Tehnologia de Inmultire In Vitro

CAPITOLUL IV. ACLIMATIZAREA MATERIALULUI VEGETAL OBȚINUT IN VITRO PENTRU REAMENAJAREA SPAȚIULUI PROTEJAT

Aclimatizarea neoplantulelor obținute in vitro este cea mai importantă etapă, pentru a putea spune că tehnologia de înmulțire și conservare a speciilor in vitro este un real succes la speciile din flora spontană (și nu numai). În unitățile specializate în micropropagarea la plante și producerea de material săditor pe calea biotehnologiilor, rata multiplicarii (numărul de plante obținute in vitro) este asigurată de felul cum se desfășoară aclimatizarea plantelor la trecerea în liber (în câmp), la condițiile de viață originale (sau necontrolate, cum ne place să spunem). Capitolul stabilește protecolul de lucru privind tehnologia de înmulțire in vitro, etapele care trebuiesc parcurse în aclimatizarea ex vitro a neo-plantulelor obținute la speciile spontane, din ariile sau sit-urile din jud. Bihor luate în studiu. S-a stabilit protoolul de conservare și de reconstrucție ecologică durabilă la speciile studiate, iar concluziile finale se axează pe protocolul de obținerea a plantelor din flora spontană in vitro.

4.1. Etape obligatoriu de parcurs în aclimatizarea materialului obținut in vitro

Pentru succesul transferului ex vitro un rol important îl are valoarea sistemul radicular, în acest sens starea neoplantulele obținute in vitro se poate afla în două situații: I. INRĂDĂCINATE, neoplantule complet conformate cu un sistem radicular viguros, corespunzător speciei; II. NEÎNRĂDĂCINATE, plantule sau lăstari diferențiați in vitro din țesut caulinar sau alt tip de țesut (exp. boboc sau organe din floare) fără rădăcini (Laslo, 2013). În prezentarea manifestărilor și problemelor care au apărut la trecerea ex vitro a neo-plantulelor obținute in vitro, aflate în oricare din cele două situații (înrădăcinate sau neînrădăcinate), m-am axat pe tatonările și constatările făcute de-a lungul timpului în experiențele întreprinse (Zăpârțan, 2001): pe rezultatele obținute atât la speciile din cultura mare (Agud et al., 2013), la speciile din flora spontană cu o anume stare sozologică (Agud, 2014) sau specii pomicole (Laslo, 2006) , rezultate pe care le-am făcut cunoscute la diferite conferințe, simpozioane și publicații (lucrări mai ample).

A. Neo-plantulele înrădăcinate, nu pun probleme la trecerea ex vitro dacă sunt urmărite cu atenție în primele 7-10 zile de la transferul lor și dacă se evită starea de șoc care poate să apară. Neo-plantulele obținute in vitro pot suferii anumite modificări morfofiziologice care creează starea de șoc, modificări cu variate manifestări, printre acestea amintim câteva în tabelul 4.1.

Tabelul 4.1. Cauze care duc la starea de șoc a neo-plantulelor obținute in vitro la trecerea ex vitro

Sursa: Sutter și Langhans, 1979

Procesul de aclimatizare a plantulelor la trecerea ex vitro, nu este un proces facil, depinzând de unele caracteristici fiziologice concrete a neo-plantulelor diferențiate in vitro: 1. calitatea neo-plantulelor, dacă s-a atins completa organizare a miniplantulelor, aspectul echilibrat între organele aeriene ale plantei (forma, lungimea și numărul tulpinilor; numărul, forma, culoarea și dispoziția sistemului folial, frunzele pe tulpini); 2. valoarea sistemului radicular, numărul și lungimea rădăcinilor diferențiate/ pantulă. La trecerea neoplantulelor în susbstratul de cultură, trebuie aplicată protecția împotriva deshidratării (un clopot de sticlă sau orice alt sistem transparent) deasupra plantulelor (primele 7-8 zile după scoaterea din vitro), acesta asigură o protecție și împotriva curenților de aer, temperaturii și luminii directe, echilibrând acești factori (Laslo et al., 2011a). Pentru înlăturarea pericolul de infecție din sol și din atmosferă, trebuie intervenit prin dezinfecția inițială a solului și chiar a plantulelor, prin tratament cu substanțe slab fitotoxice în concentrație mică (de exemplu 5-10mg/l tiram, TMTD), iar plantulele cu o soluție foarte diluată de fungicid (Boxus et al., 1995). Adaptarea plantulelor la noul regim de viață, în liber este sub influența umidității care trebuie să fie mai ridicată, a luminii a cărei intensitate trebuie să fie mai intensă și a condițiilor de perfectă sterilitate ( Jorge et al., 2000, citat de Cachiță, 2009).

Durata etapei de protecție sub clopot de sticlă, poate fii de cca. 3 săptămâni, iar aclimatizarea propriu-zisă până la chiar 4-5 luni, deci durata aclimatizării la unele specii poate ajunge la 4-5 luni. Se vehiculează și susține ideea că, neo-plantulele trebuie pregătite prealabil chiar în timpul vieții in vitro, prin administrarea unei intensități luminoase de 3-10 ori mai mare, pentru dezvoltarea anatomo-morfo-fiziologică normală a sistemului foliar a noilor plante(Murashige and Skoog, 1962). Apariția modificărilor de la nivelul sistemului folial apărut atât în camera de creștere, dar și la contactul cu condițiile din hotă (deși sterile) se datorează unor factori considerați obiectivi (natura speciei și starea fiziologică a neo-plantulelor, compoziția mediului, condițiile din camera de creștere etc.): starea precară a plantelor cerând rapid transferul în alte condiții pentru salvarea lor(Cachița et al., 2004). Se recomandă aplicarea tratamentelor antifungice sau chiar preparate cu micorize simbionte, care asigură o nutriție mai bună și reducerea stresului (Gianinazzi et al., 1989). Inocularea plantulelor pe un substrat cu micorize , prealabil plantării ex vitro (la vița de vie, pomi fructiferi, căpșuni etc.), duce la formarea unui sistem radicular caracteristic fiecărei specii bine dezvoltat și ramificat, bun pentru al doilea an de viață în liber(Rapparini et al., 1994). Posibilitatea aplicării irigațiilor succesive, iar la nivelul plantelor dezvoltate din tubercul și chiar tratamente foliare sunt benefice (Levy, 1985, citat de Cachița, 2004). Diferențierea tuberculilor de cartof in vitro și aclimatizarea acestora ex vitro depinde de starea fiziologică, de modul cum sunt respectate fazele aclimatizării, de natura populațiilor a soiurilor sau fenotipurilor înmulțit in vitro. Populațiile și soiuri autohtone au procent de aclimatizare dublu față de soiurile străine, care s-au adaptat mai greu la condițiile de la noi (Agud et al., 2013).

B. La trecerea ex vitro a neo-plantulelor neînrădăcinate in vitro trebuie controlat regimul termic în spațiu (sere, răsadnițe etc.), iar în substratul de plantare umiditatea, care nu trebuie să fie excesivă pentru a evita fenomenul de hipoxie (starea de anaerobioză), care ar duce la scădere capacității de înrădăcinare la transfer. Substratul poate fi din turbă, nisip, perlit sau vermiculit (roci expandante), iar prealabil, trebuie tratat împotriva agenților firopatogeni ai solului (Zăpârțan, 2001). Înrădăcinarea neoplantulelor, va avea loc în cca. o lună sau mai repede dacă este stimulată înrădăcinarea cu pudre sau soluții rizogene, cu rol în formarea rădăcinilor : exp. auxinele (Neamțu și Irunie, 1991). Efectul concentrației pudrelor sau a soluțiilor cu adaos auxinic asupra înrădăcinării, depinde de specie, natura substratului, fazele lunii (lună plină sau în creștere), când activitatea din țesut și procesele din plantă sunt intensificate (Zăpârțan, 1996).

Obținerea unui material sănătos in vitro (la speciile din flora spontană, la soiurile și speciile din cultura mare) asigură schimbul intern sau extern de plante obținute in vitro, care se bazează pe restricții care se impun între state și care asigură un schimb internațional are unele avantaje față de cel recoltat din liber. [NUME_REDACTAT] schimbul de material vegetal în general este bine reglementat, prin norme stabilite de fiecare stat membru al UE, deoarece odată cu creșterea schimbului de material vegetal se intensifică și preocuparea de găsire a unor soluții care să preîntâmpine introducerea unor agenți patogeni într-o altă țară (Martin și Pstman, 1999). Sănătății materialului obținut in vitro se poate realiza și prin folosirea markerilor moleculari pentru identificare și eliminarea infecțiilor (Ng. Et al., 1999).

Dorim să acordăm o atenție deosebită culturilor fotoautotrofe obținute in vitro, care au o capacitate de adaptare la trecerea plantelor la cultura ex vitro (Cristea, 2010), sunt cultivate pe medii lipsite de sursa de carbon și de sursa glucidică, într-o atmosferă îmbunătățită cu CO2 (dezvoltă exclusiv fotosintetic), chiar și fotosinteza și ametabolismul fotoautotrofelor sunt similare plantelor verzi din natură, având un statut de ceară epicuticulară foarte subțire (Sutter și Langhans, 1979). Față de culturile clasice in vitro, ele trec facil de la nutriția heterotrofă la nutriția fotosintetică având la bază unele avantaje majore : material liber de boli și dăunători, utilizarea luminii artificiale și explante mult mai mici ca dimensiune, de milimetrii (Kozai et al., 2000).

Rezultate preliminare privind speciile spontane experimentate

Acest subcapitol este conceput pentru a scoate în evidență relația dintre aspectul organizatoric al neo-plantulelor obținute in vitro și capacitatea lor de aclimatizare (exprimată procentual), cu referire specială la sistemul radicular, cunoscut ca aspect esențial în aclimatizare (Laslo et al., 2011). Astfel, am recurs la o sinteză prezentată în tabelul 4.2., care cuprinde unele variante de mediu experimentate la cultura celor patru specii conservate in vitro: Campanula rotundifolia L., din sit SCI – [NUME_REDACTAT]; Dianthus spiculifolius, sit-rile [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT], Drosera rotundifolia Huds. sit-ul [NUME_REDACTAT] și Narcissus poeticus L aria protejată Poiana cu Narcise comuna Alparea (jud. Bihor) (Agud, 2014). Variantele luate în studiu comparativ și specificate în tabel au fost alcătuite din acele variante cu rezultatele cele mai concludente, comparându-le cu proba martor. Mai jos sunt prezentate rezultatele pe specii.

Tabelul 4.2. Capacitatea de aclimatizare in vitro la speciile experimentate raportată la valoarea sistemului radicular

Sursa: proprie

Campanula rotundifolia L. ssp. Polimorpha: sit [NUME_REDACTAT], specie rară (R)

Înmulțirea speciei Campanula rotundifolia L., in vitro este dependentă de natura speciei, de compoziția mediului de cultură (natura și concentrația firohormonilor), vârsta plantei mamă, tipul de explant, faza fiziologică a țesutul și perioada când este prelevat explantul. Urmărind tabelul 4.2. constatăm că pe varianta pe care s-a dezvoltat cel mai bun sistem radicular se obține și cel mai bun procent de aclimatizare. Experimentele pe această specie dar și pe altele confirmă stimularea diferențierii rădăcinilor pe medii cu auxină (AIA – la Campanula) și procentul bun de aclimatizare funcție de valoarea sistemului radicular (Agud, 2014).

