1.1. ACIZII NUCLEICI. STRUCTURĂ CHIMICĂ ȘI ACTIVITATE BIOLOGICĂ Investigarea structurii și activității biologice a acizilor nucleici prezintă o… [301532]

CAPITOLUL I

1.1. ACIZII NUCLEICI. STRUCTURĂ CHIMICĂ ȘI ACTIVITATE BIOLOGICĂ

Investigarea structurii și activității biologice a acizilor nucleici prezintă o [anonimizat], proteomică sau biotehnologii.

Aceste molecule poartă informația genetică necesară transmiterii caracterelor de la o [anonimizat].

[anonimizat], fiind descoperiți pentru prima dată în anul 1871 de către Friedrich Miescher. Studierea acizilor nucleici a constituit de-a lungul timpului o parte importantă a [anonimizat].

[anonimizat], care se găsesc în proporții diferite în celule. Astfel, în celula bacteriei E. coli proporția ADN este de 1%, iar cea a ARN este de 6% (Tabelul 1.1).

Tabelul 1.1. Componentele moleculare ale unei celule E. coli

dupa Watson JD: Molecular Biology of the Gene, 2nd ed., Philadelphia,

PA: Saunders, 1972

1.1.1. ORGANIZAREA MOLECULARĂ A [anonimizat].

Acidul dezoxiribonucleic (ADN) – [anonimizat], dar și în mitocondrii și cloroplaste.

Acizii ribonucleici (ARN) se diferențiază în funcție de rolul pe care îl îndeplinesc în celulă. Astfel, acidul ribonucleic mesager (ARNm) transportă informația de la ADN la ribosomi și servește ca matriță pentru sinteza proteinelor. Alte două tipuri de ARN: ARN ribosomal (ARNr) și ARN de transfer (ARNt) sunt implicate în sinteza proteinelor. [anonimizat] (Tabel 1.1).

Moleculele ARN citoplasmatic de dimensiuni mici (scRNA – “Small cytoplasmatic RNAs”) intră în alcătuirea particulei de recunoaștere a semnalului (SRP – signal recognition particle) și au implicații în procesul de procesarare a ARNt.

Moleculele ARN nuclear de dimensiuni mici (snRNA – “Small nuclear RNAs”) sunt implicate în procesul de eliminare a intronilor în timpul prelucrării și maturării moleculelor de ARNm. [anonimizat] (Sn RNPs – “Ribonucleoprotein particles”).

Moleculele ARN nucleolar de dimensiuni reduse (snoARN- “Small nucleolar RNAs”) [anonimizat].

[anonimizat] (miRNAs – “Micro RNAs”) [anonimizat], fiind implicate în reglarea expresiei genelor. Aceste molecule au capacitatea de a se lega la ARNm prevenind desfășurarea procesului de sinteză a proteinelor.

Moleculele siARN (siRNA – “Small interfering RNA“) [anonimizat]. Aceste molecule au capacitatea de a [anonimizat] (la fel ca miARN) sinteza anumitor proteine.

[anonimizat]ide fosforilate.

Din punct de vedere chimic, ADN este o polinucleotidă, adică un compus în structura căruia se repetă un set limitat de macromolecule numite nucleotide.

Tabel 1.1. Tipurile de ARN și funcțiile îndeplinite

Nucleotida ca unitate de bază a acizilor nucleici este o macromoleculă organică compusă din:

O glucidă, mai exact o monozaharidă, de tipul pentoză;

O bază azotată heterociclică, cu un număr de 6 atomi de tipul pirimidinei sau o variantă a acesteia condensată cu inelul imidazolic numită purină;

un rest de acid fosforic, adică o "grupare fosfat ".

Pentozele care intră în structura acizilor nucleici sunt 2-dezoxi-riboză pentru ADN sau riboză, pentru ARN (Fig. 1.1). În cazul moleculei de 2’ – dezoxi-riboză, gruparea OH din poziția 2’ este înlocuită de un atom de hidrogen.

Fig. 1.1 Structura monozaharidelor care intră în alcătuirea

acizilor nucleici

Dintre bazele heterociclice azotate ale ADN, două sunt purinice, adenina și guanina, iar alte două sunt pirimidinice, citozina și timina. În ARN, uracilul înlocuiește timina (Fig. 1.2).

Fig. 1.2 Structura bazelor azotate care intră în alcătuirea

acizilor nucleici

Bazele azotate se leagă în poziția 1 la 2’- dezoxi-riboză în ADN sau la riboză în ARN, pentru a forma nucleozide. Nucleotidele conțin în plus una sau mai multe grupări fosfat legate la atomul de carbon 5’ al nucleozidului.

Polimerizarea nucleotidelor pentru constituirea acizilor nucleici implică formarea legăturilor fosfodiesterice între fosfatul 5’ al unui nucleotid și hidroxilul 3’ al altui nucleotid.

Oligonucleotidele sunt polimeri care conțin câteva nucleotide, pe când polinucleotidele mari ca ARN și ADN conțin mii sau milioane de nucleotide. Un lanț polinucleotidic are o anumită direcție: o extremitate a lanțului se termină cu o grupare 5’ fosfat, iar cealaltă extremitate se termină cu o grupare 3’ hidroxil. Polinucleotidele sunt întotdeauna sintetizate în direcția 5’- 3’, un nucleotid liber fiind adăugat la gruparea 3’-OH a unui lanț în creștere (Fig. 1.3).

Informația stocată în ADN și ARN este transmisă prin aranjamentul bazelor azotate din lanțul polinucleotidic.

ADN este o moleculă dublu elicoidală, alcătuită din două lanțuri polinucleotidice în care bazele azotate sunt dispuse în interiorul macromoleculei; cele două lanțuri sunt unite prin legături de hidrogen care se stabilesc între perechile de baze complementare: adenina cu timina și citozina cu guanina („regula Watson Crick”) (Fig. 1.4).

De o deosebită importanță pentru procesele care au loc ”in vivo” (replicarea, repararea leziunilor, transcripția), dar și pentru dezvoltarea tehnicilor de investigație asupra acizilor nucleici este atât legea complementarității bazelor, cât și numărul legăturilor de hidrogen care se stabilesc între bazele azotate – două între adenină și timină și trei între guanină și citozină (Fig. 1.5). Legăturile spațiale care se stabilesc între bazele azotate timină-adenină și citozină – guanină determină dispunerea în sensuri opuse a celor două catene fiind orientate antiparalel.

î

Deci, cele două catene ale moleculei ADN formează o spirală dublu helicoidală, orientată spre dreapta, având un diametru de 2nm. Structurile celor două catene, rezultate din alternarea ribozelor și a grupărilor fosfodiesterice sunt răsucite în jurul axului ca balustrada unei scări, iar perechile de baze azotate reprezintă treptele acesteia. În configurația spațială a moleculei de ADN

fiecare spiră a elicei este alcătuită dintr-un fragment de 10,4 perechi de nucleotide, cu o distanță între două subunități adiacente de 3,4nm. Se generează două șanțuri laterale – unul cu dimensiunea de 12Å și cele de-al doilea de 24 Å, care au un rol important în recunoșterea și fixarea acelor tipuri de proteine cu care interacționează molecula de ADN.

Această structură helicoidală este considerată un simbol al lumii vii, fiind asociată cu funcțiile metabolice pe care le îndeplinesc acizii nucleici.

Consecința acestei complementarități este că un lanț polinucleotidic al ADN sau ARN poate acționa ca matriță pentru sinteza unui lanț complementar. Acizii nucleici sunt singurele molecule care sunt capabile să-și direcționeze propria autoreplicare. Informația transportată de către ADN și ARN determină sinteza proteinelor specifice, care controlează activitățile celulare.

În biologia moleculară dimensiunea fragmentelor de ADN poate fi evaluată în unități de masă sau de lungime. În mod convențional, pentru lungimea fragmentelor ADN se folodește termenul de perechi de baze (“base pairs”) cu prescurtarea bp sau kb („kilo base pairs”).

1.1.2. ORGANIZAREA SUPRAMOLECULARĂ A MOLECULEI ADN

În cazul celulelor eucariote dublul helix ADN este supus unui proces de condensare, datorită interacțiunii biochimice cu alte molecule cum ar fi histonele și proteinele reglatoare. Gradul de condensare este asociat cu etapa din ciclul celular în care se află celula la un moment dat.

Ciclul de viață al fiecărei celule este alcătuit din două etape importante și anume interfaza și diviziunea celulară. În continuare sunt prezentate cîteva aspecte ale ciclului celular legate de aspectele genetice.

Interfaza este alcătuită din faza G1 sau presintetică, faza S sau sintetică și faza G2 sau postsintetică. În faza G1 cantitatea de ADN corespunde unor cromosomi monocromatidici despiralizați, alcătuiți dintr-o moleculă ADN dublu catenară. În faza S sau sintetică are loc replicarea ADN nuclear astfel încât la sfârșitul ei cantitatea de ADN este dublată. Deci, la inițierea sintezei ADN, celula se află în condiții de diploidie (2n), la sfârșit ajungând în condiții de tetraploidie (4n). În faza G2 cantitatea de ADN corespunde unor cromosomi bicromatidici despiralizați, fiecare cromatidă fiind alcătuită dintr-o moleculă ADN dublu catenară. Cea de-a doua etapă a ciclului celular o reprezintă diviziunea celulară sau mitoza. La începutul mitoyei cromozomii bicromatidici se condensează, fiind vizibili la microscopul optic.

Primul nivel de organizare supramoleculară a moleculei ADN îl reprezintă filamentul cu nucleozomi, cu un diametru de 10 nm, denumit cromatină.

Nucleozomii sunt structuri sferice, alcătuite din 8 molecule de histone. Histonele sunt proteine bazice, care poartă grupări încărcate pozitiv datorită aminoacizilor lizină și arginină. Atât arginina cât și lizina au câte o grupare laterală amino, care poate să atragă protoni, devenind astfel grupări încărcate pozitiv ( ~~ NH2 + H+ → ~~ NH3+). Aceasta încărcare pozitivă a histonelor permite atașarea la grupările fosfat negative care intră în alcătuirea moleculei ADN. Familiile de histone sunt de tip H1, H2A, H2B, H3 și H4, fiecare cuprinzând un număr de subfamilii.

Centrul nucleozomului sau miezul proteic îl reprezintă un octamer care cuprinde un tetramer alcătuit din proteinele H3 și H4 (doi dimeri H3-H4) și doi dimeri H2A-H2B.

În jurul fiecărui miez proteic este înfășurat un fragment ADN cu o lungime de 147 bp sub forma a două spire. Doi nucleozomi vecini sunt uniți prin intermediul unor fragmente ADN cu lungimea de 20-60 bp, denumite ADN de legătură (ADN linker).

Structura de „mărgele pe sfoară” este menținută și de moleculele de histone H1, care reprezintă o punte între doi nucleozomi adiacenți, fiind localizate în afara nucleozomului, lângă ADN linker și interacționând cu subunitatea H2A a miezului nucleozomic (Fig. 1.6). Aspectul de „mărgele înșirate pe sfoară” a fost confirmat și prin microscopie electronică.

Fig. 1.6. Structura filamentului cu nucleozomi, care generează imaginea de „mărgele pe sfoară” a cromatinei

Legarea histonelor la ADN nu depinde de o anumită secvență a nucleotidelor, dar depinde de secvența de aminoacizi a histonelor. Acestea se fixează în șanțul mic al moleculei de ADN, contribuind la procesul de împachetare. În anumite etape ale ciclului celular are loc modificarea chimică prin metilare, fosforilare sau acetilare a numeroase situsuri în special ale histonelor H3 și H4, ceea ce conduce la modificarea interacțiunilor cu molecula de ADN. Astfel se modifică accesul proteinelor (în special factori de transcripție) la molecula de ADN.

Pe lângă histone, cromatina mai conține o cantitate mică dintr-o gamă largă de proteine non-histonice. Majoritatea acestora este reprezentată de factori de transcripție, care se atasează în șanțul mare al moleculei de ADN, în special în porțiunile reprezentate de promotori.

Histonele sunt unele dintre cele mai bine conservate molecule în cursul evoluției. Astfel, histona H4 la bovine diferă numai prin doi aminoacizi dintr-un total de 102, de histona echivalentă de la mazăre. Se poate spune că secvența aminoacizilor din histona H4 a rămas aproape constantă în 2 miliarde de ani de când, din punctul de vedere al evoluției plantele s-au diferențiat de animale. Proteina H3 s-a modificat ceva mai mult în timpul acestei perioade de evoluție, astfel că secvențele aminoacizilor în cazul celor două organisme mai sus menționate se diferențiază prin patru aminoacizi.

Este posibil să comparăm rata de modificare a histonelor cu cea a altor proteine în cursul evoluției. Se poate utiliza o mărime care evaluează perioada în care secvența unei proteine s-a modificat cu 1%, după despărțirea celor două linii evolutive. Această perioadă, pentru histonele H3 și H4 este de 300, respectiv 600 milioane de ani, cu mult mai mare decât cea întâlnită în cazul altor proteine studiate până acum (ex: 6 milioane de ani pentru hemoglobină). Structura înalt conservată a acestor două proteine sugerează faptul că ele joacă un rol critic în alcătuirea moleculei ADN, care a fost stabilit foarte devreme în evoluție și care a rămas neschimbat de atunci.

Au fost identificate 8 tipuri diferite de histone H1, care depind de tipul celulei, poziționarea în celulă și stadiul de diferențiere. În cazul nucleozomilor care sunt poziționați lângă centromeri histona H3 este înlocuită de CENP-A ("centromere protein A"). Dacă în această regiune histona H3 nu poate fi înlocuită de CENP-A structura și funcționarea centromerului se blochează. Histona H2A poate fi înlocuită cu o altă variantă H2A.Z în regiunea care separă eucromatina și heterocromatina.

De obicei histonele standard sunt încorporate în nucleozomii moleculei ADN nou sintetizată, în timpul fazei de sinteză S a ciclului celular. Mai târziu, unele sunt înlocuite cu alte variante ale histonelor, în funcție de condițiile din celule.

Dar, aranjarea ADN sub forma nucleozomilor nu este suficientă pentru a explica o structură atât de compactă care să permită împachetarea în interiorul nucleului. Astfel, pentru ca 46 de molecule de ADN uman, totalizând mai mult de 2m în lungime, să intre într-un nucleu cu un diametru de 10µm este necesară o împachetare mai avansată.

Al doilea nivel de organizare supramoleculară a moleculei ADN este fibra de cromatină, cu un diametru de 30nm, rezultată din spiralizarea sub forma unui solenoid a cromatinei. Fiecare spiră a solenoidului este alcătuită din 6 nucleozomi, fiind stabilizată de histona H1. Astfel, se consideră că unitatea fundamentală de organizare a moleculei ADN în nucleul interfazic este fibra de cromatină, cu diametrul de 30nm.

Analiza structurală a evidențiat că prin spiralizare se apropie regiuni ale ADN, care sunt amplasate la distanțe mari unele față de celelalte în molecula liniară. Astfel, este asigurată transmiterea corectă a informației genetice, dovedind implicarea modului de împachetare în funcționarea genomului.

Spiralizarea specifică sub forma de solenoid asigură accesul enzimelor care realizează transcripția, deoarece apare o alternare a zonelor puternic spiralizate cu cele nespiralizate.

Al treilea nivel de organizare rezultă prin plierea fibrei de cromatină de 30 nm în bucle laterale, numite și domenii, de lungimi diferite (20 – 100kb), având un diametru de 300nm. Buclele nu au numai un rol structural ci și funcțional deoarece se consideră că fiecare bucla ar putea fi o unitate de transcripție.

Al patrulea nivel de organizare îl reprezintă cromatida, care apare la începutul profazei prin condensarea fibrei de cromatină pliată în bucle laterale. În metafază are loc cel mai înalt grad de condensare al fibrei de cromatină, diametrul ajungând la 700 nm (Fig. 1.7).

Cromozomul aflat în metafază este alcătuit din două cromatide surori (atașate la nivelul centromerului). Fiecare cromatidă a cromozomului conține deci o singură moleculă de ADN, care a suferit mai multe procese succesive de compactare. Cea de-a doua cromatidă a luat naștere în timpul replicării, care a avut loc în faza S a ciclului celular.

Se poate spune că molecula de ADN suferă o compactare de aproximativ 10.000 de ori și astfel poate să încapă în nucleu, care are un diametru de câțiva micrometri. Astfel, este asigurată împărțirea corectă a materialului genetic în timpul procesului de diviziune și totodată se asigură desfășurarea corespunzătoare a tuturor proceselor metabolice: replicare, transcripție, etc.

Fig. 1.7 Nivelurile de organizare supramoleculară ale moleculei ADN

(1) reprezentări schematizate ale fiecărui nivel de organizare;

(2) imagini vizualizate la microscop.

1.1.3. ORGANIZAREA SUPRAMOLECULARĂ A MOLECULEI ARN

Structura primară a moleculei de ARN este în general similară cu cea a ADN cu două excepții: monozaharidul este riboza care posedă o grupare hidroxil în poziția 2’ și timina este înlocuită de uracil.

Prezența timinei în loc de uracil în ADN influențează stabilitatea pe termen lung a acestei molecule, deoarece timina este implicată în procesele de reparare a ADN. Gruparea hidroxil de la atomul C2 al ribozei face ca molecula de ARN să fie mult mai labilă comparativ cu cea de ADN. Ca rezultat al acestei labilități, ARN poate fi clivat în mononucleotide în soluție alcalină, fenomen care nu apare în cazul moleculei de ADN. Hidroxilul de la atomul C2 pune la dispoziție o grupare chimică reactivă, care este implicată în reacțiile catalizate de ARN.

La fel ca ADN, ARN este o macromoleculă polinucleotidică, care poate fi mono (ARNmc) sau dublu catenară (ARNdc), liniară sau circulară. Poate de asemenea să participe la formarea unor molecule hibride ARNmc – ADNmc.
Spre deosebire de ADN care se găsește în celulele vii întotdeauna bicatenar, dublu helix, majoritatea moleculelor ARN sunt monocatenare (cu excepția particulelor virale), fiind posibilă adoptarea mai multor conformații. Diferențele de dimensiune și conformație permite moleculelor ARN să îndeplinească diferite funcții în celule.

Structura secundară a ARN se formează prin legarea fragmentelor monocatenare complementare. Astfel, structura ac de păr” (hairpin) se formează prin cuplarea bazelor azotate aflate la o distanță de 5 – 10 nucleotide una față de cealaltă, iar în cazul structurii sub formă de ”bucla” (loop) distanța dintre secvențele complemenare cuplate poate fi de zeci, sute sau chiar mii de nucleotide (Fig. 1.8).

Fig. 1.8 Structura secundară a moleculei de ARN

a – structura în „ac de păr” (hairpin;

b- structura sub formă de „buclă” (loop).

Aceste împachetări simple concură la formarea unor structuri terțiare mult mai complexe, specifice fiecărui tip de ARN. În cazul moleculei de ARNt se adoptă o structură tridimensională bine definită, care are o importanță deosebită în procesul de sinteză a proteinelor (Fig. 1.9).

Fig. 1.9. Modelul structurii moleculare a ARNt

Bucla 1 cuprinde situsul pentru fixarea temporară la ribozom, în timpul sintezei proteice;

Bucla 4 reprezintă situsul de recunoaștere pentru enzimele ~ ARN sintetaze, care sunt implicate în formarea complexului aminoacil~ ARNt;

Bucla 3 este numită și bucla anticodonului, la nivelul său fiind localizat tripletul care realizează recunoașterea specifică a codonului din ARNm, cu care poate forma legături de hidrogen în timpul fixării ARNt pe complexul ARNm – ribozom.

Moleculele ARNr au de asemenea structuri tridimensionale localizate, legate între ele cu regiuni mai flexibile.

Se observă adoptarea unei structuri secundare și terțiare și la moleculele de ARNm, în particular în zonele situate spre capetele moleculelor.

Prin urmare moleculele de ARN sunt asemănătoare cu proteinele, care au domenii structurate, conectate prin domenii liniare, mai puțin structurate și flexibile. Domeniile de împachetare ale moleculelor de ARN nu sunt asemănătoare cu cele ale proteinelor (α și β) dar în unele cazuri au și capacități catalitice. Astfel ARNr catalizează legarea la proteine pentru a da naștere precursorilor ribozomali.

1.2. PROTEINELE. STRUCTURA CHIMICĂ ȘI ACTIVITATEA BIOLOGICĂ

1.2.1. ORGANIZAREA MOLECULARĂ A PROTEINELOR

O celulă poate să conțină peste 100 de proteine, care îndeplinesc diferite funcții. Astfel, proteinele sunt componentele funcționale cele mai importante ale celulelor, alcătuite din 20 de aminoacizi.

Fiecare aminoacid este alcătuit dintr-un atom de carbon, numit carbon α, legat la o grupare carboxil (COO-), la o grupare amino (NH3+), la un atom de hidrogen și la o catenă laterală (radical) distinctă (Fig. 1.10).

Proprietăție chimice, specifice diferitelor catene ale aminoacizilor explică rolul fiecărui aminoacid în structura și funcția proteinei.

După proprietățile catenelor laterale aminoacizii se clasifică în patru categorii:

Șapte aminoacizi au catene nepolare alifatice, care nu interacționează cu apa (Fig. 1.11).

Trei aminoacizi cu catene laterale nepolare, aromatice (Fig. 1.12).

Cinci aminoacizi cu catene laterale polare, neutre (Fig. 1.13)

Trei aminoacizi cu catene laterale cu grupări bazice, încărcate pozitiv (Fig. 1.14).

Doi aminoacizi cu catene laterale acide, încărcate negativ (Fig. 1.15)

Aminoacizii hidrofobi sunt localizați de obicei în interiorul proteinelor. Aminoacizii cu grupări încărcate, acide sau bazice sunt hidrofili și sunt orientați spre suprafața proteinelor, intrând în contact cu soluția apoasă care alcătuiește matrixul compartimentelor celulare (citozol, mitocondrii, cloroplaste etc.).

Aminoacizii sunt legați între ei prin legături peptidice realizate între gruparea amino a unui aminoacid și gruparea carboxil a celui de-al doilea aminoacid (Fig. 1.16).

Fig. 1.11 Structura aminoacizilor cu grupări lateral nepolare, alifatice

Fig. 1.12 Structura aminoacizilor cu catene laterale nepolare, aromatice

Fig. 1.14 Structura aminoacizilor cu catene laterale cu grupări bazice,

încărcate pozitiv

Fig. 1.15 Structura aminoacizilor cu catene laterale acide,

încărcate negativ

Fig. 1.16 Reacția de formare a unei legături peptidice prin condensare

Polipeptidele sunt lanțuri liniare, alcătuite din sute sau mii de aminoacizi, cu o extremitate amino ( N – terminală) și o extremitate carboxil (C – terminală).

Polipeptidele, cu structuri specifice de aminoacizi reprezintă numai primul element al structurii unei proteine. Acestea adoptă de obicei conformații tridimensionale distincte, ca rezultat al interacțiunilor dintre aminoacizii care le compun. Deci, conformațiile proteinelor sunt determinate de secvența lor de aminoacizi.

1.2.2. ORGANIZAREA SUPRAMOLECULARA A PROTEINELOR

Proteinele au o structură supramoleculară organizată pe patru nivele, în funcție de gradul de condensare și împachetare.

Structura primară a unei proteine este dată de secvența de aminoacizi din lanțul polipeptidic.

Structura secundară este determinată de dispoziția aminoacizilor în anumite regiuni ale polipeptidului. Pauling și Corey (1951) au propus două tipuri de structuri secundare, în α helix și în pachete β (planuri pliate). Aceste două structuri secundare sunt menținute prin legăturile de hidrogen dintre grupările CO și NH ale legăturilor peptidice.

Un α helix se formează când o regiune a unui lanț polipeptidic se răsucește în jurul ei însăși; gruparea CO a unei legături peptidice formează o legătură de hidrogen cu gruparea NH a altei legături peptidice situată cu patru resturi în aval pe lanțul polipeptidic liniar.

În schimb, un pachet β este format când două porțiuni ale unui lanț polipeptidic se dispun alăturat și se leagă între ele prin legături de hidrogen. Asemenea pachete β pot fi formate între mai multe lanțuri polipeptidice, care pot fi orientate paralel sau antiparalel unele față de altele.

Structura terțiară este indusă de plierea lanțului polipeptidic ca rezultat al interacțiunii dintre radicalii aminoacizilor care se află în diferite regiuni ale secvenței primare. În majoritatea proteinelor, combinațiile în α helix și pachetele β – conectate prin regiuni flexibile în formă de buclă ale lanțului polipeptidic – se pliază în interiorul unor structuri globulare compacte, numite domenii.

Aceste domenii sunt unități de bază ale structurilor terțiare. Proteinele mici cum ar fi ribonucleaza au un singur domeniu, iar proteinele mari conțin mai multe domenii care sunt asociate frecvent cu funcții distincte. Porțiunile interne ale proteinelor pliate sunt alcătuite din aminoacizi hidrofobi aranjați în α helix sau pachete β; aceste structuri secundare sunt prezente în miezul hidrofob al proteinelor, deoarece prin legăturile de hidrogen se neutralizează caracterul polar al grupărilor CO și NH ale scheletului polipeptidic. Regiunile buclă care conectează aceste elemente ale structurii secundare sunt prezente pe suprafața proteinelor pliate, acolo unde componentele polare ale legăturilor peptidice formează legături de hidrogen cu apa sau cu radicalii polari ai aminoacizilor hidrofili.

Interacținile dintre radicalii aminoacizilor polari, realizate prin legături de hidrogen și legături ionice la suprafața proteinei sunt factori importanți ai structurii terțiare. În plus, legăturile disulfurice covalente între grupările sulfhidril ale resturilor de cisteină stabilizează structurile pliate ale multor proteine secretate sau ale proteinelor prezente pe suprafața celulară.

Cel de–al patrulea nivel al structurii unei proteine – structura cuaternară – este determinată de interacțiunile dintre diferite lanțuri poli-peptidice prezente în proteinele compuse din mai mult decât un polipeptid. De exemplu, hemoglobina este compusă din patru lanțuri polipeptidice menținute împreună prin aceleași tipuri de interacțiuni care determină structura terțiară. Conformațiile tridimensionale diferite ale proteinelor corespund funcțiilor variate pe care trebuie să le îndeplinească în biologia celulei (Fig. 1.17).

Fig. 1.17 Nivelurile de organizare supramoleculara ale lanțurilor polipeptidice

CAPITOLUL II

GENOMUL ȘI ORGANIZAREA GENICĂ

Notiunea de genom a fost introdusă pentru prima dată în anul 1920 de către un botanist pe nume Hans Winkler care a fuzionat cuvintele grecești "genesis" și "soma" pentru a descrie setul complet de gene.

În prezent, o dată cu dezvoltarea geneticii moleculare termenul de genom se referă la totalitatea materialului genetic dintr-o celulă, cuprinzând atât genele cât și secvențele necodante. Fiecare genom trebuie să conțină informația necesară pentru alcătuirea organismului și totodată sa-i permită creșterea și dezvoltarea.

