Modificari Organoleptice Nedorite ale Laptelui Cauzate de Microorganisme

[NUME_REDACTAT] S., 2006, Microbiologia produselor alimentare, vol. I, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] S., 2006, Microbiologia produselor alimentare, vol. II, Cluj-Napoca, [NUME_REDACTAT]

Apostu S., Rotar M. A., 2009, Microbiologia produselor alimentare, Lucrări practice, vol. III, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] C., 2005, Microbiologia alimentelor, [NUME_REDACTAT] din Oradea, [NUME_REDACTAT] C., 2010, Microbiologia generală a unităților agroalimentare, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] C., 2005 , Tehnici și examene de laborator în controlul alimentelor, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] C., 2009, Lucrări practice de microbiologie, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] C., Principii de apreciere ale calității unor produse alimentare, 2008, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] C., Tonț C., Ionescu C. G., 2001, Microbiologia și controlul calității laptelui și a produselor lactate, , [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] L., 2010, Ghid practic de igienă a produselor agroalimentare, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] L., Oneț C., 2009, Igiena alimentelor, [NUME_REDACTAT] din [NUME_REDACTAT] V. ,Bara C., Pop C., 1998, Tehnici de microbiologie aplicată, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] V. ,Chipurici M. ,Zabik A. ,Bara C. ,[NUME_REDACTAT] R. ,[NUME_REDACTAT] V. ,Bonta M., 2000, Metode generale de microbiologie practică, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] I., Tehnologia și controlul calității laptelui și produselor lactate, 2007, [NUME_REDACTAT] Ionescu de la Brad, [NUME_REDACTAT] Gh., Banu C., [NUME_REDACTAT]., [NUME_REDACTAT]., 2005, Cartea producătorului și procesatorului de lapte, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] D., 1964, Microbiologia produselor alimentare, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] D., Henegariu O., 1996, Microbiologie, Tipo AGRONOMIA [NUME_REDACTAT] C., Transformări biochimice importante în produsele agroalimentare în timpul procesării și depozitării, 2008, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] C., Petcu C., 2008, Igiena și controlul produselor de origine animală, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] C., 2004, Microbiologie alimentară, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT]

În lapte se pot întâlni nu doar microorganisme utile, ci și germeni microbieni dăunători. Aceștia din urmă, dacă sunt prezenți în număr mare și au condiții favorabile de dezvoltare, pot provoca o serie de transformări nedorite, dăunătoare, afectând calitatea laptelui și a produselor derivate.

Laptele conține un număr mai mare sau mai mic de microorganisme, în funcție de starea de sănătate a animalului și în special a ugerului, de condițiile de exploatare a animalului, de modul de recoltare și condiționare a laptelui. În lapte se dezvoltă cu prioritate microorganismele care găsesc condiții favorabile de înmulțire, în special în cazul mulsului și manipulării neigienice, a filtrării incorecte, arăcirii insuficiente și a păstrării în condiții corespunzătoare un timp mai îndelungat.

La rândul lor și produsele lactate se pot ușor contamina cu diverse microorganisme patogene (bacterii, drojdii, mucegaiuri, virusuri), care sunt periculoase pentru sănătatea consumatorilor acestor produse. Pătrunderea agenților microbieni patogeni în produsele lactate poate fi favorizată de diverse surse de contaminare: sol, praf, aer, omul bolnav sau purtător sănătos etc.

O importanță aparte pentru microbiologia brânzeturilor o reprezintă mucegaiurile, întrucât există anumite specii care în timpul creșterii lor produc substanțe cu acțiune toxică (micotoxine).

Evaluarea încărcăturii microbiologice a laptelui crud și a produselor obținute din acesta, cum e și cazul brânzeturilor proaspete, servește la identificarea numărului total de germeni cu scopul aprecierii igienice a laptelui crud, la identificarea microorganismelor dăunătoare sau patogene, la aprecierea condițiilor igienice de recoltare, condiționare, manipulare și transport, la identificarea surselor de contaminare a laptelui. Ea se efectuează cu scopul asigurării securității și siguranței alimentare a consumatorului.

Capitolul I. Dezvoltarea microorganismelor în lapte

Condiția esențială ca microorganismele să se dezvolte și să se multiplice într-un mediu de cultură este prezența compușilor organici (glucide, proteine, lipide), dar și a sărurilor minerale prezente sub formă de macroelemente și microelemente.

În cazul laptelui, glucidele, care constituie sursa principală de energie pentru microorganismele chimioorganotrofe, sunt reprezentate de lactoză, care, de alfel, este și elementul nutritiv cu cea mai mare pondere din compoziția chimică a laptelui.

În ceea ce privește proteinele, laptele are un conținut ridicat în protide de calitate superioară, care constituie un mediu favorabil pentru dezvoltarea microorganismelor.

Prin ponderea lor în cadrul compoziției chimice a laptelui, dar și prin structura lor, lipidele furnizează, alături de glucide, importante cantități de energie pentru microorganisme.

Prin ansamblul microelementelor și macroelementelor pe care le conține, laptele furnizează elemente constitutive pentru microorganisme.

Vitaminele din grupul B și acidul pantotenic din lapte participă intens la procesele vitale ale microorganismelor.

Este nevoie de anumite condiții, pentru ca elementele nutritive din lapte să poată fi utilizate de către microorganisme, cea mai importantă fiind producerea de către microorganisme a unor enzime, care au capacitatea de a degrada componentele nutritive ale laptelui în produși asimilabili. Aceste enzime pot fi exoenzime sau endoenzime.

Un alt factor, care influențează dezvoltarea microorganismelor în lapte este temperatura, mai precis valoarea optimă a acesteia. Temperatura de păstrare a laptelui favorizează multiplicarea microorganismelor.

Diferitele microorganisme care se dezvoltă în lapte se pot inluența reciproc. Astfel, putem vorbi de două tipuri de relații: simbioza și antibioza. Simbioza reprezintă o formă de conviețuire a mai multor specii de microorganisme, care se găsesc într-o relație reciproc avantajoasă, în cadrul căreia microorganismele cooperează la satisfacerea cerințelor de hrană. Antibioza este o formă de relație dintre diverse specii de microorganisme, în care efectele produse de unul din membrii asociației microbiene sunt negative pentru celelalte specii.

Laptele proaspăt muls conține microorganisme al căror număr depinde și de alți atori în afara celor menționați anterior, cum ar fi : igiena mulsului, condițiile de manipulare a laptelui după mulgere, durata de răcire a laptelui, modalitatea de filtrare a laptelui, condițiile de păstrare.

Se vor dezvolta în lapte sau în produsele obținute prin prelucrarea acestuia, acele microorganisme care găsesc condiții favorabile de înmulțire, în special în cazul mulsului neigienic, a manipulării neigienice a laptelui, a filtrării incorecte, a răcirii insuficiente și a păstrării în condiții necorespunzătoare un timp mai îndelungat.

În funcție de diverși factori intrinseci din lapte, de tipul microorganismelor prezente în lapte și de concentrația acestora, se pot distinge mai multe faze de evoluție a microorganismelor în lapte.

Prima fază se numește fază bacteriostatică și se caracterizează prin faptul că în această etapă, este oprită sau încetinită înmulțirea microorganismelor în laptele proaspăt muls, fără ca acestea să fie însă omorâte. Stagnarea microorganismelor în această etapă este consecința prezenței în lapte a unor substanțe naturale cu efect antimicrobian, cum este cazul lacteninelor, lactoferinelor, lizozimului. Activitatea antimicrobiană a acestor substanțe este diferită în funcție de temperatura de păstrare a laptelui după muls.

Faza următoare în evoluția microorganismelor din laptele crud este denumită faza microbiotei heterogene și se caracterizează prin creșterea semnificativă a numărului de microorganisme din lapte, în raport cu temperatura de păstrare. Fenomenul se produce în primele două zile de păstare a laptelui. Atunci când laptele este păstrat la o temperatură cuprinsă în intervalul 0-8, se vor dezvolta lent microorganismele psichrofile (Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium), la o temperatură de păstrare de 10-30se multiplică microbiota mezofilă (Lactobacillus, Propionibacterium), iar la temperaturi cuprinse în intervalul 30-60 are loc o înmulțire a microorganismelor termofile (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Escherichia coli).

A treia fază a multiplicării microorganismelor în lapte este faza dezvoltării bacteriilor lactice, care are loc în condițiile în care laptele este menținut mai mult de 2 zile, imediat după mulgere, la temeratură peste 10. Tot în această etapă, un alt factor care influențează dezvoltarea bacteriilor lactice este aciditatea laptelui, astfel încât, la valori ale pH-ului de 4,5-6,5 se multiplică lactococii, iar la un pH de 3,5-4 se dezvoltă lactobacilii cu activitate peptidazică.