Urmărind graficul 4.1. constatăm că la cultura in vitro a speciei Campanula rotundifolia procentul de aclimatizare are valori ceva mai mici la neoplantulele cu sistem radicular bun (70-90%) procentul de aclimatizare este semnalat doar la acestea și este de 27-35%, credem că pentru mărirea procentului de aclimatizare trebuie să intervenim în unele faze ale aclimatizării plantulelor (poate o protecție mai îndelungată sun clopot de sticlă și tratament la sol).

Graficul 4.1. Evoluția sistemului radicular comparativ cu capacitatea de aclimatizare (%) a neo-plantulelor de Campanula rotundifolia L

Sursa: Agud, 2014

4.2.2. Dianthus spiculifolius: sit [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT], critic periclitată (CP)

Dianthus spiculifolius (Fam.Caryophyllaceae), specia care a făcut obiectul de cercetare în acest studiu experimentate provine din ariile protejate ale PNMA (situ-ri comunitare, din Bihor) și este specie critic periclitată (CR). Materialul vegetal folosit pentru înmulțire in vitro a speciei Dianthus spiculifolius a fost format din țesut meristematic – apex. Multiplicarea in vitro a speciei Dianthus spiculifolius este determinat de prezența în mediul de cultură a Z și BA în doză moderată (1mg/l) sau poate chiar mai mare și o doză foarte mică de auxină (AIB-0,5mg/l).

Aclimatizarea la condițiile ex vitro și la această specie este analizată în raport cu valoarea sistemului radicular diferențiat in vitro, cunoscut fiind că, cu cât sistemul radicular este mai viguros și procentul de aclimatizare este mai mare. Procentul cel mai bun de înrădăcinare de 23 respectiv 25%, pe variantele cu citochinine (V2 și V3) aduc după sine și cel mai bun procent de aclimatizare de peste 50% . Urmărind graficul 4.2. constatăm relația direct proporțională dintre prezența auxinei chiar în doză mică, AIB – 0,5mg/l (auxina fiind implicată în formarea rădăcinilor) și valoarea sistemului radicular (Cachiță, 1987). Doza moderată de citochinine, în combinație cu o auxină în concentrație mică, este asociată cu capacitatea de formare a sistemului radicular, ceea ce duce la un procentul superior de aclimatizare, situat între 44 – 52% (Agud, 2014) și redat sugestiv în graficul 4.2.

Graficul 4.2. Evoluția sistemului radicular comparativ cu capacitatea de aclimatizare (%) a neo-plantulelor de Dianthus spiculifolius

Sursa: proprie

Valorile procentului de aclimatizare obținute pe varianta de control (Vo) sunt scăzute, ca de fapt și procentul de neoplantule înrădăcinate (graficul 4.2.), putem astfel concluziona necesitatea prezenței fitohormonilor pentru o evoluție bună a speciei sub toate aspectele așa cum o confirmă și alte experimente la alte specii din flora spontană (Zăpârțan, 2001).

4.2.3. Drosera rotundifolia Huds: sit [NUME_REDACTAT], specie critic periclitată (CP)

În micromultiplicarea in vitro a speciei Drosera rotundifolia Huds. via explant (boboc), avantajul tehnicii fiind obținerea plantulelor pe medii cu doze echilibrate de fitohormoni și la un preț de cost convenabil (Laslo et al., 2011a). Evoluția bobocului de drosera este favorizat la toți parametrii urmăriți de prezența citochininelor în mediul MS în doză moderată de 1mg/l(BA și Z) în combinație cu o auxină în doză mică 0,5mg/l (ANA), stimulând atât capacitatea regenerativă cât și diferențierea sistemului radicular (tabelul 4.2.).

Procentul de aclimatizare la specia Drosera rotundifolia este cuprins între 50 -55%, pe variantele pe care s-a diferențiat un sistem radicular, de până la 30 – 35% pe variantă. Auxina în mediul de cultură (ANA) favorizează înrădăcinarea plantulelor de drosera și mărește procentul de aclimatizare, efectul auxinelor în înrădăcinare fiind cunoscut și la alte specii (Neamțu și Irimia, 1991). Graficul 4.3. prezintă procentul de înrădăcinare raportat la proba martor (Do), figură care marchează sugestiv și procentul de aclimatizare a speciei pe variantele cu fitohormoni (D1 și D2).

Graficul 4.3. Evoluția sistemului radicular comparativ cu capacitatea de aclimatizare (%) a neo-plantulelor de Drosera rotundifolia [NUME_REDACTAT]: proprie

4.2.4. Narcissus poeticus L., aria protejată „Pădurea cu narcise din Alparea", specie vulnerabilă (VU)

La specia Narcissus poeticus L s-a urmărit evoluția explantului constând din secțiune de solz cu porțiune de disc, funcție de durata tratamentului cu frig, perioada din an când se aplică tratamentul, compoziția mediului de bază și a variantelor hormonale concepute și prezentate în tabel 4.2. Este cunoscută necesitatea perioadei de vernalizare sau iarovizare aplicată speciilor bulboase pentru desăvârșirea inducției florale, înfloritului (Tampsett, 1980). În experiențele întreprinse la unele soiuri de narcissus și hyacinte etc., specii ornamentale (Narcissus și Hyacinthus hybridus), tratamentul cu frig aplicat bulbilor într-o anume perioadă din an, s-a dovedit eficient în stimularea diferențierii bobocului floral. De asemenea substituirea frigului prin injectarea în bulb a unei soluții de giberelină (GA3 în diferite concentrații) a substituit frigul și a stimulat inducția florală, asigurând înflorirea timpurie a soiurilor de bulboase experimentate (Zăpârțan, 1990).

Condițiile de incubare in vitro: în cazul acestor tipuri de explante la solzii detașați din bulb este necesară o perioadă de menținere a flacoanelor cu explante (cca. 4-5 zile) la întuneric (Zăpârțan, 2004)cu efect favorabil asupra regenerării și diferențierii de minibulbili in vitro (Laslo et al., 2011). Menționăm efectul condițiilor de incubare in vitro aplicate explantelor din boboc tânăr detașată de la inflorescența speciei Clivia miniata și a tratamentului cu întuneric pentru inducția florală (Zăpârțan, 1992).

Experimentele s-au inițiat pe mediu de bază după Gamborg (B5), pe mediu fără hormoni (Bo) și pe variantele cu hormoni B1 și B2 (tabel 4.2.), pe care s-a diferențiat cca. 3-4 bulbili/explant de cca. 2-4 mm, până la 0,7cm Ø, material care asigură capacitatea de aclimatizare și înmulțire a speciei de 30-35%, funcție de mărimea bulbului și parcurgerea fazelor de aclimatizare. Graficul 4.4 prezintă capacitatea regenerativă a speciei Narcissus poeticus L, în raport cu formarea bulbilor in vitro, material vegetal de înmulțire și aclimatizare ex vitro.

Graficul 4.4. Capacitatea regenerativă în raport cu formarea bulbililor in vitro la specia Narcissus poeticus L., material vegetal de înmulțire, aclimatizat ex vitro

Sursa: proprie

4.3. Metode de conservare a speciilor de plante in situ și ex situ

Conform datelor [NUME_REDACTAT] de Conservare a Naturii, 2006 (UICN), ritmul dispariției speciilor pe glob este de 100 până la 1000 de ori mai alert decât cel natural: factorul antropic făcând ca una din 8 specii de plante să fie amenințate cu extincția ([NUME_REDACTAT] de Conservare a Naturii, 2006). [NUME_REDACTAT] din 1998 cca. 100 de specii amenințate sunt incluse în programe de restaurare in situ, cu măsuri de conservare ex situ, iar cca. 35% din taxoni se află într-un program de minimă protecție. Conferința asupra biodiversității (Rio de Janeiro, 1992) stabilește principiile și strategiile de conservare atât in situ cât și ex situ (tabelul 4.3.).

Tabelul 4.3. Strategii și principii de conservare ex situ

Sursa : Conferința asupra biodiversitții de la Rio de Janeiro, 1992

Conservarea „in situ”, la locul de origine, se considera că numai aici specia își desfășoară normal ciclul biologic, ”este singura posibilitate reală de a proteja speciile de plante periclitate și de a conserva comunitățile biologice și ecosistemele din care fac parte” (Boșcaiu, 1994), considerată soluția optimă în strategiile de conservare. Conferința asupra biodiversității de la Rio presupune: planuri de management (localizarea spațiului și caracterizarea planului), monitorizarea (metode și tehnici de utilizare în monitorizare), protecție a habitatelor unde se găsesc speciile de plante rare și vulnerabile, planuri de recuperare chiar și a unei singure specii periclitate, acțiuni de reconstrucție ecologică.

Conservarea ex situ în afara habitatelor naturale ([NUME_REDACTAT], spații verzi amenajate, bănci de gene, laboratoare de culturi de țesuturi și colecții de plante in vitro), unde se reduce pericolul extincției; cu strategii care asigură readaptarea și reconstrucția ecologică a ariei și a speciei periclitate. Sistemele de conservare „ex situ” sunt:

A. în Colecții tematice (în [NUME_REDACTAT]; Institute de Cercetări) Colecții: de lucru: active și de bază (pentru conservare pe termen lung). Dezavantajul: volum mare de muncă de spațiu și consum de energie (Engelamn și Engels, 2006).

Grădinile botanice au rol de autoritate recunoscută în determinarea plantelor și în acțiunile de conservare. În țară sunt trei mari [NUME_REDACTAT] pe lângă Universități (Cluj-Napoca, Iași și București), în ordinea înființării și importanței științifice. Acțiunile de conservare ex situ au și rol educativ, de înființare de colecții de plante, având în vedere nu numai filogenia speciilor, dar și colecții de plante de importanță economică (agricole, silvice etc.), medicinală, aromate, condimente etc. La începutul înființării lor grădinile botanice aveau în custodie ariile protejate și rezervații naturale din regiunile apropiate (Cristea, 1995).

B. „Băncile de gene” (Conservatoare de germoplasmă și de țesuturi și celule de plante) includ semințe, fructe, celule și țesuturi in vitro, embrioni etc. conservate sau criostocate (la -198oC), la temperaturii joase (Halmágyi și Keul, 2007). În băncile de gene se găsesc culturi : ortodoxe = care se pot dezhidrata ușor și rezistă la temperaturi până la -20oC recalcitrante = care nu rezistă la temperaturi scăzute ; liofilizate = care pot fi păstrate la temperaturi negative numai după o perioadă de tratament cu crioprotectori și deshidratare în vid: se poate realiza pe termen lunga la -196oC, pe termen scurt la -70 : -100oC, și temporar la 1-9oC.

Sunt adevărate colecții de semințe (germoplasmă), de aceia se mai numesc și „bănci de semințe” și cuprind atât plante sălbatice cât și cultivate. Activitatea băncilor se desfășoară prin colectarea de semințe de la speciile de interes economic și nu numai (depinde de spațiul băncii), specii periclitate etc., unde sunt depozitate perioade lungi de timp, la temperatură și umiditate redusă, după perioada de păstrare, trebuie să aibă putere de germinație. După CGIAR , în lume sunt peste 50 de „Bănci de Gene” de semințe organe, țesuturi, coordonate de acest grup. Conservarea în aceste condiții ridică unele probleme: nu este suportată de specii „recalcitrante” cu putere de germinație mică (săptămâni, zile, ore) și specii care nu tolerează temperaturile negative (Halmágyi și Keul, 2007).

