Materiale Si Metode de Lucru Folosite Pentru Supravegherea Epidemiologica

INVESTIGAȚII PERSONALE

SCOPUL LUCRĂRII

2.1. MATERIALE ȘI METODE DE LUCRU FOLOSITE PENTRU SUPRAVEGHEREA EPIDEMIOLOGICĂ

2.1.1. MATERIALE DE LUCRU

Materialele de lucru folosite în studiul dat au fost reprezentate de probe de sânge recoltat de la găini din gospodăriile populației din patru județe. Păsările erau crescute în sistem traditional, hrănirea se făcea cu concentrate de furaje pentru păsări dar și cu porumb iar cazarea acestora era făcută în adăposturi tradiționale. Păsările erau crescute atât în sistem închis cât și în sistem deschis.Exploatarea păsărilor se făcea în special pentru ouă dar și pentru carne.

Pentru supravegherea epidemiologică a bolii de Newcastle s-au luat în studiu un număr de 40 de găini dintre care:

-1 pasăre cu vârsta de 9 luni reprezentând un procent de 3% din total;

-6 păsări cu vârsta de 5 luni și respectiv 8 luni, reprezentând un procent de 8% din total fiecare;

-8 păsări cu vârsta de 4 luni șirespectiv7 luni, reprezentând un procent de 10% din total fiecare;

-10 păsări cu vârsta de 10 luni și respectiv 24 de luni, reprezentând un procent de 13% din total fiecare;

-15 păsări cu vârsta de 11 luni, repezentând un procent de 38% din total (vezi figura 1).

FIGURA 1.Distribuția pe vârste a găinilor luate în studiu

Cele 40 de găini au fost împărțite în funcție de statusul imunitar:

-vaccinate – 24 de păsări din total 40;

-nevaccinate – 16 păsări din total 40 (vezi figura 2).

Probele biologice au fost reprezentate de sânge recoltat la 21 de zile postvaccinal. Vaccinarea păsărilor luate în studiu s-a facut cu vaccinulviu contra virusului bolii de Newcastle, tulpina [NUME_REDACTAT], pentru gaini si curci, conform schemei de vaccinare următoare:

doza de vaccin : minim 6.0 log10 ELD50 virusul Bolii de Newcastle.

Calea de administrare:

aerosoli 

apa de băut 

oculo/nazală 

Volumul de vaccin care se utilizează pentru administrare este calculate în funcție de echipamentul folosit și de vârsta păsărilor care urmează să fie vaccinate.  Păsările se vor vaccina începând cu vârsta de 4 săptămâni. Timpul optim și metodele de administrare depind de situația locală a efectivului.

MODALITĂȚI DE VACCINARE:

Metoda spray

Se dizolvă vaccinul în apă rece, curată, fără urme de fier sau clor;

Se deschide flacoanul sub apă;

Se pulverizează soluția vaccinală uniform peste numărul corect de păsări, de la o distanță de 30-40 cm, preferabil atunci când păsările stau grupate în semi-întuneric; 

Observații:

Puii de 1 zi: se utilizează 0,25 litri apă pentru 1000 doze și se reglează doza pentru a produce picături care să alcătuiască o ploaie fină; 

Păsări mai mari de 1 zi: se dizolvă 1000 doze per litru apă și se reglează duza pentru a produce picături fine (se va folosi atomizorul doar atunci când se știe că este sigur pentru păsări).

2. Instilare oculo-nazala

Se dizolvă vaccinul în ser fiziologic (de obicei 30 ml per 1000 doze) sau diluant oculo-nazal și se administrează cu un picurător standardizat;

Se administrează o picătură, de la câțiva centimetri înălțime, într-un ochi sau într-o nară;

Persoana care administrează vaccinul se va asigura că picătura depusă în nas este inhalată de către pasăre.

Observație: Pentru administrarea oculo-nazala este disponibil diluantul oculo-nazal.

