Metode de Limitare Si Reducere a Continutului de Micotoxine a Unor Produse Alimentare de Origine Vegetala

CUPRINS

CUPRINS

INTRODUCERE

Micotoxicozele sunt boli ale omului și animalelor produse de micotoxine care ajung în organism odată cu ingerarea alimentelor respectiv a furajelor.

Micotoxinele sunt metaboliți toxici ai miceților dezvoltați pe diferite substraturi, în special alimente si furaje, capabili să producă îmbolnavirea celor care le consumă. Micotoxinele se găsesc în sporii și talul miceților sau ca produși de secreție ai acestora în substraturile pe care le dezvoltă.

Micotoxicozele, spre deosebire de micoze care sunt boli determinate de prezența fungilor în organismul afectat, reprezintă entități morbide produse de toxinele fungilor numite micotoxine, care sunt agenți abiotici ajunși în organismul uman sau animal odată cu alimentele sau furajele. Ele nu presupun prezența fungului în organismul afectat și uneori, nici în substratul pe care au fost elaborate micotoxinele.

Numeroase produse alimentare sau furaje de origine vegetală, cum sunt făina de grâu, secară sau de porumb, șroturile de arahide, diferite fructe pe care s-au dezvoltat fungi toxigeni, în urma prelucrărilor suferite nu mai conțin decât micotoxine care au rezistat acestor procese, în timp ce fungii care le-au produs au fost omorâți. În cazul unor produse alimentare de origine animală, cum sunt carnea și laptele animalelor de fermă, contaminarea lor cu micotoxine se face prin hrănirea lor cu furaje mucegăite și în care s-au elaborat micotoxinele.

Lucrarea ”TITLUL LUCRARII” cuprinde două părti.

PARTEA I – STUDIU BIBLIOGRAFIC

CAPITOLUL I

CONTAMINAREA CU MICOTOXINE A ALIMENTELOR

1.1. Noțiuni generale despre contaminarea chimică

Contaminanți chimici reprezintă orice substanță care nu a fost adăugată în mod intenționat într-un anumit produs alimentar, dar care poate fi prezent într-un produs alimentar ca, rezultat al uneia sau mai multor activități.

Contaminare chimică – include substanțe chimice provenite din mediu, reziduuri de medicamente de uz veterinar, metale grele sau alte reziduuri care ajung în alimente intenționat sau accidental, în timpul proceselor pe care le implică agricultura (practici agricole, de pesticide, pesticide, etc.), sau creșterea animalelor (steroizi, hormoni, etc.), și a pășurilor, prelucrarea alimentelor, transportul sau ambalarea ([NUME_REDACTAT], 2012; [NUME_REDACTAT] pentru Siguranța și igiena alimentară și nutriție,2011).

Dacă un agent contaminant generează un risc sau nu, depinde de mulți factori, inclusiv de absorbția și toxicitatea substanței, cantitatea în care contaminantul se găsește în aliment,cantitatea de alimente contaminată consumat și durata expunerii alimentelor și este mai puțin evident dar nu mai puțin semnificativă din punct de vedere sanitar([NUME_REDACTAT],2012).

Procesul de poluare chimică a alimentelor exercită efecte, atât asupra alimentului, cât și asupra sănătății celui care consumă aceste produse.

Poluarea chimică a alimentelor influențează starea de sănătate a populației, deși acest fenomen, uneori, nu este aparent la o cercetare superficială.

În realitate, prețul biologic plătit de consumator prin consumul de alimente poluate, este considerabil și afectează „a la longue” organismul.

Apariția fenomenelor de intoxicare este explicabilă prin concentrațiile mici de poluanți care, însă, acționează printr-un efect cronic, cu sau fără acumularea toxicului. (Orbán A. și colab.,2007).

Alimentele sunt contaminate în cea mai mare parte prin intermediul aerului și apei dar au la rândul lor surse proprii specifice de poluare în special pentru anumite elemente.

Contaminarea alimentelor prin intermediul apei se face prin folosirea apelor intens poluate la irigații, a precipitațiilor care spală atmosfera poluată cu pulberi sau aerosoli toxici.

Contaminarea cu pulberi rezultate din activitatea umană și industrială se realizează atât prin depunerea și absorbția de către plante a acestora pe suprafața produselor vegetale cât și prin trecerea în sol a contaminanților și absorbția de către plante și concentrarea în anumite zone a acestora (rădăcini, frunze sau fructe).

Alimentele de origine animală se contaminează de obicei prin consumul de produse vegetale contaminate, furaje, produse de uz veterinar folosite la tratamente sau la tehnologiile de creștere industrială a acestora. ([NUME_REDACTAT], 2012).

1.2. Tipuri de contaminanți chimici

Alimentele constituie sursa energetică și constructivă de bază a organismului uman. Pentru a-și putea îndeplini funcția, alimentele trebuie să fie satisfăcătoare din punt de vedere calitativ, adică să aibe calități nutriționale și să fie salubre. ([NUME_REDACTAT], 2010).

În prezent, marea diversitate de alimente disponibile, compozitia chimică complexă a acestora, riscurile de îmbolnavire prin intermediul alimentelor ingerate, schimbarea mediului în care omul își desfășoară activitatea, au determinat revizuirea concepției despre alimentație, accentuarea caracterului ei rațional și de factor preventiv în sănătate.

Factorii care influențează calitatea produselor alimentare pot fi interni, cum sunt compoziția chimică a produsului, structura anatomică și gradul de integritate, proprietățile biologice, proprietățile fizice, sau externi solicitările mecanice în timpul manipulării produselor, compoziția aerului atmosferic, temperatura aerului, umiditatea aerului, lumina și alte radiații, ambalajul, microorganismele, modul de depozitare. ([NUME_REDACTAT], 2012).

Siguranța alimentelor nu poate deveni un fapt real dacât dacă constituie o responsabilitate a tuturor celor implicați în domeniul alimentar.

De-a lungul lanțului alimentar sunt implementate diverse proceduri și mecanisme de control, care asigură ca alimentele ce ajung pe masa consumatorului să fie comestibile, riscul contaminării să fie minim.

Riscul ca alimentele să fie contaminate cu substanțe chimice sau microorganisme există pe tot parcursul lanțului alimentar. În general, siguranța alimentelor este amenințată de factori care se împart în doua categorii :

contaminarea biologică: bacterii, fungi, viruși sau paraziți – la un astfel de tip de contaminare alimentele prezintă, în cele mai multe cazuri, semne ușor de identificat;

contaminarea chimică: care include contaminarea cu substanțe chimice provenite din mediu, reziduuri de medicamente de uz veterinat, metale grele sau alte reziduuri care ajung în alimente neintenționat,accidental, în timpul proceselor pe care le impune agricultura sau creșterea animalelor și a păsărilor, prelucrarea alimentelor, transportul sau ambalarea. ([NUME_REDACTAT], 2012).

1.3. Principalele tipuri de micotoxine

Micotoxinele sunt metaboliți produși de miceți dezvoltați pe un substrat, capabile să producă îmbolnăvirea celor ce consumă produsul respectiv: oameni, animale, plante, microbi. Aceste toxine se găsesc ca produși de secreție pe substratul pe care se dezvoltă mucegaiul.

Sunt cunoscute peste 300 de micotoxine dar prin impactul pe care ȋl au asupra sănătății animalelor și oamenilor, ȋn jur de 10 compuși sunt studiați și urmăriți ȋn mod deosebit.

În același timp micotoxinele sunt foarte diverse ca și tip chimic datorită numărului mare de ciuperci care le produc și ȋn acest sens se pot distinge clase majore și clase minore de micotoxine (Tifană, 2011) ȋncadrarea in clase fiind diferita ȋntre diferiți autori.

Micotoxine majore:

[NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT]

Micotoxine minore:

[NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT] ciclopiazonic

[NUME_REDACTAT] penicilinic

Există și mucegaiuri utile ȋn industria alimentară cum ar fi:

Penicillinum roqueforti și Aspergillius camemberti utilizate pentru obținerea unor sortimente de brânzeturi

Penicillinium expansum care se utilizează pentru obținerea unor sortimente de salamuri crud-uscate.

Aflatoxinele sunt secretate de Aspergillus flavus, dar și de un număr mare de alte mucegaiuri printre care: A.ochraceus, Penicillium puberulum, diferiți penicili și chiar Rizopus sp. Principalul producător rămâne însă A. flavus, care are spori galbeni-verzi și este lipsit de ascospori. Se dezvoltă bine pe semințe oleagenoase și pe produsele secundare rezultate de la fabricarea uleiului (șrot, tărâțe), în special pe arahide, dar și pe cereale. Este depistat și pe produse de origine animală: brânzeturi fermentate, preparate din carne.

Producția maximă de aflatoxine are loc la temperaturi ridicate, acumularea aflatoxinelor este specifică țărilor cu climă caldă.

Există patru fracțiuni de aflatoxine majore și o serie de fracțiuni minore, toate derivați ai furofuranului cu nucleu cumarinic, identificate după fluorescența în lumină ultravioletă.

Principalele fracțiuni cunoscute sunt: B1, B2, G1, G2, M1, M2, M2a și p1. Toxicitatea maximă o prezintă aflatoxina B1, urmată de G1, B2 și G2. Fracțiunea P1 s-a dovedit a fi lipsită de toxicitate în teste pe embrioni de găină, și de asemenea fracțiunile B2 și G2.

Ochratoxinele au fost identificate în numeroase produse alimentare de origine vegetală: porumb, grâu, orz, ovăz, orez, soia, sorg, leguminoase, cafea și pește sărat, în concentrații de până la 28000 mg/Kg. Toxicitatea ochratoxinei este cuprinsă între 0,2 și 0,34 mg/Kg. Ochratoxinele sunt produse de miceți din genurile: Aspergillus și Penicillium.

Patulina mai este cunoscută și sub denumirea de clavacină și se acumulează în cereale și în numeroase fructe și legume: mere, pere, piersici, caise, cireșe, struguri, banane, tomate, ele putând trece și în produsele de prelucrare, în special în sucurile de fructe. În cantitate mare se formează în merele depozitate (de la 20 la 17700 mg/Kg).

Patulina este foarte toxică pentru animale și plante, având asupra acestora o acțiune mutagenă, teratogenă și carcinogenă. Este produsă de miceți din genul: Penicillium (P. urticae, P. expansum).

Sterigmatocistinele fac parte din metaboliții furofuranici. Efectele toxice sunt asemănătoare cu ale aflatoxinei B1, producând necroze miocardice, alterare celulară, reducerea cromatinei din nucleu și o progresivă degenerare celulară însoțită de o fragmentare a nucleilor.

Este produsă de miceți din genul: Aspergillus și Penicillium. A fost pusă în evidență în diferite cereale mucegăite: făină, pâine, carne și brânzeturi.

Tricotecenele sunt metaboliți ai mai multor genuri de fungi imperfecți: Fusarium, Trichothecium, Mychotecium, Cephalosporium și Stahybotrys.

Rolul cel mai important îi revine lui Fusarium sp. care afectează cel mai mult cerealele și semințele de leguminoase. Aceste micotoxine, în țările din zona temperată, prezintă un pericol mai mare decât aflatoxinele.

Tricotecenele în concentrații de până la 5000 mg/Kg au fost găsite în porumbul și orzul din mai multe țări. În intoxicațiile acute, tricotecenele provoacă vomismente, slăbiciune, diaree, tahicardie, hipotensiune și colaps.

