea lor în proba de analiză, prin utilizarea de anticorpi specifici, enzime specifice ca fosfataza, care va duce astfel la detectarea fosfopeptidelor prin creșterea/scăderea masei moleculare; sau asocierea cu alte metode, de exemplu, cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC), care implică utilizarea de metale ca zinc, fier etc., pentru care fosfoproteinele au afinitate.
[Parker și colab., 2010; Seo și Lee 2004; Sickmann și colab., 2002; Johnson 2012]
Prin spectrometria de masă, tip MALDI sunt astfel diagnosticate mai multe tipuri de cancere, printre care cancerul de sân cu modificări ale p53, BRCA1 și BRCA2, HER2, ER, carcinomul colorectal cu modificări ale BRAF, RAS, EGFR, cancerul hepatocelular și carcinomul renal. [Kriegsmann și colab., 2015; Powers și Palecek 2012]
În Tabelul 7, sunt prezentate câteva tipuri de modificări post-sintetice detectate prin spectrometria de masă, în cancerul de sân.
Tabel 7. Modificări post-sintetice în cancerul de sân
[Hongjun și Zangar 2009]
Imunohistochimia
Imunohistochimia (IHC) este o metodă ce utilizează anticorpi specifici pentru detectarea și analiza unor proteine modificate dintr-o probă sau țesut. Printre metodele de detectare a proteinelor exprimate aberant, în anumite tumori canceroase, se numără marcarea anticorpilor, prin colorarea cu fluorofor (imunoflorescență) sau cu anumite enzime (peroxidază, fosfatază alcalină). Această metodă este utilizată în vederea determinării tipurilor de celule canceroase, clasificării tipului de cancer și posibila origine a celulei canceroase respective.
Imunohistochimia, prin intermediul anticorpilor detectează modificări post-sintetice specifice, de exemplu, fosforilarea, cu scopul de a studia gradul de fosforilare și situsurile fosfoproteinelor modificate în celule. Pentru detectarea proteinelor fosforilate, a interacțiunilor dintre ele, și a componentelor căii de semnalizare, este necesară utilizarea unor anticorpi fosfo-specifici. Astfel, va face posibilă identificarea situsurilor de activare de pe anumiți receptori fosforilați sau gene, care sunt implicați în diferite cancere, ca receptorul hormonilor estrogen și progesteron, markerul Her2 (Fig. 32) la pacienții cu cancer mamar, gena p16 ca marker de substituție în infecția cu virusul papilloma (HPV) și cancerul asociat cu acest virus, și gena p63 asociată cu cancerul de prostată.
[Duraiyan și colab., 2012; Idiko 2010; O'Hurley și colab., 2014; Jin și Zangar 2009; Shi și Stack 2015]
Figura 32. Testul de imunohistochimie pentru Her2
negativ; b. neconcludent; c. pozitiv
www.nature.com/modpathol/journal
Microarray de Proteine
Prin microarray de proteine se pot măsura cu acuratețe concentrațiile de proteine la un intervalul scăzut de pg/ml probă. Anticorpii microarray sunt utilizați în scopul detectării proteinelor modificate post-sintetic ce sunt implicate în cancer, a interacțiunii dintre acestea, dar și în identificarea de biomarkeri și dezvoltarea de terapii. De asemenea, mai sunt utilizați diferiți compuși ca lectine pentru detectarea glicoproteinelor modificate, peptide pentru a evalua activitatea enzimatică a unor enzime implicate în căile de semnalizare ale acestor modificări post-sintetice. Această tehnică este utilizată în detectarea diferitelor modificări post-sintetice, atunci când detectarea lor este neclară sau imposibilă prin alte tehnici (ex. IHC, MS etc.)
[Powers și Palecek 2012; Uzoma și Zhu 2013; Jin și Zangar 2009]
Prin metoda ELISA microarray, pentru identificarea proteinelor fosforilate, se utilizează un anticorp de captare, pentru proteina țintă, după care este adăugat un alt anticorp care are specificitate pentru situl de fosforilare a proteinei care este supusă analizei. Detectarea proteinei de interes, în acest caz, proteina fosforilată, este analizată în funcție de intensitatea colorimetrică care exprimă gradul de concentrație al proteinei de interes în probă. Astfel, se pot detecta modificări la nivelul situsului de fosforilare ale proteinelor (ex. Bcr-Abl, EGFR), care sunt asociate cu diferite tipuri de cancer ca și cancerul pancreatic, leucemia cronică mieloidă, cancerul de prostată etc.