3. Administrarea înapa de băut

Se deschid flacoanele sub apă;

Se utilizează apă rece, curată fără urme de fier sau clor; dacă se adăugă 2 grame de lapte praf degresat per litru apă, virusul își menține activitatea timp mai îndelungat;

Apa în care a fost dizolvat vaccinul trebuie consumată în maximum 2 ore;

Se dizolvă 1000 doze într-un număr de litri de apă egal cu vârsta puilor în zile, dar nu mai multde 40 litri. 

Se administrează vaccinul dimineața devreme, aceasta fiind fie principala perioadă de consum al apei, fie perioada mai rece în zilele de vară.

Observație:

Când se vaccinează efective mari, se recomandă să se dizolve la început doar o parte din vaccin. În funcție de condițiile meteo, ar putea fi necesară restricționarea apei, înainte de vaccinare;

Este esențială utilizarea unui număr adecvat de adăpători pentru a asigura frontul de adăpare corespunzător; Adăpătorile trebuie să fie curate și fără urme de detergenți și substanțe dezinfectante;

Se va acordă o atenție specială atunci când vaccinul este administrat prin sistemul central de apă sau cu un dozator.  Atunci când numărul de păsări este între două dozaje standard, se va alege dozajul imediat superior.

(http://www.msd-animalhealth.ro/Products/Nobilis_ND_Lasota/020_prospect_produs.aspx)

FIGURA 2.Situația statusului imunologic al păsărilor luate în studiu

Zonele geografice unde s-a efectuat supravegherea epidemiologică sunt impărțite astfel:

6 păsări din Dragomirești-Vale, județul Ilfov;

13 păsări din Fărcașele, județul Olt;

9 păsări din Sabareni, județul Giurgiu;

8 păsări Călina, județul Vâlcea;

4 păsări Zurbaua, județul Ilfov(vezi figura 3).

Din cele 5 județe luate în studiu, județul Olt are procentajul cel mai ridicat în privința numărului de probele recolatate 32%, în timp ce în județul Ilfov localitatea Zurbaua se situează procentajul cel mai mic, respectiv de 10%. Celelalte trei localități [NUME_REDACTAT], Sabareni și Călina au procentaje de 15%, 23% și respectiv 20%.

FIGURA 3.Repartizarea geografică a probelor de cercetat

Din cele 5 localități, rasele de găini de la care s-au recoltat probe au fost: 16 găini din rasa New-Hampshire, reprezentând 60% din total și 24 găini din rasa Brahma, reprezentând 40% din total (vezi figura 4).

FIGURA 4. Rasele de găini de la care s-au recoltat probele de cercetat

TABEL 1.Titrul de anticorpi obținut prin metoda de Inhibare a hemaglutinării

2.1.2. METODE DE LUCRU

2.1.2.1.METODA DE INHIBAREA HEMAGLUTINĂRII

Determinarea titrului de anticorpi specifici prin reacția de inhibare a hemaglutinării

SCOP

Prezenta procedură detaliază tehnica de determinare, „in vitro” a statusului imun al animalelor vaccinate contra bolilor produse de virusuri hemaglutinante, folosind seruri sangvine. Titrul de anticorpi specifici este determinat printr-o reacție de inhibare a hemaglutinării, utilizând o suspensie de hematii recoltate de la specia de animal ale cărui hematii sunt aglutinate de virusul utilizat în reacție.

DEFINIȚII ȘI ABREVIERI:

DEFINITII:

Reacția de hemaglutinare: capacitatea unor virusuri de a aglutina hematiile de tip uman sau de la diferite specii de animale.

Reacția de inhibare a hemaglutinării: capacitatea anticorpilor obținuți în urma imunizării animalelor cu virusuri hemaglutinante de a se combina specific cu virusul care i-a produs, blocând în acest fel activitatea hemaglutinantă a acestuia față de categoria de hematiile pentru care prezintă acțiune aglutinantă (de tip uman sau provenite de la diferite specii de animale).

