UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA [301683]

[anonimizat]-NAPOCA, 2015

Cercetari privind genotipizarea raselor de cabaline autohtone la locusul genei GYS1 care determina Miopatia Stocarii Polizaharidelor (PSSM)

TEZA DE DOCTORAT

Miopatia stocării polizaharidelor (PSSM) – Boală determinată genetic la cabaline

Doctorand: [anonimizat], se folosește font , 10, italic, [anonimizat], pagina se va folosi pentru scrierea LISTEI DE PUBLICAȚII (v. pag. 7, Macheta)

[anonimizat] „Miopatia stocării polizaharidelor (PSSM) – Boală determinată genetic la cabaline” reperezintă concretizarea celor 3 ani de cercetări, a cunoștințelor teoretice și a abilităților practice în activitatea de cercetare. Această etapă a repreyentat o etapă esențială în pregătirea mea profesională.

Teza este structurată în două părți cu un număr de opt capitole. [anonimizat], iar partea a doua, de cercetări proprii este alcătuită de încă cinci capitole.

Îmi exprim profunda recunoștință față de conducătorul meu de doctorat Pof. Dr. Ing. [anonimizat], înțelegerea și sprijinul acordat.

Sincere mulțumiri doresc sa adresez d-lui Dr. Ing. [anonimizat] m-a ajutat

LISTA DE PUBLICAȚII

Articole publicate in extenso ca rezultat al cercetării doctorale

CUPRINS (, 16, bold)

[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], etc. [anonimizat], în scopul obținerii de forme noi de viață a căror proprietăți genetice sunt prestabilite.

Miopatia de stocare a polizaharidelor (PSSM) este o glicogenoză caracterizată prin acumularea excesivă a glicogenului și a unui polizaharid cu structură anormală (rezistent la digestia cu amilază) în fibrele musculare scheletice. Afecțiunea a [anonimizat], [anonimizat] (MC.CUE, 2008)

[anonimizat] a [anonimizat] (Warmblood). [anonimizat] a fost descrisă la caii din rasele Pursânge și Arabă. (MC.CUE, 2008; VALENTINE, 2005).

La caii cu miopatie de stocare a [anonimizat] o parte, sensibilitate crescută a [anonimizat], [anonimizat] o mutație punctiformă a genei (GYS1) care codifică sinteza acestei enzime. [anonimizat]nsificarea sintezei de glicogen, care va conduce la acumularea excesivă a glicogenului muscular (FALCĂ, 2011).

Polizaharidul acumulat în fibrele muscular la caii cu PSSM are o structură mai puțin ramificată decât cea a glicogenului normal, fapt ce-l face rezistent la digestia cu amilază. Formarea polizaharidului mai puțin ramificat pare sa fie legată de activarea mai intensă a activității glicogen sintazei, care nu este însoțită de o creștere paralelă a activității enzimei de ramificare a glicogenului (FALCĂ, 2011).

STADIUL

ACTUAL

CUNOAȘTERII

CAPITOLUL 1

RASE DE CAI

CHAPTER 1

HORSE BREEDS

1.1.Scurt istoric

1.1Breed history

Calul (Equus aballus) este un mamifer   care are o mărime considerabilă, fiind o specie  modernă a genului Equus (http://en.wikipedia.org/wiki/Horse ).

Calul pentru a scăpa de prădători se foloseau de viteză și de simțul instinctului de luptă. Cabalinele sunt capabile să dormă, atât în ​​picioare cât si culcat (http://en.wikipedia.org/wiki/Horse).

Calul domestic aparține ordinului  Perissodactylia, Familia Ecvideelor. Corpul este zvelt are gâtul puternic și poartă o coamă.

Trunchiul prezintă un piept lat, se sprijină pe patru membre lungi, musculoase, puternice, terminate cu copita. Este folosit pentru dresaj, călărie și uneori pentru consum de carne. Conform ultimelor cercetări, se pare că domesticirea cabalinelor s-a petrecut acum circa 6.000 ani (http://en.wikipedia.org/wiki/Horse ).

Caii și oamenii participă la o serie mare de competiții sportive și alte preocupări, precum și în domenii de muncă, agricultură, divertisment și terapie. Cabalinele au fost folosite de-a lungul timpului în războaie, din care o mare varietate de tehnici de dresaj și călărit au fost dezvoltate, folosind mai multe feluri de echipamente și metode de control (http://en.wikipedia.org/wiki/Horse ).

1.2. Rasa Quarter

1.2. Quarter Horse

Quarter este o rasă de cai americană, care excelează la sprinturi pe distanțe scurte. Numele său provine de la capacitatea sa de a se distanța de alte rase de cai, în cursele de un sfert de milă sau mai puțin, unii cai au atins viteze de până la 88,5 km/h. Rasa Quarter este cea mai populară în Statele Unite ale Americii de astăzi, iar asociația „American Quarter Horse Association”  cuprinde cele mai multe exemplare de rasă cabalină din lume, peste 5 milioane de cai Quarter (http://en.wikipedia.org/wiki/American_Quarter_Horse).

Rasa Quarter este bine cunoscută pentru cursele de cai, rodeo, și la muncă în ferme. Corpul compact al cailor este potrivit pentru manevrele complicate și rapide necesare în aceste evenimente de echitație, spectacole (http://en.wikipedia.org/wiki/American_Quarter_Horse).

1.2.1. Originea rasei

1.2.1. Breed history

În secolul 17, coloniștii de pe coasta de est a Americii au început să împerecheze rasa de cai Thoroughbred importata din Anglia cu rasa de cai Chicksaw, această rasă fiind una dezvoltată de oamenii nativi americani din cai descendenți ai raselor Iberian, Arabian si Barb (Denhardt Quarter Running Horse pp.).

Caii de rasă pură Thoroughbred precum Janus, au contribuit cu gene cruciale pentru dezvoltarea rasei coloniale Quarter (SMITH, 2005) . Acest cal rezultat a fost mic și rapid și a fost folosit ca un cal de muncă în timpul săptămânii și un cal de curse la sfârșit de săptămână (BECKMANN; BRUCE, 2006).

Pe măsura ce cursele drepte au devenit tot mai populare, rasa Quarter a caștigat și mai multă popularitate ca o rasă de sprint, aceasta deoarece cursele drepte erau mai scurte decât cursele tradiționale din Anglia, iar de multe ori nu erau nimic mai mult decât o întindere dreaptă de drum sau o bucată plată de teren. Cand se faceau curse între rasa locală și rasa Thoroughbred, de obicei caștigau caii din rasa ce va urma să devină oficială rasa Quarter (SMITH, 2005).

În secolul 19, pionierii care se îndreptau spre vest au avut nevoie de un cal de muncă. În această expediție au fost împerechiați cai de rasa Quarter colonial cu cai salbatici cunoscuți ca Mustang și cai domesticiți de unele triburi precum Comanche, Shoshoni și Nez Perce (SMITH, 2005).

