Metode de Determinare a Capacitatii Antioxidante a Extractelor din Plante

BIBLIOGRAFIE

Dinoiu, V., Concepte moderne ȋn chimia organică, [NUME_REDACTAT], 2013, p.193-214.

Vina, J., Lloret, A.; Orti, R.; Alonso, D., Molecular bases of the treatment of Alzheimer’s dioseare with antioxidants: prevention of oxidative stress, [NUME_REDACTAT] of Medicine, 2004, 25(1-2), p. 117-123.

Olthof, M.R., Hollman, P.C.H., Katan, M.B., Chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed in humans, [NUME_REDACTAT] of Nutrition, 2001, 131(1), p. 66-71

Pourmorad, F., Hosseinimehr, S.J., Shahahbimajd, N., Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants, [NUME_REDACTAT] of Biotechology, 2006, 5(11), p. 1142-1145.

http://en.wikipedia.org/wiki/Oxygen_toxicity, 12.06.2014

Mohammad, A., Health effects of omega-3,6,9 fatty acids, [NUME_REDACTAT]. Exp. Med., 2011, 11, p. 51–59.

Beer, D., Joubert, E., Marais, J., Manley, M., Unravelling the antioxidant capacity of pinotage wines: contribution of phenolic compounds, J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 2006, 54(8), p. 2897-2905.

http://en.wikipedia.org/wiki/Free-radical_theory_of_aging, 12.06.2014

Kovács, Z., Dinya, Z., Examination of non-volatile organic compounds in red wines made in Eger, Microchem. J., 2000, 67(1-3), p. 57-62.

Pandey, K., Rizvi, S., Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]., 2009, 2(5), p. 270–278.

Simon, B., Perez-Ilzarbe, J., Hernandez, T., Gomez-Cordoves, C., Estrella, I., Importance of phenolic compounds for the characterization of fruit juices, J. Agric . [NUME_REDACTAT]., 1992, 40, p. 1531–1535.

Dudley, J., Lekli, I., Mukherjee, S., Das, M., Bertelli, A., Das, D.K., Does white wine qualify for french paradox? Comparison of the cardioprotective effects of red and white wines and their constituents: resveratrol, tyrosol and hydroxytyrosol, J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 2008, 56(20), p. 9362-9373.

G.J. Soleas, G. Tomlinson, E.P. Diamandis and D.M. Golberg, Relative contributions of phenolic constituents to the antioxidant status of wines: development of a predictive model, J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 1997, 45(10), p. 3995-4003.

Z. Kovács and Z. Dinya, Examination of non-volatile organic compounds in red wines made in Eger, Microchem. J., 2000, 67(1-3), p. 57-62.

Istudor, V., Farmacognozie. Fitochimie. Fitoterapie. Oze, ozide și lipide, [NUME_REDACTAT], București, 1998, 1, p. 95 – 103, 112 – 114, 145 – 157, 167 – 169, 170 – 177, 181 – 185, 187 – 197, 204 – 205.

Cercasov, C., Popa, C.V., Compuși naturali cu acțiune terapeutică Curs. Partea I, [NUME_REDACTAT] din București, 2005, p. 24-27, 37-70.

Andrei, C., Moraru, M., Flavonoide. I. Structuri și proprietăți, [NUME_REDACTAT] (Bucuresti), 2002, 53(12), p. 833-836.

Aron, M., Kennedy, A., Flavan-3-ols: nature, occurence and biological activity, Mol. Nutr. [NUME_REDACTAT]., 2008, 52(1), p. 79-10.

http://plantemedicinale.wikia.com/wiki/Rosmarinus_officinalis, 02.03.2014.

Erkan, N., Ayranci, G., Ayranci, E., Antioxidant activities of rosemary ([NUME_REDACTAT] L.) extract, blackseed (Nigella sativa L.) essential oil, carnosic acid, rosmarinic acid and sesamol, [NUME_REDACTAT], 2008, 110(1), p. 76-82.

http://en.wikipedia.org/wiki/Oregano .

Pizzale, L., Bortolomeatzzi, R., Vichi, S., Uberegger, E., Conte, L., Antioxidant activity of sage (Salvia officinalis and S fruticosa) and oregano (Origanum onites and O indercedens) extracts related to their phenolic compound content, J. Sci. [NUME_REDACTAT]., 2002, 82, p. 1645–1651.

http://ro.wikipedia.org/wiki/[NUME_REDACTAT], M., Berset, C., Richard, H., Antioxidant constituents in sage (Salvia officinalis), J. Agric. [NUME_REDACTAT].,1994, 42, p. 665–669.

http://www.scribd.com/doc/223798028/Metode-de-Obtinere-Si-de-Prelucrare-a-[NUME_REDACTAT], W.B., [NUME_REDACTAT] of the [NUME_REDACTAT], J. Chem. Educ., 2007, 84 (12), p. 1913.

Esclapez, M. D., García-Pérez, J.V., Mulet,  A., Cárcel, J.A., [NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] Reviews, 2011, 3(2), p. 108-120.

Neas, E.D., Collins, M.J., Introduction to microwave sample preparation, [NUME_REDACTAT] Society (Washington), 1988, 2, p. 7-32.

Kaufmann, B., Christen, P., [NUME_REDACTAT] Techniques for [NUME_REDACTAT]: Microwave-assisted Extraction and [NUME_REDACTAT] Extraction, [NUME_REDACTAT], 2002, 13, p.105–113.

Casas, L., Mantell, C., Rodrigueza, M., Torresb, A., Macias, F.A., Martinez, E., Extraction of natural compounds with biological activity from sunflower leaves using supercritical carbon dioxide, [NUME_REDACTAT] Journal, 2009, 152, p. 301–306.

Reid, R.C., Prausnitz, J.M., Poling, B.E., The properties of gases and liquids, 4th ed., Editura McGraw-Hill, [NUME_REDACTAT], 1987;

Dahmen, N., Kordikowscki, A., Schneider, G.M., Determination of [NUME_REDACTAT] Coefficients of [NUME_REDACTAT] in [NUME_REDACTAT] Dioxide by [NUME_REDACTAT], Journal of Chromatography, 1990, 505, p. 169-178.

Kedare, B., Singh, S.B., Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay, J. [NUME_REDACTAT]. Technol., 2011, 48(4) ,p. 412-422.

Meghea, A., Iftimie, N., Giurginca, M., Estimarea efectului antioxidant al extractelor din plante prin chemiluminescență, Rev. Chim. (Bucharest), 2004, 55(12), p. 1025-1028.

Parejo, I., Codina, C., Petrakis, C.,. Kefalas, P., Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH. (2,2,-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical assay, J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 2000, 44(3), p. 507-512.

Bard, A.J., Electrogenerated chemiluminescence, edited by A.J. Bard, [NUME_REDACTAT], Inc., [NUME_REDACTAT], 2004, p. 14-17.

Chang, C.C., Yang, M.H.,Wen, H.M., Chern, J.C., Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods, Journal of Food and [NUME_REDACTAT], 2002, 10(3), p. 178-182.

(a) http://en.wikipedia.org/wiki/Electron_paramagnetic_resonance; (b) Zavoisky, E., Zhurn. Eksperiment. Teor. Fiziki. 1944, 14, p. 407

Ioniță, P., Radicali liberi persistenți ȋn exemple și aplicații, Editura ARS DOCENDI,

Universitatea din București, 2010.

Balaban, A.T., Pogany, I., Banciu, M., Aplicații ale [NUME_REDACTAT] ȋn [NUME_REDACTAT], Editura științifică și Enciclopedică, 1983.

Molyneux, P., The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for

estimating antioxidant activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 2004, 26(2), p. 211-

219.

Koksal, E., Gulcin, I., Antioxidant activity of cauliflower, Turk J. Agric. For, 2008,

32, p. 65-78.

Lungu, L., Popa C.V., Săvoiu M., Dăneț A.F., Dinoiu V., Total antioxidant capacity of several synthetic phenols by a chemiluminscence method, The international conference of the Academy of Science of Moldova, May 28-30, 2014, Chișinău, Moldova.

44. Popa, C.V., Fărcășanu, I.C., Jipa, S., Zaharescu, T., Dăneț, A.F., [NUME_REDACTAT] of the [NUME_REDACTAT] Capacity of [NUME_REDACTAT], Rev.Chim. (Bucharest), 2012, 63(7), p.715.

Popa, C.V., Lungu, L., Săvoiu M., Bradu, C., Dinoiu, V., Dăneț, A.F., Total

antioxidant activity and phenols and flavonoids content of several plants extracts,

[NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT], 2012, 15, p. 691-701.

Buettner, G.R., Spin trapping : ESR parameters of spin adducts, [NUME_REDACTAT]

Biology and Medicine, 1987, 3, p.259-303.

CUPRINS

I PARTEA DE LITERATURĂ

Introducere

I.1. Antioxidanți

I.1.1. Antioxidanți fenolici de sinteză

I.1.2. Antioxidanți naturali

I.1.3. Radicalii liberi și efectele lor asupra organismului

I.2. Compuși cu structură fenolică ȋntâlniți în plante

I.2.1. Acizi polifenolici

I.2.2. Heterozide de tip Ar-C3-Ar

I.3. Extracte vegetale

I.3.1. Rosmarinus officinalis L. (Rozmarin)

I.3.2. Origanum vulgare L.(Oregano)

I.3.3. Salvia officinalis L. (Salvie)

I.4. Metode de obținere a extractelor vegetale

I.4.1. Extracția la rece

I.4.2. Extracția la cald cu aparatul Soxhlet

I.4.3. Extracția asistată de ultrasunete

I.4.4. Extracția prin iradiere cu microunde

I.4.5. Extracția cu lichide supercritice

I.5. Metode de determinare a capacității antioxidante a extractelor vegetale

I.5.1. Metode spectrofotometrice (DPPH)

I.5.2. Metode bazate pe luminiscență (Chemiluminiscența)

I.5.3. Metode spectrometrice (RPE)

II PARTEA EXPERIMENTALĂ

II.1. Obținerea extractelor vegetale

II.1.1. Obținerea extractelor prin extracție asistată de ultrasunete

II.1.2. Obținerea extractelor prin extracție continuă ( cu Soxhlet)

II.2. Metode de determinare a capacitații antioxidante a extractelor din plante

II.2.1. Metoda spectrofotometrică DPPH

II.2.2. Metode bazate pe luminiscență (Chemiluminiscența)

II.2.3. Studiul prin spectrometrie RPE al extractelor naturale

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

ANEXE

CUPRINS

I PARTEA DE LITERATURĂ

Introducere

I.1. Antioxidanți

I.1.1. Antioxidanți fenolici de sinteză

I.1.2. Antioxidanți naturali

I.1.3. Radicalii liberi și efectele lor asupra organismului

I.2. Compuși cu structură fenolică ȋntâlniți în plante

I.2.1. Acizi polifenolici

I.2.2. Heterozide de tip Ar-C3-Ar

I.3. Extracte vegetale

I.3.1. Rosmarinus officinalis L. (Rozmarin)

I.3.2. Origanum vulgare L.(Oregano)

I.3.3. Salvia officinalis L. (Salvie)

I.4. Metode de obținere a extractelor vegetale

I.4.1. Extracția la rece

I.4.2. Extracția la cald cu aparatul Soxhlet

I.4.3. Extracția asistată de ultrasunete

I.4.4. Extracția prin iradiere cu microunde

I.4.5. Extracția cu lichide supercritice

I.5. Metode de determinare a capacității antioxidante a extractelor vegetale

I.5.1. Metode spectrofotometrice (DPPH)

I.5.2. Metode bazate pe luminiscență (Chemiluminiscența)

I.5.3. Metode spectrometrice (RPE)

II PARTEA EXPERIMENTALĂ

II.1. Obținerea extractelor vegetale

II.1.1. Obținerea extractelor prin extracție asistată de ultrasunete

II.1.2. Obținerea extractelor prin extracție continuă ( cu Soxhlet)

II.2. Metode de determinare a capacitații antioxidante a extractelor din plante

II.2.1. Metoda spectrofotometrică DPPH

II.2.2. Metode bazate pe luminiscență (Chemiluminiscența)

II.2.3. Studiul prin spectrometrie RPE al extractelor naturale

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

ANEXE

[NUME_REDACTAT] ultimii ani s-a constatat o creștere deosebită a interesului aplicării antioxidanților, ȋn special cei naturali, ȋn tratamentul medical al diferitelor boli provocate de așa numitul stres oxidativ. Ipoteza general acceptată astăzi este că ȋn orice sistem biologic trebuie să existe un important echilibru ȋntre formarea de specii reactive ce conțin oxigen și azot (numite ȋn literetura de specialitate specii ROS, respective RNS, avȃnd centrul radicalic pe atomul de oxigen, respective nitrogen) și eliminare lor din sistem [1]. Orice rupere a acestui echilibru ȋnseamnă declanșarea multor boli degenerative.

Speciile ROS și RNS sunt produse ale funcțiunii normale ale organelor din sistemul biologic sau sunt un rezultat al excesului de stres oxidativ (procesul de degradare oxidativă) [2].

Speciile reactive cum sunt oxigenul molecular anionic, numit și superoxid (O2-), peroxidul de hidrogen (H2O2), radicalul hidroxi (HO∙), peroxinitrit (ONOO-), radicalul oxid de nitrogen (NO∙), precum și acidul hipocloros (HOCl), toate sunt produse ale metabolismului normal din organismul uman, dar ȋn anumite condiții ele pot exercita o acțiune distructivă asupra țesuturilor umane [1].

Superoxidul, cea mai importantă sursă de inițiere de radicali in vivo, este produs ȋn mitocondria ȋn timpul transferului de electroni din reacțiile ȋn lanț ce au loc ȋn orice sistem biologic. Antidotul lui din sistemul biologic este enzima superoxid dismutaze, SOD ce catalizează neutralizarea lui, asigurȃnd astfel echilibrul oxido/redox necesar funcționării normale a sistemului biologic.

Pentru a menține un echilibru oxido/redox, sistemul biologic se autoprotejează față de excesul de specii radicalice agresive ROS/RNS ȋn diferite feluri, incluzȃnd și folosirea de antioxidanți endogeni și exogeni.

Sistemele vegetale conțin o multitudine de substanțe cu activitate antioxidantă datorită compușilor fenolici (antocianine, flavanoli, flavonoli, izoflavone, flavan-3-oli, acizi hidroxicinamici). Activitatea antioxidantă a polifenolilor din plante se bazează pe capacitatea lor de captare a radicalilor liberi, cu acțiune biochimică agresivă, destructivă, precum și pe capacitatea lor de chelare a ionilor metalelor tranziționale [1].

Fructele, legumele și cerealele au fost explorate științific datorită abundenței lor ȋn hrana umană și a capacității lor de prevenire a diferitelor boli, precum cancer sau boli cardiovasculare. Din acest motiv, ȋn ultimii ani, interesul utilizării antioxidanților naturali ȋn locul celor de sinteză (suspectate că prezintă risc carcinogenic pentru oameni) a crescut foarte mult [3].

În hrana oamenilor oxidarea lipidică este principalul factor de deteriorarea a aromei, calitățiilor nutritive și a sănătății, prin modificarea țesuturilor umane și apariția diverselor boli [1].