Dimensiunea genomului este o noțiune care se referă la cantitatea de ADN conținută într-o copie a genomului. Ca unitate de măsură se folosesc de obicei picograme (pg), mai rar daltoni (Da). Cel mai adesea se exprimă ca număr de perechi de nucleotide sau perechi de baze (bp). Un picogram de ADN corespunde unui fragment cu lungimea de 978 Mb.

Cantitatea totală de ADN din genomul haploid este denumită valoarea C. Nu exista o corelație între valoarea C și complexitatea unui organism, fapt denumit în literatura de specialitate paradoxul valorii C.

Tabelul 2.1. Dimensiunea genomului și numărul de gene la diferite organisme

Genomul speciei Arabidopsis thaliana, planta model al cărei genom a fost secvențializat încă din anul 2000, conține un număr 1,57 x 108 perechi de baze (bp). Aproximativ 14% din acesta este constituit din transpozoni, iar restul constituie cele 25.498 de gene. Porumbul conține de 20 de ori mai mult ADN (2,8 x 109 bp), dar numărul de gene este numai de aproximativ 2 ori mai mare, deoarece 60% din genomul porumbului este constituit din transpozoni.

În anul 2014 a fost secvențiat genomul Genlisea tuberosa, o specie de plante carnivore din genul Genlisea, care are cel mai mic genom identificat până în prezent la angiosperme și anume 0,61x108bp. Se consideră că de-a lungul evoluției genului, genomurile unor specii Genlisea au suferit o reducere drastică a dimensiunii însoțită de o miniaturizare a cromozomilor.

Genomul speciei Paris japonica, un hibrid octoploid între patru specii, cu un număr de 40 de cromozomi a identificat în anul 2010 ca fiind cel mai mare genom al unei plante analizate până în prezent, cu o lungime de 1,5 x 1011bp. Este de 50 de ori mai mare decât cel uman, fiind cel mai mare genom al vreunui organism viu cunoscut.

Interesant este că dimensiunea genomului unui organism nu se corelează cu complexitatea sa sau cu nivelul evolutiv. Deși organisme unicelulare, cum ar fi drojdia de bere sau unele specii de plante au mult mai puțin ADN comparativ cu omul, totuși există plante care au o cantitate mult mai mare de ADN.

2.1. ORGANIZAREA GENOMULUI LA VIRUSURI

2.1.1. VIRUSURI BACTERIENE

Virusurile bacteriene sau bacteriofagii au genomuri reprezentate de macromolecule de ADN sau ARN de mărimi variabile. În prezent sunt cunoscute câteva mii de bacteriofagi și numai bacteria E. coli poate fi infectată de câteva sute de fagi. Astfel fagii care infectează E. coli pot fi împărțiți în 4 grupe :

2.1.1.1 FAGII CU GENOM ADN DIN SERIA “T”

Fagii cu genom ADN din seria T, au un singur genom reprezentat de o singură moleculă de ADN de dimensiuni variabile.

După pătrunderea genomului fagic în celula bacteriană are loc reproducerea a aproximativ 100 de fagi care sunt eliberați în mediu prin liza celulei gazdă, în numai câteva minute.

Bacteriofagul T4 – fag specific bacteriei E.coli are un genom ADN dublu catenar, alcătuit din 135 de gene, având o lungime de 169 kb.

Acest fag posedă un cap, în care se găsește împachetată o moleculă de ADN dublu catenar, în care este înregistrată informația genetică. Capul se continuă cu o coadă în forma unui cilindru, gol în interior, care se sfârșește cu o placă terminală de care sunt atașate 6 fibre proteice codale.

2.1.1.2. FAGII TEMPERAȚI CU GENOM ADN

Fagii temperați cu genom ADN după ce infectează celula gazdă pot determina liza celulei bacteriene, similar celor din seria T, dacă este urmat ciclul litic, sau genomul lor poate fi integrat în cromozomul bacterian. Ei rămân în această postură de provirus sau de bacteriofag temperat un timp nedefinit, fiind replicați o dată cu genomul celulei gazdă – ciclul lizogenic.

Din acest grup face parte fagul , care are un genom ADN, cu o lungime de 48 kb. Dacă este urmat ciclul litic are loc eliberarea în mediu a aproximativ 100 de fagi.

Dacă este urmat ciclul lizogenic, genomul fagic este integrat în cromozomul bacterian și sub această formă este replicat o dată cu acesta sute și mii de generații până ce intervin fenomene de afectare a ADN, cum ar fi radiațiile UV. Din această cauză genomul fagului este eliberat din cromozomul bacterian, se replică independent și are loc astfel trecerea de la ciclul lizogenic la cel litic. Celula bacteriană este astfel lizată și aproximativ 200 de fagi noi sunt eliberați în mediu.

Caracteristicile genetice ale bacteriofagului  au fost exploatate, astfel că a stat la bază dezvoltării un sistem de clonare a fragmentelor ADN în celule bacteriene.

2.1.1.3 FAGI CU GENOM ADN MONOCATENAR

Din grupul fagilor cu genom monocatenar fac parte : fagul X 174 (cu genom alcătuit din 5386 nucleotide), fagul G4 (5577 nucleotide) și fagul M13 (7200 de nucleotide)

Dintre bacteriofagii cu genom ADN replicarea este foarte bine cunoscută la fagul X 174, la care materialul genetic este reprezentat de o macromoleculă de ADN monocatenar circular, cu o lungime de 1,8 m. După ce materialul genetic viral pătrunde în celula bacteriană are loc rapid sinteza unei catene de ADN complementare, astfel că genomul viral devine bicatenar. Apoi, el are o replicare rapidă, formând aproximativ 20 de copii de ADN circular bicatenar. În același timp începe procesul de transcripție a informației genetice virale, se sintetizează ARNm, care împreună cu ribozomii celulari determină sinteza de proteine virale.

Cele 20 de copii bicatenare ale genomului viral servesc ca matriță pentru sinteza a aproximativ 200 de molecule de ADN monocatenare.

ADN viral monocatenar împreună cu proteinele virale dau naștere particulelor virale active, celula este lizată, iar particulele virale sunt eliberate în mediu.

2.1.1.4. FAGII CU GENOM ARN

Această categorie de fagi are un genom reprezentat de o moleculă de ARN de dimensiuni mici, alcătuită din aproximativ 3500 nucleotide, cuprinzând 3 gene. În acest caz genomul funcționează în celulele gazdă ca ARNm, conducând direct la sinteza proteinelor.

2.1.2. VIRUSURI ANIMALE

În cazul virusurilor animale genomul este constituit din acidul nucleic viral, care poate fi ADN, în cazul dezoxi-ribovirusurilor, sau ARN, la ribovirusuri, neavând niciodată ambii acizi nucleici. Majoritatea virusurilor animale conține genom de tip ARN.

Din punct de vedere al mărimii acidului nucleic, structurii și secvențelor de baze azotate virusurile sunt extrem de diverse.

Diferențele privitoare la dimensiunea geomului viral sunt considerabile de la o familie la alta, atât în ceea ce privește greutatea moleculară (1,5 – 150 x 106 daltoni) a numărului de nucleotide (5-231 kb), cât și cea a secvenței bazelor azotate.

Numărul de gene cuprins în genom poate fi extrem de restrâns: HIV conține 9 structuri genice, virusul gripal – 12, dar poate să ajungă până la 240 de gene. Prin urmare și numărul de proteine va fi diferit (2 – 250 proteine), în funcție de numărul și structura genelor.

Structura genomului viral se caracterizează printr-o mare diversitate, atât la virusurile ADN cât și la cele ARN.

Virusurile ADN pot prezenta următoarele structuri (Fig. 2.1):

Fig. 2.1 Structura genomului la dezox-iribovirusurile animale

monocatenare liniare – mc;

monocatenare circulare – mc;

dublu catenare liniare, cu secvențe terminale repetitive;

dublu catenare – dc, cu extermități închise covalent;

dublu catenare, circulare, închise necovalent, cu extremități monocatenare (dc- mc);

dublu catenare, circulare, închise covalent și suprarăsucite.

Ribovirusurile, sau virusurile ARN sunt, de asemenea, diverse ca structură, fiind monocatenare sau bicatenare, cu genomul într-un singur fragment sau divizat.

Astfel, genomul virusurilor ARN prezintă următoarele structuri (Fig. 2.2.):

Fig. 2.2 Structura genomului la ribovirusurile animale

monocatenare – mc liniar, într-un singur segment;

monocatenare – mc diploid, în care două molecule ARN identice sunt legate necovalent (retrovirusuri);

monocatenare – mc divizat, format din 8 molecule liniare inegale de ARN;

monocatenar – mc, cu două segmente, unul mare și altul mic;

monocatenar – mc, cu 3 structuri circulare;

dublu catenar –dc, cu 10 sau 12 segmente separate.

Genomul segmentat permite reasortarea materialului genetic între virusuri înrudite, fiind suportul material al variabilității unor virusuri (de exemplu virusul gripal).

Se poate concluziona că, în cazul virusurilor genomul conține întreaga informație genetică virală iar infectivitatea virală este atributul acidului nucleic intact conținut în particula virală. Atât ADN cât și ARN viral sunt capabili de autoreplicare în absența celorlalți constituienți virali, excepție făcând ARN viral, izolat, monocatenar de sens negativ. Celelalte procese, cum ar fi transcripția genelor și sinteza proteinelor se desfășoară cu ajutorul sistemelor enzimatice ale celulei gazdă.

2.2. ORGANIZAREA GENOMULUI LA PROCARIOTE

Celulele procariote nu prezintă nucleu adevărat, astfel că materialul genetic nu este separat de citoplasmă printr-o structură membranară.

Materialul genetic este reprezentat de cromozomul bacterian și de elementele genetice accesorii – plasmidele.

2.2.1 CROMOZOMUL BACTERIAN. ORGANIZARE MOLECULARĂ

Cromozomul bacterian nu se află amplasat într-un organit separat de restul celulei printr-o biomembrană, ci într-o regiune cu o formă neregulată, denumită nucleoid.

In cele mai multe cazuri cromozomul bacterian este reprezentat de o singură moleculă de ADN dublu catenară, circulară și super-spiralizată, alcătuită din secvențe unice de ADN.

Cel mai bine studiat până astăzi a fost cromozomul celulei bacteriene E. coli care este format din 4639 kb, cuprinzând 4377 de gene, dintre care 4290 codifică proteine, iar celelalte ARNr. Genomul a fost secventializat în totalitate, dar numai pentru o treime dintre gene a fost determinată și funcția.

Genomul procariot are astfel o dimensiune de circa 1000 de ori mai mare decât cea a genomului viral (4000 – 5000 kb față de 5 kb).

Nucleoidul este echivalentul cromatinei din celulele eucariote, fiind alcătuit din 60% ADN și în plus molecule mici de ARN si proteine. Proteinele care ajută la menținerea structurii super-spiralizate a acizilor nucleici sunt cunoscute ca proteine asociate cu nucleoidul, fiind diferite de histonele prezente în nucleul eucariot. Acestea nu stau la baza alcătuirii nucleosomilor, ci utilizeaza alte mecanisme pentru a iniția condensarea prin formarea unor bucle ADN („DNA looping”).

În E. coli, jumătate dintre gene sunt organizate în operoni, fiecare dintre aceștia codificând enzime implicate în anumite căi metabolice, sau proteine care interacționează pentru a forma o structură complexă, alcătuită din mai multe subunități.

Un operon reprezintă o unitate funcțională alcătuită dintr-o înlănțuire de gene structurale, puse sub controlul aceluiași promotor. Genele sunt transcrise împreună într-o moleculă de ARN mesager, care poate sta la baza sintezei unei singure proteine sau poate fi clivată în mai multe molecule ARNm, care fiecare codifică o anumită proteină, cu implicare într-o cale metabolică.

Având în vedere că un operon bacterian este transcris de la un punct de pornire, într-o singură moleculă de ARNm, toate genele care îl alcătuiesc sunt reglate împreună. De aceea ele sunt activate sau represate ca urmare a aceluiași factor. Transcripția operonului este controlată de interacțiunea dintre ARN polimerază și proteine specifice activatoare sau represoare.

Regiunea de reglare, în cazul unui operon procariot este alcătuită din mai multe elemente:

o secvență care leagă proteinele activatoare – situs CAP („catabolite activator protein”);

regiunea operator, care funcționează ca receptor de semnale și controlează transcripția genelor structurale;

regiunea promotor, care este adiacentă regiunii operator, fiind secvența care permite atașarea ARN polimerazei la molecula de ADN, inițiind transcripția informației genetice (Fig 2.3).

Fig. 2.3 Structura generală a unui operon din genomul bacterian

Regiunea promotor este alcătuită din două secvențe: TATAAT localizată pe catena ADN în poziția -10, în amonte de situs-ul de start pentru sinteza ARNm (+1) și TTGACA, în poziția -35.

În structura cromozomului bacterian sunt prezente secvențe de inserție – IS –elemente mobile cu lungimi de 1-2 kb, care pot fi inserate în diferite regiuni ale genomului bacterian. Sunt secvențe specifice de ADN ce includ o serie de gene structurale, care codifică una sau două enzime necesare pentru transpoziție, delimitate la extremități de regiuni alcătuite din repetiții directe sau inverse, care condiționează procesul.

2.2.2 ELEMENTELE GENETICE ACCESORII – PLASMIDELE

Plasmidele reprezintă o informație genetică accesorie, extra-cromozomială, ce favorizează existența celulei bacteriene în medii neobișnuite. Peste 300 din numărul total al plasmidelor cunoscute au fost identificate la E. coli.

O plasmidă este o moleculă mică de ADN dublu catenară, circular închisă, care are o replicare independentă. Datorită dimensiunilor reduse (1-2% din cromozomul bacterian) aceste structuri mai poartă denumirea de minicromozomi. În unele situații pot să existe și plasmide liniare, dar în cele mai multe situații sunt circulare.

Plasmidele sunt deci entități genetice care în condiții naturale se replică autonom, iar replicarea lor poate fi corelată sau nu cu cea a cromozomului. În plasmide sunt prezente cel puțin trei gene, dar numărul acestora poate să ajungă până la 100. Adesea plasmidele conțin gene care conferă rezistență la antibiotice, de exemplu rezistență la ampicilină, tetraciclină, kanamicină sau cloramfenicol.

Caracteristicile plasmidelor și anume dimensiunile reduse, capacitatea de autoreplicare și prezența genelor care conferă rezistență la antibiotice le recomandă pentru utilizarea ca vectori de clonare a moleculelor de ADN, în tehnologia ADN recombinat.

2.3. ORGANIZAREA GENOMULUI NUCLEAR LA EUCARIOTE

În celulele eucariote depozitarea informației genetice, reglarea și controlul activităților genetice sunt asigurate de structurile celulare care conțin ADN (nucleul, mitocondriile și cloroplastele).

Dar, organitul care asigură coordonarea activităților metabolice este nucleul, care conține aproximativ 99,5% din cantitatea de ADN a celulei.

Pe parcursul ciclului celular nucleul își modifică structura, în funcție de caracteristicile fiecarei etape.

2.3.1. ETAPELE CICLULUI CELULAR

Ciclul celular la o celulă tipic eucariotă prezintă patru faze succesive care însoțesc și diviziunea celulară și anume: Faza G1 – nu are loc sinteza ADN,; Faza S – sinteza ADN; Faza G2 – nu are loc sinteza ADN; și Faza M – mitoză.

Intervalul dintre sfârșitul și începutul unei noi faze M este denumit interfază, care de fapt incorporează cele trei faze menționate G1, S și G2. Acest interval (interfază) ocupă în mod normal 90% sau mai mult din totalul timpului ciclului celular (Fig. 2.4).

Faza G1 sau presintetică a fost considerată inițial ca o perioadă de gol sintetic. Ulterior s-a constatat că în G1 are loc o intensificare a transcripției și a sintezei proteinelor, procese aproape blocate în perioada mitotică. Principalele evenimente care caracterizează perioada G1 sunt desăvârșirea condensării cromatinei și reorganizarea nucleolului. Cantitatea de ADN corespunde unui cromozom monocromatidic, alcătuit dintr-o moleculă ADN dublu catenară.

Faza S sau sintetică, urmează perioadei G1. În acest timp se desfășoară replicarea ADN nuclear astfel încât la sfârșitul ei cantitatea de ADN este dublată. În acest moment cromozomii sunt bicromatidici, fiecare fiind alcătuit din două cromatide surori.

În același timp are loc și sinteza histonelor și a altor tipuri de proteine implicate în împachetarea ADN.

Deci, la inițierea sintezei ADN, celula se află în condiții de diploidie (2n), la sfârșit ajungând în condiții de tetraploidie (4n).

Faza G2 sau postsintetică separă perioada sintetică de cea mitotică. În această etapă are loc transcripția genelor și sinteza proteinelor cu aceiași intensitate ca în G1, asigurându-se condițiile necesare intrării celulei în mitoză.

Durata ciclului celular variază în funcție de tipul celular, specie și stadiul de dezvoltare. Celulele neproliferative părăsesc ciclul în G1, intrând în faza G0, în care rămân până când primesc un semnal de multiplicare.

Fig. 2.4. Procesele desfășurate în cadrul ciclului celular, urmărindu-se comportarea unui singur cromozom

Pentru cele aproximativ 1013 celule care alcătuiesc organismul uman, durata ciclului variază în limite foarte largi. Celulele epiteliale ce delimitează lumenul intestinal se divid foarte rapid (o dată sau de două ori pe parcursul a 24 de ore), în timp ce celulele musculare și neuronii își pierd complet capacitatea proliferativă după încheierea procesului de diferențiere. Cea mai mare parte a celulelor organismului uman au o durată a ciclului celular ce se încadrează între aceste extreme.

În general faza S are o durată constantă, pe când durata G1 este variabilă, în limite largi.

S-a constatat că timpul necesar parcurgerii perioadei G1 este influențat de o serie de factori extracelulari, cum ar fi elementele nutritive și factorii de creștere.

Deci, nucleul interfazic  este delimitat la exterior de un înveliș nuclear, alcătuit din două membrane concentrice, care sunt în contact din loc în loc, generând porii nucleari. Pe fața internă a învelișului nuclear se găsește o rețea fibroasa denumită lamina nucleară, care separă interiorul nucleului în care se află cromatina și nucleoplasma. Regiunile cromosomale pe care sunt amplasate genele care codifică ARN ribozomal sunt poziționate într-o anumită regiune nucleară, denumită nucleol. Nucleolul se diferențiază de restul nucleului prin densitatea ridicată, datorată unei acumulări de ARN ribozomal, proteine ribozomale și precursori ai ribozomilor.

Cromatina este alcătuită din molecula dublu catenară de ADN, care asigură atât transmiterea informației genetice cât și sinteză proteinelor. Fiecare fragment din moleculă de ADN are o secvență bine stabilită și are un anumit rol în viața celulei. În funcție de etapa ciclului celular în care se află, cromatina poate să prezinte diferite grade de condensare.

2.3.2. CLASIFICAREA CROMATINEI ÎN FUNCȚIE DE GRADUL DE CONDENSARE

Eucromatina este puțin condensată, evidențiată sub forma unor bucle alcătuite de fibra de cromatină (30 nm). Din punct de vedere morfologic este alcătuită din ADN nerepetitiv, în care predomină perechile de baze G-C și proteinele nehistonice, conținând gene structurale. Din punct de vedere funcțional reprezintă partea activă genetic, cu un grad ridicat de transcripție.

La drojdii buclele alcătuite din eucromatină sunt situate adesea în apropierea complexelor porilor nucleari, ceea ce sugerează favorizarea deplasării compușilor de transcripție spre citozol. Totuși, în celulele animale produșii de transcripție par să fie represati în apropierea suprafeței interne a învelișului nuclear.

Noțiunea de “genă” a fost introdusă prima dată în anul 1909 de către botanistul Wilhelm Johannsen și provine din limba greacă, de la cuvântul “genos”. După descoperirea ADN ca material genetic și odată cu dezvoltarea biotehnologiei și cu secvențializarea genomului uman, noțiunea de “genă” a început să se refere mai ales la înțelesul său din biologia moleculară, adică la segmentele de ADN care sunt transcrise în ARN și apoi traduse cel puțin parțial în proteine (Fig. 2.5).

Fig. 2.5. Structura unei gene eucariote

Heterocromatina este porțiunea foarte condensată, cu replicare tardivă în faza de sinteză (S) a ciclului celular. Din punct de vedere morfologic conține mai mult ADN repetitiv, în care predomină perechile de baze A-T și histonele. Din punct de vedere funcțional reprezintă partea inactivă genetic, fiind implicată în procesul de stabilizare a centromerului și telomerilor. La nivelul heterocromatinei rata recombinarilor este redusă.

În celulele eucariote au fost evidențiate două tipuri de heterocromatina: constitutivă și facultativă.

Heterocromatina constitutivă este o cromatină constant condensată în interfază. Ea este genetic inactivă, nu conține gene structurale și pe ea nu se face niciodată transcripție. Heterocromatina constitutivă conține așa-numitul ADN repetitiv sau satelit, reprezentat de secvențe scurte, repetate de un număr mare de ori.

Heterocromatina facultativa este o cromatină condensată temporar. Conține gene structurale care într-un anumit tip de celule sau într-un anumit stadiu de dezvoltare sunt represate, dar se pot transforma în anumite momente în eucromatină.

Clasificarea menționată – eucromatina și heterocromatina s-a realizat în urma experimentelor de bandare și examinare la microscop. Dezvoltarea fără precedent a tehnicilor moderne de biologie moleculară, cum ar fi amplificarea ADN, hibridizare cu sonde moleculare sau chiar secvențializarea a permis clasificarea secvențelor ADN după structura lor și numărul de repetiții în care apar în genom.

Din punctul de vedere al numărului de repetiții în genomul celulelor eucariote există mai multe tipuri de secvențe ADN și anume: ADN nerepetitiv, ADN moderat repetitiv și ADN înalt repetitiv.

2.3.3. CLASIFICAREA CROMATINEI ÎN FUNCȚIE DE NUMĂRUL DE REPETIȚII

Analiza secvențelor ADN care intra în alcătuirea cromatinei a condus la clasificarea acestora în două categorii principale: gene unice sau duplicate și gene cu copii multiple.

2.3.3.1. GENE UNICE SAU DUPLICATE. STRUCTURĂ ȘI FUNCȚII

Genele care codifică proteine pot avea o singură copie sau pot să aparțină unor familii de gene. În organismele multicelulare numai 25-50% dintre genele care codifică proteine se găsesc într-o singură copie în genomul haploid.

O a doua categorie de gene sunt genele duplicate, cu secvențe foarte asemănătoare, dar nu identice, care se află la distanțe de 5 -50 kb una față de cealaltă. Un set de gene duplicate care codifică proteine similare, dar cu secvențe diferite de aminoacizi alcătuiesc o familie de gene, iar proteinele corespunzătoare alcătuiesc o familie de proteine. Unele familii de gene pot să conțină până la câteva sute de membri, dar cele mai comune cuprind până la 30 de tipuri. Exemple de familii de gene sunt cele care codifică proteinele citoscheletului.

Dimensiunile medii ale unei gene dintr-un organism eucariot variază mult, de la mai puțin 1 kb (genele care codifică histone), până la 2300kb în cazul unei gene care codifică o proteină neuronală sau 2200kb în cazul genei care codifică distrofina la om. Dimensiunea medie a genelor din organismele vertebrate este de 30kb, iar în organismul uman 20-50kb, spre deosebire de bacterii care au gene cu dimensiuni mult mai mici, deoarece conțin numai material codant.

Toate genele sunt alcătuite dintr-o regiune centrală și regiuni laterale sau secvente de reglare.

A. REGIUNEA CENTRALĂ SAU CODANTĂ A UNEI GENE

Regiunea centrală poartă numele de „cadru de lectură” sau ORF („open reading frame”).

Regiunea centrală a genei este transcrisă integral în ARN mesager precursor prin acțiunea ARN polimerazei II. Această regiune este alcătuită din succesiunea a două tipuri distincte de secvențe: exoni și introni, prezente sau nu în versiunea finală a ARNm matur, ce va părăsi nucleul. Pentru descoperirea structurii mozaic a genelor eucariote Richard Roberts și Philip Sharp au primit premiul Nobel în anul 1993.

Regiunea centrală a genei începe cu situsul de inițiere al transcrierii, după care urmează o regiune necodantă (transcrisă dar netradusă) cu o lungime de câteva sute de nucleotide denumită 5’UTR („untranslated region”). Această regiune conține la finalul ei codonul START– AUG, care marchează locul de începere a translației, corespunzând primului aminoacid al lanțului polipeptidic.

După codonul de inițiere a translației se succed exonii și intronii care alcătuiesc gena.

Exonii sunt secvențe transcrise în ARN mesager precursor și regăsite în molecula ARNm după maturare, fiind secvențe ce se exprimă și părăsesc nucleul. Exonii reprezintă regiunile funcționale din structura genei, care de obicei codifică anumite părți structurale și/sau funcționale distincte ale proteinei, numite domenii. Numărul exonilor variază de la o genă la alta (între 2 și mai mult de 50) precum și la diferite organisme.

Intronii sunt secvențe necodante, transcrise inițial în ARNm precursor dar secționate și eliminate ulterior din ARNm matur, ce va fi alcătuit prin asamblarea exonilor. Numărul intronilor este cu unul mai mic decât cel al exonilor iar lungimea lor este variabilă, neconcordantă cu cea a exonilor, de obicei mult mai mare. Important de precizat este faptul că aproape toți intronii încep întotdeauna cu dinucleotidele 5' GT și sfârșesc cu AG 3'. Aceste perechi de nucleotide au rolul unor semnale pentru secționarea precisă și corectă a intronilor. Rolul intronilor nu este încă bine  cunoscut, dar se știe că numărul și mărimea lor variază la diferite gene, fiind cel mai adesea mult mai mari în dimensiuni decât exonii pe care îi separă.

După ultimul exon din regiunea centrală transcrisă a genei există o secvență 3' UTR („untranslated region”), necodantă, transcrisă dar netradusa, care începe cu unul dintre codonii stop (TAA, TAG, TGA), responsabili cu oprirea translației sau sintezei proteinei.

La capătul 3’ al secvenței 3'UTR se găsește un oligonucleotid având succesiunea bazelor azotate AATAAA, care are rol în stoparea transcrierii și totodată în poliadenilarea moleculei ARNm. Astfel, la 15-30 nucleotide în aval de acest situs se produce desprinderea moleculei de ARN sintetizate de pe catena matriță a ADN și tot în acest punct reprezintă semnalul pentru procesul de poliadenilare (Fig. 2.6).

B. REGIUNILE LATERALE SAU SECVENȚELE DE REGLARE ALE UNEI GENE

Regiunea centrală a oricărei gene este flancată de două regiuni laterale, netranscrise, care au rolul de a semnaliza inițierea transcripției de către ARN polimerază și de a regla intensitatea ei; mutațiile apărute în aceste regiuni nu modifică structura de aminoacizi a proteinei codificate de genă ci numai nivelul ei de expresie (rata sintezei).