[Merbl și Kirschner 2010; Gembitsky și colab., 2004; Atak și colab., 2016]
O altă modificare post-sintetică, în care aceste tehnici de array de proteine sunt aplicate este glicozilarea. Pentru identificarea proteinelor glicozilate modificate, sunt utilizate compuși ca autoanticorpi împotriva unor glicopeptide și lectine, cu afinitate pentru glicoproteine, care ar facilita astfel detecția glicoproteinelor modificate în cancer sau a unor antigene (CA 19-9, CA 15-3, CA-125), care ar putea fi utilizate ca biomarkeri în diagnostic. Astfel, se pot detecta modificări la nivelul situsului de glicozilare ale proteinelor (ex. mucine- MUC1, MUC5, MUC16, alfa fetoproteina), care sunt asociate cu diferite tipuri de cancer ca și cancerul de piele, cancerul hepatocelular, cancerul pancreatic, cancerul colorectal etc.
[ Atak și colab., 2016; Jacob și colab., 2011; Patwa și colab., 2010;Powers și Palecek 2012]
CONCLUZII
În această lucrare de disertație s-a urmărit prezentarea principalelor aspecte privind modificările post-sintetice întâlnite la proteine în cancer.
Metodele tehnologice avansate precum spectrometria de masă, imunohistochimia, array de proteine sunt disponibile din ce în ce mai mult pentru identificarea și caracterizarea acestor tipuri de modificări ale proteinelor.
S-a încercat evidențierea cât mai precisă a modificărilor post-sintetice (acetilare, fosforilare, metilare, glicozilare, nitrare, ubiquitinare și lipidare) și rolul pe care îl au proteinele modificate în transcrierea genetică, activitățile enzimatice, procesele de semnalizare celulară pe care celulele le manifestă în timpul transformării lor pentru a deveni celule neoplazice, prin utilizarea de figuri, scheme și tabele.
Datorită rolului pe care îl au proteinele modificate în patologia bolii și prin înțelegerea mecanismelor de acțiune în progresia cancerului, acestea devin obiective pentru dezvoltarea de medicamente/terapii antitumorale.
BIBLIOGRAFIE
Adjei A.A., Hidalgo M., 2005, Intracellular signal transduction pathway proteins as targets for cancer therapy, J. Clin. Oncol., 23(23), pp. 5386-5403.
Ahn R.W., Chen F., Chen H., Stern S.T., et al., 2010, A novel nanoparticulate formulation of arsenic trioxide with enhanced therapeutic efficacy in a murine model breast cancer, Clin. Cancer Res., 16(14), pp. 3607-3617.
Ahronian L.G., Corcoran R.B., 2017, Strategies for monitoring and combating resistance to combination kinase inhibitors for cancer therapy, Genome Medicine, 9(37), pp. 1-12.
Akhtar A., Wang S.X., Ghali L., et al., 2017, Recent advances in arsenic trioxide encapsulated nanoparticles as drug delivery agents to solid cancers, J. Biomed. Res., 31(3), pp. 177-188.
Antman K.H., 2001, Introduction: The history of arsenic trioxide in cancer therapy, The Oncol., 6(2), pp. 1-2.
Arora A., Scholar E.M., 2005, Role of tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy, Perspectives in Pharmacol., 315(3), pp. 971-979.
Ashley J.D., 2016, Dual Carfilzomib and Doxorubicin loaded liposomal nanoparticles for synergistic efficacy in multiple myeloma, Mol. Cancer. Ther., 15(7), pp. 1452-1459.
Atak A., Mukherjee S., Jain R., Gupta S., et al., 2016, Protein microarray applications: Autoantibody detection and postranslational modification, Proteomics, 16(19), pp. 2557-2569.
Azmi A.S., 2016, Activation of RAS by post-translational modifications, Conquering RAS: From biology to cancer therapy, 1st edition, Editura Academic Press, Oxford, pp. 104-105.
Baccarani M., Pileri S., Steegmann J.L., Muller M., Soverini S., Dreyling M., 2012, Chronic myeloid leukemia: ESMO Clinical Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up, Ann. Oncol., 23(7), pp. 72-77.
Baláz P., Sedlák J., 2010, Arsenic in cancer treatment: Challenges for application of realgar nanoparticles (a minireview), Toxins, 2, pp. 1568-1581.
Bari S.B., Surana S.J., 2012, Tyrosine kinase receptor inhibitors: A new target for anticancer drug development, J. Phar. SciTech., 1(2), pp. 36-45.