Prezenta lucrare are ca scop studiul capacității antioxidante a trei extracte naturale și anume: Rozmarin (Rosmarinus officinalis L.), Oregano (Origanum vulgare L.) și Salvie (Salvia officinalis L.) prin două metode spectrofotometrice (DPPH, respectiv detecție

chemiluminometrică (FIA-CL), bazată pe sistemul (luminol/Co(II)/ EDTA/H2O2 ) și o metodă

spectrometrică ([NUME_REDACTAT] de Electron, RPE).

Extractele naturale au fost obținute prin două metode, una clasică continuă (Soxhlet)

cealaltă asistată de ultrasunete (US) pentru a observa eventuale deosebiri ȋn ceea ce privește activiatatea lor antioxidantă.

Prin cele două metode spectrofotometrice, DPPH și FIA-CL s-a pus ȋn evidență

comparativ activitatea antioxidantă a celor trei extracte prin măsurarea capacității antioxidante totale.

[NUME_REDACTAT] Paramagnetică de Electron, RPE s-a ȋncercat punerea ȋn evidență a radicalilor liberi cu centrul radicalic pe atomul de oxigen (aroxili), spectrele RPE fiind efectuate ȋn doi solvenți cu polaritate diferită etanol, respectiv diclormetan (DCM).

I.1. [NUME_REDACTAT] generală

Se pornește de la principiul acceptat de oamenii de știință și anume:”Cine stăpȃnește antioxidarea, controlează ȋmbătrȃnirea”[1]. Ținȃnd cont de această afirmație, putem spune că antioxidarea este un domeniu al chimiei organice destul de studiat mai ales ȋn țesuturile vii. Procesul de oxidare conduce la deterioarea celulelor astfel că prevenirea sau scăderea oxidării contribuie la ȋmbunătățirea și menținerea starii noastre de sănătate. Acest domeniu cuprinde două ramuri de cercetare și anume: sinteze de noi antioxidanți, respectiv noi cercetări ȋn ceea ce privește antioxidanții naturali. Sinteza de noi antioxidanți fenolici este utilizată ȋn industria cosmeticelor, polimerilor, ambalajului alimentar etc. Pe de altă parte obținerea de antioxidanți naturali prezintă o importanță destul de semnificativă deoarece cu ajutorul extractelor naturale putem obține antioxidanți ce nu pot fi obținuți prin sinteze chimice de către om [1].

Știm că oxigenul este un element chimic care nu se poate observa cu ochiul liber și o altă caracteristică a sa destul de importantă ar fi că acesta este indispensabil vieții. Oxigenul este necesar ca metabolismul să funcționeze și să transforme nutrienții ȋn energie, energie utilizată pentru tot ce se ȋntȃmplă ȋn corpul uman ca de exemplu: menținerea temperaturii constante a organismului [5]. În același timp putem spune că foarte puțini oameni știu că acest element chimic poate fi daunător țesuturilor biologice [5].

Se cunoaște că antioxidanții ȋncetinesc procesele de autooxidare [1]. Acest lucru e posibil prin capturarea speciilor radicalice reactive ce conțin oxigen și azot, numite ȋn literatura de specialitate specii ROS, respectiv RNS [1]. Aceste specii radicalice au centrul radicalic pe atomul de oxigen, respectiv azot lucru ce permite inițierea reacțiilor radicalice ȋn lanț [1]. Structura fenolică, Ar-OH este ȋntalnită la enzime, antioxidanți naturali și antioxidanți sintetici. Aceste structuri fenolice inhibă speciile reactive radicalice, ROO• transformȃndu-le ȋn hidroperoxizi [1].

[NUME_REDACTAT]-OH + ROO• ↔ ArO• + ROOH

Terminarea autooxidării inhibate

ArO• + O2 → Ar(=O)OO•

ArO• + RH → ArOH + R•

ArO• +ArO• → produși nonradicalici

Foarte mult timp acest mecanism de reacție s-a crezut a fi unul bazat pe transfer de hidrogen (mecanism HAT), ȋnsă ȋn 2002 cȃțiva cercetători au propus un mecanism bazat pe transfer de electroni (mecanism cunoscut sub denumirea de PCET), mecanism ce leagă hidrogenul fenolic de radicalul peroxi prin legătură de hidrogen [1]. Acest hidrogen migrează ca un proton la perechea de electroni neparticipanți din radicalul peroxi cuplat cu mișcarea unui electron din perechea de electroni de pe orbitalul 2p din oxigenul fenolic la orbitalul ce conține un electron neȋmperecheat din radicalul peroxi, astfel că electronul circulă ȋntre doi orbitali de legatură (Schema 1) [1].

Schema 1

I.1.1. Antioxidanți fenolici de sinteză

Bazȃndu-ne pe abilitatea de a ceda un hidrogen și pe entalpia de disociere a legaturii dintre oxigenul fenolic și hidrogen putem spune că structurile fenolice sunt antioxidanți eficienți. Nucleul aromatic prezintă o densitate de electron care conduce la scăderea acestei entalpii de disociere prin stabilizarea electronului neȋmperecheat din radicalul fenoxil [1]. Din acest motiv, grupările donoare de electroni din pozițiile 2,6 respectiv grupările din poziția para fac ca fenolii astfel disubstituiți să fie antioxidanți puternici. Un antioxidant puternic ar fi α-Tocoferol, numit și Vitamina E care prezintă ȋn para o grupare alcoxi și ȋn orto grupe alchil [1]. Însă antioxidanții fenolici au o limitare: dacă s-ar micșora potențialul de ionizare atunci fenolul ar reacționa cu oxigenul molecular și se vor genera specii radicalice reactive ROS care inițiază autooxidarea (Schema 2) [1].

Schema 2

Deci am putea spune că oxidarea ȋn aer ar deveni o mare problemă pentru antioxidanții fenolici de sinteză.

Deși s-au mai ȋncercat sinteze de noi structuri, acest lucru a fost ȋn zadar. În 1995 s-a observat un progres ȋn ceea ce privește ȋmbunătățirea activității antioxidante a unui antioxidant fenolic cum ar fi cromanolul pentametilat A, grupare ce se găsește ȋn Vitamina E (Schema 3) [1].

Schema 3

Acest lucru a fost realizat de către colectivul condus de profesorul [NUME_REDACTAT], din Canada care a observat că ȋntre nucleul aromatic și perechea de electroni a heteroatomului există o interacțiune, motiv pentru care a ȋnlocuit ciclul croman de 6 atomi cu unul de 5 atomi, Kinhibare mărindu-se de două ori [1]. [NUME_REDACTAT] are ideea de a ȋnlocui oxigenul legat de nucleul aromatic cu azot, lucru ce ar fi dus la obținerea unui mai bun oxidant, ȋnsă compusul astfel obținut ar fi fost instabil ȋn aer [1]. În ciuda faptului că oamenii de știință s-au străduit să producă antioxidanți fenolici mai buni decat Vitamina E, munca lor a fost ȋn zadar deoarece Vitamina E este considerată drept target. Deci ideea profesorului Ingold de a lega un heteroatom de un nucleu fenolic a fost buna dar nu suficientă [1]. Însa ȋn 2001 această problemă a fost rezolvată.

Proaspătul absolvent [NUME_REDACTAT] de la [NUME_REDACTAT] Ottawa s-a gȃndit că pe lȃngă nitrogenul alăturat nucleului fenolic să ȋnlocuiască și un atom de carbon din ciclul aromatic [1]. După aceea i-a prezentat ideea profesorului Ingold dar acesta nu a crezut ȋn ea și l-a sfătuit să o păstreze pentru el. Pratt asta a și făcut iar ȋn momentul cȃnd a venit să lucreze cu profesorul Ned A Porter și i-a prezentat ideea sa, acesta și-a dat seama că se află ȋn fața unei mari descoperiri științifice. Punȃndu-și ideea ȋn aplicare, Pratt a prevăzut că acești compuși prezintă activitate antioxidantă după care a trecut la sinteza lor. Timp de un an, el a sintetizat noii compuși, piridinolii și piridinolii biciclici [1]. Astfel trei piridinoli sintetizați au fost trimiși ȋn laboratorul condus de profesorul G.F.Pedulli, de la Universitatea din Bologna unde li s-au testat activitatea antioxidantă. În urma experimentului făcut, s-a observat că cei trei piridinoli prezintă o activitate antioxidantă de 5, 28, respectiv 88 ori mai mare decȃt α-Tocoferolul [1]. Astfel că este depășită activitatea antioxidantă a unui antioxidant natural (Schema 4) .

Schema 4

Recent cel mai bun compus fenolic din această serie de piridinoli a fost diagnosticat la Universitatea din Bolognia ca fiind de 100 de ori mai eficace decât Vitamina E [1].

I.1.2. Antioxidanți naturali

Oamenii de știință ȋși ȋndreaptă atenția ȋn cee ce privește capacitatea antioxidantă puternică a compușilor fenolici prezenți ȋn hrana oamenilor și protecție ȋmpotriva deteriorării oxidative a componentelor din hrană ca de exemplu acizii grași polinesaturați: Omega 3 și Omega 6 [1]. Acești doi acizi grași au rolul de a preveni apariția dermatitelor, a oboselii, a diabetului și de a reduce tensiunea arterială. Omega 3 și Omega 6 au un rol esențial ȋn menținerea structurii sănătoase a celulelor nervoase și ȋn menținerea echilibrului hormonal. Deși ȋn organismul uman raportul optim dintre Omega 6 și Omega 3 este 3:1, ȋn prezent majoritatea alimentelor conțin o cantitate mai mare de Omega 6 care este depus sub formă de depozite de grăsimi iar cantitatea de Omega 3 neutilizată este eliminată [6]. Uleiul de cȃnepă și semințele de cȃnepă sunt singurele care conțin un raport optim ȋntre cei doi acizi polinesaturați [6].

În ultimii ani s-a pus accent pe utilizările antioxidanților, ȋn special pe utilizările celor naturali ȋn ceea ce privește tratamentul medical al diferitelor boli provocate de așa numitul stres oxidativ [1]. Cercetătorii au formulat ipoteza acceptată astăzi și anume că ȋn orice sistem biologic trebuie să existe un echilibru ȋntre formarea de specii reactive ce conțin oxigen, respectiv azot și eliminarea acestora din sistem [1]. Orice rupere a acestui echilibru conduce la declanșarea multor boli degenerative [1].

Procesul de degradare oxidativă favorizează apariția speciilor ROS, respectiv RNS. Metabolismul normal din corpul uman generează diverse specii reactive cum ar fi: oxigenul molecular anionic, cunoscut și sub numele de superoxid (O2-), peroxidul de hidrogen (H2O2), radicalul hidroxi (HO•), peroxinitrit (ONOO-), radicalul oxid de nitrogen (NO•) [1]. Aceste specii pot avea și un efect negativ asupra țesuturilor umane.

În procesele esențiale ale vieții, precum respirația se produce autooxidarea lipidelor biologice (acizi grași ca acidul linolenic, aracadonic) și steroizilor (colesterolul) proces numit peroxidarea lipidelor, care este un proces normal biologic și care generează speciile reactive ROS [1]. Acest proces nu este toxic, el fiind controlat de enzime ca ciclooxigenaze și lipoxigenaze, dar atunci când echilibrul se rupe, în condiții de stres oxidativ sunt generați compuși citotoxici precum aldehidele α,β-nesaturate [1]. Acestea sunt reprezentate mai ales de acroleină (AC), malondialdehidă (MDA) și 4-hidroxi-2-nonenal (HNE). Acești compuși sunt foarte buni acceptori (electrofili) Mannich ce pot performa reacții cu biomolecule ce conțin nucleofili ca amine sau tioli (Schema 5) [1].

Schema 5

Peroxidarea lipidelor este un proces care a fost studiat intens. Lipidele-hidroperoxizi sunt produși primari de oxidare și conform celor doi cercetători Singleton, respectiv Hang mecanismul lor de formare este unul neradicalic care presupune migrația dublei legături și totodată se prezintă ca o stare de tranziție rezultată la atacul oxigenului singlet asupra centrului legăturii duble [1]. Reacția 6-electron periciclică duce la formarea hidroperoxidului (Schema 6) [1].

Schema 6

Colesterolul-hidroperoxid, colesterolul 5α-OOH (major) și colesterolul 6α/6β-OOH (minor) sunt trei produși ce au luat naștere ȋn urma procesului de oxidare cu oxigenul singlet și datorită faptului că nu sunt izolabili ei se vor rearanja în hidroperoxidul final, 7α,β-OOH (Schema 7) [1].

Schema 7

Hidroperoxizii obținuți ȋn urma procesului de autooxidare a lipidelor sunt descompuși ȋn cataliză acidă la aldehide α,β-nesaturate, acroleină (AC), malondialdehidă (MDA) și 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) [1].

Captarea radicalilor liberi care prezintă acțiune biochimică precum și procesul de chelare al ionilor metalelor tranziționale pun ȋn evidență activitatea antioxidantă a polifenolilor din plante. Compușii fenolici determină apariția substanțelor cu activitate antioxidantă ce se găsesc ȋn extractele naturale .

I.1.3. Radicalii liberi și efectul lor asupra organismului

Se știe că mediul ȋn care trăim este toxic și că oricȃt de mult am ȋncerca să ne ferim nu putem evita substanțele dăunatoare din mediul ȋnconjurator. Acestea le ȋntalnim peste tot: ȋn aerul pe care ȋl respirăm, ȋn hrană și ȋn apă. În momentul ȋn care organismul produce energie și au loc procese metabolice ȋsi fac apariția radicalii liberi. Radicalii liberi se formează prin expunerea la diferiți factori de mediu printre care enumerăm: fumul de țigară, reziduurile toxice și radiațiile (UV), impactul crescut al ozonului la suprafața pământului, dar și datorită factorilor endogeni (stres, inflamatii) [7].

Aceștia pot fi definiți ca fiind molecule sau fragmente moleculare ce conțin un electron neȋmperecheat. Se cunoaște că fiecare orbital al moleculei este ocupat cu doi electroni de spin contrar. Avȃnd ȋn vedere că radicalul liber va ȋncerca să compenseze lipsa electronilor, el va ataca moleculele organice, astfel că va ȋmpiedica buna funcționare a lor [7].

Radicalii liberi prezintă mai multe caracteristici cum ar fi:

-pot fi neutrii sau ȋncărcați electric;

-conțin unul sau mai mulți electroni impari;

-radicalii liberi fie au structura simplă (CH3 ), fie au structură complexă(trifenilmetil);

-pot fi izolați sau măsurați (clasificare făcută ȋn urma folosirii unor condiții speciale);

-sunt substanțe instabile ce ȋncearcă să devină stabile.

[NUME_REDACTAT] a demonstrat ȋn 1939 că radicalii liberi sunt folosiți drept intermediari ȋn reacțiile enzimatice, respectiv reacțiile de oxido-reducere. În cazul ȋn care nu s-ar folosi metode de prevenire ȋmpotriva acestor radicali liberi, ei ar putea distruge foarte rapid toate celulele corpului uman. Aceștia sunt răspunzători de apariția diverselor boli cum ar fi: bolile cardiovasculare, cancer, ȋmbatrȃnirea organismului etc. În momentul ȋn care radicalii sunt utilizați ȋn exces se produce ȋmbatrȃnirea prematură a celulelor.

