Modalitati de Obtinere a Plantelor Modificate Genetic Si Impactul Acestora Asupra Mediului Si Organismului Uman

BIBLIOGRAFIE

Ackermann C., 1977. Pflanzen aus Agrobacterium rhizogenes Tumoren aus Nicotiana tabacum. [NUME_REDACTAT]. Lett., 8, 23-30.

[NUME_REDACTAT] in Europe (ABE) [NUME_REDACTAT] Impact of [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT] 3. http://www.abeurope.info/home.html

Ahmed, F. E., Detection of genetically modified organisms in foods, 2002. [NUME_REDACTAT], 20:5, 215-223.

Amos, J., 2001. BBC [NUME_REDACTAT]'s GM tomatoes 'offer health boost' News.bbc.co.uk/1/hi/sci/tech/1517387.stm

[NUME_REDACTAT], F. C., Cibele dos [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] Valente, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], 2007, Nested PCR detection of genetically modified soybean in soybean, LWT, 40, 748-751.

Anklam, E., Gadani, F., Heinze, P., Pijnenburg, H. and Van den Eede, G. 2002. Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products. [NUME_REDACTAT] Research and Technology 214: 3-26

Beardmore, J.A., Porter, J.S., 2003. Genetically modified organisms and aquaculture. FAO [NUME_REDACTAT]. No. 989. Rome, FAO. 38p.

Benbrook, C., 2004. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]. USDA Survey data.

Berdal, K. G., A. Holst-Jensen, 2001, [NUME_REDACTAT] soybean event-specific realtime quantitative PCR assay and estimation of the practical detection and quantification limits in GMO analyses, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], 213, 432-438.

Bidney D., Scelonge C., Martich J., Burrus M., Sims L., Huffman G., 1992. Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens. [NUME_REDACTAT]. Biol., 18, 301-313.

Brisson N., Paszkowski J., Penswick J.R., Gronenborn B., Potrykus I., Hohn T., 1984. Expression of a bacterial gene in plants by using a viral vector. Nature, 310, 511-514.

Caboche M., 1990. Liposome-mediated transfer of nucleic acids into plant cells. Physiol. Plant, 79, 173-176.

Cionga, Cristina, 2005, [NUME_REDACTAT] Annual 2005, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] (GAIN) [NUME_REDACTAT]. RO2008, USDA [NUME_REDACTAT]

Service, http://www.gmo-free-regions.org/fileadmin/files/Romania_USDA_

Report_2005.pdf , pagină consultată în octombrie 2009.

Corbisier, P., [NUME_REDACTAT], D. Gancberg, [NUME_REDACTAT], P. [NUME_REDACTAT], G. Berben, H. Schimmel, H. Emons, 2005, Quantitative determination of [NUME_REDACTAT] soybean (Glycine max) extracted from highly processed flour, [NUME_REDACTAT] Chem, 383, 282-290.

Coulson, A., 2012. GMO trees. Living on earth. http://www.loe.org/shows/

Curtis I.S., He C., Power J.B., Mariotti D., de [NUME_REDACTAT]., Davey M.R., 1996. The effects of Agrobacterium rhizogenes rol AB genes in lettuce. [NUME_REDACTAT]., 115, 123-135.

Darwin, C., 1859. On the Origin of species, by means of natural selection or the prezervation of favoured races in the struggle for life. London, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT]

Debode F., E. Janssen, G. Berben, 2007, Physical degradation of genomic DNA of soybean flours does not impair relative quantification of its transgenic content, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] (2007) 226:273-280.

Deisingh, A. K., [NUME_REDACTAT], 2005, Detection approaches for genetically modified organisms in foods, [NUME_REDACTAT] International 38, 639-649.

De la Riva G.A., González-Cabrera J., Vásquez-Padrón R., Ayra-Pardo C., 1998. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. [NUME_REDACTAT] of Biotechnology, 1, 1-16.

Debnath, S.C., Teixeira da Silva, J.A., 2007. Strawberry culture in vitro: applications in genetic transformation and biotechnology. Fruit, Vegetable and [NUME_REDACTAT] and Biotechnology 1:1-12

Draper J., Davey M.R., Freeman J.P., Cocking E.C., Cox B.J., 1982. Ti plasmid homologous sequences present in tissues from Agrobacterium plasmid-transformed Petunia protoplasts. [NUME_REDACTAT] Physiol., 23, 451-458.

Duca, M., Ipate, I., Zgardan, D., Rotaru, E., 2011. Organismele modificate genetic –soluție în asigurarea securității alimentare? Österreichische [NUME_REDACTAT] Wien. ISBN 978-3-9503145-0-2, 181 pag.

Duță, I.D., 2012. Cercetări privind siguranța alimentară a utilizării organismelor modificate genetic în hrana puilor de carne. Teză de doctorat. Universitatea de [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]. Facultatea de [NUME_REDACTAT], Farmacie și [NUME_REDACTAT]. 144 pag.

Edwardson, J.R., 1970. Cytoplasmic male sterility. Botan. Rev, -V.36, -P.341-420.

Engel, K.-H., F. Moreano, [NUME_REDACTAT], U. Busch, 2006, Quantification of DNA from genetically modified organisms in composite and processed foods, Trends in [NUME_REDACTAT] & Technology 17, 490-497.

Eyquem, F., Quantitative detection of [NUME_REDACTAT] by ELISA, In: Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, 2004, Training course on the analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms, Office for the [NUME_REDACTAT] of the [NUME_REDACTAT], Luxemburg, disponibil on-line la http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN%202006/Session12.pdf , pagină consultată în octombrie 2009.

Endres, J. G., 2001, Soy protein products characteristics, nutritional aspects, and utilization, AOCS Press, Champaign, IL, SUA.

Fraley R.T., Rogers S.C., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Fink C., Hoffman N., Sanders P., 1983. Expession of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 4803-4807.

Ganea, L.Ș., 2011. Studiul diversității și distribuției spațiale a fondului genetic în populațiile de pin silvestru (Pinus sylvestris L.) în vederea ameliorării. Teză de doctorat. Universitatea de [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT] Cluj-Napoca. Facultatea de Agricultură.

Gachet, E., G.G. Martin, F. Vigneau, G. Meyer, 1999, Detection of genetically modified organisms (GMOs) by PCR: a brief review of methodologies available, Trends in [NUME_REDACTAT] & Technology, 9, 380-388.

Gartland, M.A., Crow, R.M., Fenning, T.M., Gartland, J.S., 2003. Genetically modified trees: production, properties and potential. Journal of Arboriculture. 29(5): 259-266.

Germini, A., A. Zanetti, [NUME_REDACTAT], S. Rossi, Christel Forreä, S. Schmid, [NUME_REDACTAT], 2004, Development of a seven-target multiplex PCR for the simultaneous detection of transgenic soybean and maize in feeds and foods, J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 52, 3275-3280.

Griesbach R.J., Hammond J., 1993. Incorporation of GUS gene into orhids via embryo electrophoresis. [NUME_REDACTAT]., 336, 165-169.

H. [NUME_REDACTAT], Engineering new oilseed crops from rapeseed, [NUME_REDACTAT],

Halford, N.G., Shewry, P.R., 2000. Genetically modified crops: methodology, benefits, regulation and public concerns. [NUME_REDACTAT] Bulletin. 56(1): 62-73.

Hansen, G.R., 2004. Genetic selection using genetic markers. Beef cattle short course. Texas A&M University.

Henderson, A.R., Walter, C., 2006. Genetic engineering in conifer plantation forestry. [NUME_REDACTAT], 55(6): 253–262

Higgins, Holly, 2000. Romaina – Planting seeds: Romanian legislation for GMO

seeds, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] (GAIN) [NUME_REDACTAT]. RO0005,

USDA [NUME_REDACTAT] Service, http://www.fas.usda.gov/scripts/gd.asp?

ID=25667501, pagină consultată în iulie 2006

Holst-Jensen, A., 2007, Validation of real-time PCR methods;-what can we learn

from the field of GMO detection?, http://fou02.planteforsk.no/Nordforsk

NetworkMycotox/PDFs/Validation%20of%20real-time%20PCR%20methods%2

0-%20what%20can%20we%20learn%20from%20the%20field%20of%20GMO

%20detection.pdf, pagină consultată în octombrie 2009 .

Huang, C.-C., T.-M. Pan, 2005, Event-specific real-time detection and quantification of genetically modified [NUME_REDACTAT] soybean, J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 53, 3833-3839.

James, C., 2012. [NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT]/GM Crops: 2012. [NUME_REDACTAT] Service for the Acquisition of Agri-biotech Application (ISAAA). Brief no. 44.

Kaeppler H.F., Gu W., Somers D.A., Rines H.W., Cockburn A.F., 1990. Silicon carbide fiber-mediated DNA delivery into plant cells. [NUME_REDACTAT] Rep., 8, 415-418.

Kanovski, P., 2012. Genetically modified trees opportunities for dialogue. TFG [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT].

Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C., 1987. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature, 327, 70-73.

Kost B., Galli A., Potrykus I., Neuhaus G., 1995. High efficiency transient and stable transformation by optimized DNA microinjection into Nicotiana tabacum protoplasts. J. Exp. Bot., 46, 1157-1167.

[NUME_REDACTAT] și al., 1974. Studii și cercetări, Silvicultură, Vol. 30. Institutul de cercetări și amenajări silvice, București.

Lisa, J., 2013. 10 [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]. http://listverse.com/2013/07/26/top-10-gm-animals-you-can-buy-or-eat/

Matsuoka, T., H. Kuribara, K. Takubo, H. Akiyama, H. Miura, Y. Goda, Y. Kusakabe, K. Isshiki, M. Toyoda, A. Hino, 2002, Detection of recombinant DNA segments introduced to genetically modified maize (Zea mays), J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 50, 2100-2109.

Moens, W., M. Deloose, J. Remarcle, A. Callebaut, G. Berben, 2005, Tracing and authentication of GMOs and derived products in the food-processing area: final report, [NUME_REDACTAT] Policy, Brussels: [NUME_REDACTAT] Policy, disponibil online la http://www.belspo.be/belspo/home/publ/pub_ostc/CPagr/rappCP32_en.pdf

Mugabe, J., 2003. [NUME_REDACTAT] in [NUME_REDACTAT]: Entry by and Implications for [NUME_REDACTAT]. ATPS [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]. 15 [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] Network.

Narusaka, Y., Narusaka, M., Yamasaki, S., Iwabuchi, M., 2012. Methods to transfer foreign genes to plants. "Transgenic plants – advances and limitations". Agricultural and [NUME_REDACTAT]. ISBN 978-953-51-0181-9.

Paszkowski J., Shilito R.D., Saul M., Mandak V., Hohn T., Hohn B., Potrykus I., 1984. Direct gene transfer to plants. EMBO J., 3, 2717-2722.

Potrykus I., 1991. Gene transfer to plants: assessment of published approaches and results. Annu. Rev. [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT]. Biol., 42, 205-225.

Potrykus I., Spangenberg G. (eds.)., 1995. [NUME_REDACTAT] to Plants. [NUME_REDACTAT] Manual, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] York.

Petit, Laetitia, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], Y. Bertheau, P. Fach, 2003, Screening of genetically modified organisms and specific detection of Bt176 maize in flours and starches by PCR-enzyme linked immunosorbent assay, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 217, 83-89.

Pray, C. E., 1999. Public and private collaboration on plant biotechnology in China. AgBioForum 2:48–53.

Querci, Maddalena, F. Weighardt, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], M. Mazzara, 2005, Detecting GMOs, [NUME_REDACTAT], Office for the [NUME_REDACTAT] of the [NUME_REDACTAT], Luxemburg.

Rakosy-Tican L., Neamțu S., Turcu I., Lucaciu C.M., 2000. Electroporarea și electrostimularea, tehnici cu implicații în biotehnologia vegetală. In: Actualități și perspective în biotehnologia vegetală – Lucrările celui de al IX-lea [NUME_REDACTAT] de Culturi de Tesuturi și [NUME_REDACTAT] – D. Cachiță-Cosma, A. Bavaru, A. Brezeanu (eds.), "Ovidius" [NUME_REDACTAT], Constanța, 64-79.

Rao, S., 2010. Will genetically modified Eucalyptus trees transform Southern forests? http://blogs.discovermagazine.com/80beats/2010/02/01/

Rudi, K., [NUME_REDACTAT], A. Holck, 2003, A novel multiplex quantitative DNA array based PCR (MQDA-PCR) for quantification of transgenic maize in food and feed, [NUME_REDACTAT] Research, 31 (11), e62.

Rutovitz, J., Mayer, S., 2002. [NUME_REDACTAT] and [NUME_REDACTAT]. All in a [NUME_REDACTAT]? A Report by GeneWatch UK

Singer, M., 2000. Genetically modified organisms. Nature 406: 151-157.

Sisea, C.R., Pamfil, D., 2009 . Testarea OMG. [NUME_REDACTAT]. Cluj-Napoca.ISBN 978-606-92029-5-1, 325 pag.

Songstad D.D., Somers D.A., Griesbach R.J., 1995. Advances in alternative DNA delivery techniques. [NUME_REDACTAT], Tissue and [NUME_REDACTAT], 40, 1-15.

Smith, Donna S., P. W. Maxwell, 2007, Use of quantitative PCR to evaluate several methods for extracting DNA from corn flour and cornstarch, [NUME_REDACTAT] 18, 236-242.

Swinden, S., 2013. US [NUME_REDACTAT]: genes cannot be patentated. https://www.pressenza.com/2013/06/.

Tait J., 2008. Risk governance of genetically modified crops – European and American perspectives. In: Renn O, Walker K, eds. [NUME_REDACTAT] Governance: Concept and [NUME_REDACTAT] the IRGC Framework. Dordrecht, [NUME_REDACTAT]: Springer 133-153.

Tepfer D., 1989. Ri T-DNA from Agrobacterium rhizogenes: a source of genes having applications in rhizosphere biology and plant development, ecology and evolution. In: Kosuge T., Nester E. (eds.), Plant-microbe interactions. McGraw Hill, [NUME_REDACTAT], 294-342.

Xu J., H. Miao, H. Wu, W. Huang, R. Tang, M. Qiu, J. Wen, S. Zhub, Y. Li, 2006, Screening genetically modified organisms using multiplex-PCR coupled with oligonucleotide microarray, Biosensors and Bioelectronics 22, 71-77.

Vargas, C., 2011. [NUME_REDACTAT] Organism – A summary of [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] to [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT] 2011/02. Genok – Centre for Biosafety Tromsö, Norway.

Van den Bulcke, M., [NUME_REDACTAT] Leunda, D. de Bernardi, [NUME_REDACTAT] Schrijver, G. [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], 2005, Detection of [NUME_REDACTAT] Crops in [NUME_REDACTAT]: a State of the Art, http://www.economia.uniroma2.it/conferenze/icabr2005/papers/VAn_de_Bulcke.pdf

Weeler, M.B., Farrand, S.K., Widholm, J.M., 1991. Animal and plant transformation: the application of transgenic organisms in agriculture. University of Illinois at Urbana-Champaign. College of Agricultural, Consumer and [NUME_REDACTAT] 33 (1/2).

White, T.L., Adams, W.T., Neale, D.B., 2007. Forest genetics. Wallingford, Oxfordshire, UK, Cambridge, MA: CABI Pub. ISBN 9780851993485, 682 pp.

Zadoks, J.C., Waibel, H., 2000. From pesticidesto genetically modified plants: history, economics and politics. [NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT] 48:125-149.

Zafar, Z., M. Asif, A. M. Khalid, 2004, Capacity building in biosafety of genetically modified crops: GMOs (genetically modified organisms) detection, [NUME_REDACTAT] for Biotechnology and [NUME_REDACTAT], Faisalabad, Pakistan.

Zhang L-J., Cheng L-M., Xu N., ZhaoN-M., Li C-G., Yuan J., Jia S-R., 1991. Efficient transformation of tobacco by ultrasonication.Bio/Technology, 9, 350-351.

***1, 2014. http://www.gmcrops.myewebsite.com/articles/history.html.

***2, 2014. http://www.bionetonline.org/english/content/ff_cont3.htm.

***3, 2014. http://www.cs.trinity.edu/~bdavis6/tankmates.html.

***4, 2013. http://www.fao.org/Ethics/ser_en.htm.

***5, 2000. FAO. La situation mondiale des pêches et de l’aquaculture, Rome, Italy

***6, 2013. [NUME_REDACTAT], 8 animale modificate genetic pentru folosul oamenilor http://www.adev.ro/mwbjsa.

***8, 2000. BALL, I.B., : Synthesis of national reports on activities related to poplar and willow areas, production, consumption and the functioning of national poplar commissions. FAO – I.P.C.

***7, 2009. R-Biofarm. SureFood GMO 35S/NOS Screening, http://www.rbiopharm.com/product_site.php?product_id=801&product_class_one=R1ZP&product_class_two=U2NyZWVu&product_class_three=MzVTICsgTk9T&product_class_four=&product_range=Food%20and%20Feed%20Analysis&.

***8, 2009 IAASTD ([NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT] Science and Technology for Development), Agriculture at Crossroad. [NUME_REDACTAT] (Washington D.C., [NUME_REDACTAT]), p. 590.

***9, FAO. 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] FGR/59E, [NUME_REDACTAT] Division FAO, Rome, Italy http://www.fao.org/docrep/008/ ae574e/ae574e00.htm.

***10, FAO/WHO [NUME_REDACTAT], 1998. Requirement of Vitamin A, Iron, Folate, and Vitamin B12. Food and [NUME_REDACTAT] no.23, FAO, [NUME_REDACTAT] latest report to consider requirement for vitamin A.

***11, 2014. CBRA [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT] Organisms and [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT].

Filat, M, Chira, D., 2004. Cercetări pentru introducerea în cultura de specii/clone de plop și salcie cu potenșial silvoproductiv și rezistentă sporită la adversități. Analele ICAS 47: 83-99.

***13, 1975. Benea V. și al.Cercetări preliminare privind ameliorarea genetică pentru mărirea rezistenței la Fomes annosus Fr./Cke.

Cuprins

CAPITOLUL I. Noțiuni despre organisme modificate genetic

1.1. Introducere

1.1.1. Noțiuni introductive despre modificarea genetică a plantelor

1.1.2. Noțiuni introductive despre modificarea genetică a animalelor

1.2. Termeni uzuali utilizați în biotehnologii

1.3. Situația organismelor modificate genetic în România

1.3.1. Plante modificate genetic

1.3.2. Animale modificate genetic

1.4. Metode de detecție, identificare și cuantificare a plantelor modificate genetic

1.5. Ingineria genetică și ecosistemele forestiere

1.5.1. Biotehnologii utilizate pentru arbori

1.5.2. Programe naționale și internaționale de ameliorare a speciilor de arbori

CAPITOLUL II. Tehnici utilizate în obținerea plantelor modificate genetic

2.1. Propagarea prin clonare2.2. Micropropagarea in vitro

2.3. Organogeneza

2.4. Embriogeneza

2.5. Markerii moleculari și amprentarea genetică

CAPITOLUL III. Argumente în favoarea utilizării plantelor modificate genetic

3.1. Utilizări pentru biosecuritatea alimentară

3.1.1. Rezistența la dăunători

3.1.2. Rezistența la pesticide

3.1.3. Rezistența la boli

3.1.4. Rezistența la frig

3.1.5. Rezistența la secetă

3.1.6. Creșterea rapidă

3.2. Utilizări pentru sănătatea umană

3.3. Utilizări pentru protejarea mediului

3.4. Utilizări pentru conservarea biodiversității

CAPITOLUL IV. Argumente în defavoarea utilizării plantelor modificate genetic

4.1. Impactul asupra organismului uman

4.2. Impactul asupra ecosistemelor naturale

4.1.1. Reducerea diversității speciilor

4.1.2. Persistența genelor modificate în mediu

4.1.3. Efecte asupra organismelor nemodificate genetic

4.1.4. Utilizarea excesivă a pesticidelor

4.1.5. Modificarea spectrului de patogeni

CAPITOLUL V. Legislația existentă la nivel european privind OMG

CAPITOLUL VI. Sondaj privind informarea în legătură cu OMG

3.1. Prezentarea sondajului

3.1. Analiza statistică

3.1. Interpretarea rezultatelor

BIBLIOGRAFIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Modalități de obținere a plantelor modificate genetic și impactul acestora asupra mediului și organismului uman

Cuprins

CAPITOLUL I. Noțiuni despre organisme modificate genetic

1.1. Introducere

1.1.1. Noțiuni introductive despre modificarea genetică a plantelor

1.1.2. Noțiuni introductive despre modificarea genetică a animalelor

1.2. Termeni uzuali utilizați în biotehnologii

1.3. Situația organismelor modificate genetic în România

1.3.1. Plante modificate genetic

1.3.2. Animale modificate genetic

1.4. Metode de detecție, identificare și cuantificare a plantelor modificate genetic

1.5. Ingineria genetică și ecosistemele forestiere

1.5.1. Biotehnologii utilizate pentru arbori

1.5.2. Programe naționale și internaționale de ameliorare a speciilor de arbori

CAPITOLUL II. Tehnici utilizate în obținerea plantelor modificate genetic

2.1. Propagarea prin clonare2.2. Micropropagarea in vitro

2.3. Organogeneza

2.4. Embriogeneza

2.5. Markerii moleculari și amprentarea genetică

CAPITOLUL III. Argumente în favoarea utilizării plantelor modificate genetic

3.1. Utilizări pentru biosecuritatea alimentară

3.1.1. Rezistența la dăunători

3.1.2. Rezistența la pesticide

3.1.3. Rezistența la boli

3.1.4. Rezistența la frig

3.1.5. Rezistența la secetă

3.1.6. Creșterea rapidă

3.2. Utilizări pentru sănătatea umană

3.3. Utilizări pentru protejarea mediului

3.4. Utilizări pentru conservarea biodiversității

CAPITOLUL IV. Argumente în defavoarea utilizării plantelor modificate genetic

4.1. Impactul asupra organismului uman

4.2. Impactul asupra ecosistemelor naturale

4.1.1. Reducerea diversității speciilor

4.1.2. Persistența genelor modificate în mediu

4.1.3. Efecte asupra organismelor nemodificate genetic

4.1.4. Utilizarea excesivă a pesticidelor

4.1.5. Modificarea spectrului de patogeni

CAPITOLUL V. Legislația existentă la nivel european privind OMG

CAPITOLUL VI. Sondaj privind informarea în legătură cu OMG

3.1. Prezentarea sondajului

3.1. Analiza statistică

3.1. Interpretarea rezultatelor

BIBLIOGRAFIE

Acronime și Abrevieri

OMG – Organisme modificate genetic

MG – Modificat genetic

PMG – Plante modificate genetic

AMG – Animale modificate genetic

ADN – Acid dezoxiribonucleic

ARN – Acid ribonucleic

UE – Uniunea europeană

PCR – [NUME_REDACTAT] Reaction- Reacția de Polimerizare în lanț

ADN-T – Acid dezoxiribonucleic transferat

Bt – Bacillus thuringiensis

FAO – Organizația pentru Alimentație și Agricultură

BAC – Cromozom artificial bacterian

MAS – Selecție asistată de markeri

ADNc – Acid dezoxiribonucleic complementar

ELISA – Test enzime legate de immunosorbent

CAPITOLUL I

NOȚIUNI DESPRE ORGANISME

MODIFICATE GENETIC

1.1. [NUME_REDACTAT] specifice ale organismelor sunt o consecință a informației conținute în structura ADN-ului, la nivelul genelor. Acestea pot fi îndepărtate, adăugate sau modificate folosind metode moderne ale ingineriei genetice. O astfel de manipulare genetică conduce la obținerea unor organisme cu trăsături noi, promovate de dezvoltatorii lor ca având importanță în domeniul medicinii, agriculturii, mediului (bioremediere), silviculturii și în aplicații industriale (Vargas, 2011). Spre deosebire de metodele empirice de ameliorare, prin inginerie genetică poate fi introdus sau modificat un singur caracter, iar gena poate proveni din orice sursă, fapt ce conferă acestei abordări posibilități nelimitate de ameliorare. În consecință, metodele și tehnicile de introducere în celule a unor gene noi sau de modificare a expresiei genelor existente în celule definesc noțiunea de ingineria gentică. Atât modificarea genetică cât și transformarea genetică sau transgeneza definesc ingineria genetică, ce are ca rezultat final obținerea de organisme modificate genetic (OMG).

Principalele etape necesare a fi parcurse în procesul de obținere a plantelor modificate genetic sunt (adaptat după Beardmore și Porter, 2003; Vargas, 2011; Duca și al., 2008):

a. identificarea și izolarea genelor de interes: materialul genetic poate fi preluat de la plante, animale, virusuri și bacterii. Se face cu ajutorul enzimelor de restricție urmând procedura selecționarea vectorului de clonare – detașarea fragmentelor de ADN – atașarea acestora vectorului de clonare folosind ligazele – vectorul recombinat obținut este introdus în celula gazdă (frecvent sunt utilizate bacterii).

b. amplificarea genelor utilizând tehnica PCR ([NUME_REDACTAT] Reaction- Reacția de Polimerizare în lanț), o reacție enzimatică de amplificare mediate de primeri. Numărul de copii ale secvenței de amplificat este dublat la fiecare ciclu. Bacteria împreună cu vectorul recombinat este clonată. Deoarece ambele catene de ADN sunt copiate, se produce o amplificare exponențială a numărului de copii de ADN. ADN-ul recombinat se extrage și se purifică.

c. Asocierea genelor cu un promotor potrivit și o secvență repetitivă și inserția în plasmide. Cel mai folosit vector de gene este plasmida din structura cromozomului bacteriilor Agrobacterium tumefaciens și A. rhizogenes (fragmentul de cromozom cu plasmida Ti sau Ri). Acestea au capacitatea naturală de a transforma celulele și a induce formarea unor tumori pe colet și pe ramurile joase sau de a produce rădăcini adventive la nivelul țesuturilor vegetale rănite, fiind patogeni importanți în agricultură și silvicultură. Pentru că A. tumefaciens are o abilitate limitată de replicare este inserată o genă marker (în general o genă care codifică rezistența la un antibiotic) în vectorul ce conține plasmida Ti cu scopul de a monitoriza inserția cu succes a transgenei. Chemoatractanții eliberați de plante (compuși fenolici, aminoacizi, glucide) atrag bacteriile spre țesuturile în prealabil rănite, are loc o colonizare bacteriană (exprimarea constitutivă a genelor vir cromosomale) și procesul de transfer al ADN-T (Fig. 1).

