Partea a II-a. Contribuții proprii [301957]

Partea a II-a. Contribuții proprii

II.1. [anonimizat] o parte, [anonimizat] o incidență crescută și o [anonimizat], de la suspiciunea implicării în carcinogeneza colorectală a [anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat], dar și a prognosticului pacienților cu astfel de leziuni.

Prezentul studiu și-a propus evaluarea completă și amănunțită a remodelării celulelor enterice gliale și a [anonimizat] a identifica posibile ținte terapeutice și de prognostic.

Studiul a [anonimizat], s-a urmărit îndeplinirea următoarelor obiective:

[anonimizat], raportându-i [anonimizat] a aprofunda mecanismele care stau la baza carcinogenezei colorectale;

[anonimizat], împreună cu elementele inflamatorii;

[anonimizat], clinici, histopatolgogici, precum și imunohistochimici ai pacienților incluși în acest studiu;

[anonimizat]-[anonimizat] a infiltratului leucocitar intratumoral;

II.2. Material și metode

II.2.1. Încadrarea studiului

Studiul efectuat a [anonimizat], a cuprins un număr de 58 [anonimizat] o perioadă de doi ani (2016-2018). Pentru a [anonimizat], în acest studiu am inclus pacienții în mod consecutiv.

Cazuistica analizată a provenit de la pacienți care au fost internați în Clinica de Gastroenterolgie a [anonimizat] s-a [anonimizat]. Ulterior, acești pacienți au fost supuși rezecției chirurgicale a [anonimizat] a aceluiași spital. [anonimizat], a fost imediat pus în soluție fixatoare de formol 10% și ulterior a [anonimizat] a [anonimizat] a [anonimizat]. Fragmente de material histologic au fost prelucrate în continuare în ,,Centrul pentru Studii de Morfologie Microscopică și Imunologie’’ [anonimizat] s-a realizat studiul imunohistochimic.

A fost alcătuit un singur lot de pacienți diagnosticați cu adenocarcinom colorectal, care a fost apoi împărțit în subloturi, în funcție de diferitele caracteristici clinico-patologice ale pacienților incluși în studiu, subloturi care au fost luate în considerare în momentul efectuării testelor statistice. Nu a fost necesară existența unui lot martor, întrucât s-a urmărit remodelarea celulelor enterice gliace și infiltratul leucocitar intratumoral doar pe probele de adenocarcinom colorectal, iar utilizarea altor probe din diferitele afecțiuni care ar fi necesitat excizia unui segment colorectal, în afară de adenocarcinomul colorectal, cel mai probabil ar fi oferit date fals pozitive sau negative, care nu puteau fi folosite în testele statistice efectuate în această cercetare.

Studiul a fost efectuat în conformitate cu normele și principiile Comisiei de Etică a Universității de Medicină și Farmacie din Craiova, fiind aprobat de aceasta și a respectat toate prevederile forurilor internaționale care reglementează cercetarea științifică, respectiv Declarația de la Helsinki, emisă de către Asociația Medicală Internațională (WMA – World Medical Asociation). Fiecare pacient, care a fost inclus în studiu, și-a dat acordul, semnând consimțământul informat și formularul de acceptare pentru prelevarea materialului biologic pentru studiu și, de asemenea, pentru folosirea datelor clinice și paraclinice din Foaia de Observație Medicală.

Așa cum am menționat, pe lângă informațiile obținute din analiza imagistică a secțiunilor de țesut tumoral colorectal, am utilizat și informațiile clinice și paraclinice din Foile de Observație Medicală, toate aceastea fiind înscrise pe o fișă electronică pentru fiecare pacient în parte, excluzând toate informațiile care puteau duce la identificarea pacienților, cum ar fi numele detaliat sau alte date de identificare personală.

II.2.2. Criteriile de includere și excludere din studiu

Pentru includerea în studiu am utilizat următoarele criterii:

Vârsta peste 18 ani pentru ambele sexe;

Absența antecedentelor personale patologice maligne de orice natură;

Acordul de a participa la studiu, materializat prin semnarea consimțământului informat;

Diagnosticul clinic și histopatologic de adenocarcinom primar colorectal.

Pentru neincluderea pacienților în studiu am utilizat următoarele criterii:

Vârsta mai mică de 18 ani;

Prezența antecedentelor personale patologice maligne de orice natură;

Prezența altor tipuri histopatologice de tumori maligne colorectale, în afară de adenocarcinom colorectal;

Nesemnarea consimțământului informat de către pacienți.

II.2.3. Analiza histopatologică a materialului biologic

Materialul biologic utilizat în prezentul studiu a fost prelevat în urma intervenției chirurgicale cu tentă curativă, efectuată în cadrul Clinicii de Chirurgie a SCJU Craiova.

Imediat după rezecție, acesta a fost introdus în soluție fixatoare de formol 10%, cantitate variabilă în funcție de dimensiunea pieselor de rezecție colorectală, timp de 24 – 48 ore. Soluția fixatoare de formol 10% a fost obținută din aldehidă formică, o parte și din 9 părți de apă distilată, adăugandu-se în aceasta bicarbonat de calciu, pentru a se obține un pH neutru în vederea neutralizării acidului formic, format spontan în soluțiile concentrate.

S-a preferat utilizarea soluției fixatoare de formol, deoarece aceasta este ieftină, nu afectează culoarea și structura preparatelor, având mare putere de penetrare în acestea, deformează nesemnificativ piesele, conservă bine și alte elemente precum țesutul adipos și sângele, permițând, de asemenea, realizarea mai multor colorații și utilizarea materialului biologic pentru studii de imunohistochimie.

Pentru fixarea în condiții optime a pieselor de rezecție colorectală s-a utilizat un volum al soluției fixatoare de formol de cel puțin 10 ori mai mare decât volumul ocupat de piesa de rezecție.

După cele 24 – 48 de ore în care piesele de rezecție colorectală au fost fixate, acestea au fost spălate timp de 24 de ore, cu scopul îndepărtării soluției fixatoare de formol din țesuturi, după care au fost incluse în parafină, pentru a putea realiza apoi secțiuni seriate de 3-5 µm grosime, care au putut fi colorate și analizate optim cu microscopul optic.

Materialul biologic a fost apoi supus tehnicii de deshidratare, trecându-l prin băi succesive de alcool etilic, prin care apa folosită în etapa precedentă a fost îndepărtată din țesuturi. În studiul nostru au fost folosite diferite preparate de alcool etilic, deshidratarea făcându-se în borcane de sticlă prevăzute cu dop rodat, pentru prevenirea evaporării și rehidratării probei.

Ulterior s-a efectuat clarificarea, care este o operație de eliminare a alcoolului etilic utilizat în tehnica deshidratării, utilizând o hidrocarbură aromatică de tipul benzenului (se mai pot utiliza xilenul sau toluenul), cantitatea de soluție de benzen fiind de 20 de ori mai mare decât volumul ocupat de piese.

Clarificarea, care a durat aproximativ 3 ore, a fost urmată de includerea propriu-zisă în parafină a probelor de țesut, parafinarea efectuându-se la temperatura de 56°C, prin trecerea probei prin trei băi succesive timp de 6 ore pentru fiecare baie, trecerea de la o baie la alta efectuânu-se rapid, pentru a împiedica solidificarea parafinei, după care piesele au fost înglobate într-un bloc de parafină, care s-a solidificat.

După obținerea blocurilor de țesut, s-au realizat secțiuni seriate de 3-5 µm grosime cu ajutorul unui microtom rotativ automat HM355S de înaltă precizie, echipat cu sistem de transfer al secțiunilor inițial pe o baie de apă rece, iar apoi transferate pe o baie de apă caldă la temperatura de 40°C, pentru a fi întinse și uniformizate.

Secțiunile obținute au fost apoi culese și lipite pe lame cu poli-L-lysine (un compus ce crește mult aderența țesutului la lamă), au fost introduse într-un incubator la 60°C și păstrate timp de 24 de h.

Lamele de țesut, utilizate în studiul nostru, au fost colorate mai întâi prin tehnica colorării cu hematoxilină-eozină (HE), care redă citoplasma în roz, nucleii cu nucleoli în albastru, respectiv albastru-violet și fibrele de colagen în roz palid, în timp ce fibrele de elastină și de reticulină nu se colorează. Lamele colorate cu HE au fost analizate în cadrul Laboratorului de Anatomie Patologică al SCJU Craiova, unde anatomopatologi specializați în domeniu au stabilit diagnosticul histopatologic. După stabilirea diagnosticului de adenocarcinom colorectal au fost constituite trei subloturi de pacienți, în funcție de gradul de diferențiere tumorală, astfel: sublotul pacienților cu adenocarcinom colorectal bine diferențiat (Figura 1), sublotul pacienților cu adenocarcinom colorectal moderat diferențiat (Figura 2), respectiv sublotul pacienților cu adenocarcinom colorectal slab diferențiat (Figura 3). Această clasificare s-a realizat în funcție de criteriile Organizției Mondiale a Sănătății [4].

Figura 1. Adenocarcinom colorectal bine diferențiat în care procentul de formare

glandulară > 95%, colorație hematoxilină-eozină, 20x.

Figura 2. Adenocarcinom colorectal moderat diferențiat în careprocentul de

formare glandulară este 50-95%) colorație hematoxilină-eozină, 20x..

Figura 3. Adenocarcinom colorectal slab diferențiat în care procentul de formare glandulară < 50%,colorație hematoxilină-eozină, 20x.

Studiul imunohistochimic a fost realizat pe aceleași piese de rezecție chirurgicală, incluse în parafină prin metodele amintite. Tehnica colorării imunohistochimice a fost realizată în cadrul ,,Centrului pentru Studii de Morfologie Microscopică și Imunologie’’ al Universității de Medicină și Farmacie din Craiova.

