Separarea directă a unor compuși enzimatici [301427]

SEPARAREA DIRECTĂ A UNOR

COMPUȘI ENZIMATICI

Proiect de cercetare

Coordonator științific: Prof. Dr. Ing. Dan Cașcaval

Candidat: [anonimizat]. Bioing. Ionela Ungureanu

CUPRINS

1. Denumirea, încadrarea și relevanța temei în domeniul științific abordat 2

2. Stadiul actual al cercetărilor în domeniul abordat 4

2.1. Importanța enzimelor în procesele de biosinteză 10

2.2. Tehnici de separare directă a unor produși obținuți prin transformare enzimatică 26

2.3. [anonimizat] 29

2.4. Aplicații ale extracției reactive și pertracției pentru separarea directă a unor compuși obținuți prin transformare enzimatică

3. Prezentarea temei de cercetare 33

3.1. Obiectivele cercetărilor 33

3.2. Rezultate potențiale 34

4. Realizarea experimentală a temei de cercetare 35

4.1. Planul experimental 35

4.2. Tehnica experimentală 37

4.3. Materiale, reactivi 40

4.4. Metode experimentale 43

5. Contribuții potențiale la dezvoltarea domeniului abordat 44

BIBLIOGRAFIE 46

1. Denumirea, [anonimizat] A [anonimizat].

Deoarece nu pot fi trecute în revistă toate procesele enzimatice care au fost studiate în prezența biocatalizatorilor (este suficient să se aibă în vedere doar faptul că enzimele sunt clasificate după tipul de reacții catalizate și că fiecare tip include o extrem de largă varietate de reacții mai mult sau mai puțin particulare), [anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat]:

poate cataliza transformarea chimică și a [anonimizat], [anonimizat], cel mult dioxid de carbon

nu formează deșeuri nocive

deseori utilizează chiar deșeuri organice ca materii prime

pot utiliza materii prime regenerabile.

Desigur, [anonimizat] a se depăși. [anonimizat]:

[anonimizat], [anonimizat], astfel încât să se obțină conversia de 100% la produsul dorit.

Dacă se ține cont atât de avantajele, cât și dezavantajele biosintezei, apare evidentă motivația faptului că până în prezent enzimele sunt folosite ca biocatalizatori în sintezele organice în special pentru producția de chimicale fine (medicamente, insecticide, etc.) și mai puțin pentru produse de mare tonaj ale industriei chimice.

Separarea directă a compușilor elaborați în timpul proceselor de biosintenză sau rezultați în urma unor transformări enzimatice constituie un domeniu pentru care interesul acordat a crescut foarte mult în ultimul timp.

Ultimii ani au oferit exemple de aplicații reușite privind proiectarea unui proces de bioconversie extractivă în care condițiile de recuperare ale produsului sunt integrate direct în etapa de biosinteză. Motivația principală a acestei alegeri în cuplarea separării cu biosinteza nu a fost numai eliminarea unei etape din fluxul tehnologic, ci mai ales creșterea productivității fermentației. Aceste îmbunătățiri se pot obține cel mai des prin îndepărtarea selectivă a produsului din lichidele de fermentație simultan cu producerea lui. Procesele de biosinteză care pot fi îmbunătățite prin această abordare includ procesele care generează:

– produse toxice sau inhibitorii;

– produse labile chimic;

– procese în care substratul trebuie alimentat într-o manieră controlată în mediul de cultură.

Deoarece numeroase procese de biosinteză sunt inhibate de acumularea produsului, efect caracteristic în special procedeelor discontinue, la care concentrația finală a produsului atinge valori ridicate, productivitatea biosintezei scade. Separarea directă, prin îndepărtarea compusului în timp ce se formează poate reprezenta o alternativă eficientă pentru creșterea productivității acestor procese. Metodele convenționale de recuperare a produselor de biosinteză au fost completate de: extracție reactivă, cromatografie de afinitate, electrodializă, pertracție, etc.

Pentru separarea directă a produsului biosintetizat există două variante principale:

– separare ex-situ, procedeu caracterizat prin utilizarea unui utilaj distinct de separare, lichidul de fermentație fiind apoi reintrodus în fermentator;

– separare in-situ, procedeu caracterizat prin separarea produsului util chiar în interiorul bioreactorului.

În figura 1 sunt redate cele două procedee de separare directă:

Figura 1. Procedee de separare directă a produselor de biosinteză

A – separare in-situ; B – separare ex-situ.

Procesele de biosinteză sunt, în general caracterizate de o productivitate mai mică în comparație cu reacțiile de sinteză chimică. Cel mai important dezavantaj al biocatalizatorilor aplicați pentru sinteza sau transformarea unor substanțe organice este relaționat cu necesitatea utilizării unor substrate sau medii de cultură diluate. Solubilitatea mică a multor substanțe organice în soluții apoase sau efectele inhibitorii ale acestora asupra biocatalizatorilor sau microorganismelor producătoare reprezintă numai câțiva factori restrictivi. Productivitatea unor procese de biosinteză poate fi crescută dacă transformarea are loc la valori ale concentrației substratului sau produsului la care microorganismele sau enzimele să prezinte activitate maximă. Acest fapt poate fi realizat prin adăugarea continuă a substratului sau prin îndepărtarea in-situ a produsului. [1]

2. Stadiul actual al cercetărilor științifice în domeniul abordat

2.1. Importanța enzimelor în procesele de biosinteză

Specificitatea activității enzimelor

Specificitatea catalizei enzimatice indică faptul că enzimele catalizează reacția unui număr restrâns de compuși (substrate). Astfel, enzimele sunt grupate în clase conform cu reacția pe care o catalizează (de exemplu oxidare, hidroliză etc.), întrucât aceasta este o proprietate caracteristică ce distinge o enzimă de o alta, apoi aceste clase sunt divizate în subclase pe baza tipului de reacție catalizată (de exemplu oxidarea grupărilor –CH2-OH, -CHO etc.).

Specificitatea proceselor enzimatice este, de asemenea, o consecință directă a structurilor centrelor active și ale substratelor. Complementaritățile structurale sau de formă, precum și cele electrice, sunt desigur factori importanți în recunoașterea substratului de către enzimă.

Enzimele prezintă diverse tipuri de specificitate incluzând: specificitatea de reacție, specificitatea de substrat, relativă de grup, absolută de grup, față de un izomer geometric, stereospecificitate etc. Aceste forme de specificitate pot fi cuprinse în două grupe generale: specificitatea de reacție și specificitatea de substrat.

Clasificarea enzimelor

S-a impus necesitatea unei sistematizări în funcție de natura transformării catalizate și de unele detalii privind reacția catalizată, grupările chimice asupra cărora se acționează, cofactorii implicați în reacția respectivă etc. și astfel enzimele au fost clasificate în șase clase (oxidoreductaze, transferaze, hidrolaze, liaze, izomeraze și ligaze), iar fiecare clasă a fost divizată în diverse subclase de rang diferit.

Activitatea catalitică a enzimelor

Activitatea catalitică superioară a enzimelor este legată de modul lor particular de a interveni în transformarea chimică prin reducerea energiei de activare ca urmare a stabilizării stării de tranziție. Acest lucru se realizează deoarece forma centrului activ al enzimei este special „proiectată” pentru a lega și stabiliza starea de tranziție. Astfel, starea de tranziție, un intermediar efemer, se leagă mai ușor la enzimă decât substratul sau produsul.

Sistemele catalitice enzimatice prezintă anumite particularități care le diferențiază de sistemele catalitice nebiologice. Datorită organizării la nivelul diverselor structuri, enzimele adoptă o anumită conformație în spațiu, astfel încât transformările catalitice au loc pe suprafața lor într-o manieră relativ asemănătoare catalizatorilor eterogeni. Cu alte cuvinte, activitatea catalitică a enzimelor este realizată de o regiune directă a structurii tridimensionale a acestora, denumită centru (situs) catalitic activ, sau simplu centru activ, ca și la catalizatorii eterogeni obișnuiți. În același timp, ținând cont de faptul că reacțiile enzimatice se desfășoară în mediu apos, se pot asocia caracteristici apropiate de cataliza omogenă. Pe de altă parte, prin proprietățile lor specifice, cum sunt: capacitate catalitică deosebit de ridicată, specificitate particulară pentru anumite substanțe sau reacții, termolabilitate și altele, enzimele se deosebesc fundamental de catalizatorii omogeni și eterogeni convenționali.

Mecanismul reacțiilor enzimatice

La nivelul centrului activ, enzimele catalizează un număr impresionant de transformări chimice specifice. Totuși, această varietate de reactivități poate fi cuprinsă în șase categorii generale de reacții de rupere de legături, formare de legături și transfer de grupe, care de altfel stau la baza clasificării enzimelor. Desigur că și mecanismele prin care funcționează aceste enzime sunt variate, dar există elemente comune care derivă din reactivitățile catenelor laterale ale resturilor de aminoacizi și ale cofactorilor, adică țin cont de funcțiunile pe care acestea le conțin (grupări carboxilice aminice, hidroxilice, cationi metalici, etc.) Dacă se mai are în vedere faptul că transformările chimice naturale se desfășoară în mediu apos, atunci se poate admite că în general enzimele utlizează cataliza acido-bazică, cataliza electrofilă și cataliza nucleofilă pentru a activa nenumărate reacții.

Influența mediului asupra activității enzimatice

În general, procesele catalizate de enzime, depind de condițiile de mediu. În cazul biocatalizatorilor, dată fiind natura particulară a moleculei și structurii lor, cunoașterea influenței factorilor de mediu este deosebit de importantă. Cunoașterea modului în care o reacție specifică enzimatică este afectată de modul ei înconjurător, dacă factorii de mediu sunt impuși sau dacă ei pot fi manipulați, sunt aspecte esențiale pentru optimizarea sau controlul oricărui proces mediat de enzime. Activitatea biocatalizatorilor este afectată atât de condițiile din stricta vecinătate cât și cele de la mare distanță sau de condițiile la nivel microscopic (micro-mediu de reacție) ori la nivel macroscopic (macro-mediul de reacție).

Factorii de mediu dominanți carea afectează activitatea reacțiilor enzimatice sunt: pH-ul, activitatea apei, tăria ionică a mediului, temperatura, presiunea și prezența inhibitorilor.

Surse de enzime

Încă de la început trebuie subliniat faptul că, indiferent de tipul de sursă, separarea unui compus enzimatic reprezintă o problemă dificilă, iar recuperarea acestuia înseamnă prelucrarea unor cantități mari de sursă. În general, izolarea a 1g enzimă din celule implică prelucrarea a:

– 100 kg materie primă vegetală

– 10 kg țesut animal sau 1 kg biomasă microbiană (rezultând din aproximativ 20 L de volum fermentator).

Aceste date relevă încă un aspect deosebit legat de obținerea preparatelor enzimatice și anume că producția produșilor enzimatici este generatoare de mari volume de reziduuri. Totuși, succesele realizate în ingineria genetică a permis ca în cazul microorganismelor recombinante să se reducă considerabil volumul de reziduuri. Datorită productivității și specificității acestor microorganisme, în unele cazuri s-a ajung ca pentru producerea a 1g enzimă să fie necesare doar 50 g celule.

Prin urmare, pentru obținerea compușilor enzimatici se folosesc sursele care sunt foarte bogate în enzimele dorite, sunt ieftine, ușor accesibile și care se prelucrează ușor.

Pentru obținerea enzimelor utilizate în aplicațiile biocatalitice industriale sunt preferate microorganismele, care prezintă mai multe avantaje față de sursele de enzime de origine animală și vegetală:

– se pot obține cu ușurință în cantități mari prin înmulțire în instalații speciale, pe medii de culturi ieftine (multe medii sunt formate din subproduse ale industriei alimentare)

– ciclul de dezvoltare a microorganismelor este foarte scurt în raport cu ciclul de dezvoltare a animalelor și plantelor

– producția de enzime poate fi mult mărită prin condițiile exterioare de mediu și prin obținerea unor mutanți înalt productivi

– conținutul de enzime este mai controlabil

– plantele și animalele conțin mai multe materiale nocive sau nedorite, cum sunt compușii fenolici (din plante), inhibitori enzimatici endogeni, proteaze, etc.