Faza de dezvoltare a levurilor și mucegaiurilor se manifestă consecutiv eliberării de enzime și de substanțe azotate prin acțiunea bacteriilor de putrefacție, care descompun protidele.

Capitolul II. Periodizarea evoluției bacteriilor în lapte

Pe durata păstrării laptelui, după mulgere, dezvoltarea bacteriilor în lapte nu este uniformă, ci se pot descrie mai multe perioade.

Perioada bactericidă se caracterizează printr-o oprire a multiplicării și chiar o reducere a numărului inițial de bacterii din lapte, care se află în faza de latență, având nevoie de o perioadă de acomodare la condițiile oferite de lapte. Acțiunea bacteriostatică și bactericidă a laptelui asupra bacteriilor se datorează prezenței în lapte a substanțelor antimicrobiene. Durata acestei perioade este influențată de temperatura de păstrare a laptelui, dar faza dispare după 2-3 ore de menținere a laptelui la aceeași temperatură. La rece, acțiunea este mai slabă, iar durata fazei este mai lungă. De asemenea, cu cât este respectată mai riguros igienizarea laptelui și numărul inițial de germeni prezenți în lapte este mai mic, cu atât această perioadă durează mai mult. Acțiunea bactericidă a laptelui nu se manifestă în egală măsură asupra tuturor bacteriilor. Astfel, bacteriile lactice sunt cele mai rezistente.

Perioadei bactericide îi urmează consecutiv perioada de acidifiere și se manifestă printr-o creștere rapidă a numărului de bacterii producătoare de fermenți lactici, care are ca efect mărirea acidității laptelui. Durata acestei perioade este variabilă, dar, în general, este de câteva zile și pe parcursul ei se pot distinge mai multe faze: faza de creștere logaritmică (la sfârșitul căreia numărul de bacterii lactice este maxim), faza staționară (în care numărul bacteriilor rămâne constant) și faza de declin (atunci când bacteriile ajung la o anumită densitate, ele nu se mai înmulțesc și apare moartea lor în proporție logaritmică, ca urmare a epuizării nutrienților din lapte sau a acumulării de metaboliți toxici pentru bacterii (Pamfil D., Henegariu O., 1996). În această perioadă, din punct de vedere biochim au loc mai multe transformări cum sunt: fermentarea lactozei la acid lactic, coagularea cazeinei, inhibarea de către acidul lactic în exces a dezvoltării bacteriilor lactice. Perioada bactericidă se caracterizează și prin apariția unor relații între diversele asociații bacteriene prezente în lapte. Aceste relații pot fi de simbioză, metabioză sau antagonism. Bacteriile bogate în enzime proteolitice cum sunt cele fluorescente și alcalinizante sunt capabile să sintetizeze vitamine și astfel creează condiții favorabile pentru dezvoltarea bacteriilor lactice. Acestea, având la dispoziție vitaminele necesare, produc în lapte un pH acid, care inhibă și omoară bacteriile de putrefacție.

Perioada de neutralizare se inițiază în momentul în care laptele are aciditatea necesară dezvoltării drojdiilor și mucegaiurilor. Pe seama acidului lactic eliberat în perioada anterioară, are loc dezvoltarea drojdiilor, care consumă acidul până la epuizarea lui, motiv pentru care, în această perioadă, pH-ul devine neutru sau chiar alcalin. Durata acestei perioade este de câteva zile până la câteva săptămâni.

Perioada de putrefacție a laptelui începe din momentul în care laptele este neutru sau alcalin. Pe parcursul ei, locul drojdiilor este luat de bacteriile de putrefacție, de tip caseinolitic (Pamfil D., Henegariu O., 1996).

Capitolul III. Modalități de contaminare a laptelui cu microorganisme

Laptele poate conține un număr mai mic sau mai mare de microorganisme în funcție de: starea de sănătate a animalului de la care provine, condițiile de exploatare a animalelor, modul de recoltare și condiționare a laptelui.

Microorganismele pot pătrunde în lapte pe două căi: internă și externă.

Pe calea internă, există două porți de pătrundere a microorganismelor: prin canalul mamelonar (microorganismele intră din mediul exterior prin mamelon, iar ulterior, prin flux ascendent ajung în corpul mamar) și prin circulația sangvină (pe calea sângelui, microorganismele ajung în glanda mamară unde se localizează cauzând diverse leziuni).

Calea externă prezintă mai multe surse de contaminare: om, animal, habitat, aer, apă, sol, instalații și utilaje folosite la muls.

Solul reprezintă o sursă importantă de contaminare a laptelui cu diverse specii de microorganisme telurice (bacili tetanici, bacilii antraxului, mucegaiuri, drojdii).

Apa constituie una din cele mai răspândite și rapide modalități de contaminare a laptelui. Prin apă se transmit mai ales bacterii, ea putând fi ontaminată cu materii fecale provenite de la animale și om. Pe lângă bacterii în apă pot fi prezene și mucegaiuri care pot cauza boli la animale.

Aerul poate contamina animalele și implicit laptele cu diferite bacterii (mai ales sporulate), dar și cu mucegaiuri și foarte rar cu levuri.

Praful din adăpost poate de asemenea conține numeroase bacterii sporulate, cauzând contaminarea laptelui.

O sursă importantă de contaminare cu microorganisme a laptelui este prin intermediul nutrețurilor însilozate alterate, care de altfel, favorizeză răspândirea germenilor microbieni și în adăposturi.

Dejecțiile animalelor reprezintă o altă cale de pătrundere a microorganismelor în lapte fie accidental după ce laptele a fost muls fie în timpul mulsului.

Instalațiile și echipamentele de muls, atunci când această operațiune se efectuează mecanizat, în condițiile în care nu sunt păstrate și întreținute igienic, pot constitui o sursă de contaminare a laptelui cu microorganisme. De asemenea, atunci când mulsul se execută manual, în condiții neigienice, poate survveni contaminarea laptelui cu germeni infecțioși.

Personalul care lucrează în unitățile de prelucrare a laptelui, pe fluxul obțineriii și depozitării pot realiza o contaminare externă. La fel și mulgătorul poate influența calitatea igienică a laptelui, prin igiena sa personală sau igiena mulsului.

Datorită aspectelor amintite, considerăm că o bună igienizare a adăposturilor, a locului de staționare și exploatare a animalelor de lapte, determină o diminuare a încărcăturii microbiene a laptelui.

Capitolul IV. Surse de contaminare a laptelui cu bacterii patogene

A. Animalele cu afecțiuni de natură microbiologică

[NUME_REDACTAT] bovină

Este o afecțiune cauzată de specia Mycobacterium bovis, bacterie care poate ajunge în laptele animalului bolnav fie în timpul mulsului, când boala este localizată la nivelul glandei mamare (mamită tuberculoasă), fie după muls, datorită unei igiene a mulsului necorespunzătoare, atunci când boala se localizează extramamar (tuberculoză intestinală, tubeculoză uterină, tuberculoză pulmonară). În cazul tuberculozei intestinale a animalului, bacilul tuberculozei se elimină prin materiile fecale ale acestuia, care pot ajunge să contamineze laptele în timpul mulsului. În situația în care boala se localizează la nivelul uterului (metrita tuberculoasă), contaminarea laptelui se face prin secrețiile uterine ale animalului. Dacă tuberculoza este localizată pulmonar, contaminarea laptelui se face în momentele în care animalul expectoreză secreții bronșice în timpul tusei.

Tuberculoza ovinelor și caprinelor

Este cauzată de Mycobacterium tuberculosis și se manifestă prin mamită tuberculoasă.

Comercializarea laptelui provenit de la animale cu tuberculoză este interzisă.

[NUME_REDACTAT] bovină este o afecțiune cauzată de agentul etiologic bacterian din specia Brucella abortus.În țara noastră și alte câteva țări europene, boala a fost eradicată ([NUME_REDACTAT], 2007).

Bruceloza ovinelor și caprinelor este provocată de specia Brucella melitensis.La caprine și ovine, principala formă de manifestare a bolii este mamita.

[NUME_REDACTAT] o boală produsă de bacteria din specia Bacillus anthracis.Boala poate evolua cu mamite acute sau cronice sau cu septivemie, ocazii cu care, germenul microbian poate ajunge în laptele animalului bolnav.

Laptele provenit de la animalele bolnave de antrax nu se admite în consumul uman.

