1.1 Familia Mustelidae – caracteristici generale Primele fosile de Mustelidae au fost descoperite în Eurasia în Oligocenul superior, cu 23,3 milioane… [301932]

1.INTRODUCERE

1.1 [anonimizat], cu 23,3 milioane de ani în urmă. Fosile de Mustela putorius (Dihor comun) au fost descoperite acum 400.000 de ani și au evoluat prin radiație adaptativă din strămoșul comun considerat Mustela stromeri (Sanley,1978).

Studiile realizate de Kurose și colaboratorii (2008) au sugerat că diversificarea genului Mustela a început la sfârșitul Miocenului și continuând în Pliocen. [anonimizat], a [anonimizat] 3-5 [anonimizat]. 1976; Obara 1991.

Glaciațiunile au avut un rol important în modelarea distribuției actuale a dihorilor. Perioadele alternative de răcire și încălzire a climei din timpul Pliocenului au cauzat o expansiune a [anonimizat], era prezentă taigaua iar în rest se întindeau pășuni și stepe. Profitând de noul tip de vegetație s-au diversificat foarte mult speciile de rozătoare și de păsărele ce puteau exploata aceste noi habitate. [anonimizat] (în special genurile Martes și Mustela) care s-au diversificat și specializat în vânarea prăzilor mici (rozatoare) în timpul Pliocenului. Acest scenariu este congruent cu ipoteza enuntata de King (1989) potrivit căreia dimensiunile mici ale corpului la Mustela sp., sunt parțial datorate adaptarilor pentru a beneficia de resursele reprezentate de diversificarea rozătoarelor in Pliocen.

Lumea Veche (Old World) este considerată centrul de răspândire pentru speciile de Mustelidae. Au fost descoperite fosile de dihori din perioada culturii Hamburgiene (13000-12000 AC) a [anonimizat]-[anonimizat]-estul Germaniei și România. În perioada Atlanticului (6000-5000 A.C.) [anonimizat]. [anonimizat] (3000-2000 A.C.). (Sommer,1978).

Figură 1. Resturi fosile ale speciei Mustela putorius în Europa (Sommer,1978).

După retragerea ghețurilor au fost observate mai multe modele de colonizare temporală a Europei. [anonimizat], de altfel o specie termofilă este dintre primii imigranți ce a colonizat centrul Europei (14000 – 13000 A.C.) (Sommer 1978). Studiile efectuate asupra fosilelor de dihori (Fig.1) au demonstrat că pe langă refugiile cunoscute (sudice) [anonimizat], se consideră că au existat refugii criptice (mai nordice) în vestul Moldovei și în Munții Carpați.

Familia Mustelidae este cea mai numeroasă familie a [anonimizat] 22 genuri și 59 specii (Wozencraft, 2005). [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat].

[anonimizat] a trasa cât mai precis relațiile de înrudire și istoria evolutivă a organismelor. Până la descoperirea tehnicilor de secvențiere și analiză a ADN și perfecționarea acestora, și în cazul mamiferelor se foloseau foarte mult caracterele morfologice (Youngman 1982, Anderson 1989, Barzshnikov and Abramov 1997): culoarea blănii, a subpărului, lungimea vibrizelor, caracteristici ale scheletului, lățimea interorbitală, lățimea caninului superior, greutatea osului baculum, mirosul emanat de glandele anale etc. Caracterele morfologice sunt folosite și astăzi îmbinate cu metodele moleculare (genetice) (Graphodatsky et al.1976, Davison et al. 1999, Sato et al. 2003) și biochimice (Belyaev et al. 1980, Taranin et al. 1989) pentru clasificarea mustelidelor actuale.

Există mai multe clasificări ale mustelidelor. În 2004, Sato și colaboratorii în 8 subfamilii: Galictinae, Helictidinae, Martinae, Melinae, Lutrinae, Mustelinae, Mellivorinae și Taxidiinae (vezi figura 1, clasificarea internă), pe cand Wozencraft (2005) dar și Fulton și Strobeck (2005) împart familia Mustelidae în 2 subfamilii: Lutrinae, Mustelinae (vezi Fig.2 clasificarea externă). Datele moleculare au demonstrat că subfamilia Mephitidae nu face parte din familia Mustelidae, studiile dovedind că sconcșii au un strămoș diferit față de cel al subfamiliilor enumerate mai sus.

Figură 2. Arbore filogenetic al familiei Mustelidae.

Genul Mustela, cuprinde cele mai multe specii aparținând carnivorelor -17 specii (Wozencraft, 2005). În Eurasia sunt întâlnite 12 specii ale genului Mustela: nevăstuică de munte (M. altaica), hermină (M. erminea), dihorul de stepă (M. eversmanii), nevăstuică japoneză (M. itatsi), nevăstuică cu burtă galbenă (M. kathiah), nurca europeană (M. lutreola), nevăstuică indoneziană (M. lutreolina), nevăstuica (M. nivalis), nevăstuică malaeziană (M. nudipes), dihorul european (M. putorius), nevastuica siberiană (M. sibirica) și nevăstuică cu dungi pe spate (M. strigidorsa). Nurca americană (M. vison) a fost introdusă din America de Nord și aclimatizată în Eurasia: din Insulele Britanice până în Siberia, China și Insulele Japoneze (Kurose et. al 2008).

În studiul publicat de Kurose și colaboratorii în 2008 este reconstruit pe baza markerilor mitocondriali un arbore filogenetic al genului Mustela (vezi Fig.3). Acestui arbore i-au fost adaugate și secvențe provenind de la alte 2 genuri de Mustelidae. Cele trei genuri ale familiei Mustelidae (Mustela, Martes și Meles) sunt clar separate. În cadrul genului Mustela s-au desprins primele speciile Mustela vison și Mustela strigidorsa. Mustela erminea a fost următoarea specie desprinsă. Mustela altaica și Mustela nivalis sunt grupate împreună și formează asa numitul ”grup al nevăstuicilor mici” (small weasel group) pe când celelalte specii (M. eversmanii, putorius, furo lutreola, sibirica) formează un clad numit al ”grupul mare al nevăstuicilor” (large weasel group).

Figură 3. Arborele filogenetic al familiei Mustelidae rezultat prin combinarea secvențelor de ARNr 12S și citocrom b. Mu- Mustela; Ma- Martes; Me- Meles (Kurose et. al., 2008)

1.2 Biologia generală a dihorului

Dihorii au fost menționați pentru prima dată într-un tratat despre animale, scris în secolul IV î.H. de către Aristotel (Davison, 1999) iar în Vechiul Testament sunt menționați ca animale „necurate” (Lev. IX. 29 și 30). Gabriel Sagard în lucrarea sa intitulată ”Histoire du Canada” (1636) descrie dihorii ca și „copii ai diavolului” (Honeycutt, 1997).

Etimologia cuvântului dihor nu este pe deplin cunoscută, se consideră că are originea în limba slavă veche și face trimitere la morfologia corpului dar și la mirosul emanat de glandele anale.

Denumirea științifică a dihorului comun este Mustela putorius, unde numele genului Mustela face referire la faptul că dihorul aparține grupului nevăstuicilor, iar denumirea speciei putorius vine din latinescul „putor” ce înseamnă urât mirositor (Blandford,1987).

1.2.1 Elemente de morfologie

Dihorii sunt carnivore de talie mică, ei prezintă cap mic, gât lung, corpul lung, sinuos, cilindric, iar coada și membrele sunt relativ scurte. Există variații între sexe în ceea ce privește forma, dar și greutatea corporală, astfel masculii pot cântări și de trei sau patru ori mai mult decât femelele. Greutatea corporală variază în timpul unui an, toamna și iarna dihorii au grăsime subcutanată, aceasta se pierde la masculi la începutul perioadei de reproducere, iar la femele în timpul lactației (Blandford, 1987).

La naștere puii sunt acoperiți de subpăr moale de culoare albă, care urmează a fi schimbat până la vârsta de 50 de zile, când aceștia încep să prezinte caracteristici ale blănii asemănătoare adulților. Blana dihorilor este formată din subpăr ce este dens, fin, ce are rol izolator și conturul format din fire de păr lungi și aspre. Culorile blănii variază de la negru, gri, brun până la roșcat pentru dihorul comun. La nivelul membrelor anterioare și umerilor culorile blănii sunt de un gri închis ceea ce determină ca extremitățile să pară mai întunecoase.

Blana de la nivelul feței poate prezenta marcaje albe care pot diferi de la un individ la altul, uneori fiind similar cu o mască de bandit. Blana din jurul urechilor este întotdeauna albă, în restul corpului poate prezenta multe variații în funcție de mai multe criterii printre care amintim vârsta animalului, sau anotimpul, astfel iarna au o culoare mai deschisă a blănii, aceasta având valoare adaptativă. Dihorii studiați în laborator pot prezenta albinism.

Indivizii genului Mustela năpârlesc de două ori pe an primăvara în lunile mai- iunie năpârlirea începe de la nivelul capului, membrelor, apoi se realizează posterior spre coadă, blana de vară este înlocuită cu cea de iarnă în luna septembrie, când năpârlirea începe în porțiunea posterioară a spatelui (Blandford, 1987).

Figură 4. Mustela putorius – aspect general

Dihorul de stepă (Fig. 5) poate fi confundat cu dihorul comun (Fig. 4), între aceștia nu există diferențe semnificative, totuși dihorul de stepă are o blană mai lungă și mai moale decât a dihorului comun. Și el prezintă marcaje albe la nivelul feței, uneori toată fața poate fi mai deschisă decât restul corpului (Herlo, 2014).