Fig. 1 Etapele transferului natural ADN-T din celulele bacteriene în celulele vegetale rănite (Duca și al., 2008)

d. multiplicarea plasmidei în bacterii și recuperarea genelor clonate pentru injectarea în țesutul țintă: plasmidele sunt molecule de ADN dublu catenare, circulare, capabile de replicare independentă, întâlnite la toate speciile de bacterii. Etapa se realizează printr-un proces artificial numit transformare, în urma căruia bacteria gazdă va avea un nou caracter fenotipic.

e. transferul genelor clonate în țesutul țintă în general ovule fecundate

f. integrarea genelor în genomul recipient: transferul genelor în celulele plantelor se realizează prin metode: indirecte – mediate de bacterii și virusuri, și directe – fac apel la o serie de procedee fizice și chimice. Exemple: transformarea mediată de Agrobacterium, transferul genelor în protoplaști, microinjecția, metoda biolistică etc.

g. expresia genei în genomul recipient, urmărirea heritabilității genei în generațiile următoare: celulele transformate pot regenera prin cultura in vitro plante transgenice. Testarea stabilității în condiții naturale de creștere a caracterului transferat și determinarea valorii heritabilității se realizează printr-un proces repetitiv de selecție și cultivare în câmp.

1.1.1. Noțiuni introductive despre modificarea genetică a plantelor

Caracterele, considerate de oameni valoroase, apar la plante în mod natural prin mutații. Formele rare de plante găsite în natură, cu proprietăți avantajoase pentru cultivatori au fost selectate în mod empiric până la apariția cunoștințelor de genetică. Și încrucișarea interspecifică a fost și este o metodă utilizată pentru obținerea unor plante cu caracteristici deosebite. Un exemplu este grapefruitul obținut în secolul al 18-lea prin încrucișarea plantei de pomelo cu portocalul (Singer, 200). Ceea ce cultivatorii de plante nu au știut până de curând a fost faptul că segvențele de ADN au fost transferate între organismele încrucișate, imitând în mod forțat procesul de evoluție. Organismele au evoluat și evoluează în mod natural prin achiziționarea de secvențe de ADN strain, excepție făcând diferite alele.

Rata de producere a mutațiilor în natură este prea lentă într-o economie globalizată și o populație aflată în creștere accelerată. Cercetările efectuate în anii 1920 au dus la evidențierea faptului că numărul mutațiilor poate fi crescut prin expunerea plantelor la raze X. După cel de-al doilea război mondial, datorită descoperirii energiei nucleare, plantele au fost expuse la raze gamma, protoni, neutroni, particule alfa și beta pentru a studia modul de producere al mutațiilor. În același scop au fost folosite și substanțe chimice ca azida de sodiu și metansulfonat (***1, 2014). Tehnicile noi dezvoltate în urmă cu 4 decenii permit manipularea precisă a ADN-ului prin recombinarea sau clonarea acestuia. A devenit astfel posibilă introducerea de gene de la varietăți ale aceleiași specii, gene de la specii apropiate sau de la specii complet diferite inclusive de la bacterii și animale. Un exemplu este utilizarea unor gene din AND-ul peștilor pentru protecția plantelor de căpșun împotriva înghețului (Debnath și Teixeira da Silva, 2007). Există o similaritate între “revoluția pesticidelor”și ”revoluția organismelor modificate genetic – OMG”, ambele fiind susținute de companii multinaționale. În timp ce utilizarea pe scară largă a pesticidelor a devenit subiect de dezbatere și analiză critică, OMG sunt văzute de promotorii acestora ca cel mai sigur mod de a scăpa de pesticide și ca o necessitate de a rezolva problema foametei pe glob (Zadoks și Waibel, 2000).

Prima plantă modificată genetic a fost produsă în 1982 folosind o plantă de tutun rezistentă la antibiotice. Ulterior au fost produse plante rezistente la ierbicide, boli, dăunători sau pentru a crește valoarea nutritivă. China a fost prima țară care a permis comercializarea plantelor transgenice, prin introducerea pe piață a unui tutun rezistent la boala produsă de virusul mozaicului tutunului (Pray, 1999).

[NUME_REDACTAT] primele plante plante modificate genetic aprobate spre comercializare au fost tot cele de tutun, dar de această dată rezistent la ierbicidul bromoxynil. În prima jumătate a anilor 1980, majoritatea oamenilor de știință, manageri din industrie și autoritățile de reglementare din Europa sau din America de Nord, au sprijinit adoptarea unei abordări precaute pentru dezvoltarea timpurie a tehnologiei OMG. Ei au privit în principal, această abordare ca un exercițiu de reasigurare publică, mai degrabă decât o măsură justificată de riscurile așteptate. Începând cu cea de a doua jumătate a anilor 1980 până în 1995 politicile Europei față de OMG se conturează diferit față de abordarea americană, fiind mult mai precaute. Acest lucru duce la apariția nemulțumirilor în rândul companiilor interesate de extinderea utilizării organismelor transgenice. Sunt create numeroase organizații care să facă lobby la [NUME_REDACTAT] pentru schimbarea poziției legată de OMG, una dintre companiile cele mai active, considerate lider pe piața OMG a fost Monsanto, o corporație multinational americană (Tait, 2008; Stone, 2010). Cu toate acestea în Europa există și în present îngrijorări cu privire la impactul OMG de natură etică, de mediu, siguranță alimentară, de impact socio-economic sau legat de adevărații beneficiari

Principalele ținte pentru manipularea genetică a plantelor sunt: creșterea producțivității, a rezistenței la boli și dăunători, rezistența la ierbicide pentru a facilita controlul chimic al buruienilor, creșterea rezistenței la secetă, la îngheț sau soluri cu conținut ridicat de sare, modificarea arhitecturii plantelor, pentru producerea de substanțe speciale (farmaceutice, vitamine, etc.), controlul coacerii, modificarea culorii florilor etc. În tabelul 1 sunt prezentate câteva exemple de plante transgenice utilizate în prezent, iar în tabelul 2 specii de plante, varietăți, companiile producătoare și motivele pentru care au fost modificate acestea. Plantele modificate genetic sunt de interes în domenii precum agricultura, silvicultura, industria alimentară, farmaceutică, textilă etc.

De-a lungul timpului omul a modificat fondul de gene al culturilor prin selecția și înmulțirea exemplarelor valoroase sau prin hibridizare, doar că aceasta era limitată de barierele de compatibilitate reproductivă. Depășirea barierei interspecifice a fost posibilă prin creșterea în condiții artificiale a embrionilor interspecifici, care în condiții naturale nu ar supraviețui. În mod similar prin mutageneză folosind metode fizice sau chimice se pot obține caractere noi la speciile de interes. Cu toate acestea ambele abordări sunt considerate convenționale si nu necesită evaluări detaliate ale produselor înainte de a fi introduse în lanțul alimentar sau pentru alte tipuri de consum. Ingineria genetică diferă de abordarea tradițională prin precizia transferului de gene, care în mod natural nu ar avea loc (Halford și Shewry, 2000).

Tabel 1. Exemple de plante agricole modificate genetic, cu specificarea avantajelor și dezavantajelor (adaptat după Mugabe, 2003; ***2, 2014)

Tabel 2. Varietăți obținute prin tehnicile biotehnologiilor moderne

(baza de date AGBIOS) (preluat din Duca și al., 2008)

Procesul de transformare genetică a plantelor mai este denumit și transgeneză, o tehnică importantă pentru studiul genomului funcțional al plantelor (descoperirea genelor, perspective noi în funcționarea genelor, investigarea caracteristicilor controlate genetic). Metodele utilizate în transformarea genetică au evoluat de la bombardarea sau împușcarea cu particule a protoplaștilor la metode de izolare, clonare și transfer a genelor în celulele vegetale. O sinteză schematică a acetor tehnici este prezentată în figura 2.

Fig. 2 Metode utilizate pentru obținerea

plantelor modificate genetic (Duță, 2012)

În figura 3 sunt redate schematic etapele procesului de transformare genetică, iar în figura 4 etapele procesului de transformare genetică în situația în care se utilizează metoda de bombardare cu particule a protoplaștilor.

Fig. 3 Etapele transformării genetice

la plante (Duca și al., 2008)

Fig. 4 Procesul de transformare al plantelor folosind bombardarea cu particule a protoplaștilor (Narusaka și al., 2012)

În silvicultură noțiunea de biotehnologie acoperă toate aspectele legate de înmulțirea arborilor, clonarea acestora, ordonarea genelor pe molecula de ADN sau secvențierea, manipularea genelor și transferul genelor (Kanovski, 2012). Doar o parte din cele 5 categorii de biotehnologiile forestiere prezentate mai jos sunt legate de ingineria genetică noțiune similară modificării genetice a organismelor (Henderson și Walter, 2006):

Propagare;

Markeri moleculari;

Selecția asistată de marker și înmulțirea asistată de marker;

Studiul proteinelor, studiul genomului, studiul proceselor chimice care implică metabolite;

Modificarea genetică sau ingineria genetică.

Metoda tradițională de ameliorare a arborilor constă în identificarea arborilor maturi cu fenotipul dorit, urmată de încorporarea acestora în programe de înmulțire. Pentru a ajunge la maturitate reproductivă, arborii au nevoie în medie de 20 de ani. Aplicarea biotehnologiilor folosind micropropagarea sau tehnicile embriogenezei somatice pot accelera semnificativ ciclul de înmulțire al arborilor (Gartland și al., 2003).

Cercetările în domeniul ingineriei genetice forestiere sunt mult în urma celor agricole, principalele cauze fiind reprezentate de timpul mare de rotație al culturilor, resursele limitate și greutățile legate de depășirea obținerii unor culturi de țesuturi eficiente și de tehnologiile de propagare. Cele mai recente progrese în tehnologiile culturilor de țesuturi a permis silviculturii să se dezvolte în mod similar cu agricultura și horticultura, unde progresele au vizat cu success specii de interes. Posibile beneficii potențiale includ creșterea rezistenței la ierbicide, la atacul insectelor, obținerea de substanțe pentru industria farmaceutică, utilizarea în depoluarea terenurilor, obținerea unui conținut ridicat în lignină și celuloză. De asemenea, mai recent cercetările au fost focalizate pe trăsături asociate cu structura peretelui secundar celular, cu potential de transformare a produselor axate pe lemn. De interes crescut este tendința actuală pe economie de tip bio, care utilizează resursele din material vegetal și nu din derivat e petrochimice (FAO, 2004). Utilizarea arborilor transgenici este argumentată prin satisfacerea nevoilor sporite lemn și produse de papetărie și prin contracararea defrișărilor masive la care asistăm în momentul de față.

Exemple de arbori modificați genetic: speciile Populus tremuloides și P. tremula pentru accelerarea procesului de creștere; hibrizi de P. tremula x P. alba cu conținut scăzut de lignină; Eucaliptus marginata pentru creșterea rezistenței la temperaturi scăzute; Pinus taeda cu conținut scăzut de lignină; Liriodendron tulipifera modificat pentru expresiei genetice a reductazei bacteriene crește viguros în condiții de poluare cu mercur; culturi de plop transgenice folosite pentru a degrada tricloretilena unul dintre cei mai importanți poluanți la nivel mondial; Ulmus americana rezistent la Boala olandeză a ulmului; Picea glauca modificat ritmul de creștere, conținutul de lignină și fertilitatea.

Foto 1. Plantație de plopi transgenici Foto 2. Plantație de eucalipt

(Coulson, 2012) (Rao, 2010)

La nivel mondial suprafețele cultivate cu plante modificate genetic atât în scop experimental cât și industrial, au cunoscut o creștere continuă din 1996 până în present (Fig. 5). 17,3 milioane de fermieri din 28 de țări au adoptat cultivarea plantelor modificate genetic pe o suprafață totală de 170,3 milioane ha. Datele corespund anului 2012, suprafața fiind în creștere cu 10,3 milioane ha față de anul 2011 (James, 2012).

Fig. 5 Suprafața totală a culturilor modificate genetic la nivel planetar,

între 1996-2012 (James, 2012)

1.1.2. Noțiuni introductive despre modificarea genetică a animalelor

Animale transgenice sunt produse prin introducerea genelor în embrioni înainte de naștere. Fiecare genă transferată este asimilată de materialul genetic sau cromozomii embrionului și ulterior poate fi exprimată în toate țesuturile animalului rezultat. Obiectivul este de a produce animale care posedă gena transferată în celule propagative (sperma sau ovule). Aceste animale vor putea astfel transmite urmașilor gena sau genele transferate.

Metodele utilizate pentru obținerea animalelor sunt: microinjectarea genei(lor) clonate în nucleul unui ovul fertilizat (Foto 3), injectarea de celule stem embrionare în embrionii gazdă și expunerea la retrovirusuri (Weeler și al., 1991).

Prima modificare genetică a unui mamifer a fost realizată în 1975, animalul supus experimentelor fiind un șoarece. În 1982, un șoarece a fost modificat genetic pentru a produce o proteină străină, hormon de creștere de șobolan. Rezultatul a constat într-o creștere vizibil supradimensionată a șoarecelui. O "transgenă" a fost introdusă în materialul genetic al acestuia fiind transmisă generațiilor următoare. Până în anul 2000, laboratoarele din [NUME_REDACTAT] au obținut mai mult de 575.000 soareci transgenici din generația EG3 si soareci din EG4 care au suferit mai multe sute de diferite modificări genetice. Folosind aceleași principii, au fost introduse transgene (material genetic de la specii diferite) în pești, șobolani, cobai, iepuri, oi, capre, porci, vite, găini, în încercarea de a trata diferite afecțiuni umane sau de a găsi o soluție pentru criza de alimente care planează asupra populației umane.

Diferența între organisme clonate și organisme modificate genetic constă în faptul că genomul OMG este alterat prin introducerea de material genetic străin în timp ce organismele clonate sunt copii genetice obținute prin reproducere asexuată. Primul animal clonat a fost oaia Dolly, experiment reușit în 1996 la [NUME_REDACTAT] din Edinburgh (Scoția), după 276 de încercări nereușite. Ulterior, cercetătorii europeni au clonat vite, porci, maimuțe și șoareci.

Foto. 3 Microinjectarea ADN-ului Foto. 4 Pești modificați genetic

clonat în embrioni (Duca și al., 2008) GloFish (***3, 2014)

Primele animale transgenice care au devenit accesibile publicului ca animale de companie sunt peștii GloFish (Foto 4), un brand patentat și o marcă înregistrată a organismelor modificate genetic. Peștii au culori fluorescente roșu, verde, galben-portocaliu.

Pentru sporirea productivității somonul de Atlantic a fost modificat prin adăugarea unor gene care reglează hormonul de creștere, provenite de la un somon de Pacific și de la merluciu. Aceste gene îi permit să se hrănească pe tot parcursul anului, în mod natural el mănâncă numai primăvara și vara. Scopul modificărilor este de a accelera viteza cu care peștele crește, fără a afecta dimensiunea finală sau alte calități. Peștele creste la dimensiunea de comercializare în 16-18 luni în loc de trei ani. În cazul bovinelor a fost recombinant un hormon natural, somatotropina bovină, care determină vacile să producă cantități sporite de lapte (rBST este forma recombinată). Creșterea este de 10-15 %, în SUA fiind tratate mai mult de 30% din efectivele de vaci.

În industria alimentară enzimele natural utilizate pentru închegarea laptelui au fost înlocuite cu chimozina extrasă din organisme modificate genetic (E. coli, Aspergillus niger și drojdii alimentare) (Mugabe, 2003). Alte exemple de animale transgenice sunt prezentate în tabelele 3 și 4.

Tabel 3. Exemple de animale transgenice, cu specificarea caracterelor

pentru care au fost modificate (adaptat după Lisa, 2013)

Tabel 4. Animale modificate genetic (adaptat după Rutovitz și Mayer, 2002)

1.2. Termeni uzuali utilizați în biotehnologii

1. Gena este definită ca particula materială a eredității localizată în cromozom și care condiționează formarea uneia sau mai multor caractere sau însușiri. Numită inițial de către Mendel factor ereditar, termenul de genă a fost introdus mai târziu, odată cu definiția lui Johansen care consideră că gena este unitatea funcțională a genotipului. În anul 1915 Morgan a definit-o ca fiind unitatea de funcție, recombinare și mutație a aparatului genetic celular.

Actualmente, gena (gr. zenos=descendență) este considerată ca fiind unitatea funcționalală a ADN-ului cromozomial sau mitocondrial responsabilă de sinteza unei proteine specifice (Fig. 6). Constă într-o secvență liniară de nucleotide de-a lungul unui segment de ADN care furnizează instrucțiunile codificate pentru sinteza ARN-ului. Atunci când acesta este tradus în informație de constituire a proteinelor (procesul de translație) conduce la expresia caracterului ereditar (Hansen, 2004).

Particularitățile genei:

este unitatea funcțională localizată pe cromozom, care are rolul de determinism genetic pentru exprimarea fenotipica a unui caracter.

ocupă o poziție fixă pe cromozom denumită locus.

are o poziție liniară și coninuă pe cromozom și este strict delimitată funcțional.

Fig. 6 Structura ierarhică de la celule la acizi

nucleici (după Swinden, 2013)

genele de pe același cromozom nu sunt delimitate între ele, sunt dispuse înlănțuit tranzmițându-se grupat (linkage).

gena este o unitate de recombinare genetică. Când cromozomii omologi suferă rocesul de crossing-over, genele alelomorfe (care au aceași funcție genetică și același locus pe cromozomii omologi) își inversează pozițiile. Acest proces are ca rezultat diversificarea genotipului indivizilor dintr-o populație.

gena este unitatea de mutație, fiind segmentul din cromozom care este capabil să-și modifice structura, dând naștere unor forme alelice. Astfel rezultă structuri proteice și caractere noi.

2. Genom: reprezintă totalitatea materialului genetic al unui organism.

3. Hibridare: este o metodă care permite încrucișarea unor forme parentale care se deosebesc printr-o singură pereche de caractere ori care se deosebesc prin două sau mai multe perechi de caractere. În urma procesului de hibridare se obțin organisme hibride (hibrizi). Formele parantale se notează cu P1 și P2, iar generațiile hibride cu F0, F1, F2,…, Fn.

4. Organismul modificat genetic (OMG) sau transgenic este termenul cel mai folosit pentru a defini o plantă de cultură sau un animal aparent normal căruia, prin intermediul unor tehnici de inginerie genetică, i s-au transferat gene de la alte specii (plante, animale, bacterii, virusuri sau chiar gene umane), pentru a-i conferi proprietăți noi (IAASTD ed., 2009).

Plantele modificate genetic (PMG) sunt create prin manipularea dezvoltării, structurii sau compoziției, ca urmare a introducerii unor secvențe specifice de ADN. Aceste secvențe pot proveni de la aceeași specie sau de la specii diferite de plante. Prin inginerie genetică este devine astfel posibilă depășirea barierelor de specie, putându-se transfera material genetic (respectiv caracterele codificate de aceste gene) de la alte specii de plante, microorganisme, animale și chiar de la om.

Animalele modificate genetic (AMG). Un organism modificat genetic este cel al cărui material genetic a fost alterat cu ajutorul tehnicilor de inginerie genetică. Printre ele se află și micro-organismele, ca bacteriile, dar și insecte, plante, pești și mamifere. Modificarea genetică a unor animale s-a făcut, inițial, pentru folosul oamenilor.

Oamenii de știință din Israel au creat un prototip al unei noi rase de găini fără pene și imună la gripa aviară. Beneficiile acestei rase sunt multe: poți economisi timp când gătești, pentru că nu mai trebuie jumuliți puii, plus că sunt mult mai „ecologici“. De fapt, se reduc semnificativ costurile creșterii acestor găini. Cercetătorii susțin că puii fără pene sunt extrem de siguri din punct de vedere al sănătății, pentru că reprezintă, pur și simplu, combinarea a două rase de găini, dintre care una este „gât golaș“.

Căluții de mare aurii, au fost creați de oamenii de știință vietnamezi și sunt primele animale modificate genetic din Vietnam. Praful de aur a fost amestecat cu proteine de meduză și apoi a fost inserat în ouăle căluților de mare printr-o metodă numită „împușcarea genelor“, care are foarte multe utilizări potențiale extraordinare (***6, 2013).

Dintre organismele animale, peștii (somon argintiu, somon de Atlantic, păstrav curcubeu, tilapia) au fost modificate genetic cu scopul de a se constitui în sursă de alimente cu proprietăți nutriționale îmbunătățite. [NUME_REDACTAT] au fost modificați genetic pentru a reduce timpul necesar ajungerii la maturitate, a supraviețui cu mai puțină mâncare și pentru a crește în dimensiuni și greutate. (***5, 2000)

Alte organisme modificate genetic din categoria celor utilizate ca surse de alimente de origine animală (porcine, ovine, bovine) sunt departe de momentul în care vor apărea pe piață. Metodele utilizate pentru obținerea lor sunt în prezent scumpe și ineficiente. La introducerea pe piață a acestora hazardurile potențiale care le sunt asociate vor trebui evaluate atent. În plus, îngrijorarea publică privind etica manipulării genetice a animalelor domestice este mai mare decât în cazul plantelor (www.fao.org).

5. Biotehnologie. [NUME_REDACTAT] se divide în două subdomenii ample: reproducere convențională și genetica moleculară.

Reproducerea convențională a fost folosită de secole pentru a îmbunătăți speciile de plante și animale, pentru a satisface nevoile umane. Progresele în genetica moleculară au fost rapid adoptate de comunitatea științifică în ultimele două decenii, și ei completau instrumentele deja disponibile pentru crescătoriile convenționale.

Genetica moleculară, în sine pote fi divizată în două categorii distincte. În primul rând, care ar putea fi numit tehnologii non-controversate, genomul de plante nu este modificat. Această categorie cuprinde markeri moleculari, care sunt utilizați pentru amprentarea ADN și MAS; analiză secvențială, care ajută la descoperirea genei; și propagarea în vitro ex. embriogeneza somatică). Beneficiile de cercetare utilizând aceste tehnologii sunt un real câștig genetic pentru generație prin îmbunătățirea selecțiilor prin programe de reproducere convenționale, implementare mai repidă de material genetic îmbunătățit asupra plantațiilor, și o înțelegere mai profundă a genelor cu trăsături importante de control comercial. A doua subdiviziune majoră genetică moleculară, numită tehnologii controversate include recombinarea ADN-ului și tehnici ale transferului de gene.

6. Ingineria genetică reprezintă un ansamblu de metode de lucru prin care se manipulează materialul genetic la nivel molecular și celular. Astfel se obțin microorganisme, plante și animale reprogramate genetic, în al căror genom sunt incluse gene străine, utile, exprimabile și transmisibile stabil la descendenți.

7. Plasmide: în prezent, plasmidele sunt definite ca fiind repliconi neesențiali, capabili să se replice fizic independent de cromozom și transmiși în formă extracromosomală, pe vertical (de la o generație deindivizi la alta) sau pe orizontală (de la un individ la altul în cadrul aceleiași generații). În general, plasmidele reprezintă un fenomen al lumii procariote. Cu toate acestea, au fost descrise structuri genetice plasmidiale și la unele grupuri de eucariote inferioare (drojdii, fungi, mucegaiuri) și chiar și la eucariote superioare (plasmidele din mitocondrii și cloroplaste la unele celule vegetale). Există cercetători care încadrează plasmidele în categoria organismelor acelulare. În contrastcu această teorie, alți cercetători consideră plasmidele ca nefiind organisme, ci alături de virusuri, transposoni și secvențe de inserție, ar aparține unor specii moleculare speciale, de elemente genetice mobile (ADN accesoriu) (Sykora, 1992)

8. Propagare: se înțelege procesul de creare a unor noi plante folosind diferite metode, clone a aceleași plante mamă, excepție făcând metoda de obținere a plantelor din semințe.

9. Markeri genetici: sunt gene sau secvențe de ADN cu o locație cunoscută pe cromozomi care pot fi folosiți pentru a identifica indivizi, populații sau specii. Căteva dintre aplicațiile importante ale markerilor genetici includ: descrierea sistemelor de reproducere, gradele de consangvinizare, modele temporale și spațiale de variație genetică in cadrul populațiilor, descrierea modelelor geografice de variație genetică, deducerea relațiilor taxonomice si filogenetice între specii, evaluarea impactului practicilor de domesticire în cazul plantelor (inclusiv practicile de management al pădurilor și ameliorarea arborilor), caracterizarea diversității genetice, amprentarea și identificarea germoplasmei în populații, construirea hărților genetice etc. (White și al., 2007). Includ markeri morfologici, biochimici și moleculari.

10. Markeri moleculari: pun în evidență diferențele dintre secvențele nucleotidice, marcând totodată prezența unei anumite gene în ADN-ul extras de la diferiți indivizi. Formarea sau dispariția unui marker molecular este determinată de modificarea unei singure nucleotide dintr-o genă sau chiar de la nivelul ADN-ului repetitiv (Ganea, 2011). Tipuri de markeri moleculari: RFLP (Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție), RAPD (amplificarea randomizată a secvențelor polimorfice de ADN), SSR (secvențe repetitive simple sau microsateliți), AFLP (polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate), STS (secvențe situs-țintă), QTL (loci asociați caracterelor cantitative) etc.

11. Primeri sau amorse: secvențe scurte de ADN

12. Heritabilitate: este proprietatea fiecărui caracter, a fiecărei populații, a fiecărei generații și a condițiilor de mediu în care evoluează populația respectivă. Heritabilitatea variază între 0 și 1; dacă valoarea depășește 0,5 influența genotipului este mare și invers.
Valoarea ridicată a heritabilității mărește șansa transmiterii caracterului la descendenți. Dacă heritabilitatea este redusă transmiterea caracterului este slabă și uneori evidentiază un mediu optim de creștere și exploatare.

13. Androsterilitate: este un fenomen cu ereditate complexă,care de altfel are loc la multe specii, previne autopolenizarea, împiedică ameliorarea și producerea de sămânță hibridă. La plantele cu flori, procesele reproductive masculine au loc în anteră. Acest organ este compus din mai multe țesuturi, cum sunt: tapet, endoteciu, țesutul conectiv, țesutul vascular, fiecare cu tipul corespunzător de celule și este responsabil pentru producerea grăunciorilor de polen care conțin celulele spermatice. Țesutul tapet este un țesut specializat al anterei și joacă un rol important în formarea polenului. Acesta înconjoară sacul polinic în faza de dezvoltare timpurie a anterei, degenerează în timpul fazelor târzii de dezvoltare și nu este prezent ca țesut organizat în antera matură. Țesutul tapet produce un număr de proteine și alte substanțe, fiecare dintre ele ajută la dezvoltarea polenului sau devin componente ale peretelui exterior al polenului.