1.2.2.Dezvoltarea ca rasă

1.2.2. Development as a distinct breed

Principala atribuție a cailor în America de Vest a fost la dirijarea bovinelor. Chiar și după inventarea automobilului, caii au fost încă de neînlocuit pentru a dirija animalelor în ferme. Astfel, marile ferme de vite din Texas, precum și Regele Ranch și Waggoner Ranchplayed, au avut un rol semnificativ în dezvoltarea rasei Quarter. Competențele cowboy-lor și ale caiilor de atunci, au devenit fundamentul sportului rodeo din ziua de azi, un concurs care a început cu o concurență informală între cowboy și s-a extins devenind un eveniment competitiv major de-a lungul Americii de vest. Până în această zi, rasa Quarter domină acest sport, atât în ​​cursele de viteză cât și în manevrele cu bovine ( Denhardt Quarter Horse pp. 143–167).

Cu toate acestea, cursele de sprint au fost, de asemenea, foarte populare la sfârsit de saptamană, devenind chiar o sursă economică pentru crescatorii de cai. Ca rezultat, s-a adăugat mai mult sange din rasa Thoroughbred pentru dezvoltarea rasei Quarter. Rasa Quarter, a beneficiat de asemenea de gene din rasele Arabă, Morgan și Standardbred.

În 1940, asociația „American Quarter Horse Association” (AQHA) a fost formată de către un grup de călăreți și fermierii din sud-vestul Statelor Unite dedicat păstrării de pedigree a cailor din fermele lorm Denhardt Quarter Horse pp. 143–167).

Calul onorat cu primul număr de înregistrare P-1 a fost, ( Wimpy, Kentucky Horse Park., 2008) un descendent al fundației King Ranch.

Pentru a crește în continuare performanțele cailor încă se infuzează gene ale rasei Thoroughbred cu cele din rasa Quarter. Deoarece caii astfel rezultați au continuat să intre în registrele asociatiei AQHA a dus la creearea unui flux continuu de gene de la rasa Thoroughbred la rasa Quarter, care a modificat multe dintre caracteristicile rasei de la începutul formării sale ca o rasă aparte. Unii crescători, care susțin că acest flux de gene, începe să compromită integritatea rasei, favorizează caracteristicile rasei de la început, astfel formând organizații separate, care să promoveze și să înregistreze rasa Quarter. (Foundation Quarter Horse Association.,  2007; Foundation Bred Quarter Horses, 2007)

1.2.3. Rasele de cai Quarter moderne

1.2.3. Quarter Horses today

Caii din rasa Quarter sunt foarte cunoscuți și utilizați în spectacole, curse, rodeo, mai sunt utilizați și în ferme. Cai Quarter concură și la evenimente de rodeo (National Saddle Clubs Association) . Alte evenimente cu cai, cum ar fi Cutting și Reining sunt deschise pentru toate rasele de cai, dar de asemenea domină rasa Quarter.

Caii Quarter sunt potriviți nu doar pentru aceste evenimente sportive ci și pentru alte activități, cum ar fi: munca cu bovinele, de asemenea sunt buni pentru dresaj și poat fi buni săritori. Ei mai sunt folosțti pentru echitație și în unitățile montate de poliție (Kentucky Horse Park. , 2008).

Caii Quarter au fost exportați în întreaga lume. Națiunile europene, precum Germania și Italia au importat în număr mare acești cai. Alături de American Quarter Horse Association (care cuprinde și caii Quarter din Canada), al doilea registru ca mărime de cai Quarter este în Brazilia, urmat de cel din Australia (The Canadian Quarter Horse Association). Odată cu internaționalizarea disciplinei de Reining și acceptarea acesteia ca una dintre cele șapte evenimente oficiale ale Jocurilor Mondiale Ecvestre, există un interes internațional tot mai mare pentru rasa Quarter. Țări precum Japonia, Elveția și Israel care nu au avut rase tradiționale de cai au început să concureze cu rasa de cai Quarter pe plan național si internațional.

Rasa de cai Quarter modernă are un cap mic, scurt si rafinat, cu un profil drept, și un corp puternic, bine muscularizat, cu pieptul larg și posterioare puternice și rotunjite. Caii au, de obicei, o inăltime cuprinsă intre 140 cm si 160 cm .

Există două tipuri principale de corp ale rasei: tipul Stock și tipul Hunter. Tipul de cal Stock este scurt, compact, îndesat și musculos, dar agil. Tipul de cai Hunter este mai înalt și cu mușchi mai puțin evidențiați, asemanandu-se mai mult cu rasa Thoroughbred decât tipul Stock.

Culoarea cea mai comună este roșie maronie. Alte culori recunoscute includ negru, maro, gri, roșu închis, roșu dereș și alb (American Quarter Horse Association 2010).

În trecut, modelele cu pete au fost excluse, dar acum datorită testelor ADN pentru verificarea parinților, registrul acceptă toate culorile, atâta timp cât ambii părinți sunt înregistrati ( American Quarter Horse Association, 2008;).

Fig.2. Rasa Quarter ( internet)

Fig. 2. Quarter Horse ( internet)

(http://en.wikipedia.org/wiki/File:Barrel_racing.jpg)

1.3. Rasa Draft

1.3. Draft Horse

Rasa American Cream Draft își trage originile de pe continentul American. Primul cal cunoascut din această rasa fiind Old Granny, aparut la o ferma din Story County, Iowa, în 1911. Un domn pe nume Nelson Bros, din Jewel, Iowa, a fost convins de către un medic veterinar, Eric Christian, sa creeze o noua rasă din acest frumos exemplar. Rasa rezultată ar fi trebuit să aibă o culoare crem, coama și coada albe, pielea rozalie și ochii de culoarea chihlimbarului. Exemplare din rasele Percheron, Grey, Dunn și Sorrel au fost imperecheate cu American Cream Draft, în destul de multe cazuri rezultand culoarea crem dorit(http://www.zooland.ro/American_Cream_Draft-4351.html).

În 1950 erau înregistrate 200 de exemplare de American Cream Draft, dar pe masura ce echipamentele mecanizate preluau tot mai mult din atribuțiile cailor, aceștia au început să dipară încetul cu încetul. În 1982 a fost organizat un comitet in Dubuque, Iowa, pentru reorganizarea înregistrarilor acestor cai și permiterea înregistrării femelelor cu pielea închisă la culoare, doar masculilor urmând să li se mențină obligativitatea existenței pielii de culoare rozalie. Rasa a fost comparata cu alte rase de cabaline și a fost supusă unor teste de sânge pentru identificarea datelor genetice. Rezultatele au demostrat ca American Cream Draft formeaza un grup distinctiv de cai de tracțiune. Din acel moment, rasa a fost înscrisa in randul raselor aflate în pericol de disparitie. Până in 1982 erau inscrise 114 exemplare. American Cream Drafts este o rasa de cai de tracțiune de greutate medie, usor de dresat, cu o dispoziție bună și disponibil la muncă (http://www.zooland.ro/American_Cream_Draft-4351.html).