Așadar, se poate spune că sursa majoră de enzime o constituie microorganismele, în special dacă se face referire la principalele aplicații industriale, însă nu trebuie neglijat nici rolul celorlalte surse de enzime, din materii prime vegetale și animale, care furnizează de regulă enzimele necesare unor aplicații deosebite în scopuri analitice, terapeutice, cosmetice etc.

În practică, cea mai mare parte a enzimelor microbiene vin dintr-un număr limitat de tulpini, cele mai importante fiind speciile de Aspergillus, Bacillus și Kluzveromyces. Cele mai multe sușe comerciale provin fie din cele folosite în industria alimentară, fie au fost obținute din astfel de sușe prin mutație și selecție. Obiectivele comune producătorilor de enzime industriale sunt: economicitatea, eficacitatea și siguranța. Din acest motiv, dezvoltarea de enzime comerciale este o activitate specializată, în care un număr relativ mic de compuși au experință și abilități în:

– depistarea de enzime noi și îmbunătățite

– procedee de instalații și fermentație industrială

– metode și facilități pentru purificarea enzimelor la scară largă

– formulare de enzime pentru comercializare

– legături cu utilizatori și organisme care reglementează producerea și comercializarea enzimelor.

Producția enzimelor

Înainte de a fi prezentate procesele fundamentale sau unitare aplicate în procesele de recuperare și purificare a enzimelor, se va sublinia în câteva cuvinte structura sistemelor de producție pentru obținerea preparatelor enzimatice. Din experiența acumulată până în prezent în domeniul biotehnologiilor, s-a ajuns la următoarea împărțire a producției de materiale biologice, în operații în flux ascendent (upstream operations) și operații în flux descendent (downstream operations). Partea ascendentă include fermentația și cultura de celule, producând enzima dorită într-o anumită formă de materie primă, iar partea descendentă include operații de recuperare și purificare a acestui produs.

În figura X se prezintă schema generală de flux a proceselor downstream, ilustrând etapele de recuperare și cele de purificare.

Figura X. Schema de flux a proceselor DS (flux descendent)

Integrarea operațiilor din fluxul ascendent (US) și cel descendent (DS) în proiectarea fabricației este recunoscută în teoreie, dar din păcate negligată în practică. Integrarea poate avea ca rezultat un produs cu cost scăzut și calitate mai înaltă, ceea ce îi conferă competitivitate.

Este important de notat impactul îmbunătățirilor în părțile ascendentă și descendentă ale procesului. Cea mai ingenioasă îmbunătățire a unui proces de recuperare DS va produce, în cel mai bun caz, o creștere de zece ori a randamentului, (de exemplu, de la 8 la 80%, dar niciodată 100%). În schimb, o îmbunătățire ingenioasă a procesului US prin selecția organismelor înalt productive, medii de rată înaltă de creștere și condiții de operare optime poate conduce la o creștere de mii de ori a producției.

Preparate enzimatice solubile

În prezent există un număr important de enzime disponibile comercial. Ele sunt produse pentru diverse scopuri și pot diferi substanțial ca puritate și ca preț.Sunt vândute pe bază de unități de activitate.

Stabilitatea preparatelor enzimatice, atât în timpul depozitării, cât și în utilizare, prezintă o importanță deosebită atunci când se au în vedere aplicațiile industriale ale preparatelor enzimatice. Există cel puțin două căi de a măsura stabilitatea enzimei:

a). stabilitatea la depozitare: în acest caz, mărimea caracteristică este timpul de înjumătățire a activității catalizatorului (τ1/2)

b). stabilitatea operațională sau la utilizare: în acest caz se utilizează numărul total de cicluri catalitice (TON) ca un consum specific al enzimei (grame de preparat enzimatic per kilogram de produs).

Produși enzimatici obținuți prin diferite modalități de imobilizare a enzimelor:

Imobilizarea se poate realiza printr-o serie de metode, prin utilizarea unui număr mare de suporturi sau sisteme de imobilizare, membrane de ultrafiltrare, cu ajutorul matricelor sau gelurilor, prin adsorbție fizică sau legare ionică, legare covalentă de un suport sau prin reticularea enzimei, cu sau fără legarea de un suport.

Aplicații ale biocatalizei

1. Reactoare enzimatice

Un reactor enzimatic constă dintr-un recipient sau mai multe recipiente așezate în serie, în care se realizează procesul biocatalitic în condiții determinate. Alegerea unui reactor pentru un proces particular depinde de anumiți factori:

– aspecte economice: costul substratului, al enzimei, al instalației și în final al produsului

– starea enzimei (liberă sau imobilizată)

– cinetica și termodinamica reacției

– proprietățile fizice și chimice ale suportului de imobilizare

– stabilitatea substratului, enzimei, produsului, etc.

1.1. Reactoare cu enzime în soluție

Pentru sisteme omogene, reactorul cel mai potrivit este reactorul cu amestecare perfectă, care poate fi operat atât în regim continuu, cât și discontinuu. Dacă enzima este scumpă sau trebuie să se utilizeze enzimă pură, sau trebuie evitată contaminarea produsului/mediului, se impun alte sisteme de reacție. Cel mai des folosite sunt reactoarele cu membrană (MR).

1.2. Reactoare cu enzime imobilizate

Pentru realizarea practică a proceselor biocatalitice în prezența enzimelor imobilizate se pot folosi următoarele tipuri generale (ideale) de reactoare: reactor discontinuu cu amestecare perfectă (STR), reactor continuu cu amestecare perfectă (CSTR), reactor cu strat fix (PBR) și reactor cu strat fluidizat (FBR).

2.2. Tehnici de separare directă a unor produși obținuți prin transformare enzimatică

Au fost utilizate o gamă largă de metode de intensificare a procesului, majoritatea dintre acestea bazându-se pe îndepărtarea (in-situ) a produsului dintr-un mediu de reacție care are ca rezultat o inhibare sau toxicitate redusă a produsului asupra enzimei, schimbarea echilibrului nefavorabil, evitarea (bio)transformării produsului sau reducerea numărului de etape ulterioare de prelucrare în flux descendent.[5]

Pentru separarea directă a produselor de biosinteză din lichidele de fermentație au fost propuse și utilizate următoarele tehnici:

extracția: presupune dispersia unui solvent organic în lichidele de fermentație, picăturile de solvent se separă datorită diferenței de densitate, extrăgând selectiv produsul, formând apoi un strat distinct lichidului de fermentație prin coalescență. Solventul este apoi regenerat și recirculat în fermentator. Astfel, concentrația produsului inhibitor este păstrată sub valoarea inhibitorie, fiind posibilă biosinteza continuă a acestuia.

extracția prin membrane lichide/ pertracția: membranele lichide cu aplicații în acest domeniu pot fi obținute prin emulsionare (LME) sau prin includere într-un polimer solid (SLME). În cazul LME, solventul este interpus între lichidul de fermentație , din care se face extracția și soluția de reectracție. Stabilizarea membranei se realizează cu ajutorul unor compuși tensioactivi sau prin înglobarea solventului în porii unui material polimer hidrofob.

pervaporizarea: este aplicabilă amestecurilor de lichide care conțin componenți cu volatilități diferite. Vaporii difuzează, cu viteze diferite, prin porii unei membrane semipermeabile. Membranele sunt confecționate din: polidimetilsiloxan, cauciuc siliconic, silicați, poli(1-trimetilsilil)-1-propină).

striparea cu gaze: folosește un gaz inert, în general CO2 sau azot care nu este toxic pentru microorganisme. Gazul barbotat în lichidul de fermentație antrenează vaporii produsului util volatil.

adsorbția: utilizează următorii adsorbanți: filtru textil cu cărbune activ, ester polimetacrilic, adsorbanți hidrofili. O condiție impusă de această tehnică este folosirea numai a acelor adsorbanți selectivi pentru produsul util. Metoda poate fi combinată cu striparea cu gaze, pentru a se evita adsorbția compușilor necesari desfășurării procesului de fermentație (glucoza).

prin reacții chimice: reactanții folosiți formează cu produsul util compuși ușor de separat.

dializa: este tehnica care utilizează membrane semipermeabile confecționate din: acetat de celuloză, polisulfone, cauciuc siliconic.

osmoză inversă: reprezintă separarea prin membrane semipermeabile sub acțiunea presiunii. Se aplică numai ex-situ.

distilarea prin membrane: constă în evaporarea și trecerea vaporilor printr-o membrană hidrofobă de tipul politetrafluoretilenă. Eficiența procedeului poate fi crescută prin înglobarea în porii membranei a unui solvent.

Alegerea unei metode de separare ca fiind cea mai bună este deosebit de dificilă, în special datorită diferențelor care apar între variabilele considerate de fiecare grup de cercetători: tipul, tulpina și faza de creștere a microorganismelor, sursa, tratamentele preliminare și concentrația nutrienților și a substratului, temperatura, pH-ul, concentrația oxigenului, tipul fermetatorului, nivelul amestecării. [1]

Există, deci, o varietate de tehnici pentru separarea directă a produselor de biosinteză,

fiecare dintre ele având avantaje și dezavantaje, aplicabile pentru o arie relativ largă de clase de

microorganisme.

Extracția lichid-lichid reprezintă una dintre tehnicile folosite curent la separarea industrială a compușilor obținuți prin biosinteză. Însă, metoda separării directe prin extracție ridică două probleme majore, referitoare la solventul utilizat și la echipamentul de extracție. Astfel, selectarea unui solvent compatibil cu sistemul de biosinteză respectiv trebuie să îndeplinească următoarele cerințe:

– absența toxicității pentru micoorganismele cultivate

-valoriri dicate ale coeficientului de distribuție al solutului între lichidul de fermentație și solvent

– formarea unor emulsii puțin stabile cu mediul de cultură

– regenerare ușoară.

Numeroși autori au indicat faptul că toleranța microorganismelor față de solvenții utilizați în extracția directă crește, în general, odată cu masa moleculară a acestor solvenți.A doua problemă constă în alegerea și proiectarea echipamentului de extracție adecvat, ținându-se cont de particularitățile lichidului de fermentație, cum ar fi: prezența unei faze solide (biomasă), vâscozitatea ridicată, comportarea reologică nenewtoniană, prezența unor compuși tensioactivi, etc. Prezența masei celulare, precum și vâscozitatea sau comportarea reologică reală a lichidelor de fermentație reduc gradul de extracție al produsului util, comparativ cu sistemul pur apă-solvent. Un alt dezavantaj al extracției cu solvenți îl reprezintă dificultatea controlului contactului dintre faze și a separării emulsiei formate. Contactul interfazic convențional (în extracția lichid-lichid) este creat prin amestecarea intimă a celor două faze, pentru asigurarea unei arii interfaciale cât mai ridicate, urmată de repaus, pentru separarea celor două faze, operație realizată în două etape. În acest caz, un control scăzut al valorii ariei interfaciale de contact dintre cele două faze lichide poate cauza formarea emulsiilor stabile ți separarea incompletă a fazelor.

Pentru înlăturarea dezavantajelor oferite de utilizarea extracției fizice, a fost studiată și

aplicată o nouă tehnică de extracție, denumită extracție reactivă. Extracția reactivă a fost utilizată inițial pentru separarea compușilor anorganici, însă numeroase studii s-au orientat spre

stabilirea condițiilor de separare a compușilor organici, în special a celor obținuți prin biosinteză

(acizi carboxilici, antibiotice, aminoacizi etc.), datorită avantajelor oferite comparativ cu celelalte

tehnici de separare. Extracția reactivă presupune utilizarea unor extractanți solubili fie în solvent, fie în faza apoasă, însă este esențial ca produsul format în urma reacției cu solutul să fie puternic hidrofob. Aplicarea extracției reactive în cadrul proceselor fermentative oferă avantaje comparative cu metodele convenționale, cum ar fi:

separarea selectivă a compusului dorit

obținerea unor randamente ridicate în produs util

obținerea unor produse cu purități ridicate

ușurință și simplitate în operarea procesului

reducerea costurilor.