Figură 5. Mustela eversmanii – exemplar împăiat. Foto: Jan Dušek [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons

Date biometrice ale speciei Mustela putorius: Lungimea (L) cap + trunchi = 305 – 460 mm, L coadă = 130 – 145 mm, tarsul= 48 – 60 mm, greutatea = 502 – 1522 g pentru masculi; și respectiv L cap + trunchi = 290 –355 mm, L coadă = 115 – 130 mm; tarsul = 45 – 55 mm; greutatea = 442 – 800 g pentru femele (Murariu și Munteanu 2005).

Date biometrice ale speciei Mustela eversmannii.: Lungimea (L) cap + trunchi = 370-560 mm pentru masculi și 290-520 mm pentru femele; L coadă = 80-183 mm pentru masculi și 70-180 mm pentru femele; greutatea = 2050 g masculii și circa 1350 g femelele (Ognev 1962). Principalele caractere craniometrice la masculi: L condilo-bazală = 61,7 – 82,2 mm, lățimea zigomatică = 30 – 58,9 mm, lățimea mastoidiană = 35,7 -47,9 mm, lățimea interorbitală = 15,5 – 24,3 mm, lățimea post-orbitală =12 – 17,2 mm; iar la femele: L condilo-bazală = 52,4 – 76,7 mm, lățimea zigomatică = 30 – 47,8 mm, lățimea mastoidiană = 35,3 – 43,2 mm, lățimea interorbitală = 14 – 19,5 mm, lățimea postorbitală = 11,3 – 15,3 mm (Murariu și Munteanu 2005).

În ceea ce privește scheletul, aceștia prezintă dimorfism sexual ce constă în faptul că masculul are craniul mai mare decât cel al femelei. Dihorii prezintă os penian denumit baculum (Fig.6 ) care are rol în copulație. Este un os heterotipic format din țesut conjunctiv. Măsurând greutatea și dimensiunea acestuia se pot face interferențe cu privire la vârsta animalului.

Figură 6. Vedere ventrală și laterală a osului baculum al unui adult de dihor ( Blandford, 1987).

De asemenea femurul prezintă particularități ce pot fi utilizate pentru a distinge indivizii de Mustela putorius și M. eversmanni. Craniul are o dentiție puternică și mușchi masticatori bine dezvoltați care le trădează preferințele alimentare.

Dentiția este alcătuită din 32 de dinți și are următoarea formulă: I , C , PM , M . S- a observat că la indivizii cu albinism, apar în plus aproximativ 6 incisivi superiori.

Craniul dihorului de stepă este mai greu și mai masiv decât cea a dihorului european, având arcadele zigomatice mai larg distanțate și proiecții mai dezvoltate, în special creasta sagitală (Herlo, 2014).

1.2.2 Habitat

Habitatul reprezintă locuința unui animal și aceasta trebuie să îndeplinească anumite condiții pentru a fi folosit. În cazul dihorilor selectarea habitatului se face după următoarele criterii: prezența speciilor pe care le consumă, condiții climatice favorabile, absența prădătorilor. În cazul prezenței indivizilor din aceiași specie, se evită indivizii de același sex, există toleranță doar în cazul indivizilor de sex opus și doar în perioada de reproducere (luna martie), habitatul unui mascul poate interfera cu habitatul uneia sau ai multor femele (Lode, 1996). Dihorii în general sunt solitari, excepție făcând doar femelele care au grijă de progenituri.

Figură 7. Habitatul dihorului comun Mustela putorius (Wikimedia Commons)

Se observă o variație sezonieră în ceea ce privește habitatul dihorilor, astfel vara aceștia preferă pădurile și pajiștile, care sunt populate de amfibieni, hrana majoră a dihorilor în această perioadă, iarna locuiesc în apropierea locuințelor, în hambare și ferme pentru că le oferă protecție față de vremea rece și hrană reprezentată de șoareci și șobolani (Blandford, 1987).

Habitatul dihorilor (Mustela putorius) (Fig.7) este reprezentat de păduri de foioase, păduri de amestec, pajiști, pășuni, zone care sunt situate în apropierea cursurilor unor ape, uneori chiar și în apropierea așezărilor umane. Dihorul de stepă (Mustela eversmanni) preferă zonele aride, stepice în apropierea vizuinelor popândăilor cu care se hrănesc și își însușesc adăposturile acestora.

Activitățile umane afectează zonele unde dihorii au ascunzătorile, în special utilizarea agricolă a zonele arabile, drenarea cursurilor apelor, ceea ce duce la scăderea numărului de indivizi din populații. Dihorii sunt vulnerabili și la raticidele folosite în gospodăriile umane.

Semnele prezenței indivizilor din genul Mustela (Fig.8) sunt de obicei reprezentate de urmele lăsate și mai exact de prezența amprentelor digitale și de fecale sau lăsături . Lăsăturile sunt de obicei prezente în apropierea ascunzătorilor și au o mare importanța pentru marcarea teritoriului și comunicarea intra și interspecifică. Pentru studii privind alimentația, lăsăturile sunt de asemenea importante ele conțin resturi nedigerate ale animalelor consumate.

Figură 8. Semnale lăsate de dihorul comun Mustela putorius. În stânga sunt amprente digitale, iar în dreapta lăsături (Ionescu et. al., 2013).

1.2.3. Dietă

Dieta este bazată exclusiv pe hrană de origine animală: iepuri, șoareci, păsări, șerpi, amfibieni dar și nevertebrate cum ar fi râme, gândaci, albine, larve ș.a. Analizele stomacale au relevat prezența și a altor alimente precum ouă sau plante, care se consideră ca sunt preluate din animalele pe care le consumă. Juvenilii au o alimentație mai bogată ce include și fructele. Între sexe nu se observă anumite preferințe alimentare.

S-a observat că un dihor cu greutatea de aproximativ un kilogram are nevoie să metabolizeze circa 250 kcal pe zi (Farell & Wood, 1968). Cele mai frecvente sunt consumate mamiferele mici în special cei din genul Microtus sp., amfibienii, iar păsările și peștii sunt consumați mai rar pentru că sunt mai greu de vânat.

Există variații sezoniere ce duc la schimbarea habitatului și implicit a preferințelor alimentare. Astfel vara hrana dihorilor este în mare parte compusă din amfibieni, iarna consumă mamifere mici ce se află pe lângă așezările umane, dar și resturi de organe de la hoituri. În ceea ce privește alternanța zi-noapte, dihorii sunt mai activi noaptea, însă natura activităților de vânătoare pot fi dictate de sezon și vreme (Blandford,1987)

Atunci când hrana este din belșug dihorii consumă doar părțile preferate din animalul vânat, spre exemplu la broaște preferă să consume doar mușchii membrelor (Fig. 9) sau își fac provizii în ascunzători și nu se opresc din ucis chiar dacă au un număr mare de victime pe care să le consume. Dacă au puțină hrană atunci, dihorii mănâncă vânatul complet. Nu se deplasează prea mult de la adăposturile lor circa 300m, distanțe mai lungi străbătând numai în cazul unei crize alimentare.

Figură 9. Amfibieni omorâți de dihori și consumați incomplet. Părțile consumate sunt marcate cu negru (Weber, 1987).

În căutarea hranei, dihorii au mai multe opțiuni: vânarea mamiferelor mici și colectarea ouălor din jurul casei, vânarea șobolanilor și a organelor de hoit din gropile de gunoi, fie vânarea amfibienilor în păduri (Weber, 1987), ceea ce relevă comportamentul de hrănire oportunistă a dihorului. Puii învață de mici să vâneze, aproximativ la vârsta de 8 săptămâni printr- un mod caracteristic atacând prada la gât, iar faptul că au un miros bine dezvoltat îi ajută foarte mult în detectarea prăzii. Prezintă totuși și un dezavantaj reprezentat de faptul că sunt gălăgioși.

Conform lui Gossow (1970) există mai multe etape ale „vânătorii” dihorilor: căutarea, percepția acustică și olfactivă, detectarea prăzii, uciderea prin mușcare și consumarea sau ascunderea prăzii.

Suprapunerea indivizilor genului Mustela, cu indivizi ce aparțin aceleiași familii și ocupă aceeași nișă ecologică, duce la apariția concurenței alimentare, implicit la scăderea numărului de indivizi dintr-un gen sau altul. S-a observat că M. eversmanni preferă popândăii, iar M. putorius broaște, rozătoare dar și alte mamifere de talie mică.

1.2.4. Elemente de etologie

Dihorii sunt animale teritoriale și solitare cu un comportament agresiv. Își marchiază teritoriul cu ajutorul urinei, fecalelor și secreției produse de glandele anale care au consistență cremoasă cu miros neplăcut, evitându-se astfel indivizii de același sex, în special masculi între care s-au observat lupte în natură. Comportamentul indivizilor de sex opus se poate schimba mai ales atunci când femelele nu răspund semnalelor emise de mascul în perioada de reproducere.

Figură 10. Dihorul european – femelă împreună cu un pui.

Glandele anale sunt active și în perioada de reproducere, iar mirosul este distinct în această perioadă între mascului și femele. Glandele anale sunt folosite și atunci când animalul se simte în pericol. Puii au un comportament la fel de agresiv, jocurile dintre aceștia fiind în mare parte reprezentate de mușcături, fugă, mișcări stângace, alungare. Când se simt în pericol, puii emit sunete către mamă, deseori și aceasta le răspunde (Fig. 10). Și adulții au un repertoriu bogat de sunete în mare parte au caracter agresiv, dar și defensiv de salut sau de cerșit.