B.1. Regiunea laterală 5' este amplasată în amonte de regiunea centrală a genei, reprezentând locul unde se fixează ARN polimeraza pentru inițierea transcripției. Această regiune poartă numele de promotor și conține mai multe elemente (cis-activatoare) cu o secvență nucleotidică scurtă și precis definită. Pe aceste secvențe se fixează niște proteine reglatoare (trans-activatoare) denumite factori de transcripție care au rolul de a regla transcripția.

Promotorul eucariotelor superioare este divizat la rândul lui în regiuni care au structură și funcții diferite:

Elementele de bază ale promotorului sunt alcătuite din casetele „TATA box”, „CCAAT box” și regiunea promotor distală.

TATA box  (secvența TATAAA situată la circa 20-30 bp în amonte de situsul de inițiere al transcrierii este locul la care ARN polimeraza II se fixează la ADN prin intermediul factorilor de transcripție. La genele comune (“housekeeping genes”) – funcționale  în toate țesuturile, secvența TATA este înlocuită de secvența GC (sau insule CpG) datorită concentrației mari de dinucleotide 5’- CG- 3’. Procesul de formare a complexului transcripțional se va prezenta în capitolul 3.1.2.

CAAT box  (secvența GGT/CCAATCT) este situată în amonte de caseta TATA (la circa 50 -130 bp de situsul de inițiere a transcrierii) și fixează alți factori de transcripție cum ar fi C/EBP (CCAAT-box/Enhancer Binding Protein).

Regiunea promotor distală  conține o serie de elemente care determină expresia  specifică a anumitor gene fie într-un anumit tip celular fie la un anumit stadiu de dezvoltare ontogenetică. De exemplu, secvențele specifice unui tip de țesut sunt recunoscute de factori de transcripție specifici, inițiind expresia genei.

Elemente de răspuns (RE) care modulează transcripția unor gene în funcție de anumite semnale extracelulare ("expresie genică indusă"). Aceste semnale pot fi stimuli externi (molecule nutritive, concentrația unor ioni, temperatură, șoc) sau semnale de comunicare de la alte celule (hormoni, morfogeni) – care activează anumiți factori de transcripție ce se fixează pe elementele de răspuns ale anumitor gene și determină transcripția lor temporară.

Activatorii ("enhancers") sunt elemente de reglare pozitivă care măresc nivelul bazal al transcripției, inițiată de promotor. Funcția lor nu depinde de localizare (pot fi plasați și în regiunea 3’) sau orientare, fiind determinată de mai ales de fixarea unor factori de transcripție specifici anumitor țesuturi (stimulează activitatea unor gene specifice, de ex. cele pentru imunoglobuline).

Inhibitorii ("silencers") reduc nivelul transcripției și uneori represează funcția unor gene.

Acțiunea activatorilor și inhibitorilor este limitată la o anumită genă de către niște secvențe "izolatoare" ("insulators") care blochează răspândirea efectului unor “agenți” ce intensifică sau atenuează transcripția.

B.2. Regiunea laterală 3'

Orice genă se termină în regiunea 3' cu o secvență netranscrisă, care flanchează "cadrul de lectură a genei" sau zona ei centrală. Această secvență nu este întru-totul cunoscută, dar existența ei certă îi conferă teoretic un rol structural sau funcțional. În această regiune se găsesc secvențe semnal care afectează procesarea, stabilitatea și durata de viață a ARNm. Se mai știe că la unele gene (ex. gena beta-globinei) în această regiune 3' a genei se pot găsi secvențe reglatoare de tip activator („enhancer”) (Fig. 2.7).

Fig. 2.7. Dispunerea secvențelor care alcătuiesc regiunile  laterale  sau  secvențele   de reglare  a  genei ale unei gene eucariote

2.3.3.2. GENE CU COPII MULTIPLE. STRUCTURA ȘI FUNCȚII

În cazul în care molecula ARN transcrisă este direct funcțională (ARNr, ARNt sau snARN), sau proteina codificată este necesară în cantități foarte mari în celulă este necesară prezența unui număr mare de gene identice sau gene cu copii multiple.

S-a demonstrat că o genă unică poate fi matriță pentru sinteza a 104 molecule ARNm, iar fiecare moleculă ARNm poate fi matriță pentru sinteza a 105 proteine. Deci o singură genă stă la baza sintezei a 109 molecule de proteine.

Atât la vertebrate cât și la nevertebrate, genele care codifică ARN ribozomal și alte tipuri de ARN, cum ar fi cel implicat în procesul de splicing ARN apar sub forma unor structuri repetate în tandem. Acestea se diferențiază de genele duplicate care alcătuiesc familiile de gene deoarece codifică proteine sau molecule de ARN funcțional identice.

A. GENELE RIBOSOMALE

Genele ribosomale, care codifică ARNr sunt transcrise cu ajutorul ARN polimerazei I. Se găsesc dispuse în unități repetate în tandem localizate în regiunile denumite "organizatori nucleolari", care formează nucleolii în nucleul interfazic (~ 300 copii în genomul uman). Aceste regiuni codifică trei subunități ribosomale 18 S, 5,8 S și 28 S. Cea de-a patra subunitate ARNr 5S este codificată de gene situate într-o altă regiune a nucleului. Deși porțiunile transcrise ale genelor ARNr sunt aceleași la fiecare individ, regiunile interne transcrise pot să difere (Fig. 2.8).

Fig. 2.8. Dispunerea secvențelor care alcătuiesc unitațile repetitive care codifică ARN ribosomal

NTS – regiuni netranscrise

ITS – regiuni interne transcrise

ETS – regiuni externe transcrise

Genele ribosomale sunt prezente în copii multiple în genom deoarece în cazul ARN implicat în biogeneza ribosomilor procesul amplificării în cursul translației nu este posibil – aceste molecule de ARN sunt produsul final al transcrierii genelor.

În fiecare celulă și cu precădere în cele active din punct de vedere metabolic, sinteza proteinelor este accentuată, necesitând un număr mare de ribozomi. Prin urmare sunt necesare cantități mari de ARN ribosomal, care să stea la baza formării subunităților ribozomale.

B. ADN MODERAT REPETITIV

Unele dintre secvențele ADN moderat repetiv codifică anumite proteine, sau ARN, iar altele reprezintă secvențe necodante, ale căror funcții sunt mai puțin cunoscute.

Genele pentru ARNt (~ 500 copii în genomul uman) și alte molecule mici de ARN sunt transcrise cu ajutorul ARN polimarezei III. Se gasesc dispuse în grupe de gene repetate în tandem fiind localizate pe diferiți cromozomi.

Genele care codifică moleculele ARN de dimensiuni reduse, implicate în procesul de eliminare a intronilor se găsesc într-un număr de

~ 500 copii în genomul uman.

Genele care codifică histone sunt prezente în număr variabil, în funcție de organism; astfel, la drojdii există doar două copii pentru fiecare tip de histone, la alte specii, de exemplu ariciul de mare se ajunge la un număr de 300-1000 de copii. Caracteristic pentru genele histonice este absența intronilor și a secvențelor terminale poly(A). S-a emis ipoteza că absența acestor structuri ar facilita sinteza și transportul foarte rapid prin citosol al histonelor.

Un procent foarte mare din ADN genomic este alcătuit din gene sau secvențe ADN necodante. Astfel se evidențiază ADN satelit, care are un rol structural și se gaseste în anumite regiuni cromozomiale cum ar fi centromerul, telomerul sau constricțiile secundare, alcătuind heterocromatina constitutivă. Se diferențiază două tipuri de ADN satelit și anume:

minisateliții hipervariabili (sau VNTR de la "variable number of tandem repeats"), alcătuiți din secvente scurte 10-100 bp, repetate în tandem de 20-50 de ori, dispersate în toți cromozomii, ocupând anumite regiuni precise, relativ scurte (1-5 kb);

microsateliții, secvențe de 1-13 bp (de cele mai multe 2, 3 sau 4 bp), repetate de 10 -100 de ori. Sunt formați cel mai adesea din repetiția unui dinucleotid, dar pot fi și secvențe tri sau tetranucleotidice, cu o structură variabilă, avand o distribuție uniformă în genom. Secvența CA este foarte frecventa în genomul uman și se găsește la fiecare mie de perechi de baze.

Secventele de mini și micro sateliți pot fi utilizate ca markeri genetici, deoarece sunt specifice fiecarui individ în parte. Se cunoaște că fiecare regiune alcătuită din secvențe scurte repetate se diferențiază din punctul de vedere al numarului de unități repetitive și totodată datorită secvențelor care mărginesc regiunea repetitivă. Pe baza acestor secvențe s-au dezvoltat tehnicile de amprentare, cu utilizare în cartarea genomurilor, analiza cromozomala, evaluarea variabilitații, identificarea speciilor sau a indivizilor și diagnostiul molecular. Se consideră că probabilitatea de a găsi doi indivizi identici, neîrudiți având același profil la nivelor

O altă categorie de secvențe repetate sunt IRS "interspersed repeated sequences"), alcătuite dintr-un număr mare de copii, răspândite în întregul genom. Acestea sunt cunoscute și sub numele de secvențe ADN moderat repetate și formează 25 – 50% din genom la mamifere și 45% la om.

Deoarece aceste secvențe au proprietatea unică de a se deplasa în genom, ele sunt denumite elemente transpozabile mobile, sau transpozoni. Procesul prin care aceste secvențe sunt copiate și inserate într-o nouă poziție în genom poartă numele de transpoziție.

Dacă transpoziția apare în celulele germinale, secvențele transferate în noile poziții sunt transferate generațiilor următoare. Astfel, elementele mobile s-au multiplicat și acumulat în genomul eucariot de-a lungul evoluției, constituind acum o parte semnificativă din genomul multor eucariote. Transpozonii nu sunt numai o sursă pentru creșterea cantității de ADN din genom, dar constituie un al doilea mecanism care, pe lângă recombinarea meiotică a produs o restructurare a materialului genetic de-a lungul evoluției.

Au fost evidențiate două clase de transpozoni, în funcție de mecanismul de inserare a secvențelor ADN.

Clasa I – Retrotranspozoni, sau transpozoni ARN, care acționează prin copierea unor fragmente ADN și inserția lor înapoi în genom, în poziții multiple (sistemul “copy – paste”). Prima dată are loc copierea secvențelor retrotranspozonilor în ARN, prin transcripție, după care are loc un proces de revers-transcripție prin care molecula de ARN este copiată în ADN, care este inserat înapoi în genom. Retrotranspozonii se comportă similar cu retrovirusurile, conducând la ipoteza posibilei origini evolutive a acestora. Au fost caracterizate trei categorii diferite de retrotranspozoni și anume:

Retrotranspozonii virali, care codifică revers-transcriptaza și au secvențe terminale repetitive cu lungime mare, denumite LTR (“long terminal repeats”).

Retrotranspozonii non-virali, care codifică revers-transcriptaza, dar nu posedă secvențe terminale repetitive cu lungime mare (LTR), se împart la rândul lor în două categorii:

Secvențele LINE ("long interspersed repeated sequences") cu lungimea de 6 kb, prezente în circa 900.000 copii, dispersate în genom; Secvențele LINE sunt probabil implicate în împerecherea corectă a cromozomilor omologi în meioză, ceea ce asigură desfășurarea optimă a mitozei.

Secvențele SINE ("short interspersed repeated sequences") sunt secvențe scurte de 100 – 400 bp, prezente în circa 500.000 de copii (13% din genomul uman), dispersate în cromozomi în 1,6 milioane de situsuri; dintre acestea 1,1 milioane sunt reprezentate de elementele Alu, denumite astfel deoarece conțin un singur situs de recunoaștere pentru enzima de restricție Alu I. Funcția lor nu este cunoscută, considerându-se că au o implicare în inițierea replicării în anumite puncte din genom.

Pseudogene, care provin din molecule ARNm maturate (au suferit procesele de eliminare a intronilor și poliadenilare). Aceste molecule sunt supuse unui proces de revers-transcripție, după care fragmentul ADN nou sintetizat este inserat înapoi în genom.

Clasa II – Transpozoni ADN, care se diferențiază de cei din clasa I prin mecanismul lor de transpoziție, care nu necesită un intermediar ARN. Astfel, transpozonii din clasa II se deplasează printr-un mecanism tăiere-inserare (“cut and paste”), cu ajutorul unei enzime specifice – transpozaza.

Mecanismele de transpoziție ale diferitelor tipuri de transpozoni sunt descrise amplu în capitolul 3.1.3.2.

2.4. GENOMUL  MITOCONDRIAL

Mitocondriile au dimensiuni destul de mari, astfel că pot fi vizualizate la microscopul optic, iar ADN mitocondrial (ADNmt) poate fi detectat prin microscopie în fluorescență.

Studiile comparative au evidențiat un număr diferit de molecule ADNmt, cu dimensiuni variabile, în mitocondriile diferitelor specii.

De cele mai multe ori genomul mitocondrial al celulelor animale este definit printr-un singur tip de ADN circular, bicatenar format din ~16kb, caracterizat printr-o mare densitate de gene, alcătuite numai din exoni, amplasate pe ambele catene (Fig. 2.9).

La organismele animale ADNmt codifică cele două tipuri de ARNr, care intră în alcătuirea ribozomilor mitocondriali, 22 molecule de ARNt, implicate în procesul de sinteză a proteinelor și 13 proteine implicate în lanțul de transport al electronilor și sinteza ATP.

Fig. 2.9 Structura genomului mitocondrial al unei celule animale

Proteinele sintetizate în mitocondriile celulelor animale sunt identificate ca fiind subunități ale unor complexe multimerice necesare în transportul electronilor, sinteza ATP și inserția proteinelor în membrana mitocondrială internă sau în spațiul intermembranar și sunt sintetizate cu ajutorul ribozomilor mitocondriali. Codul genetic utilizat la sinteza acestor proteine este diferit de cel standard și poate să difere chiar între specii.

Totuși, marea majoritate a proteinelor implicate în procesul de respirație celulară sunt codificate de ADN nuclear, sintetizate în citosol și importate în mitocondrii prin procese specializate de transport, care vor fi discutate în capitolele următoare.

O caracteristică a genomului mitocondrial vegetal este dimensiunea și complexitatea. Astfel, în cazul plantei model Arabidopsis thaliana, ADNmt are dimensiuni de 367 kb, iar ADN mitocondrial cu cele mai mari dimensiuni a fost identificat la plante din familia cucurbitaceelor, cu o lungime de aproximativ 2 Mb.

În cazul celulelor vegetale s-au evidențiat diferențe majore față de cele animale, deoarece marea majoritate a ADNmt nu codifică proteine. ADNmt vegetal este alcătuit din introni, pseudogene, elemente de ADN mobil, care nu părăsesc mitocondria și fragmente de ADN străin, provenit de la cloroplaste, ADN nuclear sau viral. Se consideră că aceste fragmente au fost inserate în genomul mitocondrial de-a lungul evoluției. Secvențele duplicate contribuie de asemenea la dimensiunile mari ale ADNmt vegetal.

În mitocondriile celulei vegetale este sintetizat un număr redus de proteine (15-20). Acestea sunt subunități componente ale lanțului de transfer al electronilor, sau parte a complexului ATPazic. Restul proteinelor necesare pentru desfășurarea procesului de respirație celulară sunt sintetizate în citozol și importate în mitocondrii.

O altă caracteristică importantă a moleculelor ADNmt vegetal este aceea că nu conțin un set complet de gene care codifică ARNt, dar conțin un număr de aproximativ 16 gene ARNt, specifice pentru 12-16 aminoacizi. Restul de molecule de ARNt (până la totalul de 20) sunt importate din citozol.

Spre deosebire de celulele animale, în cazul celor vegetale codul genetic utilizat la sinteza proteinelor în mitocondrii este identic cu cel standard.

Trebuie subliniat că atât în cazul celulelor animale cât și vegetale genomul mitocondrial al zigotului provine exclusiv de la ovul, deci de la mamă. Se poate spune că genele mitocondriale au o transmitere exclusivă pe cale maternă.

2.5. GENOMUL CLOROPLASTIC

Cloroplastele, de altfel ca toate plastidele au evoluat dintr-o bacterie endosimbiotică fotosintetizatoare ancestrală. Acest eveniment simbiotic care a condus la apariția cloroplastelor a avut loc mai recent (1,2-1,5 miliarde de ani), comparativ cu cel care a condus la apariția mitocondriilor (1,5 – 2,2 miliarde de ani). De aceea, în prezent ADNcp prezintă o diversitate mai redusă comparativ cu mitocondriile.

Cloroplastele pot fi întâlnite la toate celulele vegetale, reponsabile cu fotosinteza, astfel că într-o celulă tipică parenchimatică se găsesc în jur de 10-100 cloroplaste.

Similar cu mitocondriile, cloroplastele conțin copii multiple de ale genomului cloroplastic (ADNcp) și ribozomi, care stau la baza sintezei unui număr redus de proteine, pe baza codului genetic standard.

La plantele superioare ADNcp are o lungime de 120-160 bp lungime, în funcție de specie. Inițial s-a considerat că are o structură circulară, pentru că în organismul model Chlamydomonas reinhardtii harta genetică este circulară.

Totuși, studii recente au arătat ca ADNcp este de fapt alcătuit din concatemeri liniari cu lungime mare, legați “cap-coadă”, care suferă o serie de recombinări și care conduc la niște structuri aparent circulare, în urma adoptării unor conformații specifice (Fig. 2.10).

Studiile asupra ADN cloroplastic au avansat, astfel că în prezent a fost deja determinată secvența completă a câtorva ADNcp din plantele superioare.

Numărul mediu de gene se încadrează în intervalul 120 – 135. Astfel, cloroplastele plantei model Arabidopsis thaliana au un genom care cuprinde 76 de gene codante pentru proteine și 54 de gene care sintetizează ARNr și ARNt.

Totodată ADNcp codifică subunitățile unei ARN polimeraze asemănătoare cu cea bacteriană, iar multe gene sunt alcătuite din operoni, la fel ca în cazul bacteriilor. Unele gene cloroplastice conțin introni, dar aceștia sunt mai asemănători cu intronii specializați găsiți în unele gene bacteriene și în genele mitocondriale ale unor fungi și protozoare, decât cu cei nucleari.

Marea majoritate a proteinelor implicate în procesul de fotosinteză sunt codificate de ADN nuclear, sintetizate în citozol și importate în cloroplastele prin procese specializate de transport, care vor fi discutate în capitolele următoare.

La fel ca în cazul mitocondriilor, genomul cloroplastic provine exclusiv de la ovul, deci transmiterea genelor cloroplastice are o ereditate maternală.

Fig. 2.10. Structura ADN cloroplastic și procesul de replicare ADN, dependent de recombinare

(A) Capătul unui genom monomeric se recombină cu o altă moleculă și inițiază replicarea. Dacă se urmează calea (1) este generat un produs concatemeric “cap-coadă”. Are loc apoi secționarea cu o enzimă de restricție în două poziții (situsurile sunt marcate cu ), rezultând genomul cloroplastic; Dacă are loc o recombinare alternativa, din sens opus, este urmată calea (2), rezultând un produs concatemeric “cap-coadă” cu un segment inversat. Gemomul format în cel de-al doilea caz are o lungime mai mare comparativ cu prima variantă.

(B) O structură multigenomică produsă prin replicare dependentă de recombinare.

(C) Forme circulare ale genomului, produse prin recombinare moleculară („flipping”).

Structura ADNcp, menționată anterior subliniază înaltul grad de polimorfism, care a permis dezvoltarea unei game largi de markeri moleculari. Este posibilă astfel caracterizarea genetică a unor populații, evaluarea diversității, stabilirea gradului de înrudire și totodată analize filogenetice.

CAPITOLUL III

MECANISMELE MOLECULARE

ALE SINTEZEI ȘI PRELUCRĂRII PROTEINELOR

În celulele animale sinteza proteinelor are loc în două compartimente subcelulare, citoplasma și mitocondriile. În mitocondrii sunt codificate un număr de 10-12 proteine, dar marea majoritate a proteinelor necesare în aceste compartimente sunt sintetizate în citozol și importate în mitocondrii prin procese specializate de transport. Codul genetic care coordonează sinteza proteinelor în mitocondrii este diferit de cel standard.

În plante, sinteza proteinelor are loc în trei compartimente subcelulare. Citoplasma, plastidele și mitocondriile conțin sisteme diferite de sinteză a proteinelor. Aproximativ 75% dintre proteinele celulare sunt sintetizate în citoplasmă, unde ARNm este tradus. Într-o celulă activă din punct de vedere fotosintetic (de exemplu celule mezofilice tinere), aproximativ 20% dintre proteine sunt sintetizate în cloroplaste, prin translația ARNm transcris după genomul cloroplastic. O proporție mai mică de proteine (2-5%) sunt sintetizate în mitocondrii, fiind codificate de gene din genomul mitocondrial. În celulele vegetale este respectat codul genetic standard, în toate cele trei compartimente în care au loc sinteze proteice.

În general, mecanismul sintezei proteice este considerat un proces de traducere, translație a celor patru litere (A, T, G, C) ale alfabetului acizilor nucleici în alfabetul complet diferit al proteinelor.

Din punct de vedere teoretic secvența de aminoacizi dintr-o proteină reprezintă un analog al secvenței nucleotidice dintr-un anumit fragment de ADN, între aceste două macromolecule existând o colinearitate.

Acest proces de traducere sau translație necesită interacțiunea unui număr mai mare de 100 de macromolecule (ARNm, ARNt, enzime activatoare, factori proteici, ribozomi). Fiecărui aminoacid îi corespunde cel puțin o enzimă activatoare și cel puțin o moleculă de ARNt.

Sinteza proteică atât la procariote cât și la eucariote are loc în două etape și anume:

transcripția sau transcripția (transportul informației de la nivelul ADN-ului la ARNm);

translația sau traducerea informației ajunse la nivelul ribozomilor în secvențe specifice de aminoacizi din lanțul peptidic, care se sintetizează la nivelul respectivilor ribozomi.

În cazul celulelor procariote, atât transcripția cât și translația au loc în citoplasmă, iar în cazul celulelor eucariote procesele sunt separate în spațiu, astfel că transcripția – sinteza ARN se desfășoară în nucleu, iar translația, sau sinteza proteinelor are loc în citoplasmă (Fig. 3.1).

Fig. 3.1. Desfășurarea proceselor de transcripție și translație în celula procariotă, respectiv eucariotă

În ultima perioadă s-a demonstrat că sinteză proteinelor nu se finalizează o dată cu translația. După eliberarea lanțului polipeptidic sintetizat la nivelul ribozomilor, pentru a deveni activă, o proteină trebuie să fie supusă unor modificări post-translaționale de ordin chimic și conformațional, în urma cărora devine stabilă și funcțională. Apoi proteinele sunt orientate spre un organit țintă cu ajutorul unor secvențe de localizare. La destinație, secvențele care au avut rolul de a orienta deplasarea proteinei în celulă sunt eliminate, rezultând proteina, în forma funcțională finală (Fig. 3.2).

Fig. 3.2. Procesele care au loc de-a lungul transferului de informație, de la genă la proteina funcțional activă

3.1 MECANISMELE MOLECULARE ALE TRANSCRIERII GENETICE

Transcripția genetică este un fenomen complex, prin care se asigură transferul informației genetice de la ADN, care servește ca matriță pentru sinteza ARN. Toate tipurile de ARN sunt codificate la nivel de ADN, dar numai ARNm este capabil să transmită mai departe mesajul genetic la proteine.

Transcripția este mediată de ARN-polimerază, o enzimă care are capacitatea de a recunoaște secvențe specifice din molecula de ADN si de a iniția sinteza unei molecule ARN, pe baza complementarității bazelor azotate.

Spre deosebire de ADN-polimerază, ARN-polimeraza poate realiza sinteza de novo, fără a necesita un primer, ci numai molecula ADN matriță, pe care urmează să o copieze.

În celulele procariote se găsește cel mai adesea o singură ARN-polimerază, iar în celulele eucariote au fost caracterizate trei tipuri de ARN polimeraze, care sunt localizate în anumite regiuni ale nucleului, în funcție de produșii finali de sinteză.

În cadrul procesului de transcripție ARN-polimeraza recunoaște o secvență specifică de nucleotide dintr-o catenă de ADN, denumită promotor, la care se atașează; apoi, cele doua catene ale ADN se separa printr-un proces de denaturare fiziologica si incepe sinteza unei molecule ARN, în secvența căreia sunt prezente ribonucleotide ce stabilesc legături de hidrogen cu ADN, pe baza complementarității dintre bazele azotate. Se formează astfel un hibrid ADN-ARN temporar între ADN matriță și catena nou sintetizată de ARN. Aceasta catena ARN este sintetizata intotdeauna in directia 5’→3’, descifrand catena ADN pe care o copiaza in directia 3’→ 5’ (Fig. 3.3.). Astfel, la gruparea OH de la capatul 3’ al catenei ARN in formare sunt adaugati ribonucleozid-trifosfați, printr-o reactie de esterificare in urma careia se elibereaza grupări pirofosfat.

Transcripția realizată de ARN-polimerază este un proces similar cu replicarea, prezentand etapele de inițiere, elongare și terminare.

Fig. 3.3. Desfășurarea procesului de transcripție a genelor, în prezența ARN-polimerazei

Teoretic există posibilitatea ca oricare dintre cele două lanțuri ADN care alcătuiesc o genă să fie copiat în câte o moleculă de ARN. Deci, pentru o genă ar exista două lanțuri de ARN complementare, care ar codifica două proteine diferite. De fapt numai unul dintre cele două lanțuri ale genei este transcris, deci o genă codifică o singură proteină, promotorul având un rol determinant în acest proces.

3.1.1. MECANISMUL REACȚIEI DE TRANSCRIPȚIE ÎN CELULELE PROCARIOTE

În cazul celulelor procariote materialul genetic este organizat sub forma operonilor, care sunt alcătuiți din mai multe gene reglate împreună. Pentru transcripție există o singură ARN-polimerază care este responsabilă pentru sinteza tuturor celor trei specii de ARN (ARNr, ARNm și ARNt).

Cea mai cunoscută ARN-polimerază, care a stat la baza celor mai complexe studii a fost enzima extrasă și purificată din celulele bacteriene E. coli.

Aceasta are o masă moleculară de 49.000 Da și conține patru subunități diferite α2, β, β’, σ, care alcătuiesc două structuri de bază:

– subunitățile α2 β β’ formează structura centrală, corpul sau miezul enzimei, care este implicat în sinteza ARN, dar nu poate iniția reacția;

– subunitatea σ constituie structura implicată în legarea enzimei la promotor.

În condiții intracelulare normale, molecula de ARN-polimerază recunoaște și se leagă de situsurile de ințiere specifice – promotorii și transcrie numai una dintre catenele ADN dublu catenare.

Regiunea promotor la procariote este alcătuită din două secvente: TATAAT localizată pe catena ADN în poziția -10, în amonte de situs-ul de start pentru sinteza ARNm (+1) și TTGACA, în poziția -35. Componența regiunii de reglare a genelor în celulele procariote a fost descrisă detaliat în cadrul capitolului 2.2.1.

Legarea ARN-polimerazei la un anumit promotor este determinată de interacțiunea cu proteine de reglare, care afectează abilitatea ei de a recunoaște situsurile start. Aceste proteine de reglare pot să acționeze atât ca activatori cât și ca represori, accesul ARN-polimerazei la regiunea promotor fiind în multe cazuri reglată de interacțiunea lor cu regiunea denumită operator.