Basakran N.S., 2015, CD44 as a potential diagnostic tumor marker, Saudi Med. J., 36(3), pp. 273-279.
Bedford M.T., Richard S., 2006, Arginine methylation: An emerging regulator of protein function, Molec. Cell, 18, pp. 263-272.
Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., 2002, Protein structure and function, Biochemistry, 5th edition, Editura W.H. Freeman and Company, New York.
Capello F., Conway de Macario E., Marasà L., Zummo G., Macario A.J.L., 2008, Hsp60 expression, new locations, functions and perspectives for cancer diagnosis and therapy, Cancer Biol. & Ther., 7(6), pp. 801-809.
Charkie J., 2014, Psammaplin A: A putative adjuvant for DNA damaging therapies, J. Cancer. Sci.Ther., 6(2), pp. 505-509.
Chen H., MacDonald R.C., Li S., Krett N.L., et al., 2006, Lipid encapsulation of arsenic trioxide attenuates cytoxicity and allows for controlled anticancer drug release, J. Am. Chem. Soc., 128(41), pp. 13348-13349.
Cheng L., Zhang D.Y., 2008, Introduction to clinical proteomics, Molecular genetic pathology, Editura Humana Press, pp. 232-238.
Choudhari S.K., Chaudhari M., Bagde S., et al., 2013, Nitric oxide and cancer: a review, World J. Surgical Oncol., 11(118), pp. 1-11.
Ciocca D.R., Calderwood S.K., 2005, Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications, Cell Stress & Chaperones, 10(2), pp. 86-103.
Cooper G.M., 2000, Protein folding and processing, The Cell: A molecular approach, 2nd edition, Editura Sinauer Associates, Sunderland (MA).
Cooper G.M., 2000, The development and causes of cancer, The Cell: A molecular approach, 2nd edition, Editura Sinauer Associates, Sunderland (MA).
Cristea S., Sage J., 2016, Is the canonical RAF/MEK/ERK signaling pathway a therapeutic target in SCLC?, J. Thorac. Oncol., 11(8), pp. 1233-1241.
Culf M., Culf A., 2014, Protein acetylation as an integral part of metabolism in cancer development and progression, Am. J. Cancer Rev., 2(1), pp. 1-23.
Dall’Olio F., Trinchera M., 2017, Epigenetic bases of aberrant glycosylation in cancer, Int. J. Mol. Sci., 18(998), pp. 1-19.
De Sanctis F., Sandri S., Ferrarini G., Pagliarello I., et al., 2014, The emerging immunological role of post-translational modifications by reactive nitrogen species in cancer microenvironment, Front. Immunol., 5(69), pp. 1-12.
Dervisis N., Klahn S., 2016, Therapeutic innovations: Tyrosine kinase inhibitors in cancer, Vet. Sci., 3(4), pp. 1-11.
Di Cerbo V., Schneider R., 2013, Cancers with wrong HATs: the impact of acetylation, Briefings in Functional Genomics, 12(3), pp. 231-243.
Duraivan J., Govindaraian R., Kalivappan K., Palanisamy M., 2012, Applications of immunohistochemistry, J. Pharm. Bioallied. Sci., 4(2), pp. 307-309.
Dwarakanath B.S., Verma A., Bhatt A.N., Parmar V.S., Raj H.G., 2008, Targeting protein acetylation for improving cancer therapy, Ind. J. Med. Res., 128, pp. 13-21.
Folmer F., Orlikova B., Schnekenburger M., Dicato M., Diederich M., 2010, Naturally occurring regulators of histone acetylation/deacetylation, Current Nutr.& Food Sci., 6, pp. 78-99.
Gallo L.H., Ko J., Donogue D.J., 2017, The importance of regulatory ubiquitination in cancer and metastasis, Cell Cycle, 16(7), pp. 634-648.
Gembitsky D.S., Lawlor K., Jacovina A., Yaneva M., Tempst P., 2004, A prototype antibody microarray platform to monitor changes in protein tyrosine phosphorilation, Molec. & Cell. Proteomics, 3(11), pp. 1102-1118.
Gnyszka A., Jastrzębski Z., Flis S., 2013, DNA methyltransferase inhibitors and their emerging role in epigenetic therapy of cancer, Anticancer Res., 33, pp. 2989-2996.
Guan X., Fierke C.A., 2011, Understanding protein palmitoylation: Biological significance and enzymology, Sci. China Chem., 54(12), pp. 1888-1897.
Haery L., Thompson R.C., Gilmore T.D., 2015, Histone acetyltransferases and histone deacetylases in B- and T-cell development, physiology and malignancy, Genes&Cancer, 6(5-6), pp. 184-213.