Temperatura optimă de producere a toxinelor este cuprinsă între 1,5 și 8°C. Ele sunt termostabile, rezistând 18 ore la 110°C și, ca urmare, își manifestă efectul și după operațiile de coacere și fierbere.

Toxina T-2 este principalul tricotecen care se formează pe porumbul mucegăit, dar poate fi identificată și pe alte cereale, pe care s-a dezvoltat Fusarium tricinctum.

Porumbul care se maturizează târziu sau are un conținut mare de apă este predispus la primul îngheț alterării de către fusarii și acumulării de toxine. Toxina T-2 provoacă dizenterie mortală la mamifere și are un efect de reducere a coagulabilității sângelui.

Se manifestă prin vomismente, gastroenterită cu dizenterie, scădere în greutate și moarte.

Zearalenonele reprezintă contaminanți frecvenți ai produselor cerealiere. În porumb, orz și grâu concentrația micotoxinei poate înregistra valori de 50 mg/Kg.

Zearalenona F2 este elaborată de Fusarium roseum, dar și de alte fusarii și miceți. S-au izolat fracțiunile F3, F1 și F5, dar cu acțiune toxică mai redusă. Sunt sintetizate la temperaturi scăzute, de 12°C, ridicarea temperaturii la 25°C sporește producerea de micotoxine. Se acumulează în special pe porumbul depozitat, cu umiditate ridicată (peste 14%).

Zearalenonele sunt lactone ale acidului rezorcilic. În doze reduse au un efect stimulant asupra sporului de greutate, fiind chiar utilizate în acest scop. În doze mari au acțiune estrogenă, producând avorturi la femelele gestante și sterilitate.

Rubratoxinele sunt substanțe toxice elaborate de Penicillium rubrum și P. purpurogenum și se prezintă sub două forme: A și B. Ele provoacă o stare hemoragică și sunt hepatotoxice. Rubratoxina B are și o oarecare acțiune carcinogenă, acționând sinergic cu aflatoxina B1. În mod obișnuit produsele pot fi contaminate concomitent cu A. flavus și cu P. rubrum, efectele conjugându-se.

Dozele subletale produc oprirea creșterii și apariția unor malformații congenitale la animalele de experiență.

Sub acțiunea rubratoxinelor s-au constatat dezagregări ale poliribozomilor, ceea ce determină o alterare a sintezei proteinelor.

Citreoviridina este o substanță cu efecte neurotoxice, sintetizată de Penicillium citreoviridae, care se dezvoltă cu predilecție pe orez, la temperaturi joase, de 12-18°C. Ea este responsabilă de apariția unor simptome asemănătoare bolii beri-beri.

Toate aceste micotoxine sunt hepatotoxine puternice. Simptomele intoxicației cu P. islandicum diferă de cantitatea de orez mucegăit ingerată.

1.4. Prezența micotoxinelor în diverse produse alimentare

Un mare număr de produse alimentare poate fi contaminat cu micotoxine. Contaminarea bunurilor alimentare animale sau de origine animală este, de obicei, consecința unei absorbții digestive de către animal a micotoxinelor prezente în furaje.

Micotoxinele absorbite persistă după absorbție în carne și organe sub formă mai mult sau mai puțin metabolozată sau se elimină prin diferite secreții și excreții, cum sunt laptele și urina, sau odată cu unele produse cum sunt ouăle.

Micotoxinele în cereale – cerealele pot favoriza în anumite condiții de temperatură și umiditate creșterea mucegaiurilor și producerea de micotoxine.

Înmulțirea miceților pe timpul depozitării cerealelor este favorizată în condițiile unei umidități de 80 – 85% și a unei temperaturi de peste 26°C. Prezența aflatoxinelor s-a pus în evidență în pâine și produse de panificație, în crupele de porumb și în diferite tipuri de pâine dietetică.

În boabele de grâu, secară și orz, predomină ochratoxina A, ditrinina, sterigmatocistina.

Prin măcinarea cerealelor, ochratoxina A trece, în mare măsură, în produsele de măciniș. Cantitatea cea mai mică de ochratoxină este prezentă în făina perlată, unde se determină 10 – 30% din conținutul inițial, iar în tărâțe se înregistrează concentrații mult mai mari.

Făina poate fi contaminată cu fungi producători de micotoxine ca: Penicillium, Aspergillus, Mucor și Fusarium, în timpul depozitării, în special în condiții de umiditate ridicată a aerului putându-se forma substanțe toxice ca rezultat al metabolismului acestora.

Porumbul, în multe zone de pe glob, se recoltează la o umiditate ridicată, ceea ce favorizează mucegăirea. S-a stabilit că Aspergillus flavus se poate dezvolta pe porumb încă din câmp, cu formare de aflatoxine; în afară de aflatoxine, în porumb s-a evidențiat și zearalenona.

Orzul și ovăzul au o cantitate mică de micotoxine, evidențiindu-se A. flavus, producător de aflatoxine și P. verrucosum, producător a ochratoxinei. Prin fierbere sub presiune se inactivează peste 81% din aflatoxine, deci autoclavarea orezului reprezintă o metodă eficientă de inactivare a aflatoxinelor.

Micotoxinele trec în produsele de măciniș și, ca urmare, pot fi determinate în pâine, paste făinoase, etc. Prin procesul de fermentare a aluatului, ca urmare a reacțiilor de acidifiere și oxidare care au loc, se reduce doar într-o proporție mică cantitatea inițială de aflatoxine.

Coacerea nu influențează conținutul în aflatoxine, în schimb excesul de bromați în aluat (substanțe oxidante) poate determina o reducere importantă a aflatoxinelor.

Pâinea mucegăită poate conține diferite micotoxine. Pe pâine se pot dezvolta și Aspergillus ochraceus și diferite specii de Penicillium.

În produsele făinoase s-au determinat diferite tipuri de Aspergillus, Penicillium, Mucor și Cladosporium.

Micotoxinele în semințele oleaginoase și în ulei – semințele oleaginoase și în special arahidele sunt ușor atacate de mucegaiuri, inclusiv de Aspergillus flavus, cu formare de aflatoxine. Micotoxinele produse de mucegaiuri se dezvoltă în tot bobul. Invadarea semințelor de către mucegai se face cu ocazia recoltării, dar mai ales pe timpul depozitării. Umiditatea și temperatura ridicată pe timpul depozitării facilitează dezvoltarea mucegaiului și producerea de micotoxine. Uscarea imediat după recoltare a arahidelor este cea mai bună metodă de a preveni contaminarea cu aflatoxine.

Micotoxinele în legume și fructe – fructele și legumele mucegăite pot prezenta diferite micotoxine. În morcovi s-au evidențiat aflatoxine produse de Aspergillus parasiticus și A. flavus, de tipul B1 și G1, care trec apoi în suc. De asemenea, și pe fructe uscate (caise, smochine, ananas) se pot forma aflatoxine. În gemuri s-a evidențiat patulina.

Micotoxinele în cafea și cacao – în cafeaua verde mucegăită s-au identificat Aspergillus ochraceus și ca urmare, ochratoxina A. Mai rar s-au izolat miceți din genul Aspergillus (A. flavus) producător de sterigmatocistine. Prin prăjire, o mare parte din micotoxine (70-80%) se distrug.

Micotoxinele în băuturi fermentate – s-au evidențiat aflatoxine în cedru; nu s-au pus însă în evidență în vin.

Aflatoxinele B1, B2, G1 și G2 se pot forma în timpul malțificării necorespunzătoare a orzului, ca urmare a mucegăirii acestuia. În bere trec aproximativ 5 – 10% din aflatoxinele existente în malț.

Micotoxinele în carne și preparate de carne – ca urmare a ingerării de furaje mucegăite, aflatoxinele pot fi detectate în carnea animalelor de măcelărie. În rinichi se acumulează în special ochratoxine. Acestea, prin prăjirea cărnii la 150 – 160°C, timp de 6 – 12 minute, se reduc cu 14-35%, în timp ce în țesutul gras concentrația nu se schimbă.

Preparatele de carne pot fi contaminate cu diverse mucegaiuri din genurile: Penicillium, Aspergillus și Fusarium. În salamurile fermentate – uscate s-au pus în evidență un mare număr de tulpini de Penicillium producătoare de micotoxine (tremortină, citrinină, patulină, etc.) și mai multe tulpini de Aspergillus: A. flavus, A. parasiticus, A. versicolor, producătoare de aflatoxine.

Micotoxinele în lapte și produse lactate – când se administrează vacilor furaje cu conținut mare în aflatoxine, apare în lapte un metabolit al aflatoxinei B1, cunoscut la început sub denumirea de „milktoxin” și denumit în prezent aflatoxina M1. Se formează și un derivat al aflatoxinei B2, aflatoxina M2, care prezintă însă o mai mică importanță. Metabolizarea aflatoxinelor ingerate este foarte rapidă.

Administrarea furajelor care conțin 50 mg/Kg aflatoxină B1 determină detectarea aflatoxinei M1 în lapte chiar din primele zile. Cantitatea de toxine crește în primele patru zile, după care rămâne stabilă. Cantitatea de aflatoxină M1 care se formează în lapte reprezintă 1 – 3% din aflatoxina ingerată cu furajul. În laptele recoltat în perioada de iarnă, cantitatea este de 1,5 ori mai mare decât primăvara.

Laptele praf depozitat în condiții necorespunzătoare poate fi contaminat cu miceți din genul Aspergillus, Penicillium și Cladosporium, care pot produce micotoxine cu acțiune nefrotoxică și hepatotoxică.

În cazul brânzeturilor se poate înregistra prezența micotoxinelor datorită atât mucegaiurilor din mediul ambiant, cât și celor utilizate în tehnologia de fabricare a brânzeturilor.

Brânzeturile de tipul Tilsit, Edam, Romadur și Camembert sunt cele mai susceptibile de a conține aflatoxine.

Aspergillus flavus și A. parasiticus se dezvoltă bine pe brânza Tilsit la temperatura de 18 – 30°C și la o umiditate relativă a aerului mai mare de 79%.

S-a stabilit că A. flavus produce pe brânza Tilsit aflatoxină B1 în cantitate de 2000 mg/Kg și aflatoxină B2 în cantitate de 200 mg/Kg.

Aflatoxinele pot fi prezente și în brânzeturile topite, în cantități și mai mici, întrucât în timpul proceselor tehnologice, temperatura de topire (80 – 138°C, sărurile de topire și ph-ul reduc cantitatea de aflatoxine din brânzeturi. Este posibilă însă o contaminare ulterioară a acestora și mucegăirea lor. Cercetări recente arată că Penicillium camemberti și P. roqueforti, utilizați la fabricarea unor sortimente de brânză sunt capabile să producă substanțe toxice (patulină, citrinină și acid penicilic).

CAPITOLUL II

FACTORI CARE INFLUENȚEAZĂ PRODUCEREA MICOTOXINELOR

2.1. Formarea micotoxinelor: în general, pe larg la aflatoxine

Speciile de Aspergillus produc micotoxine puternice cunoscute sub denumirea de aflatoxine. Alți metaboliți cu acțiune metabolică elaborați de Aspergillus flavus sunt asperthecina, flavacolul și acidul aspergillic.