Este cunoscut că, multe mutații privind androsterilitatea interferă cu diferențierea celulelor tapetale și/sau cu funcția acestora. De aceea, se consideră că, țesutul tapetal este esențial pentru producerea de graunciori de polen viabili.

Primul caz de androsterilitate citoplasmatică a fost descris de C. Correns, care a descoperit în anul 1904 plante de cimbru (Satureja hortensis L.) cu polen neviabil. În urma polenizării plantelor androsterile cu polen de la plante fertile au fost obținute forme androsterile până în generația F6, demonstrând astfel că sterilitatea masculină se moștenește pe linie maternă (Edwardson, 1970). Ulterior, acest fenomen a fost descoperit și descris la o serie de plante din clasa mono- și dicotiledonatelor, anuale și perene, alo- și autogame. J. Edwardson a remarcat cazuri de androsterilitate necromozomală la 153 specii, ce fac parte din 51 genuri și 22 familii, clasifi cându-le în funcție de originea lor în felul următor:

sterilitate apărută în rezultatul încrucișărilor dintre plante cu genom și citoplasmă

incompatibilă;

sterilitate care se manifestă spontan la hibrizii intraspecifici;

sterilitate determinată de mutații citoplasmatice.

14. Transgenic: termen sinonim cu OMG, folosit pentru a descrie organismele care conțin ADN străin (au fost transferate gene de la alte specii – plante, animale, bacterii, virusuri sau chiar gene umane, pentru a-i conferi anumite proprietăți).

15. Clonare: este o tehnică specifică prin care ADN-ul unui organism este folosit pentru a produce un alt organism, identic din punct de vedere genetic. Este o metodă de reproducere asexuată. Cu toate acestea, fenotipic și comportamental organismul clonat nu este identic cu clona deoarece mediul în care se dezvoltă diferă, și drept urmare transferul informației din ADN în caracteristici (ex. mărimea, temperamentul etc.) este afectat. La plante (care prezintă fenomenul de totipotență), clonarea se realizează prin androgeneză și ginogeneză. La animale, se realizează transplantul de nuclei străini în ovule la care s-au îndepărtat nuclei.

16. Variabilitate genetică: este proprietatea ființelor vii de a-și schimba, (sub influența mediului și a ereditații, a factorilor externi și interni), însușirile lor morfologice, fiziologice, biologice, ecologice de a se deosebi unele de altele (Darwin, 1859). Datorită variabilității, în natură nu există două ființe sau două organe perfect identice. Variabilitatea este contrariul eredității, deoarece prin variabilitate urmașii se îndepărtează de înfățișarea părinților (într-o măsură mai mică sau mai mare). Variabilitatea și ereditatea sunt totuși legate între ele prin sistemele de nucleoproteine din celulă.

17. Ereditate: ereditatea este însușirea tutror viețuitoarelor de a poseda o informație genetică, pe baza căreia sunt transmise de la ascendenți la descendenți caractere morfologice, fiziologice, biochimice și comportamentale. Informația genetică este codificată biochimic in acizii nucleici.

18. Poliploidie: este considerată unul din factorii genetici importanți în lucrările de ameliorare a plantelor, alături de selecție, hibridare și mutație. Ca și celelalte modificări ale numărului de cromozomi, poliploidia, realizată pe cale naturală sau artificială, reprezintă de fapt o formă particulară de modificare a eredității și participă la explicarea unor mecanisme ce duc la apariția de caractere noi. Ea exercită o influență complexă asupra morfologiei și fiziologiei plantelor. (Leandru și al., 1974).

1.3. Situația organismelor modificate genetic în România

1.3.1. Plante modificate genetic

România are o istorie relativ lunga in cultivarea de plante modificate genetic. Primele culturi comerciale de plante modificate genetic au fost introduse în România în anul 1998. Este vorba de 14 varietăți soia modificată genetic.

Până la această dată au existat și câmpuri de testare a mai multor varietăți de porumb și cartof modificate genetic (Jompan, 2012).

Cifre oficiale arată că:

în anul 2004 au fost cultivate 5 523 ha cu soia MG,

în anul 2005 au fost cultivate 87 600 ha cu soia MG

iar în 2006 au fost cultivate 137 275,5 ha.

Datele sunt prezentate în Fig. 8.

[NUME_REDACTAT] a devenit stat membru al UE in anul 2007, soia MG a fost oficial interzisă pentru cultivare pe teritoriul României, conform reglementărilor europene (soia MG nu era autorizată pentru cultivare pe teritoriul UE, fiind considerată nefezabilă din punct de vedere economic). Totuși, în același an, in luna aprilie, a fost aprobat tacit pentru cultivare in România un soi de porumb MG cu denumirea MON810 (ce aparține companiei Monsanto). Acesta era singurul OMG autorizat în UE, pe care România l-a autorizat automat. [NUME_REDACTAT] nu au fost efectuate studii de evaluare a porumbului modificat genetic pentru a se vedea care sunt efectele asupra mediului.

În privința porumbului modificat genetic MON810, cifrele oficiale arată că:

– în 2007 au fost raportate 332,5 ha cultivate cu porumbul MON810,

– în anul 2008, suprafețele au crescut semnificativ până la 6 130,44 ha,

– în anul 2009, s-a raportat însământarea unor terenuri cu suprafața totală de 3093,5177 ha.

Datele sunt prezentate în Fig. 9.

Implicațiile pe care le poate avea introducerea acestuia in mediu nu au fost adresate de către autorități nici în agenda internă, nici în cadrul procesului de aderare. România este o țara în care culturile de porumb au devenit o tradiție, detinând un patrimoniu genetic valoros de varietăți traditionale de porumb. Cele aproximativ 3 milioane de hectare cultivate cu porumb nemodificat genetic sunt expuse contaminării.

În 1996, culturile comerciale de PMG-uri au ocupat 1,7 milioane ha, fiind prezente în SUA, China, Canada, Argentina, Australia și Mexic (Nap șt al., 2003; James, 1998). Ulterior, plantele transgenice s-au răspândit rapid, fiind utilizate în prezent pe toate continentele globului. Cea mai mare parte din culturile de plante transgenice este concentrată în SUA, Argentina, Brazilia, India și Canada care, împreună cu alte câteva țări, sunt considerate marile cultivatoare de plante transgenice ale lumii (“biotech megacountries”) (Figura 7).

În țara noastră, soia și porumbul au fost singurele plante MG cultivate în scop comercial. Deși opoziția publicului față de aceste culturi este, în general, evidentă, fermierii susțin că beneficiile economice obținute sunt considerabile. Aceste aspecte au fost evidențiate de rapoartele [NUME_REDACTAT] de Agricultură din cadrul Departamentului de Agricultură al [NUME_REDACTAT] (USDA [NUME_REDACTAT] Service) (Cionga, 2005; Higgins, 2000), precum și de publicații de diverse tipuri. Astăzi, cultivarea PMG-urilor în România se face pe suprafețe relativ restrânse, în principal datorită implementării legislației europene care, odată cu aderarea țării noastre la UE, la 1 ianuarie 2007, a impus renunțarea la soia MG. Această legislație reglementează strict domeniul biotehnologiilor, în special cultivarea PMG-urilor, astfel că, în cadrul UE și implicit în România, doar două evenimente de transformare la porumb (i.e. MON810 și T25) mai dețin încă autorizare pentru cultivare. Trebuie însă remarcat că au fost deja făcute demersurile pentru acordarea/înnoirea autorizației de cultivare, conform legislației adoptate în anul 2004, a peste 100 de evenimente de transformare, inclusiv a celor două menționate anterior (Sisea și Pamfil, 2009).

Fig. 7 Țările în care sunt cultivate plante modificate genetic și suprafețele

pentru anul 2012 (James, 2012)

În țara noastră, soia și porumbul au fost singurele plante MG cultivate în scop comercial. Deși opoziția publicului față de aceste culturi este, în general, evidentă, fermierii susțin că beneficiile economice obținute sunt considerabile. Aceste aspecte au fost evidențiate de rapoartele [NUME_REDACTAT] de Agricultură din cadrul Departamentului de Agricultură al [NUME_REDACTAT] (USDA [NUME_REDACTAT] Service) (Cionga, 2005; Higgins, 2000), precum și de publicații de diverse tipuri. Astăzi, cultivarea PMG-urilor în România se face pe suprafețe relativ restrânse, în principal datorită implementării legislației europene care, odată cu aderarea țării noastre la UE, la 1 ianuarie 2007, a impus renunțarea la soia MG. Această legislație reglementează strict domeniul biotehnologiilor, în special cultivarea PMG-urilor, astfel că, în cadrul UE și implicit în România, doar două evenimente de transformare la porumb (i.e. MON810 și T25) mai dețin încă autorizare pentru cultivare. Trebuie însă remarcat că au fost deja făcute demersurile pentru acordarea/înnoirea autorizației de cultivare, conform legislației adoptate în anul 2004, a peste 100 de evenimente de transformare, inclusiv a celor două menționate anterior (Sisea și Pamfil, 2009).

În ceea ce privește activitatea de testare OMG, s-au creat și în România premisele dezvoltării unui sistem adecvat, capabil să asigure punerea în aplicare a noilor prevederi legislative europene (i.e. trasabilitatea, etichetarea și monitorizarea post-market a produselor alimentare care conțin OMG-uri) menite să asigure o alegere informată și conștientă (informed choice) de-a lungul lanțului de producție și comercializare (Lee și al., 2006; Zafar și al., 2004). Concomitent, prin aceste mijloace se asigură și implementarea prevederii Protocolului asupra Biosecurității de la Cartagena ([NUME_REDACTAT] on Biosafety/CPB), referitoare la punerea la dispoziția statelor semnatare a informațiilor necesare pentru luarea unor decizii informate în ceea ce privește importul OMG-urilor pe teritoriul lor (Žel și al., 2008).

Datele oficiale publicate de [NUME_REDACTAT], Pădurii și [NUME_REDACTAT] din România pentru perioada 2004-2006 în cazul culturilor de soia și din 2007-2010 pentru porumbul MON810, sunt prezentate în figura 8 și 9.

Fig. 8 Suprafața cultivată cu soia modificată Fig. 9 Suprafața cultivată cu porumb modificat

genetic în România perioada 2004-2006 genetic în Romania perioada 2007-2010

1.3.2. Animale modificate genetic

1.4. Metode de detecție, identificare și cuantificare a plantelor modificate genetic

Tipurile de metode utilizate în mod curent pentru testarea OMG sunt prezentate în Figura 10, iar în Tabelul 3 sunt detaliate avantajele și dezavantajele celor mai utilizate dintre acestea.

Tabelul 3. Caracteristicile metodelor bazate pe analiza ADN-ului și proteinelor

Characteristics of DNA- and protein-based analytical methods (după EnviroLogix, 2009)

O mare parte dintre probele care fac obiectul testărilor OMG este reprezentată de matrici alimentare. Acestea se caracterizează de obicei printr-un intens grad de procesare, în special sub influența temperaturilor ridicate (Endres, 2001). Datorită faptului că termostabilitatea ADN-ului este mai bună decât a proteinelor (Anklam și al., 2002, în Taverniers și al., 2005; Gachet și al., 1999), reacția PCR este cea mai potivită tehnică pentru detecția, identificarea și cuantificarea OMG-urilor (Anklam și al., 2002, în [NUME_REDACTAT] și al., 2007; Tavernierst și al., 2005; Berdal și Holst-Jensen, 2001). Această tehnologie prezintă deci o sensibilitate, specificitate și eficiență mai mare decât în cazul tehnicilor bazate pe analiza proteinelor (Holst-Jensen și al., 2003, în Smith și Maxwell, 2007; Anklam și al., 2002, în Taverniers și al., 2005; Gachet și al., 1999).

Fig. 10. Metode disponibile pentru testările OMG

Detecția OMG-urilor cu ajutorul biotestelor

Detecția OMG-urilor pe baza biotestelor este posibilă doar în cazul diferitelor tipuri de rezistență (ex. la erbicide, insecte sau antibiotice) (Zafar et al., 2004).

Testele de germinare presupun folosirea unor medii simple care conțin erbicidul sau antibioticul pentru care se testează rezistența. În cazul în care erbicidul nu se adaugă în mediu, acesta va fi aplicat prin pulverizare asupra plăntuțelor (Figura 11). În condițiile descrise, indivizii rezistenți se vor dezvolta normal, fiind considerați pozitivi din punct de vedere al prezenței transgenei.

Fig. 11. Biotest pentru detecția și identificarea

plantelor rezistente la erbicid (……..)

În cazul testării rezistenței la atacul insectelor, larvele speciilor țintă sunt lăsate libere pentru a se hrăni cu plantele provenite din lotul de semințe testate. Se poate concluziona că plantele sunt transgenice în cazul în care larvele nu supraviețuiesc testului.

Aceste teste sunt ușor de aplicat, nu necesită dotare specială, sunt relativ ieftine, dar necesită timp și se pot folosi doar în cazul loturilor de semințe germinabile sau plantelor care produc astfel de semințe. Trebuie de asemenea să se aibă în vedere că proprietățile germinative pot determina obținerea unor rezultate eronate, iar zigoția caracterului transgenic nu poate fi stabilită.

Detecția OMG-urilor prin analiza proteinelor

Dintre metodele bazate pe analiza proteinelor, doar cele imunologice sunt folosite în practica testării OMG. Acestea au la bază interacțiunea anticorp-antigen, proteina rezultată în urma expresiei transgenei în organismul gazdă reprezentând antigenul.

Teoretic, testele imunologice pot fi utilizate pentru o largă varietate de molecule țintă. În practică însă, există trei limite majore ale acestor metode:

necesitatea prezenței în proba analizată a proteinelor cu structuri terțiare și cuaternare intacte; de obicei, în cazul matricilor procesate intervine denaturarea proteinelor, condiția neputând fi astfel satisfăcută;

disponibilitatea anticorpilor specifici; aceștia sunt mult mai greu de sintetizat comparativ cu primerii utilizați în cadrul metodelor bazate pe analiza ADN-ului;

posibilitatea ca ADN-ul transgenic prezent în probă să nu fie exprimat uniform în timp și în toate organele plantei.

Datorită primului dezavantaj menționat, metodele de testare imunologice se pot utiliza, în general, doar în cazul probelor proaspete sau cu grad redus de procesare (Zafar et al., 2004), iar în analizele de rutină se utilizează exclusiv kituri comerciale. Există două formate ale imunotestelor, ELISA și teste rapide de tipul stripurilor (lateral flow strips), care diferă în principal prin gradul de complexitate și performanța rezultatelor, cele două caracteristici fiind invers proporționale.

Tehnica ELISA este utilizată, în general, pentru detecție calitativă sau stabiliream nivelului de expresie proteică. Principiul ELISA cu cea mai largă aplicabilitate în testarea OMG, sandwich ELISA (Figura 12), utilizează un anticorp de captură, imobilizat pe o suprafață solidă, și un anticorp de detecție marcat. Dacă proteina de interes (antigenul) este prezentă în extractul testat, aceasta va fi legată de anticorpii care căptușesc pereții godeului de analiză. Urmează apoi legarea la proteină a celui de-al doilea set de anticorpi.

În urma unei reacții enzimatice de culoare, anticorpii marcați colorează mediul de reacție, fiind astfel indicată și prezența proteinei transgenice. Deși ELISA poate fi utilizată pentru cuantificare (Corbisier și al., 2005; Querci și al., 2005), în practică, aplicațiile în această direcție sunt foarte restrânse (Corbisier și al., 2005; Querci și al., 2005 și Eyquem, 2004) au descris și demonstrat modul de utilizare a kitului GMO [NUME_REDACTAT] Testing (noua denumire GMOChek RUR [NUME_REDACTAT]) produs de [NUME_REDACTAT] (http://www.sdix.com) și validat de JRC pentru cuantificarea proteinei EPSPS în diferite fracțiuni alimentare de soia (Lipp și al., 2002, în Corbisier et al., 2005, și [NUME_REDACTAT], 2004) și alimente ușor procesate, dar nerecomndat pentru detecția proteinei de interes în stare denaturată. Acesta este probail și motivul pentru care rezultatele au fost negative în cazul probelor tratate termic la temperaturi ridicate (Corbisier și al., 2005).

Stave (1999) afirmă că detecția proteinelor denaturate este posibilă utilizând anticorpii monoclonali, dar cuantificarea rămâne în continuare foarte dificilă în cazul alimentelor procesate (Debode și al., 2007).

Fig. 12. Principiul metodei sandwich ELISA (……)

Stripurile reprezintă o formă simplificată a testului ELISA, care înlocuiește godeurile cu membrane nitrocelulozice (stripul propriu-zis) în care sunt încorporați anticorpi dubli, specifici proteinei analizate și marcați cu un reactiv colorat (Figura 13).

Fig. 13. Lateral flow strips – principiu de funcționare. (a) Vedere laterală ilustrând principiul testului imunologic și modul de dispunere a benzilor de control și testare pe membrana nitrocelulozică. (b) Vedere frontală a testelor introduse în extract vegetal. Rezultatul din stânga este negativ, iar cel din dreapta pozitiv. Sursă: Layton în Ahmed (2002).

Testarea se face prin introducerea stripului într-un recipient ce conține extract din planta analizată. Dacă proteina de interes este prezentă, aceasta va fi legată de anticorpii specifici marcați (Figura 13a). Complexul migrează apoi, prin capilaritate, de-a lungul membranei nitrocelulozice poroase. Pe direcția de migrare sunt plasate două zone de captură, una pentru structurile anticorp-antigen, iar cealaltă pentru anticorpii marcați liberi. Prezența celei de a doua linii (controlul pozitiv) pe membrană indică o probă negativă, iar prezența ambelor linii indică un rezultat pozitiv (Figura 13b). Acest sistem (Anexa III) oferă rezultate calitative în doar câteva minute, testele fiind considerate ieftine, ușor de efectuat și foarte potrivite pentru etapa de screening ([NUME_REDACTAT] și al., 2002, în Van den Bulcke și al., 2005), domeniu în care și-au găsit o largă aplicabilitate, spre deosebire de ELISA. După cum s-a menționat mai sus (vezi Tabelul 3), EnviroLogix a introdus recent sistemul QuickScan care, în combinație cu stripurile clasice, poate oferi rezultate cantitative în cazul analizei loturilor de boabe/semințe (Envirologix, 2009).

Principalii producători de kituri imunologice destinate testării OMG sunt: EviroLogix (http://envirologix.com/artman/publish/index.shtml), [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] (http://www.romerlabs.com/romer.htm ) și Agdia (http://www.agdia.com).

Testarea OMG bazată pe analiza ADN-ului

Reacția PCR clasică și real-time

Reacția PCR permite amplificarea selectivă, într-un număr foarte mare de copii, a unei secvențe ADN prezentă într-o proporție relativ redusă în cadrul unui amestec complex de fragmente ADN (Zafar și al., 2004). Analiza produșilor rezultați prin amplificare, în cadrul unei reacții PCR clasie, permite formularea unei concluzii calitative („da” sau „nu”) asupra prezenței OMG-urilor în proba testată. În practică, evaluarea ampliconilor se face, în general, prin separare electroforetică în gel de agaroză, marcare cu EtBr, vizualizare în prezeța luminii UV și compararea cu probe standard. Pentru obținerea informațiilor cantitative referitoare la conținutul de acizi nucleici este utilizată tehnica real-time PCR. Caracteristicile acestor două metode, precum și particularitățile care trebuie avute în vedere în contextul analizelor OMG, vor fi prezentate în subcapitolele următoare.

[NUME_REDACTAT] evenimentelor de transformare la plantele de cultură este în continuă creștere, diversificându-se totodată și elementele genetice utilizate. Ca urmare, metodologia de detecție și identificare folosită în prezent se va confrunta cu o serie de probleme esențiale. Spre exemplu, screeningul nu va mai fi posibil utilizând doar un număr redus (1-3) de reacții PCR (Xu și al., 2006). În acest context, o metodologie care să permită identificarea rapidă a tuturor elementelor necesare este amplificarea PCR multiplex. Un inconvenient care apare însă în acest caz este faptul că metoda convențională de confirmare a produșilor PCR (i.e. electroforeza) este mai dificil de aplicat (Demekea și al., 2002, în Xu și al., 2006; Permingeat și al., 2002; Matsuoka și al., 2002), alternativa fiind reprezentată de microarray. Astfel, amplificarea PCR multiplex – amplificarea concomitentă a mai multor secvențe țintă – combinată cu detecția microarray reprezintă cel mai bun candidat pentru o strategie eficientă, capabilă să acopere o gamă cât mai largă de secvențe țintă și care să permită identificarea ușoară a secvențelor amplificate.

Un sistem microarray include mai multe zone de reacție (spoturi) alcătuite din sonde (fragmente) oligonucleotidice specifice, fiind astfel posibilă detecția simultană a unui număr foarte mare de secvențe de interes. Majoritatea aplicațiilor microarray sunt destinate analizelor de expresie genică, identifcării polimorfismelor și genotipării.

Fig.14. Chip microarray cu aproximativ 40.000 de spoturi.

Tehnologia microarray, inclusă în clasa microsistemelor analitice, derivă din blottinguri și utilizează principiul clasic al hibridării moleculare între două fragmente complementare. ADN-ul genomic este izolat din proba analizată și amplificat prin PCR, iar ulterior ampliconii hibridează sonde oligonucleotidice (Xu și al., 2006) atașate pe suporturile microscopice solide (cipuri) de sticlă, material plastic sau silicon (Deisingh și Badrie, 2005). În sistemul clasic, numărul sondelor este foarte mare, chiar de ordinul zecilor de mii (Figura 14), determinarea se face în urma unor reacții fluorimetrice sau colorimetrice, iar analiza datelor este foarte complexă. Acest sistem permite realizarea unor economii de timp, menținând însă ridicate precizia, specificitatea și reproductibilitatea (Deisingh și Badrie, 2005).

Fig.15. Testarea OMG calitativă utilizând kitul DualChip GMO V2.0 (Eppendorf). (a) Principiul funcțional al kitului. (b) Repartizarea seturilor de sondele specifice pentru detecția ampliconilor pe spoturile microarrayului (după Eppendorf, 2008).

Reacțiile multiplex combinate cu detecția microarray permit determinarea simultană a prezenței sau absenței unui set mare de secvențe de interes (Xu et al., 2006; Lauter, 2001 în Deisingh și Badrie 2005), oferind posibilitatea realizării într-o singură etapă, a detecției taxonilor, screeningului, precum și identificarea evenimentelor de transformare. Cipurile ADN reprezintă probabil și cea mai eficientă modalitate de identificare precisă a evenimentelor de transformare care includ mai multe inserturi (“stacked events”) datorită posibilității de detecție concomitente a unui mare număr de secvențe genice.

Primul kit de detecție a OMG-urilor cu ajutorul cipurilor a fost creat de GeneScan (http://www.genescan.de/en.aspx). Un alt exemplu din această categorie este DualChip GMO Kit V2.0, produs de Eppendorf (http://www.eppendorf.com/int/?l=1&action=start ). Acest kit permite testarea calitativă simultană pentru mai multe elemente genetice comune sau specifice diferitelor PMG-uri (Eppendorf, 2008). Aplicația presupune executarea a trei seturi de amplificări PCR multiplex (un set pentru identificarea taxonilor, care include șapte reacții; un set pentru screening OMG, care include detecția a 12 elemente; un set pentru identificarea OMG-urilor, care include detecția a 11 elemente) și o reacție de control a contaminării cu CaMV, urmată de hibridarea ampliconilor marcați (primerii utilizați pentru amplificare sunt biotinilați) pe un singur cip ADN care conține sonde complementare acestora. Ampliconii sunt detectați colorimetric utilizând principiul Silverquant, patentat de Eppendorf. Etapele de lucru și dispunerea spoturilor pe cip sunt prezentate în Figura 15.

Alte modele pentu detecția OMG-urilor utilizând tehnica microarray au fost descrise de Engel și al. (2006), Moens și al. (2005), Xu și al. (2006), Germini și al. (2004) și Rudi și al. (2003).

PCR-ELISA

O altă metodologie cu capacitate mare de procesare și potențial pentru automatizare este PCR-ELISA (Brunnert și al., 2001, în Deisingh și Badrie, 2005), tehnică ce are la bază hibridarea specifică cu o sondă marcată cu digoxigenină (format ELISA) a unui produs PCR biotinilat și imobilizat. Detecția are loc după reacția colorimetrică în care este implicată digoxigenina.

Aplicațiile de acest fel sunt însă reduse ca număr, fiind potrivite doar pentru etapa de screening din cadrul testării OMG (ex. Vollenhofer și al., 1999, în Deisingh și Badrie, 2005, sau Petit și al., 2003). R-Biofarm (http://www.r-biopharm.com/index.php?) oferă un astfel de kit comercial pentru detecția promotorului 35S și a terminatorului nos (SureFood GMO 35S/NOS Screening) în diferite tipuri de probe (vezi R-Biofarm, 2009).

Alte principii de analiză a OMG-urilor

În cazul în care compoziția sau structura ingredientelor derivate din PMG-uri (ex. acizi grași sau trigliceride) este modificată, metode bazate pe cromatografie pot fi utilizate pentru detecția diferențelor din profilul compoziției chimice (Anklam și al., 2002, în Huang și Pan, 2005; Zafar și al., 2004). Această posibilitate a fost demonstrată prin analiza uleiurilor obținute din rapița MG. Asfel, pentru investigarea amprentei trigliceridelor a fost utilizată cromatografia lichidă de înaltă performanță (high performance liquid cromatography/HPLC) și ionizarea chimică la presiune atmosferică combinată cu spectrometria de masă (atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry/APCI-MS), iar cuantificarea s-a făcut cu un detector cu ionizare în flacără (flame ionization detector/FID).

Utilizând spectroscopia NIR (near infrared), se pot detecta anumite modificări genetice care alterează structura morfologică a plantelor, fără însă a modifica în mod semnificativ conținutul de proteine și uleiuri (ex. soia RR) (Anklam și al., 2002 în Huang și Pan, 2005; Zafar și al., 2004). Posibilitatea identificării unui conținut redus de OMG-uri este însă limitată, ca și în cazul metodelor cromatografice.