C. Culturi „in vitro” (laboratoare de Biotehnologii a Institutelor de cercetare, Centre de cercetare și învățământ, universități). Prin micromultiplicare in vitro, în condiții controlate și pe medii de cultură aseptice echilibrate, cu avantajul obținerii unui număr mare de plante identice cu planta mamă, pornind de la un organ, secțiune de organ, țesut, celulă, calus, meristem etc. Dar și cu dezavantaje: pregătirea unui personal calificat, existența unei baze materiale: care pot fi diminuate prin găsirea unor metode simple de obținere in vitro a materialului vegetal și prin numărul mare de exemplare (de ordinul sutelor) care se poate obține (Ronse , 1990).

Sistemului de conservare a speciilor de plante prin metode neconvențională de micropropagare in vitro este o preocupare de mare interes, cu o multitudine de avantaje dar și dezavantaje (Cachiță, 1987). În programul de conservare a plantelor in vitro trebuie ținut cont de anumite condiții sau aspecte cu influență determinantă în succesul tehnologiei, legate de: natura și valoarea biologică a speciei, tipul de tehnică aleasă, logistica necesară (baza materială, aparatură și materialele necesare, personal cu studii superioare și medii specializat în domeniu etc., măsuri pentru succesul metodei, ca de exemplu asigurarea unui grad de rentabilitate la aplicarea metodei (Zăpârțan, 2001).

Procesul de micropropagare, de microînmulțire sau înmulțire in vitro, din perspectiva conservării materialului vegetal, a speciilor periclitate prin această tehnică se poate defini „ca o formă de înmulțire vegetativă, proces de stimulare a diferențierii țesutului sau explantului, care asigură obținerea unui material vegetativ superior ca număr și aspect, față de alte procedee de înmulțire clasice, bine cunoscute”. Tehnica prezintă avantaje multiple dat și un număr mic și nesemnificative de dezavantaje, realizându-se pe mai multe căi.

Protocolul de lucru pentru înmulțirea plantelor in vitro

Înmulțirea in vitro a speciilor din flora spontană în scopul conservării lor și repopulării habitatelor naturale, urmărește obținerea unui număr mare de plantule într-un timp relativ scurt, identice fenotipic și genotipic cu planta mamă pe care dorim să o conservăm și de la care s-a prelevat țesutul (Laslo et al., 2011a). Pentru inițierea culturii, se poate folosi un singur explant (o plantă mamă, o sămânță, o frunză, un apex, un meristem, o celulă etc.), fără a fi compromise plantele din natură și așa puține (Laslo et al., 2011b). Fiecare organ din plantă: sămânță sau parte din plantă (rădăcină, frunză, tulpină, floare etc.), are capacitate proprie de regenerare și multiplicare (Agud, 2014).

Cercetările au dovedit că speciile spontane rare, periclitate și vulnerabile se pretează la înmulțirea in vitro. De reținut faptul că specia cultivată in vitro, trebuie să aibă stabilită exact aria de proveniența, cunoașterea categoriei sozologice în care se încadrează, cronologia și arealul de răspândire a speciei, asigură succesul repopulării locului de origine sau a unui spațiu arhitectural peisagist.

Succesul tehnicii de cultură in vitro a plantelor depinde de specie, de capacitatea ei de adaptare la condițiile in vitro și de reluare a metabolismul. Natura, proveniența plantei, vârsta explantului, capacitatea regenerativă a țesutului și perioada din an când se inițiază cultura, joacă rol esențial în reușita tehnicii, iar factorii microclimatici din camera de creștere, trebuie reglați după cerințele speciei (Cristea et al., 2004).

În conservarea speciilor de plante superioare, semnalul de alarmă asupră stării sozologice a lor îl dau „listele” și „Cărțile roșii (Boșcaiu et al., 1994), care cuprind speciile periclitate după categoriile UINC, și care trebuie actualizate periodic. Starea sozologică a speciei joacă rol esențial, fapt pentru care listele și cărțile roșii a plantelor sunt adevărate mărturii a nevoii de conservare a elementului botanic rar și periclitat cu extincția (Olteanu et al., 1994).

Operațiuni ale etapelor de micropropagare.

Fiecare etapă a procesului de propagare in vitro conține operațiuni specifice sau intervenții atât în etapa premergătoare cât și la celelalte etape de inoculare, incubare, subcultură, transfer, aclimatizare etc. Deosebim două grupe mari de operații, fiecare cu faze sau etape în desfășurare (Cachiță, 1987):

Operații necesare înaintea începerii procesului de lucru la masa de suflat aer steril (hota). În aceste operații sunt incluse în principal pregătirea sticlăriei de laborator necesară, prin sterilizarea acesteia. Spălarea vaselor pentru mediu, clătirea cu apă bidistilată împachetarea lor în alufolie și introducerea la condițiile de etuvă, odată cu strilizeazarea vasele de laborator, borcane, pipete, etc.,

Operații premergătoare procesului de micropropagare. Inițial începerii declanșării etapelor de multiplicare in vitro se pregărește camera sterilă, hota (cu aer steril) prin dezinfectare cu spirt. În masa hotei se introduc vasele cu mediile de cultură, instrumentarul (bistriu, pense, anse, etc.), vasele (orice vas de care avem nevoie), Petri, borcanele cu apă sterilă și alte vase pentru evacuarea apei rezultate de la clătirea materialului vegetal dezinfectat, tampoane de vată, sisteme de acoperire a flacoanelor cu mediu etc. Instrumentarul se dezinfectează prin flambare până la roșu înainte și chiar după sterilizarea materialului vegetal (Zăpârțan, 2001).

Tabelul 4.4. Fazele generale ale micromultiplicării (înmulțirii) vegetale

Sursa : proprie

Operațiile generale (care se pot schimba după caz) în procesul de micropropagare, modul și ordinea operațiilor sunt prezentate în tabelul 4.4. Tabelul 4.4 prezintă cele 8 etape generale care trebuie urmate la o cultură vegetală înmulțită in vitro. Fiecare dintre etape necesită o prezentare mai amplă fapt pentru care se insistă asupra substanțelor chimice sterilizatoare (dezinfecției), concetrația și durata tratamentului. Substanțele folosite sunt: hipoclorit de calciu și natriu în conc. de 2-10% (5-30min.); apă oxigenată 10-12%; apă bromată cca. 2% (10-15 min.); azotat de argint 1% (30min); clorură mercurică 1% (2-10min)și antibiotice 4-40mg/l (30-60min) (Street, 1977). În afara substanțelor amintite se pot folosi cu succes clorura de var, cloramină, recomandându-se tatonări inițiale, pricind concentrația și durata tratamentului funcție de specie (Margara, 1982).

Figura 4.1. SCHEMA micropropagării in vitro la plantele vasculare

Sursa : ( Cachița et al., 2004)

Generalități privind reconstrucția ecologică a ariilor protejate

Monitorizarea biodiversității ariilor protejate stabilește starea lor și un plan de refacere prin reconstrucție ecologică a acestor zone, pentru a ajuta ecosistemele să intre în funcțiile și dinamica lor normală. Reconstrucție ecologică ca proces natural a fost definită la sfârșitul secolului trecut de S.E.R., care consideră acțiunea „Procesul de modificare intenționată a unui areal pentru crearea unui ecosistem definit, autohton, istoric în scop de a reface structura, funcțiile, diversitatea și dinamica specifică ecosistemului”. Principiile care stau la baza reconstrucției ecologice sunt prezentate în tabeul 4.5.

Tabelul 4.5. Principiile reconstrucției ecologice

Sursa : Cairns și Heckman, 1996

Reconstrucției ecologice are ca scop redarea funcțiilor inițiale ale ecosistemului, pentru care se aplică monitorizarea biodiversității ariilor protejate afectate de factorii meteo-climatici externi, dar și de cei antropici. Astfel, specialiștii vor contribui la refacerea habitatelor și ecosistemelor degradate (Daiy, 1995). Acțiunile de conservare a biodiversității uneori intră în conflict cu necesitățile reale ale omenirii, așa că specialiștii recunosc importanța dezvoltării economice și durabile a resurselor, cu o mulțime de avantaje (exp. creșterea locurilor de muncă) cu minimizarea impactului asupra mediului și cu îmbunătățirea organizării în exploatarea mediului (Vădineanu, 1998).

Priorități în conservarea și reconstrucția ecologică a ariilor protejate pentru durabilitatea lor

Prioritar în conservare este prevenirea extincției speciilor: prin reducerea periclitării speciilor pe întreg arealul; prin protejarea speciilor reprezentate singure a genului sau familiei; prin monitorizarea familiilor sau genurilor monotipice (conservate cu prioritate față de cele politipice); prin protejarea în ordinea priorității speciilor (periclitate, vulnerabile și apoi rare); ca și speciile cu distribuție restrâns-limitată trebuie monitorizate chiar dacă nu sunt periclitate (conform normelor IUCN/UNEP/WWF din 1980). Ariile protejate inițial au fost create pentru a conserva doar anumite specii care demonstrau starea ecosistemului, ariile protejat sunt arii reprezentative pentru mai multe comunități biologice, iar sistemul național de arii protejate asigură protecția mai eficientă prin includerea tipurilor majore de ecosisteme. Convenția de la Berna (1979) a luat măsuri concrete pentru cercetarea și înmulțirea speciilor rare, măsuri de prevenire a unor pericole sub îndrumarea UICN (Maunder și Higgens, 1998), precum și unele măsuri neconvenționale adoptate de statele europene ulterior prin dezvoltarea băncilor de gene.

[NUME_REDACTAT] pe lângă înființarea de arii protejate, publicații, conferințe etc., în scopul conservării naturii, amintim și acțiuni științifico–sintetice, care constau în elaborarea și reactualizarea „listelor roșii” și a „Cărții roșii” (Dihoru și Negranu, 2009), care cuprind speciile periclitate din România și o mulțime de monografii ale speciilor care cad în sfera de activitate a sozologiei, cu anumit statut de periclitare, prezentate prin econografii, hărți corologice, ordonarea alfabetică a taxonilor: sunt adevărate lucrări academice a specialiștii din domeniu.

Folosirea categoriilor UICN a evidențiat existența pe glob a unui număr de cca. 60.000 de specii de plante amenințate și cuprinse în listele roșii de plante. Încă din 1994 IUCN, stabilește un criteriu de clasificare a speciilor de plante, bazat pe posibilitatea riscului la extincție, prezentând cele trei categorii și evaluarea lor cantitativă (Regan et al., 2000): Specii amenințate în fază critică: cu un procent de dispariție de 50% în următorii 10 ani sau ultimile 3 generații (în caz de durată mai mare de viață); Specii amenințate: cu o probabilitate de 20% dispariție (într-o perioadă de 20 ani sau cinci generații); Specii vulnerabile: cu 10% probabilitatea de dispariție în ultima 100 de ani (IUCN, 1994b). O specie devine vulnerabilă în majoritatea țărilor europene, deși este sub protecție oficială (fiind deja pe lista roșie a speciilor în pericol), totuși se află într-un declin continuu (Primack, 2002). În stabilirea acestor categorii se prevede că speciile vor fi reduse la 80%, la fel ca și speciile care conțin un număr foarte mic de indivizi. Informațiile primite au stabilit categoriile sociologice de pe teritoriu țării noastre, încadrarea taxonomică a acestor categorii fiind lovite de o oarecare subiectivitate.