Acești compuși își manifestă acțiunea toxică asupra altor microorganisme.

În general fungii galbeni-verzi, cum a fost denumită genul Aspergillus sunt nelipsiți de pe toate cerealele și furajele, datorită abilității lor de a invada substraturile lor a invada substraturile solide.

Aceștia sunt raspândiți abundent în sol, aer, alimente stocate, materii organice, corpuri vie, etc. Interesul deosebit al biotehnologiei pentru genul de fungii amintit, este reprezentat de produsele metabolismului lor, anume: metabolitii primari (acizi organici, enzime, etc) și secundari, printre care mulți sunt micotoxine.

Din puncte de vedere istoric, date despre acest gen de fungi apar încă din 1729 și continuă cu noi descoperiri până în 1983, când se utilizează deja frecvent în biotehnologii.

Aflatoxinele sunt toxigene, carcinogene (cele mai puternice carcinogene naturale cunoscute), mutagene și teratogene. Aflatoxinele, compuși cu structura cumarinică, au fost notate ințtial în ordinea descrescatoare a activității biologice și toxicității, după cum urmează; aflatoxina B1, aflatoxinele G1, G2, aflatoxina B2 (produse în speță de Aspergillus parasiticus, extrem de toxigen, urmat de Aspergillus flavus), etc. Ele sunt grupate în trei categorii: aflatoxine majore, aflatoxine monohidroxilate și aflatoxine dihidroxilate.

Aflatoxinele prezintă fluorescenta în UV. De altfel, primii patru compuși izolați au fost denumiți în funcție de culoarea fluorescenței la 254 nm și 366 nm, albastră sau verde, respectiv B (blue) și G (green).

Aceste substanțe produc afecțiuni grave organismelor superioare, mai ales la nivelul ficatului și al vezicii biliare, dar nu par a avea efecte toxigene asupra bacteriilor.

Aflatoxinele pot fi distruse de acizi și baze tari, de hipoclorați, de permanganatul de potasiu, de apa oxigenată, de clor, de ozon, etc.

Printre cele aproximativ 20 de substante incluse în categoria aflatoxinelor, în alimente se regăsesc cu precădere 4, anume: aflatoxinele B1, B2, G1 si G2.

În lapte și produsele din lapte s-au identificat cu precădere aflatoxinele M1 si M2, apărute prin biotransformarea în rumenul ierbivorelor a altor tipuri de aflatoxine ([NUME_REDACTAT], 2002, Mycotoxins, INRA, France).

Incidența apariției aflatoxinelor este sporită în țările în curs de dezvoltare din Africa și Asia, care nu au implementate sistemele de control calitativ al alimentelor.

2.2.Principalele genuri de mucegaiuri din industria alimentară

Etiologia micotoxicozelor reprezintă elementul esențial în tentativa de rezolvare a unei probleme extrem de complexe care din punct de vedere epidemiologic poate fi sintetizată în triada: micromiceți – micotoxine – organisme vii (oameni, animale).

Contaminarea fungică – substraturile vegetale la nivelul biosferei suportă o agresiune atât de intensă și diversificată încât afirmația unui mare micolog că „trăim într-o lume a miceților și nu într-o lume cu miceți” este pe deplin justificată.

Boabele de cereale (porumb, grâu, orz, ovăz, secară) și de leguminoase (soia, mazăre, fasole) oferă prin conținutul lor ridicat în trofine, mediul nutritiv ideal pentru multiplicarea micromiceților și elaborarea micotoxinelor.

Ele pot fi contaminate cu fungi și micotoxine atât în faza de vegetație a plantelor, cât mai ales în perioada de conservare, când condițiile de recoltare și păstrare sunt favorabile germinării formelor de rezistență ale micromiceților și multiplicării aparatului micelian.

Brazilia este a doua mare producătoare de fasole din lume, în special tipul de fasole cu boabe de culoare neagră, aliment foarte apreciat de populația băștinașă. Costa și Scussel (1988) au efectuat, în această țară, un studiu amplu folosind metode adecvate pentru izolarea și identificarea micromiceților toxigeni sau a celor potențiali toxigeni. Examenele efectuate au arătat că toate cele 52 de probe recoltate din zone situate în sudul țării au fost contamiante cu micromiceți filamentoși și levuriformi aparținând genurilor: Botrytis, Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Curvularia, Fusarim, Helmintosporium, Penicillium și Trichoderma.

[NUME_REDACTAT], calitatea produselor alimentare, indiferent de natura și proveniența lor este asigurată printr-o legislație foarte exigentă și care este respectată cu o rigurozitate tipic saxonă. Și totuși, sunt situații când anumite produse sau sortimente alimentare destinate consumului public se depreciază calitativ prin infestarea lor fungică. Birzele și col. (1998) au examinat micotoxinic diferite sortimente de grâu de toamnă din Worthrhine-Westfalia stocat în silozuri în care temperatura a fost de 20oC, iar umiditatea relativă a avut valori de 90%. Încărcătura micotică a produselor analizate în 1995 a fost redusă în privința germenilor: Fusarium, Aspergillus și Penicillium, dar în anii următori 1996, 1997 speciile de miceți aparținând geniului Fusarium au înregistrat o creștere semnificativă, acest fenomen fiind în legătură directă cu factorii meteorologici.

Aceste câteva exemple alese aleatoriu dintr-o vastă rețea de investigații micotoxicologice sunt argumente care demonstrează clar că intensitatea fenomenului de contaminare fungică și micotoxinică este atât de mare „în plan orizontal” încât, practic, toate substraturile vegetale care într-un fel sau altul ajung în dieta omului și animalelor nu scapă acestui flagel.

Dacă contaminarea fungică a boabelor de cereale și a semințelor de leguminoase sau oleaginoase poate fi acceptată fie și numai din conservatorism, contaminarea cu micromiceți și micotoxine a condimentelor, a plantelor medicinale, a fructelor și a legumelor, a sucurilor naturale, surprinde și ridică serioase semne de întrebare privind riscul lor epidemiologic.

Ele au fost puse în evidență în boabele de cereale (grâu, porumb, orz, ovăz, sorg, secară) și leguminoase (soia, arahide, mazăre, fasole) în toate produsele și subprodusele acestora (pâine, aluat, prăjituri, franzeluțe de mălai), în semințele de oleaginoase (floarea-soarelui, bostan, miez de nucă), în legume și fructe (morcov, ardei, tomate, pătrunjel, mere, pere, gutui, citrice, smochine, kiwi, piersici, caise), în preparate (gem, dulceață, compot, peltea, sucuri naturale), în bere, must, vin, cidru, în condimente (piper verde, negru sau alb), paprica, curry, oregano, cimbru, boia de ardei și în plante medicinale (frunze de pătlagină, sunătoare, izmă, etc).

Micotoxinele contaminează cele mai diverse sub straturi vegetale –tipul și cantitatea de toxină și implicit incidența micotoxicozelor în diferite țări depind de condițiile pedoclimatice, de metodele agroindustriale practicate, de modalitățile de păstrare a produselor respective, de metodele de procesare, de specificul alimentației și particularitățile artei culinare, de gradul de cultură și de civilizație al populației. Până în prezent au fost identificate și confirmate ca toxigene câteva zeci de genuri de micromiceți care produc peste 1000 de substanțe toxice, unele dintre ele fiind încadrate în clasa micotoxinelor.

Micotoxicozele sunt patologii determinate de micotoxine, agenți abiotici, care pătrund în organism odată cu alimentele ingerate; deci, micotoxicozele nu implică prezența agentului biotic (fungului).

Paleta efectelor toxice ale micotoxinelor este foarte largă: efecte cancerigene, mutagene, teratogene, imunosupresoare, alergenice, estrogenice, necrozante, neurotoxice, nefrotoxice etc.

Organele și țesuturile țintă sunt, de asemenea, foarte diferite: ficat, rinichi, piele, sistem imunitar, sistem nervos, glande endocrine; în multe situații se produc leziuni organice ireversibile.

În general, micotoxicozele se manifestă ca îmbolnăviri cronice, după expuneri prelungite la concentrații chiar foarte reduse de micotoxine.

Bacteriile, drojdiile și mucegaiurile (fungii) au un rol deosebit de important în biotehnologii, prin capacitățile lor speciale (echipamente enzimatice) de a fermnata substraturi variate, organice și anroganice, fermentații din care rezultă o gamă largă de metaboliți primari și secundari.

Diferențierea dintre metaboliții primari și secundari nu este chiar atât de ușor de stabilit, cu toate că se admite în mod general, că metaboliții primari (esențiali pentru creșterea microorganismului) se formează în faza de creștere logaritmică a microorganismelor, pe când metaboliții secundari apar la sfârșitul acestei perioade.

Marea majoritate a microbilor produc toxine. Se consideră că doar cinci microorganisme pot fi considerate sigure, din punct de vedere toxicologic.

Acestea sunt: o bacterie, două drojdii și două specii de mucegaiuri.

Microorganismele industriale utilizate, fungii și bacterii, biosintetizează anumiți metaboliți secundari, incluși în categoria toxinelor, care exercită efecte negative severe asupra organismelor superioare, în special asupra mamiferelor și omului. Multe dintre microorganisme se pot utiliza însă, în procesele fermentative implicate în maturarea mezelurilor, brânzeturilor.

Detecția micotoxinelor nu depinde de punerea în evidență a fungilor în probele respective și nici invers. Controlul micotoxinelor, ajunse ulterior în alimente, nu poate fi facută în consecință, la un singur nivel, fiind necesară analiza intregului lanț alimentar al unui produs.

Mucegaiurile, multe dintre ele toxigene, necesită o atenție specială. În afara faptului că toxinele lor acționează puternic, chiar în cantități mici, se pune problema sinergismului acestor toxine o dată ajunse în organismele superioare.

Mucegaiurile din genurile Aspergillus, Penicillium, Cephalosporium, Mucor, Rhizopus, Trichoderma etc, sunt larg utilizate în industria alimentară si farmaceutica, multe fiind producatoare de antibiotice.

2.3. Influența factorilor extrinseci asupra apariției micotoxinelor

Temperatura are influență asupra speciei de mucegai, dar și asupra produselor de metabolism.

Procesele metabolice se desfășoară în limite stricte de temperatură, specifice fiecărui microorganism. Acest factor poate favoriza sau inhiba dezvoltarea microorganismelor, iar în anumite cazuri poate chiar determina moartea acestora.

Efectul temperaturii asupra dezvoltării microorganismelor se datorește influenței pe care aceasta o exercită asupra:

stării de agregare a apei, în funcție de care se mărește sau se micșorează disponibilitatea apei;

vitezei reacțiilor enzimatice;

plasticității membranei celulare și citoplasmei;

macromoleculele pe care le pot denatura;

Mucegaiurile se dezvoltă la temperaturi diferite. Există pentru fiecare specie, un grad de temperatură la care dezvoltarea se face cu cea mai mare intensitate. Această temperatură se numește temperatura optimă de dezvoltare. Deasupra și sub temperatura optimă, dezvoltarea mucegaiurilor slăbește, și când atinge un anumit punct, superior sau inferior, încetează de a se mai dezvolta chiar dacă mediul nutritiv ramâne același.