[NUME_REDACTAT] specii bacteriene din genul Salmonella, care reprezintă agenții etiologici ai salmonelozelor, au ca habitat natural tubul digestiv al animalelor, astfel încât, ele pot ajunge în lapte accidental, prin eliminarea lor odată cu materiile fecale ale animalelor bolnave, în situația în care nu este respectată igiena mulsului.

Datorită faptului că reprezintă un pericol pentru sănătatea consumatorilor, laptele provenit de la animale cu salmoneloză, nu se admite pentru consum.

[NUME_REDACTAT] se poate manifesta la bovine, ovine, caprine, sub formă de mamite provocate de bacterii din specia Listeria monocytogenes, care poate ajunge în lapte, în timpul mulsului.Laptele contaminat cu acest microorganism, se confiscă și se distruge.

Mamitele streptococice și stafilococice

Mamitele streptococice sunt afecțiuni relativ frecvente la bovine, cauzate de bacteria din specia Streptococcus agalactiae.

Mamitele stafilococice sunt datorate infecției cu pbacteria patogenă Staphylococcus aureus.

Atât în cazul mamitelor streptococice , cât și în cazul celor stafilococice, bacteriile ajung în lapte, prin manoperele din cadrul actului de mulgere.

B. Animalele cu stare de igienă precară

Îndeosebi în situațiile, în care mulsul este efectuat manual, contaminarea laptelui se poate realiza accidental, în condițiile nerespectării igienei mulsului, microorganismele ajunse în recipientele de colectare a laptelui provenind, de multe ori, de pe murdăria prezentă pe corpul animalului, reprezentată de fire de păr, particule de materii fecale, particule de pământ, resturi de vegetale.

C. Obiectele folosite la operațiunea de mulgere

În situația în care nu se respectă igienizarea instalațiilor folosite la mulsul mecanizat, acestea pot constitui o sursă de contaminare a laptelui cu microorganisme.

D. Persoana care efectuează mulsul manual

Mulgătorul și personalul îngrijitor sunt o sursă de infectare cu bacterii patogene (tuberculoză, dizenterie, scarlatină, pojar, paratifos, etc). Bacteriile se pot găsi pe mâini, sub unghii, în cutele pielii. Mulgătorii trebuie să respecte strict regulile de igienă: halate curate, să poarte bonetă, să nu-și sprijine capul pe corpul animalului (provoacă scuturarea prafului de pe corp), să aibă mâinile spălate regulat cu apă caldă, cu săpun și șterse.

E. Vectorii care pot vehicula microorganisme prezente la suprafața corpului lor

Insectele, mai ales muștele, direct, prin căderea în lapte sau indirect prin așezarea lor pe vase, pot produce infectarea laptelui. Pe corpul lor se pot găsi până la un milion germeni și bacterii patogene ale febrei tifoide și paratifosului.

F. Depozitarea și transportul laptelui defectuoase, prin intermediul unor mijloace neigienizate corespunzător

G. Apa contaminată cu microorganisme utilizată la operațiunile de curățare a instalațiilor de muls, recipientelor de colectare și utilajelor folosite în cadrul etapelor de procesare.

Capitolul V. Modificări organoleptice nedorite ale laptelui cauzate de microorganisme

Modificările reprezentative ale proprietăților organoleptice ale laptelui crud, sub acțiunea microorganismelor, sunt reprezentate de: modificări de consistență, modificări de culoare, modificări de gust și miros.

Aceste modificări se datorează acțiunii microorganismelor asupra unor componente ale compoziției chimice a laptelui, cum sunt proteinele și lipide.

Multe microorganisme de tip proteolitic acționează asupra cazeinei, principala proteină a laptelui, pe care o hidrolizează la aminoacizi, care sunt ulterior degradați la compuși de tipul : amoniac, indol, scatol, hidrogen sulfurat.În urma acestei acțiuni, laptele poate suferi modificări de coagulare, de culoare dar și de gust și miros.

Microorganismele lipolitice care se pot dezvolta în lapte, determină prin activitatea enzimei lipază, hidroliza grăsimilor laptelui, proces în urma căruia rezultă acizi grași și glicerină. Dintre efectele acțiunii microorganismelor lipolitice asupra laptelui fac parte modificările de gust și de miros (ex. iute, înțepător, picant, rânced).Marea majoritate a microorganismelor lipolitice desfășoară în același timp și o activitate de tip proteolitic, astfel încât modificările produse prin acțiunea lipazelor vor fi aproape constant însoțite și de unele modificări proteolitice.

Modificările de consistență cauzate de microorganisme constau în aspectul filant (vâscos) al laptelui, absența coagulării laptelui,coagularea dulce (neacidă) a laptelui.

Laptele filant reprezintă un defect cauzat de dezvoltarea în lapte a unor microorganisme capabile să producă o cantitate mare de sustanțe mucilaginoase, cu consistență crescută.Acesat aspect vâscos al laptelui se manifestă cu precădere la suprafața laptelui colectat și poate avea diferite grade: de la un fenomen abia perceptibil, când grosimea firului de filanță este la fel ca cea a firului de paianjen, până la o vâscozitate pronunțată, când firul filant este foarte gros. Defectul se datorează multiplicării în lapte a bacteriilor : Bacterium lactis viscosus, Propionibacterium freudenreichi, Enterobacter aerogenes, Alcaligenes viscolactis, Alcaligenes paraviscosus.

Absența coagulării laptelui este un fenomen care apare atunci când laptele a fost invadat de la început de o floră proteolitică, care a hidrolizat cazeina, făcând imposibilă acidifierea laptelui. Din categoria bacteriilor cu acțiune proteolitică fac parte cele din genurile: Bacillus, Pseudomonas ([NUME_REDACTAT], 2007).

Coagularea dulce a laptelui se caracterizează prin formarea unui coagul foarte moale, care se sparge repede și separă ușor zerul. Coagularea neacidă apare în urma contaminării laptelui cu bacterii ca: Micrococcus, Pseudomonas fluorescens, Streptococcus faecalis subsp. liquefaciens.

Modificările de culoare sunt consecința multiplicării în lapte a unor bacterii producătoare de pigmenți, fie difuzibili sau solubili în toată masa de lapte, care se va colora uniform, fie nedifuzibili, care dezvoltă pete colorate (reprezentate de colonii microbiene confluate) doar la suprafața laptelui.

Culoarea neagră a laptelui este rezultatul dezvoltării în lapte a bacteriei din specia Bacterium lactis niger sau a unor fungi : Cladosporium herbarum, Torulopsis spp., Rhizopus spp..

Culoarea albastră a laptelui apare în urma multiplicării în lapte a speciilor bacteriene Pseudomona syncyanea, Chromobacterium violaceum și a unor fungi din genul Oidium.

Culoarea galbenă a laptelui e dată de bacterii din genurile: Pseudomonas, Flavobacterium, Micrococcus (M. luteus) sau de drojdii din genul Saccharomyces. De exemplu, când specia Pseudomonas fluorescens acționează în lapte, acesta devine un lichid tulbure, galben-verzui, fluorescent, cu miros neplăcut (de amoniac, de pește sau de urină).

Culoarea roșie a laptelui apare în următoarele situații: când se dezvoltă la suprafața laptelui colonii pigmentate, de culoare roșie, produse de bacterii din specia Serratia marcescens și în acest caz, pigmentul produs de bacterie fiind nedifuzibil, colorarea în roșu a laptelui va fi limitată numai la zonele în care se dezvoltă colonii vizibile cu ochiul liber; când în lapte se dezvoltă bacteria Brevibacterium lactis erytrogenes , care elaborează un pigment roșu doar la întuneric și numai dacă laptele este neutru sau alcalin; când în lapte se dezvoltă microorganisme care produc pigmenți difuzibili, ceea ce determină colorarea întregii mase de lapte, de ex. Corynebacterium roseum sau unele levuri din genurile Torula și Rhodotorula.

Modificările de miros și gust sunt reprezentate de: gustul și mirosul de mucegai (care se datorează dezvoltării unor mucegaiuri), gustul și mirosul de putrid (este consecința dezvoltării bacteriilor din genurile Alcaligenes și Escherichia); gustul și mirosul de săpun (apare când în lapte se multiplică bacteria Bacterium lactis saponacei, Pseudomonas sapolactica, Pseudomonas fluorescens sau levuri din genul Candida); gustul amar (produs de Enterobacter aerogenes, Micrococcus freudenreichi, Micrococcus casei amari); gustul și mirosul de pește (este cauzat de dezvoltarea în lapte a speciilor Pseudomonas fluorescens și Pseudomonas ichtyosomia) ([NUME_REDACTAT], 2006).