Însă, o problemă majoră în folosirea extracției reactive pentru recuperarea compușilor din mediul de fermentație o constituie toxicitatea extractanților și a solvenților folosiți în cadrul procesului de separare. Selectarea solventului, pentru realizarea extracției reactive, trebuie să se bazeze pe două criterii esențiale, menționate anterior: toxicitate minima și capacitate de extracție maximă. Problema devine mai dificilă atunci când separarea compușilor se realizează in-situ. Solvenții pot fi toxici la nivel celular, din cauza hidrofobicității solventului organic care determină inhibarea activității enzimatice sau modificarea permeabilității membranei celulare, precum și la nivel de contactare a fazelor (faza organică și celulele microbiene), conducând la blocarea difuziei nutrienților din mediu către celule, prin formarea peliculei de solvent, și la distrugerea peretelui celular, datorită creșterii tensiunii interfaciale. Pentru evitarea contactului dintre solvent și biomasă, acolo unde este posibil, se pot utiliza următoarele metode:

separarea prin extracție prin membrane lichide incluse pe suporturi solide poroase;

extracția din medii de cultură care conțin celule imobilizate;

separarea prealabilă a biomasei prin filtrare sau ultrafiltrare.

Dintre procedeele menționate, interesul pentru procesele care folosesc membrane lichide în recuperarea produselor de fermentație a crescut într-un mod rapid, deoarece o parte substanțială din succesul tehnologic și financiar al bioproceselor depinde de operațiile post-fermentative. O importantă reducere a costurilor a putut fi obținută prin integrarea a două etape din procesul de separare, extracția și reextracția, într-o singură etapă prin utilizarea membranelor lichide. Astfel, o dezvoltare a procesului de extracție reactivă o constituie pertracția, respectiv extracția și transportul prin membrane lichide, care poate fi considerată una dintre tehnicile aplicabile pentru separarea produselor naturale. Tehnica pertracției constă în transferul solutului între două faze apoase (faza inițială sau de extracție și faza finală sau de reextracție), între care există o diferență de proprietate (pH, concentrație, tărie ionică), prin intermediul unui strat de solvent organic interpus între soluțiile apoase.

Eficiența extracției și selectivitatea separării pot fi îmbunătățite semnificativ prin adăugarea în membrana lichidă a unui agent purtător, cum ar fi compuși organofosforici, amine alifatice cu catenă lungă sau eteri coroană, procesul de separare fiind denumit, în acest caz, pertracție facilitată.

Adăugarea în membrana lichidă a agenților purtători induce accelerarea transportului solutului dinspre faza apoasă inițială către faza apoasă finală, în paralel cu creșterea gradului de extracție. Agentul purtător reacționează reversibil cu solutul la interfața de separare dintre faza apoasă inițială și membrana lichidă, iar complexul format este transportat către faza apoasă finală. La interfața de separare dintre faza apoasă finală și membrana lichidă, solutul reacționează cu un compus prezent în faza apoasă finală, iar agentul purtător este eliberat sauregenerat și rămâne în solvent, devenind capabil sa reia ciclul.

Membranele lichide pot fi obținute prin emulsionare (emulsion liquid membrane – figura 3), însă stabilitatea acestora este scăzută, prin înglobarea solventului în porii unui material polimer hidrofob sau în interiorul unui material fibros (supported liquid membranes – figurile 4 și 5), sau prin utilizarea unor echipamente de extracție de construcție specială, denumite pertractoare, care permit obținerea și menținerea celor trei faze fără adăugarea de agenți tensioactivi (bulk liquid membrane – figura 6). Din categoria membranelor lichide incluse pe suport solid fac parte și modulele membranare spiralate (spiral wound – figura 5.A.) și cele cu fibre goale (hollow fibre – figura 5.B.). Aceste module oferă o arie interfacială controlabilă ridicată și necesită folosirea unor cantități scăzute de solvent.

Figura 2. Membrană lichidă emulsionată (emulsion liquid membrane – ELM).

Figura 3. Membrană lichidă obținută pe suport solid (supported liquid membranes – SLM).

Figura 4. Module membranare spiralate (A) și cu fibre goale (B): F – faza apoasă inițială;R – faza apoasă finală.

Figura 5. Membrană lichidă liberă (Bulk liquid membrane – BLM).

În comparație cu extracția lichid-lichid fizică și reactivă, utilizarea membranelor lichide

prezintă o serie de avantaje:

folosirea unor cantități reduse de solvenți, aceștia fiind continuu regenerați

reducerea timpului total necesar separării unui anumit produs, prin reunirea extracției cu reextracția

posibilitatea transportului unui solut împotriva gradientului său de concentrație, dacă se menține diferența de gradient a proprietății care controlează procesul

obținerea unor fluxuri masice mai mari comparativ cu membranele polimerice sau anorganice, datorită valorilor coeficienților de difuzie în lichide, cu un ordin de mărime superior

selectivități înalte, datorate utilizării unui domeniu extins de interacțiuni specifice în membrană prin folosirea unor extractanți selectivi

consum de energie redus

instalații compacte

costuri de investiții scăzute.

Agenții de extracție (extractanți, agenți purtători) utilizați pentru realizarea separării directe a produselor de biosinteză fac parte din următoarele clase: amine cu masă moleculară ridicată și săruri ale acestora, derivați organofosforici, compuși macrociclici, lichide ionice etc. Agenții de extracție din categoria derivaților aminici sunt clasificați astfel: amine primare (n-octilamina, trialchilmetilamina etc.), secundare (lauril-trialchilmetilamina, di-tridecilaminaetc.), terțiare (tri-n-hexilamina, tri-n-octilamina, tri-n-decilamina etc.), amine aromatice și săruri de amoniu (clorură de metil-tri-n-octilamoniu). Acești extractanți sunt utilizați la separarea metalelor, acizilor minerali, acizilor carboxilici, aminoacizilor, antibioticelor, constituind în numeroase cazuri alternative eficiente ale tehnicilor de separare folosite curent la nivel industrial. [4]

2.3. Mecanismele generale ale extracției, extracției reactive și pertracției

2.3.1. Extracția

Extracția lichid-lichid este utilizată pentru a separa constituenții din soluții lichide omogene. Implică adăugarea unui solvent lichid care este nemiscibil sau parțial miscibil cu lichidele de fermentație și distribuția componenților prin amestecarea celor două faze. Extracția lichid-lichid are, în particular, câteva avantaje în comparație cu alte procedee in-situ și este unul dintre cele mai studiate procese de separare pentru creșterea productivității într-un proces de fermentație.

În acest caz, fermentatorul este continuu alimentat cu substrat care este consumat de microorganisme. În timpul fermentației, un solvent organic este dispersat în lichidul de fermentație. Picăturile de solvent se ridică la suprafață, formând prin coalescență un strat distinct la partea superioară a lichidului de fermentație. Solventul, îmbogățit cu produs, este regenerat și apoi recirculat în fermentator. Astfel, este posibilă menținerea unei concentrații a produsului sub valoarea inhibitorie, permițând astfel dezvoltarea în continuare a microorganismelor.

Metoda separării directe a produselor de biosinteză prin extracție ridică două probleme majore referitoare la solventul utilizat și echipamentul de extracție. Solvenții joacă un rol important în mediul de reacție, putând afecta viteza sau mecanismul de reacție. Procedeul este utilizat frecvent pentru obținerea: etanolului, acetonei, butanolului, acidului propionic, acidului butiric.

Selectarea unui solvent compatibil cu sistemul de biosinteză respectiv este condiționată puternic de contactul direct între solvent și celulele din lichidul de fermentație. Solventul trebuie să îndeplinească următoarele condiții [2,4,5]:

absența toxicității pentru microorganismele cultivate (biocompatibilitatea)

valori ridicate ale coeficientului de distribuție al solutului între lichidul de fermentație și solvent

formarea unor emulsii puțin stabile cu mediul de cultură

regenerare ușoară

solubilitate minimă în lichidul de fermentație

densitate cât mai diferită de cea a lichidului pentru a asigura separarea fazelor

vâscozitate redusă

tensiune interfacială ridicată

stabilitate chimică ridicată în special la temperaturi ridicate și în timpul proceselor de sterilizare

lipsa unor efecte negative asupra mediului înconjurător

cost scăzut.

Totuși, este puțin probabil să existe un solvent care să îndeplinească toate aceste cerințe. În consecință, este necesară stabilirea unor priorități în cadrul acestor atribute. [1]

2.2.2. Extracția reactivă

Deși mecanismul extracției reactive prezintă unele particularități specifice fiecărui sistem

de extracție, în figura 7 este reprezentat schematic mecanismul general al extracției reactive:

Figura 6. Mecanismul extracției reactive.

În ipoteza în care solubilitatea reciprocă a fazei apoase (aq) și a fazei organice (o) este

nulă, procesul de extracție reactivă constă în următoarele etape [10]:

difuzia extractantului (Q) din volumul fazei organice către interfața de separare a celor

două faze;

difuzia solutului (A) din volumul fazei apoase către interfață;

reacția interfacială dintre solut și extractant;

difuzia compusului rezultat în urma reacției interfaciale în faza organică (extract).

În anumite cazuri, în funcție de solubilitatea componenților sistemului de extracție în cealaltă fază, locul de desfășurare al reacției dintre solut și extractant poate fi situat fie în vecinătatea interfeței, fie în faza apoasă.

Structura chimică a agenților de extracție determină mecanismul reacțiilor interfaciale implicate în extracția reactivă. Astfel, reacțiile chimice implicate în procesul de extracție sunt cu formare de perechi ionice, de schimb ionic, cu formare de specii solvatate sau cu formare de aducți. Natura reacțiilor este determinată de tipul agentului de extracție și al solutului. Luându-se în considerare etapele care intervin în desfășurarea separării, viteza procesului global poate fi controlată de două tipuri de rezistențe: difuzia și reacția chimică. În funcție de condițiile de operare, precum și de viteza reacției chimice dintre solut și agentul de extracție, procesul poate fi limitat difuzional sau cinetic. Stabilirea importanței relative a celor două etape determinante se face prin studierea efectului intensificării amestecării fazelor asupra gradului de extracție sau asupra vitezei transferului de masă al solutului. Domeniul difuzional constă în limitarea vitezei procesului global de către difuzia componenților sistemului și corespunde creșterii continue a gradului de extracție sau a vitezei de transfer de masă cu intensitatea amestecării fazelor (redată prin turație, criteriul Re etc.). Atingerea unui nivel constant de variație al parametrului urmărit indică trecerea în domeniul cinetic de desfășurare a extracției reactive, în care procesul este controlat de reacția chimică. După cum afirma Baird (1991), aceste două tipuri de rezistențe pot fi localizate în cinci posibile regiuni, prezentate în figura 8.

Figura 7. Regiunile în care pot fi localizate rezistențele la procesul

global de extracție reactivă.

2.2.3. Pertracția

Pertracția (extracție și transport prin membrane lichide) este o combinație în timp și spațiu a două operații de separare binecunoscute: extracție și reextracție cu solvent, oferind avantaje semnificative față de extracția clasică lichid-lichid. Procesele de separare bazate pe membrane lichide folosesc mai puțin solvent organic, integrând extracția și reextracția într-un proces continuu. Dacă două fluide miscibile sunt separate de un lichid nemiscibil cu acestea, dar care permite transportul masic al unuia sau a mai multor componenți, între fluide se formează o membrană lichidă. Totuși, numai descoperirea a noi metode de contactare a celor trei faze și a unor tipuri noi de membrane au condus la procese semnificative în ultimii patruzeci de ani a acestui deceniu.

O reprezentare schematică a unui proces de separare directă utilizând o membrană lichidă este prezentată în figura 4.