Halsall J.A., Turner B.M., 2016, Histone deacetylase inhibitors for cancer therapy: An evolutionarily ancient resistance response may explain their limited success, Bioessays, 38, pp. 1102-1110.
Hamamoto R., Nakamura Y., 2016, Dysregulation of protein methyltransferases in human cancer: An emerging target class for anticancer therapy, Cancer Sci., 107, pp. 377-384.
Hickok J.R., Thomas D.D., 2010, Nitric oxide and cancer therapy: The emperor has no clothes, Curr. Pharm. Des., 16(4), pp. 381-391.
Ho L.W., Hsu W.M., Huang M.C., Kadomatsu K., Nakagawara A., 2016, Protein glycosylation in cancers and its potential therapeutic applications in neuroblastoma, J. Hematol. Oncol., 9(1), pp. 1-15.
Huang X., Dixit V.M., 2016, Drugging the undruggables: exploring the ubiquitin system for drug development, Cell Res., 26, pp. 484-498.
Idikio H.A., 2009, Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretations of immunohistochemical stains, Int. J. Clin. Exp. Pathol., 3(2), pp. 169-176.
Issa M.E., Takhsha F.S., Chirumamilla C.S., Perez-Novo C., et al., 2017, Epigenetic strategies to reverse drug resistance in heterogenous multiple myeloma, Clin. Epig., 9(17), pp. 1-13.
Jacob F., Goldstein D.R., Bovin N.V., Pochechueva T., et al., 2012, Serum antiglycan antibody detection of nonmucinous ovarian cancers by usig a printed glycan array, Int. J. Cancer, 130, pp. 138-146.
Jain P., Tiwari M., kumar N., Rao J.V., Udupa N., 2016, Orally delivered decitabine loaded PLGA nanoparticles combined with docetaxel supress solid tumors: an in vitro investigation, Res. J. Pharm. Biol.&Chem. Sci., 7(5), 417-424.
Jego G., Hazoumé A., Seigneuric R., Garrido C., 2013, Targeting heat shock proteins in cancer, Cancer Letters, 332, pp. 275-285.
Jin H., Zangar R.C., 2009, Protein modifications as potential biomarkers in breast cancer, Biomarker Insights, 4, pp. 191-200.
Johnson M., 2012, Protein modification research methods, Mater Methods, 2(118), pp. 1-12.
Kamura T., Sato S., Iwai K., Czyzyk-Krzeska M., et al., 2000, Activation of HIF1α ubiquitination by a reconstituted von Hippel-Landau (VHL) tumor supressor complex, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97(19), pp. 10430-14035.
Kaneal R., Gupta S., 2012, Epigenetic modifications in cancer, Clin Genet., 81(4), pp. 303-311.
Kar G., Keskin O., Fraternali F., Gursoy A., 2013, Emerging role of the ubiquitin-protesome system as drug targets, Current Pharmaceutical Design, 19(00), pp. 1-15.
Karve T.M., Cheema A.K., 2011, Small changes huge Impact: The role of protein post-translational modifications in cellular homeostasis and disease, J. Amino Acids, 2011, pp. 1-13.
Kim Y.Z., 2015, Protein methylation and demethylation in cancer, Int. J. Neurol. Research, 1(3), 129-140.
Kriegsmann M., Arens N., Endris V., Weichert W., Kriegsmann J., 2015, Detection of KRAS, NRAS, BRAF by mass spectrometry- a sensitive, reliable, fast and cost-effective technique, Diagnostic Pathology, 10(132), pp. 1-11.
Kwak T.W., Kim D.H., Jeong Y.I., Kang D.H., 2015, Antitumor activity of vorinostat- incorporated nanoparticles against human cholangiocarcinoma cells, J. Nanobiotechnol., 13(60), pp. 1-11.
Lakshmaiah K.C., Jacob L.A., Aparna S., Lokanatha D., Saldanha S.C., 2014, Epigenetic therapy of cancer with histone deacetylase inhibitors, J. Cancer Res.&Ther., 10(3), pp. 469-478.
Larsen M.R., Trelle M.B., Thingholm T.E., Jensen O.N., 2006, Analysis of posttranslational modifications of proteins by tandem mass spectrometry, Biotechniques, 40(6), pp. 790-798.
Lewandowska J., Bartoszek A., 2011, DNA methylation in cancer development, diagnosis and therapy- multiple opportunities for genotoxic agents to act as methylome disruptors or remediators, Mutagenesis, 26(4), pp. 475-487.
