Oxidarea Biomoleculelor

[NUME_REDACTAT] biomoleculelor mediată de radicalii liberi și stresul oxidativ erau noțiuni neverosimile acum câteva zeci de ani. Descoperirea superoxid dismutazei la sfârșitul anilor 1960 a dus la realizarea unor cercetări intense care, în final, au condus la descrierea proceselor de producere a radicalilor liberi și oxidanților de către mitocondrie și unele căi metabolice în celulele mamiferelor.

Pentru prevenirea și înlăturarea toxicității radicalilor liberi și a oxidanților, viața în mediu aerobic a necesitat strategii antioxidante. Ca un corolar al acestor descoperiri, [NUME_REDACTAT] a formulat conceptul de stres oxidativ, punând accent pe echilibrul dintre oxidanți și antioxidanți. Mai târziu, s-a demonstrat că radicalii liberi și oxidanții nu sunt doar factori de stres toxic celular, ci joacă și un rol important în semnalizarea celulară și reglarea redox a proceselor metabolice. În particular, a fost apreciată implicarea radicalilor liberi și a oxidanților în căi redox discrete, sugerând faptul că mecanisme specifice au evoluat spre semnalizarea cu ajutorul radicalilor liberi și a oxidanților. Aceste observații, care aduc argumente contra teoriei echilibrului dintre oxidanți și antioxidanți, duc la o actualizare a noțiunii de stres oxidativ, pentru a sublinia importanța circuitelor redox celulare. Conceptul actualizat al stresului oxidativ poate astfel ajuta la proiectarea unor abordări terapeutice noi, îndreptate selectiv asupra unor ținte și unor simptome ale bolilor 1.

Speciile reactive ale oxigenului și azotului joacă un rol important în reglarea celulară. Cele mai multe mecanisme celulare reglatoare modulate redox servesc la protejarea celulelor de stesul oxidativ și la restabilirea homeostaziei redox. În mitocondrie, speciile reactive ale oxigenului sunt generate ca produși secundari ai metabolismului oxidativ generator de energie. O creștere excesivă și susținută a producerii acestor specii reactive a fost implicată în patogenia cancerului, poliartritei reumatoide, diabetului zaharat, aterosclerozei, bolilor neurodegenerative și altor boli, precum și în mecanismul îmbătrânirii 2.

Durerea cronică este o problemă majoră a societății, fiind raportată la aproximativ jumătate din populația adultă, iar artrita este cea mai frecventă cauză a durerii. Durerea este simptomul predominant în artrită, apărând încă din stadiile incipiente și persistând pe toată durata bolii. În fazele incipiente ale artritelor inflamatorii, durerea este predominant legată de sinovită, iar în stadiile avansate este influențată de apariția leziunilor articulare.

Antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS) sunt substanțe din grupa analgezice-antipiretice-antiinflamatoare, cu efect predominant antiinflamator și care sunt folosite în scop antiinflamator și analgezic. Efectul antireumatic este imediat, însă are durată scurtă după întreruperea administrării. Aceste substanțe au acțiune simptomatic-patogenică, diminuând sau înlăturând unele simptome și semne ale inflamației în bolile reumatice cronice, dar nemodificând evoluția procesului patologic [3].

Inflamația implică mulți mediatori chimici produși local, incluzând prostaglandinele, leucotrienele, produși derivați ai complementului, substanțe activatoare ale leucocitelor, trombocitelor, mastocitelor. Efectul central și cel mai important al AINS este inhibarea ciclooxigenazei (COX), diminuând astfel biosinteza prostaglandinelor. Mecanismul acțiunii antiinflamatoare al AINS nu este însă complet cunoscut, pe lângă efectul de inhibiție al COX, variatele AINS având, posibil, și alte mecanisme adiționale de acțiune.

Dezvoltarea acidului acetilsalicilic, medicamentul analgezic și antiinflamator clasic, poate fi urmărită înapoi în timp până în perioada lui Hippocrat, când extractele din salcie erau utilizate pentru tratamentul febrei. În anii 1760 [NUME_REDACTAT] a raportat efectele benefice ale scoarței de salcie. Până în 1829 s-a identificat compusul activ ca fiind salicina, această descoperire având drept urmare sintetizarea acidului salicilic. Acesta, deși avea proprietăți antireumatice, determina dispepsii severe și avea gust neplăcut. Ca urmare, căutarea unor compuși derivați, dar cu proprietăți potrivite pentru folosirea practică, a dus la obținerea în anii 1860 a acidului acetilsalicilic de către [NUME_REDACTAT] pentru compania Bayer. Denumirea de aspirină a fost introdusă în anii 1890: ,,a’’ se referă la gruparea acetil, iar ,,spirina’’ amintește de genul botanic Spiraea din care se pot extrage salicilați. În primii ani ai secolului XX aspirina a fost cel mai bine vândut medicament pe plan mondial. Mai târziu au fost obținute și introduse în terapeutică și alte medicamente antiinflamatoare: fenilbutazona (1949), indometacinul (1963), ibuprofenul (1974), piroxicamul (1982). În 1971 [NUME_REDACTAT] a demonstrat pentru prima dată că mecanismul de acțiune al aspirinei și al altor AINS constă în inhibarea COX și prin urmare a sintezei de PG. În 1976 Miyamoto purifică COX, până în 1990 stabilindu-se că enzima are două izoforme, COX-2 fiind identificată de către Simmons în 1989, iar în 1999 este introdus în terapeutică celecoxibul, inhibitor selectiv al COX-2 [4,5].

Dezvoltarea unor proceduri care ameliorează producția de specii reactive de oxigen poate fi, în viitorul apropiat, un obiectiv central în cercetările asupra îmbătrânirii și bolilor în care este implicat stresul oxidativ 2.

1. Viața în prezența oxigenului. Teoria radicalilor liberi

Formele de viață incipiente – celulele simple – au apărut acum 4 miliarde de ani, iar în roci vechi de 3,5 miliarde de ani s-au descoperit microfosile ale unor organisme primitive unicelulare, procariotele 6. Atunci, atmosfera conținea puțin oxigen și viața era anaerobă. Acum aproximativ 3 miliarde de ani au apărut algele albastre-verzi (cianobacteriile), care realizau fotosinteză și care, în cele din urmă, au ridicat încet (800 milioane de ani mai târziu) concentrația oxigenului atmosferic 7,8. Creșterea concentrației de oxigen în atmosferă coincide cu dezvoltarea vieții eucariote complexe 9–11, iar explozia din Cambrian, o diversificare intensă a vieții animale care a avut loc cu aproximativ 540 milioane de ani în urmă, a început atunci când oxigenul atmosferic a atins concentrații apropiate de cele de astăzi (21%) 12,13. Într-adevăr, analizele moleculare și genetice au sugerat o corelație între dezvoltarea metabolismului aerob și creșterea complexității organismelor, pe parcursul ultimilor 2,3 miliarde de ani 10.

Metabolismul aerob, care utilizează oxigen (fosforilarea oxidativă), din mitocondrie este foarte eficient în generarea energiei din compuși organici, iar analize matematice au demonstrat că prezența oxigenului molecular în căile metabolice permite realizarea unor reacții mult mai complexe decât ar putea avea loc în absența oxigenului 14. Conform unor ipoteze, eucariotele au apărut ca urmare a includerii într-o bacteriei anaerobă (gazdă) a unei bacterii care realiza respirație (simbiont), simbiontul stând la originea mitocondriei 15. Astfel, abilitatea de a realiza metabolism oxidativ este văzută ca un factor crucial în apariția vieții multicelulare complexe și evoluția animalelor. Metabolismul oxidativ rămâne forma majoră de producere a energiei la majoritatea animalelor de astăzi. O altă consecință importantă a apariției oxigenului în atmosferă a fost formarea stratului de ozon, care protejează pământul de nivelele letale de radiații UV 6. Totuși, în ciuda multor efecte benefice, apariția oxigenului ca și constituent major al atmosferei a pus toate formele de viață care trăiesc în prezența lui în fața unei probleme fundamentale: cum să se protejeze eficient de toxicitatea oxigenului. De fapt, se crede că multe organisme primitive anaerobe au dispărut atunci când a crescut nivelul oxigenului atmosferic. Au supraviețuit doar acele specii care și-au dezvoltat mecanisme eficiente de înlăturare a efectelor toxice ale oxigenului, precum și acelea care trăiesc în medii anaerobe sau microaerobe 16,17.

Oxigenul a fost descoperit independent de spițerul suedez Karl W. Scheele, în 1772 și de chimistul amator englez [NUME_REDACTAT], în 1774 și a fost descris la început ca un gaz care întreține arderea. Priestley și-a dat seama că este produs și de către plante (prin fotosinteză) și este esențial pentru supraviețuirea animalelor (respirația) . [NUME_REDACTAT] a repetat experimentele lui Priestley, a caracterizat acest gaz, dându-i și numele curent de oxigen și se pare că și-a dat seama și de efectele toxice ale oxigenului. De atunci, se știe că oxigenul în exces este nociv asupra majorității formelor de viață, toxicitatea sa fiind stabilită experimental de [NUME_REDACTAT] (1878) și J. [NUME_REDACTAT] (1899) în timpul studierii oxigenului hiperbaric. Efectele oxigenului asupra sistemului nervos central sunt cunoscut ca efectul Bert, iar asupra plămânilor ca efectul [NUME_REDACTAT] sau efectul Smith 6.

Mecanismul acestor efecte toxice a rămas necunoscut pentru încă 50 de ani, până când [NUME_REDACTAT] și col. au postulat implicarea radicalilor oxigenului (1954), constatând că efectele toxicității oxigenului prezintă multe trăsături comune și sinergice cu cele produse de radiația ionizantă și demonstrând că multe substanțe radioprotectoare erau eficiente și împotriva otrăvirii cu oxigen, fiind de fapt, antioxidanți cunoscuți în chimia lipidelor. Se cunoștea faptul că iradierea implica ruperea homolitică a legăturilor și formarea radicalilor liberi, dar ideea că astfel de procese pot avea loc in vivo a fost revoluționară, deoarece radicalii liberii sunt prin însăși natura lor foarte reactivi și instabili. În anii 1950, [NUME_REDACTAT] a argumentat, nu numai că radicalii liberi ai oxigenului (mai exact HOO și HO) se formează in vivo, dar că efectul toxic cumulativ determinat de acești radicali liberi determină îmbătrânirea (1956). Teoria a fost controversată deoarece ideea că radicalii liberi pot exista în medii biologice nu avea suport experimental. În anii următori rezonanța paramagnetică electronică a demonstrat existența in vivo a radicalilor liberi ai carbonului, dar cea mai mare atenție asupra acestei teorii a atras-o descoperirea de către Joe McCord și [NUME_REDACTAT] a superoxid dismutazei (SOD). Faptul că natura a dezvoltat atât de abundent enzime pentru a neutraliza specific radicalii liberi superoxid susține existența acestor radicali liberi in vivo. Aproximativ în aceeași perioadă s-a demonstrat că peroxidul de hidrogen (H2O2) este generat de mitocondrie ca produs al respirației aerobe (fosforilarea oxidativă), provenind din dismutarea superoxidului, evidențiindu-se clar producerea speciilor reactive ale oxigenului în procesele biologice normale. Astfel, oxigenul este o sabie cu două tăișuri pentru viața aerobă: este necesar pentru producerea de energie, dar inevitabil ,,fură’’ electroni, generând superoxid și alte specii reactive ale oxigenului 6.

În timp, teoria originală a radicalilor liberi a fost modificată și dezvoltată, termenul nefiind întru totul corect, deoarece mulți oxidanți nu sunt radicali liberi (ex. H2O2). Harman a sugerat că producerea mitocondrială a ROS (reactive oxygen species – specii reactive de oxigen, un termen colectiv pentru superoxid, H2O2 și alte specii parțial reduse, înalt reactive ale oxigenului) determină îmbătrânirea, această idee fiind urmată de propunerea unei alte versiuni a teoriei radicalilor liberi – teoria mitocondrială. Aceasta susține că mitocondria nu este numai producătorul major de ROS, ci și principala țintă a acestora, datorită proximității cu locul de producere, leziunile determinate de ROS la nivelul mitocondriei și al ADN-ului mitocondrial ducând la acumularea de mitocondrii care vor produce mai multe ROS, determinând un cerc vicios 6.

O versiune mai generală este teoria stresului oxidativ, stresul oxidativ referindu-se la dezechilibrul dintre producția de ROS (și a produșilor înrudiți) și apărarea împotriva ROS. Se știe acum că există și alte surse endogene de ROS în afara mitocondriei. Astfel, teoria stresului oxidativ este mai flexibilă și mai puțin restrictivă decât versiunea teoriei centrată pe mitocondrie 6.

O perspectivă nouă asupra radicalilor liberi a fost impusă de descrierea efectelor biologice benefice ale radicalilor liberi. Mittal și Murard au demonstrat că anionul superoxid (O2), prin derivatul său – radicalul hidroxil, stimulează activarea guanilat ciclazei și formarea mesagerului secund GMPc. Efecte asemănătoare au fost descrise și pentru peroxidul de hidrogen. Ignarro și Kadowitz, precum și Moncada și col. au descoperit independent, rolul oxidului nitric (NO) ca moleculă reglatoare în controlul relaxării musculare și în inhibiția agregării plachetare. Roth și Dröge au descoperit că în celulele T activate, O2 sau concentrații micromolare de peroxid de hidrogen cresc producerea factorului de creștere al celulelor T pentru interleukina-2, o proteină cu importanță imunologică. Keyse și Tyrrell au demonstrat că H2O2 induce expresia genei pentru hem oxigenază (HO-1), iar Schreck și Baeuerle au raportat activarea de către H2O2 a factorului nuclear de transcripție κB în celule de mamifere 2.

La începutul secolului XXI s-a demonstrat printr-o multitudine de probe că organismele vii nu numai că s-au adaptat unei coexistențe neprietenoase cu radicalii liberi, dar au reușit chiar să dezvolte mecanisme pentru utilizarea avantajoasă a acestora. Există funcții fiziologice importante ce implică radicalii liberi sau derivații lor, printre care: reglarea tonusului vascular, sesizarea presiunii oxigenului și reglarea funcțiilor care sunt controlate de concentrația oxigenului, amplificarea semnalului de transducție provenit de la diferiți receptori membranari, inclusiv receptorul pentru antigen al limfocitelor și răspunsul la stresul oxidativ, care asigură menținerea homeostaziei redox (Tabelul 1) 2.

Tabelul 1. Funcții fiziologice care implică radicalii liberi și derivații lor.

Stresul oxidativ, determinat de un dezechilibru între ROS sau RNS și sistemele antioxidante biologice, poate duce la alterări ale macromoleculelor, producând degradări ale ADN-ului, inhibarea activității unor enzime celulare și inducerea morții celulare prin activarea cascadelor kinazelor și caspazelor [18]. Domeniul reglării redox este important și din punctul de vedere al rolului pe care stresul oxidativ îl joacă în numeroase boli. Aceste condiții patologice demonstrează importanța biologică a reglării redox. Echilibrul fragil care există între efectele benefice și cele dăunătoare constituie un aspect important al vieții. Biologia ‚,reglării redox’’ constituie un domeniu care se dezvoltă rapid, având impact asupra unor discipline diverse, printre care: fiziologia, biologia celulară și medicina clinică 2.

2. Radicalii liberi și derivații lor

Radicalii liberi sunt atomi, molecule sau fragmente moleculare care conțin unul sau mai mulți electroni impari (neîmperecheați) pe orbitalul extern sau chiar pe doi orbitali [19], care conferă, de obicei, un anumit grad de reactivitate radicalului liber [20].

Radicalii liberi ai oxigenului sau mai exact speciile reactive ale oxigenului (ROS), ca și speciile reactive ale azotului (RNS) sunt produși ai metabolismului celular normal, având un rol dual, putând fi atât benefici cât și nocivi sistemelor vii. Efectele benefice ale ROS apar la concentrații mici/medii și presupun implicarea în răspunsuri celulare fiziologice (de ex. apărarea împotriva agenților infecțioși) și în funcționarea unor sisteme de semnalizare celulară. Efectele nocive ale radicalilor liberi poartă numele de stres oxidativ (SO) și stres nitrozativ, apărând în condițiile în care există o supraproducție a ROS/RNS pe de o parte și un deficit antioxidant enzimatic sau neenzimatic pe de altă parte. Deci, stresul oxidativ apare în reacțiile metabolice care folosesc oxigen și reprezintă un dezechilibru între reacțiile antioxidante și prooxidante care au loc în organismele vii [20].

În sistemele biologice există un număr mare de diferite specii reactive ale oxigenului și azotului, cele mai importante fiind: superoxidul (O2), oxigenul singlet (1O2), radicalul perhidroxil (HO2), peroxidul de hidrogen (H2O2), radicalul hidroxil (HO), hidroperoxizii organici și radicalii hidroperoxid organici, oxidul nitric (NO), peroxinitritul (ONOO), radicalul carbonat (CO3) și aldehide reactive cu diferite lungimi ale catenei. Pot fi, de asemenea, relevanți și diferiți complecși oxo-metalici (cum sunt cei formați de H2O2 cu hemul) (Figura 1) 6 .

Figura 1. Cei mai importanți radicali liberi (RH – moleculă organică) [21]

2.1. Speciile reactive ale oxigenului

Radicalii liberi derivați de la oxigen reprezintă cea mai importantă categorie a speciilor de radicali care apar în sistemele vii [20] și pot fi grupați în :

-specii radicali: anorganici: superoxidul (O2), radicalul hidroxil (HO), radicalul perhidroxil (HO2) și organici: radicalul alcoxil (RO), radicalul hidroperoxil (ROO);

-specii neradicali: peroxidul de hidrogen (H2O2), acidul hipocloros (HOCl), oxigenul singlet (1O2), ozonul (O3), dioxigenul (O2) [19].