Figura 8. A. Mecanismul transportului solutului prin membrane lichide;

B. Mecanismul pertracției facilitate.

Principalul avantaj al utilizării extracției și transportului prin membrane lichide obținute prin înglobare pentru separarea directă constă în faptul că lichidele de fermentație, și inclusiv celulele nu sunt în contact direct cu solventul utilizat pentru separare. Suporturile solide utilizate, care separă cele două faze: soluția de reextracție și lichidele de fermentație permit utilizarea unor solvenți care sunt caracterizați de coeficienți de distribuție maximi, chiar dacă aceștia prezintă toxicitate față de microorganismele utilizate pentru biosinteză. În același timp, utilizarea acestor tipuri de membrană evită probleme legate de separarea celor două faze specifice extracției directe in-situ. Dintre compușii separați direct prin extracție și transport prin membrane lichide se numără:

– acizi organici: acid butiric, acid propionic, acid lactic, acid fumaric

– alcooli: etanol

– aminoacizi: fenilalanină, leucină.

– antibiotice: acidul 6-aminopenicilanic (6-APA), acidul 7-aminocefalosporanic (7-ACA)

– amine: metilbenzil amina

– cetone: acetofenona

– monozaharide: glucozamina

Un nou sistem de pertracție utilizează microcapsule cu diametrul de aproximativ 2mm pentru separarea directă utilizând pertracția. Acest sistem a fost utilizat pentru a mări concentrația finală a PEA (2-fenil-etanol), un produs aromatizant, cu o aromă asemănătoare trandafirului, la biosinteza acestuia utilizându-se drojdii pentru bioconversia L-fenilalaninei la PEA. Solventul, dibutil sebacat (DBS) care prezintă toxicitate față de S. cerevisiae, este încapsulat într-o membrană polimerică, constituită din hidrogel pe bază de alginat, nefiind în contact cu celulele. Dimensiunile mici ale microsferelor oferă o suprafață interfacială mare pentru un proces de extracție rapid. Capsulele au fost obținute prin coextrudere.

2.4. Aplicații ale extracției reactive și pertracției pentru separarea directă a unor compuși obținuți prin transformare enzimatică

Enzimele sunt prezente în toate organismele vii. Numărul și concentrația lor depinde însă de natura organismului. La microorganisme, echipamentul enzimatic și concentrația diferitelor enzime luate ca indivizi chimici depind de specia microorganismului și sunt influențate în mare măsură de condițiile mediului exterior. La plantele și animalele superioare, enzimele se găsesc în toate celulele vii ale acestora, însă distribuția enzimelor ca număr și concentrație variază după natura țesutului din care fac parte celulele.

Prin urmare, materiile prime folosite la fabricarea preparatelor enzimatice pot fi de natură vegetală, animală sau microbiană, iar tabelul 2.1.1 prezintă câteva exemple de enzime utilizate industrial și sursele din care au fost obținute :

Tabel 2.1.1. Câteva enzime importante industrial și sursele lor

În ceea ce privește obținerea preparatelor enzimatice pentru aplicații biocatalitice, sursa biologică aleasă trebuie să satisfacă anumite criterii și anume:

disponibilitatea materiei prime

calitatea constant a materiei prime

reproductibilitatea produsului final (preparatul enzimatic)

cost global scăzut al procesului (materiale, echipament, personal, tratament reziduuri, etc.).[3]

Aplicarea enzimelor ca biocatalizatori este extrem de favorizată datorită specificității excelente a substratului și stereoselectivității lor, precum și eficiența lor de a lucra în condiții ușoare, cu o încărcătură redusă pentru mediu. Enzimele sunt aplicate pe scară largă în fabricarea bioindustrială a substanțelor chimice vrac și a ”chimicalelor fine” care, în cele din urmă, găsesc aplicare în diferite domenii, de exemplu în alimente și furaje, produse cosmetice și farmaceutice. Cu toate acestea, procesele enzimatice suferă adesea de inhibarea substratului și/sau produsului, echilibru nefavorabil, (bio)transformarea nedorită a produsului și stabilitatea scăzută a enzimei. Eforturile de cercetare s-au îndreptat spre remedierea acestor dezavantaje într-o anumită măsură și s-a încercat găsirea unor strategii diferite pentru a intensifica procesele enzimatice, rezultând o creștere a randamentului produsului, a productivității procesului și/sau a stabilității enzimei. [5]

O serie de studii au vizat extracția acizilor 6-aminopenicilanic, 7-aminocefalosporanic, a benzilmetilaminei, glucozaminei și a acetofenonei din lichidele de fermentație, prin folosirea diferitelor sisteme de extracție care conțin combinații de agenți de extracție și/sau combinații de solvenți.

Clasa antibioticelor β-lactamice este de departe cea mai mare din punct de vedere al volumului de producție și constă, în principal din subclasele: peniciline, cefalosporine și cefamicine. Ultima subclasă este preparată exclusiv prin sinteză chimică, iar penicilinele și cefalosporinele sunt produse semi-sintetic, bazate pe combinarea fermentației și a sintezei organice. Ambele sunt bazate pe câte un intermediar-cheie, și anume acidul 6-aminopenicilanic (6-APA) pentru peniciline și acidul 7-aminocefalosporanic (7-ACA) pentru cefalosporine. Acești intermediari sunt apoi transformați prin diferite căi de reacție în numeroase medicamente ce se comercializează de zeci de ani. Volumul de producție al celor 2 acizi este de mii de tone anual. S-a acordat un interes puternic dezvoltării unei abordări extrem de atractivă din punct de vedere economic, dar în același timp durabilă față de astfel de intermediari, necesari pe scară largă. [6]

Acidul 6-aminopenicilanic(6-APA) produce antibiotice β-lactamice semi-sintetice, cum ar fi ampicilina, amoxicilina, oxacilina și carbenicilina. Este produs comercial prin hidroliza penicilinei G catalizată de enzima penicilin acilază (cunoscută și ca penicilin amidaza), cu acidul fenilacetic (PAA) ca produs secundar (Figura 9) [24]. În mod natural, hidroliza enzimatică a penicilinei G s-a efectuat în soluție tampon apoasă la pH 7,5-8. Totuși, acest sistem are mai multe dezavantaje cum ar fi: (1) nevoia de a ajusta pH-ul mediilor de reacție datorită producției continue de acid fenilacetic secundar care conduce la formarea de deșeuri ce conțin săruri și (2) reducerea activității enzimatice datorată efectului de inhibare al penicilinei, acizilor 6-APA și PAA.

Figura 9. Hidroliza enzimatică a penicilinei G

Producerea de antibiotice

Benzilpenicilinele și fenoxipenicilinele (penicilinele V și G) sunt produse prin fermentație și sunt precursorii de bază pentru obținerea unei game largi de antibiotice de semi-sinteză. Legătura amidică poate fi hidrolizată prin metode convenționale, însă condițiile necesare pentru hidroliza sa specifică, fără să provoace hidroliza ciclului β-lactamic, intrinsec mai labil, dar esențial farmacologic, sunt dificil de atins. În schimb, o astfel de hidroliză specifică poate fi realizată biocatalitic prin utilizare de penicilin amidaze. Diferitele preparate enzimatice sunt utilizate pentru hidroliza penicilinelor G și V, penicilin V amidaza fiind mult mai specifică decât penicilin G amidaza.

Penicilin amidaza poate fi obținută din E.coli și a fost imobilizată pe un număr de suporturi incluzând Sephadex G200 activat cu bromcian. Acest procedeu a reprezentat unul din primele succese ale biocatalizei cu enzime imobilizate și, în general, se utilizează în reactoare discontinue sau semicontinue (40000U.kg-1 penicilină G, 35°C, pH=7,8, 2 ore). Biocatalizatorul poate fi utilizat de peste 100 ori. A fost utilizat și în reactoare cu strat fix, unde a avut o activitate de peste 100 zile, producând circa 2 tone de acid 6-aminopenicilanic per kg enzimă imobilizată.

Penicilin G amidazele pot fi folosite și în sens invers, pentru a sintetiza peniciline și cefalosporine. De exemplu, ampicilina este obținută prin utilizarea penicilin G amidazei imobilizată prin adsorbție pe DEAE-celuloză în reactoare cu strat fix. [3]

Numeroase procese de hidroliză integrate cu separarea in-situ a produsului au fost dezvoltate pentru a elimina inhibiția de produs. În general, aceste metode pot fi clasificate în separarea cu membrane (pertracție) și extracție lichid-lichid. În metoda de separare cu membrane, reacția de hidroliză a fost efectuată în compartimentul separat de membrană, iar acidul fenilacetic produs a fost în continuare îndepărtat prin electrodializă [4-6] sau pertracție într-o altă fază de solvent sau compartiment membranar. Pe de altă parte, s-au introdus săruri suplimentare sau solvenți organici cu scopul de a induce sau forma o fază separată pentru a extrage produși din amestecul hidrolitic în abordarea extracției lichid-lichid. De exemplu, Anderson and Hahn-Hagerdal au dezvoltat procesul de separare integrat folosind sistemul apos bifazic PEG/KH2PO4. Aceștia au aflat că cei doi produși, 6-APA și PAA au fost extrași în faza bogată în polimeri, în timp ce enzima a rămas în faza bogată în săruri, care a redus semnificativ inhibiția de produs .Diender et al and Ferreira et al. au folosit acetatul de butil pentru a extrage PAA, în timp ce penicilina a fost hidrolizată în faza apoasă în sistem bifazic acetat de butil/apă. Avantajul acestui sistem este acela că s-a lucrat la un pH cuprins între 3.5- 4.4, care este aproape de punctul izoelectric al acidului 6-aminopenicilanic. Ca rezultat, echilibrul reacției a fost schimbat spre partea produsului. În orice caz, acest sistem a arătat, de asemenea, numeroase deficiențe cum ar fi activitate și stabilitate enzimatică scăzute la pH mic și constrângeri de mediu referitoare la utilizarea de solvenți organici volatili.

Recent a fost investigată hidroliza penicilinei în sisteme ce conțin lichide ionice (IL). Este unanim recunoscut că lichidele ionice sunt săruri lichide la temperatura camerei. Acestea au fost utilizate pe scară largă ca alternative potențiale la solvenții organici inflamabili, puternic volatili, toxici, și periculoși, datorită proprietăților lor neobișnuite, dar utile în diverse domenii de aplicare, cum ar fi extracția, biotransformarea, separarea etc. Enzima penicilin acilaza a arătat o mai mare stabilitate în IL decât în solvenți ​​organici. De exemplu, a fost observat un timp de viață de 23 h în 1-etil-3-metilimidazoliu bis [(trifluormetil)sulfonil] imidă ([Emim] [Tf2N]), care a fost de aproximativ 200 de ori mai mare decât cea din izopropanol. În plus, au fost propuse, de asemenea, procese integrate pentru hidroliza penicilinei în lichide ionice. De exemplu, Jiang et al. au dezvoltat un sistem ATP cu amestec de IL/apă pentru separarea, recuperarea și hidroliza penicilinei. În studiul lor, penicilina din fluxul apos a fost mai întâi extrasă în faza bogată în IL folosind sistemul bifazic apos cu lichide ionice (ILATP) bazat pe lichidul ionic hidrofil 1-butil-3-metilimidazoliu tetrafluoroborat ([Bmim][BF4]) și NaH2PO4. Un lichid ionic hidrofob, hexafluorofosfat 1-butil-3-metilimidazolic ([Bmim][PF6]) a fost apoi introdus în faza bogată în IL a sistemului ILATP conținând penicilină și transformată în sistemul mixt IL/apă (MILW). Penicilina a fost hidrolizată de către penicilin acilaza în faza apoasă a sistemului MILW la pH=5. Produsul secundar PAA a fost împărțit în faza amestecului de IL, în timp ce produsul dorit 6-APA a fost precipitat la pH-ul operat, astfel a beneficiat de echilibrul de reacție și a îmbunătățit eficiența hidrolizei. [7]

În lucrarea sa, Mai (2014) a realizat hidroliza enzimatică a penicilinei G și separarea in-situ a produsului, folosind lichidele ionice ca mediu de reacție. Reacția de hidroliză se desfășoară de obicei în tampon de soluție apoasă la pH 7,5-8. Cu toate acestea, traseul apos prezintă mai multe dezavantaje în stabilitatea enzimei și recuperarea produsului. Rezultatele au arătat că lichidele ionice hidrofobe/sistemul bifazic apos au fost medii bune pentru reacție. De exemplu, randamentul hidrolizei de 87,13% a fost obținut în sistem conținând 30%wt [TBP] [Tf-ILe] (Tetra-n-butylphosphonium trifluoromethanesulfonyl isoleucine) cu controlul pH-ului (pH=7,6). Deoarece separarea de fază a acestui mediu de sistem poate fi schimbată dintr-o fază în două faze prin modificarea ușoară a temperaturii soluției, reacția hidrolitică enzimatică și recuperarea produsului au fost mai eficiente decât cele ale sistemului apos. În plus, lichidele ionice ar putea fi reutilizate pentru cel puțin 5 cicluri fără pierderi semnificative în eficiența hidrolizei. [7]

Avinash et al. (2016) au utilizat celule întregi imobilizate de Escherichia coli pentru biotransformarea penicilinei V în 6-APA, exprimând o activitate ridicată a penicilin V acilazei.