ABREVIERI:

Log –logaritm;

TM – tulpina matcă;

TL – tulpină de lucru;

SFT – ser fiziologic tamponat;

UHA – unitate hemaglutinantă;

DOCUMENTE DE REFERINȚÃ:

-[NUME_REDACTAT], ediția a 7-a, monografiile:

01/2008:1202, pag. 891; 01/2008:0870, pag. 922;01/2008: 1176, pag. 864; 01/2008: 1955, pag. 875; 01/2008: 0795, pag. 876 01/2008: 0964, pag.877 ; 01/2008: 0249, pag. 893; 01/2008: 0794, pag. 898; 01/2008: 0965, pag. 930; 01/2008: 2325, pag. 933.

Resurse necesare

Material biologic:

Seruri sangvine provenite de la pasari;

Antigene specifice;

Seruri martor pozitiv (seruri de referință);

Suspensii de hematii în concentrație de 0,75 – 1% (preparată conform anexei 1)

Substanțe și reagenți:

ser fiziologic tamponat steril (SFT) cu pH 7, care se va folosi în cazul virusurilor hemaglutinante aviare și a anticorpilor produși de acestea soluție PBS (phosphat buffer saline) cu pH 7,2 ± 0,2;

soluție Alsever, pH = 6,1;

soluție decontaminanta.

Sticlărie și accesorii:

pipete gradate de 1 și 10 ml;

tuburi pentru centrifugă;

cilindru gradat;

plăcuțe de microtitrare cu 96 godeuri, cu fundul în V sau U;

vârfuri (conuri) polipropilenă de 20 – 200 μl;

seringi de 1, 2 ml;

vacutainere;

tuburi pentru ser de 2-5 ml;

rezervoare reagenți polipropilenă de 60 ml.

Echipamente de incercare si mijloace de masurare:

Centrifugă HARRIER 18/80, 15/80;

Balanță METTLER TOLEDO, Tip PB, 1502-S;

Termometrele încorporate în Vitrina frigorifică Sanyo, Baie de apă GFL, [NUME_REDACTAT] 240L , Termostat BINDER,

ETAPELE DE LUCRU:

Pregătirea probelor de analizat:

Sângele recoltat în vacutainer se introduce la termostat, la 37- 380C timp de 30’ pentru exprimarea serul sanguin;

FIGURA 6. INTRODUCEREA PROBELOR LA TERMOSTAT LA TEMPERATURA DE 37°

Serul recoltat este inactivat în baia de apă, timp de 30’ la 560C. După inactivare serurile pot fi congelate sau se poate trece la analizarea lor;

FIGURA 7. SERURILE RECOLTATE

Înainte de a fi analizate serurile de testrat sunt dezghețate. La fel se procedează și cu antigenul și serul martor pozitiv sau se procedează la reconstituirea acestuia, în cazul în care sunt liofilizate;

Pregătirea suspensie de hematii 0,75 – 1%;

Efectuarea reacției de inhibare a hemaglutinare (pentru determinarea titrului de anticorpi):

Fiecare probă de ser se lucrează în duplicat;

Se pregătesc probele de ser;

Se repartizează câte 25 μl SFT în toate godeurile microplăcuței de titrare;

În primul godeu de la capătul fiecărui rând se adaugă câte 25 μl ser sanguin de testat;

Se execută 4-5 barbotări cu micropipeta și se trece în următorul godeu 25 μl din primul godeu, realizându-se astfel diluții binare până la ultimul rând. Din ultimul godeu se elimină 25 μl;

Se repartizează în fiecare godeu câte 25 μl din antigen titrat și adus la 4 UHA;

Conținutul plăcuței se agită ușor, apoi se lasă la temperatura camerei, timp de minim 30 minute la temperatura camerei sau la temperatura de 40C timp de 60 minute, pentru realizarea reacției dintre antigen și anticorp;

Se adaugă în fiecare godeu câte 25 μl din suspensia 1% hematii și după o ușoară amestecare, hematiile sunt lăsate să se depună, timp de 40 minute la temperatura camerei sau la temperatura de 40C timp de 60 minute;

La fiecare titrare se pun mai multe godeuri, cu martori de hematii: 25 μl SFT + 25 μl suspensie de hematii 1%, precum și martor de antigen: 25 μl SFT + 25 μl antigen titrat cu 4 UHA + 25 μl suspensie hematii 1%;

Se poate face și back titrarea pentru antigen și se folosește un ser martor pozitiv și unul negativ (ca seruri de referință) .

