Studiul Influentei Unor Cationi Asupra Activitatii Alcool Dehidrogenazei In Procesul de Obtinere a Bioetanolului
STUDIUL INFLUENȚEI UNOR CATIONI ASUPRA ACTIVITĂȚII ALCOOL DEHIDROGENAZEI ÎN PROCESUL DE OBȚINERE A BIOETANOLULUI
Cuprins
Introducere
Capitolul I. ASPECTE TEHNOLOGICE PRIVIND FABRICAREA BIOETANOLULUI
I.1. Schema tehnologică de fabricare a bioetanolului din materii prime amidonoase și melasă
I.2. Materii prime folosite la fabricarea bioetanolului
I.3. Materii auxiliare și utilități folosite la fabricarea bioetanolului
I.4. Tehnologia fabricării spirtului din materii prime amidonoase
I.5. Fermentarea plămezii principale
I.6. Tehnologia fabricării spirtului din melasă
Capitolul II. CAPITOLUL II. BIOCHIMIA FERMENTAȚIEI
II.1. Primele teorii ale fermentației alcoolice
II.2. Teorii ulterioare ale fermentației alcoolice
II.3. Enzimele
II.4. Mecanismul fermentației alcoolice
Capitolul III. PARTE EXPERIMENTALĂ. DETERMINAREA ACTIVITĂȚII ALCOOL DEHIDROGENAZEI ÎN FERMENTAȚIA VINULUI
III.1. Principiul metodei
III.2. Construirea curbelor etalon
III.3. Determinarea influenței unor cationi asupra activității enzimatice a
alcooldehidrogenazei
Concluzii
Bibliografie
INTRODUCERE
Industria bioetanolului se bazează în principal pe activitatea fermentativă a drojdiilor, care transformă zaharurile fermentescibile din substrat în alcool etilic ca produs principal de fermentație și respectiv în biomasă.
Pe plan mondial, cea mai mare cantitate de bioetanol se obține prin fermentație, materiile prime folosite fiind: trestia de zahăr, melasa, cartofii, cerealele, (îndeosebi porumbul), sfecla de zahăr, fructele, etc.
Bioetanolul are multiple utilizări în diferite industrii. Astfel în industria alimentară este folosit pentru fabricarea băuturilor alcoolice și a oțetului, în industria chimică pentru obținerea cauciucului sintetic și ca dizolvant, în industria farmaceutică pentru prepararea anumitor substanțe (eter, cloroform etc.), iar în medicină ca dezinfectant.
În ultimii ani alcoolul etilic este utilizat tot mai mult în amestec cu benzina drept carburant pentru motoare, ceea ce a dat o nouă dezvoltare industriei bioetanolului în diferite țări, mai ales în cele cu agricultura dezvoltată.
În lucrarea de față se prezintă studiul influenței unor cationi asupra activității alcooldehidrogenazei din mediul de fermentație al bioetanolului.
CAPITOLUL I.
ASPECTE TEHNOLOGICE PRIVIND FABRICAREA BIOETANOLULUI
Noțiunea de alcool își are originea în cuvintele arabe: al (articol) și cohol (lucru subtil) [1]. El se obține prin fermentarea anaerobă a glucozei obținută biotehnologic din diverse medii și are utilizări multiple. Bioetanolul se amestecă în orice proporție cu apa și este inflamabil, având următoarele caracteristici fizice:
– masa moleculară: 46,07
– punct de topire: 114,1 oC
– punct de fierbere: 78,32 oC
– densitate: 0,7893 g/cm3
Prin distilarea simplă a unui amestec de alcool și apă, nu se poate obține alcool pur, ci se atinge o concentrație de 95,57% alcool și 4,43% apă (amestec azotropic ce are punctul de fierbere 78,15oC) [2]. Concentrația alcoolului în amestec cu apa se determină prin măsurarea densității acestor amestecuri cu aerometrespeciale denumite alcoolmetre gradate direct în procente de volum sau procente de masă. Densitatea amestecurilor nu este o proprietate aditivă, de aceea se folosesc tabele cu densitățile diferitelor amestecuri de alcool-apă, determinate experimental.
De regulă, concentrația alcoolică se exprimă în procente de volum la 20oC. Dacă se măsoară concentrația alcoolică la altă temperatură se fac corecțiile necesare din tabelele de corecție pentru alcool etilic.
I.1. Schema tehnologică de fabricare a bioetanolului din materii prime amidonoase și melasă
În fig.I.1 [3] este reprezentată schema tehnologică a fabricării spirtului din materii prime amidonoase (cartofi) care este valabilă și pentru prelucrarea cerealelor, cu deosebire că lipsește operația de spălare a cartofilor și la fierbere se adaugă și apă.
Materia primă este supusă întâi recepției cantitative și calitative,determinându-se conținutul în amidon,după care este depozitată în silozuri speciale pentru cartofi sau cereale. Din siloz, materia primă este transportată în secția de fabricație, unde se realizează mai întâi o spălare în cazul cartofilor, pentru îndepărtarea impurităților aderente.
MALȚ VERDE CARTOFI DROJDIE
Măruntire umedă Recepție Multiplicare
în laborator
Dezinfecție Depozitare
LAPTE DE SLAD Transport
PREPARATE ENZIMATICE Spălare
MICROBIENE
Cântarire
Fierbere
Zaharificare
PLĂMADĂ
DULCE Prefermentare
Acidulare
Plămadă însămânțată PLĂMADĂ
DE DROJDIE
Bioxid de carbon Fermentare
Spalare PLĂMADĂ
FERMENTATĂ
CO2 ape de
spălat spălare
Distilare
BIOETANOL
BRUT BORHOT
Rafinare Apă de luter
FRUNTI SI COJI SPIRT RAFINAT ULEI DE
FUZEL
Depozitare Depozitare Depozitare
Fig.I.1.Schema tehnologică de fabricare a spirtului din materii prime amidonoase (cartofi)
APA MELASA ACID SULFURIC SĂRURI NUTRITIVE
Recepție
Depozitare Diluare cu apa 1:3 Dizolvare in apă
Transport
Cântărire
Diluare la 60 grade Bllg Apa
Diluare la 30-34 grade Bllg Diluare la 12-16 grade Bllg
PLĂMADĂ PLĂMADĂ
PRINCIPALĂ DE DROJDIE
Neutralizare
si acidulare
Adăugare de săruri
nutritive
(Sterilizare) DROJDIE
Limpezire Multiplicare in laborator
Bioxid Fermentare Prefermentare Multiplicare in secția
de carbon de culturi pure
Spălare PLĂMADA FERMENTATĂ Drojdie refolosită
CO2 ape de Separarea Drojdie Drojdie
spălat spălare drojdiei separată excedentară
Distilare BORHOT
BIOETANOL BRUT
Rafinare Apa de luter
FRUNTI ALCOOL ULEI DE FUZEL
RAFINAT
Fig.I.2 Schema tehnologică de fabricare a spirtului din melasă (procedeul cu două plămezi si două concentrații și reutilizarea drojdiei)
Cartofii spălați sau cerealele (porumbul) sunt apoi cântărite și trecute fără o prealabilă mărunțire, la operația de fierbere. În urma fierberii, se obține o masă fiartă care este supusă apoi zaharificării. În urma acestei operații, amidonul este transformat în principal în maltoză și dextrine care intră în compoziția plămezii dulci care se însămânțează cu drojdie.
Alte operații la care mai este supusă materia primă sunt: fermentare, distilare și rafinare unde rezultă alcool rafinat care se depozitează [4].
Tehnologia de fabricare a bioetanolului din melasă este prezentat în figura I.2.
I.2. Materii prime folosite la fabricarea bioetanolului
I.2.1. Clasificarea materiilor prime
În funcție de natura substanțelor utile pe care le conțin, materiile prime folosite la fabricarea bioetanolului se pot clasifica astfel [5]:
a) Materii prime amidonoase (care conțin amidon)
-cartofii;
-cerealele (porumb,secară,grâu,ovăz,orez etc);
b) Materii prime care conțin zahăr fermentescibil:
-sfecla și trestia de zahăr;
-melasa din sfecla și trestia de zahăr;
-struguri, fructe, tescovine dulci, banane etc;
c) Materii prime care conțin inulina și lichelina (hidrați de carbon asemănători cu amidonul);
-rădăcini de cicoare ce conțin inulina;
-mușchi de Islanda ce conțin lichelina;
d) Materii prime care conțin alcool:
-vinul din struguri sau din fructe;
-tescovina fermentată și drojdia de vin;
-distilate din fructe fermentate cu defecte;
Materiile prime care se folosesc cel mai des pentru obținerea alcoolului etilic sunt: melasa, cartofii și porumbul.
Melasa
Prin melasă se înțelege ultimul reziduu care rămâne de la fabricarea zahărului în urma cristalizării repetate a zaharozei și din care nu se mai poate obține economic zaharoza prin cristalizare, fiind un subprodus la fabricarea zahărului.
Deși conține o mare cantitate de zahăr, de 46-52 %, aceasta nu mai poate cristaliza din cauza vâscozității ridicate și a conținutului ridicat în substanțe minerale și organice. Sărurile organice de potasiu, în special, împiedică cristalizarea, formând cu zahărul combinațiMaterii prime care conțin inulina și lichelina (hidrați de carbon asemănători cu amidonul);
-rădăcini de cicoare ce conțin inulina;
-mușchi de Islanda ce conțin lichelina;
d) Materii prime care conțin alcool:
-vinul din struguri sau din fructe;
-tescovina fermentată și drojdia de vin;
-distilate din fructe fermentate cu defecte;
Materiile prime care se folosesc cel mai des pentru obținerea alcoolului etilic sunt: melasa, cartofii și porumbul.
Melasa
Prin melasă se înțelege ultimul reziduu care rămâne de la fabricarea zahărului în urma cristalizării repetate a zaharozei și din care nu se mai poate obține economic zaharoza prin cristalizare, fiind un subprodus la fabricarea zahărului.
Deși conține o mare cantitate de zahăr, de 46-52 %, aceasta nu mai poate cristaliza din cauza vâscozității ridicate și a conținutului ridicat în substanțe minerale și organice. Sărurile organice de potasiu, în special, împiedică cristalizarea, formând cu zahărul combinații complexe cu solubilitate ridicată. Cantitatea de melasă ce rezultă de la fabricarea zahărului reprezintă 4 – 4.8% din greutatea sfeclei, variind în funcție de calitatea sfeclei și de procesul tehnologic aplicat la fabricarea zahărului.