Temperatura superioară optimului, la care se mai poate observa o foarte slabă dezvoltare a mucegaiurilor, se numește temperatura maximă iar cea inferioară, temperatura minimă de dezvoltare. Când temperatura se ridică deasupra maximului de temperatură, mucegaiul este distrus. Dacă temperatura scade sub minimul de temperatură, mucegaiul nu este distrus ci se găsește într-o stare de viață foarte lentă, favorabilă conservării.

Temperatura optimă pentru creșterea mucegaiurilor este cuprinsă între 25-30ºC iar limita maximă este de 40-45ºC. Există totuși mucegaiuri care se pot dezvolta fără probleme la temperaturi de 55ºC Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, dar și mucegaiuri care sunt capabile să se dezvolte la temperaturi de 0ºC, Penicillium cyclopium.

În unele situații există o apropiere între temperatura minimă necesară pentru creșterea mucegaiului și cea la care are loc producerea de micotoxine. Avem însă unele excepții când temperatura de dezvoltare a mucegaiului este cuprinsă între 6°-45ºC cu un optim la 37ºC iar producția de micotoxine are loc într-un interval de temperatură cuprins între 11°-36ºC cu un maxim la 30ºC.

Umiditatea – cantitatea de apă existentă în mediul ambiant și în substraturi este unul din factorii importanți pentru dezvoltarea mucegaiurilor și pentru producția de micotoxine.

În atmosferă există o umezeală relativă de 70-90% și prin păstrarea alimentelor, în timp, în funcție de temperatură și compoziția produsului are loc o absorbție a vaporilor de apă din aer, instalându-se o stare de echilibru, cu creșterea cantității de apă liberă și a indicelui de activitate a apei. Este știut faptul că mucegaiurile apar după o creștere accidentală a umidității.

Tensiunea superficială – microorganismele sunt influențate de tensiunea superficială a mediului în care se găsesc. Substanțele care coboară tensiunea superficială întârzie sau împiedică dezvoltarea mucegaiurilor, aceste substanțe pot să aibă, de asemenea, influență asupra morfologiei și sporulării

Presiunea osmotică poate provoca modificări bruște ale structurii celulare (plasmoliza, turgescența) și modificări ale morfologiei microorganismelor.

Mucegaiurile sunt microorganisme osmofile (se pot dezvolta pe medii cu presiune osmotică mare) și din acest motiv, ele pot altera produsele alimentare care conțin o cantitate mare de zahăr (miere, dulceață, etc.). Ele se pot dezvolta pe produse care conțin max. 70% zahăr.

Lumina – acțiunea luminii depinde de specia microorganismelor. În general se poate spune că lumina este dăunătoare mucegaiurilor. Acțiunea vătămătoare a luminii crește cu scăderea luminii de undă a razelor luminoase. Din spectrul luminos cele mai vătămătoare sunt razele violete, iar din spectrul invizibil, radiațiile ultraviolete. Acțiunea dăunătoare a razelor ultraviolete depinde de intensitatea și durata lor de acțiune asupra mucegaiurilor, acestea putând fi împiedicate sau oprite din activitatea lor, ori complet distruse.

Când acțiunea luminii se exercită asupra unei culturi și nu numai asupra unui singur microorganism, se deosebește alături de acțiunea directă, și acțiunea indirectă asupra mediului de cultură. Astfel, în mediile de cultură care au fost expuse la lumină solară sau la radiațiile UV, s-a găsit întotdeauna apă oxigenată, rezultată din oxidarea apei, oxidare produsă de raze, care constituie un toxic pentru microorganism. Prin urmare, acțiunea luminii asupra microorganismului, se exercită fie direct, asupra celulei însăși, fie indirect, prin producerea apei oxigenate.

Integritatea fizică a boabelor și învelișului produselor vegetale – factorul acesta asigură calitatea produselor în timpul conservării și face mai dificil atacul mucegaiurilor.

Produsele cerealiere sunt protejate de mediul exterior, de tegumente care sunt o barieră foarte eficace împotriva penetrării microorganismelor. Această eficacitate scade după recoltare, deoarece anvelopa protectoare este eliminată sau lezată. Structura internă reprezentată de pereții celulozici, diminuează înmulțirea și deci proliferarea germenilor în masa produselor alimentare.

2.4. Influența factorilor intrinseci asupra apariției micotoxinelor

Natura substratului – în general, substratul optim este cel glucidic. Mucegaiurile nu sunt exigente din punct de nutrițional, ele hrănindu-se cu micro și macro elementele care există în substratul unde se dezvoltă.

Aflatoxina este secretată în special pe amidon, iar zearenona se formează pe un substrat celulozic.

Acțiunea pH-ului asupra creșterii microorganismelor se situează la trei nivele:

mediu

permeabilitatea membranei

activitatea metabolică

Disponibilitatea anumitor nutrienți în mediul de cultură este modificată prin echilibrul ionic. La pH acid, ionii de magneziu formează compuși insolubili, la pH bazic, zincul, calciul și ionii ferici sunt complexați. Sub această formă acești ioni indispensabili ca și cofactori ai enzimelor sunt dificil de folosit.

Nutrienți minerali – microorganismele, pentru dezvoltare au nevoie de apă, o sursă de energie, de azot, de săruri minerale și eventual de oxigen și/sau factori de creștere. Microorganismele care se întâlnesc pe produsele alimentare sunt chimio-organotrofe și folosesc mai degrabă hidrații de carbon ca sursă de energie decât acizii grași sau substanțele azotoase. Monomerii sau moleculele mici sunt încorporate în citoplasmă prin transport membranar, polimerii trebuie să fie însă hidrolizați în prealabil.

Produsele alimentare conțin în general toți nutrienții necesari dezvoltării microorganismelor, dar diferențele de compoziție observate au un efect selectiv asupra florei microbiene.

Sunt în relație cu compoziția substratului, fierul și zincul, fiind elementele cele mai importante pentru creșterea fungică. Lipsa anumitor elemente are ca rezultat o creștere fungică foarte scăzută.

Potențialul de oxido-reducere (O2/CO2) – acțiunea oxigenului asupra metabolismului microbian se poate manifesta în trei moduri:

modificarea potențialului de oxido-reducere;

acceptul final al electronilor pentru aerobioza strictă și facultativă;

agenți ai stresului oxidativ prin intermediul formelor sale active (peroxid sau superoxid).

Oxigenul poate fi procurat de microorganisme din aer, din apa cum și din diferite substanțe care îl conțin. Rolul principal însă în nutriție și în funcțiunea celulei microbiene îl joacă oxigenul din aer și cel din compușii organici.

Majoritatea mucegaiurilor sunt aerobe și din acest motiv au nevoie de O2 pentru a crește și pentru reacțiile lor metabolice. O lipsă parțială de O2, condiționează creșterea mucegaiurilor, iar lipsa acestuia duce la moartea acestora. Este cazul lui Penicillium, care poate suporta și condiții extreme.

O diminuare a concentrației în O2 și o creștere a concentrației de CO2, provoacă o scădere a toxicogenezei, mai importantă decât creșterea.

În cazul fumonisinei B1, în condiții de O2 scăzut, creșterea mucegaiului va fi scăzută, consumul de glucoză va fi important și producția de micotoxină va fi nulă.

Barrios si col. (1996) au arătat că inocularea bacteriilor lactice cu trei zile înaintea inoculării lui Aspergillus parasiticus provoacă o diminuare a creșterii și producției de micotoxine. Acest fenomen are un efect de competiție pentru substrat și pH.

Efectul microflorei acționează asupra acumulării toxinelor. În termen ecologic, există o competiție pentru substraturi: doar sursele foarte competitive și care posedă un vast spectru de substraturi metabolizabile se dezvoltă.

Insectele intervin indirect în producția de micotoxine, ele fiind vectorii sporilor. În plus, insectele pătrund în zonele interioare ale grânelor prin rănile pe care le produc. Contaminarea după recoltare a alunelor și porumbului cu Aspergillus flavus este corelată cu un atac al insectele. Acestea pot fi prezente în spațiile de depozitare creând o contaminare importantă și în consecință constituie o cauză a prezenței micotoxinelor.

CAPITOLUL III

METODE DE LIMITARE ȘI REDUCERE A CONȚINUTULUI ÎN MICOTOXINE A UNOR PRODUSE ALIMENTARE DE ORIGINE VEGETALĂ

3.1. Strategii preventive: limitarea contaminanților

Sistemul HACCP, o metodă pentru protecția igienico – sanitară a alimentelor, este unul dintre diferitele procedee propuse pentru a garanta producere igienico- sanitară a alimentelor care a întrunit sufragiile majorități organismelor internaționale în domeniu. Sistemul HACCP face posibilă prevenirea contaminărilor și/sau reducerea la un nivel acceptabil a potențialelor riscuri inerente procesului productive sau produsului finit.

Este greșit să se considere că sistemul HACCP reprezintă o metodă care determină eliminarea în totalitate a riscurilor pentru obținerea de alimente sigure; sistemul HACCP acceptă și posibilitatea de a reduce riscurile la un nivel acceptabil.

Acest aspect reprezintă o noutate introdusă de sistemul HACCP, care obligă la o respectare riguroasă a principiilor preventive conținute de el; nerespectarea acestor principii în oricare dintre fazele procesului de producție pune în pericol întreg sistemul.

Demersul este bazat pe dezvoltarea unei strategii de prevenire, de control, de bune practice industriale și control al calității la toate etapele producției. Presupune punerea în evidență a punctelor de risc, ca și a punctelor critice, punerea la punct a soluțiilor finale de luptă, ca și dezvoltarea metodelor de verificare.

Contaminarea externă prin aer și apă, trebuie să fie supravegheată. Din practicile care trebuie respectare pentru limitarea contaminării alimentelor amintim: curățarea echipamentelor, o bună igienă personală și purtarea îmbrăcămintei de securitate.

Pentru fiecare produs, echipa HACCP trebuie să studieze dacă micotoxinele care constituie un pericol pentru sănătate sunt susceptibile de a fi prezente și dacă da, care sunt acelea.

Eliminarea completă a micotoxinelor din alimente contaminate nu se poate realiza la ora actuală, obiectivul fiind acela de a reduce la minim apariția acestor toxine prin bune practice agricole.

Principiile pentru prevenirea și reducerea micotoxinelor diferă în funcție de cultură, climat și practice agricole locale.

Rotirea culturilor constituie în general un mod eficace de a reduce riscul contaminării în funcție de sursa fungică și specia cultivată.

Este foarte eficientă pentru a reduce contaminarea cerealelor de iarnă în particular. Culturile care nu sunt contaminate de specii de Fusarium, care afectează în general cerealele, precum cartofii, trifoiul, lucerna sau alte legume, trebuie să fie cultivate prin rotație pentru a reduce contaminarea câmpului. Cerealele cu bobul mic, cum ar fi grâul, trebuie să fie semănate numai după o evaluare a riscurilor de infecție cu mucegaiuri.

Interacțiunea semnificativă descoperită între cultura precedentă și gestionarea solului a pus în evidență importanța rămășițelor de la cultura gazdă în ciclul vieții patogenilor. S-a constat că, conținutul în desoxinivalenol este mult mai mare în cazul cultivării grâului după o cultură contaminată cu ssp de Fusarium, decât porumbul sau alte cereale.

Se recomandă să se aleagă hibrizi sau specii mai bine adaptate la natura solului, sau la condițiile climatice și la practicile agricole uzuale.