Fig.3. Rasa Draft ( internet)

Fig.3. Draft Horse ( internet)

https://en.wikipedia.org/wiki/File:MuttAndJeffHorses.jpg

1.4. Rasa Lipițan

1.4. Lipițan Horse

1.4.1. Origine și mod de formare

1.4.1. Breed history and development as a distinct breed

Rasa Lipițană s-a format la herghelia Lipizza (Lipița), situată în mijlocul Platoului Sesana din Muntii Karst (Istria). În Evul Mediu în acest loc exista un cal renumit pentru robustețea sa și pentru rezistența la oboseală. ( SUCIU, 1975).

Herghelia de la Lipizza a fost inființată de austrieci în anul 1580 , pentru a crea acolo un cal nepretențios, rezistent, cu multă energie și eleganță în mișcări. Din nucleul inițial au făcut parte 24 iepe și 6 armăsări de sânge spaniol (din Andaluzia), completat cu iepe locale din rasa Karst și împreună cu armăsari de sânge italian cumpărați din Lombardia, a constituit materialul de bază din care s-a format Lipițanul de mai târziu ( SUCIU, 1975; VELEA, 1976).

În secolul al XVIII-lea, când noul cal era aproape format, s-a recurs la armăsari arabi și danezi, caii de Holstein și de Kladrub, care au contribuit la consolidarea rasei Lipițan ( MUREȘAN, 2005).

1.4.2. Exteriorul, conformația și constituția

1.4.2. Conformation and constitution

Rasa Lipițană se caracterizează printr-o formă corporală dreptunghiulară, având talia de 157-167 cm ( MUREȘAN, 2005).

Capul este uscățiv, cu profil ușor berbecat, urechi mijlocii și foarte mobile, ochi mari și privire vioaie. Gătul musculos și bine prins, obișnuit în formă de ”gât de lebădă”, iar coama abundentă. Linia superioară a trunchiului este marcată de greabăn ușor proeminent și bază largă, spinare lungă, dar corectă, șale scurte și rezistente, crupă musculoasă și puțin oblică, iar coama frumos prinsă. Pieptul larg și musculos, este demarcat de umeri ușor proeminenți și continuat cu torace larg, adânc și spațios; abdomen proporționat și flancuri puțin evidente. Membrele scurte ( mai ales fluierele) și viguroase, sunt musculoase se, dar uscățive, cu articulații largi și tendon bine reliefat, iar copitele mici și rezistente. Culoarea mai frecvent întâlnită este cea vânătă ( ca urmare a utilizării intense a arabului), apoi murgă și mai rar dereșă, roibă și neagră. Conformația de ansamblu este armonioasă și elegantă, constitiuția robustă, temperamentul vioi și caracterul docil. Se utilizează la călărie și la tracțiune ușoară, pe parcursul timpului fiind una dintre rasele foarte apreciate pentru trăsură ( MUREȘAN, 2005).

Este puțin pretențios față de hrană, cu o deosebită rezistență, este blând și cuminte, se dresează ușor, este relativ tardiv, cu mersul înalt și spornic. În alură de galop realizează 1′ 22″/km (pe 2400m), 20-21 km/oră la proba de tracțiune grea (1350 kg tractate pe 10 km) ( MUREȘAN, 2005).

1.4.3. Aria de răspândire

1.4.3. Spread area

Inițial, prin creșterea rasei Lipițan se dorea producerea unui cal de lux pentru trăsături și pentru vestita școală de echitație de la Viena (Spanische Hofreitshule), înființață în anul 1728 ( MUREȘAN, 2005).

În ultimele decenii, la iugoslavi și la români se dorea producerea unui cal mai masiv și mai liniștit, care să se poată utiliza în agricultură și alte activități ( MUREȘAN, 2005).

În prezent, rasa Lipițană este deosebit de prețuită ca animal de călărie și de divertisment, pentru trăsură și de tracțiune ușoară ( MUREȘAN, 2005).

Rasa Lipițană se crește în rasă curată în țările și hergheliile următoare: Austria Piber Cehia Topolcianky, Italia Monte Maggiore, Iugoslavia-Stancic, România-Sâmbăta de Jos, Ugaria-Szilvasvarad, unde este folosită ca rasă amelioratoare pentru populațiile locale din zonele colinare și muntoase ( MUREȘAN, 2005).

În țară noastră, rasa Lipițană pătrunde pentru prima dată în 1809, când herghelia de la Lipizza a fost transferata în localitatea Pecica de lângă Arad și care în 1815 este readusă în vechea herghelie. Din anul 1813, calul Lipițan s-a crescut și în herghelia Mezohegyes din Ungaria, de unde în 1894 rasa este transferată la Sâmbăta de Jos, zonă ce întrunea condițiile apropiate de ale hergheliei în care rasa s-a format. Herghelia de la Sâmbăta de Jos, avea drept scop producerea materialului de reproducție necesar depozitelor de armăsari de la Homord si Sf. Gheorghe, în vederea asigurării cailor necesari armatei și pentru export ( MUREȘAN, 2005).

În prezent, materialul de rasă Lipițană existent și crescut în țară , este considerat de specialiști ca cel mai selecționat și mai reprezentativ din cadrul rasei. În herghelia Sâmbăta de Jos calul Lipițan se crește în rasă curată, cuprinzând 12 armăsari pepinieri, aproape 150 iepe mame de reproducție și tineretul aferent ( în total peste 500 capete), la care se însumează aproximativ 250 armăsari de montă publică cuprinși în depozitele de armăsari. Liniile de Lipițan și ponderea acestora în herghelie sunt următoarele: liniile Favory (19,3%), Maestoso (19,7%), Siglavy-Capriola (17,5%), linia Pluto cu 11,4%, linia Tulipan cu 12,3% , linia Conversano cu 13,3% si linia Napolitano cu o pondere de 6,5% din efectiv ( MUREȘAN, 2005).

Este de remarcat că față de datele din anul 1922 existente în literatură, dimensiunile corporale în prezent sunt mai mari, talia crescând cu 6,3% , lungimea trunchiului cu 5,5% , perimetru toracic cu 4,9%, perimetru fluierului cu 5,3% ș.a.m.d ( MUREȘAN, 2005).

În ce priveste indicii de reproducție, rasa se remarcă prin performanțe mulțumitoare.Fecunditatea medie a fost de 83,63%, natalitatea de 72,61% și avorturile de 10,02%, indici care în ultimii 10 ani subliniază o îmbunătățire evidentă, cu fecunditate medie de 84,7%, natalitate de 81,3% și pierderi prin avort 3,4% (VELEA, 1976)

Tineretul realizează o bună viteză de creștere și dezvoltare, la 3 ani atinge 98% din talia de adult și respectiv 87,46% din masa corporală.

Dresajul și antrenamentul se începe la vârsta de 3,5 ani și se încheie la 4,5 ani ( MUREȘAN , 2005).

Potențialul productiv se exprimă prin rezultatele obținute la probele de calificare care la proba de viteză la trap, înhămare individuală la docar, pe 15km, cu 450 kg greutate tracționată, a realizat o medie cuprinsă între 19,2km/oră și 20,5km/oră, la proba de tracțiune grea, înhămare individuală la căruță, pe 10 km, cu 1000kg tracționată, a realizat între 7,3km/oră și 8,3km/oră, cu recordul de 9,7km/oră (Napolitano XIX-3). La proba suplimentară de călărie la galop, pe 2400m cu 65 kg pe șa, a realizat între 1′15″ și 1′27″/km ( MUREȘAN, 2005).