Sunt urmate apoi etapele specifice procesului de transcripție:

Subunitatea σ se asociază cu corpul enzimei, având rolul de a menține enzima într-o conformație aptă pentru a se lega la situsul de ințiere de pe ADN matriță (la nivelul promotorului).

Legarea ARN-polimerazei este urmată de separarea celor două catene ADN și schimbarea conformațională a enzimei. Apoi, primul nucleozid 5’-trifosfatat (cel de inițiere), care este întotdeauna ATP sau GTP se leagă la ARN-polimerază pentru a forma complexul de inițiere.

Legarea celui de-al doilea nucleozid 5’- trifosfatat, de obicei UTP sau CTP determină formarea primei legături internucleotidice. Prin atacul nucleofil al grupării 3’ – hidroxil al nucleozid- 5’- trifosfatului purinic de inițiere asupra atomului de fosfor α din cel de-al doilea nucleozid-trifosfat se formează prima legătură fosfodiesterică, eliberându-se pirofosfatul anorganic.

Se observă că nucleozid – trifosfatul purinic de inițiere își menține, după atașarea nucleotidului secundar și a resturilor nucleotidice succesive, gruparea 5’– trifosfat. Această grupare permite astfel recunoașterea capătului 5’-terminus al moleculei ARN.

Creșterea și sinteza catenelor de ARN.

O dată unite cele două resturi nucleotidice, creșterea catenei are loc rapid, transcripția făcându-se în direcția 5’-3’, antiparalelă direcției 3’-5’ din catena de ADN matriță. În cursul creșterii, un segment de ARN nou sintetizat formează un duplex hibrid ARN-ADN complementar, de tranziție, mult mai puțin stabil decât duplexurile ADN-ADN. De aceea catena de ARN are tendința de a se separa de ADN la bifurcația de transcripție.

După atașarea a 8-9 nucleotide factorul σ disociază de restul ARN-polimerazei, formând enzima activă care continuă replicarea ADN matriță. Factorul σ devine astfel disponibil pentru inițierea unei noi catene de ARN, cu o altă parte centrală a enzimei.

Creșterea catenei continuă de-a lungul matriței ADN până când molecula de ARN-polimerază primește semnalul stop pentru terminarea transcrierii. Semnalele stop specifice sunt necesare, deoarece altfel ARN ar fi sintetizat la infinit.

Maturarea sau prelucrarea lanțului ARN are loc în funcție de tipul celulei în care a avut loc transcripția și totodată de tipul de ARN transcris.

Deci, ARN-polimeraza atașează la capetele 3’–hidroxil ale catenei ARN, unități mononucleotidice, sintetizând ARN în direcția 5’-3’, antiparalelă catenei ADN folosită ca matriță. Ca în cazul ADN polimerazei, hidroliza enzimatică a pirofosfatului face ca reacția să decurgă în celulă în sensul sintezei ARN (Fig. 3.4).

Molecula ARN nou formată are o compoziție bazică complementară celei din catena matriță.

Fig. 3.4. Mecanismul molecular al reacției de transcripție

3.1.2. MECANISMUL MOLECULAR AL REACȚIEI DE TRANSCRIPȚIE ÎN CELULELE EUCARIOTE

Mecanismul de sinteză a unei noi molecule ARN, avînd ca matriță ADN este identic în celulele eucariote cu cel al procariotelor. La eucariote însă aparatul de transcripție este mult mai complex și mai puțin cunoscut decât la procariote. Într-o celulă eucariotă există trei tipuri de ARN-polimeraze nucleare. Ele ocupă poziții distincte în spațiul nuclear și fiecare tip de enzimă prezintă o structură complexă (Tabel 3.1 )

Tabelul 3.1 Caracterizarea și localizarea ARN-polimerazelor nucleare

U1, U2, U3, U4, U5, U6 – molecule de ARN de dimensiuni mici, implicate în procesul de eliminare a exonilor („RNA splicing”)

ARN-polimeraza I este localizată in nucleol, iar celelalte două se găsesc în nucleoplasmă. Cele trei ADN polimeraze prezente in nucleu sunt alcatuite din mai multe subunitati polipeptidice, avand mase moleculare de cel putin 500 kDa. In celulele eucariote au fost identificate ARN polimeraze si in organitele citoplasmatice – mitocondrii si cloroplaste, acestea avand dimensiuni mai reduse comparativ cu ARN polimerazele nucleare, fiind mai asemanatoare enzimelor caracterizate la procariote.

Fiecare celulă eucariotă conține între 2×104 și 2,3 x107 molecule de ARN-polimeraze. Celulele mamiferelor conțin aproximativ 4 x104 molecule de ARN-polimerază I și aproape același număr de molecule de ARN-polimerază III. Numărul lor depinde totuși de rata creșterii și de gradul de diferențiere al celulelor respective.

Mecanismul reacției de transcripție este similar celui din celulele procariote, având însă câteva deosebiri esențiale. La eucariote transcripția se produce pe ADN legat în nucleozomi. Pentru ca ARN-polimeraza să se poată lega la promotori este necesar ca molecula de ADN să sufere niște modificări de conformație. Totodată, în cazul celulelor eucariote se sintetizează precursori ai ARN, care necesită procese de maturare complexe. Există numai câteva specii de ADN mici și stabile, transcrise de ARN-polimeraza III, care nu suferă procese de maturare.

Spre deosebire de procariote, în celulele eucariote nici una dintre cele trei tipuri de ARN-polimeraze nu recunosc promotorul în mod direct ci prin intermediul unor factori de transcripție, inițiindu-se astfel procesul de transcripție. Factorii de transcripție au aceleași funcții pentru toate tipurile de ARN-polimeraze, numărul lor fiind mai mare în cazul ARN-polimerazei II.

Dacă ARN-polimerazele sunt universale, identice pentru toate celulele și țesuturile, factorii de transcripție sunt specifici pentru anumite țesuturi. Ei joacă un rol important în diferențierea celulară și menținerea tipurilor de celule.

Pe lângă acești factori de transcripție, implicați direct în sinteza ARN există și proteine care reglează desfășurarea procesului, în sensul că îl intensifică, atenuează sau blochează. Acestea sunt proteine reglatoare, care similar cu factorii de transcripție au capacitatea de a se lega la ADN. În această categorie de proteine intră receptorii hormonali steroidici, care transportă hormonii în nucleu și interacționează cu secvențele specifice ADN, inițiind, accelerând sau blocând transcripția unor gene.

Factorii de transcripție care intervin în proces sunt proteine multimerice, denumite TF II A, TF II B, etc. Factorul de transcripție cu cea mai mare dimensiune este TF II D, alcătuit dintr-o proteină de legare la regiunea TATA – TBP („TATA-box-binding protein”) și 13 factori asociați – TAF.

Procesul de transcripție parcurge în continuare mai multe etape:

Prima dată proteina TBP („TATA-box-binding protein”) se leagă la regiunea TATA, după care este posibilă și legarea factorului de transcripție TF II B. Acest factor de transcripție este o proteină monomerică, de dimensiuni puțin mai reduse comparativ cu TBP. Domeniul C-terminal al factorului de transcripție intră în contact atât cu TBP, cât și cu secvența ADN, într-o parte a regiunii TATA, în timp de domeniul N-terminal se extinde spre situsul de transcripție.

Factorul de transcripție TF II F formează un complex tetrameric cu ARN-polimeraza, după care se leagă la nivelul situsului start al transcrierii.

La complexul TF II F – ARN-polimerază-ADN se leagă și alți factori de transcripție (TF II E și TF II H), necesari pentru formarea complexului de preinițiere a transcrierii. Prima dată se leagă TF II E, un complex tetrameric, care crează situsul de legare pentru TF II H, care este un factor multimeric alcătuit din 10 subunități.

Activitatea de helicază a unei subunități din TF II H, utilizează energia furnizată de hidroliza ATP pentru a desface dublul helix ADN la nivelul situsului start al transcripției. Se permite astfel ARN-polimerazei să formeze un complex deschis în care ADN este disociat, iar catena ADN matriță (care urmează să fie transcrisă) se leagă la situsul activ al polimerazei.

ARN-polimeraza începe sinteza moleculei ARN, cu ajutorul ribonucleozid-trifosfaților prezenți în mediu.

În continuare are loc elongarea transcriptului, după același mecanism descris în cazul celulelor procariote.

În rezumat putem spune ca transcripția urmează următorii pași importanți: legarea factorilor de transcripție și menținerea duplexului ADN; menținerea stării active a genei țintă sub acțiunea altor factori transcripționali și legarea ARN-polimerazei; discocierea moleculei ADN și activarea ARN-polimerazei cu ajutorul energiei furnizate de hidroliza ATP; inițierea transcripției, a sintezei ARN; elongarea transcriptului.

Procesul de transcripție este specific fiecărui tip de ARN sintetizat, respectiv ARN-polimerază implicate. In urma reacțiilor de transcripție se formează precursori ai ARN, care suferă apoi multiple procese de prelucrare, pentru a rezulta forma lor activă. Particularitățile fiecărei clase de ARN plimeraze vor fi prezentate în continuare.

MECANISMUL MOLECULAR DE ACȚIUNE AL ARN-POLIMERAZEI I

ARN-polimeraza I este localizată în nucleol și catalizează în celulele eucariote sinteza a trei tipuri de ARN ribozomal și anume ARNr 28S, ARNr 18S și ARNr 5,8S, care vor intra în alcătuirea ribozomilor.

Studiile cele mai ample cu privire la structura și modul de acțiune s-au efectuat asupra ARN-polimerazei din celulele animale. În acest caz enzima transcrie genele care codifică ARNr, amplasate în copii multiple pe anumiți cromozomi, în regiuni speciale denumite organizatori nucleolari. Cromozomii sunt astfel dispuși în celulă încât toți organizatorii nucleolari sunt orientați într-o anumită regiune, denumită nucleol.

Deci, nucleolul este alcătuit din bucle mari de ADN care provin de la diferiți cromosomi, fiecare buclă conținând o serie de copii multiple ale genelor ARNr. În această regiune genele ARNr sunt transcrise cu o viteză foarte mare de către ARN-polimeraza I.

Deoarece au un aranjament repetitiv și pentru că trascrierea lor are loc cu o viteză foarte mare, genele ARNr dispuse în serie pot fi ușor evidențiate prin tehnicile de microscopie electronică. Pe o singură genă efectuează transcripția, în mod succesiv până la 100 de molecule de ARN-polimeraze I, ARN transcris dispunându-se perpendicular pe molecula de ADN. Astfel, fiecare „unitate de transcripție” are aspectul unui brad, structură ușor de vizualizat. Tot în nucleol ARNr este imediat împachetat cu proteinele ribozomale pentru a genera precursorii ribozomali.

A. MECANISMUL MOLECULAR AL TRANSCRIERII ARN RIBOZOMAL (ARNr) DE CĂTRE ARN-polimeraza I

Genele ribozomale din nucleul celulelor eucariote au copii multiple repetate în tandem și codifică precursori ai ARNr. Astfel, genele care codifică cele trei forme ale ARNr și anume 18S, 5,8 S și 28 S sunt toate transcrise ca o singură unitate, rezultând un produs cu o lungime foarte mare. Această moleculă conține, pe lângă cele trei tipuri ARNr și regiunile interne cât și cele externe transcrise. După aceea acest produs este împărțit în lanțuri polipeptidice mai scurte, necesare pentru asamblarea ribozomilor (Fig. 3.5).

Produsul inițial de transcripție reprezintă un precursor ARNr, cu masa 45 S, care se scindează apoi în două molecule cu mase de 32, respectiv 20S. Molecula 32 S se scindează la rândul ei, dând naștere moleculelor ARNr 28 S și 5,8 S. Molecula 20 S va genera în final, după prelucrare molecula ARNr 18 S. Moleculele de ARNr au o conformație complexă, alcatuita din regiuni monocatenare si bicatenare, formate datorita unor secvente complementare din structura lor.

Moleculele ARNr 28 S, 5,8 S și 5 S se vor asocia cu proteine și vor da naștere precursorilor subunității ribozomale mari. ARNr 5 S este transcris de o genă separată, care are și ea copii multiple, amplasate în afara nuleolului.

Molecula ARNr 18 S se va asocia cu proteine și va da naștere precursorilor subunității ribozomale mici.

Fig. 3.5 Sinteza moleculelor ARNr – transcripția precursorilor și prelucrarea ulterioară a acestora

B. MECANISMUL DE FORMARE A PRECURSORILOR RIBOZOMALI ÎN CELULELE EUCARIOTE

ARNr reprezintă aproximativ 80-85% din cantitatea totală de ARN celular, intrând în structura ribozomilor. Ribozomii sunt particule nucleoproteice citoplasmatice implicate în sinteza proteinelor, contribesajului uind la transformarea mesajului genetic dintr-o secvență de ribonucleotide din ARNm într-o secvență de aminoacizi din catena polipeptidică.

Ribozomii din celulele eucariote au o constantă de sedimentare de 80S fiind alcătuiți dintr-o subunitate mică de 40S și o subunitate mare de 60S. Ribozomii din organitele celulelor eucariote (mitocondrii și cloroplaste) sunt de tip procariot, avand o constanta de sedimentare de 70S.

Ribozomii conțin 40-60% ARN, restul fiind reprezentat de proteine bazice ribozomale (75-80 tipuri). In medie, diametrul unei particule ribozomale mature este de 12-23 nm.

Imediat după ce a avut loc sinteza moleculelor ARNr, în nucleol începe procesul de formare a precursorilor ribozomali care se vor deplasa în citoplasmă.

În final, subunitatea ribozomală mică conține o moleculă de ARNr 18 S care se asociază cu 33 tipuri de proteine ribozomale, iar în cea mare se găsesc trei tipuri de ARNr (28 S; 5,8 S și 5 S) și 50 tipuri de proteine ribozomale (Fig. 3.6). Molecula ARNr 5S este sintetizată în afara nucleolului și este transferată după transcripție la nivelul situsului de formare a precursorilor ribozomali, în nucleol.

Fig. 3.6. Componența și modul de alcătuire a ribozomilor dintr-o celulă eucariotă

MECANISMUL MOLECULAR DE ACȚIUNE AL ARN-POLIMERAZEI III

ARN-polimeraza III este localizată în nucleoplasmă și catalizează sinteza moleculele ARN cu dimensiuni reduse.

Celulele eucariote conțin un număr mare de molecule de ARN cu o lungime de 300 de nucleotide, sau chiar mai mici. Acestea sunt sintetizate de ARN-polimeraza III, în exteriorul nucleolului.

A. SINTEZA ARN RIBOZOMAL 5S (ARNr 5S)

În plus față de subunitățile ARNr 18 S, 5,8 S și 28 S, care provin din pre-ARNr, celulele eucariote mai conțin o moleculă mică, cu o lungime de 120 de nucleotide, cunoscută ca 5S ARNr.

Aceasta este transcrisă de pe o genă separată, aflată în altă parte pe cromozom (nu în nucleol), dar care posedă și ea copii multiple.

Produsul primar de transcripție al acestei gene este funcțional, ceea ce face ARNr 5S unic între celelalte molecule de ARN din celulele eucariote. Secvența care codifică acest tip de ARN este înalt conservată, fiind identică în toate celulele și totodată în mitocondrii și cloroplaste.

B.SINTEZA ARN DE TRANSFER (ARNt)

ARNt este implicat în activarea aminoacizilor din citoplasmă și în transportarea lor la locul de sinteză a proteinelor în ribozomi. El constituie aproximativ 15% din totalul ARN din celulă, comparativ cu ARNr care reprezintă 80-85%. Genele care codifică ARNt sunt prezente în copii multiple pe cromozomi, dar ele nu sunt așa de înalt repetitive ca ARNr 5S.

Prima dată sunt transcriși precursori ai ARNt care suferă apoi o serie de modificări: micșorarea lungimii, modificări chimice, care să permită adoptarea structurii lor secundare specifice și totodată să asigure buna lor funcționare.

Prelucrarea precursorilor ARNt are loc prin modificarea lungimii – scurtare cu 30-40 de nucleotide și totodată metilarea unui număr mare de baze azotate.

În mod practic s-a constatat că moleculele de ARNt conțin multe baze rare, dintre care cele mai multe sunt formele metilate ale nucleozidelor uzuale. Se consideră că metilarea are loc după transcripție și are ca scop:

să împiedice formarea de legături de hidrogen, în anumite puncte, între bazele complementare ale aceleiași molecule de ARNt, în așa fel încât să poată rezulta structura secundară caracteristică.

Să nu permită formarea de legături de hidrogen între bazele complementare din moleculele de ARNt și ARNm.

Să reducă susceptibilitatea ARNt la atacul hidrolitic al nucleazelor.

Din punctul de vedere al structurii lor primare după prelucrare, există mai multe tipuri diferite de ARNt, cel puțin unul pentru fiecare aminoacid, dar toate au o lungime medie de 75-80 de nucleotide și prezintă aceiași structură secundară.

Secvența de nucleotide a diferitelor tipuri de ARNt prezintă regiuni de complementaritate a bazelor azotate, la nivelul cărora au loc împerechieri intracatenare, astfel încât macromolecula realizează o structură secundară caracteristică, asemănătoare unei frunze de trifoi. Molecula de ARNt cuprinde patru bucle monocatenare, corespunzătoare celor patru regiuni dublu catenare formate prin împerecherea bazelor azotate complementare. Aceste bucle prezintă o mare importanță pentru funcțiile ARNt, la nivelul lor fiind localizate o serie de situsuri specifice (Fig 1.9- capitolul 1.1.3.).

C. SINTEZA ALTOR MOLECULE MICI DE ARN

ARN-polimeraza III contribuie și la transcripția altor molecule mici de ARN. Acestea sunt de obicei asociate cu proteine specifice și formează particulele ribonucleoproteice (RNPs). Ele pot funcționa în nucleu și atunci poartă numele de particule (snRNP) sau în citoplasmă, purtând denumirea de ribonucleo-proteice citoplasmatice (sc RNPs).

Rolul acestor particule depinde de tipul și structura lor (Tabelul 3.2)

Tabelul 3.2 Rolul și localizarea particulelor ribonucleoproteice (RNPs)

MECANISMUL MOLECULAR DE ACȚIUNE AL ARN-POLIMERAZEI II

ARN-polimeraza II este localizată în nucleoplasmă și catalizează sinteza moleculelor ARNm. Într-o celulă există o populație de molecule ARNm, a cărei structură depinde de genele care sunt transcrise la acel moment și poate să difere în funcție de tipul țesutului, etapa de dezvoltare ontogenetică sau de condițiile de mediu.

ARN mesager (ARNm) este numit și ARN informațional, deoarece este implicat direct în copierea informației genetice de pe matrița de ADN și în translația ei în proteine. De aceea, în funcție de mărimea mesajului genetic, moleculele de ARNm pot avea dimensiuni foarte variate. De asemenea, secvența primară de nucleotide este caracteristică fiecărui tip de ARNm, în funcție de mesajul genetic pe care îl poartă.

ARNm se sintetizează în nucleu, prin transcripția genelor corespunzătoare, sub forma unor precursori pre-ARNm. Aceaste molecule precursoare, reprezentând transcriptul primar al genelor, cuprind regiuni codificatoare (exoni) precum și regiuni necodificatoare (introni) și sunt supuse unor serii de modificări post-transcripționale care au ca scop atașarea unor structuri specifice la capetele moleculei de ARN și totodată eliminarea (excizia) intronilor.

După cum s-a arătat în fig. 2.6, structura zonei centrale a unei gene începe cu o regiune netranscrisă, urmată apoi de o regiune transcrisă, dar netradusă în proteină, care se notează de obicei 5’UTR („untranslated region”). Această regiune începe cu situsul de start al transcrieii și se încheie cu codonul start al translației.

La extremitatea 3’ a precursorilor ARNm se găsește o secvența notată 3'UTR, care începe cu codonul stop al translației.

Aceste regiuni transcrise dar netraduse joacă un rol important în prelucrările post-translaționale, inclusiv în stabilirea eficienței cu care ARNm se deplasează din nucleu în citoplasmă, în localizarea subcelulară și în stabilitatea acestuia. Importanța funcțională a acestor regiuni este subliniată de faptul că apariția unor mutații conduce la apariția anumitor afecțiuni.

A. STRUCTURA PRECURSORILOR ARNm

Lungimea medie a regiunii 3'UTR este aproximativ constantă în cadrul diferitelor specii, încadrându-se în intervalul 100-200 de nucleotide, în timp ce lungimea medie a secvenței 3'UTR este mult mai variabilă, de la 200 de nucleotide la plante până la 800 de nucleotide la om.

Regiunea genomică corespunzătoare regiunilor UTR ale unei molecule ARNm poate să conțină și introni, mai frecvent la capătul 5' decât 3'. Compoziția bazelor azotate în cele două regiuni poate de asemenea să difere. Astfel, conținutul G+C în secvența 5'UTR este mai mare, comparativ cu cel din 3'UTR. S-a evidențiat și o corelație interesantă între conținutul de G+C în regiunile 3'UTR sau 5'UTR și prezența acestor baze azotate (G și C) în cea de-a treia poziție a codonilor care alcătuiesc secvența codificatoare. De asemenea s-a constatat o corelație negativă între conținutul G+C în regiunile 3'UTR sau 5'UTR și lungimea acestora. Astfel se poate spune că genele localizate în regiunile bogate în G și C ale cromozomilor au regiuni netranscrise cu lungimi mai reduse.

Ținând cont de structura genelor se poate spune că un precursor al ARNm este alcătuit din mai multe regiuni, înainte de a fi prelucrată.

Regiunea netradusă 5’UTR („untranslated region”), cu rol în controlul translațional;

regiunea codificatoare: codonul de inițiere a translației – AUG, secvența de nucleotide (codoni) pentru sinteza polipeptidului și o secvență stop, reprezentată de unul dintre codonii stop- UAA, UGA sau UAG

Regiunea netradusă 3’UTR („untranslated region”), cu rol în localizarea celulară, transportul ARNm din nucleu în citoplasmă și stabilitatea ARNm.

B. MODIFICĂRI POST-TRANSLAȚIONALE ALE PRECURSORILOR ARNm

Pentru a ajunge la structura finală a moleculei mature, pre-ARNm trebuie să sufere mai multe modificări și anume: adăugarea unei grupări 7-metil guanozina (m7Gppp) la capătul 5’, poliadenilarea la capătul 3’ și eliminarea intronilor (”ARN splicing”). Astfel, molecula ARNm poate fi transferată în citoplasmă, unde își va îndeplini funcția de matriță pentru sinteza lanțurilor polipeptidice.

B1. MODIFICAREA CAPĂTULUI 5’AL MOLECULEI ARNm

Orice tip de moleculă de ARN începe cu un nucleozid 5’ trifosfatat (A sau G), care reprezintă primul nucleotid la care s-a legat ARN-polimeraza și care constituie punctul de pornire al sintezei ARN.

Imediat după începerea transcrierii, la capătul 5’ al ARNm este atașată o moleculă de 7-metil guanozină, sub acțiunea guanil transferazei. Se formează astfel o legătură 5’-5’ trifosfat cu primul nucleozid trifosfatat al ARNm (Fig. 3.7).

Acest capăt m7GpppAp protejează molecula ARNm de degradarea enzimatică, fiind implicat și în procesul de transfer în citoplasmă. De asemenea, leagă un factor proteic care este necesar inițierea sintezei lanțului polipeptidic.

Fig. 3.7 Atașarea capătului m7Gppp la molecula ARNm

B2. MODIFICAREA CAPĂTULUI 3’ AL MOLECULEI ARNm

După transcripția completă, la capătul 3’ al moleculei de ARNm se adaugă 100-250 de resturi de acid adenilic (poly A), proces care poartă numele de poliadenilare și are loc după următorul mecanism:

Secvența 5’–AAUAAA- 3’, amplasată la extremitatea 3’ a regiunii 3’ UTR mediază desprinderea moleculei de ARN sintetizate, de pe catena matriță, în aval cu 15-30 nucleotide.

Aceiași secvență este recunoscută de un complex alcătuit dintr-o endonuclează și o polimerază poly A care secționează pre-ARNm înainte de acest semnal și apoi adaugă 100-250 de resturi adenilate.

Acest capăt poly A este implicat în exportul ARNm din nucleu, stabilizează ARNm împotriva degradărilor exonucleolitice și pare să fie implicat în inițierea translației.

B3. ELIMINAREA INTRONILOR – ARN SPLICING

Studiile efectuate asupra ARNm au evidențiat că acesta are dimensiuni mult mai reduse, comparativ cu ADN pe care l-a transcris.

În anul 1977 s-a demonstrat că, la eucariote, ADN este format din exoni – secvențe de ADN codificatoare care sunt transcrise și traduse și introni – segmente de ADN care sunt transcrise, dar nu sunt traduse, interpuse între secvențele exonice codificatoare.

Deci ADN este un mozaic alcătuit din introni și exoni. În cadrul procesului de maturare intronii sunt eliminați printr-un proces de înnădire – „ARN splicing”.

Mecanismul reacției de eliminare a intronilor – ARN splicing

Poziția 5’ de secționare este reprezentată de o secvență GU, care separă intronul 1 de primul exon. În poziția de secționare 3’, este prezentă o secvență AG. În interiorul fiecărui intron există un punct de ramificare (branch point) care este reprezentat de un adenin-nucleotid.

Între poziția 5’ de secționare și punctul de ramificare, in interiorul intronilor sunt prezente secvențe bogate în UA. Între punctul de ramificare și poziția 3’ de secționare secvențele sunt bogate în U.

În prima etapă gruparea hidroxil de la un atom de C2’ al nucleotidei care constituie punctul de ramificare atacă nucleofil legătura fosfodiester care leagă ultima bază a primului exon cu prima bază a intronului.

Se formează un exon cu o grupare OH liberă la un capăt 3’ și o structură lariat, în care capătul 5’ al intronului este atașat printr-o legătură 2’-5’ de baza care constituie punctul de ramificare.

În timpul celei de-a doua etape, gruparea hidroxil 3’ a primului exon atacă nucleofil legătura fosfodiesterică care leagă atomul de C3’ al intronului cu atomul C5’ al celui de-al doilea exon, după următorul mecanism:

Astfel sunt legați doi exoni între ei și se elimină un intron (Fig.3.8). Energia necesară pentru formarea legăturilor între exoni este furnizată prin desfacerea legăturilor intron – exon.

Fig. 3.8 Mecanismul reacției de eliminare a intronilor (ARN splicing)

Procesul de eliminare a intronilor este mediat de molecule mici ribonucleoproteice (snRNP) și anume: U1, U2, și U4, U5 și U6. Aceștia se leagă la situsurile de secționare/ legare formând un complex ribonucleoproteic denumit spliceosome de dimensiuni mari (60 S) (Fig. 3.9).

Acești spliceosomi recunosc granița dintre introni și exoni iar, în final, recunosc segmente de exoni pe care le reunesc în ARN matur.