1.2.5.Reproducere

Maturitatea sexuală este atinsă la un an de la naștere. Se observă că masculii în perioada de reproducere devin și mai agresivi decât în mod normal și scot sunete de curtare. În luna decembrie încep să crească în dimensiuni testiculele, maximum este atins în luna martie. Femelele au perioada de estru între lunile martie-aprilie. În timpul copulației masculul mușcă femela de ceafă.

S-a observat că femelele gestante care pierd produșii de concepție, au o perioada de 10- 20 de zile de recuperare, apoi pot intra din nou în estru și avea noi produși de concepție. Reproducerea se realizează între lunile martie- mai, gestația durează 38-42 zile. Femela la naștere poate ucide puii slabi, nesănătoși care nu se pot adapta la condițiile de mediu. Puii au ochii și urechile lipite la naștere, sunt crescuți de către mamă până la vârsta de 3 luni (Fig.12).

Reproducerea se poate realiza între indivizi care aparțin a specii diferite rezultând hibrizii. M. putorius poate hibridiza cu M. lutreola și rezuta din această încrucișare indivizi cu o culoare a blănii diferită față de cea a părinților. M. putorius poate încrucișa și cu M. eversmanni iar prin translocație Robertsoniană rezultând hibrizi (2n=39) cu gigantism, se consideră că aceste două specii au dat naștere dihorului domestic M. furo, iar acesta din urmă este fertil.

Durata de viață estimată pentru indivizii genului Mustela este de circa 5- 6 ani, dar dihorii domesticiți pot trăi cu mult peste această medie, unii ajung chiar și la vârsta de 14 ani. Numărul de pui născuți de o femelă este situat între 6- 10 (Fig.11).

Figură 11. Femela de Mustela putorius cu pui

Dușmanii naturali sunt în special: vulpile, câini, paraziți externi precum căpușe, păduchi sau pureci dar și paraziți interni sau virusuri precum virusul turbării, virusul rabiei etc.

Oamenii îi vânează pentru blană. De asemenea sunt animale nedorite din cauza daunelor pe care le produc la fermele de păsări și în crescătoriile de pește. Dihorii sunt animale inteligente care au capacitatea de a învăța și înțelege foarte ușor.

Acum 2000 de ani erau dresați pentru vânarea iepurilor dar și a șoarecilor, șobolanilor din gospodăriile umane, contribuind astfel la menținerea unui echilibru în populațiile de rozătoare. Dihorii aveau în trecut un statut asemănător pisicilor de astăzi.

Astăzi dihorii domesticiți sunt animale de companie și au un comportament sociabil total diferit față de cel al dihorilor sălbatici.

1.2.Răspândire:

Centrul de origine al genului Mustela este considerată Eurasia, în timp s-au răspândit și în Africa, America de Sud și America de Nord. Distribuția actuală a genului Mustela este rezultatul ultimei glaciațiuni (acum circa 2,4 milioane de ani), deoarece, pentru a supraviețui speciile au fost obligate să migreze spre zone cu un climat ceva mai cald (Michaux et Maite, 2012).

În Europa dihorul comun este prezent pe coasta Atlanticului, în vest, la Urali în Est; nord la sud-estul Norvegiei, sudul Finlandei și Suediei; sud, la Marea Mediterană și Marea Neagră, cu excepția coasta Adriaticii și o mare parte din Balcani (Fig.13). În partea sudică a Europei se suprapun arealele celor două specii M. putorius și M. eversmanni, realizându-se hibridizări. În Noua Zeelandă a fost introdus în secolul al IX- lea pentru a controla populațiile de iepuri, astăzi dihorul comun este un membru stabil al faunei din această țară (Blandford, 1987). Este prezent de la nivelul mării până la altitudini de aproximativ 2400 m la populațiile din Africa.În România specia este larg răspândită, mai puțin întâlnită în zonele de munte, practic lipsind la altitudini de peste 1000 m ( Ionescu et al., 2013). În România în zona Dobrogei este endemică subspecia M. putorius rothschildi. Subspecia M. putorius furo este forma domestică a dihorului, cea mai răspândită subspecie în țara noastră, dar și în Europa este M. putorius putorius.

Figură 11. Arealul de răspândire al speciei Mustela putorius (UICN, 2010)

Dihorul de stepă (Mustela eversmanii) se întâlnește – ca distribuție din Europa Centrală și de Est, în sudul Rusiei, nordul Georgiei, Kazahstan, Turkmenistan, Uzbekistan, Tadjikistan, Kârgâzstan, Mongolia. (Fig.14 ) (Ionescu et al., 2013). Se poate întâlni până la 800 m altitudine în Europa și până la 2.600 m în Asia Centrală. Își face apariția în următoarele țări: Austria, Bulgaria, China, Republica Cehă, Georgia, Ungaria, Kazahstan, Kârgâzstan, Moldova, Mongolia, Polonia, România, Rusia, Serbia și Muntenegru, Slovacia, Tadjikistan, Turkmenistan, Ucraina și Uzbekistan, fiind, de asemenea, cunoscut în Kashmir (Pocock, 1941). În România au fost semnalați în Dobrogea, Muntenia și Oltenia, există două populații ce sunt separate de Munții Carpați. Există două subspecii prezente și la noi în țară și anume: Mustela eversmannii hungarica și Mustela eversmannii eversmannii.

Figură 12. Arealul de răspândire al speciei Mustela eversmannii (UICN, 2010).

1.3.Măsuri de conservare a speciei

În marea majoritate a țărilor din Europa nu se observă că speciile de dihor comun ar fi vulnerabil, totuși în unele țări se observă scăderea efectivului populațiilor de dihori. Spre exemplu în Italia este protejat, în Spania este listat în Cartea Roșie ca amenințat. M. putorius nu este o specie amenințată cu dispariția conform datelor actuale numărul total de indivizi din țara noastră este de circa 15.000 (Murariu și Munteanu, 2005). În schimb M. eversmanni este o specie vulnerabilă, numărul estimat de indivizi care aparțin acestei specii din România este aproximativ 1000 (Murariu și Munteanu, 2005).

Cauzele scăderii numărului de indivizi din populațiile de dihori sunt următoarele: intensificarea agriculturii, declinul populațiilor de animale ce constituie hrana acestora, construirea de autostrăzi și drumuri, devresarea râurilor, utilizarera de pesticide și rodenticide, hibridizarea cu alte specii de mustelide, vânătoarea și persecuția directă.

Trebuie să existe un echilibru în ceea ce privește activitatea agricolă, dacă este prea intensă aceasta va duce la distrugerea și pierderea habitatului dihorilor, iar lipsa totală a activităților de acest tip în special în zonele stepice duc la scăderea penetranței indivizilor în vizuinele pe care ar trebui să le ocupe. Declinul populațiilor de hârciogi și popândăi afectează în mod direct efectivul populațiilor de dihor de stepă, iar scăderea numărului de indivizi din populațiile de iepuri, amfibieni, șoareci, șobolani afectează populațiile de dihor comun.

Creșterea densității rețelelor de drumuri duc la fragmentarea habitatelor, scăderea fluxului de gene, iar accidentele rurale reprezintă o cauză majoră a mortalității dihorilor.

SCOP

Scopul acestei lucrări este de a contribui la cunoașterea speciei Mustela putorius (dihorul european) – o specie comună și cunoscută tuturor, dar puțin studiată. Obiectivul general este reprezentat de stabilirea structurii genetice prezente în unele populații din România. Din studiile publicate se desprinde concluzia că la nivelul Europei Vestice, dihorul comun prezintă un regres al populațiilor (Davison et al, 1999; Davison et al, 2001). Utilizarea markerilor ADN mitocondriali permit o bună observare a structurii genetice a populațiilor analizate.

Dintre mamifere, reprezentanții familiei Mustelidae sunt în mod particular amenintați în principal de activitățile umane prin fragmentarea habitatelor și influențarea structurii genetice a populațiilor.

Ultimii 20 de ani, perioadă în care tehnicile de biologie moleculară au cunoscut o dezvoltare deosebită au reprezentat și perioada în care au apărut noi discipline și anume filogeografia și genetica populațiilor. Filogeografia (definită în 1987 de Avise) reprezintă domeniul care studiază principiile ce guvernează distribuția geografică a liniilor genealogice, în interiorul aceleași specii luând în considerare toate aspectele istorice ce au putut influența distribuția actuală a speciilor de interes. Este un domeniu pluridisciplinar, chiar dacă partea principală este reprezentată de genetică în analiza și interpretarea datelor este nevoie de informații provenind din ecologie, etologie, paleontologie și geologie dar și informații legate de climă.

Genetica populațiilor studiază distribuția frecvențelor alelice în populații diferite sub influența presiunii selective exercitate prin drift genetic, selecție naturală, mutații sau migrații.

Aceste noi perspective de cercetare primit o mai bună abordare a studiului impactului exercitat de fragmentare populațiilor asupra diversității lor genetice dar și asupra supraviețuirii pe termen lung al populațiilor.

2. MATERIALE ȘI METODE

2.1.Material biologic studiat

Probele de Mustela putorius și Mustela eversmanii analizate provin din colecția de țesuturi și ADN iniațiată de Laboratorul de Biologie Moleculară a Muzeului de Istorie Naturală ”Grigore Antipa” (MNINGA) vezi tabelul 1. Probele analizate provin în marea lor majoritate de la exemplare omorâte accidental de mașini. Probele au fost colectate și determinate de dr. Gabriel Chișamera, specialist mamalog al Muzeului.