1.5.4. Perspective de creștere

1.5.4. Prospects for growth

Rasa Lipițană se va crește în rasă curată pe bază de linii și familii, prin selecție se vizează sporirea potențialului energetic și creșterea precocității. Materialul cabalin din această rasă este mult apreciat de crescătorii particulari, fiind solicitat pentru diversele activități desfășurate în agricultură, armată, sport, călărie etc. Prin planul de zonare, rasa Lipițană se prevede a fi utilizată pentru ameliorarea calului autohton din zona de deal și cea submontană din Transilvania, Banat și Oltenia (MUREȘAN, 2005).

Fig.4. Rasa Lipițan (original)

Fig.4. Lipițan Horse (original)

1.6. Rase autohtone de cai

1.6 Indigenous breeds

Calul românesc s-a format de-a lungul timpului, sub influența puternică a factorilor naturali și social economici specifici țării noastre care au determinat apariția mai multor varietăți. Calul românesc își are originea în calul mongol (Equus Prezewalski) și tarpanic (Equus Gmelini), primul a avut o influență mai mare asupra calului din Transilvania, iar ultimul asupra calului Moldova și Dobrogea. Primele tipuri de cai românești, cum sunt: Moldovenesc, Dobrogean, Ialomițan, Transilvanean și de munte, s-au menținut ca varietăți până la începutul secolului al XX-lea. După ce au fost importate și crescute în țara noastră anumite rase culturale create în alte țări, calul autohton a fost supus influenței de ameliorare a acestora, rezultând tipuri noi ( MUREȘAN, 2005).

În cadrul procesului ameliorativ al populațiilor locale de cabaline, încă din anul 1950 s-au inițiat cercetări privind posibilitaea de a forma noi rase de cabaline în condițiile specifice țării. Astfel până în prezent s-au conturat ca rase în devenire următoarele: Calul Semigreu românesc, Calul de sport românesc și Calul de Bucovina ( MUREȘAN, 2005).

1.6.1. Rasa Semigreu românesc

1.6.1 Semigreu Românesc Horses

1.6.1.1. Origine și mod de formare

1.6.1.1 Breed history and development as a distinct breed

Având în vedere capacitatea de aclimatizare redusă a raselor grele de cabaline, din anul 1950 Institutul de Cercetări Zootehnice București a inițiat crearea unui cal semigreu care să fie adaptat condițiilor de la noi, destinat pentru lucrările din agricultură și transporturi. În acest scop, s-au preconizat încrucișări complexe între rasa Ardeneză și iepe Furioso North-Star, Ardenez x Lipițan, Ardenez x Trăpașul românesc, Ardenez x iepe ialomițene x Trăpaș ( MUREȘAN, 2005).

Formarea calului Semigreul românesc a început în hergheliile Rușețu și Bonțida- Jucu, județul Cluj. Efectivul de cai din Semigreul de Transilvania s-a mutat la herghelia Beclean, jud. Bistrița- Năsăud din herghelia Bonțida-Jucu aici, în prezent se crește rasele Furioso North-Star și un nucleu din rasa Lipițan. Schema de formare a rasei Semigreul românesc urmărește obținerea unor produși cu 68,75% sânge din rasa Ardenez și 31,25% sânge din celelalte rase în funcție de tipul urmărit ( MUREȘAN, 2005).

1.6.1.2. Caractere morfofiziologice și aptitudini.

1.6.1.2 Morphophysiological characters and skills

Tipul de cal semigreu mare (Ardenez x Trăpaș și Ardenez x Furioso North-Star) are talie de 156 cm și masa corporală de 560 kg iar tipul mic de semigreu (rezultat din variantele Ardenez x iepe ialomițene x Trăpaș și Ardenez x Lipițan) se caracterizează pritr-o talie de 154 cm și 500 kg masa corporală ( MUREȘAN, 2005).

Caii din rasa Semigreul românesc opținuți până în prezent se caracterizează printr-un exterior dezvoltat armonios și atrăgător. Formatul corporal este dreptunghilar, capul este mare, s-a dezvoltat proporțional cu întregul organism, cu profilul drept, gatul este lung și musculos, bine legat de trunchi, se continuă cu greabăn șters, spinarea și șalele sunt lungi, largi și puternice. Crupa ușor oblică, lungă și largă. Pieptul este larg și musculos, toracele profund și adânc. Membrele sunt puternice, copitele de mărime mijlocie și rezistente. Ca defecte se întâlnesc: genunchi șterși , jarete apropiate ( MUREȘAN, 2005).

Culoarea predominantă este murgă (44%) dar se întâlnesc și alte culori: dereșă, piersicie și robilă, la tipul mare de semigreu. La tipul mic de semigreu, culoarea este tot murgă la varianta din trei rase și vânătă la variant din două rase. Au o constituție robustă însă armonioasă (Fig.5),

(MUREȘAN, 2005).

Sunt destinați pentru lucrări agricole și pentru transporturi în alură de pas și trap. La tracțiune grea, tineretul din diferite categorii de metiși existenți supuși probelor de calificare, tipul Semigreu mare, realizează la proba de tracțiune o viteză de 85 km/oră (1500 kg tractate pe 10 km), iar tipul mic 8,8 km/oră și de 18-19 km/oră la proba de rezistență (500 kg tractate pe distanța de 15 km în alură de trap) ( MUREȘAN, 2005).

Fig. 5. Rasa Semigreu românesc (original)

Fig.5. Semigreu românesc Horse (original)

1.6.1.3. Perspective de creștere

1.6.1.3 Prospects for growth

Pe viitoar se dorește ca acțiunea de ameliorare a Semigreului românesc sa fie consolidată spre consolidarea caracterelor prin creșterea în rasă curată, prin asigurarea condițiilor de hrănire, îngrijire, dresaj și antrenament ( MUREȘAN, 2005).

1.6.2. Calul de Sport Românesc

1.6.2 Romanian Sport Horse

1.6.2.1 Origine și mod de formare

1.6.2.1Breed history and Development as a distinct breed

Calul de Sport Românesc este o rasă în formarea căruia s-a pornit de la posibilitatea asocierii, în acest tip, a diferitelor calități ale raselor participante în proporții diferite, folosindu-se cu pricepere potrivirea perechilor, asociată cu o selecție adecvată și asigurându-se condiții de hrănire, adăpostire, dresaj și antrenament corespunzător. Iepele mame din herghelia Jegălia (jud. Ialomuița) folosite la împerecheri au făcut parte din șase grupe „jumătate sânge” și anume: Anglo Arabă, 1/2 sânge Plevna, 1/2 sânge Furioso North-Star, 1/2 sânge Arab, 1/2 sânge Trăpaș românesc și 1/2 sânge englez. Armăsarii folosiți pentru monta acestor iepe au talie medie de 168 cm, cu limite între 164-170 cm, iar masa corporală medie este de 592 kg. Iepele din cele șase grupe au talia medie de 161 cm, cu limite între 160-162 cm (Fig. 6), ( MUREȘAN, 2005).