Deci, precursorii ARNm suferă modificări complexe, pentru a ajunge la forma de ARN matur, care se deplasează apoi în nucleul, unde stau la baza procesului de sinteză a proteinelor. Centralizarea proceselor de maturare care au loc în nucleu sunt prezentate în Figura 3.10.

Fig. 3.9 Mecanismul formării spliceosomilor în procesul de eliminare a intronilor

Se pare că intronii au fost prezenți în genele ancestrale, dar au fost pierduți în timpul evoluției de către organismele cu un ciclu de dezvoltare foarte rapid (eubacterii, drojdii), sub acțiunea unor presiuni de selecție. Poziția intronilor în unele gene, la eucariotele superioare, se consideră a fi veche de cel puțin 1 miliard de ani. Se consideră că acest mecanism comun de segmentare a genelor (exoni și introni) a apărut înainte de diferențierea regnului animal la fungi și plante.

S-a emis ipoteza că prin rearanjarea exonilor ce codifică elementele structurale ar fi putut să apară noi proteine în cursul evoluției. Rearanjarea exonilor este un mijloc rapid și eficient de a genera noi gene, deoarece aceste aranjări păstrează unitățile funcționale, dar permite acestora să interacționeze într-un mod nou.

Intronii sunt zone întinse de ADN care se pot rupe și recombina fără a avea vreun efect asupra proteinei codificate de gena respectivă.

Fig. 3.10 Procesele de sinteză și maturare a ARNm

Fig. 3.10. Etapele parcurse de molecula ARN, de la transcripție până la translație

Structura finală a moleculei ARNm, după ce a suferit toate modificările postranscripționale este prezentată în Fig. 3.11.

Fig. 3.11. Structura moleculei ARNm maturat

un capăt 5’ specific – m7Gppp;

regiune netranscriptibilă 5’ (UTR);

regiunea codificatoare: codonul de inițiere a translației – AUG, secvența de nucleotide (codoni) pentru sinteza polipeptidului și o secvență stop, reprezentată de unul dintre codonii stop- UAA, UGA sau UAG

regiune netranscriptibilă 3’ (UTR);

un capăt 3’ poly A;

3.1.3. MECANISMUL MOLECULAR AL PROCESULUI DE TRANSPOZIȚIE – ELEMENTE TRANSPOZABILE

Deși elementele transpozabile au fost descoperite pentru prima dată în celulele eucariote, ele se găsesc și în procariote. Procesul prin care aceste secvențe sunt copiate și inserate într-o nouă poziție în genom poartă numele de transpoziție.

Dacă transpoziția apare în celulele germinale, secvențele transferate în noile poziții sunt transferate generațiilor următoare. Astfel, elementele mobile s-au multiplicat și acumulat de-a lungul evoluției, constituind acum o parte semnificativă din genomul multor eucariote.

Transpozonii nu sunt numai o sursă pentru creșterea cantității de ADN din genom, dar constituie un al doilea mecanism care, pe lângă recombinarea meiotică produce o restructurare a materialului genetic de-a lungul evoluției.

Barbara McClintock a descoperit pentru prima dată elementele mobile, în timpul efectuării unor experimente la porumb, în anii 1940. Ea a caracterizat aceste structuri genice care se pot insera in interiorul anumitor gene, modificând fenotipul. Teoria ei a fost controversată până în momentul în care au fost identificate elemente mobile similare la bacterii, caz în care a fost posibilă caracterizarea secvențelor specifice de ADN și a fost descifrată baza moleculară a procesului de transpoziție.

O dată cu progresul cercetărilor asupra acestor elemente mobile, ele au fost împărțite în două categorii:

elemente transferate direct ca ADN – denumite transpozoni ADN

elemente la care transferul are loc via un intermediar ARN, care transcrie elementul ADN mobil cu ajutorul ARN-polimerazei și este apoi convertit din nou într-un fragment ADN bicatenar de către revers-transcriptază, denumite retrotranspozoni sau transpozoni ARN (Fig. 3.12).

Fig. 3.12 Mecanismul de acțiune al transpozonilor

3.1.3.1. PROCESUL DE TRANSPOZIȚIE LA PROCARIOTE

Majoritatea elementelor mobile la bacterii sunt de tip ADN. Primele investigații moleculare ale elementelor mobile au provenit din studii asupra

unei mutații la E. coli, produsă de o inserție spontană a unei secvențe cu lungimea de 1- 2 kb în mijlocul unei gene. Această secvență a fost denumită secvență de inserție, sau element IS. Apoi au mai fost identificate alte 20 de secvențe IS la bacterii.

Transpoziția la bacterii este un proces care apare rar, deoarece de obicei acest proces inactivează gene metabolice esențiale, care conduc la moartea celulelor. Structura generală a elementelor IS este prezentată în fig. 3.13.

Fig. 3.13. Structura generală a unui element IS bacterian

O repetiție inversă („inverted repeat”), cu lungimea de 50 bp este prezentă întotdeauna la ambele capete al situsului de inserție. Într-o astfel de structură, secvența 5’-3’ a unei catene este repetată în secvența complementară după cum urmează:

Între repetițiile inverse este amplasată o regiune care codifică transpozaza, o enzimă necesară pentru transpoziția elementului IS într-un nou situs.

La cele două extremități, lîngă repetițiile inverse sunt amplasate secvențe denumite repetiții directe („direct repeat”), cu lungimi de 5-11bp. Lungimea repetițiilor directe depinde de fiecare tip de element IS, dar secvențele lor depind de de situsul țintă în care se inserează o copie a IS.

Inserția unui astfel de element are loc după mecanismul „cut and paste”. Transpozaza mediază trei procese și anume: (1) excizează foarte precis elementul IS din ADN donor; (2) produce secționări în ADN țintă; (3) inserează elementul IS în ADN țintă.

În acest fel elementul IS a fost transferat într-un nou situs în genom, unde se menține pe parcursul proceselor de multiplicare bacteriană, până la momentul la care suferă o nouă transpoziție.

3.1.3.2. PROCESUL DE TRANSPOZIȚIE LA EUCARIOTE

În celulele eucariote, spre deosebire de procariote au fost evidențiați atât transpozoni ADN, cât și retrotranspozoni (transpozoni ARN).

A. TRANSPOZONI ADN

Mulți ani după ce Barbara McClintock a studiat efectul transpozonilor asupra fenotipului la porumb, experimentele de clonare și secvențializare au demonstrat care este structura transpozonilor ADN. Ei conțin o secvența terminală denumită repetiție inversă, care flanchează regiunea codificatoare pentru o transpozază. Această enzimă recunoaște secvențele terminale repetate și catalizează transpoziția într-un alt situs din genom.

Transpoziția ADN, care are loc după mecanismul „cut and paste” poate să conducă la creșterea numărului de copii ale transpozonului dacă apare în timpul fazei S a ciclului celular, atunci când are loc sinteza ADN.

Acest fenomen are loc atunci când secvența mobilă provine dintr-una dintre cele două catene ADN, dintr-o regiune cromozomală care a fost deja replicată și ADN țintă se află în regiunea care nu a fost încă replicată. La finalizarea procesului de replicare, la sfârșitul fazei S, secvența mobilă ajunsă în noua locație va fi de asemenea replicată, conducând la o creștere semnificativă a numărului de transpozoni din celulă.

Atunci când o astfel de transpoziție apare înaintea meiozei, una dintre cele patru celule germinale produse conține copii suplimentare ale transpozonilor. Repetarea acestui proces de-a lungul evoluției a condus la acumularea unui număr mare de transpozoni ADN în genomul unor organisme. ADN uman conține aproximativ 300.000 de copii de transpozoni cu secvență totală sau parțială, constituind aproximativ 3% din genom.

B.TRANSPOZONI ARN

Retrotranspozonii sau transpozonii ARN actíonează după sistemul “copy -paste”, care constă în copiere și atașare înapoi în genom, în poziții multiple.

Ca o primă etapă a unui astfel de proces se constituie transcripția secvenței mobile (retrotranspozon) într-o moleculă de ARN complementară. Apoi are loc un proces de revers-transcripție, în care molecula de ARN este transformată din nou în ADN, care este inserat înapoi în genom. Retrotranspozonii se comportă similar cu retrovirusurile, conducând la ipoteza posibilei origini evolutive a acestora. Au fost caracterizate trei categorii diferite de retrotranspozoni si anume:

Retrotranspozonii virali

Retrotransozonii virali sunt alcătuiți dintr-o regiune codificatoare, cu o lungime de 6- 11 kb, care conține toate genele specifice retrovirusurile, mai puțin cele care codifică proteinele învelișului viral (revers-transcriptaza, transpozaze). Această regiune este mărginită de secvențe terminale repetitive cu lungime mare, denumite LTR („long terminal repeats”), de asemenea specifice retrovirusurilor. Aceste fragmente, cu lungimi de 250-600 bp sunt caracteristice pentru integrarea ADN viral și critice pentru ciclul de viața al retrovirusului. La ambele extremități sunt amplasate repetiții directe care funcționează ca de situs specific de inserție sau situs țintă (Fig. 3.14).

Fig. 3.14 Structura generală a unui retrotranspozon LTR

(„long terminal repeats”),

Mecanismul după care are loc transpoziția este complex, fiind exploatate atât sistemele enzimatice ale celulei cât și cele codificate de transpozon.

Secvența LTR stângă funcționează ca un promotor care direcționează ARN-polimeraza celulară să inițieze transcripția. După finalizarea procesului, extremitatea stângă a ARN (corespunzătoare secvenței LTR din partea dreaptă) direcționează enzimele care procesează ARN din celula gazdă să secționeze transcriptul primar și să adauge secvența poly A, la capătul 3’.

Molecula ARNm astfel prelucrată este transportată în citoplasmă, unde are loc copierea într-o moleculă ADN, cu ajutorul revers-transcriptazei sintetizate anterior. Fragmentul ADN este transportat din nou în nucleu și inserat în genom cu ajutorul transpozazei.

Mecanismul de acțiune este similar cu cel al retrovirusurilor, al căror material genetic este copiat, transformat și apoi inserat în genom.

Retrotranspozoni non-virali

Retrotranspozonii non-virali alcătuiesc clasa celor mai abundente elemente mobile din genomul uman, care codifica revers-transcriptaza, dar nu poseda secvente terminale repetitive cu lungime mare (LTR).

Aceste secvențe mobile sunt moderat repetate și formează două clase în genomul mamiferelor: secvențele LINE ("long interspersed repeated sequences"), cu o lungime de 6kb, transcrise de ARN-polimeraza II si SINE ("short interspersed repeated sequences"), cu o lungime de 300bp, transcrise de RNA polimeraza III, având un sistem de acțiune similar.

LINE ("long interspersed repeated sequences")

ADN uman poate conține trei mari familii majore de secvențe LINE, care au mecanisme de transpoziție similare, dar diferă în funcție de secvență: L1, L2. L3. In prezent, în genomul uman se mai întâlnește numai familia L1, pentru celelalte două nu au mai fost identificate copii funcționale.

Secvențele LINE constituie 21% din genom, fiind inserate în 900.000 de poziții. Ele sunt flancate de situsuri specifice de inserție (situsuri țintă), alcătuite din repetiții directe și o regiune centrală cu o lungime de 6 kb. Regiunea centrală conține două cadre de citire ORF („open reading frames”): ORF 1, cu o lungime de 1 kb, care codifică o proteină de legare a ARN și ORF 2, cu o lungime de 4 kb, care codifică o proteină care prezintă o omologie înaltă cu revers-transcriptaza retrovirusurilor și a transpozonilor virali, dar prezintă în plus activitate endonucleazică (Fig. 3.15).

Fig. 3.15. Structura generală a unei secvențe LINE

("long interspersed repeated sequences")

Mecanismul de acțiune al secvențelor LINE diferă de cel al retrotanspozonilor, deoarece nu conțin secvențe terminale repetitive cu lungime mare – LTR („long terminal repeats”), care să medieze procesul de transcripție și de inserare în noul situs.

În cazul secvențelor LINE, genele care alcătuiesc regiunile ORF 1 și ORF 2 sunt transcrise cu ajutorul ARN-polimerazei celulare, care este direcționată de către un promotor, amplasat în partea stângă a secvenței ADN-LINE, reprezentat de o regiune bogată în A/T.

Apoi ARN-LINE este poliadenilat de mecanismele celulare specifice și exportat în citozol, unde sunt sintetizate proteinele ORF 1 și ORF 2. Copii multiple ale proteinei ORF 1, se leagă la ARN-LINE, iar proteinele ORF 2 se leagă la secvența poly A. Sub această formă, ARN-LINE este transportat înapoi în nucleu ca un complex cu proteinele ORF 1 și ORF 2 și este revers- transcris în nucleu de către proteina ORF 2.

Mecanismul de inserție presupune parcurgerea mai multor etape:

Proteina ORF 2 produce o secționare a a ADN cromosomal, la nivelul unei catene, într-o regiune bogată în A/T;

Molecula ARN-LINE se atașează la această catenă bogată în T (generată prin secționarea decalată) a ADN cromozomal, denumită regiunea monocatenară inferioară, prin secvența proprie poly A;

Revers-transcriptaza copiază ARN-LINE, având ca primer catena ADN cromosomal care a fost secționată;

ORF 2 transcrie ARN-LINE și apoi începe să copieze regiunea monocatenară superioară a cromozomului;

Enzimele celulare hidrolizează apoi ARN și extind capătul 3’ al ADN cromozomal, înlocuind catena ARN LINE cu ADN.

Un proces complet conduce la inserția unei copii a retrotanspozonilor într-un situs nou al ADN cromozomal. O regiune scurtă, cu repetiții directe este generată la situsul de inserție, datorită clivării inițiale a două catene ADN cromozomal, fără a necesita integrază pentru inserare.

SINE ("short interspersed repeated sequences")

ADN uman conține 13% secvențe SINE ("short interspersed repeated sequences"), care apar în aproximativ 1,6 milioane de situsuri.

Acestea variază în lungime de la 100 la 400 bp, nu codifică proteine, dar majoritatea conțin un capăt 3’ bogat în secvențe A/T similare cu cele ale secvențelor LINE.

Secvențele SINE sunt transcrise de aceiași ARN-polimerază nucleară care transcrie genele care codifică ARNt, 5S ARNr și alte molecule mici ARN –ARN-polimeraza III. Se consideră că proteinele ORF 1 și ORF 2, codificate de secvențele LINE mediază și revers-transcripția și integrarea, după același mecanism. În consecință, secventele SINE pot fi considerate ca paraziți ai secvențelor LINE, concurînd cu acestea în procesele menționate.

1,1 milioane dintre secventele SINE sunt elemente Alu, denumite astfel deoarece conțin un singur situs de recunoaștere pentru enzima de restricție Alu I. Aceste elemente prezintă o omologie de secvență considerabilă și probabil au evoluat dintr-un tip de ARN, care formează un complex ribonucleoproteic, denumit particulă de recunoaștere a semnalului (SRP). Această particulă se găsește în cantități mari în celule și este implicată în dirijarea anumitor proteine spre membrana reticulului endoplasmatic, în timpul transportului co-translațional (capitolul 3.4.2.). Secvențele Alu sunt răspândite în genomul uman în poziții în care inserția lor nu a afectat expresia genelor și anume: între gene, în introni, în regiunile 3 netraduse ale unor molecule ARNm

Pseudogene

În plus față de elementele mobile prezentate, mai există o largă varietate de molecule ARNm care sunt integrate în ADN cromosomal. Deoarece acestor secvențe le lipsesc intronii și nu posedă regiuni de flancare similare cu cele ale genelor funcționale, se consideră că ele nu pot fi simple gene duplicate care au devenit nefuncționale. De fapt ele par să fie retrotranspozoni ai unor molecule ARN prelucrate (maturate) și de aceea poartă numele de pseudogene. Majoritatea pseudogenelor sunt flancate de repetiții directe scurte, care mențin ipoteza că au fost generate de evenimente de retrotranspoziție care au implicat ARNm celular.

Aceste molecule sunt supuse unui proces de revers-transcripție, după care, fragmentul ADN nou sintetizat este inserat înapoi în genom.

Alte tipuri de secvențe sunt cele care reprezintă copii parțiale ale unor molecule ARN de dimensiuni reduse, cum ar fi snARN și ARNt. Similar cu pseudogenele procesate derivate de la ARNm, aceste copii nefuncționale sunt flancate de repetiții directe scurte și cel mai probabil rezultă din evenimente de retrotranspoziție rare, care s-au acumulat în cursul evoluției.

Analizând modul de acțiune al secvențelor mobile se poate spune că ADN a unui retrotranspozon viral (LTR) este sintetizată din forma sa ARN în citozol și transportată apoi în nucleu unde este integrată în ADN cromozomal de către integraza codificată de retrotranspozon. În contrast, forma ADN a unui retrotranspozon neviral este sintetizată în nucleu, fără a necesita integrază pentru inserția în genom.

Toate tipurile de transpozoni au avut o contribuție majoră la evoluția organismelor deoarece au contribuit la mai multe procese cum ar fi:

Generarea unor familii de gene prin duplicare;

Crearea unor gene noi prin modificarea exonilor existenți;

Formarea unor regiuni de reglare mai complexe care permit un control diferit al expresiei genelor;

În prezent cercetătorii acordă o atenție deosebită posibilității de exploatare a mecanismelor transpoziției pentru inserarea unor gene terapeutice ca o formă a terapiei genice, sau pentru identificarea unor gene la plante.

3.1.4 REGLAREA EXPRESIEI GENELOR

Celulele oricărui organism, indiferent de structura și funcția lor, posedă aceeași informație genetică, deoarece rezultă prin mitoze succesive din zigot, dar expresia genică este diferită. Unele gene, constitutive („housekeeping genes”) sunt exprimate în toate tipurile de celule, în toate etapele de dezvoltare, deoarece codifică proteine necesare permanent în celule. Altele sunt exprimate numai în țesuturi specifice, sau în stadii diferite ale dezvoltării, diferențierii, ciclului celular iar altele sunt complet și permanent inactivate.

Din această cauză a fost necesară dezvoltarea unor sisteme foarte complexe de reglare a genelor. Mecanismele de reglare a expresiei genelor au fost descifrate inițial la procariote; ele se bazează pe celebrul “model al operonului” descris în 1961 de către Jacob și Monod la E. coli. (Premiul Nobel, 1965).

Operonii regrupează într-o singură unitate funcțională mai multe gene de structură (ce codifică enzime diferite, implicate însă în același lanț metabolic, precum și gene de reglare a transcrierii. Genele reglatoare produc prin intermediul unor substanțe (represori) inactivarea sau activarea genelor de structură, de obicei sub acțiunea unor factori de mediu (inductori, corepresori).

Mecanismele de reglare evidențiate la procariote nu sunt valabile în totalitate la eucariote, datorită dimensiunilor mult mai mari ale genomului și împachetării complexe pe care o suferă fibrele de cromatină în nucleu. In acest caz sunt active mecanisme de reglare mult mai complexe, care acționează asupra tuturor etapelor parcurse până la obținerea unei proteine funcționale. Astfel a fost evidențiată o reglare pretranscripțională, transcripțională, postranscripțională, translațională și postranslațională.

3.1.4.1. REGLAREA PRE-TRANSCRIPȚIONALĂ A EXPRESIEI GENICE

In nucleul celulelor eucariote, moleculele de ADN formează cu histonele structuri compacte sub forma fibrelor de cromatină. Pentru a fi posibilă inițierea transcrierii este necesară modificarea structurii cromatinei, astfel încât factorii de expresie să poată interacționa cu promotorii. Aceste modificări structurale sunt în general datorate unor modificări ale histonelor sau metilării ADN. Aceste modificări sunt reversibile, ceea ce le face extrem de utile în reglarea expresiei genice și totodată au un potențial ereditar, adică se pot transmite de la o generație la alta, precum și în cursul diviziunilor celulare.

A. MODIFICĂRI CHIMICE

A.1. MODIFICAREA HISTONELOR

Modificările histonelor se asociază cu modificări ale structurii cromatinei. Atunci când cromatina se află într-o conformație puternic condensată, cu nucleozomi strâns legați între ei cu ajutorul histonei H1, este inactivă transcripțional. În schimb cromatina adoptă o conformație mai relaxată atunci când histonele suferă procese de metilare, acetilare sau fosforilare. Aceste reacții au loc asupra capetelor aminoterminale, bogate în aminoacizi precum lizina, arginina și serina, fiecare dintre aceste reacții interesând specific anumiți aminoacizi.

Un proces important este acetilarea histonelor produsă de enzimele histon-acetil transferaza (HAT) care disociază molecula ADN de pe complexul histonic, permițând începerea transcrierii.

An insight into how these modifications could affect chromatin structure came from solving the high-resolution X-ray structure of the nucleosome in 1997

O întelegere a modului în care procesele de modificare a histonelor pot să influențeze structura cromatinei a avut loc atunci când structura nucleosomului a fost descifrată cu ajutorul razelor X cu rezoluție înaltă, în anul 1997.

A.2.. MODIFICAREA ADN

În genomul uman metilarea ADN are loc aproape exclusiv în poziția 5' a citozinei din cadrul dinucleotidelor CpG, care sunt concentrate în anumite regiuni denumite insule CpG, localizate foarte adesea la nivelul regiunilor promotor a numeroase gene, precum și în interiorul unor gene. Reacțiile de metilare sunt mediate de enzime specifice – ADN-metiltransferaze și ADN-demetilaze, care au rolul de a adauga sau elimina grupări metil în poziții specifice ale bazelor azotate.

In general genele inactive au ADN metilat și histone deacetilate, ceea ce conduce la o creștere a gradului de condensare a cromatinei. În momentul în care o genă devine activă, grupările metil suplimentare sunt eliminate de la nucleotidele care alcătuiesc promotorul, iar histonele sunt acetilate.

Se consideră că prezența grupărilor metil atașate la ADN poate inhiba legarea unor factori de transcripție la secvențele lor țintă. În al doilea rând, represarea expresiei genice poate fi mediată de către o serie de proteine care au capacitatea de a recunoaște și a se lega specific la grupările metil atașate citozinei.

B. MODIFICĂRI STRUCTURALE

Structura ADN nu este fixă, rigidă, ea poate suferi o serie de modificări conformaționale care influențează interacțiunea dintre anumite secvențe ale ADN și diferite molecule exogene reglatoare. Trecerea de la forma B a ADN unor gene la forma Z ar putea fi vitală pentru reglarea activității genice.

3.1.4.2. IMPLICAȚII ALE MECANISMELOR EPIGENETICE ÎN CONTROLUL EXPRESIEI GENICE

Epigenetica se referă la modificări în expresia genelor controlate genetic, care nu implică schimbări în secvența nucleotidelor, dar se manifestă ca markeri chimici, adăugați după replicare, fie la ADN, fie la proteinele care intră în alcătuirea cromatinei.

Astfel, metilarea ADN este un proces care are loc după replicare, în care resturi citozinice din secvențele CpG sunt metilate, formând modele de metilare specifice genelor. Genele comune (“housekeeping genes”) au regiuni bogate în secvențe CpG în regiunea promotorului, care sunt nemetilate în toate tipurile de celule, în timp ce genele specifice unui tip de țesut sunt metilate în toate țesuturile, cu excepția țesutului în care genele sunt exprimate. Aceste modele de metilare sunt evident corelate cu expresia genelor. În plus, s-a demonstrat că cele mai eficiente mecanisme de inactivare a genelor implică metilarea ADN. Modelul de metilare este stabilit încă din fază embrionară și se menține pe tot parcursul vieții.

3.1.4.3. REGLAREA TRANSCRIPȚIONALĂ

A. REGLAREA TRANSCRIPȚIONALĂ INTERNĂ

Controlul transcripțional al expresiei genice vizează reglarea activității ARN-polimerazei II, enzima ce transcrie genele care codifică proteine și sintetizează ARNm. Reglarea transcripțională implică interacțiunea unor proteine – factori trans-reglatori cu secvențe specifice de pe ADN-elemente cis-reglatoare, proces care determină transcripția specifică a anumitor gene, într-un anumit moment pentru a se produce o cantitate adecvată dintr-o anumită proteină.

Elementele cis-reglatoare sunt secvențe scurte de ADN ale căror funcții sunt limitate la o anumită genă; după fixarea unor factori "trans-reglatori" specifici, denumiți factori de transcripție, aceste secvențe permit recunoașterea genei de către ARN-polimerază și reglează specificitatea și intensitatea transcripției, în funcție de nevoile celulare.

In capitolul 2.3.2.1 au fost descrise elementele reglatoare, care sunt constituite dintr-un promotor, alcătuit din casetele „TATA box”, „”CCAAT box” și regiunea promotor distală. Regiunea distală este alcătuită din elemente RE, care modulează transcripția unor gene în funcție de anumite semnale extracelulare ("expresie genică indusă"), activatorii ("enhancers") care măresc nivelul bazal al transcripției, inițiată de promotor și inhibitorii ("silencers"), care reduc nivelul trascripției și uneori represează funcția unor gene.

Activatorii pot fi amplasați fie în aval, fie în amonte de gena țintă, sau chair în interiorul genei pe care o controlează. Anumiți factori de transcripție, denumiți proteine care se leagă la activatori ("Enhancer-binding protein") se leagă la aceste regiuni de ADN situate chiar la câteva mii de baze distanță de gena țintă, care funcționează ca activatori, mărind rata de transcripție. Proteinele care se leagă la activatori au un situs care le permite leagarea la activatori și un altul care se atașează la factorii de transcripție legați în prealabil la nivelul promotorului. Se formează astfel o structură în formă de buclă, care permite activatorului să acționeze asupra complexului de transcripție (Fig. 3.16 ).

Fig. 3.16 Modul de acțiune a activatorilor ("enhancers") asupra transcrierii genelor

Inhibitorii ("silencers") sunt regiuni de control care, la fel ca activatorii pot fi localizate la mii de baze distanță de gena pe care o controlează. Totuși, în momentul în care leagă anumiți factori de transcripție, expresia genei controlate este represată.

Se poate spune că atât activatorii cât și inhibitorii pot să activeze gene situate la distanțe mari, acționând asupra promotorilor. În această situație există posibilitatea ca un activator sau inhibitor să acționeze asupra unei alte gene decât gena țintă. Pentru a preîntâmpina o astfel de situație, în genom există structuri specifice de ADN denumite secvențe "izolatoare" ("insulators"), cu o lungime de 42 bp situate între activatorii și promotorii, sau inhibitorii și promotorii unor gene adiacente. Astfel activarea unei gene de către un alt activator decât cel specific nu mai este posibilă, deci acțiunea activatorilor și inhibitorilor este limitată numai la gena țintă.

Factorii de transcripție trans-reglatori sunt proteine reglatoare care se fixează pe elementele cis-reglatoare ale ADN, de obicei, în marea încizură a dublei elice ADN și interacționează cu alți factori de transcripție, controlând inițierea transcripției. Toate aceste proteine transcripționale conțin un domeniu de fixare la ADN prin intermediul cărora proteina recunoaște atât genele "țintă" cât și regiunile de reglare ale acestora și un domeniu prin intermediul căruia interacționează cu alți factori de transcripție pentru a regla transcripția. Unele proteine trans pot conține un al treilea domeniu care este un situs de fixare pentru hormoni, ioni etc.