Diferitele căi de formare a ROS sunt prezentate în figura următoare [20]:

Figura 2. Căile formării ROS, procesul de peroxidare a lipidelor și rolul glutationului și a altor antioxidanți (vitamina E, vitamina C, acidul lipoic) în managementul stresului oxidativ (ecuațiile nu sunt egalate).

Reacția 1: Formarea superoxidului prin procesul de reducere a oxigenului molecular mediată de NAD(P)H oxidază și xantin oxidază sau neenzimatic prin intemediul compușilor reactivi redox cum este semi-ubiquinona lanțului transportor de hidrogen mitocondrial. Reacția 2: Radicalul superoxid este dismutat de către SOD la peroxid de hidrogen. Reacția 3: Peroxidul de hidrogen este cel mai bine epurat de către glutation peroxidază (GPx), care necesită glutation (GSH) ca donor de electroni. Reacția 4: Glutationul oxidat (GSSG) este redus la GSH de către glutation reductază (Gred), care folosește NADPH ca donor de electroni. Reacția 5: Unele metale tranziționale (ex. Fe2+, Cu+ și altele) pot descompune peroxidul de hidrogen cu formarea radicalului hidroxil reactiv (reacția Fenton). Reacția 6: radicalul hidroxil poate extrage un electron din acizi grași polinesaturați (LH) cu formarea unui radical lipidic (L). Reacția 7: Radicalul lipidic (L) poate interacționa mai departe cu oxigenul molecular, formând un radical peroxil lipidic (LOO). Dacă radicalul peroxil lipidic LOO rezultat nu este redus de către antioxidanți, are loc procesul de peroxidare a lipidelor (reacțiile 18-23 și 15-17). Reacția 8: Radicalul peroxil lipidic (LOO•) este redus în membrană de către forma redusă a vitaminei E (T-OH), ducând la formarea unui hidroperoxid lipidic și a unui radical al vitaminei E (T-O). Reacția 9: Refacerea vitaminei E de către vitamina C: radicalul vitaminei E (T-O) este redus la vitamină E (T-OH) de către acidul ascorbic (forma fiziologică a ascorbatului este monoanionul ascorbat, AscH–), foermându-se radicalul ascorbil (Asc–). Reacția 10: Refacerea vitaminei E de către GSH: radicalul vitaminei E oxidate (T–O) este redus de către GSH. Reacția 11: Glutationul oxidat (GSSG) și radicalul ascorbil (Asc–) sunt reduse la GSH și monoanion ascorbat (AscH–) de către acidul dihidrolipoic (DHLA) care este transformat în acid lipoic (ALA). Reacția 12: Refacerea DHLA din ALA folosind NADPH. Reacția 13: Hidroperoxizii lipidici sunt reduși la alcooli și dioxigen de către GPx folosind GSH ca donor de electroni. Procesul de peroxidare a lipidelor: Reacția 14: Hidroperoxizii lipidici pot reacționa repede cu Fe2+ cu formarea radicalilor alcoxil lipidici (LO) sau mult mai lent cu Fe3+ cu formarea radicalilor peoxil lipidici (LOO). Reacția 15: Radicalul alcoxil lipidic (LO) provenit de exemplu de la cidul arahidonic suferă un proces de ciclizare cu formarea unui ciclu hidroperoxidic cu șase atomi. Reacția 16: Ciclul hidroperoxidic cu șase atomi suferă alte transformări (implicând β-scindări) cu formarea 4-hidroxi-nonenalului. Reacția 17: 4-hidroxi-nonenalul este transformat într-un aduct glutatiil inofensiv (GST, glutation S-transferază). Reacția 18: Un radical peroxil localizat în interiorul catenei acidului gras se poate cicliza formând un peroxid ciclic. Reacția 19: Acest radical poate fi redus cu formarea unui hidroperoxid (reacția nu este prezentată) sau poate suferi o ciclizare secundară cu formarea unui peroxid biciclic care după cuplarea cu dioxigenul și reducere formează o moleculă asemănătoare structural cu un endoperoxid. Reacția 20: Compusul rezultat este un intermediar în formarea malondialdehidei. Reacțiile 21, 22, 23: Malondialdehida poate reacționa cu bazele ADN citozina, adenina și guanina cu formarea unor aducți M1C, M1A respectiv M1G [20].

2.1.1. Sursele speciilor reactive ale oxigenului

Deși speciile reactive de oxigen pot să apară în multe împrejurări și în diferite compartimente celulare, numărul enzimelor care generează O2 este relativ scăzut. O2 poate fi produs de NADPH oxidaze, xantin oxidaze, aldehid oxidaze, citocromi P450 și lanțul transportor de electroni mitocondrial. Multe alte sisteme enzimatice (cel mai adesea oxidaze, ex. monoamin oxidaza) generează H2O2. O sursă de H2O2 deosebit de activă include enzime implicate în oxidarea acizilor grași din peroxizomi.

De asemenea, s-a sugerat că α-cetoglutarat dehidrogenaza generează superoxid și H2O2. Experimental, s-a constatat în mitocondrii provenind de la Drosophila melanogaster, că glicerol 3-fosfat dehidrogenaza este o sursă majoră de superoxid.

Deși rata producerii mitocondriale a superoxidului este cel mai probabil scăzută in vivo (aproximativ 1 electron din 40000 este deviat spre formarea de superoxid), este totuși suficient de mare pentru a fi incompatibilă cu viața în absența SOD. Studii efectuate folosind inhibitori ai respirației (ex. antimicina A, rotenon) au arătat că aproape orice interferență în delicatul transfer de electroni prin lanțul respirator, determină o creștere foarte mare a producției de ROS.

Presiunea oxigenului influențează, de asemenea, producția de superoxid, iar absența oxigenului (anaerobioza sau anoxia) este singura modalitate cunoscută de prevenire a formării superoxidului. Și căldura, care denaturează proteinele și expune intermediarii reactivi la O2, stimulează foarte mult producția de superoxid (în anumite modele, anaerobioza crește foarte mult toleranța termică). Astfel, proteinele de șoc termic ar putea micșora producția de superoxid, prin menținerea complecșilor transportori de electroni într-o stare adecvată 6.

În organism, ROS (O2, HO, H2O2, HClO, 1O2) sunt generate la nivelul mitocondriilor, peroxizomilor și lizozomilor și la nivel membranar celular și microzomal, în cursul sintezei de PG, când se eliberează HO [19,22].

S-a demonstrat că NADH-ubichinon oxido-reductaza (complexul I) și ubichinol/citocrom c oxido-reductaza (complexul III), care conțin semiubichinonă, generează O2 și H2O2. Producerea ROS mitocondrială a fost implicată și în stresul oxidativ mediat de TNF.

Xantin oxidaza generează O2 prin transformarea hipoxantinei în xantină și a xantinei în acid uric. În condiții normale, xantin oxidaza este responsabilă de producerea unui procent mic din totalul ROS, dar producerea ROS de către xantin oxidază în celulele endoteliale tratate cu TNF a fost considerată ca sursă majoră de stres oxidativ în anumite procese patologice (ex. ischemia).

ROS generate prin oxidarea dopaminei au fost implicate în distrugerea neuronilor dopaminergici la persoanele vârstnice și mai ales în boala Parkinson 2,23.

Figura 3. Localizarea celulară a producerii ROS (membrana plasmatică, mitocondrie, citoplasmă). Cea mai mare cantitate de ROS este produsă în mitocondrie datorită pierderii de electroni din lanțul respirator. La suprafața celulei, NADPH oxidazele transportă electronii prin membrana plasmatică, generând superoxid [22].

2.1.2. Superoxidul (O2)

O2 este o specie destul de puțin agresivă, însă poate determina formarea multor specii reactive (HO, HO2, H2O2, 1O2, ONOO) [19].

Formarea și inactivarea O2

Se formează prin reducerea oxigenului molecular (dioxigenul), cu ajutorul unui electron, proces mediat enzimatic de către NAD(P)H oxidază, xantin oxidază, aldehid oxidază, citocromul P450 sau nonenzimatic, prin intermediul unor compuși redox-reactivi, cum este semi-ubichinona din lanțul transportor de electroni mitocondrial 2,6.

Superoxidul este transformat enzimatic de către SOD în peroxid de hidrogen, dar poate fi transformat și neenzimatic în H2O2 și oxigen singlet (1O2), H2O2 putând fi mai departe transformat în apă de către catalază sau glutation peroxidază 2.

Figura 4. Căi de formare și metabolizare ale superoxidului [2]

Tabelul 2 . Principalii factori care controlează nivelul de superoxid [21]

Principala sursă de O2 este complexul I și III al lanțului respirator, dar în caz de hipoxie sau disfuncție ar putea genera O2 și complexul II. În complexul I, principalele localizări ale formării O2 se consideră a fi centrii Fe-S și situsul activ flavinic. În timp ce complexul III eliberează O2 atât în matrice cât și în spațiul intermembranar, complexul I direcționează producția de O2 către matrice [21].

Figura 5 . Lanțul transportor de electroni mitocondrial principala sursă celulară de radicali liberi [24].

Sursele extramitocondriale de O2 includ: reticulul endoplasmic, un lanț redox lizozomal și enzimele membranare Nox. Reticulul endoplasmic neted conține enzime care detoxifică xenobiotice, printre care izoformele citP450, în special CYP2E1 inductibilă de către etanol, capabile să reducă O2 la O2 și H2O2. Alte enzime – xantin oxidaza, aldehid oxidaza, dihidroorotat dehihdrogenaza, triptofan-dioxigenaza – pot produce O2 ca produs secundar. Sintaza oxidului nitric (NOS), în forma „necuplată” care apare în urma deficitului de cofactori (tetrahidrobiopterină sau L-arginină), poate produce O2. 5-Lipooxigenaza generează direct O2 și indirect ROS prin activarea Nox indusă de leucotriene. O2 rezultă și prin autooxidarea flavinelor, hidrochinonelor, tiolilor și metalelor (libere sau legate de proteine) [21].

Dintre enzimele familei Nox, prima descoperită a fost Nox2, responsabilă de explozia respiratorie din fagocite. Nox2 precum și alți analogi ai acestei enzime se găsesc în diferite celule și se pare că micile cantități de O2 produse de acestea sunt implicate în semnalizarea celulară. [NUME_REDACTAT] sunt denumite Duox (dual function oxidase), deoarece pe lângă domeniul Nox au un domeniu omolog tiroid peroxidazelor. [NUME_REDACTAT] sunt implicate în activarea majorității enzimelor Nox, Rac1 fiind distribuită peste tot, Rac2 în principal în celulele mieloide, iar Rac3 în sistemul nervos. Existența atâtor izoforme Nox sugerează importanța in vivo a cascadei de semnalizare redox-sensibilă, stimularea excesivă a enzimelor Nox de către citokine și alți mediatori fiind implicată în diferite patologii [21].

Descompunerea spontană a superoxidului este dependentă de pH și poate fi scrisă astfel 6 :

O2 O2 2H H2O2 O2 (k 105 M1 s1 la pH 7,0)

În 1938, Mann și Keilin au izolat hemocupreina, o enzimă pe care în 1969, McCord și Fridovich au redenumit-o mai corect superoxid dismutază (SOD), după ce au descoperit că enzima catalizează dismutarea O2, cu formarea O2 și a H2O2, viteza acestei transformări fiind una dintre cele mai mari cunoscute pentru o reacție enzimatică [25].

Mecanismul general al acțiunii SOD poate fi reprezentat după cum urmează, unde M reprezintă metalul (Cu2+ sau Mn3+), iar k este constanta de viteză, care nu variază la un pH cuprins între 5,5 și 9 6:

O2 SOD-M O2 SOD-M (k 109 M1 s1)

O2 2H SOD-M H2O2 SOD-M (k 109 M1 s1)

Astfel, SOD accelerează distrugerea superoxidului prin creșterea constantei de viteză pentru dismutarea spontană de până la 1000 de ori, fiind mai eficientă comparativ cu dismutarea spontană, la concentrații scăzute de O2. Totuși, deoarece o enzimă nu poate modifica direcția echilibrului, ci numai viteza cu care este atins, există o limită inferioară a concentrației de superoxid sub care enzima nu îl poate reduce 6 .

Producerea H2O2 impune cuplarea SOD cu catalaza (CAT) care descompune H2O2, pentru a împiedica reacția:

O2 + H2O2 → HO +HO– + O2

cu formarea radicalului HO foarte nociv 19 .

Totuși, pentru a cataliza dismutarea O2, SOD poate determina o serie de reacții secundare din care rezultă diferiți radicali, cei mai reprezentativi fiind HO și CO3, într-o manieră dependentă de H2O2, numită reacție de peroxidare 6,26. De asemenea, poate descompune peroxinitritul, transformându-l în radicalul NO2 foarte reactiv 6,27.

SOD este o enzimă inductibilă, concentrațiile crescute de O2 determinând accelerarea sintezei sale 19 .

La mamifere au fost identificate trei izoforme ale SOD, care exercită același rol, dar diferă prin structura proteică, localizare cromozomială, cofactori metalici, localizare celulară:

-CuZnSOD – codificată de gena sod1 și localizată în citoplasmă, nucleu și membrana mitocondrială;

-MnSOD – codificată de gena sod2 și localizată în matricea mitocondrială;

-SOD extracelulară (EC-SOD) – codificată de gena sod3 și localizată în membrana plasmatică și în fluidul extracelular [18]

Implicațiile O2

Producerea O2 în cursul fagocitozei determină omorârea bacteriilor. De asemenea, O2 joacă un rol important în reglarea tonusului vascular, controlând producerea NO. Endoteliul produce cantități mici de O2, ce reacționează cu NO formând produși inactivi (ionul nitrat) 19.

O2 + NO → intermediari → NO3–

În afara dismutării, superoxidul poate acționa atât ca reducător (ex. superoxidul reduce fericitocromul la starea feroasă) cât și ca oxidant, prin intermediul combinațiilor ferului cu sulful cu potențial scăzut, eliberând fer activ redox. Eliberarea Fe2+ din combinațiile fer-sulf este considerată de unii cercetători ca fiind principala cale de manifestare a toxicității biologice a superoxidului 28,29: disponibilitatea ferului activ redox se consideră a fi etapa limitantă de viteză în formarea HO prin reacție Fenton [6].

Superoxidul, după transformarea în HO2 poate iniția peroxidarea lipidelor. Alte oxidări cu potențială importanță biologică includ reacția cu catecolii și tiolii, ultima putând avea loc printr-o reacție în lanț asemănătoare peroxidării 6,30. O2 fiind un radical liber poate reacționa cu alți radicali liberi, cu viteză mare, de exemplu cu NO, formând peroxinitrit și acid peroxinitric 31. Peroxinitritul poate suferi rearanjări chimice ulterioare, ducând la formarea unor oxidanți puternici (NO2, HO, CO3) 32, producerea acestora fiind considerată de unii cercetători ca principala cale de manifestare a toxicității O2, părere care rămâne însă controversată, deoarece formarea peroxinitritului nu este singura reacție radicalică de neutralizare relevantă din punct de vedere biologic, multe enzime folosind radicali liberi delocalizați ca parte a mecanismului lor catalitic normal 6,33. Teoretic, O2 poate reacționa foarte rapid cu astfel de radicali, determinând inactivare enzimatică ireversibilă, de exemplu reacția cu radicalii tirozil ai ribonucleotid reductazei, enzimă esențială pentru sinteza ADN-ului, ducând la formarea peroxidului corespunzător și inactivarea ireversibilă a acestei enzime 34. Există și alte căi ale toxicității O2: inițierea oxidării lanțurilor zaharidice scurte 35, formând compuși ,-dicarbonilici toxici, oxidarea unor proteine de tipul hemoglobinei sau mioglobinei, rezultând forme met- incapabile să transporte oxigen 6.

2.1.3. Peroxidul de hidrogen (H2O2)

Formarea, reactivitatea și inactivarea H2O2

H2O2 este generat în toate organismele aerobe ca rezultat al metabolismului celular normal, în special prin dismutarea O2, dar și prin acțiunea altor enzime (enzimele care metabolizează acidul arahidonic, xantin oxidaze, NOS, citocrom P450, NADPH oxidaze) ca și în răspunsul celular la radiațiile ultraviolete [36].

Peroxizomii pot să producă și, de asemenea, să epureze H2O2, deoarece conțin enzime care generează H2O2 (ex. D-aminoacid oxidaze, urat oxidaze, L-α-hidroxiacid oxidaze, acil-CoA oxidaze, glicolat oxidaze), dar și catalază. Oxidazele extraperoxizomale inclusiv amin oxidazele pot fi surse directe de H2O2 [21].