Pentru începerea secvențelor tehnicii de imunoshitochimie, s-a realizat mai întâi deparafinarea secțiunilor, prin trecerea lor prin 3 băi succesive de xilol și apoi rehidratarea lor trecându-le prin soluții de alcool cu concentrații descrescânde. În primul timp al tehnicii imunohistochimice a avut loc recuperarea antigenică, prin fierberea lamelor cu țesut la microunde, într-un cuptor setat la 650W, în soluție specifică fiecărui anticorp utilizat în această tehnică. După aceasta, lamele au fost spălate cu apă de la robinet, iar apoi cu apă distilată.

În cea de-a doua etapă a tehnicii imunohistochimice, lamele au fost incubate cu o soluție de peroxid de hidrogen 1% în apă distilată, timp de 30 de minute, cu scopul de a bloca activitatea peroxidazei endogene, împiedicând astfel interferența acesteia cu detecția semnalului, ceea ce ar fi putut crea rezultate fals-pozitive. După incubarea de 30 de minute, lamele au fost spălate cu apă distilată din abundență și apoi trecute în soluție tampon fosfat salin (PBS – phosphate buffered saline solution).

În cea de-a treia etapă a acestei tehnici, lamele cu țesut au fost incubate într-o soluție de albumină bovină pură 1%, în tampon fosfat salin (PBS – phophate buffered saline) pentru a bloca legarea anticorpilor primari de alte structuri proteice din țesutul de analizat, în afară de structurile specifice. Doar după spălarea lamelor în această soluție, s-a adăugat anticorpul primar, după care lamele au fost incubate timp de 24 de ore în frigider la 4°C.

Ziua următoare, după ce au fost scoase de la frigider și lăsate la temperatura camerei timp de 30 de minute, lamele au fost spălate în PBS pentru înlăturarea excesului de anticorp primar, urmând apoi adăugarea unui sistem secundar de detecție, prin folosirea unui anticorp secundar anti-anticorp primar, legat de un polimer de peroxidază specific pentru absorbția imunoglobulinelor umane (Nichirei-Bioscience, Tokyo, Japan).

În ultima etapă a tehnicii imunohistochimice a avut loc deteția semnalului, prin incubarea lamelor cu un substrat pentru peroxidază, 3-3’diaminobenzidina (DAB, Dako), în prezența apei oxigenate 1%, această reacție fiind urmărită la microscop cu scopul de a stopa apariția semnalului de fond, după care lamele au fost contrastate cu hematoxilină, în vederea colorării nucleilor și urmăririi morfologiei generale a țesuturilor studiate.În acest studiu am folosit anticorpul primar GFAP pentru a identifica celulele enterice gliale și anticorpul CD45 (CLA) pentru a evalua infiltratul leucocitar intratumoral.

Pentru a asigura păstrarea optimă a lamelor un timp mai îndelungat, acestea au fost acoperite cu un mediu de montare pe bază de xilol DPX (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), peste care s-a aplicat apoi o lamelă protectoare. De menționat că antigenele țintă supuse studiului s-au colorat în maro, iar nucleii celulelor în albastru.

II.2.4. Achiziția și analiza imaginilor microscopice

Pentru achiziția și analiza imagistică computerizată am utilizat metoda de microscopie optică dar și metoda de microscopie multispectrală.

În vederea implementării metodei menționate mai sus, am utilizat un microscop Zeiss Imager Z2, dotat cu o cameră foto de mare acuratețe și cu obiective cu factori de mărire de 10x, 20x, 40x, respectiv 60 x. Acesta este redat în Figura 4.

Figura 4. Microscopul tip Zeiss Imager Z2, utilizat pentru achiziția imaginilor analizate în lucrarea de licență.

Imaginile obținute cu ajutorul microscopului și metodei citate au fost analizate utilizând softul Image-Pro Plus AMS 7, de analiză imagistică computerizată (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA), cu ajutorul căruia, după calibrarea în funcție de obiectivul utilizat în captura imaginilor, au fost cuantificate densitatea optică integrată (IOD – integrated optical density) și aria semnalului de culoare.

Pentru a calcula aria totală a țesutului nervos pentru o lamă, pe care ulterior să o raportăm la aria totală a țesutului de pe acea lamă, în vederea calculării densității elementelor nervoase, lamele au fost scanate cu ajutorul microscopului motorizat Nikon 90i, cu obiectivul de 4x, apoi imaginile au fost exportate în softul Image-Pro Plus AMS7, unde, după calibrarea pentru 1 mm, a fost delimitată manual suprafața totală tisulară de pe acea lamă. De asemenea, pentru a calcula aria pentru fiecare plex nervos în parte sau pentru a analiza numai epiteliul sau stroma tisulară au fost delimitate manual regiuni de interes, cu ajutorul softului Image-Pro Plus AMS7, în funcție de profilul de culoare corespunzător și, de fiecare dată, după calibrarea softului în funcție de obiectivul microscopului utilizat la achiziția imaginilor. În figurile următoare sunt redate imaginile pentru analiza unor parametri în țesutul total (Figura 5), în epiteliu (Figura 6) respectiv în stromă (Figura 7).

Figura 5. Analiza, cu ajutorul softului ImagePro Plus AMS 7, a unorp arametri (arie și densitate optică integrată) în țesutul total.

Figura 6. Analiza, cu ajutorul softului ImagePro Plus AMS 7, a unor parametri (arie și densitate optică integrată) numai în stroma tisulară.

Figura 7. Selectarea, cu ajutorul softului ImagePro Plus AMS 7, a unor parametri (arie și densitate optică integrată) numai în epiteliul tisular. (imagine din arhiva personală)

II.2.5. Prelucrarea statistică a datelor

Așa cum am afirmat, principalii parametri, calculați cu ajutorul softului ImagePro Plus AMS 7, au fost aria și densitatea optică integrată a semnalului, respectiv de culoare, care a fost selectat. Atât pentru acești parametri, cât și pentru indicele de proliferare, s-au obținut date numerice, care au fost analizate cu ajutorul softului Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA) și, după reprezentarea grafică, au fost exportate în softul SPSS (IBM SPSS Statistics, Versiunea 20.0), unde, mai întâi, au fost calculate media și deviația standard pentru fiecare grup, apoi a continuat analiza statistică. Am folosit testul „t Student”, pentru evaluarea diferențelor statistice dintre mediile a două grupuri de date și testul varianței ANOVA. pentru analiza diferențelor statistice dintre mediile a mai mult de două grupuri de date. Pentru a efectua corelații între diferitele date, am utilizat testul de corelație Pearson. În toate cazurile în care am avut valoarea p<0.05 am considerat diferență statistică semnificativă între mediile grupurilor comparate. Mai mult decât atât, valoarea lui p < 0.05, 0.01 și 0.001 a reprezentat diferență statistică semnificativă, înalt și foarte înalt semnificativă, date evidențiate prin *,** și ***.

II.3. Studiul clinico-epidemiologic al pacienților

Studiul efectuat a fost unul de tip analitic prospectiv, observațional descriptiv, a cuprins un număr de 52 de pacienți diagnosticați cu adenocarcinom colorectal, dintre care 30 (57%) de pacienți au fost de sex masculin, iar 22 (43%) au fost de sex feminin (Figura 8), selectați pe o perioadă de doi ani (2016-2018).

Figura 8. Distribuția cazurilor în funcție de sex.

Vârsta, în momentul diagnosticului, la pacienții incluși în studiu a fost cuprinsă între 43 de ani și 87 de ani, însă pacienții au fost împărțiți apoi în două subloturi, în funcție de o limită de vârsta de 65 de ani, astfel, în sublotul pacienților cu vârstă mai mică de 65 de ani au fost incluși 17 (33%), iar în sublotul pacienților cu vârstă mai mare sau egală cu 65 de ani au fost incluși 35 (67%) (Figura 9). Statistica descriptivă a pacienților în funcție de vârstă și sex este redată în Figura 10.

Figura 9. Distribuția pacienților în funcție de vârsta de 65 de ani

Figura 10. Statistica descriptivă a pacienților în funcție de vârstă și sex (valoarea minimă, maximă, prima quartilă, quartila a 3-a și mediana ).

Tumorile colorectale au fost localizate preponderent distal (după treimea medie a colonului transvers până la canalul anal), la un procent de 79% dintre pacienți (n=43), spre deosebire de localizarea proximală (după valva ileo-cecală până la treimea medie a colonului transvers), care a fost caracterizată de un procent de 21% dintre pacienți (n=13) (Figura 11).

Figura 11. Distribuția cazurilor în funcție de localizarea tumorală.

Evaluând gradul de invazie tumorală, am constatat că la 29% dintre pacienți (n=17) acesta era T1-2, în timp ce la 71% (n=39) dintre pacienții incluși în studiu acesta era T3-4 (Figura 12).

Figura 12. Distribuția cazurilor în funcție de gradul de invazie tumorală.

Prin evaluarea gradului de metastazare în limfaticele regionale, am observat că 45 dintre pacienți (43%) au prezentat metastază în unul sau cel mult doi dintre toți ganglionii limfatici regionali examinați anatomopatologic, iar 11 pacienți (17%) au prezentat metastaze în mai mult de 2 ganglioni limfatici regionali, din totalul ganglionilor limfatici regionali examinați (Figura 13).

Figura 13. Distribuția cazurilor în funcție de gradul de metastazare în limfaticele regionale.

În ceea ce privește dimensiunea tumorii, s-a observat că, la 19 pacienți (36%), formațiunea tumorală a avut un diametru maxim mai mic de 5 cm, în timp ce la 33 de pacienți (56%) formațiunea tumorală a avut un diametru maxim mai mare sau egal cu 5 cm (Figura 14).