Penicilin G acilaza (PGA) din E. coli a fost folosită de mult timp în acest scop. Cu toate acestea, utilizarea penicilin V acilazei (PVA) prezintă câteva avantaje, inclusiv stabilitatea mai bună și rate de conversie mai mare. Aplicarea industrială a PVA-urilor a fost până acum limitată din cauza inaccesibilității tulpinilor bacteriene adecvate și problemelor legate de costuri. Optimizarea parametrilor pentru biotransformare prin celulele imobilizate au arătat că se poate realiza conversia completă a penicilinei V la 6-APA în decurs de 1 oră la pH 5,0 și 35 °C și până la 4% (greutate/volum) concentrație a substratului. Productivitatea enzimatică ridicată a sistemului enzimatic PVA face un caz promițător pentru aplicarea sa în producția 6-APA la nivel industrial. [8]

Galaction et al. (2016) a analizat producerea acidului 6-aminopenicilanic prin hidroliza enzimatică a penicilinei G folosind un bioreactor cu pat mobil de penicilin amidază imobilizată în Eupergit C în condițiile inhibării substratului (penicilina G) și a produsului (6-APA și acidul fenilacetic). Au fost elaborate modele matematice specifice luând în considerare penicilina
G pentru o singură particulă sub efecte inhibitorii și au fost utilizate pentru calculul
concentrațiilor de penicilină G la suprafață și în interiorul biocatalizatorului. Utilizând aceste valori de concentrație, s-a constatat că valoarea maximă a fluxului de masă extern a penicilinei G corespunde dimensiunii intermediare a particulelor de biocatalizator, datorită echilibrului stabilit între procesele antagoniste de difuzie internă și inhibare induse de substrat. Variația fluxului masic intern al penicilinei G cu raza particulei au indicat faptul că este posibil să se atingă valori foarte scăzute ale fluxului de masă aproape de centrul particulei, valori care ar putea fi neglijabile. Amploarea acestei regiuni enzimatice inactive a variat de la 0 la 9,2 % din volumul total al particulelor biocatalizatoare prin creșterea numărului diametrul particulelor.

Influența difuziunii interne a penicilinei G asupra ratei de hidroliză enzimatică a fost
analizate cu ajutorul numărului Bi, a modulului Thiele și a factorului de reducere λ.
Creșterea diametrului particulelor a dus la o creștere atât a numărului Bi, cât și a modulului Thiele și, implicit, la scăderea factorului λ în centrul de particule. Pentru particulele de penicilin amidază imobilizate cu diametrul de 1 mm față de cele cu diametrul de 2 mm, rata de conversie a penicilinei G a scăzut cu aproximativ 1,4 până la 34 de ori.

Figura 10. Variația debitului masic intern al penicilinei G cu distanța față de centrul de particule. [9]

McDonald et al. (2017) a utilizat cristalizarea reactivă enzimatică pentru a îmbunătăți sinteza ampicilinei. Selectivitatea sintezei ampicilinei s-a realizat cu penicilin G acilază (PGA) executând reacția simultan cu cristalizarea. PGA catalizează condensarea esterului metilic al fenilglicinei (PGME) cu acid 6-aminopenicilanic (6-APA) pentru a forma ampicilina.

Cristalizarea reactivă poate fi utilizată pentru a crește selectivitatea ampicilinei. Un nou model sensibil la pH prezice concentrațiile pentru reacțiile independente de pH. Experimentele confirmă predicțiile modelului de selectivitate mai bună pentru ampicilină. Folosind Assemblase® selectivitatea este crescută cu 50% prin reacție paralelă/cristalizare. Randamentul este îmbunătățit cu 20% față de maximul teoretic, fără a lua în considerare cristalizarea.

Figura 11. Schema de reacție și izolarea intermediară (ampicilină) prin cristalizare

Pentru înocularea cristalizatorului reactiv, 14,1 mg/ml de trihidrat de ampicilină au fost adăugați la o soluție de PGME și 6-APA în cantități echimolare. Solubilitatea trihidratului de ampicilină este mai mică decât 14,1 mg/ml (Figura 12, echivalent cu 35 mM ampicilină dizolvată), ceea ce înseamnă că, la echilibru și înainte de începerea reacției, amestecul rezultat este o suspensie de ampicilină dizolvată și fază solidă (5-15% cristale de semințe, în funcție de valoarea pH). Pentru a simula procesul omogen (fără cristalizare), 13,0 mg/mL de ampicilină sare de sodiu (echivalentă cu 35 mM ampicilină dizolvată) s-au adăugat în soluția de reacție.

Figura 12. Solubilitatea 6-APA (ș), a ampicilinei (♦) și a fenilglicinei (▲) în

funcție de valoarea pH-ului. Linile indică modelarea pe baza modelului ecuației Henderson-

Ecuație Hasselbalch cu corecție a intensității ionice. Pentru ampicilină linia continuă

reprezintă trihidrat de ampicilină, în timp ce linia întreruptă reprezintă

ampicilina sare de sodiu. PGME nu este afișat deoarece este foarte solubil. [10]

Acidul 7-aminocefalosporanic

Groger et al. (2017) au studiat câteva repere industriale în dezvoltarea unui proces de producție pentru acidul 7-aminocefalosporanic. Cefalosporina C constituie o sursă valoroasă de materie primă, fiind accesibil[ prin fermentare și disponibilă în cantități mari. Inițial, un proces de producție chimică în mediu organic bazat pe diferiți reactivi pentru chimia grupului de protecție și activarea aciclică a amidelor au servit ca tehnologie de producție la scară largă pentru transformarea cefalosporinei C în 7-ACA. Ulterior, a fost dezvoltată o producție bi-enzimatică în mediu de reacție apos bazată pe D-aminoacid oxidaza pentru modificarea lanțului lateral și glutaril acilaza pentru scindarea acestuia. De asemenea, această abordare biocatalitică s-a dovedit a fi o soluție la scară industrială și a redus dramatic cantitatea de deșeuri de la 31 kg (pentru "procesul chimic original") la mai puțin de 1 kg. Ultima inovație a fost extinderea procesului bi-enzimatic în două etape la un proces monoenzimatic cu o singură etapă, bazat pe scindarea directă a legăturii de amidă aciclică a cefalosporinei C prin intermediul cefalosporinei C acilazei. Această alternativă, un proces biotehnologic eficient din punct de vedere economic și durabil, a fost deja stabilit la scară industrială în ultimii ani. Aceste realizări biotehnologice reprezintă repere industriale în biocataliză și exemple care arată că biocataliza modernă poate contribui la dezvoltarea și implementarea unor procese de producție industriale foarte economice și durabile. [6]

Acetofenona reprezintă materia primă pentru sinteza multor produse farmaceutice, fiind de asemenea folosite pentru a crea parfumuri care seamănă cu migdală, cireș, caprifoi, iasomie și căpșuni și se găsește în mod natural în multe alimente, inclusiv mere, caise, banane și carne de vită. Acetofenona este, de asemenea, o substanță tipică pentru hidrogenarea transferurilor asimetrice a cetonelor, cu produsul de 1-feniletanol chiral, care este utilizat pe scară largă în industria farmaceutică și a parfumurilor. Interesant de știut este că, acetofenona poate fi formată prin reacție de oxidare a 1-feniletanolului viz. acetofenonă și 1-feniletanolul se poate converti unul în celălalt prin procese redox. Din păcate, deoarece punctele lor de topire sunt aproape egale (aproximativ 293 K) și punctul de fierbere al 1-feniletanolului (477 K) este puțin mai mare decât al acetofenonei (475 K), separarea acestora prin distilare sau cristalizare obișnuită este abia fezabilă [9]. Prin urmare, în modul tehnologic de producere a acetofenonei pure sau 1-feniletanolului, procesul discontinuu, cum ar fi separarea produselor și substanțelor este una dintre cele mai provocatoare probleme din industria chimică. Adsorbția selectivă pe adsorbanți solizi specifici oferă perspective promițătoare pentru proiectarea procedurilor de separare eficiente din punct de vedere tehnologic și economic.

Un studiu recent a luat acetofenonă și 1-feniletanol ca pereche de compuși model pentru studierea adsorbției selective a aldehidei și a alcoolului din amestecul de reacție biocatalitică simulat cu argilă naturală de kerolit. Materialul adsorbant studiat a furnizat o selectivitate distinctă față de acetofenonă, deoarece a adsorbit mai degrabă cetona decât alcoolul în soluția apoasă. Deși se poate face diferența între acetofenonă și 1-feniletanol prin procedeul de adsorbție, până acum a fost acordată mai puțină atenție separării acestora față de cele mai fierbinți sisteme de amestecuri cum ar fi izomerii C8, cis- și trans-olefinele și enantiomerii, etc.[11]

Acetofenona este utilizată pe scară largă ca solvent industrial pentru fibre/rășini și constituie un stoc important folosit pentru a produce produse chimice cum ar fi acid benzoic, acid benzoilformic, feniletanol, fenol și etilbenzen. [12]

Este o cetonă cristalină utilizată ca solvent pentru eteri și esteri ai celulozei în fabricarea rășinilor solubile în alcool. Această substanță chimică poate fi obținută prin distilarea uscată a unui amestec de săruri de calciu ale acizilor acetic și benzoic. În prezent, acetofenona provine în principal ca un produs secundar al sintezei fenol-acetonă în procesul de oxidare a cumenului. La un moment dat a fost folosit ca un hipnotic sub numele de hipnone.

Acetofenona este, de asemenea, extrasă din fluxul de producție și comercializată într-o calitate comercială cu puritate de 98% și 99%. Este o materie primă de bază în rășini hidrocarbonice pentru producerea de adezivi și cerneluri tipografice. Acetofenona este, de asemenea, un precursor al anumitor agrochimicale.