Tabel 1. Probele analizate

Eșantioanele de țesut prelevate în teren au fost păstrate în alcool etilic 96%, în colecția de Mamifere a Muzeului Național de Istorie Naturală ”Grigore Antipa” precum și în colecția de țesuturi și ADN a acestuia.

Coordonatele geografice ale probelor au fost stabilite utilizand platforma Google Earth sau au fost prelevate în teren în momentul colectarii probelor. Localizarea probelor analizate a fost efectuată utilizand softul Diva GIS etc.

Pe langă probele prelevate pe parcursul acestui studiu au fost extrase din baza de date NCBI (GenBank) secvente aparținand speciei Mustela putorius, obținute din studii precedente, după cum se poate observa în tabelul 2.

Tabel 2. Secventele provenite din GenBank.

Figură 15. Localizarea punctelor de colectare prezentate în tabelul 1

2.2.Metode

Pentru a reconstitui istoria filogeografică a unei specii utilizarea markerilor moleculari este obligatorie. Filogeografia este o disciplină care studiază principiile și procesele ce determină distribuția geografică a liniilor filogenetice în lumina geneticii populațiilor. (Avise et al. 1987). S-a dezvoltat în jurul anilor 70’, datorită descoperirii de noi metode și tehnici de analiză a diversității la nivel genetic. Este considerată parte integrantă a biogeografiei istorice care folosește la rândul său principii și metode din alte domenii cum ar fi: genetica populației, sistematică, demografie, etologie, paleontologie. Este considerată o punte de legătură între genetica populației și sistematică, acestea fiind separate anterior.

În studiile de filogeografie se folosesc metode clasice morfologice, etologice dar și moleculare. Un rol foarte important îl joacă ADN mitocondrial foarte folosit la ora actuală, aproximativ 70% dintre studiile de filogeografie se bazează pe acest tip de ADN datorită unor avantaje ale acestuia precum o rată mare de evoluție și mutație sau transmiterea acestuia doar pe cale maternă.

Studiile filogeografice ne oferă informații valoroase despre stabilirea locului de origine și modului de răspândire al speciilor, despre gradul de structură al populațiilor, având contribuții majore pentru taxonomie și conservare.

Există mai multe abordări ale filogeografiei care au apărut pe măsura dezvoltării acestui domeniu. Metoda clasică presupune comparația între distribuția geografică a indivizilor eșantionați și suprapunerea hărții genealogice. În această metodă sunt utilizate două criterii mărimea divergenței genei dintre linii și gradul de localizare geografică din care rezultă cinci ipoteze (Fig. 16):

Izolarea indivizilor un timp îndelungat determină apariția divergenței (tip I);

La încrucișarea unor indivizi ce au fost izolați în trecut, apare întrepătrunderea liniilor divergente ce ocupă același spațiu (tip II);

Când izolarea durează o perioadă mai scurtă de timp, divergența genetică este scăzută (tip III);

Apariția fenomenului de omogenizare al populației atunci când nu există bariere geografice sau de altă natură, divergența este aproape absentă (tip IV);

Prezența grupurilor izolate în care fluxul de gene este scăzut, asemănător divergenței (tip V)

Figură 16. Modele generale ale distribuției filogeografice (Avise et colab. 1987)

O altă metodă folosită în filogeografie este cea matematică, prin care se poate merge în timp până la strămoșul comun, pornind de la populația actuală, al unor specii strâns înrudite și de a determina modul în care acestea au descins și au dus la distribuția și variabilitatea genetică actuală. Această metodă ține cont de procese care au loc în cadrul unei populații precum apariția de noi alele (mutație), sau dispariția altor alele (drift genetic), acțiunea selecției naturale, divergența populației, ratele migrației . Este un proces stochastic care se mai numește și coalescența (Fig. 17) și este de fapt teoria centrală a filogeografiei.

Figură 17. Reprezentarea relației evolutive a patru haplotipuri în cadrul unei populații.

Evenimentele de coalescență sunt noatate cu asterix ( Vázquez–Domínguez et al., 2009).

Filogeografia este foarte utilizată în numeroase domenii, dar cele mai importante aplicații le găsește în taxonomie, respectiv conservarea speciilor.

Principala problemă în taxonomie era stabilirea limitelor între specii și subspecii doar cu ajutorul metodelor tradiționale. Astăzi metodele filogeografice sunt precise și reprezintă o mare achiziție pentru sistematică. A fost introdus și conceptul de specie filogenetică definindu- se ca un grup minim de indivizi sau populații, care poate fi identificată printr- un număr de caractere pe care le au în comun și care descind dintr- un strămoș comun. Adică unitatea taxonomică minimă ce poate fi studiată din punct de vedere filogenetic. (Domínguez et Vázquez, 2009). În astfel de studii se folosesc mai multe caractere, deoarece folosirea unui singur caracter ar duce la rezultate eronate, datorită polimorfismului.

În conservarea speciilor, caracterele moleculare sunt folosite pentru a realiza un management corect al populațiilor, evidențierea speciilor și populațiilor care au prioritate și de a stabili programe de conservare eficiente. Pentru conservare a fost introdus termenul de Unitate Evolutivă Semnificativă (UES), care se definește ca un grup de indivizi ce au fost izolați din populație pentru o perioadă lungă de timp, iar aceștia au căpătat caractere genotipice și fenotipice noi.

2.3. Markeri moleculari utilizați în ecologie

Markerii genetici reprezintă forme diferite ale aceleiași gene care controlează expresii fenotipice mutante și permit identificarea prezenței unei gene la nivel individual. Markerii genetici se bazează pe polimorfismul genei la nivelul expresiei fenotipice în relație cu condițiile de mediu. Există trei tipuri de markeri genetici: morfologici, biochimici și moleculari. Markerii moleculari sunt cei mai utilizați datorită numărului lor nelimitat, aceștia provenind din diferite tipuri de mutații ale ADN: substituții (mutații punctiforme), rearanjamente (inserții sau deleții) sau erori în replicarea ADN în tandem. Acești markeri sunt neutrii deoarece sunt localizați în regiuni necodate a ADN, de asemenea, markerii moleculari sunt practic în număr nelimitat. (Winter & Kahl, 1995)

Markerii moleculari prezintă multe avantaje și sunt instrumente care oferă informații valoroase în experimentele de ecologie moleculară și filogeografie. Printre acestea putem enumera: stabilirea gradului de înrudire între taxoni îndepărtați filogenetic, disocierea dintre organismele homozigote și cele heterozigote, frecvența alelelor într- o populație, etc.

Pentru a fi folosit în analizele de filogeografie moleculele trebuie să îndeplinească o serie de criterii:

Molecula să fie distinctă și distribuită randomic;

Să poată fi ușor de izolat și analizat;

Să prezinte o structură genetică simplă;

Să se transmită simplu fără să fie nevoie de recobinare genetică

Să evolueze într- un ritm rapid;

În general în studiile de filogeografie se folosește ADN extranuclear de tip cloroplastidial la plante, iar cel mitocondrial atât la plante cât și la animale, deoarece acestea prezintă mai multe avantaje.

ADN mitocondrial

Mitocondria este un organit aflat într-un număr mare în celulă, având rol în respirația celulară. ADN mitocondrial este reprezentat de o moleculă dublu catenară, circulară, super-răsucită și haploid deoarece este transmis pe cale monoparentală, doar de la mamă. Acest tip de transmitere maternă se datorează faptului că în momentul fecundării toate componentele celulare de origine paternă, în afară de nucleu sunt degradate, inclusiv mitocondriile.

ADN mitocondrial are dimensiuni reduse, nu este complexat cu histone, rata de recombinare este scazută, rata mutațiilor este mai ridicată decât în ADN nuclear datorită funcției sale fiind numită ”uzina celulei”, prezentând radicalii liberi de oxigen, nu are introni. Are o structură foarte bine conservată la toate organismele cu situsuri de inițiere și terminare a replicării. ADN mitocondrial provenit de la animale conține 13 gene codificatoare pentru proteine, 22 de gene pentru molecule de ARN de transfer și două care codifică pentru ARN ribosomal (Fig.18).

Figură 18. Reprezentarea schematică a organizării genomului mitocondrial la mamifere. Liniile întunecate reprezintă genele pentru ARN ribozomal, genele abreviate cu ND reprezintă genele NADH dehidrogenazei, iar CO genele citocrom oxidazei (Freeland, 2005).

Una dintre aceste regiunile mitocondriale intens folosite pentru studii de filogeografie la mamifere este reprezentată de regiunea control de la nivelul ADN mitochondrial numită și DLOOP (Fig.19) care este formată dintr-o regiune centrală conservată la toate organismele care are importanță în procesul de replicare al ADN mitocondrial, flancată de două regiuni hipervariabile (Wei et al., 2009).

Figură 19. Reprezentarea schematică a regiunii de control al ADN mitocondrial- secvența (D-LOOP) de la carnivore (Wei et al. 2009).

2.4.Izolare ADN genomic:

Pentru izolare ADN genomic a fost folosit kit-ul commercial Isolate II Genomic DNA de la BIOLINE. Procedura de lucru începe cu incubarea probei intr-o solutie de proteinaza K si în tampon de liză. Condițiile necesare legării ADN la membrana de silica din coloana Isolate II Genomic DNA sunt realizate prin adăugarea de săruri chaotropice și etanol. Procesul de legare la membrana este reversibil și specific acizilor nucleici. Contaminările sunt înlăturate prin spălări succesive în două tampoane diferite. ADN genomic este eluat la final cu un tampon ușor alcalin.