Așa cum rugina degradează fierul așa și radicalii liberi ajung să ducă la degradarea celulelor. Cȃțiva cercetatori au indicat faptul că radicalii liberi sunt un factor important ȋn evoluția bolii Huntington și că alterează ADN-ul și ARN-ul din celule prin legarea lanțurilor de ADN [8]. Radicalii liberi prezintă un efect destul de cunoscut ce presupune alterarea membranelor celulare printr-un proces numit peoxidarea lipidelor. Aceștia pot ataca direct proteinele membranare influențȃnd ȋn acest mod activitatea membranelor celulare.

În momentul ȋn care se produce un dezechilibru ȋntre cantitatea de oxigen produsă de organism și capacitatea organismului de a elimina acești produși ȋși face apariția stresul oxidativ [2].

I.2. Compuși cu structură fenolică ȋntâlniți în plante

Regnul vegetal se prezintă ca fiind principalul furnizor de compuși fotochimici care se folosesc ȋn diverse ramuri industriale cum ar fi cele ale produselor cosmetice, farmaceutice, alimentare. Studiile efectuate pun ȋn evidență peste 1500 de compuși noi care se găsesc ȋn diferite specii de plante .

Compușii fenolici se definesc ca fiind substanțe aromatice ce conțin una sau mai multe grupe hidroxil legate de atomul de carbon al ciclului aromatic. Acești compuși sunt utilizați ca principii active a remediilor medicinale, pentru tăbăcirea pielii sau drept coloranți pentru articolele textile. Compușii cu structură fenolică sunt responsabili de caracteristicile antioxidante ale plantelor. Dintre aceștia se remarcă cei cu caracter puternic oxidant și anume: acizi fenolici, flavonoide, antociani, taninuri.

I.2.1. Acizi polifenolici

În ultimul deceniu s-a pus accent pe beneficiile polifenolilor prezenți ȋn plante, fapt pentru care studiile epidemiologice au arătat că folosirea plantelor bogate ȋn polifenoli conferă o bună protecție ȋmpotriva bolilor cardiovasculare, neurogenerative, diabetul și osteoporoza [9]. Polifenolii prezintă un interes științific ȋn creștere din cauza posibilelor efecte benefice ale lor asupra sănătății umane. Această revizuire se concentrează pe ȋnțelegerea actuală a efectelor biologice de polifenoli dietetici și importanța lor ȋn domeniul sănătății și a bolilor [10]. Polifenolii sunt metaboliți secundari ai plantelor ce se folosesc ȋmpotriva radiațiilor ultraviolete și a patogenilor.

Peste 8000 de compuși polifenolici au fost identificați ȋn diferite specii de plante. Compușii fenolici apar sub formă conjugată cu unul sau mai multe resturi de zahăr legate ȋntre ele prin grupări hidroxil. Asocierea polifenolilor cu alți compuși cum ar fi acizii carboxilici, acizii organici, amine, lipide cȃt și legătura cu alți fenoli sunt des ȋntȃlnite [10]. Polifenolii pot fi clasificați pe categorii ȋn funcție de numărul grupelor fenolice pe care le conțin cȃt și pe baza elementelor structurale care leagă inelele ȋntre ele [10].

Distribuirea polifenolilor ȋn țesutul plantelor nu este uniformă, deoarece fenolii insolubili se găsesc ȋn pereții celulelor, ȋn timp ce fenolii solubili sunt prezenți ȋn celulele vegetale. Straturile exterioare ale plantelor conțin niveluri mai ridicate de fenoli decȃt cele situate ȋn partea inferioară [11].

Anumiți polifenoli cum ar fi quercetinul se găsesc ȋn toate produsele vegetale, fructe, legume, ceai, vin, infuzii, ȋn timp ce flavonele și izoflavonele sunt specifice anumitor produse alimentare [10]. Conținutul polifenolilor din plante este influențat de diverși factori cum ar fi: prelucrarea, depozitarea, gradul de coacere ȋn timpul recoltării, factori de mediu. În timp ce conținutul de acid fenolic scade ȋn timpul coacerii, concentrația de antociani crește. Depozitarea la rece prezintă un efect minim asupra conținutului de polifenoli din mere, pere și ceapă [10]. De exemplu, dacă fierbem timp de 15 minute ceapa, aceasta pierde ȋntre 75%-80% din conținutul ei de quercetin inițial [10].

Acizii fenolici se găsesc din abundență ȋn alimente și sunt ȋmpărțiți ȋn două mari clase: derivați ai acidului benzoic și derivați ai acidului cinamic [10]. Dintre acizii benzoici se enumeră: acidul galic [7], vanilic [12] și siringic ȋn timp ce din categoria acizilor hidroxicinamici fac parte : acidul cafeic[7], acidul ferulic [12] și glocozida sa, acidul p-cumaric, acidul m-cumaric [13] și glucozida sa [14]. Compușii polifenolici din clasa derivaților acidului cinamic sunt reprezentați ȋn pricipal de esteri ai acidului cafeic, acidului p-cumaric, acidului ferulic și acidul sinapic (tabelul 1).

Tabelul 1. Structurile derivaților acidului cinamic

Derivații care prezintă ȋn structura lor două grupe o-dihidroxi fenolice se numesc ODP-uri. Activitatea antioxidantă a ODP-urilor este pusă ȋn evidență de acidul clorogenic, acidul rozmarinic, acidul cichoric și cinarina (tabel 2) [15].

Tabelul 2. Structurile acidului clorogenic, rozmarinic, cichoric și cinarina

Fenolii sunt sensibili față de agenții oxidanți, deacea oxidantul atacă atomul de hidrogen al grupării hodoxil, astfel generȃnd radicalul liber fenoxi care se stabilizează prin dimerizare (Schema 8).

Schema 8

Pe această proprietate se bazează atȃt reacția cu clorură ferică cȃt și neutralizarea radicalilor liberi, astfel explicȃndu-se proprietățiile antioxidante ale heterozidelor fenolice [16]. În cazul ȋn care un compus conține două grupări OH plasate ȋn poziția para sau orto, procesul de oxidare se face ușor generȃnd chinonele corespunzătoare. Refacerea grupelor fenolice reprezintă un proces de reducere ce stă la baza numeroaselor sisteme redox (Schema 9) [16].

Schema 9

I.2.2. Heterozide de tip Ar-C3-[NUME_REDACTAT] ȋndeplinesc rolul de pigmenți vegetali care asigură protecția celulelor ȋmpotriva razelor nocive UV și a agenților patogeni. Acești compuși prezintă o serie de caracteristici, dar cea mai importantă constă ȋn efectul lor antioxidant [17]. Putem caracteriza flavonoidele ca fiind produse secundare ale proceselor fiziologice vegetale.

Flavonoidele ȋndeplinesc o serie de funcții printre care enumerăm:

– pigmentarea: conferă culoare părților vegetale ȋn care se află, acesta fiind cel mai important aspect al antocianidelor de culoare albastră, roșie, purpurie (petudinida, malvidina);

– protecția ȋmpotriva razelor UV, a radicalilor liberi produși la nivelul celulelor vegetale, ȋmpotriva microorganismelor și a altor factori dăunători plantelor [17];

– modifică funcționarea enzimelor;

– sunt folosite drept coloranți naturali ȋn unele produse vegetale consumabile, modificȃndu-le gustul [17].

În momentul de față există peste 6000 de structuri cunoscute ale flavonoidelor, dintre care cca 500 ȋn stare liberă, restul ȋn formă glicozidată. Compușii flavonoidici sunt ȋmpărțiti ȋn mai multe clase și anume:

– flavonozidele sunt derivați ce imprimă culoare galbenă florilor, frunzelor plantelor și fructelor;

– chalconele sunt compuși ȋn care ciclul piranic central este deschis;

– izoflavonele sunt derivați ai 3-fenilbenzo-y-pironei;

– antocianozidele sunt compuși care ȋn funcție de pH-ul sucului celular determină colorația frunzelor, florilor și fructelor;

– taninuri catechice, catecholi sau flavan -3-oli: sunt substanțe polifenolice care prezintă o serie de proprietăți comune: se dizolvă ȋn apă, reacționează cu diverși compuși cum ar fi alcaloizii, gelatina și acetatul de plumb cu formare de precipitate, se colorează intens cu clorura ferică. În procedeul de extracție al taninurilor folosim ca solvent apa [15].

– proantocianidolii mai sunt cunoscuți și sub denumirea de leucoantocianidoli. Acești derivați ai flavonoidelor se găsesc ȋn plante sun formă de oligo și de polimeri [16]. Proantocianii sunt substanțe solubile ȋn solvenți polari și insolubili ȋn cei nepolari [15-16]. În tabelul următor (tabelul 3) sunt prezentate principalele structuri chimice ale flavonoidelor și denumirile lor :

Tabelul 3. Principalele structuri chimice ale flavonoidelor și denumirile lor

Flavanii reprezintă clasa cea mai complexă de flavonoide. În general aceștia pot fi identificați ca mono-, bi-, tri- și poliflavani, lucru ce demonstrează că una, două sau mai multe molecule de structură se leagă de baza flavană [17]. Monoflavanii ca epicatechul și catecbinul se găsesc ȋn fructele coapte, iar triflavanii ȋn fructe și cereale. Însă cele mai cunoscute surse de flavani care au ȋn componența lor molecule de epicatech, galat de epitechbin sunt reprezentate de către ceaiul verde și negru [17,18].

Flavonele sunt substanțe cristalizate care pot fi incolore (flavononele și flavanonolii) sau colorate în galben (flavonele, flavonolii și chalconele). Avȃnd ȋn vedere că flavonele prezintă o grupare cetonică la C4, acestea se pot reduce cu hidrogenul născȃnd ȋn mediu hidroalcolic conducȃnd la formarea antocianidolilor [15]. Flavonele și chalconele nu dau colorații.

Grupele oxidril fenolice ale flavonelor pun ȋn evidență anumite caracteristici și anume:

– ȋn mediu bazic flavonele se transformă ȋn fenoxizi;

– ȋn mediu acid prin reacția cu H2SO4 concentrat sau HCl concentrat, flavonele se transformă ȋn săruri de oxoniu galbene;

– prin reacția flavonelor cu săruri de diazoniu rezultă compuși de culoare galben-portocaliu;

– flavonele au caracter reducător (reduc reacticii Tollens, Fehling și Folin Ciocȃlteu).

Printre proprietățiile flavonelor o deosebită importanță o reprezintă grupările oxidril-alcoolice din vecinătatea grupării ceto, grupări ce permit formarea de chelați cu metale bivalente (Zn,Mg) și trivalente (Al,Cr,Sb). Complecșii chelatici iau naștere prin intermediul grupelor OH situate ȋn vecinătatea grupei ceto fie prin OH-ul din poziția 4 (poziție orto), fie prin cel din poziția 5 (poziția peri) [15-17]. Ca de exemplu, quercetolul formează combinații chelatice cu structurile urmatoare (Schema 10) [15-17]:

Schema 10

Prezența a două grupe OH vicinale și un mediu de reacție alcalin constituie o altă metodă de obținere a chelaților, deoarece numai ȋn aceste condiții grupa OH din poziția 4΄ se poate transforma ȋn grupă cetonică printr-o reacție de tautomerie. Acești chelați au culoarea galbenă și prezintă flourescență galbena-verzuie sau albastră ȋn UV [15]. În cazul ȋn care dubla legătură C2-C3 este hidrogenenată, culoarea dispare. Condiția ca flavonele să izomerizeze ȋn chalcone este ca reacția să aibă loc ȋntr-un mediu slab bazic, reacție prin intermediul căreia se observă schimbul de culoare de la incolor sau galben-slab la galben intens (Schema 11) [15-16].

Schema 11

Alți cercetători au pus ȋn evidență efectul peroxidant al flavonelor. Astfel, dacă se utilizează un exces de ioni de fier se formează radicalul quercetolului prin procesul de autooxidare sau prin interacțiune cu procesele electronice la nivel celular, lucu ce conduce la generarea radicalilor superoxid și hidroxil [17].

I.3 Extracte vegetale

Extractele vegetale conțin anumite substanțe care prezintă proprietăți antioxidante deoarece ȋn structura lor ȋntalnim diverși compuși fenolici cum ar fi: antocianine, flavanali, flavonoli, acizi hidroxicinamici. O importanță deosebită o reprezintă polifenolii, flavonoidele, acidul carnosic și carnosolul, substanțe prezente ȋn cantități considerabile ȋn plante și cu efecte imunomodulare, antioxidante, neurotrope și antitumorale. Activitatea antioxidantă a polifenolilor din plante este pusă ȋn evidență prin intermediul a doua procese și anume: captarea și anihilarea radicalilor liberi ce se formează ȋn reacțiile radicalice și procesul de chelare a ionilor metalelor tranziționale.

Proprietatea antioxidantă a extractelor naturale constituie ȋn prezent obiectul de studiu ȋn multe laboratoare de cercetare ȋn ȋntreaga lume.

I.3.1. Rosmarinus officinalis L. (Rozmarinul)

Încadrare în regn: Rosmarinus officinalis L. (Rozmarinul) este o plantă perenă, lemnoasă care face parte din familia Lamiaceae (figura 1). Rozmarinul se prezintă ca un subarbust cu miros plăcut și cu frunze care ȋși păstrează culoarea verde și ȋn anotimpul rece [19].

Descriere: este o plantă ȋnaltă de circa 60-150 cm și cuprinde următoarele componente [19]:

– tulpina erectă prezintă ramuri arcuite, ȋn timp ce scoarța tulpinei este exfoliată la bază și poroasă ȋn partea superioară.

– frunzele sunt așezate ȋnghesuit, pe partea superioară sunt colorate ȋn verde iar pe cea inferioară ȋn alb. Acestea prezintă o formă liniară, cu perișori scurți, deși și lȃnoși, lungimea lor fiind cuprinsă ȋntre 2-4 cm iar lățimea ȋntre 2-5 mm.

– florile prezintă o coroană bilabilă, poroasă la exterior: labiul inferior cuprinde trei petale dintre care cea mediană este cea mai dezvoltată și se prezintă sub formă de lingură cu patru stamine și fructe. Labiul superior este adȃnc sectat, fiind format din două petale [19]

– florile pot fi albastre, roșii sau albe;

– fructul este o alchenă.

Răspȃndire: rozmarinul este originar din regiunile mediteraneene și din Uruguay. Acesta necesită o climă blandă, fără schimbări prea mari de temperatură și lumină directă. Datorită prezenței perișorilor deși pe dosul frunzelor, rozmarinul poate suporta și perioadele secetoase neavȃnd pretenții exagerate ȋn ceea ce privește umiditatea [19]. Rozmarinul se cultivă ȋn zonele cu soluri nisipoase, bogate ȋn calciu, cu un pH ușor alcalin care sunt permeabile și se ȋncăzesc ușor. Acest arbust se cultivă ȋn țara noastră ca plantă ornamentală, condimentară și medicinală și anume ȋn zona de sud-vest a țării, ȋn Cȃmpia Timișului și ȋn județul Constanța.