Melasa se prezintă ca un lichid vâscos, de culoare brun-închisă, cu miros de cafea caracteristic și cu gust dulce – amărui. Reacția melasei este de regulă ușor alcalină.
În funcție de materia primă folosită la fabricarea zahărului, deosebim [6]:
– melasa din sfecla de zahăr;
– melasa din trestie de zahăr;
Melasa se utilizează atât la fabricarea etanolului cât și a drojdiei de panificație și furajere. Astfel, în țara noastră peste 50% din producția de etanol se obține din melasă, din sfeclă sau cartofi.
Cartofii
Originar din America de Sud, cartoful este o plantă erbacee anuală, care se cultivă bine în zonele cu climă temperată și soluri nisipoase. În țara noastră, se folosește la fabricarea bioetanolului excedentul de cartofi industriali rezultați din regiunile mai importante de cultivare (județele Suceava, Covasna, Harghita). Pentru industrializare se preferă soiurile tardive de cartofi, cu o perioadă mai lungă de vegetație deoarece acumulează o cantitate mai mare de amidon și au o rezistență mai bună la depozitare [7].
Porumbul
Porumbul (Zea mays) reprezintă o materie primă importantă pentru producția de alcool etilic, dar cu utilizări și pentru obținerea de mălai, amidon și derivate de amidon, bere (ca nemalțificat), ulei (germene de porumb) și conserve (porumbul dulce).
Pentru fabricarea etanolului se preferă porumbul cu boabe făinoase (specia Dentiformis) care se caracterizează printr-un conținut ridicat în amidon și mai scăzut în substanțe proteice. Conținutul în amidon al porumbului reprezintă circa 70% din substanța uscată a bobului. Alături de amidon se găsesc și cantități mai reduse de zaharuri simple, dextrine și pentozani.
Dintre soiurile industriale de porumb cele mai răspândite sunt [8]:
-Zea mays dentiformis (porumbul dinte de cal);
-Zea mays amilaceae (porumbul amidonos);
Utilizarea porumbului în producția de alcool este dependentă de conținutul în amidon. În România, porumbul ocupă primul loc ca importanță între plantele cerealiere cultivate, deoarece:
are o mare capacitate de producție (cu 40-45% mai mare decât al celorlalte cereale);
se păstrează bine în condiții economicoase.
Bobul de porumb are următoarele părți anatomice:
endosperm (80-84% din masa bobului);
embrion (10-13% din masa bobului);
straturile de înveliș reprezintă 5-6% față de masa bobului (înveliș exterior sau pericarp, înveliș seminal, care acoperă endospermul și embrionul și stratul aleuronic).
Compoziția chimică a porumbului este variabil de la un soi la altul și chiar în cadrul aceluiași soi, în funcție de condițiile de climă și sol [9].
Umiditatea porumbului este variabilă în funcție de modul de uscare după recoltare. După recoltare, porumbul are o umiditate de cca. 25%. La porumbul uscat artificial, umiditatea este cuprinsă între 12-15%, fiind cel mai indicat pentru conservarea în aceste condiții.
Glucidele constituie componentul principal al bobului de porumb. Pe lângă amidon care constituie 85% din substanța uscată, se mai găsesc și alți hidrați de carbon, cum sunt monoglucidele și dextrinele (cca.3%), pentozani (6%) și celuloză (3%) [10].
Substanțele proteice reprezintă cca. 95% din compușii cu azot ai bobului.
Substanțele grase sunt regăsite în proporție de 4-6% din substanța uscată a bobului.
Cenușa care reprezintă aproximativ 1,7% din substanța uscată a bobului, este constituită din săruri de fosfor, potasiu și magneziu. În bobul de porumb se mai găsesc vitaminele A, E, B1, B6.
Depozitarea și păstrarea corespunzătoare a porumbului constituie una dintre problemele principale și dificile ale unei fabrici de etanol. La depozitarea porumbului în funcție de umiditatea și temperatura boabelor, precum și de condițiile de păstrare, pierderile de substanță utilă (amidonul) pot fi minime sau foarte mari, iar în acest caz, rezultatele economice ale fabricii de etanol putând fi grav afectate.
În toamnele secetoase, boabele au umiditate scăzută (12-14%). La această umiditate, germenul nu se poate dezvolta, găsindu-se în stadiul de viață latentă, absorbind oxigen și degajând CO2 în cantități foarte mici, datorat procesului de respirație. Fenomenul constă în transformarea glucozei în prezența O2 în CO2 și H2O cu degajare de căldură (reacție exotermă):
C6H12O6 + 6O2 = 6CO2 + 6H2O + calorii
În primele săptămâni de recoltare, respirația este mai intensă, bobul având umiditate mai mare. La scăderea umidității, respirația scade, întrucât materialul respirator (zahărul), scade. Prin acest mod, embrionul dispune de cantități extrem de mici de zahăr, pe seama căruia respiră, transformându-l în CO2 și apă. Prin respirație crește temperatura, umiditatea, se activează enzimele, pe baza cărora este necesară menținerea umidității la valoarea de 14-15%.
Din punctul de vedere al fabricației, este necesară reducerea la minimum a pierderilor de amidon. Boabele, în timpul păstrării se vor proteja de condițiile favorabile germinării, ceea ce înseamnă păstrarea lui sub umiditatea critică de 14-15%. Peste această valoare, începe germinarea bobului, deci alterarea acestuia [11]. La creșterea umidității, se produc și alte modificări: pierderea de substanță utilă (amidon) și posibilitatea dezvoltării de bacterii și mucegaiuri. Cu cât materia primă conține mai mult amidon zaharificabil, cu atât producția de alcool va fi mai mare, deci mai rentabilă.
I.2.2. Structura amidonului
Amidonul se găsește în granule de amidon care au dimensiuni variind între 1 și 100µm și densitatea ≈ 1,5 g/cm3. Mărimea granulelor, forma granulelor (sferică, lenticulară, poliedrică) precum și poziția hilului sunt controlate genetic.
Granulele de amidon sunt formate dintr-un nucleu de condensare numit hil și din straturi concentrice (striuri) în jurul nucleului de condensare. Acumularea de striuri reprezintă creșteri ale granulei datorită mecanismului de biosinteză a amidonului [12].
La examinare prin microscopie în lumină polarizată, granula de amidon prezintă o cruce de interferență ce trece prin hil și care sugerează existența straturilor ordonate sub forma de cristalite din amidon.
La nivel macromolecular, granula de amidon prezintă coeziune radială covalentă corespunzătoare axei longitudinale a macromoleculelor de amidon și o coeziune tangențială în care predomină legături de hidrogen intermoleculare.
I.2.2.1. Fracțiunile amidonului
Amidonul este format din două componente care diferă între ele structural, și anume, amiloza și amilopectina.
Amiloza. Este componenta cantitativ mai redusă a amidonului fiind un polimer liniar format din molecule de D-glucoză legate α-1,4 (fig.I.3). Cu cât masa moleculară a amilozei este mai mare, pot fi puse în evidență și unele legături α-1,6 prezente în puctele de ramificare, confirmat fiind de faptul că ß-amiloliza limită a amilozei este de 77-79%. Amiloză nativă conține 500-6000 unități de glucoză repartizate în 1-20 lanțuri [13].
În soluție apoasă, amiloza are o structură dezordonată, cea sub formă de helix fiind prezentă intr-o proporție redusă. Au fost propuse trei modele structurale pentru amiloza în soluție apoasă: modelul A, în care amiloza este sub forma de ghem neordonat; modelul B, în care amiloza este prezentată sub formă de helix deformat; modelul C, care este o structură cu zone în helix intercalate cu zone ghem [14].
La temperatura camerei soluțiile apoase de amiloza sunt instabile și pot forma precipitate (soluții ≤1,5%). Amiloza precipitată nu mai poate fi redizolvată în apă la 25°C. La această temperatură, apa poate fi considerată ca un solvent slab, deoarece interacțiunile apă-apă și amiloză-amiloză sunt net preponderente în comparație cu cele apă-amiloză.
Gelifierea amilozei este consecință a formarii unei rețele interconectate. Gelurile de amiloză sunt reversibile prin încălzire la temperaturi ≥160°C.
Fig.I.3 Structura moleculară a amilozei [15]
Amilopectina. Este principala componentă a amidonului reprezentând 70-80% și este un polimer ramificat în care unitățile de D-glucoză sunt legate α-1,4 și parțial α-1,6, acestea din urmă contând pentru 5-6% din numărul total de legături existente (fig.I.4).
Fig.I.4. Structura moleculară a amilopectinei [15]
I.2.3. Alți componenți ai amidonului
Materialul intermediar. Acesta reprezintă 5-7% și este mai abundent în amidonul bogat în amiloză în care caz materialul intermediar poate depăși 10%. Acest material intermediar reprezintă în fapt forme imperfecte de amilopectină, explicabile prin anomalii în mecanismul de biosinteză a amilopectinei.
Lipidele. Acestea reprezintă o componentă minoră (≤1,12%) și pot fi extrase din amidon cu solvenți polari la cald, în care caz are loc dezintegrarea granulei de amidon. Sunt reprezentate în principal de fosfolipide care formează un complex cu amiloză și lanțurile lungi din amilopectină, fapt ce determină o “înmuiere” limitată a amidonului.
Alți componenți. Amidonul conține și cantități reduse de fosfor sub forma de monoesterfosfat și fosfolipide. Alti componenți minori ai amidonului sunt proteinele și substanțele minerale care au localizare internă sau externă granulei de amidon și nu modifică proprietățile fizico-chimice de bază ale amidonului, dar pot influența comportamentul general al amidonului.
I.3. Materii auxiliare și utilități folosite la fabricarea bioetanolului
I.3.1. Malțul verde
Este folosit în tehnologia alcoolului din materii prime amidonoase ca agent de zaharificare, datorită enzimelor amilolitice acumulate în timpul germinării [16]. Fabricarea malțului verde pentru alcool este mai simplă în comparație cu producerea malțului pentru bere, deoarece în acest caz interesează în principal obținerea unei activități amilazice cât mai ridicate. Datorită umidității ridicate, malțul verde nu este conservabil și trebuie utilizat imediat la zaharificarea plămezilor din materii prime amidonoase. În unele țări malțul verde se conservă printr-o uscare atentă la temperaturi scăzute intr-un uscător destinat uscării malțului pentru bere.