Aspecte de reconstrucție ecologică a ariilor protejate luate în studiu (jud. Bihor)

În abordarea acestui aspect de referim cu precădere la speciile experimentate și care au fost conservate prin tehnica de micromultiplicae in vitro. Amintim speciile și arealele de unde a provenit planta mamă donatoare de explant pentru inițierea culturii in vitro: Campanula rotundifolia L., din sit SCI – [NUME_REDACTAT], explantul a constat din boboc tânăr detașat de la planta mamă din situ-ul [NUME_REDACTAT]; Dianthus spiculifolius, de la care s-a detașat apex (vârf vegetativ de creștere) de la planta mamă din ariile: sit-rile [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT], Drosera rotundifolia Huds. s-a multiplicat in vitro pornind de la boboc juvenil recoltat de la plante mamă mature din sit-ul [NUME_REDACTAT]; Narcissus poeticus L s-a înmulțit in vitro din bulb matur tratat cu temperaturi scăzute recoltat din Poiana cu Narcise comuna Alparea (Agud, 2014). Plantulele formate s-au obținut printr-un protocol care a urmărit exact etapele de regenerare și multiplicare a neo-plantulelor in vitro.

[NUME_REDACTAT], E., (2014), "Vulnerable and protected endemic species from the protected areas of [NUME_REDACTAT]. Their conservation through in vitro multiplication", Internati. Symp. "Risk factors for environment and food safety" & "Natural resources and sustainable development", în: [NUME_REDACTAT] din Oradea, Fascicula: [NUME_REDACTAT],vol.XXIII, Ed. Univ. Oradea; pp.553-565,

Agud E., (2014) " Campanula rotundifolia L. species endangeres with extinction, conserved through in vitro techniques ", în: [NUME_REDACTAT] din Oradea, Fascicula : [NUME_REDACTAT],vol.XXIII, Ed. Universității din Oradea ,pp.565-577,

Agud, E.M., Laslo, V., Zăpârțan, M., (2013), Factors with diferentiated implication in the in vitro minituberizațion at some potato varieties (Solanum tuberosum L.), în: Book of Abst., UAB-B.E.N.A. Intern. [NUME_REDACTAT] Engineering and [NUME_REDACTAT], Alba-Iulia,

Agud, E., Zăpârțan, M., and Laslo V., (2013), The influence of the moment of sampling of the potato meristem over the in vitro regeneration and differentiation capacity, in: The XII [NUME_REDACTAT] Prospects for the 3-rd. millennium Agriculture, Cluj-Napoca, la 26-28 [NUME_REDACTAT] vol II, 102,

Boșcaiu, N., Gh. Coldea, C. Horeanu, (1994), Lista roșie a plantelor vasculare dispărute, periclitate, vulnerabile și rare din flora României, Ocrot. Nat. Med. Înconj., 38 (1); p. 56,

Boxus, P., Jemmali, A., Piéron, S., (1995), Micromultiplication végétative-la micropropagation in: Biotehnology végétales, Ed. Demarly; Y., Picard, E., Boxus, P., CNED; Inst., de Rennes, France; p. 5-116,

Cachiță, C.D, (1987), Metodele in vitro la plantele de cultură, Ed. CERES, Cluj – Napoca, pp. 30-42,

Cachiță, D., Deliu, C., Racosz, L., (2004). Tratat de biotehnologii vegetale, Vol I, Ed. Dacia, Cluj-Napoca,

Cachiță., D.. Ardeleanu, A., (2009), Tratat de biotehnologie vegetală, Vol. II., Ed. Dacia, Cluj,

Cairns J., și Heckman J. R., (1996), Restoration ecology: The state of an emerging field. [NUME_REDACTAT] of Energy and the Environment 21: 167-189,

Coldea, Ghe., Fărcaș, S., Ciobanu, M., Hurdu, B., Ursu, T., (2008), Diversitatea floristică și fitocenotică a principalelor situri protejate din [NUME_REDACTAT] Apuseni,

Cristea V., (1995), La conservation de la nature en Roumanie, Univ. degli [NUME_REDACTAT] (Macerata) Italia,

Cristea, Victoria., M. Miclăuș, M. Pușcaș., C. Deliu, (2004), Conservative micropropagation of some endemic or rare species from the Dianthus L. genus. In: In vitro Cult. and Hortic. Breeding, Fifth IV CHB [NUME_REDACTAT], as therorz and Practice in Horticulture, p. 3-13,

Cristea, Victoria, 2010, Culturi in vitro fotoautotrofe la speciile de Dianthus endemice și periclitate din România, Ed. Todesco, Cluj – Napoca;

[NUME_REDACTAT], EAL., (1984), The rol of in vitro techniques in germoplasm conservation. In: Holden, JHW., Williams, JT., (eds.), [NUME_REDACTAT] Resources: Conservation and Evaluation, Allen and Unwin, London, pp. 131-137,

Dihoru, Gh., Negranu, G., (2009), Lista roșie a plantelor vasculare din România, Ed. Acad. Ro.,

Engelman, F., (1997), In vitro conservation methods. În: Callow, JA., FordțLoyd BV, Nrwbury, HJ., (eds.) Biotehnology and [NUME_REDACTAT] Resources, pp. 120-160,

Engelamn, F., Engels, JMM., (2006), Botanic gardens and agricultural genebanks: building on complementary strengths for mor effective global conservation of plant genetic resources. PGR Newletter, 13l pp. 50-54,

Halmágyi A., Butiuc-Keul, (2007),Conservarea resurselor genetice vegetale, Ed. Todesco, Cluj-Napoca, 2-4,

Kozai, T., Kubota, C., Zobayed, S., Nguyen, Q. T., Afreen-Zobayed, F., Heo, J., (2000), Photoautotrophic micropropagation. În: Proc. [NUME_REDACTAT] on Contamination and Aclimatization management in Plant cel land [NUME_REDACTAT],. Bangkok,

Laslo, V., Vicaș, S., Agud, E., Zăpârțan, M., (2011a), "Methods of conservation of the plant germplasm. In vitro techniques", în: [NUME_REDACTAT]. Oradea, Fas. P.M, vol.XVI B, Ed. Univ. Oradea,

Laslo, V., Zăpârțan, M., Agud., E., (2011b), "In vitro conservation of certain endangered and rare species of Romanian spontaneons flora", în: [NUME_REDACTAT]. din Oradea, Fasc. P. M.,vol. XVI A, Ed. Univ. Oradea,

Laslo, V., (2013), Biotehnologii vegetale și aplicațiile lor. [NUME_REDACTAT] din Oradea,

Laslo, V., (2006), Micromultiplicarea la cais, Ed. Universității din Oradea,

Margara . J, (1981), Bases de la multiplication végétative, Les mèristèes et l̀ ̀organog̀ènese, INRA; Versailles,

Martin, R.R., Pstman, J.D., (1999), Phytosanitary aspects of plant germoplasm conservation. In: Benson E.E., (ed.) [NUME_REDACTAT] Biotehnology, Zaylor and [NUME_REDACTAT]. London, 63-82,

Murashige, T., Skoog, F., (1962), a revised medium for rapid growth and bioassay with tabacco tissue culture, Pysiol. Plant., 15, 374-497,

Ng, S.Y. C., Mantell, S.H., Ng, N. Q., (1999), Biotehnology in germoplasm management of Cassava and Yams, in: Benson E.E., (ed.) [NUME_REDACTAT] Biotehnology, Zaylor and [NUME_REDACTAT]. London, 179 – 209,

Neamțu, G., Irunie, F., (1991), Fitoregulatorii de creștere. Ed CERES, [NUME_REDACTAT] M., Negrean, G., Popescu, A., Roman, N., Dihoru, G., Sandală, V., Mihăilescu, S., (1994), Lista roșie a plantelor superioare din România, [NUME_REDACTAT] Documentații de Ecologie, [NUME_REDACTAT], Institutul de [NUME_REDACTAT], pp.16, 24, 28, 31,

Primack, R.H., (2002),Conservarea diversității biologice, Ed. tehnică, București (traducere),

Rapparini, F., Baraldi, R., Bertazza, G., Brazanti, B., Predieri, S., (1994), Vesicular arbuscular mycorrhizal inoculation of micropropagation fruit trees, J. Hort. Sci. 69,

Reagan H. M., Colyvan M., Burgman M.A. (2000), A proposal for fuzzy [NUME_REDACTAT] for Conservation of Nature (IUCN) categories and criteria, [NUME_REDACTAT] 92,

Ronse , A., (1990) In vitro culture at [NUME_REDACTAT] Garden of Belgium, in: Bot. Gardens, Micropop. New (Kew) 1, 2 Dec. 14-16,

Sutter, E., Langhans, R.W., 1979, Epicuticular wax formation an carnation plantlets regenerated from shoot tip culture, J. Amer. Hort. Soc., 104 (4),

Tampsett, A.A., (1980), Advancing and retarding flowering of narcissus [NUME_REDACTAT], in: [NUME_REDACTAT]., 109, pp. 57-63,

Vădineanu A., (1998), Dezvoltarea durabilă. Vol. I. Teorie și practică. Ed. Univ. din București,

Zăpârțan, M., (1996), Rolul culturii de țesuturi in conservarea unor specii rare pentru salvarea și extinderea lor în cultură, în: [NUME_REDACTAT], 1995-1996, p. 217-221,

Zăpârțan, M., (1996), Conservarea of Leontopodium alpinum using in vitro techniques in Romania., in: Bot. [NUME_REDACTAT]. New (Kew), 2. 26-29,

Zăpârțan, M., (1996), „In vitro regeneration and organogenesis in the species Fritillaria imperialis (L) „Aurora” in: Intrenational plant propagatiors Society, IPPS in: Bulgaria – [NUME_REDACTAT] Conferice, 57. [NUME_REDACTAT]. Seek Y Share., p.120-127,

Zăpârțan, M, (1996), Rolul culturilor de țesuturi în conservarea unor specii rare pentru salvarea și extinderea lor în cultură, Contrib. Bot. Cluj – Napoca,

Zăpârțan, M, (2001), Conservarea florei spontane prin înmulțire in vitro. Ed. ALC MEDIA GROUP, Cluj,

Zăpârțan, M., Laslo, V., Agud, E., (2014), Ariile protejate formă de conservare a biodiversității, Ed. EIKON / CARTEA ARDELEANĂ, Cluj-Napoca,

***Conform normelor IUCN/UNEP/WWF din 1980,

*** [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT],

*** [NUME_REDACTAT] on [NUME_REDACTAT] Research,

*** [NUME_REDACTAT] de Conservare a Naturii, 2006 (UICN)

CONCLUZII

PRIVIND CONDITIILE DE CULTURA IN VITRO SI DE ACLIMATIZARE EX VITRO

Conservarea in vitro a speciilor din flora spontană asigură obținerea unui număr mare de exemplare, identice fenotipic și genotipic cu planta mamă donatoare de explant, succesul tehnicii depinde de specie, capacitatea de adaptare la noile condiții, capacitatea de reluare a metabolismul, natura, proveniența și vârsta explantului, capacitatea regenerativă a țesutului (care este legată de perioada din an când se inițiază cultura). Factorii din camera de creștere și valorile lor: intensitatea luminii, temperatura, umiditatea, trebuie reglați în funcție de cerințele normale ale speciei;

A. Campanula rotundifolia. Bobocul de Campanula a dovedit capacitatea regenerativă in vitro foarte bună de 90% și de multipilicare de peste 80% pe medii cu concentrații mari de fitohormoni.

După etapele de protecție , cu reglarea factorilor de temperatură, umiditate și lumină funcție de nevoile speciei, aclimatizarea plantelor a depins de valorile sistemul radicular: la o înrădăcinare de peste 90%, aclimatizarea este de 35%, considerată cea mai bună pe mediul cu fitohormoni (C2) și de 27% pe C1. Procentul de aclimatizare considerat relativ mic depinde de natura speciei : ce influențează și alți parametrii urmăriți in vitro (Pospišilová et. all, 1999);

B. Dianthus spiculifolius. Etapa finală a procesului de aclimatizarea ex vitro este asigurată de valoarea plantulelor, capacitatea lor de a diferenția un sistem radicular viguros, de parcurgerea etapele intermediare, care aduc un procent de supraviețuire în condiții libere cât mai bun;

La specia Dianthus spiculifolius procentul de aclimatizare depășește 50% pe mediile cu zeatină (V3) din plante cu un sistem radicular diferențiat în procent de abia 15%, dar multe ca număr și viguroase : în prezența BA și adaus de NH4NO3, aclimatizare atinge 44% .