Pe cât este posibil, culturile trebuie să fie planificate pentru a evita condițiile climatice care prelungesc coacerea în câmp înainte de recoltare.

Uscarea trebuie de asemenea considerată ca fiind un factor de risc în cazul contaminării cu mucegaiuri. Trebuie să se evite plantarea apropiată a plantelor. Din acest motiv se recomandă respectarea spațiilor între rânduri și între plante. Informația referitoare la aceste spații poate fi furnizată de producătorii de semințe.

La cultivare, trebuie să se țină cont de riscurile eroziunii și de buna gestionare a solului. Toate practicile agricole distrug sau ascund reziduurile culturilor infectate, aratul permițând după toate aparențele reducerea contaminării culturii următoare cu mucegaiuri. Pământul trebuie semănat astfel încât să se lase o suprafață de semănat rugoasă, o zonă de semănat grosieră, pentru a favoriza infiltrarea apei și reducerea la minimum a riscului de eroziune a solului și nutrienților săi. Se recomandă pe cât posibil pregătirea suprafețelor destinate semanării prin arare, înlăturarea speciilor rămase pe câmp de la cultura precedentă, precum și înlăturarea tijelor și a altor rămășițe vegetale care pot servi ca substrat pentru dezvoltarea mucegaiurilor producătoare de micotoxine. În zonele care sunt expuse eroziunii, practicile de lucru pot fi cuplate cu cele de conservare. O atenție deosebită trebuie acordată gestionării reziduurilor recoltei susceptibile de a favoriza contaminarea culturii următoare cu mucegaiuri; aceste reziduuri trebuie să fie sfărâmate cât de fin posibil și încorporate în sol astfel încât să se faciliteze descompunerea lor.

Trebuie să se evite pe cât posibil stresul plantelor. Există numeroși factori de stres: seceta, frigul, carențele în nutrienți și reacțiile nedorite între materialele folosite pentru cultură.

Referitor la măsurile luate pentru a evita stresul plantelor, de exemplu irigațiiile, trebuie să se reducă la minim riscul ulterior de infestare fungică prin evitarea irigării prin stropire în timpul dezvoltării organelor florale.

Irigarea este o metodă valabilă pentru reducerea stresului cauzat plantelor în anumite condiții de creștere. Un aport optim de nutrienți este esențial pentru a evita o „slăbiciune" a plantei, susceptibilă favorizării unei infestări cu mucegaiuri. Trebuie să se asigure un aport în nutrienți specifici plantei.

Evaluarea calității cerealelor înaintea recoltării, ținând cont de limitele unei eșantionări reprezentative și o analiză rapidă pe teren.

Separarea, dacă este posibilă, a cerealelor pe baza exigențelor calității pieței – de exemplu – pentru producția de pâine sau hrană pentru animale – și calitatea culturii vechi – umedă, curată sau uscată.

Recoltarea să se facă pe cât posibil atunci când conținutul de apă al plantei să fie adecvat. Întârzierea recoltării cerealelor deja contaminate cu mucegaiuri poate provoca o creștere sensibilă a conținutului de micotoxine în cultură. Trebuie să se țină cont de posibilitatea uscării în cazul în care cultura nu poate fi recoltată în condiții optime de conținut de apă. Înainte de recoltare trebuie să se verifice dacă echipamentul care va fi folosit la recoltare și depozitare este în stare bună. O defecțiune în această perioadă critică poate dăuna calității cerealelor și favoriza formarea micotoxinelor. Trebuie de asemenea verificat și etalonat echipamentul necesar pentru măsurarea conținutului de apă. Trebuie să se evite pe cât posibil sfărâmarea mecanică a cerealelor și contactul cu solul în timpul recoltării. Cerealele cu boabe zbârcite și mici pot prezenta mai multe micotoxine decât cele cu dimensiune normală.

Trebuie să se determine conținutul de apă al culturii înaintea recoltării sau imediat după recoltare.

Eșantioanele prelevate în acest scop trebuie să fie cât mai reprezentative. Se recomandă pe cât posibil uscarea cerealelor pentru a atinge conținutul de apă recomandat pentru depozitare. În cazul cerealelor umede care trebuie să fie uscate, se va reduce la minimum perioada cuprinsă între recoltare și uscare. În consecință, va trebui, în anumite cazuri, să se planifice recoltarea în funcție de capacitatea de uscare.

Cerealele trebuie să fie uscate astfel încât conținutul în apă să fie inferior celui care va permite dezvoltarea mucegaiurilor în timpul depozitarii. O activitate a apei inferioară valorii de 0,65 corespunde în general unui conținut în apă mai mic de 15%. Trebuie să se stabilească valori precise ale conținutului de apă, ținând cont de condițiile locale de depozitare. Este o necesitate pentru prevenirea dezvoltării unui anumit număr de specii fungice care se pot găsi în cereale înaintea uscării.

Dacă cerealele umede trebuie să fie depozitate fară să fie uscate, mucegaiurile se vor dezvolta în câteva zile și vor provoca reîncălzirea lor.

Cerealele trebuie să fie uscate astfel încât să se reducă la minimum pagubele cauzate de dezvoltarea mucegaiurilor. Aerarea cerealelor umede poate evita supraîncălzirea înaintea uscării. Evitarea pe cât posibil a amestecării loturilor de cereale care prezintă riscuri diferite de contaminare.

Pentru a reduce variația conținutului de apă în lot, cerealele se pot transfera în altă instalație sau în alt depozit după uscare.

Pentru mărfurile ambalate trebuie să se asigure că sacii sunt curați și uscați și sunt așezați pe paleți sau au intercalat între ei un strat impermeabil.

Aerarea pe cât posibil a cerealelor, prin trecerea circulară a aerului în zone de depozitare pentru a menține o temperatură apropiată și uniformă în toate aceste zone. Controlul regulat al conținutului de apă și temperatura cerealelor depozitate în timpul depozitării este necesară. Un miros neplăcut poate arăta că boabele sunt încinse, în cazul în care locul depozitării este închis, lipsit de ventilație.

Măsurarea temperaturii cerealelor depozitate la intervale determinate în timpul depozitării.

O creștere a temperaturii poate indica o dezvoltare microbiană și/sau o infestare cu insecte. Separarea părților aparent infestate și prelevarea de eșantioane pentru analiză. Scăderea temperaturii cerealelor rămase și aerarea este o metodă eficientă pentru a împiedica dezvoltarea mucegaiurilor. Evitarea folosirii cerealelor contaminate pentru producția de alimente destinate consumului uman și animal.

Folosirea metodelor de întreținere dupa reducerea la minimum a prezenței insectelor și formarea mucegaiurilor în depozite. Folosirea insecticidelor și fungicidelor agreate sau altor metode adaptate. Alegerea produselor chimice care nu influențează calitatea cerealelor și folosirea acestora în cantități prescrise.

Folosirea unui agent de conservare agreat (de exemplu acizi organici – acidul propionic) poate avea efecte benefice pentru cerealele destinate alimentației animale. Acidul propionic și sărurile sale sunt fungistatice și sunt uneori folosite pentru conservarea cerealelor recoltate umede, evitând pe cât posibil incingerea sau mucegăirea înaintea aplicării tratamentului. Aceste produse trebuie să fie aplicate rapid cu ajutorul echipamentelor adecvate astfel încât să se obțină o repartiție uniformă în tot lotul tratat. Daca cerealele sunt tratate după o perioadă de depozitare umedă, prezența agentului de conservare nu constituie o garanție a necontaminării.

Mașinile destinate transportului cerealelor trebuie să fie uscate și lipsite de mucegaiuri vizibile, insecte și alte materiale contaminate.

Dacă este necesar, trebuie să se curețe și dezinfecteze înainte și după folosire, fiind adaptate destinației prevăzute. Folosirea fumigatelor și ierbicidelor omologate poate fi util. Se vor proteja cerealele, în timpul transportului, de umezeală. Se vor evita fluctuațiile de temperatură și intervențiile care ar putea provoca o condensare a suprafeței cerealelor, ceea ce va conduce la o creștere localizată a nivelului umidității care va favoriza dezvoltarea mucegaiurilor și formarea micotoxinelor.

Evitarea pătrunderii insectelor, pasărilor si rozătoarelor în timpul transportului.

Totuși, aplicarea practicilor agricole nu este suficientă pentru a împiedica contaminarea. Strategiile de decontaminare sunt dezvoltate pentru a face față acestei probleme.

3.2. Strategii curative: decontaminarea

În conformitate cu reglementările FAO/OMS, procesele de decontaminare în vederea reducerii impactului toxicologic și economic al prezenței micotoxinelor în alimente, urmăresc:

să distrugă, să inactiveze sau să îndepărteze micotoxinele;

să nu producă sau să nu conducă la apariția unor reziduuri toxice, mutagene sau carcinogene în produsele supuse tratamentului decontaminant;

să nu modifice proprietățile senzoriale ale alimentului;

să asigure distrugerea sporilor fungici și a miceliilor care, în condiții favorabile ar putea biosintetiza

micotoxine;

să fie accesibile tehnic și economic.

Reducerea aportului de micotoxine pentru organismul uman și animal, prin ingerare de alimente contaminate se poate realiza prin:

limitarea conținutului de micotoxine în furaje și produse alimentare;

inactivarea (reducerea toxicității) acestora în organismul uman sau animal.

Diminuarea prezenței micotoxinelor în produsele alimentare se poate realiza prin metode fizice sau chimice.

În cazul cerealelor și semințelor oleaginoase se pot aplica metodele fizice: separarea boabelor afectate, spălarea, măcinarea, extracția cu solvenți.

Separarea boabelor afectate

Separarea boabelor afectate (strivite, decolorate, mucegăite) contribuie în mare măsură la reducerea conținutului în micotoxine. Separarea se poate realiza manual, mecanic sau prin mijloace

Spălarea boabelor

Spălarea boabelor este o metodă simplă de reducere a conținutului în micotoxine produse de Fusarium (DON, ZEN, fumonisine) din boabele de porumb, orz . Ca lichide de spălare pot fi utilizate apa distilată sau soluții de carbonat de sodiu. Spre exemplu, spălarea semințelor de orz, de trei ori, cu apă distilată, reduce conținutul în dioxinivelanol cu 65 – 69%.

Această metodă nu se recomandă în cazul produselor care urmează să fie măcinate, deoarece uscarea la parametrii optimi pentru măcinare este prea costisitoare. În cazul merelor, spălarea asigură transferul micotoxinelor din produs în apa de spălare; astfel, concentrația în patulină poate fi redusă de la 920 la 190 ng/g.

Îndepărtarea manuală a zonei din fruct afectată de mucegai, asociată cu spălarea cu apă distilată a fructelor, conduce la scăderea nivelului patulinei de la 2335 la 55 ng/g.

[NUME_REDACTAT] este o metodă prin care se poate reduce conținutul cerealelor în micotoxine. Distribuția toxinelor în diferite zone ale bobului permite obținerea, în timpul măcinării, a unor fracțiuni ce au conținut mai redus de micotoxine.

Extracția cu solvenți

Diferiți solvenți sau amestecuri de solvenți au capacitatea de a dizolva și extrage micotoxinele din produse alimentare (arahide, semințe de bumbac): acetonă, soluție 90% în apă; etanol 95%; izopropanol, soluție 80% în apă; hexan – metanol; metanol-apă; acetonitril-apă; hexan-etanol-apă; acetonă-hexan-apă etc. Inconvenientul acestei metode constă, pe lângă costurile ridicate, în extracția simultană a unor componente din aliment, cu scăderea valorii biologice a acestuia.