Capitolul VI. Igiena laptelui

Adăposturile destinate cazării animalelor trebuie să îndeplinească o serie de condiții privind igiena. Accesul la adăposturi ăi la spațiile adiacente acestora trebuie să fie libere de orice acumulare de materii dăunatoare și în permanență trebuie asigurate conditii igienice și constructive.

Canalele de colectare a dejecțiilor se vor curăța ori de cate ori este necesar. Grajdurile se vor menține uscate, iar dacă este necesar, se va folosi un așternut pentru animale (Savu C., Petcu C., 2008).

Dezinfecția adăposturilor și spațiilor adiacente acestora trebuie făcută astfel încat operațiunea să nu prezinte risc de depreciere sau de contaminare a laptelui.

În adaposturile pentru animale vor fi combătute insectele și animalele indezirabile; nu este permisă depozitarea substanțelor chimice, produselor biologice și medicamentoase. Acestea se vor depozita în spații special amenajate și ținute sub cheie.

De asemenea, în adăposturi nu este permisă depozitarea furajelor și alimentelor care pot influența calitatea laptelui.

Echipamentele și ustensilele folosite la mulsul și manipularea laptelui trebuie să fie menținute curate și în stare corespunzătoare. Se vor spăla, dezinfecta și se vor limpezi cu apă potabilă, după care, se vor depozita într-o încăpere igienizată. Tancurile de depozitare a laptelui, după golire, spălate și dezinfectate, se vor lăsa cu unul dintre orificii deschis până la refolosire (Bara L., 2010).

Fiecare animal trebuie să fie marcat prin una dintre metodele de individualizare, pentru a putea fi identificat la nevoie. Toate animalele trebuie să fie curate și bine întreținute, iar înaintea operațiunii de muls, se face igiena glandei mamare și a zonelor adiacente acesteia. Nu este permisă nici o operațiune care ar putea avea efect nociv asupra laptelui, înainte și în timpul mulsului.

Înaintea mulsului, operatorul va analiza aspectul laptelui. Dacă va constata modificări organoleptice se vor aplica măsuri speciale. Animalele cu boli clinice ale glandei mamare se vor mulge la sfârșitul mulsului colectiv, cu o mașină separată sau se vor mulge manual, iar laptele astfel obținut se colectează separat și nu se livrează.

Animalele producătoare de lapte care au afecțiuni ale glandei mamare se tratează după muls, cu substanțe cu acțiune locală, cu spray-uri speciale sau în alt mod dictat de autoritatea competentă.

Personalul care efectuează mulsul și manipulează laptele are obligația de a purta echipament adecvat și de a avea mâinile curate în permanență, conform normelor de igienă. În acest scop, în apropierea locului de desfășurare a mulsului trebuie să existe facilități pentru spălarea mâinilor și a brațelor. Plăgile deschise și oricare alte leziuni se vor acoperi cu bandaje rezistente la apă (Bara L., Oneț C., 2009).

După muls, laptele se depozitează până la colectare într-un spațiu separat. Recipientele cu lapte se vor acoperi pe durata staționării în adăpostul pentru animale sau vor fi transportate în spații special amenajate.

Dacă laptele este filtrat, filtrul utilizat se va înlocui sau curăța înainte de depășirea capacității sale de filtrare, ori de câte ori este necesar. La fiecare muls se utilizează un filtru nou. Este interzisă utilizarea ca filtru a materialelor textile.

Capitolul VII. Condiții care facilitează multiplicarea microorganismelor în produsele lactate

Acțiunea microorganismelor în produsele lactate poate să fie variabilă și să influențeze caracteristicile fizico-chimice, organoleptice și nutriționale ale acestuia. Activitatea microbiană se manifestă, de cele mai multe ori, în legătură cu reacțiile enzimatice. Proliferearea microbiană duce la modificări nedorite, defavorabile pentru produsul alterat (miros, gust, aspect, culoare, textură, valoare alimentară, valoare igienică). Modificările care apar depind de compoziția produsului și în special de conținutul în apă, glucide, proteine, lipide (Tofan C., 2004). Pentru a favoriza dezvoltarea microbiană, substanțele nutritive din compoziția chimică a produsului lactat trebuie să fie prezente într-o formă utilizabilă sau degradabilă, motiv pentru care, unele substraturi sunt fie rezistente la atacul microorganismelor fie vor fi degradate doar de acele microorganisme care posedă enzime specifice. Astfel, stadiile inițiale de degradare a multor produse, pot fi efectuate numai de microorganisme care sintetizează enzime numite celulaze și pectiunaze, care depolimerizează polizaharidele din peretele celulelor și eliberează componente cu masă moleculară mică, metabolizabile și de către microorganisme care posedă un echipament enzimatic mai sărac. Majoritatea microorganismelor de alterare nu sunt pretențioase din punct de vedere nutritiv.

Sub acțiunea microorganismelor și a fenomenelor enzimatice proprii, produsul lactat își modifică compoziția chimică și consecutiv structura, devenind astfel accesibil pentru o varietate de microorganisme.

Pe parcursul procesului de degradare a alimentului, cerințele nutritive ale unui grup de microorganisme, se pot schimba în raport cu condițiile întâlnite în produs. Astfel unele microorganisme devin mai pretențioase din punct de vedere nutritiv când întâlnesc în aliment temperaturi ridicate sau valori mai mici ale activității apei.

Supraviețuirea și înmulțirea microorganismelor sunt fenomene posibile doar în cadrul unor anumite valori de pH. Regimurile convenabile de pH sunt diferite pentru diverse genuri și specii de microorganisme. Într-un grad oarecare, celula microbiană are capacitatea de a-și regla pH-ul intern. Acest fapt explică limitele destul de largi de pH în care unele microorganisme trăiesc și se multiplică, cum este și cazul mucegaiurilor sau drojdiilor. Modul de acțiune al pH-ului asupra dezvoltării microorganismelor într-un produs lactat este legat de mediul în care acesta se află, de permeabilitatea membranei celulare a microorganismelor și de activitatea lor metabolică. Anumite substanțe din mediul în care se află microorganismele se modifică prin echilibrul ionic, cum este cazul ionilor metalici. La un pH acid, ionii de magneziu formează complexe insolubile, iar la pH bazic, cei de zinc, de calciu și fier se complexează. Sub această formă, ionii, care sunt indispensabili formării coenzimelor, sunt greu de utilizat. Permeabilitatea membranei celulei microbiene este de asemenea afectată de variațiile concentrației ionilor de hidrogen și hidroxid, întrucât, într-un mediu acid, permeazele cationice se saturează în ioni de hidrogen, ceea ce limitează sau anulează transportul cationilor indispensabil, iar într-un mediu alcalin, ionii hidroxilici saturează membrana celulară microbiană, împiedicân transportul anionilor indispensabili. Reacțiile enzimatice au un optim de pH pentrru dezvoltare. Peste sau sub acest optim, cinetica este perturbată (Apostu S., 2006, vol.I).

Potențialul oxidoreducător al unui mediu poate să scționeze asupra sensului de deplasare a echilibrelor de reacție a metabolismului. Metabolismul unei celule microbiene cuprinde pe de o parte reacții de degradare a substratului nutritiv (reacții catabolice), eliberatoare de energie, iar pe de altă parte, reacții de sinteză a materiei vii proprii (reacții anabolice), consumatoare de energie. Aceste reacții se desfășoară pe baza echipamentului enzimatic celular, a cărui activitate este condiționată de anumite caracteristici fizico-chimice ale mediului în care se află, din care face parte și potențialul oxidoreducător. Microorganismele strict aerobe nu se pot dezvolta decât într-un mediu cu potențial oxidoreducător ridicat, în timp ce microorganismele strict anaerobe se pot dezvolta numai într-un mediu cu valori scăzute ale potențialului oxidoreducător.

Fiecare specie microbiană se poate înmulți numai între anumite limite de temperatură, între ele situându-se temperatura opotimă de dezvoltare, adică temperatura la care raportul timp/generație este cel mai mic. Pe baza temperaturilor minime, maxime și optime de înmulțire, microorganismele pot fi clasificate în cinci grupe principale: termofile, termotrofe, , mezofile, psihotrofe, psihrofile (Apostu S., 2006, vol.I). Microorganismele psihrotrofe, care au temperatura otimă de înmulțire în intervalul 25-30, sunt cele mai răspândite în natură, ele având semnificația cea mai mare pentru alterarea produselor alimentare.