Oxidarea laterală a lanțurilor aromatice de alchil reprezintă o reacție centrală în chimia organică, atât pentru cercetarea fundamentală, cât și pentru producția industrială.
Utilizarea efectivă a etilbenzenului (EB), disponibilă în fluxul de xilen al industriei petrochimice, este o propunere atractivă pentru mai multe produse cu valoare adăugată. O atenție mare s-a axat recent pe oxidarea etilbenzenului pentru producerea cetonei aromatice acetofenonă (ACP), unul dintre produsele cruciale în industria chimică. Se utilizează ca intermediar în producția de farmaceutice, rășini, alcooli, esteri, aldehide și gaze lacrimogene și este, de asemenea, utilizat ca a componentă în parfumerie și ca solvent pentru eteri de celuloză. Așadar, a fost un interes considerabil în dezvoltarea unor procese extrem de eficiente pentru producția de ACP din EB. Modul obișnuit pentru producția ACP este prin acilare Friedel-Crafts cu clorură de acetil, utilizând cantități stoichiometrice de acizi omogeni Lewis (AlCl3), care conduc la cantități mari de substanțe toxice și deșeuri corozive. Acetofenona poate fi, de asemenea, produsă prin oxidarea etilbenzenului cu oxigen sau aer peste compuși de metal de tranziție omogeni (Co, Mn, Cu sau Fe) drept catalizatori. Cu toate acestea, ei suferă de mai multe dezavantaje: condițiile de funcționare în acest proces sunt adesea dure, selectivitatea produsului este slabă, iar catalizatorul dă naștere la multe probleme cum ar fi manipularea, recuperarea și reciclarea catalizatorului. Atât din punct de vedere economic, cât și din punct de vedere al mediului este, prin urmare, de mare interes practic să se dezvolte un catalizator mai eficient, ușor separabil, reutilizabil și ecologic pentru producerea de acetofenonă. [13]

Transaminazele (TA) sunt unul dintre cei mai promițători biocatalizatori în sinteza organică pentru prepararea compușilor amino chirali. Reacția concisă, enantioselectivitatea excelentă, prietenia cu mediul și compatibilitatea cu alte sisteme enzimatice sau chimice au adus TA în atenția oamenilor de știință care lucrează în domeniul biocatalizei. Cu toate acestea, pentru a utiliza transaminazele într-un mod cât mai eficient și mai economic, trebuie făcute încercări de optimizare a performanței lor. Cererea pentru diferite specificități de substrat, stabilitate în condiții nefiziologice și conversii mai mari în reacții reversibile au fost vizate și complet investigate. Un număr de strategii bazate atât pe proteine cât ​​și pe procese au fost dezvoltate pentru a îmbunătăți TA și sistemele care implică TA. Mai mult, prin combinarea cu alte enzime din reacții în cascadă sau chiar în sisteme mai complexe, așa-numita biologie sintetică și biocataliză a sistemelor, TA pot fi biocatalizatori cu potențial imens în producția industrială de substanțe chimice de înaltă valoare. În review-ul realizat de Guo (2017) sunt evidențiate strategii de optimizare a TA și discutate o serie de sisteme pentru îmbunătățirea performanței acestora. Biocatalizatorul transaminază a fost și va continua să fie, unul dintre subiectele cele mai interesante din sinteza organică ”verde”.

(2016 Transaminase biocatalysis: optimization and application- Fei Guo) [18]

În lucrarea sa, Guixian et al. (2013) a reușit conversia etilibenzenului în proporție de 72.7% și selectivitatea acetofenonei de 95.4%. Pentru aceasta, a folosit o suprafață de atapulgit activat de acid (ATP) modificat prin grefarea 3-aminopropiltrietoxisilanului (ATPS) pentru imobilizarea unei sări heteropoliacide Co4HP2Mo15V3O62 (CoHPAs). Probele au fost caracterizate prin spectroscopie cu infraroșu cu transformare Fourier, difracție a pulberii cu raze X, măsurători ale suprafeței specifice, analiză termică și microscopie cu emisie în câmp. Activitatea catalitică a fost testată pentru oxidarea etilbenzenului în prezența a 50% H2O2 pentru prima dată în această lucrare. S-a constatat că activitatea din catalizatorul CoHPA susținut de ATP este evident influențat de inserția APTES. Catalizatorul CoHPA/ATPAPTES prezintă o activitate înaltă datorită sililării lui. Rezultatele arată, de asemenea, că acest catalizator, CoHPA/ATPAPTES poate fi reutilizat de cel puțin cinci ori fără scăderea semnificativă a activității.

Reacția catalitică: Procedura generală pentru oxidarea etilbenzenului în fază lichidă în acetofenonă este descrisă după cum urmează: 0,3 g catalizator, 5,4 mmol de co-catalizator (KBr), 3 ml de catalizator etilbenzen și 12,5 ml de H2O2 50% au fost introduse într-un recipient de 100 ml cu trei gâturi, cu fund rotund. Balonul a fost imersat într-o baie de ulei pentru a putea face ca temperatura de lucru să fie constantă la 70 °C pentru un timp predeterminat (40 min), cu agitare continuă, la care a fost conectat un condensator. Amestecul de reacție s-a răcit în mod natural la temperatura camerei și s-a filtrat pentru a separa catalizatorul. Filtratul a fost analizat pe un cromatograf de gaz SP-3420 echipat cu detector de ionizare în flacără (FID) și o coloană capilară (30m x 0,32 mm x 0,5 μm) folosind azot ultra-pur ca gaz purtător, cu metoda internă standard utilizând toluen ca substanță standard. [13]

Sekar et al. (2013) a descris într-una dintre lucrări dezvoltarea unei metode de electroforeză capilară (CE) pentru separarea simultană a acetofenonei (AP), 2-hidroxiacetofenonei (2-HAP), 3-hidroxiacetofenonei (3-HAP) și 4-hidroxiacetofenonei (4-HAP) în amestecuri sintetice utilizând 10 mmol/l tetraborat de sodiu ca soluție tampon (pH=9,5).

Scopul lucrării a fost de a demonstra eficacitatea CE pentru separarea AP și a izomerilor săi monohidroxi și pentru a defini modul în care separările sunt afectate de soluțiile tampon, pH-ul acestora, probele-enșantion și tensiunea de separare. Această metodă a fost utilizată cu succes pentru separarea și determinarea 2-HAP, 3-HAP și 4-HAP în amestec sintetic și 4-HAP în eșantioane spiked cu plasmă.

Figura 13. (a) Electroferograma soluției tampon fără analiți

(b) AP și izomerii monohidroxi (AP, 2-HAP, 3-HAP și 4-HAP). Condiții CE: 10 mmol/l tetraborat de sodiu (pH 9,5) și 5% (v /v) ACN

(c) 10 mmol/l acetat de amoniu (pH 10,0)

Tensiunea de injectare a fost de 10 kV/10 s, tensiunea de separare 15 kV, capilara din siliciu topit neacoperită de 60 cm și lungimea (efectivă) 50 μm i.d, detecția lungimii de undă fiind de 195 nm. [14]

Chai et al. (2014) și-a îndreptat atenția spre separarea amestecului puțin studiat de acetofenonă și 1-feniletanol, produs secundar obișnuit prin instalația de rafinare a petrolului, bazată pe afinitatea preferențială a β-ciclodextrinei (abreviată ca β-CD) pentru acetofenonă. Pentru a demonstra aplicarea potențială a β-CD pentru separarea acetofenonei de 1-feniletanol, interacțiunile non covalente din β-CD cu acetofenonă și 1-feniletanol au fost comparate din punct de vedere termodinamic și conformațional. Pentru scopul separării, s-a stabilit o tehnică multicomponentă de coprecipitare bazată pe proprietatea de legare non covalentă selectivă a β-CD, fiind riguros dovedită. În condiții optimizate, amestecul binar echimolar acetofenona/1-feniletanol poate fi separat cu un factor de separare >37. Pentru produsul secundar petrochimic, care conține 74,93% în greutate acetofenonă, 17,79% în greutate 1-feniletanol și alți compuși minori, extinderea scării de separare poate duce la un procent de 99,2 % acetofenonă în complex, iar eficiența de separare a β-ciclodextrinei este menținută stabilă după reciclare de două ori.

Figura 14. Separarea amestecurilor binare cu fracții molare diferite de acetofenonă și 1-

feniletanol prin tehnica coprecipitării (● reprezintă fracția molară a acetofenonei în complex,

* reprezintă fracția molară a 1-feniletanolului în reziduu). [11]

Halim et al. (2014) a propus în lucrarea sa stabilirea unor metode la micro-scară pentru a explora rapid opțiunile bioprocesului care ar putea fi utilizate pentru a spori randamentul reacției de bioconversie: fie prin schimbarea echilibrului de reacție nefavorabil, fie prin depășirea inhibării substratului și/sau a produsului. Ca exemplu tipic și industrial relevant de problemă des întâlnită este sinteza asimetrică a (2S,3R)-2-amino-1,3,4-butanetriol din L-eritruloză utilizând ω-transaminaza din Chromobacterium violaceum DSM30191 (CV2025 ω-TAm) și metilbenzilamină ca donor de aminoacizi. Prima opțiune de proces implică utilizarea
de donori amino alternativi. Cel de-al doilea cuplează CV2025 ω-TAm cu alcool dehidrogenază și glucoz-dehidrogenază pentru îndepărtarea subprodusului acetofenonă (AP), prin conversia in-situ în (R)-1-feniletanol. Abordările finale implică metode fizice de îndepărtare in-situ a produsului. Condițiile de presiune redusă, obținute prin utilizarea unui colector în vid cu 96 de godeuri, au fost utilizate pentru a crește selectiv evaporarea AP volatilă în timp ce rășinile polimerice s-au folosit, de asemenea, pentru adsorbția selectivă a AP din mediul de bioconversie. Pentru reacția specială studiată în această lucrare, cele mai promițătoare opțiuni de bioproces au fost utilizarea unui donor amino alternativ, cum ar fi izopropilamină, care a permis o creștere de 2,8 ori a randamentului de reacție sau utilizarea unui sistem de enzime secundare care a înregistrat o creștere a randamentului de 3,3 ori.

Figura 15. Rezumat al metodelor la micro-scară stabilite în această lucrare pentru a investiga opțiunile de bioproces pentru a depăși limitările termodinamice sau cinetice ale bioconversiilor

Creșterea randamentului obținut cu un exemplu de reacție pentru fiecare dintre opțiunile de bioproces investigate sunt rezumate în tabelul 1.

Tabelul 1 Rezumat al creșterilor concentrației produsului și al randamentului bioconversiei
obținute utilizând diferite metode la micro-scară

(Creșterea randamentului calculată in raport cu concentrația produsului (13 mM) obținută în bioconversia standardă a lizatului CV2025 Tam folosind concentrațiile inițiale [Ery] și [MBA] de 50 mM fiecare) [15]

Într-un studiu realizat de Yang et al. (2015) au fost izolați câțiva compuși chimici precum fenoli și cetone (printre care și acetofenona) din ulei bio, la scară de laborator. Extracția și cromatografia pe coloană au fost combinate pentru a separa uleiul bio și a furniza posibilele chimicale. Acetofenona a fost obținută în concentrație suficient de mare și anume într-un procent de aproximativ 71,2 %. [12]

Li et al. (2016) au realizat bioconversia asimetrică a acetofenonei în emulsie de dimensiune nanometrică folosind Rhizopus oryzae. În figura următoare sunt redate performanțele reducerii acetofenonei atunci când se utilizează peleți, micelii suspendate și aglomerări.

Figura 16. Performanțele reducerii acetofenonei atunci când se utilizează peleți, micelii suspendate și aglomerări.

(A) Conversia maximă (82%) a fost obținută la 72 ore când s-au folosit peleți cu diametrul de 0,54 mm. Peleții cu diametrul de 0,65 și 0,75 mm, miceliile și aglomerările au nevoie de mai mult timp de incubare pentru a ajunge la conversia lor maximă. (n = 5)

(B) Excesele enantiometrice (e.e.) de (S)-feniletanol au atins aproximativ 85% când se utilizează peleți pe întreaga perioadă de incubație. Miceliile suspendate și aglomerările au arătat valori scăzute ale e.e. (n = 5)

(C) Peleții cu diametrul de 0,54 mm au consumat glucoză mai repede decât peleții cu diametre de 0,65 și 0,75, mieliile suspendate și aglomerări, succesiv. (n = 5)

(D) Mai multă biomasă finală a fost obținută atunci când se utilizează peleți mai mari. Cu toate acestea, biomasa finală a miceliilor suspendate și a aglomerărilor a scăzut în comparație cu biomasa inițială. (n = 5) [16]

Scopul lucrării realizate de Bajic et al. (2016) a fost studierea gradării treptate a unui reactor în miniatură cu pat împachetat (MPBR) pentru procesul catalizat de transaminaze pentru a crește productivitatea și, în același timp, pentru a permite utilizarea eficientă a biocatalizatorilor. A fost elaborat și testat un MPBR utilizând LentiKats® (particule PVA în formă de lentilă cu ω-TA imobilizată), pentru sinteza acetofenonei (ACP) și l-alaninei (l-ALA) ca model de reacție. Influența lungimii, lățimii și adâncimii canalelor asupra performanței MPBR a fost evaluată pentru două reactoare. Mai mult decât atât, pentru a demonstra posibilitatea unui screening cu capacitate ridicată a condițiilor de funcționare a procedeului utilizând MPBR, a fost analizat efectul temperaturii asupra ω-TA imobilizate și stabilitatea operațională în flux continuu de substraturi pe o perioadă de 3 săptămâni.