Adsorbția pe substraturi solide

Cărbunele activ și bentonita au fost experimentate în scopul reducerii conținutului în micotoxine al unor produse alimentare. Astfel, cărbunele activ, în concentrație de 3-5 g/L reduce semnificativ conținutul în patulină al sucului de mere.

Inactivare termică

Inactivarea termică este o metodă aplicabilă pentru reducerea contaminării cu micotoxine. Majoritatea micotoxinelor sunt relativ stabile la temperaturile la care sunt supuse în timpul procesului culinar convențional (80-121°C). Sensibilitatea termică a micotoxinelor în alimente este influențată de conținutul în apă, pH, activitatea ionică.

Iradierea alimentelor

Tratamentul cu radiații ionizante (X, gama), aplicat inițial pentru decontaminarea fungică a produselor alimentare în depozite a fost extins și pentru degradarea micotoxinelor prezente în alimente. Inactivarea micotoxinelor prin gamairadiere este influențată de doza de radiații, tipul de aliment și natura micotoxinei.

În prezent sunt cercetate și chiar aplicate numeroase metode chimice de reducere, distrugere sau inactivare a micotoxinelor. Substanțele chimice utilizate pot fi: acizi (acid clorhidric), baze (amoniac, hidroxid de sodiu), oxizi (peroxid de hidrogen, ozon), agenți reducători (bisulfiți), agenți de clorinare (clor, hipocloriți, dioxid de clor), aldehide (formaldehidă).

Utilizarea acizilor sau bazelor

Aflatoxinele B1 și G1 sunt transformate în mediu acid în semiacetali solubili în apă; tratamentul cu acid clorhidric (pH =2), timp de 24 h scade conținutul în AFB1 cu 20% ; după tratamentul cu acid clorhidric sau acid sulfuric 1%, AFB1 și AFB2 sunt distruse în procente de 13, respectiv 18%.

De asemenea, numeroase baze organice sau anorganice sunt eficace în detoxifierea produselor agricole contaminate; amoniacul este admis în numeroase țări pentru decontaminarea micotoxinică a produselor agricole (arahide, bumbac, porumb).

Condițiile de aplicare ale tratamentului includ: agentul chimic (amoniac lichid, gazos sau amestecul acestora), concentrația aplicată, timpul de contact, presiunea mediului, temperatura, determină nivelul de reducere a conținutului în micotoxinele eventual prezente în aliment.

Efectul distructiv al altor baze (hidroxid de sodiu, hidroxid de potasiu, hidroxid de calciu) asupra micotoxinelor este mai redus decât cel produs de amoniac.

Capacitatea de distrugere a AFB1, în urma tratamentului cu baze, în soluție, la 110°C, determinată experimental se prezintă astfel: hidroxid de potasiu > hidroxid de sodiu > carbonat de potasiu >hidroxid de amoniu >bicarbonat de sodiu >carbonat de amoniu. Spre exemplu, tratamentul arahidelor decojite (30% umiditate) cu soluție de hidroxid de sodiu 2%, timp de 30 minute la 120°C reduce la urme cantitatea de AFB1 existentă.

Utilizarea agenților oxidanți

Agenți oxidanți ca peroxidul de hidrogen și ozonul au fost experimentați în scopul reducerii conținutului în micotoxine al alimentelor. Legăturile duble din structura unor aflatoxine (AFB1, AFG1, AFM1) sunt distruse sub acțiunea ozonului, în timp ce aflatoxinele AFB2, AFG2 și AFM2 sunt stabile în condiții identice de tratament.

S-a raportat distrugerea totală a aflatoxinelor și G1 prin tratarea cu ozon de concentratie 2%; aflatoxinele B2 și G2 necesită concentrații de ozon de 20% pentru a obține aceleași rezultate.

De asemenea, expunerea timp de 15 secunde la concentrații de ozon de 10% reduce concentrația de acid ciclopiazonic, aflatoxină, ochratoxină, patulină și zearalenonă la valori nedetectabile. În plus, tratamentul cu ozon reduce mutagenitatea aflatoxinelor.

Utilizarea agenților reducători

Bisulfitul de sodiu este un compus mult utilizat ca aditiv pentru numeroase alimente și băuturi datorită proprietăților antioxidante, de inhibare a alterării enzimatice și acțiunii bacteriostatice. Numeroase studii experimentale au demonstrat capacitatea sa de a micșora toxicitatea unor micotoxine, mai ales, a aflatoxinelor B1 și G1.

Mecanismul de acțiune se bazează pe interacțiunea dintre bisulfit și legătura dublă a micotoxinei. În paralel, este diminuată acțiunea mutagenă a AFB1. Tratarea smochinelor deshidratate cu soluție 1% de bisulfit de sodiu a redus conținutul în aflatoxină B1 cu 28,2%. La fel, tratamentul boabelor de porumb cu bisulfit de sodiu 0,5%, respectiv 2%, a redus conținutul de aflatoxine cu 80%, respectiv 90%.

Utilizarea agenților de clorinare

Soluțiile apoase de clor sunt utilizate în mod curent în industria alimentară pentru dezinfecția echipamentelor, dar și pentru spălarea unor materii prime (fructe, pește, carne) înaine de procesare. Clorul gazos și hipocloritul de sodiu distrug aflatoxinele; concentrații de clor de 10% în aer distrug până la 90% din aflatoxinele prezente în arahide.

Alături de aceste categorii de agenți chimici experimentați și chiar utilizați pentru detoxifierea produselor alimentare, numeroase alte substanțe active sunt folosite pentru distrugerea micotoxinelor: aldehida formică, permanganatul de potasiu, boratul de sodiu, metanolul (soluție 75%).

Utilizarea acestora în procesarea alimentelor este restricționată datorită problemelor de siguranță alimentară; în aliment ar putea să se acumuleze reziduuri nocive pentru organismul uman. S-a studiat capacitatea de reducere a conținutului de patulină în sucul de mere prin adăugare de tiamină, piridoxină și pantotenat de calciu.

Cercetările realizate au evidențiat că unele uleiuri esențiale, mai ales cele de scorțișoară și cuișoare au capacitatea de a limita producerea de micotoxine de către Fusarium, Penicillium verucosum, Aspergillus ochraceus, în funcție de condițiile de mediu. Butilhidroxi- toluenul, propil-parabenul, uleiul de scorțișoară și resveratrolul au redus cu până la 90% acumularea de dioxinivelanol și nivelanol în cereale (grâu).

Alternativa la utilizarea metodelor fizice și chimice de îmbunătățire a siguranței alimentelor prin reducerea conținutului de micotoxine este aplicarea metodelor biologice și microbiologice, succesele obținute în ultimii ani în biologia moleculară, ingineria genetică și genomica microbiană au permis abordarea cercetărilor privind potențialul catabolic al unor compuși de metabolism microbian.

Astfel, diferite culturi de fungi și-au dovedit capacitatea de a detoxifia aflatoxinele și ochratoxina în proporție de până la 100%.

PARTEA A II-A – EXPERIMENTALĂ

CAPITOLUL IV

SCOPUL LUCRĂRII

Micotoxinele prezintă un real pericol atât pentru animale cât și pentru om, și este obligatoriu ca manipularea probelor să se facă cu grijă și să se lucreze în condiții care să împiedice contaminarea materialelor și a atmosferei.

În plus, anumite mucegaiuri care produc aceste substanțe sunt ele însuși toxice: este exemplul lui Aspergillus flavus și Aspergillus parasiticus pentru care s-au diagnosticat trei tipuri de simptome la om: infecție, alergie și toxicoză.

Acest studiu reprezintă, pe de o parte, o evaluare a florei micologice epifite și endofite care apare pe cariopsele de cerealedupă depozitare de termrn mediu, iar pe de altă parte, o caracterizaqre complexă (morfologică, toxicologică, citogenetică) în vederea evitării sau diminuării pagubelor produse de agenții patogeni fungici.

Scopul prezentei lucrări constă în:

stabilirea unei corelații cu privire la umiditatea semințelor conservate și evoluția activității microflorei de depozit;

stabilirea influenței tipului de substrat mediu CGA (cartof – dextroză – agar), mediu Sabourand (extract de drojdie – dextroză – cloramfenicol – agar), hârtie sugativă asupra evoluției agenților patogeni fungici;

Condițiile de experimentare pot fi grupate astfel:

condițiile specifice de depozitare pentru conservare pe mediu: T= +4 ⁰C (± 1⁰C), umiditatea relativă a aerului = 30 – 40%, iar porcentul de umiditate al semințelor între 5 – 8% (Străjeru și colab., 2001).

Deoarece pierderile economice cauzate de micotoxine se produc pe tot parcursul lanțului alimentar.

În plus, ca rezultat al consumului de către animale a furajelor contaminate, care conțin de regulă mai multe micotoxine, există riscul major ca micotoxinele să ajungă în produsele alimentare de origine animală – ouă, lapte, carne.

În acest context, se impune nesesitatea dezvoltării capacității de determinare a conținutului de micotoxine pe întreg lanțul alimentar: plantă- animal- produse alimentare de origine animală.

În aceste sens vom utiliza:

medii de cultură specifice: CGA, Sabourand

termostat

microscop.

CAPITOLUL V

MATERIALUL TESTAT

Materialul testat constă în:

probe de grâu Triticum aestivum Ssp. Vulgare, soi din varietatea Erythrospermum, Crișana

probe de grâu Triticum aestivum ssp. vulgare, soi din varietatea Erythrospermum, Alex – Lovrin 50.

Primul soi de grâu Crișana a fost creat la SCDA Oradea. Este un soi semidardiv spre tardiv are o rezistență medie la condițiile de iernare și o rezistență bună la cădere, secetă și arșiță. Soiul este sensibil la făinare mijlociu de rezistent la septorioza frunzelor, tolerant la o concentrație mai mare cu ioni de aluminiu.

Se încadrează în grupa soiurilor cu însușiri pentru panificație foarte bune.

Al doi-lea tip de soi Alex – Lovrin 50 a fost creat la SCA Lovrin. Acesta este un soi semitimpuriu, zonat în câmpia din vestul și sudul țării.

(Sursa: [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], AdrianBorcean – ” Tehnici de cultură și protecție a cerealelor și leguminoaselor” – [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] – 2006)

Probele au fost prelevate în luna iulie 2013.

În figura 5.1 sunt prezentate probele testate.

Figura 5.1

Material testat: grâu

CAPITOLUL VI

METODE UTILIZATE ÎN DETERMINĂRI

6.1.Pregătirea preliminară a probelor

Materialul biologic ales este reprezentat de populații locale și soiuri ce aparțin la o specie de cereale ( Triticum aestivum), cu două soiuri: Crișana si Alex – Lovrin 50. În cadrul fiecărui soi s-au constituit 5 probe medii de 100 semințe din fiecare soi:

semințele conservate timp de 7, 14 și 28 zile la temperatura de + 4 ⁰C (pentru Triticum aestivum) pentru primul si al doi-lea soi.

Majoritatea probelor de semințe provin din aceeași categorie biologică (populații locale). Probele luate in studiu au origini diferite, provenind din expedițiile de colectare realizate.