Culorile întâlnite sunt: murgă, roibă, vânătă, dereșă și neagră. Calul de Sport Românesc este robust , docil și ușor de dresat.

Exteriorul Calului de Sport Românesc este armonios detzvoltat, dar se întâlnesc și unele defecte, ca: șale lungi, jarete deschise, chișițe moi.etc.

Fecunditatea medie este de 85,8 % iar natalitatea de 79,7%

( MUREȘAN, 2005).

Calul de Sport Românesc are aptitudini reale pentru călărie, cu deosebire pentru sărituri peste obstacole. În proba de viteză și rezistență, alergare plata la galop pe 2400 m; cu 65-75 kg în șa, realizează, în medie, 1’17”/km cu recordul de 1’10”/km ( MUREȘAN, 2005).

Calul de Sport Românesc se numără printre puținele rase de cabaline din țara noastră care sunt în formare ( MUREȘAN, 2005).

Specialiștii au fixat următorii parametrii pentru tipul dorit:

Talie peste 160cm și cu dezvoltarea corporal proporțională

Dezvoltarea aptitudinilor de foarte buni săritori peste obstacole

Viteză mare de dezvoltare la galop

Temperament vioi dar nu exagerat

Fig.6. Calul de sport românesc (original)

Fig.6. Romanian Sport Horse (original)

CAPITOLUL 2

ASPECTE PRIVIND METABOLISMUL GLICOGENULUI ÎN FIBRA GLICOGENULUI

2.1. Date generale

Glicogen sintaza (uridin-difosfat-glucoza=UDP-G) enzima care catalizează sinteza glicogenului, determinând formarea legaturilor α-1,4-gli-cozidice, și implică convertirea glucozei în glicogen.

Glicogen-sintaza formează legături α-glucozidice (-1,4-) între moleculele de glucoză și terminațiile C4 ale lanțurilor ramificate ale glicogenului. Ramificațiile (-1,6-) se produc sub acțiunea enzimei de ramificatie.

S-au facut multe cercetari pe degradarea glicogenului, pentru determinarea funcției și structurii enzimei glicogen fosforilaza, enzima cheie în reglementarea degradării glicogenului (BUCHBINDER, 2001).

Pe de altă parte, mult mai puțin se știe despre structura enzimei glicogen-sintaza, enzima cheie în sinteza glicogenului (BUSCHIAZZO ,2004).

Deși mecanismele catalitice utilizate de glicogen-sintaza nu sunt bine cunoscute, structura similară și mecanismele catalitice a enzimei glicogen sintaza cu ale enzimei glicogen fosforilaza, ne indicâ faptul că mecanismul de sinteză ale enzimei glicogen sintaza este asemănător cu cele ale enzimei glicogen foforilaza (BUCHBINDER, 2001).

Intr-un studiu recent efectuat pe șoareci transgenici, în care a avut loc o activitate în exces a enzimei glicogen sintaza (AZPIAZU, 2000) și a fostfatazei (ASCHENBACH, 2001), în urma ambelor activitați s-a produs o stocare în exces a glicogenului în ficat.

Acest lucru sugereaza faptul că glicogen-sintaza joacă un rol biologic important în reglarea nivelului glicogenului/glucozei și este activată de defosforilare.

La oameni există doua tipuri de izoenzime asemanatoare : Glicogen sintaza 1 și Glicogen sintaza 2.

Expresia enzimei din ficat are loc doar în ficat, în timp ce expresia enzimei glicogen sintaza din mușchi, este larg exprimată și în alte țesuturi.

Glicogenul din ficat servește ca un bazin de stocare pentru a menține nivelul de glucoză din sânge, în timp ce glicogen sintaza din mușchi are rolul de a elimina glucoza din mușchi pană la 90% .

Rolul glicogenului din mușchi este de a furniza energie în timpul activității ( KOLLBERG, 2007).

Mutațiile la nivelul genei GYS1 sunt asociate cu miopatia stocării glicogenului.

Aceste mutații din gena GYS1 mai pot fi asociate cu diabetul zaharat și hiperglicemia (SALTIEL, 2001).

2.2. Glicogenogeneza –Glicogenoliza

Glicogenul (Gn) este o formă polimerizată de stocare a glucozei, cu o masă moleculară mare, ușor (rapid) mobilizabilă la nevoie. Structura sa ramificată este similară cu cea a amilopectinei. Ficatul poate depozita glicogen pana la 7-10% din masa sa (maximum 150g), aceasta fiind principala sursă pentru menținerea glicemiei în perioadele interprandiale.

Mușchiul poate depozita glicogen doar în proportie de 0,7-1,2% din masa sa în total aproximativ 300-400g, acesta fiind utilizat pe plan local pentru sinteza de ATP. Glicogenul hepatic prezintă variații circadiene : este maxim după masa de seară și minim înainte de micul dejun: dupa 14-16 ore de privare alimentară, depozitele hepatice de glicogen se epuizează.

În timpul somnului nocturn (de mai lungă durată) sursa menținerii glicemiei virează dinspre glicogenoliză spre gluconeogeneză, process esențial pentru menținerea glicemiei în perioadele prelungite de înfometare (DOBREANU, 2010).

Este necesar ca glicogenul să fie ramificat (tip “amilopectinic”) deoarece în forma aceasta are un singur capăt reducător (-OH glicozidic C1) și o mulțime de capete nereductoare (-OH neglicozidice C4) care sunt de fapt locul de acțiune al Glicozil fosforilazei si Glicozin sintazei.

Dacă structura glicogenului ar fi de tip “amiloză” (neramificata) cu un singur capăt C1 și unul C4, descompunerea și sinteza glicogenului ar fi foarte lente (DOBREANU, 2010).

În organism, glucoza întră și în căi metabolice multiple. În hepatocite și în fibrele musculare (mai modest în alte celule), glucoza activată (transformata în uridin-difosfat-glucoza= UDP-G), se depozitează sub formă de glicogen, printr-o secvență de reacții, numită glicogenogeneza (DOBREANU, 2010).

Glicogen sintaza (uridin-difosfat-glucoza =UDP-G) enzima care catalizează sinteza glicogenului, determinând formarea legaturilor α-1,4-gli-cozidice, și implică convertirea glucozei în glicogen (DOBREANU, 2010).

2.2.1. Glicogenogeneza

Are loc predominant la nivel hepatic sau muscular, imediat postprandial când concentrația glucozei sanguine crește foarte mult (DOBREANU, 2010).

GLUT 4 transportă glucoza în miocit, iar GLUT 2 in interiorul hepatocitului, hexokinaza și glucokinaza fosforilează glucoza, menținand-o astfel în interiorul celulei ( fosforilarea moleculei de glucoză modifică major solubilitatea acesteia în membranele celulare, în sensul scăderii acesteia)

G +ATP HK/GK G-6-P +ADP

G-6-P PG-mutaza G-1-P

G-1-P + UTP G-1—P URIDIN TRANSFERAZA UDP-G+PPi

Gn+ UDP-G Glicogen sintaza G n+1 + UDP

Glicogen sintaza necesită un primer pentru a-și începe activitatea (glucoza este o moleculă simplă, care nu poate funcționa ca primer).