Figura 14. Distribuția cazurilor în funcție de dimensiunea tumorală.

Analizând aspectul macroscopic, am observat că la 23 de pacienți (44%), acesta a fost exofitic, în timp ce la 29 de pacienți (56%) acesta a fost infiltrativ (Figura 15). Diferite aspecte macroscopice ale tumorilor colorectale sunt redate în Figurile 16 – 17.

Figura 15. Distribuția cazurilor în funcție de aspectul macroscopic al tumorii

Figura 16. Diferite aspecte macroscopice ale tumorilor colorectale,

în timpul examinărilor.

Figura 17. Aspect macroscopic extraluminal al unei piese de rezecție chirurgicală, cu localizare tumorală la joncțiunea recto-sigmoidiană.

Figura 18. Aspect macroscopic intraluminal din timpul tratamentului chirurgical al unei tumori cu localizare la joncțiunea recto-sigmoidiană.

II.4. Evaluarea celulelor enterice gliale care au exprimat GFAP

din sistemul nervos enteric.

Celulele enterice gliale au fost evaluate prin analiza expresiei imunomarkerului GFAP în toate secțiunile de țesut tumoral colorectal ale pacienților incluși în studiu. Metoda de analiză a fost realizată cu ajutorul microscopiei multispectrale (Figura 19) și softului a de analiză imagistică ImagePro Plus AMS7.

Figura 19. Exemplu de imagine obținută prin microscopie spectrală, care evidențiază celulele enterice gliale din sistemul nerovos enteric, în cancerul colorectal. A) Imagine obținută prin microscopie optică, în care cu maro (DAB) se observă celulele enterice gliale. B) Imagine compusă spectral; se văd mixate culorile albastru pentru nuclei și maro pentru antigenele țintă, care identifică GFAP-ul din celulele enterice gliale. C) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare albastru. Se observă numai culoarea pentru nuclei. D) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare maro. Se observă numai culoarea pentru antigenele țintă, care identifică celulele enterice gliale (GFAP). Pătratul mare reprezintă imaginea mărită din pătratul mic.

Scala este de 20µm.

Pentru a evalua celulele enterice gliale din sistemul nervos enteric la pacienții cu neoplasm colorectal, am calculat aria expresiei imunomarkerului pentru acestea și, apoi suprafața markerului a fost raportată la mm2. Pentru a vedea ce procent din țesutul nervos total este reprezentat de celulele enterice gliale care exprimă GFAP, am calculat cu ajutorul imunomarkerului S100 aria plexurilor ganglionare intratumorale Meissner (Figura 20) și Auerbach (Figura 21), dar și aria filetelor nervoase multiaxonale intratumorale, mai mari de 20µm (Figura 22), pe care nu le-am putut încadra nici în plexul Meissner, nici în plexul Auerbach.

Figura 20. Exemplu de imagini cu plexul Meissner. Cu maro se observă mici ganglioni nervoși cu localizare în submucosă. De asemenea, tot cu maro se observă și filetele nervoase din plexurile aganglionare din mucoasă și muscularis mucosae.

Imunomarkaj S100, 20x.

Figura 21. Exemplu de imagini cu plexul Auerbach. Cu maro se observă ganglionii nervoși ai acestui plex, cu localizare între straturile circular și longitudinal ale tunicii musculare. De asemenea, tot cu maro se observă și filetele nervoase din plexurile aganglionare din tunica musculară. Imunomarkaj S100, 20x.

Figura 22. Exemplu de imagini cu filetele nervoase multiaxonale mai mari de 20µm, cu localizare intratumorală, care nu au putut fi încadrate nici în plexul Meissner, nici în plexul Auerbach. Imunomarkaj S100, 20x.

Aria țesutului nervos total, calculată prin metoda menționată, a fost exprimată ca arie procentulă (densitate a țesutului nervos), pentru a putea fi efectuată analiză statistică între subgrupurile din studiu. Aria procentuală a țesutului nervos total, calculat cu ajutorul imunomarkerului S100, a fost în medie de 0.121296±0.079121%/mm2, în timp ce aria procentuală a celulelor enterice gliale, calculată cu ajutorul imunomarkerului GFAP, a fost în medie de 0.003056±0.001485%/mm2, ceea ce a însemnat un procent al celulelor enterice gliale de 2.52% din țesutul nervos total.

În ceea ce privește subîmpărțirea țesutului nervos în plexuri, evaluat cu imunomarkerul S100, am observat că aria procentuală a plexului nervos Meissner a fost de 0.011161±0.005783%/mm2, aria procentuală a plexului nervos Auerbach a fost de 0.048022±0.032311%/mm2, iar aria procentuală a altor filete nervoase multiaxonale, cu diametru mai mare de 20 µm, a fost de 0.062113±0.045006%/mm2, mai mare decât a plexurilor Meissner și Auerbach (Figura 23).

Figura 23. Aria procentuală a țesutului nervos total, calculată conform imunomarkerului S100, subîmpățită în plexuri nervoase.

Subîmpărțind aria ocupată de celulele enterice gliale, evaluate cu imunomarkerul GFAP, în plexuri, am observat că aria procentuală a enterogliilor plexului nervos Meissner a fost de 0.00013±0.000101%/mm2, aria procentuală a enterogliilor plexului nervos Auerbach a fost de 0.002237±0.001562%/mm2, iar aria procentuală a enterogliilor din alte filete nervoase multiaxonale cu diametru mai mare de 20 µm a fost de 0.001074±0.000677%/mm2, aria procentuală a enterogliilor din plexul nervos Auerbach fiind mai mare decât ariile procentuale din celelalte două categorii (Figura 24).

Figura 24. Aria procentuală a celulelor

enterice gliale, calculată conform imunomarkerului GFAP, subîmpățită în plexuri nervoase.

Cu alte cuvinte, enterogiile au ocupat din plexul nervos Auerbach un procent de 4.66%, din plexul nervos Meissner 1.17%, iar din aria ocupată de filetele nervoase multiaxonale cu diametru mai mare de 20 µm un procent de 1.73%. Diferențe între expresia celulelor enterice gliale din plexul nervos Auerbach și filetele nervoase multiaxonale cu diametru mai mare de 20 µm se pot observa în Figura 25 A, B.

Figura 25 A. Expresia celulelor enterice gliale la nivelul plexului nervos Auerbach. Se observă culoare maro, care nu markează întregul ganglion nervos, ci are o distribuție neregulată după forma celulelor enterice gliale, care se pliază pe corpurile și prelungirile neuronilor enterici. Imunomarkaj GFAP, 20x.

Figura 25 B. Expresia celulelor enterice gliale, la nivelul elementelor nervoase multiaxonale mai mari de 20µm, cu localizare intratumorală, care nu au putut fi încadrate nici în plexul Meissner, nici în plexul Auerbach. Spre deosebire de plexul Auerbach, la nivelul acestor filete

expresia celulelor enterice gliale (culoarea maro) este mai difuză, însă redusă ca intensitate. Imunomarkaj GFAP, 20x.

Evaluarea celulelor enterice gliale, în diferitele stadii de diferențiere tumorală ale cancerului colorectal, a evidențiat faptul că densitatea acestor elemente nervoase este mai mare în tumorile colorectale bine diferențiate (G1), înregistrându-se o arie procentuală a acestui tip de celule de 0.004187±0.001532%/mm2, în timp ce în tumorile colorectale moderat diferențiate (G2) s-a înregistrat o arie procentuală de 0.003641±0.00211%/mm2, cu o scădere semnificativă a acestui parametru la 0.00123 ± 0.000812%/mm2 în tumorile colorectale slab diferențiate (G3) (Figura 26).

Comparând, cu ajutorul testului ANOVA, urmat de testul Bonferroni post-hoc, media densităților nervoase ale celulelor enterice gliale în diferitele stadii de diferențiere ale cancerului colorectal, am observat că a existat o diferență statistic semnificativă între denstitatea celulelor enterice gliale din tumorile bine diferențiate și tumorile slab diferențiate (p=0.006**) și, de asemenea, între densitatea celulelor enterice gliale din tumorile moderat diferențiate și tumorile slab diferențiate (p= 0.024*), în timp ce între tumorile bine diferențiate și tumorile moderat diferențiate nu s-au întregistrat diferențe statistic semnificative, în ceea ce privește densitatea acestui tip de celule.

Figura 26. Evaluarea celulelor enterice gliale

în diferite stadii de diferențiere tumorală ale CCR.

În funcție de vârsta pacienților incluși în studiu în momentul diagnosticului, s-a constatat că la cei cu vârsta mai mică de 65 de ani aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.002056125±0.001326%/mm2, mai mică decât la pacienții cu vârstă mai mare sau egală cu 65 de ani, unde aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.00356529±0.002275%/mm2, existând o diferență statistic semnificativă în funcție de vârstă (Figura 31).

Figura 27. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de vârstă.

Luând în considerare localizarea tumorală, am constatat că, la pacienții cu localizare tumorală distală, celulele enterice gliale au înregistrat o arie procentuală de 0.00314407±0.002107729 %/mm2, mai mare decât la pacienții cu localizare tumorală proximală, unde au înregistrat o arie procentuală de 0.002568166 ± 0.002357988 %/mm2, în funcție de această caracteristică neexistând o diferență statistic semnificativă (Figura 28).

Figura 28. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de localizarea tumorală.

În funcție de sexul pacienților incluși în studiu, s-a constatat că, la cei de sex feminin, aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.003079765 ± 0.00177949 %/mm2, mai mare decât la pacienții de sex masculin, unde aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.003050512 ± 0.00209808%/mm2, în funcție de această caracteristică neexistând o diferență statistic semnificativă (Figura 29).