Recoltare: ȋn luna aprilie sau mai cȃnd plantele sunt ȋnflorite se iau vȃrfurile florale, se duc ȋn stațiile de distilare și se supun procedeului de extracție. În urma acestui proces se obține uleiul volatil de rozmarin care prezintă o importanță deosebită ȋn industria cosmetică. Recoltarea se face de două ori pe an cu secera sau cu foarfeca de vie [19].

Pregătirea produsului ȋn scopul prelucrării: principalele condiții de prelucrare ar fi ca produsul cultivat să se afle ȋn stare proaspătă și să fie format din tulpini nelemnificate cu maxim 10 cm mai jos de la ultima ramnificație.

Compoziția chimică: frunzele și ramurile rozmarinului recoltate ȋn timpul ȋnfloririi conțin 0,5-2% ulei volatil cu compoziție chimică foarte bogată formată din: esteri ai borneolului, cineol, camfor, acetat de bornil, rozmaricina, acid rozmarinic [20]. Această plantă lemnoasă mai conține acizi fenolici, taninuri, lipide, ulei volatil, vitamine, flavonoizi, substanțe diterpenice și triterpenice [20].

Utilizări și acțiuni terapeutice: rozmarinul este o plantă lemnoasă ce fortifică organismele slăbite de boli și totodată ajută la combaterea proceselor de ȋmbătrȃnire [1]. Este un antiseptic care prezintă o acțiune stimulantă asupra sistemului nervos, fiind utilizat ȋn cazurile de astenie. Mai poate fi folosit pentru prevenirea durerilor reumatice și pentru tratarea problemelor legate de circulația sangvină, sub formă de creme ce prezintă un conținut de pănă la 10% ulei esențial de rozmarin [1]. Uleiul de rozmarin se poate folosi atȃt pentru uz extern cȃt și pentru uz intern. Acesta fortifică organismul slăbit, accelerează tranzitul intestinal și ajută la funcționarea optimă a ficatului.

Deoarece rozmarinul prezintă un conținut semnificativ în flavonoide putem afirma că acesta intensifică circulația sângelui la nivel periferic și la creier, ajută la evitarea arteritelor, trombozelor, precum și senzația de sufocare sau cea de răcire a mâinilor și picioarelor, chiar în anotimpurile calde. Un alt aspect pentru care rozmarinul este cunoscut ar fi că stimulează memoria și capacitatea de concentrare [20].

I.3.2. Origanum vulgare L. (Oregano)

Ȋncadrare ȋn regn: Origanum vulgare (Oregano) este o plantǎ semilemnoasǎ perenǎ care face parte din familia Lamiaceae și care provine din zona mediteraneanǎ (figura 2). Fiind ȋnruditǎ dupǎ genul Origanum cu maghiranul, acest arbust crește prin fânețele de deal și de munte, preferând solurile ușoare și locurile ȋnsorite [21].

Descriere: oregano este un subarbust ce are tulpina lemnoasǎ ȋnaltă de pânǎ la un metru, ramnificatǎ și roșiaticǎ. Frunzele acestei plante perene sunt ovale, ascuțite , cu lungimi de 1-4 cm , care cresc ȋn perechi și sunt acoperite de perișori foarte fini. Florile sunt violete, cu lungimi de 3-4 mm și cresc grupate ȋn mǎnunchiuri rotunde ȋn varful tulpinilor [21].

Recoltare: frunzele se recolteazǎ ȋnainte de ȋnflorire , iar acestea se usucǎ ȋn locuri umbroase și aerisite.

Compoziție chimicǎ: extractul de oregano cuprinde atât acizi polifenolici cât și flovonoide care pun ȋn evidențǎ activitatea antioxidantǎ a acestei plante. Compușii identificați ȋn extractul de oregano sunt acidul cafeic, acidul rozmarinic, carvacrol, timol (un fungicid natural cu proprietăți antiseptice, care întărește sistemul imunitar) etc [22]. De asemenea, uleiul de oregano conține o cantitate mare de tocoferol, calciu, magneziu, dar și vitaminele A și C.

Utilizări : aceastǎ plantǎ din familia Lamiaceae prezintǎ o deosebitǎ importanțǎ, fiind utilizatǎ ȋn alimentație, tratamente cosmetice și uz medical. Oregano este unul dintre condimentele nelipsite din bucătăria greceascǎ fiind utilizat ȋn asonarea carnii de porc, vită, pui, pește, fructe de mare, legume și leguminoase. Ȋn medicinǎ este folosit ȋn tratarea gripei și a guturaiului, pentru calmarea durerilor de stomac, problemelor de circulație și creșterea poftei de mâncare, ca remediu pentru astm, indigestie, dureri de cap, reumatism, durere de dinți, durere de urechi, epilepsie [22]. Deasemenea prezintǎ efecte calmante, putând fi folosit ȋn cazul febrei și sinuzitei. Uleiul de oregano are proprietǎți antioxidante și antifungice.

I.3.3. Salvia officinalis L. (Salvia)

Ȋncadrare ȋn regn: Salvia officinalis L. (Salvia) este o plantǎ perenǎ, erbacee ce face parte din familia Lamiaceae (figura 3). Se prezintǎ ca fiind un semiarbust, cultivat ȋn scopuri medicinale sau decorative care crește ȋn locuri pietroase si secetoase. Acest tip de plantǎ cuprinde mai mult de 900 de specii rǎspândite ȋn ȋntreaga lume , dintre care 13 sunt cultivate ȋn România [23].

Descriere: este o plantǎ perenǎ de cultura, ramnificatǎ, ȋnaltǎ de 30-80 cm. Tulpina și frunzele subarbustului sunt dens acoperite de peri de culoare cenușie-argintie, aceste din urmǎ fiind petiolate, ovale și cu vinișoare bine definite. Florile acestei plante au o culoare albastrǎ-violacee, fiind bilabiate cu douǎ stamine ieșite ȋn afarǎ [23].

Rǎspândire: salvia provine din partea de sud a Europei și s-a răspândit în America și Africa de Nord cuprinzând câteva sute de specii. Ȋn România se cultivǎ ȋn zona de sud, unde solul este ușor alcalin și permeabil.

Recoltare: ȋn cazul acestei plante erbacee se recolteazǎ frunzele, vârfurile florale sau herba cu flori . Frunzele se recolteazǎ ȋn momentul când sunt ȋncǎ verzi, ȋnainte de ȋnflorire, ȋn timpul zilei când soarele este puternic, iar vârfurile și herba se recolteazǎ ȋn timpul ȋnfloririi. Acest procedeu se realizeazǎ prin secerare. Dupa secerare, are loc separarea frunzelor atât de vârfurile florale cât și de pǎrțile lemnoase ale plantei. Uscarea parților recoltate se realizezǎ la umbrǎ, ȋn ȋncaperi bine aerisite și la o temperaturǎ de maxim 40ºC [23].

Compoziție chimicǎ: extractul de salvie cuprinde atât acizi polifenolici cât și flovonoide care pun ȋn evidențǎ activitatea antioxidantǎ a acestei plante. Compușii identificați ȋn extractele de salvie sunt acidul cafeic, acidul rozmarinic, acidul carnosic, acidul salvianolic și derivatele sale: carnosol, rosmanol, vitamina B1 și C, sǎruri de potasiu [24]. Dintre acestea, un constituent important al salviei ȋl reprezintǎ rosmanolul care prezintǎ activitate antioxidantǎ puternicǎ deoarece grupele fenolice din componența sa cedeazǎ mai ușor atomi de hidrogen, ȋn felul acesta activând radicalii liberi [24].

Utilizări: salvia prezintǎ un dublu efect, ea putând fi folositǎ atât ȋn alimentație cât și medicinǎ . Aceasta are un gust puternic și ușor amărui fiind excelentă în condimentarea cărnii (de pui, vită sau vițel). În medicină prezintǎ o deosebitǎ importanțǎ, fiind utilizatǎ în caz de indigestie, balonare, astm, bronșită, astenie, eczeme [24]. Studiile recente au demonstrate cǎ salvia poate fi folositǎ la prepararea antibioticelor. De asemenea, are proprietăți antifungice, antispasmice, tonice, hipoglicemice și este un bun astringent [24].

I.4. Metode de obținere a extractelor vegetale

Extractele din plante care prezintă un conținut ridicat ȋn antioxidanți au fost utilizate ȋn scop medicinal, deși ȋncă există incertitudini ȋn ceea ce privește eficiența și efectul lor asupra organismului. Numeroase studii cu privire la consecințele acestor compuși asupra sănătății omului au permis stabilirea efectelor ȋmpotriva bolilor cardiovasculare, activități antiinflamatoare, anticancerigene și imuno-regulatoare. Avȃnd ȋn vedere că se dorește să se obțină un efect maxim al substanțelor ce se găsesc ȋn plantele medicinale se folosesc diverse metode de preparare. Din acest motiv este necesar să cunoștem anumite tehnici de curățare și de ȋmbogățire a extractului astfel ȋncȃt acesta să prezinte proprietăți antioxidante. Ținȃnd cont că aceste tehnici sunt destul de laborioase s-a propus ca tehnica optimă de extracție să fie o succesiune simplă de etape care să conducă la recuperarea cȃt mai bună a speciilor antioxidante [25].

Extracția cu solvent este operația prin intermediul căreia se izolează unul sau mai mulți componenți din planta care reprezintă materia primă. Aceste metode de obținere a extractelor vegetale utilizează ca dizolvanți: apă, ulei, oțet, alcool sau vin. Principalii factori care influențează extracția solid-lichid (S-L) din produșii naturali de origine vegetală sunt: fază de extras, fază extractoare și procedeul de extracție.

Faza de extras: ȋn scopul obținerii compușilor naturali cu acțiune terapeutică se folosește ca materie primă produse vegetale care se supun extracției solid-lichid (S-L). De exemplu, pentru a păstra intacte compoziția și proprietățiile unui produs vegetal, plantele medicinale se prelucrează ȋn stare prospătă imediat după recoltare prin: refluxare cu alcool, deshidratare completă ȋn vid, liofilizare etc [25].

Uscarea prezintă o importanță semnificativă deoarece prin intermediul ei se determină proprietățiile ulterioare ale produsului vegetal. Este o operație ce se realizează la temperatura ambiantă sau ȋn instalații de uscare. Uscarea plantelor medicinale trebuie să aiba loc astfel ȋncȃt pierderile ȋn principii active să fie minime, iar culoarea și aspectul să se modifice foarte puțin. Deși produsele vegetale se păstreză ȋn vase ȋnchise, nu putem afirma că acestea nu se modifică deoarece ȋn continuare pot avea loc diverse reacții cum ar fi: reacții de hidroliză enzimatică, oxidări, degradări, volatilizări [25].

Mărunțirea este operația ce trebuie făcută cu puțin timp ȋnainte de a ȋncepe procedeul de extracție pentru a ȋmpiedica modificările nedorite ale pricipiilor active induse de factorii externi [25]. Pentru a se obține rezultate cȃt mai eficiente, produsul vegetal supus extracției trebuie să fie cat mai bine mărunțit, ȋnsă nu trebuie să se exagereze deorece s-ar ȋngreuna procesul de filtrare. Din această cauză, gradul de mărunțire se alege ȋn funcție de structura produselor vegetale, ca de exemplu: produsele vegetale care prezintă țesuturi tari trebuiesc mărunțite mai fin decat cele cu țesuturi moi (flori,frunze). În cazul ȋn care ȋn procedeul de extracție se utilizează solvenți anhidrii, pulverizarea produsului vegetal trebuie să fie avansată deoarece extracția se realizează prin simpla dizolvare [25].

Extracția se poate realiza la cald sau la rece prin macerare, percolare, extracție Soxhlet, extracția cu lichide supercritice și cu ultrasunete.

I.4.1. Extracția la rece. [NUME_REDACTAT] reprezintă cea mai simplă metodă de realizare a extracției solid-lichid (S-L) ce constă ȋn introducerea solventului peste faza de extras la temperatura camerei. Cele două faze se află ȋn contact pentru o perioadă nederminată de timp care poate dura de la cȃteva ore la cȃteva zile. Soluția obținută (extractul) se separă de produsul vegetal prin filtrare, iar supernatantul este evaporat la sec la presiune scăzută sau se distilă pe baie de apă (figura 4).

Figura 4. Instalație de distilare

Cel mai simplu mod de accelerare a procedeului de extracție constă ȋn agitare riguroasă a vasului ȋn care se află amestecul de extras. Agitarea se poate realiza prin intermediul unei baghete, prin agitare magnetică, prin acțiunea ultrasunetelor sau prin vibrații electromagnetice.

Operația de macerare necesită o pȃlnie de separare și un dispozitiv cu dop rodat care se ȋnchide bine și care ȋmpiedică pierderea de solvent. Pentru creșterea randamentului extracției prin macerare, se folosește macerarea repetată. În acest caz, peste faza de extras rămasă după procedeul de extracție se adaugă o nouă cantitate de solvent, menținȃndu-se ȋn contact ȋntr-un vas ȋnchis pentru un anumit timp. Extractele obținute se reunesc, obținundu-se extractul total [25].

I.4.2. Extracția la cald. [NUME_REDACTAT]

În laborator se utilizează diverse tipuri de extractoare continue S-L printre care enumerăm: extractoare cu scurgere continuă, cu preaplin, Soxhlet [26]. Un extractor Soxhlet este un aparat ce a fost conceput pentru extracția lipidelor din materiale solide. În cazul ȋn care compușii ce urmează a fi separați prezintă solubilitate mare ȋn solventul folosit drept mediu extractant este suficientă macerarea ș filtrarea ca tehnică de extracție. Extracția cu aparatul Soxhlet se aplică compușilor ce prezintă solubilitate limitată ȋn solvent. [NUME_REDACTAT] cuprinde urmatoarele componente ca ȋn figura 5.

Acesta se compune dintr-un balon ȋn care se introduce solventul sau amestecul de solvenți aleși și pe care se fixează dispozitivul Soxhlet si un refrigerent ascendent cu bule [25]. La partea inferioară a dispozitivului Soxhlet se găsește tubul de sifonare prin intermediul căruia lichidul se reȋntoarce ȋn balon. Materialul vegetal mărunțit ce urmează a fi supus operației de extracție este introdus ȋntr-un cartuș Soxhlet, confecționat din hȃrtie de filtru. Marginea superioară a cartușului nu trebuie să depășească curbura sifonului. Vaporii solventului trec prin tubul lateral ce unește partea inferioară a dispozitivului cu cea superioară și se condensează ȋn refrigerentul ascendent [26]. Lichidul ce se condensează se scurge picătură cu picătură peste conținutul cartușului, atfel că ȋn momentul ȋn care soluția formată atinge partea superioară a sifonului, aceasta se scurge ȋn balon.

Deși metoda realizată cu aparatul Soxhlet rămȃne metoda cea mai utilizată la momentul actual, aceasta prezintă și unele dezavantaje cu ar fi: timpi mari de extracție, posibile degradări ale compușilor ce sunt supuși supraȋncălzirii locale [26].