Fiecare genă posedă "un sistem de reglare" alcătuit din mai mulți factori transcripționali care nu sunt însă specifici unei singure gene. Numărul lor este mic dar acțiunea particulară este produsă prin combinația specifică a anumitori factori trans și elemente / secvențe cis. Situația este comparabilă cu scrisul sau muzica, în care un număr limitat de simboluri sau sunete permite o infinitate de combinații diferite.

B. REGLAREA TRANSCRIERII CA RĂSPUNS LA SEMNALE EXTRACELULARE (“EXPRESIA INDUCTIBILĂ A GENELOR”).

O varietate de mecanisme realizează reglarea transcripțională ca răspuns la semnale (stimuli) extracelulare, numiți generic liganzi; aceștia produc o modificare temporară și reversibilă a transcripției unor gene (“expresia inductibilă a genelor”). Indiferent de mecanism, punctul final în acest tip de reglare este același: un factor de transcripție inițial inactiv este activat specific de către o cale de semnalizare și apoi se fixează la secvențele reglatoare specifice (numite elemente de răspuns) (RE) din promotorul genelor țintă, activând transcripția lor. Pentru a răspunde imediat la un stimul, factorul transcripțional necesar trebuie să fie deja prezent în celulă sub o formă inactivă. Activarea sa se poate face prin mai multe procese.

B.1. ACTIVAREA TRANSCRIPȚIEI PRINTR-UN LIGAND INDUCTIBIL (CONTROLUL HORMONAL AL TRANSCRIERII)

Hormonii hidrofobi cu moleculă mică (de exemplu, hormonii steroizi) sau unele morfogene (de exemplu, acidul retinoic) difuzează prin membrana celulelor-țintă și se fixează pe un receptor intracelular, citoplasmatic sau nuclear; ei funcționează ca factori de transcripție inductibili. Fixarea ligandului la receptor produce activarea lui; complexul ligand (hormon) receptor se fixează pe ADN la RE (elementul de răspuns) localizat în promotorul mai multor gene țintă și activează transcripția lor.

B.2. ACTIVAREA TRANSCRIERII PRIN TRANSDUCȚIA SEMNALULUI

Anumiți factori extracelulari (hormoni peptidici, citokine, neurotransmițători) pot declanșa transcripția unor gene fără a intra în celule (nu pot trece prin membrana plasmatică). Ei se fixează pe un receptor specific de pe suprafața celulei (cu activitate kinazică sau care poate activa kinaze intracelulare) care, după fixarea ligandului, își schimbă conformația spațială și devine activ; în această stare el transmite semnalul ligandului altor molecule din celulă. Prin activarea transcripției unor gene specifice, acest proces, numit transducția semnalului, joacă un rol important în controlul diviziunii celulare, creșterii și diferențierii.

3.1.4.4. REGLAREA POST-TRANSCRIPȚIONALĂ

Reglarea expresiei genelor poate avea loc și prin intermediul unor mecanisme ce pot interveni post-transcripțional, modificând calitativ sau cantitativ formarea ARNm matur. Astfel, există situații prin care, pornind de la același precursor ARN s-au format molecule ARN matur diferite.

Mai frecvent este vorba de eliminarea intronilor sau poliadenilarea alternativă, prin care o genă codifică mai multe proteine; mai rar se întâlnește “editarea” ARN. Aceste mecanisme, deseori combinate, implică recunoașterea unor secvențe specifice din ARN de către proteine sau molecule de ARN reglatoare. Vom prezenta câteva din mecanismele mai cunoscute.

A. ELIMINAREA INTRONILOR (ARN SPLICING) ȘI POLIADENILAREA ALTERNATIVE SAU DIFERENȚIALE

În unele situații, în procesul de maturare a precursorilor ARNm se elimină nu numai intronii ci și unii exoni. De asemenea, numeroase gene conțin la nivelul regiunii lor 3'UTR două sau mai multe semnale de poliadenilare și, ca urmare, pot suferi procese de adenilare alternativă, cu specificitate tisulară. In alte cazuri, eliminarea alternativă a intronilor poate să evidențieze un asemenea situs alternativ de adenilare.

În acest fel, pornind de la un produs de transcripție primar se formează mai multe molecule diferite de ARNm matur care pot sta la baza sintezei unor proteine diferite.

B. STABILITATEA PRODUSULUI DE TRANSCRIPȚIE

O moleculă procesată de ARNm trebuie să părăsească nucleul pentru a furniza matrița necesară pentru sinteza unei proteine. Spre deosebire de ARNm procariotic, al cărui timp de injumătățire este de 1-5 minute, ARNm eucariot poate să se comporte foarte diferit din punctul de vedere al stabilitații. Unii produși de transcripție sunt instabili, deoarece posedă secvențe care indică degradarea rapidă (predominant, dar nu exclusiv în regiunea 3’ netranslatată).

REGLAREA TRANSLAȚIONALĂ

Există cu certitudine o reglare translațională a procesului de sinteză a proteinelor, dar aceasta este puțin cunoscută. Totuși, având în vedere că multe tipuri de ARNm posedă un număr mai mare de codoni „metionină”, abilitatea ribozomilor de a recunoaște și a iniția sinteza de la codonul AUG corect poate să afecteze expresia produsului genic. S-au evidențiat câteva situații în care s-a demonstrat că proteina a fost inițiată de un alt codon și nu de codonul start. Acest fenomen a fost apărut la E. coli de mai multe ori, dar recent a fost observat și în moleculele ARNm eucariot.

În ultimii ani s-a dovedit un nou model de reglare a genelor, care implică și controlul exercitat de molecule ARN de dimensiuni mici, necodante. Controlul acestor molecule se poate exercita atât la nivelul translației ARNm, cât și la stabilitatea ARNm sau prin intermediul modificărilor structurale ale cromatinei.

3.1.4.6. REGLAREA POSTRANSLAȚIONALĂ

După ce a avut loc translația, proteinele suferă o serie de modificări care includ glicozilarea, acetilarea sau formarea legăturilor bisulfurice, procese care vor fi prezentate în capitolul 3.4.

Totodată, după translație și procesare, pentru a fi funcționale proteinele sunt orientate spre locul unde își vor îndeplini funcția. Anumite secvențe ale ARNm localizate la nivelul extremităților 5' si 3' (regiunile UTR) pot determina localizarea țintită a acestor molecule la nivelul anumitor compartimente ale celulelor.

Multe proteine sunt degradate rapid, în timp ce altele sunt foarte stabile. Se pare ca degradarea rapidă este semnalizată de prezența anumitor secvențe de aminoacizi.

3.2. MECANISMELE MOLECULARE ALE PROCESULUI DE TRANSLAȚIE – SINTEZA PROTEINELOR

După ce moleculele de ARNm au suferit procele de maturare acestea se deplasează în citoplasmă, unde stau la baza sintezei lanțurilor polipeptidice, alcătuite dintr-un număr de 20 de aminoacizi esențiali.

În principiu, polimerii biologici ar putea fi sintetizați prin alinierea prealabilă a subunităților într-o ordine corectă și apoi legarea simultană a acestora. Dar în celulă procesul nu are loc în acest fel. Asamblarea proteinelor este un proces care se desfășoară treaptă cu treaptă, într-o singură direcție chimică. Sinteza proteinelor începe la capătul amino-terminal și se continuă spre capătul carboxil. Există un punct specific de pornire a sintezei, iar creșterea are loc într-o singură direcție, până la un punct terminus.

3.2.1. COMPUȘI IMPLICAȚI ÎN SINTEZA PROTEINELOR

3.2.1.1. ARNm – COD GENETIC

Acizii nucleici sunt polimeri liniari, care conțin patru tipuri de unități nucleotidice. ARN conține ribonucleotide de adenină (A), citozină (C), guanină (G) și uracil (U).

Deoarece patru nucleotide nu pot specifica aranjarea liniară a 20 de tipuri de aminoacizi, după principiul un nucleoid – un aminoacid, codificarea trebuie făcută de un grup de nucleotide; codul folosit trebuie să fie capabil să specifice cel puțin 20 de variante, deci cei 20 de aminoacizi.

S-a evidențiat că unitatea de codificare este alcătuită din trei nucleotide, care constituie un codon. Astfel, din punct de vedere matematic este posibilă existența a 64 de codoni. Dintre aceștia, 61 specifică un anumit aminoacid, deci un număr de aminoacizi au mai mult decât un singur codon (Tabelul 3.3.).

Semnificația fiecărui codon este aceiași la toate organismele cunoscute, ceea ce subliniază originea lor comună.

Tabelul 3.3. Semnificația codului genetic

Abrevieri pentru aminoacizi

ala  (A)   –   alanina                       gly (G)   –   glicina                        pro (P)   –   prolina

arg  (R)   –   arginina                      his (H)   –   histidina                      ser (S)   –   serina

asn (N)   –   asparagina                  ile (I)     –   isoleucina                     thr (T)   –   treonina

asp (D)   –   acidul aspartic            leu (L)   –   leucina                          trp (W)  –   triptofanul

cys  (C)   –   cisteina                       lys (K)   –   lizina                            tyr (Y)   –   tirozina

gln  (Q)   –   glutamina                   met (M) –   metionina                     val (V)   –   valina

glu  (E)   –   acidul glutamic           phe (F)  –   fenilalanina                   X       –   stop

Codul genetic are o serie de caracteristici care asigură desfășurarea în condiții optime a procesului de sinteză a proteinelor.

Codul genetic este triplet deoarece 3 este prima putere a lui 4 (cele patru tipuri de nucleotide) care formează 64 de combinații, suficiente pentru cei 20 de amino acizi care se găsesc în structura proteinelor.

Codul genetic are un codon inițiator (AUG) și trei codoni stop (UAA, UAG, UGA), care reprezintă semnalele de început și de finalizare a sintezei lanțului polipeptidic. Codonii stop sunt numiți și "codoni nonsens" deoarece nu codifică nici un aminoacid. Ceilalți 61 de codoni sunt "codoni  sens" ce codifică cei 20 de aminoacizi.

Codul genetic este degenerat (redundant) deoarece mai mulți codoni  codifică un același  aminoacid – "codoni sinonimi".

Cu excepția metioninei și triptofanului, care sunt codificați de un singur codon, ceilalți 18 amino acizi sunt codificați de 2-6 codoni (deseori deosebiți prin al treilea nucleotid).

Degenerescența nu s-a stabilit la întâmplare deoarece aminoacizii cei mai reprezentați în proteine sunt cei care posedă cei mai mulți codoni și reprezintă un avantaj pentru celulă, deoarece unele mutații genice ce produc codoni sinonimi  nu modifică proteina codificată de genă (mutații silențioase).

Codul genetic este nesuperpozabil, deoarece codonii vecini nu au un nucleotid comun și fără semne de punctuație, deoarece codonii sunt adiacenți, definiți de simpla grupare de câte trei. În cazul în care are loc inserția sau delecția unui număr de 1 sau 2 nucleotide cadrul de citire este modificat, iar proteina sintetizată va avea o succesiune total diferită de aminoacizi.

Codul genetic este lipsit de ambiguitate întrucât un codon semnifică întotdeauna un anumit aminoacid, totdeauna același.

Codul genetic este universal, același la toate organismele, bacterie, plantă, animal sau om. În cazul mitocondriilor din celulele animale au fost identificate diferențe ale codului genetic.

Universalitatea codului genetic are o importanță deosebită în domeniul manipulării genomului sau al ingineriei genetice, deoarece o genă umană introdusă într-o celulă bacteriană, sau o genă bacteriană introdusă în genomul unei plante vor conduce la sinteza unei proteine identice cu cea din organismul de origine.

ARNt- MOLECULĂ ADAPTOR

Studiile efectuate cu privire la procesul de sinteză a proteinelor nu au evidențiat posibilitatea recunoașterii chimice directe dintre bazele acizilor nucleici și aminoacizii specifici. Aceasta înseamnă că tripletele de baze din ARNm nu pot selecta aminoacizii în mod direct. Pentru aceasta, sistemele celulare de sinteză proteică folosesc o categorie de molecule adaptor, reprezentate de ARN de transport (ARNt).

Moleculele de ARNt au rolul de traducători, deoarece ele produc translația informației codificate de un codon, într-un aminoacid. Acest lucru este posibil pentru că ARNt conține anticodonul pentru un anumit aminoacid, iar pe de altă parte, pentru că se leagă specific de acest aminoacid (Fig 3.17).

Fig. 3.17 Relația de asociere a unui codon cu un anticodon

Moleculele de ARNt sunt scurte (70-80 de nucleotide) și au o conformație spațială particulară. Secvența de nucleotide la toate tipurile de ARNt (pentru toți aminoacizii) se termină la capătul 3’cu tripletul CCA, iar aminoacidul se leagă la adenozina teminală a acestui triplet. O buclă a moleculei de ARNt conține un triplet de baze care se împerechează prin complementaritate cu codonul de pe ARNm, specific pentru aminoacidul pe care îl poartă legat.

Ribozomii, situsul de sinteză a proteinelor

Translația ARNm în proteine necesită un dispozitiv molecular complex, care se deplasează de-a lungul ARNm, recunoaște complexele ARNt – aminoacid, le așează pe poziție, după care leagă aminoacizii între ei pentru a forma un lanț polipeptidic. Un astfel de dispozitiv este constituit de către ribozom.

În celulele eucariote subunitățile ribozomale se formează prin asocierea ARNr proaspăt transcris cu proteinele ribozomale, care au fost transportate în nucleu după sinteza lor în citoplasmă. Când sinteza precursorilor ribozomali este terminată în nucleu (mai precis în nucleol), ele se deplasează în citoplasmă, prin intermediul porilor nucleari.

După deplasarea în citozol, precursorii subunităților ribozomale se asociază cu proteine și se împachetează în structuri foarte ordonate, proteinele reprezentând aproximativ jumătate din masa ribozomilor.

Fiecare compartiment subcelular în care are loc sinteza proteinelor conține ribozomii proprii. Astfel, celulele vegetale conțin trei tipuri diferite de ribozomi: citoplasmatici, plastidiali și mitocondriali. Toți ribozomii sunt alcătuiți din cele două subunități – subunitatea mică și subunitatea mare. În funcție de tipul celulei sau al compartimentului celular în care are loc sinteza, subunitățile ribozomale au o componența diferită (Tabelul 3.4).

Tabelul 3.3 Compoziția și proprietățile unor tipuri variate de ribozomi

Cele două subunități se asociază și disociază reversibil în timpul procesului de sinteză a proteinelor.

Subunitatea mică împerechează ARNt cu codonii de pe lanțul ARNm, în timp ce subunitatea mare catalizează formarea legăturilor peptidice care inseră aminoacidul într-un lanț polipeptidic.

Atunci când începe sinteza proteică, cele două subunități ribozomale se asociază cu o moleculă ARNm, la capătul 5’. Apoi, ribozomul se deplasează de-a lungul ARNm traducând secvența nucleotidică în secvența unui aminoacid. Ribozomul utilizează ARNt ca adaptori pentru a adăuga fiecare aminoacid în poziție corectă, la capătul lanțului polipeptidic. În final, când sinteza este terminată cele două subunități ale ribozomului se disociază.

Un ribozom conține patru situsuri de legare pentru moleculele implicate în sinteza proteinelor: unul pentru molecula de ARNm și trei numite A, P și E pentru ARNt – A, de la aminoacil-ARNt, P de la peptidil și E – ieșire (exit).

O moleculă de ARNt este menținută în situsurile A sau P numai dacă anticodonul său se împerechează cu un codon complementar de pe molecula ARNm legată la ribozom (Fig. 3.18).

Fig. 3.18 Reprezentarea grafică a unui ribozom, cu situsurile specifice de legare

3.2.2. MECANISMUL REACȚIEI DE SINTEZĂ A PROTEINELOR

3.2.2.1. REACȚIA DE ACTIVARE A AMINOACIZILOR ȘI SPECIFICITATEA DE AMINOACID

În prima etapă a sintezei proteice, care are loc în citozol, cei 20 de aminoacizi care servesc drept unități constituiente pentru proteine sunt esterificate cu ARNt corespunzători prin acțiunea unei clase de enzime, numite sisteme de activare a aminoacizilor, sau mai precis aminoacil-ARNt sintetaze, fiecare dintre ele fiind înalt specifică pentru un anumit aminoacid și pentru ARNt corespunzător.

În prima etapă molecula ATP reacționează cu aminoacidul și are loc eliminarea pirofosfatului, formându-se un intermediar legat de enzimă – aminoacil-acid adenilic. La acest intermediar, gruparea carboxil a aminoacidului este legată, printr-o legătură de tip anhidridă de gruparea 5’-fosfat din AMP; legătura macroergică anhidridică activează gruparea carboxil a aminoacidului.

În a doua etapă, gruparea aminoacil este transferată de pe AMP la capătul 3’ al ARNt corespunzător aminoacidului, urmată de eliberarea produșilor, un aminoacil-ARNt și acidul adenilic ((Fig. 3.19).

Gruparea aminoacil este esterificată prin carboxilul ei activat cu gruparea 2’ – hidroxi liberă a AMP terminal de la capătul 3’ al moleculei de ARNt și anume acela care poartă secvența terminală CCA.

Aminoacil ARN sintetazele sunt foarte specifice atât față de aminoacid cât și față de ARNt corespunzător. Acest lucru este foarte important pentru că, după ce aminoacil – ARNt s-a format, el este recunoscut numai prin tripletul anticodon din ARNt și nu prin restul de aminoacid.

Fig. 3.19 Reacția de activare a aminoacizilor, înainte de a avea loc încorporarea lor în lanțul polipeptidic

Deci, aminoacil ARNt sintetazele trebuie să posede două locuri foarte specifice de legare, unul penru aminoacid și unul pentru ARNt corespunzător și de asemenea un loc pentru legarea ATP.

Aceste enzime au o capacitate atât de mare de a deosebi diferiți aminoacizi naturali între ei, încât șansa unei erori în condițiile normale intracelulare este de 1:10.000.

3.2.2.2. INIȚIEREA LANȚULUI POLIPEPTIDIC

Procesul de inițiere este un proces complex, care are loc în mai multe etape și necesită participarea a trei proteine specifice, numite factori de inițiere (FI -1, FI-2, FI-3).

Mai întâi subunitatea mică formează un complex cu FI-3, care apoi se leagă de ARNm. La acest complex se adaugă o moleculă de FI-1. Apoi f Met-ARNt și GTP se leagă de FI-2 și complexul rezultat se combină cu complexul format de subunitatea 30S, FI-3, ARNm și FI-1 pentru a da naștere la o structură denumită complex de inițiere.

Complexul de inițiere se combină apoi cu subunitatea ribozomală mare, pentru a forma ribozomul complet, funcțional. În acest proces GTP-ul este hidrolizat la GDP și fosfat, iar cei trei factori de inițiere se disociază apoi de pe ribozom.

Este de presupus faptul că acest proces de inițiere mai sofisticat este necesar pentru a face ca aminoacil-ARNt de ințiere să se lege la situsul peptidil dispus în dreptul codonului de inițiere AUG, astfel încât ribozomul să înceapă translația la punctul corect de pe ARNm. Factorii de inițiere sunt utilizați în permanență pentru a iniția noi lanțuri.

S-a stabilit că translația codonilor din ARNm are loc în direcția 5’ → 3’; astfel, situsul P (peptidil) și A (aminoacil) de pe ribozom recunosc polaritatea lanțului ARNm.

CICLUL DE ELONGAȚIE

Elongația, sau alungirea lanțului are loc atunci cînd aminoacil-ARNt se leagă la situsul peptidil, poziționat pe codonul său de pe ARNm, având situsul A liber. Procesul de elongație decurge în trei etape principale:

Legarea noului aminoacil-ARNt

În prima etapă, noul aminoacil-ARNt este așezat pe situsul aminoacil (A); la început, noul aminoacil-ARNt se leagă de o proteină citoplasmatică specifică. În cazul celulelor procariote acest factor, denumit factor de elongație T, conține două subunități FE-Ts și FE-Tu. Factorul de elongație se combină cu GTP pentru a forma complexul FE-Tu-GTP se leagă apoi de aminoacl-ARNt pentru a forma complexul ternar FE-Tu-GTP-aminoacil-ARNt. Acest complex se leagă la ribozom, astfel încât aminoacil-ARNt să fie așezat pe situsul A, cu anticodonul său legat prin legături de hidrogen de codonul corespunzător din ARNm. În același timp, GTP este hidrolizat la GDP și P. GDP părăsește ribozomul sub formă de complex FE-Tu-GDP. Se pare că energia furnizată prin hidroliza GTP servește pentru a poziționaea corectă a aminoacil-ARNt pe situsul A.

Formarea legăturii peptidice (Fig 3.20)

Având f Met- ARNt pe situsul P și aminoacil – ARNt nou legat pe situsul A, prima legătură peptidică se formează printr-un atac nucleofil al grupării amino a aminoacil-ARNt asupra atomului de carbon de la gruparea carboxilică esterificată a f-Met-ARNt. Această reacție este catalizată de peptidil-transferază, care este prezentă pe subunitatea 50S a ribozomului.

Produsul de reacție este un dipeptidil – ARNt legat de situsul A ARNt liber rămâne legat de situsul P. La formarea noii legături peptidice nu este necesară intervenția GTP sau ATP, legătura făcându-se probabil pe socoteala energiei legăturii esterice dintre N – formilmetionină și ARNt .

Deși această descriere se referă la formarea primei legături peptidice a unui lanț polipeptidic, un proces identic are loc la fiecare ciclu de elongație.

Translocația

După formarea legăturii peptidice, peptidil ARNt, care tocmai a fost alungit cu încă o unitate, este legat încă de situsul A, poziționat în dreptul codonului corespunzător aminoacidului nou adăugat. Acum, în a treia etapă a ciclului de elongație ribozomul se deplasează la următorul codon de pe ARNm și mută, în același timp, peptidil – ARNt de pe situsul A pe situsul P.

Această translocație este un proces destul de complex, care are loc într-o succesiune de etape. O proteină specifică, numită factor de elongație G (FE – G) cât și GTP sunt necesare în această etapă.

La început, GTP se leagă de FE – G și complexul rezultat se leagă de ribozom. GTP este apoi hidrolizat la GDP și Pi. Această hidroliză pune la dispoziție energia necesară pentru realizarea unei modificări conformaționale care deplasează ribozomul la următorul codon de pe ARNm și trece peptidil – ARNt de pe situsul A pe situsul P. Situsul A este acum liber, cu un nou codon în poziție, gata să primească un nou aminoacil – ARNt declanșându-se astfel un nou ciclu de elongație. După etape de translocație FE – G disociază de pe ribozom.

Suita de evenimente din ciclul de elongație necesită o topologie înalt specifică a locurilor de legare a peptidil – ARNt , aminoacil – ARNt, ARNm , factori de elongație și GTP. Este de presupus că ribozomul trece printr-o serie de modificări specifice complexe ale formei sale în timpul fiecărui ciclu de formare a unei legături peptidice. Pare ca și cum ARNm ar aluneca printr-un șanț sau tunel din ribozom (aprox. 25 nucleotide/ribozom).

3.2.2.4. TERMINAREA LANȚULUI POLIPEPTIDIC

Completarea unui lanț polipeptidic și detașarea sa de pe ribozom necesită etape speciale. Terminarea sintezei lanțului polipeptidic este semnalată de unul din cei trei codoni de terminare (codoni stop) de pe ARNm . După ce ultimul rest de aminoacid, care este cel carboxil terminal a fost adăugat lanțului polipeptidic de pe ribozom, polipeptidul este încă atașat covalent prin gruparea sa carboxil – terminală la ARNt , care se află pe situsul A de pe ribozom. Desprinderea polipeptidil – ARNt de pe ribozom este inițiată de trei proteine numite factori de desprindere notați cu R1 , R2 și P3 . Aceștia se leagă de ribozom pentru a produce trecerea polipeptidil – ARNt de pe situsul A pe situsul P.

Legătura esterică dintre lanțul polipeptidic și ultimul ARNt este apoi hidrolizată, prin acțiunea unei peptidiltransferaze, a cărei acțiune catalitică și specificitate pare să fie modificată de factori de desprindere legați de ribozom.

O dată ce polipeptidul este desprins sunt eliberați și ultimul ARNt și ARNm . Ribozomul liber 70S se disociază în subunitățile sale 50S și 30S , proces care necesită prezența unuia dintre factorii specifici de inițiere și sinteza unui nou lanț polipeptidic poate începe.

3.3. MECANISMELE MOLECULARE DE MODIFICARE POSTRANSLAȚIONALĂ

Pentru a-și putea îndeplini funcțiile în celule, lanțurile polipeptidice sintetizate trebuie să se plieze în conformații tridimensionale distincte și uneori, mai multe lanțuri polipeptidice trebuie să se asambleze într-un complex funcțional. Apoi, multe proteine suferă modificări ulterioare care sunt foarte importante pentru funcționarea și localizarea lor corectă în celulă:

Plierea sau împachetarea lanțurilor polipeptidice;

Maturarea lanțurilor polipeptidice, care constă în clivarea unor secvențe, sau atașarea unor grupări (oligozaharide sau lipide).

3.3.1. MATURAREA LANȚURILOR POLIPEPTIDICE

Clivarea lanțului polipeptidic, proteoliza este o etapă importantă în maturarea multor proteine. De exemplu, metionina inițiatoare, de la capătul amino al multor polipeptide este înlăturată prin proteoliză, imediat după ce capătul NH2 iese din ribozom. De asemenea, secvențele semnal care orientează lanțurile polipeptidice spre destinații intracelulare precise sunt îndepărtate după ce și-au îndeplinit funcția.

Glicozilarea constă în modificarea proteinelor prin adiția oligozaharidelor, fiind un proces specific celulelor eucariote. Glicoproteinele astfel rezultate sunt de obicei secretate sau localizate pe suprafața celulei, dar există și unele proteine nucleare și citozolice glicozilate.

După situsul de atașare al lanțului lateral glucidic, glicolipidele pot fi clasificate în N- linkate sau O-linkate. În glicoproteinele O-linkate, atomul de oxigen din catena laterală a serinei și treoninei este situsul pentru atașarea oligozaharidului. În glicoproteinele N-linkate, oligozaharidul este atașat la atomul de azot din catena laterală a asparaginei.

Glicoproteinele situate pe suprafața celulară au grupările glucidice orientate spre exterior, având rol în semnalizarea celulară.

Atașarea lipidelor la proteinele asociate pe fața citozolică a membranei plasmatice a celulelor eucariote. Procesul poate fi realizat prin trei mecanisme:

N-miristoilarea, în care acidul miristic este atașat la un rest de glicină N-terminal.

Prenilarea, care permite atașarea unor lipide specifice la atomii de sulf din catenele laterale ale resturilor de cisteină localizate lângă capătul C-terminal al lanțului polipeptidic. În acest mod sunt modificate numeroase proteine asociate cu membrana plasmatică, implicate în controlul creșterii și diferențierii celulare.

Palmitoilarea constă în adaosul acidului palmitic la atomii de sulf ai catenelor laterale ale resturilor de cisteină, permițând astfel asocierea unor proteine pe fața internă a membranei plasmatice.