Figura 29. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de sexul pacienților.

Analizând celulele enterice gliale în funcție de aspectul macroscopic al tumorii, am constatat că la pacienții la care aspectul macroscopic tumoral a fost preponderent exofitic, aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.002625845 ± 0.00155193%/mm2, mai mică decât la pacienții la care aspectul macroscopic a fost preponderent infiltrativ, unde aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.003321204 ± 0.00235558 %/mm2, în funcție de această caracteristică neexistând o diferență statistic semnificativă (Figura 30).

Figura 30. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de aspectul macroscopic al tumorii.

În ceea ce privește dimensiunea tumorală, am observat că la pacienții la care diametrul maxim tumoral a fost mai mic de 5 cm, aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.00292145 ± 0.00313 %/mm2, mai mică decât la pacienții la care diametrul maxim tumoral a fost mai mare sau egal cu 5 cm, unde aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.00314994 ± 0.001548 %/mm2, în funcție de această caracteristică neexistând o diferență statistic semnificativă (Figura 31).

Figura 31. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de dimensiunea tumorală.

Evaluând celulele enterice gliale în funcție de gradul de invazie tumorală, am constatat că la pacienții la care gradul de invazie tumorală a fost T1-2, aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.003449 ± 0.001798%/mm2, mai mare decât la pacienții la care gradul de invazie tumorală a fost T3-4, unde aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.00264 ± 0.00226%/mm2, în funcție de această caracteristică neexistând o diferență statistic semnificativă (Figura 32).

Figura 32. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de gradul de invazie tumorală.

Luând în considerare statusul limfatic ganglionar, s-a constatat că la pacienții la care s-a înregistrat metastază în cel mult un ganglion limfatic regional (N0-1), aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.00343699 ± 0.002547%/mm2, mai mare decât la pacienții la care s-au înregistrat metastaze în cel puțin doi ganglioni limfatici regionali, unde aria procentuală a celulelor enterice gliale a înregistrat o valoare de 0.00187427 ± 0.000957%/mm2, în funcție de această caracteristică existând o diferență statistic semnificativă (Figura 33).

Figura 33. Expresia celulelor enterice gliale în funcție de statusul ganglionilor limfatici regionali.

II.5. Evaluarea infiltratului leucocitar intratumoral

Infiltratul leucocitar intratumoral a fost evaluat numai intraepitelial, nefiind luat în considerare infiltratul leucocitar intratumoral din stromă. Imunohistochimic, infiltratul leucocitar intratumoral a fost evaluat utilizând imunomarkerul CD45 (CLA – common leukocyte antigen), care identifică toate leucocitele, calculând pentru acesta atât aria semnalului, dar și densitatea optică integrată (IOD) în toate cele trei stadii de diferențiere ale CCR, cu ajutorul microscopiei multispectrale (Figurile 34-36).

Figura 34. Exemplu de imagine obținută prin microscopie spectrală, care evidențiază infiltratul leucocitar intratumoral în cancerul colorectal bine diferențiat. A) Imagine obținută prin microscopie optică, în care, cu maro (DAB), se observă leucocitele. B) Imagine compusă spectral; se văd mixate culorile albastru pentru nuclei și maro pentru antigenele țintă care identifică CLA-ul din leucocite. C) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare albastru. Se observă numai culoarea pentru nuclei. D) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare maro. Se observă numai culoarea pentru antigenele țintă, care identifică leucocitele (CLA).

Scala reprezintă 20µm.

Figura 35. Exemplu de imagine obținută prin microscopie spectrală, care evidențiază infiltratul leucocitar intratumoral în cancerul colorectal moderat diferențiat. A) Imagine obținută prin microscopie optică, în care, cu maro (DAB) se observă leucocitele. B) Imagine compusă spectral; se văd mixate culorile albastru pentru nuclei și maro pentru antigenele țintă care identifică CLA-ul din leucocite. C) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare albastru. Se observă numai culoarea pentru nuclei. D) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare maro. Se observă numai culoarea pentru antigenele țintă, care identifică leucocitele (CLA).

Scala reprezintă 20µm.

Figura 36. Exemplu de imagine obținută prin microscopie spectrală, care evidențiază infiltratul leucocitar intratumoral în cancerul colorectal slab diferențiat. A) Imagine obținută prin microscopie optică, în care, cu maro (DAB), se observă leucocitele. B) Imagine compusă spectral; se văd mixate culorile albastru pentru nuclei și maro pentru antigenele țintă care identifică CLA-ul din leucocite. C) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare albastru. Se observă numai culoarea pentru nuclei. D) Imagine nemixată pentru spectrul de culoare maro. Se observă numai culoarea pentru antigenele țintă, care identifică leucocitele (CLA). Scala reprezintă 20µm.

Am constat o creștere graduală atât a ariei cât și a densității optice integrate – IOD (Figurile 37,38), de la adenocarcinomul colorectal bine diferențiat (2124.296 ± 836.0828 µm2 pentru arie și 259963.0316 ± 105263.5552 pentru IOD) la adenocarcinomul colorectal moderat diferențiat (4440.312 ± 1358 µm2 pentru arie și 524583.331 ± 153044.9749 pentru IOD), respectiv la adenocarcinomul colorectal slab diferențiat (7593.812 ± 1940.834 µm2 pentru arie și 942815.1146 ± 233017.7378 pentru IOD). Comparând, cu ajutorul testului ANOVA, urmat de testul Bonferroni post-hoc, media infiltratului leucocitar tumoral în diferitele stadii de diferențiere ale CCR, am observat că a existat o diferență statistic semnificativă între infiltratul leucocitar din tumorile bine diferențiate și tumorile moderat diferențiate (p= 0.024* pentru arie; P = 0.043* pentru IOD), între infiltratul leucocitar din tumorile bine diferentiate și tumorile slab diferențiate (p= 0.000*** pentru arie; p= 0.000*** pentru IOD) și, de asemenea, între infiltratul leucocitar din tumorile moderat diferențiate și tumorile slab diferențiate (p= 0.003** pentru arie; p= 0.002** pentru IOD).

Figura 37. Evaluarea infiltratului leucocitar intratumoral prin calculul ariei CLA în diferite stadii de diferențiere tumorală a CCR.

Figura 38. Evaluarea infiltratului leucocitar intratumoral prin calculul densității optice integrate a CLA în diferite stadii de diferențiere tumorală a CCR.

În funcție de vârsta pacienților incluși în studiu în momentul diagnosticului, s-a constatat că, la cei cu vârsta mai mică de 65 de ani, infiltratul leucocitar intratumoral a înregistrat o arie de 6432.76183 ± 2148.097µm2 și o densitate optică integrată de 792519.080 ± 281709.27, valori mai mari decât la pacienții cu vârstă mai mare sau egală cu 65 de ani, unde aria infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o valoare de 3930.795528 ± 2655.226 µm2 și o densitate optică integrată de 473685.3447 ± 327833.65, existând o diferență statistic semnificativă în funcție de vârstă, atât pentru aria cât și IOD infiltratului leucocitar intratumoral (Figura 39,40).

Figura 39. Aria CLA în funcție de vârstă

Figura 40.Densitatea optică integrată a CLA în funcție de vârstă

Luând în considerare localizarea tumorală, am constatat că, la pacienții cu localizare tumorală distală, infiltratul leucocitar intratumoral a înregistrat o arie de 5106.92361 ± 2680.27806µm2 și o densitate optică integrată de 616831.4664 ± 328992.89, valori mai mari comparativ cu pacienții cu localizare tumorală proximală, unde s-au înregistrat 3685.937161 ± 3720.38374 µm2 pentru arie și o valoare de 477365.2427 ± 494295.16 pentru densitatea optică integrată, în funcție de această caracteristică neexistând diferențe statistic semnificative nici pentru arie și nici pentru IOD (Figura 41, 42).

Figura 41. Aria CLA în funcție de localizarea tumorală

Figura 42. Densitatea optică integrată în funcție de localizarea tumorală

În funcție de sexul pacienților incluși în studiu, s-a constatat că la cei de sex feminin aria infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o valoare de 4944.844755 ± 2943.32539 µm2, iar densitatea optică integrată o valoare de 570477.1144 ± 253870.97, valori mai mici decât la pacienții de sex masculin, unde aria infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o valoare de 4944.844755 ± 2943.32539µm2, iar densitatea optică integrată o valoare de 603126.6862 ± 369280.22, în funcție de această caracteristică neexistând diferențe statistic semnificative (Figura 43, 44).

Figura 43. Aria CLA în funcție de sexul pacienților.

Figura 44. Densitatea optică integrată a CLA în funcție de sexul pacienților.

Analizând infiltratul leucocitar intratumoral în funcție de aspectul macroscopic al tumorii, am constatat că la pacienții la care aspectul macroscopic tumoral a fost preponderent exofitic, aria infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o valoare de 4043.113208 ± 3001.61885 µm2, iar densitatea optică integrată o valoare de 493589.0691 ± 357717.354, valori mai mici decât la pacienții la care aspectul macroscopic a fost preponderent infiltrativ, unde s-au înregistrat 5334.331722 ± 2676.99762 µm2 pentru arie și o valoare de 648567.0457 ± 339551.09 pentru densitatea optică integrată, în funcție de această caracteristică neexistând diferențe statistic semnificative (Figura 45, 46).

Figura 45. Aria CLA în funcție de aspectul macroscopic tumoral.

Figura 46.Densiatea optică integrată a CLA în funcție de aspectul macroscopic tumoral.