Umiditatea relativă a atmosferei în care se depozitează un produs agroalimentar (presiunea vaporilor de apă) are o foarte mare influență asupra dezvoltării microorganismelor aflate la suprafața produsului și în consecință, influențează durata de conservare a acestuia. Excesul de umiditate care se formează la suprafața unui produs poate avea două origini: vaporii din atmosferă sau apa din produs. Produsele a căror conservare se bazează în special pe conținutul redus de apă (valoare mică a activității apei) se vor altera începând cu straturile lor superficiale. Dacă gradul de umiditate nu este așa de mare, în straturile superficiale se vor dezvolta la început mucegaiurile, apoi treptat și unele bacterii. Dacă umiditatea atmosferică este mare, se creează de la început condiții favorabile dezvoltării bacteriilor în straturile superficiale ale produselor.

Presiunea și tipul gazelor din locul de depozitare a produselor lactate influențează dezvoltarea microorganismelor. Microorganismele aerobe se vor dezvolta mai bine pe suprafața produselor depozitate într-o atmosferă cu presiunea parțială a oxigenului normală, iar microorganismele anaerobe în produse depozitate în condiții de anaerobioză.

Interrelațiile care pot apărea în condiții naturale între microorganismele care trăiesc pe același produs sunt foarte complexe. Datorită proprietăților variate ale diverselor specii microbiene și intensității cu care decurg procesele lor metabolice, aceste relații au un rol important asupra vieții microorganismelor și indirect, asupra modificărilor pe care le suferă produsele alimentare.

Într-un anumit mediu, o specie sau o tulpină microbiană se înmulțește într-un anume mod, cu o rată caracteristică. Rata de înmulțire a unui microorganism reprezintă un factor implicit de influențare a altor microorganisme, numai în măsura în care ea se desfășoară în condiții optime, care însă nu sunt aceleași pentru toate grupele și speciile de microorganisme. Gradul de extindere a înmulțirii unui microorganism este, în general, determinat de : lungimea fazei de lag, raportul timp/generație și numărul total de celule rezultat la sfârșitul perioadei de înmulțire. Aceste condiții depind atât de proprietățile biochimice ale microorganismului, cât și de factori specifici, prezenți incidental, fapt care explică diferențele în privința caracteristicilor de creștere, chiar la tulpini aparținând aceleeași specii.

Profilul microbian al unui produs se modifică continuu, în sensul că, o asociație microbiană îi urmează alteia. Înlocuirea unei asociații microbiene cu alta reprezintă succesiunea microbiană și este determinată de interacțiunea dintre factorii care țin de produsul agroalimentar, factorii de mediu și factorii care țin de microorganisme. Alterarea produsului implică o succesiune de microorganisme.

Capitolul VIII. Partea practică

VIII.1.Obiectivul experimentului

Studiul a pornit de la ideea că, anumite inconveniente generate de o igienă necorespunzătoare a laptelui folosit ca materie primă în procesul de obținere a unor produse lactate, pot genera modificări nedorite în produsele respective.

Pe lângă modificările de natură organoleptică și fizico-chimică pe care le induc produselor lactate diversele microorganisme dezvoltate în laptele utilizat ca materie primă, există și riscul ca, prin consumul produselor respective, să apară toxiinfecții alimentare în rândul consumatorilor, care pun în pericol sănătatea acestora, atunci când există o contaminare a produselor lactate cu microorganisme patogene.

În acest context, am considerat utilă investigarea contaminării cu microorganisme de tipul bacteriilor, drojdiilor și mucegaiurilor, a produselor lactate de tipul brânzeturilor produse din lapte crud, colectat direct de la crescătorii de vaci de lapte și de la câteva centre de colectare a laptelui din județul Bihor, care au contracte cu diverși crescători individuali de animale, ce-și desfășoară activitatea în zonele arondate centrelor respective.

VIII.2. Motivația alegerii temei lucrării

Înainte de a trece la descrierea propriu-zisă a modului de lucru în cadrul experimentului efectuat, se impune o scurtă trecere în revistă a modului de recoltare în gospodăriile individuale, a laptelui crud pe care l-am folosit ca materie primă în procesul de obținere a produsului lactat: telemea proaspătă de vacă, pentru a justifica astfel motivația alegerii obiectivului studiului experimental și pentru a oferi o mai bună înțelegere a importanței microbiologiei laptelui folosit ca materie primă, pentru a obține produse lactate de calitate superioară din punct de vedere organoleptic și sigure din punct de vedere microbiologic.

În cadrul gospodăriilor individuale care furnizează lapte crud centrelor de colectare din județul Bihor incluse în studiu, mulsul se efectuează manual, iar laptele obținut este valorificat de către procesatorii care gestionează centrele din zonele unde sunt amplasate exploatațiile gospodărești. Laptele proaspăt muls de la vacile apaținând crescătorilor individuali este colectat în găleți care nu sunt acoperite și care sunt menținute cel puțin 15 minute în adăpostul unde se efectuează mulgerea, fiind astfel expus contactului cu flora microbiană a aerului încăperii adăpostului. Laptele proaspăt muls este filtrat de impurități cu ajutorul unei pânze de tifon. Livrarea laptelui se face o dată pe zi la centrele de colectare care preiau de la producător o cantitate de lapte reprezentată de amestecul de lapte muls cu o seară înainte împreună cu laptele muls în dimineața zilei respective.

VIII.3.Material experimental

În cadrul părții practice a lucrării, am efectuat analize microbiologice ale unor probe de telemea proaspătă de vacă, pe care am obținut-o în condiții de microproducție, din lapte de vacă crud, nepasteurizat, pe care l-am folosit ca materie primă în procedeul de fabricație a brânzei.

Pentru realizarea planului experimental pe care ni l-am propus, am recoltat lapte în vederea fabricării brânzei telemea, în două situații:

1. din lapte crud, proaspăt muls, colectat în găleți, după obținerea acestuia prin procedeu manual, direct de la fermieri

2. din lapte crud obținut de la centre de colectare și prelucrare a laptelui.

Studiul a fost efectuat pe durata 2012-2014 și s-a efectuat în mai multe etape:

1. În toamna anului 2012 s-a recoltat lapte crud direct de la producător, dintr-o gospodărie particulară din județ.

2. În anul 2013, am recoltat lapte crud, în vederea obținerii brânzei telemea în 2 ocazii: prima dată, în primăvara anului, de la o altă gospodărie particulară și a două oară, în vara anului, de la un centru de colectare a laptelui din județ.

3. În anul 2014, laptele a fost recoltat dintr-un al doilea centru de prelucrare a laptelui.

Am obținut , potrivit schemei propuse, din laptele recoltat în modul prezentat, un număr de 4 loturi experimentale de telemea proaspătă de vacă. Astfel, primul lot s-a fabricat în 2012, următoarele 2 loturi în 2013 și al patrulea, în 2014.

Din loturile obținute, am recoltat un număr de câte 4 probe de telemea, fiecare cântărind 25 de grame, pe care le-am supus analizelor microbiologice, în cadrul laboratorului de microbiologie al facultății. Am luat probe de la suprafața și din profunzimea produsului, din care am obținut probe medii.

VIII.4. Procesul tehnologic de fabricație a brânzei telemea proaspătă din lapte de vacă

Brânza telemea este o brânză care se prepară din lapte integral sau normalizat, pasteurizat, coagulat cu cheag sau pepsină, cu adaos de culturi starter lactice, care se conservă în saramura de zer acidifiat.

Tehnologia fabricării brânzei telemea include mai multe operațiuni care vor fi descrise în continuare.

Pregătirea preliminară a laptelui presupune recepția calitativă/cantitativă, curățire, eventual stocare la rece. Aciditatea laptelui la intrare în fabricație nu trebuie să depășescă 19, lapele de vacă.

Normalizarea laptelui se face până la conținutul de grăsime, care să asigure în produsul finit, grăsimea necesară.

Pasteurizarea laptelui se recomandă să se facă la 67-68, timp de 20 de minute.

Pregătirea pentru închegare include răcirea laptelui pasteurizat la 32-33, cu însămânțare de cultură de bacterii lactice (Streptococcus lactis și Lactobacillus casei).

Coagularea laptelui se face la temperatura de 31-33, cantitatea de enzimă coagulantă adăugată trebuind să asigure coagularea în decurs de 45-60 de minute. La finalizarea coagulării, coagulul trebuie să fie bine legat, favorizându-se astfel scurgerea zerului.