Li M., Song L., Qin X., 2010, Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer-vaccines, J. Biosci., 35, pp. 665-673.
Li Y., seto E., 2016, HDACs and HDAC inhibitors in cancer development and therapy, Cold Spring Harb. Prospect Med., 6, pp. 1-34.
Lu B., Huang X., Mo J., Zhao W., 2016, Drug delivery using nanoparticles for cancer stem-like cell targeting, Front. Pharmacol., 7(84), pp. 1-12.
Lu M., Faull K., Whitelegge J.P., He J., et al., 2007, Proteomics and mass spectrometry for cancer biomarker discovery, Biomarker Insights, 2, pp. 347-360.
Marchion D., Münster P., 2007, Development of histone deacetylase inhibitors for cancer treatment, Expert Rev. Anticancer Ther., 7(4), pp. 583-598.
Marslin g., Revina A.M., Megraj V.K., Balakumar K.K., Prakash J., et al., 2015, Delivery as nanoparticles reduces imatinib mesylate-induced cardiotoxicity and improves anticancer activity, Int. J. Nanomed., 10, pp. 3163-3170.
Martin T.A., Ye L., Sanders A.J., Lane J., Jiang W.G., 2013, Cancer invasion and metastasis: Molecular and cellular perspective, Madame Curie Bioscience Database, Editura Landes Bioscience, Austin (TX), pp. 1-54.
Masri F., 2010, Role of nitric oxide and its metabolites as potential markers in lung cancer, Ann. Thoracic Medicine, 5(3), pp. 123-127.
Mattingly R.R., 2013, Activated Ras as a therapeutic target: constraints on directly targeting Ras isoforms and wild-type versus mutated proteins, ISRN Oncology, 2013, pp. 1-14.
Medina F.J., 2016, The road ahead of the Epi-informatics fiels, Epi-informatics: Discovery and development of small molecule epigenetic drugs and probes, 1st edition, Editura Academic Press, Oxford, pp. 411-413.
Merbl Y., Kirschner M.W., 2011, Protein microarrays for genome-wide posttranslational modification analysis, Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med., 3(3), pp. 347-356.
Micel N.L., Tentler J.J., Smith P.G., Eckhardt S.G., 2013, Role of ubiquitin ligases and the proteasome in oncogenesis: Novel targets for anticancer therapies, J. Clin. Oncol., 31, pp. 1231-1238.
Midgley R.S., Kerr D.J., 2002, Ras as a target in cancer therapy, Critical Rev. Oncol. Hematol., 44(2), pp. 109-120.
Misra S., Heldin P., Hascall V.C., Karamanos N.K., Skandalis S.S., et al., 2011, HA/CD44 interactions as potential targets for cancer therapy, FEBS. J., 278(9), pp. 1429-1443.
Mitra A., Shevde L.A., Samant R.S., 2008, Multi-faced role of HSP40 in cancer, Clin. Exp. Metastasis, 26, pp. 559-567.
Morettin A., Baldwin R.M., Côté J., 2015, Arginine methyltransferases as novel therapeutic targets for breast cancer, Mutagenesis, 30, pp. 177-189.
Murphy M.E., 2013, The HSP70 family and cancer, Carcinogenesis, 34(6), pp. 1181-1188.
Narayan S., Bader G.D., Reimand J., 2016, Frequent mutations in acetylation and ubiquitination sites suggest novel driver mechanisms of cancer, Gen. Med., 8(55), pp. 1-13.
Neupane R.Y., Srivastava M., Gyenwalee S., Ahmad N., et al., 2014, Solid lipid nanoparticles for oral delivery of decitabine: Formulation optimization, characterization, stability and ex-vivo gut permeation studies, Sci. Adv. Mater., 6, pp. 1-13.
O’Hurley G., Sjöstedt E., Rahman A., Li B., Kampf C., et al., 2014, Garbage in, garbage out: A critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers, Molec. Oncol., 8, pp. 783-798.
Owens W.T., Gilmore P.A., Streuli C.H., Foster F.M., 2013, Inhibitor of apoptosis proteins: Promising targets for cancer therapy, J. Carcinog. Mutagen, 14, pp. 1-9.
Pandey H., Rani R., Agarwal V., 2016, Liposome and their applications in cancer therapy, Braz. Arch. Biol. Technol., 59, pp. 1-10.
Parker C.E., Mocanu V., Mocanu M., Dicheva N., Warren M.R., 2010, Mass spectrometry for post-translational modifications, Neuroproteomics, Editura CRC Press/Taylor&Francis, Boca Raton (FL).