I.4.3. Extracția asistată de ultrasunete

Pentru a ȋmbunătății extracția speciilor antioxidante se utilizează tehnici de extracție ce folosesc ultrasunetele. Acestea pot avea atat efecte constructive cȃt și destructive pentru celule, ȋn funcție de parametrii aleși pentru ultrasonare [27]. Extracția cu ultrasunete este un procedeu ce presupune accelerarea proceselor utilizȃnd o sursă de radiații. Undele electromagnetice din domeniul ultrasunetelor crează bule ȋn solvent care ȋn momentul în care se sparg, creează unde de șoc ce conduc la spargerea pereților celulelor și eliberarea conținutului lor în solvent [27]. Deși viteza de extracție este mare este necesar să utilizăm o cantitate mare de solvent. În momentul ȋn care vrem să extragem principiile active din produsele vegetale sub acțiunea ultrasunetelor se intensifică transferul de masă și solventul ajunge mai repede la celulele materialului vegetal, generȃnd astfel ruperea legăturilor glicozidice pȃnă la glucide și glicon [27].

Pentru extracția indirectă atat solventul cȃt și materialul vegetal se introduc ȋntr-un pahar Erlenmayer care se acoperă, se introduce ȋn baia de ultrasunete și se supune ultrasonării (figura 6). În schimb, pentru metoda de extracție directă, masa de extracție se introduce direct ȋn baia de ultrasunete (figura 7).

I.4.4. Extracția prin iradiere cu microunde

Extracția cu microunde a compușilor organici apare ca o tehnică nouă în 1986 odată cu apariția în literatură a rezultatelor experimentelor efectuate de Ganzler și colaboratorii săi, Lane și Jenkins [28]. Această metodă de extracție oferă avantajul de a reduce timpii de ȋnjumătățire și cantitățiile de solvent, totodată conducȃnd la obținerea extractelor de ȋnaltă puritate. Acest procedeu se poate aplica atȃt ȋn fază lichidă cȃt și ȋn fază gazoasă (figura 8). Domeniul microundelor este situat ȋntre limite de frecvență 300 MHz și 300 GHz, ceea ce corespunde la lungimi de undă ȋntre 1 m și 1 mm. Microundele sunt utilizate ca vectori de energie ȋn momentul ȋn care radiația acționează asupra compusului care poate absorbi o parte din energie și pe ce care o transformă ȋn caldură [29]. Transformarea energiei electromagnetice ȋn căldură poate decurge prin două căi: conducția ionică sau rotația momentului de dipol, timp ȋn care microundele ȋncălzesc mai ȋntȃi solventul, după care proba [28,29].

Avȃnd ȋn vedere că punctul de fierbere se atinge foarte repede, microundele reacționează cu moleculele de apă care se găsesc ȋn plante producȃnd astfel o creștere a temperaturii apropiată de punctul de fierbere al apei și o migrare a componenților către solventul organic [28].

Migrarea ionilor dizolvați produce ciocniri ȋntre molecule, deoarece direcția de deplasare a ionilor se modifică de fiecare dată cȃnd se modifică semnul și direcția vectorului electric. Sub acțiunea orientării dipolilor electrici ȋn cȃmpul electric, variabil al radiației electromagnetice are loc ȋncălzirea substanței, fenomen ce se observă numai ȋn momentul cȃnd materialul ȋnregistrează pierderi dielectrice și de conductanță la iradiere [28,29]. Compușii polari prezintă pierderi dielectrice mari ceea ce face ȋncălzirea cu microunde un proces selectiv ȋn comparație cu ȋncălzirea convențională [29]. O diferență ȋntre cele două ȋncălziri ar fi că gradientul de temperatură este inversat și că ȋncălzirea e volumică.

Solvenții utilizați, cum ar fi: etanol sau diclormetan pot atinge temperaturi cu 20 ̊ C față de punctul de fierbere inițial. În 1986, Gonzler și colaboratorii săi au urmărit eficacitatea ȋncălzirii cu microunde prin intermediul procedeului de extracție ce s-a realizat ȋn cățiva mL de solvent ȋn lipide și pesticide din soluri prin iradierea de șapte ori, timp de 30 s. În urma studiilor efectuate s-au putut stabili urmatoarele: compușii polari sunt extrași ȋn metanol sau amestec metanol/apă, iradierea secvențială ȋmpiedică creșterea temperaturii mediului de extracție și că speciile chimice termolabile sunt recuperate ȋn procente mult mai mari față de extracția Soxhlet.

Ținȃnd cont de toate aceste lucruri putem spune că extracția prin iradiere cu microunde evidențiază randamente mai bune de extracție ȋn comparație cu extractele obținute prin alte metode care necesită o operație de purificare a extractului [29].

I.4.5. Extracția cu lichide supercritice

Un lichid supercritic se definește ca fiind substanța ce se află ȋn condițiiile de temperatură si de presiune deasupra punctului termodinamic critic. Prezintă anumite caracteristici printre care enumerăm cȃteva: poate dizolva compușii chimici ca un lichid și poate difuza ca un gaz printre solide. În plus, mici modificări de presiune și temperatură în apropierea punctului critic au ca rezultat modificări ale densității acest lucru permițând controlarea unor proprietăți a fluidului supercritic. Solvenții cei mai des folosiți în extracțiile cu lichide supercritice sunt CO2 și H2O [30].

Din punct de vedere al extracției solid-lichid, fluidele supercritice pot fi privite ca solvenți hibrizi cu proprietăți care-i situează la limita dintre gaze și lichide: solvent cu vâscozitate mică, viteză mare de difuzie și fără tensiune superficială.

În tabelul următor (tabelul 4) se face comparația dintre lichide,gaze și lichide supercritice [32]:

Tabelul 4. Valorile vȃscozității, respectiv densității pentru lichide,gaze și lichide supercritice

Fluidele supercritice sunt complet miscibile între ele, motiv pentru care punctul critic al unui amestec binar poate fi estimat ca fiind media aritmetică a temperaturilor critice și presiunile celor două componente.

Principala proprietate a fluidelor supercritice este concretizarea capacității de solvatare a fluidelor supercritice sub forma unei funcții dependentă de presiune și temperatură și independentă de densitate. Acest lucru demonstrează că speciile chimice care se găsesc ȋn materia primă și care sunt solubile ȋn lichidul supercritic sunt supuse procecelor de extracție sau de precipitare pentu a se obține extracte ultrapure. Acest procedeu de extracție cu lichide supercritice reprezintă pricipalul mod de a produce tutun fără nicotină, cafea decofenizată.

Una dintre cele mai bune metode de extracție care permite folosirea unui solvent cu toxicitate mică ar fi extracția cu CO2 supercritic. Ținȃnd cont că majoritatea compușilor fenolici sunt polari, acestă metode de extracție constituie un dezavantaj, deoarece CO2 este un solvent nepolar. Pentru a crește polaritatea solventului de extracție se poate introduce etanol în lichidul supercritic. Deasemea plolaritatea amestecului mai poate fi crescută și prin utilizarea unor specii chimice care se găsesc ȋn plante.

În urma unor studii efectuate asupra unor derivați ai cumarinei, Choi și colaboratorii săi au stabilit că hidroxicumarinele au solubilitate foarte mică ȋn CO2, lucru datorat formării legăturilor de hidrogen intramoleculare. Deși acești derivați prezintă solubilitate mică ȋn CO2, ei pot fi extrași la diferite valori ale presiunii. Luȃnd ȋn considerare acest lucru, Lack și Seidlitz au putut extrage antioxidanții prezenți în rozmarin (compuși care prezintă solubilitate mică în CO2 la presiune scăzută) ȋn momentul când au folosit CO2 supercritic la 70 Mpa.

Rodriguez-Meisozo și colaboratorii săi au reușit să extragă specii chimice cu acțiune antioxidantă din oregano folosind drept solvent apa fierbinte la presiune înaltă. Avantajul acestei metode față de extracția cu CO2 supercritic se datorează faptului că apa este un solvent polar care permite extracția unor compuși care nu se pot extrage în CO2.

I.5. Metode de determinare a capacității antioxidante a extractelor vegetale

Determinarea compușilor cu structură fenolică se poate realiza utilizȃnd următoarele metode:

spectrofotometrice (DPPH);

electrochimice (Voltametria);

metode bazate pe luminiscență (Chemiluminiscența);

spectrometrice (Rezonanță paramagnetică de electron).

I.5.1. Metode spectrofotometrice

Metodele spectrofotometrice sunt frecvent folosite pentru determinarea compușilor cu structuri fenolice din diferite probe, ca de exemplu: plasmă și alte lichide biologice, fructe, legume sau produse obținute din acestea (sucuri, piureuri), diverse extracte vegetale (obținute din frunze, flori, tulpini, rădăcini, scorță) etc.

Metoda DPPH

DPPH cunoscută ca 2,2 difenil-1-picrilhidrazil este o celulă permeabilă sau un radical liber stabil, fiind frecvent utilizată atȃt pentru evaluarea capacității compușilor ce captivează radicalii liberi sau donorii de hidrogen cȃt și pentru măsurarea activității antioxidante ȋn țesuturile vegetale (figura 11)

Figura 11. Structura 2,2 difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)

DPPH-ul este unul dintre puținii radicali organici stabili ai azotului care prezintă două aplicații majore: atȃt ȋn cercetarea de laborator, unde este utilizat ca un monitor de reacții chimice ce implică radicali cȃt și pentru intensificarea și poziționarea semnalelor de rezonanță paramagnetică electronică [33]. Acest radical este o pulbere cristalină de culoare ȋnchisă care se prezintă sub mai multe forme cristaline cum ar fi: DPPH I-ortorombic cu p.t=160̊ C, DPPH II- amorf cu p.t=137 ̊ C și DPPH III-triciclic cu p.t cuprins ȋntre 128̊ -129̊ C. Din cauza faptului că prezintă o bandă puternică de absorbție, radicalul DPPH are ȋn soluție o culoare violetă iar ȋn momentul cȃnd este neutralizat devine incolor sau galben pal. Această proprietate permite monotorizarea vizuală a reacției precum și stabilirea numărului de radicali apăruți ȋn urma absorbției optice la 520 nm [35].

În cinetica de reacție a fenolilor cu radicalul DPPH, etapa determinată de viteză se bazează pe transferul imediat de la anionul fenoxid la DPPH. Generarea unui atom de hidrogen din fenol de către radicalul stabil se prezintă ca fiind o reacție secundară ce se realizează ȋn solvenți precum etanol și metanol și cu care formează ușor legături de hidrogen [35]. Acizii sau bazele ce se găsesc ȋn solvenți ca impurități pot conduce la reducerea sau creșterea constantei de viteza și totodată pot influența considerabil echilibrul de ionizare al fenolilor.

Metoda DPPH este simplă, rapidă, necesită echipament relativ simplu (un spectrofotometru UV-Vis) și poate fi cuplată cu HPLC. Însă această metodă de determinare a compușilor fenolici prezintă unele dezavantaje care fac ca metoda să fie mai puțin precisă ȋn măsurarea activității antiradicalice printre care enumerăm : DPPH-ul este un radical cu viață lungă și reactivitate ȋnaltă, de aceea antioxidanții care reacționează cu radicalii peroxil, obținuți prin procesul de peroxidare lipidică pot fi inerți față de DPPH din cauza ȋmpiedicărilor sterice; DPPH-ul poate fi decolorat de agenți reducători care influențează ȋn mod nefavorabil interpretările analizelor; cinetica reacției dintre DPPH și antioxidanți nu este lineară față de concentrațiile DPPH-ului.

I.5.2. Metode bazate pe luminiscență

Din această categorie fac parte metodele bazate pe fluorescență (FL) și metodele care au la bază producerea de chemiluminescență (CL), electrochemiluminescenṭă (ECL) și fotochemiluminescenṭă (PCL).

Chemiluminescența (CL) este o metodă care se bazează pe reacția dintre oxidanții radicalici și anumiți compuși, reacție în urma căreia rezultă specii în stare excitată și cu viață scurtă care ulterior se pot relaxa la starea fundamentală cu emiterea unui foton (lumină indusă chimic) [34]. Deci se poate spune că pe parcursul acestei metode au loc atât procesul luminescent cât și reacția chimică.

Sunt două căi posibile de emisie a CL [34]:

A + B C*

– direct de la molecula excitată C* ;

– indirect, când energia este transferată de la C* la un emițător fluorescent.

Intensitatea emisiei de lumină este proporțională cu concentrația speciei chimice apărută în reacția chemiluminescentă, iar energia necesară pentru obținerea stării excitate provine din reacția chimică. Emisia acestor specii este albastră [34,35].

Pentru această metodă folosim ca reactiv de lucru luminol, lucigenina sau proteine bioluminescente. Se folosesc oxidanți precum: permanganat de potasiu, hipoclorit de sodiu sau iodură de potasiu. De cele mai multe ori, oxidantul este H2O2 sau un peroxid. Apa oxigenată produce apariția radicalilor HOˉ foarte reactivi, care reacționeză extrem de rapid cu luminolul, generând un semnal CL constant în prezența catalizatorului. Dacă se reprezintă grafic intensitatea emisiei ȋn funcție de timp se obține diagrama urmatoare (figura 12):

Metodele bazate pe electrochemiluminiscență prezintă avantajul că procesele electrolitice sunt capabile să producă energie mare, în condițiile în care reactanții instabili nu sunt ușor disponibili prin orice mecanism de reacție chimic, deci poate fi realizată energia mare necesară producerii CL. De cele mai multe ori unul din reactanți sau un sistem chemiluminescent poate fi generat electrochimic. Din acest motiv se poate spune că această metodă este mai ușor de folosit ȋn comparație cu CL. Un alt avantaj este că această metodă necesită aparatură mai simplă și mai puțin costisitoare decât CL [36].

Fotochemiluminescența (PCL) combină generarea fotochimică a radicalilor liberi superoxid cu detecția CL [37]. Procesul este inițiat prin excitarea optică a unui compus (S), cu obținerea anionului superoxid:

Mecanismul de reacție complet nu este cunoscut. Determinările chemiluminescente sunt relativ rapide și lucrează cu cantități mai mici decât în cazul altor metode. Este o metodă simplă și relativ ușoară.

I.5.3. [NUME_REDACTAT] de Electron (RPE)

[NUME_REDACTAT] de Electron (RPE) denumită și [NUME_REDACTAT] de Spin (RES) este metoda spectrometrică care pune ȋn evidență radicalii liberi stabili. Primul spectru de radical liber, ionul de Cu a fost ȋnregistrat ȋn anul 1944 de către fizicianul [NUME_REDACTAT] [38]. Proprietatea de paramagnetism este conferită de electronul neȋmperecheat ce reprezintă una din condițiile primordiale ale existenței vieții (ȋn celule vii se formează radicali liberi). Cantitatea de radicali liberi prezentă în mediul biologic este foarte scazută, orice trecere peste un anumit prag a concentrației putând induce distrugerea celulelor, motiv pentru care echilibrul între aspectele benefice ale prezenței radicalilor liberi în ființele vii și aspectele distructive ale acestora este foarte fragil.

Electronul neȋmperecheat se comportă ca un mic magnet și în consecință a fost imaginată o tehnică prin care poate fi detectat. Această tehnică o reprezintă rezonanța paramagnetică de electron. Prin definiție radicalii liberi sunt instabili și foarte reactivi. Această reactivitate mare constituie cauza dereglărilor reacțiilor enzimatice ce au loc ȋn sistemele biologice, așa numitul stres oxidativ, care duce ȋn final la ȋmbolnăvirea sistemului biologic respectiv. Prezența în moleculă a unui electron liber presupune ocuparea parțială a unui orbital molecular, ceea ce implică o reactivitate crescută pentru acel sistem.