C. Drosera rotundifolia. Multiplicarea cu succes a speciilor de Drosera în general și a celei de Drosera rotundifolia in vitro în special are loc pe mediu de bază MS simplu sau cu adaus de citochinine : Z și BA (Cristea, 2010);

Procentul de înrădăcinare este de 30-35% pe medii doar cu o doză mică de auxină (cca. 0,5%), care asigură o aclimatizare de 50-55% pe mediile cu: 0.5mg/l ANA + 1,0mg/l BA (D1) și 0.5mg/l ANA + 1,0mg/l Z (D2).

D. Narcissus poeticus L. Menționăm rolul și necesitatea tratamentului cu întuneric și frig aplicat explantelor detașate din bulb și inoculate in vitro, în scopul stimulării diferențierii organelor de reproducere: frigul este implicat în reducerea sau chiar eliminarea repausului profund (pentru inducția florală). O lună de tratamentul cu frig s-a dovedit insuficient: după 2 luni cu frig la 4oC capacitatea creștere, fiind semnală și caulogeneza (formarea de funzulițe adevărate).

Tratamentul cu 2-3oC aplicat trei-patru luni, stimulează capacitatea regenerativă, care ajunge la 30-60%, cu diferențierea de bulbili în procent de 30-60% (mai mare pe mediu cu concentrația mare de BA, mediul B2), cca. 3-6 bulbili/explant.

Procentul de aclimatizare la cele trei specii: Campanula rotundifolia, Dianthus spiculifolius, Drosera rotundifolia este prezentat comparativ în graficul 4.5. Cel mai mic procent de aclimatizare raportat la proba martor este obținut la Campanula rotundifolia (C. ro.) de 24%, urmat de Dianthus spiculifolius în procent de 35% și de 37% la Drosera rotundifolia. Procentul la Narcissus poëticus L, se datorează bulbili formați care se aclimatizează în procent de 100%: la această specie trebuie să găsim formula de mărire a numărului de bulbili folosind pe viitor sistemul de robotizare : la bulbii de gladiole și alte specii bulboase (Ziv, 1989) în reactoare speciale cu mediu a materialului vegetal.

Graficul 4.5. Procentul de aclimatizae la speciile conservate in vitro

Sursa : proprie

(C. ro.= Campanula rotundifolia; D. Sp. = Dianthus spiculifolius; Dr. Sp. = Drosera rotundifolia; N. Po. = Narcissus poeticus)

RECOMANDĂRI

Recomandăm conservarea ex situ, a plantelor de Campanula rotundifolia L, Dorosera rotundifolia, Dianthus spiculifolius și Narcissus poeticus L prin înmulțire in vitro pentru reconstrucția și popularea zonelor de unde specia este amenințată (ariile din jud. Bihor), plantarea unui spațiu arhitectural (în [NUME_REDACTAT]), acțiuni asigurate de plante viguroase, înrădăcinate, după etapele de aclimatizare (protecție de razele directe ale soarelui, umiditate moderată de sol și atmosferă etc.).

Recomandăm multiplicarea in vitro a speciei Narcissus poeticus L, după parcurgerea perioadei normale de vernalizare (natural sau tratament cu frig de cca. trei luni) și doze mai ridicate de citochinine, pentru diferențierea unui număr mare de microbulbili in vitro, ceea ce va asigura materialul vegetal de plantare la speciile bulboase. Folosirea unor sisteme robotizate și computerizate pentru obținerea de performanțe în multiplicarea bulbililor in vitro, rămâne încă un obiectiv de studiu pentru specialiștii în domeniu (Cachiță et al., 2004).

BIBLIOGRAFIE

Agud, E., (2014), "Vulnerable and protected endemic species from the protected areas of [NUME_REDACTAT]. Their conservation through in vitro multiplication", Internati. Symp. "Risk factors for environment and food safety" & "Natural resources and sustainable development", în: [NUME_REDACTAT] din Oradea, Fascicula: [NUME_REDACTAT],vol.XXIII, Ed. Univ. Oradea; pp.553-565,

2. Agud E., (2014) " Campanula rotundifolia L. species endangeres with extinction, conserved through in vitro techniques ", în: [NUME_REDACTAT] din Oradea, Fascicula : [NUME_REDACTAT],vol.XXIII, Ed. Universității din Oradea ,pp.565-577,

Agud, E.M., Laslo, V., Zăpârțan, M., (2013), Factors with diferentiated implication in the in vitro minituberizațion at some potato varieties (Solanum tuberosum L.), în: Book of Abst., UAB-B.E.N.A. Intern. [NUME_REDACTAT] Engineering and [NUME_REDACTAT], Alba-Iulia,

Agud, E., Zăpârțan, M., and Laslo V., (2013), The influence of the moment of sampling of the potato meristem over the in vitro regeneration and differentiation capacity, in: The XII [NUME_REDACTAT] Prospects for the 3-rd. millennium Agriculture, Cluj-Napoca, la 26-28 [NUME_REDACTAT] vol II, 102,

[NUME_REDACTAT], (2011), "Economical methods of in vitro tuberization at [NUME_REDACTAT] L Variety", în: [NUME_REDACTAT] din Oradea, Fascicula : [NUME_REDACTAT],vol.XVI B, Ed. Univ. Oradea,

[NUME_REDACTAT], Cap Z., Zăpârțan M.,(2010), " The aspects concerning in vitro tuberring at the potatoe varieties", în: [NUME_REDACTAT] din Oradea, Fascicula : [NUME_REDACTAT],vol.XV, Ed. Universității din Oradea, pp. 7-13,

Agud, E., Savatti M., Zăpârțan M., (2008), "[NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] in the [NUME_REDACTAT] Tuberisation of [NUME_REDACTAT] Cultivars", în : [NUME_REDACTAT]. Oradea, Fascicula : [NUME_REDACTAT],vol.XIII, Ed. Univ. din Oradea, pp. 1-5,

Ardeleanu G., Ardeleanu, D., Leș G., (2008)„Știința mediului și dezvoltarea durabilă”, [NUME_REDACTAT], Satu – Mare,

Bajaj. YPS., (1986), In vitro preservation of genetic resources. IAEA-SM-282/66 Vienna,

Banciu, C., A. Brezeanu, M. Paucă-Comănescu., (2006), Reactivitatea in vitro a speciei vulnerabile Crocus flavus Weston, Micropropagarea speciilor vegetale, în: Lucrările celui de al XV lea Simp. Nați. de Culturi de Țesuturi și [NUME_REDACTAT], Iași, p. 50-59,

Barbier, E. B., (1993), Valuation of environmental resources and impact in developing countries. În: E.K. Turner (ed.) [NUME_REDACTAT]. Economics and Management, [NUME_REDACTAT], NY,

Baskin Y., (1997), [NUME_REDACTAT] of Nature: how the Diversity of [NUME_REDACTAT] Us, [NUME_REDACTAT].,Washington, D. C.,

Bavaru A., Godeanu S., Butnaru G și Bogdan A., (2007), Diversitatea și ocrotirea naturii, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT],

Băltăceanu D., Dumitrașcu M., Ciupitu D., (2003), România. Ariile naturale protejate. [NUME_REDACTAT] Române,

Berca, M. ( 1998), Teoria gestionării mediului și a resurselor naturale, Ed., [NUME_REDACTAT].,

Blându, R., I. Holobiuc, (2006), Armeria maritima ssp. Alpina – ex situ conservation using in vitro techniques, [NUME_REDACTAT] Cibiniensis, Univ. [NUME_REDACTAT], Sibiu,

Blându, R., I. Holobiuc, (2007), Contributions in ex situ conservation of rare plants from [NUME_REDACTAT] massif using biotechnology, [NUME_REDACTAT] The 1st [NUME_REDACTAT] Enviironment – [NUME_REDACTAT] – [NUME_REDACTAT] in [NUME_REDACTAT] Ensfi 2007, 1st edition, p. 483-788,

[NUME_REDACTAT]., [NUME_REDACTAT] (2008), Conservarea ex situ a speciilor de plante din lista roșie a plantelor superioare în România, în: Biotehnologii vegetale pentru secolul XXI; Lucrările celui de al XVI – lea Simp. Nați. de Cult. de Țesut. și Cel. Veget., București, Iunie 2007. Ed. RISOPRINT, Cluj – Napoca pp. 153 -168,

Bleahu M., (2004), Arca lui Noe în sec. XXI. Ariile protejate și protecția naturii, Ed. Național, București,

Boșcaiu, N., Gh. Coldea, C. Horeanu, (1994), Lista roșie a plantelor vasculare dispărute, periclitate, vulnerabile și rare din flora României, Ocrot. Nat. Med. Înconj., 38 (1); p. 56,

Botnariuc, N. 2005, Evoluția sistemelor biologice supraindividuale, Ed. Acad. Ro. Buc,

Boxus, P., Jemmali, A., Piéron, S., (1995), Micromultiplication végétative-la micropropagation in: Biotehnology végétales, Ed. Demarly; Y., Picard, E., Boxus, P., CNED; Inst., de Rennes, France; p. 5-116,

Brown, L., Sachs, A., Platt, A., Bright, C., Flavin, C., Roodman, D.M., Gardner, G., Kane, H., Abramovitz, J., Postel, S., (2001), Probleme globale ale omenirii. Starea lumii. Ed. Tehnică, București,

Bryant D., Nelson D., Tangley L., (1997), [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]: Ecosystems and Economies on the Edge. [NUME_REDACTAT] Institut, Washington, D.C,

Butiuc-Keul, A, Zăpârțan, M., (1996), Influence of natural maize extract upon the organogenesis in vitro in some flowery species, Iliev I., Zhelei, P., Aleksandrov, P (eds). IPPS in Bulgaria – Sec. [NUME_REDACTAT]. Sheek and Share, Ed. Sofia, pp. 19 – 27,

Butiuc -Keul, A., (2006), Marcheri moleculari utilizați în genetica și biotehnologiile vegetale, [NUME_REDACTAT], Cluj – Napoca,

Cachiță, C.D, (1987), Metodele in vitro la plantele de cultură, Ed. CERES, Cluj – Napoca, pp. 30-42,

Cachiță, C D., (2006), Micropropagarea speciilor de interes economic prin utilizarea de dispozitive automate sau de roboți. Micropropagarea speciilor vegetale. Lucrările celui de al XV – lea Simp. Național de Culturi de Țesuturi și [NUME_REDACTAT], Iași p. 1 – 14,

Cachiță, D., Deliu, C., Racosz, L., (2004). Tratat de biotehnologii vegetale, Vol I, Ed. Dacia, Cluj-Napoca,

Cachiță., D.. Ardeleanu, A., (2009), Tratat de biotehnologie vegetală, Vol. II., Ed. Dacia, Cluj,

Cairns J., și Heckman J. R., (1996), Restoration ecology: The state of an emerging field. [NUME_REDACTAT] of Energy and the Environment 21: 167-189,

Caroll, C.R, (1992). Ecological management of sensitive natural areas, in: P.L. Fiedler și S.K. jain (eds.) [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT] ans Practice of [NUME_REDACTAT], Preservation and management, Chapman and Hall, NY.,