3.3.2. PLIEREA, ÎMPACHETAREA LANȚURILOR POLIPEPTIDICE

Conform principiului clasic al împachetării proteinelor, toată informația necesară pentru ca o proteină să adopte conformația tri-dimensională corectă este furnizată de secvența sa de aminoacizi. În plus, există macromolecule specializate, care facilitează plierea corectă a lanțurilor polipeptidice. Acestea pot fi chaperone (însoțitori moleculari) sau enzime.

Chaperonele, sau însoțitorii moleculari au rolul de a facilita plierea corectă a altor proteine. Astfel, chaperonele stabilizează lanțurile polipeptidice deja formate în timpul transportului lor spre organite celulare.

Ele stabilizează lanțurile polipeptidice în formare, a căror translație se desfășoară încă la nivelul ribozomilor. Legarea chaperonelor menține porțiunea aminoterminală a lanțului polipeptidic într-o conformație nepliată, până când restul lanțului polipeptidic este sintetizat, iar proteina se poate plia corect. Totodată chaperonele mențin proteinele nepliate, pentru a media transportul lor prin canale transmembranare specifice.

Termenul de chaperonă a fost utilizat pentru prima dată pentru o proteină, nucleoplasmina care se leagă la histone și mediază asamblarea acestora în nucleozomi, fără ca nucleoplasmina să fie încorportă în structura nucleozomului final. Dar chaperonele au, pe lângă un rol de catalizator mediator al plierii proteinelor, deoarece ele asistă procesul de autoasamblare al lanțurilor polipeptidice.

Una dintre cele mai cunoscute molecule însoțitor este HSP (heat shock protein), prezentă în toate celulele. Sinteza multor proteine HSP este inițiată ca răspuns la un șoc termic, probabil pentru a preveni împachetarea greșită, sau pentru a repara proteinele împachetate greșit.

Astfel de proteine pe lângă implicarea în translocare și împachetare mai îndeplinesc și alte funcții în transportul proteinelor prin membrane.

Membri familiei Hsp 60 (numiți chaperonine) facilitează plierea proteinelor în conformațiile lor native. O chaperonină are 16 subunități, aranjate sub forma a două inele. Lanțurile polipeptidice sunt protejate de citozol prin legarea în interiorul cavității centrale a cilindrului chaperoninei. În acest mediu izolat are loc plierea corectă a lanțurilor polipeptidice, proces care este însoțit de hidroliza ATP. Energia furnizată de hidroliza ATP este folosită pentru desfășurarea proceselor de eliberare și reatașare a regiunilor nepliate ale lanțului polipeptidic la chaperonină, permițând plierea gradată a ppolipeptidului în conformația corectă.

Enzimele implicate în împachetarea corectă a lanțurilor polipeptidice catalizează ruperea și refacerea unor legături specifice.

Astfel, protein disulfid izomeraza catalizează ruperea și refacerea legăturilor disulfurice între resturile de cisteină, permițând plierea corectă (Fig. 3.21).

Legăturile disulfurice sunt specifice proteinelor de secreție și pentru unele proteine membranare. Formarea legăturilor disulfurice în citozol nu este posibilă datorită agenților reducători care mențin resturile de cisteină în forma lor redusă. Legăturile S-S se formează în reticulul endoplasmatic deoarece aici se menține un mediu oxidant.

Fig. 3.21 Acțiunea protein disulfid-izomerazei (PDI) în procesul de rearanjare a legăturilor disulfurice

Peptil prolil izomeraza este cea de-a doua enzimă implicată în plierea proteinelor. Ea catalizează izomerizarea legăturilor peptidice care implică resturi de prolină. Peptidil prolil izomeraza catalizează izomerizarea între configurațiile cis și trans ale legăturilor peptidice prolil, care ar putea constitui o etapă limitativă în plierea proteinelor.

3.3.3. REGLAREA FUNCȚIILOR PROTEINELOR

Enzimele catalizează aproape toate reacțiile biologice. Reglarea activității enzimatice se realizează parțial la nivelul expresiei genice, care determină cantitatea oricărei enzime sintetizată în celulă. Dar există și sisteme de reglare a funcțiilor proteinelor deja sintetizate, după cum urmează :

REGLAREA PRIN MOLECULE MICI

Enzimele pot să-și modifice conformația prin legarea unor molecule mici, cum ar fi aminoacizii sau nucleotidele și în acest fel activitatea lor enzimatică va fi alterată. De exemplu, produșii finali ai multor căi biosintetice inhibă enzimele care catalizează primul pas al sintezei lor și astfel se asigură o cantitate adecvată de produs și se împiedică sinteza acestuia în cantități excesive

Acest tip de inhibare poartă numele de reglare alosterică, în care molecula reglatoare se leagă necovalent la un situs de pe enzimă, care este diferit de situsul catalitic.

Un alt tip de mecanism de control a activităților celulare intracelulare este legarea GTP. De cele mai multe ori forma legată de GTP a proteinelor reprezintă forma lor activă, în schimb forma legată de GDP reprezintă conformația inactivă. În celule are loc un schimb permanent între GTP și GDP atașate la proteine, în funcție de necesitățile de moment ale celulei.

REGLAREA PRIN MODIFICĂRI COVALENTE

Unele enzime sunt reglate prin clivarea proteolitică a precursorilor inactivi. Proteoliza este un proces ireversibil, constituind un mod covalent de reglare a activității enzimatice.

Un alt exemplu de modificare covalentă a proteinelor este fosforilarea. Fosforilarea este un proces rapid de activare sau inhibare a activității unor proteine celulare ca răspuns la stimuli externi.

Fosforilarea proteică este catalizată de protein kinază, care transferă grupările fosfat de la ATP la grupările hidroxil ale catenelor laterale ale serinei, treoninei sau tirozinei.

Fosforilarea proteică este reversibilă datorită proteinfosfatazelor care catalizează hidroliza resturilor de aminoacizi fosforilați.

La fel ca protein kinazele, majoritatea protein fosfatazelor sunt specifice, fie pentru serină și treonină, fie pentru tirozină, deși unele recunosc toți cei trei aminoacizi. Prin acțiune combinată, protein kinazele și protein fosfatazele mediază fosforilarea reversibilă a multor proteine celulare.

După fosforilare, gruparea polară dar neutră din punct de vedere electric (OH) este înlocuită cu o grupare fosfat ( – PO32-), încărcată negativ. Acest schimb va conduce la modificarea structurii tridimensionale a proteinei substrat. Astfel de modificări afectează în primul rând activitatea proteinei dar pot influența și stabilitatea ei sau localizarea subcelulară.

Deci, fosforilarea/defosforilarea reprezintă un mecanism de reglare, în care proteina substrat poate fi în forma activă sau inactivă în funcție de fosforilare.

Protein kinazele și fosfatazele sunt componente importante ale căilor de semnalizare care controlează diviziunea celulară, creșterea, formarea citoscheletului și metabolismul. Ele funcționează ca amplificatori ai semnalelor și modifică răspunsul celular la semnalele externe.

3.3.3.3. INTERACȚIUNILE PROTEINĂ – PROTEINĂ

Subunitățile componente ale unor proteine sunt lanțuri polipeptidice identice. Alte proteine conțin două sau mai multe polipeptide distincte.

Interacțiunile dintre lanțurile polipeptidice sunt importante în reglarea activității proteice. Astfel, la multe enzime alosterice legarea unei molecule reglatoare alterează conformația proteică, prin modificarea interacțiunilor dintre subunități.

3. 4. PROCESELE DE PRELUCRARE POST-TRANSLAȚIONALE

Aproape toate proteinele unei celule eucariote sunt codificate de ADN nuclear și sintetizate de ribozomii citozolici, care pot să fie atașați la membrana RE sau nu. Totuși, proteinele codificate de ADN cloroplastic și mitocondrial (aproximativ 100) sunt sintetizate de ribozomi în interiorul acestor organite și încorporate direct în compartimentul organitului respectiv.

Proteinele sintetizate în citoplasmă trebuie să se deplaseze spre o destinație specifică, care este indicată de un domeniu de localizare specific. Domeniile de localizare sunt de obicei peptide scurte, dar pot fi și oligozaharide ca în cazul hidrolazelor lizozomale din celulele mamiferelor. Domeniile de localizare sunt de obicei localizate la capătul aminoterminal al proteinei, alteori pot să fie localizate la capătul carboxil, sau chiar în mijlocul lanțului polipeptidic.

Domeniul de localizare este esențial pentru transportul proteinei, dar de obicei nu face parte din forma activă a proteinei. De aceea, după atingerea destinației aceste domenii sunt clivate de proteaze specifice dând naștere proteinei active, mature.

În cazul proteinelor care rămân în citozol (ex. actina, tubulina) nu sunt prezente domenii de localizare dar există domenii informaționale care permit monomerilor să dea naștere unei structuri organizate.

Pentru a pătrunde într-un anumit compartiment celular este necesar ca proteinele să traverseze membrana acestuia. Majoritatea proteinelor posedă suprafețe hidrofilice și de aceea ele nu pot să traverseze direct miezul hidrofob al biomembranelor. Această traversare are loc prin intermediul unor proteine transmembranare care funcționează ca proteine transportoare sau proteine canal prin care proteina trebuie să treacă într-o configurație neîmpachetată. Pentru a se menține în formă neîmpachetată lanțul polipeptidic se asociază cu proteine însoțitoare, (chaperone). Acestea stabilizează structura lanțului polipeptidic neîmpachetat, ușurând astfel traversarea membranei. Alte tipuri de chaperone se leagă de lanțul polipeptidic după ce acesta a traversat membrana, asigurând împachetarea corectă. (Fig. 3.22).

Fig. 3.22 Stabilizarea lanțului polipeptidic, cu proteine chaperone specifice,

în vederea traversării membranei

Calea urmată de fiecare lanț polipeptidic este determinată deci de domeniile de localizare, care permit sortarea proteinelor în mai multe etape. Primul eveniment de sortare a proteinelor le separă în două grupuri.

Proteinele din prima categorie sunt sintetizate pe ribozomii liberi din citoplasmă și pot să rămână în acest compartiment sau să fie dirijate spre alte compartimente în funcție de secvențele semnal specifice – plastide, mitocondrii, peroxizomi și nuclei (Fig. 3.23. A).

Proteinele din cel de-al doilea grup sunt orientate spre RE datorită prezenței unei secvențe semnal specifice, localizate la capătul amino terminal. Translația acestei molecule semnal face ca ribozomul să se atașeze la RE în timpul sintezei proteice. RE la care s-au atașat ribozomii este denumit RE rugos. Proteinele astfel sintetizate sunt proteinele care urmează calea secretorie, adică sunt eliminate din celulă sau sunt orientate spre diferite compartimente cum ar fi: perete celular, plasmalemă, vacuole și tonoplast (Fig. 3.23, B).

Fig. 3.23 Sortarea proteinelor în funcție de destinație

3.4.1. CALEA TRANSPORTULUI POST-TRANSLAȚIONAL

Calea transportului post-translațional este urmată de proteinele sintetizate pe ribozomii liberi, care nu se atașează la membrana reticulului endoplasmatic (RE). Aceștia sunt denumiți ribozomi liberi, deși uneori ei sunt asociați cu citoscheletul. Cu ajutorul acestor ribozomi sunt sintetizate atât proteine solubile cât și proteine membranare, care vor fi orientate spre nucleu, mitocondrii, cloroplaste sau peroxizomi.

3.4.1.1. PROTEINELE LOCALIZATE ÎN CITOPLASMĂ

În cazul sintezei unor astfel de proteine în lanțul polipetidic nu sunt prezente domenii de localizare. Proteinele sunt sintetizate pe ribozomii liberi aflați în citoplasmă, iar după finalizarea sintezei sunt împachetate astfel încât să-și îndeplinească funcția specifică. De exemplu, monomerii actinici sunt sintetizați pe ribozomii liberi aflați în citozol, iar după sinteză se asamblează dând naștere filamentelor de actină.

3.4.1.2. PROTEINELE LOCALIZATE ÎN PLASTIDE

Deși plastidele conțin propriul lor ADN și ribozomi, majoritatea proteinelor sunt codificate de ADN nuclear și importat din citoplasmă. Conținutul plastidelor este separat de citoplasmă prin două membrane distincte – membrana internă și cea externă. În plus cloroplastele au un sistem de membrane intern–membranele tilacoide. Cele trei membrane definesc trei compartimente apoase: spațiul intermembranar, stroma și lumenul tilacoid. Fiecare compartiment apos și fiecare membrană conțin proteine specifice, unice. Localizarea proteinelor într-un anumit compartiment necesită prezența a două domenii de localizare: primul, care orientează proteina spre cloroplaste și cel de-al doilea care asigură localizarea precisă în compartimente.

Proteinele sintetizate pe ribozomii liberi, care sunt apoi orientate spre cloroplaste posedă un domeniu de localizare cloroplastică, denumit peptidă de tranzit. Această peptidă de tranzit este localizată la capătul amino al proteinei și este alcătuită din 40-50 de aminoacizi, având rol atât în orientare cât și în procesul de translocare prin învelișul cloroplastului. După translocarea prin învelisul cloroplastului peptida de tranzit este eliminată de către o peptidază.

Peptidele de tranzit sunt necesare și suficiente pentru importul în cloroplaste. Proteinele care nu au o peptidă de tranzit nu pot fi importate iar dacă o peptidă tranzit este adăugată la capătul amino al unei proteine străine cloroplastului aceasta va fi importată.

Mecanismul după care are loc translocarea proteinelor prin învelișul cloroplastic

Importul proteinelor în cloroplaste are loc prin intermediul unor canale transmembranare care apar la locul de contact dintre cele două membrane. Astfel precursorii proteici străbat ambele membrane, pătrunzând în stroma mitocondrială. Până în prezent nu se cunoaște sigur dacă peptida de tranzit interacționează inițial cu receptori proteici sau cu lipide din membrana externă. Este posibil ca ambele interacțiuni să apară. Proteinele destinate să ajungă în membrana externă a cloroplastului nu intră prin canalul de transport ci pătrund în membrană direct din citozol.

Înainte de a traversa canalul transmembranar precursorii proteici se asociază cu chaperone, care împiedică împachetarea și ușurează pătrunderea prin canalul transmembranar.

După pătrunderea proteinei în stromă peptida de tranzit este eliminată de către o peptidază.

O dată aflat în interiorul cloroplastului polipeptidul are câteva posibilități (Fig. 3.24):

Fig. 3.24 Mecanismul de import al proteinelor în cloroplaste

Dacă proteina rămâne în stromă o chaperonă complexă, de dimensiuni mari (alcătuită dintr-o subunitate mare HSP 60 și o subunitate mică HSP 10 kDa) va ajuta la împachetare într-un proces dependent de ATP (Fig. 3.24, calea 1).

Dacă proteina va fi localizată în membrana cloroplastică internă ea va fi orientată spre această membrană de către o secvență semnal specifică, care devine activă după eliminarea peptidazei de tranzit (nu se evidențiază în figură).

Dacă proteinele fac parte din alcătuirea membranei tilacoide, după eliminarea peptidei de tranzit se activează o secvență semnal de care se leagă o particulă de recunoașterea semnalului (SRP). Complexul alcătuit din proteină și secvența de recunoaștere a semnalului este orientat spre membrana tilacoidă. Procesul necesită GTP (Fig. 3.24 Calea 2, particula SRP nu este evidențiată).

In cazul proteinelor care funcționează în lumenul tilacoid, după eliminarea peptidai semnal se activează un domeniu de localizare lumenală și totodată proteina se asociază cu chaperone specifice, care împiedică împachetarea. În această formă proteina este orientată spre tilacoizi. În membrana tilacoidă există canale transmembranare care permit transferul proteinelor care posedă semnal de localizare lumenală (Fig. 3.24, calea 3).

Importul în cloroplaste poate fi studiat prin reconstituirea procesului într-o cultură de celule sau cu ajutorul plantelor modificate genetic.

Procesul necesită chaperone pe ambele fețe ale învelișului cloroplastic și un grup de proteine denumite aparat de import proteic Acest aparat străbate ambele membrane la locul în care ele vin în contact. Ambele etape necesită energie provenită din hidroliza ATP.

În prima etapă chaperonele citozolice mențin proteinele într-o formă nepliată. Peptida de tranzit de pe aceste proteine interacționează cu lipidele membranei externe sau cu proteinele din aparatul de import, care formează canalul transmembranar prin care are loc importul. În timpul anilor 90 cercetătorii au identificat câteva proteine care fac parte din aparatul de import și au obținut ADNc care le codifică. Aceste componente au fost denumite Toc (translocon of the outer envelope membrane of the chloroplast). Două dintre aceste proteine Toc 34 și Toc 159 sunt proteine dependente de GTP strâns ancorate în membrana externă, cu domeniul care leagă GTP orientat spre citozol. O a treia proteină, Toc 75, care este de asemenea adânc împlântată în membrana externă, are o secvență care nu prezintă omologie cu nici o proteină cu funcție cunoscută identificată până în prezent. A patra proteină, HSP 70 IAP ( import intermediate – associated protein) un omolog al proteinei HSP 70 prezintă caracteristicile biochimice ale unei proteine membranare integrale. Interacțiunea precisă a acestor proteine și implicarea lor în procesul de transport nu este încă bine înțeleasă. Numai o componentă a sistemului de translocare din membrana internă a fost identificată până acum.

3.4.1.3. PROTEINELE LOCALIZATE ÎN MITOCONDRII

Mitocondriile sunt prezente în aproape toate celulele eucariote. La fel ca și cloroplastele, posedă o membrană internă și o membrană externă, care delimitează două compartimente și anume spațiul intermembranar și matrixul mitocondrial.

Fiecare membrană și fiecare compartiment posedă un set unic de proteine, similar cu celelalte organite. Enzimele care alcătuiesc lanțul de transport al electronilor se găsesc în membrana internă, pe când majoritatea enzimelor care alcătuiesc ciclul acidului citric se găsesc în matrixul mitocondrial.

Mitocondriile posedă propriul ADN, ARN și sistem enzimatic de sinteză proteică. Cu toate acestea majoritatea proteinelor mitocondriale trebuie să fie importate din citozol, deoarece sunt codificate de ADN nuclear și sintetizate în citozol.

Transportul mitocondrial a fost studiat cu precădere la drojdii, dar se consideră că mecanismul de transport la plante este similar.

Majoritatea proteinelor mitocondriale sunt sintetizate sub forma unor precursori, având la capătul amino-terminal un domeniu de localizare – presecvență, care facilitează translocarea proteinelor prin ambele membrane mitocondriale. Aceste presecvențe sunt asemănătoare cu peptidele de tranzit ale proteinelor cloroplastice.

Presecvențele au structuri de helixuri cu caracter amfipatic, deoarece posedă aminoacizi hidrofobi pe una dintre fețe și resturi de aminoacizi încărcați pozitiv pe cea de-a doua latură. După ce o proteină pătrunde în matrixul mitocondrial presecvența este clivată de o peptidază, exact ca în cazul cloroplastelor.

Proteinele sunt transportate în mitocondrii neîmpachetate, fiind menținute în această formă cu ajutorul chaperonelor citozolice. Procesul de translocare a proteinelor este mediat de un aparat de import, care străbate ambele membrane la punctul de contact dintre acestea. După ce proteina a pătruns în matrix, aceasta este împachetată cu ajutorul altor chaperone.

Din nou ca la cloroplaste transportul unor proteine în membrana mitocondrială internă și în spațiul intermembranar necesită existența a două semnale. Astfel de proteine posedă o secvență de aminoacizi hidrofobici imediat după presecvență. Atunci când presecvența este eliminată de către o peptidază din matrix, secvența hidrofobică nou expusă funcționează ca un domeniu de localizare pentru a orienta proteina din matrix spre membrana internă. Proteinele destinate a face parte din membrana internă rămân fixate în aceasta, pe când proteinele care funcționează în spațiul intermembranar sunt translocate în spațiul intermembranar unde este eliminat domeniul de localizare, formându-se proteina activă.

3.4.1.4. PROTEINELE LOCALIZATE ÎN PEROXIZOMI

Peroxizomii sunt organite specializate care participă la mai multe căi metabolice fiind prezente în toate celulele eucariote. Celulele vegetale conțin cel puțin trei tipuri de peroxizomi.

Plantele tinere și frunzele senescente conțin glioxizomi, care au rol în mobilizarea trigliceridelor stocate.

Cea de-a doua categorie de peroxizomi, prezenți în frunze joacă un rol important în reacția de respirație care însoțește fixarea dioxidului de carbon în plantele C3.

A treia categorie, întâlnită la unele plante leguminoase tropicale care exportă ureide, conțin enzime unice, implicate în metabolismul azotului.

Spre deosebire de cloroplaste și mitocondrii, peroxizomii sunt mărginiți de o membrană simplă și ei nu conțin ADN sau ribozomi. În consecință toate proteinele peroxizomilor sunt sintetizate de către ribozomii liberi din citoplasmă și importate în peroxizomi.

Cel puțin două domenii de localizare PTS1 și PTS 2 sunt implicate în importul proteinelor în matrixul mitocondrial. Secvența semnal PTS1 este foarte scurtă (tripeptidă) și spre deosebire de alte domenii de localizare se găsește la capătul carboxiterminal al lanțului polipeptidic și nu este îndepărtată după translocarea în peroxizomi.

Secvența semnal PTS2 se află la capătul aminoterminal al lanțului polipeptidic, este îndepărtată după translocarea proteinei în matrixul peroxizomului și marchează proteinele prezente în matrix.

Importul proteinelor în peroxizomi nu necesită numai un domeniu de localizare dar necesită de asemenea și energie furnizată de hidroliza ATP-ului.

Deși transportul unor proteine care conțin secvențele PTS1 necesită factori citozolici, cum ar fi membri ai familiei Hsp 70 nu se cunoaște încă dacă pentru transportul unor proteine în peroxizomi sunt necesare chaperonele.

3.4.1.5. PROTEINELE LOCALIZATE ÎN NUCLEU

În funcție de dimensiunile lor, moleculele pot traversa complexul porului nuclear prin două mecanisme.

Moleculele mici (sub 40 KDa) difuzează activ prin cele opt canale deschise, cu diametru de 9 nm, care sunt delimitate de ansamblul spițe-inele din structura porului nuclear.

Macromoleculele (proteine, ADN) trec prin canalul central printr-un proces activ, în care proteinele specifice și ARN sunt recunoscute și transportate selectiv într-o singură direcție (Fig. 3.25).

Fig. 3.25 Tipurile de transport ale proteinelor și ARN,

prin complexul porului nuclear

Proteinele transportate în nucleu, dintre care pot fi menționate histonele, ADN polimerazele, factorii de transcripție sunt dirijate spre nucleu prin secvențe de aminoacizi specifice, denumite semnale de localizare nucleară (NLS).

Până în prezent au fost identificate două semnale majore pentru importul proteinelor în nucleu: tipul SV 40 și tipul bipartit.

Prima secvență de acest tip a fost identificată la virusul SV40, având următoarea structură : PKKKRKV. Acest tip de semnal este caracterizat de câteva resturi bazice consecutive și în multe cazuri mai conține și un rest prolinic.

Tipul bipartit are următoarea secvență de localizare nucleară (NLS): KRPAATKKAGQAKKKK. Aceasta se caracterizează printr-un model alcătuit din două resturi bazice, 10 resturi distanțatoare și o altă regiune bazică, constituită din 3-5 resturi bazice.

3.4.2 CALEA TRANSPORTULUI CO-TRANSLAȚIONAL

Calea transportului co-translațional este urmată de proteinele care sunt orientate în final spre peretele celular, plasmalemă, vacuole și tonoplast, sau sunt eliminate din celulă.

Proteinele care urmează această cale sunt orientate spre reticulul endoplasmatic (RE) încă din timpul sintezei proteice, împreună cu ribozomii. După ce procesul de sinteză s-a finalizat, proteinele sunt modificate, asamblate, sortate și orientate spre destinațiile specifice.

RE care ia astfel naștere poartă numele de reticul endoplasmatic rugos. Acesta este abundent în celulele specializate în secreția proteinelor (de exemplu celulele cerealelor aleurone) sau în stocarea proteinelor vacuolare (de exemplu celulele parenchimatice ale semințelor).

Proteinele care urmează calea secretorie pot fi împărțite la rândul lor în două categorii:

Proteinele care sunt orientate spre vacuole sau spre exteriorul celulelor (perete celular și proteine de secreție) traversează membrana reticului endoplasmatic, regăsindu-se în forma lor finală în interiorul acestuia;

Proteinele integrale, care vor intra în alcătuirea plasmalemei, tonoplastului, complexului Golgii sau membranei nucleare rămân încastrate în membrana reticulului endoplasmatic (RE).

3.4.2.1. MECANISMUL DE TRANSPORT CO-TRANSLAȚIONAL AL PROTEINELOR DE SECREȚIE

În cazul proteinelor care urmează calea transportului co-translațional lanțul polipeptidic nou sintetizat posedă la capătul aminoterminal un domeniu de localizare care poartă numele de peptidă semnal, cu o lungime de 16-30 de aminoacizi, care orientează lanțul polipeptidic în formare spre membrana RE.

O peptidă semnal tipică constă din unul sau mai mulți aminoacizi încărcați pozitiv, urmați de o regiune alcătuită din 6-12 aminoacizi hidrofobici. Aminoacizii încărcați pozitiv permit interacțiunea acestei secvențe cu partea polară a membranei RE, iar aminoacizii hidrofobi preîntâmpină respingerea lanțului polipeptidic de către miezul hidrofob al membranei.

Peptidele semnal sunt similare în cazul diferitelor proteine atât în celulele vegetale cât și în cele animale și drojdii. Prin tehnologia ADN recombinat s-a dovedit că prezența acestei secvențe semnal la orice tip de proteină va conduce la orientarea ribozomului pe care are loc acea sinteză spre membrana RE.

Înainte de a se lega la RE, peptida semnal este recunoscută de o particulă de recunoaștere a semnalului (SRP) care este un complex ribonucleoproteic. Această particulă conține o moleculă mică de ARN, cu o lungime de 300 de nucleotide care leagă 6 proteine diferite, fiecare având o funcție specifică. Particula de recunoaștere a semnalului (SRP) este prezentă de obicei în citozol unde așteaptă apariția unei peptide semnal la capătul unui lanț polipeptidic care tocmai este sintetizat. Procesul de recunoaștere între peptida semnal și particula de recunoaștere a semnalului are loc atunci când polipeptidul nou sintetizat are o lungime de aproximativ 70 aminoacizi cu aproximativ 40 de aminoacizi ieșiți din ribozom. Legarea particulei de recunoaștere a semnalului (SRP) la lanțul polipeptidic în formare blochează sinteza și evită împachetarea greșită a polipeptidului deja sintetizat.

Translocarea lanțului polipeptidic prin membrana reticulului endoplasmatic (RE)

Translocarea proteinelor în lumenul RE implică particula de recunoaștere a semnalului, receptorul acestei particule și o proteină canal (complex de translocare) din membrana RE.

După ce particula de recunoaștere a semnalului (SRP) s-a legat la peptida semnal care iese din ribozom întregul ansamblu intră în contact cu receptorul SRP și se atașează la membrana RE.