Glicogenina este o proteină care îndeplinește rolul de primer: prin glicolizarea cu UDP-glucoza a unui rest de tirozină, se formează glicogenina glicolizată, care devine un nucleu de sinteză a glicogenului (DOBREANU, 2010).

Reglarea glicogenogenezei se poate realiza prin trei modalități : modificări covalente, mecanisme alosterice si reglare hormonală. Formele active ale enzimelor glicogenogenezei sunt formele defosforilate. (DOBREANU, 2010).

2.2.2 Glicogenoliza

Este procesul ce are loc între mesele principale și are drept scop mobilizarea glucozei depozitată în perioadele de abundență energetică (postprandial) în glicogen, cu rolul de a menține glicemia și de a asigura țesuturilor consumatoare subtratul energetic (DOBREANU, 2010).

Șirul de reacții care au loc:

Gn +Pi Fosforilaza Gn-1 + G-1-P

G-1-P PG -mutaza G-6-P

G-6-P G-6-P fosfataza G+P1

Enzima cheie a glicogenolizei este fosforilaza, care eliberează succesiv din catenele glicogenului câte o moleculă de glucoză fosforilată (glucoza-6-fosfat). După izomerizarea enzimatică în glucoza-6-fosfat, acest produs poate să urmeze căile metabolice de descompunere anaeroba sau aeroba a glucozei ( în mușchi, G-6-P trece direct în calea glicolitică și produce ATP), iar pe de altă parte desfosforilarea lui de către glucoza-6-fosfat fosfataza, duce la eliberarea glucozei din hepatocite cu GLUT 2 , cu rol important în menținerea glicemiei (DOBREANU, 2010).

Glicogen fosforilaza acționeaza doar asupra legaturilor α 1-4 glicozidice, activitatea ei încetand la distanta de 4 resturi glucidice de legătura 1-6 glicozidică (DOBREANU, 2010).

Reglarea glicogenolizei se poate realiza prin trei modalitați: modificări covalente, mecanisme alosterice și reglare hormonală.

Formele active ale enzimelor glicogenolizei sunt formele fosforilate. (DOBREANU, 2010).

CAPITOLUL 3

ASPECTE PRIVIND BOALA

MIOPATIA STOCĂRII POLIZAHARIDELOR (MSP) LA CABALINE

3.1. Date generale

Caii au fost domesticiți în urma cu 1000 de ani și rasele moderne au fost obținute prin selecția mai multor trăsaturi: sportive, fizice, comportamentale etc. La cai ca și la alte specii de animale, la liniile din cadrul raselor se dorește păstrarea caracterelor pozitive, dar nu se pot exclude în totalitate caracterele nedorite (VALBERG, 1999;  FIRSHMAN, 2005).

Rabdomioliza de efort (RE) este un sindrom caracterizat prin contractură musculară, durere și disfuncție locomotorie de intensitate variabilă, apărute consecutiv efortului muscular. Deși a fost semnalat cu peste 100 de ani in urmă, deocamdată nu există unanimitate in privinta terminologiei.

Din punct de vedere evolutiv sindromul se împarte în două forme majore: forma sporadica și forma cronica.

Forma sporadica a rabdomiolizei de efort se caracterizeaza prin apariția unor episoade unice sau foarte rare de necroză musculara asociate cu efortul. Ît timp ce forma cronică presupune episoade recurente de rabdomioliză. In forma sporadică rabdomioliza este urmarea unei disfunctii musculare temporare induse de factori extemi. Formele cronice ale RE sunt consecinta unor disfunctii intrinseci ale fibrelor musculare striate, determinate de defecte genetice mostenite, dintre care unele au fost identificate. iar altele sunt doar banuite. Deocamdată în forma cronica a rabdomiolizei de efort sunt incluse doud entitati morbide distincte, respectiv miopatia de stocare a polizaharidelor (MSP) si rabdomioliza recurenta de efort (RRE)).

Formele cronice ale rabdomiolizei de efort sunt declanșate de interactiunea dintre anumiti factori de mediu ți un defect genetic care afecteaza functia musculaturii scheletice.

Miopatia de stocare a polizaharidelor (PSSM) este o glicogenoză caracterizată prin acumularea excesivă a glicogenului și a unui polizaharid cu structură anormală (rezistent la digestia cu amilază) în fibrele musculare scheletice. Afecțiunea a fost descrisă inițial în Statele Unite ale Americii, la caii din rasele Quarter, American Paint, precum și la metișii acestora (MC.CUE, 2008)

La caii cu miopatie de stocare a polizaharidelor se constata, pe de o parte, sensibilitate crescută a fibrei musculare scheletice la actiunea insulinei, iar pe de alta parte, creșterea activitàtii glicogen sintetazei, determinată de o mutatie punctiforma de tip G/A din gena GYS1 care codificà sinteza acestei enzime. Ca urmare, se produce un influx crescut de glucoză în fibra musculara asociat cu intensificarea sintezei de glicogen, care va conduce la acumularea excesivă a glicogenului muscular. Polizaharidul acumulat in fibrele musculare la caii cu MSP are o structură mai putin ramificată decât cea a glicogenului normal, fapt ce-1 face rezistent la digestia cu amilaza. Formarea polizaharidului mai putin ramificat pare să fie legată de activarea mai intensa a activitàtii glicogen sintetazei, care nu este însoțită de o creștere paralelă a activității en,inzei de ramificare alicogenului.

Caii hrăniti cu rații ce includ o cantitate crescută de concentrate sunt mai frecvent afectati de RE decât cei hrăniti cu diete sărace in hidrati de carbon ușor solubili. La caii cu MSP, cantitatea mare de concentrate din rație conduce la creșterea depozitelor de glicogen din fibra musculară, cu atât mai mult cu cât excesul de concentrate se asociază cu o perioadă, fie și numai de 2-3 zile, de inactivitate.

3.2. Semnele fenotipice și clinice manifestate de caii afectați de miopatia stocării polizaharidelor.

Rezultatele clinice compatibile cu PSSM au fost raportate la începutul anilor 1900, la rasele de tracțiune Draft, care au dezvoltat rabdomioliză după efort ( CARLSTROM, 1932).

Cu toate acestea PSSM nu a fost recunoscută ca o glicogenoză a mușchilor scheletici pană in 1992. Astazi pană la 36% cai din rasa Draft și 10% cai din rasa Quarter manifestă miopatia stocării polizaharidelor (MC.CUE, 2007).

În formele cronice ale sindromului de rabdiomioliza semnele clinice se instaleaza la scurt timp dupa debutul efortului fizic (frecvent, in mai putin de 20 de minute), chiar daca acesta este de intensitate slaba (plimbare la pas, incalzire). In mod particular semnele clinice apar mai frecvent la caii care, înainte de a fi supuși la efort fizic, au fost lasați în repaus pentru câteva zile și au fost hrăniți cu rații bogate concentrate. Miopatia de stocare a polizaharidelor se caracterizeaza prin apariția repetată a episoadelor de rabdomioliză, care pot să varieze foarte mult ca frecvență și gravitate. Se descriu forme asimptomatice, în care se constantă doar reducerea performanțelor fizice ale cailor și creșterea activității serice a enzimelor care trădează alterarea permeabilității de membrană a miocotelor.