Alte metode de analiză OMG, majoritatea aflate în fază experimentală sau utilizate la scară foarte redusă, sunt descrise de Obeid și al. (2004) și Garcia-Canas și al. (2004) (electroforeza capilară cuplată cu fluorescență indusă de laser), Jastrzebska și al. (2003) (wavelength-dispersive X-ray fluorescence/WDXRF), Moens și al. (2005), Mannelli și al. (2003a; 2003b) și Feriotto și al. (2003; 2002) (biosenzori/biocipuri) (Deisingh și Badrie, 2005; Huang și Pan, 2005).

1.5. Ingineria genetică și ecosistemele forestiere

În timp ce termenul "biotehnologie" se referă la un spectru larg de instrumente moderne și punerea în aplicare a acestor instrumente, este adesea asimilată cu ingineria genetică de neprofesioniști. FAO a remarcat în raportul lor din 2004 Statul de Alimentație și Agricultură că "biotehnologia este mai mult decât ingineria genetică" (FAO, 2004a). De fapt, 81% tuturor activităților de biotehnologie din silvicultură în ultimii zece ani nu au fost legate de de modificare genetică (Wheeler, 2004).

Pe scurt, biotehnologia pădurii este asociată cu un spectru larg de moderne metode aplicabile pentru domeniul științei agricole și forestiere, dintre care numai unele sunt legate de inginerie genetică. În silvicultură, definiția de biotehnologie acoperă toate aspectele legate de reproducere arborilor și clonarea plantelor, genotipare ADN și gene manipulare, și transferul de gene.

Progresele din domeniul biotehnologiei în îmbunătățirea culturilor, prin inginerie genetică au atras o mare atenție din partea comunităților atât științifice cât și laice. Acestă observație este valabilă și pentru domeniile de silvicultură și agricultură. De fapt, modificarea genetică este atât de încorporată în conștiinciozitatea publică că este adesea considerată sinonim cu biotehnologie pe termen lung. Cu toate acestea, ingineria genetică reprezintă doar o cincime din totalul activităților de biotehnologie publicate în ultimii zece ani (Walter și Killerby, 2004). Modificare genetică este frecvent văzut ca cel mai controversat utilizarea biotehnologiei (Dale, 1999; Stewart, și al., 2000; Thompson și Campbell, 2000; Dale, și al., 2002; Conner și al., 2003; Burdon și Walter, 2004; Walter, 2004; Walter și Fenning, 2004). O teamă majoră legată de modificarea genetică este posibilitatea răspândirii transferului de gene prin hibridizare și/sau introgresie aferente speciilor indigene. Această preocupare este resimțită în special în zonele unde specii interfertile sunt prezente în vecinătatea unei plantații de plante modificate genetic și când nu sunt luate măsuri de prevenire a fluxului de gene. Diferite abordări au fost propuse pentru a asigura izolarea de organisme modificate genetic (OMG-uri) prin sterilitate (Brunner și colab., 2007). În comparație cu progresele înregistrate în domeniul biotehnologiilor agricole, la care se poate urmări succesul a zece ani de aplicații comerciale, ingineria forestieră rămânând în urmă. Acest lucru se datorează în principal faptului că resursele sunt mai puține sau o mai mare rotație a culturilor ce pot depăși obstacolele semnificative cu privire la eficiența și propagarea țesutului de cultură. O dezvoltare mai recentă a eficienței tehnicilor pentru țesutul plantelor de cultură a permis silviculturii să imite ceea ce a fost realizat pentru agricultură și horticultură.

Deși au existat progrese majore în reproducerea convențională a arborilor, există unele trăsături de interes ce nu pot fi disponibile în alegerea speciile de arbori. Posibile trăsături de interes includ rezistența la insecte și erbicide, și modificarea ligninei și conținutul de celuloză (Xu și al., 1999; Bishop – Hurley și al., 2001; Pilatet și al., 2002.; Grace și colab., 2005).

1.5.1. Biotehnologii utilizate pentru arbori

Problemele cu care se confruntă omenirea la nivel global privind distrugerea pădurilor, degradarea ecosistemelor și dispariția resurselor genetice datorită unor factori biotici și abiotici, ca și schimbării globale a climei, fac necesară adaptarea de urgență a unei strategii integrate de gestiune a resurselor genetice și de conservare a biodiversității. Conservarea resurselor genetice forestiere, comparativ cu cea a celor agricole, a căror conservare este rezolvată în așa-numitele „bănci de gene”, cunoaște o dezvoltare lentă și se limitează în general la crearea de parcuri naționale și la unele populații conservate ex situ, rezervații de semințe și arboretumuri.

De aceea este nevoie de biotehnologii moderne de conservare a diferitelor tipuri de germoplasmă (semințe, polen, culturi in vitro) pe termen mediu și lung. Rezolvarea acestor probleme este cu atât mai necesară cu cât, pentru resursele genetice ale acestor specii, unele din categoria celor periclitate (amenințate cu dispariția), nu există încă alternative ex situ.

La speciile forestiere, datorită perioadelor lungi de regenerare, pentru conservarea resurselor genetice se preferă integrarea principiilor conservării in situ într-o gestiune durabilă a pădurilor (Yeatman, 1987), aceste măsuri fiind completate prin crearea de bănci genetice ex situ și de populații de conservare.

Conservarea plasmei germinative prin metode biotehnologice constituie o metodă eficientă de conservare pentru speciile care nu pot fi propagate prin multiplicare vegetativă, speciile cu ciclu de viață lung și la care producția de semințe este foarte lentă, speciile la care semințele sunt de tip recalcitrant și care mor atunci când sunt deshidratate, indivizii sterili care posedă calități particulare importante, propagulele recoltate în afara sezonului de diseminare a semințelor și la speciile la care este necesară eradicarea maladiilor pentru a se asigura o bună conservare și multiplicare.

Folosirea acestor metode de stocare prezintă numeroase avantaje cum ar fi: spațiul relativ redus necesar conservării unui număr relativ mare de plante clonale multiplicate, plantele sunt libere de patogeni și virusuri, în condiții speciale de stocare, plantele nu necesită tratamente speciale pe parcursul stocării, materialul are o formă adecvată pentru a forma structuri nucleare care fac posibilă propagarea rapidă a unui număr foarte mare de plante.

Conservarea ex situ a resurselor genetice forestiere prin metode biotehnologice se înscrie în obiectivul global de conservare a genelor și de menținere a diversității genetice a speciilor forestiere.

1.5.2. Programe naționale și internaționale de ameliorare a speciilor de arbori

Programele de reproducere a speciei Pinus elliottii din sudul SUA: a început în urmă cu mai mult de o jumătate de secol și se desfășoară în două instdtute de îmbunătățire a arborilor: [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] Program, CFGRP, gazduit la Universitatea din Florida din Gainesville, și [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], WGFTIP, localizat în [NUME_REDACTAT] Service, Texas A & M University, în [NUME_REDACTAT].

Aceste institute de ameliorare a arborilor constau de companii private, agenții de stat și personal al universității toate lucrează împreună pentru a efectua selecție, reproducere, de testare a descendenților și cercetare pentru a îmbunătăți genetic specia Pinus elliottii.

Programele de ameliorare a arborilor forestieri în Brazilia: sectorul forestier brazilian este considerat unul dintre cele mai dezvoltate din lume, fiind baza pentru segmente importante industriale care folosesc lemnul ca materie primă.

Principalele specii utilizate în programele de ameliorare sunt cele de eucalipți, pini, salcâmul și Tectona. Acestea sunt utilizate de industrii pentru obținerea celulozei și hârtiei, taninurilor, în siderurgie, export de produse prelucrate din lemn, care constituie o sursă importantă de venituri pentru economia braziliei, care poate avea un impact pozitiv pentru populație.

Eucaliptul face parte din [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT]. În acest gen sunt incluse aproximativ 600 de specii, aproape toate fiind originare din Australia (cu excepția speciei E. urophylla, originară din Indonezia, și E. deglupta din Indonezia și [NUME_REDACTAT] Guinee). Printre cele mai importante specii pentru Brazilia se numără E. urophylla și E. tereticornis.

Principalele specii de genul Pinus, ameliorate genetic în Brazilia sunt prezentate mai jos cu precizarea utilizărilor și zonelor climatice în care vegetează (Resende, 1999):

– Pulpă de fibre lungi și hârtie, cherestea, în zonele cu climă subtropicală: Pinus elliottii, Pinus taeda.

– Fibre lungi de celuloză și hârtie, cherestea în climat tropical: Pinus caribaea, Pinus oocarpa, Pinus tecunumanii, Pinus patula (pentru regiunile care nu sunt foarte aride și care nu sunt situate la altitudine mare), Pinus maximinoi.

– Pulpă de fibre lungi și hârtie, cherestea, în regiunile de tranziție între climate tropicale și subtropicale: Pinus tecunumanii și Pinus maximinoi.

– Producția de rășină: Pinus elliottii.

Programele de ameliorare a arborilor forestieri în România:

Cercetări privind ameliorarea specei Picea abies L.

Cercetări privind ameliorarea speciei Picea abies L. au fost intreprinse în Romania de (Pârnuța, 1993).

Cercetările au fost efectuate pentru a crea noi hibrizi care să poată oferi caractere genetice superioare în ceea ce privește creșterea productivității, calității, și stabilității arborilor de molid.

Materialul biologic cercetat a constat din hibrizi obținuți din încrucișările controlate în sistem dialel de tipul 8×8 realizate între patru arbori de molid pendula (cu coroană îngustă) și patru molizi comuni (cu coroană normală sau largă). Puieții în vârstă de patru ani (1 an solar și 3 ani în pepinieră, repicați în pungi de polietilenă) au fost instalați în teren în cinci culturi experimentale utilizând un dispozitiv experimental în blocuri complet randamizate cu patru repetiții.

Pe parcursul celor 4 ani s-a urmărit

Pe baza cercetărilor referitoare la programul de ameliorare la hibrizii de molid pendula x molid cu coroană normală și hibrizii reciproci rezultă următoarele concluzii:

– Variabilitatea genetică a caracterelor de creștere și de adaptare este largă și se manifestă atât în primul an cât și în al doilea an de la plantare în mod diferit, în funcție de tipul de hibrid de molid și condițiile staționale unde sunt instalate experimentele. Se constată existența unui control genetic aditiv asupra caracterelor de creștere și adaptare la cei doi hibrizi de molid, ceea ce face posibilă selecția unor părinți valoroși pentru utilizarea lor în programul de ameliorare a molidului.

– Estimarea capacității generale de combinare (CGC) a genitorilor și a capacității specifice de combinare (CSC) a familiilor hibride a permis întocmirea unui clasament al genitorilor cu cea mai bună capacitate generală și specifică de combinare. Aceștia vor fi utilizați în programul de ameliorare a molidului.

– Estimarea vigorii hibride (heterozis) pentru încrucișarea dintre arborii de molid pendula x molid normal indică heterozis cu semn negativ pentru majoritatea caracterelor de creștere (H, CH și LR) și heterozis pozitiv pentru caracterele adaptive (NR, PI și S). Valorile heterozisului la hibrizii de tipul molid normal x molid pendula suntpozitive pentru patru din șase caracterele analizate în primul an de la plantare și negative pentru caracterele H și NR. În cultura [NUME_REDACTAT], la hibrizii de molid comun x pendula valorile heterozisului sunt pozitive pentru toate caracterele analizate la doi ani de la plantare, în ipoteza raportării performanțelor hibridului la media arborilor parentali.

– Performanțele hibrizilor sunt estimate în stadiul juvenil, manifestă o evoluție diferită în timp, ceea ce face necesară continuarea cercetărilor pentru a se fundamenta științific strategia de ameliorare a molidului.

La molid de asemenea au mai fost realizate cercetări preliminare privind ameliorarea genetică pentru mărirea rezistenței la putregaiul roșu de rădăcină (Fomes annosus Fr./Cke) (Benea și al., 1975).

Cercetarea sa realizat asupra arborilor de molid, fenotipic rezistenți și sensibili la [NUME_REDACTAT], s-a făcut în arborete puternic infectate de ciupercă: caracteristicile lor morfologice și biometrice precum și condițiile pedoclimatice și de arboret s-au înscris în fișe speciale.

Ameliorarea genetică a molidului ([NUME_REDACTAT] L. Karst) la putregaiul roșu de rădăcină (Fomes annosus Fr./Cke) se bazează pe folosirea ca material inițial, a fenotipurilor rezistente în special de origine autohtonă, reunirea lor în coleții de genitori și testarea lor riguroasă în condiți de laborator seră și naturale și în final, producerea în masă a materialului de reproducere ameliorat în plantaje de semințe clonale și de descendență (Benea și al., 1975).

Fenotipurile rezistente prezintă unele caracteristici specifice față de cele sensibile în privința dimensiunilor acelor, și a densități lemnului.

Cercetări privind ameliorarea clonelor de plop și salcie

Cercetări pentru introducerea în cultură de specii / clone de plop și salcie cu potențial silvoproductiv superior și rezistentă sporită la adversității au fost realizate între ani 2000-2004 de către [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT]. Cercetările au urmărit evaluarea capacității silvoproductivea speciilor / clonelor de plop și salcie obținute din patrimoniul național sau internațional precum și determinarea proprietăților fizico-mecanice la clonele de perspectivă, (Filat și Chira, 2004).

Obiectivele pricipale a lucrărilor de cercetare au fost:

– testarea și selecționarea de specii / clone de plop și salcie din patrimoniul națioal și internațional productive și rezistente la factori abiotici și biotici;

– determinări privind proprietățile fizico-mecanice ale lemnului la clone de plop de perspectivă;

– înființarea culturilor de plop utilizând sade de mari dimensiuni plantate la 1,5 – 2,0 m adâncime.

Pentru realizarea obiectivelor stabilite, în pepiniera Nufăru – Tulcea s-a instalat o colecție de clone de plop și salcie, prin multiplicarea vegetativă a materialului biologic obținut din țară și din străinătate prin colaborări cu institute de cercetare. Butășirile au fost efectuate la schema de 1,0 x 0,3 m pentru cele 123 specii / clone, din care 89 de plop și 34 de salcie (Filat și Chira, 2004).

Conform rezultatelor publicate de Filat și Chira în 2004, au rezultat următoarele:

– pentru observațiilor și măsurătorilor efectuate în timpul sezoanelor de vegetație asupra capacității productive și asupra rezistenței / sensibilității la boli foliare ale speciilor / clonelor de plop și salcie din pepiniera Nufăru – Tulcea, se desprind în principal următoarele concluzii:

– în pepinieră s-a remarcat capacitatea mare de adaptare la condițiile de la noi clonelor de plop provenite din Belgia și Olanda, la care s-au înregistrat procente superioare de menținere.

– pentru creșterile în înălțime și procente de menținere superioare s-au evidențiat la P. deltoides 'Peoria' și 'Alcinde', la P. x canadensis 'Branagesi', 'Dorskamp', Heidemij', 'Lampertheim', 'Regenerata 111', 'Philisburg' și 'Toropogritzki'; la clone de P. nigra mai ales '[NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]'; la clone de P. x interamericana 'Beaupré' și 'Rap', iar la P. trichocarpa 'Fr 210'. La salcie procent de menținere de peste 95% au realizat 6 clone, dintre care se disting pentru creșteri medii în înălțime și diametru, în special 'Ro 433', 'Ro 892', 'Ro 1078' și Ro 1082'.

– în ceea ce privește sensibilitatea clonelor la infecțiile artificiale cu Mellampsora spp., dintre clonele testate de P. deltoides 3 au fost imune la infecțiile artificiale, 7 au fost foarte rezistente sau aproape imune, 3 au fost rezistente (ex. 'Lux I 69/55'), 1 relativ rezistentă, 6 au fost moderat sensibile și 3 foarte sensibile. Dintre clonele de plop negru european relativ rezistentă a fost 'P. nigra var. piramidalis'. La plopii euramericani au fost depistate 2 clone imune, 2 foarte rezistente, 7 rezistente, 15 relativ rezistente, 13 moderat sensibile (ex. 'I 45/51', 'Sacrau 79', cu tendințe de sensibilitate mai mare), 8 sensibile și nici o clonă foarte sensibilă. Dintre hibrizii interamericani, 'Barn' a fost constant rezistent la infecții, în timp ce 'Rap', 'Beaupré' și 'Donk' au fost relativ rezistenți.

Rezultatele din culturi comparative au condus la concluzia că P. x interamericana 'Rap', prin capacitatea productivă remarcabilă și rezistența superioară la adversități, demonstrată în suprafețele experimentale de la Turcoaia 78T – O.S. Măcin, Boianu 97P – O.S. Călărași și Rachelu 99T – O.S. Măcin, poate fi introdusă în culturi de producție. Performanțele productive realizate de plopul 'Rap' în diferite stadii de dezvoltare și în diverse condiții staționale, au fost semnificativ mai mari în comparație cu 'Ro 16' (de referință pentru plopicultura românească), respectiv nesemnificative în comparație cu cele mai productive clone din plopicultura internațională (de referință fiind 'I 214').

Tehnologia de plantare a sadelor utilizată în experiment se poate considera a fi viabilă, conducând la obținerea de plante cu dezvoltare foarte viguroasă încă din primul an.

În ceea ce privește valorile parametrilor fizico-mecanici, plopul 'Rap', la vârsta de 24 ani din cultura Turcoaia, este în top, cu mențiunea că din punct de vedere al durității, care indică ușurința la prelucrare, se încadrează la categoria de specii lemnoase semidure, în timp ce celelalte clone sunt încadrate la categoria de specii lemnoase foarte moi sau moi. Rezultatele cercetărilor se vor putea aplica la ocoalele silvice din lunca Dunării, cultivatoare de plop și salcie, atât în centrele de plante mamă zonale cât și în plantații.

Cercetări privind ameliorarea salcâmului

De asemenea au fost făcute cercetări pentru ameliorarea salcâmului de către [NUME_REDACTAT], lucrarea cuprinde rezultate obținute in lucrările de ameliorarea salcîmului, executate între ani 1972-1975. O parte din lucrările efectuate au constituit o continuare a unor cercetări efectuate într-o perioadă anterioră acestei etape.

Scopurile cercetări au fost ;

Selecționarea unor forme de salcîm de interes forestier și apicol.

Obținerea unor forme valoroase ameliorate din punct de vedere forestier și apicol, prin hibridări.

Stabilirea unor metode de înmulțire vegetativă prin drajoni, a formelor valoroase, deficitare din punct de vedere al fructificației.

Aceste cercetări de durată se înscriu ferm în sarcinile stabilite în Programul național privind conservarea și dezvoltarea fondului forestier în perioda 1976-2010 cu extinderea în cultură a speciilor de foioase repede crescătoare și cu valoare economică ridicată.

În urma cercetărilor sau obținut o serie de rezultate valoroase cum ar fi identificarea unei noi varietăți de salcîm pentru flora R.S România var. oltenica diferețiată morfologic de salcîmul comun și cu insușiri valoroase de creștere precum și selecționare onor specii de interes apicol.

CAPITOLUL II

TEHNICI UTILIZATE ÎN OBȚINEREA PLANTELOR MODIFICATE GENETIC

2.1. Propagarea prin clonare

Sunt relativ puține lucrări care abordează, în mod critic, problema metodelor utilizate pentru transformarea genetică a plantelor (Potrykus, 1991), respectiv a mecanismelor biologice care permit transferul și integrarea unui fragment de ADN străin într-o celulă vegetală țintă. In numeroase laboratoare s-a reușit transformarea genetică a diferitelor specii de plante, fie ele plante model cum ar fi tutunul (Nicotiana tabacum) sau petunia (Petunia hybrida), sau dimpotrivă plante considerate recalcitrante dar de un mare interes economic, cum ar fi soia sau unele cereale. Pentru o anumită specie de plante poate fi aplicată eficient o metodă de transformare genetică, sau mai multe.

Pentru o specie cum ar fi Arabidopsis thaliana, specie model pentru cercetările de genetică moleculară, al cărui genom a fost deja cartat în întregime, se pot aplica cu succes, în funcție de scopul urmărit, mai multe metode de transformare genetică: transformarea semințelor, a explantelor radiculare sau chiar a inflorescențelor in planta, cu ajutorul vectorului Agrobacterium tumefaciens, transformarea directă a protoplastelor, metoda biolistică sau microinjectarea. Din păcate, însă, nu se pot aplica cu aceeași eficiență diferite metode la specii considerate recalcitrante, iar celulele țintă pentru transformare nu sunt întotdeauna cele care posedă totipotențialitate și deci pot regenera plante întregi. Mai mult, eficiența transformării este dependentă nu numai de specie, dar chiar și de genotip. De aceea, găsirea unei metode general aplicabile care să permită transformarea eficientă și de rutină a tuturor genotipurilor și speciilor de plante dorite de experimentatori, rămâne un obiectiv al cercetării din acest domeniu. Metodele de transformare pot fi clasificate în metode indirecte, bazate pe utilizarea unor vectori de ADN, și metode directe (Fig. 1).

Principalele metode utilizate pentru transformarea celulelor vegetale:

A. METODE INDIRECTE – TRANSFORMAREA MEDIATA

Transformarea mediată de bacterii:

Agrobacterium tumefaciens

– Agrobacterium rhizogenes

b) Transformarea mediată de virusuri

B. METODE DIRECTE

Transformarea protoplastelor

Metoda “biolistics” – împușcarea directă a ADN în cellule

[NUME_REDACTAT]

Utilizarea fibrelor de carbură de siliciu

A. Metode indirecte de transformare a plantelor

a) Transformarea mediată de [NUME_REDACTAT] din sol, Agrobacterium tumefaciens și Agrobacterium rhizogenes realizeză ceea ce adeseori s-a numit “inginerie genetică naturală”. Aceaste bacterii sunt capabile să transfere în țesutul vegetal lezat, un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti (“tumor inducing”) – în cazul speciei A. tumefaciens – sau Ri (“root inducing”) – în cazul speciei A. rhizogenes, care se integrează în genomul plantei. Ca urmare bacteria A. tumefaciens induce formarea de tumori la nivelul coletului (“crown gall disease”) iar A. rhizogenes formarea de rădăcini firoase (“hairy roots”). In decursul coevoluției plantă – microorganism aceste bacterii au devenit capabile să transforme plantele pentru a le exploata mai bine ca și surse de energie. ADN –T se transmite prin semințe după legile Mendeliene, ca genă dominantă. Există date care confirmă faptul că o astfel de transformare genetică are loc în natură fără intervenția omului. Astfel, s-a demonstrat că plasmida Ri poate purta una sau două copii de ADN-T, iar o parte din una dintre aceste secvențe a fost regăsită în genomul unor plante nemodificate genetic (Potrykus și Spangenberg, 1995). Celulele vegetale care poartă ADN-T devin celule tumorale, deoarece acest fragment de ADN conține gene cu efect oncogen. Deleția acestor gene din ADN-T nu interferă, din fericire, cu transferul și integrarea ADN-T în genomul celulei vegetale receptoare. Doar capetele ADN-T, așa numitele latură dreaptă și stângă constănd din o secvență alcătuită din 24 de nucleotide care se repetă, reprezintă situri de recunoaștere pentru sistemul de transfer. Prin înlocuirea oncogenelor din ADN-T cu gene de interes este posibil transferul acestora în celule vegetale țintă, celule care nu mai dobândesc caracter tumoral și deci pot regenera plante transformate genetic. Genele de interes – fie ele gene marker sau raportoare sau gene cu importanță economică – pot fi introduse în plante fie prin lincaj cu regiunea ADN-T dezarmată prin recombinare, obținându- se un așa numit vector de integrare, fie prin clonarea lor între secvențele repetate laterale într-un replicon independent, ceea ce se numește vector binar. Existența mai multor regiuni T în celula de Agrobacterium conduce la cotransferul acestora în celula vegetală țintă cu eficiență crescută. Pe de altă parte pentru integrarea ADN-T în celula vegetală se pot utiliza secvențe omoloage ADN vegetal țintă care induc, cu frecvență relativ scăzută, recombinarea omolagă între ADN-T și ADN vegetal.

Agrobacterium tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de plante chiar dacă unele dintre acestea nu formeză tumori (de la Riva și colab., 1998). Deși spectrul de gazde pentru această bacteriei este limitat la plantele dicotiledonate s-au obținut tulpini supervirulente, capabile să infecteze eficient și celulele plantelor monocotiledonate (Potrykus și Spangenberg, 1995). S-a deschis, astfel, calea transformării cerealelor și prin intermediul acestui vector bacterian. Eficiența transformării celulei vegetale de către A. tumefaciens, variază destul de mult în funcție de specie, genotip sau chiar de țesutul țintă. Este foarte important, totodată, ca țesutul supus transformării să fie totipotent și deci să regenereze plante transformate genetic. De cele mai multe ori, însă, dintr-un țesut doar un număr limitat de celule sunt totipotente și nu întodeauna acestea sunt și cele transformate de agrobacterium. Pentru diferite specii de plante s-au identificat metode potrivite pentru transformarea eficientă mediată de A. tumefaciens. Ca țesuturi țintă pot fi utilizate: discuri sau fragmente foliare, fragmente de rădăcini, hipocotile, pețiol, cotiledoane sau semințe întregi. Primele plante transformate prin intermediul lui A. tumefaciens au fost regenerate în 1983 (Fraley și colab.,1983), succesele inițiale limitându-se la solanacee, în particular la sistemul model tutunul (Nicotiana tabacum L.). In anii optzeci și nouăzeci ai secolului douăzeci, tot mai multe specii de plante au putut fi transformate prin intermediul vectorului A. tumefaciens, multe dintre ele specii cu o mare importanță economică, cum ar fi: soia, bumbacul, orezul, ovăzul, sorgul, trestia de zahăr, grâul și multe altele (Potrykus și Spangenberg, 1995; Songstad și colab., 1995; de la Riva și colab., 1998). Eficiența transformării variază foarte mult de la o specie la alta în funcție de: identificarea metodei optime de cultură a țesutului țintă, condițiile de cultură a materiallului sursă, sau sușa bacteriană utilizată. Acești factori afectează și numărul de copii de ADN-T care se integrează în genomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii de plante, integrarea unei singure copii de ADN-T. Mai recent, cercetările au vizat descifrarea mecanismelor implicate în colonizarea țesuturilor vegetale de către bacterii, relevându-se noi detalii privind controlul genetic al virulenței bacteriene (de la Riva și colab., 1998).

Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oară pentru transformarea plantelor de tutun în anul 1977 (Ackermann, 1977). Această bacterie transferând ADN-T de pe plamida Ri determină formarea rădăcinilor firoase pe diferite organe ale plantelor, rădăcini care pot purta gene de interes, dacă acestea au fost integrate în ADN-T, respectiv pot regenera plante transformate genetic. O etapă intermediară, în procesul de transformare mediată de A. rhizogenes, este cultura rădăcinilor firoase care au capacitatea de a se alungi și ramifica. Astfel, prin cultura rădăcinilor firoase se pot obține metaboliți secundari sau pot fi realizate studii fundamentale privind creșterea și dezvoltarea rădăcinilor. Acest sistem experimental este foarte potrivit și pentru analize biochimice, rădăcinile prezentând căi biochimice mai simple și, deci, mai ușor de analizat. Rădăcinile firoase pot fi cultivate ușor, folosind un echipament simplu și ieftin iar, comparativ cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabile din punct de vedere genetic. Asemănător sistemului A. tumefaciens, bacteria A. rhizogenes poate co-tranfera ADN-T de pe plasmida Ri și un vector “binar”, de obicei o plasmidă mai mică. Aceasta din urmă poate purta în ADN-T o genă marker, de exemplu o genă care conferă rezistență la un antibiotic, o genă raportoare – sau marker pentru vizualizare fenotipică și o genă cu importanță economică. Avantajul acestui sistem este acela că cele două tipuri de ADN-T, cel care determină dezvoltarea rădăcinilor firoase, și ADN-T de pe vectorul binar, se integrează de obicei pe cromozomi diferiți în plantele transformate și deci, vor segrega independent în descendență. Un avantaj aparte al sistemului de transformare Ri este faptul că toate celulele vegetale care integrează ADN-T de pe plasmida Ri pot fi ușor identificate și selectate prin prezența fenotipului de rădăcină firoasă.

Sistemul de transformare mediată de A. rhizogenes a fost aplicat unui mare număr de specii de plante (în jur de 200 încă în 1989 – Tepfer 1989), dar asemănător sistemului A. tumefaciens răspunsul optim variază în funcție de specie, genotip sau sușa bacteriană. Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes sunt: fragmente de tulpină de la plante tinere, fragmente de pețiol, fragmente foliare, segmente de hipocotile sau cotiledoane, sau fragmente ale unor organe de rezervă cum ar fi rădăcinile de morcov sau tuberculii de cartof. Uneori astfel de explante prezintă un răspuns polar, formând rădăcini firoase numai la una din extremele explantului, rădăcini capabile să ignore forța gravitațională. Mai mult, există date experimentale care sugerează efectul de piticire a plantelor indus de una dintre genele de virulență, rolA, de la A. rhizogenes, efect cu importanță practică mai ales pentru unele plante horticole (Curtis și colab., 1996).

Figura 16. Reprezentarea etapelor de transformare și regenerare a plantelor transgenice

pentru două metode eficiente: stânga – transformarea mediată de Agrobacterium;

dreapta – metoda de împușcare directă a ADN (…).

b) Transformarea mediată de virusuri

Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, în ciuda numeroaselor eforturi experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Deși, în 1984 a fost posibil transferul unei gene de rezistența la antibiotic cu ajutorul unui virus ADN (Brisson și colab., 1984), cercetările ulterioare au demonstrat că genomul viral nu poate accepta și transfera fragmente mai lungi de ADN străin. Descoperirea faptului că virusurile ARN pot genera ADNc prin transcripție inversă a generat sperența că, mult mai numeroasele virusuri ARN ar putea fi utilizate ca vectori de gene pentru celula vegetală. Din păcate, însă, s-au întâmpinat alte dificultăți. ADNc viral nu se integrează în genomul vegetal iar meristemele, principala sursă de celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai rar utilizați în experimentele de transformare genetică a plantelor.

B. Metode directe de transformare a plantelor

Utilizarea protoplastelor pentru transferul direct de AND:

Protoplastele, celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezintă limita de expresie a totipotențialității. De la primele plante de tutun regenerate din protoplaste izolate (Takebe și colab., 1971) până astăzi numărul plantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenit posibilă a crescut permanent, ajungând actualmente la aproximativ 400 de specii de plante. Dacă până în anul 1985 tehnologia protoplastelor se putea aplica cu succes mai ales Solanaceaelor și Brassicaceaelor, o dată cu descoperirea totipotențialității protoplastelor izolate din suspensii celulare embriogene de cereale s-au deschis noi oportunități de modificare genetică a acestui important grup de plante.

Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN și selecția transformanților. Indepărtarea peretelui celular elimină principala barieră în calea pătrunderii ADN străin în celula vegetală. Izolarea enzimatică a protoplastelor acționează ca un factor de stress care induce reacții de răspuns la rănire – reacții presupuse a declanșa starea de competență atât de importantă pentru transformarea eficientă. Mai mult, suspensia de protoplaste se aseamănă cu o suspensie bacteriană avănd avantaje similare prin posibilitatea de a cultiva populații mari de celule individuale în medii de cultură bine definite. Tesuturile derivate din protoplaste au în general origine clonală provenind din celule individuale. Eficiența selecției transformanților este, prin urmare, maximă în cazul protoplastelor deoarece se evită formarea de himere, destul de frecvente la nivelul sistemelor multicelulare. Pentru transferul ADN, de obicei plasmidial, în protoplastele izolate se pot utiliza diferite metode, și anume:

Tratamente chimice cu agenți permeabilizanți (mai ales polietilenglicol – PEG): PEG și alți agenți chimici pot permeabiliza membrana plasmatică permițând intrarea unor macromolecule, ADN, în citoplasmă. Mecanismul intim al acestui proces nu este pe deplin înțeles. Primele date raportate în literatură se referă la transferul ADN-T, provenind de la Agrobacterium tumefaciens, în protoplaste de petunia în prezența PEG (Draper și colab., 1982). Primele plante transgenice au fost obținute la tutun prin această metodă de către Paszkowski și colab. (1984). Transformarea protoplastelor prin permeabilizare cu PEG a fost realizată cu succes pentru multe specii de plante, atât dicotiledonate cât și monocotiledonate, cheia succesului reprentând-o existența unui protocol eficint de regenerare a plantelor din protoplaste.

Electroporarea – implică permeabilizarea reversibilă a membranei plasmatice în prezența unor pulsuri de curent continuu având amplitudine crescută și durată foarte scurtă, porii formați în membrană permițând intrarea ADN străin în citoplasmă (vezi Rakosy-Tican și colab., 2000). Electroporarea a devenit o metodă de rutină pentru transformarea protoplastelor vegetale, dar și pentru celulele de mamifere sau bacteriene. La plante electroporarea protoplastelor se folosește eficient atât pentru analiza expresiei transiente a transgenelor cât și pentru transformarea permenetă, pentru numeroase specii de plante incluzând cerealele. Mai mult, prin electroporarea protoplastelor se elimină necesitatea utilizării unor gene marker, ceea ce reprezintă un avantaj deosebit în condițiile oponenței acerbe a opiniei publice fată de eliberarea în câmp a unor plante purtând gene marker. Avantajele electroporării constau în eficiența crescută a incorporării ADN străin, reproductibilitatea și simplitatea acestei metode. Singura limitare a aplicării electroporării o reprezintă capacitatea de regenerare a protoplastelor, dar și acest dezavantaj a fost depășit prin extinderea aplicării electroporării celulelor sau chiar țesuturilor întregi.

Sonicarea – permeabilizarea membranei protoplastelor în prezența ultrasunetelor s-a dovedit, de asemenea o metodă eficientă pentru transferul ADN în protoplaste vegetale. Ulterior metoda a fost aplicată și celulelor sau țesuturilor întregi, dar este utilizată pe scară mai redusă comparativ cu electroporarea (Zhang și colab., 1991).

Microinjectarea – constă în introducerea cu ajutorul unei micropipete a ADN direct în protoplaste, acestea fiind fixate cu o altă micropipetă. Microinjectarea celulei vegetale întregi sau a țesuturilor este, de asemenea posibilă, dar se realizează mai greu din punct de vedere tehnic. Un sistem eficient a fost utilizat mai recent (Kost și colab., 1995) și constă în imobilizarea protoplastelor recipiente de tutun într-un strat foarte subțire de mediu solidificat cu agaroză sau alginat. Protoplastele au fost imobilizate deasupra unei grile care a permis localizarea și monitorizarea prin fotografiere a protoplastelor microinjectate, respectiv a celulelor sau calusurilor derivate din acestea.

Fuziunea cu lipozomi – fuziunea lipozomilor încărcați cu ADN cu membrana plasmatică a protoplastelor și eliberarea ADN străin în citoplasmă a fost demonstrată în 1990 (Cacboche, 1990). Metoda nu prezintă avantaje deosebite comparativ cu alte metode de transfer direct, de aceea este mai puțin utilizată. S-a încercat, de asemenea, utilizarea lipozomilor pentru a transporta ADN în celule sau țesuturi întregi, în ideea trecerii lipozomilor prin plasmodesme. S-a demonstrat însă că peretele celular este o barieră de netrecut pentru lipozomi iar plasmodesmele se închid ca răspuns la rănire. O idee interesantă a fost aceea a injectării lipozomilor în vacuola unor celule vacuolate. In acest caz s-a constatat fuziunea lipozomilor cu tonoplastul și eleiberarea ADN în citoplasmă. Deși elegantă această metodă are aplicații restrânse deoarece celulele vacuolate nu sunt totipotente (Potrykus, 1991).

Metoda “biolistics” – împușcarea directă a ADN în celule

Metoda biolistică (“biolostics”) sau “particle gun”, de împușcare directă a ADN în țesuturi țintă (Klein și colab., 1987), este cea mai spectaculoasă metodă de transformare genetică a plantelor care a declanșat un val de entuziasm în rândul specialiștilor din acest domeniu. In dezvoltarea acestei tehnici s-a investit foarte mult efort și bani dar și rezultatele obținute au fost pe măsura așteptărilor. Metoda constă în accelerarea unor particule foarte mici (1μm diametru) din tungsten sau aur coloidal, pe care a fost precipitat ADN, în țesuturi vegetale țintă. Această tehnică are numeroase avantaje care o recomandă pentru aplicabilitate generală: este o metodă ușor de aplicat, printr-o împușcătură pot fi țintite mai multe celule, celulele supraviețuiesc după împușcare, genele purtate de particule își păstrează activitatea biologică, particulele pot fi împușcate în stratele superficiale sau în profunzimea unui organ vegetal, celulele țintă pot fi foarte diferite: polen, celule în suspensie, embrioni imaturi, celule din țesuturi diferențiate sau chiar meristeme. Datorită avantajelor sale biolisticul a devenit metoda favorită în numeroase laboratoare, permițând transformarea cu succes a unor plante pentru care alte metode nu au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovăzul, orezul, sorgul, trestia de zahăr, grâul, plante forestiere etc. O aplicație aparte a fost utilizarea împușcării de microproiectile pentru rănirea apexurilor la floarea soarelui, eficientizând astfel transformarea mediată de Agrobacterium tumefaciens (Bidney și colab., 1992). Mai mult, s-a reușit împușcarea directă în țesuturi vegetale a celulelor bacteriene întregi.

[NUME_REDACTAT] ADN printr-un țesut vegetal țintă a fost o altă idee interesantă pentru transferul de gene și a fost aplicată pentru prima oară embrionilor intacți de orz (Ahokas, 1989). In aceste experimente s-a demonstrat expresia tranzientă a alogenelor. Ulterior s-a imaginat un sistem simplu pentru realizarea electroforezei folosind embrioni zigotici (Songstad și colab., 1995)(Fig. 17).

Figura 17. Reprezentarea metodei de electroforeză a ADN în țesuturi vegetale țintă (după Songstad și colab., 1995).

Condițiile optime pentru electroforeza embrionilor sunt considerate: un curent de 0,5 mA la 25V/embrion, timp de 15 min. In aceste condiții în jur de 50% din embrioni rămân viabili. S-a reușit, de asemenea, transformarea permanentă, folosind genele marker de rezistență la kanamicină și GUS (β-glucuronidază), a embrionilor unei specii de orhidee (Griesbach și Hammond, 1993). Aplicarea acestei tehnici prezintă interes deosebit pentru acele specii care nu au dat rezultate prin aplicarea unor metode ca biolisticul sau electroporarea.

Utilizarea fibrelor de carbură de siliciu („silicon carbide technology“)

Fibrele de carbură de siliciu se utilizează în industrie. Transformarea genetică prin această tehnologie este relativ simplă, constând în vortexarea (agitarea) țesuturilor împreună cu ADN și fibre de carbură de siliciu. Astfel, fibrele penetrează pereții celulari permițând ADN să pătrundă în citoplasmă. Metoda a fost aplicată inițial transformării embrionilor de insecte, iar ulterior s-a dovedit eficientă și în transformarea celulelor vegetale (Kaeppler și colab., 1990). Cercetările de microscopie electronică au relevat penetrarea peretelui celular de către astfel de fibre, sugerând că ADN aderă de suprafața fibrelor și este introdus odată cu acestea în celulă. Având proprietăți fizice asemănătoare azbestului fibrele de carbură de siliciu sunt probabil carcinogene. Transformarea genetică tranzientă a fost raportată folosind această tehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ovăz, tutun și Agrostis alba. Transformarea stabilă a fost, de asemenea posibilă folosind suspensii celulare de porumb și tutun. Datele obținute au indicat transformarea preponderentă a aglomeratelor celulare neembriogene la porumb, de aceea se impun cercetări ulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda prezintă avantajul de a fi foarte simplă și ieftină, dar datorită riscurilor potențiale pentru sănătatea umană se caută materiale alternative, eventual biodegradabile (Songstad și colab., 1995).

Metode de ameliorare a arborilor

Multiplicarea vegetativă reprezintă indiscutabil metoda cea mai utilizată în cadrul silviculturii clonale, fapt datorat progresului spectaculos al tehnologiilor în domeniul fiziologiei plantelor (inclusiv la speciile forestiere). Prin urmare, aceste tehnici ocupă în prezent un loc foarte important în practica ameliorării silvice, fiind practic nelipsite din multiplele programe sau etape de ameliorare la cele mai importante specii de arbori.

Înmulțirea vegetativă se bazează pe aptitudinea majorității speciilor de plante de a putea reconstitui un exemplar identic cu el însuși, plecând de la un organ (tulpină, rădăcină, frunze), de la un țesut sau chiar de la o celulă (Lucău, 1998).

În ceea ce privește speciile forestiere, numai câteva se pretează la multiplicarea vegetativă de rutină (eucalipt, sequoia, molid, pin, cireș, plop, sălcie, tei). Restul speciilor de arbori dovedesc o afinitate mult mai redusă în ceea ce privește obținerea facilă de butași, drajoni sau inoculi in vitro. Prin urmare, la acestea din urmă, costurile ridicate și punerea cu dificultate în aplicare a acestor tehnici nu justifică efortul de inițiere și dezvoltare ulterioară a unor programe silviculturale în sistem clonal.

Altoirea este una din cele mai vechi metode (tehnici) horticole, succesul acesteia depinzând de specie, tipul altoaielor și de epoca altoirii. Altoirea în cap este recomandată pentru înființarea de livezi de semințe, în vederea obținerii unor creșteri rapide și armonioase a plantelor, precum și a reducerii timpului necesar de producere a semințelor (Pinus, Picea, etc.).

În cadrul lucrărilor de ameliorare a arborilor, altoirea este intens utilizată la înființarea livezilor semincere de clone.

În efectuarea lucrărilor de altoire trebuie să se țină cont de câteva principii de bază, și anume:

– contactul între altoi și portaltoi trebuie să fie cât mai strâns în vederea realizării unei perfecte sudări a țesuturilor, mai ales a cambiului ca zonă generatoare a ambelor componente;

– portaltoii trebuie să fie puieți proveniți din sămânță, bine dezvoltați (la rășinoase, diametrul la colet să fie de 6-8 mm iar la foioase de minimum 10-12 mm), sănătoși, să aibă creșteri active, coajă netedă și o bună înrădăcinare;

– altoaiele se recoltează, de regulă, în perioada de repaus vegetativ (între octombrie-noiembrie și martie-aprilie). Pentru altoirile de vară (luna august), recoltarea altoaielor se face cu maximum 2 zile înaintea lucrării. În funcție de poziția florilor, recoltarea altoaielor se face fie din treimea mijlocie a coroanei pentru un raport echilibrat între inflorescențele mascule și femele (ex. la pin) sau din oricare parte a coroanei la speciile cu flori hermafrodite (ex. la salcâm);

– confecționarea altoaielor se face din lujeri viguroși, în vârstă de 1-2 ani, cu o lungime de cca. 20 cm, iar după recoltare, altoaiele se leagă în mănunchiuri de câte 25-30 bucăți cu etichetă;

– păstrarea altoaielor se va face în încăperi cu suficientă umiditate și o temperatură care să nu le permită intrarea în vegetație, în situația de încălzire a vremii.

Altoirea în seră este mai ușoară și mai sigură decât altoirea în aer liber, beneficiind de unele avantaje cum ar fi: adăpost față de condițiile nefavorabile de mediu, un regim reglabil de intensitate luminoasă temperatură și umiditate si poate fi practicată și iarna. Dezavantajele constau în costurile ridicate privind investiția, încălzirea, materialele și, nu în ultimul rând, riscul apariției unor boli criptogamice. Acest tip de altoire se poate practica la rășinoase și la unele foioase (fag).

Altoirea în aer liber, respectiv în livezile de semințe, prezintă unele mari avantaje, în sensul că este mult mai puțin costisitoare decât altoirea în seră și materialul biologic nu trebuie să suporte atât de multe manipulări ca în cazul precedent. Totuși, acest tip de altoire trebuie să se execute pe timp cu suficientă umiditate atmosferică, cer înnorat, fără vânturi uscate și calde, toate aceste condiții la un loc fiind greu de îndeplinit pentru perioade mai lungi de timp. Anumite specii (duglas) prezintă fenomene de incompatibilitate pe o perioadă mai mare sau mai mică de timp. În acest caz, se selecționează portaltoaie compatibile care vor produse din sămânță sau din butași.

Marcotajul reprezintă metoda vegetativă prin care este provocată formarea de rădăcini pe un ram nedetașat (în primă fază) de arborele mamă. Dezvoltată inițial în domenii ca horticultura, pomicultura sau horticultura, tehnica inducerii și formării rădăcinilor pe ramuri nedetașate inițial s-a aplicat, treptat și cu bune rezultate, la unele specii de arbori. Operații ca inelarea scoarței și aplicarea unor tratamente cu substanțe rizogene (mai ales cele din categoria auxinelor), precum și crearea mediului necesar dezvoltării rădăcinilor (sub formă de mușuroaie la marcotaj în lăstar sau sub formă de manșon la marcotaj aerian), stau la baza înrădăcinării și separarea noii plante de arborele mamă. Această tehnică este complexă și relativ costisitoare și, în consecință, se recomandă a fi aplicată drept completare sau în caz de eșec la aplicarea altor tehnici vegetative (ex. la nuc ).

Drajonarea este fenomenul prin care se produc lujeri tineri pe rădăcini. Anumite specii (cireș sălbatic, tei, plopi hibrizi) au capacitatea intrinsecă de a dezvolta aceste formațiuni specifice, rezultând adevărate buchete de drajoni, iar fiecare dintre aceștia reprezentă o clonă. Aceste formațiuni se pot preleva fie în mănunchiuri de 50-100 bucăți (lungime de cca. 8-10 cm) și care se pot instala în seră, fie câte 2-3 lujeri, lungi de 20 cm și care se pot instala în pepinieră. Important este faptul ca acești lujeri să fie recoltați de pe plante tinere, în vederea inducerii rapide și eficiente a procesului de înrădăcinare.

Butășirea reprezintă probabil tehnica cea mai veche dar și cea mai utilizată în silvicultura clonală, aceasta în scopul răspândirii materialului selecționat și ameliorat (molid, pin, cireș, sălcii, plopi). Butașii de calitate se disting mai ales prin capacitatea lor deosebită de înrădăcinare, iar factorii de care depinde calitatea butașilor sunt legați de vârsta arborelui mamă și de starea fiziologică a materialului vegetal, ca factori endogeni, respectiv de condiții de butășire sau aplicare de tratamente – factori exogeni.

Înaintarea în vârstă conduce invariabil la o descreștere a capacității de înrădăcinare a butașilor și, implicit, la scăderea calității materialului. Descreșterea poate fi bruscă (ex. la nuc) sau progresivă (larice sau molid).

Poziția lujerilor pe ramuri poate, de asemenea, influența direct calitatea viitorilor butași. Astfel, lujerii din vârful ramurilor sau cei proveniți de la ramurile aflate la baza coroanei sunt mai tineri și pot furniza butași de calitate superioară, cu un procent superior de înrădăcinare. Ca anotimp, este recomandabil ca la rășinoase, recoltarea să se facă înainte de intrarea în vegetație, pe când la foioase chiar în plin sezon de vegetație, în fază activă de creștere.

Legat de factori exogeni, mediul de butășire poate avea adesea o influență decisivă asupra procesului de formare și dezvoltare a unor rădăcini de bună calitate la butași. Se cunoaște faptul că la duglas, un procent mai mare de pietriș în mediul de butășire induce formarea unor rădăcini groase, puțin ramificate și fragile la repicaj. Dimpotrivă, utilizarea unor medii cu un conținut mai ridicat de turbă favorizează formarea de rădăcini fine, lignificate și ramificate, favorabile repicajului.

Există o relație directă între factorul termic și umiditatea mediului de butășire, în sensul că la o umiditate suficientă, butașii pot înrădăcina destul de bine și la temperaturi mai mari sau mai scăzute, însă optimul termic al mediului este cel cuprins între 21- 24oC. Între aceste limite ale temperaturii, viteza de înrădăcinare este cea mai favorizată.

În ceea ce privește administrarea unor substanțe active (simple sau combinații), pe baza cercetărilor efectuate, se poate afirma că aplicarea acestor produși, în anumite concentrații, combinații sau în anumite etape fiziologice de creștere, au o influență benefică pentru butașii aparținând majorității speciilor forestiere. Cele mai indicate substanțe, în acest sens, sunt cele aparținând grupei auxinelor (AIA, ANA, AIB, etc.) ce au un efect rizogen recunoscut.

Strategii de butășire

Dezvoltarea și aplicarea pe scară tot mai largă a acestei tehnici de înmulțire vegetativă în pomicultură și viticultură au creat premize favorabile stabilirii și adoptării unor programe și chiar strategii de butășire și în silvicultură.

Multiplicarea clonală a arborilor vârstnici. Nu este indicat a se utiliza în mod direct butași prelevați de la arbori vârstnici, deoarece acești butași înrădăcinează foarte greu și, în final, rezultă plante de calitate mediocră. În prezent, sunt puse la punct tehnici de revenire le un anumit stadiu de juvenilitate a zonei de interes la un astfel de arbore Aceste tehnici favorizează dezvoltarea mugurilor inițiați de mai mulți ani dar care au fost menținuți reprimați. În acest scop, se procedează la executarea unor tăieri severe, sau la tăierea puieților aproape de pământ (recepare), aceste operații permițând multiplicarea vegetativă la unele specii importante de rășinoase (pin) sau foioase (stejar, nuc, frasin). De asemenea, rejuvenilizarea se mai poate realiza și prin executarea unor altoiri repetate pe răsaduri tinere (ex. la duglas, pin, eucalipt).

În ciuda faptului că toate aceste tehnici necesită timp și se efectuează cu costuri destul de ridicate, totuși ele sunt dezvoltate în cadrul activităților specifice de înființare a unor parcuri de arbori-mamă de butași sau chiar în anumite etape ale unor programe de ameliorare forestieră.

Multiplicarea cu selecție clonală în pepinieră constituie o importantă metodă pentru multiplicarea materialului juvenil și fost aplicată, prima dată, la molidul comun, în Germania.

Este recomandabil de a se preleva un număr cât mai mare de clone (câteva mii), deoarece este greu a se depista exemplarele valoroase la vârste mai fragede. În plus, definitivarea selecției se realizează pe parcursul mai multor etape ale testelor clonale. Menținerea stadiului de juvenilitate se poate realiza prin butășire ciclică și menținerea clonelor sub formă de nuieliș.

Multiplicarea în vrac a proveniențelor constituie o altă variantă strategică în cadrul programelor de silvicultură clonală și depinde de stadiul de avansare a programelor de ameliorare. Sistemul de butășire aplicat la populațiile semincere conduce la obținerea rapidă de plantații foarte performante, permițând totodată și menținerea juvenilă a parcurilor de arbori-mamă. Există posibilitatea ca, la apariția primelor simptome de maturare-îmbătrânire la butași, respectivele exemplare să fie înlocuite cu noi răsaduri obținute din același lot de semințe. Dezavantajul constă în costul ridicat al activității, situație datorită echipamentelor sofisticate necesare creșterii și formarea plantelor, cât și pentru realizarea butășirii (ex. la Picea mariana) (Lucău, 1988).

2.2. Micropropagarea in vitro

Înmulțirea “in vitro” a plantelor poartă denumirea de micropropagare (micromultiplicare sau microînmulțire). Este o formă de multiplicare vegetativă și asigură un randament net superior, în comparație cu alte procedee practicate, până în prezent, în horticultură și silvicultură. Micropropagarea se face prin minibutășire “in vitro”, atunci când plantulele din culturile primare sunt bine dezvoltate, cu rădăcinițe, tulpinițe și frunzulițe bine individualizate și viguroase. Minibutașii rezultați sunt trecuți, în condiții aseptice, pe medii de cultură noi și vor forma culturile secundare.

Faptul că într-un timp relativ scurt (în mai puțin de un an) se pot obține, prin micropropagare, milioane de exemplare (copii fidele ale plantei donatoare), forme care în condiții obișnuite s-ar obține foarte greu sau nu ar putea supraviețui, reprezintă un câștig enorm privind eficiența și implicațiile practice ale acestei metode în ameliorarea unor importante specii forestiere. De asemenea, prelevarea și cultura “in vitro” de meristeme asigură obținerea și multiplicarea unui material biologic sănătos, liber de viruși (Fărtăiș, 2002).

2.3. [NUME_REDACTAT] vegetative se formează într-un proces complex de diferențiere celulară numit organogeneză sub influența factorilor externi și interni.

Organogeneza cuprinde patru etape:

Formarea oului (zigotului) în urma fecundării oosferei (gametul femel).

Formarea embrionului prin diviziuni succesive ale zigotului încă înainte de maturizarea seminței în care acesta se află. Are loc și un proces de diferențiere organică prin formarea miniorganelor vegetative embrionare: radiculă sau radaciniță, hipocotil sau tulpiniță, gemula sau muguraș. Embrionul însoțit de unul sau mai multe cotiledoane conține substanțe nutritive; se află închis în sămânță și este înconjurat de țesuturi hrănitoare și protectoare.