Rezonanța paramagnetică de electron se bazează pe orientarea electronului într-un câmp magnetic exterior H. Se cunoaște faptul că numărul de spin s al electronului este s=1/2, deci există, conform mecanicii cuantice , 2s+1 orientari (adica două), una paralelă și alta antiparalelă cu câmpul H [38,39]. Orientarea paralelă cu câmpul magnetic presupune o energie mai scăzută, în timp ce pentru a se orienta antiparalel este nevoie de o cantitate suplimentară de energie. Între cele doua orientari exista o diferență de energie ΔE=h x ν= g x μB x H, unde h este constanta lui Plank, ν reprezintă frecvența, g este factorul giromagnetic, iar μB este magnetonul lui Bohr [38,39]. Pentru electronul liber g are valoarea de 2,00231. Trecerea electronului din orientarea paralelă cu câmpul magnetic din orientare antiparalelă se face prin absorbția unei cuante de radiație electromagnetică.

Mărimile obținute prin înregistrarea unui spectru RES ne pot furniza în general următoarele informații:

– tipul de radical, din mărimea factorului g (radical centrat pe oxigen, pe azot, etc.);

– numărul de centri paramagnetici se poate determina din intensitatea spectrului (există o dependență liniară între concentrație și intensitatea spectrală, măsurată ca valoarea dublei integrale);

– tipul de interacțiuni, din lărgimea liniei spectrale (dependentă de timpii de relaxare spin-spin si spin-rețea);

– constantele de cuplaj furnizează cele mai importante detalii structurale. Electronul impar poate interacționa cu nucleele atomilor vicinali( în acele situații în care nucleele au momentul magnetic nuclear I diferit de 0, apărând în acest fel o scindare hiperfină, caracterizată de constantele de cuplaj (numite uneori și constante de cuplaj hiperfin) [40]. În acest caz apare scindarea liniilor spectrale, numărul liniilor fiind 2 I+1 (în cazul unui numar de n nuclee identice numărul liniilor va fi 2n I+1).

Aparatura uzuală pentru înregistrarea unui spectru RES constă în principal dintr-un electromagnet, necesar pentru a genera un camp electric uniform cu o intensitate de cateva mii de Gauss și un dispozitiv care poate genera și detecta undele electromagnetice din domeniul microundelor (10GHz). În cavitatea rezonantă se pot introduce probe aflate în orice stare de agregare.

Spectroscopia RES prezintă unele avantaje comparativ cu alte tehnici spectrale [39]:

– limita de detecție extrem de joasa se poate ȋnregistra rapid și fără nici un fel de artificii, spectrul unui radical aflat într-o concentrație de 10-6, o proba de 50 μL fiind mai mult decât suficientă pe un aparat obișnuit;

– de obicei prezența oricăror impurități diamagnetice nu influențează spectrul (adică dacă într-un amestec de sute de componente avem doar un singur radical liber, numai acela este inregistrat de aparat);

– poate fi cuplată cu alte tehnici cum ar fi cele electrochimice (există celule electrochimice special construite adaptabile cavității rezonante) și spectroscopice: UV, Vis, sau IR.( cavități cu ferestre optice).

II PARTEA EXPERIMENTALĂ

II.1. Obținerea extractelor

Extractele din plante au fost obținute din materiale vegetale uscate, prin extracția asistată de ultrasunete și prin metoda clasică cu Soxhlet. Iradierea ultrasonică s-a efectuat cu un aparat sonomatic ELSA – MANANTECH, cu o frecvență de operare de 60 kHz , timpul de extracție fiind de o oră, iar ca solvent de extracție s-a folosit etanol 96% v/v concentrație. În extracția clasică s-a folosit metoda cu Soxhlet, ȋn același solvent de reacție, timpul de extracție fiind de 6 ore.

Reactivi și materiale

– material vegetal: rozmarin (Rosmarinus officinalis L.) cumpărat de la SC Dacia-Plant SRL (Alba, Romania), salvie (Salvia officinalis L.) producător FARES (Orastie, Romania), oregano ( Origanum vulgare L.) cumpărat de la SC FUCHS CONDIMENTE RO SRL (Arges, Romania);

– etanol 96% ([NUME_REDACTAT]);

-instalație de refluxare, alcătuită din balon de fierbere, aparat Soxlet și refrigerent ascendent;

– baie de ultrasunete ELSA – MATNANTECH (frecvență 60 Hz, putere 750 W);

– pahare Erlenmeyer și Berzelius;

– cilindri gradați;

– pȃlnii;

– hârtie de filtru;

– balanță.

II.1.1. Obținerea extractelor prin extracție asistată de ultrasunete

În extracția asistată de ultrasunete (US) s-a folosit ca solvent de extracție alcool etilic 96% (v/v) .

Mod de lucru.

[NUME_REDACTAT] uscat de 250 mL, ce conține 10 g material vegetal uscat și mărunțit și 100 mL solvent de extracție (raportul material vegetal: solvent = 1:10, m/v) se acoperă cu parafilm, se introduce ȋn baia cu ultrasunete (figura 13) și se supune iradierii timp de 60 minute.

Figura 13. Baie de ultrasunete ELSA – MATNANTECH

(Centrul de [NUME_REDACTAT] “C.D. Nenițescu”, Academia Romȃnă, București)

II.1.2. Obținerea extractelor prin extracție continuă ( cu Soxhlet)

În extracția continuă s-a utilizat ca solvent, etanol 96% (v/v) .

Mod de lucru

Se confecționează un cartuș din hartie de filtru ȋn care se introduce materialul vegetal. Cartușul se pune ȋn aparatul Soxhlet care este atașat la un balon cu fund rotund ȋn care se găsește solventul de extracție. [NUME_REDACTAT] se pune un refrigerent (figura 14). Se păstrează raportul material vegetal/solvent 1:10 m/v.

Figura 14. [NUME_REDACTAT]

Observație: ȋn ambele metode de extracție, clasică și cu iradiere ultrasonică, volumele soluțiilor alcoolice obținute au fost filtrate și apoi măsurate, după care s-au introdus ȋn flacoane uscate și bine ȋnchise și păstrate ȋn frigider (+4 ºC) ȋn vederea analizelor prevăzute.

II.2. Metode de determinare a capacitații antioxidante a extractelor din plante

II.2.1. Metoda spectrofotometrică DPPH

Principiul metodei

Datorită delocalizării electronului neîmperecheat pe întreaga moleculă radicalul DPPH. este stabil și nu manifestă tendinṭa de a dimeriza, cum se întâmplă în cazul majorităṭii radicalilor. Această metodă spectrofotometrică constă ȋn reducerea DPPH. (de culoare roșu-purpurie sau violetă) de către un donor de hidrogen cum ar fi antioxidantantul A-H, prezentat ȋn schema 12 [41].

În urma reacṭiei, rezultă o molecula galbenă numită DPPH-H (2,2-difenil-1-picrilhidrazină) care prezintă un maxim de absorbṭie la 520 nm în soluṭie etanolică de concentratie 96% .

Scăderea intensităṭii culorii soluției este pusă ȋn evidență cu ajutorul unui spectrofotometru. Absorbanṭa se determină la lungimea de undă determinata ( = 514-520 nm) de regulă timp de 30 min.

Reactivi și materiale

– extractele alcoolice obținute conform capitolului II.1.;

– etanol 96 % (Chemical company);

– acid galic (Sigma);

– soluție de DPPH. 0,135 mM în etanol 96%, (v/v);

– balanță analitică Cole-Parmer;

– baloane cotate;

– pipete automate;

– spectrofotometru UV-Vis mini-1240 Shimadzu (figura 15)

Figura 15. Spectrofotometru UV-Vis mini-1240 [NUME_REDACTAT] de lucru

Activitatea antioxidantă a extractelor de Rosmarinus officinalis L., Salvia officinalis L., Origanum vulgare L. (Lamiaceae) s-a pus ȋn evidență prin intermediul metodei DPPH., folosind ca standard pentru determinări și pentru trasarea curbei de calibrare acidul galic ( soluție preparată în etanol 80%, v/v).

Acidul galic (AG) a fost ales ca standard deoarece ȋn compoziția acestor trei extracte se găsesc acizi fenolici și flavonoide. Astfel s-a preparat o soluție stoc de acid galic ȋn etanol de concentratie 100 mg/L din care s-au facut mai multe diluții.

S-a trasat curba de calibrare folosind soluții de concentrații 10 – 100 mg/L acid galic în etanol 96% (v/v). S-a procedat astfel: peste 1 mL soluṭie DPPH (0,135 mM în etanol 96%, v/v) a fost adăugat 1 mL soluție de probă (standard/extract), dupa care amestecul rezultat s-a omogenizat prin agitare. Amestecul a fost lăsat ȋn repaus timp de 30 de minute la temperatura camerei și la ȋntuneric după care a fost măsurată absorbanța acestuia la lungimea de unda 520 nm în cuve de sticle (1 cm). Pentru extractele etanolice s-a folosit ca probă-martor o soluție formată dintr-un mL etanol 96% (v/v) și 1 mL de soluție DPPH. 0,135 mM.

Lungimea de undă λ = 520 nm s-a determinat prin înregistrarea spectrului absorbanță în funcție de lungimea de undă. Pentru stabilirea acestei lungimi de undă s-a lucrat cu soluție de 0,135 mM DPPH ȋn etanol.

Mod de calcul

Activitatea antioxidantă a unei probe determinată prin metoda DPPH., exprimată ca activitate de ȋndepărtare a DPPH (%) a fost calculată cu formula (2) [42] :

unde: Aprobă = absorbanṭa probei/standardului,

Acontrol = absorbanṭa soluției martor (soluṭia etanolică de DPPH 0,135 mM).

% DPPH reprezintă procentul de radical DPPH “neutralizat” de către antioxidanții prezenți ȋn extract/soluție standard. Pentru fiecare soluție standard/probă s-au efectuat cel puțin trei determinări. S-a calculat SD (deviatia standard) pentru n = 3 determinari (Anexa 2).

Tabelul 5. Valorile necesare pentru trasarea curbei de calibrare %DPPH în funcție de concentrația standardului

Curba de calibrare %DPPH în funcție de concentrația standardului

În figura 16 este prezentată dreapta de calibrare DPPH neutralizat ȋn funcție de concentrația acidului galic (AG) în etanol 80% (v/v).

Figura 16. Dreapta de calibrare a acidului galic în etanol 80% (v/v)

În tabelul 6 este prezentatǎ ecuația curbei de calibrare evidențiatǎ în figura 16, domeniul de liniaritate și coeficientul de corelare (R2).

Tabelul 6. Ecuația, coeficientul de corelare și domeniul de liniaritate al dreptei de calibrare

Unde : by: I0 /I ;

xc: concentrația standardului (mg/L);

na : numărul de determinări.

Rezultate și discuții

Determinarea capacității antioxidante a extractelor

Capacitatea antioxidantă a extractelor de Rosmarinus officinalis L., Salvia officinalis L., Origanum vulgare L. analizate este prezentată ȋn tabelul 7. Pentru determinarea activității antioxidante a extractelor vegetale, s-a procedat în mod asemănător celui descris la trasarea dreptei de calibrare, modul de calcul detaliat fiind prezentat ȋn Anexa 1. Pentru fiecare soluție (standard/probă) s-au efectuat cel puțin trei determinări. Calculele efectuate se găsesc ȋn detaliu ȋn Anexele 2, respectiv 3.

Tabelul 7. Activitatea antioxidantă a extractelor exprimată ca g echivalenți acid galic /100 g plantă uscată

După cum se observă ȋn tabelul 7 valorile pentru activitatea antioxidantă a extractelor etanolice exprimată ca echivalenți acid galic variază între 0,779 ± 0,0354 și 2,81 ± 0,161. Se constată că extractele de rozmarin obținute prin ambele metode de extracție au cea mai bună activitate antioxidantă.

II.2.2. Metode bazate pe luminiscență (Chemiluminiscența)

Principiul metodei

Chemiluminiscența se bazeazǎ pe reacția dintre oxidanții radicalici cu anumiți compuși ȋn urma cǎreia rezultǎ specii ȋn stare excitatǎ și cu viațǎ scurtǎ (notate ȋn reacția (2) cu C*). Aceste specii formate pot trece la starea fundamentalǎ prin emiterea unui foton, deci a unei radiații luminoase. Deci în aceastǎ metoda de determinare a capacitǎții antioxidante au loc atât procesul luminescent cât și reacția chimică.

Se cunosc douǎ modalitǎți de emisie a CL [43,44]:

– direct de la molecula excitată C*, conform reacṭiei (3);

– indirect atunci cǎnd specia formatǎ ,C* transferǎ energia la un emitent fluorescent.

Intensitatea emisiei de lumină este proporțională cu concentrația speciei chimice apărută în reacția chemiluminescentă, iar energia necesară pentru obținerea stării excitate provine din reacția chimică [43,44]. Emisia acestor specii este albastră ( = 520 nm).

Pentru această metodă folosim ca reactiv de lucru luminol, lucigenina sau proteine bioluminescente. Se folosesc oxidanți precum: permanganat de potasiu, hipoclorit de sodiu sau iodură de potasiu. De cele mai multe ori, oxidantul este H2O2 sau un peroxid. Apa oxigenată determinǎ apariția radicalilor HOˉ foarte reactivi, care reacționeză extrem de rapid cu luminolul, generând un semnal CL constant în prezența catalizatorului (ioni metalici precum Fe(II) și Fe(III), Co (II) etc) [43,44].

Reactivi și materiale

– acid boric;

– hidroxid de sodiu (Chemapol, Praha);

– etanol p.a. (SC PAM CORPORATION SRL, Bucuresti, Romania);

– luminol (5-Amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindionă )- Sigma;

– clorură de cobalt(II) × 6H2O (Reactivul, București, România);

– 30% m/v peroxid de hidrogen (Chimopar, București);

– EDTA (sarea disodică a acidului tetraacetic de etilenediamină, Aldrich).

Soluții preparate

Tinandu-se cont de faptul cǎ ionii metalelor grele pot descompune H2O2 printr-o reacție de tip Fenton cu generare de radicali HO., s-a adǎugat soluție de EDTA pentru a complexa acești ioni care pot influența apreciabil determinǎrile [44]. Acești catalizatori mai pot fi complexați de quercetol și de alte flavonoide.

Soluția 1: s-au preparat 1000 mL Na2EDTA: 3 × 10-3 M (0,0745g) ȋn apă bidistilată;

Soluția 2: 1000 mL tampon borat 0,01 M (6,183 g) și pH=9 ȋn apă bidistilată;

Soluția 3: 500 mL Na2EDTA: 3 × 10-3 M ȋn tampon borat sau 0,114 g Na2EDTA dizolvat ȋn tampon borat (soluția 2);

Soluția 4: s-a preparat fie prin adăugarea a 250 mL soluție CoCl2 × 6H2O: 3 × 0.8 × 10-3 M ȋn tampon borat (soluția 2) fie prin dizolvarea a 0,0571 g soluție CoCl2 × 6H2O ȋn 100 mL soluție EDTA (soluția 3) aducȃndu-se la volum final de 250 mL cu soluția 2;

Soluția 5: 100 mL soluție luminol: 3,39 10-4 M ȋn tampon borat sau 0,006 g luminol ȋn 100 mL soluție 2.