Figura 17. Asamblarea și părțile principale ale unui MPBR

1. fitinguri pentru tuburi de înaltă presiune 2. plăci de polimetilmetacrilat 3. LentiKats® cu ω-transaminază 4. garnitură din polieter eter cetonă 5. distanțier non-compresibil PTFE [17]

Acetofenona poate fi produsă enzimatic prin conversia metilbenzilaminei utilizând transaminază. Procesul enzimatic este puternic afectat de inhibarea produsului, necesitând astfel îndepărtarea acetofenonei din mediu în timpul sintezei sale. În acest scop, extracția individuală și selectivă a acetofenonei și metilbenzilaminei cu solventul biocompatibil n-heptan conținând 1-octanol, D2EHPA sau TOA a fost analizată la trei valori ale pH-ului (5, 7 și 9) de către Kloetzer et al. (2016). Indiferent de solventul utilizat și valoarea pH-ului, cea mai mare eficiență a fost atinsă pentru extracția acetofenonei, diferența dintre randamentele de extracție a acetofenonei și metilbenzilaminei fiind amplificate în timpul separării acestora din amestecul. Pe baza factorilor de selectivitate experimentală și luând în considerare atât pierderea posibilă a substratului din mediu, cât și pH-ul necesar pentru reacția enzimatică, pH = 7, s-a concluzionat că o combinație optimă de solvent este amestecul între n-heptan și 1-octanol. Acest amestec de solvenți a permis atingerea unui factor de selectivitate ridicat de 315, corespunzător valorii randamentului de extracție al acetofenonei de 94,5% și al metilbenzilaminei de numai 0,3%. [19]

Lu et al. (2017) au realizat biosorbția și separarea selectivă a acetofenonei și a 1-feniletanolului cu polimeri pe bază de polizaharidă (SPM) ca adsorbant. Un efect de roll-up a fost observat în adsorbția continuă. SMP poate fi regenerat fără pierderi de performanță. Mecanismul de adsorbție a fost propus prin calcule teoretice și analize experimentale. [20]

În cazul benzilmetil aminei, Rehn et al. (2014) au raportat un studiu recent în care au demonstrat utilizarea reușită a tehnicii supported liquid membrane (SLM) pentru îndepărtarea in-situ a produsului (ISPR) (S)-α-metilbenzilamină (MBA) produs de Arthrobacter citreus, ω-transaminază prezentă în celulele imobilizate de Escherichia coli. [21]

D-glucozamina (2-amino-2-deoxi-D-glucoză), un aminozahar ce constituie unitatea structurală de bază a chitosanului, este un medicament util în diferite domenii de medicină și stomatologie (Sitanggang et al., 2012; Igawa și colab., 2014). Se știe că D-glucozamina posedă

multe roluri biologice și a primit o atenție deosebită pentru tratamentul osteoartritei (Krikham și Samarasinghe, 2009). Cercetări privind D-glucozamina în efectul contra durerii la pacienți cu osteoartrita au evidențiat capacitatea de a suprima durerea asociată cu o dizabilitate a osteoartritei. Acest aminozahar este sintetizat natural în organism și se găsește în cartilajul articulației mamiferelor, fiind evaluat și ca supliment alimentar sau nutraceutic (Hiroshi, 2011).

D-Glucozamina găsește, de asemenea, aplicații în vindecarea rănilor, regenerarea osoasă și agent antibacterian în stomatologie (Muzzarelli et al., 2012). Datorită aplicațiilor pe scară largă, există interese comerciale emergente în producția comercializată de D-glucozamină. D-glucozamina disponibilă comercial este derivată în principal din chitina crustaceelor marine, prin hidroliza cu HCI concentrat (Krikham și Samarasinghe, 2009; Sitanggang și colab., 2012). Pe lângă hidroliza acidă, hidrogenarea directă a chitinei poate fi aplicată pentru prepararea D-glucozaminei (Chang și colab., 2011). În orice caz, aceste metode chimice ale preparării D-glucozaminei au mai multe dezavantaje, inclusiv randament scăzut, costuri ridicate, formarea acidului efluent, poluarea mediului datorită acidului efluent etc. Astfel, metodele biologice, în special hidroliza enzimatică a chitosanului pentru producția de D-glucozamină a primit o atenție considerabilă, pentru a aplica condiții de reacție blânde, precum și consistența produsului (Sashiwa și colab., 2003; Sujata și colab., 2011). Hidroliza enzimatică a chitosanului la D-glucozamina se realizează cu ajutorul unei enzime cu specificitate de hidroliză a chitosanului "exo-β-D-glucozaminidază". În orice caz, nu s-au înregistrat progrese comerciale reale până în prezent în producția enzimatică de D-glucozamină, în principal din cauza indisponibilității exo-β-D-glucozaminidazei comerciale (Sujata și colab., 2011).

În lucrarea sa, Nidheesh et al. (2015) a încercat degradarea enzimatică a chitosanului și producerea de D-glucozamină prin fermentarea substratului solid al exo-β-D-glucozaminidazei din Penicillium decumbens CFRNT15. Exo-β-D-glucosaminidaza este o enzimă care acționează asupra legăturilor β-(1/4) a chitosanului de la capătul său nereducător și produce D-glucozamina ca produs final. Producția solidă de fermentare a substratului (SSF) de exo-β-D-glucozaminidază de către un nou izolat de Penicillium decumbens (CFRNT15) a fost optimizat folosindu-se metodologia Box-Behnken de proiectare și răspuns. Condițiile optimizate pentru producția maximă de exo-β-D-glucozaminidază a fost de 22 ± 1 °C, umiditate 75% (greutate/greutate), 120 ore de fermentație, 5,0% (g /g) chitosan, 0,05% (g / g) CaCI2, 0,5% (g/g) MgS04 și 15,1% (greutate/vol) inocul. Acordul apropiat al rezultatelor experimentale cu predicția modelului a arătat că modelul a fost precis și de încredere pentru prezicerea producției de exo-β-D-glucozaminidază. A rezultat optimizarea statistică într-o creștere globală a activității exo-β-D-glucozaminidazei de la 116,7 ± 4,6 până la 2335,1 ± 12,4 unități/g substrat uscat inițial. S-a constatat că exo-β-D-glucozaminidaza brută are o activitate optimă la 42 ± 1 °C și pH=5.6. Exo-β-D-glucozaminidaza brută a produs randamentul maxim de D-glucozamină de 410-546 mM din

hidroliza diferitelor substraturi de α-chitosan. Analiza cromatografică în strat subțire a arătat că D-glucozamina a fost singurul produs final al hidrolizei chitosanului. Aceste rezultate au indicat potențialul P. decumbens pentru producerea exo-b-D-glucosaminidazei utilizând procedeul SSF eficient din punct de vedere al costului și semnificația exo-β-D-glucozaminidazei pentru prepararea D-glucozaminei importante din punct de vedere comercial și pentru a face față procesării fructelor de mare cu biomateriale chitinoase. [22]

Sun et al. (2013) au preparat D-glucozamină prin hidroliza chitosanului cu chitozanaza (chitosan N-acetilglucozaminidaza) și β-D-glucozaminidază. Enzimele brute, incluzând chitosanaza și β-D-glucozaminidaza, au fost obținute prin separare centrifugală din mediul de fermentație al Microbacterium sp. OU01. Apoi, enzimele brute sunt folosite pentru a hidroliza chitosanului pentru producerea de D-glucozamină (GlcN). Efectele temperaturii, pH-ului, concentrației de substrat, raportul dintre enzimă și chitosan și timpul de hidroliză asupra productivității GlcN au fost discutate. Rezultatele experimentului au arătat că condițiile optime au fost temperatura de 50 °C, pH 5,8, concentrația substratului 20 mg/ml, raportul optim dintre enzimă și chitosan 1,5 U/60 mg. În condițiile de mai sus, chitosanul a fost
complet hidrolizat în 5 ore. Aceste rezultate oferă un material științific pentru procesul de optimizare a producției enzimatice de GlcN. Mai mult, s-a utilizat cromatografia în strat subțire și cromatografia lichidă de înaltă performanță pentru a analiza produsul hidrolitic, care s-a dovedit a fi GlcN.

Figura 18. Efectul temperaturii asupra producției GlcN. Datele sunt afișate ca medie
± SD (n = 3). Chitosan: (S) = 10 mg/ml, 30 ml; enzima brută: 10,4 U; pH=5.6 (tampon de acetat de sodiu 0,2 mol/l); la temperatură diferită timp de 3 ore; 30 rpm.

Figura 19. Efectul pH-ului asupra producției GlcN. Datele chitosanului sunt prezentate ca medie
± SD (n = 3). Chitosan: (S) = 50 mg / ml, 30 ml; enzima brută: 10,4 U; pH 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8 (tampon acetat de sodiu 0,2 mol / l) 6.0, 6.2, 6.4 (tampon fosfat 0,1 mol/l); 50 °C; 3 ore; 30 rpm.

Figura 20. Efectul concentrației chitosanului asupra producției GlcN. Datele sunt afișate ca
media ± SD (n = 3). Chitosan: 30 ml; enzima brută: 10,4 U; pH=5.6 (tampon de acetat de sodiu 0,2 mol/l); 50 °C timp de 3 ore; 30 rpm. [23]

3. Prezentarea temei de cercetare

3.1. Obiectivele cercetărilor

Prin tema abordată, teza de cercetare se înscrie în principalele direcții de cercetare și dezvoltare ale procedeelor de separare care vizează domeniul biotehnologiilor. Studiile propuse au drept scop studierea posibilității de separare directă a unor compuși (acidul 6-aminopenicilanic, acidul 7-aminocefalosporanic, metilbenzil amina, acetofenona, glucozamina) prin extracție, extracție reactivă, pertracție, in timpul proceselor enzimatice, pentru a mari productivitatea proceselor (prin evitarea inhibiției de produs).

În cadrul temei de cercetare se vor aborda următoarele obiective principale:

Studiul separării directe a unor compuși obținuți prin transformare enzimatică (acidul 6-aminopenicilanic, acidul 7-aminocefalosporanic, metilbenzil amina, acetofenona, glucozamina) din lichide de fermentație (fără îndepărtarea biomasei) prin extracție și extracție reactivă

Studiul separării directe a unor compuși obținuți prin transformare enzimatică (acidul 6-aminopenicilanic, acidul 7-aminocefalosporanic, metilbenzil amina, acetofenona, glucozamina)din lichide de fermentație (fără îndepărtarea biomasei) prin pertracție.

Pentru realizarea acestor obiective se vor studia mecanismul și cinetica proceselor de separare menționate, ale caracteristicilor mediului, precum și ale condițiilor de operare asupra mecanismului interfacial, vitezei transferul de masă și asupra eficienței separării prin extracție reactivă sau pertracție.

3.2 Rezultate potențiale

Studiile vor conduce la realizarea unor contribuții originale cu privire la îmbunătățirea proceselor fermentative integrate cu separarea, prin recuperarea și purificarea compușilor enzimatici direct din mediul de biosinteză. Teza de doctorat va realiza conceperea unui proces integrat, în care operațiile de separare ale produsului să decurgă fără întreruperea procesului de biosinteză.

4. Realizarea experimentală a temei de cercetare

4.1. Planul experimental

4.2. Tehnica experimentală

Echipamentele experimentale, unele de concepție originală și care constituiesubiectul unor brevete, publicate sau cereri de brevet ale colectivului înregistrate la OSIM asigură obținerea unor rezultate deosebite și susțin aportul științific al acestor rezultate pentru experimentele propuse. Cele mai importante echipamente destinate studiilor experimentale menite să soluționeze obiectivele temei de cercetare sunt:

Coloana de extracție cu agitare vibratorie

Aceasta oferă avantajul unei arii interfaciale de contact dintre faze foarte mari și atingeriirapide a echilibrului.