Prelucrarea coagulului implică o prelucrare a acestuia în vană ( întoarcerea stratului de suprafață, tăierea cu harfa în coloane cu secțiune pătrată cu latura de 2-3 cm și tăierea cu căușul în cuburi cu latura de 2-3 cm, repaus 5-10 minute și apoi scoaterea coagulului cu scafa pe crintă). Prelucrarea pe crintă începe cu legarea sedilei cu coagul care se lasă în repaus 20-30 de minute, pentru presare, după care se desface sedila, se rup marginile coagulului și se leagă din nou mai strâns sedila cu coagul, lăsându-se încă o perioadă de 30 de minute pentru scurgerea zerului.

Presarea constă în următorul procedeu: se așează chenarul metalic peste masa de brânză formată, se desface sedila, se uniformizează coagulul, se rup ușor marginile, se presează cele patru colțuri și se strânge din nou sedila în formă de plic, iar pe deasupra se așează un capac metalic, realizându-se presarea pe fiecare compartiment cu o forță de 20 kgf timp de 10-15 minute după care se mărește forța la 40 kgf timp de 110-135 de minute. Blocul de coagul presat se taie în bucăți cu latura de 11 cm, care se așează pe crintă una lângă alta.

Sărarea brânzei se face în saramură cu concentrația 20-22% și aciditatea de 20-30, având temperatura de 14-18. Durata sărării umede este de 14-18 ore, perioadă în care bucățile de brânză se întorc de 2-3 ori presărând pe fiecare față liberă sare grunjoasă. După sărarea umedă, urmează sărarea uscată a brânzei, care se face pe crintă sau în navete, timp de 3-8 ore, cu sare granulară, cu întoarcere de 1-2 ori.

VIII.5.Metode de lucru utilizate în experiment

Pe parcursul analizelor microbiologice ale probelor de brânză, am recurs, în funcție de obiectivul urmărit, la 2 tipuri de metode experimentale: cantitative și calitative.

VIII.5.1.Metode cantitative

Pentru a putea face însămânțări pe mediile de cultură din probele de telemea proaspătă de vacă, am obținut mai întâi diluții successive, folosind metoda diluțiilor seriale. Tehnica folosită a fost următoarea: într-o eprubetă conținând 90 ml ser fiziologic am introdus din cantitatea de probă recoltată, 10g, cu ajutorul unei spatule metalice sterile, am descărcat conținutul spatulei, am omogenizat amestecul eprubetei și am obținut o diluție de 1/10; din această primă diluție am pipetat o cantitate de 10 ml într-o a doua eprubetă conținând 90 ml de ser fiziologic obținând o diluție de 1/100; am procedat în același fel obținând diluții de 1/1000 și 1/10000.

Determinarea numărului total de germeni

Pentru a determina numărul total de germeni mezofili aerobi care s-au dezvoltat în probele de telemea proaspătă de oaie, am recurs la mediul de cultură cel mai folosit pentru determinarea acestui parametru: agar nutritiv cu adaos de glucoză și extract de drojdii, care permite dezvoltarea și a speciilor microbiene care nu se pot dezvolta pe agarul nutritiv simplu.

Am însămânțat pe câte 2 plăci Petri conținând mediul agar nutritiv cu adaos de glucoză și extract de drojdii , câte 2 probe din diluțiile 1/000 și 1/10000, după care am incubat plăcile la termostat la temperatura constantă de 30C.

Rezultatele însămânțării le-am citit la 24 și la 48 de ore de la incubare.

Am ales perechea de plăci Petri în care s-au dezvoltat între 20 și 200 de colonii după care am numărat coloniile din cele 2 plăci, iar suma am înmulțit-o cu factorul de diluție și am împărțit la 2, determinând în acest fel, NTGMA/g produs.

Numărul total de germeni mezofili aerobi a reprezentat un indicator microbiologic sanitar general, care ne-a furnizat date asupra stării generale de contaminare a probelor de telemea.

Determinarea numărului total de drojdii și mucegaiuri

Pentru determinarea numărului total de drojdii și mucegaiuri din probele de telemea proaspătă de oaie analizate, am utilizat ca mediu de cultură: agar Sabouraud cu gucoză și cloramfenicol.

Tehnica de lucru pe care am folosit-o a fost următoarea: Din fiecare din cele două diluții utilizate în experiment (1/1000 și 1/10000) am repartizat câte 1 ml în două cutii Petri. În fiecare cutie Petri am turnat câte 15 ml de agar Sabouraud cu gucoză și cloramfenicol topit și răcit la 50C. Am omogenizat inoculul cu mediul pentru o repartizare cât mai uniform. Am lăsat cutiiole întredeschise pentru ca mediul să se solidifuce și să dispară picăturile de condens de pe suprafața agarului. Am închis cutiile și le-am răsturnat cu capacul în jos și le-am așezat într-un loc ferit de lumină la temperature laboratorului, timp de 5 zile. După această perioadă, am numărat coloniile de drojdii și separate cele de mucegaiuri, din cele două cutii care au prezentat fiecare cun număr de colonii cuprins între 10 și 100. Suma obținută am înmulțit-o cu factorul de diluție și am împărțit la 2, obținând astfel numărul per gram de produs.

Fig.nr.VIII.1. Aspectul cultural al unor colonii de drojdii și mucegai dezvoltate pe mediul Sabouraud cu glucoză și cloramfenicol

VIII.5.2.Metode calitative

VIII.5.2.1.Metode calitative pentru identificarea bacteriilor

Identificarea speciei Escherichia coli

Testul catalazei

Principiul testului: Catalaza este o hemoproteină care descompune peroxidul de hidrogen în apă și oxigen. Bacteriile care produc catalază, se protejează astfel de efectele letale ale peroxidului de hidrogen, apărut ca metabolit final, în metabolismul aerob al carbohidraților.

Mod de lucru: Testarea am făcut-o prin suspensionarea cu ansa de platină sterilizată în prealabil, a unei colonii din cultura de analizat repicată de pe mediul de cultură solid Levine, pe o lamă de sticlă, într-o picătură dintr-o soluție de H2O2 de concentrație 20%. După descărcarea inoculului cu ansa în picătura de apă oxigenată, prin imprimarea unor mișcări circulare ansei, am omogenizat amestecul.

Interpretarea testului: Am urmărit apariția, pe lamă, după 30 de secunde, a efervescenței sau bulelor de gaz.

Fig.nr.VIII.2.Etapele efectuării testului catalazei

Testul fermentării lactozei

Principiul testului: Microorganismele care fermentează lactoza se dezvoltă pe mediile selective și diferențiale care conțin bilă și indicatorul roșu neutru (agarul [NUME_REDACTAT]) sub forma unor colonii lactozo-pozitive, de culoare roșie care pot fi înconjurate de un halou opac, roz, datorat precipitării sărurilor biliare de către acizi și absorbției subsecvente a roșului neutru, iar microorganismele lactozo-negative cresc pe aceleași medii sub forma unor colonii incolore transparente sau ușor opace.

Mod de lucru: Am introdus culturile însămânțate pe agar [NUME_REDACTAT] la termostatul reglat la temperatura de 37oC, timp de 24 de ore, după care am urmărit caracterele coloniilor dezvoltate în acest interval.

Testul indol

Principiul testului: Bacteriile care produc enzima numită triptofanază, dezaminează triptofanul prezent în mediul de cultură pe care s-au dezvoltat, în prezența unei coenzime numită piridoxal-fosfat, formând: indol, acid piruvic și amoniac. Indolul rezultat reacționează cu p-dimetilaminobenzaldehida din soluții acid-alcoolice dând naștere unui complex colorat în roșu.

Mod de lucru: Am efectuat testarea din cultură de 48 ore dezvoltată pe mediul solid Levine, prin descărcarea cu ajutorul unei anse bacteriologice cu buclă, a unei colonii bacteriene, într-o eprubetă conținând 2 ml apă peptonată. Am incubat apoi eprubeta timp de 48 ore , la termostat reglat la 37°C. După 48 de ore, am scos eprubeta din termostat și am adaugat 0,5 ml reactiv Kovacs, agitând apoi ușor eprubeta și examinând-o după 1 minut, pentru a observa apariția culorii roșu-rubiniu în faza alcoolică superioară.

Interpretarea testului: Testul se consideră pozitiv la apariția culorii roșii în eprubeta în care s-a descărcat cultura de analizat.

Fig.nr.VIII.3. Eprubetă conținând apă peptonată înainte de însămânțare

Fig.nr.VIII.4.Testului indol pozitiv

Testul citrat

Principiul testului: Grație unei permeaze și a unei citrat-liaze, unele enterobacterii permit accesul citratului în celulă, îl clivează și îl folosesc ca unică sursă de carbon într-un mediu sintetic minimal pe care cresc și îl alcalinizează.