Uscarea se realizează in două faze:
– pe grătarul superior – la temperatura de 35-40 grade Celsius timp de 12 ore sub aerare și amestecare intense până la scăderea umidității la circa 10 %;
– pe grătarul inferior – la temperatura de 40-45 grade Celsius timp de 12 ore sub aerare intense până la umiditatea finală de circa 5%;
În aceste condiții, capacitatea de zaharificare a malțului uscat scade cu numai 20-30 % în comparație cu cea a malțului verde. Malțul astfel uscat este folosit în special în fabricile de alcool din cereale sau cartofi care nu dispun de mălțării proprii.
I.3.2. Preparatele enzimatice microbiene
Însușirea anumitor mucegaiuri și bacterii de a produce în cursul dezvoltării lor, ca de altfel și cerealele care germinează, enzime amilolitice este de mult timp cunoscută în țările din Asia, în special Japonia și China. Astfel pentru prepararea băuturii saké din orez se folosește un amestec de mucegaiuri producătoare de enzime.
Primul procedeu de zaharificare a porumbului pentru obținerea alcoolului, care s-a bazat pe folosirea enzimelor microbiene, a apărut la sfârșitul secolului trecut in Franța, servindu-se de o cultură pură din mucegaiul Amylomyces Rouxii ca agent de zaharificare, în locul malțului. La scurt timp japonezul Takamin a obținut prin culturi de suprafață pe tărâțe din grâu a mucegaiului Aspergillus orizae un preparat enzimatic brut [17].
I.3.3. Săruri nutritive și factori de creștere
Atât la fabricarea etanolului cât și a drojdiei este necesară adăugarea de săruri nutritive care conțin azot, fosfor, magneziu etc., cât și factori de creștere pentru a compensa deficitul substratului în aceste substanțe necesare în cantități bine determinate.
Deficitul de azot se completează de obicei prin adaos de sulfat de amoniu, îngrășământ complex, amoniac sau uree, iar necesarul de fosfor se asigură prin adaos de superfosfat de calciu și îngrașământ complex. Factorii de creștere se asigură prin adaos de autolizat de drojdie, extract de radicele de malț, de malț sau de porumb.
Sulfatul de amoniu este o sare solubilă ce conține 20-21 % azot, care se adaugă sub formă de soluție apoasă acidulate cu acid sulfuric cu concentrația de 5-7 grade Balling.
Amoniacul se adaugă sub formă de apă amoniacală obținută prin diluarea amoniacului cu apă in raport de 1:5.
Superfosfatul de calciu se obține prin tratarea făinii de oase cu acid sulfuric și este un amestec format din 3 moli de fosfat monocalcic și 7 moli sulfat de calciu. În fabricile de etanol din țara noastră superfosfatul de calciu este înlocuit cu îngrășământ complex, care conține atât fosfor cât și azot și care are avantajul formării unei cantități mult mai reduse de depozit insolubil.
I.3.4. Acidul sulfuric
Se utilizează pentru neutralizarea și acidularea plămezilor din melasă până la un pH optim pentru activarea drojdiei, pentru acidularea plămezilor speciale de drojdie la fabricarea spirtului din melasă sau materii prime amidonoase în vederea cultivării melasei în culturi pure tehnice cât și pentru dezinfecția laptelui de drojdie.
Acidul sulfuric are o concentrație de 96-98 %.
I.3.5. Antispumanții
La fabricarea spirtului se formează cantități mari de spumă datorită substanțelor superficial active din melasă care se dispun la suprafata bulelor de aer care barbotează în mediu, stabilizând spuma formată. Cu cât melasa este mai bogată în substanțe coloidale și deci insuficient limpezită, cu atât cantitatea de spumă formată este mai mare.
Formarea spumei, care duce la micșorarea capacităților utile ale fermentatoarelor și la pierderi de mediu prin deversare, se poate combate atât prin procedee mecanice cât și prin folosirea de substanțe cu acțiune antispumantă.
Antispumanții utilizați pe scara cea mai largă sunt acizii grași vegetali rezultați din procesul de rafinare a uleiurilor vegetale. În ultimul timp se folosesc ca antispumanți uleiurile siliconice cât și mono- și digliceride care prezintă o eficiență mai mare de distrugere a spumei în comparație cu acizii grași. Alegerea antispumanților se face în funcție de calitatea melasei folosite, de procesul tehnologic și de sistemul de aerare aplicat.
Antispumanții folosiți trebuie să fie nevătămători, să nu producă murdărirea utilajelor și să nu influențeze negativ aspectul exterior.
I.3.6. Apa
Apa este folosită atât ca apă tehnologică pentru diluarea melasei și a acidului sulfuric, dizolvarea sărurilor nutritive și spălarea laptelui de drojdie, spălarea utilajelor, cât și ca apă de răcire a linurilor de fermentare. Astfel la fabricarea etanolului se consumă 7.5 – apă/hl. alcool absolut.
Apa tehnologică trebuie să îndeplinească condițiile unei ape potabile. Ca apă tehnologică se pretează mai bine apa de adâncime, care are o compoziție și o temperatură aproape constantă și un număr mai mic de germeni. Apele de suprafață nu pot fi utilizate ca atare în fabrică, fiind necesară tratarea lor prin filtrare, aerare, clorinare sau ozonizare.
În ceea ce privește apa de răcire, care ocupă o pondere foarte mare în consumul de apă în fabricile de etanol, aceasta nu trebuie să îndeplinescă condițiile apei potabile. Se cere însă să aibă o temperatură și o duritate cât mai scăzute.
I.4. Tehnologia fabricării spirtului din materii prime amidonoase
I.4.1. Pregătirea cartofilor și cerealelor
Pregătirea cartofilor se realizează prin spălare cu apă pentru indepărtarea impurităților aderente (nisip, pământ, pietre, paie etc.) [18]. În acest scop cartofii sunt scoși din stive pe timp mai puțin rece și transportați în magazia de recepție unde se află mașina de spălat cartofi. În fabricile de etanol transportul cartofilor se face hidraulic prin canale cu lățimea de 35-40 cm și înălțimea de 60-70 cm. În timpul transportului hidraulic se realizează și o prespălare a cartofilor prin reținerea corpurilor plutitoare și depunerea corpurilor grele în prinzătoarele de pietre de pe fundul canalului. Cartofii prespălati sunt preluați din canalul de transport hidraulic de către un elevator și introduși în mașina de spălat cartofi.
Spălarea cartofilor este necesară deoarece impuritățile conținute pot produce înfundarea conductelor și uzura prematură a utilajelor tehnologice. Se realizează cu ajutorul unor mașini speciale prevăzute cu două sau trei compartimente prin care cartofii sunt transportați cu ajutorul unui ax cu palete. Spălarea se face cu apă, care circulă în contracurent cu cartofii, iar corpurile grele trec prin fundul perforat al mașinii și sunt colectate în camere de unde se evacuează periodic.
Consumul de apă pentru spălare este de 5- cubi/tona de cartofi. Pentru spălare se folosește de obicei apă de răcire de la zaharificator care are o temperatură mai ridicată, ceea ce ușurează operația de spălare. Cartofii spălați sunt preluați de un elevator, care îi ridică până la cântarul automat de cartofi.
Cântărirea cartofilor trebuie să se facă cu precizie pentru stabilirea cât mai corectă a cantității de cartofi și de malț verde, care se iau în considerare în final la calculul randamentului în alcool. Cântărirea se execută cel mai exact cu ajutorul cântarelor automate.
Fabricile mai mici de etanol care nu dispun de cântar de cartofi, se pot servi de masa hectolitică a cartofilor, care pentru cartofii de mărime medie este de circa 70 kg/hl. În acest caz fierbătorul se umple la nivel cu cartofi și se calculează masa cartofilor în kg.
O altă metodă simplă pentru determinarea masei de cartofi din fierbător este următoarea:
– după ce se umple fierbătorul cu cartofi, se umple cu apă, măsurându-se cantitatea de apă introdusă, cu ajutorul unui debitmetru;
– din diferența între volumul total al fierbătorului și volumul apei introduse rezultă volumul cartofilor, care prin înmulțire cu masa lor specifică determinată în laborator, conduce la masa cartofilor din fierbător.
Pregătirea cerealelor se realizează prin precurățire cu ajutorul tararelor aspiratoare și a separatoarelor magnetice, prin care sunt îndepărtate impuritățile conținute: pleavă, paie, nisip, pietriș, corpuri metalice, etc. Cerealele sunt apoi cântărite și introduse în fierbător, fără a fi măcinate, tinându-se seama că la fierberea cerealelor se adaugă și apă.
I.4.2. Fierberea materiilor prime amidonoase
Operația de fierbere este necesară deoarece amidonul natural conținut în materiile prime amidonoase, cereale sau cartofi, nu poate fi atacat de către amilazele din malț fără o prealabilă gelifiere și solubilizare care se realizează prin fierbere sub presiune [19].
I.4.2.1. Teoria procesului de fierbere
Gelifierea amidonului se face prin îmbibare cu apă și încălzirea la temperatura de gelifiere, care este în funcție de felul amidonului. Astfel pentru amidonul din cartofi temperatura de gelifiere este 65 grade Celsius, pentru cel din porumb 75 grade Celsius, pentru cel din grâu 79-80 grade Celsius, iar pentru orz și orez 80 grade Celsius.
În timpul fierberii cartofilor, care conțin o cantitate mai mare de apă, granulele de amidon ce plutesc în sucul celular se umflă, absorbând tot lichidul intracelular, ceea ce duce la distrugerea celulei și punerea în libertate a gelului de amidon.
În cazul porumbului, datorită umidității scăzute, cantitatea de suc celular este mult mai mică, astfel încât granulele de amidon nu dispun de suficientă apă pentru a se umfla și a se elibera din celulă sub forma de clei. Din acest motiv la fierberea porumbului trebuie să se adauge o cantitate importantă de apă.