Exprimarea rezultatelor

Citirea reacției se realizează la sfârșitul intervalului de timp precizat mai sus;

Titrul IHA este reprezentat de cea mai mare diluție de ser care determină o inhibare completă a hemaglutinării(a celor 4 UHA de antigen). Reacția de inhibare a hemaglutinării este evaluată prin înclinarea plăcuței. Numai godeurile în care hematiile curg, asemănător celor cu martorul de hematii, sunt considerate că exprimă inhibare;

Pentru validarea rezultatelor obținute, serul martor negativ nu trebuie să exprime un titru mai mare de 1/4 (≤ 22 sau ≤ log2 2), iar serul martor pozitiv să aibă titrul cunoscut anterior;

Rezultatul încercării se exprimă direct sub forma unui raport pentru fiecare probă de ser (ex. 1/16), acesta reprezintă titrul inhibant al hemaglutinării (de exemplu titrul IHA poate fi considerat pozitiv pentru virusul bolii de Newcastle dacă este mai mare decât 1/16 (24 sau ≥ log2 4).(O.I.E., 2012)

FIGURA 8. CITIREA REACȚIEI DE INHIBARE A HEMAGLUTINĂRII(poza aparține Dr. [NUME_REDACTAT])

FIGURA 9. REACȚIA DE INHIBARE A HEMAGLUTINĂRII(poza aparține Dr. [NUME_REDACTAT])

Numai godeurile în care hematiile curg, asemănător celor cu martorul de hematii, sunt considerate că exprimă inhibare;

2.1.2.2. IZOLARE PE OUĂ EMBRIONATE A TULPINII VACCINALE DE DIFTEROVARIOLĂ

Pentru izolarea virusuli difterovariolei pe ouă embrionate se pot folosi fibroblastele embrionilor, celule renale embrionate, celule dermice embrionate sau linia celulară QT-35 de prepeliță. Adaptarea tulpinilor virusului la culturile celulare este o cerință importantă pentru apariția leziunii, întrucât nu toate tulpinile pot determina formarea leziunilor inițiale.

ETAPELE DE LUCRU:

Inocularea materialului pathologic în ouăle de găină embrionate

Aproximaiv 0,1 ml de suspensie de piele sau leziuni difterice, cu o concentrație aproape potrivită de antibiotice se inoculează la nivelul membranelor corioalantoidiene, la o vârstă de 9-12 zile a embrionilor de găină.

FIGURA 10. Inocularea materialului în ouăle de găină embrionate

(poza aparține Dr. [NUME_REDACTAT])

Incubarea ouălelor

Se incubează la 37 de grade timp de 5-7 zile, urmând să fie apoi examinate pentrut evidențierea leziunilor focale sau a îngroșării generalizate de la nivelul membranei corioalantoidiene.

FIGURA 11. Leziunile de la nivelul membranei corioalantoidiene(poza aparține Dr. [NUME_REDACTAT])

3) Examenul histopatologic

La nivelul leziunilor prin examenul histopatologic se relevă incluzii eozinofile intracitoplasmatice (după colorarea ulterioară cu H-E).

REZULTATE ȘI DISCUȚII

BOALA DE NEWCASTLE

TABELUL NR. 2. TITRUL DE ANTICORPI OBȚINUȚI PRIN IHA ȘI VÂRSTA PĂSĂRILOR LUATE ÎN STUDIU

După cum se poate observa în tabelul de mai sus la categoria de vârstă 24 luni avem un titru de anticorpi cuprins între 1/32 și între 1/64 spre deosebire de categoria de vârstă 11 luni unde avem un titru cuprins între <1/2 și între >1/256.