Formele ușoare ale evoluției se exprimă clinic prin mers înțepenit, redoare musculară și mioglobinuire de intensitate slabă. Formele de gravitate medie se manifestă prin contractură musculară, însoțită de durere de intensitate variabilă, exteriorizată prin mers înțepenit, ezitant, refuzul animalului de a se mișca, transpirație abundentă, creșterea frecvenței cardiatice și respiratorii. La caii de tracțiune diagnosticați cu miopatie de stocare a polizaharidelor dificultățile locomotorii sunt exprimate mai frecvent prin flexarea exagerată a membrelor, lărgrirea bazei de sustinere pe membrele pelvine, asociate cu fasciculatii și tremurături musculare. De asemenea, se pot constata semne de slăbiciune musculară, asociate cu pierdere de masă musculară, în special în regiunea crupei a coapsei, care conduc la intoleranța la efort și chiar la ridicarea dificilă a animalelor din decubit.

Deși MSP era recunoscută clinic, metabolismul acestei boli a rămas un mister timp de peste o sută de ani (MC.CUE, 2008).

Fig.7. Diverse semne fenotipice și clinice a cailor afectați de miopatia stocării polizaharidelor. (internet).

Fig.7. Diversity of phenotypes and clinical signs of horses affected with PSSM (internet).

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2430182/figure/F1/)

3.3.Examenul patologic

Diagnosticul

În general, tabloul umoral este dominant de creșterea semnificative a enzimelor care sunt bine reprezentate în celulele din musculatura striată. Astfel, activitatea serictă a creatinfosfokunazei (CPK), aspartat aminotransferazei (AST) si lactat dehidrogenazei (LDH) inregistreazà creșteri a căror ansplitudine este dependentà de severitatea leziunilor musculare și de timpul scurs de la instalarea rabdomiolizei. Uneori, la caii apartinând raselor cu sânge cald precum si la caii de tractiune cu MSP, activitatea sericâ a CPK și a AST se incadrează în limite fíziologice sau înregistrează creșteri de mică amplitudine.

In formele grave de evoluție, la examenul sângelui se mai poate constata creșterea hematocritului a proteinelor totale consecutiv hemoconcentratiei, hiperkalemie, hiponatremie. hipocloremie si hiperazotemie, iar la examenul urinei se identifică prezenta mioglobinuriei.

La examenul necropsic se constată prezenta unor zone decolorate, palide, sub formà de striuri sau pete de culoare cenusie sau cu aspect de “carne fiartă" localizate îndeosebi în musculatura membrelor pelvine. Leziunile se intâlnesc mai frecvent in muschii gluteu, semitendinos, semimembranos. biceps și cvadriceps femural. Histopatologic, in zonele musculare afectate se pun în evidență leziuni de miodistrofie de tip Zenker, edem intermiofibrilar și infiltrare redusă cu celule inflamatorii.

În formele cronice ale rabdomiolizei de efort diagnosticul pozitiv are în vedederere caracterul recidivant al semnelor clinice, momentul aparitiei acestora respectiv la scurt timp de la debutul efortului fizic, cresterea activitatii serice a enzimelor cu specíficitate pentru musculatura striată si modifícarile histologice identificate in probele de mușchi recoltate prin biopsie. În miopatia de stocare a polizaharidelor, prin tehnici histochimice, se pot evidentia incluzii polizaharidice PAS pozitive, amilazo-rezistente.

Fig.8 Microfotografia mușchiului semitendinos ( internet)

Fig.8 Photomicrograph of skeletal muscle ( internet)

plan a) Sectiune transversala a muschiului semitendinos a unui cal sanatos.

plan b) Sectiune transversala a muschiului semitendinos a unui cal cu PSSM, care prezinte cristale de polizaharide anormale in mai multe fibre.

Panel a) Periodic acid Schiff’s (PAS) staining of cross-section of semitendinosus muscle from a normal horse demonstrating the presence of normal glycogen.

Panel b) PAS staining of the same muscle from a horse with PSSM showing crystalline PAS positive inclusions of abnormal polysaccharide in multiple fibers.

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2430182/figure/F2/)

3.4. Aspecte genetice privind miopatia de stocare a polizaharidelor

De și la rasele de cabaline crescute în România simptomele asociate miopatiei sunt prezente dar cu toate acestea studii genetice nu au fost realizate până în prezent.

Astfel au inceput sa se faca si studii genetice

În genomul ecvinelor a fost identificată o mutație în gena GYS1, care codifică enzima glicogen sintaza, care se exprimă în musculatură scheletică, responsabilă pentru miopatia mușchilor scheletici. Prin analiza secvenței de ADN, s-a constatat că această mutație constă în substituția unei arginine cu a unei histidine (MC.CUE, 2008).

Astfel, este mult mai probabil ca acumularea de glicogen în mușchii cailor cu MSP este cauzată de mutația Arg309His și rezultă din creșterea sau scăderea activității enzimei mutante (MC.CUE, 2008).

Pană în prezent, nu s-a identificat nici o altă mutatie funcțională în gena GYS1, care să provoace miopatia stocării glicogenului la orice specie de mamifere (MC.CUE, 2008).

Mutația din gena GYS1, care provoacă miopatia stocării polizaharidelor, conduce la o activitate crescută a glicogen sintazei în muschii scheletici, care duce la apariția unei forme noi de stocare a glicogenului în exces (MC.CUE, 2008).

Ar putea fi util să se examineze GYS1 ca o gena candidat pentru posibila asociere cu miopatia stocării glicogenului la oameni (KOLLBERG ,2007).

3.4.1. Analiza întregului genom ecvin

Au fost studiați 105 markeri microsateliți de la nivelul fiecarui cromozom și s-au comparat genotipurile cailor ce manifestau boala cu genotipurile cailor sănătoși (MC.CUE, 2008).

S-au utilizat 48 de probe care proveneau de la caii cu MSP și 48 de probe care proveneau de la caii sănătosi, din rasa Quarter. Cei 48 de cai din rasa Quarter cu MSP au fost selectați pe parcursul a șapte generații având un strămoș comun și prin urmare au moștenit segmente cromozomiale similare, crescând în acest fel șansa identificării regiunii din genom asociata cu boala PSSM (MC.CUE, 2008).

În urma efectuarii testului Chi pătrat ( χ²) s-a constat o asociere seminficativă între anumite regiuni cromozomiale purtatoare de mutații cu prezența sau absența bolii. Astfel folosind markerul NVEQ018, distribuția sa alelică a indicat că 23 din 48 de cai afectați au alela mutantă defectivă, care este practic absentă la caii sănatosi ( doar 2/48). Pe un segment cromozomial de 10 Mb din cromozomul 10 cabalin ( ECA10p) au fost identificați 8 markeri, care au fost asociați cu PSSM (MC.CUE, 2008).