I.4.2.2. Instalații de fierbere
Pentru fierberea materiilor prime amidonoase se folosesc astăzi în exclusivitate aparate de fierbere sub presiune tip Henze, de formă cilindrică-conică [20]. Partea conică este mult mai înaltă, astfel încât să se poată goli complet fierbătoarele la sfârșitul operației. Fierbătoarele pot fi alimentate cu abur atât pe la partea superioară cât și pe la partea inferioară.
În ultimul timp s-au pus la punct și procedee continue de fierbere a materiilor prime amidonoase, prin care s-a realizat creșterea randamentului în alcool cu 1-2 %, datorită unei fierberi, zaharificări și fermentări mai complete a materiei prime.
Instalațiile de fierbere continuă necesită mărunțirea cât mai fină a cartofilor și a cerealelor.
Există mai multe tipuri de instalații de fierbere continuă, care diferă între ele prin modul în care se realizează operația:
a) instalații cu coloane de fierbere;
b) instalații cu cap de contact și serpentine sau vase de menținere a temperaturii de fierbere;
c) instalații prin pulverizare;
Instalațiile din prima grupă sunt prevăzute de obicei cu două coloane:
-în prima coloană terciul de materie primă preâncălzit este supus operației de fierbere timp de 20-30 min,materialul circulând în contracurent cu aburul introdus pe la partea inferioară unde temperatura este de circa 150 grade Celsius;
-în cea de-a doua coloană de temperare are loc gelifierea și solubilizarea amidonului prin menținerea masei în fierbere timp de 25-30 min. la 140 grade Celsius în cazul cartofilor și 150 grade Celsius la porumb.
Instalațiile de fierbere din cea de-a doua grupă au ca element principal așa-numitul cap de contact, format dintr-o teavă prin care circulă materia primă mărunțită cu apa sub formă de terci și în care se introduce lateral prin orificii abur de presiune ridicată, încălzindu-se materia primă la temperatura de fierbere.
Instalațiile de fierbere prin pulverizare se caracterizează prin folosirea a două fierbătoare asemănătoare din punct de vedere constructive cu fierbătorul discontinuu tip Henze.
I.4.2.3. Conducerea și controlul fierberii
În funcție de felul și calitatea materiei prime, regimul de fierbere diferă de durata, temperatura (presiune) maximă, cantitatea de apă adăugată la fierbere și modul de introducere a aburului în fierbător [21]. Astfel, cartofii necesită o durată mai scurtă și o temperatură maximă de fiebere mai scazută în comparativ cu cerealele.
Regimul de fierbere diferă și în funcție de calitatea cartofilor sau a cerealelor. Astfel cartofii înghețați sau alterați se fierb la o temperatură mai scazută decât cei sănătoși, iar cerealele cu structură sticloasă necesită un regim mai intens de fierbere decât cele făinoase.
Cu cât temperatura de fierbere este mai ridicată, cu atât se reduce mai mult durata de fierbere. În practică se evită însă la fierberea clasică încălzirea prea rapidă a materiei prime la temperaturi ridicate datorită pericolului de formare a unor cantități mai mari de melanoide și caramel și de a rămâne zone de material negelificat. La fierberea cartofilor, aburul se introduce atât pe la partea superioară cât și pe la cea inferioară a fierbătorului, în timp ce în cazul fierberii cerealelor, aburul se introduce numai pe jos.
Practic operația de fierbere decurge in două faze:
– încălzirea produsului până la temperatura de fierbere;
– menținerea temperaturii maxime de fierbere;
Pentru a se evita gelifierea incompletă a materiei prime cât și formarea melanoidelor și caramelului se recomandă ca la prelucrarea cartofilor și cerealelor întregi încălzirea produsului până la temperatura de fierbere să se facă mai lent, iar presiunea maximă de fierbere să se mențină un timp cât mai scurt.
Fierberea cartofilor sănătoși se realizează astfel:
– se încarcă fierbătorul cu cartofi și se închide etanș gura de încărcare;
– se deschide apoi ventilul de golire și se introduce abur pe la partea superioară, care încălzește cartofii și se scurge sub formă de condens pe la partea inferioară;
– după 15-20 minute din momentul introducerii aburului, când începe să iasă abur in jet continuu pe la partea inferioară a fierbătorului, se oprește introducerea aburului pe la partea superioară, continuându-se încălzirea cu abur numai pe la partea inferioară timp de 40-45 minute, lăsând ventilul de aer parțial deschis, până ce presiunea ajunge la circa 3 atmosfere;se menține masa din fierbător timp de 10-15 minute la temperatura de fierbere, continuându-se introducerea de abur pe la partea inferioară; dacă este cazul se ridică ușor presiunea;
– după terminarea fierberii se oprește accesul aburului și se descarcă fierbătorul în timp de 10-30 minute, cartofii trecând printr-un grătar din bare triunghiulare cu o muchie îndreptată în sus care se află la partea inferioară a fierbătorului,realizându-se astfel obținerea unei mase fierte omogene.
Pentru stabilirea momentului când fierberea este terminată se iau probe din masa fiartă prin robinetul de luat probe și se spală cu apă rece și apoi caldă pe o sită. Fierberea se consideră terminată când cojile sunt translucide și nu conțin amidon aderent.
Fierberea cartofilor degerați sau alterați se conduce după un regim deosebit, deoarece aceștia au o structură mai moale, tinzând să formeze o masă compactă în fierbător care nu poate fi străbătută integral de abur. În afară de aceasta, cartofii degerați au pierdut în timpul dezghețării circa 20 % din apa continută, iar cantitatea de zaharuri simple este mult mai mare.
În aceste condiții la fierberea lor trebuie să se ia următoarele măsuri:
– înainte de introducerea cartofilor în fierbător, acesta se umple cu apă în partea conică, pentru a se evita terciuirea cartofilor în cădere; cantitatea de apă introdusă reprezintă circa 20 % din masa cartofilor;
– aburul se introduce numai pe la partea inferioară a fierbătorului, lăsându-se ventilul de aer deschis, astfel încât presiunea să nu depășească 2.5 atmosfere, pentru a se evita caramelizarea zahărului.
Fierberea porumbului se face astfel [22]:
– se introduce mai întâi apa in fierbător în cantități de 250-300 1itri/100 kg porumb, în funcție de umiditate și se încălzește prin introducere de abur până la fierbere;
– se introduce cantitatea stabilită de porumb în fierbător și se închide ermetic gura de încărcare;
– se introduce abur pe la partea inferioară a aparatului, lăsându-se ventilul de aer parțial deschis și se ridică presiunea manometrică la circa 3 atmosfere.
– se golește apoi brusc fierbătorul, realizându-se prin trecerea de la presiunea de fierbere la cea atmosferică explozia boabelor și transformarea lor într-un terci uniform.
Regimul de fierbere al cerealelor trebuie ales cu grijă în funcție de felul și calitatea materiei prime. Astfel unele soiuri de cereale se fierb mai greu decât altele, iar cerealele cu coajă mai groasă se fierb mai greu, necesitând o durată și o presiune mai ridicată cât și menținerea materialului în mișcare continuă în timpul fierberii.
I.4.3. Zaharificarea materiilor prime amidonoase
După ce amidonul din materia primă a fost gelificat și solubilizat prin fierbere sub presiune, masa fiartă obtinută este supusă în continuare operației de zaharificare, prin care se realizează transformarea amidonului în zaharuri fermentescibile de către drojdie.
Operația de zaharificare mai este denumită și plămădire, întrucât se obține o plămadă care conține toate componentele insolubile ale materiei prime și a malțului (suspensii,coji).
Zaharificarea se poate realiza în trei moduri, în funcție de agentul de zaharificare [23]:
– cu malț verde;
– cu preparate enzimatice microbiene;
– cu acizi minerali;
În fabricile de alcoo este cea mai răspândită este zaharificarea pe cale enzimatică cu ajutorul malțului verde sau a preparatelor enzimatice microbiene.
I.4.3.1. Transformările care au loc la zaharificare
Acțiunea de zaharificare a malțului verde se datorează conținutului său în enzime amilolitice, în principal α si β –amilaza,care acționează asupra celor două componente ale amidonului solubil –amiloza și amilopectina- pe care le transformă în zaharuri fermentescibile.
α-amilaza are o capacitate foarte mare de fluidificare și o capacitate relativ scăzută de zaharificare, caracterizându-se în special prin formarea de dextrine și în mai mică măsură de maltoză.
β-amilaza se caracterizează, dimpotrivă, printr-o putere de fluidizare slabă, în schimb printr-o mare capacitate de zaharificare, formând în cea mai mare parte maltoza.
La zaharificare trebuie să se țină seama de condițiile optime de temperatură și pH necesare pentru cele două enzime, cât și de termorezistența lor.
I.4.3.2. Instalații de zaharificare
Utilajul principal folosit este zaharificatorul care poate avea capacitatea egală cu a unui fierbător sau cu a 2-3 fierbătoare. În zaharificator au loc următoarele operații [24]:
– răcirea masei fierte până la temperatura de fluidificare (75-80 grade Celsius) sau de zaharificare (55-60 grade Celsius)
– amestecarea cu laptele de slad;
– zaharificarea propriu zisă;
– răcirea plămezii dulci până la temperatura de însămânțare cu drojdie (30grade Celsius)
– însămânțarea cu drojdie sub formă de plămadă de drojdie;
– răcirea plămezii însămânțate până la temperatura de începere a fermentației (18-20 grade Celsius și pomparea în linul de fermentare).
Un zaharificator trebuie să asigure o durată de răcire cât mai scurtă, cu un consum cât mai redus de apă și o amestecare cât mai uniformă a plămezii cu malțul în scopul menținerii cât mai exacte a temperaturii de zaharificare. Capacitatea zaharificatorului trebuie să fie de circa 10 % mai mare decât a fierbătoarelor ce se descarcă în zaharificator, datorită adaosului de lapte de slad.
În cadrul instalațiilor cu funcționare continuă de prelucrare a materiilor prime amidonoase operațiile de zaharificare se pot realiza în două moduri:
– cu ajutorul unui vas,asemănător cu zaharificatorul clasic, în care se face răcirea masei fierte până la temperatura de zaharificare și adăugarea laptelui de slad, după care plămada este introdusă într-o serpentină de menținere a temperaturii de zaharificare timp de câteva minute;
– cu ajutorul unui aparat special prevăzut cu transportor melc, în care se introduce la unul din capete masa fiartă, răcită și laptele de slad, rezultând la capătul opus plămada zaharificată.