În ceea ce privește dimensiunea tumorală, am observat că la pacienții la care diametrul maxim tumoral a fost mai mic de 5 cm, aria infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o valoare de 5505.54 ± 2531.452 µm2, iar densitatea optică integrată o valoare de 693667.6832 ± 314354.2, valori mai mici decât la pacienții la care diametrul maxim tumoral a fost mai mare sau egal cu 5 cm, unde s-au înregistrat 4643.28 ± 2843.59µm2 pentru arie și o valoare de 556803.7349 ± 348685 pentru densitatea optică integrată, în funcție de această caracteristică neexistând diferențe statistic semnificative (Figura 47, 48).

Figura 47. Aria CLA în funcție de dimensiunea tumorală.

Figura 48.Densitatea optica integrată a CLA în funcție de dimensiunea tumorală.

Evaluând celulele infiltratul leucocitar intratumoral, am constatat că la pacienții la care gradul de invazie tumorală a fost T1-2, aria infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o valoare de 1620.336 ± 564.6501µm2, iar densitatea optică integrată o valoare de 201437.4208 ± 74834.3, valori mai mici decât la pacienții la care gradul de invazie tumorală a fost T3-4, unde s-au înregistrat 5659.476 ± 2421.63 µm2 pentru arie și o valoare de 686488.9671 ± 315921.4114 pentru densitatea optică integrată, în funcție de această caracteristică existând diferențe statistic semnificative, atât pentru arie cât și pentru IOD (Figura49,50).

Figura 49. Aria CLA în funcție de gradul de invazie tumorală.

Figura 50.Densitatea optică integrată a CLA în funcție de gradul de invazie tumorală.

Luând în considerare statusul limfatic ganglionar, s-a constatat că la pacienții la care s-a înregistrat metastază în cel mult un ganglion limfatic regional (N0-1) , aria infiltratului leucocitar intratumoral a înregistrat o valoare de 3664.252825 ± 1944.08521µm2, iar densitatea optică integrată o valoare de 430124.03 ± 224281.224, valori mai mici decât la pacienții la care s-au înregistrat metastaze în cel puțin doi ganglioni limfatici regionali, unde s-au înregistrat 7533.271001 ± 2517.81802 µm2 pentru arie și o valoare de 920455.09 ± 314575.391 pentru densitatea optică integrată, în funcție de această caracteristică existând o diferență statistic semnificativă (Figura 51,52).

Figura 51. Aria CLA în funcție de statusul ganglionilor limfatici regionali.

Figura 52. Densitatea optică integrată a CLA în funcție de statusul ganglionilor limfatici regionali.

II.6. Corelații între parametrii evaluați la pacienții incluși în studiu.

După evaluarea parametrilor: am efectuat corelații între expresia celulelor enterice gliale și infiltratul leucocitar intratumoral. Pentru adenocarcinomul colorectal bine diferențiat (G1), nu am găsit corelații ale celulelor enterice gliale cu infiltratul leucocitar intratumoral. Pentru tumorile colorectale moderat diferențiate, am găsit însă o corelație inversă înaltă, între celulele enterice gliale și infiltratul leucocitar intratumoral ( r = -0.779). În ceea ce privește tumorile colorectale slab diferențiate, a fost înregistrată o corelație inversă înaltă între celulele enterice gliale și infiltratul leucocitar intratumoral ( r = -0.764). În ceea ce privește corelațiile între aria celulelor enterice gliale din întregul lot de pacienți incluși în studiu și infiltratul leucocitar tumoral s-a înregistrat o corelație inversă globală înaltă (r = -0.701) (Figura 53).

Figura 53. Corelații între aria celulelor enterice gliale din întregul lot de pacienți incluși în studiu și infiltratul leucocitar tumoral. Corelație inversă globală înaltă (r = -0.701).

II.7. Discuții

Natura exactă a transformării neoplazice colorectale, dar și progresia și metastazarea tumorală nu sunt pe deplin elucidate la ora actuală, aspecte ce genereaza multiple studii în acest sens, pentru identificarea unor noi strategii terapeutice.

Celulele enterice gliale, considerate mult timp doar celule de suport pentru neuronii enterici, sunt componenta principală a sistemului nervos enteric [97]. În ultimele decade, rolul celulelor enterice gliale în starea de sănătate sau boală a fost reconsiderat, întrucât numeroase studii au evidențiat faptul că acest tip de celule constituie un element de legătură important între celulele epiteliului intestinal, celulele sistemului imun, neuronii enterici și celulele enteroendocrine [43]. Atât celulele enterice gliale, care sunt implicate în menținerea integrității barierei intestinale și au rol antiproliferativ [43], dar și celulele sistemului imun pot avea un rol important în patogenia și evoluția neoplasmului colorectal [98].

Scopul studiului nostru a fost evaluarea celulelor enterice gliale din sistemul nervos enteric, în diferite stadii de diferențiere ale tumorilor colorectale și corelarea acestori modificări cu infiltratul leucocitar intratumoral.

Ințelegerea interacțiunii factorilor adiționali din micromediul tumoral, cum ar fi celulele nervoase sau celulele inflamatorii, cu celulele neoplasmului colorectal poate elucida multe dintre căile patogeniei neoplasmului colorectal.

Prezentul studiu corelează, pentru prima dată în literatura de specialitate, scăderea densității celulelor enterice gliale din sistemul nervos enteric în tumorile colorectale cu gradul de diferențiere tumorală și variații inverse cu diverși factori de prognostic negativ în acest tip de neoplasm, cum ar fi infiltratul inflamator intratumoral [99]. Pe de o parte, noi am evidențiat anterior faptul că plexul nervos mienteric Auerbach, dar și plexul submucos Meissner se reduc cu gradul de diferențiere tumorală în cancerul colorectal [100]. De asemenea, în studii anterioare a fost evidențiat faptul că influențele neuronale asupra procesului neoplazic colorectal printr-o creștere a anumitor receptori, cum ar fi adrenoreceptorii β2 cu gradul de diferențiere al tumorilor colorectale, sugerând și mai mult inter-relațiile neuroneoplazice care se desfășoară la nivel colorectal [101-103]

Despre celulele enterice gliale, considerate mult timp doar celule care aveau rolul de suport pentru neuronii enterici, se cunoaște foarte bine, la ora actuală, rolul lor în menținerea homeostaziei neuronilor enterici, în suportul și stabilitatea sistemului nervos enteric din peretele intestinal, în neurotransmisia enterică, de asemenea, se cunoaște faptul că pot constitui o sursă importantă a substratului pentru enzimele implicate în sinteza de neurotransmițători, dar și rolul important în reglarea funcțiilor barierei intestinale [43]. Savidge TC și colaboratorii au arătat că, în menținerea funcției barierei intestinale, un rol important îl au și enterogliile, prin secreția GSNO (glial-derived s-nitrosoglutathione) [43]. Astfel, atât „in vitro” cât și „in vivo” GSNO a fost asociat direct cu o reglare pozitivă a F-actina perijoncțional și proteinele zonula occludens-1 și ocludina, cu rol important în menținerea integrității barierei intestinale, iar ablația celulelor enterice gliale, la șoarecii transgenici, produce alterări ale barierei intestinale, în timp ce administrarea de GSNO inhibă creșterea permeabilității intestinale și inflamația, evenimente cauzate de ablația celulelor enterice gliale [43].

Prin sinteza de TGF β1 (transforming growth factor β1), celulele enterice gliale inhibă proliferarea celulelor epitaliale intestinale atât in vitro cât și in vivo, în timp ce ablația lor determină stimularea proliferării celulare, prin creșterea încorporării timidinei în celulele epiteliale [43]. Acest lucru a fost evidențiat și în culturile cu celule neoplazice HT-29, Caco-2 și T84 din adenocarcinomul colorectal [43].

Alt mediator glial, cu acțiune antiproliferativă, este 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2 (15dPGJ2), derivat din prostaglandina D2 [51], proEGF (pro-epidermal growth factor) sintetizat, de asemenea, în celulele enterice gliale, s-a dovedit a fi implicat în procesul de reparare al epteliului intestinal [51].

Studiile menționate anterior sugerează faptul că celulele enterice gliale, prin intermediul factorilor solubili pe care îi sintetizează, joacă un rol important în menținerea barierei intestinale și în controlul proliferării celulare, de unde se poate deduce faptul că afectarea integrității lor în adenocarcinomul colorectal, așa cum a fost raportată în studiul nostru, ar constitui un element favorizant al proliferării și metastazării celulare.

În contrast cu rezultatele studiului nostru, care sugerează ca densitatea celulelor enterice gliale variază invers cu gradul de diferențiere tumorală, un studiu recent publicat de Vales S. Și colaboratorii a arătat faptul că celulele enterice gliale modulează funcția celulelor stem neoplazice ale CCR (CSCs) și sunt asociate și promovează tumorigeneza colorectală [44]. Conform acestui studiu, atât in vitro cât și in vivo, celulele tumorale colonice activează celulele enterice gliale, care capătă abilități protumorigenice și aceste celule enterice gliale activate determină creșterea dimensiunii tumorale, via o cale dependentă de prostaglandin E2 (PGE2) [44].

Este foarte bine cunoscut faptul că numeroase celule inflamatorii sau diverși factori secretați și eliberați de acestea (citokine) au, pe de o parte, un rol antitumoral, iar, pe de altă parte, pot fi implicați în inițiere, progresie și metastazare tumorală [43].

Asemenea altor tumori maligne, cancerul colorectal este infiltrat cu mai multe tipuri de celule inflamatorii cum ar fi: neutrofile, celule NK, mastocite, celule dendritice și macrofage asociate tumorii, dar, paradoxal, există și celule supresoare mieloide, care au un rol principal în supresia răspunsului imun antitumoral, favorizând astfel carcinogeneza [43].