Soluția 6: 25 ml soluție stoc 10-1 M H2O2 cu apă bidistilată (268 μl H2O2 30% la 25 mL soluție finală);

Soluția 7: 100 mL H2O2: 3 × 10-4 M se prepară din soluția 6 (se iau 300 μl din soluția 6 și se completează cu apă bidistilată pȃnă la semn);

Soluția 8: soluția de lucru utilizatǎ ȋn metoda CL a fost preparată zilnic prin amestecarea a 25 mL din soluția 3, cu 25 mL din soluția 4 și 25 mL din soluția 5. Soluție de H2O2: 3 × 10-4M a fost obținută corespunzător diluției de 10- soluție stoc de H2O2 .

Soluția standard de acid galic (3 × 10-3 M) a fost preparată ȋn alcool etilic 80% ȋn soluția 1.

Aparaturǎ

Toate determinǎrile CL au fost efectuate la un luminometru [NUME_REDACTAT] 20n/20 (figura 17) cu două injectoare, cuplat la un calculator al cărui soft permite înregistrarea intensitații luminii [43]:

– într-o formă numerotată( unități relative de luminiscență, RLU);

– într-o formă grafică în MS-EXCEL programată pentru a înregistra intensitatea chemiluminiscenței (RLU) ca o funcție a timpului(s).

In interiorul luminometrului este plasat tubul Eppendorf (aproximativ 2mL) ȋn care se adaugǎ amestecul format din probǎ și reactivii preparați. Acest amestec se omogenizeazǎ, dupǎ care se efectueazǎ masurǎtori ale CL.

Figura 17. [NUME_REDACTAT] 20n/20 cu două injectoare [43]

Mod de lucru

Pentru evaluarea activitații antioxidante a extractelor de Rosmarinus officinalis L., Salvia officinalis L., Origanum vulgare L. cu o metoda bazată pe chemiluminiscență mai întâi s-au trasat curbe de calibrare I0/I în funcție de concentrațiile acidului galic (cu valori cuprinse între 0,01 și 2 mg/L) pentru soluțiile alcoolice de standard [45].

S-a procedat astfel: s-a preparat un amestec format din 350 μL soluție de lucru 0,1M pentru determinări CL, soluție tampon borat pH 9 și 3 × 10-4M soluție de H2O2. Amestecul rezultat s-a omogenizat ȋntr-un tub Eppendorf de 1,5 mL dupǎ care s-a introdus ȋn aparat și s-a măsurat intensitatea radiației chemiluminiscenței.

Se ȋnregistreazǎ valoarea intensității semnalului de CL ȋn absența oricărui antioxidant, notată cu I0 (figura 18) [43,44].

Figura 18. Forma semnalului de CL în sistemul luminol –Co(II)/EDTA-H2O2

După 600s (când valorile semnalului CL rămân constante și variația lui I0 vs. timp ajunge la platou), se adaugǎ ȋn amestecul de reacție 25 µL de probă analizată (standard/extract). Cu ajutorul unei pipete s-a omogenizat amestecul din tubul Eppendorf dupǎ care s-a constatat o scădere a semnalului CL a cărui valoare a fost notată cu I și înregistrată (figura 19) [43,44,45].

Figura 19. Aspectul unui semnal de CL inregistrat la injectarea unei probe

Se calculeazǎ pentru fiecare probă ȋn parte valorile raportului I0/I. Din valoarea I0/I din probele analizate s-a scăzut valoarea I0/I din proba martor care a fost etanol: soluție EDTA 2 x 10- = 80% (v/v) (Anexa 4).

În tabelul 8 sunt prezentate valorile I0/I determinate necesare pentru trasarea curbei de calibrare a acidului galic ȋn etanol 80%.

Tabelul 8. Valorile necesare pentru trasarea curbei de calibrare I0 /I ȋn funcție de concentrația acidului galic ȋn etanol: soluție EDTA 2 x 10- = 80% (v/v)

*Din valoarea I0/I a fost scazut martorul soluție EDTA 2 x 10- = 80% (v/v) avand valoareaI0/I=2.14

În figura 20 se prezintă curba de calibrare I0/I în funcție de concentrația acidului galic în etanol: soluție EDTA 2 x 10- = 80% (v/v) obținutǎ la determinarea capacității antioxidante a probelor.

Figura 20. Curba de calibrare I0 /I ȋn funcție de concentrația acidului galic ȋn etanol: soluție EDTA 2 x 10- = 80% (v/v)

În tabelul 9 este prezentatǎ ecuația curbei de calibrare evidențiatǎ în figura 20, domeniul de liniaritate și coeficientul de corelare (R2).

Tabelul 9. Ecuația, coeficientul de corelare și domeniul de liniaritate al dreptei de calibrare

Unde: by: I0 /I;

xc: concentrația standardului (mg/L);

na : numărul de determinări.

Mod de calcul

Din ecuația curbei de calibrare I0/I în funcție de concentrația acidului galic s-a calculat valoarea capacității antioxidante, în mg/L. Pentru calculul final s-a luat ȋn considerare factorul de diluție, volumul de extract obținut și cantitatea de extract vegetal uscat luat în analizǎ (prezentate în anexa 4). Rezultatele experimentale s-au exprimat în echivalenți acid galic (GAE) /100g material vegetal uscat (dw, dry weight).Pentru fiecare soluție standard/probă luatǎ ȋn lucru s-au efectuat cel puțin trei determinări.

S-a calculat SD (deviația standard) pentru 3 determinări. Calculul detaliat se găsește prezentat ȋn Anexa 5, respectiv Anexa 6. Toate determinările s-au efectuat în programul [NUME_REDACTAT] Excel.

Rezultate și discuții

Determinarea capacității antioxidante a extractelor

Capacitate antioxidantă a extractelor de Rosmarinus officinalis L., Salvia officinalis L., Origanum vulgare L. analizate este exprimată ca g echivalenți acid galic /100 g plantǎ uscată și prezentatǎ ȋn tabelul 10.

Tabelul 10. Capacitatea antioxidantă totală exprimată ca g echivalenți acid galic /100 g plantă uscată

După cum se observă ȋn tabelul 10 valorile pentru activitatea antioxidantă a extractelor etanolice exprimată ca echivalenți acid galic variază ȋntre 0,554 ± 0,0035 si 9,32 ± 0,089. Se constată că extractele de rozmarin obținute prin ambele metode de extracție au cea mai bună activitate antioxidantă, datele obținute fiind ȋn corcondanță cu cele obținute de alți autori [44]. Activitatea antioxidantă a extractelor obținută prin chemiluminiscență este similară cu cea obținută ȋn cazul metodei prin DPPH.

Comparație între valorile capacității antioxidante prin metoda chemiluminescenței și cele prin metoda DPPH obținute experimental

În figura 21 se reprezintă grafic valorile capacității antioxidante obținute prin metoda chemiluminiscenței în funcție de activitatea antioxidantă obținută prin metoda DPPH, pentru extractele alcoolice de rozmarin, salvie și oregano obținute prin extracție continuă, respectiv extracție asistată de ultrasunete.

Figura 21 A Figura 21 B

Corelații activitatea antioxidantă obținută prin DPPH/CL: pentru extractele etanolice obținute prin extracție continuă (A), prin extracție asistată ultrasonic (B) rezultate exprimate în echivalenți acid galic (GAE);

Observație: după cum se observă în figurile 21 A și 21 B o foarte bună corelare s-a ȋnregistrat ȋn cazul extractelor obținute prin metoda continuă, avȃnd coeficientul de corelare, R2 =0,9985 ȋn timp ce pentru extractele obținute prin ultrasonare coeficientul de corelatie este mult mai mic ((R2 =0,5749), corelarea nefiind la fel de bună.

II.2.3. Studiul prin spectrometrie RPE al extractelor naturale

Principiul metodei

Studiul antioxidanței extractelor naturale este în centrul atenției cercetătorilor în ultimile decade.

Este bine știut faptul că Rozmarinul, Salvia și Oregano sunt printre cele mai potente specii de antioxidanți naturali, capabili de a substitui antioxidanții de sinteză, precum BHT, care se presupune a avea o activitate carcinogenezică în întârzierea oxidării lipidelor prevenind astfel deteriorarea alimentelor.

În fapt, interesul crescut pentru vitamina C, E și fenoli se datorează proprietăților lor antioxidante care determină puternic funcțiunile lor biologice atât în plante cât și în animale, interacționând enzimatic și non-enzimatic cu radicalii cu oxigen.

De asemenea, este bine cunoscut faptul ca în celulele plantelor se disting două tipuri de antioxidanți: vitamina C hidrofilică și vitamina E lipofilică. La acestea se adaugă carotinoidele care sunt structuri fenolice complexe.

Așa cum se observă din figura 22, activitatea antioxidantă a extractelor naturale (în figura 22 sunt prezentați compușii fenolici din rozmarin, dar și celelalte două extracte avănd compoziții asemănătoare), se datorează prezenței compușilor fenolici în compoziția lor [1].

Figura 22. Compuși fenolici

Prin reacția cu DPPH, acești compuși fenolici generează în prima etapă diferite tipuri de radicali liberi cu viață scurtă, cu centrul radicalic pe atomul de oxigen sau carbon. Pentru observarea influenței solventului asupra acestor intermediari radicalici, spectrele RPE au fost efectuate în doi solvenți de polaritate diferită etanol (EtOH), respectiv diclormetan (DCM).

[NUME_REDACTAT] Electronică (RPE) cunoscută ca și [NUME_REDACTAT] de Spin (RES) este o tehnică analitică care măsoară direct radicalii liberi.

Prezenta lucrare prezintă studiul prin spectrometrie RPE a celor trei extracte naturale folosind un antioxidant standard, un radical liber stabil, 1,1-Difenil-2-Picrilhidrazil (DPPH, lipofilic) și a unui captator de radicali, 5,5-dimetil-1-pirolin-N-oxid (DMPO) (figura 23) [39].

Figura 23. Structura chimică a oxidantului (DPPH), respectiv a captatorului de radicali (DMPO)

Reactivi și materiale

– DPPH (1,1-Difenil-2-Picrilhidrazil), reactiv Aldrich;

– DMPO (5,5-dimetil-1-pirolin-N-oxid), reactiv Aldrich;

– Alcoolul etilic absolut și diclormetanul (DCM) , reactivi [NUME_REDACTAT];

– pipetă Pasteur.

[NUME_REDACTAT] RPE au fost realizate cu un spectrometru JEOL FA 100 (figura 24) cu următorii parametri de operare: frecvența de modulare 100 kHz, 0.998 mW sursă putere microunde, 120 s sweep time, 0.7 G amplitudine de modulare, constantă timp 0.1 s, amplitude 1000. Datele spectrale RPE obținute au fost procesate cu un program de simulare cu soft WINSIM.

Figura 25. Spectrometru JEOL FA 100

(Institutul de [NUME_REDACTAT], Academia Romȃnă București)

Tehnica de Spin -[NUME_REDACTAT] de spin-trap a fost prima dată folosita în anii 1960 (Lagercrantz si Forshult, Janzen și Blackburn, Chalfont) pentru a putea detecta radicali liberi a căror concentrații depășesc limita de detecție a rezonanței electronice de spin directe. Tehnica de spin-trapping utilizează un captator de spin, conducând în final la formarea unui radical liber persistent (Schema 13) [39].

Schema 13. Formarea unui radical persistent prin tehnica spin-trapping

Nitrozo-derivații și compușii de tip nitronă pot adiționa cu ușurință radicalii liberi instabili, formând nitroxizi cu o viață suficient de lungă, de ordinul orelor, pentru a permite detectarea lor direct prin spectrometrie RPE [39]. Spectrometria RPE prezintă avantajul vizualizării numai a compușilor paramagnetici, oricât de complicat ar fi sistemul studiat.

Atât spectrul RPE al spin-aductului format, cât și concentrația radicalilor liberi captați sunt depedente de condițiile experimentale folosite, incluzând chiar tipul și diametrul tubului EPR folosit, solvenții, volumele și măsurarea acestora [39]. Spin-aductul format cu ajutorul acestei tehnici are o viață suficient de lungă pentru a permite detecția prin spectroscopie RPE fără a utiliza alte artificii. Pe lângă asta, parametrii spectrali sunt dependenți de natura radicalului cu viață scurtă; deși din punct de vedere practic, de multe ori acest fapt nu este suficent pentru o caracterizare completă a radicalului.

Cei mai frecvenți compuși de tip spin-trap sunt nitronele si nitrozo-derivații, ambii conținând o dublă legătură ce reacționează cu radicalii liberi, putând adiționa cu ușurință radicali liberi instabili [39]. Compușii de spin-trap pot detecta atât radicali liberi cu viață scurtă din mediul biologic, cât și radicali instabili derivați din aceștia.

Drept captator de radicali s-a folosit 5,5-dimetil-1-pirolin-N-oxid (DMPO), prezentat ȋn figura 22. DMPO este un captator de spin care este folosit pentru a detecta specii reactive precum HO● sau radicalul superoxid (O2●-)

Prin reacția chimică dintre acești captatori de spin și radicalul liber instabil se formează un spin-aduct de tip nitroxid. Radicalii liberi cu viață scurtă pot fi radicali liberi ai carbonului (de tip alchil, acil, aril, etc.), radicali ai oxigenului (hidroxil, superoxid, peroxil sau alcoxil), dar și radicali ai sulfului.

Compușii de spin-trap pot detecta atat radicali liberi cu viață scurtă din mediul biologic, cât și radicali instabili derivați de la aceștia. De exemplu, radicalul hidroxil este extrem de reactiv și poate reacționa cu orice compus întâlnit, formând alți radicali liberi cu viață scurtă care pot fi captați de același spin-trap [39].

Deși radicalul instabil se adiționează chiar la atomul de azot al nitrozoderivaților, rezultând astfel un nitroxid care furnizează informații structurale suplimentare prin apariția unor noi constante de cuplaj [46], totuși acest tip de spin-trap prezintă câteva dezavantaje, nefiind benefic pentru captarea și evidențierea radicalilor liberi centrați pe atomul de oxigen.

Prezența speciilor oxidative reactive (ROS) generate de oxidarea cu DPPH a compușilor fenolici prezenți in cele trei extracte supuse prezentului studiu fost evidențiată prin metoda de spin-trapping folosind ca și captator de spin DMPO (5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide) [39].

Mod de lucru

0.2 mL soluție DPPH în etanol absolut respectiv în DCM, la care s-a adăugat un volum de 0.2 mL din fiecare extract natural în etanol respectiv DCM, s-au amestecat timp de 10 s după care au fost transferați într-un tub capilar (pipeta Pasteur). [NUME_REDACTAT] ce conține proba de analizat a fost dezaerată cu barbotare de nitrogen și introdusă în cavitatea de rezonanță a aparatului RPE. Procedura, ce durează aproximativ 3 minute s-a desfășurat la temperatura camerei, de aproximativ 24̊ C.