I.4.3.3. Procedee de zaharificare
În conducerea practică a operației de zaharificare trebuie să se aibă în vedere următoarele aspecte:
– să se creeze condiții optime de temperatură pentru acțiunea de fluidificare și de zaharificare produsă de amilaze;
– termorezistența celor două amilaze la temperatura de zaharificare;
– evitarea infecțiilor cu microorganisme străine;
– simplificarea pe cât posibil a operației;
În practică, zaharificarea se poate realiza la o temperatură de 55-62 grade Celsius, mai ridicată decât cea optimă, pentru a se proteja plămada de infecțiile cu microorganisme termofile, în special bacterii lactice, sau chiar la temperatura optimă de zaharificare de circa 55 grade Celsius prin folosirea formalinei ca dezinfectant [25].
Zaharificarea la temperaturi mai ridicate, peste 60 grade Celsius, implică însă pericolul inactivării unei părți din amilaze chiar în cursul operației fără a se realiza efectul de pasteurizare scontat.
Pentru evitarea infecțiilor cu microorganisme străine este necesară în primul rând o spălare și o dezinfecție foarte atentă a zaharificatorului. Astfel după fiecare golire, se face o spălare cu jet puternic de apă, iar la fiecare 24 de ore o spălare și o dezinfecție cu soluție de formol sau lapte de var. În afară de zaharificator, se mai dezinfectează și traseele cu plămadă dulce, inclusiv pompa de plămadă. Pentru dezinfecția plămezii se adaugă o astfel de cantitate de formalină, încât în plămada dulce să se ajungă la o concentrație de 0.02 %. Se poate adăuga întreaga cantitate de formalină stabilită la prepararea laptelui de slad, sau numai jumatate din acesta, urmând ca cealaltă jumătate să se introducă în plămada dulce, după ce s-a scos în prealabil plămada de drojdie.
Descărcarea fierbătorului sau fierbătoarelor în zaharificator se poate face în trei moduri:
-la temperatura de zaharificare (55-60 grade Celsius)
-la temperatura de fluidificare (75-80 grade Celsius)
-fără a se lua în considerare aceste temperaturi (95-100 grade Celsius)
În funcție de modul cum se face descărcarea fierbătorului și cum se conduce zaharificarea, deosebim:
-procedee de zaharificare în timpul descărcării fierbătorului;
-procedee de zaharificare după descărcarea fierbătorului;
Procedeul de zaharificare în timpul descărcării fierbătorului se prezintă astfel:
-se introduce mai întâi în zaharificator 1/3 din cantitatea necesară de lapte de slad, peste condensul de temperatură de maximum 55 grade Celsius;
-se începe golirea lentă a fierbătorului sub agitare, iar în momentul în care masa fiartă ajunge la serpentinele de răcire se dă drumul la apa de răcire și se intensifică descărcarea sub răcire, astfel încât temperatura să se mențină între 55 și 60 grade Celsius ;
-se adaugă încă 1/3 din laptele de slad în momentul în care zaharificatorul s-a umplut pe jumătate,continuându-se umplerea lui sub răcire;
-se adaugă ultima treime din laptele de slad după ce s-a golit fierbătorul și s-a umplut zaharificatorul și se lasă plămada în repaus timp de 10-20 minute la temperatura optimă de zaharificare de 55 grade Celsius controlându-se sfârșitul zaharificării cu soluția de Lugol;
-se răcește plămada sub agitare până la temperatura de 30 grade Celsius , la care se face însămânțarea cu drojdie și apoi se răcește în continuare până la temperatura de pornire a fermentației de 18-20 grade Celsius și se pompează în linul de fermentare.
Procedeele de zaharificare după descărcarea fierbătorului sunt cele mai răspândite datorită faptului că se evită pericolul inactivării amilazelor și se execută mai simplu,în două moduri:
a) prin descărcarea fierbătorului la temperatura de fluidificare a masei fierte ( 75-80 grade Celsius);în acest caz se procedează astfel:
-se introduce în zaharificator peste condens 1/10 din cantitatea totală de lapte de slad și se descarcă fierbătorul sub agitare și răcire, menținându-se temperatura optimă de fluidificare de 75-80 grade Celsius;
-se răcește apoi masa fluidificată la temperatura optimă de zaharizare de 55-60 grade Celsius, se adaugă restul de lapte de slad, se zaharifică timp de 10-30 minute și se răcește apoi plămada la 30 grade Celsius, temperatura de însămânțare cu drojdie.
b) prin descărcarea fierbătorului la temperatura de fierbere (95-100 grade Celsius). După acest procedeu zaharificarea are loc astfel:
-se introduce în zaharificator 5-7 % din cantitatea totală de lapte de slad, peste o cantitate de apă sau condens;
-se golește rapid fierbătorul sub agitare și răcire fără să se țină seama de temperatură;
-după descărcarea fierbătorului se răcește masa fiartă la 72-73 grade Celsius și se adaugă 1/3 din laptele de slad rămas;
-se continuă răcirea sub agitare până la temperatura de 63-64 grade Celsius ,la care se adaugă și restul de slad, temperatura scăzând după 5 minute de agitare la 60-62 grade Celsius;
-se zaharifică plămada la această temperatură sau la 55 grade Celsius timp de 30 minute, fără agitare, după care plămada dulce este răcită în continuare la 30 grade Celsius;
Acest procedeu este cel mai răspândit, permițând golirea rapidă a fierbătorului în 15 minute, față de 45-50 minute la procedeul precedent.
I.4.4. Controlul zaharificării
În timpul operației de zaharificare se controlează:
-gradul de zaharificare;
-gradul Balling și coeficientul calitativ al plămezii;
-aciditatea și pH-ul;
-puterea amilolitică a plămezii dulci.
În vederea controlului zaharificării se filtrează o porțiune din plămada dulce, examinându-se ataâ reziduul cât și filtratul limpede obținut. În reziduul spălat bine cu apa trebuie să se găsească numai coji, fără amidon aderent și să se obțină cu iodul o colorație gălbuie sau roșiatică. Filtratul trebuie să aibă o culoare galbenă deschisă și gust dulce și să nu dea nici el o colorație cu iodul, care ar indica o zaharificare incompletă [26].
În filtratul limpede se determină în primul rând conținutul în extract al plămezii (gradul zaharometric) cu ajutorul zaharometrului Balling sau prin alte metode cunoscute.
Gradele zaharometrice (grade Balling) exprimă în procente masice totalitatea substanțelor existente în plămada limpede [27]:
-maltoza,glucoza,maltotrioza,dextrine(substanțe fermentescibile);
-substante azotoase, minerale etc (substante nefermentescibile).
Întrucât gradele Balling nu ne dau indicații asupra conținutului plămezii în zaharuri fermentescibile și deci asupra randamentului în alcool este necesar să se cunoască și așa numitul coeficient calitativ al plămezii, care reprezintă procentul de zaharuri fermentescibile din extractul plămezii, având astfel aceeași semnificație cu gradul final de fermentare folosit în industria berii.
Coeficientul calitativ al plămezii (Q) se poate determina pe cale chimică sau printr-o probă de fermentare și prezintă următoarele valori:
-pentru plămezi din cartofi sau secară Q= 79-85 %
-pentru plămezi din porumb sau grâu Q= 89-90 %
-pentru plămezi din melasă Q= 60 %
Aciditatea plămezii se exprimă în practică în grade Delbrück care reprezintă mililitri NaOH 1N necesari pentru neutralizarea acizilor din 20 mililitri plămadă.În locul determinării acidității se folosește în ultimul timp pH-ul, care trebuie sa fie cuprins între 5.3-5.7.
Controlul puterii amilolitice a plămezii zaharificate este necesar pentru a se constata dacă mai există suficiente amilaze active necesare pentru zaharificarea secundară a dextrinelor limită la fermentare.
I.4.5. Pregătirea drojdiei pentru fermentare
Fermentația plămezilor dulci din materii prime amidonoase se realizează cu ajutorul drojdiilor, care datorită complexului enzimatic conținut, transformă zahărul din plămada în alcool etilic și dioxid de carbon. La fabricarea etanolului din materii prime amidonoase, principalul obiectiv este utilizarea materialului alcooligen cu randament maxim. Printre factorii de care depind randamentul în alcool și calitatea alcoolului obținut, alături de calitatea materiei prime, alegerea și respectarea parametrilor celui mai adecvat proces tehnologic, un rol deosebit îl are drojdia utilizată la fermentarea plămezilor. Ținând seama de rolul drojdiei, aceasta trebuie selecționată după criterii specifice acestui domeniu de utilizare, tulpinile selecționate fiind conservate și multiplicate în condițiile evitării contaminării cu o microflotă de infecție.
În industria etanolului se lucrează cu culturi pure de drojdii, obținute plecând de la o singură celulă de drojdie, care se multiplică în condiții sterile în două faze:
-faza de laborator;
-faza din secția de culturi pure, obținându-se în final o cantitate suficientă de plămadă (cuib) de drojdie necesară pentru însămânțarea plămezii dulci principale.
I.4.5.1. Tipuri de drojdii folosite la fabricarea spirtului
Pentru fermentația plămezilor în industria alcoolului se folosesc de regulă drojdii de fermentație superioară, specia Sacharomyces cerevisiae, cu putere alcoologenă ridicată, capabile să transforme repede și cât mai complet zahărul fermentescibil în alcool etilic, pe care să-l poată suporta în concentrații ridicate de 10-12 %. În afară de aceasta ele trebuie să se poată acomoda la plămezile acide din cartofi sau cereale, cât și la condițiile mai puțin prielnice oferite de plămezile din melasa și să fermenteze la temperaturi mai ridicate de 28-30 grade Celsius.
În timpul fermentării drojdia trebuie să formeze o cantitate redusă de spumă, pentru a se putea utiliza la maximum capacitățile de la fermentare. Celelalte însușiri ale drojdiei, ca de exemplu capacitatea de floculare și formarea produselor secundare de fermentație, prezintă o însemnătate mai redusă în comparație cu drojdia de bere.