Diferite citokine și chemokine sunt implicate în cancerul colorectal prin mutații genetice și schimbări epigenetice, determinând astfel rezistență la apoptoză, creștere și proliferare tumorală, angiogeneză și metastazare [43]. Datorită acestui fapt, la ora actuală este bine cunoscut rolul medicației cu antiinflamatoare nonsteriodiene în prevenția cancerului colorectal și ca tratament adjuvant în această patologie [43].

Despre relația dintre sistemul imun și celulele enterice gliale se cunosc până acum puține aspecte, mai ales în ceea ce privește această interacțiune în cazul pacienților cu neoplasm colorectal. Studiul nostru a fost doar unul observațional în acest sens, evidențiind pentru prima dată faptul că există o corelație inversă între densitatea celulelor enterice gliale și infiltratul leucocitar intratumoral. Însă, putem specula că această relație se datorează, pe de o parte, faptului că celulele enterice gliale, scăzând ca densitate cu gradingul tumoral, permit celulelor sistemului imun să-și exercite efectele protumorale. Pe de altă parte, scăderea densității celulelor enterice gliale cu gradingul tumoral și cu creșterea infiltratului leucocitar intratumoral se poate explica și prin scăderea abilității celulelor enterice gliale de a acționa drept celule prezentatoare de antigen [43], acest lucru permițînd scăparea de sub răspunsul imun a celulelor tumorale colorectale.

II.8. Concluzii

Cancerul colorectal este al treilea cel mai frecvent diagnosticat tip de cancer în lume și, de asemenea, a patra cauză principală de deces la nivel mondial.

Natura exactă a transformării neoplazice colorectale, dar și progresia și metastazarea tumorală nu sunt pe deplin elucidate la ora actuală.

Celulele enterice gliale, prin intermediul factorilor solubili pe care îi sintetizează, joacă un rol important în menținerea barierei intestinale și în controlul proliferării celulare, de unde se poate deduce faptul că este afectată integritatea lor în adenocarcinomul colorectal, așa cum a fost raportată în studiul nostru

Procentul celulelor enterice gliale a fost de 2.52% din țesutul nervos enteric total, în cazul pacienților incluși în studiul nostru.

Evaluarea celulelor enterice gliale în diferitele stadii de diferențiere tumorală ale cancerului colorectal a evidențiat faptul că densitatea acestor elemente nervoase este mai mare în tumorile colorectale bine diferențiate, spre deosebire de tumorile colorectale moderat diferențiate și tumorile colorectale slab diferențiate.

Analizând infiltratul leucocitar intratumoral, am constatat o creștere graduală atât a ariei cât și a densității optice integrate, de la tumorile colorectale bine diferențiate la tumorile colorectale moderat diferențiate, respectiv la tumorile colorectale slab diferențiate.

În tumorile colorectale moderat diferențiate s-a înregistrat o corelație inversă înaltă, între celulele enterice gliale și infiltratul leucocitar intratumoral.

În tumorile colorectale slab diferențiate a fost înregistrată o corelație inversă înalt semnificativă între celulele enterice gliale și infiltratul leucocitar intratumoral.

În ceea ce privește corelațiile între aria celulelor enterice gliale din întregul lot de pacienți incluși în studiu și infiltratul leucocitar tumoral s-a înregistrat o corelație inversă globală înalt semnificativă.

Drept concluzie finală, putem spune că scăderea densității celulelor enterice gliale în cancerul colorectal cu diferențierea tumorală dar și variația inversă a acestora cu infiltratul leucocitar intratumoral poate servi ca factor de prognostic negativ în acest tip de cancer. Totuși, rolul jucat de celulele enterice gliale în cancerul colorectal rămâne indirect și studii ulterioare sunt necesare pentru a confirma rezultatele cercetării noastre.

Bibliografie

Giovannucci EL, Keum N. Epidemiology of Colorectal Cancer. Chapter 12: Epidemiology of Colorectal Cancer. In: Loda M, Mucci LA, Mittelstadt ML, Hemelrijck MV, Cotter MB (eds.) Pathology and Epidemiology of Cancer. Springer International Publishing Switzerland, 2017, 391 – 409.

Ferlay J, Steliarova-Foucher E, Lortet-Tieulent J, Rosso S, Coebergh JWW, Comber H, Forman D, Bray F. Cancer incidence and mortality patterns in Europe: estimates for 40 countries in 2012. Eur J Cancer. 2013 Apr;49(6):1374-403.

GLOBOCAN 2012, International Agency for Research on Cancer 2017, World Heath Organization. Valabil la http://gco.iarc.fr. Accesat la 01.05.2018.

https://cancerstatisticscenter.cancer.org/#/cancer-site/Colorectum. Accesat în 01.05.2018.

Edwards BK, Ward E, Kohler BA, Eheman C, Zauber AG, Anderson RN, Jemal A, Schymura MJ, Lansdorp-Vogelaar I, Seeff LC, van Ballegooijen M, Goede SL, Ries LA. Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2006, featuring colorectal cancer trends and impact of interventions (risk factors, screening, and treatment) to reduce future rates. Cancer. 2010 Feb 1;116(3):544-73.

Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin, 2016, 66(1):7–30.

van de Velde CJ, Boelens PG, Borras JM, Coebergh JW, Cervantes A, Blomqvist L, Beets-Tan RG, van den Broek CB, Brown G, Van Cutsem E, Espin E, Haustermans K, Glimelius B, Iversen LH, van Krieken JH, Marijnen CA, Henning G, Gore-Booth J, Meldolesi E, Mroczkowski P, Nagtegaal I, Naredi P, Ortiz H, Påhlman L, Quirke P, Rödel C, Roth A, Rutten H, Schmoll HJ, Smith JJ, Tanis PJ, Taylor C, Wibe A, Wiggers T, Gambacorta MA, Aristei C, Valentini V. EURECCA colorectal: multidisciplinary management: European consensus conference colon & rectum. Eur J Cancer. 2014 Jan;50(1):1.e1-1.e34.

Brenner H, Bouvier AM, Foschi R, Hackl M, Larsen IK, Lemmens V, Mangone L, Francisci S; EUROCARE Working Group. Progress in colorectal cancer survival in Europe from the late 1980s to the early 21st century: the EUROCARE study. Int J Cancer. 2012 Oct 1;131(7):1649-58.

Karim-Kos HE, de Vries E, Soerjomataram I, Lemmens V, Siesling S, Coebergh JW. Recent trends of cancer in Europe: a combined approach of incidence, survival and mortality for 17 cancer sites since the 1990sEur J Cancer. 2008 Jul;44(10):1345-89.

Dunn JE. Cancer epidemiology in populations of the United States–with emphasis on Hawaii and California–and Japan. Cancer Res. 1975 Nov;35(11 Pt. 2):3240-3245.

http://www.cancer.net/cancer-types/lynch-syndrome . Accesat la 01.05.2018.

Bonadona V, Bonaïti B, Olschwang S, Grandjouan S, Huiart L, Longy M, Guimbaud R, Buecher B, Bignon YJ, Caron O, Colas C, Noguès C, Lejeune-Dumoulin S, Olivier-Faivre L, Polycarpe-Osaer F, Nguyen TD, Desseigne F, Saurin JC, Berthet P, Leroux D, Duffour J, Manouvrier S, Frébourg T, Sobol H, Lasset C, Bonaïti-Pellié C; French Cancer Genetics Network. Cancer risks associated with germline mutations in MLH1, MSH2, and MSH6 genes in Lynch syndrome. JAMA. 2011 Jun 8;305(22):2304-10.

Järvinen HJ, Renkonen-Sinisalo L, Aktán-Collán K, Peltomäki P, Aaltonen LA, Mecklin JP. Ten years after mutation testing for Lynch syndrome: cancer incidence and outcome in mutation-positive and mutation-negative family members. J Clin Oncol. 2009 Oct 1;27(28):4793-7.

Ricciardiello L, Ahnen DJ, Lynch PM. Chemoprevention of hereditary colon cancers: time for new strategies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2016 Jun;13(6):352-61.

Risio M. The natural history of adenomas. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2010 Jun;24(3):271-80.

Cetta F, Dhamo A. Inherited multitumoral syndromes including colorectal carcinoma. Surg Oncol. 2007 Dec;16 Suppl 1:S17-23.

Coussens LM, Werb Z. Inflammation and cancer. Nature. 2002 Dec 19-26;420(6917):860-7.

Triantafillidis JK, Nasioulas G, Kosmidis PA. Colorectal cancer and inflammatory bowel disease: epidemiology, risk factors, mechanisms of carcinogenesis and prevention strategies. Anticancer Res. 2009 Jul;29(7):2727-37.

Chau R, Jenkins MA, Buchanan DD, Ait Ouakrim D, Giles GG, Casey G, Gallinger S, Haile RW, Le Marchand L, Newcomb PA, Lindor NM, Hopper JL, Win AK. Determining the familial risk distribution of colorectal cancer: a data mining approach. Fam Cancer. 2016 Apr;15(2):241-51.

Johns LE, Houlston RS. A systematic review and meta-analysis of familial colorectal cancer risk. Am J Gastroenterol. 2001 Oct;96(10):2992-3003.

Shussman N, Wexner SD. Colorectal polyps and polyposis syndromes. Gastroenterol Rep. 2014;2:1–15.

Muto T, Bussey HJ, Morson BC. The evolution of cancer of the colon and rectum. Cancer. 1975;36:2251–70.

Neugut AI, Jacobson JS, Ahsan H, Santos J, Garbowski GC, Forde KA, Treat MR, Waye J. Incidence and recurrence rates of colorectal adenomas: a prospective study. Gastroenterology. 1995;108:402–8.