Pentru a exclude erorile posibile privind asocierea dintre posibila mutație și prezența bolii, erori puteau fi cauzate de gradul mare de înrudire a indiviziilor din populația analizată, au fost selectionați indivizi neînrudiți dintr-o alta populatie, în vederea validării acestor asocieri. Astfel au fost genotipizați 52 de indivizi care manifestau boala și 44 de indivizi sănătoși din rasa Quarter (MC.CUE, 2008).

Folosind alți doi markeri ( CORO15 si SCGV030) s-au obținut de asemenea asocieri semnificative cu PSSM. Comparând harta genomului de la cal cu cea a genomului uman s-a constatat că regiunea ECA10p (CORO15 și SCGV030) este omoloagă cu o regiune a cromozomului uman 19 (HSA) dintre pozițiile 51.9-54.6 Mb (CANDICE, 2005). S-a constatat că dintre toate genele aflate în această regiune a cromozomului HSA19, doar gena GYS1 este implicată în metabolismul glucidic. Gena GYS1 codifică enzima glicogen sintetaza (GS) care se exprimă în muschii scheletici dar nu se exprimă în ficat (ROACH, 2002)

Glicogen sintaza este o enzima care catalizează sinteza glicogenului în muschi, mediind formarea legaturilor α1,4-glicozidice ce implică convertirea glucozei în glicogen  (MC GRANE, 2000; SKURAT,1996).

3.4.2. Identificarea mutației din gena GYS1 responsabilă de PSSM

Regiunea codificatoarea a genei GYS1 care codifică enzima glicogen sintaza și regiunile netraduse (5’și 3’ UTR) au fost amplificate și secvențiate din probe de ADN, respectiv din ADN complementar, obținut prin reverstranscripția ARNm extras din mușchii scheletici (MC.CUE, 2008).

Din grupul de indivizi ce au prezentat boala a fost selectat pentru secvențierea genei GYS1 un individ homozigot la locii COR015 și SCGV030 care au indicat posibila prezență a mutației căutate. Din grupul de indivizi sănătoși a fost ales în mod randomizat pentru secvențierea genei GYS1 un individ. În urma analizei secvențelor s-a identificat în exonul 6 al genei GYS1 un polimorfism simplu de tip G/A cea ce are ca efect substituția în proteină a unei arginine, prezentă la caii sanătoși în poziția 309 (codificată de codonul CGT) cu o histidină (codificată de codonul CAT) prezentă la caii cu PSSM (MC.CUE, 2008). Analiza secventiei exonului 6 al genei GYS1 obținută din ADN-ul genomic a evidențiat că din cei 6 cai afectati de PSSM, 2 au fost homozigoti (pentru histidina din pozitia 309) și 4 au fost heterozigoți. Cei 6 cai cu genotipurile normale au fost toți homozigoți pentru alela normală ce codifica arginina in pozitia 309(MC.CUE, 2008).

Intreaga secvență de ADN a genei GYS1 a fost asamblată din baza de date NCBI. Secvența genei GYS1 a fost folosită pentru a produce primeri folosiți în reacția de amplificare PCR și la secvențiere (MC.CUE, 2008).

3.4.3 Genotipizarea indivizilor din rasa Quarter și stabilirea frecventei mutației în populație.

Polimorfismul la locusul GYS1 (atat la caii cu MSP cât și la caii sănătoși) a fost studiat prin tehnica PCR-RFLP (MC.CUE, 2008).

Fragmentul de 230 pb (exonul 6 și secvențele intronice adiacente) au fost amplificate prin PCR (un primer sens și unul antisens 5’TGA AAC ATG GGA CCT TCT CC / 5’AGC TGT CCC CTC CCT TAG AC) ((MC.CUE, 2008).

Caii cu genotip normal (fară substituția G/A) prezintă un singur situs de restricție pentru enzima HpyCH4V. Indivizii care au polimorfism pentru subtituția G/A prezintă 2 situsuri de restricție. Fragmentele obținute au fost migrate în electroforeză într-un gel de agaroza 3%.

Pentru acest studiu s-au selectat un număr de 99 de cai din rasa Quarter cu PSSM. La acești indivizi s-au efectuat o analiză a întregului genom, pentru a identifica mutația de la nivelul genei GYS1 și asocierea ei cu miopatia stocării polizaharidelor (MC.CUE, 2008). Din cei 99 de indivizi, 72 au fost homozigoți la alela H (mutantă) și 5 au fost heterozigoți la alela H (mutantă), surprinzător 22 din caii cu PSSM au fost homozigoți la alela R (normală).

După care s-a selectat un număr de 92 de cai din rasa Quarter sănătoși, la fel și la acești indivizi au efectuat o analiză a întregului genom. Din cei 92 de cai sănătoși, 88 au fost homozigoți la alela normală R și 4 din ei au fost heterozigoți pentru alela H (mutantă). Pe baza acestor genotipuri, proporția genotipului homozigot (HH) este 1.0% iar a genotipului heterozigot RH este de 0,9%( MC.CUE, 2007).

Astfel s-a asociat alela H (mutantă) cu miopatia stocării polizaharidelor (MC.CUE, 2008).

Indivizii care au MSP și care nu au alela H sugerază fie că nu substituția G cu A cauzează mutația, sau caii afectați de MSP nu se manifestă fenotipic fară substituția G cu A (MC.CUE, 2008).

Dacă se face o secvențiere la nivelul regiunii exonului 1 a genei GYS1 nu se detectează nici o diferența între caii cu MSP și caii sănătoși.

Folosind aceeași markeri microsateliți se exclude că mutația GYS1 să fie cauza acumulării anormale a polizaharidelor la genotipurile homozigote RR care manifestă boala. (rasa de cai Quarter) și indică faptul ca mai există o a doua mutație în gena GYS1 care de asemenea produce rabdomioliză și MSP la caii din rasa Quarter (MC.CUE, 2008).

La Universitatea din Minnesota în Laboratorul de diagnosticare neuromusculară au fost verificate biopsiile musculare dintre anii 1997 -2007.

In baza de date au fost identificați 812 cai ce manifestau miopatia stocării polizaharidelor, care făceau parte din 35 de rase.

Din cei 812 indivizi la 712 s-au gasit probe de sânge integral sau țesut care au fost folosite pentru izolarea ADN-ului si genotipizarea pentru mutația din gena GYS1 (MC.CUE, 2008).

ADN-ul genomic a fost izolat din probele de sânge , folosindu-se kituri de purificare a ADN-ului (Gentra, Minneapolis, MN), în conformitate cu protocolul propus de producator (MC.CUE, 2008).

Atunci când sângele nu a fost disponibil, ADN-ul genomic a fost izolat din biopsii musculare (congelate sau formalizate) folosind kitul de extractie DNeasy Tissue ( Qiagen, Valencia, CA) în conformitate cu protocolul propus de producator (MC.CUE, 2008).

Polimorfismul la locusul GYS1 a fiecarui cal a fost studiat prin tehnica PCR-RFLP (MC.CUE, 2008).

Alela His309 a fost găsită atât sub forma homozigotă cât și heterozigotă la 350 de cai (MC.CUE, 2008).