Prin izolări și selecționări pe baza criteriilor mai sus menționate, în instituții specializate, s-au obținut diferite rase de drojdii pentru industria spirtului, dintre care se pot menționa următoarele:II, XII, M, D, λ.
Rasa II se caracterizează printr-o putere mare de fermentare, însă produce o spumare intensă, ceea ce conduce la pierduri de plămadă.
Rasa XII are de asemenea o putere mare de fermentare, însă prezintă față de prima avantajul de a produce mai puțină spumă în timpul fermentării. Aceasta rasă este folosită atât la fermentarea plămezilor din cereale, cartofi cât și din melasa.
Rasa M reprezintă un amestec de patru rase, fiecare având însușiri bune pentru utilizarea în industria spirtului.
Rasa D se caracterizează printr-o capacitate mare de fermentare, persistența și la concentrații mai ridicate ale plămezilor din porumb sau melasă, astfel încât ea este superioară rasei M.
Rasa λ este o drojdie de fermentare inferioară, capabilă să fermenteze integral rafinoza, zahăr prezent în plămezile din melasă. Din această cauză, ea este folosită în special la fermentarea melasei.
I.4.5.2. Prepararea și prefermentarea plămezii speciale de drojdie
Drojdia se cultivă într-o plămadă specială acidulată, care trebuie să conțină cantități suficiente de substanțe necesare pentru nutriția drojdiei. În acest fel, se va obține o drojdie viguroasă, cu putere de fermentare ridicată.
La prepararea și prefermentarea plămezii de drojdie deosebim două procedee principale:
– procedeul clasic;
– procedeul simplificat cu acid sulfuric.
Procedeul clasic – acest procedeu se caracterizează prin scoaterea unei porțiuni din plămadă dulce (5-10 %) și pregătirea ei în mod special pentru cultivarea drojdiei prin acidulare și adaos de substanțe nutritive. Pregătirea plămezii de drojdie cuprinde trei faze principale:
– prepararea plămezii speciale;
– acidularea plămezii speciale;
– prefermentarea.
Prepararea – porțiunea de plămadă dulce, scoasă din plămada zaharificată se filtrează și se adaugă 4-6 % malț verde sub formă de lapte de slad în cazul cartofilor și circa 10 % la prelucrarea porumbului pentru îmbogățirea ei în substanțe nutritive. Se zaharifică apoi plămada timp de 60 minute la 60-62 grade Celsius și se răcește rapid la temperatura de însămânțare cu drojdie de 28-30 grade Celsius. Plămada astfel obținut are o concentrație de 20-22 grade Balling.
Acidularea plămezii speciale se poate face cu acizi organici sau anorganici.Caracteristic pentru procedeul clasic este acidularea prin fermentație lactică a plămezii speciale timp de 20-24 ore la temperatura de 50-55 grade Celsius prin însămânțare cu Bacillus Delbrücki. Aciditatea plămezii speciale se poate face și prin adaos de acid sulfuric diluat în prealabil cu apă în raport de 1:3 până ce se ajunge la o aciditate de 1-1.3 grade Delbrücki. Acidularea plămezii speciale cu acid sulfuric este mai simplă, mai sigură și nu mai sunt necesare cele 24 ore pentru fermentația lactică.
Prefermentarea – plămada specială acidulate și răcită se însămânțează apoi cu o cultură pură de laborator, obținută prin multiplicarea drojdiei în condiții sterile pe must de malț sau chiar pe melasă.În timpul campaniei plămada specială se însămânțează cu o porțiune (1/10) dintr-o plămadă specială de drojdie anterioară, această porțiune reținută pentru însămânțarea unei noi plămezi speciale purtând denumirea de drojdie matcă.
Procedeul clasic de pregătire a drojdiei pentru fermentare se caracterizează așadar, prin prepararea unei plămezi speciale pentru drojdie, care se acidulează prin fermentație lactică sau cu acid sulfuric și se prefermentează 20-24 ore, reținându-se 1/10 din plămada de drojdie obținută sub formă de drojdie matcă pentru însămânțarea unei noi plămezi speciale acidulate. Procedeul este mai puțin folosit astăzi deorece necesită o durată mai lungă, de circa 48 ore și astfel un număr mai mare de vase de drojdie, este mai complicat iar siguranța în ceea ce privește obținerea gradului de aciditate dorit este mai redusă.
Procedeul simplificat cu acid sulfuric – în urma cercetărilor efectuate în ultimii 20-30 ani s-a constatat că nu este necesar să se prepare o plămadă specială și nici să se lucreze cu drojdie matcă, introducându-se întreaga cantitate de plămadă de drojdie prefermentată în plămada dulce principală la temperatura de 30 grade Celsius, din care după răcire la temperatura de începere a fermentației de 18-20 grade Celsius să se scoată aceeași cantitate (5-10 %) care să se aciduleze cu acid sulfuric și să prefermenteze în vederea obținerii unei noi plămezi de drojdie.
Acest procedeu, cunoscut sub denumirea de procedeul simplificat cu acid sulfuric, s-a impus atât în fabricile de bioetanol din cartofi cât și din cereale, fără a se constata o carență a plămezii de drojdie în substanțe nutritive, decât ocazional la prelucrarea porumbului.
În comparație cu procedeul clasic acest procedeu prezintă mai multe avantaje:
– este mult mai simplu și nu necesită decât un singur vas de drojdie în locul a trei vase la procedeul clasic;
– acidularea se face mult mai simplu, atingându-se gradul de aciditate dorit;
– nu sunt necesare în general adaosuri de substanțe nutritive.
I.4.5.3. Instalații pentru prepararea plămezii de drojdie
Pregătirea drojdiilor pentru fermentare se realizează în instalații speciale amplasate într-o secție de culturi pure. Instalația de obținere a culturii pure de drojdie este formată din unul sau două vase de preparare a plămezii speciale pentru drojdie și două sau mai multe vase de drojdie. Cu ajutorul pompei este preluată din zaharificator cantitatea stabilită de plămadă dulce și pompată în vase. Mediul de cultură obținut este trecut prin conductă în vasele de drojdie în care se prepară alternativ plămada de drojdie. Plămada de drojdie prefermentată este trecută la însămânțare din nou în zaharificator printr-o conductă.
I.5. Fermentarea plămezii principale
Împreună cu prepararea drojdiilor, fermentarea plămezilor reprezintă una din cele mai importante operații din procesul tehnologic, o oglindă a mersului fabricației într-o fabrică de bioetanol. Astfel o fermentație defectuoasă ne poate da indicații atât asupra unor greșeli executate în operațiile anterioare (fierbere incompletă, zaharificare insuficientă, slad de calitate slabă, drojdie de însămânțare slăbită, dezinfecție și sterilizare insuficientă etc) cât și asupra unor greșeli efectuate chiar la fermentare.
În scopul realizării unei fermentații corespunzătoare în fabricile de spirt din cartofi sau cereale se cer următoarele:
– fermentație pe cât posibil pură,ferită de infecții;
– fermentația să fie condusă la concentrații și temperaturi optime ale plămezii;
– să se atingă la sfârșitul fermentației un grad de fermentare cât mai ridicat.
I.5.1. Conducerea fermentației și fazele ei
În funcție de transformările care au loc la fermentația plămezilor din materii prime amidonoase, deosebim trei faze distincte [27]:
durata
-faza inițială circa 22 ore
-faza principală circa 18 ore
-faza finală (secundară) circa 32 ore
Durata totală: 72 ore
Deși aceste faze nu se pot delimita cu precizie, ci se întrepătrund, ele se deosebesc prin procesele care predomină în fiecare din faze.
Faza inițială care durează 20-22 ore, se caracterizează în special prin multiplicarea drojdiei și prin fermentarea a circa 40 % din maltoză. Astfel 5 % din zahăr este consumat pentru necesitățile energetice proprii ale celulei de drojdie prin procesul de respirație.
Cantitatea de oxigen înglobată în plămada dulce în zaharificator prin agitare este suficientă pentru asigurarea procesului de respirație. O aerare intensă ar conduce la o creștere a numărului de celule de drojdie peste cel necesar fermentației, consumându-se inutil zahăr, ceea ce duce la scăderea randamentului în alcool.
Fermentația se pornește la o temperatură mult mai scăzută decât cea optimă, pentru a proteja plămada care nu conține încă alcool față de infecțiile cu bacterii. Datorită căldurii degajate din procesul de fermentație, temperatura plămezii crește apoi treptat în faza inițială până la cea optimă de 28-30 grade Celsius.
Faza principală care durează 18-20 ore,se caracterizează prin fermentația intensă a maltozei, cu formare de alcool,dioxid de carbon și căldură. Datorită creșterii concentrației alcoolice a plămezii peste 5%,încetează practic în această fază multiplicarea drojdiei.
Căldura rezultată din procesul de fermentație conduce la creșterea temperaturii plămezii, care este cu atât mai rapidă cu cât plămezile sunt mai concentrate și cu cât linurile de fermentare sunt mai mari.În momentul când temperatura plămezii a ajuns la 28-30 grade Celsius se începe răcirea pentru a se evita creșterea temperaturii plămezii peste 32 grade Celsius, care ar afecta capacitatea fermentativă a drojdiei.
Răcirea plămezii trebuie să se facă cu atenție, pentru a se prelua numai căldura formată prin fermentație, fără a se modifica temperatura plămezii, deoarece drojdia este sensibilă la șocurile de temperatură.
Faza principală de fermentație durează atâta timp cât în plămadă se găsesc cantități mai mari de maltoză și se exteriorizează prin formarea unei cantități mai mari sau mai reduse de spumă, datorită dioxidului de carbon care se degajă. Spuma este tulbure, datorită celulelor de drojdie aflate în suspensie și formează valuri care se rostogolesc la suprafața plămezii. Acest aspect al fermentației mai poartă denumirea de fermentație ondulată și denotă un mers normal al fermentației.
Faza finală a fermentației începe după ce s-a terminat maltoza din plămadă și se caracterizează îndeosebi prin zaharificarea secundară a dextrinelor limită sub acțiunea amilazelor rămase în plămadă și fermentarea maltozei rezultate. Întrucât procesul de zaharificare secundară a dextrinelor decurge mai lent, faza finală de fermentare are durata cea mai lungă, de 30-32 ore.