Mod de lucru:

țesutul (fragment de mușchi, 25mg) a fost omogenizat mecanic. În tuburi s-a adaugat 180 μl de tampon de liză și 25 μl de soluție de Proteinază K.

Incubare la 56oC pentru 1-3 ore, până la liza completă a țesuturilor.

Se adaugă 200 μl tampon de liză G3, se vortexează probele

Incubare la 70oC, timp de 10 minute.

Se adaugă 210 μl etanol 96-100%, vortexând ulterior probele.

Se transfera lizatul celular in colonițele furnizate în kit, si se centrifughează 1min. la 11000xg.

Supernatantul a fost aruncat.

Se adaugă 500 μl de tampon de spălare GW1, se centrifughează 1min. la 11000xg.

Se adaugă 500 μl de tampon de spălare GW2, se centrifughează 1min. la 11000xg.

Centrifugarea a fost repetată în aceleași condiții pentru a îndepărta orice urmă de etanol pentru 3 min.

Colonițele sunt plasate în tuburi de centrifugă de 1,5 ml.

Se adaugă tampon de eluție, preîncălzit la 70oC, câte 100 μl per tub.

Se incubează la 70oC pentru 15 min și apoi se centrifughează

Tuburile cu ADN izolat de la probele de interes sunt păstrate la 4oC pentru scurt timp sau la -20oC pentru timp îndelungat.

2.5.Verificarea concentrației și purității ADN genomic la spectrofotometru

Concentrația și puritatea ADN s-a verificat cu ajutorul spectrofotometrului NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, USA). Absorbanța în ultraviolet (UV) a fost citită la lungimile de undă de 230 nm, 260 nm și 280 nm.

Absorbanța maximă pentru moleculele ADN (fie dublucatenare sau monocatenare) se face la lungimea de undă de 260 nm. La 230 nm sunt citite eventuale polizaharide rămase în probă, iar la 280 nm – proteine și ARN. Astfel, în funcție de rapoartele A260/230 și A260/280 va fi stabilit gradul de contaminare a ADN izolat.

Raportul optim A260/230 trebuie să fie mai mare de 2, un raport mai mic indicând o contaminare cu polizaharide. Pe de altă parte, raportul optim A260/280 trebuie să fie cuprins între 1,8 și 2. Un raport mai mic de 1,8 indică o contaminare cu proteine, iar unul mai mare de 2 o contaminare cu ARN.

2.6.Reacția de amplificare în lanț a regiunii Dloop de la nivelul ADN mitocondrial

Reacția de Polimerizare în Lanț (Polymerase Chain Reaction) reprezintă o tehnică de amplificare enzimatică in vitro a unei secvențe ADN de interes. Practic, prin acestă metodă au loc cicluri repetitive de replicare ADN cu ajutorul a doi primeri oligonucleotidici ce vor hibridiza cu cele două catene ADN matriță. Spre deosebire de replicarea in vivo, în reacția PCR desfacerea celor două catene ADN nu se realizează enzimatic, ci prin denaturare termică. O altă diferență constă în faptul că atașarea primerilor, de asemenea, se realizează la o anumită temperatură (specifică acestora) și nu cu ajutorul enzimelor. Practic, singura enzimă folosită într-o reacție clasică de PCR este ADN polimeraza, ce are funcție de replicază. Aceasta a fost izolată dintr-o bacterie termofilă (Thermus aquaticus) pentru a nu se degrada în timpul etapelor de denaturare a ADN. În urma reacției PCR se obține o cantitate mare de copii ale unui fragment ADN de interes. Practic, la fiecare replicare, numărul de copii ale fragmentului de interes este dublat. Ulterior aceste copii sunt verificate printr-o electroforeză în gel de agaroză și folosite mai apoi în alte analize, în funcție de scopul urmărit.

Pentru a amplifica regiunea control (Dloop) de la nivelul ADN mitocondrial au fost utilizate următoarele amorse (primeri) nucleotidice (Fig.20):

Figura 20. Reprezentarea schematică a fragmentului de ADN mitochondrial amplificat de primerii utilizați (Cabria et al., 2011)

Pentru a putea realiza reacția de secvențiere capilară printr- un serviciu comercial și pentru a micșora costurile acestei analize amorsei Lutb Forward i-a fost adaugată o coadă universal de tip M13, primerul rezultat având următoarea secvență:

5' – GGATAACAATTTCACACAGGAGAACACCCATTCATCATTATCG – 3'

ADN genomic extras și cuantificat în etapa precedentă a fost utilizat ca matriță pentru amplificare prin PCR. Protocolul utilizat pentru PCR este următorul (vezi tabelul 3):

Tabel 4 Compoziția mixului de reacție pentru amplificarea regiunii control (Dloop)

Reacția de amplificare s-a desfășurat într-un aparat DNA Engine Cycler PTC 200. Amplificarea a avut loc utilizând următorii parametric (vezi tabel 4):

Tabel 5. Programul reacției PCR

După finalizarea programului de PCR, cate 5 µl din fiecare probă este încarcat pe gel de agaroză pentru verificarea succesului reacției de amplificare.

Pentru probele la care se apreciază că a existat o reacție de amplificare cu un randament bun, va fi efectuată următoarea etapă și anume – izolarea produșilor de PCR obținuți, izolare care poate fi realizată direct din produșii de PCR obținuți sau așa cum s-a procedat cu probele analizate în prezentul studiu – decupare a produsului de interes din gel de agaroză.

2.7.Izolarea produșilor de PCR obținuți din gel de agaroză

Se prepară un gel de agaroză de concentrație 2%. Sunt încarcate probele și se setează parametri obișnuiți de migrare. După un interval de aproximativ 40 de minute, gelul este îndepărtat din tancul de electroforeză și este captată o imagine a gelului.

Fragmentele de interes sunt excizate din gel. Fiecare fragment în parte este cântărit pentru a verifica să nu depășească 300mg. Pentru a izola Fragmentul de interes din gel s-a utilizat kitul comercial FavorPrepTM Gel/PCR Purification Kit de la Favorgen Biotech Corp. Protocolul de lucru urmat a fost următorul:

Se tranferă fragmentul de gel excizat (până la 300mg) într-un tub de centrifugă de 1.5ml.

Se adaugă 500 µl Tampon FADF peste fragmentul de gel și se vortexează.

Se incubează 10-15 minute la 55șC, cu vortexare la un interval de 3 minute pentru a asigura dizolvarea completă a fragmentului de gel.

Se răcește proba la temperatura camerei și se pregătește o coloană de silica furnizat în kit.

Se transferă toată cantitatea de mixtură obținută în tubul de contrifugă pe coloana de silica FADF și se centrifughează 1 minut la 10000Xg. Se îndepărtează lichidul din tubul colector.

Se adaugă 750µl de tampon de spălare peste coloane FADF. Se centrifughează 1 minut la 10000Xg. Se îndepărtează lichidul din tubul colector.

Se centrifughează coloana pentru 3 minute la 10000Xg pentru a se usca membrana de silica.

Se poziționează coloana de silica într-un tub nou de 1,5ml și se adaugă peste colonița de silica 30µl tampon de eluție furnizat de kit.

Se incubează 2 minute la temperatura camerei apoi se centrifughează 1minut la 10000Xg.

2.8.Verificarea concentrației ampliconilor izolați la spectrofotometru

Concentrația ampliconilor de ADN mitocondrial (regiunea control) s-a verificat cu ajutorul spectrofotometrului NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, USA). Absorbanța în ultraviolet (UV) a fost citită la lungimile de undă de 230 nm, 260 nm și 280 nm.

2.9.Secvențierea regiunii Dloop de la nivelul ADN mitocondrial

Secvențele D-loop din probele de interes au fost obținute cu ajutorul metodei de secvențiere Sanger. Această metodă descrisă de către Frederick Sanger și colaboratorii în anul 1977 constă în replicarea ADN in vitro cu ajutorul unei polimeraze prin adăugarea de dideoxinucleotide la capătul 3’ al catenei ADN. Elementele necesare realizării unei reacții de secvențiere prin metoda Sanger sunt: fragmentul de ADN de interes pentru secvențiat (matrița ADN) în formă monocatenară, polimeraza ADN, primeri, deoxinucleotide obișnuite (dNTP adenină, guanină,citozină, timină), di- deoxinucleotide ddNTP . Dideoxinucleotidelor le lipsește o grupare (OH) care atunci când este inserată în catena de ADN nu mai permite polimerazei să lege alte nucleotide, iar replicarea se oprește. Dideoxinucleotidtrifosfații sunt inserați randomic în catena de ADN, astfel se vor forma fragmente de diferite dimensiuni. ddNTP sunt marcate fluorescent, fiecare nucleotidă având un flurocrom de culoare diferită, semnalele colorate sunt citite de un laser și reprezentate grafic pe computer ca și ” pick- uri”.

Astfel, când într-o catenă este încorporat un ddNTP, ADN polimeraza încetează extensia acestei catenei. În urma unei reacții de secvențiere se obțin fragmente de diferite lungimi. Pentru detecția fragmentelor se folosesc ddNTP sau primeri marcați fluorescent, detecția realizându-se cu un sistem laser. Metoda Sanger prezintă mai multe variante, cele utilizate în prezentul studiu fiind secvențierea capilară și secvențierea în gel de poliacrilamidă.

Secvențierea pe gel de poliacrilamidă a fragmentelor Dloop

Fragmentele Dloop (ADN mitocondrial regiune control) obținute de la 10 indivizi de Mustela putorius au fost secvențiate folosind metoda Sanger pe un aparat LI-COR 4300L DNA Analyzer și protocolul pentru DNA Cycle Sequencing Kit (Jena Biosciences). Primerii utilizați pentru secvențiere au fost primeri M13 (tabelul 5) marcați cu fluorocrom IRD700 și IRD800.

Tabel 6. Secvențele primerilor M13 folosiți la secvențierea fragmentului Dloop

Mod de lucru:

• Pentru fiecare probă de ADN supusă secvențierii, se calculează cantitatea de soluție ADN (obținută după izolarea din gel) care trebuie adaugată în reacția de secvențiere.

• Pentru fiecare probă ADN care va fi secvențiată după amplificarea PCR, se realizează un premix, prin pipetarea reactivilor prezentați in tabelul 6.

Tabel 7. Componentele reacției PCR pentru secvențiere

• Se închide tubul cu premix-ul și se vortexează 10 secunde pentru amestecarea completă a reactivilor.

• Pentru fiecare probă ADN care este secvențiată, se pregătesc 4 tuburi de PCR de 200µl, care se notează cu indicele probei și cu următoarele coduri: A, C, G, T (fiecare dintre cele 4 nucleotide).

• În fiecare tub (notat A, C, G, T) se pipetează câte 4 µl din terminatorul corespunzător schemei prezentate în tabelul 8.

Tabel 8.Schema de pipetare a terminatorilor pentru secvențiere

• În fiecare tub (A, C, G, T) al fiecărei probe, se adaugă câte 4 µl premix. Se închid tuburile și se vortexează 10 secunde pentru amestecarea completă a reactivilor.

• După ce au fost pregătite astfel toate tuburile pentru fiecare probă ADN care urmează a fi secvențiată, se încarcă tuburile în termoblocul de amplificare.

• După finalizarea programului de amplificare pentru secvențiere (tabelul 8), în fiecare tub se vor adăuga 4 µl soluție IR2 Stop Solution Red, iar tuburile vor fi păstrate la frigider 4șC pâna la rularea electroforezei.

Tabel 9 . Programul PCR pentru secvențiere

Prepararea gelului și electroforeza

Pentru secvențierea fragmentelor Dloop a fost utilizat aparatul LI-COR 4300L DNA Analyzer. Ca urmare a acestui fapt, toate etapele premergătoare electroforezei propriu-zise sunt în conformitate cu specificațiile acestui sistem.

• Alegerea plăcilor și distanțatorilor potriviți. Pentru secvențierea fragmentelor de până la 800 pb se folosesc plăci de 41 cm. Am folosit distanțatori de 0,2 mm grosime.

• Asamblarea plăcilor presupune ștergerea lor cu etanol 70%. Etanolul este șters folosind șervețele din hârtie specială (KimWhipes), astfel ca pe fețele care vin în contact cu gelul să nu rămână impurități care ar putea determina formarea de bule de aer în momentul turnării gelului.

• Prepararea tamponului de electroforeză. Pentru secvențiere se folosește un buffer TBE 0,8x (Tris-borat EDTA). Tamponul TBE 10x are un pH~8,5 și conține următoarele componente: Tris 0,040 M; acid acetic 0,040 M; EDTA de Na 0,002 M.

• Prepararea gelului. Pentru secvențiere se folosește un gel de 5,5% poliacrilamidă, de 41 cm lungime și 0,2 mm grosime. Pentru acesta sunt necesare componentele prezentate în tabelul 10:

Tabel 10. Componentele gelului de poliacrilamidă pentru secvențiere

Este recomandat ca soluția de APS 10% (persulfat de amoniu) să fie preparată chiar înainte de începerea realizării gelului. APS determină polimerizarea gelului, de aceea este bine ca după adăugarea acestuia, gelul să fie turnat cât mai repede în plăci.

În cazul în care la turnarea gelului se formează bule de aer, acestea trebuie înlăturate, înainte de polimerizare, pentru ca probele să migreze drept în timpul electroforezei. Bulele pot fi scoase cu ajutorul unui cârlig special.

Pentru gelul de secvențiere se folosește un pieptene cu 48 de godeuri de tip SharkTooth (cu dinți ascuțiți).

Electroforeza. Mai întâi trebuie stabiliți parametrii de realizarea a procesului de separare electroforectică. Astfel, procesul de separare poate fi mai lung sau mai scurt, în funție de mărimea fragmentelor care vor fi secvențiate. Programul de rulare pentru secvențeierea fragmentelor mai mici de 800 pb este de 10 ore.

Înainte de încărcarea pe gel, probele se denaturează la 95°C timp de 3 minute, după care se țin pe gheață pentru a fi menținute în această stare.

Secvențele obținute sunt verificate și corectate manual dacă este cazul, folosind programele eSeq™ (LI-COR), AlignIR™ (LI-COR) și CodonCode Aligner v.3.7.1 (CodonCode, Dedham, Massachusetts, USA).

2.10.Secvențierea capilară a fragmentelor Dloop

Pentru secvențierea fragmentelor Dloop provenite de la o parte a probelor analizate în prezentul studiu s-a apelat la serviciile comerciale ale companiei Macrogen (http://www.macrogen.com/eng/). Aparatul folosit pentru secvențierea fragmentelor a fost ABI 3730XL (Applied Biosystems), sistem automatizat de secvențiere capilară cu reactivi BigDye® Terminator.

Electroforeza capilară utilizează un polimer fluid cu proprietăți denaturante. În timpul electroforezei capilare, fragmentele care trebuie secvențiate pătrund în capilare prin injecție electrocinetică – un curent electric de tensiune înaltă forțează fragmentele încărcate negativ prin electrolitul din capilare. Fragmentele sunt separate pe baza raportului dintre dimensiune și sarcina electrică globală. Chiar înainte de a ajunge la catod, fragmentele ADN marcate fluorescent, separate pe baza dimensiunii lor, trec prin dreptul unei raze laser. Această rază produce excitarea substanțelor fluorescente care produc lumină care este detectată de un dispozitiv optic. Pentru citirea și diferențierea celor patru baze azotate din structura acizilor nucleici este suficientă o singură injecție capilară, deoarece sistemul folosește câte o substanță fluorescentă diferită (emit la lungimi de undă diferite) pentru fiecare bază azotată.

Rezultatele electroforezei capilare sunt prezentate sub formă de electroforegrame (Fig. 21) care sunt verificate și corectate atunci când este cazul, în programul CodonCode Aligner v.3.7.1 (CodonCode, Dedham, Massachusetts, USA).

Figura 21 Electroforegramele secvențelor Dloop provenite de la 3 indivizi de Mustela putorius în CodonCode Aligner.

2.11.Programele de bioinformatică utilizate pentru analiza secvențelor obținute

Secvențele obținute au fost mai întâi verificate și corectate, dacă a fost nevoie, folosind programul CodonCode Aligner v.3.7.1 (CodonCode, Dedham, Massachusetts, USA) pentru secvențele obținute prin secvențiere capilară sau programele eSeq™ (LI-COR) și AlignIR™ (LI-COR) pentru secvențele obținute pe aparatul LI-COR 4300L DNA Analyzer.

După corectarea secvențelor în CodonCode Aligner aceastea au fost tăiate astfel încât să aibă același număr de nucleotide – lucru necesar pentru analiza lor cu programele de biostatistică și analiză genetică alese), acestea au fost verificate pentru prezența codonilor

Secvențele obținute au fost analizate folosind mai multe pachete software pentru aprecierea relațiilor dintre haplotipurile observate și evaluarea diversității genetice.

• aplicația BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) care poate fi accesată pe pagina de internet http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi prezintă mai multe variante de căutare în toate tipurile de secvențe (de nucleotide sau aminoacizi) prezente în baza de date GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Folosind BLASTN putem compara o secvență nucleotidică de interes cu alte secvențe nucleotidice prezente în GenBank.

• MEGA v.6.0 (Tamura și colab., 2013) – programul MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) oferă uneltele pentru explorarea, descoperirea și analiza ADN și a secvențelor proteice dintr-o perspectivă evolutivă. Softul este utilizat pentru analiza comparată a secvențelor proteice și nucleotidice, cu scopul de a evidenția modele evolutive ale genelor, genomurilor, chiar și ale speciilor de-a lungul unor perioade de timp.

• DnaSP v.5 (Librado și Rozas, 2009) – realizează analize moleculare exhaustive de genetica populațiilor pe baza modelului coalescent al evoluției. Folosind acest program, se poate măsura nivelul de polimorpfism al secvențelor ADN (în interiorul unei populații sau între populații diferite), precum și nivelul de divergență între specii. Cu acest program poate fi estimată variația la nivelul situsurilor sinonime și ne-sinonime, pot fi realizate testele Tajima, Fu and Li și Ramos-Onsins & Rozas. De asemenea, acest soft este utilizat pentru a determina numărul de haplotipuri, diversitatea haplotipică (h) și diversitatea nucleotidică (p). Aceste teste permit evaluarea unei expansiuni recente sau a unei regresii în populația analizată. Dacă rezultatul este negativ pentru testele Tajima, Fu & Li acest lucru semnifică o expensiune a populației analizate. Dacă valoarea obținută este aproape de zero, populația analizată este stabilă iar dacă valoarea obținută pentru test este negativă atunci populațiile speciei analizate sunt în regres. Pentru testul Ramos-Onsins & Rozas atunci când valorile calculate sunt pozitive, populațiile analizate sunt în regres, pe când la valori apropiate de zero sau negative populațiile sunt stabile sau în expansiune.

Tabel 11. Sinteză a diferite ipoteze ce privesc istoria demografică a unui populații bazată pe cei doi parametri: diversitatea de haplotipuri (h) și diversitate nucleotidică (p).

• Network v.4.6.0.0 (Bandelt și colab., 1999) – acest program utilizează metoda „median joining” (MJ) pentru a construi rețele bazate pe date genetice la nivelul cărora se consideră că nu intervine recombinarea. În filogenie, nodurile rețelei create sunt secvențe provenite de la specii actuale sau fosile cu mutații specific. Descendenții unui asemenea nod pot fi grupați într-un cluster sau ramură. Când numărul de caractere analizat este extins, lungimea brațelor se modifică, devenind mai lungi.

• jModelTest v.2.4.1 (Guindon și Gascuel, 2003; Posada, 2008) – program folosit pentru a determina cel mai potrivit model de substituție a nucleotidelor pentru analiza datelor noastre. În acest scop, programul implementează 5 strategii diferite de selecție (printre care și hierarchical and dynamical likelihood ratio tests, Akaike information criterion, Bayesian information criterion). Modelul de substituție a nucleotidelor este folosit în calculul probabilității schimbului dintre nucleotide de-a lungul ramurilor unui arbore filogenetic. Utilzarea unui anume model de substituție poate modifica complet rezultatele unei analize filogenetice. De aceea, selectarea statistică a modelului de substituție, utilizat în analiza filogenetică a secvențelor, este o etapă foarte importantă. În urma utilizării modelului optim de substituție se pot face estimări corecte de filogenie pe baza alinierii secvențelor ADN.

AIC (Akaike Information Criterion) reprezintă un criteriu pe baza căruia se poate măsura calitatea unui model statistic pentru un set de date ales. Acest criteriu oferă o estimare a informației pierdute atunci când un model statistic este utilizat în procesul de generare a datelor.

BIC ( Bayesian information criterion (BIC) or Schwarz criterion (also SBC, SBIC) reprezintă un criteriu de selecție a modelului bazat pe analiza probabilității și este strâns înrudit cu AIC. Este preferat modelul pentru care există cea mai scăzută valoare BIC.

3.REZULTATE:

3.1.Izolare ADN genomic

În urma determinării spectrofotometrice a probelor ADN, s-au obținut curbe absorbție/lungime de undă de tipul celor din figura 22:

Figură 22. Curbe absorbție/lungime de undă pentru probe de la specia Mustela putorius

Valorile absorbției la cele trei lungimi de undă de interes, precum și raportul 260/280, respectiv 260/230. Au fost obținute concentrații cuprinse între 58,58 ng/μl și 200 ng/μl.

3.2.Reacția de amplificare în lanț a regiunii Dloop de la nivelul ADN mitocondrial

Imaginile gelurilor de electroforeză (Fig 23) obținute în urma amplificării fragmentului Dloop (regiuni control) de la nivelul ADN mitocondrial pentru probele de Mustela putorius studiate sunt prezentate în figurile:

Figura 23. Imaginea electroforetică a ampliconilor de ADN mitocondrial (Dloop) încărcați pe geluri de agaroză

3.3. Analiza fragmentului Dloop (ADN mitocondrial)

Pentru identificarea haplotipurilor (vezi tabelul 11) a fost utilizat softul DNAsp (Librado et Rozas, 2009). Secvențele prelucrate cu CodonCode Aligner au fost aliniate în MEGA 6, utilizând aplicația Clustal W (Higgins si colab. 1994). Aliniamentul salvat a fost utilizat apoi in softul DNAsp pentru a realiza o analiză a haplotipurilor prezente în setul de date.

Tabel 11. Haplotipurile identificate în probele analizate

Arborele filogenetic realizat pe baza haplotipurilor identificate în probele analizate nu ne arată o structură bine definită (Fig.24). Putem decela 3 grupuri de haplotipuri (haplogrupuri), cu toate că în arborele construit există numeroase neclarități. Într-un prim haplogrup sunt reunite probe de Mustela putorius din Dobrogea (Hap 9 și Hap 8) dar și probe aparținând speciei Mustela eversmanii (hap 4). Un al doilea grup este reprezentat de haplotipurile 3, 7 și 5, aparținand speciilor Mustela putorius și Mustela eversmanii. Al treilea grup conturat este cel format din 3 haplotipuri de Mustela putorius, răspandite în Belgia și Spania. Haplotipul 1 reprezintă un amalgam de probe, un haplotip larg răspândit aparținând speciei Mustela putorius. Este întâlnit in Oltenia, Muntenia și Dobrogea dar de asemenea este regăsit și la probele provenite din Polonia.

Figura 24 . Arbore filogenetic realizat pe baza secventelor de ADN mitocondrial (Dloop). Istoria evolutivă a fost dedusă pe baza metodei ML (Maximum Likelihood) și utilizând modelul Hasegawa-Kishino-Yano, selectat pe criterii bayesiene.

Pentru alegerea modelului evolutiv pentru implementarea analizei ML am utilizat softul Jmodel test, folosind criteriul Bayesian de alegere al modelului. Este preferat modelul cu cel mai mic scor BIC, așa cum se poate observa din tabelul 12.

Tabel 12. BIC MODEL SELECTION : Selection uncertainty

Figura 25. Reprezentarea in retea a haplotipurilor de Mustela sp.

Analiza în rețea a haplotipurilor identificate precum și relațiile existente între acestea a fost realizată cu ajutorul softului Network 5.0 după metoda Median Joining. Putem remarca prezența a 3 haplogrupuri dar și a unui haplotip dominant (H1) precum și a unor haplotipuri mai puțin frecvente (H4, H8, H3, H5, H13, H11, H12). Diferențele mutaționale între haplotipurile identificate sunt foarte reduse (cel mai adesea 2 mutații).

Tabelul 13. Diversitatea haplotipică și nucleotidică

Tabelul 14. Teste demografice și de neutralitate

Diversitatea haplotipică și cea nucleotidică precum și analizele de neutralitate și cele demografice au fost realizate cu ajutorul softului DnaSP v.5. și sunt prezentate în tabelul 14. putem observa că diversitatea nucleotidică este una moderată în populația din România comparată cu probele ce provin din exteriorul țării (non_Romania: Polonia, Belgia, Danemarca și Spania). Nivelul diversității haplotipice este unul comparabil între probele analizate.

3.4.Analize de mismatch distribution:

Tabelul 15. Analiza mismatch distribution pentru diferite seturi de probe

Analiza ”mismatch distribition” este în concordanță cu indicii demografici prezentați în tabelul . Pentru populațiile provenind din afara Romaniei se poate observa o tendință de expansiune, pe cand populațiile din Romania și analiza realizată pe întregul set de probe sugerează o populație cu efective constante (vezi cazurile A și B).

4.DISCUȚII

4.1.Structura genetică a populațiilor analizate:

Studiile bazate pe analiza markerilor ADN mitocondriali (Dloop) nu au susținut o

structurare evidentă a diversității genetice a populațiilor analizate. Markerul mitocondrial ales nu a oferit suficientă rezoluție pentru a decela o delimitare clară între cele două specii ale genului Mustela: putorius și eversmanni. Hap 3 și Hap 4 cuprind exclusiv probe de Mustela eversmanii cu răspândire în județele Constanța și Tulcea pe când Hap 5 și Hap 6 au in componență câte 2 probe aparținând celor 2 specii și cu localizare geografică diferită.

Atât analizele filogenetice cât și analizele tip rețea au susținut ideea unui amestec de haplotipuri. Cel mai răspândit este Hap 1, identificat la 16 probe din România cât și la două probe din Polonia. Din cele 13 haplotipuri identificate în setul de probe analizat, 8 haplotipuri sunt particulare României, 4 au fost identificate la probele din Spania, Belgia și Danemarca iar un haplotip (Hap 1) este comun României și Poloniei.

Studiile realizate până în prezent au demonstrat că populațiile de carnivore posedă o foarte slabă structurare a diversității genetice (Vila et. al., 1999; Walker et al., 2001). Nu este un lucru rar identificarea unui haplotip comun între regiuni foarte îndepărtate geografic, cum este și cazul haplotipului (Hap 1) identificat în probele analizate din România și Polonia.

Rezultatele observate în acest studiu sunt similare celor obținute de Michaux et al., 2005 pentru o altă specie a genului Mustela, nurca europeană (european mink) – Mustela lutreola. De asemenea, Pertoldi et al., 2006 a pus în evidență cu ajutorul markerilor mitocondriali 2 clade majore – una corespunzând populațiilor din nordul și estul Europei (Danemarca și Polonia) și cea de-a doua fiind alcătuită din populații răspândite în sudul și vestul Europei (Spania, Belgia, Franța). În prezentul studiu populațiile din sudul și vestul Europei (Spania, Belgia) sunt separate de populațiile din Polonia, dar separarea nu are un suport statistic foarte solid și sunt amestecate cu haplotipurile private pentru România.