Pentru probele de semințe studiate s-au folosit metodele clasice de analiză fitopatologică (metoda Ulster pe mediu CGA (cartof – dextroză – agar), metoda sugativei și metoda Sabourand (extract de drojdie – dextroză – cloramfenicol – agar), metoda cromatografiei în strat subțire (CSS) – pentru aflatoxina B1, respectiv metoda imunoenzimatică ELSA pentru determinarea calitativă a micotoxinelor (aflatoxinele totale B1+B2+G1+G2, ochartoxina A, zearalenona) și metoda preparatelor microscopice pentru analiza citogenetică.

Pentru a face posibil acest studiu fitopatologic de evaluare a micromicetelor prezente pe cariopsele de cereale precum și pentru probele analizate s-au aplicat următoarele metode:

Analiza macroscopică a seminței;

Metoda mediului CGA (cartof – dextroxă – agar);

[NUME_REDACTAT] (extract de drojdie – dextroză – cloramfenicol – agar).

6.2.Metode calitative

Există trei tipuri de metode analitice pentru evidențierea micotoxinelor și evaluarea lor aproximativ calitativă:

Metode de screening rapid

Metode de screening cromatografic și biologic

Teste de confirmare

Teste de screening rapid

Testul de câmp întunecat

Testul de câmp întunecat este o metodă de teren, simplă din punct de vedere tehnic, putând fi aplicată și la nivelul silozurilor, de persoane cu pregătire medie. Se folosește pentru detectarea și determinarea semicantitativă a aflatoxinelor din boabele de porumb, grâu, ovăz, sorg, soia, orez, arahide. Principiul acestei metode se bazează pe proprietatea aflatoxinelor de a emite fluorescență în lumină UV de 254-366 nm. Pentru a putea pune în practică acest test avem nevoie de o lampă generatoare de UV cu lungimea de undă de 254-366 nm și o cameră obscură fixă sau portabilă. Limita minimă de detecție este de 10 ppb.

Metodologia de lucru: Se cântăresc 100 g boabe din proba medie de examinat, se aleg boabele sparte de cele întregi, cântărindu-se separat. Boabele întregi se decojesc și se evidențiaza embrionul. Boabele pregătite se așează cu embrionul în sus pe un platou, se introduc în camera obscură a cabinetului UV și se examinează. Se separă boabele fluorescente de cele nefluorescente. Fluorescența galbenă-verzuie indică prezența aflatoxinelor, acesta este vizibilă când în substrat există minimum 10 ppb. Acest test are numai o valoare orientativă, motiv pentru care probele pozitive trebuie examinate prin cromatografie. Testul nu poate fi folosit pentru determinări la probele alimentare, altele decât boabele, și nici la probele recoltate de la bolnavi (Coman și Popescu, 1985).

Testele de minicoloană

Testele de minicoloană sunt procedee rapide de screening pentru micotoxine, se folosesc la nivelul depozitelor pentru examinarea boabelor de cereale și oleaginoase pentru detectarea și determinarea semicantitativă a aflatoxinelor și ochratoxinei A, având o sensibilitate de 4 ppb respectiv 8 ppb.

Minicoloana pentru determinarea aflatoxinelor este un tub de sticlă nefluorescentă cu lungimea de 150 mm și cu diametrul de 8 mm, în care se introduce ca umplutură florisil (100-200 mesh) cu înălțimea de 15 mm la partea inferioară și alta de 15 mm cu oxid de aluminiu neutru la partea superioară.

Minicoloana pentru determinarea ochratoxinei A este construită dintr-un tub de aceeași dimensiune umplut pe o înălțime de 60 mm cu florisil.

Reactivi:

solvenți de extracție: metanol – apă 8:2 (v/v);

soluție de spălare: sulfat de zinc (150 g), apă distilată până la 1000 ml;

soluție hexan – acetonă 8:2 (v/v);

benzen chimic pur, alcool metilic 80%, acid sulfuric 0,25 N.

Tehnica de lucru:

La boabele de cereale măcinate fin, se adaugă solventul de extracție după care se agită între 2 – 5 minute, prelungindu-se timpul de extracție în cazul semințelor oleaginoase între 5 – 10 minute. Proporția de 1:2 între greutatea probei și volumul solventului de extracție trebuie respectată. Se filtrează prin hârtia de filtru și se rețin 15 ml într-o eprubetă cu dop rodat. Se adaugă 15 ml soluție de spălare după care se agită. Amestecul se filtrează printr-un disc de fibră de sticlă, reținându-se 15 ml filtrat.

Trei mililitri benzen se introduc, se închide eprubeta și se agită din nou, după care se lasă în repaus pentru separarea straturilor. Din stratul superior benzenic se recoltează 1 ml cu pipeta și se transferă la partea superioară a minicoloanei pentru aflatoxină. Se racordează partea inferioară la o pompă de vacuum. După ce benzenul a fost aspirat se adaugă la partea superioară a coloanei 5 ml soluție hexan-acetonă și se aspiră din nou timp de 2 minute. Minicoloana se examinează în lumină UV de 366 nm. Prezența unui inel cu fluorescență albastră, discretă, la interfața dintre florisil și alumină indică prezența în probă a aproximativ 4 ppb aflatoxină. Atunci când intensitatea fluorescenței inelului este mai mare, extractul benzenic se diluează până fluorescența devine discretă. Ținând seama de factorul de diluție se calculează concentrația reală a aflatoxinei în proba examinată.

În cazul determinării ochratoxinei A, se adaugă 1 ml din soluția benzenică rămasă pe minicoloana corespunzătoare acestui tip de micotoxină, care fusese în prealabil racordată la vacuum. Se adaugă 3 ml alcool metilic, după ce benzenul a fost aspirat, la partea superioară a coloanei și se continuă vacuumarea timp de 15 – 20 secunde. Sursa de vacuum se îndepărtează și se adaugă 0,3 ml acid sulfuric 0,25 N după care se examinează minicoloana la lumină UV de 366 nm.

Apariția unei benzi albastre fluorescente discrete la aproximativ 1 cm de limita superioară a stratului de florisil arată o concentratie de aproximativ 8 ppb ochratoxină A la probele de porumb, orez sau arahide și de aproximativ 16 ppb la probele de orz, grâu, sorg sau secară.

Pentru o probă timpul mediu de lucru este de aproximativ 15 minute pentru screeningul ambelor micotoxine (Coman I. și col., 2007).

Testele de tip card

Avantajele acestor metode sunt ușurința în execuție, expeditivitatea și investițiile mici în aparatură.

Probele pozitive, fiind teste calitative, trebuiesc analizate în continuare prin proceduri cantitative, care sunt mult mai costisitoare.

Metode de screening cromatografic

Sunt metode de înaltă eficacitate, de precizie și de confirmare.

Executarea acestor procedee implică laboratoare cu dotări tehnico-materiale superioare și personal bine instruit.

Cromatografia în general și cromatografia în strat subțire în special este o metodă foarte utilă de analiză micotoxicologică în scopul identificării precise cu micotoxine standard de referință și rapide a micotoxinelor în probele de analizat (alimente, furaje, extracte de miceți potențial toxigeni etc.).

Există multe metode de screening cromatografic pentru micotoxine, însă pentru diagnosticul micotoxicologic sunt de preferat metodele care permit separarea și identificarea simultană a micotoxinelor în probele de analizat.

Principiul metodei

Principiul metodei constă în izolarea micotoxinelor prezente în substrat prin extracție cu solvenți organici, după care se face separarea pe plăci cromatografice și identificarea lor pe baza culorii fluorescenței și a valorii Rf – ului, în lumina UV cu lungimea de undă de 254 – 366 nm.

Metodele fizice, chimice sau fizico – chimice se folosesc pentru confirmare. Sunt de preferat primele pentru că sunt mai simple și expeditive (Coman I. și col., 2007).

Pregătirea probelor

Se cântăresc probele la balanța analitică. Se va folosi apa dublu distilată sau deionizată, iar reactivii folosiți trebuie să fie în termenul de valabilitate.

Aparatura și reactivii folosiți

Aparatura:

Cameră obscură pentru vizualizare în UV cu lungimea de undă de 254 – 366 nm

Balanță tehnică

[NUME_REDACTAT] magnetic

Tanc pentru cromatografie sau cameră cromatografică cu capac de etanșeizare

[NUME_REDACTAT]

Baie de apă

Micropipete automate de 20 µl și vârfuri mobile din material plastic

Microseringă de 5 µl

Cilindri gradați de 50 ml, 100 ml, 250 ml

[NUME_REDACTAT] de filtru

Plăci cromatografice

Pâlnii de separare

Tampoane din material textil

Reactivi necesari: acetonă, metanol, alcool absolut, cloramină, apă oxigenată, sulfat de sodiu anhidru, hipoclorit de calciu, amidon, ALL-Dec FORTE (Coman I. și col., 2007).

Micotoxine standard

Aflatoxina B1 0,25 – 0,50 µg / ml benzen

Aflatoxina B2 0,25 – 0,50 µg / ml benzen

Aflatoxina G1 0,25 – 0,50 µg / ml benzen

Aflatoxina G2 0,25 – 0,50 µg / ml benzen

Amestec de aflatoxine 0,5 – 1,0 µg / ml benzen, ochratoxina A 10 µg / ml benzen, sterigmatocistina 10 µg / ml benzen, zearalenonă 0,1 – 1,0 µg / ml benzen, citrinină 0,5 – 1,0 µg / ml cloroform.

Micotoxinele etalon dizolvate în solvenți specifici vor fi menținute la frigider la o temperatură de 4ºC.

Sistem de solvenți pentru extracția micotoxinelor:

Cloroform : apă, 85 : 15 (v / v)

Clorură de metilen : apă, 85 : 15 (v / v)

Acetonă : apă, 85 : 15 (v / v)

Alcool metilic : apă, 85 : 15 (v / v)

Sistem de solvenți de developare toluen : acetat de etil : acid formic, cu o proporție de 6 : 3 : 1 (v / v / v)

Solvenți pentru degresare: eter de petrol

Solvenți de etalare: benzen, acetonitril, cloroform, clorură de metilen, acetat de etil sau benzen – acetonitril, 98 : 2 (v/v)

Amestec de diazotare:

– soluția 1: 0,5 g benzidină se introduc într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 20 ml apă, 1,5 ml acid clorhidric concentrat, după care se aduce la semn cu apă bidistilată.

– soluția 2: 10 g azotit de sodiu se introduc într-un balon cotat de 100 ml și se aduce la semn cu apă bidistilată.

Cele două soluții se amestecă în momentul folosirii în proporție de 1 : 1 (v / v). La început amestecul este de culoare portocalie închis, însă după câteva minute devin galben pal.

Soluție paraanisaldehidă: metanol – acid acetic glacial – acid sulfuric concentrat – p – anisaldehidă 85 : 10 : 5 : 0,5 (v / v / v / v).

Soluție etanolică de clorură ferică 1%

Soluție apoasă de KOH 20% (Coman I. și col., 2007).