În această fază, temperatura plămezii trebuie să fie de circa 27 grade Celsius. La temperaturi prea ridicate se epuizează maltoza din mediu, înainte de a se forma noi cantități de maltoză prin zaharificarea secundară, astfel încât se poate întrerupe activitatea fermentativă a drojdiei și rămân dextrine limită nefermentate. Fermentația se consideră terminată când extractul aparent al plămezii,determinat cu ajutorul zaharometrului Balling nu se mai modifică în ultimele 4 ore de la fermentare. La sfârșitul fermentării, plămada se poate trimite direct la distilare sau printr-un rezervor tampon, iar linul de fermentare se spală și se dezinfectează, acordându-se o atenție deosebită evacuării dioxidului de carbon.
Prin folosirea în fabricile de spirt din țara noastră a linurilor de fermentare de mare capacitate,care se încarcă cu 3-6 zaharificatoare, lucrându-se prin împrospătare, procentul de plămada drojdie se poate reduce până la 3-4 % în raport cu volumul total al plămezii supuse fermentării.
I.5.2. Fermentarea anormală a plămezilor
În funcție de felul și calitatea materiilor prime amidonoase cât și de modul de conducere a operațiilor de fierbere și zaharificare, la fermentarea plămezilor din cereale și cartofi pot apare aspecte anormale, nedorite, care conduc în final la scăderea randamentului în alcool [28]. Dintre acestea se pot menționa următoarele:
– fermentația cu ridicarea și coborârea plămezii;
– fermentația cu formare intensă de spumă;
– fermentația cu formare de strat superficial.
Fermentația cu ridicarea și coborârea plămezii apare mai des la plămezile mai vâscoase de secară și ovăz cu un conținut mai ridicat de coji și se caracterizează prin ridicarea suprafeței plămezii în timpul fermentației cu 10-15 % peste nivelul normal, datorită acumulării de dioxid de carbon, după care nivelul scade din nou prin degajarea acestuia. Acest fenomen duce atât la o utilizare mai redusă a capacității linurilor de fermentare cât și la înrăutățirea activității fermentative a drojdiei, care nu se mai poate distribui uniform în substrat. Pentru evitarea acestui neajuns se recomandă amestecuri cu cereale care dau plămezi mai fluide, de exemplu porumb, mei sau cartofi.
Fermentația cu formare intensă de spumă se caracterizează prin formarea unei cantități mari de spumă, deja din faza initială a fermentației când temperatura a ajuns la 22-23 grade Celsius, care nu se distruge ci se stratifică ajungând în grosimi de 1- și în final deversează din linul de fermentare, ceea ce conduce la pierderi de plămadă.
Dintre măsurile care se pot lua pentru evitarea formării de spumă intensă în timpul fermentației se pot menționa:
– fierberea mai îndelungată a cartofilor care prezintă asemenea tendințe;
– zaharificarea la temperaturi mai ridicate în scopul obtîa la temperaturi mai ridicate inerii unor plămezi mai fluide;
– prelucrarea mai multor varietăți de cartofi în amestec sau chiar fermentarea plămezilor din cartofi în amestec cu porumb ;
– folosirea la zaharificare a unui amestec de slad din orz și ovăz (mai bogat în grăsimi);
– folosirea unei drojdii cu tendință redusă de spumare;
– adăugarea de antispumanți la fermentare (acizi grași sau grăsimi lichide).
Fermentarea cu formare de strat superficial se caracterizează prin apariția unui strat compact de coji la suprafața plămezii, chiar în faza inițială a fermentației, al cărui grosime poate să atingă 1- și care rămâne până la sfârșitul fermentației, neputând fi străpuns dioxidul de carbon format. Acest defect apare în special la prelucrarea boabelor cu coajă groasă (ovăz, orz, mei etc ) care se fierb sub formă de boabe întregi în fierbătorul Henze.
Deși cauzele formării stratului superficial nu sunt prea clare, se apreciază că acest fenomen nedorit apare mai de în cazul fierberii prea rapide a materiei prime, la concentrații mai scăzute ale plămezii în extract cât și la folosirea drojdiei comprimate pentru însămânțarea plămezii.
I.5.3. Controlul fermentației
În scopul desfășurării normale a procesului de fermentație se controlează:
– temperatura plămezii în diferite faze ale fermentației;
– concentrația în extract a plămezii;
– aciditatea plămezii;
-puritatea microbiologică a fermentației.
Temperatura plămezii. Alegerea corectă a temperaturii de pornire a fermentației cât și menținerea temperaturilor optime în timpul fazei principale și finale a fermentației, printr-o răcire corespunzătoare, reprezintă una din sarcinile de cea mai mare importanță pentru conducerea practică a fermentației.
Concentrația în extract a plămezii scade treptat în timpul fermentației ca urmare a consumului de zahăr și a acumulării alcoolului.
Aciditatea plămezii dulci crește în cazul unei fermentației normale cu 0.1-0.2 grade Delbrücki, iar în cazul unei fermentații mediocre cu 0.3 grade Delbrücki.
În locul acidității se folosește tot mai mult ph-ul, care scade cel mai rapid în faza inițială de fermentație, ajungând în plămezile fermentate din cartofi la valori de 4.5-4.8, iar la cele din porumb la 4.2-4.3.
I.5.4. Linuri de fermentare
Fermentarea plămezilor din cereale sau cartofi are loc în vase speciale, denumite linuri de fermentare, care sunt amplasate într-o încăpere specială aflată la parter în apropierea sălii zaharificatoarelor și a instalației de distilare, astfel încât traseele de conducte să fie cât mai scurte.
În industria spirtului se folosesc astăzi în exclusivitate linuri metalice închise, prevăzute cu serpentine de răcire și conducte de captare a dioxidului de carbon. În comparație cu linurile deschise din lemn sau beton folosite în trecut, acestea au următoarele avantaje:
– se curăță și se dezinfectează mai ușor;
– se reduc pierderile în alcool prin evaporare;
– se evită pericolul de infecție.
Ca materiale pentru construcția linurilor de fermentare se folosesc: tabla obișnuită de oțel, tabla de oțel inoxidabil, tabla de aluminiu și rășinile sintetice. Linurile de fermentare pot avea formă cilindrică sau paralelipipedică. Din forma de casetă cu muchiile rotunjite a luat naștere forma de vană cu fundul semisferic.
Spălarea linurilor se execută mai întâi cu peria pentru îndepărtarea resturilor de plămadă, după care se spală cu apă, se tratează cu soluție de dezinfectant și apoi se face o sterilizare prin aburire de circa 30 minute. După aburire se lasă să intre aer pentru a se evita deformarea linului datorită vidului produs.
I.5.5. Spălarea dioxidului de carbon
Chiar și prin folosirea linurilor închise de fermentare se pierde alcool deoarece dioxidul de carbon degajat din plămadă este aproape saturat cu alcool. Pierderile în alcool sunt cu atât mai mari cu cât plămada este mai agitată,mai bogată în alcool, mai caldă și cu cât suprafața ei este mai mare în raport cu volumul.
Pierderile în alcool prin antrenare cu dioxidul de carbon sunt in medie de 0.7 % putând să ajungă chiar până la 1.4 % din alcoolul produs în lin. Pentru recuperarea alcoolului antrenat se folosesc spălătoare speciale de dioxid de carbon, cu talere sau umplutură, care funcționează pe principiul coloanelor de distilare.
I.5.6. Fabricarea spirtului din materii prime amidonoase în amestec cu melasa
La prelucrarea cartofilor și porumbului se adaugă în unele țări, după zaharificare, circa 20 % melasă, ținând seama că melasă sunt echivalente cu 250- cartofi sau cu 80- porumb.
Prin amestecarea plămezilor din materii prime amidonoase cu melasa este posibil să se lucreze cu concentrații mai ridicate ale plămezii la fermentare, sporindu-se astfel productivitatea la fermentare.
Procesul tehnologic de obținere a plămezii fermentate este asemănător cu cel de la fermentarea spirtului din cartofi sau cereale [28].
Se face mai întâi fierberea și zaharificarea materiei prime amidonoase, obținându-se o plămadă dulce, din care se scoate plămada specială pentru drojdie, înainte de a introduce melasa în zaharificator. Nu se recomandă să se introducă melasă în zaharificator înaintea masei fierte, deoarece melasa ar impiedica, prin alcalinitatea și conținutul ei mare în săruri minerale, zaharificarea porțiunilor de plămadă care se descarcă în zaharificator. Înainte de adăugarea ei în plămadă, melasa este cântărită, diluată cu apă, de regulă în raport de 1:1 cu apă fierbinte și apoi pasteurizată prin barbotare de abur timp de 30 minute la temperatură de 80-85 grade Celsius.
Plămada de melasă astfel obținută se poate adăuga fierbinte sau răcită plămezii dulci în zaharificator, având grijă ca temperatura plămezii în zaharificator să nu depășească 60 grade Celsius.
Cantitatea de malț verde necesar pentru zaharificare se calculează în mod obișnuit în raport cu cantitatea de amidon din materia primă fără să se țină seama de melasa adăugată, iar prepararea plămezii de drojdie se face în mod uzual numai în plămada din cartofi sau cereale.
Fermentația plămezii obținute decurge în mod asemănător, cu deosebirea că extractul aparent al plămezii fermentate este ceva mai mare (0.5-1 grade Balling) datorită fermentescibilității mai reduse a melasei comparativ cu a cartofilor sau cerealelor.
I.6. Tehnologia fabricării spirtului din melasă
Obținerea plămezilor fermentate din melasa de sfeclă sau trestie de zahăr cuprinde trei etape principale:
– pregătirea melasei în vederea fermentației;
– pregătirea drojdiei pentru fermentare;
– fermentarea plămezilor din melasă.
I.6.1.Pregătirea melasei în vederea fermentației
Cuprinde următoarele operații necesare pentru transformarea melasei într-un mediu fermentescibil de către drojdie:
– diluarea cu apă;
– neutralizarea și acidularea;
– adăugarea sărurilor nutritive;
– limpezirea melasei.