Aceste rezultate par a susține ipoteza unei singure linii filogenetice majore de dihori cu răspândire largă în Europa. Această linie filogenetică ar fi putut supraviețui într-un refugiu glaciar unic, situat în Peninsula Iberică, cum sugerează datele paleontologice (Sommer & Nadachowski, 2006). Studiile precedente au identificat un număr mare de haplotipuri prezente în această regiune, fapt ce pare să susțină ipoteza unui refugiu glaciar în această regiune. O a doua linie filogenetică cu răspândire estică și nordică se pare că ar fi supraviețuit într-un refugiu situat în estul Europei. Diversitatea haplotipică crescută identificată în probele din România par a susține această ipoteză a refugiului glacial estic. În ceea ce privește diversitatea nucleotidică ea este una comparabilă cu cea identificată pentru probe ce provin din alte regiuni ale Europei.

Mustela eversmanni sau eversmanii așa cum l-a numit inițial Lesson – dihorul de stepă este aproape de nedeosebit din punct de vedere morfologic cu excepția unei nuanțe mai deschise a blănii. De asemenea, există deosebiri în ceea ce privește preferințele de habitat (Corbet, 1966). În prezentul studiu au fost analizate și 8 probe de Mustela eversmanii provenite din România, din județele Tulcea și Constanța.

În cele 8 probe de Mustela eversmanii au fost identificate 5 haplotipuri (Hap 2, Hap 3, Hap 4, Hap 5, Hap 6). Dintre aceste 5 haplotipuri 2 sunt private speciei Mustela eversmanii (Hap3 și Hap 4) pe când celelalte 3 sunt comune cu specia Mustela putorius. Multe dintre probele utilizate în prezentul studiu provin de la animale grav deteriorate așa că pot exista rezerve asupra specimenelor identificate ca Mustela eversmanii și care prezintă același haplotip cu Mustela putorius.

Figura 26. Arborele filogenetic al haplotipurilor analizate. Istoria evolutivă a fost dedusă pe baza metodei ML (Maximum Likelihood) și utilizând modelul Hasegawa-Kishino-Yano, selectat pe criterii bayesiene.

Analiza tip Network efectuată pe setul de probe analizat identifică prezența a trei haplogrupuri:

Haplogrupul 1 cuprinde haplotipurile H1, H10, H9, H8, H4, H2, H6 – dintre care H4 reunește probe aparținând speciei Mustela eversmanii (haplotip privat pentru această specie). De asemenea, în ce privește localizarea geografică, se păstrează structurarea regăsită de Pertoldi și colaboratorii și anume linii filogenetice prezente în Nordul și Estul Europei (Danemarca H10, Polonia H1 și probele din Romania (H1, H2, H4, H6, H8).

Haplogrupul 2 cuprinde haplotipurile H3, H5, H7 – dintre care H3 reprezintă un haplotip privat pentru specia M. eversmanii iar H5 și H7 reunesc probe de M. putorius și M. eversmanii. În ceea ce privește localizarea geografică – probele provin toate din România.

Haplogrupul 3 cuprinde haplotipurile H11, H12, H13 – reunesc probe cu răspândire in Spania și Belgia aparținând speciei Mustela putorius.

Figura 27. Haplogrupurile identificate în probele analizate

4.2.Diversitatea genetică și istoria demografică a populațiilor

Cu ajutorul markerilor ADN microsatelit, studiul nostru a pus în evidență o

diversitate haplotipică comparabilă cu cea calculată în studiile precedente (Pertoldi et al., 2006). Probele provenite din România (0.819 ± 0,0018) au același nivel de diversitate haplotipică precum cele din Belgia (0.813 ± 0,067) și Spania (0,952 ± 0,040). Valorile obținute pentru diversitatea haplotipică pot fi considerate ridicate dacă ne gândim la cele obținute pentru alte specii de Mustelidae. Pentru Mustela lutreola, Michaux et al., 2005 raportează o diversitate de 0,469 ± 0,939 iar în cazul Lutra lutra de 0.16 ± 0,06 (Ferrendo et al., 2004).

La nivelul diversității nucleotidice valorile obținute pentru probele din România au fost de 0,0385 ± 0,00045 similare cu cele obținute de Pertoldi și colaboratorii (2006) și sunt considerabil mai mari decât valori raportate pentru alte specii de mamifere protejate precum Enhydra lutris – 0,0006 (Larson și colab., 2002).

Valorile obținute pentru diversitatea haplotipică și pentru cea nucleotidică ne descriu o specie care a suferit o expansiune rapidă și recentă și care a pornit de la o populație cu un efectiv numeric scăzut. Această ipoteză poate fi confirmată și de analiza tip Network efectuată, de indicele Fu Fs calculat (-1,685) sau de analiza de mismatch distribution. În același timp, rezultatele pot fi afectate de numărul relativ mic de probe analizate.

Diferențele la nivel nucleotidic între perechi de secvențe (the pairwise nucleotide differences) variază între 0-10. Analiza de ”mismatch distribution” pentru populațiile analizate în prezentul studiu a dezvăluit un model corespunzător unei populații în expansiune (vezi figura ) (Davison și colab., 2001; Luikart și colab., 2001; Pertoldi și colab., 2006).

Rezultatele obținute nu pot pune în evidență existența unei structuri genetice clare. Prezentul studiu, primul realizat asupra populațiilor de Mustela putorius din România cu ajutorul markerilor mitocondriali, a evidențiat existența a 8 haplotipuri particulare pentru țara noastră.

Datele obținute în acest studiu coroborate cu studiile precedente – Pertoldi si colab, 2006 pot susține ipoteza existenței în partea de est a Europei al unui secund refugiu glacial pentru specia Mustela putorius. Pertoldi menționează în studiul său din 2006 un singur eveniment de colonizare a Belgiei și Olandei din refugiul glacial Iberic și multiple evenimente de colonizare pentru Polonia și Danemarca dintr-un posibil refugiu glacial din estul Europei. Datele noastre susțin existența acestui de-al doilea refugiu glacial, posibil chiar pe teritoriul țării noastre, pentru că diversitatea haplotipică și nucleotidică a probelor analizate este una mare, corespunzătoare zonelor care au funcționat în trecutul geologic drept refugii. Procesul de recolonizare al Europei a început cu cel mult 10000 de ani în urmă, pe când gheața acoperea nordul Europei iar în Europa Centrală era prezent permafrostul. Aceste regiuni nu erau propice supraviețuirii populațiilor de mustelide, drept urmare ele s-au retras spre regiuni sudice (Peninsula Iberică) sau estice, unde puteau supraviețui, clamatul fiind unul mai bland.

Figură 28. Răspândirea calotei glaciare in timpul ultimei glaciațiuni

Lipsa unei structuri genetice clare dar și prezența unui divergențe genetice scăzute observate în toate studiile având drept subiect populațiile de dihori comuni sugerează că procesul de recolonizare al Europei a fost unul rapid și care a avut la bază cel puțin două refugii glaciale: unul iberic și unul est european.

Studii viitoare, realizate pe un eșantion mai numeros de probe, cu o acoperire geografică mai bună dar și utilizând marleri moleculari de tip ADN microsatelit vor contribui cu siguranța la o mai bună înțelegere a istoriei evolutive a speciei Mustela putorius la nivel european.

5.CONCLUZII

5.1.Structura genetică a populațiilor analizate:

Studiile bazate pe analiza markerilor ADN mitocondriali (Dloop) nu au susținut o structurare evidentă a diversității genetice a populațiilor analizate. Markerul mitocondrial ales nu a oferit suficientă rezoluție pentru a decela o delimitare clară între cele două specii ale genului Mustela: putorius și eversmanni.

Studiile realizate până în prezent au demonstrat că populațiile de carnivore posedă o foarte slabă structurare a diversității genetice (Vila et. al., 1999; Walker et al., 2001). Nu este un lucru rar identificarea unui haplotip comun între regiuni foarte îndepărtate geografic, cum este și cazul haplotipului (Hap 1) identificat în probele analizate din România și Polonia.

5.2.Diversitatea genetică și istoria demografică a populațiilor

Valorile obținute pentru diversitatea nucleotidică a probelor din România au fost similare cu cele obținute de Pertoldi și colaboratorii (2006) și sunt considerabil mai mari decât valorile raportate pentru alte specii de mamifere protejate.

Diversitatea haplotipică și cea nucleotidică ne descriu o specie care a suferit o expansiune rapidă și recentă și care a pornit de la o populație cu un efectiv numeric scăzut. Această ipoteză a fost confirmată de indicele Fu Fs calculat sau de analiza de mismatch distribution. În același timp, nu trebuie să uităm că rezultatele pot fi afectate de numărul relativ mic de probe analizate.

Prezentul studiu, primul realizat asupra populațiilor de Mustela putorius din România cu ajutorul markerilor mitocondriali, a evidențiat existența a 8 haplotipuri particulare pentru țara noastră, date ce pot susține existența unui al doilea refugiu glacial, posibil chiar pe teritoriul țării noastre, pentru că diversitatea haplotipică și nucleotidică a probelor analizate este una mare, corespunzătoare zonelor care au funcționat în trecutul geologic drept refugii.

6. MULȚUMIRI

Cu această ocazie aș dori să mulțumesc pentru susținerea acordată realizării acestei lucrări de licență domnului director al Muzeului Național de Istorie Naturală ”Grigore Antipa” – CSI. Dr.Luis Popa, doamnei CSII. Dr. Oana Paula Popa îndrumătorul științific și nu în ultimul rând doamnei Conf. Dr. Staicu Cristina Andrea coordonatorul științific.

Fig.29 Aspectul morfologic al dihorului comun Mustela putorius. (Sursa UniProt).