Aceste date sunt asemănătoare cu cele din literatură, unde după [NUME_REDACTAT] (2006) pragul de pozitivare a reacției este de 1/8, dar o infecție în curs sau recentă antrenează în general titruri ridicate. Titrurile medii pot constitui indici serologici ai unei infecții trecute sau pot fi date de o vaccinare. Pentru atestarea stării de boală, este necesară examinarea a cel puțin 10 probe recoltate de la păsări bolnave, sau trecute prin boală și repetarea la interval de 6-7 zile. Ascensiunea evidentă a titrurilor anticorpilor atestă o infecție actuală și exclude originea lor postvaccinală.

La păsările în vârstă de 10 luni se poate observa un titru de anticorpi <1/2, la fel ca și la cele care au o vârstă de 9 luni unde s-a obținut un titru de 1/256.

Cele în vârstă de 8 luni au provocat un titru de anticorpi cuprins între 1/64 și 1/256, iar cele care au o vârstă de 7 luni au avut un titru cuprins între <1/2 și 1/256.

Păsările care aveau o vârstă de 5 luni au avut un titru <1/2, iar de la cele în vârstă de 4 luni au fost obținute titruri de anticorpi cuprinse între <1/2 și 1/218.

TABELUL NR.3 TITRUL DE ANTICORPI OBȚINUȚI PRIN IHA ȘI STATUSUL DE IMUNITATE

Așa cum se poate observa în tabelul de mai sus, păsările care au fost imunizate contra Bolii de Newcastle au prezentat un titru de anticorpi cuprins între 1/64 și un titru mai >1/256. Cum este specificat și în literatura de specialitate ([NUME_REDACTAT]), titrurile de 1/640-1/5120, denotă o imunitate postvaccinală satisfăcătoare.

La păsările care nu au fost imunizate cu vaccin contra Bolii de Newcastle, au dat titruri de anticorpi cuprinse între <1/2 și 1/64.

TABELUL NR.4 TITRUL DE ANTICORPI OBȚINUȚI PRIN IHA ȘI ZONA GEOGRAFICĂ

TITRUL ZONA GEOGRAFICĂ

Conform tabelului nr. 4, titrurile din localitatea Zurbaua, [NUME_REDACTAT] au fost mai mici de 1/2 , în comparație cu titrurile obținute de la păsările din localitatea Dragomirești-Vale, [NUME_REDACTAT] care au fost cuprinse între <1/2 și >1/256.

[NUME_REDACTAT] Olt în schimb, au fost obținute titruri cuprinse între <1/2 și 1/256, în timp ce în imediata apropiere, în [NUME_REDACTAT] s-au obținut titruri de anticorpi cuprinse între <1/2 și 1/64, dominând titrurile de <1/2.

Păsările din [NUME_REDACTAT] au dat un titru de anticorpi cuprins între 1/64 și 1/256, titrurile de 1/256 fiind mai frecvente.

TABELUL NR. 5 TITRUL DE ANTICORPI ȘI RASA PĂSĂRILOR DE LA CARE S-AU RECOLTAT PROBELE DE CERCETAT

TITRUL RASA

S-a realizat un criteriu și în funcție de rasa păsărilor de la care s-au recoltat poze și din rasa Brahma s-au observant titruri de anticorpi cuprinse între <1/2 și >1/256 aceleași rezultate fiind întâlnite și la păsările din rasa New-Hampshire, cel mai frecvent rezultat fiind cel de 1/256 la cele din rasa Brahma, iar la cele din rasa New-Hampshire <1/2.

2. DIFTEROVARIOLA

Difterovariola se manifestă în localizarea cutanată, prin apariția de noduli pe creastă, bărbițe, urechiușe, cioc, pleoape, uneori și generalizat așa cum este specificat și în literatura de specialitate ([NUME_REDACTAT], 2012).

Prin inocularea virusului pe membrane corioalantoidiană a embrionilor de găină îm vârstă de 11 zile s-a pus în evidență apariția pe această membrane a nodulilor variolici, de culoare alb-cenușie, opaci, cu dimensiuni maxime după 7 zile. În celulele epiteliale ale membranei și ale embrionului se pot pune în evidență incluzii citoplasmatice specific (incluziile lui Bollinger).

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI