Evaluarea caracterelor de patogenitate și virulență a speciilor de Candida albicans și Candida non-albicans [302036]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Evaluarea caracterelor de patogenitate și virulență a [anonimizat]: Absolvent: [anonimizat]. Dr. [anonimizat]-Gabriela

Anul 2017

[anonimizat] o [anonimizat]. Numeroasele si diversele activități biologice le fac candidați promițători pentru o [anonimizat] a se limita doar la sectorul alimentar. [anonimizat] o contribuție majoră în dezvoltarea gustului pentru produsele fermentate iar activitățile lor antagoniste față de bacteriile și fungii nedoriți sunt cunoscute la o scară largă. [anonimizat], [anonimizat] ([anonimizat]-[anonimizat], formarea lor poate fi determinată de nucleu ori de ADN plasmidic) și antibacterieni (Ozhovan și colab., 2002).

Termenul de “drojdie” a fost inițial derivat din cuvântul olandez “gist” care se referea la spuma formată în timpul fermentației berii. Termenul de “levuri” provine din latinescul “levere” care însemna a ridica și care indică mecanismul acțiunii fermentative a [anonimizat]. Sau denumirea mai poate fi provenit din francezul “levure” care se refera la rolul drojdiei ca element de afânare și de creștere în volum a aluatului. [anonimizat] (1836), cercetările fiind preluate și continuate de alți microbiologi precum: Meyen, Rees și Hansen care realizează o ierarhizare a drojdiilor în anul 1896, aceasta fiind completată de Guillermond în anul 1928.

[anonimizat]: [anonimizat], precum și în medicină și în industria biomedicală și farmaceutică. [anonimizat]. Activitatea inhibitorie a levurilor, a fost descoperită pentru prima dată de Hayduck în 1909. [anonimizat], care implică producția de metaboliți secundari cunoscuți sub numele de toxinele killer sau mycocins. [anonimizat], [anonimizat], peroxid de hidrogen și diverse alte substraturi evacuate în produs.

Frecvența bolilor fungice a crescut îngrijorător în ultimele decenii. Utilizarea în clinică a unui spectru larg de substanțe antimicrobiene și a [anonimizat] a unor progrese în chirurgie sunt asociate cu creșterea riscului de infecții fungice. În ciuda eficacității antifungicelor disponibile pentru combaterea unor astfel de infecții, apariția rezistenței la antifungice și problemele de toxicitate și slaba furnizare de medicamente la locul țintă în infecții, au necesitat o abordare sistemică în studiul agenților patogeni fungici, a interacțiunii gazdă-fungi și identificarea factorilor de virulență. Caracterizarea factorilor de virulență este de așteptat să înbunătățească înțelegerea patogenezei fungice și pentru a ajuta la descoperirea noilor medicamente.

Scopul lucrării a fost reprezentat de studiul fenotipic al nivelului de exprimare a factorilor de patogenitate și virulență solubili/extracelulari și parietali la tulpini de Candida albicans și non-albicans implicate în diverse patologii sistemice și localizate.

Obiective:

Determinarea capacității de sinteteză a factorilor solubili de virulență și patogenitate la tulpini de Candida albicans și non-albicans izolate din infecții sistemice și localizate.

Determinarea capacității de aderență la substrat celular a tulpinilor de Candida albicans și non-albicans.

Capitolul 1

Caracterizarea generală a levurilor

Drojdiile sunt microorganisme eucariote larg răspândite în mediile naturale, inclusiv în microbiota normală la oameni, în sol, aer, apă, plante, animale, în produsele alimentare și în multe alte nișe ecologice, existând ca forme saprofite de viață. În regnul vegetal, drojdiile se găsesc pe suprafața frunzelor, florilor și fructelor alcătuind microflora epifită, iar raspândirea lor este ajutată de către insecte care odată ce preiau anumite substanțe (nectar) preiau și celulele de drojdie. Factorii care influențează dezvoltarea lor în diferite habitate de viață sunt reprezentați de: temperatură, pH, umiditate, substanțe nutritive și sursele de energie. Acești factori sunt decisivi și foarte semnificativi pentru supraviețuirea levurilor în condiții nefavorabile. Drojdiile sunt dependente de sursele de carbon, ele încorporează zaharuri simple, precum glucoză, manoză, fructoză care le furnizează surse de energie. În concordanță cu clasificarea botanică, drojdiile aparțin diviziunii Fungilor și drojdiile găsite în mâncare sunt divizate în clasele Ascomicete și Fungi imperfecti (I. Anghel și colab., 1984).

Celulele micotice la fel, ca și omologii lor bacterieni și vegetali, dar, spre deosebire de celulele animale, sunt protejate de peretele celular, care este esențial în supraviețuirea lor. Celulele fungice au o presiune mare de turgescență și chiar și o crăpătură minoră în structura peretelui celular poate duce la distrugerea si moartea acestuia. Cu toate acestea, întrucât peretele celular este la exteriorul celulei, el trebuie să se dezvolte odată cu celula și să îndure toate schimbările pe care celula le suferă în timpul ciclului de diviziune. Pentru a asigura integritatea permanentă și o creștere constantă a peretelui celular, fără a interfera cu plasticitatea celulei, aceasta elaborează un mecanism de control care trebuie să funcționeze și care trebuie sa fie într-o strânsă legătură cu cele care se ocupă de ciclul celular. Datorită versatilității înmuguririi levurilor pentru studii biochimice și genetice s-a înregistrat cea mai considerabilă cantitate de muncă asupra pereților celulari (I. Anghel și colab., 1984; I. Anghel și colab., 1989).

Cercetătorii și-au îndreptat atenția asupra structurii particulare, diversității biochimice și diferențierii peretelui celular, majoritatea studiilor realizându-se pe celule de Saccharomyces, Candida și Schizosaccharomyces. Peretele celular al levurilor are o grosime de 50-250 nm fiind un înveliș rigid, gros, datorită prezenței chitinei (poliglucid rezistent și flexibil, alcătuit din resturi de N-acetilglucozamină), la acțiunea unor factori chimici, fizici sau biologici cu numeroase roluri în viața celulei: comunică cu plasmalema în legătură cu schimburile de material al celulei cu mediul extern, reglează rata de creștere a celulei și acoperă protoplastul. Peretele celular al levurilor determină forma celulei care poate fi: ovală (elipsoidală), sferică, apiculată (formă de lămâie), cilindrică (alungită) și integritatea organismului în timpul creșterii și diviziunii celulare. De asemenea, variză în funcție de specie, factorii ambientali sau stadiul ontogenetic. Mai mult, acesta este o structură dinamică, care se poate adapta la schimbările fiziologice (de exemplu de la faza logaritmică la cea staționară) și modificări morfologice (conjugare, sporulare) (Orleans, 1988). Mecanismul compensatoriu al peretelui celular este activat ca răspuns al agenților perturbatori sau mutațiilor peretelui celular, care permite remodelarea acestuia și combaterea lizei celulare. Unul dintre rezultatele majore ale acestui mecanism este o creștere puternică a chitinei, care poate ajunge până la 20% din masa uscată a peretelui celular, în timp ce un conținut ridicat de chitină poate contribui la rezistența peretelui celular (Popolo și colab., 1997). Peretele celular este o matrice formată din trei grupuri principale de polizaharide: glucanul, manoproteinele și chitina, acestea reprezentând peste 90% din substanța uscată a peretelui celular.

Glucanul este un polizaharid complex cu o structură ramificată formată dintr-un lanț principal glicozidic β 1-3 și lanțuri laterale formate din legături glicozidice β 1-6. La speciile de Candida albicans 72% sunt legaturi β 1-6 și 28% legături β 1-3. De obicei se alipește formând subunități microfibrilare, care la rândul lor se asociază și se organizează sub forma unei rețele în interiorul matrixului, fapt ce demonstrează principalul rol al glucanului și anume cea scheletică. Locul de sinteză al glucanului are loc la nivelul aparatului Golgi, reticulului endoplasmatic sau plasmalemei (I. Anghel și colab., 1984; I. Anghel și colab., 1989).

Manoproteinele un alt component al peretelui celular, compozitia sa putând varia la diferitele specii de drojdii. Structura sa este ramificată fiind constituită dintr-un ax dispus central, care prezintă o catenă lungă în care resturile de manoză sunt legate α 16 și lanțurile laterale α 12 și α 13 linkate. Moleculele de manan au proprietatea de heterogenitate indusă de gradul de polimerizare a unităților manosil ce se stabilesc în relația lor cu alte molecule. Manoproteinele joacă un rol important în menținerea integrității peretelui celular, supus acțiunii diferitelor enzime, presiunilor înalte sau temperaturilor scăzute (I. Anghel și colab., 1984; I. Anghel și colab., 1989).

Chitina este componentul caracteristic care se regăsește la toate clasele de fungi. Din punct de vedere chimic, este o aminopolizaharidă cu molecule liniare, fiind alcatuită din lanțuri β 14 de N-acetil glucozamină și concentrat în cea mai mare parte sau în exclusivitate în regiunea septală, deși mai este dispersat și în peretele celular. Acest component, deși este într-o cantitate mai mică, el are un important rol structural, scheletic fiind implicat în rezistența celulelor fungice la acțiunea unor factori chimici, fizici, biologici din mediu (I. Anghel și colab., 1984; I. Anghel și colab., 1989).

Pe lângă acești constituienți în peretele celular se găsesc în concentrații mai mici: lipidele, care au o organizare asemănătoare cu cea a complexelor lipoproteice din structura peretelui celular al bacteriilor, fiind deosebite și izolate: mono-, di-, și trigliceride, esteri sterolici, acizi grași liberi și fofolipide. Proteinele, prezența lor a fost constată de Nickerson și colaboratorii în anul 1961, care au dovedit prezența unui complex polizaharidic în pereții celulari de la Candida albicans, ulterior acest fapt a fost generalizat în structura peretelui celular a tuturor drojdiilor. Constituenți anorganici, aici ca prim component primează apa, volumul ei fluctuând în funcție de tipul celular, pe lângă apă mai intră ioni divalenți Ca2+ și Mg2+, enzime cum sunt invertaza, fosfataza, permeaze care sunt incluse în biosinteza compușilor peretelui celular și în procese de transfer a substanțelor (I. Anghel și colab., 1984; I. Anghel și colab., 1989).

Un lucru foarte important de menționat este faptul că odată cu îndepărtarea peretelui celular prin metode enzimatice se obțin protoplaști folosiți în ingineria genetică și pentru obținerea hibrizilor prin fenomenul de fuziune. S-a observat că prin amplasarea acestora pe mediu nutritiv timp de 8-12 ore are loc regenerarea peretelui celular, acest fapt a fost demonstrat de-a lungul timpul de mai mulți microbiologi: Svoboda și colaboratorii, la mai multe specii de drojdii.

Dezvoltarea drojdiilor este legată de modul în care celulele transportă și asimilează nutrienți iar apoi integrează în celulă numeroase componenete funcționale pentru a crește în dimensiuni pentru ca apoi să se poată divide. Drojdiile s-au dovedit foarte utile în descoperirea elementelor majore de control din cadrul ciclului celulelor eucariote (I. Anghel și colab., 1984).

Analizele moleculare arată faptul ca ascomicetele de tipul Saccharomyces și Pichia reprezintă forme telomorfe (adică prezintă meioză, sporulare și sexualitate) iar cei din categoria fungilor imperfecți de exemplu, speciile de Candida sunt considerate ca fiind forme anamorfe (adică se divid vegetativ prin mitoză și nu prezintă sexualitate). Dintre ascomicete, drojdia care a reprezentat modelul experimental pentru majoritatea studiilor experimentale este Saccaromyces cerevisiae. Proprietățile unice ale acestei drojdii și potențialul ei ascuns a făcut-o una dintre cele mai exploatate specii, fiind un organsim adecvat pentru cercetare. De fapt drojdia de bere a fost introdusă la mijlocul anilor 1930 de către Hershel Roman și a primit o atenție sporită din partea multor cercetători, aceștia realizând că este un sistem ideal în care arhitectura celulară și mecansimele celulare fundamentale pot fi investigate cu succes.

Reproducerea prin înmugurire (calea asexuată) este cel mai comun mod de reproducere vegetativă a levurilor și este tipică la ascomicete precum Saccaromyces cerevisiae, fiind reprezentată de celule diploide sau haploide, care se multiplică prin cicluri succesive mitotice atunci când din celula mamă se formeaza o nouă celulă fiică identică din punct de vedere genetic cu celula mamă de origine. Împerecherea la Saccaromyces cerevisae implică conjugarea a două celule haploide de sex opus. Aceste celule își sincronizează între ele ciclul celular iar conjugarea celulelor de împerechere are loc pe suprafața peretelui celular fiind urmată de fuziunea membranei plasmatice, formând o citoplasmă comună. Apoi urmează fuziunea nucleară ce rezultă într-un nucleu diploid. Zigotul diploid continuă ciclul celular mitotic dacă mediul este bogat în nutrienți, iar dacă este lipsit de azot celulele diploide sporulează pentru a produce 4 celule haploide. Acestea germinează pentru a forma celule de înmugurire haploidă care se pot împerechea între ele pentru a restaura starea diploidă. Termenul de înmugurire înseamnă un proces în care unele excrescențe ale protoplasmei ies prin peretele celular, aceste excrescențe cresc în dimensiuni și în final peretele celular crește împrejurul lor și formează o nouă celulă de drojdie. Acest tip de reproducere are loc probabil în condiții nefavorabile, în special în cazul în care există un deficit de substanțe nutritive și abundență de oxigen. Mugurii se dezvoltă atunci când celula mamă atinge o mărime critică la un timp care coincide cu debutul sintezei ADN. Acest fapt este urmat de slăbirea peretelui celular care împreună cu tensiunea exercitată de presiunea de turgescență permit evacuarea citoplasmei într-o zonă delimitată de noul material al peretelui celular. În timpul dezvoltării mugurilor peretele celular al celulei mamă este adiacent cu cel al celulei fiice, însă se pot forma mai multe celule fiice pe suprafața celulei mamă, proces numit înmugurire multilaterală. În urma diviziunii atât pe suprafața peretelui celular atât a celulei mamă cât si pe cea a celulei fiice se găsesc cicatrici care sunt bogate în polimeri de chitină. Folosindu-se coloranți fluorescenți se poate afla numărul de diviziuni celulare ale celulei mamă (I. Anghel și colab., 1984).

Înmultirea filamentoasă survine la numeroase specii de drojdii și reprezintă un mod alternativ de diviziune vegetativă. Unele levuri prezintă o tendință de a dezvolta pe suprafața lor hife formate din tuburi germinale (reprezintă o excrescență produsă de spori și de levuri producătoare de spori în timpul germinării), un exemplu de astfel de levură este Candida albicans, deoarece dezvoltarea acestor tuburi germinale este foarte rapidă, ele sunt utilizate în diagnosticarea infecțiilor cu Candida albicans în 90 de minute și se consideră că contribuie la patogenitatea speciei Candida albicans. Unele pot dezvolta pseudohife induse de condițiile nefavorabile de mediu. Înmulțirea filamentoasă reprezintă așadar o adaptare a levurilor în lipsa de nutrienți (I. Anghel și colab., 1984; I. Anghel și colab., 1989).

Capitolul 2

Candida albicans

Fungii sunt microorganisme eucariote care fac parte din grupul Eumycota și sunt chemoheterotrofe (își procură energia din substraturile organice) cu un perete celular chitinizat. De-a lungul timpului au fost descrise mai mult de 100 000 de specii, cele mai multe dintre acestea cresc ca filamente multicelulare numite hife care formează miceliul, alte specii cresc de asemenea ca celule unice, cum ar fi celulele levurice. Anumite grupuri de fungi sunt patogene pentru oameni și necesită măsuri de control. În Europa, 17% dintre persoanele internate la terapie intensivă suferă complicații cauzate de infecțiile fungice (Rupp, 2007), în timp ce în SUA a devenit a șaptea cauză cea mai comună a deceselor în rândul pacienților internați în spital (Martin și colab., 2003). Aproximativ 15% dintre pacienți care suferă transplant alogenic de celule stem hematopoietice și 20% dintre pacienții care au suferit transpant pulmonar au dobândit infecții fungice (Ribaud și colab., 1999). Datele de la sfârșitul anilor 1950 și începutul anilor 1960 indică faptul că infecțiile fungice invazive au fost extrem de rare, chiar și la pacienții cu cancer imunocompromiși (Chakrabarti, 2005). În acest moment, incidența infecțiile fungice a crescut dramatic în ultimele două decenii, prezentând o rată a mortalității foarte mare. Utilizarea medicamentelor imunosupresoare, antibioticelor cu spectru larg și a intervențiilor chirurgicale mai agresive au dus la dezvoltarea unor infecții complicate, inclusiv infecții fungice invazive. În plus, pacienții cu arsuri, neutropenie (afecțiune bazată pe descreșterea numărului de neutrofile din circulația sangvină) și infecțiile cu HIV sunt acum în mod serios expuse la infecții fungice (Kuleta și colab., 2009). Infecțiile fungice au devenit mult mai frecvente în populația sănătoasă. Sistemul Național de Supraveghere a Infecțiilor Nosocomiale a raportat că a patra cea mai comună infecție nosocomială din SUA este cauzată de Candida spp. Peste 95% din totalul infecțiilor fungice au fost asociate cu Candida albicans, Aspergillus fumigates și Cryptoccocus neoformans (Richardson, 2005).

Genul Candida este încadrat în Ordinul Deuteromycetes(fungi imperfecți), Familia Cryptococcaceae ( Rose și colab., 1987). Candida albicans este o levură patogenă care cauzează infecții ale mucoaselor și infecții sistemice cu un grad ridicat al mortalității, fiind una dintre puținele specii fungice care cauzează boli umane. Este un membru al microbiotei sănătoase ce colonizează asimptomatic tractul gastrointestinal, tractul reproducător, cavitatea bucală și tegumentul la majoritatea oamenilor. La persoanele cu un sistem imunitar sănătos, Candida albicans, este de cele mai multe ori inofensiv, păstrat în echilibru cu ceilalți membrii ai microbiotei locale. Cu toate acestea, modificările privind microbiota gazdă (de exemplu, din cauza antibioticelor), modificări ale raspunsului imun al gazdei( de exemplu, în timpul stresului, infecția cu un alt microb sau terapia imunosupresoare) ori simple variații ale mediului local (de exemplu schimbarea ph-ului sau conținutul nutrițional scăzut) poate activa Candida albicans, ducând la dezvoltarea acesteia și la posibile infecții. Aceste infecții variază în funcție de tipul de infecție, de la infecții ale mucoaselor și infecții dermice superficiale, cum ar candidozele, infecțiile vaginale, erupțiile cutanate, până la infecții diseminate cu o rată a mortalității considerabilă (se apropie de 40% în unele cazuri) (Wenzel și Gennings, 2005).

Factori de patogenitate și virulență

Toate microorganismele patogene au dezvoltat mecansime care permit colonizarea cu succes sau infecția gazdei. Ca rezultat, cei mai mulți agenți patogeni, inclusiv speciile de Candida, au dezvoltat un sistem eficient de virulență și strategii specifice pentru a ajuta la capacitatea lor de a coloniza țesuturile gazdă, sau de a cauza boli și de a depăși barierele de apărare ale gazdei. Factorii de virulență exprimați de speciile Candida, și în special Candida albicans, pentru a provoca infecții pot varia în funcție de tipul de infecție (de exemplu, la nivelul mucoaselor), al locului și stadiului de infecție, precum și natura răspunsului gazdei. Pare evident că un grup de atribute ale virulenței sunt implicate în procesul de infectare dar nu există un singur factor reprezentant pentru virulența tulpinilor de Candida și nu toate atributele sunt necesare pentru un anumit stadiu al infecției. Deși au fost propuși mulți factori ca atribute ale virulenței pentru Candida albicans, cele mai studiate în ultimii ani au fost: formarea hifelor, suprafețele recunoscute de molecule, comutarea fenotipică și producerea de enzime hidrolitice extracelulare (Mayer și colab., 2013).

Patogenitatea este abilitatea unui microorgansim de a infecta gazda și de a produce boli care rezultă din interecțiunea dintre patogen și gazdă prin exprimarea anumitor factori asupra ambelor părți. Patogenitatea unui fung depinde de capacitatea sa de a se adapta la condițiile țesutului la care aderă și pentru a rezista activitatea litică de apărare a gazdei. Câțiva factori determinanți, inclusiv gene sau produși genici cum ar fi molecule enzimatice cunoscute ca factori de virulență sunt implicați în această relație, producând infecții superficiale până la invazive la oameni (Mohd Sajjad Ahmad și colab., 2010).

Virulența se referă în mod specific la o proprietate a patogenității și, în conformitate cu definițiile moderne, virulența reprezintă capacitea unui agent patogen de a se multiplica și provoca efecte adverse aupra gazdei sale (Casadevall, 2007). Pentru a produce o boală la un pacient, un fung trebuie să invadeze în mod activ țesuturile. Mulți agenți patogeni fungici în cazul oamenilor sunt dimorfici (capabili de tranziții reversibile între levuri și forme de hife), iar tranziția morfogenetică dintre aceste forme este adesea stimulată de creșterea în gazdă și corelate cu invazia gazdei. Cu toate acestea, natura asocierii între morfogeneza fungică și invazia gazdei este un aspect extrem de controversat al virulenței fungice (Klein și Tebbets, 2007).

Candida este o specie ubicvitară, fiind găsită pe plante dar și ca un component al microbiotei normale a tractului digestiv, a tegumentelor și mucoaselor la om. Speciile genului Candida au câteva proprietăți de virulență care includ aderența la suprafața celulei gazdă, producerea de fosfolipaze și proteinaze, ca și formarea de hife care le ajută să scape de mecanismele de apărare ale gazdei (Lazăr, 2003). În general este acceptat faptul că dimorfismul (capacitatea de a se dezvolta sub formă de muguri, sub formă filamentoasă sau hife) este o trăsătură a virulenței și este în strânsă legătură cu alți factori de virulență asociați cu morfologia celulară (Brown și colab., 1999). Un alt tip de modificare morfologică este comutarea fenotipică care implică generarea spontană și reversibilă a diferitelor stări morfologice și fiziologice care exprimă diferite modele de trăsături legate de patogenitate (factori de virulență și rezistența la medicamente antifungice) observate cu ușurință prin morfologia coloniilor (Soll, 1992). Ambele procese conferă tulpinii de Candida albicans abilitatea de a genera variante care să permită o adaptare mai bună la modificările condițiilor de mediu și, în special pentru a rezista sistemului imunitar al gazdei.

Fig. 1. Fotocompoziția epiflorescentă a diferitelor forme de creștere morfologică a tulpinilor de Candida albicans colorate cu calcofluor alb : (A) blastocondia; (B1) reproducerea prin înmugurire; (B2) formarea tuburilor germinale; (C1) formarea pseudohifelor; (C2 și C3) hife (după Silva și colab., 2011).

Fosfolipaze

Termenul de “fosfolipaze” se referă la un grup heterogen de enzime care au în comun capacitatea de a hidroliza una sau mai multe legături, în glicerofosfolipide. Deși toate fosfolipazele țintesc fosfolipide ca substraturi, fiecare enzimă are capacitatea de a scinda o legătură ester specifică.

Astfel, literele de clasificare precum A, B, C și D sunt folosite pentru a diferenția fosfolipazele și pentru a indica legătura specificată în molecula fosfolipidă, de exemplu, fosfolipaza A1 ( PLA 1) hidrolizează acidul gras al legăturii în poziția Sn-1 al fragmentului de glicerol, în timp ce fosfolipaza A2 (PLA 2) înlătură acidul gras din poziția Sn-2 a acestei molecule. Fosfolipaza C (PLC) hidrolizează legătura fosfodiesterică în fosfolipide pentru a produce 1,2-diacil glicerol. A doua legătură fosfodiester este scindată prin fosfolipaza D (PLD) pentru a obține acidul fosfatidic, din nou, în funcție de clasa fosfolipidică implicată. Deși, fosfolipaza B (PLB) se referă la o enzimă care poate elimina atât acizi grași Sn-2 cât și Sn-1, nomenclatura sa fiind încurcată. Această confuzie apare deoarece PLB are atât hidrolază (eliberare de acizi grași) cât și lisofosfolipaze-transacilaze (LPTA). Activitatea hidrolazică îi permite enzimei să scindeze acizii grași din fosfolipide, în timp ce activitatea tranacilazică permite enzimei să producă fosfolipide prin transferul unui acid gras liber la un lisofosfolipid (Ghannoum M. A., 2000).

Invazia cu celule microbiene a celulelor gazdă implică penetrarea și deteriorarea anvelopei externe a celulei, acest proces fiind mediat de transmigrare. Fosfolipidele și proteinele reprezintă constituienții chimici majori ai celulei gazdă. De aceea, enzime capabile să hidrolizeze aceste clase chimice, cum ar fi fosfolipazele și proteinazele, sunt susceptibile de a fi implicate în procesul de ditrugere al membranei, în timpul invaziei celulei gazdă. Prin distrugerea fosfolipidelor, fosfolipazele destabilizează membrana și are ca rezultat liza celulei. Dovezile care implică utilizarea fosfolipazei în penetrarea celulei gazdă, afectarea și liza de către microorganisme, a fost raportată de Rickettsia rickettsii (Walker și colab., 1983).

Secreția de fosfolipaze extracelulare de către Candida albicans a fost raportată pentru prima dată în 1960 de către Costa și colab. (1967) prin cultivarea pe medii solide care conțin gălbenuș de ou sau lecitină și analiza degradării lipidelor. Mai târziu, activitatea fosfolipazei a fost identificată la mai multe tulpini patogene de Candida albicans, prin utilizarea de medii ce conțin ser sangvin și eritrocite de oaie (Costa și colab., 1968). Observația că Candida albicans secretă fosfolipaze a determinat dezvoltarea unei metode citochimice pe bază de lecitină pentru a detecta această enzimă (Pough și Cowson, 1975). Într-un studiu ulterior, acești autori au folosit această metodă împreună cu un model de membrană corioalantoică (membrană a ouălor de găină ce ajută embrionii pentru a obține oxigen și calciu suficient pentru dezvoltare) de pui, pentru a evalua detalii ultrastructurale de invazie candidozică și pentru a determina locul de producție a fosfolipazei. Invazia a fost inițiată prin plasarea pe membrană a blastosporilor, într-o fază staționară, care a stimulat modificări celulare în blastospori. Mulți dintre blastospori au dezvoltat hife cu activitate fosfolipazică concentrată la vârful de creștere. Activitatea a fost cea mai mare, în cazul în care hifele au fost în contact direct cu membrana. În general, numai hifele au invadat membrana cu succes iar pe baza acestor rezultate, investigatorii au propus ca fosfolipidele extracelulare au fost importante în invazia tulpinii de Candida albicans.

Tipuri de fosfolipaze prezente la Candida

Literatura de specialitate conține rapoarte contradictorii cu privire la numărul și tipurile specifice de enzime fosfolipazice secretate de Candida albicans (Costa, 1968), a raportat secreția ambelor enzime fosfolipazice PLA și PLC pentru această levură din punct de vedere chimic. Rezultatele lor s-au bazat pe izolarea acidului palmitic și fosfatidilcolinei din apropierea coloniilor candidozice cultivate pe mediu de agar Sabouraud suplimentat cu ser și eritrocite de oaie. Deoarece acest mediu nu este definit chimic, sursele de produși de hidroliză sunt incerte.

Evidența corelării virulenței și fosfolipazei

Deși contribuția fosfolipazelor la patogeneza bacteriană și a protozoarelor a fost cunoscută de ceva timp, au fost întreprinse investigații pentru a verifica dacă aceste enzime sunt asociate cu virulența fungică. Barrett-Bee și colab. (1985) a fost primul care a evaluat rolul fosfolipazelor candidozice extracelulare în virulență prin utilizarea unui model de candidoză. Atunci când activitatea fosfolipazei a fost măsurată în șase drojdii ( 4 tulpini Candida albicans și câte o tulpină de Candida parapsilosis și Saccharomyces cerevisiae), o corelație a fost găsită între activitatea fosfolipazei și doi parametrii potențiali ai patogenității. Izolarea tulpinii de Candida albicans care a aderat cel mai puternic la celulele epiteliale bucale și au fost cele mai patogene la șoareci, au avut cele mai mari activități fosfolipazice. Cele mai puțin patogene tulpini de Candida albicans, Candida parapsilosis și Saccharomyces cerevisiae, au fost mai puțin aderente la celulele epiteliale și mai puțin letale la șoareci, având activități fosfolipazice inferioare (Barrett-Bee și colab., 1985).

Proteaze

Levurile Candida sunt rareori infecțioase dar frecvent provoacă infecții sistemice amenințătoare la pacienții bolnavi de SIDA sau care urmează terapii imunosupresoare. Proteazele aspartice secretate (SAP) sunt factori de virulență dăunători ai speciei Candida. Cele mai virulente, Candida albicans, posedă cel puțin nouă gene SAP, dintre care unele sunt exprimate în mod specific de celule cu morfologii asociate cu virulența. Numai una dintre aceste proteaze, SAP2, a fost purificată în prealabil din drojdii în cantități suficiente pentru studii enzimatice. Celelalte enzime sunt prezente în cantități mici în cultura de levură și sunt dificil de purificat. Ca o consecință, proprietățile enzimatice, inclusiv caracteristicile specifice ale substratului, ale tuturor enzimelor SAP sunt puțin studiate.

Principalele trei enzime hidrolitice extracelulare cele mai semnificative, produse de Candida albicans sunt: proteazele aspartice (SAP), enzimele PLB fosfolipazice și lipazele. Dintre acestea, proteinele SAP, sunt codificate de o familie de 10 gene SAP, fiind cel mai cuprinzător studiate ca determinanți cheie ai virulenței la Candida albicans (Felk și colab., 2000).

Proprietățile moleculare și biochimice a familiei SAP exprimate de Candida

Toate cele 10 gene SAP ale speciei de Candida albicans codifică aproximativ 60 de aminoacizi mai lungi decât enzima matură, care sunt tranformați atunci când sunt transportați pe calea secretorie. Enzimele mature conțin secvențe tipice pentru toate proteazele aspartice, inclusiv cele două resturi conservate ale situsului aspartic activ și resturile de cisteină conservate și implicate în menținerea structurii tridimensionale. Studii structurale asupra proteazelor familiei Candida albicans, s-au concentrat pe SAP2 care este cea mai abundent secretată proteină in vitro, atunci când sunt crescute în prezența proteinei ca unică sursă de azot (Hube și colab., 1994).

Sinteza proteinazelor la Candida albicans

Calea sintezei proteinazelor începe în nucleu, de unde ARN-ul mesager nou sintetizat este transferat în citoplasmă și tradus în preproenzime în reticulul endoplasmatic rugos. Odată activată enzima este înfășurată în vezicule secretoare și transportată la membrana plasmatică, și fie rămâne atașată la membrana celulară și este încorporată în peretele celular (de exemplu, SAP 9 si 10), fie este eliberată în spațiul extracelular. Din moment ce familia de gene SAP codifică preproenzime, reglarea expresiei proteinazei poate fi controlată la nivelul ARN mesager sau la nivelul proteinei. Comparațiile dintre proteinele SAP și nivelurile de ARN mesager la puncte identice de timp (White și Agabian. 1995) au sugerat că sinteza proteinazelor și secreția sunt strâns legate ceea ce implică ca reglarea activității SAP are loc predominant la nivelul ARN mesager.

Proprietățile biochimice ale proteinazelor la Candida albicans

Proteinele SAP 1 pâna la SAP 10 măsoară între 35-50 kDa și sunt considerate responsabile pentru toată activitatea proteolitică extracelulară la Candida albicans. Există diferențe între pH-ul optim al proteinazelor SAP 1-6, unde SAP 1, 2, 3 au cea mai mare activitate atunci când pH-ul este scăzut iar SAP 4, 5, 6 au activitate mare când pH-ul este ridicat. Această proprietate versatilă este vitală pentru succesul tulpinilor de Candida albicans ca agent patogen oportunist, favorizând levura pentru a supraviețui și pentru a induce infecții la nivelul unei varietate largi de țesuturi și mucoase, tegumente și organe interne. Bazat pe studiile prezentate de Koelsch și colaboratorii (2000), care au studiat aspectele funcționale ale proteinazelor SAP 1-6, este foarte probabil ca principalul rol al proteinazelor sintetizate de Candida albicans este cel de a asigura nutriția celulelor, pentru a ajuta penetrarea și invazia gazdei, precum și pentru a evita răspunsurile imune ale gazdei. Însă, proprietățile biochimice și proteolitice ale enzimelor SAP 7-10 nu sunt cunoscute cu certitudine și astfel repertoriul funcțional al familiei SAP nu este total elucidat (Naglik și colab., 2003)

Complexitatea implicării SAP în virulență celulelor de Candida albicans, a fost asociată cu un număr de alte atribute de virulență cum ar fi, formarea hifelor, aderența și comutarea fenotipică. Deși, consecințele secreției de proteinaze în timpul infecțiilor umane nu sunt cunoscute cu precizie, rolul și funcția familiei proteinazelor SAP poate fi dedus din datele in vivo pe modele experimentale pe animale. Ca rezultat aproape toate studiile au implicat proteinaze din Candida albicans într-una din următoarele șapte moduri (Naglik și colab., 2003):

Corelația in vitro dintre producția de SAP și virulența la tulpini de Candida

Asocierea producției de SAP cu alte mecanisme de virulență exprimate de Candida albicans

Producția de proteine SAP și răspunsul imun la SAP în infecțiile animale și umane

Expresia genei SAP în timpul infecției cu Candida

Modularea virulenței la Candida albicans prin inhibitori de aspartil proteinază

Utilizarea mutanților cu SAP perturbat pentru a studia mecanismele de virulența la Candida albicans.

S-a constat că proteinaza SAP 2 este cea mai responsabilă pentru degradarea mai multor proteine umane printre care molecule care protejează suprafața mucoaselor, cum ar fi mucina ( Colina și colab., 1996) și imunoglobulina secretorie Ig A (Goldman și colab., 1995). Nu numai că acest lucru ar putea oferi azot esențial pentru creștere, dar, de asemenea, ar putea stimula aderarea, colonizarea și penetrarea țesutului gazdă prin depășirea barierelor gazdei. Digestia Ig A secretoare este deosebit de importantă deoarece este considerabil mai rezistent la proteoliză decât sunt monomerii sau Ig serice și poate inhiba atașarea tulpinilor de Candida albicans la celulele epiteliale bucale (Vudhichamnong și colab., 1982) și a mai sugerat că proteina SAP sintetizată de tulpinile de Candida degradează proteinele salivare din cavitatea bucală.

Aderența celulelor de Candida albicans la celula gazdă este un proces complex multifactorial care implică mai multe tipuri de adezine candidozice care se poate modifica morfogenetic, iar un mecansim prin care aderența se poate baza pe producția de proteinaze. Deși mecanismele exacte prin care proteinele SAP contribuie la aderență nu sunt clare, două ipoteze sunt favorizate. În prima, proteinazele speciei Candida albicans pot acționa ca liganzi la suprafața celulei gazdă care nu necesită neapărat activitatea enzimelor. În cea de-a doua, Candida albicans folosește proteinele SAP ca enzime active pentru a modifica proteinele țintă sau liganzii de pe suprafața celulei fungice sau de pe celulele gazdă (adică, celule epiteliale), care pot altera hidrofobicitatea suprafeței sau să conducă la modificări conformaționale permițând astfel o mai bună aderență a celulelor levurice (Monod și Borg-Von Zepelin., 2002). Capacitatea specie Candida albicans de a se transforma în hife poate fi un factor patogen determinant în procesele inițiale ale invaziei tisulare superficiale, prin care hifa poate favoriza aderența și penetrarea celulelor de Candida albicans în țesutul gazdă. În mediile de cultură, principalele proteinaze asociate cu formarea hifelor sunt SAP 4-6 (Hube și colab., 1994), pH-ul și inducerea hifei sunt suficiente pentru inducerea SAP 4-6.

Producția SAP și comutarea fenotipică

Selecția fenotipică de tulpini modificate este realizată de Candida albicans printr-un fenomen cunoscut sub numele de comutare fenotipică, prin care celulele levurice isi comută în mod aleatoriu fenotipul, în special ca răspuns la stres. În timp ce multe microorganisme procariote și eucariote pot comuta între fenotipuri alternative în diferite condiții de mediu, Candida albicans pare să aibe o capacitate sporită de rearanjare cromozomială și reorganizare genetică. Spre deosebire de comutarea în alți patogeni microbieni, comutarea în Candida albicans este pleiotropă, adică afectează mai mulți parametrii fiziologici și morfologici și o serie de trăsături de virulență, toate acestea putând permite fungilor să se adapteze la diferite medii în cursul unei infecții.

Pentru o tulpină de Candida albicans denumită WO-1 descoperirea și caracterizarea tranziției de la alb (W-white) și până la opac (O-opaque) a indicat că comutarea poate afecta o varietate de caracteristici celulare, inclusiv producția de proteinaze. Ca urmare, o corelație între secreția SAP și comutare a fost ulterior descrisă pentru tulpina WO-1 (Morrow și colab., 1992) și 3153A (Morrow și colab., 1994). În ambele tulpini, transcrieri intense ale genelor ce codifica proteinele SAP1 au fost reglate prin mecanismul de comutare, proteina SAP1 fiind în principal responsabilă pentru activitatea proteolitică extracelulară observată în această stare de comutare. Expresia SAP3 poate fi de asemenea reglată prin comutare fenotipică, dar mecanismul de reglare al acesteia este diferită de cel al SAP1 deoarece SAP3 este detectat în tulpini Candida albicans atunci când SAP2 este exprimat. În prezent, în tulpina Candida albicans WO-1, SAP1 este singura proteinază care este strict reglată de comutarea fenotipică. Cu toate acestea, schimbarea fenotipică este un process foarte complex, care nu este pe deplin înțeles. De fapt, foarte puține detalii sunt cunoscute despre acest fenomen (Naglik și colab., 2003). Pe scurt, studiile de laborator au indicat că familia de gene a speciei Candida albicans este exprimată diferențiat în drojdii, formarea hifelor și comutarea fenotipică, și poate contribui la aderența celuleor de Candida albicans. La cel mai de bază nivel, se poate concluziona că celulele de levură exprimă predominant un set de gene ( 1-3), hifele exprimă predominant proteinele 4-6 și prin comutare fenotipică se exprima 1-3.

Hemolizine

Mai mulți factori pot influența virulența tulpinilor de Candida albicans cum ar fi: aderența, persistența, dimorfismul sau formarea tubului germinal, comutarea fenotipică, interferența cu sistemul de apărare al gazdei, sinergismul cu bacteriile și producerea de hidrolaze (cum ar fi lipaze și proteaze care pot fi proteinaze aspartice sau fosfolipaze).

Fiind unul dintre cei mai importanți factori de virulență ai tulpinii de Candida albicans, proteinazele aspartice au fost studiate pe deplin (Schaller și colab., 2005), în timp ce activitatea sa hemolitică nu este bine înțeleasă. Activitatea hemolitică este un potențial factor de virulență care ajută la diseminarea candidozei și facilitează invazia hifelor. Activitatea hemolitică a tulpinii Candida albicans este sporită prin creșterea pe mediu de agar ce conține sânge cu multă glucoză (Mans și colab., 1994). Aceștia au prezentat faptul că Candida albicans are capacitatea de a utiliza fierul derivat de hemoglobină și poate dobândi acest fier prin producerea unui factor care poate elibera hemoglobină prin lizarea eritrocitelor. Candida albicans folosește hemolizine pentru degradarea hemoglobinei și pentru a obșine fier. De aceea, hemolizinele sunt factori de virulență cruciali care ajută agenții patogeni să supraviețuiască și să persiste. Producția acestui factor hemolitic poate fi reglată prin prezența glucozei în mediu de creștere. Mulți factori pot influnța activitatea hemolitică cum ar fi: temperature (Tanaka și colab., 1997), glucoza (Luo și colab., 2001), anumiți ioni inclusiv Fe3+ (Ronsani și colab., 2011), anumiți compuși (etanol, n-butanol sau vapori de n-pentanol) (Shuster și colab., 2004), sau specia de la care provine sângele (Yigit și Aktas, 2009). Wan și colab., 2015 au investigat activiatatea hemolitică a tulpinii de Candida albicans în prezența a trei electroliți: CaCl2 , NaCl, KCl, în concentrații diferite. Tulburările electrolitice sunt complicat de analizat in vivo, în medii locale cum ar fi: mucoasa bucală sau mucoasa vaginală, substanțele exogene cum ar fi: alimente, medicamente și clătiri, care pot influența balanța electrolitică. Utilizarea pastei de dinți ce conține bicarbonat de calciu, poate fi de ajutor în prevenirea candidozei bucale. Alte strategii, cum ar fi clătiri ce conțin anumiți electroliți, pot fi utile în prevenirea candidozei vaginale. Cercetătorii au arătat că activitatea hemolitică în prezența celor trei electroliți a fost redusă în comparație cu activitatea normală și nu au existat diferențe semnificative în activitatea hemolitică a tulpinii de Candida albicans între diferite concentrații de CaCl2 și KCl.

Aderența

În general, oamenii sunt expuși prima dată infecției cu Candida albicans la naștere atunci când sunt contaminați la nivelul mucoaselor și la nivelul tegumentului. Infecția apare când fungii pătrund accidental barierele gazdei atunci când există defecte imunologice sau când exista condiții ce favorizează intrarea și dezvoltarea acestora. Infecția unei gazde începe cu aderența fungului la suprafața straturilor epiteliale și diseminarea acestuia în diferite situsuri ale gazdei. Invazia diferitelor țesuturi și rezistenta atacurilor provenite de la sistemul imunitar ale gazdei sunt necesare pentru ca un agent patogen să dezvolte infecția. Ca și în cazul altor microorganisme patogene, aderența celulelor de Candida albicans la suprafața gazdei este un pas important în procesul patogen și o condiție necesară pentru colonizarea țesuturilor gazdă (celule epiteliale, endoteliale, matrice extracelulară).

Celulele epiteliale care alcătuiesc majoritatea mucoasei au un rol important în prevenirea invaziei fungice. Locația lor la suprafețele exterioare ale corpului asigură că acestea sunt printre primele celule gazdă care vin în contact cu majoritatea fungilor. Partea cea mai importantă a contactului inițial este aderența celulelor fungice la celulele epiteliale ale gazdei, un proces al cărui rezultat are un impact major asupra interacțiunilor ulterioare dintre fung și gazdă.

Procesul de aderență al celulelor de Candida la suprafețele epiteliale este un proces complex și multifactorial. Suprafețele celulelor, atât la Candida cât și la celulele epiteliale sunt de obicei încărcate negativ și reușita aderenței depinde de suma factorilor nespecifici ce contribuie la energia eliberată prin interacțiune. Acestea includ o varietate de forțe pasive, forțe de atracție (forțe van der Waals și interacțiuni hidrofobe) și forțe de repulsie. Odată depășite aceste forțe de repulsie, aderența celulelor de Candida albicans este ulterior mediată de molecule specifice cunoscute sub numele de adezine, de pe suprafața celulelor fungice, și care interacționează cu liganzi specifici de pe suprafața celulelor gazdă. Acești liganzi specifici ai gazdei cu care interacționează celulele de Candida albicans la suprafața celulelor epiteliale cuprind matricea extracelulară a gazdei ECM (Extracellular matrix) care include componente precum: laminina, fibronectina, colagenul, vitronectina (Chaffin, 2008) și receptori de pe suprafața celulei gazdă cum sunt: integrinele și caderinele.

Odată inițiate aceste evenimente ce permit contactul celulă-celulă, aderența celulelor de Candida albicans la celulele epiteliale gazdă implică o serie de interacțiuni între receptorii celulelor epitaliale și adezinele celulelor de Candida albicans, adezine ce diferă în funcție de starea morfologică a fungului (Chaffin, 2008).

Hwp1p (proteina peretelui hifei) este una dintre cele mai intens studiate adezine și este exprimată ca proteina glicozilfosfatidilinozitol (Staab și colab., 2004). Această adezină interacționează cu proteinele neidentificate ale gazdei având ca rezultat legarea covalentă a celulelor de Candida albicans de celulele epiteliale ale gazdei. Glutaminele N-terminale din Hwp1p sunt reticulate pentru a găzdui proteina. Importanța acestei adezine poate fi observată din experimentele unde Candida albicans care nu prezintă Hwp1p nu a cauzat candidoză orofaringiană la șoareci (Sundstrom și colab., 2002). Experimentele recente in vivo folosind Hwp1p mutant au arătat ca rolul acestei adezine este legat de virulența la nivelul suprafețelor mucoaselor și are efect asupra capacităților de diseminare cauzatoare de infecții sistemice (Staab și colab., 2013).

Poate unele dintre cele mai cunoscute adezine ale celulelor de Candida albicans sunt secvențele de aglutinină (ALS-Agglutinin-like sequence) care cofică pentru glicoproteine mari ale peretelui celular, având acțiune în aderența celulelor de Candida albicans la suprafețele gazdei (Zhao și colab., 2003; Hoyer și colab., 2001). Familia de gene ALS cuprinde opt membri (ALS1, ALS7 și ALS9) și toate au trei domenii structurale asemanătoare fiind asociate cu β 1,6 glucan din peretele celular al tulpinii de Candida albicans. ALS3 se pare că are un rol important în aderența la celulele epiteliale din cavitatea orală.

În afară de Hwp1p și familia de proteine ALS au mai fost identificate și alte adezine cum este cazul proteinei EAP1 (Enhanced Adherence to Polystyrene – Sporirea Aderentei la Polistiren). Aceasta a fost studiată deoarece are aptitudinea de a codifica o proteină ce mediază aderența la polistiren a Saccharomyces cerevisiae și deoarece EAP1 mai are rol și în aderența celulelor de Candida albicans la celulele epiteliale ca și la cele de polistiren (Li si colab., 2003).

Fig. 2. Etapele procesului infecțios la Candida și factorii de virulență implicați în acest proces (după Naglik și colab., 2003)

Odată aderate la suprafața celulelor epiteliale au loc doua evenimente majore, după care urmează evenimentele de recunoaștere și invazie. Evenimentul de recunoaștere are la bază funcționarea unor proprietăți discriminatorii între patogen și comensal. Dat fiind numărul mare de microbi de pe suprafața celulelor epiteliale, în general, acestea s-au adaptat creându-și mecanisme care să le poată face capabile să identifice și să raspundă doar acelor agenți cauzatori de boli și nerăspunzând acelora comensali.

Rezistența la antifungice

Tratamentul împotriva infecțiilor candidozice de la cele superficiale la cele invazive, se bazează pe o categorie limitată de medicamente, formată din trei clase majore de antifungice: poliene, azoli și echinocandine (Odds și colab., 2003). Cu toate că, această grupare de medicamente este compromisă de probleme de selectivitate, toxicitate și dezvoltarea rezistenței.

Polienele, au fost prima clasă de medicamente antifungice descoperite, fiind introduse in clinică în jurul anilor ’50. Aceste molecule amfipatice includ amfotericina B și nistatina, având rolul de a lega sterolii din membrana celulei fungice care duc la scurgeri de constituienți intracelulari prin formarea de canale transmembranare. Amfotericina B este ca un agregat extramembranar de dimensiuni mari ce acționează ca un fungicid ce omoara levurile prin simpla legare și extracție de ergosterol (Anderson și colab., 2014).

Azolii, cea de-a doua clasă, sunt cea mai numeroasă familie de medicamente antifungice. Azolii sunt cei care rup membrana celulei prin inhibarea activității C14-α-lanosterol-demetilază, o enzimă implicată în biosinteza ergosterolului. Ergosterolul este similar colesterolului în celulele animale, fiind unul dintre componentele majore ale membranei celulei fungice. Familia azolilor cuprinde: imidazol (miconazol, econazol, clotrimazol și ketconazol) și triazoli (fluconazol, itraconazol) iar ultimul agent voriconazol, ce este un derivat triazol sintetic (Hof, 2006). Toți triazolii sunt inhibitori ai C14-α-lanosterol-demetilază, enzima esențială în biosinteza ergosterolului, această situație conducând la probleme ale integrității membranei celulare. Datorită faptului că fluconazolul este rapid absorbit, acesta are o biodistribuție mai mare de penetrare în lichidul cefalorahidian și în umoarea vitroasă. Din nefericire, o problemă ce apare adesea ține de apariția rezistenței, incluzând aici și rezistența încrucișată față de derivații de tip azol multiplii (Perea și colab., 2001).

Echinocandinele, cele mai noi clase de medicamente antifungice disponibile și răspândite la începutul anilor 2000. Echinocandinele, din care fac parte: caspofunginele, micafunginele și anidulafunginele, inhibă sinteza β 1,3 gucan, un component esențial al peretelui celular fungic, fiind singura clasă de antifungice ce vizează un anumit component fungic. Această inhibare dirijează la modificări structurale care în final conduc la liza de tip osmotic (Grover, 2010). Echinocandinele sunt cele mai selective și mai puțin toxice medicamente antifungice.

Rezistența la antifungice are la bază diferite mecanisme: a) reducerea acumulării de medicamente intracelulare, b) scăderea afinității țintă pentru medicament și c) contracararea efectului medicamentului. Mecanismul de rezistență va fi diferit în funcție de modul de acțiune al compușilor antifungici.

Rezistența la azoli, în ultimii 10 ani, fluconazolul și itraconzolul au fost foarte fololosite în chimioprofilaxii și în tratamentele infecțiilor fungice (Meis și colab., 2001). Mai târziu au fost depistați mai mulți pacienți cu rezistență la fluconazol, de fapt, Candida albicans azol rezistentă se întâlnește de cele mai multe ori la pacienții infectați cu HIV cu candidoză orofaringiană (Skiest și colab., 2007).

Reducerea acumulării de medicamente intracelular, un astfel de mecansim prin scăderea concentrației intracelulare de azol constă în suprareglarea a două familii de pompe de eflux (Cannon și colab., 2009). Aceste pompe diferă prin sursa de energie utilizată. Pompele CDR aparțin superfamiliei casetei de legare a ATP-ului (ABC) ce au capacitatea de a de a scoate toți azolii antifungici. Acestea sunt codificate de Candida rezistente 1 și 2 (CDR1 și CDR2), gene ale tulpinii de Candida albicans.

O altă pompă este un transportor secundar ce folosește gradient de protoni ca sursă de energie, fiind specifică pentru fluconazol. Aceasta aparține superfamiliei transportoare MFS fiind codificată de gena MDR1 a tulpinii de Candida albicans.

Scăderea afinității țintă pentru medicamente. Ținta antifungicelor de azol este C14-α-lanosterol-demetilază codificată de gena ERG11.

Contracararea efectului medicamentului, la acest proces intervin două mecanisme. Primul sistem are la bază suprareglarea genei leader ERG11 ce duce la o creștere intracelulară a proteinei țintă. Al doilea mecansim, deși foarte puțin frecvent, a fost observat în câteva izolări clinice a tulpinii de Candida albicans (Martel și colab., 2010).

Capitolul 3

Candida non-albicans

În ultimii ani, dintre speciile de Candida non-albicans, cele mai des întâlnite ca patogeni umani sunt Candida glabrata, Candida tropicalis și Candida parapsilosis. Dintre speciile de Candida izolate la om, Candida albicans este cel mai des întâlnită, atât în condiții fiziologice de boală cât și în stare sănătoasă dar deși studiile arată că 80% din cazuri pacienții sunt infectați cu Candida albicans. În ultimele două decenii, numărul de infecții datorate speciilor Candida non-albicans au crescut considerabil în principal din cauza speciei Candida glabrata. Studiile recente au arătat că fungemia se află în corelație cu speciile Candida non-albicans (Colombo și colab., 2007) iar incidența speciei Candida glabrata este mai crescută la adulți decât la copii și scăzută la nou-născuți (Kremery și colab. 2002).

Candida glabrata

Candida glabrata este în general a doua cea mai comună cauză de candidoză după Candida albicans. Infecțiile cu Candida glabrata pot fi la nivelul mucoaselor sau la nivel sistemic și pot apărea la persoane imunocompromise. În contrast față de alte specii de Candida, Candida glabrata nu este dimorfică, nu are creștere polimorfică și crește ca o blastoconidie în orice mediu indiferent de condiții. Pe mediu Sabouraud dextroză agar, Candida glabrata formează colonii de culoare gălbuie, strălucitoare și netede și care sunt foarte asemănătoare cu celelalte specii de Candida. Celulele de Candida glabrata măsoară între 1-4 µm, fiind mult mai mici decît Candida albicans 4-6 µm, Candida tropicalis 4-8 µm și Candida parapsilosis 2,5-4 µm (Calderone, 2002).

Aderența

Celulele de Candida glabrata pot coloniza cavitatea bucală, esofagul, intestinele și suprafața mucoasei vaginale. Se presupune că mecansimul de apărare al gazdei supresează proprietățile patogene și astfel previne infecția. Aderența celulelor de Candida glabrata la suprafața țesutului epitelial al gazdei este influențat de glicozilfosfatidilinozitol (Sundstrom, 2002). Candida glabrata este capabilă de a coloniza țesuturile gazdă și de asemenea suprafețele abiotice, unde se dezvoltă ca biofilm pluristratificat, deși nu este capabilă de a forma filamente. Un factor important care este corelat cu abilitatea de aderență a speciilor de Candida este dat de prezența unor proteine specifice din peretele celular denumite adezine.

Aderența este un factor de virulență extrem de important, fiind compusă din mai multe proprietăți, de exemplu suprafața celulelor hidrofobe care sunt afectate de factorii de mediu și pot afecta interacția cu adezinele receptor. În timp ce hidrofobicitatea suprafeței celulelor de Candida albicans au fost extrem de sensibile la creșterea în condiții specifice, la Candida glabrata au fost mai puțin sensibile în aceleași condiții de creștere, ceea ce sugerează că Candida glabrata nu este atât de sensibilă sau atât de inflențată de factorii înconjurători (Hazen și colab. 1986). Mai mult chiar, în timp ce Candida albicans sunt recunoscute de anticorpi monoclonali cum este cazul integrinei β2 care sunt receptori pentru adezine, legarea acelorași anticorpi la Candida glabrata nu a fost identificată, cum a fost identificată legarea la Candida parapsilosis și Candida krusei, ceea ce sugerează faptul că Candida glabrata nu exprimă aceste adezine specifice, acest lucru fiind un dezavantaj în aderența lor (Bendel și colab., 1991).

La Candida glabrata majoritatea adezinelor sunt codificate de familia de gene EPA (adezine epiteliale). Structura proteinei EPA este asemănătoare cu cea a proteinei ALS (secvențe aglutinin-like) ale tulpinii de Candida albicans. (Cormack și colab., 1999) au descoperit că proteina EPA1P este o lectină dependentă de Ca2+ care se leagă cu N-acetil lactozamină. Genele EPA1, EPA6 și EPA7 sunt implicate în aderența celulelor de Candida glabrata la celulele epiteliale umane gazdă (Cormack și colab., 1999). Secvențele analizate de la Candida glabrata sunt mai asemănătoare cu Saccharomyces cerevisiae și mai puțin asemănătoare cu Candida albicans (Bialkova, 2006). Reglarea complexului de adezine la Candida glabrata este similar cu procesul de reglare a genelor de floculare (FLO) de la Saccharomyces cerevisiae care sunt implicate în fermentarea berii (Brunke și colab., 2013). Știind că aderența celulelor de Candida glabrata joacă un rol important în virulență, genele FLO1, FLO5 și FLO10 au fost studiate. La Candida glabrata FLO10 (numită și EPA1) este esențială pentru realizarea aderenței la țesutul epitelial uman in vitro (Cormack și colab., 1999). FLO5 face parte din familia adezinelor EPA, dar rolul lor în aderență nu a fost studiat.

Un alt factor specific de virulență la Candida albicans este instabilitatea fenotipică ce permite tulpinilor să schimbe fenotipul coloniilor fără a afecta genotipul, acest factor fiind denumit schimbare fenotipică. Acest fenomen a fost observat de curând și la Candida glabrata fiind un lucru interesant deoarece un asemenea fenomen pot avea loc și la organismele non-dimorfice la fel ca și la organismele haploide.

Producția de enzime

La genul Candida, factorii de virulență cuprind nu doar aderența și formarea de biofilme dar și capacitatea de a distruge țesutul gazdă care poate fi facilitat prin eliberarea enzimelor hidrolitice. Secreția de enzime, cum este cazul proteazelor, fosfolipazelor, lipazelor și hemolizinelor intervin în supraviețuirea și replicarea levurii, având capacitatea de a distruge epiteliul. Candida glabrata nu produce proteaze acest lucru fiind contrar celorlalte specii de Candida.

Fosfolipazele

Fosfolipazele hidrolizează fosfolipidele în acizi grași iar producerea lor contribuie la deteriorarea membranei celulei gazdă și expunerea receptorilor ce conduc la aderență. Candida glabrata produce fosfolipaze care conduc la o interacțiune și mai puternică cu suprafața mucoasei gazdă și mai departe la distrugerea și invazia efectivă a țesutului implicat. Fosfolipazele sintetizate la Candida glabrata sunt aceleași ca cele două secretate de Candida albicans: fosfolipaza B (PLB) și lizo-fosfolipaza A (Ghannoum, 2000). Comparativ cu Candida albicans care sintetizează cel puțin patru fosfolipaze diferite, la Candida glabrata s-a observat sinteza a două fosfolipaze ceea ce sugerează că sinteza acestora este puțin importantă în patogenitatea speciei Candida glabrata.

Candida glabrata mai produce și lipaze ce sunt implicate în hidroliza triacilglicerolilor. La Candida albicans sunt implicate 10 gene ce codifică pentru lipaze, iar secvențe similare ca la Candida albicans (LIP1-10) au fost observate la Candida tropicalis dar nu și la Candida glabrata.

Hemolizine

Luo și Samaranayake (2002) au susținut faptul că speciile de Candida non-albicans, cum este și cazul speciei de Candida glabrata sunt capabile de a degrada hemoglobina folosind hemolizine în schimbul obținerii fierului. Asemănător altor specii de Candida, Candida glabrata poate crește în celulele gazdă prin degradarea hemoglobinei și eliberarea fierului din celulele gazdă pentru procesele metabolice.

Antifungice și modul lor de acțiune

Rezistența la tratamentul antifungic a tulpinilor de Candida glabrata se întâmplă foarte rar înainte ca pacientul să fie infectat cu HIV (Fidel și colab., 1999). Datorită utilizării la o scară foarte largă a antifungicelor, un număr tot mai mare de pacienți imunocompromiși se află în imposibilitatea de a elimina candidoza datorită fenomenului de rezistență la antifungice.

Ca în majoritatea infecțiilor de candidoză, tratamentul se realizează cu ajutorul unor antifungice ce au două efecte majore: fungistatic – creșterea agentului patogen este inhibată și fungicid – agentul patogen este eradicat sau ucis. Clasele de antifungice sunt sortate pe baza acțiunii asupra levurii.

Azolii

Azolii, cei mai comuni folosiți, cuprind fluconazoli, itraconazoli, ketoconazoli, miconazoli, voriconazoli, posaconazoli și rosaconazoli, fiind capabili de a bloca biosinteza de ergosterol prin inhibiția lanosterolului 14-α-demetilază ceea ce conduce la o diminuare a producției de ergosterol. În plus, sunt responsabili de lipsa capacității de a construi și a reînnoi sterolii din membrana celulară, schimbarea fluidității membranei și funcția vitală a procesului de semnalizare, transport, exocitoză și endocitoză. În plus inhibă citocromul P450 care este dependent de lanosterol-demetilază și care este esențial pentru biosinteza ergosterolului (o componentă a membranei celulare).

Mecanismul de rezistență la azoli a tulpinii de Candida glabrata include și o afinitate mică pentru lanosterol 14-α-demetilază sau o capacitate mare de a regla ERG11 (gene de biosinteză a ergosterolului) în urma expunerii la azoli (Kaur și colab., 2007). Disfuncția mitocondrială este un alt mecanism posibil prin care rezistența la azoli poate avea loc la Candida glabrata. În plus, dezvoltarea “mutantelor petite” (celule cu deficiență de ADN mitocondrial) suprareglează genele transportatoare a casetelor ABC de legare a ATP, care cresc rezistența la azoli. Dintre speciile de Candida, Candida glabrata pare să aibă cea mai mica sensibilitate la azoli (Fidel și colab., 1999). Mecanismele responsabile de rezistența la antifungice la Candida albicans sunt: 1) schimbări în peretele celular sau în membrana plasmatică ceea ce consuc la absorbția redusă a medicamentelor; 2) modificări ale enzimei lanosterol demetilază, codificată de gena ERG11 ceea ce duce la pierderea afinității antifungicelor sau supraexpresia ERG11; 3) angajarea unui mecanism de eflux al medicamentelor, dependent de energie mediat de proteine membranare de transport al ATP-ului (ABC). Dintre acestea, ultimele două sunt cele mai studiate și au fost observate ca mecanism de rezistență la Candida glabrata.

Polienele

Studiile cu privire la rezistența la antifungice a tulpinii de Candida glabrata se bazează în general pe azoli și echinocandine, deși se cunosc puține lucruri despre rezistența la poliene, acestea sunt componentele esențiale ale membranei celulare. Polienele, precum este amfotericina B, nistatina și pimaricina omoară organismul fungal și se leagă de moleculele de ergasterol, care conduc la formarea porilor în peretele celular și crește permeabilitatea celulei. Principala țintă a polienelor este componenta esențială a membranelor celulelor și anume ergosterolul. Interesant este faptul că rezistența la poliene este asociată cu rezistența la azoli, acest lucru se datorează faptului că lipsa de ergosterol reduce relul enzimei lanosterol-demetilază, prin urmare reducerea azolilor va avea un efect mai redus asupra levurii patogene (Phillix și colab., 2015). Deși Candida glabrata a demonstrat susceptibilitatea la poliene, utilizarea lor la scară largă ca antifungice este mai puțin frecventă datorită efectelor toxice.

Echinocandinele

Antifungicele care sunt utilizate în prima fază pentru candidozele invazive sunt echinocandinele care cuprind capsofungine, micofungine și anidulafungine. Acestea funcționează prin inhibarea enzimelor care sintetizează β 1-3 D glucan care este esențial pentru peretele celular ai fungilor (Silva, 2012). Spre deosebire de azoli, rezistența la echinocandine nu a fost corelată cu mecanismul de eflux al antifungicelor deoarece sunt un substrat slab pentru transportatorii antifungicelor de eflux. În schimb rezistența la echinocandine este cauzată de interferența dintre medicament și enzima țintă care sintetizează β 1-3 D glucan (Perlin, 2007). Subunitățile țintă pentru această enzimă sunt codificate de trei gene: FKS 1, 2 și 3, iar mutațiile genelor FKS 1 și 2 au determinat rezistența la antifungice la Candida glabrata. Mutațiile în anumite zone importante ale FKS 1 și FKS 2 cauzează un număr predominant de substituții de aminoacizi ceea ce conferă rezistență la echinocandine (Katiyar și colab., 2012).

Statinele

Deși nu au fost concepute ca antifungice, statinele, principalele medicamente utilizate în tratarea hipercolesterolemiei nu au proprietăți antifungice. Două dintre acestea, simvastanina și atorvastatina sunt utilizate zilnic de milioane de oameni pentru a inhiba activitatea HMG-COA-reductaza și pentru a reduce sinteza colesterolului la un nivel normal. Cu toate acestea, HMG-COA-reductaza este prezentă la toate eucariotele iar în cazul speciei de Candida duce la reducerea producției de ergosterol, ceea ce similar cu efectul azolilor: ambele duc la niveluri mici de ergosterol și astfel inhibă creșterea (Westermeyer și colab., 2007).

Candida tropicalis

Conform informațiilor epidemiologice Candida tropicalis a fost asociată cu infecțiile tractului urinar și cu bolile maligne hematologice. Printre speciile de Candida, Candida tropicalis a fost recunoscută ca prima sau a doua specie din grupul tulpinilor de Candida non-albicans. Câțiva factori de virulență par a fi cauza pentru infecțiile cu Candida tropicalis, ce prezintă o rată mare a diseminării infecției și mortalității (Okawa și colab., 2008). Aderența la suprafețele gazdei (celulele epiteliale) și formarea de biofilme sunt primul pas în diseminarea infecției. Mai mult de atât, producerea de enzime (proteaze și fosfolipaze), la fel și activitatea hemolitică sunt recunoscute ca fiind factori importanți în invazia țesutului gazdă. În plus, infecțiile din mucoasa orală și din tractul gastrointestinal sunt cele mai predispuse la invazia candidozică (Bodey, 1984). Studiile de autopsie la astfel de pacienți au dovedit că aceste candidoze din tractul gastrointestinal sunt datorate infecției cu Candida albicans sau Candida tropicalis (Stone și colab., 1974). Un risc major de colonizare cu speciile de Candida non-albicans se produc în perioada neonatală atunci când poate predomina Candida tropicalis, cel mai probabil prin contaminare încrucișată (Roilides și colab., 2003).

Factorii de patogenitate

Activitatea secretorie a proteinazelor aspartice 5 și 9 (Sap 5 și Sap9) are loc la toate speciile după cum urmează: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida kefyr, Candida krusei. Proteinazele aspartice secretate de Candida tropicalis au fost descoperite pe suprafața pereților pereților celulelor fungice înainte de a invada țesutul gazdă în timpul diseminării infecțiilor și invadării macrofagelor după fagocitoză (Borg și Ruchel, 1990). Ca și în cazul tulpinii de Candida albicans, studiile in vitro au demonstrat că Candida tropicalis are un nivel al secrețiilor Sap ridicat într-un mediu care conține ser bovin și albumină ca unică sursă de azot (Negri și colab., 2010). În plus, Candida tropicalis are cel puțin 4 gene ce codifică pentru Sap. Prezența Sap secretate de Candida tropicalis a fost observată și pe suprafața unor elemente fungale care penetrau țesutul în timpul răspândirii infecției (Borg și Ruchel, 1990). Sap sunt enzime ce au fost clasate ca fiind fosfolipaze implicate în patogenitatea speciilor de Candida. Câteva studii au arătat că speciile de Candida non-albicans produc fosfolipaze extracelulare (Galan și colab., 2010) dar la nivele mult mai scăzute în comparație cu Candida albicans (Ghannoum, 2000). Candida tropicalis apare ca având o capacitate scăzută de a produce fosfolipaze extracelulare (Galan și colab., 2010).

Aderența

Panagoda și colab., 2001 au arătat că procesul inițial de aderență a celulelor de Candida parapsilosis și de Candida tropicalis sunt asociate cu hidrofobicitatea suprafeței.

Creșterea filamentoasă

Se consideră că hifele au un rol important în invazia țesuturilor. Formele morfologice de Candida tropicalis sunt asemănătoare cu cele de Candida albicans. Într-un studiu realizat de Silva și colab., (2010) au arătat că doar formele filamentoase de Candida tropicalis sunt apte de a se propaga în epiteliul oral.

Hemolizine

Candida glabrata, Candida parapsilosis și Candida tropicalis sunt toate capabile de a produce hemolizine in vitro inducând liza totală sau parțială a eritrocitelor.

Antifungice și modul lor de acțiune

Într-un studiu amplu realizat de Pfaller și colab., (2009) au observat că Candida tropicalis avea un nivel mediu de rezistență la fluconazol. Acest lucru indică faptul că poate exista un risc de rezistență la fluconazol prin suprareglarea transportorilor de eflux la expunerea de concentrații crescute ale medicamentului. Nistatinele și amfotericina B dar nu și fluconazolul scad activitatea fosfolipazelor atât a speciilor de Candida albicans cât și cele de Candida tropicalis (Anil și Sanaranayake, 2003). Cu excepția speciei Candida tropicalis, voriconazolul este mult mai eficient decât fluconazolul împotriva majorității speciilor importante de Candida (Pfaller și Diekema, 2007). Posaconazolul are acțiune fungistatică împotriva unor specii Candida non-albicans precum Candida glabrata, Candida tropicalis și Candida parapsilosis (Scozo și colab., 2007). Echinocandinele sunt foarte active împotriva Candida albicans, Candida glabrata și Candida tropicalis atât in vitro cât și in vivo (Bayegan și colab., 2010).

Candida parapsilosis

În ultimii ani, incidența tulpinilor de Candida parapsilosis a crescut îngrijorător și este raportată ca fiind adesea cea de-a doua cea mai răspândită specie de Candida în unele spitale (Pfaller și colab., 2001). Candida parapsilosis, a fost izolată pentru prima dată de Ashford (ca fiind o specie de Monilia deoarece nu era capabilă să fermenteze maltoza), de la scaunul unui pacient cu diaree din Puerto Rico în 1928 (Ashford, 1928). Această specie a fost numită Monilia parapsilosis pentru a fi diferențiată de Monilia psilosis, care este cunoscută astăzi drept Candida albicans.

Începând din 2005 au fost identificate 3 grupe distincte de Candida parapsilosis (numite grupuri I, II și III) și au fost descrise ca specii noi: Candida parapsilosis sensu stricto, Candida ortopsilosis și Candida metapsilosis (Tavanti și colab., 2005).

Celulele de Candida parapsilosis pot avea formă ovală, rotundă sau cilindrică. Când sunt cultivate pe agar Sabouraud dextroză, coloniile de Candida parapsilosis sunt de culoare albă, crem, strălucitoare și netede sau încrețite. Spre deosebire de Candida albicans și Candida tropicalis care pot exista în multiple forme morfogenetice, Candida parapsilosis nu formează hife ci există fie într-o stare de levură sau într-o formă pseudohifală (Laffey și Butler, 2005). Pseudohifele sunt în general mari și curbate fiind denumite de cele mai multe ori “celule gigante”. Candida parapsilosis este comensală găsindu-se frecvent pe tegumentul uman iar patogenitatea sa este limitată dacă tegumentul este intact. În comparație cu alte specii de Candida, Candida parapsilosis este răspândită în natură deoarece spre deosebire de Candida albicans și Candida tropicalis, nu este un agent patogen izolat la oameni (Weems, 1992) dar se întâlnește și la animale domestice, insecte sau în mediu marin (Fell și Meyer, 1967). Diseminarea tulpinilor de Candida albicans și Candida tropicalis este de obicei precedată de o colonizare iar aceste drojdii sunt transmise vertical de la mamă la copil în momentul nașterii, spre deosebire de Candida parapsilosis poate să apară fără a fi precedată de colonizare și este frecvent transmisă orizontal prin surse externe cum ar fi: dispozitive medicale contaminate, fluide, mâinile și așa mai departe.

Virulența tulpinii de Candida parapsilosis a fost cercetată folosind diferite moduri: un mod este o infecție in vitro utilizând celule microgliale și are ca rezultat în urma testării cu cele 3 grupe de Candida parapsilosis, unde Candida metapsilosis a fost cea mai puțin virulentă. De asemenea s-au folosit infecții epiteliale și modele de țesut epidermic unde Candida metapsilosis a fost cea mai puțin patogenă deoarece a produs mai puține modificări iar celulele de levură puteau fi observate foarte rar atașate la epiteliu (Gago și colab., 2014, Gacser și colab., 2008).

Aderența

Colonizarea și infecția cu Candida parapsilosis depinde de capacitatea levurii de a adera la celulele gazdei și la țesuturi, în special pe suprafața mucoaselor. Aderența la dispozitive medicale ușurează formarea biofilmului și poate afecta gazda. Hidrofobicitatea suprefeței celulelor a fost inițial asociată cu aderența tulpinii de Candida parapsilosis la suprafețe (Panagoda și colab., 2001) iar producerea de substanță vâscoasă a fost corelată de tendința Candida parapsilosis de a adera la cateterul de plastic (Branchini și colab., 2004). Virulența scăzută a Candida parapsilosis spre deosebire de Candida albicans a fost corelată cu capacitatea de a produce forme hifale care sunt mult mai aderente în comparație cu formele pseudohifale produce de Candida parapsilosis (Grubb și colab., 2009). Unul dintre factorii care ar putea să o facă pe Candida parapsilosis o specie colonizatoare este o familie mare de potențiale adezine care se găsesc în genom. Mai mult, Butler și colab., 2009 au găsit un număr foarte mare de gene ce au rol în codificarea proteinelor ce se comportă ca adezine la peretele celular printre care și cinci proteine Als și șase proteine pentru Pga 30 (proteine ce se ancorează în glicozilfosfatidilinozitol).

Secreția de enzime

În ultimii ani, secreția de enezime microbiene a agenților patogeni a fost studiată în detaliu datorită potențialului în patogeneză și ca posibilă țintă pentru proiectarea inhibitorilor sintetitici în tratarea infecției. Cele mai importante enzime sunt proteinazele aspartice, fosfolipazele și lipazele. În cazul tulpinilor de Candida parapsilosis nu s-a constatat nicio corelație între producția de hemolizine sau urează și dezvoltarea de pseudohife (Sabino și colab., 2011). Cu toate acestea, toate grupele din specia Candida parapsilosis au prezentat activitate proteinazică și au putut dezvolta pseudohife.

Secreția de Sap

Comparativ cu Candida albicans, Candida parapsilosis are mult mai puțină activitate Sap. Trei proteine Sap au fost identificate la Candida parapsilosis din care două au rămas în mare parte necaracterizate (Odds 1987, Ruchel și colab., 1986).

Secreția de fosfolipaze

Fosfolipazele sunt enzime capabile de hidrolizarea legăturilor esterice în glicerofosfolipide. Secreția de fosfolipaze se presupune că are rol în perturbarea membranelor celulelor gazdei (Ghannoum, 2000). Rolul fosfolipazelor în patogeneza Candida parapsilosis este neclară întrucât nu toate tulpinile prezintă activitate fosfolipazică, Ghannoum, 2000 raportând că a găsit astfel de activitate doar în 51% din tulpinile de Candida parapsilosis iar Kantarcioglu și Yucel, 2002 nu au înregistrat deloc activitate fosfolipazică în testele lor.

Lipazele

Lipazele catalizează atât hidroliza cât și sinteza triacilglicerolului și sunt caracterizate de stabilitatea lor la temperaturi ridicate în solvenți organici și de rezistența lor la proteoliză (Brockerhoff, 1974). Se presupune că lipazele au multiple roluri care include digestia lipidelor pentru nutrient, aderența la celule și țesuturi, inițierea procesului inflamator prin care afectează celulele sistemului imunitar și de autoapărare prin liza microflorei adverse (Schaller și colab., 2005). La Candida parapsilosis s-au identificat două gene lipazice: CpLip1 și CpLip2, deși doar CpLip2 codifică pentru o proteină activă (Brunel și colab., 2004). De asemenea, Trofa și colab., 2008 au cercetat rolul lipazei în patogeneza tulpinii de Candida parapsilosis. Aceștia au arătat că folosind inhibitori ai lipazei s-au redus semnificativ leziunile țesutului în timpul infecției cu Candida parapsilosis apoi, ei au construit homozigoți mutanți de CpLip1 și CpLip2 și au constatat că au format biofilme mult mai puțin complexe și subțiri, având o creștere redusă în mediu bogat în lipide, mai vulnerabile față de celulele macrofage și au fost mai puțin virulente în infecția epiteliului oral uman reconstituit.

Capitolul 4

Evaluarea caracterelor de patogenitate și virulență a speciilor de Candida albicans și Candida non-albicans

Introducere

Toate microorganismele patogene au dezvoltat mecansime care permit colonizarea cu succes sau infecția gazdei. Ca rezultat, cei mai mulți agenți patogeni, inclusiv speciile de Candida, au dezvoltat un sistem eficient de virulență și strategii specifice pentru a ajuta la capacitatea lor de a coloniza țesuturile gazdă, sau de a cauza boli și de a depăși barierele de apărare ale gazdei. Pare evident că un grup de atribute ale virulenței sunt implicate în procesul de infectare dar nu există un singur factor reprezentant pentru virulența tulpinilor de Candida și nu toate atributele sunt necesare pentru un anumit stadiu al infecției.

Scop

Caracterizarea fenotipică a factorilor de virulență și patogenitate a unor tulpini levurice aparținând genului Candida izolate din clinică.