Rezultate și [NUME_REDACTAT] studiul RPE s-au constatat trei lucruri și anume:

A) Extractul de rozmarin, salvie sau oregano nu arată nici un semnal RPE în soluție de etanol sau diclormetan.

B) Prin adăugarea radicalului DPPH (care este un oxidant) la cele trei extracte naturale, nu se pune în evidență nici un semnal RPE, ceea ce arată că nu se formează radicali liberi stabili, așa cum ar fi fost de așteptat la oxidarea unor fenoli (Schema 14).

Schema 14

C) Extractele naturale supuse studiului nu arată nici un semnal RPE în prezență de DMPO (captator de readicali), dar dacă se adaugă și oxidantul DPPH se observă un semnal RPE puternic (figura 25 ). Spectrul experimental arătat în figura 25 indică prezența unui aduct DMPO cu radicalul A din Rozmarin (mai corect cu diverșii radicali A din extractul natural) în soluție de DCM, după adăugarea de radical DPPH (Schema 15).

Schema 15

Constantele hiperfine obținute prin simularea spectrului experimental pentru DMPO-aduct sunt: aN = 14,045 G, aH = 12 G și corespund unui radical cu centrul pe atomul de oxigen, ȋn acord cu datele de literatură [46].

Figura 25. Spectrul RPE al extractului de Rozmarin obținut prin extracție continuă în DCM în prezență de DPPH și DMPO, inițial, după 3 minute, respectiv după 10 minute

Spectrele RPE ale extractelor naturale au fost obținute imediat după adăugarea DMPO la amestecul extract-DPPH, după 3 minute de la adaugarea DMPO respecttiv după 10 minute (pentru unele probe) și sunt prezentate ȋn Anexa 6.

După cum se observă, semnalul RPE care este puternic la început suferă o descrește vizibila după 3 minute, mai mult după 10 minute și chiar dispare după o anumită perioadă de timp. Explicația constă în reacția DMPO cu radicalii instabili din sistemul extract natural-DPPH. Pe măsură ce radicalul DMPO reacționează, semnalul RPE descrește până la dispariția lui.

Spectrele RPE ale DMPO în EtOH respectiv în DCM sunt presentate în figura 26. După cum se observă, cele două spectre sunt asemănătoare, micile diferențe datorându-se polarității diferite ale celor doi solvenți: etanol și diclormetan.

Figura 26. Spectre RPE ale DMPO în EtOH respectiv în DCM.

Spectrele RPE ale celor trei extracte obținute prin extracție continuă, respectiv asistată de ultrasunete, în prezență de DPPH și DMPO, sunt prezentate în figura 27, respectiv figura 28. Se observă asemănarea spectrelor RPE atât pentru cele trei extracte cât și pentru cei doi solvenți de extracție. Acest lucru arată pe de o parte asemănarea compoziției celor trei extracte (în mare cam aceleași structuri fenolice prezente), pe de altă parte polaritatea diferită a celor doi solvenți folosiți la extracție, etanolul respectiv diclormetan, neinfluențând semnificativ reacțiile radicalice care se formează în cursul oxidării și captării de radicali.

Figura 27. Spectre RPE ale celor trei extracte (oregano, rozmarin și salvie) obținute prin extracție continuă (S) respectiv asistată de ultrasunete (US), în prezență de DPPH și DMPO, în DCM

Figura 28. Spectre RPE ale celor trei extracte (oregano, rozmarin și salvie) obținute prin extracție continuă (S) respectiv asistată de ultrasunete (US), în prezență de DPPH și DMPO, în etanol

O analiză detaliată a aducțiilor DMPO studiat ȋn prezenta lucrare poate demonstra că parametrii fizici (solvent, metode de extracție, iradiere) ai probelor analizate pot influența procese asociate cu tehnica spin-trapping, ȋn mecanismele de antioxidare ce au loc, aceasta constituind obiectul unor cercetări viitoare.

Spectre RPE ale sistemelor extracte naturale-DPPH, obținute imediat la adăugarea de DMPO, după 3 minute sau dupa 10 minute, sunt prezentate ȋn Anexa 8.

Fiecare spectru RPE are o constantă de cuplaj aN proprie, aceasta fiind prezentată ȋn tabelul 11.

Tabelul 11. Valorile constantelor aN (G)

CONCLUZII

În prezenta lucrare s-a studiat activitatea antioxidantă a trei extracte naturale și anume Rozmarin (Rosmarinus officinalis L.), Salvie (Salvia officinalis L.), Oregano ( Origanum vulgare L.).

Cele trei extracte naturale au fost obținute prin extracție continuă (metoda cu Soxhlet), respectiv prin extracție asistată cu ultrasunete (US).

Activitatea antioxidantă a fost studiată prin două metode spectrofotometrice ( DPPH și prin detecție chemiluminometrică (FIA-CL), bazată pe sistemul luminol/Co(II)/ EDTA/H2O2 ) și prin spectrometrie de [NUME_REDACTAT] de Electron (RPE).

Prin metoda spectrofotometrică DPPH, activitatea antioxidantă a extractelor etanolice exprimată ca g echivalenți acid galic variază între 0,779 ± 0,0354 și 2,81 ± 0,161, rozmarinul obținut prin ambele metode de extracție prezentȃnd cea mai mare activitatea antioxidantă.

Rezultate asemănătoare s-au obținut și prin metoda chemiluminometrică (FIA-CL); activitatea antioxidantă a extractelor etanolice exprimată ca g echivalenți acid galic variază ȋntre 0,554 ± 0,0035 si 9,32 ± 0,089 și pune ȋn evidență faptul că rozmarinul prezintă cea mai mare activitate antioxidantă.

Ambele metode spectrofotometrice arată o foarte bună corelare ȋn cazul extractelor obținute prin metoda continuă, avȃnd coeficientul de corelare, R2 =0,9985 ȋn timp ce pentru extractele obținute prin ultrasonare coeficientul de corelare este mult mai mic ((R2 =0,5749).

Extractele naturale supuse studiului prin spectrometrie RPE nu arată nici un semnal RPE în prezența oxidantului DPPH, ceea ce sugerează formarea unor radicali liberi instabili. În schimb, un semnal RPE puternic apare la adăugarea captatorului de radicali, DMPO ceea ce arată formarea unor radicali liberi stabili ai aductului DMPO-extract natural-DPPH.

Spectrele RPE ale sistemelor extracte naturale-DPPH-DMPO au fost ȋnregistrate ȋn

doi solvenți cu polaritate diferită, etanol respectiv diclormetan și nu au prezentat

deosebiri semnificative ȋntre ele; acest lucru arată că polaritatea diferită a solvențiilor

nu a influențat semnificativ reacțiile radicalice care se formează ȋn cursul oxidării și

captării de radicali.

BIBLIOGRAFIE

Dinoiu, V., Concepte moderne ȋn chimia organică, [NUME_REDACTAT], 2013, p.193-214.

Vina, J., Lloret, A.; Orti, R.; Alonso, D., Molecular bases of the treatment of Alzheimer’s dioseare with antioxidants: prevention of oxidative stress, [NUME_REDACTAT] of Medicine, 2004, 25(1-2), p. 117-123.

Olthof, M.R., Hollman, P.C.H., Katan, M.B., Chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed in humans, [NUME_REDACTAT] of Nutrition, 2001, 131(1), p. 66-71

Pourmorad, F., Hosseinimehr, S.J., Shahahbimajd, N., Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants, [NUME_REDACTAT] of Biotechology, 2006, 5(11), p. 1142-1145.

http://en.wikipedia.org/wiki/Oxygen_toxicity, 12.06.2014

Mohammad, A., Health effects of omega-3,6,9 fatty acids, [NUME_REDACTAT]. Exp. Med., 2011, 11, p. 51–59.

Beer, D., Joubert, E., Marais, J., Manley, M., Unravelling the antioxidant capacity of pinotage wines: contribution of phenolic compounds, J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 2006, 54(8), p. 2897-2905.

http://en.wikipedia.org/wiki/Free-radical_theory_of_aging, 12.06.2014

Kovács, Z., Dinya, Z., Examination of non-volatile organic compounds in red wines made in Eger, Microchem. J., 2000, 67(1-3), p. 57-62.

Pandey, K., Rizvi, S., Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]., 2009, 2(5), p. 270–278.

Simon, B., Perez-Ilzarbe, J., Hernandez, T., Gomez-Cordoves, C., Estrella, I., Importance of phenolic compounds for the characterization of fruit juices, J. Agric . [NUME_REDACTAT]., 1992, 40, p. 1531–1535.

Dudley, J., Lekli, I., Mukherjee, S., Das, M., Bertelli, A., Das, D.K., Does white wine qualify for french paradox? Comparison of the cardioprotective effects of red and white wines and their constituents: resveratrol, tyrosol and hydroxytyrosol, J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 2008, 56(20), p. 9362-9373.

G.J. Soleas, G. Tomlinson, E.P. Diamandis and D.M. Golberg, Relative contributions of phenolic constituents to the antioxidant status of wines: development of a predictive model, J. Agric. [NUME_REDACTAT]., 1997, 45(10), p. 3995-4003.

Z. Kovács and Z. Dinya, Examination of non-volatile organic compounds in red wines made in Eger, Microchem. J., 2000, 67(1-3), p. 57-62.

Istudor, V., Farmacognozie. Fitochimie. Fitoterapie. Oze, ozide și lipide, [NUME_REDACTAT], București, 1998, 1, p. 95 – 103, 112 – 114, 145 – 157, 167 – 169, 170 – 177, 181 – 185, 187 – 197, 204 – 205.

Cercasov, C., Popa, C.V., Compuși naturali cu acțiune terapeutică Curs. Partea I, [NUME_REDACTAT] din București, 2005, p. 24-27, 37-70.

Andrei, C., Moraru, M., Flavonoide. I. Structuri și proprietăți, [NUME_REDACTAT] (Bucuresti), 2002, 53(12), p. 833-836.

Aron, M., Kennedy, A., Flavan-3-ols: nature, occurence and biological activity, Mol. Nutr. [NUME_REDACTAT]., 2008, 52(1), p. 79-10.

http://plantemedicinale.wikia.com/wiki/Rosmarinus_officinalis, 02.03.2014.

Erkan, N., Ayranci, G., Ayranci, E., Antioxidant activities of rosemary ([NUME_REDACTAT] L.) extract, blackseed (Nigella sativa L.) essential oil, carnosic acid, rosmarinic acid and sesamol, [NUME_REDACTAT], 2008, 110(1), p. 76-82.

http://en.wikipedia.org/wiki/Oregano .

Pizzale, L., Bortolomeatzzi, R., Vichi, S., Uberegger, E., Conte, L., Antioxidant activity of sage (Salvia officinalis and S fruticosa) and oregano (Origanum onites and O indercedens) extracts related to their phenolic compound content, J. Sci. [NUME_REDACTAT]., 2002, 82, p. 1645–1651.

http://ro.wikipedia.org/wiki/[NUME_REDACTAT], M., Berset, C., Richard, H., Antioxidant constituents in sage (Salvia officinalis), J. Agric. [NUME_REDACTAT].,1994, 42, p. 665–669.

http://www.scribd.com/doc/223798028/Metode-de-Obtinere-Si-de-Prelucrare-a-[NUME_REDACTAT], W.B., [NUME_REDACTAT] of the [NUME_REDACTAT], J. Chem. Educ., 2007, 84 (12), p. 1913.

Esclapez, M. D., García-Pérez, J.V., Mulet,  A., Cárcel, J.A., [NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] Reviews, 2011, 3(2), p. 108-120.

Neas, E.D., Collins, M.J., Introduction to microwave sample preparation, [NUME_REDACTAT] Society (Washington), 1988, 2, p. 7-32.

Kaufmann, B., Christen, P., [NUME_REDACTAT] Techniques for [NUME_REDACTAT]: Microwave-assisted Extraction and [NUME_REDACTAT] Extraction, [NUME_REDACTAT], 2002, 13, p.105–113.

Casas, L., Mantell, C., Rodrigueza, M., Torresb, A., Macias, F.A., Martinez, E., Extraction of natural compounds with biological activity from sunflower leaves using supercritical carbon dioxide, [NUME_REDACTAT] Journal, 2009, 152, p. 301–306.

Reid, R.C., Prausnitz, J.M., Poling, B.E., The properties of gases and liquids, 4th ed., Editura McGraw-Hill, [NUME_REDACTAT], 1987;

Dahmen, N., Kordikowscki, A., Schneider, G.M., Determination of [NUME_REDACTAT] Coefficients of [NUME_REDACTAT] in [NUME_REDACTAT] Dioxide by [NUME_REDACTAT], Journal of Chromatography, 1990, 505, p. 169-178.

Kedare, B., Singh, S.B., Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay, J. [NUME_REDACTAT]. Technol., 2011, 48(4) ,p. 412-422.

Meghea, A., Iftimie, N., Giurginca, M., Estimarea efectului antioxidant al extractelor din plante prin chemiluminescență, Rev. Chim. (Bucharest), 2004, 55(12), p. 1025-1028.

Parejo, I., Codina, C., Petrakis, C.,. Kefalas, P., Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH. (2,2,-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical assay, J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 2000, 44(3), p. 507-512.

Bard, A.J., Electrogenerated chemiluminescence, edited by A.J. Bard, [NUME_REDACTAT], Inc., [NUME_REDACTAT], 2004, p. 14-17.

Chang, C.C., Yang, M.H.,Wen, H.M., Chern, J.C., Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods, Journal of Food and [NUME_REDACTAT], 2002, 10(3), p. 178-182.

(a) http://en.wikipedia.org/wiki/Electron_paramagnetic_resonance; (b) Zavoisky, E., Zhurn. Eksperiment. Teor. Fiziki. 1944, 14, p. 407

Ioniță, P., Radicali liberi persistenți ȋn exemple și aplicații, Editura ARS DOCENDI,

Universitatea din București, 2010.

Balaban, A.T., Pogany, I., Banciu, M., Aplicații ale [NUME_REDACTAT] ȋn [NUME_REDACTAT], Editura științifică și Enciclopedică, 1983.

Molyneux, P., The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for

estimating antioxidant activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 2004, 26(2), p. 211-

219.

Koksal, E., Gulcin, I., Antioxidant activity of cauliflower, Turk J. Agric. For, 2008,

32, p. 65-78.

Lungu, L., Popa C.V., Săvoiu M., Dăneț A.F., Dinoiu V., Total antioxidant capacity of several synthetic phenols by a chemiluminscence method, The international conference of the Academy of Science of Moldova, May 28-30, 2014, Chișinău, Moldova.

44. Popa, C.V., Fărcășanu, I.C., Jipa, S., Zaharescu, T., Dăneț, A.F., [NUME_REDACTAT] of the [NUME_REDACTAT] Capacity of [NUME_REDACTAT], Rev.Chim. (Bucharest), 2012, 63(7), p.715.

Popa, C.V., Lungu, L., Săvoiu M., Bradu, C., Dinoiu, V., Dăneț, A.F., Total

antioxidant activity and phenols and flavonoids content of several plants extracts,

[NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT], 2012, 15, p. 691-701.

Buettner, G.R., Spin trapping : ESR parameters of spin adducts, [NUME_REDACTAT]

Biology and Medicine, 1987, 3, p.259-303.