Formarea plantulei (plantei tinere) prin dezvoltarea embrionului în urma germinării seminței. Minioganele embrionului cresc prin înmulțirea celulelor meristematice care apoi se diferențiază treptat și continuu cu apariția țesuturilor primare definitive și specifice fiecărui organ vegetativ. Această etapă marchează și trecerea de la o nutritție heterotrofă la nutriția autotrofă.

Formarea plantei mature prin ramificarea rădăcinii primare, a tulpinii purtătoare de frunze și prin apariția organelor de reproducere: floare, fruct și semințe.

2.4. Embriogeneza

O altă tehnologie de micropropagare, care a fost dezvoltat mai recent si are aplicatii promițătoare pentru silvicultură clonale este embriogeneza Somatica. Succes embriogeneza a fost raportat pentru Liquidambar (styraciflua Liquidambar) în 1980 (Sommer și Brown, 1980) și pentru Molid (Picea abies) la mijlocul anilor 1980 (Hakman și von Arnold, 1985; Chalupa 1985). De atunci, a fost embriogeneza Somatica investigata pentru multe specii forestiere, inclusiv lemn de esență tare, precum plopi, sălcii și eucalypt și conifere precum molizi, Larice (Larix spp.), pini și [NUME_REDACTAT]. Ca și organogeneza, există un număr de etape pentru embriogeneza, care implică deschiderea țesutului embriogenetic, multiplicare, dezvoltarea și maturarea, germinarea și aclimatizare. Un avantaj important al embriogeneza este capacitatea de a menține sau de a stoca clone prin crioconservare.

2.5. Markerii moleculari și amprentarea genetică

În ultimul deceniu, dezvoltarea de markeri moleculari bazate direct pe polimorfisme de ADN a înlocuit în mare măsură allozymes pentru aplicațiile cele mai practice și științifice. Această înlocuire a fost accelerat prin dezvoltarea reacției de polimerizare în lanț (PCR) tehnica. Markeri moleculari vin in multe forme, fiecare cu o serie de beneficii și dezavantaje (Ritland și Ritland, 2000). Utilitatea acestor markeri moleculari și metodele analitice utilizate diferă în funcție de tipul de întrebare a cerut și natura markerilor (dominante vs co-dominant).

După 1990, la concurență cu analizele electroforetice ale marcherilor biochimici, s-au dezvoltat impetuos tehnicile de utilizare a marcherilor genetici moleculari ce pătrund în intimitatea structurii macromoleculei de ADN, secvențele fiind legate de un locus anume al materialului genetic (locus marcher).

Reacția de polimerizare în lanț (PCR – [NUME_REDACTAT] Reaction) reprezintă tehnica de multiplicare enzimatică in vitro a unei secvențe din macromolecula de ADN alcătuită din câteva perechi de nucleotide (oligonucleotide specifice – primeri – cu max. 20 de perechi de baze azotate). Enzima specifică acestei reacții este ADN-polimeraza, enzimă termostabilă (+95oC) și denumită Taq polimerază.

Reacția implică parcurgerea câtorva etape importante: denaturarea ADN-ului, fixarea inițiatorului (de la nivelul enzimei) și elongația catenelor. Cele 2 fragmente sunt apoi replicate de foarte multe ori (milioane de copii), pe parcursul mai multor cicluri, fiecare de câte 20-50 de ori. De fiecare dată se dublează numărul copiilor de fragmente, analiza acestora urmând să fie făcută electroforetic.

Această metodă (reacție) stă la baza tuturor celorlalte tehnici mai performante privind marcherii genetici moleculari.

Polimorfismul lungimii lanțurilor de restricție (RFLPs – [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]) este o tehnică extrem de performantă și de vârf în genetica moleculară, bazată pe hidroliza (digestia) ADN cu ajutorul unei enzime specifice acestei reacții (endonuclează de restricție). Polimorfismul este relevat după o „hibridare” a fragmentului de ADN, deja separat electroforetic, cu o „sondă” marcată cu izotopi radioactivi și transferarea ulterioară pe membrană (tehnica Southern).

Endonucleaza de restricție taie fragmentul din macromolecula ADN până la o secvență de bază de recunoaștere (4-8 perechi de baze azotate). Sunt deja identificate câteva sute de endonucleaze, fiecare cu specificitate proprie legată de recunoașterea secvenței de bază. Numărul și lungimea fragmentelor rezultate depind de numărul și distribuția siturilor de recunoaștere.

Comparativ cu izoenzimele, marcherii RFLP sunt cu mult mai numeroși și, prin aceasta, metoda deschide o arie de investigație mult mai largă în ceea ce privește analiza variabilității genetice în cadrul populațiilor naturale, chiar dacă această tehnică este mai laborioasă și mai costisitoare.

Amplificarea nedirijată de ADN polimorfic (RAPD – [NUME_REDACTAT] Polymorphic DNA) este o tehnică ce implică utilizarea unui inițiator (primer – oligonucleotid scurt ce include maximum 10 perechi de baze) ce poate începe amplificarea ca și în cazul tehnicii PCR. Amplificarea fragmentelor se face la întâmplare în cadrul unui genom, în urma, procesului rezultând cel puțin 10 astfel de fragmente de inițiere (așa-numitele amprente), după care are loc separarea electroforetică pe gel de agaroză sau poliacrilamidă. În final, secvențele rezultate în urma amplificării sunt colorate cu bromură de etidium și pot fi analizate în câmp de radiații UV.

Pe baza acestei tehnici se poate estima gradul de polimorfism existent într-o populație, analiza populației și chiar identificarea indivizilor.

Ca și în cazul RFLP, marcherii RAPD sunt marcheri dominanți și, în principiu, pot rezulta în număr nelimitat. În acest caz, însă, avantajul constă în faptul că nu se utilizează izotopi radioactivi și nu sunt necesari inițiatori (primeri) pentru fiecare specie. Din aceste motive, metoda utilizării marcherilor RADP este mai simplă, mai rapidă și mai puțin costisitoare ca cea a marcherilor RFLP.

Ca dezavantaj menționăm că această tehnică permite numai detectarea genelor dominante, nepermițând determinarea structurii genotipice a unei populații, pe ansamblu (AA, Aa, aa), mai ales în ceea ce privește proporția heterozigoților.

Microsateliții sunt secvențe ale macromoleculei de ADN rezultați în urma repetiției în tandem a unei secvențe simple din întregul genom. Sunt formați doar din două nucleotide, sunt foarte comuni și, totodată, polimorfici. Segmentul care încorporează microsatelitul poate fi replicat, iar lungimea acestuia se va determina electroforetic.

Microsateliții sunt microformațiuni de natură multialelică și codominantă, sunt foarte numeroși și bine repartizați în genom și au un înalt grad de polimorfism. Analiza lor poate fi ușor automatizabilă, nefiind necesară o mare cantitate de material și nici prezența de izotopi radioactivi. Ca dezavantaj ar fi doar faptul că la separarea electroforetică este necesară utilizarea unui gel cu un grad mare de rezoluție (din cauza separării unor fragmente foarte mici), ceea ce implică o mai mare atenție în pregătirea substratului și un cost mai ridicat al operațiunii.

Trebuie remarcat faptul că, prin analiza microsateliților, s-au putut descifra genomurile și stabili majoritatea hărților genetice, aceste microformațiuni constituind marcherii predilecți ai geneticii animale și umane. De asemenea, pe baza analizelor microsateliților, s-a putut efectua studiul complet al introgresiunii genetice între 2 specii forestiere foarte importante, respectiv stejarul și gorunul.

Principalele domenii de utilizare a marcherilor moleculari în ameliorare și conservare genetică sunt:

a) Cuantificarea diversității genetice

Utilizarea marcherilor biochimici și moleculari (izoenzime, produși de metabolism sau marcheri ADN) pentru determinarea gradului de variabilitate genetică în interiorul unei populații sau între populațiile de arbori constituie astăzi, în multe țări, o prioritate în activitățile complexe de evaluare și conservare a resurselor genetice forestiere. De menționat, totuși, că rezultatele acestor studii bazate pe utilizarea de marcheri genetici moleculari trebuie luate în calcul și interpretate cu prudență deoarece, nu de puține ori, s-a constatat un nivel scăzut privind corelația cu variabilitatea unor caractere legate de adaptabilitate, trăsături foarte importante în practica forestieră.

b) Verificarea genotipurilor

Marcherii moleculari sunt foarte mult utilizați în identificarea genotipurilor, în diferite studii taxonomice și biologice (care includ și tehnica „amprentelor” genetice). Este cert faptul că derularea cu succes a diferitelor programe de ameliorare și conservare forestieră presupune existența unei taxonomii clare. De asemenea, prin utilizarea marcherilor biochimici (studiul terpenelor), s-au înregistrat progrese remarcabile în ceea ce privește studiul de dispersie a semințelor sau de împrăștiere a polenului, aceasta pentru dezvoltarea și perfecționarea metodelor de polenizare dirijată (controlată).

Rezultatele diferitelor studii ce utilizează marcheri moleculari au o deosebită însemnătate practică în ceea ce privește reușita unor programe de ameliorare, cu precădere în practica amenajării și gestionării diferitelor populații de arbori sau livezi de semințe (constituite din clone sau răsaduri provenite de la arbori valoroși selecționați), cultivate pentru producții rapide și abundente de semințe de calitate superioară pentru reîmpăduriri.

c) Hărți genetice și selecția asistată de marcheri moleculari

Hărțile genetice de linkage se pot folosi pentru a localiza gene răspunzătoare de manifestarea unor caractere cantitative (QTL) cu un deosebit impact economic, precum producția de masă lemnoasă sau cantitatea de pastă. Detectarea QTL din genomul diferitelor specii forestiere presupune constituirea unor hărți genetice bazate pe consegregarea marcherilor (zone identificate prin marcare moleculară ADN) în încrucișări controlate (în generația a doua prin retroîncrucișare).

Studiul de perspectivă al selecției asistate de marcheri moleculari la speciile forestiere presupune, în principal, construirea unei rețele de marcheri polimorfici, repartizați relativ uniform în cromozomi, care să se constituie în hărți genetice.

CAPITOLUL III

ARGUMENTE ÎN FAVOAREA UTILIZĂRII PLANTELOR MODIFICATE GENETIC

3.1. Biosecuritatea alimentară

3.1.1. Rezistența la dăunători

Pierderile de recolte datorită pesticidelor pentru rezistența la insecte poate fi uimotoare, ca rezultat devastator pierderi financiare pentru agricultori și de foame în țările în curs de dezvoltare, fermierii de obicei folosesc mai multe tone de pesticide chimice anual. Consumatorii nu doresc să mănânce produse alimentare care au fost tratate cu pesticide din cauza potențialelor riscuri pentru sănătate, și deșeurile agricole din utilizarea excesivă a pesticidelor și a îngrășămintelor pot otrăvi sursele de alimentare cu apă și provoca daune pentru mediul înconjurător. Cultivarea alimente modificate genetic, cum ar fi B.t. porumb poate ajuta la eliminarea și aplicarea pesticidelor chimice și de a reduce costurile de a aduce o cultură de piață.

Folosirea plantelor transgenice cu rezistență la dăunători reprezintă peste un sfert din totalul cererilor pentru testarea în câmp. Cele mai importante gene candidat pentru crearea de plante modificate genetic rezistente la atacul de insecte sunt genele ce codifică proteinele cristaline insecticide de la Bacillus thuringiensis (gene cunoscute sub denumirea Bt) și cele ce codifică sinteza de inhibitori ai proteazelor (prezenți în numeroase specii de plante).

[NUME_REDACTAT] thuringiensis, genele ce codifică sinteza toxinei (endotoxină) sunt prezente în plasmide de dimensiuni mari. Există câteva variante ale genelor cry, produsul lor fiind toxic pentru un grup foarte specific de insecte. Endotoxinele se acumulează în bacterii sub forma de cristale ce conțin precursorii pentru adevărata toxină. Majoritatea speciilor de insecte sensibile au sucurile stomacale alcaline, care dizolvă cristalele; acestea au de asemenea enzime pentru conversia precursorilor toxinei în toxina activă.

Proteinele cristaline insecticide sunt o clasă de proteine produse de diferite tulpini de Bacillus thuringiensis (de exemplu var. kurstaki și var. tenebrionis), având efect toxic pentru grupe specifice de insecte dăunătoare. Ingerată de insecte, protoxina (aproximativ 130 kDa) este degradată proteolitic la peptida toxină matură (aproximativ 66 kDa), care se atașează de celulele epiteliale ale intestinului mijlociu, cauzând moartea acestora și scurgerea electroliților în hemocel. Aceasta are ca rezultat modificări fatale ale pH-ului și echilibrului ionic. Proteinele toxice codificate de genele cry sunt letale pentru mai mult de 100 de specii de insecte dăunătoare (lepidoptere, coleoptere, diptere), dar sunt inofensive pentru păianjeni, alte insecte, animale și oameni. În mediu, aceste proteine se degradează rapid și nu lasă reziduri toxice.

[NUME_REDACTAT], ai căror produși au efect letal asupra unor specii de Lepidoptere și Coleoptere, au fost transferate la peste 30 de specii de plante cultivate, unele cu importanță economică deosebită (porumbul, bumbacul, soia, cartoful, orezul, tomatele, vița de vie, tutunul, mărul, nucul, etc.).

Bacteriile din genul Streptomyces constituie o altă sursă de gene utilizabile pentru obținerea unor plante rezistente la atacul diferitelor specii de insecte. Astfel, gena ce codifică colesterol oxidaza (enzimă ce provoacă liza celulelor epiteliului intestinal) a fost utilizată pentru pentru obținerea de plante transgenice de bumbac rezistente la atacul de Anthonomus grandis, plante transgenice de porumb rezistente la atacul de Diabrotica undecimpunctata și plante transgenice de tutun rezistente la atacul de Heliothis virescens. Una dintre sursele de gene codificând proteine insecticide este bacteria Photorhabdus luminescens, prezentă în intestinele nematozilor entomofagi, care produce toxine cu efect letal asupra unei game largi de insecte aparținând mai multor ordine.

Plantele transgenice cu rezistență la boli și dăunători (aceasta fiind în fapt aplicația cea mai importantă pentru agricultură în viitorul apropiat) sunt considerate ca fiind o componentă majoră a agriculturii moderne, adică a unei agriculturi a cărei principală caracteristică este creșterea productivității în condițiile reducerii sau eliminării folosirii de substanțe chimice, cum sunt pesticidele. Evident, orice societate umană își dorește o agricultură care nu dăunează mediului și oferă produse mai sănătoase. Prin urmare, acesta ar fi un argument puternic pentru introducerea în cultură a plantelor modificate genetic. Nu este vorba însă numai de plante folosite ca hrană pentru om sau animale, ci și de plante folosite în alte scopuri, de exemplu în industria textilă, așa cum este cazul bumbacului. Pentru moment, o certitudine este creșterea an de an a numărului de specii de plante cultivate la care s-au obținut forme transgenice, multe dintre acestea aflându-se în faza testării în câmp sau fiind deja introduse în cultura comercială.

3.1.2. Rezistența la pesticide

Cifrele pe care le oferă statisticile arată că cultivarea plantelor modificate genetic prin introducerea genelor pentru rezistență la dăunători a determinat în anul 2002 reducerea cantității de pesticide folosite pentru controlul lor cu 22-23 milioane de kilograme. De exemplu, cultivarea soiului “Ingard” de bumbac modificat genetic, introdus în cultura comercială în Australia în anul 1996, a determinat reducerea cu 40-60% a tratamentelor cu pesticide pentru controlul dăunătorilor.

Unul dintre beneficiile majore pentru mediu folosind culturi modificate genetic este reducerea utilizării de pesticide. Bt-exprimarea culturi va reduce numărul de insecte dăunătoare ce se hrănesc pe aceste plante fără ca agricultorii să aplice mai multe insecticide.( Marvier M. și al. 2007 ), ( Brookes și al. 2008)

Peste 70% din vânzările de pesticide în SUA în 1997 au fost erbicide (Duke, 1998). Este, de asemenea, o mare piață pentru culturile transgenice, oferă reducerea nivelului de buruieni în culturi și pașuni cu succes. Recolte non-selective rezistente la erbicide (de exemplu, RoundupTM și LibertyTM) oferă cultivatorilor reducerea costurilor și controlul asupra buruienilor prin utilizarea de erbicide în cantități reduse.

Dezvoltarea de culturi modificate genetic cu rezistență la erbicide neselectiv, precum glifosat (RoundupTM) și glufosinat de amoniu (LibertyTM), a făcut posibilă utilizarea acestor erbicide într-o cultură în creștere. Anterior, beta-adrenoblocant erbicide ce ar putea fi utilizate numai atunci când o cultură este în curs de dezvoltare (ex. înainte de plantare sau după recoltare). Jumătate din 72 de milioane de acri de soia plantate în SUA în anul 1999 au fost plantate cu semințe rezistente genetic la erbicide pentru a spori controlul buruienilor (Abelson și Hines, 1999). Soia modificat genetic Roundup ReadyTM reduce cu 10-40 la sută necesarul de erbicid decât soia conventionala (Monsanto, 1999). În anul 1999, în SUA au fost plantate peste 63 de milioane de acri cu culturi transgenice, rezistente la erbicide, și peste 5 milioane de bumbac Breviar ([NUME_REDACTAT]) și 2.3 milioane de acri de porumb Breviar ([NUME_REDACTAT]) (Penn, 2000).

3.1.3. Rezistența la boli

Plantele sunt capabile să se apere de invazia patogenilor folosind diverse mecanisme, inclusiv prin intermediul propriilor produse chimice, enzime care degradează patogenii sau proteine ce stimulează ribozomii.

Transferul de gene de la o specie de plante la alta, pentru a-i spori rezistența la boli sau pentru a-i modifica propriul mecanism de apărare, a fost dezvoltat extensiv.

(Penn, 2000) enumeră 13 culturi care au fost modificate genetic pentru a deveni rezistentente la virus, de obicei, prin inserarea de gene care codifică componente ale virusului, cum ar fi proteine din membrană virusului.

Primul raport că plantele transgenice care conțin proteina virusului mozaicului tutunului (TMV) în membrană, au dezvoltat rezistență înpotriva bolilor, care datează din anul 1986 (Abel și al. 1986). Aceeași strategie a fost ulterior folosită pentru a crea rezistență la o serie de alte virusuri (Beachy și al. 1990). Utilizarea unei gene din virusul manioc (cassava) mozaic din Africa în plantele de Nicotiana benthamiana, a avut ca rezultat creșterea toleranței la virusul mozaicului african manioc (cassava), (Sangare și a. 1999). Maniocul (cassava) este planta ce se clasează pe locul trei în lume ca sursă de calorii, a fost modificată pentru a rezista împotriva virusului manioc (cassava) mozaic din Africa, utilizând o genă care secretă o enzimă care perturbă ciclul de viață al virusurilor patogenice.

Dacă aceste eforturi au succes în domeniu, randamentul de manioc (cassava) ar putea crește de 10 ori, la 80-100 tone pe hectar (Powell, 1999).

Semințe de papaya rezistente la virusul ringspot papaya s-au dezvoltat în comerț (Powell, 2000).

Ingineriea pentru rezistența la boli bacteriene a început, de asemenea să se dezvolte. De exemplu, transferul unei gene ce exprimă rezistență la bacteria patogenă Xanthomonas oryzae la orez a fost raportată de către (Song și al. 1995).

Rezistența la patogenii fungici a fost de asemenea un scop. (Penn, 2000) prezintă 19 culturi cu rezistență la fungi, proiectată și îmbunătațită in laboratoare. Spre exemplu (Thomzik și al. 1997) au creat roșii cu rezistență sporită la infestarea cu Phytophthora,specie ce aparține regnului fungi, transferând gene pentru fitoalexină, substanță ce conferă protecție impotriva infecțiilor patogene. Două gene pentru sinteza stilbenelor, ce catalizează sinteza fitoalexinei, au fost transferate din struguri roșiilor. (Tabei și al. 1998) au dezvoltat rezistența castravetelui la mucegaiul gri, utilizând gene chitinaze din orez. Enzimele chitinaze sunt sintetizate in mod normal de către plante drept răspuns la patogeni și au capacitatea de a degrada membrana celulelor fungice. Savanții organizatiei canadiene “Agri-food”au creat soia utilizând gene provenite din grâu, ce controleza producția de enzime oxidante, determinând rezistența plantei la mucegaiul alb. (Sclerotinia sp.) (Penn, 2000).

Anumite enzime derivate inhibitoare și lectine sunt promițătoare in ceea ce privește expresia transgenică a culturilor de plante, pentru controlul nematodelor. (Burrows et al., 1998). Au fost clonate două gene ce conferă rezistență la nematode,provenite din sfecla de zahăr și roșii. (Jung and Wyss, 1999). Expresia genetică a plantelor pentru rezistența la nematode este in curs de dezvoltare. Brevetul de cercetare (Jung și Wyss, 1999) dezvăluie numeroase preocupări in privința rezistenței la nematode.

Transferul genelor implică unele beneficii neașteptate. Spre exemplu, nucleele porumbului Bt prezintă un conținut redus de toxine fumonizine, în comparație cu porumbul natural (Munkvold, 1999). Acest fapt se datoreză gradului redus de infestare al porumbului Bt, ceea ce a determinat diminuarea infecțiilor ulterioare cu mucegai producător de fumonizine, inclusiv a infecțiilor cu Fusarium verticillioides și F. proliferatum.

3.1.4. Rezistența la frig

Înghețul neașteptat poate distruge răsaduri sensibile. O gena antigel de pește de apă rece a fost introdus în plante, cum ar fi tutunul și cartofi. Cu aceasta gena antigel, aceste plante sunt capabilile de a tolera temperaturi scăzute, care în mod normal le-ar ucide.

Tratamentul culturilor de soiuri convenționale, prin pulverizarea cu bacterii tranzgenice (antigel) pentru protejarea acestor culturi de înghețuri târzii.

Inserția unei gene provenite de la speciile din apele reci, cum ar fi spre exemplu o genă de la Hippoglossus hippoglossus (pește din [NUME_REDACTAT]) transferată la căpșuni. La tomate inserția unei gene care blochează galacturonaza enzima responsabilă de înmoierea fructelor.

3.1.5. Rezistența la secetă

Daca tot e secetă, trioul companiilor ce produc semințe modificate genetic – DuPont Pioneer, Monsanto si Syngenta – au scos pe piața semințe de porumb rezistent la secetă. Semințele au fost prezentate, săptămâna trecută, cu ocazia [NUME_REDACTAT] Progress de la Boone, Iowa, relatează USA Today. Nimic insă despre ce inseamnă OMG-urile pentru sănătatea si viitorul Planetei nu se pomenește însă in articol. Pentru ca, adevărul este că aceste organisme sunt de fapt niște ființe transgenice.

Ele se adaugă celor modificate genetic pentru a rezistă la daunători si ierburi. Cele rezistente la secetă – in SUA, 2012 a fost cel mai secetos din ultimii 24 de ani – au fost testate pe 4 hectare de teren din Texas, Oklahoma si Kansas. Productivitatea este mai mare cu 5 pana la 10% in locurile unde acestea au fost plantate.

Monsanto, care deține supremația in domeniul semințelor modificate genetic incepând cu anii ’90, a obținut deja aprobarea guvernului SUA pentru sortimentul lor denumit Droughtgard, in vreme ce mai asteaptă aprobarea guvernelor celorlalte țări pentru a le vinde în afara granițelor. DuPont si Syngenta, care se bazează pe tehnologia germplasm, nu au inca aprobarea de a iesi pe piață anul acesta. (USA Today, 2013)

3.1.6. Creștere rapidă

Numit AquAdvantage, este vorba de o specie de somon din Atlanticul de Nord, căruia i s-a adăugat o genă de la somonul Chinook, din Pacific, cu creștere mai rapidă și o specie de la un țipar de mare din Atlantic, care determină secreția hormonului de creștere, chiar și atunci când somonul modificat genetic se află în ape reci.AquAdvantage atinge greutatea de adult în 18 luni, în loc de 36.Administrația pentru Alimente și Medicamente din SUA (FDA) a hotărât în 2010 că acest pește modificat genetic este sigur pentru consumul uman, iar in 2012 că nu prezintă nici o amenințare pentru mediu. Cum ultimele formalități sunt în curs de desfășurare, firma AquaBounty preconizează că își va putea vinde produsul începând cu anul 2014. ([NUME_REDACTAT] 2014)

3.2. Utilizări pentru sănătatea umană

Utilizarea organismelor modificate genetic în domeniul medicinii reprezintă o contribuție extrem de importantă în procesul de descoperire și dezvoltare a unor noi remedii sau medicamente folosite pentru tratarea diferitelor tipuri de boli. Cele mai multe boli umane de la cancer la demență, sunt parțial cauzate de genotipul fiecărui organism, iar peste 10000 de boli sunt cauzate de disfuncționalitatea unei singure gene (***8, 2014). OMG-urile pot ajuta pe cercetători să înțeleagă modul de funcționare a genelor umane și animale, și permit cercetătorilor să înțeleagă mai bine rolul genelor în apariția stării de boală. Folosirea de OMG în cercetarea medicală este fundamentală pentru dezvoltarea de noi modalități de a trata bolile, a crea vaccinuri, anticorpi, precum și pentru dezvoltarea și fabricarea produselor farmaceutice. Exempl ale utilizării OMG: producerea de insulină folosind ingineria genetică și nu metoda inițială de extragere a acesteia din pancreasul animalelor; obținerea hormonului de creștere uman și a somatostatinei o proteină care simulează formarea de celule rosii din sânge; obținerea de organe pentru realizarea transplantelor; identificarea genelor responsabile de producerea alergiilor etc.

3.3. Utilizări pentru protejarea mediului

Se poate obține o cantitate mai mare de hrană de pe o suprafață mai mică de teren cultivat. Posibilitatea utilizării terenurilor degradate prin cultivarea plantelor rezistente spre exemplu la salinizare, metale grele sau produse petroliere. Utilizarea OMG contribuie la creșterea potențialului energetic prin obținerea unor cantități mai mari de biomasă (biocombustibili). Impactul asupra pădurilor naturale va scădea ca urmare a creșterii productivității pădurilor obținute prin plantarea de arbori transgenici. Agricultura convențională a avut un impact major asupra ecosistemelor acvatice sau a resurselor de apă potabilă. Sunt extrem de răspândute cazurile de poluare cu nitriți, nitrați, pesticide sau impactul irigării terenurilor pe scară largă. Susținătorii OMG afirmă că aceste aspecte se vor diminua ca urmare a utilizării plantelor transgenice rezistente la secetă, poluanți sau pesticide.