Mod de lucru: Am însămânțat un inocul de cultură bacteriană dezvoltată pe mediul Levine, printr-o singură striere, pe suprafața pantei mediului Simmons turnat într-o eprubetă în plan înclinat. Am incubat apoi eprubeta la 37°C la termostat și am examinat zilnic, timp de 7 zile, dezvoltarea culturii și virajul indicatorului conținut de mediul Simmons.

[NUME_REDACTAT] este un mediu diferențial, care a avut compoziția (pentru 1000 ml):

Agar 15,0g

NaCl 5,0g

Citrat de Na 2,0g

K2HPO4 1,0g

(NH4)H2PO4 1,0g

MgSO4·7H2O 0,2g

Albastru brom-timol 0,08g

pH-ul mediului a fost de 6,9.

Interpretarea testului: Testul s-a considerat pozitiv atunci când culoarea mediului Simmons a virat în albastru, iar la suprafața mediului a putut fi observată o strie de cultură bacteriană. Testul s-a considerat negativ pentru situațiile în care, culoarea mediului Simmons a rămas neschimbată (mediul neînsămânțat are culoare verde), verde și s-a constatat absența creșterii bacteriene la suprafața mediului.

Fig.nr.VIII.5.Test citrat negativ

Fig.nr.VIII.6.Test citrat pozitiv

Testul reducerii nitratului

Principiul testului: Nitrat reductazele produse de unele bacterii, reduc nitrații la nitriți. Adevăratele organisme denitrifiante, reduc în continuare nitriții la azot, prin proces respirator anaerob în care folosesc nitrații și nitriții ca acceptori terminali de electroni. Suspensia microbiană acționează fie asupra nitratului inclus în mediul de cultură, fie asupra unei soluții separate de nitrat. Nitritul rezultat reacționează cu acidul sulfanilic și formează o sare de diazoniu, care cu N,N-dimetil-l-naftilamina dă un compus diazo roșu. Acești reactivi depistează numai nitritul, nu și azotul. De aceea, în cazul absenței culorii roșii, într-un al doilea timp al testului, trebuie adăugată la mediul reacției, o cantitate mică de pulbere de zinc. Apariția culorii roșii va atesta absența reducerii nitratului în primul timp. Absența culorii roșii arată că reducerea nitratului a fost completă și a depășit stadiul de nitrit. Un tub Durham imersat în bulionul cu nitrat permite captarea azotului din denitrificare.

Mod de lucru: Într-un tub conținând mediul bulion nitrat, am introdus un inocul de cultură bacteriană dezvoltată pe mediul Levine, prin descărcarea acestuia cu ajutorul unei anse cu buclă sterilă. Într-o primă fază a testării, am adăugat la mediul de cultură soluții de dimetil-l-naftilamină și acid sufanilic și am urmărit reacția din tub. În a-II-a fază a testului, am introdus în tub, în plus față de substanțele adăugate în faza I, pulbere de zinc, după care am urmărit din nou reacția din tub.

Compoziția mediului bulion nitrat a fost:

KNO3 chimic pur l g

Bulion nutritiv 1000 ml

Mediul a fost ajustat la pH 7,1.

Interpretarea testului:

Fig.nr.VIII.7.Faza I a testului: Tub de control neinoculat conținând bulion nitrat

Fig.nr.VIII.8.Faza I a testului: Test negativ, prin absența culorii roșii, după adăugarea în tub a soluțiilor de dimetil-l-naftilamină și acid sufanilic

Fig.nr.VIII.9.Faza I a testului : Test pozitiv, prin prezența culorii roșii; în tub a avut loc reducerea nitratului la nitrit, după adăugarea soluțiilor de dimetil-l-naftilamină și acid sufanilic

Fig.nr.VIII.10.Faza a-II-a a testului: La introducerea zincului în tub, absența culorii roșii arată că reducerea nitratului a fost completă în faza I și a depășit stadiul de nitrit.

Fig.nr.VIII.11.Faza a-II-a a testului: La introducerea zincului în tub, culoarea mediului virează în roșu, indicând absența reducerii nitratului în primul timp al testului

Testul roșu-metil

Principiul testului: Acizii acumulați prin fermentarea glucozei pe calea acidă mixtă (lactic, acetic, formic, succinic) imprimă mediului de cultură, o reacție puternic acidă (pH sub 4,5), nesemnificativ influențată de procesele oxidative concomitente. Metaboliții intermediari și finali ai căii butilen glicolice (acetonina, butilen-glicol, etanol etc), cu reacție predominant neutră, alături de procesele oxidative concomitente previn scăderea semnificativă a pH-ului. Indicatorul roșu metil (roșu la pH sub 5,0 și galben la pH peste 5,8) surprinde bine modificările de pH care particularizează cele două căi de fermentare a glucozei.

Mod de lucru: Am inoculat tulpina de testat într-un tub cu bulion Clark-Lubs, după care am incubat tubul timp de 48 de ore la termostat, la temperatura de 37°C. După ce a trecut acest interval de timp, am scos tubul din termostat și am adaugat la conținutul său 3 picături de soluție indicator roșu metil, fără a amesteca conținutul tubului, urmărind reacția din tub.

Compoziția chimică a bulionului Clark-Lubs a fost:

Peptonă 7 g

K2HPO4 5 g

Gluoză 5 g

Apă distilată 1000 ml

Interpretarea testului: Am considerat testul pozitiv, atunci când indicatorului roșu-metil folosit în experiment a virat culoarea mediului de cultură la roșu și negativ atunci când indicatorul de culoare a virat culoarea mediului de cultură la galben.

Fig.nr.VIII.12.Test roșu–metil pozitiv

Fig.nr.VIII.13. Test roșu–metil negativ

Testul ureazei

Principiul testului: Ureaza hidrolizează ureea cu formare de amoniac și CO2. Amoniacul alcalinizează mediul și determină virajul indicatorului, roșu fenol, de la galben (pH 6,8-6,9) la roșu magenta.

Mod de lucru: În mediul bulion uree am suspensionat trei anse per tub din cultura de testat, după care, am incubat tubul în baie de apă la 37°C, urmărind reacția din tub la 8, 12, 24 și 48 ore.

Interpretarea testului: Am considerat testul pozitiv, când s-a produs virajul indicatorului de culoare din mediul de cultură , la culoarea roșu magenta și negativ atunci când culoarea inițială, galben pai a mediului de cultură bulion uree, a rămas nemodificată.

Fig.nr.VIII.14. Interpretarea testului ureazei: stânga test negativ (culoarea mediului a rămas galben pai) nemodificată, dreapta test pozitiv (culoarea mediului a devenit roșu magenta)

[NUME_REDACTAT]-[NUME_REDACTAT] testului: Bacteriile care degradează glucoza pe calea butilenglicolică, metabolizează acidul piruvic în acetoină (acetilmetilcarbinol), cu formare , în continuare ,de butilenglicol și etanol. În mediul puternic alcalinizat prin KOH și în contact cu aerul, acetoina, precursorul butilenglicolului, este oxidată la diacetil, care dă cu α-naftolul, un complex colorat, roșu.

Mod de lucru: Am însămânțat un inocul de colonii de analizat dezvoltate pe suprafața mediului Levine, într-un tub conținând 1 ml bulion Clark-Lubs, după care, am incubat tubul timp de 48 de ore, la temperatura de 37°C în termostat.

Interpretarea testului: Am apreciat testul ca pozitiv, în situația în care culoarea mediului însămânțat cu inocul a devenit roz și negativ atunci când culoarea mediului însămânțat a rămas nemodificată.

Fig.nr.VIII.15.[NUME_REDACTAT]-Proskauer pozitiv

Fig.nr.VIII.16.[NUME_REDACTAT]-Proskauer negativ

[NUME_REDACTAT] spp.

Pentru izolarea și identificarea speciilor de Enterococcus, am folosit ca mediu de cultură, mediul selectiv bilă-esculină-agar. Din diluțiile 10-3 și 10-4 am făcut însămânțări pe bilă-esculină-agar și am incubat cutiile Petri cu mediul însămânțat la 35°C, pentru 48 de ore, perioadă după care, am urmărit evoluția coloniilor pe mediul însămânțat la 24 și 48 de ore, precum și caracteristicile culturale ale acestora.

Coloniile obținute de Enterococcus spp. au fost colonii de formă rotund-ovalară, cu suprafața netedă strălucitoare, înconjurate de un halou, pigmentate, de culoare neagră, caracteristic fiind înnegrirea mediului din jurul coloniilor.

Fig.nr.VIII.17.Aspect cultural al coloniilor de Enterococcus dezvoltate pe mediul bilă-esculină-agar

[NUME_REDACTAT] coagulazo-pozitiv spp.