Chernela, J., (1987), Endangered ideologies: Tukano fishing taboos, [NUME_REDACTAT] Quarterly, 11,

Cogălniceanu D., (1999) „Managementul capitalului natural”, Ed. Ars. Docendi, București,

Cogălniceanu D., (2003), Biodiversity, [NUME_REDACTAT], Remagen,

Coldea, Ghe., Fărcaș, S., Ciobanu, M., Hurdu, B., Ursu, T., (2008), Diversitatea floristică și fitocenotică a principalelor situri protejate din [NUME_REDACTAT] Apuseni,

Cox, P. Elmqvist, T., (1987), Ecocolonialism and indigenous – controlled rainforest preserves in Samoa. Ambio 26,

Cristea, M., (1985), Conservarea genetică a plantelor și agricultura, [NUME_REDACTAT] RSR, București, pp. 58,

Cristea, M., (1988), Evaluarea și utilizarea resurselor genetice vegetale, Ed. Academiei RSRomâne, București, pp. 200-214,

Cristea M., (2006), Biodiversitatea, Ed. CERES, București,

Cristea V., (1995), La conservation de la nature en Roumanie, Univ. degli [NUME_REDACTAT] (Macerata) Italia,

Cristea, V., S. Denaeyer., J.P. Herremans., I, Goia., (1996), Ocrotirea naturii și [NUME_REDACTAT] în România, Ed. [NUME_REDACTAT]., Cluj – Napoca, p. 365,

Cristea, V., Denaeyre (2004), De la Biodiversitate la OGM-uri, Ed. EIKON, Cluj-Napoca, pp. 66-57,

Cristea, Victoria., M. Miclăuș, M. Pușcaș., C. Deliu, (2004), Conservative micropropagation of some endemic or rare species from the Dianthus L. genus. In: In vitro Cult. and Hortic. Breeding, Fifth IV CHB [NUME_REDACTAT], as therorz and Practice in Horticulture, p. 3-13,

Cristea, Victoria., M. Miclăuș, M. Pușcaș., C. Deliu, A. Halmagyi., (2004), The micropropagation of some endemic or rare taxa from Gilău, M-tele Mare massif. Contrib. Bot., XXXIX, Cluj – Napoca, p. 201-209,

Cristea, Victoria, 2010, Culturi in vitro fotoautotrofe la speciile de Dianthus endemice și periclitate din România, Ed. Todesco, Cluj – Napoca;

[NUME_REDACTAT], EAL., (1984), The rol of in vitro techniques in germoplasm conservation. In: Holden, JHW., Williams, JT., (eds.), [NUME_REDACTAT] Resources: Conservation and Evaluation, Allen and Unwin, London, pp. 131-137,

Dihoru, Ghe., Alexandrina, Dihoru, (1994), Plante rare, periclitate și endemice din flora României – Lista roșie. [NUME_REDACTAT]. Hort. București, pp. 173-197,

Dihoru, Gh., Negranu, G., (2009), Lista roșie a plantelor vasculare din România, Ed. Acad. Ro.,

Domuța, C. (coord.), Brejea, R., Șandor, Maria, Domuța, Cr., Borza, Ioana, Timar, A., Vușcan., A., Ciobanu, Gh., Csep, N., Ciobanu, Cornelia., Bucureanu, Elena, Zăpârțan, Maria, Curilă, M., Romocea, Tamara, Sarca, Gh., Laslo, V., Pantea, Emilia, Samuel, Alina, Oneț, Aurelia, Oneț, C., Șerban, Eugenia, Costea, Monica, Gîtea, M., Agud, Eliza, Bodog, Marinela, Jude, E., Cozma, Alina (2013), "Monitoringul mediului: lucrări practice", Ed. Universității din Oradea, Oradea ISBN : 978-606-10-0993-0, 607p.,

Engelman, F., (1997), In vitro conservation methods. În: Callow, JA., FordțLoyd BV, Nrwbury, HJ., (eds.) Biotehnology and [NUME_REDACTAT] Resources, pp. 120-160,

Engelamn, F., Engels, JMM., (2006), Botanic gardens and agricultural genebanks: building on complementary strengths for mor effective global conservation of plant genetic resources. PGR Newletter, 13l pp. 50-54,

Enescu V., (2002),Silvicultură durabilă, Ed.AGRIS, redacția revistelor agricole, București,

Farusworth, E., ([NUME_REDACTAT]), [NUME_REDACTAT] ([NUME_REDACTAT]). (2008), Conservation and management of rare plant species. in: Encyclopedia of Earth. Eds. Culter J. Cleveland (Washington, D.C., [NUME_REDACTAT] Coalition, [NUME_REDACTAT] for Science and the Environment).Published in the Encyclopedia of [NUME_REDACTAT] 28, 2007; [NUME_REDACTAT] 16,

Fay, M.F., Muir, H.J., (1990), The role of micropropagation in the conservations of european plants, [NUME_REDACTAT], in Botanic G. Koenigstein, [NUME_REDACTAT] Book,

Fay, M.F., Redwood, G.N., (1990), Micropropagation of rare specie at the [NUME_REDACTAT] Gardens, Kew. Abstract VII-th Internat. Congres of [NUME_REDACTAT] and [NUME_REDACTAT] Amsterdam, 66:99,

Fay, M.F., (1992), Conservarea of rare and endagered plants using in vitro methods. In vitro cell. Dev. Biol., 28, pp. 1-4,

Forman R. T., (1995), [NUME_REDACTAT]: The ecology of Landscapes and regions, [NUME_REDACTAT]. Press, NY,

Frankel, O.P., Hawkes, J. G. (eds), (1975), [NUME_REDACTAT] Resources for Today and Tomorrow. IBS series Vol. 2. [NUME_REDACTAT] Press, Cambridge, UK,

Gianinazzi, S., Gianianzzi-Pearson, V., Trouvelot, A., (1989), Potentialities and procedures for the use of endomycorrhizas with special emphasis and high values crops. In: Biotehnologii of Fungi for [NUME_REDACTAT] Growth (ed. Whipps and Lumdesn), [NUME_REDACTAT]. Press. Cambridge, (England), 41-4,

Giurăscu, C., (1976), Istoricul pădurilor românești din cele mai vechi timpuri și până astăzi., Ed. II a CERES, București,

Giurgiu V., (1995), Conservarea și ameliorarea diversității biologice a pădurilor. Protejarea și dezvoltarea durabilă a pădurilor României, Ed. [NUME_REDACTAT], București,

Godeanu, S., Paraschiv G., (2005), Compendiu de lucrări de ecologie aplicată. Ed. [NUME_REDACTAT], București,

Godoy R.A., lubowski R., Markandya, (1993), Amethod for rhe economic evaluation of non – timber tropical forest products, [NUME_REDACTAT] 4 ,

Grumbine E.R., (1994b), [NUME_REDACTAT] and Bioidiversity, [NUME_REDACTAT]., Washington, D.C.,

Halmágyi A., Butiuc-Keul, (2007),Conservarea resurselor genetice vegetale, Ed. Todesco, Cluj-Napoca, 2-4,

Harribey, J., M., (1998), Le developpement soutenable, Ed. [NUME_REDACTAT],

Holobiuc, I., Blîndu, R., (2006), Improvement of the micropropagation and in vitro medium – term preservation of some rare Dianthus species, [NUME_REDACTAT], 42 (2)Cluj, pp. 143-151,

Holobiuc, I., Blîndu, R., (2006- 2007), In vitro culture introduction for ex situ conservation of some rare plant species, [NUME_REDACTAT] of Biology. [NUME_REDACTAT], Volumes 51-51(1), București, pp. 13 – 23,

Homer – Dixon, T. F., (1999), Environment, Scarcity and Violence, [NUME_REDACTAT] Press, Princeton, NJ.,

Iancu, A., (1976), „Creșterea economică și mediul înconjurător”, Ed. Polirom, București,

Ionel A., Manoliu, Al., Zanoschi, V., (1986), Conservarea și ocrotirea plantelor rare, Ed. Ceres, București,

Iușan, C., (2011), [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] Rodnei (Rezervație a Biosferei). [NUME_REDACTAT], Cluj-Napoca,

Jain, S., (2001), Tissue culture-derived variation in crop improvement, Euphytica, 118,

Johnson N. C., (1995), Biodiversity in the Balance. Approaches to [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] Press. Landover, Maryland,

Krishnan, P. N., Seeni S., (1994), Rapid micropropagtion of Woodfordiia fruticosa (L) Kurtz (Lythraceae), a rare medicinal plant, in: [NUME_REDACTAT] Reports 14, Sp-Verlag, 55-58,

Kozai, T., Kubota, C., Zobayed, S., Nguyen, Q. T., Afreen-Zobayed, F., Heo, J., (2000), Photoautotrophic micropropagation. În: Proc. [NUME_REDACTAT] on Contamination and Aclimatization management in Plant cel land [NUME_REDACTAT],. Bangkok,

Larkin PJ., and Scowcroft, WR., (1981), Somaclonal variation – a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theor. Appl. Genet., 60, 190-200,

Laslo, V., Vicaș, S., Agud, E., Zăpârțan, M., (2011a), "Methods of conservation of the plant germplasm. In vitro techniques", în: [NUME_REDACTAT]. Oradea, Fas. P.M, vol.XVI B, Ed. Univ. Oradea,

Laslo, V., Zăpârțan, M., Agud., E., (2011b), "In vitro conservation of certain endangered and rare species of Romanian spontaneons flora", în: [NUME_REDACTAT]. din Oradea, Fasc. P. M.,vol. XVI A, Ed. Univ. Oradea,

Laslo, V., (2013), Biotehnologii vegetale și aplicațiile lor. [NUME_REDACTAT] din Oradea,

Laslo, V., (2006), Micromultiplicarea la cais, Ed. Universității din Oradea,

Laslo, V. Zăpârțan, M. Agud, E., (2013), "The in vitro reaction of the Drosera intermedia Hayne species, a critically endangered species of Romanian flora", [NUME_REDACTAT] "Risk factors for environment and food safety" & "Natural resources and sustainable development", în: [NUME_REDACTAT]. Oradea, Fascicula : [NUME_REDACTAT],vol.XXI, Ed. Univ. Oradea, 23-31,

Le, C., Thomas, D., Tschuy F., Derron, M., Gmtr, P., Moret, J. L., Baumann, R., (2000)., In vitro culture of Anagallis tenella (L) Murray in Bot. [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT].2 (4) Aug., Kew p. 54-57,

Lee, T. C., Jusaltis M., (2000)., Micropropagation of Haloragis eyreans Orch. (Haloragaceae) in Bot. Gard. Microprop. [NUME_REDACTAT] 2 (4), August 2000, Kew, 50-52,

Lubchenco, și col., (1991), The sustenabele biosphere initiative: in Ecological research agenda, Ecology, 72,

Mann C.C., Plummer M. L., (1993), The high cost of biodiversity, Science 294,

Manoleli D., Găldeanu N., Cogălniceanu D., Nistor M., (2004), Raport de evaluare tematică privind implementarea CNDB. Ed. [NUME_REDACTAT], Buc.,

Margara . J, (1981), Bases de la multiplication végétative, Les mèristèes et l̀ ̀organog̀ènese, INRA; Versailles,

Marten, G. G., (2001), [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT]., Ltd, London,

Martin, R.R., Pstman, J.D., (1999), Phytosanitary aspects of plant germoplasm conservation. In: Benson E.E., (ed.) [NUME_REDACTAT] Biotehnology, Zaylor and [NUME_REDACTAT]. London, 63-82,