3.4. Utilizări pentru conservarea biodiversității

Alimentele modificate genetic au un aspect mai atrăgător, cantitatea de alimente produse va crește foarte mult, putând fi utilizate la eradicarea sărăciei și foametei, fapt ce va duce la scăderea presiunii exercitate de acestea supra resurselor naturale și implicit asupra biodiversității. Prin modificare genetică se pot obține organisme care nu dispun de potențial invaziv.

3.5. Alte argumente

Sporirea veniturilor comercianților ca urmare a creșterii cantității de produse vândute/cumpărate; înmulțirea OMG este mult mai predictibilă ca urmare a transferului de gene; accelerarea obținerii genotipurilor dorite comparativ cu metodele tradiționale utilizate în ameliorare etc.

CAPITOLUL IV

ARGUMENTE ÎN DEFAVOAREA UTILIZĂRII

PLANTELOR MODIFICATE GENETIC

4.1. Impactul asupra organismului uman

OMG-urile reprezintă o realitate a societății moderne aflate în continuă dezvoltare. Indiferent de motivele pentru care acestea au fost create și comercializate, transgeneza poate revoluționa multe domenii ale științei, agriculturii, industriei sau medicinei. Nu trebuie însă ignorat faptul că utilizarea OMG-urilor prezintă și un potențial factor de risc pentru mediul înconjurător, pentru cel economico-social și pentru sănătatea consumatorilor.

Utilizarea judicioasă a acestor organisme poate determina sporirea profiturilor, reducerea inputurilor sau o mai bună satisfacere a necesarului de hrană. Cele mai aprinse dezbateri pe marginea OMG-urilor au însă ca punct de plecare tocmai acest domeniu – aplicațiile în agricultură – existând o serie de păreri extreme, atât printre susținători, dar mai ales printre opozanții tehnologiei. Considerăm aceste atitudini ca fiind eronate și contraproductive. Soluția optimă necesită în primul rând evaluarea și punerea în balanță a riscurilor și beneficiilor asociate PMG-urilor, iar utilizarea lor ulterioară trebuie să se împletească cu a celorlalte tehnologii, fie tradiționale, moderne, intensive sau organice.

Studiind literatura de specialitate, se poate observa că majoritatea situațiilor în care utilizarea PMG-urilor a prezentat neajunsuri, nu au fost condiționate de proprietățile transgenice, ci s-au datorat unor cauze de natură agrotehnică determinate de factorul uman. De asemenea, dorim să accentuăm faptul că, de multe ori, PMG-urile sunt utilizate ca elemete ale retoricii discursului direcționat înspre atingerea unor obiective economice sau sociale, pierzându-și în majoritatea cazurilor substratul și fundamentarea științifică.
În urma discuțiilor teoretice care au acoperit o arie largă de aspecte privind sănătatea omului în legătură cu OMG principalele probleme luate în dezbatere sunt: alergenicitatea, transferul genetic și transferul natural al genelor transferate arificial, la celelalte culturi.

– alergenicitatea: nu au fost evidențiate efecte alergice legate de alimentele noi modificate genetic până în prezent.

– transferul de gene din alimentele noi modificate genetic în organizmul uman sau la bacterii aflate în intestinul uman: Acest subiect este important în deosebi pentru genele care induc rezistență la substanțele chimice, în acest caz, la antibiotice dacă transferul de gene ar fi posibil. Cu toate că probabilitatea acestui transfer este foarte mică, experții Fondului pentru Alimentație și Agricultură (FAO) și experții [NUME_REDACTAT] ai Sănătăți au recomandat neutilizarea proceselor de transfer al genelor de rezistență la antibiotice la noile organisme modificate genetic (OMG).

– transferul natural în culturi și amestecarea semințelor provenite din culturile naturale, cu cele din transfer genetic, ar putea afecta siguranța alimentelor. Acest risc este real și a fost demonstrat atunci când, urme de orez aprobat a fi ultilizat doar pentru nutrețuri, au fost decelate în produse de orez pentru consum uman obținute din culturi care nu erau modificate genetic în mod voluntar, în SUA. S-au adoptat strategii naționale pentru reducerea mixarii, prin separarea clară a perimetrelor culturi (orgaminsme modificate genetic și culturile convenționale).

În acest moment se pun la punct la nivel mondial detaliile pentru monitorizarea și punerea pe piață a organismelor modificate genetic și alimentelor noi modificate genetic. Cele mai recente studii demonstrează că produsele modificate genetic afectează sănătatea mamiferelor. Porumbul modificat genetic MON863 al companiei Monsanto, aprobat pentru consum uman pe piata [NUME_REDACTAT], a cauzat serioase modificari la nivelul ficatului si rinichilor cobailor care l-au consumat în timpul unui studiu stiințific.Studiul a fost realizat de cercetatorul francez [NUME_REDACTAT] Serralini și publicat în martie 2007.

4.1.1. Capacitate alergenă a hranei provenită din OMG

[NUME_REDACTAT] (1991), reacțiile alergice sunt răspunsuri de adaptare si de apărare a organismului la proteina toxica. La persoanele sensibile reacția alergică poate fi provocata chiar si de o doza infima de alergen. Este foarte greu de stabilit individual doza minimă declanșatoare. Totuși consecințele reacției alergice depind de cantitatea ingerată de alergen, astfel gravitatea depindede doză .

Alergiile alimentare sunt foarte frecvente în toate tarile dezvoltate și afectează în medie 3-4% din populația adultă și până la 8% copii. Alergiile alimentare sunt bazate pe reacții imunologice, spre deosebire de intoleranța alimentară, definită ca reacție non-imunolgică (Bargmann et al. 1992, Klein 1991).

Experții FAO/WHO (FAO/WHO 2001) au stabilit un protocol de evaluare al potențialului alergizant al alimentelor MG. Protocolul este aplicabil pentru alimentele care conțin gene derivate atât din surse cunoscute, ca fiind alergice, cât și din surse care nu au prezentat pericol alergic.

Grupul de experți oricum, și-a exprimat dezacordul privind transferul genelor din alimentele-alergeni, excepție făcând doar cazurile în care a fost demonstrată lipsa capacităților alergizante al proteinelor rezultate în urma transferului de gene.

Aceste principii au fost aplicate de numeroase agenții pentru evaluarea siguranței alimentelor MG și au servit ca bază pentru Ghidul privind estimarea securității alimentelor produse prin biotehnologii ([NUME_REDACTAT] Commission. Guidelines for the safety assessment of foods derived from biotechnology [CAC 2003c,d]).

Pe parcursul ultimilor ani, savanții si comunitățile medicale devin tot mai neliniștiți în privința creșterii incidenței alergiilor provocate de plantele MG. Datorită faptului că alimentele MG conțin proteine de la alte organisme ale căror gene le-au fost transferate, reacțiile alergice cauzate de acestea sunt considerate ca principalul pericol pentru sănătatea omului.

În primul rând, modificările genetice pot crea în plante schimbări, care rezultă în expresia unui nou alergen sau în creșterea expresiei alergenilor en-dogeni. Drept exemplu poate servi alergenul din alunele de Brazilia în soia MG.

Soia este o importantă sursă de proteine în dieta omului și a animalelor, dar este săracă în metionină. Pentru a îmbunătăți calitățile ei nutriționale, cercetătorii de la [NUME_REDACTAT]-[NUME_REDACTAT] au creat soia mG, care produce o proteină bogată în metionină, a cărei genă a fost preluată de la alunele de Brazilia (alunele de Brazilia conțin 18% metionină). Datorita faptului, că alunele de Brazilia sunt cunoscute ca alergeni, s-au făcut investigații în privința proprietăților alergizante a soiei MG. Drept rezultat, s-a determinat că persoanele alergice la alunele de Brazilia, dezvolta reacții alergice si la soia MG, din care cauza a fost sistată producerea acesteia.

În 2004, a apărut informația despre îmbolnăvirea fermierilor din Filipine. Aceștia locuiau în apropierea câmpurilor semănate cu soiul transgenic de Btporumb (Dekalb 818 YG). Manifestarea simptomelor coincidea cu perioada de înflorire și de răspândire a polenului. Porumbul a fost modificat genetic pentru a produce insecticidul Bt-toxina Cry1Ab toxica pentru viermele sfredelitor al porumbului.

Simptomele prezentate se refereau la sistemul respirator (strănut, tuse alergică, până la astm ș.a.), tractul digestiv și tegumente, de asemenea era prezentă febra. Simptomele respective dispăreau odată cu plecarea în alte raioane ale țării și reapăreau la întoarcere. Pentru început, s-a presupus că este vorba de o boală infecțioasă, dar în urma diferitor cercetări, această presupunerea fost infirmată.

4.1.2. Rezistența la antibiotice

Antibioticele sunt substanțe care distrug bacteriile sau le opresc înmulțirea.Ele sunt anticorpi naturali, produși de anumite mucegaiuri, pentru a combate bacteriile − competitorii acestora.

Unele specii de bacterii „au învățat” să dezactiveze antibioticele, ele având gene care le fac rezistente la acestea. Gena rezistenței la antibiotice este o genă care codează enzima responsabilă de degradarea antibioticului specific până la bioproduși inofensivi, protejând astfel bacteria.

Răspândirea genelor rezistenței la antibiotice este rezultatul selecției clonelor rezistente la prezența antibioticului și transmiterii active intergeneticea genelor rezistente (transferul genetic pe orizontală), Mazodier și Davies, 1991; Lorenz și Wackernagel, 1994. Este recunoscut faptul că utilizarea largă a antibioticelor în tratamentul oamenilor și animalelor, de asemenea utilizarea lor ca aditivi alimentari în hrana pentru animale pe parcursul ultimelor decenii, a contribuit la creșterea frecvenței genelor rezistenței la antibiotice labacterii.

Este știut faptul că genele rezistenței la antibiotice au apărut cu milioane de ani în urmă, pe parcursul evoluției bacteriilor, ca rezultat al necesității microorganismelor producătoare de antibiotice de a se autoproteja împotriva propriilor toxine (Davies, 1994) și al coexistenței bacteriilor solului cu diverse microorganisme producătoare de antibiotice.

Genele rezistenței la antibiotice sunt utilizate în crearea plantelor MG în calitate de markeri. Aceștia au fost utilizați în timpul procesului de transformare/ selecție pentru obținerea marii majorități a plantelor modificate genetic.

Pentru a depista în stadiile timpurii de dezvoltare a plantei MG dacă a avut loc modificarea dorită , specialiștii introduc pe lângă gena dorită și gena rezistenței la antibiotic, adică markerul. Markerul funcționează conform principiului toxină-antidot. Astfel, celulele care au fost modificate cu succes prin ingineria genetică nu vor muri la acțiunea antibioticului, ceea ce demonstrează și inserția calitativă a celeilalte gene (dorite). Așadar, deoarece modificarea genetică este destul de inexactă, geneticienii folosesc gena-marker pentru a stabili dacă inserția genelor a reușit.

Cea mai mare îngrijorare în legătură cu folosirea markerilor este diminuarea eficacității terapiei cu antibiotice la om și la animale. OMS in 2013 aavertizat că oamenii manifestă deja rezistență la diferite antibiotice, ceea ce îi face mai vulnerabili la maladiile severe.

4.1.3. Producerea de pesticide naturale

O nouă posibilitate de a lupta cu insectele dăunătoare este folosirea virusului Baculovirus, care le afectează în mod natural. Acesta infectează doar insectele și are un potențial biopesticid din cauză ca acționează doar asupra nevertebratelor (artropodelor), poseda specificitate și cauzează moartea anumitor insecte-țintă (Carstens,1996). Baculovirusul acționează încet, având nevoie de 5-14 zile pentru a distruge insecta si are o virulența moderată. Perioada lungă de activare sugerează ca insectele pot aduce daune considerabile plantelor în acest timp. În plus, producerea baculovirusului este mai costisitoare decât producere pesticidelor chimice. Dar întrucât tendința de baza în prezent este de a le abandona și întrucât creste și rezistenta vătămătorilor la ele, producerea agenților benigni (biopesticidele) devine un obiectiv de bază.

Astfel, în prezent, cercetătorii au demonstrat metode ale ingineriei genetice cu ajutorul cărora au accelerat activitatea virusului. Prin incorporarea hormonilor, care afectează viabilitatea insectei se obține scăderea apetitului sau accelerarea metamorfozei și insecta moare mai repede. De exemplu, baculvirusul MG, care conține hormonul Hez-HK-II (Suszkiw, 1998) provoacă dereglări grave în metabolismul larvei. Aceasta încetează sa mănânce și în 2 zile moare. Baculovirusul este distrus momentan de razele solare.

4.2. Impactul asupra ecosistemelor naturale

Odată eliberate in mediu, fie ca sunt culturi de testare, fie comerciale, plantele modificate genetic nu pot fi controlate pentru că acestea interacționează in mod liber cu intregul ecosistem. Culturile convenționale sau ecologice din jur pot fi impurificate prin polenizare, datorită vântului sau insectelor. De asemenea întreaga biodiversitate are de suferit de pe urma culturilor modificate genetic rezistente la insecte si erbicide. Multe insecte care se hrănesc in mod natural cu daunătorii plantelor de cultură suferă si chiar mor dacă consumă daunători de pe plante modificate genetic. Asa este cazul buburuzelor care se hrănesc cu păduchi de frunză. Au apărut deja buruieni rezistente la erbicidele neselective cu care sunt tratate plantele modificate genetic. OMG se pot reproduce și încrucisa cu organisme din mediul natural, rezultând astfel organisme noi, într-un mod necontrolat și imprevizibil.

La nivel mondial se desfăsoară analize de risc privind impactul organismelor modificate genetic asupra ecosistemelor naturale. Procesul de analiză a riscului include evaluarea caracteristicilor organismelor modificate genetic (OMG), efectele și stabilitatea sa în mediu, combinate cu caracteristicile ecologice ale mediului în care va fi introdus acest OMG. Analiza are în vedere și efecte neașteptate, ce ar putea rezulta în urma procesului de inserție genetică.

4.2.1. Reducerea diversității speciilor

Genele introduse pentru a face culturile toxice pentru anumite insecte dăunătoare pot ucide alte insecte benefice. Acest lucru ar putea conduce la o reducere a diversității faunei sălbatice în zonele afectate și,eventual, chiar la dispariția unor specii vulnerabile.
Efecte dăunătoare asupra dinamicii populației de specii în mediul gazdă și asupra diversității genetice a fiecăreia dintre aceste populații; plantele modificate genetic sunt specii exotice, capabile să pună stăpânire pe noi teritorii, eliminând alte culturi și creând supergândaci și superburuieni, care obligă la folosirea a și mai multe chimicale toxice. Plantele modificate genetic pot poleniza încrucișat cu plantele culturilor similare, fenomen care a provocat deja distrugerea multor ferme organice, ale căror standarde nu permit folosirea semințelor modificate genetic.

4.2.2. Persistența genei modificate în mediu

Acest fenomen este unul din cele mai frecvente și severe critici și nemulțumiri care se aduc cultivării plantelor modificate genetic.

Există multe discuții despre posibilul transfer de gene, neprogramat, de la culturile GM la flora salbatică sau tradițională și consecințele acestui transfer. În cazul plantelor care se înmulțesc sexuat există două condiții care trebuie îndeplinite pentru ca un astfel de transfer să se poată produce:

– polenul să fie transferat de la o plantă pe receptorii de polen de la altă plantă într-un timp optim;

– plantele să fie din aceeași specie sau din două specii sexual compatibile.

Un alt factor ce trebuie luat în considerare este polenizarea prin intermediul insectelor (albinele și alte insecte) care pot transporta polenul la receptorii plantelor la distanțe de mai mulți kilometri, încât există posibilitățile transferului de gene, la un nivel scăzut, pe o arie largă și acestea nu pot fi neglijate.

Acest foarte redus nivel de transfer, prin polenizarea încrucișată, nu a prezentat niciodată o problemă în producția de sămânță de înaltă puritate a soiurilor de culturi, sezon după sezon. În practică, posibilitatea de răspândire de gene între plante este foarte limitată datorită caracteristicilor de specie, a distanțelor între plante, a distanțelor între tarlale (200 m pentru porumb ar fi suficient pentru asigurarea purității semințelor).(ABE 2002)

4.2.3. Efecte asupra organismelor nemodificate genetic

De exemplu, cultivarea rapiței tolerante la erbicid pe scară largă, în apropiere de o altă tarla cu cultură non-GM, fără măsuri specifice de siguranță, va duce la un nivel foarte redus de polenizare încrucișată cu efecte nesemnificative pentru mediu, pozitiv sau negativ. Polenizarea culturii de rapiță vecină se va face la nivelul de sub 1%, la marginea tarlalei și la un nivel și mai scăzut la mijlocul tarlalei. Dacă se va trata prima cultură cu ierbicidul specific, atunci în anul următor plantele rezistente la erbicid vor supraviețui, iar fermierul va trebui să le îndepărteze mecanic sau manual.(ABE 2002 )

Practic însă este mult mai simplu să le elimine folosind un alt erbicid în cadrul rotației culturilor.

Desigur, situația nu este valabilă la toate culturile, dar reglementările autorităților nu permit cultivarea plantelor GM fără respectarea strictă a normelor de siguranță, în cadrul strict delimitat al principiilor coexistenței.

Acest aspect va fi pe larg abordat într-un capitol dedicat așa numitei situații de coexistență. Pe de altă parte, există deja plante „convenționale” pentru care polenizarea încrucișată este evitată, iar știința a dezvoltat deja plante GM care nu-și pot transfera genele la plantele înrudite pentru că acestea (genele) nu apar în polen. Aceasta este absolut vital dacă unele culturi se folosesc la producerea de vaccinuri sau alte produse importante iar culturile respective sunt cultivate în câmp deschis.

Un bun exemplu și actual, în sensul celor arătate, este revelator prin aceea că cercetătorii germani au comunicat producerea unui soi nou de tomate modificate genetic „sigure” în sensul că tehnica folosită la obținerea lor previne trecerea genelor la alte plante, convenționale, pentru că genele de interes nu s-au introdus în ADN-ul nuclear al plantei ci în ADN-ul din cloroplaste, care nu se transmite în polen și elimină posibilitatea „contaminării” mediului cu genele transferate.( [NUME_REDACTAT] BBC )

4.2.4. Utilizarea excesivă a pesticidelor

Monsanto a promovat plantele sale de soia MG ca fiind ușor de cultivat și necesitând un consum scăzut de pesticide. Dar amândouă afirmațiile s-au dovedit a fi inexacte la doar 5 ani dupa aceea. Eficacitatea stropirilor cu Roundup este scăzută și duce la apariția de buruieni rezistente la erbicid. Cultivatorii au încercat să elimine această problemă prin folosirea unor cantități mai mari de pesticid, astfel încât, spre exemplu, cantitatea de glifosat folosită în [NUME_REDACTAT] a crescut considerabil (BENBROOK 2004). La fel s-a întamplat și cu folosirea de amestecuri de pesticide, facând astfel din ce în ce mai dificilă ținerea sub control a apariției de plante cu rezistență multiplă. S-a dovedit astfel ca, în timp, cantitățile de pesticid folosite au crescut o dată cu costurile suportate de cultivatori și cu riscurile asumate în ceea ce priveste răspândirea acestor substanțe în mediu.

În analiza sa foarte bine documentată asupra datelor furnizate de catre Departamentul de Agricultura al [NUME_REDACTAT] privind folosirea pesticidelor, dr. [NUME_REDACTAT] (BENBROOK 2004), unul dintre principalii experți în domeniul cultivării plantelor modificate genetic, a concluzionat ca soia, porumbul și bumbacul modificate genetic au dus la cresterea consumului de pesticide cu 122 milioane de livre începând din 1996 o data cu marirea considerabilă a suprafețelor cultivate cu plante tolerante la erbicide și cu scăderea modestă a suprafetelor cultivate cu tipul de plante Bt.

4.2.5. Modificarea spectrului de patogeni

Principalul mecanism de evoluție naturală a virusurilor îl constituie recombinările secvențelor genetice. De aceea, unii cercetatori au lansat ideea unei posibile recombinări între gena virala cp, prezentă într-o anumită plantă, cu gene ale unui virus înrudit care a infectat o plantă rezistentă sau care se afla în mod natural în aceasta. Astfel de recombinari au fost deja observate experimental în laborator, fară a se fi putut determina dacă noul virus ar fi mai mult sau mai puțin patogen decât virusul parental. Marele necunoscut este reprezentat, desigur, de frecvența cu care aceste recombinări s-ar produce în natură, mai ales în vastele culturi transgenice, unde sunt prezente numeroase gene virale.

În anul 1999, o serie de cercetări arată ca infectiile virale erau frecvente în populațiile de Brassica napus: peste jumatate din eșantioanele examinate conțineau mai mult de un tip de virus, și în aceste condiții par justificate îngrijorările generate de apariția posibilă a unor noi virusuri dăunătoare plantelor.

CAPITOLUL V

LEGISLAȚIE EXISTENTĂ LA NIVEL EUROPEAN PRIVIND ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC

Introducerea deliberată în mediu, cultivarea, schimburile transfrontaliere și utilizarea

în alimentație a OMG-urilor sunt reglementate la nivelul UE de un set de proceduri stricte ce alcătuiesc un larg cadru legislativ (Mazzara și al., 2008). Primele acte normative Comunitare,elaborate în 1990, cu scopul de a proteja sănătatea oamenilor, a animalelor și mediul, au fost [NUME_REDACTAT] 90/219/CEE și [NUME_REDACTAT] 90/220/CEE (Querci et al., 2004a).

În prezent, în cadrul UE, principalul instrument legal orizontal de reglementare în domeniul biotehnologiilor este Directiva 2001/18/CE a [NUME_REDACTAT] și a Consiliului din 12 martie 2001 referitoare la introducerea deliberată în mediu a OMGurilor. Aceasta abrogă [NUME_REDACTAT] 90/220/CEE și întărește reglementările existentere feritoare la introducerea în mediu a OMG-urilor, aducând totodată o serie de principii noi, a căror implementare este obligatorie: evaluarea riscului (risk assessment) asupra mediului șisănătății, informarea cetățenilor, etichetarea (labelling) și trasabilitatea (traceability) în toate etapele plasării pe piață, monitorizarea post-market (post-marketmonitoring). [NUME_REDACTAT] este acela de a proteja sănătatea oamenilor și mediul înconjurător, din perspectiva utilizării deliberate a PMG-urilor, precum și asigurarea coexistenței, la toate nivelurile, a produselor derivate din biotehnologii cu cele Convenționale. Se pun de asemenea bazele întocmirii unui registru unic de evidență moleculară.

Directiva 2001/18/CE, implementată în fiecare stat membru prin acte normative naționale, face referire, atât la experiențele în câmp, la scară mică (i.e. introducere voluntară în scopuri experimentale) (secțiunea B a Directivei), cât și la comercializarea OMG-urilor (secțiunea C a Directivei). Totodată, autorizațiile deja existente conform [NUME_REDACTAT] 90/220/CE sunt valabile până la expirarea perioadei pentru care au fost acordate, putând fi apoi înnoite, conform noii legislații. Acordarea autorizației se face pentru o perioadă de maxim zece ani începând cu data la care este emisă, putând fi înnoită. Amintim că situația proceselor de autorizare a OMG-urilor pentru comercializare în cadrul UE poate fi consultată pe site-ul [NUME_REDACTAT] sau pe site-ul GMO Compass (vezi [NUME_REDACTAT], 2009, GMO Compass, 2009).

Pe lângă directivele deja menționate, au fost elaborate și implementate o serie de instrumente legale verticale care introduc norme specifice privitoare la aprobarea și utilizarea în siguranță a PMG-urilor destinate consumului. Astfel, plasarea pe piața comunitară a alimentelor și ingredientelor alimentare noi, a fost reglementată inițial prin Regulamentul 258/97, ulterior fiind adoptat Regulamentul 1139/98, act normativ care a introdus un model de etichetare pentru produsele alimentare derivate din OMG-uri. Regulamentul 1139/98 a fost amendat de așa-numitul „regulament al pragului limită” –Regulamentul 49/2000 – care aborda problema contaminării accidentale. Aceasta făcea obligatorie etichetarea produselor al căror conținut MG, la nivel de ingredient, depășea pragul de 1%. Pentru a întări caracterul accidental al prezenței OMG-urilor, operatorii aveau și obligativitatea de a prezenta dovezi care să ateste adoptarea măsurilor de evitarea contaminării.

Treptat, s-a făcut simțită nevoia adoptării unor acte normative complete, unificate și aduse la zi. În cele din urmă, în octombrie 2003, două noi Regulamente au fost publicate, amendând sau înlocuind legislația deja existentă în domeniu. Acestea sunt:

 Regulamentul 1829/2003 al [NUME_REDACTAT] și al Consiliului din 22

septembrie 2003 privind produsele alimentare și furajele MG;

 Regulamentul 1830/2003 al [NUME_REDACTAT] și al Consiliului din 22

septembrie 2003 privind trasabilitatea și etichetarea OMG-urilor și

trasabilitatea alimentelor destinate alimentației umane sau animale, produse

din OMG-uri, și de modificare a Directivei 2001/18/CE.

Cele două regulamente, intrate în vigoare din 18 aprilie 2004, introduc, ca elemente principale, reglementări referitoare la etichetare, trasabilitate și autorizarea evenimentelor de transformare pentru comercializare. Tot în aprilie 2004 a fost adoptat și Regulamentul 641/2004 care face referire la normele de aplicare a Regulamentului 1829/2003 în ceea ce privește cererea de autorizare a noilor produse alimentare și a noilor furaje MG, notificarea produselor existente și prezența întâmplătoare sau tehnic inevitabilă a material MG care a făcut obiectul unei evaluări de risc și a obținut un aviz favorabil.

UE recunoaște dreptul consumatorilor la informare și etichetare, ca un instrument ce facilitează luarea deciziilor informate/conștiente, Regulamentul 1830/2003 întărind prevederile referitoare la aceste aspecte. Obligativitatea de etichetare a fost extinsă pentru toate alimentele și furajele care consistă, conțin sau au fost obținute din OMG-uri, chiar dacă detecția materialului MG nu este posibilă în produsul final. Se introduce în acest fel conceptul de trasabilitate, ceea ce înseamnă abilitatea de a identifica OMG-urile și produsel derivate, precum și sursa acestora în toate etapele plasării pe piață, prin intermediul rețelelor de producție și distribuție. Conceptul de trasabilitate presupune, dacă este cazul, înlocuirea dovezilor analitice produse de metodele de testare cu înregistrările efectuate de-a lungul lanțului de aprovizionare (GMO Compass, 2007).