Pentru a identifica diversele specii de stafilococi coagulazo-pozitivi prezente în probele de telemea proaspătă de vacă, am procedat în felul următor: din fiecare din diluțiile seriale 10-3 și 10-4, am efectuat însămânțări în mediul de cultură Chapmann lichid, pe care l-am folosit ca mediu de îmbogățire; am incubat eprubetele cu mediul lichid însămânțat la o temperatură de 37°C, în termostat, timp de 24 de ore; din coloniile dezvoltate pe mediul lichid, am făcut treceri ale inoculului bacterian pe mediile selective, de confirmare: mediul hiperclorurat solid Chapmann și mediul Baird-Parker, incubând plăcile Petri cu cele 2 medii solide, la37°C, în termostat, timp de 24 de ore; am examinat prezența coloniilor specifice, tipice pentru stafilococii coagulazo-pozitivi.

Pe mediul solid Chapmann, coloniile dezvoltate au prezentat următoarele caracteristici: colonii de 1-2 mm, convexe, netede, rotunde, de culoare galben-aurie, mediul din jurul coloniei a virat în galben.

Fig.nr.VIII.18.Aspect cultural al coloniilor de stafilococi coagulazo-pozitivi dezvoltați pe mediul [NUME_REDACTAT].nr.VIII.19.Colonii izolate de stafilococi coagulazo-pozitivi dezvoltați pe mediul Chapmann (imagine mărită)

Pe mediul Baird-Parker, coloniile de stafilococi dezvoltate au avut dimensiuni de 1-2 mm, au fost negre-strălucitoare, de formă rotundă, convexe, cu suprafața netedă, prezentând o margine albicioasă înconjurată de o zonă transparentă.

Fig.nr.VIII.20.Aspect cultural al coloniilor de stafilococi coagulazo-pozitivi dezvoltați pe mediul [NUME_REDACTAT].nr.VIII.21 Detaliu al unor colonii izolate de stafilococi coagulazo-pozitivi dezvoltați pe mediul Baird-Parker

VIII.5.2.2.Metode calitative pentru identificarea drojdiilor și mucegaiurilor

Din culturile de drojdii și mucegaiuri dezvoltate pe mediul de cultură agar Sabouraud cu glucoză și cloramfenicol, pe care l-am folosit în etapa de identificare cantitativă a numărului total de drojdii și mucegaiuri, am repicat cu ajutorul unei anse bacteriologice cu buclă, sterilă, colonii, pe care le-am reînsămânțat din nou pe același mediu, în vederea obținerii de colonii izolate.

În cazul culturilor de mucegaiuri și drojdii pure, izolate sub formă de colonii, am urmărit caracteristicile culturale, la o săptămână de la însămânțare : topografia generală, textura, ritmul de creștere al coloniilor, pigmentarea acestora. După studierea caracterelor de cultură ale mucegaiurilor și drojdiilor, am efectuat examenul cu stereolupa, urmărind prin acest procedeu detaliile aparatului vegetativ și de reproducere, pentru a stabili diagnosticul de gen.

Atât din coloniile de drojdii cât și din cele de mucegaiuri izolate prin repicare, am efectuat preparate microbiene tip frotiu , pe care le-am colorat prin tehnica lactofenol-albastru de anilină și pe care ulterior le-am examinat cu ajutorul microscopului optic. Pe preparatele microscopice am urmărit forma celulelor, mărimea, dispoziția lor.

Fig.nr. VIII.22.Aspectul cultural al unor colonii de Candida spp. dezvoltate pe mediul Sabouraud cu glucoză și cloramfenicol

Fig.nr.VIII.23. Aspectul cultural al unor colonii de Geotrichum spp.dezvoltate pe mediul Sabouraud cu glucoză și cloramfenicol

Fig.nr.VIII.24. Aspect microscopic al celulelor de drojdii din genul Candida : colorație albastru anilină-lactofenol

Fig.nr.VIII.25.Aspect microscopic al celulelor de mucegai din genul Geotrichum : colorație albastru anilină-lactofenol

[NUME_REDACTAT] total de germeni mezofili aerobi a reprezentat un indicator microbiologic sanitar general, care ne-a furnizat date asupra stării generale de contaminare a probelor de telemea proaspătă de vacă, incluse în studiu. Valoarea obținută pentru NTGM a fost peste 100.000/. Numărul total de germeni determinat pentru brânzeturi reflectă nu numai condițiile de manipulare, prelucrare, păstrare, ci este un indicator și pentru starea de degradare sau gradul de prospețime al acestora.

Din categoria bacteriilor care au contaminat brânza telemea proaspătă de vacă, am identificat speciile: Staphylococcus coagulazo-pozitiv (peste 100/gram), Escherichia coli (peste 100/gram), Enterococcus (peste 1000/gram).

Dintre indicatorii microbiologici sanitari, Escherichia coli reprezintă un indicator sigur de contaminare fecală.

Enterococcii sunt reprezentați de bacterii care în mod obișnuit colonizează tractul gastro-intestinal al animalelor, motiv pentru care, prezența lor în lapte sau în produsele lactate, cum e șți cazul brânzeturilor reprezintă un indicator al contaminării fecale.

Comparând datele obținute, cu rezultatele altor autori din literatura de specialitate, am constatat că spre deosebire de brânzeturile obținute din lapte care se procesează industrial, cele obținute din lapte care se recoltează și se prelucrează în mod artizanal, prezintă o incidență mai crescută a bacteriilor potențial patogene, cum este și cazul bacteriilor coliforme și a stafilococilor coagulazo-pozitivi.

În cadrul numărului de microorganisme, un indicator sanitar microbiologic important l-a reprezentat și numărul de drojdii și mucegaiuri, prezența fungilor în număr mare (peste 100/gram) informându-ne despre antecedentele improprii de igienă ale produselor lactate și a permis, în același timp, aprecieri privind consumabilitatea brânzeturilor. Din categoria mucegaiurilor am identificat 2 genuri: Candida și Geotrichum, care s-au dezvoltat în telemea.

Datele obținute în urma studiului efectuat sugerează importanța recoltării igienice a laptelui materie primă folosit la fabricarea brânzeturilor, precum și a modului de păstrare al acestuia atât în gospodăriile particulare, cât și la centrele de colectare sau procesare, pentru asigurarea unor produse lactate cu o calitate igienică corespunzătoare, care să poată fi comercializate fără să prezinte riscuri pentru sănătatea consumatorului.

[NUME_REDACTAT] S., 2006, Microbiologia produselor alimentare, vol. I, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] S., 2006, Microbiologia produselor alimentare, vol. II, Cluj-Napoca, [NUME_REDACTAT]

Apostu S., Rotar M. A., 2009, Microbiologia produselor alimentare, Lucrări practice, vol. III, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] C., 2005, Microbiologia alimentelor, [NUME_REDACTAT] din Oradea, [NUME_REDACTAT] C., 2010, Microbiologia generală a unităților agroalimentare, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] C., 2005 , Tehnici și examene de laborator în controlul alimentelor, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] C., 2009, Lucrări practice de microbiologie, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] C., Principii de apreciere ale calității unor produse alimentare, 2008, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] C., Tonț C., Ionescu C. G., 2001, Microbiologia și controlul calității laptelui și a produselor lactate, , [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] L., 2010, Ghid practic de igienă a produselor agroalimentare, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] L., Oneț C., 2009, Igiena alimentelor, [NUME_REDACTAT] din [NUME_REDACTAT] V. ,Bara C., Pop C., 1998, Tehnici de microbiologie aplicată, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] V. ,Chipurici M. ,Zabik A. ,Bara C. ,[NUME_REDACTAT] R. ,[NUME_REDACTAT] V. ,Bonta M., 2000, Metode generale de microbiologie practică, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] I., Tehnologia și controlul calității laptelui și produselor lactate, 2007, [NUME_REDACTAT] Ionescu de la Brad, [NUME_REDACTAT] Gh., Banu C., [NUME_REDACTAT]., [NUME_REDACTAT]., 2005, Cartea producătorului și procesatorului de lapte, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] D., 1964, Microbiologia produselor alimentare, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] D., Henegariu O., 1996, Microbiologie, Tipo AGRONOMIA [NUME_REDACTAT] C., Transformări biochimice importante în produsele agroalimentare în timpul procesării și depozitării, 2008, [NUME_REDACTAT] din Oradea , [NUME_REDACTAT] C., Petcu C., 2008, Igiena și controlul produselor de origine animală, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] C., 2004, Microbiologie alimentară, [NUME_REDACTAT], București