Patwa T., Li C., Simeone D.M., Lubman D.M., 2010, Glycoprotein analysis using protein microarrays and mass spectrometry, Mass Spectrom. Rev., 29(5), pp. 830-844.
Petsko G.A., Ringe D., 2004, Protein Structure and Function, Editura New Science Press Ltd., London, pp. 126-127.
Piotrowicz R.S., Damaj B.B., Hachicha M., Incardona F., et al., 2011, A6 peptide activates CD44 adhesive activity, induces FAK and MEK phosphorylation, and inhibits the migration and metastasis of CD44-expressing cells, Mol. Cancer Ther., 10(11), pp. 2072-2081.
Planey S.L., 2013, Discovery of selective and potent inhibitors of plamitoylation, Drug discovery, Editura Intech, pp. 251-276.
Poulard C., Corbo L., Le Romancer M., 2016, Protein arginine methylation/demethylation and cancer, Oncotarget, 7(41), pp. 67532-67550.
Powers A.D., Palecek S.P., 2012, Protein analytical assays for diagnosing, monitoring, and choosing treatment for cancer patient, J. Healthc. Eng., 3(4), 503-534.
Printz C., 2010, Arsenic nanoparticle holds promise in blocking agressive breast cancer, Cancer, 116(24), pp. 5567.
Rajasekharan S.K., Raman T., 2013, Ras and Ras mutations in cancer, Cen. Eur. J. Biol., 8(7), pp. 609-624.
Rayburn E.R., Ezell S.J., Zhang R., 2009, Anti-inflamatory agents for cancer therapy, Mol Cell Pharmacol., 1(1), pp. 29-43.
Reuter S., Gupta S.C., Park B., Aggarwal B.B., 2011, Epigenetic changes induced by curcumin and other natural compounds, Genes Nutrs., 6(2), pp. 93-108.
Rivankar S., 2014, An overview of doxorubicin formulations in cancer therapy, J. Cancer Res.& Ther., 10(4), pp. 853-858.
Roberts P.J., Der C.J., 2007, Targeting the RAF-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer, Oncogene, 26, pp. 3291-3310.
Robinson P.A., Ardley H.C., 2004, Ubiquitin-protein ligases, J. Cell Sci., 117, pp. 5191-5194.
Romana B., Batger M., Prestidge C., Colombo G.,Sonvico F., 2014, Expanding the therapeutic potential of statins by means of nanotechnology enabled drug delivery systems, Curr. Topics Med. Chem., 14, pp. 1182-1193.
Ropero S., Esteller M., 2007, The role of histone deacetylases (HDACs) in human cancer, Molec. Oncol., 1, pp. 19-25.
Roxburgh C.S.D., McMillan D.C., 2014, Cancer and systemic inflammation: treat the tumor and treat the host, Br. J. Cancer., 110(6), pp. 1409-1412.
Sacks J.D., Barbolina M.V., 2015, Expression and function of CD44 in epithelial ovarian carcinoma, Biomolecules, 5, pp. 3051-3066.
Sager R., 1997, Expression genetics in cancer: Shifting the focus from DNA to RNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, pp. 952-955.
Sane S., Rezvani K., 2017, Essential Roles of E3 Ubiquitin ligases in p53 regulation, Int. J. Mol. Sci., 18(2), pp.1-20.
Santarpia L., Lippman S.L., El-Naggar A., 2012, Targeting the mitogen-activated protein kinase RAS-RAF signaling pathway in cancer therapy, Expert Opin. Ther. Targets, 16(1), pp. 103-119.
Sawant S., Shekogar R., 2014, Cancer research and therapy: Where are we today?, Int. J. Cancer Ther.& Oncol., 2(4), pp.1-18.
Seo J., Lee K.J., 2004, Post-translational modifications and their biological functions: Proteomic analysis and systematic approaches, J. Biochem.& Molec. Biol., 37(1), pp. 35-44.
Shangary S., Wang S., 2008, Targeting the MDM2–p53 interaction for cancer therapy, Clin. Cancer Res., 14(17), pp. 5318-5324.
Shchemelinin I., Šefc L., Nečas E., 2006, Protein kinases, their function and implication in cancer and other diseases, Folia Biologica (Praha), 52, pp. 81-101.
Sheta R., Bachvarov D., 2014, Role of aberrant glycosylation in ovarian cancer dissemination, Biomed. Reviews, 25, pp. 83-92.