Tehnica de lucru

Degresarea, extracția și purificarea probei

Din proba măcinată se introduc într-un pahar Berzelius sau Erlenmeyer de 500 ml, 100 g din probă, la care se adaugă o cantitate dublu de sovent de degresare și se pune 30 de minute pe un agitator magnetic, după care se decantează, se îndepărtează solventul. Se adaugă peste proba degresată 200 ml solvent de extracție, se lasă la întuneric 6 ore când extracția se face la rece, agitând conținutul balonului. Se adaugă 10 g sulfat de sodiu anhidru, după care se filtrează prin hârtia de filtru. Se evaporă la sec extractul obținut într-un rotavapor sau pe o baie de apă termoreglabilă cu temperatura de 60 – 65ºC (Coman I. și col., 2007).

Pregătirea plăcii și a tancului cromatografic

Vasul (tancul) de developare trebuie pregătit înaintea cromatoplăcii, deoarece în interiorul acestuia trebuie să se realizeze o atmosferă saturată în vapori cel puțin 30 de minute înaintea introducerii plăcii. Pentru aceasta, partea interioară a tancului se căptușește cu hârtie de filtru, care se îmbibă cu solvenți de developare, după care se introduce amestecul de solvenți, care asigură migrarea fracțiilor fluorescente într-o cantitate al cărui nivel nu trebuie să depășească 0,5 cm înălțime. Tancul se acoperă cu capacul de etanșeizare după care se lasă în repaus pe o suprafață plană (Coman I. și col., 2007).

Pregătirea plăcii cromatografice începe odată cu activarea acesteia prin introducerea ei în etuvă la temperatura de 110 – 115ºC. După 30 de minute pe placă se marchează discret linia de start, la aproximativ 2 cm de la marginea inferioară a plăcii, unde vor fi etalate extractele brute și micotoxinele standard. De la linia de start se trasează în plan vertical cu ajutorul unui obiect ascuțit (bisturiu), la o distanță de aproximativ 0,8 cm una de cealaltă respectiv de marginile plăcii, liniile care vor marca pozițiile individuale de migrare ale solventului de irigare, care antrenează și substanțele dizolvate, inclusiv micotoxinele.

Se introduc câte 500 µl soluție de etalare în baloanele în care s-a realizat evaporarea solventului de extracție. În mijlocul fiecărui culoar de irigare, la linia de start, se spotează cu o micropipetă micotoxinele standard, în alternață cu extractele produselor în următoarea configurație descrisă de Coman I. și col. (2007):

În prima poziție se etalează 5 µl aflatoxină B1 și 5 µl soluție etalon de sterigmatocistină

În poziția a doua se aplică 5 µl soluție etalon de aflatoxină B2 și 5 µl soluție etalon de zearalenonă

În poziția trei se aplică 10 µl soluție din prima probă

În poziția nr. patru se spotează 5 µl soluție etalon de aflatoxină G1 și 5 µl soluție etalon de zearalenonă

În poziția a cincia se aplică 5 µl soluție etalon de aflatoxină G2

În mijlocul culoarului al șaselea se spotează 10 µl din proba a doua

În poziția a șaptea se spotează 5 µl din amestecul celor patru aflatoxine (B1, B2, G1, G2)

În poziția a opta se etalează 5 µl soluție de citrinină

În poziția a noua se spotează 10 µl din proba a treia

În poziția a zecea se spotează 10 µl din proba a patra

În poziția a unsprezecea se spotează 5 µl din amestecul de aflatoxine, sterigmatocistină, zearalenonă

În poziția a douăsprezecea se etalează 5 µl de citrinină.

Se marchează cu un creion fiecare culoar al plăcii cromatografice, în partea superioară a acesteia, cu abrevierea micotoxinelor și numărul probei.

Placa pregătită se introduce în tancul cromatografic astfel încât, marginea inferioară a plăcii, unde a fost etalat materialul de examinat, să coboare în solventul de irigare până la înălțimea de 0,5 – 0,6 cm. Aceasta se menține în tanc până când frontul solventului de irigare ajunge la 1 – 2 cm de limita ei superioară. Placa se scoate din tanc, se usucă excesul solventului în curent de aer cald timp de câteva minute, notându-se cu vârful creionului limita până la care a migrat solventul de irigare.

Pentru a fi examinată placa se introduce în camera obscură la lumină UV cu lungimea de undă de 254 – 366 nm (Coman I. și col., 2007).

Identificarea micotoxinelor

Plăcile cromatografice sunt analizate în lumină UV și se notează cu vârful unui creion zona centrală a spoturilor, care au aceeași fluorescență cu micotoxinele standard, precum și zonele centrale ale acestora, deoarece identificarea micotoxinelor se face prin coroborarea culorii fluorescenței spotului în lumină UV cu valoarea Rf-ului. Raportul zonelor de fluorescență se calculează cu ajutorul relației:

Rf = d1 / d2 , în care:

d1 – distanța de migrare în mm a micotoxinei de la linia de start până la nivelul spotului (central zonei de fluorescență)

d2 – distanța dintre linia de start și linia până la care a migrat solventul de irigare (mm).

Teste de confirmare

Nesiguranța testelor de screening poate fi redusă prin testele de confirmare. Atât testele se screening cât și cele de confirmare sunt calitative, însă cu roluri diferite, primele permit descoperirea probelor presupuse pozitive, iar testele de confirmare separă pe cele adevărat pozitive de cele fals pozitive.

Testele de confirmare se pot face prin metode fizice, chimice sau fizico-chimice fie în situ pe placa cromatografică fie în afara acesteia. Mai uzuale sunt primele, deoarece sunt expeditive și simple.

Testul de confirmare urmărește descoperirea unei sau a unor proprietăți fizico-chimice a unei substanțe presupusă a fi micotoxină identică sau identice cu ale micotoxinei standard corespunzătoare. Identificarea micotoxinelor se face pe baza culorii fluorescenței spoturilor din proba de analizat pe baza valorii Rf-ului în funcție de rezultatul metodei standardului intern. [NUME_REDACTAT]-ului sunt doar orientative și trebuie determinate de fiecare dată când se analizează o probă, utilizând micotoxinele standard de referință pe aceeași placă cromatografică. Când se analizează o probă alături de micotoxina standard de referință și în probă se descoperă mai multe spoturi apropiate, cu florescență și Rf-uri asemănătoare, este dificil de identificat o anumită micotoxină.

Testele fizice de confirmare urmăresc evidențierea unor proprietăți fizice comune spotului presupus a fi micotoxina căutată și a spotului micotoxinei standard corespunzătoare.

Testele chimice implică separarea extractelor de probă pe plăci cromatografice cu strat subțire urmată de derivatizarea in situ a spoturilor fluorescente cu anumiți reactivi care modifică culoarea fluorescenței inițiale.

Testele fizico-chimice sunt mai complexe și presupun o dotare specială a laboratorului. Cele mai utilizate metode sunt cromatografia în fază de gaz-lichid și spectroscopia de masă.

Confirmarea micotoxinelor prin teste de derivatizare

În aceleași condiții de lucru aceeași micotoxină are o anumită fluorescență în lumină UV de 254 – 366 nm și o anumită valoare Rf. Dacă se analizează o probă alături de micotoxina standard iar în probă se descoperă mai multe spoturi apropiate cu fluorescență și Rf-uri asemănătoare este dificil de identificat o anume micotoxină. Pentru aceasta derivatizarea poate fi un test de clarificare. În acest sens placa cromatografică, după ce a fost vizualizată în camera obscură, unde zonele incerte au fost identificate cu un marker, este retrasă, iar suprafața ei se pulverizează cu o soluție de derivatizare. Placa se introduce după pulverizare în etuvă, timp de 2 – 3 minute, la o temperatură de 60ºC. Aceasta va fi examinată din nou în lumină UV iar dacă fluorescența are modificări asemănătoare celor din etaloane poate fi confirmată prezența micotoxinei în proba analizată (Coman I. și col., 2007).

Tehnica standardului intern

La linia de start a plăcii cromatografice se spotează un volum precis din proba cu rezultate incerte, în două puncte apropiate (1 și 2) și un volum precis de soluție standard de aflatoxină B1 (a cărei prezentă este suspectată), cu concentrația cunoscută, în două puncte separate, din care unul într-un punct în care a fost spotată proba de analizat (2), iar celălalt într-un punct separat apropiat (3).

Dacă aflatoxină B1 este prezentă în proba de analizat, atunci se va obține un spot cu o fluorescență corespunzătoare micotoxinei din punctul 1, iar în punctul 2 un spot mai mare sau mai strălucitor, corespunzător sumării cantităților celor 2 aflatoxine din proba de analizat și din proba standard , iar în punctul 3 un spot corespunzător ca intensitate și culoare aflatoxinei B1 standard.

Atunci când micotoxina căutată în probă nu este aflatoxina B1 în punctul 1 se obține o fluorescență asemănătoare aflatoxinei B1, dar cu Rf diferit, iar în punctul 2 două spoturi separate unul corespunzător aflatoxinei standard, iar celălalt unei substanțe fluorescente oarecare prezentate în probă, iar în punctul 3 un spot identic cu al aflatoxinei standard (Coman I. și col., 2007).

6.3.Metode cantitative

Determinarea micotoxinelor din produsele alimentare și furajere folosind metode rapide, moderne, test care nu necesită aparatură și echipamente costisitoare. Aceste metode au însă inconvenientul că în cazul în care rezultatele sunt pozitive, acestea trebuiesc confirmate prin examene mult mai complicate și cu aparatură performantă.

CSS și GC sunt înlocuite treptat cu metode mai dificile, mai complexe, cu aparaturămai precisă, mai sigure precum HPLC și LC/MS (Coman I. și col., 2007).

HPLC este o metodă foarte utilizată pentru detectarea micotoxinelor, este o metodă sigură, necesită timp, aparatură scumpă și personal calificat.

Cromatografia în strat subțire permite separarea și identificarea micotoxinelor prezente în substraturile alimentare (Coman I. și col., 2007).

Testul imunoenzimatic ELISA este superior cromatografiei în strat, deoarece permite evaluarea cantitativă a micotoxinelor din substraturi până la nivel de ppt, necesită consum mic de materiale, este expeditivă, poate fi automatizată.

Sunt mai multe variante tehnice de realizare a testului imunoenzimatic ce are la bază utilizarea anticorpilor specifici pentru micotoxina incriminată și interpretarea rezultatelor pe baza unei reacții de culoare detectabilă cu ochiul liber sau cu un fotometru (Boicu, 2007, citat de Coman I. și col., 2007).

Etapele testului ELISA sunt descrise de Boicu (2007) și citate de Coman I. și col. (2007) astfel:

etapa I – se adaugă standardele sau probele de analizat în sistemul de lucru

etapa a II a – se introduce conjugatul enzimatic

etapa a III a – se adaugă anticorpul specific

etapa a IV a – începe reacția cu stabilirea unor echilibre dinamice între standarde sau probă și conjugatul enzimatic în postură legată sau nelegată

etapa a V a – se îndepărtează reactivii aflați în exces prin trei spălări succesive

etapa a VI a – îndepărtarea totală a reactivilor

etapa a VII a – se adaugă substratul specific, care în prezența enzimei produce un element colorat

etapa a VIII a – se adaugă soluția de stopare, culoarea apărută este măsurată cu ajutorul unui fotometru

etapa a IX a – se tratează curba standard de etalonare și se interpretează rezultatele, concentrația micotoxinelor fiind exprimată în ppb.

Principiul metodei constă în interacțiunea dintre anticorpii anti-IG care căptușesc godeurile plăcii și antigenii din proba suspectă.