Boyle T, Keegel T, Bull F, Heyworth J, Fritschi L. Physical activity and risks of proximal and distal colon cancers: a systematic review and meta-analysis. J Natl Cancer Inst. 2012 Oct 17;104(20):1548-61.

Campbell PT, Patel AV, Newton CC, Jacobs EJ, Gapstur SM. Associations of recreational physical activity and leisure time spent sitting with colorectal cancer survival. J Clin Oncol. 2013 Mar 1;31(7):876-85.

Schmid D, Leitzmann MF. Television viewing and time spent sedentary in relation to cancer risk: a meta-analysis. J Natl Cancer Inst. 2014 Jun 16;106(7). pii: dju098.

Chao A, Connell CJ, Jacobs EJ, McCullough ML, Patel AV, Calle EE, Cokkinides VE, Thun MJ. Amount, type, and timing of recreational physical activity in relation to colon and rectal cancer in older adults: the Cancer Prevention Study II Nutrition Cohort. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004 Dec;13(12):2187-95.

Bardou M, Barkun AN, Martel M. Obesity and colorectal cancer. Gut. 2013 Jun;62(6):933-47.

Harriss DJ, Atkinson G, George K, Cable NT, Reilly T, Haboubi N, Zwahlen M, Egger M, Renehan AG; C-CLEAR group. Lifestyle factors and colorectal cancer risk (1): systematic review and meta-analysis of associations with body mass index. Colorectal Dis. 2009 Jul;11(6):547-63.

Larsson SC, Wolk A. Obesity and colon and rectal cancer risk: a meta-analysis of prospective studies. Am J Clin Nutr. 2007 Sep;86(3):556-65.

O'Keefe SJ. Diet, microorganisms and their metabolites, and colon cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2016 Dec;13(12):691-706.

Tilg H, Moschen AR. Food, immunity, and the microbiome. Gastroenterology. 2015 May;148(6):1107-19.

Fung TT, Brown LS. Dietary Patterns and the Risk of Colorectal Cancer. Curr Nutr Rep. 2013 Mar 1;2(1):48-55.

Magalhães B, Peleteiro B, Lunet N. Dietary patterns and colorectal cancer: systematic review and meta-analysis. Eur J Cancer Prev. 2012 Jan;21(1):15-23.

Ley SH, Sun Q, Willett WC, Eliassen AH, Wu K, Pan A, Grodstein F, Hu FB. Associations between red meat intake and biomarkers of inflammation and glucose metabolism in women. Am J Clin Nutr. 2014 Feb;99(2):352-60.

Giovannucci E, Martínez ME. Tobacco, colorectal cancer, and adenomas: a review of the evidence. J Natl Cancer Inst. 1996 Dec 4;88(23):1717-30.

Cross AJ, Boca S, Freedman ND, Caporaso NE, Huang WY, Sinha R, Sampson JN, Moore SC. Metabolites of tobacco smoking and colorectal cancer risk. Carcinogenesis. 2014 Jul;35(7):1516-22.

Botteri E, Iodice S, Bagnardi V, Raimondi S, Lowenfels AB, Maisonneuve P. Smoking and colorectal cancer: a meta-analysis. JAMA. 2008 Dec 17;300(23):2765-78.

Bagnardi V, Rota M, Botteri E, Tramacere I, Islami F, Fedirko V, Scotti L, Jenab M, Turati F, Pasquali E, Pelucchi C, Galeone C, Bellocco R, Negri E, Corrao G, Boffetta P, La Vecchia C. Alcohol consumption and site-specific cancer risk: a comprehensive dose-response meta-analysis. Br J Cancer. 2015 Feb 3;112(3):580-93.

Jokelainen K, Nosova T, Koivisto T, Väkeväinen S, Jousimies-Somer H, Heine R, Salaspuro M. Inhibition of bacteriocolonic pathway for ethanol oxidation by ciprofloxacin in rats. Life Sci. 1997;61(18):1755-62.

Hillman RS, Steinberg SE. The effects of alcohol on folate metabolism. Annu Rev Med. 1982;33:345-54.

Furness JB. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2012 Mar 6;9(5):286-94.

Gulbransen BD. Enteric glia. In: Verkhratsky A, Parpura V (eds). Colloquium series on neuroglia in biology and medicine: from physiology to disease. Morgan & Claypool Life Sciences, 2014, 1(2):1–70.

Ochoa-Cortes F, Turco F, Linan-Rico A, Soghomonyan S, Whitaker E, Wehner S, Cuomo R, Christofi FL. Enteric Glial Cells: A New Frontier in Neurogastroenterology and Clinical Target for Inflammatory Bowel Diseases. Inflamm Bowel Dis. 2016 Feb;22(2):433-49.

Hanani M, Reichenbach A. Morphology of horseradish peroxidase (HRP)-injected glial cells in the myenteric plexus of the guinea-pig. Cell Tissue Res. 1994 Oct;278(1):153-60.

Boesmans W, Rocha NP, Reis HJ, Holt M, Vanden Berghe P. The astrocyte marker Aldh1L1 does not reliably label enteric glial cells. Neurosci Lett. 2014 Apr 30;566:102-5.

Liu YA, Chung YC, Pan ST, Shen MY, Hou YC, Peng SJ, Pasricha PJ, Tang SC. 3-D imaging, illustration, and quantitation of enteric glial network in transparent human colon mucosa. Neurogastroenterol Motil. 2013 May;25(5):e324-38.

Hoff S, Zeller F, von Weyhern CW, Wegner M, Schemann M, Michel K, Rühl A. Quantitative assessment of glial cells in the human and guinea pig enteric nervous system with an anti-Sox8/9/10 antibody. J Comp Neurol. 2008 Aug 1;509(4):356-71.

Rühl A. Glial cells in the gut. Neurogastroenterol Motil. 2005 Dec;17(6):777-90.

Gulbransen BD, Sharkey KA. Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system. Gastroenterology. 2009 Apr;136(4):1349-58.

Fung C, Boesmans W, Cirillo C, Foong JPP, Bornstein JC, Vanden Berghe P. VPAC Receptor Subtypes Tune Purinergic Neuron-to-Glia Communication in the Murine Submucosal Plexus. Front Cell Neurosci. 2017 Apr 25; 11:118.

Antonioli L, Fornai M, Awwad O, Giustarini G, Pellegrini C, Tuccori M, Caputi V, Qesari M, Castagliuolo I, Brun P, Giron MC, Scarpignato C, Blandizzi C, Colucci R. Role of the A(2B) receptor-adenosine deaminase complex in colonic dysmotility associated with bowel inflammation in rats. Br J Pharmacol. 2014 Mar;171(5):1314-29.

Wang GD, Wang XY, Xia Y, Wood JD. Dietary glutamate: interactions with the enteric nervous system. J Neurogastroenterol Motil. 2014 Jan;20(1):41-53.

Grubišić V, Verkhratsky A, Zorec R, Parpura V. Enteric glia regulate gut motility in health and disease. Brain Res Bull. 2017 Mar 29. pii: S0361-9230(17)30183-1.

MacEachern SJ, Patel BA, McKay DM, Sharkey KA. Nitric oxide regulation of colonic epithelial ion transport: a novel role for enteric glia in the myenteric plexus. J Physiol. 2011 Jul 1;589(Pt 13):3333-48.

Segura BJ, Zhang W, Cowles RA, Xiao L, Lin TR, Logsdon C, Mulholland MW. Lysophosphatidic acid stimulates calcium transients in enteric glia. Neuroscience. 2004;123(3):687-93.

Boesmans W, Cirillo C, Van den Abbeel V, Van den Haute C, Depoortere I, Tack J, Vanden Berghe P. Neurotransmitters involved in fast excitatory neurotransmission directly activate enteric glial cells. Neurogastroenterol Motil. 2013 Feb;25(2):e151-60.

Costagliola A, Van Nassauw L, Snyders D, Adriaensen D, Timmermans JP. Voltage-gated delayed rectifier K v 1-subunits may serve as distinctive markers for enteroglial cells with different phenotypes in the murine ileum. Neurosci Lett. 2009 Sep 18;461(2):80-4.

Jiang L, Li J, Liu X, Burnstock G, Xiang Z. Expression of aquaporin-4 water channels in the digestive tract of the guinea pig. J Mol Histol. 2014 Apr;45(2):229-41.

Zhang W, Segura BJ, Lin TR, Hu Y, Mulholland MW. Intercellular calcium waves in cultured enteric glia from neonatal guinea pig. Glia. 2003 May;42(3):252-62.

Esposito G, Capoccia E, Turco F, Palumbo I, Lu J, Steardo A, Cuomo R, Sarnelli G, Steardo L. Palmitoylethanolamide improves colon inflammation through an enteric glia/toll like receptor 4-dependent PPAR-α activation. Gut. 2014 Aug;63(8):1300-12.

Murakami M, Ohta T, Otsuguro KI, Ito S. Involvement of prostaglandin E(2) derived from enteric glial cells in the action of bradykinin in cultured rat myenteric neurons. Neuroscience. 2007 Mar 16;145(2):642-53.

Bach-Ngohou K, Mahé MM, Aubert P, Abdo H, Boni S, Bourreille A, Denis MG, Lardeux B, Neunlist M, Masson D. Enteric glia modulate epithelial cell proliferation and differentiation through 15-deoxy-12,14-prostaglandin J2. J Physiol. 2010 Jul 15;588(Pt 14):2533-44.

Neunlist M, Aubert P, Bonnaud S, Van Landeghem L, Coron E, Wedel T, Naveilhan P, Ruhl A, Lardeux B, Savidge T, Paris F, Galmiche JP. Enteric glia inhibit intestinal epithelial cell proliferation partly through a TGF-beta1-dependent pathway. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007 Jan;292(1):G231-41.

Cheadle GA, Costantini TW, Lopez N, Bansal V, Eliceiri BP, Coimbra R. Enteric glia cells attenuate cytomix-induced intestinal epithelial barrier breakdown. PLoS One. 2013 Jul 1;8(7):e69042.

Van Landeghem L, Chevalier J, Mahé MM, Wedel T, Urvil P, Derkinderen P, Savidge T, Neunlist M. Enteric glia promote intestinal mucosal healing via activation of focal adhesion kinase and release of proEGF. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011 Jun;300(6):G976-87.

Rodrigues DM, Li AY, Nair DG, Blennerhassett MG. Glial cell line-derived neurotrophic factor is a key neurotrophin in the postnatal enteric nervous system. Neurogastroenterol Motil. 2011 Feb;23(2):e44-56.

Fletcher EL, Clark MJ, Furness JB. Neuronal and glial localization of GABA transporter immunoreactivity in the myenteric plexus. Cell Tissue Res. 2002 Jun;308(3):339-46.

Lavoie EG, Gulbransen BD, Martín-Satué M, Aliagas E, Sharkey KA, Sévigny J. Ectonucleotidases in the digestive system: focus on NTPDase3 localization. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011 Apr;300(4):G608-20.

Gulbransen BD, Sharkey KA. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2012 Nov;9(11):625-32.

Aikawa H, Suzuki K. Enteric gliopathy in niacin-deficiency induced by CNS glio-toxin. Brain Res. 1985 May 20; 334(2):354-6.

Linan Rico A, Grants I, Needleman BJ, et al. Gliomodulation of neuronal and motor behavior in the human GI tract. Gastroenterology. 2015;148:S-18.

Neunlist M, Van Landeghem L, Mahé MM, Derkinderen P, des Varannes SB, Rolli-Derkinderen M. The digestive neuronal-glial-epithelial unit: a new actor in gut health and disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2013 Feb;10(2):90-100.

Tsukita S, Yamazaki Y, Katsuno T, Tamura A, Tsukita S. Tight junction-based epithelial microenvironment and cell proliferation. Oncogene. 2008 Nov 24;27(55):6930-8.

Savidge TC, Newman P, Pothoulakis C, Ruhl A, Neunlist M, Bourreille A, Hurst R, Sofroniew MV. Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione. Gastroenterology. 2007 Apr;132(4):1344-58.

Matteoli G. Enteric glial cells: new players in mucosal defence against bacteria? Gut. 2011 Apr;60(4):429-30.

Flamant M, Aubert P, Rolli-Derkinderen M, Bourreille A, Neunlist MR, Mahé MM, Meurette G, Marteyn B, Savidge T, Galmiche JP, Sansonetti PJ, Neunlist M. Enteric glia protect against Shigella flexneri invasion in intestinal epithelial cells: a role for S-nitrosoglutathione. Gut. 2011 Apr;60(4):473-84.

Kabouridis PS, Lasrado R, McCallum S, Chng SH, Snippert HJ, Clevers H, Pettersson S, Pachnis V. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 2015 Jan 21;85(2):289-95.

Barajon I, Serrao G, Arnaboldi F, Opizzi E, Ripamonti G, Balsari A, Rumio C. Toll-like receptors 3, 4, and 7 are expressed in the enteric nervous system and dorsal root ganglia. J Histochem Cytochem. 2009 Nov;57(11):1013-23.

Round JL, Mazmanian SK. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 2009 May;9(5):313-23.

Terzić J, Grivennikov S, Karin E, Karin M. Inflammation and colon cancer. Gastroenterology. 2010 Jun;138(6):2101-2114.e5.

Meira LB, Bugni JM, Green SL, Lee CW, Pang B, Borenshtein D, Rickman BH, Rogers AB, Moroski-Erkul CA, McFaline JL, Schauer DB, Dedon PC, Fox JG, Samson LD. DNA damage induced by chronic inflammation contributes to colon carcinogenesis in mice. J Clin Invest. 2008 Jul;118(7):2516-25.

Lasry A, Zinger A, Ben-Neriah Y. Inflammatory networks underlying colorectal cancer. Nat Immunol. 2016 Mar;17(3):230-40.

Ou B, Zhao J, Guan S, Feng H, Wangpu X, Zhu C, Zong Y, Ma J, Sun J, Shen X, Zheng M, Lu A. CCR4 promotes metastasis via ERK/NF-κB/MMP13 pathway and acts downstream of TNF-α in colorectal cancer. Oncotarget. 2016 Jul 26;7(30):47637-47649.

Ben-Neriah Y, Karin M. Inflammation meets cancer, with NF-κB as the matchmaker. Nat Immunol. 2011 Jul 19;12(8):715-23.

Bondar T, Medzhitov R. The origins of tumor-promoting inflammation. Cancer Cell. 2013 Aug 12;24(2):143-4.

Amit S, Hatzubai A, Birman Y, Andersen JS, Ben-Shushan E, Mann M, Ben-Neriah Y, Alkalay I. Axin-mediated CKI phosphorylation of beta-catenin at Ser 45: a molecular switch for the Wnt pathway. Genes Dev. 2002 May 1;16(9):1066-76.

Cole BF, Logan RF, Halabi S, Benamouzig R, Sandler RS, Grainge MJ, Chaussade S, Baron JA. Aspirin for the chemoprevention of colorectal adenomas: meta-analysis of the randomized trials. J Natl Cancer Inst. 2009 Feb 18;101(4):256-66.

https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02301286?term=NCT02301286&rank=1 . Accesat la data de 01.05.2018.

Steinbach G, Lynch PM, Phillips RK, Wallace MH, Hawk E, Gordon GB, Wakabayashi N, Saunders B, Shen Y, Fujimura T, Su LK, Levin B, Godio L, Patterson S, Rodriguez-Bigas MA, Jester SL, King KL, Schumacher M, Abbruzzese J, DuBois RN, Hittelman WN, Zimmerman S, Sherman JW, Kelloff G. The effect of celecoxib, a cyclooxygenase-2 inhibitor, in familial adenomatous polyposis. N Engl J Med. 2000 Jun 29;342(26):1946-52.

Lee V, Murphy A, Le DT, Diaz LA Jr. Mismatch Repair Deficiency and Response to Immune Checkpoint Blockade. Oncologist. 2016 Oct;21(10):1200-1211.

Angevin E, Tabernero J, Elez E, Cohen SJ, Bahleda R, van Laethem JL, Ottensmeier C, Lopez-Martin JA, Clive S, Joly F, Ray-Coquard I, Dirix L, Machiels JP, Steven N, Reddy M, Hall B, Puchalski TA, Bandekar R, van de Velde H, Tromp B, Vermeulen J, Kurzrock R. A phase I/II, multiple-dose, dose-escalation study of siltuximab, an anti-interleukin-6 monoclonal antibody, in patients with advanced solid tumors. Clin Cancer Res. 2014 Apr 15;20(8):2192-204.

Peyrin-Biroulet L. Anti-TNF therapy in inflammatory bowel diseases: a huge review. Minerva Gastroenterol Dietol. 2010 Jun;56(2):233-43.

Wang Y, Wang K, Han GC, Wang RX, Xiao H, Hou CM, Guo RF, Dou Y, Shen BF, Li Y, Chen GJ. Neutrophil infiltration favors colitis-associated tumorigenesis by activating the interleukin-1 (IL-1)/IL-6 axis. Mucosal Immunol. 2014 Sep;7(5):1106-15.

Dinarello CA. Why not treat human cancer with interleukin-1 blockade? Cancer Metastasis Rev. 2010 Jun;29(2):317-29.

https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02090101?term=NCT02090101&rank=1 . Accesat la data de 01.07.2017.

Neunlist M, Rolli-Derkinderen M, Latorre R, Van Landeghem L, Coron E, Derkinderen P, De Giorgio R. Enteric glial cells: recent developments and future directions. Gastroenterology. 2014 Dec;147(6):1230-7.

Kraus S, Arber N. Inflammation and colorectal cancer. Curr Opin Pharmacol. 2009 Aug;9(4):405-10.

Târtea EA, Florescu C, Donoiu I, Pirici D, Mihailovici AR, Albu VC, Bălșeanu TA, Iancău M, Badea CD, Vere CC, Sfredel V. Implications of inflammation and remodeling of the enteric glial cells in colorectal adenocarcinoma. Rom J Morphol Embryol 2017, 58(2): In press.

Ciurea RN, Rogoveanu I, Pirici D, Târtea GC, Streba CT, Florescu C, Cătălin B, Puiu I, Târtea EA, Vere CC. B2 adrenergic receptors and morphological changes of the enteric nervous system in colorectal adenocarcinoma. World J Gastroenterol 2017; 23(7): 1250-1261.

Florescu C, Istratoaie O, Târtea GC, Pirici D, Streba CT, Catalin B, Puiu I, Tartea EA, Caragea DC, Ghilusi MC, Comanescu MV, Rogoveanu I, Vere CC. Neuro-neoplastic interrelationships in colorectal level–immunohistochemical aspect in three cases and review of the literature. Rom J Morphol Embryol 2016, 57(2 Suppl):639–650.

Târtea GC, Florescu C, Pirici D, Caragea D, Târtea EA, Vere CC. The substrate of the biopsychosocial influences in the carcinogenesis of the digestive tract. Journal of Mind and Medical Sciences 2016; 3:108-117.

Florescu C, Târtea GC, Streba CT, Pirici D, Puiu I, Târtea EA, Ghiluși M, Comănescu MV, Rogoveanu I, Vere CC. The Evaluation of Beta-2-Adrenoreceptors’ Expression in Normal Peritumoral Tissue in Patients with Colorectal Adenocarcinoma. Current Health Sciences Journal, 2016; 42 (4): 335 – 341.