Shi D., Grossman S.R., 2010, Ubiquitin becomes ubiquitinous in cancer. Emerging roles of ubiquitin ligases and deubiquitinases in tumorigenesis and as therapeutic targets, Cancer Biology & Therapy, 10(8), pp. 737-747.
Shi Z., Stack M.S., 2015, An update on immunohistochemistry in translational cancer reasearch, Cancer Transl. Med., 1(4), pp. 115-122.
Sickmann A., Mreyen M., Meyer H.E., 2002, Identification of modified proteins by mass spectrometry, I.U.B.M.B. Life, 54(2), pp. 51-57.
Singh B., Zhang G., Hwa Y.L. Li J., et al., 2010, Nonhistone protein acetylation as cancer therapy targets, Expert Rev. Anticancer Ther., 10(6), pp. 935-954.
Spataro V., Norbury C., Harris A.L., 1998, The ubiquitin-proteasome pathway in cancer, Brit. J. Cancer, 77(3), pp. 448-455.
Sun Y., 2006, E3 ubiquitin ligases as cancer targets and biomarkers, Neoplasia, 8(8), pp. 645-654.
Tran T.H., Chu D.T., Truong D.H, Tak J.W., et al., 2016, Development of lipid nanoparticles for a histone deacetylases inhibitor as a promising anticancer therapeutic, Drug delivery, 23(4), pp. 1335-1343.
Tucillo F.M., Laurentiis A., Palmieri C., Fiume G. et al., 2014, Aberrant glycosylation as biomarker for cancer: Focus on CD43, BioMed Research Int., 2014, pp. 1-14.
Uzoma I., Zhu H., 2013, Interactome Mapping: Using protein microarray technology to reconstruct diverse protein networks, Genom. Proteom. Bioinf., 11(1), pp, 18-28.
Vahora H., Khan M.A., Alalami U., Hussain A., 2016, The potential role of nitric oxide in halting cancer progression through chemoprevention, J. Cancer Prevention, 21(1), pp. 1-12.
Van der Merwe D.E., Oikonomopoulu K., Marshall J., Diamandis E.P., 2007, Mass spectrometry: uncovering the cancer proteome for diagnostics, Adv. Cancer Res., 96, pp. 23-50.
Vannini F., Kashfi K., Nath N., 2015, The dual role of iNOS in cancer, Redox Biol., 6, pp. 334-343.
Vasconcelos-dos Santos A., Oliveira I.A., Lucena M.C., Mantuano N.R, et al., 2015, Biosynthetic machinery involved in aberrant glycosylation: promising targets for developing of drugs against cancer, Front. Oncol., 5(138), pp. 1-23.
Vlahovic G., Crawford J., 2003, Activation of tyrosine kinases in cancer, The Oncol., 8, pp. 531-538.
Wang T., Hou J., Su C., Zhao L., Shi Y., 2017, Hyaluronic acid-coated chitosan nanoparticles induce ROS-mediated tumor cell apoptosis and enhance antitumor efficiency by targeted drug delivery via CD44, J. Nanobiotechnol., 15(7), pp. 1-12.
Watson M.E., Diepeveen L.A., Stubbs K.A., Yeoh G.C., 2015, Glycosylation-related diagnostic and therapeutic drug target markers in Hepatocellular Carcinoma, J. Gastrointestin Livers Dis., 24(3), pp. 349-357.
Weathington N.M., Mallampalli R.K., 2014, Emerging therapies targeting the ubiquitin proteasom system in cancer, J. Clin. Invest., 124(1), pp. 6-12.
Wei W., Lin H.K., 2012, The key role of ubiquitination and sumoylation in signaling and cancer: a research topic, Front. Oncol., 2(187), pp. 1-2.
Wiseman H., Halliwell B., 1996, Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer, Biochem. J., 313, pp. 17-29.
Wu W., Koike A., Rakeshita T., Ohta T., 2008, The ubiquitin E3 ligase activity of BRCA1 and its biological functions, Cell Division, 3(1), pp. 1-10.
Wu Y., Wang Z., Liu G., Wang X., et al., 2015, Novel Simvastatin-loaded nanoparticles based of cholic acid core star shaped PLGA for breast cancer treatment, J. Biomed. Nanotechnol., 11(7), pp. 1247-1260.
Yadav A.K., Agarwal A., Rai G., Mishra P, Jain S., et al., 2010, Development and characterization of hyaluronic acid decorated PLGA nanoparticles for delivery of 5-fluorouracil, Drug delivery, 17(8), pp. 561-572.