Regulamentul 1829/2003 definește și un nou prag limită pentru etichetatarea OMG-urilor autorizate, respectiv 0,9%, la nivel de ingredient, cu condiția ca această prezență să fie accidentală sau tehnic inevitabilă. Tot aici, precum și Anexa I a Regulamentului 641/2004, se stipulează obligativitatea aplicantului de a pune la dispoziție, în cadrul dosarului pentru obținerea autorizației, o metodologie validată de detecție și cuantificare a evenimentului de transformare, precum și materiale de referință corespunzătoare. În cadrul procedurii de autorizare, dosarul este evaluat de [NUME_REDACTAT] pentru [NUME_REDACTAT] ([NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]/EFSA; http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_home.htm ), iar metodele de testare vor fi evaluate și validate de către [NUME_REDACTAT] de Referință pentru Alimente și [NUME_REDACTAT] Genetic ([NUME_REDACTAT] Laboratory for [NUME_REDACTAT] Food and Feed/CRL-GMFF; http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/) (CRL-GMFF, 2009a). CRL-GMFF reprezintă un alt element introdus de noua legislație în domeniul OMG. În contextul Regulamentului 1829/2003, [NUME_REDACTAT] de Cercetare (al Comisiei) ([NUME_REDACTAT] Centre/JRC; http://ec.europa.eu/dgs/jrc/index.cfm ) asistat de [NUME_REDACTAT] de Laboratoare OMG ([NUME_REDACTAT] of GMO Laboratories/ENGL; http://engl.jrc.ec.europa.eu/ ), a fost numit Laborator de [NUME_REDACTAT] pentru Alimente și [NUME_REDACTAT] Genetic, având rolul de a evalua și valida metodele de testare (Regulamentul 1981/2006), astfel încât aceastea să corespundă normelor în vigoare și să poată reprezenta instrumente pentru punerea în aplicare a legislației referitoare la OMG-uri. Procesele de evaluare și testare menționate anterior sunt cele incluse în procedura de autorizare de către [NUME_REDACTAT] a comercializării OMG (Regulamentul 1829/2003).

Conducerea GMO-CRL a fost atribuită Unității pentru [NUME_REDACTAT] și Genomică ([NUME_REDACTAT] and [NUME_REDACTAT]/MBG) (MBG, 2009) a Institutului pentru Sănătate și [NUME_REDACTAT] (Institute for Health and [NUME_REDACTAT]/IHCP, JRC-Ispra; http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/ ) din cadrul JRC, cea care a propus și promovat, încă din 1999, formarea unei rețele de laboratoare de control care să asigure implementarea și respectarea legislației aferente OMG-urilor și problematicii acestora (CRL-GMFF, 2009c).

[NUME_REDACTAT] de Laboratoare OMG a fost inaugurată oficial în decembrie 2002 și cuprinde în prezent peste 100 de laboratoare repartizate în cele 27 de state membre UE, precum și în Norvegia și Elveția. Activitatea ENGL are ca scop crearea unei platforme unice pentru experții implicați în eșantionarea, detecția, identificarea și cuantificarea OMG-urilor din semințele și produsele agricole utilizate ca material semincer sau ca materie primă, din alimente și furaje, precum și din mediul înconjurător.

Scopul acestei platforme este de a veni în sprijinul activităților CRL-GMFF (ENGL, 2009).

Cele mai importante aspecte tehnice luate în considerare în cadrul activității ENGL sunt (Querci et al., 2004a):

crearea metodelor de analiză calitativă și cantitativă;

transferul tehnologic;

instruirea și acordarea asistenței pentru dezvoltare;

validarea și expertizarea metodelor screening pentru diferite matrici

alimentare sau a metodelor de estimare a conținutului OMG;

punerea la dispoziție a materialelor de referință;

optimizarea strategiilor și procedeelor de eșantionare pentru diferite bunuri

de larg consum care pot conține OMG-uri;

crearea unor baze de date și instrumente pentru bioinformatică.

Conform legislației, metodele analitice trebuie să fie accesibile, eficiente, precise și versatile. Activitatea de cercetare are deci menirea de a asigura elaborarea unor strategii și metode analitice armonizate și standardizate la nivelul tuturor laboratoarelor de testare OMG din UE, necesitatea acestor proceduri fiind menționată de JRC ca element esențial pentru asigurarea succesului funcționării legislației în domeniu.

O altă instituție europeană importantă pentru domeniul OMG-urilor este Institutul pentru Materiale de Referință și Măsurători (Institute for [NUME_REDACTAT] and Measurements/IRMM, JRC-Geel; http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/homepage.htm ), însărcinat cu producerea materialelor de referință certificate (MRC), necesare desfășurării activitățlor de testare OMG.

Site-ul EUR-Lex (http://eur-lex.europa.eu/ro/index.htm ) oferă acces direct gratuitla legislația UE.

În ceea ce privește țara noastră, armonizarea legislației naționale în domeniul OMG-urilor cu cea europeană a fost inițiată cu mult înainte de momentul aderării, situație remarcată și de Cionga (2005), care sublinia dorința autorităților de a introduce legi corespunzătoare celor europene, inclusiv în ceea ce privește etichetarea și trasabilitatea. [NUME_REDACTAT] Agriculturii, Pădurilor și [NUME_REDACTAT] (MAPDR, 2008), documentele legislative relevante în domeniul OMG sunt următoarele:

Ordinul MAPDR nr. 237/2006 privind autorizarea cultivatorilor de plante modificate genetic;

Ordinul MAPDR nr. 471/2006 pentru completarea și modificarea Ordinul MAPDR nr. 237/2006 privind autorizarea cultivatorilor de plante modificate genetic;

OUG nr. 43/2007 privind introducerea deliberata în mediu și introducerea pe piață a organismelor modificate genetic;

OUG nr. 195/2005 privind protecția mediului;

Legea 265/2006 pentru aprobarea Ordonantei de urgență a guvernului nr. 195/2005 privind protecția mediului;

HG nr. 173/2006 privind trasabilitatea și etichetarea organismelor modificate genetic și trasabilitatea alimentelor și hranei pentru animale, obținute din organisme modificate genetic.

La cele enumerate anterior se mai adaugă:

HG nr. 497/2007 privind stabilirea unor măsuri pentru aplicarea [NUME_REDACTAT] European și al Consiliului (CE) nr. 1946/2003 din 15 iulie 2003 privind mișcarea transfrontieră a organismelor modificate genetic;

HG nr. 256/2006 privind hrana pentru animale și alimentele modificate genetic;

Legea nr. 3/2008 pentru aprobarea Ordonanței de urgență a Guvernului nr. 44/2007 privind utilizarea în condiții de izolare a microorganismelor modificate genetic.

CAPITOLUL VI

SONDAJ PRIVIND INFORMAREA

ÎN LEGĂTURĂ CU OMG

6.1. Prezentarea sondajului

OPINIA PUBLICĂ ÎN LEGĂTURĂ CU OMG

Genul : a) Masculin, Feminin.

Vârsta: Sub 20 de ani, Între 20 și 30, Între 40 și 50, Peste 50.

Educația: Învătământ mediu, Învățământ postliceal, Învățământ superior.

Știți ce sunt organismele modificate genetic?

a) DA b) NU c) Nu mă interesează

Considerați că produsele modificate genetic sunt sigure?

a) DA b) NU c) Nu mă interesează

Cunoașteți produse ce conțin sau provin din organisme modificate genetic?

a) DA b) NU c) Nu mă interesează

Ați consuma produse care conțin organisme modificate genetic?

a) DA b) NU c) Nu mă interesează

Ce ați face dacă ar fi mult mai ieftine decât produsele tratate chimic, pe care le acceptam, sau decât cele naturale?

a) Le-aș cumpara b) Nu le-aș cumpara c) Nu mă interesează

Stiați că există și medicamente care provin din organisme modificate genetic?

a) DA b) NU c) Nu mă interesează

Este necesar ca producătorii să solicite aprobare, de la o autoritate publică, înainte de a introduce pe piața produse ce conțin OMG?

a) DA b) NU c) Nu mă interesează

Etichetele produselor modificate genetic mă informează suficient?

a) DA b) NU c) Nu mă interesează

Sunt interesele mele de consumator suficient de bine apărate prin legile și instituțiile existente?

a) DA b) NU c) Nu mă interesează

Ați dori interzicerea organismelor modificate genetic în România și Europa?

a) DA b) NU c) Nu mă interesează

6.2. Analiza statistică

6.3. Interpretarea rezultatelor

BIBLIOGRAFIE

Ackermann C., 1977. Pflanzen aus Agrobacterium rhizogenes Tumoren aus Nicotiana tabacum. [NUME_REDACTAT]. Lett., 8, 23-30.

[NUME_REDACTAT] in Europe (ABE) [NUME_REDACTAT] Impact of [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT] 3. http://www.abeurope.info/home.html

Ahmed, F. E., Detection of genetically modified organisms in foods, 2002. [NUME_REDACTAT], 20:5, 215-223.

Amos, J., 2001. BBC [NUME_REDACTAT]'s GM tomatoes 'offer health boost' News.bbc.co.uk/1/hi/sci/tech/1517387.stm

[NUME_REDACTAT], F. C., Cibele dos [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] Valente, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], 2007, Nested PCR detection of genetically modified soybean in soybean, LWT, 40, 748-751.

Anklam, E., Gadani, F., Heinze, P., Pijnenburg, H. and Van den Eede, G. 2002. Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products. [NUME_REDACTAT] Research and Technology 214: 3-26

Beardmore, J.A., Porter, J.S., 2003. Genetically modified organisms and aquaculture. FAO [NUME_REDACTAT]. No. 989. Rome, FAO. 38p.

Benbrook, C., 2004. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]. USDA Survey data.

Berdal, K. G., A. Holst-Jensen, 2001, [NUME_REDACTAT] soybean event-specific realtime quantitative PCR assay and estimation of the practical detection and quantification limits in GMO analyses, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], 213, 432-438.

Bidney D., Scelonge C., Martich J., Burrus M., Sims L., Huffman G., 1992. Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens. [NUME_REDACTAT]. Biol., 18, 301-313.

Brisson N., Paszkowski J., Penswick J.R., Gronenborn B., Potrykus I., Hohn T., 1984. Expression of a bacterial gene in plants by using a viral vector. Nature, 310, 511-514.

Caboche M., 1990. Liposome-mediated transfer of nucleic acids into plant cells. Physiol. Plant, 79, 173-176.

Cionga, Cristina, 2005, [NUME_REDACTAT] Annual 2005, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] (GAIN) [NUME_REDACTAT]. RO2008, USDA [NUME_REDACTAT]

Service, http://www.gmo-free-regions.org/fileadmin/files/Romania_USDA_

Report_2005.pdf , pagină consultată în octombrie 2009.

Corbisier, P., [NUME_REDACTAT], D. Gancberg, [NUME_REDACTAT], P. [NUME_REDACTAT], G. Berben, H. Schimmel, H. Emons, 2005, Quantitative determination of [NUME_REDACTAT] soybean (Glycine max) extracted from highly processed flour, [NUME_REDACTAT] Chem, 383, 282-290.

Coulson, A., 2012. GMO trees. Living on earth. http://www.loe.org/shows/

Curtis I.S., He C., Power J.B., Mariotti D., de [NUME_REDACTAT]., Davey M.R., 1996. The effects of Agrobacterium rhizogenes rol AB genes in lettuce. [NUME_REDACTAT]., 115, 123-135.

Darwin, C., 1859. On the Origin of species, by means of natural selection or the prezervation of favoured races in the struggle for life. London, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT]

Debode F., E. Janssen, G. Berben, 2007, Physical degradation of genomic DNA of soybean flours does not impair relative quantification of its transgenic content, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] (2007) 226:273-280.

Deisingh, A. K., [NUME_REDACTAT], 2005, Detection approaches for genetically modified organisms in foods, [NUME_REDACTAT] International 38, 639-649.

De la Riva G.A., González-Cabrera J., Vásquez-Padrón R., Ayra-Pardo C., 1998. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. [NUME_REDACTAT] of Biotechnology, 1, 1-16.

Debnath, S.C., Teixeira da Silva, J.A., 2007. Strawberry culture in vitro: applications in genetic transformation and biotechnology. Fruit, Vegetable and [NUME_REDACTAT] and Biotechnology 1:1-12

Draper J., Davey M.R., Freeman J.P., Cocking E.C., Cox B.J., 1982. Ti plasmid homologous sequences present in tissues from Agrobacterium plasmid-transformed Petunia protoplasts. [NUME_REDACTAT] Physiol., 23, 451-458.

Duca, M., Ipate, I., Zgardan, D., Rotaru, E., 2011. Organismele modificate genetic –soluție în asigurarea securității alimentare? Österreichische [NUME_REDACTAT] Wien. ISBN 978-3-9503145-0-2, 181 pag.

Duță, I.D., 2012. Cercetări privind siguranța alimentară a utilizării organismelor modificate genetic în hrana puilor de carne. Teză de doctorat. Universitatea de [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]. Facultatea de [NUME_REDACTAT], Farmacie și [NUME_REDACTAT]. 144 pag.

Edwardson, J.R., 1970. Cytoplasmic male sterility. Botan. Rev, -V.36, -P.341-420.

Engel, K.-H., F. Moreano, [NUME_REDACTAT], U. Busch, 2006, Quantification of DNA from genetically modified organisms in composite and processed foods, Trends in [NUME_REDACTAT] & Technology 17, 490-497.

Eyquem, F., Quantitative detection of [NUME_REDACTAT] by ELISA, In: Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, 2004, Training course on the analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms, Office for the [NUME_REDACTAT] of the [NUME_REDACTAT], Luxemburg, disponibil on-line la http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN%202006/Session12.pdf , pagină consultată în octombrie 2009.

Endres, J. G., 2001, Soy protein products characteristics, nutritional aspects, and utilization, AOCS Press, Champaign, IL, SUA.

Fraley R.T., Rogers S.C., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Fink C., Hoffman N., Sanders P., 1983. Expession of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 4803-4807.

Ganea, L.Ș., 2011. Studiul diversității și distribuției spațiale a fondului genetic în populațiile de pin silvestru (Pinus sylvestris L.) în vederea ameliorării. Teză de doctorat. Universitatea de [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT] Cluj-Napoca. Facultatea de Agricultură.

Gachet, E., G.G. Martin, F. Vigneau, G. Meyer, 1999, Detection of genetically modified organisms (GMOs) by PCR: a brief review of methodologies available, Trends in [NUME_REDACTAT] & Technology, 9, 380-388.

Gartland, M.A., Crow, R.M., Fenning, T.M., Gartland, J.S., 2003. Genetically modified trees: production, properties and potential. Journal of Arboriculture. 29(5): 259-266.

Germini, A., A. Zanetti, [NUME_REDACTAT], S. Rossi, Christel Forreä, S. Schmid, [NUME_REDACTAT], 2004, Development of a seven-target multiplex PCR for the simultaneous detection of transgenic soybean and maize in feeds and foods, J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 52, 3275-3280.

Griesbach R.J., Hammond J., 1993. Incorporation of GUS gene into orhids via embryo electrophoresis. [NUME_REDACTAT]., 336, 165-169.

H. [NUME_REDACTAT], Engineering new oilseed crops from rapeseed, [NUME_REDACTAT],

Halford, N.G., Shewry, P.R., 2000. Genetically modified crops: methodology, benefits, regulation and public concerns. [NUME_REDACTAT] Bulletin. 56(1): 62-73.

Hansen, G.R., 2004. Genetic selection using genetic markers. Beef cattle short course. Texas A&M University.

Henderson, A.R., Walter, C., 2006. Genetic engineering in conifer plantation forestry. [NUME_REDACTAT], 55(6): 253–262

Higgins, Holly, 2000. Romaina – Planting seeds: Romanian legislation for GMO

seeds, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] (GAIN) [NUME_REDACTAT]. RO0005,

USDA [NUME_REDACTAT] Service, http://www.fas.usda.gov/scripts/gd.asp?

ID=25667501, pagină consultată în iulie 2006

Holst-Jensen, A., 2007, Validation of real-time PCR methods;-what can we learn

from the field of GMO detection?, http://fou02.planteforsk.no/Nordforsk

NetworkMycotox/PDFs/Validation%20of%20real-time%20PCR%20methods%2

0-%20what%20can%20we%20learn%20from%20the%20field%20of%20GMO

%20detection.pdf, pagină consultată în octombrie 2009 .

Huang, C.-C., T.-M. Pan, 2005, Event-specific real-time detection and quantification of genetically modified [NUME_REDACTAT] soybean, J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 53, 3833-3839.

James, C., 2012. [NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT]/GM Crops: 2012. [NUME_REDACTAT] Service for the Acquisition of Agri-biotech Application (ISAAA). Brief no. 44.

Kaeppler H.F., Gu W., Somers D.A., Rines H.W., Cockburn A.F., 1990. Silicon carbide fiber-mediated DNA delivery into plant cells. [NUME_REDACTAT] Rep., 8, 415-418.

Kanovski, P., 2012. Genetically modified trees opportunities for dialogue. TFG [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT].

Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C., 1987. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature, 327, 70-73.

Kost B., Galli A., Potrykus I., Neuhaus G., 1995. High efficiency transient and stable transformation by optimized DNA microinjection into Nicotiana tabacum protoplasts. J. Exp. Bot., 46, 1157-1167.

[NUME_REDACTAT] și al., 1974. Studii și cercetări, Silvicultură, Vol. 30. Institutul de cercetări și amenajări silvice, București.

Lisa, J., 2013. 10 [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]. http://listverse.com/2013/07/26/top-10-gm-animals-you-can-buy-or-eat/

Matsuoka, T., H. Kuribara, K. Takubo, H. Akiyama, H. Miura, Y. Goda, Y. Kusakabe, K. Isshiki, M. Toyoda, A. Hino, 2002, Detection of recombinant DNA segments introduced to genetically modified maize (Zea mays), J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 50, 2100-2109.

Moens, W., M. Deloose, J. Remarcle, A. Callebaut, G. Berben, 2005, Tracing and authentication of GMOs and derived products in the food-processing area: final report, [NUME_REDACTAT] Policy, Brussels: [NUME_REDACTAT] Policy, disponibil online la http://www.belspo.be/belspo/home/publ/pub_ostc/CPagr/rappCP32_en.pdf

Mugabe, J., 2003. [NUME_REDACTAT] in [NUME_REDACTAT]: Entry by and Implications for [NUME_REDACTAT]. ATPS [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]. 15 [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] Network.

Narusaka, Y., Narusaka, M., Yamasaki, S., Iwabuchi, M., 2012. Methods to transfer foreign genes to plants. "Transgenic plants – advances and limitations". Agricultural and [NUME_REDACTAT]. ISBN 978-953-51-0181-9.

Paszkowski J., Shilito R.D., Saul M., Mandak V., Hohn T., Hohn B., Potrykus I., 1984. Direct gene transfer to plants. EMBO J., 3, 2717-2722.

Potrykus I., 1991. Gene transfer to plants: assessment of published approaches and results. Annu. Rev. [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT]. Biol., 42, 205-225.

Potrykus I., Spangenberg G. (eds.)., 1995. [NUME_REDACTAT] to Plants. [NUME_REDACTAT] Manual, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] York.

Petit, Laetitia, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], Y. Bertheau, P. Fach, 2003, Screening of genetically modified organisms and specific detection of Bt176 maize in flours and starches by PCR-enzyme linked immunosorbent assay, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 217, 83-89.

Pray, C. E., 1999. Public and private collaboration on plant biotechnology in China. AgBioForum 2:48–53.

Querci, Maddalena, F. Weighardt, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], M. Mazzara, 2005, Detecting GMOs, [NUME_REDACTAT], Office for the [NUME_REDACTAT] of the [NUME_REDACTAT], Luxemburg.

Rakosy-Tican L., Neamțu S., Turcu I., Lucaciu C.M., 2000. Electroporarea și electrostimularea, tehnici cu implicații în biotehnologia vegetală. In: Actualități și perspective în biotehnologia vegetală – Lucrările celui de al IX-lea [NUME_REDACTAT] de Culturi de Tesuturi și [NUME_REDACTAT] – D. Cachiță-Cosma, A. Bavaru, A. Brezeanu (eds.), "Ovidius" [NUME_REDACTAT], Constanța, 64-79.

Rao, S., 2010. Will genetically modified Eucalyptus trees transform Southern forests? http://blogs.discovermagazine.com/80beats/2010/02/01/

Rudi, K., [NUME_REDACTAT], A. Holck, 2003, A novel multiplex quantitative DNA array based PCR (MQDA-PCR) for quantification of transgenic maize in food and feed, [NUME_REDACTAT] Research, 31 (11), e62.

Rutovitz, J., Mayer, S., 2002. [NUME_REDACTAT] and [NUME_REDACTAT]. All in a [NUME_REDACTAT]? A Report by GeneWatch UK

Singer, M., 2000. Genetically modified organisms. Nature 406: 151-157.

Sisea, C.R., Pamfil, D., 2009 . Testarea OMG. [NUME_REDACTAT]. Cluj-Napoca.ISBN 978-606-92029-5-1, 325 pag.

Songstad D.D., Somers D.A., Griesbach R.J., 1995. Advances in alternative DNA delivery techniques. [NUME_REDACTAT], Tissue and [NUME_REDACTAT], 40, 1-15.

Smith, Donna S., P. W. Maxwell, 2007, Use of quantitative PCR to evaluate several methods for extracting DNA from corn flour and cornstarch, [NUME_REDACTAT] 18, 236-242.

Swinden, S., 2013. US [NUME_REDACTAT]: genes cannot be patentated. https://www.pressenza.com/2013/06/.

Tait J., 2008. Risk governance of genetically modified crops – European and American perspectives. In: Renn O, Walker K, eds. [NUME_REDACTAT] Governance: Concept and [NUME_REDACTAT] the IRGC Framework. Dordrecht, [NUME_REDACTAT]: Springer 133-153.

Tepfer D., 1989. Ri T-DNA from Agrobacterium rhizogenes: a source of genes having applications in rhizosphere biology and plant development, ecology and evolution. In: Kosuge T., Nester E. (eds.), Plant-microbe interactions. McGraw Hill, [NUME_REDACTAT], 294-342.

Xu J., H. Miao, H. Wu, W. Huang, R. Tang, M. Qiu, J. Wen, S. Zhub, Y. Li, 2006, Screening genetically modified organisms using multiplex-PCR coupled with oligonucleotide microarray, Biosensors and Bioelectronics 22, 71-77.

Vargas, C., 2011. [NUME_REDACTAT] Organism – A summary of [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] to [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT] 2011/02. Genok – Centre for Biosafety Tromsö, Norway.

Van den Bulcke, M., [NUME_REDACTAT] Leunda, D. de Bernardi, [NUME_REDACTAT] Schrijver, G. [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], 2005, Detection of [NUME_REDACTAT] Crops in [NUME_REDACTAT]: a State of the Art, http://www.economia.uniroma2.it/conferenze/icabr2005/papers/VAn_de_Bulcke.pdf

Weeler, M.B., Farrand, S.K., Widholm, J.M., 1991. Animal and plant transformation: the application of transgenic organisms in agriculture. University of Illinois at Urbana-Champaign. College of Agricultural, Consumer and [NUME_REDACTAT] 33 (1/2).

White, T.L., Adams, W.T., Neale, D.B., 2007. Forest genetics. Wallingford, Oxfordshire, UK, Cambridge, MA: CABI Pub. ISBN 9780851993485, 682 pp.

Zadoks, J.C., Waibel, H., 2000. From pesticidesto genetically modified plants: history, economics and politics. [NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT] 48:125-149.

Zafar, Z., M. Asif, A. M. Khalid, 2004, Capacity building in biosafety of genetically modified crops: GMOs (genetically modified organisms) detection, [NUME_REDACTAT] for Biotechnology and [NUME_REDACTAT], Faisalabad, Pakistan.

Zhang L-J., Cheng L-M., Xu N., ZhaoN-M., Li C-G., Yuan J., Jia S-R., 1991. Efficient transformation of tobacco by ultrasonication.Bio/Technology, 9, 350-351.

***1, 2014. http://www.gmcrops.myewebsite.com/articles/history.html.

***2, 2014. http://www.bionetonline.org/english/content/ff_cont3.htm.

***3, 2014. http://www.cs.trinity.edu/~bdavis6/tankmates.html.

***4, 2013. http://www.fao.org/Ethics/ser_en.htm.

***5, 2000. FAO. La situation mondiale des pêches et de l’aquaculture, Rome, Italy

***6, 2013. [NUME_REDACTAT], 8 animale modificate genetic pentru folosul oamenilor http://www.adev.ro/mwbjsa.

***8, 2000. BALL, I.B., : Synthesis of national reports on activities related to poplar and willow areas, production, consumption and the functioning of national poplar commissions. FAO – I.P.C.

***7, 2009. R-Biofarm. SureFood GMO 35S/NOS Screening, http://www.rbiopharm.com/product_site.php?product_id=801&product_class_one=R1ZP&product_class_two=U2NyZWVu&product_class_three=MzVTICsgTk9T&product_class_four=&product_range=Food%20and%20Feed%20Analysis&.

***8, 2009 IAASTD ([NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT] Science and Technology for Development), Agriculture at Crossroad. [NUME_REDACTAT] (Washington D.C., [NUME_REDACTAT]), p. 590.

***9, FAO. 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] FGR/59E, [NUME_REDACTAT] Division FAO, Rome, Italy http://www.fao.org/docrep/008/ ae574e/ae574e00.htm.

***10, FAO/WHO [NUME_REDACTAT], 1998. Requirement of Vitamin A, Iron, Folate, and Vitamin B12. Food and [NUME_REDACTAT] no.23, FAO, [NUME_REDACTAT] latest report to consider requirement for vitamin A.

***11, 2014. CBRA [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT] Organisms and [NUME_REDACTAT]. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT].

Filat, M, Chira, D., 2004. Cercetări pentru introducerea în cultura de specii/clone de plop și salcie cu potenșial silvoproductiv și rezistentă sporită la adversități. Analele ICAS 47: 83-99.

***13, 1975. Benea V. și al.Cercetări preliminare privind ameliorarea genetică pentru mărirea rezistenței la Fomes annosus Fr./Cke.