Melinte I., Mladin, E, manoleli, D., Blujdea, V., Fenton D., Șerban, R., Zisu D., Cogălniceanu, D., Vlădescu G., Nistor M., Găldean N., Cruțu G., (2005), – Raport final privind implementarea Convenției de la Rio (UNFCCC, UNCCD, UNCBD),

Mercier, H., Kerbauy, G.B., (1993), Micropropagation of Dyckia macedoi an endangered endemic brazilian bromeliad, Bot. [NUME_REDACTAT]. News (Kew), 1 (6), 70-72,

Mittermeier R.A., Myers M., Gil P.R., și Mittermeier G., Hotspots, (1999), Earth’s Richest and [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], Agrupación [NUME_REDACTAT], S.C., [NUME_REDACTAT], Mexico,

[NUME_REDACTAT]., Ardeleanu A., Georgescu M., (1993), Rezervații și monumente ale naturii din România, Ed. Scaiul, București,

Mohan G., Ardelean, A, (2004), Dicționar encyclopedic de biologie, Ed. [NUME_REDACTAT]., Buc.,

Munteanu, D., Mihăilescu, S., Coldea, Ghe., (coordon.), (2003), Parcuri naționale, naturale și rezervații ale Biosferei din România, Ed. Min. APAM, București, 

Murashige, T., Skoog, F., (1962), a revised medium for rapid growth and bioassay with tabacco tissue culture, Pysiol. Plant., 15, 374-497,

Ng, S.Y. C., Mantell, S.H., Ng, N. Q., (1999), Biotehnology in germoplasm management of Cassava and Yams, in: Benson E.E., (ed.) [NUME_REDACTAT] Biotehnology, Zaylor and [NUME_REDACTAT]. London, 179 – 209,

Neamțu, G., Irunie, F., (1991), Fitoregulatorii de creștere. Ed CERES, [NUME_REDACTAT], R.F., (1992), Essay: Issues of scale in conservation biology, in: Fiedler and Jain (edit.) [NUME_REDACTAT], Conseravation, Preservation and Management. Campman and Hall, N.Y.,

Oltean M., Negrean, G., Popescu, A., Roman, N., Dihoru, G., Sandală, V., Mihăilescu, S., (1994), Lista roșie a plantelor superioare din România, [NUME_REDACTAT] Documentații de Ecologie, [NUME_REDACTAT], Institutul de [NUME_REDACTAT], pp.16, 24, 28, 31,

Opriș., T., (1990), Plante unice în peisajul rămânesc, [NUME_REDACTAT]-Turism, București,

Pârvu, C., (2004), Enciclopedia plantelor- plante din flora României, Vol. III, Ed. Thenică. București, pp. 496-503,

Peterfi S., Filipașcu, A., Boșcaiu N., (1974), Resursele naturale și ocrotirea naturii în România. Sargetia, ser. Sci. nat., Deva,

Pop, E., Sălăgeanu, N., (1965), Monumente ale naturii din România, Ed. Meridiane, București,

Pop C-L., (2009), Ecologie și conservarea biodiversității, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca,

Poffenberger, M., (ed.) (1990), Keepers of the Forest, Kumarian, [NUME_REDACTAT], CT.,

Primack, R.H., (2002),Conservarea diversității biologice, Ed. tehnică, București (traducere),

Primack R.B., (1998b), Monitoring rare plant, [NUME_REDACTAT] 12, 29-35,

Puia, I., Soran, S., Carlier, L., Rotar, I., Vlahova, M., (2001), Agroecosisteme și ecodezvoltare, Editura AcademicPress, Cluj-Napoca,

Rapparini, F., Baraldi, R., Bertazza, G., Brazanti, B., Predieri, S., (1994), Vesicular arbuscular mycorrhizal inoculation of micropropagation fruit trees, J. Hort. Sci. 69,

Reagan H. M., Colyvan M., Burgman M.A. (2000), A proposal for fuzzy [NUME_REDACTAT] for Conservation of Nature (IUCN) categories and criteria, [NUME_REDACTAT] 92,

Ristoiu, T., Ristoiu D., (2004), Elemente de ecologie, Editura U.T. Press, Cluj – Napoca,

Ristoiu, T., Ristoiu D., (2003), Ecologie – aplicată, Ed. Univ. Thenice-Press, Cluj-Napoca,

Rojanschi V., [NUME_REDACTAT]., [NUME_REDACTAT]., Ioan I., (2006), Cuantificarea dezvoltării durabile, Ed. Econ., Buc.,

Ronse , A., (1990) In vitro culture at [NUME_REDACTAT] Garden of Belgium, in: Bot. Gardens, Micropop. New (Kew) 1, 2 Dec. 14-16,

Sarasan, V., Cripps, R., Ramsay, MM., Atherton, C., McMichen, M., Prendergast, G., Rowntree, J.K., (2006), Conservation in vitro of threstened plants – progress în the past decade. In vitro Cellular and [NUME_REDACTAT]. – Plant, 42, 206-214,

Sârbu A (coord.), (2007), Arii speciale pentru protecția și conservarea plantelor din România, Ed. Victor, B., București,

Sârbu, I., Chifu, T., (2003), Lista roșie a plantelor vasculare din Moldova, [NUME_REDACTAT]. Șt., [NUME_REDACTAT], 4 (24), 131-151,

Schenk, R., Hidebrandt, AC., (1972), Medium and techniques for education growth of monocotyledonous and dicocotyledonous plant cell cultures., Can., Ju., Bot., 50,199-204,

Scott J. M., Csuti B., Davis F., (1991), Cap analiysis : An aplication of GIS for wildlife species. [NUME_REDACTAT], Krasny, Goff, Smith și Cross (eds.)., Challenges in the Conservation of [NUME_REDACTAT]: A Practitioner’s Guide, pg. 167-179. [NUME_REDACTAT], Boulder,

Seeni, A., (1990), Micropropagation of some rare planta t the [NUME_REDACTAT] Garden and research [NUME_REDACTAT] India, Bot. [NUME_REDACTAT]. News, (Kew), 1, 16-19,

Soran, V., Bândiu, C., Munteanu D., (1993), Criteria for establishment of minimal and optimal areas of an effective constancy of forest ecosystems , Rev. Pădurilor, nr. 108,

Soran, V., Puia, I., Ardeleanu, A., Maior, C., (2001), Ecologie umană, Ed. „V. Goldiș”, Arad,

Stork, N.E., Samways, M.J., (1995), Inventorying and monitoring of biodiversity, in: Heywood W.H., (Ed.) [NUME_REDACTAT] Assessment. [NUME_REDACTAT]. Press,

Sutter, E., Langhans, R.W., 1979, Epicuticular wax formation an carnation plantlets regenerated from shoot tip culture, J. Amer. Hort. Soc., 104 (4),

Șuteu, A., Butic-Keul, A.L., Mocanu, S., Pârcu, M., (1997-1998), Research concering in vitro micropropagation of Astragalus peterfii Jav.,an endangered species of the Romanian, Flora, Contrib. Bot., 209-213,

Tampsett, A.A., (1980), Advancing and retarding flowering of narcissus [NUME_REDACTAT], in: [NUME_REDACTAT]., 109, pp. 57-63,

Toniuc N., Oltean, M., Romanca, G., Zamfir, U., (1992) List of protected areas in Romania (1932-1991), Revista: [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], nr.36, 1,

Toniuc, N., Purcelean, L., Boșcaiu, N., (1994), Rezervații biogenetice și importanța lor pentru conservarea genofondului, Ocrot. Nat. Med. Înconj., 38, 2: 107-113,

Van de Veer, D., Pierce, C., (1994), [NUME_REDACTAT] Ethics and [NUME_REDACTAT]: Philodophy, Ecology, Economics, [NUME_REDACTAT] Company, Belmont, CA.,

Vădineanu A., (1998), Dezvoltarea durabilă. Vol. I. Teorie și practică. Ed. Univ. din București,

Vădineanu A., (1999), Dezvoltarea durabilă. Vol. II Mecanisme și instrumente, Ed. U. Buc.,

Western D., Wright R. M., Strum S. C. (eds.), (1994), [NUME_REDACTAT]: Perspectives in [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], Washington, D.C,

White, PS, (1996), In search of the conservation garden, [NUME_REDACTAT], 11(2),

Withers, LA.,(1990a), In vitro tehnic for the conservation of crop germoplasm. [NUME_REDACTAT] on Plant and [NUME_REDACTAT], Nairobi, Kenya, 5-27,

Withers, LA., (1990b), Tissue culture in the conservation of plant genetic resources. International workshop on tissuew culture for the conservation of biodiversity and plant genetic resources, Kuala-Lumpur, pp. 1-25,

Willers, B., (1994), Sustainable development, [NUME_REDACTAT] deception, [NUME_REDACTAT] 8,

Yamagishi,M., (1993), Effects of in vitro culture temperature and cold treatment on breakage of dormancy in bulblets of Lilium japonicum., Bull., RIAR, [NUME_REDACTAT]. Coll., 3,

Zăpârțan, M., Deliu, C., (1994), Conservations of endemic, rare and endangered species in the Romanian flora using in vitro methods Lilium martagon Kerner., in: Proceeding of the 8-th Nati. Sympo. of [NUME_REDACTAT] and Biotechology, Bucharest, 423-426,

Zăpârțan, M., (1995), Specii endemice rare și ocrotite, conservarea prin tehnici in vitro (Dianthus spiculifolis Scur), [NUME_REDACTAT]. Oradea, Biologie, an II, 42-49,

Zăpârțan, M., (1996), Rolul culturii de țesuturi in conservarea unor specii rare pentru salvarea și extinderea lor în cultură, în: [NUME_REDACTAT], 1995-1996, p. 217-221,

Zăpârțan, M., (1996), Conservarea of Leontopodium alpinum using in vitro techniques in Romania., in: Bot. [NUME_REDACTAT]. New (Kew), 2. 26-29,

Zăpârțan, M., (1996), „In vitro regeneration and organogenesis in the species Fritillaria imperialis (L) „Aurora” in: Intrenational plant propagatiors Society, IPPS in: Bulgaria – [NUME_REDACTAT] Conferice, 57. [NUME_REDACTAT]. Seek Y Share., p.120-127,

Zăpârțan, M, (1996), Rolul culturilor de țesuturi în conservarea unor specii rare pentru salvarea și extinderea lor în cultură, Contrib. Bot. Cluj – Napoca,

Zăpârțan, M., (1997), Fritillaria meleagris (L) – specie rară și vulnerabilă conservată prin tehnici de cultură in vitro in: Cachiță-Cosma d., Ardelean., Crăciun C., (eds.), Ed. [NUME_REDACTAT],

Zăpârțan, M, (2001), Conservarea florei spontane prin înmulțire in vitro. Ed. ALC MEDIA GROUP, Cluj,

Zăpârțan M., Butiuc. Keul A., (2002), „ In vitro multiplication and callus induction of Syringa josikaea Jacq. endemic taxa from Romanian flora, în [NUME_REDACTAT], XXXVII, 2002, Grădina – Botanică „[NUME_REDACTAT]” Cluj – Napoca,

Zăpârțan, M., Laslo, V., Agud, E., (2014), Ariile protejate formă de conservare a biodiversității, Ed. EIKON / CARTEA ARDELEANĂ, Cluj-Napoca,

Zedler, J. B., (1996), Ecological issues in wetland mitigation: An introduction to the forum. [NUME_REDACTAT] 6: 33-37,

Zonneveld I. S., Forman R.T.,(eds.), (1990), [NUME_REDACTAT]: [NUME_REDACTAT] Perspective. Springe – Verlag, N.Y.,