Tabelul 3 . Principalii factori care controlează nivelul H2O2 [21]

H2O2 reacționează cu ionii metalici în cadrul reacțiilor Haber-Weiss și Fenton, reacția Fenton perfecționându-se în cursul evoluției, prin utilizarea unor ioni în stări superioare de valență și a unor enzime de tipul catalazei sau peroxidazei [19]:

2 H2O2 H2O +O2

H2O2 + H2O2 2H2O + O2

H2O2 + R–CH2OH 2H2O + R–CHO

Catalaza acționează ca o dismutază a H2O2, transformând două molecule de H2O2 în O2 și H2O. În peroxizomi, pentru neutralizarea H2O2, catalaza poate acționa folosind substraturi diferite [19]:

2H2O2 + O2 → H2O +O2

H2O2 + fenoli → 2H2O + chinone

H2O2 + etanol → 2H2O + acetaldehidă

Activitatea CAT este foarte eficientă și este completată de către peroxidaze, cele mai cunoscute fiind MPO, lactoperoxidaza, GPx [6,19]:

H2O2 + AH2 → 2H2O + A

Catalaza constituie cea mai economică modalitate de a înlătura H2O2, fiind foarte eficientă în descompunerea unei mari cantități de H2O2, dar la concentrații scăzute de H2O2 demonstrează o activitate peroxidazică nespecifică, de exemplu, poate cataliza oxidarea dependentă de H2O2 a unor molecule 6 .

Nivelele de CAT și GPx diferă în funcție de țesut, în creier constatându-se o activitate scăzută a CAT și relativ crescută a GPx, pe când în ficat ambele enzime au o activitate crescută [37].

Termenul de glutation peroxidază este utilizat pentru a defini o familie de proteine înrudite filogenetic cu peste 700 de membrii, răspândite în toate domeniile vieții, la mamifere fiind detectate până la opt GPx diferite, dar doar trei dintre ele (GPx-1, 3 și 4) au fost caracterizate funcțional [38].

GPx catalizează reacția de reducere a H2O2 și a hidroperoxizilor organici, folosind glutation (GSH) [19,37]:

H2O2 + 2GSH → 2H2O + GSSG

Cea mai studiată GPx este GPx-1, care este exprimată în diferite țesuturi, dar cu nivele maxime în ficat și rinichi. Este distribuită atât în citoplasmă, cât și în mitocondrie și reduce mai ales hidroperoxizii anorganici și organici solubili. GPx-2 (GPx gastrointestinală) și GPx-3 (GPx plasmatică) sunt exprimate mai ales în tractul gastrointestinal și respectiv în rinichi, având structură și specificitate de substrat asemănătoare cu GPx-1, cu excepția faptului că GPx-3 este o glicoproteină extracelulară [37]. GPx-4 (phospholipid hydroperoxide GPx) poate reduce hidroperoxizii lipidelor complexe, acționând și asupra hiroperoxizilor incluși în membrane [37] și antagonizând astfel activitatea 12/15-lipooxigenazelor, care peroxidează lipidele membranare fără o eliberare prealabilă a acizilor grași [38]. Dacă activitatea acestei lipooxogenaze nu este inhibată de către GPx-4 sau produșii săi nu sunt metabolizați de GPx-4, ea declanșează o cale specifică a morții celulare programată, care nu este mediată de activarea caspazelor, ci de AIF (apoptosis-inducing factor), sugerând nu numai că GPx-4 este un protector al membranei, ci oferind și o posibilă explicație faptului că lipsa GPx-4 la șoareci determină letalitate prenatală, pe când lipsa celorlalte GPx este compatibilă cu viața [38].

Mieloperoxidaza (MPO) din neutrofile transformă H2O2 în acid hipocloros (HOCl), un oxidant puternic, ce acționează ca agent bactericid în fagocite. Prin reacția dintre HOCl și H2O2 se formează 1O2 [19].

Mult timp, GPx și CAT au fost considerate ca fiind principalele mecanisme de epurare a H2O2 celular, dar studiile realizate pe organisme cărora le lipseau aceste enzime nu au demonstrat o creștere semnificativă a stresului oxidativ endogen, acest fapt datorându-se, în opinia unor autori, detoxifierii H2O2 printr-un alt sistem enzimatic – peroxiredoxinele 6, ce catalizează reducerea H2O2 și a peroxizilor organici la apă, respectiv alcooli, unele izoforme fiind capabile să descompună și peroxinitritul [39].

Peroxiredoxinele sunt o familie de proteine antioxidante, cu activitate peroxidazică, la mamifere existând șase izoforme, (Prx 1-6), care adesea au denumiri proprii. În funcție de țesut au concentrații celulare variabile, reprezentând 0,1-1% din proteinele hidrosolubile, concentrații care le permit să acționeze ca tampon redox, controlând nivelul intracelular de H2O2. Datorită mecanismului catalitic specific, Prx pot funcționa ca senzori redox ai H2O2 și modulatori ai activității de semnalizare a H2O2 [39]. Peroxiredoxinele sunt inactivate de nivele mari de H2O2, deoarece situsul lor activ tiolic este oxidat (,,supraoxidat’’) la acid sulfinic, nefiind eficace în a înlătura nivele ridicate de H2O2. Dimpotrivă, ele par a fi țintele preferate de nivelele scăzute de H2O2, probabil datorită marii lor abundențe, potențialului redox scăzut și vitezei rapide de reacție cu H2O2 6,40,41,42.

Implicațiile H2O2

Există unele studii care dovedesc implicarea H2O2 în procese de reglare vitale pentru funcționarea normală a celulelor cum sunt: creșterea, diferențierea, motilitatea și adeziunea celulară, iar altele sugerează rolul esențial al H2O2 în modularea activității diferitelor molecule semnal (ex. fosfataze, kinaze, proteaze, canale ionice, transportori, factori de transcripție, ciclu celular) [39].

H2O2 este de obicei un oxidant lent 30 și este mai degrabă stabil. Totuși, în prezența unor catalizatori metalici sau a hemului poate acționa ca un oxidant foarte rapid și neselectiv; anumite molecule biologice sunt ținte directe ale H2O2, mai ales acelea care conțin cisteină. Oxidarea tiolului indusă de H2O2 poate fi dăunătoare așa cum este în cazul enzimei gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, dar de asemenea poate fi importantă în reglarea redox a anumitor enzime, așa cum este cazul PTP1B fosfatazei 6.

2.1.4. Radicalul hidroxil (HO)

Formarea și inactivarea HO

HO, unul dintre cei mai puternici agenți oxidanți cunoscuți în chimie [6], se poate forma în citoplasmă, microzomi și mitocondrii [19], printr-o reacție numită transformare Fenton, care presupune reacția H2O2 cu ionii metalici reduși, în absența O2 (mai ales cu Fe2+ și Cu+) 43 :

Fe2+ H2O2 HO HO Fe3

Cu H2O2 HO HO Cu2

Cea mai importantă cale de formare a HO este reacția de interconversie a O2 și H2O2, transformarea Haber-Weiss, care are loc în prezența unor ioni metalici, cum este ferul [19]:

O2 H2O2 O2 HO HO

care combină o reacție Fenton (O2 H2O2 + Fe2+ HO HO Fe3) cu reducerea Fe3 de către O2, ducând la Fe2+ și oxigen (Fe3 + O2 → Fe2+ O2) [20].

HO reacționează cu aproape toate substanțele existente în celulă, toxicitatea sa fiind neselectivă, ceea ce face din antioxidanți epuratori puțin eficienți ai HO. Spre deosebire de H2O2 și O2, nu există o enzimă care să neutralizeze specific HO și se pare că sistemele biologice reglează foarte precis disponibilitatea ionilor metalici capabili să realizeze transformare Fenton sau Haber-Weiss (de ex. feritina și transferina reduc concentrațiile ferului și cuprului, metalotioneinele fixează ioni metalici) pentru a minimiza formarea HO 6,19.

2.1.5. Radicalul hidroperoxil sau perhidroxil (HOO)

Este forma protonată (acidul conjugat) a O2 [20], formarea în exces a O2 fiind o sursă majoră pentru formarea HOO. Dismutarea spontană a O2 și generarea H2O2 are loc în două etape, în prima formându-se HOO [19]:

O2 + H+ → HOO

O2 + HOO + H+ → H2O2 + O2

HOO inițiază peroxidarea acizilor grași pe două căi paralele: independent de hidroperoxizii acizilor grași și dependent de aceștia, ultima putând fi importantă în ceea ce privește mecanismul inițierii peroxidări lipidelor in vivo [20].

2.1.6. Radicalul peroxil (ROO)

Peroxizii și compușii lor de descompunere reprezintă finalul activării O2, fiind cele mai stabile ROS. Peroxidarea constă în producerea unor reacții în lanț, în cursul cărora pot să apară amestecuri complexe de peroxizi și compuși de descompunere, fiind un fenomen universal răspândit, care necesită un raport optim între prooxidanți/antioxidanți, cu depășirea sistemelor antioxidante [19].

2.1.7. Oxigenul singlet (1O2)

Nu este un radical liber propriu-zis, neavând electroni impari, dar are efect distructiv important, mutagen și genotoxic prin afectarea guaninei și fragmentarea ADN, fiind implicat și în peroxidarea lipidelor și oxidarea proteinelor. Este considerat ca cea mai puternică ROS, alături de HO [19].

2.1.8. Acidul hipocloros (HOCl)

Este o specie reactivă neradical a oxigenului, care contribuie la efectul bactericid al ROS în fagocite. În timpul exploziei respiratorii în macrofage și neutrofile crește producția de O2, H2O2, HO, 1O2 și NO cu efecte antimicrobiene și antitumorale, iar prezența mieloperoxidazei (MPO) determină, prin oxidarea Cl– folosind H2O2, formarea hipocloritului, care contribuie la distrugerea agenților patogeni [19]:

H2O2 + Cl– H2O + OCl– sau

H2O2 + Cl– OOCl– + 1O2 + 2H+ sau

H2O2 + Cl– OCl– + 1O2 + H2O

sau prin protonarea OCl– : OCl– + H+ → HOCl.

Majoritatea OCl– generat astfel este convertit în cloramine toxice [44]:

OCl– + H+ + R―NH2 → R―NHCl + H2O

sau poate reacționa cu alți compuși [19]:

OCl– + 1O2 + aminoacizi, acizi grași → cloramine, peroxizi, aldehide

HOCl este un oxidant puternic fiind responsabil nu doar de efectele antimicrobiene, ci și de cele lezante din inflamația cronică mediată de PMN [44].

MPO este singura peroxidază ce catalizează oxidarea Cl– la hipoclorit, transformând astfel 20–70% din H2O2 eliberat de neutrofilele activate [45].

În afara acestei activități de halogenare, MPO acționează ca o peroxidază clasică. MPO ferică reacționează cu H2O2 produs de neutrofilele stimulate pentru a forma intermediarul redox–compusul I, care este un oxidant puternic ce reacționează cu diferite substraturi. Compusul I poate fi redus de către substraturi organice (RH) rezultând radicali liberi și compusul II, ce reacționează cu o a doua moleculă RH refăcând enzima [46]:

Compusul I + RH → Compusul II + R

Compusul II + RH → MPO + R

2.2. Specii reactive ale azotului

Azotul poate forma specii reactive (RNS – reactive nitrogen species) de tipul:

-radicali: oxid nitric sau monoxid de azot (NO), dioxid de azot sau oxid nitros (NO2);

-neradicali: acid azotos sau acid nitros (HNO2), acid azotic sau acid peroxinitros (HNO3), trioxid de azot (N2O3), tetraoxid de azot (N2O4), cationul nitrozoniu (NO+), anioni: nitroxil (NO–), peroxinitrit (ONOO), nitrit (NO2–), nitrat (NO3–) [19].

Supraproducția RNS se numește stres nitrozativ și apare atunci când generarea RNS depășește capacitatea respectivului sistem de a neutraliza și elimina aceste specii, ducând la reacții de nitrozilare care alterează structura proteinelor, inhibându-le funcționarea normală [20].

2.2.1. Oxidul nitric (NO)

Formarea NO

A fost descoperit de Furchgott și Zawadzki ca factor relaxant derivat din endoteliu (endothelium –derived relaxing factor EDRF), care prin activarea guanilat ciclazei determină vasodilatație și alte funcții fiziologice reglatoare [47].

Stările reactive ale NO pot fi: anionică – nitroxil (NO–), radical (NO), cationică – nitrozoniu (NO+) [19].

Radicalul NO conține un electron neîmperecheat pe orbitalul de antilegătură 2π*y și este generat în țesuturile de către NOS (nitric oxide synthase), prin transformarea L-argininei în L-citrulină (Figura 6) [20,48].

Figura 6. Sinteza și transformările NO [52]

Există trei izoforme ale NOS: neuronală (nNOS sau NOS I), endotelială (eNOS sau NOS III) și inductibilă (iNOS sau NOS II) [49].

Tabelul 4 . Izoformele NOS (LPS – lipopolizaharide) [49]

Cinetica producerii NO de către izoformele NOS este diferită: iNOS produce cantități mari, toxice de NO o perioadă mai lungă de timp, pe când nNOS și eNOS produc rapid cantități mai mici de NO pentru acțiune directă și imediată [47].

Implicațiile NO

Wink și col. au împărțit biochimia NO în două tipuri de efecte: directe și indirecte [50,51]. Efectele directe, care au loc la concentrații mici de NO și probabil sunt responsabile de majoritatea efectelor fizilogice și reglatoare ale NO, sunt mediate direct de NO și includ interacțiile cu metalele, metaloproteinele (ex. legarea NO de hemul guanilat ciclazei, citocromului P-450, citocrom c oxidazei, peroxidazelor, ciclooxigenazelor) și capacitatea de epurare a radicalilor liberi (ex. transformarea O2, cu formarea ONOO, a HO cu formarea HNO2, a peroxizilor lipidici și a altor radicali liberi). În condițiile unui stres oxidativ mărit, crește posibilitatea interacțiunii NO și ROS formate în exces, ducând la apariția RNS, responsabile de efectele indirecte, ducând la nitrozarea, nitrarea sau oxidarea unor biomolecule [51].

În timpul exploziei respiratorii, celulele sistemului imun produc atât O2 cât și NO, cele două specii reactive putând reacționa între ele, rezultând în cantități mari un oxidant putenic – anionul peroxinitrit, toxicitatea NO fiind legată în principal de capacitatea de a se combina cu O2 [20]:

O2 + NO → ONOO

ONOO mediază efecte citotoxice precum lezarea ADN, oxidarea LDL, formarea izoprostanilor, inhibiția aconitazei și a respirației mitocondriale [47], nitrarea tirozinei și resturilor de tirozină din proteine [46].

Cantitățile mari de NO și ONOO pot determina, prin nitrarea cisteinei (din structura lor), activarea sau inactivarea unor enzime implicate în procese de semnalizare celulară și esențiale pentru supraviețuirea celulei, cum sunt: proteinele JAK sau STAT, calea NF-κB/IκB sau MAPK, proteine G și factori de transcripție [47].

S-a descoperi că MPO catalizează și nitrarea tirozinei, prezența 3-nitrotirozinei la locul inflamației implicând ONOO în lezarea tisulară din inflamație [46].

2.3. Sisteme antioxidante

Sistemele antioxidante ale eucariotelor s-au dezvoltat din trei sisteme enzimatice clasice – SOD, catalaza și glutation peroxidaza – pentru a include un grup de agenți enzimatici și neenzimatici care încă se extinde 6. Pe lângă cele trei sisteme enzimatice majore menționate în organism mai există și alte enzime capabile să epureze ROS cum sunt: glutation S-transferaza, sitemele tioredoxine/peroxiredoxine, tiroid peroxidaza, eozinofil peroxidaza, sulfiredoxina (Srxn1) (o enzimă care poate reduce acidul sulfinic la tiol, printr-o reacție dependentă de ATP) 52. S-a constatat în anumite studii de stres oxidativ că Srxn1 este up-reglată în raporturi foarte ridicate (ex. inducția ei masivă este observată în leziunile pulmonare produse de hiperoxie sau fosgen) 6. O activitate catalitică similară sulfiredoxinei o au sestrinele 1 și 2, iar blocarea genei implicată în codificarea lor determină creșterea leziunilor oxidative, scurtarea duratei de viață și cancer, care pot fi atenuate semnificativ prin introducerea în dietă a unui antioxidant cum este N-acetilcisteina 6,53.

Antioxidanți neenzimatici pot fi și proteinele complexante: transferina, feritina, lactoferina, albumina, ceruloplasmina și metalotioneinele [54].

Agenții antioxidanți cu masă moleculară mică pot fi:

-endogeni: glutationul, coenzima Q, acidul lipoic, hormonii sexuali, bilirubina [6] (care poate acționa ca antioxidant prin ruperea lanțului de peroxidare, Snyder și col. raportând că biliverdina/bilirubina și biliverdin reductaza formează o rețea care detoxifică, catalitic H2O2, iar îndepărtarea ei determinând moarte celulară prin apoptoză 55).

-exogeni: vitamina C (acid ascorbic), vitamina E (tocoferol), vitamina P (flavonoide), provitamina A (beta-caroten) [54] acționează neutralizând stoechiometric un radical liber, cu excepția provitaminei A care poate inactiva mai multe molecule de oxigen singlet. Vitamina E reacționează cu radicalii liberi ai oxigenului cu formarea unui radical tocoferil stabil, stopând astfel lanțul reacțiilor radicalilor liberi. Vitamina C reacționează cu radicalul tocoferil formând ascorbil, foarte stabil, regenerând vitamina E și având astfel un rol antioxidant indirect. Vitamina P este antioxidantă și regenerabilă prin vitamina E, ca și vitamina C. Provitamina A inactivează mai multe molecule de oxigen singlet, utilizând energia acestuia pentru convertirea formei cis a beta-carotenului în forme trans și invers 3.

3. Rolul ROS în diferite afecțiuni – implicațiile fiziopatologice ale reglării redox

Rolul important al ROS în reglarea răspunsurilor fiziologice este subliniat de aparentele neregularități ale răspunsurilor fiziologice în diferite boli care sunt legate de stresul oxidativ. Nivele excesive de ROS pot fi generate fie prin stimularea excesivă a NAD(P)H oxidazei, fie prin alte mecanisme care produc ROS în mod accidental (producerea ROS în exces de către lanțul transportor de electroni mitocondrial). Producerea ROS în lanțul transportor de electroni mitocondrial depinde în parte de disponibilitatea substratului. În celulele endoteliale creșterea concentrației de glucoză extracelulară determină creșterea masivă a producției de ROS de către lanțul transportor de electroni mitocondrial și o activare corespunzătoare a NF-kB (Figura 7) 2.

Restricția calorică este o strategie experimentală eficientă de diminuare a stresului oxidativ in vivo și de creștere a duratei de viață la animale, iar exercițiile fizice pot substitui într-o anumită măsură restricțiile calorice la om. Exercițiile fizice intense induc însă diferite manifestări ale stresului oxidativ 2.

Diabetul zaharat și cancerul prezintă de obicei o modificare pro-oxidativă în statusul redox tiol/disulfură, similar cu cel observat la vârste înaintate. Aceste condiții de stres oxidativ mitocondrial sunt de obicei asociate cu pierderea masei musculare. În diabetul zaharat ROS pot fi generate și de auto-oxidarea glucozei, care este asociată cu formarea proteinelor glicate în plasmă. ROS sunt carcinogene potențiale care facilitează mutageneza, promovarea și progresia tumorilor. Efectele de promovare a creșterii determinate de ROS sunt legate de cascadele de semnalizare care răspund la modificările redox [2].

Figura 7. Efectul disponibilității substratului asupra producției de ROS. Cantități substanțiale de superoxid sunt produse de componenta semiubichinonică a lanțului transportor de electroni mitocondrial. Probabilitatea producerii ROS este mărită dacă influxul de electroni este mare, iar consumul de electroni de către citocrom oxidază în complexul IV mitocondrial este relativ scăzut. Consumul de electroni este mic dacă gradientul de protoni este mare, de exemplu, doar dacă numai câțiva protoni sunt consumați de către sistemul ce generează ATP ca rezultat al concentrațiilor relativ ridicate de ATP și scăzute de ADP. Această împrejurare, în mod normal, inhibă glicoliza și prin urmare și influxul altor substraturi energetice în interiorul mitocondriei. La concentrații mari de glucoză, de exemplu, ca rezultat al activității necorespunzătoare a glicogen sintazei, acest control poate fi încălcat, rezultând o creștere a producției de ROS. (PFK – fosfofructokinază) 2.

Un alt grup de boli desemnate ca ,,boli inflamatorii oxidative’’ include ateroscleroza și inflamația cronică și este de obicei asociat cu stimularea excesivă a activității NAD(P)H oxidazei. Unele complicații patologice sunt un indicator al neregularităților în semnalizarea cascadelor mediate redox și/sau exprimării unor gene (ex. supraproducția moleculelor de adeziune). Producerea ROS de către xantin oxidază a fost implicată în patologia ischemiei și a leziunilor de reperfuzie, iar mecanisme similare par să acționeze și în apneea obstructivă din timpul somnului 2.

Teoria implicării radicalilor liberi în procesul îmbătrânirii susține că fenomenele degenerative legate de îmbătrânire sunt într-o mare măsură consecința leziunilor induse de radicalii liberi, dovezi din ce în ce mai multe susținând că îmbătrânirea implică și modificări progresive în procesele reglatorii mediate de radicalii liberi, alterând expresia unor gene (Figura 8).

Figura 8. Stresul oxidativ și îmbătrânirea: modificări observate legate de vârstă și mecanisme posibile. O creștere persistentă a producției de ROS, fie în mitocondriile țesutului muscular scheletic, fie prin stimularea cronică a activității NAD(P)H oxidazei din leucocite poate determina neregularități în căile de semnalizare redox-sensibile, adițional leziunilor oxidative directe. Schimbările progresive ale statusului redox al sistemului tiol/disulfură plasmatic pot determina modificări ale căilor de semnalizare redox-sensibile în orice loc din organism 2.

Există diferite manifestări indirecte ale stresului oxidativ la vârste înaintate, printre care: peroxidarea lipidelor, oxidarea ADN-ului, oxidarea proteinelor și o modificare a statusului redox tiol/disulfură al unor cupluri redox cum sunt glutationul, cisteina și albumina. Toate aceste manifestări sugerează că rata producției de ROS pe unitate de timp crește cu vârsta. Termenul de ,,senescență replicativă’’ descrie faptul că celulele somatice se multiplică în culturi celulare într-un număr finit de generații. Dovezi recente sugerează faptul că micșorarea capacității replicative poate fi corelată cu creșterea nivelelor de ROS și/sau cu modificarea pro-oxidativă a statusului redox tiol/disulfură. S-a demonstrat, de asemenea, că stresul oxidativ moderat determină scurtarea telomerilor în fibroblaști 2.

4. Procesul inflamator și implicațiile stresului oxidativ în afecțiunile inflamatorii

4.1. Procesul inflamator

Procesul inflamator stă la baza mecanismelor patogenice din cadrul multor afecțiuni. Inflamația reprezintă un proces patologic complex, care cuprinde toate reacțiile vasculare, metabolice, celulare, care apar în urma unor agresiuni tisulare (fizice, infecțioase, chimice, imunologice) ca un răspuns biologic nespecific de apărare, urmat de fenomene reparatorii, servind la menținerea integrității individului. Perpetuarea inflamației este nocivă, putând determina distrugerea structurilor și limitarea funcțiilor fiziologice. În inflamație se produc modificări ale microcirculației, ale fluxului sanguin, ale metabolismului celular și mai ales ale țesutului conjunctiv. Dacă nu se intervine terapeutic, un proces inflamator local antrenează și reacții generale cum sunt: febra, leucocitoza, mobilizarea factorilor umorali nespecifici, care, la rândul lor influențează desfășurarea proceselor locale 56.

Datorită modificărilor care se produc în structura endoteliului vascular, are loc o creștere a permeabilității vasului cu exudarea apei, electroliților și proteinelor plasmatice, precum și un proces de infiltrare a țesutului inflamat cu celule sanguine. În forma cronică a inflamației participă în număr mare și limfocite de tip T și B. Afectarea substanței conjunctive fundamentală este urmată de eliberarea histaminei, serotoninei, polipeptidelor de tipul kininelor (bradikinina) și apariția unor enzime lizante (liziloxidaza, fosfolipaza, lipoxigenaza, epoxigenaza). Implicarea acestor enzime este urmată de eliberarea prostaglandinelor, leucotrienelor, lipoxinelor, considerate mediatori chimici ai inflamației, responsabile și de apariția durerii care însoțește inflamația 56.

Complexitatea procesului inflamator decurge și din relația inflamație–coagulare, procese care par să se condiționeze reciproc. Astfel, modificările hemodinamice locale de la nivelul procesului inflamator, încetinirea și staza sanguină, alterarea peretelui vascular cu eliberarea de factori tromboplastinici, acidoza, favorizează agregarea trombocitelor, declanșând și formarea trombului vascular.

Elementul inițiator al inflamației nu este în mod necesar unul specific. De exemplu, articulația bolnavilor cu poliartrită reumatoidă este mai degrabă un ,,mediu’’ unde orice cauză, care poate genera o inflamație tranzitorie, declanșează o serie de procese care se autoîntețin. Membrana sinovială reumatoidă este un țesut care poate să producă un umăr foarte mare de substanțe cu rol în întreținerea inflamației locale. Tiparul biochimic original al inflamației inițial nespecifică este distorsionat în prezența factorilor reumatismali, care au proprietatea de a se fixa pe componenta IgG a complexului imun. Complecșii formați sunt fagocitați de celulele mediului sinovial determinând eliberarea unor enzime lizozomale, printre care ADN-aza, care poate furniza prin acțiunea sa noi disponibilități antigenice unui ciclu care astfel se autoîntreține.

În producerea inflamației, indiferent de natura stimulilor proinflamatori, sunt implicate numeroase tipuri de celule: neutrofile polimorfonucleare, monocite, macrofage, limfocite, mastocite, plachete, celule endoteliale și epiteliale etc. și sunt activați numeroși factori (ai coagulării, ai complementului, ai kininelor). Activarea macrofagelor, celulelor endoteliale, limfocitelor T, fibroblaștilor conduce la producerea altor mediatori polipetidici (citokine): interleukine, TNF (factorul de necroză tumorală) și interferon cu rol în procesul inflamator 56.

Dacă răspunsul este corespunzător și agentul lezant este înlăturat, inflamația dispare și țesutul se reface. Aceasta se realizează prin transformarea mediatorilor lipidici din proinflamatorii (ex. prostaglandinele) în antiinflamatorii (lipoxine, rezolvine, protectine) și prin acțiunea macrofagelor. Leucocitele tisulare suferă apoptoză și sunt fagocitate de către macrofage, care părăsesc locul inflamației prin drenaj limfatic. Apoptoza celulelor inflamatorii este un proces fiziologic esențial pentru rezolvarea inflamației, având avantajul că după fagocitarea celulelor care au suferit apoptoză, macrofagele achiziționează un fenotip ce conduce spre vindecare, eliberând semnale antiinflamatorii ca interleukina 10 (IL-10) și factorul de transformare a creșterii (TGF, transforming growth factor ) 1.

Totuși, dacă neutralizarea și îndepărtarea stimulilor toxici sau clearance-ul celulelor inflamatorii care suferă apoptoză de la nivelul țesutului inflamat eșuează, procesul inflamator persistă și se poate dezvolta inflamația cronică sau autoimunitatea, prin recrutarea diferiților agenți (în special limfocitele T) și prin apariția infiltratelor limfoide în țesut 1.

4.2. Bolile reumatismale

Există numeroase afecțiuni inflamatorii cauzate de o mare diversitate de factori etiologici și factori favorizanți, care contribuie la apariția și promovarea acestora. Astfel, etiologia infecțioasă (microbiană, virală), traumatică, autoimună este completată de factori de mediu (frig, umezeală), factori genetici, factori de stres, fumatul, consumul de alcool și alte condiții de viață necorespunzătoare. Se estimează că 7% din populația globului suferă de diferite maladii inflamatorii, ponderea cea mai mare având-o bolile reumatismale, care prin gravitatea lor și limitarea capacității de muncă, adesea la o vârstă tânără, constituie o problemă de sănătate publică majoră 56.

Reumatismele pot fi împărțite în 6 grupe principale 57:

– reumatismele infecțioase sunt cauzate de prezența unui germene în articulație; ex. artrita gonococică, artrita tuberculoasă.

-reumatismele inflamatorii se observă, în general, în cadrul bolilor de sistem ca reumatismul articular acut, poliartrita reumatoidă, spondilartropatia, atrita psoriazică, lupusul eritematos diseminat, pseudopoliartrita rizomelică, sindromul lui Schönlein-Henoch, angeitele.

– reumatismele microcristaline sunt cauzate de prezența cristalelor în articulație sau în tendoane: gută, condrocalcinoză articulară, boala calcificărilor tendinoase.

– reumatismele degenerative sunt provocate fie de degenerescența și uzura unei articulații (artroza membrelor), fie de cauze mecanice, fie de o combinație a acestor factori (sindromul de îngustare a canalului carpian).

– atingerile inflamatorii periarticulare cele mai frecvente sunt: tendinitele, bursitele și periartritele 57.

4.3. Căi de semnalizare în inflamație

Cele mai multe căi de semnalizare legate de inflamație implică membrii ai familiei receptorilor pentru IL-1, TNF și TLR (Tall-like microbial pattern recognition receptor – receptorul pentru recunoașterea tiparului microbian Tall-like). Primii doi receptori sunt activați de IL-1, respectiv TNF-α, citokine locale eliberate la nivelul leziunii tisulare. TLR recunoaște tipare microbiene și reprezintă un sistem de recunoaștere nonself, care atunci când este activat, declanșează răspuns inflamator. Activarea oricăruia dintre acești receptori recrutează proteine de adaptare legate de reglarea supraviețuirii celulare, care mai departe recrutează proteine de semnalizare, care determină activarea MAPK (mitogen-activated protein kinase) (ex. jun N-terminal kinaza și p38MAPK) și a IKK (inhibitor of nuclear factor kB kinase). MAPK determină fosforilarea factorilor de transcripție cum este AP-1 (activator protein-1) și proteinele CREB (cAMP response element-binding protein), care se leagă de promotori ai genelor pro-inflamtorii, activând transcripția acestora. Aceste kinase sunt capabile să inducă mecanisme post-trancripționale pentru a regla expresia genelor pro-inflamatorii 1.

IKK este responsabilă de activarea factorului de transcripție NF-kB, recunoscut ca un element central în răspunsul imun și cel inflamator.

Atât MAPK, cât și IKK induc expresia IL-1 și a TNF-α, ceea ce înseamnă că sunt capabile să amplifice răspunsul imun. IL-6 și IL-12 sunt de asemenea ținte ale MAPK și IKK.

Activarea receptorilor pentru citokine sau a TLR determină activarea fosfoinozitid-3-kinazei, care poate activa alte kinaze, precum Akt. Acțiunea coordonată a acestor cascade de semnalizare duc la inițierea și menținerea răspunsului inflamator 1.

4.4. Implicațiile stresului oxidativ în poliartrita reumatoidă

Poliartrita reumatoidă (PR) este o boală reumatismală inflamatorie caracterizată printr-o atingere a sinovialei. Este o boală frecventă, ce afectează 1% din populație, cu predominanță net feminină (3 bolnavi din 4 sunt femei). De cauză necunoscută, face parte din bolile autoimune, în cursul cărora organismul produce anticorpi (factor reumatoid) îndreptați împotriva propriilor lui țesuturi 57, iar prin deformarea articulațiilor și prin procesele degenerative osoase duce la invaliditate.

Creșterea reactivității imune de către condițiile pro-inflamatorii este foarte importantă pentru ca sistemul imun să țină sub control și să învingă agenții patogeni care se multiplică rapid, dar există, de asemenea, și riscul de a induce procese autoimune. PR este o boală autoimună sistemică, ce se caracterizează prin inflamarea cronică a articulațiilor, cu infiltrarea macrofagelor și a celulelor T activate. Există dovezi care susțin că producerea radicalilor liberi la locul inflamației poate contribui decisiv la patogeneza acestei boli 2.

În celulele T izolate din lichidul sinovial al pacienților cu PR s-a constatat o diminuare a nivelului de GSH intracelular. Aceste celule T prezintă dereglări ale fosforilării proteinei linker de adaptare a activării celulelor T (LAT). S-a demonstrat că modificările nivelului intracelular al GSH alterează localizarea subcelulară a LAT. Migrarea monocitelor și limfocitelor în sinoviala bolnavilor cu PR este mediată de expresia anormală a câtorva molecule de adeziune, printre care ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1 și ICAM-2, efect ce poate fi explicat de inducerea anormală a căilor de semnalizare redox-sensibile. Condițiile oxidative din țesutul sinovial sunt asociate și cu o incidență mai mare a mutațiilor p53 2,58. Deși tumorile maligne ale sinovialei sunt rare, s-a emis ipoteza că prezența celulelor transformate în sinoviala pacienților cu PR poate duce la destrucție articulară progresivă fără degenerare malignă 59.

Proteina de șoc termic hsp65/60, care a fost implicată în patogenia aterosclerozei, este, de asemenea, un (auto)antigen candidat la determinarea patogenei PR 2.

4.5. Implicațiile stresului oxidativ în patofiziologia artrozei

Articulațiile pot fi considerate organe al căror rol fundamental este acela de a asigura stabilitatea și mobilitatea scheletului [60]. Diartrozele sunt cele mai întâlnite în organism, permit o gamă largă de mișcări de diverse tipuri, au suprafețele articulare acoperite de cartilaj, iar articulația este delimitată de o membrană sinovială și un manșon fibros care formează capsula articulară. Aceste articulații sunt numite sinoviale și sunt cel mai frecvent afectate de artroză [61].

Artroza este condiția patologică asimilată unei „insuficiențe” articulare, fiind determinată de destructurarea cartilajului articular și de un răspuns reparator anormal al osului subcondral, la care se asociază afectarea celorlalte structuri articulare și periarticulare [62].

Termenul de artroză este atribuit unui grup de afecțiuni ce se caracterizează prin degenerare a cartilajului, cu progresie lentă, la început neinflamatorie, hipertrofie a structurilor osoase articulare, inflamare a membranei sinoviale, afectând una sau mai multe articulații și ducând la deformarea progresivă a articulației afectate. Boala afectează cartilajul articular, structură anatomică ce prezintă o capacitate limitată de refacere, ceea ce duce și la o corelare cu vârsta a artrozei. Deteriorarea și degenerarea structurală a cartilajului, care este aneural și avascular, este lipsită de durere (artroza latentă), dar în timpul fazelor acute (durere tranzitorie în artroza inflamatorie) sau în stadiile cronice (durere cronică în atroza decompensată) se asociază cu inflamație secundară și patologie a structurilor sinoviale și periarticulare, determinând durere articulară dizabilitantă [63].

Modificările care apar în cartilajul articular afectat de artroză provin din dezechilibrul dintre procesele anabolice și cele catabolice influențate de forțele biomecanice ca și de defecte ale reglării autocrine, paracrine și endocrine la nivel celular, ducând la un dezechilibru al turnoverului normal al țesutului articular [64].

4.5.1. Cartilajul articular

Este un material biologic înalt specializat, o matrice avasculară, aneurală și alimfatică, sintetizată de celule numite condrocite, formând suprafața netedă și alunecoasă a articulațiilor sinoviale. Constituenții majoritari ai cartilajului articular sunt: colagenul, proteoglicanii, un grup heterogen de proteine non-colagenice non-proteoglicanice, iar cea mai mare parte din greutatea cartilajului este dată de apa legată de proteoglicani [65]. Aceste componente sunt înalt organizate începând de la suprafața cartilajului și până la straturile de adâncime, formând patru zone: zona superficială, zona mediană, zona de adâncime și cartilajul calcificat. La suprafața cartilajului există o zonă acelulară numită lamina splenda, care acoperă zona superficială [61].

Aria pericelulară care înconjoară condrocitele este alcătuită dintr-un strat subțire de material non-fibrilar, care reprezintă cel mai probabil produșii de sinteză ai condrocitelor, cum sunt proteoglicanii și proteinele. În imediata vecinătate a ariei pericelulare există matricea cartilaginoasă teritorială, care conține o rețea densă de fibre de colagen subțiri, care formează o structură asemănătoare unei capsule împrejurul celulelor și care asigură condrocitelor protecție mecanică [67].

Colagenul, proteoglicanii și celelate proteine și glicoproteine reprezintă doar 20% din masa țesutului umed, restul fiind apă și săruri anorganice. Conținutul în apă al colagenului joacă un rol important în menținerea rezistenței și a capacității de refacere a țesutului, contribuind la sistemul de nutriție și lubrifiere. În cartilaj conținutul în apă este distribuit inegal, cea mai mare concentrație (80%) găsindu-se în apropierea suprafeței, concentrația scăzând până la aproape 65% în zona de adâncime. Difuzia apei prin cartilaj facilitează transportul nutrienților din lichidul sinovial prin țesut și contribuie la nutriția condrocitelor. Sărurile anorganice precum clorurile de sodiu, calciu și potasiu sunt dizolvate în apa tisulară [67].

Cartilajul artrozic este decolorat, moale și adesea se constată o intensificare a producerii de lichid sinovial. Suprafața cartilajului hialin sănătos este albă, lucioasă, elastică și solidă, devenind lipsită de strălucire și neregulată în artroză, constatându-se câteodată și apariția unor vase de sânge, deși cartilajul normal nu este vascularizat. În stadiile incipiente ale artrozei se observă o îngroșare a cartilajului care corespunde hipertrofiei acestuia, în stadiile avansate putând fi observate zone în care cartilajul este distrus complet expunând osul subcondral [66].

Colagenii în artroză. Deși în artroză pot să apară modificări ale concentrației diferitelor tipuri de colagen, boala se caracterizează prin intensificarea proceselor de degradare din fibrilele care conțin colagen de tip II [67], ceea ce determină scăderea elasticității cartilajului [68]. În cartilajul artrozic, degradarea fibrilelor de colagen este realizată de unii membrii ai familiei MMP ce acționează concomitent, ducând la o fibrilare ireversibilă a cartilajului. Degradarea proteolitică a fibrilelor de colagen în fazele incipiente ale artrozei contribuie probabil la hipertrofia și creșterea hidratării cartilajului articular, rețeaua slăbită a fibrilelor de colagen neputând rezista adecvat umflării proteoglicanilor pe care îi înglobează. Toate proteazele implicate în degradarea fibrilelor de colagen pot fi exprimate de condrocite. Conținutul și distribuirea tisulară a colagenului de tip VI sunt alterate în cartilajul artrozic, iar colagenul de tip X este prezent în cartilajul artrozic în zonele profunde, unde se pot observa aglomerări de condrocite hipertrofice [67].

Proteoglicanii în artroză. Proteoglicanii sunt fomați dintr-un miez proteic de care se leagă covalent lanțuri de glicozaminoglicani (GAG). GAG sunt lanțuri polizaharidice lungi formate prin legarea repetitivă a unui dizaharid constituit dintr-un aminozid și un hexuronat [61]. Este probabill ca agrecanii să fie printre primii constituenți afectați ai matricei cartilajului, deoarece se constată o depleție a lor odată cu agravarea artrozei. Într-o anumită etapă a evoluției bolii, chiar dacă sinteza de proteoglicani crește, condrocitele par incapabile să compenseze în totalitate pierderea acestora, rezultând o pierdere netă a matricei, iar structura proteoglicanului care rămâne în cartilaj este alterată în diferite moduri. În general, prezența agregatelor pare să reducă vulnerabilitatea proteoglicanilor la atacul enzimatic. În artroză, anumite proteaze pot ataca monomerul proteoglicanic, dar fragmentele degradate pot difuza rapid din cartilaj, lăsând în urmă proteoglican normal capabil să formeze agregate. Artroza este asociată cu pierderea crescută de fragmente de agrecan, datorită acțiunii MMP și agrecanazelor, scindarea predominantă având loc la nivelul domeniului interglobular al agrecanului, ceea ce determină o pierdere maximală a funcției agrecanului prin separarea întregii regiuni de legare glicozaminoglicanice de regiunea G1 care îl ancorează în țesut. În stadiile incipiente ale artrozei, MMP-13 este exprimată predominant în regiunile mijlocii inferioare și în straturile profunde ale cartilajului, iar agrecanazele sunt exprimate în straturile superficiale. În cartilajul artrozic se sintetizează totuși agrecan, probabil în încercarea condrocitelor de a iniția repararea, iar agregatele de proteoglican astfel formate sunt reținute în cartilaj în fazele incipiente ale artrozei, dar în stadiile ulterioare trec în lichidul sinovial. Agrecanul nou sintetizat are o compoziție care seamănă mai mult cu cea a cartilajului juvenil decât cu cea a celui adult, având un conținut mai mic de keratan sulfat și mai mare de condroitin-4-sulfat comparativ cu condroitin-6-sulfat [67]. Lezarea fibrilelor determină pierderi de biglican și decorin, care sunt de obicei asociate fibrilelor de la suprafața articulară [68]. Miezul proteic al proteoglicanilor bogați în leucină devine mai fragmentat în artroză datorită unei proteolize crescute, dar acest fapt poate fi compensat de creștrea sintezei lor. Rata sintezei și degradării proteglicanilor variază în diferitele regiuni ale cartilajului ca rezultat al stresului mecanic diferit la care acesta este supus. Deși nu se cunosc prea multe date despre influența bolii asupra altor proteoglicani din cartilaj, în cartilajul artrozic a fost raportată creșterea sintezei și nivelului de versican și perlecan [67]

Pe parcursul evoluției bolii, proprietățile fizice ale matricei extracelulare sunt afectate, în cartilaj apărând pierderi de colgen și agrecan. Totuși, chiar și în absența unui proces patologic, colagenul și agrecanul sunt alterate odată cu îmbătrânirea, mărindu-se numărul legăturilor încrucișate din colagen, ceea ce face ca rețeaua de colagen să devină mai rigidă și mai fragilă [67].

Factorii anabolici. Factori de creștere sunt polipeptide necesare sintezei și menținerii unei matrici extracelulare capabile să protejeze articulația de leziunile produse de mișcările repetate ale articulației, traumatisme sau inflamație. Cei mai studiați factori de creștere implicați în formarea și funcționarea cartilajului sunt: BMP (bone morphogenetic proteins), IGF (insulin-like growth factors), TGF-β (transforming growth factor β), FGF (fibroblast growth factor), CTGF (connective-tissue growth factor), CDMP (cartilage-derived morphogenetic proteins) și HGF (hepatocyte growth factor) [67].

Factorii catabolici: fibronectina, proteazele, anumiți neuromediatori și factori inflamatorii pot amplifica procesele degradative ale cartilajului, ducând astfel la apariția artrozei [67].

Proteazele. Metaloproteazele (MMP) constituie una dintre principalele clase de enzime implicate în artroză. Aceste proteaze sunt împărțite în mai multe clase pe baza specificității substratului și a localizării celulare: colagenaze, stromelizine, gelatinaze, MT-MMP (membrane-type MMP) și adamalizine (ADAM și subgrupul ADAMTS). În artroză s-au găsit nivele crescute ale expresie și sintezei MMP-1, MMP-8 și MMP-13. Datele sugerează, de asemenea, implicarea MMP-1 în faza inflamatorie a bolii și a MMP-13 în faza de remodelare [14]. Nivelul MMP-13 este crescut în cartilajul artrozic și se pare că are un rol important în degradarea colagenului de tip II [69].

Au fost identificați șase membrii ai subgrupului MT-MMP: MT1-MMP – MT6-MMP. Studiile au sugerat rolul MT1-MMP în degradarea matricei extracelulare, deoarece posedă activitate colagenolitică și asemănătoare agrecanazelor, având și acțiune de activare a MMP-2 și MMP-13 [67]. Activatorii prometaloproteazelor, care sunt crescuți în artroză includ: MT1-MMP, care activează MMP-2 și MMP-13, MMP-2 care superactivează MMP-13, MMP-3 care superactivează colagenazele și activatorul plasminogenului care activează plasminogenul pentru a produce plasmină – un activator general al MMP. Deficitul inhibitorilor tisulari ai MMP (TIMP) favorizează proteoliza excesivă, observată în cartilajul articular artrozic [68].

ROS stimulează sinteza MMP și activează prometaloproteazele matricei extracelulare. H2O2 poate induce biosinteza MMP-1 prin activarea directă a enzimei ce convertește TNF-α, dar nu poate activa proMMP-7. În schimb, alte ROS (ex. hipocloritul sau peroxinitritul în prezența glutationului pentru a asigura glutationilarea) pot activa proMMP-7 [21].

Tiol proteazele. Catepsinele B și L scindează colagenul de tip II, IX și XI, distrugând legăturile încrucișate din colagen la pH scăzut [67]. În cartilaj, catepsina B are efect degradativ direct asupra unor molecule extracelulare, dar ar putea fi și un activator al MMP, iar catepsina K este capabilă să degradeze colagenul fibrilar de tip I și II [67,68].

Alți factori catabolici. Fibronectina este o glicoproteină dimerică de adeziune existentă în matricea extracelulară a cartilajului, nivelul său crescând în artroză. În cartilaj, fragmentele de fibronectină sunt implicate în: accentuarea pierderii de proteoglican, scăderea sintezei de proteoglicani și creșterea producției de MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-13, agrecanaze și NO, asociată cu inducerea iNOS. În condrocitele umane fragmentele de fibronectină activează MMP-13 și induc formarea NO, activând MAP (mitogen-activated protein), ERK (extracellular signal-regulated kinase), p38 și JNK (Jun-N-terminal kinase) [67].

Neuromediatori. S-a arătat că interacțiunile dintre sistemele neuroendocrine pot contribui la patogeneza bolilor articulare, leptina și substanța P considerându-se a fi implicate în patofiziologia artrozei [67].

Factorii inflamatori. Există dovezi care sugerează că mediatorii inflamatori influențează homeostazia matricei celulelor țesutului articular, alterându-le metabolismul. Mediatorii inflamatori acționează asupra condrocitelor crescând catabolismul prin mărirea producției de proteaze ca și de citokine și alți factori inflamatori. Există și alți mediatori inflamatori care, alături de citokine, influențează procesele patologice din artroză, printre care: NO, PAR-2 (protease activated receptor 2), eicosanoidele (prostaglandinele și leucotrienele) [67].

Citokinele proinflamatorii. IL-1β este considerată cel mai important factor responsabil de procesele catabolice din artroză, exercitând multiple efecte: își stimulează propria producție, crește sinteza de enzime cum sunt MMP, reprimă sinteza inhibitorilor fiziologici ai acestor enzime, inhibă sinteza constituenților matricei cum sunt colagenii și proteoglicanii, stimulează sinteza și eliberarea unor eicosanoide. Alte citokine proinflamatorii precum IL-6, IL-17, IL-18, OSM (oncostatin M), LIF (leukemia inhibitory factor), TNF-α, sunt considerați factori potențiali ai patogenezei artrozei, deși importanța și rolul exact al fiecăruia în patogenia bolii nu este clar stabilit. Acțiunea acestor citokine asupra proceselor enzimatice, combinată cu supresia sintezei matricei, determină degradarea severă a țesutului articular și apariția leziunilor caracteristice artrozei [67].

Oxidul nitric. NO și ROS sunt produse în cantități mari în cartilajul artrozic. Expresia iNOS este up-reglată în condrocitele artrozice, ceea ce duce la creșterea sintezei de NO. TNFα și IL-1 stimulează producția NO în cartilaj [68], iar NO determină creșterea proceselor catabolice și reducerea proceselor anabolice majore [67].

Eicosanoidele. PG și LT sunt factori inflamatori majori implicați în patofiziologia artrozei. PGE2 exacerbează inflamația articulară, potențează efectele altor mediatori ai inflamației, afectează remodelarea cartilajului direct sau indirect ca un factor reglator autocrin și poate contribui la distrugerea cartilajului prin promovarea producției de MMP [67]. În artroză, s-a observat creșterea producției de LTB4 și LTC4 în țesutul sinovial [70]. Studiile au arătat că în țesuturile artrozice LTB4 stimulează puternic eliberarea citokinelor proinflamatorii, precum IL-1β și TNF-α [67]. PGE2 este predominant produsul COX-2 și are atât efecte catabolice cât și anabolice în cartilaj, putând inversa degradarea proteoglicanilor indusă de IL-1β. PGE2 nu are efect asupra turnoverului cartilajului sănătos, dar în prezența IL-1β și a TNF-α, PGE2 crește acest turnover. Dacă sinteza PGE2 este inhibată de către inhibitorii selectivi ai COX-2, efectele adverse ale IL-1β și TNF-α sunt anulate [48].

PAR (proteinase-activated receptor). În artroză, condrocitele umane supraexprimă PAR-2, proces stimulat de citokinele proinflamatorii IL-1β și TNF-α și reprimat de citokina reglatoare TGF-β1 [62]. Activarea acestui receptor este asociată cu NO, COX-2, PGE2, MMP și s-a sugerat că activarea sa induce producerea citokinelor proinflamatorii, inclusiv a IL-1β [67].

4.5.2. Membrana sinovială și lichidul sinovial. Capsula articulară

Membrana sinovială îndeplinește funcții importante pentru homeostazia articulației: asigură rezistența hidraulică prin intermediul matricei extracelulare și permite unui ultrafiltrat al plasmei să treacă prin pereții capilarelor și prin matricea extracelulară în cavitatea articulară. Ultrafiltratul și HA sintetizat de sinoviocitele de tip B formează lichidul sinovial, esențial pentru păstrarea unui coeficient de frecare scăzut între suprafețele cartilajului articular și asigurarea nutrienților necesari metabolismului condrocitelor [60].

Inflamația este recunoscută din ce în ce mai mult ca un factor ce contribuie la progresia artrozei, dovezi serologice și histologice ale sinovitei fiind găsite frecvent în artroză, aceasta putând să apară chiar din stadiile incipiente la pacienții cu artroză posttraumatică [71]. În procesele degenerative din artroză se observă două modele de reacție sinovială: hiperplazia sinovială și sinovita bogată în produși de degadare din ultimele stadii ale bolii, când în membrana sinovială sunt încorporate fragmente de cartilaj și os. De cele mai multe ori însă sinoviopatia hiperplastică este forma de reacție sinovială întâlnită la pacienții cu artroză incipientă, dar care poate genera probleme catilajului articular, deoarece aceste celule pot secreta MMP și citokine catabolice (IL-1β, TNF-α) [65].

În artroză, mediatorii inflamatori detectați în lichidul sinovial pot proveni de la țesuturile care suferă modificări histologice – cartilajul, osul subcondral și membrana sinovială. Astfel, sunt produși: TNF, IL-1β (scăzând producerea antagonistul său natural IL-1Ra), IL-6, IL-10, GM-CSF, chemokine (IL-8), VCAM-1, ICAM-1, TIMP-1, PGE2, IL-17, IL-15, IL-21. Sinoviala artrozică poate conține și adipokine ca visfatină, adiponectină și leptină, care pot acționa ca mediatori ai inflamației și ai degradării cartilajului. Ca și condrocitele artrozice, celulele sinoviale produc mari cantități de MMP (MMP-1, MMP-3, MMP-9, MMP-13) [72].

Benito și colab. au comparat elemente ale țesutului sinovial la pacienții cu artroză incipientă și avansată sugerând că inflamația este mai intensă în fazele incipiente ale artrozei și că angiogeneza are loc în zonele inflamate ale siovialei, ceea ce ar presupune un interschimb între celulele vasculare și sinoviale [73]. Angiogeneza ar putea contribui la tranziția inflamației acute la inflamație cronică, mai degrabă potențând-o și perpetuând-o, decât inițiind-o. Moleculele de adeziune din vasele nou formate (ex. E-selectina) pot facilita infiltrarea celulelor inflamatorii, iar răspunsul inflamator este menținut prin transportul la locul inflamației, prin noile vase, a celulelor inflamatorii, nutrienților și oxigenului [72].

Macrofagele sinoviale sunt intermediari importanți în formarea osteofitelor indusă de TGF-β, probabil prin secreția BMP (BMP-2 și BMP-4) sau/și prin semnalul condrogenic ce acționează asupra celulelor stem mezenchimale [72].

Împreună cu ligamentele, capsula articulară asigură stabilitatea mecanică și permite flexibilitatea articulației. Prin urmare, îngroșarea stratului de colagen, caracteristică multor pacienți cu artroză, în special în stadiile avansate, diminuă semnificativ capacitatea de mișcare a articulației. Astfel, fibroza capsulară influențează major apariția rigidității articulare, care este după durere, caracteristica simptomatică a degradării cartilajului în artroză. În plus, fibroza capsulară determină îngustarea capsulei articulare, ducând la mărirea stresului biomecanic asupra cartilajului deja lezat prin creșterea presiunii în întreaga articulație [65].

Structurile juxtaarticulare (capsula articulară, tendoane, ligamente) sunt afectate progresiv, fiind posibilă apariția fibrozei, scurtărilor și rupturilor ligamentare, amiotrofiilor, iar în stadiile finale anchiloza articulară, dispariția completă a spațiului articular, malalinieri și deformări care determină alterări funcționale majore [62].

4.5.3. Osul subcondral

Are o organizare specifică, proprietățile structurale unice făcându-l de 10 ori mai deformabil [60]. În artroză, modificările morfologice care apar la nivelul osului subcondral includ apariția osteofitelor marginale (proliferări osoase apărute la baza leziunilor cartilaginoase), a chistelor subcondrale de retenție (arii necrotice de os subcondral) și scleroza subcondrală [62]. Implicarea osului subcondral în artroză a fost sugerată de relația inversă care există între artroză și osteoporoză [74], integritatea cartilajului articular depinzând și de proprietățile mecanice ale osului subcondral, care are un rol important în absorbția greutății în articulație [75]. Datorită faptului că este mai puțin rigid, are un conținut mineral mai redus și este considerat mai puțin dens, osul subcondral pare să aibe un rol complex în artroză [76,77]. Densitatea aparentă a osului subcondral pare a fi cresută în artroză, datorită creșterii volumului tisular, posibil prin îngroșarea trabeculelor și mărirea numărului de trabecule, în timp ce densitatea materială a osului este semnificativ mai mică decât la persoanele sănătoase Scăderea conținutului mineral poate fi explicată prin creșterea ratei turnoverului în osul afectat de artroză, ceea ce determină formarea unui os mai tânăr și mai puțin mineralizat [78].

Nu se știe încă exact dacă modificările patologice din țesutul osos subcondral (ex. scleroza) precedă modificările în cartilajul articular (ex. masa osoasă ca factor de risc pentru artroză) sau modificările osului subcondral sunt procese adaptative secundare modificărilor proprietăților biomecanice ale cartilajului. Formarea activă de os nou se observă în multiple focare la pacienții cu artroză incipientă și până în stadii mai avansate, iar în stadii foarte avansate au loc procese severe de remodelare osoasă, mai ales în zonele de destrucție avansată a cartilajului articular situat deasupra. În artroză, pe lângă scleroza osoasă extinsă, o caracteristică obișnuită a degradării articulare o constituie nercroza osoasă aseptică. În zonele de destrucție totală a cartilajului, lichidul sinovial are acces la măduva osoasă, inducând modificări fibrotice și chiar condrometaplastice ale celulelor precursoare mezenchimale, ceea ce determină frecvent, în stadiile avansate ale bolii, apariția nodulilor cartilaginoși în aceste zone. În artroză, în cazul destrucțiilor moderate până la severe, modificările apărute în osul subcondral constituie o sursă a apariției durerilor articulare [65].

În regiunea osului subcondral afectat de artroză s-au găsit cantități mari de IL-1α, IL-8, TNF-α, MMP, ceea ce implică osul subcondral în procesele inflamatorii din patologia artrozei [79].

4.5.4. Influența ROS/RNS asupra dezvoltării artrozei

Există o multitudine de studii care s-au concentrat pe efectele distructive pe care le au agenții oxidativi și nitrozativi în patogenia artrozei. Stresul oxidativ este implicat în artroză nu numai în distrucția cartilajului [80], ci și indirect prin activarea colagenazelor, proenzimelor și up-reglarea unor gene care codifică enzime implicate în producția de citokine și degradarea matricei [81].

Maneesh și colab. au arătat un nivel ridicat al stresului oxidativ la pacienții cu artroză comparativ cu persoane sănătoase, datorat fie creșterii peroxidării lipidelor, fie diminuării nivelului antioxidanților [82].

ROS sunt implicate în modularea eliberării mediatorilor inflamatori, crescând expresia chemokinelor și citokinelor și reglând expresia moleculelor de adeziune în celulele inflamatorii [47]. Radicalii liberi împiedică formarea fibrilelor de colagen și degradează colagenul, un rol imortant în acest mecanism avându-l prolidaza, implicată în reciclarea prolinei pentru biosinteza colagenului, activitatea ei fiind afectată de SO [83]. ROS, mai ales H2O2, acționează ca mesageri secunzi pentru sinteza MMP stimulată de fragmente de fibronectină în condrocitele articulare umane [48].

Inflamația și stresul mecanic sunt asociate cu up-reglarea sintezei NO [80], care afectează condrocitele prin inhibiția sintezei colagenului și proteoglicanilor, activarea MMP, modularea expresiei citokinelor, supresia proliferării și promovarea apoptozei condrocitelor [84].

NO joacă un rol important în modularea funcțiilor condrocitare [80]: activează MMP, inhibă sinteza proteoglicanilor și colagenului, mediază apoptoza și promovează răspunsul inflamator al condrocitelor. NO și RNS pot regla activitatea MMP-9, nivele scăzute de NO exogen mărind activitatea MMP-9 și inhibând activitatea TIMP-1. În cartilajul artrozic, NO crește expresia MMP și reglează expresia unor molecule care influențează expresia MMP. De exemplu, prin inducerea iNOS, endotelina-1 determină sinteza MMP-1 și MMP-13 în condrocitele artrozice umane [49].

NO și derivații săi reglează activarea NF-κB indus de citokine în cartilaj [48]. NF-κB este un factor de transcripție care mediază răspunsul celular la factori imunogenici și induce gene care codifică citokine, molecule de adeziune celulară, imunoreceptori și enzime legate de stresul oxidativ [49]. În celule, NF-κB este inactiv și este reținut în citoplasmă de IκB. Ca răspuns la semnalele inflamatorii IκB este fosforilat, disociază și permite translocarea NF-κB în nucleu, acesta ajutând aici la medierea transcripției genelor proinflamatorii, inclusiv ale IL-1β, TNF-α, iNOS și ale altor factori catabolici, inclusiv MMP [48]. Mendes și colab. au descoperit că degradarea IκB-α indusă de IL-1 și prin urmare activarea NF-κB precum și expresia iNOS în condrocite este mediată de superoxid, în timp ce H2O2 nu pare să participe în aceste răspunsuri induse de IL-1 [85].

În cartilajul și membrana sinovială artrozică au fost descoperite semnale mediate de NOS [80]. Condrocitele din cartilajul artrozic, mai ales în zona superficială, supraexprimă iNOS, indusă de factori mecanici și biochimici, inclusiv mediatori inflamatori (IL-1β, TNF-α, NF-kB) [48,80]. NOS sunt exprimate de condrocite mai ales în zona superficială a cartilajului artrozic. Zona de suprafață este locul unde începe destrucția cartilajului în stadiile incipiente ale artrozei, ceea ce sugerează că aceste țesuturi lezate produc activ NO. Inducerea iNOS în cartilajul artrozic este influențată de multiplii stimuli patogenici ca: forțele biomecanice anormale, acțiunile mediatorilor proinflamatori ca IL-1β și TNF-α și acțiunea proteolitică asupra unor proteine ale matricei extracelulare cum sunt fibronectina, colagenul de tip II și fragmentele de hialuronan [49]. Au fost descrise NOS afectate de artroză, evidențiate doar în cartilajul artrozic, având proprietăți asemănătoare nNOS și iNOS [80].

În artroză, IL-1β este implicată în destrucția cartilajului printr-un mecanism dependent de ROS, Nox4 fiind considerată o sursă importantă de ROS indusă de IL-1β în condrocite [86]. În țesutul cartilaginos, enzima condrocitară ce convertește IL-1 și nivelul IL-18 sunt mediate de NO, iar producerea în execes a NO în artroză ar putea avea legătură cu scăderea sintezei antagoniștilor naturali ai receptorilor IL-1 [80]. NO este un important promotor al activității catabolice a condrocitelor, determinând ihibiția sintezei matricei cartilajului, accelerarea degradării matricei mediată de condrocite, promovarea răspunsurilor inflamatorii și apoptozei condrocitelor, ceea ce duce la pierderea matricei cartilajului [49].

S-a observa că în condrocitele artrozice, comparativ cu cele normale, scade activitatea complexelor I, II și III din lanțul transpotor de electroni mitocondrial, ceea ce poate afecta diferite căi implicate în degradarea cartilajului, printre care: stresul oxidativ, biosinteza condrocitară deficitară, inflamația indusă de citokine, catabolismul matricei, calcificarea matricei și creșterea apoptozei condrocitelor [87,88]. NO influențează funcțiile mitocondriei în artroză [80]. Grishko și colab. au analizat integritatea și capacitatea de reparare a mtADN (ADN mitocondrial) în condrocite, observând acumularea mtADN afectat, ceea ce indică prezența SO în mitocondria condrocitară in timpul evoluției bolii și o capacitate scăzută de reparare a ADN corelată cu scăderea viabilității și creșterea inducției apoptozei condrocitelor [89]. Depleția ATP și afectarea transportului mitocondrial de electroni în condrocite sunt asociate cu degradarea și mineralizarea cartilajului. ROS suprimă fosforilarea oxidativă mitocondrială și formarea ATP în culturi de condrocite, mecanisme legate de diminuarea sintezei colagenului și proteoglicanilor [90]. Activitatea complexului II și III din lanțul respirator ca și potențialul de membrană mitocondrial sunt semnificativ scăzute în condrocitele artrozice. În culturi, condrocitele tratate cu donori de NO suferă o diminuare a potențialului de membrană mitocondrial și inhibiția sintezei ATP, care nu sunt însă asociate cu moartea celulară, sugerând că NO afectează metabolismul energetic și alte funcții condrocitare și nu în mod deosebit viabilitatea celulară, dar este posibil ca aceste condrocite să devină sensibile la alți inductori ai morții celulare [91].

HOCl afectează preferențial proteinele din lichidul sinovial, micșorând vâscozitatea acestuia, mai ales prin precipitarea hialuronanului solubil. HOCl reacționează, de asemenea, cu polizaharidele, formând acetat, care, corelat cu activitatea MPO din lichidul sinovial, implică HOCl în degradarea cartilajului [81]. În condrocite HOCl determină depleția GSH și ATP și scade viabilitatea acestora [90].

Se poate concluziona că în circumstanțe patologice ROS/RNS contribuie la destrucția cartilajului prin susținerea activității citokinelor catabolice, degradarea directă a componentelor matricei și prin reducerea capacității de reparare a cartilajului [90].

4.5.5. Influența ROS/RNS asupra îmbătrânirii celulare și apoptozei condrocitelor

Progresia artrozei este corelată cu senescența celulară și apoptoza în toate compartimentele articulare, în toate aceste procese fiind implicate și ROS/RNS [80]. Intensificarea stresului oxidativ accelerează senescența și inițiază apoptoza condrocitelor, micșorând astfel capacitatea condrocitelor de a menține și reface cartilajul [92].

Având reactivitate înaltă, ROS/RNS pot influența proliferarea celulară, reglarea expresiei unor gene, activarea factorilor de transcripție, degradarea ADN-ului și apoptoză [89]. Yudoh și colab. au cercetat influența SO asupra senescenței cartilajului și implicarea în patogeneza artrozei și au constatat că SO induce instabilitate genomică, în special eroziuni ale telomerilor și senescență a condrocitelor care duc la îmbătrânirea cartilajului [93]. Afectarea ADN-ului de către radicalii liberi poate modifica transcripția, determinând erori de transcripție, traduse prin formarea unor proteine cu structură alterată. Acumularea ADN-ului, proteinelor și lipidelor alterate poate fi responsabilă de întreruperea funcționării normale a celulelor și ar putea explica creșterea incidenței artrozei cu vârsta. Modificările bazelor și metilarea ADN ar putea fi implicate în alterarea fenotipului condrocitelor în artroză [94].

Odată cu înaintarea în vârstă, capacitatea proliferativă și sintetică a condrocitele articulare scade, dar se menține abilitatea de a produce mediatori proinflamatori și enzime care degradează matricea [22].

Apoptoza este inițiată de activarea caspazelor (cistein-aspartil proteaze). Radicalii liberi promovează apoptoza prin activarea JNK (c-Jun N-terminal kinase) și p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase) prin intermediul ASK (apoptosis signal regulating kinase), acționând ca mesageri secunzi, amplificând activarea ASK 1 și ducând la moarte celulară chiar și atunci când nu există o concentrație suficientă de ROS pentru generarea apoptozei [80].

NO pare să fie un factor important al inducerii apoptozei condrocitelor, o caracteristică patogenică majoră a artrozei, printr-un mecanism dependent de mitocondrie. De exemplu, atunci când condrocitele umane sunt expuse la NO exogen sau endogen, cresc nivelele citocromului c, NO, ROS, activarea caspazei-3 și fragmenatrea ADN, toate caracterisitici ale apoptozei, iar tratamentul cu L-NMA (N-monometil L-arginină) ca inhibitor NOS determină scăderea nivelului NO și a altor markeri ai apoptozei. Există însă și studii care indică peroxinitritul ca principal responsabil al apoptozei condrocitelor printr-un mecanism independent de caspaze. [48]. Whiteman și colab. au studiat mecanismul prin care peroxinitritul determină moarte celulară în condrocitele umane, constatând creșterea calciului intracelular și disfuncție mitocondrială, fără activarea caspazei-3, care este un marker al apoptozei, sugerând că proteaze dependente de calciu, calpainele, determină moartea condrocitelor și demonstând astfel că disfuncția mitocondrială determină apoptoză independentă de caspaze [88]. Alterările celulare induse de SO sunt susținute și de degenerarea mitocondriei odată cu vârsta, ducând la scăpări din lanțul oxidativ și leziuni semnificative ale genomului mitocondrial, ceea ce determină creșterea producției de radicali liberi și duce la afectarea crescută a ADN mitocondrial. Genomul mitocondrial este expus leziunilor oxidative deoarece este localizat aproape de lanțul oxidativ, nefiind protejat de membrane [90].

Se crede că echilibrul între NO și ROS intracelular determină tipul morții condrocitelor, concentrațiile scăzute de ROS promovând apoptoza în prezența NO, iar concentrațiile ridicate de ROS determinând necroză [91].

Îmbătrânirea este asociată cu pierderea semnificativă de condrocite și creșterea vulnerabilității la moarte celulară indusă de ROS, un contributor important la creșterea nivelului intracelular al ROS fiind catalaza, enzimă antioxidantă a cărei activitate este semnificativ și specific scăzută în condrocitele îmbătrânite [95].

Efectele produse de NO, corelate cu cele ale altor radicali liberi, antrenează nitrozilarea proteinelor și favorizează moartea celulară [96]. La persoanele vârstnice și în cartilajul artrozic, nitrotirozina, formată prin oxidarea tirozinei în prezența NO, este supraexprimată în cartilaj, sugerând implicațiile stresului oxidativ în îmbătrânirea și degenerarea cartilajului [97].

5. Utilizarea antiinflamatoarelor nesteroidiene în tratamentul artrozei

Antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS) sunt substanțe din grupa analgezice-antipiretice-antiinflamatoare, cu efect predominant antiinflamator, folosite în scop antiinflamator și analgezic. Efectul antireumatic este imediat, însă are durată scurtă după întreruperea administrării. Sunt substanțe cu acțiune simptomatic-patogenică, diminuând sau înlăturând unele simptome ale inflamației în bolile reumatice cronice, dar nemodificând evoluția procesului patologic [3]. Efectul cel mai important al AINS este inhibarea COX, diminuând astfel biosinteza PG. Mecanismul acțiunii antiinflamatoare al AINS nu este însă complet cunoscut, pe lângă efectul de inhibiție al COX, diferitele AINS având, posibil, și alte mecanisme adiționale de acțiune.

5.1. Clasificarea antiinflamatoarelor nesteroidiene

Antiinflamatoarelor nesteroidiene (AINS) pot fi clasificate în funcție de mai multe criterii, cum sunt: clasa chimică, COX inhibată sau intensitatea reacțiilor adverse gastrointestinale. Astfel, există:

I. AINS clasice (generația I):

1. Acizi carboxilici:

– derivați ai acidului salicilic: acid acetilsalicilic, benorilat, diflunisal;

– derivați de acid acetic:

– derivați de acid fenilacetic: diclofenac, alclofenac;

– derivați de acizi carbociclici și heterocicli acetici: indometacina, tolmetina, sulindac, ketorolac, lonazolac;

– derivați de acid propionic: ibuprofen, ketoprofen, dexketoprofen, naproxen;

– derivați de acid fenamic (fenamați): acid mefenamic, acid flufenamic, acid niflumic, etofenamat; acid meclofenamic.

2. Acizi enolici:

– pirazolone: fenilbutazona;

– oxicami: piroxicam, tenoxicam, lornoxicam.

II. AINS inhibitoare selective sau specifice de COX-2 (generația a II-a):

1. Blocante selective: meloxicam, nimesulid, etodolac, nabumetona.

2. Blocante specifice (coxibi): celecoxib, parecoxib, etoricoxib, rofecoxib.

În funcție de reacțiile adverse gastrointestinale, AINS se pot clasifica astfel:

– cu cel mai mic risc: ibuprofen;

– cu risc intermediar: piroxicam, diclofenac, ketoprofen, naproxen;

– cu cel mai mare risc: fenilbutazona, azapropazona [3]

5.2. Mecanisme de acțiune ale AINS

Enzimele implicate în biosinteza eicosanoidelor sunt ținta principală pentru intervenția terapeutică în afecțiunile inflamatorii. Deși AINS care inhibă producția acestor mediatori lipidici nu afectează progresia distrucției articulare în artroză, ele reduc durerea, rigiditatea și tumefierea asociate acestei afecțiuni.

Prima etapă a metabolismului acidului arahidonic (AA) este eliberarea AA din fosfolipidele membranare de către fosfolipaza A2. AA este metabolizat mai departe de către enzime ce includ ciclooxigenaze (COX), lipooxigenaze (LOX) și sintaze terminale pentru a forma diferiți metaboliți, printre care și prostaglandinele, tromboxanii (TX), leucotrienele, acizii hidroxieicosatetranoici (HETE) și lipoxinele (LX) [5].

Acești eicosanoizi, acționează prin intermediul unui receptor celular de suprafață specific asupra nociceptorilor periferici, celulelor endoteliale și a celulelor structurale ale articulației într-un mod autocrin/paracrin și modulează complex funcțiile leucocitare. Producția diferiților eicosanoizi este dependentă de tipul celulei și se modifică în timp. De exemplu, în timp ce anumite PG au proprietăți proinflamatorii, studii recente au demonstrat că unii mediatori derivați din AA, inclusiv LX pot contribui la vindecarea inflamației prin mecanisme antiinflamatorii endogene [5,98].

COX este enzima esențială pentru biosinteza PGH2, substratul comun pentru sinteza PG și TX activi (PGE2, PGD2, PGF2α, PGI2 (prostaciclina) și TXA2). AA generat din fosfolipidele membranei celulare de către PLA2, este transformat în PGG2 și apoi trece secvențial într-un intermediar instabil, PGH2, prin activitatea peroxidazică a COX. Au fost clonate și investigate două izoforme majore ale COX, COX-1 și COX-2. COX-1 este constitutivă în aproape toate tipurile de celule și țesuturi, și funcționează pentru a menține homeostazia. COX-2 este inductibilă și apare ca răspuns la diferiți agenți proinflamatori (citokine, factor de creștere și alți mediatori asociați cu inflamația), sugerând rolul cheie pe care COX-2 îl are în producerea inflamației. [5,99].

În anul 2002 s-a descoperit COX-3, care nu este o izoformă diferită genetic precum COX-2, ci o variantă a COX-1. De fapt, ARNm al COX-1 duce la formarea a patru izoforme diferite: COX-1, COX-3 (o variantă care include intronul 1) și două izoforme inactive PCOX-1a și 1b. COX-3, datorită prezenței intronului 1, care îi modifică structura conformațională, are o activitate semnificativ mai mică (25%), fiind prezentă în principal în creierul uman și în inimă și s-a sugerat că este implicată în mecanismul febrei și durerii din inflamație [47].

La oameni există polimorfism în ceea ce privește izoformele COX-1 și COX-2, ceea ce poate determina susceptibilitate alterată la diferite afecțiuni sau răspunsuri diferite la utilizarea inhibitorilor COX. Ca izoformă inductibilă majoră COX-2 este puternic up-reglată în timpul inflamației de către citokinele proinflamatorii, IL-1β, IL-15, TNFα, lipopolizaharide. Căile intracelulare care leagă eliberarea mediatorilor inflamatori de inducerea COX-2 sunt complexe și incomplet elucidate, însă căile NF-κB și p38/MAPK par să joace roluri importante. Mai mult, PGE2 acționând asupra receptorilor EP2 și EP4 crește expresia COX-2 printr-un mecanism modulat de p38/MAPK [100].

Efectele biologice ale PG sunt numeroase. PG mai ales PGE2 și prostaciclina (PGI2) stimulează terminațiile senzitive și favorizează efectul algogen al serotoninei, bradikininei și histaminei. Patogenia febrei implică formarea crescută de PG, mai ales PGE2 la nivelul hipotalamusului sub influența inductoare a pirogenilor și a citokinelor (IL-1, IL-6, interferoni, TNFα). PGE2, prin intermediul AMPc, determină reglarea centrului termoregulator pentru temperaturi mai mari decât cea fiziologică. PG, îndeosebi PGE2, care se formează în cantități mari în țesuturile supuse agresiunii inflamatorii, contribuie la generarea inflamației [101]. PG cresc fluxul sanguin prin dilatarea arteriolelor. Edemul apare datorită creșterii fluxului sanguin indus de PG, la care se adaugă stimuli ce produc permeabilitate endotelială (LT, bradikinină, PAF). Producerea PGE2 la locul inflamației este corelată cu inducția COX-2. PGI2 și activarea receptorului său (receptorul IP) contribuie de asemenea la răspunsul inflamator acut generând durere, vasodilatație și creșterea permeabilității vasculare. În contrast cu PG proinflamatoare, 15-deoxi-Δ12,14-PGJ2 (15d-PGJ2), un metabolit al PGD2, are efecte antiinflamatorii, cel puțin parțial, prin activarea receptorului PPAR-y (peroxisome proliferator-activated receptor- gamma), în inflamația periferică. 15d-PGJ2 inhibă expresia citokinelor proinflamatorii IL-1β și TNFα în culturi de fibroblaste sinoviale [5]. PG au, se pare, un efect pradoxal antiinflamator, asupra leucocitelor. PG inhibă in vitro chemotaxia neutrofilelor și producția de superoxid [102].

Diferite AINS pot avea, posibil, mecanisme adiționale de acțiune cum sunt: inhibarea activării celulelor inflamatorii (cum sunt polimorfonuclearele neutrofile) cu diminuarea formării de endoperoxizi și radicali liberi; diminuarea formării și acțiunii moleculelor de adeziune de către celulele endoteliale, leucocite, plachete; inhibarea chemotaxiei celulelor inflamatorii; reglarea ,,down’’ a producerii de IL-1; interferarea unor fenomene celulare mediate de calciu; inhibarea și a lipoxigenazei [3]; decuplarea fosforilării oxidative; inhibarea eliberării enzimelor lizozomale; inhibarea activării complementului [5].

A fost descrisă o acțiune directă de micșorare a procesului de activare a neutrofilelor de către stimulii inflamatori. Aceasta, alături de inhibarea COX duce la diminuarea formării de endoperoxizi intermediari, respectiv de radicali liberi agresivi, care contribuie la generarea inflamației. Poate interveni, de asemenea, interferarea producerii și funcției unor molecule de adeziune (selectine, integrine, ICAM-1, VCAM-1) exprimate de celulele endoteliale activate de inflamație, de leucocite, de plachete și care intervin în procesul de reținere și acumulare a celulelor circulante la locul inflamației. AINS au tendința de a se acumula în țesuturile inflamate. Acest tropism specific s-ar explica prin permeabilitatea mai mare a capilarelor la acest nivel, care permite extravazarea locală a compușilor antiinflamatori, inclusiv sub forma legată de proteinele plasmatice (pentru majoritatea antiinflamatoarelor proporția molelculelor legate fiind mare). Mai mult, aciditatea zonei inflamate, care crește proporția formei neionizate, favorizează pătrunderea moleculelor active în celulele unde se formează PG [101].

Numeroase căi moleculare legate de inflamație, dar diferite de inhibiția COX sunt modificate de AINS: salicilații inhibă expresia genei COX indusă de IL-1 în culturile de celule endoteliale umane, acidul acetilsalicilic inhibă translocarea factorului de transcripție NF-kB la nucleu, ceea ce poate duce la inhibarea unei varietăți de răspunsuri imune și inflamatorii. Alte mecanisme de acțiune includ acumularea adenozinei, care posedă activitate antiinflamatoare. Inhibitorul preferențial al COX-2, nimesulid, induce fosforilarea și transcripția receptorului pentru glucocorticoizi în culturi de fibroblaste sinoviale umane, determinând creșterea acțiunii antiinflamatorii a corticosteroizilor endogeni și exogeni. Tenidapul, ibuprofenul și naproxenul inhibă in vitro răspunsul proliferativ al celulelor T la IL-2, când sunt adăugate în culturi în doze terapeutice, în timp ce indometacinul, piroxicamul și sulindacul nu influențează acest proces [102].

Toate aceste acțiuni sugerează că AINS pot avea activitate antiinflamatorie prin mecanisme diferite de capacitatea de a inhiba COX. Este posibil ca în viitor noile AINS să acționeze prin mecanisme care nu au legătură cu inhibiția COX

5.3. Mecanismul efectelor adverse ale AINS

AINS provoacă efecte adverse la doze terapeutice, majoritatea fiind efecte secundare derivate din mecanismul molecular de inhibare a COX.

Tulburările gastrice (gastrita, reactivarea ulcerului gastro-duodenal, hemoragiile gastrice) sunt datorate blocării sintezei PGE2. Aceasta are efect citoprotector la nivelul mucoasei gastrice prin creșterea secreției de mucus și inhibarea secreției de acid clorhidric și pepsină. Tulburările astmatiforme sunt datorate, de asemenea, blocării de PGE2, care are efect bronhodilatator. Creșterea tensiunii arteriale la hipertensivi și normotensivi cu renină plasmatică foarte scăzută se produce ca urmare a blocării sintezei de PG vasodilatatoare (PGA2, PGE2, PGI2) [3].

Acidul acetisalicilic, ibuprofenul, indometacina, acidul mefenamic, naproxenul inhibă contracțiile uterine. Efectul tocolitic se explică prin diminuarea producerii PG E și F, care au proprietăți ocitocice, intervenind în spasmele uterine, din dismenoree și stimulând, direct sau indirect (prin intermediul estrogenilor), activitatea fazică a miometrului în timpul travaliului. Administrarea acidului acetilsalicilic sau a indometacinului în cură scurtă la nou-născuții la care persistă canalul arterial, poate controla fenomenele de insuficiență cardiacă și favorizează închiderea acestei comunicări între artera pulmonară și aortă (caracteristică circulației fetale). Se presupune că persistența canalului arterial este legată de formarea locală crescută de PGE2, diminuarea cantității de PG sub influența AINS explicând beneficiul terapeutic. Tratamentul cu AINS trebuie întrerupt în apropierea nașterii, pentru a evita întârzierea travaliului, hemoragiile post-partum și închiderea intrauterină a canalului arterial [101].

Tendința de retenție hidrosalină se întâlnește la toate medicamentele din această grupă. După 2-3 săptămâni de tratament, fenomenul este corectat în mare parte prin intervenția unor mecanisme compensatorii. Retenția hidrosalină poate favoriza decompensarea la bolnavii cu funcționalitatea pompei cardiace la limită. La bolnavii cu insuficiență cardiacă, ascită cirotică, hipovolemie sau afecțiuni renale cronice AINS scad fluxul renal și filtrarea glomerulară și pot fi cauză de insuficiență renală. Efectul este datorat apariției unui deficit local de PG, respectiv lipsei efectului vasodilatator benefic al acestora. Mai puțin frecvent este un efect caracterizat prin hiporeninemie (lipsa PG determină reducerea secreției de renină), hipoaldosteronism și hiperkalemie. Tratamentul îndelungat cu AINS în doze mari provoacă uneori leziuni renale. Primul simptom este eozinofiluria, apoi se dezvoltă o nefrită interstițială, însoțită deseori de un sindrom nefrotic; în continuare apare ischemia și necroza papilară. Afectarea renală a fost atribuită inhibării COX, PG fiind implicate în controlul circulației renale și în producția de renină și aldosteron [101].

Acidul acetilsalicilic și indometacina pot diminua nivelul crescut al calcemiei la bolnavii cu cancer metastatic. Efectul este datorat probabil tot inhibării sintezei de PG, acestea având acțiune osteolitică marcată. AINS pot micșora fertilitatea masculină, deoarece PG sunt importante pentru funcționalitatea spermatozoizilor [101].

Deși AINS sunt considerate sigure, unele dintre acestea au fost asociate cu cazuri rare de afectare hepatică. Modelul clinic și epidemiologic al afectării renale induse de AINS este de tip idiosincrazic [103].

5.3. Influența AINS asupra stresului oxidativ

Stresul oxidativ este implicat în numeroase afecțiuni (artroza, ateroscleroza, cancerul, diabetul, hipertensiunea arterială) (figura 9) [44], prin diferite mecanisme: ROS produse prin hiperactivarea Nox indusă de angiotensina II mediază hipertrofia musculaturii netede vasculare și hipertensiune, creșterea producției de ROS prin intemediul Nox este implicată în hipertensiune prin epurarea rapidă a NO, Nox2 este activată în măduva spinării la pacienții cu scleroză laterală amiotrofică și ar putea fi implicată și în infarctul miocardic, producerea ROS în diabetul zaharat are loc în special prin glicoxidarea zaharurilor. Apariția cataractei este atribuită ROS induse de radiațiile UV, iar Nox1 activată ar putea fi implicată, alături de formarea directă a ROS prin mecanism fizico-chimic mediat de radiațiile UV în arsurile solare. Ototoxicitatea unor medicamente și toxine ar putea fi datorată supraproducției de ROS mediată de Nox3 [21]. Se consideră că stresul oxidativ compromite integritatea neuronilor vulnerabili, contribuind astfel la degenerarea neuronală din boala Parkinson [104]. Deci, orice medicament capabil să protejeze împotriva stresului oxidativ ar putea fi benefic în managementul acestor boli, iar AINS constituie o astfel de clasă de substanțe.

Figura 9. Afecțiuni care implica specii reactive ale oxigenului [44]

Mecanismul principal de acțiune al AINS constă în inhibiția COX, dar s-a sugerat că activitatea lor antiinflamatoare ar putea fi datorată și capacității de a epura ROS/RNS și de a inhiba explozia respiratorie din neutrofile [44].

Conform acestor considerente s-au fectuat numeroase studii care au arătat capacitatea AINS de a interfera cu stresul oxidativ în diferite afecțiuni. Astfel, în leziunile aterosclerotice AINS reglează supraexpresia COX-2 și modulează procesele oxidative; acidul acetilsalicilic inhibă creșterea concentrației de glucoză indusă de activarea PKC, prin scăderea translocării PKC citosolice în membrană, diminuând producția de radicali liberi datorată hiperglicemiei în celulele endoteliale; AINS care au capacitatea de a traversa bariera hemato-encefalică conferă protecție împotriva bolii Alzheimer, prin inhibarea activării exploziei respiratorii în celulele microgliale; la nivelul căilor respiratorii, unde au fost raportate relații între producția de ROS și incidența sau progresia unor procese patologice cum sunt hiperreactivitatea bronșică și astmul, utilizarea unor medicamente cu proprietăți atât antioxidante cât și antiinflamatorii ar putea fi benefică din punct de vedere terapeutic [44]; s-a demonstrat că AINS reduc concentrațiile de colesterol, trigliceride și LDL din plasmă la șobolani cu hiperlipidemie, Curcelli și colab. descoperind că la șobolani, diclofenacul are efecte benefice asupra Ox-LDL datorită influenței pozitive asupra sistemelor antioxidante prin creșterea semnificativă a nivelului SOD, reducând astfel stresul oxidativ in vivo [105].

Există studii care sugerează o posibilă legătură între stresul oxidativ și inducția proceselor inflamatorii mediate de COX. În timpul sintezei PG sunt generați radicali liberi, prin urmare inhibitorii sintezei PG scad producția acestora. S-a observat că inhibitorii COX blochează activitatea NOS în trombocite, iar NO stimulează activitatea COX, ducând la formarea PG. COX-2 este implicată și în sinteza MDA și în producerea peroxidului de hidrogen, care promovează carcinogeneza. Agenții care blochează COX inhibă semnificativ dezvoltarea cancerului pancreatic in vitro și in vivo, în paralel cu inducerea apoptozei [106]. Sulindacul și metaboliții săi protejează celulele pulmonare normale împotriva leziunilor oxidative și sensibilizează celulele canceroase la acțiunea agenților oxidanți, ducând la creștrea producerii ROS în aceste celule și moartea lor prin apoptoză [107]. Piroxicamul, inhibitor neselectiv al COX, care scade producția de PGE2, stimulează funcția celulelor imune in vitro și in vivo. Pe lângă COX, AINS pot inhiba activitatea altor enzime, inclusiv unele fosfodiesteraze și protein kinaze implicate în inițierea și promovarea cancerului. Studii epidemiologice au arătat o diminuare a incidenței cancerului pulmonar la pacienții care utilizează AINS. În modele pe animale, inhibitorii selectivi ai COX-2 măresc sensibilitatea tumorilor la radiații, fără a crește apreciabil efectele radiațiilor asupra țesuturilor normale. AINS au o mare diversitate de mecanisme de acțiune și efectele lor asupra inflamației, imunității, anemiei secundare, sistemului cardiovascular și în prevenirea cancerului pot fi atribuite unor acțiuni independente de COX [106].

În artroză, AINS par să acționeze prin inhibiția sintezei de PG prin blocarea activității COX – atât COX-1 cât și COX-2, dar o parte din mecanismele lor de acțiune pot fi legate și de diminuarea generării superoxidului și radicalilor liberi, prevenirea formării și eliberării radicalilor liberi și a enzimelor degradative din macrofagele sinoviale și leucocitele polimorfonucleare, putând influența mobilitatea, chemotaxia și agregarea PMN și macrofagelor, dar și prin neutralizarea directă a radicalilor liberi [108].

AINS acționează în principal prin inhibiția COX, însă s-a sugerat că activitatea lor s-a putea datora și capacității de a neutraliza ROS/RNS și de a inhiba explozia respiratorie din neutrofile. Saeed și colab. au investigat capacitatea de inhibare a producerii ROS pentru nouă AINS (diclofenac, ibuprofen, indometacin, etodolac, naproxen, piroxicam, acid acetilsalicilic, paracetamol, nimesulid), rezultatele indicând paracetamolul ca fiind cel mai putenic inhibitor, diclofenacul și indometacinul având o activitate inhibitorie semnificativă, iar nimesulidul și naproxenul slabă [44]. Tolmentinul, ketorolacul și oxaprozinul nu sunt active asupra superoxidului, iar acemetacinul și indometacinul au efecte dependente de concentrație. Etodolacul este eficace în epurarea ROO• și toate AINS testate au epurat NO și ONOO−. Indometacinul și tolmentinul par să fie cei mai puternici epuratori ai NO, urmați de acemetacin, tolmentin și ketorolac, oxaprozinul fiind cel mai puțin eficace [44]. Deși motivele pentru care au un asemenea comportament nu este deplin cunoscut se pare că cei mai reactivi atomi împotriva RNS sunt atomii de carbon din pozițiile 2 și 7 ai heterociclului indolic [109].

Printre potențialele acțiuni ale AINS este inclusă și capacitatea de a împiedica eliberarea radicalilor liberi din macrofagele sinoviale și leucocitele polimorfonucleare (PMN). Aceste medicamente pot afecta mobilitatea, chemotaxia și agregarea PMN și macrofagelor și de asemenea ar putea să epureze direct radicalii liberi. Šoltés și colab. au arătat că naproxenul și acidul acetilsalicilic intervin în etapele de inițiere și de propagare a reacțiilor radicalice de degradare a hialuronanului, ducând la întârzierea sau posibil la oprirea degradării acestuia determinată de radicalii liberi [108]. Gonzales și colab. au arătat că generarea oxigenului de către PMN scade după 15 zile de tratament cu diclofenac și aceclofenac la pacienții cu gonartroză severă [110].

Ikeda și colab. au cercetat activitatea antioxidantă in vitro a indometacinului și etodolacului folosind rezonanța magnetică de spin și au observat că aceste două AINS au acțiune directă de epurare a superoxidului [111].

În neutrofile, care au rolul de a proteja organismul, explozia respiratorie duce la formarea ROS ca superoxidul, H2O2, HOCl, dar în anumite patologii, cum sunt bolile autoimune, acumularea lor este însoțită de o degranulare necontrolată, iar speciile reactive rezultate în urma acetor procese acționează împotriva structurilor proprii. Această producție necontrolată de ROS a determinat cercetarea inhibiției MPO și eliminarea ROS de către AINS. Piroxicamul, tenoxicamul, acidul flufenamic, diclofenacul, acidul niflumic, indometacinul inhibă sistemul MPO/H2O2/Cl−, în timp ce acidul acetilsalicilic, ibuprofenul, ketoprofenul, flurbiprofenul nu au efecte semnificative [112].

Leziunile oxidative de la nivelul matricei extracelulare în artroză, in vivo, se pot evidenția prin analiza lichidului sinovial. În inflamație, vâscozitatea lichidului sinovial scade, probabil prin degradarea hialuronanului. Lichidul sinovial nu posedă însă activitate hialuronidazică, astfel încât este foarte posibilă implicarea oxidanților în fragmentarea HA. Analizând lichidului sinovial de la pacienți cu poliartrită reumatoidă sau artroză pentru evidențierea produșilor de degradarea a matricei s-au găsit grupe N-acetil cu masa moleculară mică, produși clorurați, acetat și formiat. S-a sugerat că acetatul este produsul final al reacției HOCl cu polizaharidele, generarea sa fiind corelată cu activitatea MPO din lichidul sinovial, corespunzător rolului HOCl în degradarea cartilajului [81].

S-a demonstrat că AINS inhibă formarea HOCl, dar îl și neutralizează. Paino și colab. au sugerat că AINS împiedică formarea HOCl prin competiția cu ionul clorură pentru situsul activ al MPO, fără a inhiba complexul enzimatic al NADPH-oxidazei, cu excepția indometacinului [113]. Kato și colab. au observat că fenolii sunt substraturi tipice pentru MPO, deci piroxicamul și tenoxicamul ar putea fi mai eficace decât compușii care nu au structură fenolică ca diclofenacul și naproxenul [114], iar indometacinul, un alt substrat al MPO, este la fel de eficient ca piroxicamul și tenoxicamul [44].

[NUME_REDACTAT] și Nève au studiat efectul de epurare a ROS in vitro pentru piroxicam, tenoxicam, lornoxicam, meloxicam, nimesulid și ibuprofen și au descoperit că piroxicamul are o activitate antioxidantă mai mare decât tenoxicamul, ibuprofenul și nimesulidul. Ar fi de așteptat ca moleculele care conțin grupe tiol să aibă o capacitate antioxidantă mai pronunțată datorită transformării lor de către HO• în sulfoxid sau sulfonă, iar o activitate mai scăzută ar putea fi legată de atacul asupra nucleului aromatic al AINS (ex. acidul arilacetic, arilpropionic sau indolic) sau asupra grupării sulfoanilidă. În ceea ce privește oxicamii este propus un atac radicalic asupra nucleelor benzotiazinic (piroxicam) sau tieno-tiazinic (tenoxicam), cumulat cu afectarea grupei enolice, cu reactivitae intermediară. Astfel, ținând cont de reactivitatea față de HO•, AINS ar putea fi clasificate în ordinea: molecule conținând tiol>oxicami>alte AINS studiate. În ceea ce privește reactivitatea față de H2O2, datorită capacității oxidante slabe a acesteia, niciun AINS studiat, nici măcar cei care posedă funcții enolice cum sunt oxicamii, nu este capabil să reacționeze cu acestă specie. Epurarea HOCl de către oxicami este legată de oxidarea C3 al moleculei; ibuprofenul nu interacționeză la un nivel detectabil cu HOCl, iar nimesulidul are o capacitate antioxidantă mai slabă, legată de oxidarea C6 al moleculei, care dă naștere unui produs clorurat. Deci, oxicamii și nimesulidul sunt epuratori slabi ai HOCl in vitro, pe când AINS din grupa acizilor ariacetici, arilpropionici sau indolici nu interacționează cu HOCl [115].

Activitatea tenoxicamului de neutralizare a radicalilor hidroxil, superoxid, peroxil, care sunt implicați în reacțiile inflamatorii, a fost testată in vitro în multe tipuri de sisteme non-celulare, acest medicament demonstrându-se a fi un bun epurator al radicalului hidroxil și al superoxidului in vitro [116].

Ozgocmen și colab. au determinat că tenoxicamul poate avea efecte antioxidante, iar celecoxibul și tenoxicamul pot scădea nivelul seric al nitritului [117].

Peroxidarea lipidelor este inițiată de multe specii reactive printre care superoxidul și radicalul hidroxil. Peroxizii lipidici acționează ca substanțe dăunătoare prin alterarea proprietăților membranelor celulare, a membranelor lizozomale și mitocondriale, determinând modificarea gradienților osmotici, electrici și chimici [19], inactivează enzime și receptori membranari și pot modifica permeabilitatea nespecifică a ionilor de calciu [118]. MDA este unul dintre produșii finali ai peroxidării lipidelor și un marker al stresului oxidativ și al leziunilor mediate de ROS. MDA poate reacționa cu bazele ADN-ului, formând aducți care afectează structura și funcțiile ADN-ului [119].

Au fost realizate diferite studii și modele experimentale prin care s-au cercetat efectele AINS asupra peroxidării lipidelor în diferite afecțiuni. Yang și colab. au observat că administrarea meloxicamului la șoareci tratați cu săruri de aluminiu, care cresc concentrația MDA și scad expresia antioxidanților precum SOD sau GSH, previne printre altele alterarea memoriei și inhibă creșterea nivelului MDA [120]. La șoarecii supuși stresului cronic, administrarea îndelungată de meloxicam diminuă leziunile oxiative, scăzând peroxidarea lipidelor și nivelul NO [121]. La șobolanii cu leziuni la nivelul măduvei spinării s-a observat creșterea semnificativă a nivelului MDA și a activității MPO, dar aceste fenomene au fost oprite după administrarea meloxicamului, sugerând faptul că acesta determină reducerea stresului oxidativ și exercită neuroprotecție prin inhibarea peroxidării lipidelor, a depleției de GSH și a fragmentării ADN [122]. Agha și colab. au observat că în artrita indusă experimental la șobolan, meloxicamul influențează statusul oxidant în special peroxidarea lipidelor [123].

Efectele AINS asupra markerilor stresului oxidativ la pacienții cu artroză au fost evaluate în relativ puține studii [124]. Bartosiewicz și colab. au observat că nivelurile serice ale MDA au scăzut la pacienții cu artroză tratați cu piroxicam, dar nu s-au modificat la pacienții cu poliartrită reumatoidă, sugerând că acesta exercită acțiune antioxidantă în funcție de afecțiune [125]. Ozgocmen și colab. au arătat că tenoxicamul și celecoxibul nu au avut o influență semnificativă statistic asupra nivelului MDA seric la pacienții cu artroză [117], iar Tuzun și colab. au descoperit că acidul tiaprofenic și flurbiprofenul influențează nivelurile serice ale MDA [126].

Pe lângă PG și alți mediatori ai inflamației cum sunt produșii reactivi ai oxigenului și citokinele contribuie considerabil la apariția inflamației și a durerii, astfel încât, pe lângă inducerea COX-2, are loc și inducția iNOS, ceea ce duce la creșterea nivelului de NO în țesuturile inflamate, unde contribuie la formarea edemului, hiperalgezie și durere [127]. Procesele inflamatorii și imune, variația presiunii oxigenului și stresul mecanic pot determina condrocitele să sintetizeze NO și superoxid [90]. NO poate reacționa cu anionul superoxid cu obținerea peroxinitritului, care este de asemenea implicat în efectele proapototice și proinflamamtorii din cartilaj [48].

În cartilajul artrozic apar cantități mari de NO și ROS, iar iNOS este up-reglată în condrocitele artrozice, ceea ce duce la mărirea sintezei de NO. TNFα și IL-1 stimulează producția de NO în cartilaj [68]. NO este implicat în promovarea catabolismului cartilajului artrozic prin intermediul mai multor mecanisme: inhibiția sintezei unor molecule din matricea cartilajului (ex agrecan [68]), creșterea activității MMP [67], scăderea sintezei de IL-1Ra, un inhibitor endogen al IL-1β [49]. NO este implicat în apoptoza condrocitelor și induce sinteza COX-2 și a PGE2 [67], dar inhibiția sintezei PGE2 de către inhibitorii COX-2 nu influențează semnificativ producerea de NO [128]. În schimb, PGE2 poate sensibiliza condrocitele artrozice la moartea celulară indusă de NO. Astfel, NO acționează prin micșorarea proceselor anabolice majore și prin intensificarea reacțiilor catabolice [67].

În ceea ce privește efectul AINS asupra NO in vitro, Berg și colab. au găsit că unele AINS inhibă formarea NO mediată de iNOS, doză-dependent: lornoxicamul și indometacinul în aproximativ aceeași măsură, piroxicamul și diclofenacul de trei ori mai puțin decât lornoxicamul, iar ketorolacul, ibuprofenul și naproxenul foarte puțin [127]. AINS administrate epidural afectează hiperalgezia produsă de NO și suprimă, în funcție de doză, hiperalgezia termică indusă de nitroglicerină [106].

Tuzun și colab. au determinat că acidul tiaprofenic și flurbiprofenul determină scăderea valorilor plasmatice ale NO și ROS [126], Ozgocmen și colab. au arătat că tenoxicamul și celecoxibul reduc nivelul NO [117] la pacienții cu artroză, iar Yoon și colab. au observat că AINS inhibă apoptoza indusă de NO independent de acțiunea lor asupra activității COX [129].

Se știe că stresul oxidativ poate induce moarte celulară prin apoptoză, iar SOD joacă un rol important în prevenirea apoptozei [130]. Regan și colab. au raportat o scădere semnificativă a activității SOD la pacienții cu artroză [131]. Cimen și colab. au investigat efectul in vivo al celecoxibului, ibuprofenului și tenoxicamului asupra metabolismului radicalilor liberi în eritrocite la pacienții cu artroză, descoperind o influență asemănătoare asupra SOD și potențialului antioxidant a acestor AINS, în ciuda mecanismului diferit de acțiune asupra COX [132]. La pacienții cu artroză s-a observat că piroxicamul [133], acidul tiaprofenic și flurbiprofenul [126] determină creșterea semnificativă a valorilor plasmatice ale SOD, în timp ce Ozgocmen și colab. au arătat că tenoxicamul și celecoxibul determină o creștere nesemnificativă a SOD [117].

Studiile realizate cu privire la influența AINS asupra GPx sunt relativ puține, constatându-se variații nesemnificative ale activității acestei enzime. Într-un studiu realizat pe pacienți cu artroză s-a constat că celecoxibul determină o scădere, iar tenoxicamul o creștere nesemnificativă din punct de vedere statistic a activității GPx [117]. Bartosiewicz și colab. au determinat faptul că piroxicamul produce modificări semnificative ale activității GPx la pacienți cu poliartrită reumatoidă [125]. Agha și colab. au observat la șobolani cu artrită indusă experimental creșterea activității plasmatice a GPx, iar administrarea de meloxicam duce la modularea parametrilor afectați [123]. Orhan și Sahin au găsit că piroxicamul, ketorolacul, naproxenul și acidul tiaprofenic determină o inhibiție semnificativă a glutation peroxidazei seleniu-dependentă din eritrocitele umane in vitro [134].

Concluzii

1. Stresul oxidativ apare în reacțiile metabolice care folosesc oxigen și reprezintă un dezechilibru între reacțiile antioxidante și prooxidante care au loc în organismele vii.

2. Sistemele antioxidante ale eucariotelor s-au dezvoltat din trei sisteme enzimatice clasice (SOD, catalaza și glutation peroxidaza) și includ un grup de agenți enzimatici și neenzimatici cum sunt: glutation S-transferaza, sitemele tioredoxine/peroxiredoxine, tiroid peroxidaza, eozinofil peroxidaza, sulfiredoxina, proteinele complexante (transferina, feritina, lactoferina, albumina, ceruloplasmina și metalotioneinele), agenții antioxidanți cu masă moleculară mică – endogeni (glutationul, coenzima Q, acidul lipoic, hormonii sexuali, bilirubina) și exogeni (vitamina C, E, P, beta-carotenul).

3. Rolul important al ROS/RNS în reglarea răspunsurilor fiziologice este subliniat de aparentele neregularități ale răspunsurilor fiziologice în diferite boli care sunt legate de stresul oxidativ.

4. Procesul inflamator stă la baza mecanismelor patogenice din cadrul multor afecțiuni, cele mai răspândite afecțiuni inflamatorii fiind bolile reumatismale.

5. Poliartrita reumatoidă este o boală autoimună sistemică, ce se caracterizează prin inflamarea cronică a articulațiilor, cu infiltrarea macrofagelor și a celulelor T activate, iar producerea radicalilor liberi la locul inflamației poate contribui decisiv la patogeneza bolii.

6. Modificările care apar în cartilajul articular afectat de artroză provin din dezechilibrul dintre procesele anabolice și cele catabolice influențate de forțele biomecanice ca și de defecte ale reglării autocrine, paracrine și endocrine la nivel celular.

7. Stresul oxidativ este implicat direct în artroză prin destrucția cartilajului, dar are și acțiune indirectă prin activarea colagenazelor, proenzimelor și up-reglarea unor gene care codifică enzime implicate în degradarea matricei și producției de citokine.

8. În cartilajul artrozic apar cantități mari de NO și ROS, iar iNOS este up-reglată în condrocitele artrozice, ceea ce duce la mărirea sintezei de NO. Acesta acționează prin micșorarea proceselor anabolice majore și prin intensificarea reacțiilor catabolice.

9. ROS/RNS sunt implicate în modularea eliberării mediatorilor inflamatori, crescând expresia chemokinelor și citokinelor și reglând expresia moleculelor de adeziune în celulele inflamatorii.

10. Antiinflamatoarele nesteroidiene (AINS) fac parte din grupa analgezice-antipiretice-antiinflamatoare, având efect predominant antiinflamator. Sunt utilizate în special în scop antiinflamator și analgezic.

11. Mecanismul principal de acțiune al AINS constă în inhibiția COX, dar s-a sugerat că activitatea lor antiinflamatoare ar putea fi datorată și capacității de a epura ROS/RNS și de a inhiba explozia respiratorie din neutrofile.

12. În artroză, AINS par să acționeze prin inhibiția sintezei de PG prin blocarea activității COX – atât COX-1 cât și COX-2, dar o parte din mecanismele lor de acțiune pot fi legate și de diminuarea generării superoxidului și radicalilor liberi, prevenirea formării și eliberării radicalilor liberi și a enzimelor degradative din macrofagele sinoviale și leucocitele polimorfonucleare, putând influența mobilitatea, chemotaxia și agregarea PMN și macrofagelor, dar și prin neutralizarea directă a radicalilor liberi

13. AINS inhibă formarea HOCl, dar îl și neutralizează probabil prin competiția cu ionul clorură pentru situsul activ al MPO, fără a inhiba complexul enzimatic al NADPH-oxidazei.

14. Deși în timpul sintezei prostaglandinelor din acidul arahidonic sub influența COX sunt generați radicali liberi, doar inhibiția COX nu pare a explica în totalitate efectele antioxidante demonstrate de oxicami, ceea ce sugerează un mecanism adițional asupra stresului oxidativ, independent de blocarea COX.

15. Dezvoltarea unor medicamente care ameliorează producția de ROS/RNS poate fi, în viitorul apropiat, un obiectiv central în cercetările asupra tratamentului bolilor în care este implicat stresul oxidativ.