Obiective

Evidențierea fenotipică a unor factori de virulență enzimatici, produși de tulpini de Candida albicans și Candida non-albicans, din diferite produse patologice.

Determinarea capacitatii de aderența a celulelor levurice la substrat celular.

Materiale și metode

Tulpini levurice

În acest studiu s-au utilizat 40 de tulpini levurice izolate din probe clinice și incluse în colecția de culturi a Departamentului de Microbiologie al Facultății de Biologie (tabel 1).

Tabel. 1. Tulpini levurice utilizate în studiu și sursa de izolare.

Alte materiale

anse cu fir metalic

Medii de cultură: Mediu Yeast Peptone Glucose (YPG)

Mediu cu glucoză sânge – evidențierea hemolizinelor

Mediu pentru producerea de proteaze

Mediu pentru fosfolipaze

pipete

Metode de lucru:

Evidențierea fenotipică a expresiei de factori enzimatici solubili implicați în virulență.

Expresia factorilor enzimatici solubili de virulență a fost determinată cu ajutorul a trei teste enzimatice care au urmărit punerea în evidență a următoarelor enzime: hemolizine, proteaze și fosfolipaze.

Producerea de hemolizine

Tulpinile au fost însămânțate în spot pe geloză cu adaos de 3% glucoză și 7% sânge. După incubare la 370C timp de 48 de ore, producerea de hemolizine a fost indicată prin apariția în jurul culturii levurice a unor zone de hemoliză.

Producerea de proteaze

Tulpinile au fost însămânțate în spot pe un mediu format din MgSO4, K2HPO4, NaCl, extract de drojdie, glucoză, albumină serică bovină și agar. După incubare la 370C, timp de 24 de ore, producerea de proteaze a fost indicată de apariția în jurul spoturilor de cultură a unor zone de precipitare și respectiv a unor halouri transparente.

Producerea de fosfolipaze

Tulpinile au fost însămânțate în spot pe un mediu format din apă distilată (184 ml) în care au fost adăugate Saboraud Geloză Agar, NaCl, CaCl2 cu adaos 10% galbenuș de ou. După incubare la 370C timp de 24 de ore, producerea de fosfolipaze a fost indicată prin apariția în jurul spoturilor a unor zone de precipitare și respectiv a unor halouri transparente.

II. Determinarea capacitatii de aderența a celulelor levurice la substrat celular.

Pentru testarea capacității de aderență la substrat celular s-a utilizat linia celulară tumorală HeLa (carcinom de col uterin) cu grad de confluență 80-100%. Pentru aceasta, mai întâi se fac suspensii de 1 McFarland pentru 35 de probe, având ca referință o probă martor. Din fiecare suspensie se repartizează câte 500 de µl în fiecare godeu în care se află monostrat celular în mediu nutritiv. După incubare timp de două ore, se înlătură mediul împreună cu suspensia și se spală cu AFS pentru a înlătura resturile de celule levurice neaderate. Se adauga alcool metilic pentru 5 minute cu scopul de a fixa celelule levurice și se spală din nou cu AFS. Ca o ultimă etapă, se colorează cu Giemsa 10% timp de 20 de minute și apoi se vizualizează la microscopul cu obiectiv de imersie (1000x). Se apreciază semicantitativ capacitatea de aderență prin calcularea indicelui de aderență = % de celule eucariote care prezintă celule levurice aderate la suprafață (matrice extracelulară)/număr total de celule eucariote.

Rezultate și discuții

Studiul de față a cuprins un număr de 40 de tulpini levurice de Candida albicans izolate din: probe de urocultură (50%), probe din secreție traheală (30%), secreție bronșică și secreție sputa (10%) și Candida non-albicans după cum urmează: Candida glabrata (23%), Candida tropicalis și Candida krusei (17%), Candida famata (13%), Candida lusitaniae (10%), Candida gilliermondi, Candida parapsilosis (7%) și Candida kefyr (6%).

Fig. 3. Reprezentarea diagramatică a distribuției procentuale a surselor de izolare a tulpinilor de Candida albicans.

Fig. 4. Reprezentarea diagramatică a distribuției procentuale a speciilor de Candida non-albicans analizate.

Obiectiv 1. Evidențierea fenotipică a unor factori de virulență enzimatici, produși de tulpini de Candida albicans și Candida non-albicans, din diferite produse patologice.

În ceea ce privește producerea de hemolizine, tulpinile care s-au remarcat au fost cele de la Candida glabrata (45%) și se poate vedea că această proprietate este prezentă și la celelalte tulpini non-albicans, dar la un nivel mai redus : Candida famata, Candida kefyr, Candida parapsilosis, Candida gilliermondi, Candida krusei (11%).

Fig. 5. Reprezentarea diagramatică a distribuției procentuale a producerii de hemolizine exprimate de tulpinile de Candida-non albicans.

Fig. 6. Producerea de hemolizine ilustrate prin zonele de hemoliză din jurul coloniei levurice.

În ceea ce privește producerea de proteaze, tulpinile care s-au remarcat ca fiind înalt producătoare au fost Candida krusei (20%), Candida parapsilosis (20%). Se poate observa că această proprietate este prezentă și la celelate specii non-albicans luate în studiu, dar la un nivel mai scăzut.

Fig. 7. Reprezentarea diagramatică a distribuției procentuale a producerii de proteaze exprimate de tulpinile de Candida-non albicans.

Fig. 8. Producerea de proteaze ilustrate prin zonele de precipitare din jurul coloniei levurice.

În ceea ce privește producerea de fosfolipaze, tulpinile care s-au remarcat au fost cele de la Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis (18%). Se poate observa că această proprietate este prezentă și la celelalte specii non- albicans, dar la un nivel mai scăzut. Mai mult, la una dintre tulpinile de Candida tropicalis producerea de fosfolipaze a fost dublu pozitivă.

Fig. 9. Reprezentarea diagramatică procentuală a distribuției producerii de fosfolipaze exprimate de tulpinile de Candida-non albicans.

Fig. 10. Producerea de fosfolipaze a unei tulpini de Candida tropicalis dublu pozitivă ilustrată prin zonele de precipitare din jurul coloniei levurice.

În ceea ce privește distribuția tulpinilor de Candida albicans producătoare de hemolizine, se poate observa faptul că 75% dintre aceste tulpini au fost izolate din secreții ale tractului respirator inferior (secreții traheale și bronșice) provenite de la pacienți intubați aflați în secția de Terapie intensivă (figura 11). De asemena, dintre tulpinile producătoare de hemolizine, restul de 25% au fost izolate din probe de urocultură.

Fig. 11. Reprezentarea diagramatică procentuală a distribuției producerii de hemolizine exprimate de tulpinile de Candida albicans.

În ceea ce privește distribuția tulpinilor de Candida albicans producătoare de proteaze, se poate constata faptul că 50% dintre aceste tulpini au fost izolate din probe de urocultură, iar restul de 50% au fost izolate din secreții ale tractului respirator inferior (secreții traheale și bronșice) provenite de la pacienți intubați aflați în secția de Terapie intensivă (fig. 12).

Fig. 12. Reprezentarea diagramatică procentuală a distribuției producerii de proteaze exprimate de tulpinile de Candida albicans.

În ceea ce privește distribuția tulpinilor de Candida albicans producătoare de fosfolipaze se poate remarca faptul că 55% dintre aceste tulpini au fost izolate din secreții ale tractului respirator inferior (secreție traheală și bronșică) provenite de la pacienți intubați aflați în secția de Terapie intensivă iar restul au fost izolate din probe de urocultură (fig. 13).

Fig. 13. Reprezentarea diagramatică procentuală a distribuției producerii de fosfolipaze exprimate de tulpinile de Candida albicans.

Analizând aceste date, se poate concluziona că tulpinile izolate din probele de tract respirator prezintă un înalt grad de virulență și patogenitate, aceste tulpini exprimând la nivel înalt toți factorii de virulență analizați.

Tabel 2. Rezultatele evidențierii fenotipice a factorilor de virulență pentru fiecare tulpină levurică utilizată în studiu.

Obiectiv 2: Determinarea capacitatii de aderența a celulelor levurice la substrat celular.

Analizând datele prezentate în tabel, se poate observa faptul că tulpinile non-albicans studiate au prezentat indici de aderență la valori scăzute, cu excepția tulpinii C. tropicalis care a prezentat un indice de aderență de 30% și un pattern agregativ (tabel 3.)

Tabel 3. Tulpini levurice utilizate în studiul capacității de aderență, distribuția procentuală al indicelui de aderență și tipul de aderență observat.

Fig. 14. Aderența difuză a celulelor levurice de Candida tropicalis, imagine observată la microscopul optic (colorație Giemsa, 1000x).

Fig. 15. Aderența agregativă a celulelor levurice de Candida kefey, imagine observată la microscopul optic (colorație Giemsa, 1000x).

Fig.16. Aderența agregativă a celulelor levurice de Candida glabrata, imagine observată la microscopul optic (colorație Giemsa, 1000x).

Fig. 17. Aderența difuză a celulelor levurice de Candida glabrata, imagine observată la microscopul optic (colorație Giemsa, 1000x).

Fig. 18. Aderența agregativă a celulelor levurice de Candida glabrata, imagine observată la microscopul optic (colorație Giemsa, 1000x).

Fig.19. Aderența agregativă a celulelor levurice de Candida gilliumondi, imagine observată la microscopul optic (colorație Giemsa, 1000x).

Fig. 20. Aderența agregativă a celulelor levurice de Candida tropicalis, imagine observată la microscopul optic (colorație Giemsa, 1000x).

Fig. 21. Aderența agregativă a celulelor levurice de Candida glabrata, imagine observată la microscopul optic cu obiectivul de imersie 100x.

Fig. 22. Aderența agregativă a celulelor levurice de Candida tropicalis, imagine observată la microscopul optic cu obiectivul de imersie 100x.

Fig. 23. Aderența agregativă a celulelor levurice de Candida krusei, imagine observată la microscopul optic cu obiectivul de imersie 100x.

Concluzii

Studiul realizat pe tulpinile levurice de Candida albicans și Candida non-albicans a dovedit că expresia fenotipică a factorilor de virulență a fost una variabilă, în funcție de sursa de izolare și de specia testată.

În urma efectuării celor trei teste enzimatice ce au urmărit punerea în evidență a următoarelor enzime: hemolizine, proteaze și fosfolipaze, s-a putut observa că, în ceea ce privește evidențierea fenotipică a factorilor de virulență, tulpinile supuse studiului care au avut rezultate pozitive pentru toate cele trei teste au fost: Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis și Candida albicans izolată din secreție bronșică. Celelalte tulpini au prezentat rezultate pozitive sau negative, acestea fiind variabile în funcție de specie și sursa de izolare.

În ceea ce privește capacitatea de aderență, se poate observa că, deși tulpinile de Candida non-albicans nu au prezentat indici de aderență la valori foarte mari, 50% dintre aceste tulpini au manifestat un pattern de aderență agregativ, completând astfel tabloul factorilor de virulență exprimați de către acestea.

Biografie