*** Conferința ONU de la Rio de Janeiro, 1992,

***Convenția asupra biodiverstsității; Rețeaua ecologică „Natura 2000” ,

*** UNEP:[NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT],

*** WWF: [NUME_REDACTAT],

*** [NUME_REDACTAT] UICN (http://www.iucnredlist.org),

*** Encyclopédie universelle des 15.000 de plantes, 1999, [NUME_REDACTAT] Brickell, en association avec la [NUME_REDACTAT]. Soc., Editura LAROUSSE-BORDAS, 1999

***[NUME_REDACTAT] Conservancy, 1996,

***[NUME_REDACTAT] Facility (GEF); [NUME_REDACTAT] și agențiile ONU,

*** Summitul de la Lisabona, 1997,

***Rețeaua ecologică „NATURA 2000”,

*** Flora, R.P.R. T, Savulescu (ed.)., de la Vol. I – 1952., Vol. – XIII, 1974,

*** IBPGR, 1974 = [NUME_REDACTAT] pentru [NUME_REDACTAT] vegetale ([NUME_REDACTAT] for [NUME_REDACTAT] Resources), organsm neguvernamental autonom, înființat în 1974 cu sediul în capitala Italiei, Roma,

*** IBPGR, 1983 = [NUME_REDACTAT] on in vitro storage, Report of the [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] for Plant genetic Resources, Rome,

***Parteneriatele de acest tip sunt în creștere datorită căilor de finanțare oferite de [NUME_REDACTAT] Facility (GEF), de [NUME_REDACTAT] și de agențiile ONU,

***2003, Parcuri naționale, Naturale și Rezervații ale Biosferei din România, [NUME_REDACTAT] Agriculturii, Pădurilor, Apelor și [NUME_REDACTAT],

*** [NUME_REDACTAT] a Pădurilor ROMSILVA, 2004, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT], București,

*** Lgile din țară care asigură funcționarea ariilor protejate: Legea 5/2000, 462/2001 HG230/03,

***http://www:areas.com;http://www.iucnredlist.org; http://www.plantaeuropa.org/ ,

*** Wikipedia: [NUME_REDACTAT], Sit de importanță comunitară,

*** Programului „Omul și Biosfera” elaborate în 1984 de UNESCO: creează rețeaua de Rezervații ale Biosferei care nu este inclusă în UICN dar acceptată pe plan internațional,

*** BOTANICA – Encyclopédie de botanique et d`horitculture, plus de 10.000 plantes du monde entier (Ed. Könemann) Cologne, 1997, pp. 184-186,

(http://www.natureserve.org/aboutUs/PressReleases/IUCN_Red_List_release.pdf),

(http://www.bgci.org.uk/files/7/0/global_strategy.pdf),

http://www.iucnredlist.org/info/2007RL_Stats_Table%202.pdf ,

(http://www.natureserve.org/aboutUs/PressReleases/IUCN_Red_List_release.pdf,

http://.bbc.co.uk/nature/environment/conservationnow/global/biodiversity/page2.shtml

www.PlantConservationDay;http://www.bgci.org.uk/files/7/0/global_strategy.pdf,

http://www.iucnredlist.org/info/2007RL_Stats_Table%202.pdf.

ANEXA I. HĂRȚI

Harta 1. Aria protejată Muntele ȘES, sit comunitar

Harta 2. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT](PNMA)

Sursa : (Bavara și col., 2007)

Harta 3. Harta cu răspândirea speciei

Campanula rotundifolia L. (syn. Carpatica), pe teritoriul [NUME_REDACTAT]: Dihoru și Negreanu 2009

Harta 4. Aria de răspândire a speciei

Drosera rotundifolia Huds. pe suprafața [NUME_REDACTAT]: Dihoru și Negreanu 2009

Harta 5. Răspândirea speciei Narcissus poeticus L

Sursa: [NUME_REDACTAT] Vol. XI, 1866

Harta nr. 6. Harta ariilor protejate din [NUME_REDACTAT]: Cristea și Denaeyer, 2004

PLANȘA I. Campanula rotundifolia L. ssp. polimorpha: sit SCI – [NUME_REDACTAT] (R)

Sursa: proprie

PANȘA II. Dianthus spiculifolius : sit-rile V. Glabenă și P. Bulzului, critic periclitată (CP)

Sursa: proprie

PLANȘA III. Drosera rotundifolia Huds: sit SCI – [NUME_REDACTAT], specie critic periclitată (CP)

Sursa: proprie

PLANȘA IV. Narcissus poeticus L., aria protejată „Pădurea cu narcise din Alparea (com. Oșorhei), specie vulnerabilă (VU)

Sursa: proprie

ANEXA II. Legislația românească privind conservarea ariilor protejate

Schimbările în legislația românească privind protecția și conservarea resurselor naturale au căpătat amploare după anul 1990, când cu un an mai târziu se înființează [NUME_REDACTAT], iar după un alt an (1992) [NUME_REDACTAT] Pădurilor și [NUME_REDACTAT] (prin Hotărârea de Guvern nr. 792), care avea printre obiective și crearea de arii protejate și gestionarea, monitorizarea și conservarea patrimoniului natural al parcurilor naturale și naționale existente. Apoi în 1993 prin Legea 82 completată cu hotărârea nr. 248/1994 încep să se înființeze „[NUME_REDACTAT]” incluse și pe listele UNESCO. Încă din 1990 [NUME_REDACTAT] este înscrisă pe lista patrimoniului natural mondial ca Rezervație a zonei umede. [NUME_REDACTAT] mare – masivul Retezat încă din 1980 a fost declarată Rezervație a Biosferei.

Inventarierea corectă a ariilor protejate din țara noastră s-a publicat abia în 1992 și cuprindea: 586 de obiective, dintre care:

12 [NUME_REDACTAT] + cele trei rezervații ale Biosferei;

2 [NUME_REDACTAT]: Grădiște de munte-Cioclovina și Porțile de Fier;

572 de Rezervații naturale, în care sunt incluse toate acele rezervații care aveau interes județian (Toniuc et al., 1992). Dintre toate aceste obiective majoritatea (cca.68%) aveau suprafața sub 100 de ha, fiind totuși considerate rezervații (Conform normelor UICN).

Urmează legea 137/1995 care abrogă legile anterioare care stabișețte cadrul general al protecției mediului în România: în art. 54 al Legii 137 este stipulat că „ariile protejate declarate până la data intrării în vigoare a prezentei legi își păstrează calitatea”, urmată de reinventarierea ariilor protejate din România și stabilirea unor liste (unele cu scăpări) care au stat la baza înființării fiecărei rezervații. Legea mai prevdea și aspecte de „Protecția resurselor naturale și conservarea biodiveristății” și chiar „protejarea unor specii de organisme rare, amenințate cu dispariția, conservarea biodiveristății și instituirea de arii protejate, precum și unele măsuri de protecție a mediului prioritare, față de altele”. Legea specifică și responsabilitatea autorităților centrale de-a a elabora, actualiza și difuza periodic „Cartea roșie a speciilor” și „Catalogul ariilor protejate și al monumentelor naturii”, dar prevede și sancțiuni în caz de încălcare a ei. Cu un an mai târziu MAPșiPM elaborează „Strategia națională și planul de conservare a diversității biologice cu utilizarea durabilă a componentelor biodiversității”, strategia prezintă o listă de arii protejate care atinge un număr de 569 de arii protejate.

Abia în anul 1996 putem vorbi de arii protejate încadrate corect în categoriile UICN prin lucrarea elaborată de Cristea, V și colab. 1996. Acest colectiv consideră că alături [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT] funcționează ca un [NUME_REDACTAT], o zonă umedă „Rezervație a Biosferei” Autorii stabilesc următoarele arii, zone sau teritorii cu următoarea denumire și cu urnătorul număr:

11 „Parcuri naționale” cu statut provizoriu și 2 [NUME_REDACTAT];

46 de Rezervații științifice și 372 rezervații naturale de natură diferită (botanice, speologice, zoologice, forestiere, paleontologice;

18 zone care cuprind asociații de plante cu o mare valoare esteico-peisagistă, păstrate integral și denumite „Rezervații peisagistice”;

„Monumente ale naturii” care adăpostesc peste 150 de arbori seculari autohtoni sau exotici, cca, 25 cormofite și cca. 30 vertebrate (Cristea et al., 1996).

La începutul acestui secol apare „Legea aprobării Planului de amenajare a teritoriului național”, legea nr.4/2000 elaborată de MLPAT ([NUME_REDACTAT] Publice și Amernajării teritoriului). La anexele I-IV ale legii sunt elaborate de către specialiștii [NUME_REDACTAT] în colaborare cu cercetărorii din domeniu liste de protecție printre care: 17 Parcuri naturale și naționale de cca. 1.056.363 ha și 826 arii protejate întinse pe o suprafață de 107.109,23 ha, (cca. 5,16 din teritoriul țării fiind protejat prin lege). În ultimul timp aceste liste au fost verificate pe terne și unele se pare că nu mai există (după aproximativ 15 ani) și deci trebuisc scoase din evidență, apoi unele nu sunt încadrate corect în categoriile UICN (expl. [NUME_REDACTAT] este inclusă în categoria Parc natural).

Problema ariilor protejate din România este legată de modul cum sunt monitorizate, protejate și gestionate, nu de suprafața acestora și de numărul lor. Deci nu toate aceste arii au protecție efectivă, unele fiind în custodia primăriilor unde protecția, paza și gestionarea lor lasă de dorit, fie din lipsă de fonduri, fie din lipsă de interes., dar marile rezervații, mai ales cele ale Biosferei (Delta, Retezat, Rodna) au protecție integrală efectivă.

În ordine cronologică este elaborată Legea 462/2001 privind protecția ariilor naturale protejate, conservarea habitatelor naturale a florei și faunei splbatice. Legea stabilește un management exact al eficientizării ariilor protejate și a monumentelor naturii din România. Hotărârea de Guvern 230/2003, Ordinul nr. 552/2003, Hotărârea de Guvern 1267/2003 a [NUME_REDACTAT], Pădurii, Apelor și Mediului(acest minister din 2007 se numește [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT]), cu privire la ariile protejate, sunt acte normative care vin să delimitează [NUME_REDACTAT], Parcurile naționale și naturale și elaborează hărți în care sunt specificate exact normele de administrare a ariilor protejate. [NUME_REDACTAT] România se plasează pe locul 26 (din 36 de țări) sub aspectul rezervațiilor care sunt cca. 157 ca număr întinse pe cca. 100 de ha (cca. 4,6% din suprafața țării).

ORDIN nr. 1.964 din 13 decembrie 2007privind instituirea regimului de arie naturala protejata a siturilor de importanta comunitara, ca parte integranta a retelei ecologice europene Natura 2000 in Romania

“Această lucrare a fost realizată cu sprijinul finanțării obținute în cadrul proiectului de studii doctorale și postdoctorale: „Studii doctorale și postdoctorale Orizont 2020: promovarea interesului național prin excelență, competitivitate și responsabilitate în cercetarea științifică fundamentală și aplicată românească” Contract POSDRU/159/1.5/S/140106.

PARTENERI:

Institutul de [NUME_REDACTAT]

Institutul de [NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT] de Apărare ”Carol I”

Institutul de [NUME_REDACTAT] ”Acad. [NUME_REDACTAT]”

[NUME_REDACTAT] pentru [NUME_REDACTAT] în [NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT] Militară

Österreichisch-Rumänischer [NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT] de [NUME_REDACTAT]

Calea 13 Septembrie nr. 13, Corp A, Etaj 5

http://www.iem.ro/orizont2020

contact: orizont2020@iem.ro

Cod de bare ISBN