Figura 21. Coloana de extracție cu agitare vibratorie (1 – coloană de sticlă; 2 – manta de

termostatare; 3 – agitator; 4 – pH-metru digital; 5 – termostat).

Instalația experimentală constă dintr-o coloană de sticlă cu diametrul interior de 36 mm și

înălțimea de 250 mm, prevăzută cu o manta de termostatare, prin care circulă agentul termic (un

amestec de apă și etilenglicol) menținut la 25 °C. Contactarea fazelor se realizează cu un agitator

vibrator, alcătuit dintr-un disc perforat cu diametrul de 20 mm și o secțiune liberă de 20%,vibrațiile având frecvența de 50 s-1 și amplitudinea de 4 mm. Poziția agitatorului se situează pe interfața de contact dintre cele două faze, durata extracției fiind de 1 min. Emulsia rezultatăeste eliminată pe la baza coloanei de extracție, fiind, apoi, separată într-un separator centrifugal, la o turație de 6000 rot/min.

Instalația de pertracție (extracție și transport prin membrane lichide)

Acest echipament de separare permite obținerea și menținerea cu ușurință a stratului desolvent organic între cele douăfaze apoase (membrană lichidă liberă) (Figura 23). Elementulcentral al instalației îl reprezintă celula de pertracție, dispozitiv brevetat de colectivul decercetare [163].

Figura 23. Celula de pertracție.

Celula de pertracție este alcătuită dintr-un tub de sticlă în formă de U, având diametrulinterior de 45 mm și volumul total de 450 ml. Compartimentele echipamentului de pertracție care conțin fazele apoase sunt echipate cu câte un agitator cu două palete, cu diametrul interior de 1cm, a cărui turație poate varia între 0 și 1000 rpm. Pentru asigurarea unei viteze ridicate dedifuzie a solutului prin membrana lichidă, faza organicăeste amestecată cu ajutorul unui agitator identic, cu turația constantă de 500 rpm. Aria interfacială de contact dintre faza apoasă inițială și solventul organic, precum și dintre solventul organic și faza apoasă finală, este de 1,59·10-3 m2. Prelevarea probelor s-a efectuat din soluțiile inițiale și de pe traseele de evacuare alefazelor apoase.

Bioreactorul

Bioreactorul utilizat este de tip FerMac 310/60, prevăzut cu un sistem computerizat de monitorizare, control și înregistrare a parametrilor de operare (temperatură, valoarea pH-ului, concentrația oxigenului dizolvat, nivelul spumei, turația agitatorului, debitul de aer barbotat, debitele diferiților componenți care trebuie adăugați în timpul procesului de fermentație etc.).

Experimentele se vor realiza utilizând echipamente moderne, care oferă posibilitatea achiziționării și interpretării datelor experimentale cu un grad ridicat de acuratețe. În figura 24 este redată imaginea unei astfel de echipament:

Figura 24. Bioreactor tip FerMac 310/60, volum util 1litru

pH-metru digital (CONSORT C 836)

pH-metrul se utilizează pentru măsurarea valorii pH-ului soluțiilor apoase pe durataexperimentelor (figura 41). Corecția pH-ului la valorile prestabilite se realizează cu o soluție de 3% acid sulfuric, respectiv cu o soluție de 3% hidroxid de sodiu în funcție de programulexperimental.

Figura 25. pH-metru digital (Consort C 836)

Separator centrifugal MLW T23D

Acest echipament este utilizat pentru separarea emulsiilor soluție apoasă-solventformate în anumite etape ale experimentelor (Figura 26). Uzual, probele sunt supusecentrifugării la 6000 rpm timp de 20 – 30 minute.

Figura 26. Separator centrifugal MLW T23D

Vâscozimetrul rotativ de tipul Viscotester 6 plus (HAAKE)

Se utilizează pentru măsurarea vâscozității soluțiilor de carboximetilceluloză sare desodiu de diferite concentrații, și a suspensiilor de biomasă, înainte și după fiecare experiment înparte (figura 43).Mediile utilizate au vâscozități aparente cuprinse între 1 și 30 cP.

Figura 27. Vâscozimetrul rotativ tip Viscotester 6 plus (HAAKE)

Spectrofotometru UV-VIS Camspec M550

Spectrofotometrul se utilizează pentru determinarea concentrației unor acizi carboxiliciîn faza apoasă inițială și în rafinat, și pentru urmărirea evoluției concentrației biomasei pe parcursul desfășurării proceselor fermentative (figura 44). Determinarea concentrației biomasei se realizează prin citirea densității optice și compararea cu o curbă de calibrare (densitate optică vs

substanță uscată).

Figura 28. Spectrofotometru UV-VIS (Camspec M550).

Cromatograf tip HPLC (UltiMate 3000 Dionex)

Pentru dozarea compușilor de interes se utilizează o stație HPLC având o coloană detip Acclaim Organic Acids OA (diametru 4 mm, lungime 150 mm, porozitatea particulelor 5 μm) și un detector de lungimi de undă VWD 3100RS/ VWD 3400RS (figura 29).

Figura 29. Cromatograf tip HPLC, UltiMate 3000 Dionex

(1 – Pompe de solvent, 2 și 3 – autosampler WPS-3000SL/WPS-3000RS, 4 – compartimentul

coloanei, 5 – RS detector de lungimi de undă, 6 – detector Shodex RI -101).

4.3. Materiale, reactivi

Acidul 6-aminopenicilanic (6-APA)

Acidul 7-aminocefalosporanic (7-ACA)

Benzilmetil amina

Glucozamina

Acetofenona

Extractanți (agenți purtători)

Agenții de extracție (extractanți, agenți purtători) utilizați pentru realizarea separării directe a produselor de biosinteză fac parte din următoarele clase: amine cu masă moleculară ridicată și săruri ale acestora, derivați organofosforici, compuși macrociclici, lichide ionice etc.

Solvenți: n-heptan, acetat de butil

Modificatori de fază: 1-octanol

Enzime

4.4. Metode experimentale

Rezultatele obținute vor fi analizate prin intermediul randamentului separării, al coeficientului de distribuție, al factorului de selectivitate și al fluxurilor masice extrase.

5. Contribuții potențiale la dezvoltarea domeniului abordat

Prin teza de doctorat vor fi aduse o serie de contribuții originale cu privire la: îmbunătățirea proceselor integrate de separare prin extracție, extracție reactivă și pertracție a compușilor enzimatici de interes prin recuperarea acestora direct din mediul de fermentație.

Bibliografie

1. D. Cașcaval, A.I. Galaction (Editori), Biotehnologia între știință și Artă, Venus, Iași, 2007.

2. D. Cașcaval, C. Oniscu, A.I. Galaction, Inginerie Biochimică și Biotehnologie.3. Procese de

Separare, Performantica, Iași, 2004.

3. E. Dumitriu, Biocataliza- introducere în structura, activitatea și aplicațiile enzimelor, VIE Iași, 2003.

4. A. Cârlescu, Contribuții privind extracția directă a unor compuși privind extracția directă a unor compuși de biosinteză din lichidele de fermentație, Teză de doctorat, Iași, 2013.

5. Y. Satyawali, K. Vanbroekhoven, W. Dejonghe, Process intensification: The future for enzymatic processes?, Biochemical Engineering Journal, 2017, 121, 196–223.

6. H. Gröger, M. Pieper, Burghard König, T. Bayer, H. Schleich, Industrial landmarks in the development of sustainable production processes for the β-lactam antibiotic key intermediate 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA), Sustainable Chemistry and Pharmacy, 2017, 5, 72–79.

7. N. L. Mai, Y.M. Koo, Enzymatic hydrolysis of penicillin and in situ product separation inthermally induced reversible phase-separation of ionic liquids/water mixture, Enzyme and Microbial Technology, 2014, 63, 34–38.

8. V. S. Avinash, P. D. Chauhan, S. Gaikwad, A. Pundle, Biotransformation of penicillin V to 6- aminopenicillanic acid using immobilized whole cells of E. coli expressing a highly active penicillin v acylase, Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2016.

9. A. I. Galaction, R. M. Matran, M. Turnea, A. C. Blaga, D. Cașcaval, Engineering aspects of penicillin G transfer and conversion to 6-aminopenicillanic acid in a bioreactor with a mobile bed of immobilized penicillin amidase, Chemical Engineering Communications, 2014.

10. M. A. McDonald, A. S. Bommarius, R. W. Rousseau, Enzymatic reactive crystallization for improving ampicillin synthesis, Chemical Engineering Science, 2017, 165, 81–88.

11. K. Chai, H. Ji, Inclusive Separation of Acetophenone from Petrochemical By-Product with 1-Phenylethanol via Noncovalent Interactions, American Institute of Chemical Engineers AIChE J, 2014, 60: 2962–2975.

12. H. M. Yang, W. Zhao, K. Norinaga, J. J. Fang, Y. G. Wanga, Z. M. Zong, X. Y. Wei, Separation of phenols and ketones from bio-oil produced from ethanolysis of wheat stalk, Separation and Purification Technology, 2015, 152, 238–245.

13. G. Li, Y. Li, R. Mu, Y. Xu, P. Dong, Direct side-chain oxidation of ethylbenzene over supported Co4HP2Mo15V3O62 catalysts as a clean and highly efficient approach to producing

acetophenone, Reac Kinet Mech Cat, 2013, 109:199–212.

14. R. Sekar, S. K. Kailasa, W. S. Li, H. C. Wuc, H. F Wua, Rapid separation of acetophenone and its monohydroxy isomers by capillary electrophoresis, Chinese Chemical Letters, 2013, 24, 833–836.

15. M. Halim, L. Rios-Solis, M. Micheletti, J. M. Ward, G. J. Lye, Microscale methods to rapidly evaluate bioprocess options for increasing bioconversion yields: application to the ω-transaminase synthesis of chiral amines, Bioprocess Biosyst Eng, 2014, 37:931–941.

16. Q. Li, Y. Shi, L. He, H. Zhao, Asymmetric Bioconversion of Acetophenone in Nano-Sized Emulsion Using Rhizopus oryzae, J. Microbiol. Biotechnol., 2016, 26(1), 72–79.

17. M. Bajica, I. Plazla, R. Stloukalb, P. Z. Plazla, Development of a miniaturized packed bed reactor with ω-transaminase immobilized in LentiKats®, Process Biochemistry, 2016.

18. F. Guo, P. Berglund, Transaminase biocatalysis: optimization and application, The Royal Society of Chemistry 2016.

19. L. Kloetzer, I. B. Petrilă-Cocuz, A. I. Galaction, N. Szita, A. C. Blaga, D. Cașcaval, Eco- friendly production of chemicals. 1. Improvement of enzymatic production of acetophenone by direct extraction, Environmental Engineering and Management Journal, 2016.

20. K. Lu, K. Chai, Q. Liang, Z. Xu, G. Li, H. Ji, Biosorption and selective separation of acetophenone and 1-phenylethanol with polysaccharide-based polymers, Chemical Engineering Journa, 2017, 317, 862–872.

21. G. Rehn, P. Adlercreutz, C. GreyLund, Supported liquid membrane as a novel tool for driving theequilibrium of ω-transaminase catalyzed asymmetric synthesis, Journal of Biotechnology, 2014, 179, 50–55.

22. T. Nidheesh, P. G. Kumar, P.V. Suresh, Enzymatic degradation of chitosan and production of D-glucosamine by solid substrate fermentation of exo-β-D-glucosaminidase (exochitosanase) by Penicillium decumbens CFRNT15, International Biodeterioration & Biodegradation, 2015, 97, 97-106.

23. Y. Suna, J. Zhangb, S. Wua, S. Wanga, Preparation of d-glucosamine by hydrolysis of chitosan with chitosanase and β-D-glucosaminidase, International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 61, 160– 163.