Yan Y., Zuo X., Wei D., 2015, Concise review: Emerging role of CD44 in cancer stem cells: A promising biomarker and therapeutic target, Stem Cells Transl. Med., 4(9), pp. 1033-1043.
Ylmaz O.K., Ozkan A., Akgun E., Kukut M., et al., 2012, Controlled release of imatinib mesylate from PLGA microspheres inhibit craniopharyngioma mediated angiogenesis, J. Mater. Sci.: Mater Med., 24(1), pp. 147-153.
Zhang C., Zhong J.F., Stucky A., Chen X.L., et al., 2015, Histone acetylation: novel target for the treatment of acute lymphoblastic leukemia, Clin. Epigen., 7, 1-10.
Zhang X., Wen H., Shi X., 2012, Lysine methylation: beyond histones, Acta Biochim. Biophys. Sin., 44(1), pp. 14-27.
Zoubeidi A., Gleave M., 2012, Small heat shock proteins in cancer therapy and prognosis, Int. J. Biochem. & Cell Biol., 44(2012), pp. 1646-1656.
Linkuri
135.https://www.researchgate.net/figure/311502657_fig1_Figure-2-sTeM-images-of-simvastatin-crystals-A-sVT-lcNs-B-and-sVT-lcN_Mailab-C
136. https://www.researchgate.net/figure/6763171_fig1_Figure-2
137.https://www.researchgate.net/figure/6869411_fig3_Fig-3-Mdm2-p53-interaction-Mdm2-translocates-from-the-nucleolus-to-the-nucleoplasm-and
138. http://www.uniprot.org/help/post-translational_modification
139.https://www.thermofisher.com/ro/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-post-translational-modification.html
140. http://www.nccri.ncc.go.jp/en/divisions/08epigenomics/14carc03_1.html
141. httpmedia.springernature.com/full/springerstatic/image/art%3A10.1186%2Fs12951-015-0122-4/MediaObjects/12951_2015_122_Figa_HTML.gif
142.https://www.researchgate.net/publication/301685835_Hyaluronic_acid conjugated_liposome_nanoparticles_for_targeted_delivery_to_CD44_overexpressing_glioblastoma_cells
143. http://news.berkeley.edu/2014/10/16/new-front-in-war-on-alzheimers-other-protein-folding-diseases/
144. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9843/figure/A1202/?report=objectonly
145. http://www.nature.com/nrc/journal/v1/n3/fig_tab/nrc1201-194a_F2.html
146. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1074718/figure/F1/
147. https://www.synevo.ro/gena-de-fuziune-bcr-abl1-detectie-cantitativa/
148. http://leukd.blogspot.ro/p/ignorance-is-torture.html
149. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9843/figure/A1213/?report=objectonly
150. http://www.nature.com/nrm/journal/v8/n4/fig_tab/nrm2143_F1.html
151. http://www.nature.com/nrc/journal/v4/n1/fig_tab/nrc1251_F4.html
152. https://www.smj.org.sa/index.php/smj/article/view/smj.2015.3.9622/7107
153.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=4819660_jcp-21-001f1.jpg
154. http://erj.ersjournals.com/content/erj/33/5/1165/F2.large.jpg
155. http://www.medscape.org/viewarticle/416521_13
156.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=3306611_nihms362025f1.jpg
157. http://www.wikiwand.com/en/Von_Hippel%E2%80%93Lindau_disease
158. http://www.pnas.org/content/103/6/1659/F1.expansion.html
159.http://www.nature.com/modpathol/journal/v21/n2s/fig_tab/modpathol200834f3.html#figure-title
160.https://journals.prous.com/journals/servlet/xmlxsl/pk_journals.xml_summary_pr?p_JournalId=2&p_RefId=712566&p_IsPs=N
161. https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-017-0431-3
162. http://www.cumc.columbia.edu/publications/in-vivo/Vol1_no8_apr29_02/
163.https://www.researchgate.net/figure/232230468_fig1_Fig-1-Scanning-electron-microscopy-micrographs-of-imatinib-mesylate-loaded-PLGA
164. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1742706115002883
165. http://www.vidaza.net/wp-admin/install.php
166. https://innovareacademics.in/journals/index.php/ijpps/article/view/13086/6727
167. http://www.rjpbcs.com/pdf/2016_7(5)/[52].pdf
168. http://mct.aacrjournals.org/content/molcanther/15/7/1452/F2.large.jpg
169. https://www.spandidos-publications.com/10.3892/etm.2015.2651
170.http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/life-science-innovations/mission-shrna-library.html
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Șef lucr. dr. SESĂRMAN Alina [302043] (ID: 302043)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.