Receptorul este o proteină integrală transmembranară compusă din două polipeptide dependente de GTP. O dată ce tot complexul s-a atașat la membrana RE particula de recunoaștere a semnalului disociază de pe peptida semnal, utilizând energia furnizată de hidroliza GTP-ului.

După ce SRP este eliberată în citozol, ribozomul și lanțul polipeptidic în formare se atașează la complexul de translocare care este o proteină canal transmembranară, alcătuită din trei proteine transmembranare. În continuare translația și translocarea în lumenul RE au loc simultan. În timp ce lanțul polipeptidic înaintează prin canalul transmembranar peptida semnal este clivată de către o peptidază, un complex enzimatic care se află în lumenul RE. Ca rezultat, peptida semnal nu este prezentă în proteinele vacuolare sau proteinele de secreție.

După eliminarea peptidei semnal lanțul polipeptidic pătrunde în lumenul RE, până la finalizarea sintezei, când întregul lanț polipeptidic se regăsește în lumenul RE. În timp ce are loc translația și translocația de lantul polipeptidic care crește în lumenul RE se leagă chaperoane specifice care împiedică împachetarea greșită pe parcursul sintezei (Fig. 3.26).

Fig. 3.26 Mecanismul de translocare a lanțului polipeptidic prin membrana reticulului endoplasmatic

Particula de recunoaștere a semnalului (SRP) se atașează la peptida semnal;

Întregul complex format se depasează la nivelul complexului de translocare, SRP fiind recunoscută de un receptor specific;

Lanțul polipetidic în formare străbate canalul complexului de translocare;

Peptidaza semnal clivează peptida semnal, lanțul polipeptidic ănaintând în lumenul RE;

Lanțul polipeptidic, după finalizarea sintezei se regăsește în lumenul RE.

3.4.2.2. MECANISMUL DE TRANSPORT CO-TRANSLAȚIONAL AL PROTEINELOR MEMBRANARE INTEGRALE

În această categorie se încadrează proteinele membranare integrale ale RE, complexului Golgi, tonoplastului și plasmalemei. Mecanismul urmat depinde de numărul segmentelor transmembranare ale proteinei și de orientarea acesteia.

În funcție de numărul și tipul domeniilor transmembranare posedate de către fiecare lanț polipeptidic, proteinele de membrană se împart în trei categorii.

Tipul I de proteine de membrană

În această categorie se încadrează proteinele care au un singur domeniu transmembranar, iar regiunea care rămâne localizată în citozol se află la capătul carboxi.

Peptida semnal, localizată la capătul amino, care pătrunde în lumenul RE, este clivată imediat după ce proteina începe să traverseze membrana RE. Apoi translocarea este oprită înainte de finalizarea translației, în momentul apariției unei secvențe de stopare a transferului (secvență hidrofobică) (Fig. 3.27).

Dimensiunile domeniului polipeptideic care rămâne în citozol depinde de localizarea domeniului transmembranar în interiorul proteinei.

Fig. 3.27 Mecanismul de stopare a transferului în cazul proteinelor de membrană

Tipul II de proteine de membrană

În această categorie se încadrează proteinele care au un singur domeniu transmembranar, iar domeniul care rămâne localizat în citozol se află poziționat la capătul amino al lanțului polipeptidic.

Aceste proteine nu posedă o peptidă semnal care să fie eliminată după pătrunderea în lumenul RE. Se pare că domeniul transmembranar de natură hidrofobică acționează ca o secvență semnal și direcționează integrarea proteinei în membrana RE lăsând o mare porțiune a regiunii aminoterminale în citozol. Segmentul carboxi – terminal al proteinei se găsește în lumenul RE.

În această categorie se încadrează proteinele membranare ale Complexului Golgi.

Tipul III de proteine de membrană

În această categorie se încadrează proteinele care posedă mai multe domenii transmembranare. În structura acestor lanțuri polipeptidice alternează regiuni hidrofobe, care alcătuiesc domeniile transmembranare cu regiuni hidrofile care alcătuiesc buclele de legătură. Acestea din urmă sunt poziționate fie în citozol, fie în lumenul RE (Fig. 3.28).

În cazul acestor proteine primul domeniu transmembranar acționează ca o peptidă semnal iar cel de-al doilea funcționează ca o secvență de ancorare. Al treilea domeniu acționează din nou ca o peptidă semnal, al patrulea ca o secvență de ancorare, etc. Deși atât SRP cât și receptorii pentru SRP sunt necesari pentru integrarea primului domeniu transmembranar ele nu sunt necesare pentru următoarele domenii transmembranare.

Fig. 3.28. Dispunerea celor trei tipuri de proteine de membrană

în reticulul endoplasmatic (a- tip I, b-tip II, c-tip III)

O dată ce aceste proteine sunt inserate în membrana RE ele pot să fie reținute acolo (rezidente RE) sau să fie îndreptate spre alte destinații. Până în prezent nu există cunoștințe despre domeniile care orientează proteinele spre alte destinații sau le mențin în calea de transport.

3.4.3. PRELUCRAREA PROTEINELOR ÎN LUMENUL RETICULULUI ENDOPLASMATIC

Modificările care au loc în lumenul reticulului endolasmatic permit proteinelor să se împacheteze corect și să fie orientate spre compartimentul celular în care își vor îndeplinifuncția.

Lumenul reticulului endoplasmatic conține un număr de enzime și chaperone care asigură împachetarea corectă și care au posibilitatea să degradeze polipeptidele sintetizate greșit. Astfel există certitudinea că numai proteinele corect împachetate și asamblate sunt transportate pe calea secretorie spre destinația lor finală.

Proteinele care se regăsesc în lumenul RE (proteinele orientate spre vacuole, perete celular și proteine de secreție) pot să sufere următoarele modificări:

Adoptarea conformației spațiale corecte a proteinelor care are loc fie cu ajutorul proteinelor însoțitoare (chaperoane) fie prin formarea legăturilor disulfidice între grupările SH ale resturilor cisteinice sau oligomerizarea și atașarea unor glicani N-linkați;

Glicozilarea proteinelor.

Fiecare proteină suferă o parte dintre aceste modificări, dar pot să apară și altele, după ce proteina părăsește RE. Proteinele care nu sunt corect împachetate sau asamblate pot să fie reținute în RE unde ele pot să fie distruse de proteaze.

3.4.3.1. ADOPTAREA CONFORMAȚIEI SPAȚIALE CORECTE A PROTEINELOR

Procesul este mediat de o chaperonă BiP – Binding protein (70 kDa) (care funcționează în lumenul RE și a fost descoperită în celulele animale care secretă imunoglobulină G) și alte proteine de acest tip care se află în lumenul RE.

BiP se leagă la proteina în formare sau la lanțul polipeptidic parțial împachetat, în special la acele segmente bogate în aminoacizi hidrofobici care nu sunt expuse în mod normal la suprafața unei proteine împachetate corect. Prin legarea ei, proteina BiP previne interacțiunile nespecifice ale acestor segmente, prevenind în final împachetarea incorectă. Este o enzimă dependentă de ATP (energia este furnizată de hidroliza ATP).

Multe proteine de secreție, proteine vacuolare sau proteine membranare sunt stabilizate prin legături disulfidice formate atunci când grupările SH de la cisteine sunt oxidate cu agenți de oxidare potriviți.

Totuși, lanțurile polipeptidice conțin adesea mai mult de două cisteine, și de aceea punțile disulfidice care se formează nu sunt întotdeauna cele corecte. Ruperea și reformarea legăturilor disulfidice astfel încât să se realizeze împachetarea corectă sunt catalizate de o enzimă denumită protein-disulfid-izomeraza (PDI), o enzimă prezentă în lumenul reticulului endoplasmatic.

Multe proteine nu sunt alcătuite dintr-un singur lanț polipeptidic ci sunt oligomeri cu două, trei, patru sau mai multe subunități care iau naștere în lumenul RE.

De exemplu proteinele de rezervă (vicilin și faseolin) acumulate în vacuolele de stocare sunt trimeri cu dimensiuni de 45 kDa, formați în lumenul RE. Dacă nu are loc formarea trimerilor subunitățile sunt degradate de către proteaze.

Deci mecanismele de control ale calității acționează pentru a reține proteinele în RE în timpul împachetării și asamblării și să degradeze polipeptidele defective structural care nu se pot matura corespunzător.

O parte din proteinele greșit împachetate sunt degradate chiar în lumenul RE, altele sunt translocate în citozol unde sunt degradate în proteazomi. Nu se cunoaște încă mecanismul care sortează aceste proteine și care determină locul de desfășurare a degradării.

3.4.3.2. GLICOZILAREA PROTEINELOR ÎN RETICULUL ENDOPLASMATIC

Adiția covalentă a zaharidelor la proteine este una dintre funcțiile majore ale RE. Majoritatea proteinelor din lumenul RE sunt glicozilate înainte de a fi transportate la complexul Golgi.

Reacțiile de glicozilare sunt importante pentru că produc markeri, care asigură transportul proteinelor prin diferite compartimente celulare, iar radicalii oligozaharidici asigură sortarea proteinelor și direcționarea lor corectă către alte organite celulare.

Glicozilarea N-linkată are caracteristici comune pentru toate proteinele, implicând participarea a aproximativ 50 de enzime, din trei compartimente subcelulare. Glicozilarea impune parcurgerea a patru etape importante și anume:

Sinteza lipidei purtătoare dolicol pirofosfat (dolicol -PP)

Asamblarea intermediarului oligozaharid – lipidă dolicol-PP-oligozaharid

Transferul oligozaharidului de la dolicol la enzima țintă (Fig. 3.29).

Enzima glicozil transferaza transferă gruparea oligozaharidică ancorată pe dolicol pirofosfat la un rest de asparagină prezent în protina țintă. Această reacție are loc pe fața lumenală a membranei reticulului endoplasmatic și necesită prezența secvenței de recunoaștere Asn-X-Ser/Thr. Un rest de asparagină, care nu este urmat de serină sau treonină, fiind separate de orice alt aminoacid nu va fi recunoscut de transferază.

Modificarea oligozaharidelor în lumenul reticulului endoplasmatic și în complexul Golgi

Deci, oligozaharidul precursor este legat la membrana RE prin intermediul unei molecule lipidice speciale denumite dolicol pirofosfat. Oligozaharidul este sintetizat pe acest lipid, treaptă cu treaptă după care este transferat in bloc pe asparagina unei molecule proteice.

Fig. 3.29 Mecanismul reacției de glicozilare a proteinelor în reticulul endoplasmatic

După ce prima etapă a glicozilării proteinelor a fost realizată în RE, glicoproteinele rezultate sunt împachetate în vezicule și sunt transportate prin intermediul acestora la nivelul aparatului Golgi, unde procesul este continuat și în cele din urmă finalizat.

În final, proteinele care au fost eliberate în lumenul RE, prelucrate și asamblate corect pot să se deplaseze spre alte destinații, în funcție de domeniul lor de localizare. Dacă nu au un alt domeniu de localizare ele sunt secretate în afara celulei.

Există totuși unele proteine cum ar fi BiP și protein disulfid-izomeraza care rămân în RE. Ele sunt reținute în acest compartiment prin două mecanisme și anume: datorită afinității pe care o au una față de cealaltă se leagă între ele și totodată au posibilitatea de a lega ionii de Ca2+ care se găsesc în concentratie mare in RE (datorită unor domenii cu afinitate ridicată față de Ca2+) dând astfel naștere la o rețea care nu permite eliminarea lor prin vezicule.

3.4.4. TRANSPORTUL ȘI PRELUCRAREA PROTEINELOR ÎN COMPLEXUL GOLGI

În complexul Golgi, organitul membranar cu rol în prelucrarea finală a proteinelor sunt supuse modificărilor proteinele de secreție, proteinele lizozomale și cele membranare.

3.4.4.1. PRELUCRAREA ÎN COMPLEXUL GOLGI A PROTEINELOR DE SECREȚIE

În sacii complexului Golgi are loc concentrarea produșilor de secreție sintetizați în reticulul endoplasmatic și totodată prelucrarea biochimică a acestora, care constă în glicozilarea terminală, scindarea lanțurilor polipeptidice precum și alte modificări cum ar fi sulfatarea urmată de sortare și livrare spre diferite destinații.

GLICOZILAREA

În reticulul endoplasmatic proteinele sunt glicozilate de către un singur tip de oligozaharid, în special manoza. În complexul Golgi, proteinele sunt supuse unor modificări mai complexe, formându-se două clase de oligozaharide: complexul oligozaharidic, format din N-acetilglucozamină, acid N-acetil-neuroaminic, galactoză și oligozaharide formate numai din molecule de manoză.

În realizarea glicozilării sunt implicate glicoziltransferazele și glicozidazele care sunt proteine integrale cu zona activă orientată spre interiorul sacilor membranoși. Cele mai importante enzime de acest tip sunt glicozil-transferazele și anume sial-transferaza, galactozil-transferaza și manozidazele, care îndepărtează manoza pentru adăugarea N-acetilglucozaminei.

O categorie specială de proteine, care sunt glicozilate în aparatul Golgi este reprezentată de proteogicani, la care lanțul glucidic rezultă printr-o polimerizare extensivă. Dintre proteoglicanii secretați o parte intră în componența matrix-ului extracelular, iar restul rămîn ancorate în membrana plasmatică

B. CLIVAJUL PROTEOLITIC SPECIFIC

Numeroși hormoni peptidici, enzime, sunt sintetizați în formă inactivă, sub formă de precursori. Produsul activ apare numai după proteoliza moleculei precursor, proces care începe în reticulul Golgi trans.

Se pune întrebarea de ce în unele cazuri sunt sintetizați precursori ai proteinelor. Uneori, proteinele sunt foarte mici și sinteza lor pe ribozomi nu ar fi eficientă, iar împachetarea în vezicule de secreție ar eșua. Alte proteine, cum ar fi hormonii sunt sintetizate sub această formă în reticulul endoplasmatic pentru a nu acționa asupra celulei în care sunt sintetizați. Sunt apoi modificate în complexul Golgi, după care, în forma lor activă sunt exportate sb forma unor vezicule spre celulele țintă.

C. SORTAREA PRODUȘILOR DE SECREȚIE

În compartimentele complexului Golgi are loc separarea proteinelor de secreție de enzimele lizozomale și de alte tipuri de proteine, după care sunt ambalate în membrane compatibile pentru a fuziona cu plasmalema și exportate în exteriorul celulei. Acestea pot să urmeze două căi:

Calea secretorie reglată este o cale urmată de proteinele care necesită un stimul sau un mecanism de declanșare pentru a fi secretat. Unii stimuli reglează sinteza proteinei și de asemenea eliminarea ei din celulă.

Calea secretorie constitutivă permite secretarea proteinelor care sunt necesare în afara celulei, cum ar fi matrix-ul extracelular. Ele nu necesită stimuli, deși procesul poate fi stimulat de către factorii de creștere.

3.4.4.2. PRELUCRAREA ÎN COMPLEXUL GOLGI A PROTEINELOR LIZOZOMALE

În compartimentele complexului Golgi are loc prima dată segregarea enzimelor lizozomale de ceilați produși de secreție. Enzimele lizozomale au grupări gluidice terminale – manoza-6-fosfat care funcționează ca marker. Acest compus este recunoscut de un receptor specific din membrana reticulului endoplasmatic și a complexului Golgi, determinând separarea enzimelor lizozomale în zona trans, de unde se desprind vezicule, care formează apoi liozomii primari.

3.4.4.3. PRELUCRAREA ÎN COMPLEXUL GOLGI PROTEINELOR MEMBRANARE

Proteinele integrale de membrană, sintetizate în reticulul endoplasmatic rugos sosesc pe calea veziculelor la complexul Golgi unde sunt maturate și eliberate sub forma unor vezicule care furnizează membranelor atât proteine cât și lipide.

Totodată complexul Golgi este implicat în reciclarea membranelor, ca un proces de reutilizare a componentelor plasmalemei. Pe parcursul procesului de exocitoză plasmalema își mărește permanent suprafața, datorită veziculelor cu care fuzionează. Pentru a contracara acest fenomen, din plasmalemă se desprind vezicule care se întorc la complexul Golgi unde are loc reciclarea componentelor membranare. Deci, la complexul Golgi sosesc vezicule care pot să conțină și proteine de membrană, enzime, receptori ce pot fi modificate, separate și refolosite.

Modificările suferite de diferitele tipuri de proteine au loc în compartimente specifice ale complexului Golgi, fiind precedate de procesele desfășurate în nucleu sau reticulul endoplasmatic (Fig. 3.30).

Fig. 3.30 Reacțiile la care sunt supuse proteinele sau lipidele în reticulul

endoplasmatic și complexul Golgi

Compartimentul cis al complexului Golgi primește moleculele de la reticulul endoplasmatic și apoi le transmite compartimentului median, având o participare redusă la procesul de modificare a proteinelor. Se îndepărtează parțial manoza și se fosforilează oligoglucidele conținute de proteinele lizozomale.

Compartimentul median are ca funcție primară glicozilarea, prin adăugarea N-acetilglucozaminei la moleculele proteice și lipidice.

În compartimentul trans și reticulul Golgi trans se adaugă acid sialic la oligozaharide. El reprezintă sediul sortării finale și a exportării moleculelor cu destinații bine orientate.

Transportul moleculelor prin complexul Golgi este direcțional, cisternele complexului fiind asociate cu un număr mare de vezicule de dimensiuni reduse. Aceste vezicule transportă proteinele și lipidele de la reticulul endoplasmatic, care intră prin compartimentul cis în aparatul Golgi și avansează în toate compartimentele până sunt eliminate prin rețeaua Golgi trans. Aceste vezicule sunt acoperite de o proteină de învelire („coating protein”) care se consideră că ar juca un rol de semnal în direcționarea transportului. Ele reglează tipul de molecule care sunt împachetate într-un anumit tip de vezicule, controlează procesul de asamblare a veziculelor indicând atât membrana țintă cât și sistemul care permite veziculelor să fuzioneze cu ținta.

3.4.5. DEGRADAREA PROTEINELOR

Nivelurile proteinelor în celule sunt determinate nu numai de ratele de sinteză, dar și de ratele de degradare. Proteinele care nu mai sunt utile la un moment dat în celulă sau proteinele sintetizate greșit trebuie să fie eliminate din celule. Dacă nu sunt îndepărtate, aceste proteine otrăvesc celula, prin formarea unor agregate cu dimensiuni mari, insolubile. Alte proteine sunt degradate ca răspuns la semnale specifice, furnizând un alt mecanism pentru reglarea activității enzimatice.

Proteinele anormale apar în celule ca rezultat al mutațiilor, erorilor apărute în sinteza sau împachetarea proteinelor, denaturării spontane, bolilor, stresului sau degradării oxidative.

Degradarea proteinelor are ca scop atât reglarea activității proteice prin eliminarea moleculelor care nu mai sunt utile în celulă cât și reciclarea aminoacizilor.

Degradarea proteinelor în celule are loc prin câteva căi proteolitice, specifice fiecărui compartiment celular.

Astfel, sisteme distincte sunt prezente în vacuole, citozol, nucleu, cloroplaste mitocondrii și lizozomi. Mecanismul după care are loc proteoliza reflectă originea evolutivă a organitului respectiv (mecanismul proteolitic observat în cloroplaste și mitocondrii este mai apropiat de sistemele bacteriene decât de cele localizate în citozol).

3.4.5.1 DEGRADAREA PROTEOLITICĂ CITOZOLICĂ

În fiecare celulă, numărul și diversitatea proteinelor este extrem de mare, astfel că este necesară existența unor mecanisme precise atât pentru acțiunea proteazelor cât și pentru marcarea proteinelor care urmează să fie degradate. Fără o astfel de reglare enzimele proteolitice ar degrada proteinele celulare fără discriminare.

Proteinele care nu mai sunt utile în celulă sau cele care au fost sintetizate sau împachetate greșit, posedă sisteme de recunoaștere specifică :

Proteinele citozolice destinate a avea o viață scurtă sunt marcate la capătul aminoterminal prin apariția unor secvențe scurte de aminoacizi, care par să funcționeze ca semnal proteolitic.

În alte cazuri căile proteolitice sunt activate de condițiile de mediu – temperatura ridicată, expunerea la metale grele sau infecția cu patogeni.

Alteori, proteinele aberante sau împachetate incorect implică probabil o creștere semnificativă a numărului de reziduuri hidrofobice prezente pe suprafața proteinei. De obicei, secvențele hidrofobe sunt îngropate în interiorul proteinei, pentru a preveni interacțiunea lor cu mediul apos.

Atunci când o proteină a fost sintetizată sau împachetată incorect, lanțurile hidrofobe sunt expuse spre exterior. Aceste zone hidrofobe furnizează situsuri de legare pentru proteinele care reglează activitatea diverselor enzime proteolitice.

Calea cea mai importantă a degradării proteolitice selective în celulele eucariote utilizează ubiquitina ca marker pentru proteinele citozolice, care devin ținte pentru o proteoliză rapidă.

Ubiquitina este un polipeptid mic, alcătuit din 76 de aminoacizi, înalt conservați în archebacterii și eucariote. Ea se atașează la gruparea amino laterală a unui rest de lisină și în acest fel marchează proteina respectivă.

Apoi ubiquitine adiționale sunt adăugate pentru a forma un lanț poliubiquitinic. Asemenea proteine poliubiquitinice sunt recunoscute și degradate de un complex proteazic de dimensiuni mari, numit proteazom (M=1,5 MDa). Ubiquitina este eliberată în procesul degradării proteice, astfel încât ea poate fi utilizată într-un alt ciclu.

Se cunoaște că procesul de proteoliză în celulele eucariote necesită energie furnizată prin hidroliza ATP. Deoarece hidroliza legăturilor peptidice este favorizată din punct de vedere energetic, se consideră că ATP este necesar pentru reglarea activității proteolitice și anume are rol în recunoașterea și marcarea proteinelor care urmează să fie degradate.

Mecanismele de acțiune a proteazelor sunt complexe, iar sistemele de reglare dificil de caracterizat.

Procesul de degradare a proteinelor se desfășoară în mai multe etape, după cum urmează (Fig. 3.31).

Fig. 3.31 Procesul de marcare a proteinelor cu ubiquitine în vederea degradării

În prima etapă ubiquitina este activată prin atașarea la enzima E1- Gruparea carboxil terminală a ubiquitinei se leagă covalent la o grupare SH a enzimei E1 (1).

Ubiquitina este transferată la un reziduu cisteinic al enzimei E2 (2).

Proteina țintă, care poartă semnalul de degradare este recunoscută de enzima E3, cu care se leagă într-un complex necovalent (3).

Sistemul E3-proteină țintă se leagă la enzima E2, formând un complex (4)

Ubiquitina este transferată de la E2 la proteina țintă prin intermediul unei grupări NH2 de pe un rest de lisină al proteinei țintă (5)

Transferul ubiquitinei este repetat astfel încât se formează un lanț poliubiquitinic. Fiecare grupare carboxil de la capătul C al fiecărei ubiquitine, atașată suplimentar este legată la un reziduu lizinic al ubiquitinei precedente.În general, o serie de 4 ubiquitine trebuie să fie atașate la proteina țintă înainte ca aceasta să se deplaseze spre proteasom (6)

Enzimele E2 și E3 se disociază (7)

Complexul proteină-lanț poliubiquitinic este transportat la un proteasom pentru degradare. Ubiquitina este eliminată de pe proteina țintă, astfel că poate fi reutilizată (8).

Proteasomul este o structură proteică complexă (26 S) alcătuit din trei subunități: un miez (20 S) cu care sunt asociate două subunități reglatoare (19S) (Fig. 3.32).

Miezul este alcătuit din 4 inele suprapuse, fiecare inel conținând șapte subunități. Inelele formează la interior un canal, care conține situsurile active pentru proteoliză. Amplasarea centrilor catalitici în canal protejează proteinele nemarcate împotriva degradării. Subunitățile reglatoare funcționează ca o cale de intrare în proteasom, dirijând pătrunderea proteinei marcate în canal.

Proteinele marcate cu ubiquitină, pătrund în canalul proteazomului, unde sunt amplasați centri catalitici, fiind degradate. După finalizarea procesului de degradare, proteazomul se disociază, iar aminoacizii și ubiquitinele sunt eliberate în citoplasmă.

Ubiquitinele se întorc în alte procese de marcare, iar aminoacizii vor sta la baza sintezei altor lanțuri polipeptidice.

Fig. 3.32 Structura și modul de funcționare a proteazomului

3.4.5.2. DEGRADAREA PROTEOLITICĂ ÎN LIZOZOMI

Lizozomii intervin în metabolismul celular prin digestia proteinelor extracelulare preluate prin endocitoză, precum și datorită înlocuirii permanente a organitelor citoplasmatice și a proteinelor citozolice.

Astfel, în lizozomi pot fi degradate moleculele pătrunse în celulă din exterior – heterofagie, sau molecule sau chiar organite citoplasmatice care nu mai sunt utile în celule – autofagia.

Moleculele sau componentele care urmează a fi degradate sunt înconjurate de membrane provenite de la reticulul endoplasmatic pentru a forma vezicule. Aceste vezicule fuzionează cu lizozomii, iar enzimele lizozomale digeră conținutul veziculelor. În interiorul lizozomilor sunt prezente aproximativ 50 de enzime, care sunt active numai la pH-ul acid din acest compartiment.

În unele situații speciale, când celula este lipsită de hrană, lizozomii preiau și degradează în mod selectiv anumite proteine citozolice. Sunt degradate în special proteine care conțin secvența Lys-Glu-Arg-Gln, care se pare că le orientează către lizozomi. În procesul de degradare este implicată și chaperona Hsp 70, care menține lanțurile polipeptidice nepliate în timpul transportului lor prin membrana lizozomală.

Pe această cale sunt degradate proteine de care celula se poate lipsi și astfel se furnizează aminoacizi și energie, care permit derularea proceselor metabolice fundamentale.

3.4.5.3. DEGRADAREA PROTEOLITICĂ ÎN VACUOLE

Vacuolele sunt bogate în enzime hidrolitice și îndeplinesc mai multe funcții în celule. Una dintre funcțiile de bază constă în degradarea proteinelor, funcție similară cu cea a lizozomilor din celulele animale. Unii cercetători sugerează că în timpul lipsei nutrienților plantele transportă o serie de proteine citozolice în vacuole, unde sunt degradate pentru a genera aminoacizii necesari sintezei altor proteine.

3.4.5.4. DEGRADAREA PROTEOLITICĂ ÎN ALTE ORGANITE CELULARE

Proteoliza este prezentă în cloroplaste, deoarece acestea conțin aproximativ 50% din proteinele prezente în aparatul foliar. Una dintre proteazele identificate în cloroplaste prezintă omologie cu o enzimă de același tip, izolată din E. coli. Activitatea acestei enzime este importantă pentru prevenirea acumulării proteinelor anormale în timpul senescenței țesuturilor foliare.

Alte organite din celulele vegetale, inclusiv mitocondriile, peroxizomii și reticulul endoplasmatic posedă de asemenea sisteme pentru degradarea proteinelor. Aceste sisteme proteolitice nu au fost caracterizate până în prezent.