I.6.1.1. Diluarea melasei
Deoarece melasa are o concentrație ridicată în substanță uscată, de 75-80 grade Balling, la care drojdiile nu pot acționa, este necesară diluarea cu apă până la concentrațiile optime pentru pregătirea drojdiei și fermentarea.
De obicei în fabricile de spirt din melasă se lucrează cu două plămezi:
– plămada pentru prefermentare de 12-16 grade Balling;
– plămada pentru fermentare de 28-32 grade Balling.
În practică melasa pentru prefermentare și pentru fermentare se diluează mai întâi la aproximativ 60 grade Balling în vase prevăzute cu un record pentru apa de diluare și cu un barbotor prin care se poate introduce aer comprimat pentru omogenizare sau abur pentru pasteurizare.
Diluarea se mai poate face și cu ajutorul unor eprubete de diluare montate pe conductele de melasă, formate dintr-o țeavă cu diafragmă în care intră pe la un capăt melasa și lateral apa, eventual și sărurile nutritive. Prin reglarea debitului de alimentare cu melasă și apă se poate realiza concentrația dorită a melasei diluate, iar pentru dispunerea excentrică a orificiilor diafragmelor se asigură o omogenizare bună cu apa.
I.6.1.2. Neutralizarea și acidularea melasei
Datorită reacției ușor alcaline a celor mai multe melase este necesară neutralizarea și acidularea lor în continuare până la pH-ul optim de fermentație de 4.5-5 uneori chiar și la un pH mai scăzut. Această operație se execută în practică prin adăugare de acid sulfuric, care are și rol antiseptic și favorizează procesul de limpezire a melasei.
Cantitatea de acid sulfuric necesară pentru neutralizarea melasei se stabilește pe baza alcalinității melasei determinate în laborator, adăugându-se pentru fiecare grad de alcalinitate circa 140 mililitri acid sulfuric la melasă. Pentru acidularea plămezii neutre sunt necesari aproximativ 15 mililitri acid sulfuric concentrat la plămadă de melasă. Consumul total de acid sulfuric pentru neutralizare și acidulare este de 2- /tona de melasă.
I.6.1.3. Adăugarea sărurilor nutritive
Pentru compensarea de azot asimilabil al melasei se pot folosi: sulfat de amoniu,îngrășământ complex, amoniac sau uree, care se adaugă în proporție de 0.1 % azot față de melasă.
Necesarul de fosfor se poate asigura prin adaos de superfosfat sau îngrășământ complex în doză de 0.2 % P2O5 față de melasă.
În unele cazuri se adaugă și magneziu sub forma de sulfat de magneziu în proporție de 0.2-0.8 % MgSO4 față de melasă.
Sărurile nutritive se adaugă sub agitare ca soluție limpede obținută prin dizolvare sau sedimentare, numai în melasă pentru prefermentare,calculându-se însă față de întreaga cantitate de melasă.
Uneori se mai adaugă la cultivarea drojdiei autolizat de drojdie cam 0.5 % față de melasă, extract de malț sau de radicele de malț.
I.6.1.4. Limpezirea și sterilizarea melasei
Melasa acidulată și îmbogățită în substanțe nutritive este supusă în continuare operației de limpezire, prin depunerea coloizilor care au fost aduși la punctul izoelectric și precipitate prin adăugarea acidului sulfuric. Astfel, ionii de hidrogen ai acidului sulfuric neutralizează sarcinile coloizilor favorizând procesul de limpezire.
Limpezirea cu acizi a melasei se poate realiza prin două procedee :
– procedeul la rece;
– procedeul la cald.
Procedeul de limpezire la rece se folosește pentru melasele cu compoziție normală și decurge astfel:
melasa acidulată și corectată cu săruri nutritive, diluată la 12-16 grade Bllg, este lăsată să se limpezească prin sedimentarea suspensiilor și coloizilor precipitate timp de 12-20 ore la rece, decantându-se melasa limpede deasupra, care este trecută la prefermentare.
Limpezirea la cald a melasei este cea mai răspândită metodă de limpezire, întrucât se realizează concomitent și un efect de pasteurizare a melasei cât și îndepărtarea unor substanțe dăunătoare drojdiei (SO2,NO2,etc.).
Limpezirea melasei pentru pregătirea drojdiei și prefermentare este absolut necesară, deoarece suspensiile fine se depun pe membranele celulei de drojdie împiedicând pătrunderea zahărului și a celorlalte substanțe nutritive în celulă ,unde are loc fermentația.
I.6.2. Pregătirea drojdiilor pentru fermentarea plămezilor din melasă
Chiar și după operațiile de corectarade Celsius.
În linul de fermentare se aduce mai întâi plămada de drojdie dintr-un prefermentator peste care se adaugă în mod treptat melasa diluată. În funcție de modul de alimentare cu melasă se deosebesc două procedee de fermentare dicontinuă:
– procedeul cu alimentare periodică;
– procedeul cu alimentare continuă.
I.6.3.2 Procedee continue de fermentare
Fermentarea continu este strâns legată de combaterea infecțiilor, care se poate face prin adăugarea de antiseptice în doze care să fie inhibitoare pentru microorganismele de infecție, dar suportate de drojdii.
Dintre antisepticii experimentați, cele mai bune rezultate s-au obținut prin folosirea pentaclorfenolatului de sodiu în cantități 60-90 g/tona de melasă. Antisepticul se adaugă sub formă de soluție alcoolică cu concentrația în substanța activă de 12-17 %, de regulă în melasă diluată la 60 grade Balling. Prin folosirea lui este posibil să se realizeze fermentația continuă a melasei fără sterilizare termică, cu condiția ca drojdia să fie aclimatizată în prealabil cu antisepticul.
Procedeele de fermentație continuă a melasei se pot împărți în două grupe:
– procedee fără reutilizarea drojdiei;
– procedee cu separarea și reutilizarea drojdiei.
Procedee fără reutilizareiei
Dintre procedeele de fermentare continuă a melasei fără reutilizarea drojdiei se cunosc următoarele:
– procedeul cu două plămezi și două concentrații diferite și anume:
-la prefermentare 12-16 grade Balling;
-la fermentare 30-34 grade Balling.
– procedeul cu o plămadă și o concentrație de 23 grade Balling;
– procedeul cu două plămezi și o singură concentrație de 23 grade Balling.
Primul procedeu se caracterizează prin folosirea unei plămezi pentru fermentare cu o concentrație mai scăzută de 12-16 grade Balling și a unei plămezi concentrate de melasă pentru fermentare de 30-34 grade Balling. Antisepticul se adaugă în aceeași doză în ambele plămezi în timp ce acidul sulfuric și sărurile nutritive se adaugă numai în plămada pentru prefermentare.
Acest procedeu are avantajul că la prefermentare se poate folosi separat o melasă de mai bună calitate și se asigură condiții bune pentru multiplicarea drojdiei, deoarece sărurile nutritive se adaugă în plămada pentru prefermentare. În practică nu este răspândit deoarece lucrându-se la prefermentare cu concentrații mai scăzute se acumulează o cantitate prea mare de drojdie, consumându-se astfel din zahărul destinat formării alcoolului.
Cel de-al doilea procedeu folosește o singură concentrație de melasă de 23 grade Balling, atât pentru prefermentare cât și pentru fermentare.Folosindu-se o singură plămadă se simplifică mult operațiile tehnologice, astfel încât se poate face o automatizare complexă a instalației de fermentare.
Ultimul procedeu se bazează pe folosirea a două plămezi, una pentru prefermentare și alta pentru fermentare, care au aceeași concentrație de 23 grade Balling. Melasa se pregătește separat, adăugându-se acidul sulfuric și sărurile nutritive numai în melasa pentru prefermentare, în timp ce antisepticul se dozează în mod egal în cele două plămezi. Dintre cele trei procedee acesta prezintă cele mai multe avantaje și anume:
-drojdia se înmulțește la prefermentare în condiții optime de concentrație, săruri nutritive și aciditate și numai în cantitățile necesare unei bune fermentații;
-datorită concentrației mai ridicate în alcool la prefermentare posibilitatea infectării cu drojdii sălbatice este practic eliminată, menținându-se timp îndelungat sterilitatea mediului;
-se pot prelucra melase defecte, care se introduc numai la fermentare.
Procedee cu separarea și reutilizarea drojdiei
Din cercetările efectuate s-a constatat că în plămezi drojdia se înmulțește până la o concentrație maximă de circa 750 milioane de celule la un mililitru, după care multiplicarea încetează. Dacă se introduce de la început în plămadă acest număr de celule la un mililitru se economisește zahărul necesar multiplicării drojdiei, rezultând o creștere a randame, plămezile din melasă nu reprezintă un substrat ideal pentru cultivarea drojdiei. Din acest motiv, pentru a se asigura o fermentație corespunzătoare a melasei ,se impun următoarele condiții:
– să se utilizeze o drojdie de fermentație inferioară capabilă să fermenteze integral rafinoza;
– drojdia folosită să fie aclimatizată la melasă ,suportând concentrația mai mare de săruri;
– să se folosească o drojdie viguroasă ,cu mare capacitate de fermentare ,care să reziste eventualelor microorganisme de infecție;
– să se utilizeze o cantitate mare de drojdie de însămânțare de 35-40 % față de plămada principală, peste care să se adauge treptat plămadă de melasă, astfel încât drojdia să se poată acomoda cu cantitatea mare de săruri din melasă.
Prin selecționare s-a ajuns la rase și sușe speciale de drojdie care se pretează cel mai bine la fermentația plămezilor din melasă.
Pregătirea drojdiilor se realizează în trei etape principale :
– multiplicarea drojdiilor în laborator;
– multiplicarea drojdiilor în secția de culturi pure;
– prefermentarea melasei.
Multiplicarea drojdiilor în laborator – plecând de la o cultură pură de drojdie (de bază) se realizează în laborator multiplicarea treptată a drojdiei, obținând-se în final circa 5 litri de cultură de drojdie, care va servi pentru însămânțare în primul vas din secția de culturi pure. Multiplicarea trebuie să se facă în condiții absolut pure, deoarece prin apariția infecțiilor scade randamentul în alcool,iar la fabricarea drojdiei de panificație se pot compromite chiar șarjele de produs.
Multiplicarea drojdiilor în secția de culturi pure – în scopul acumulării cantității de drojdie necesară pentru prefermentarea și fermentarea melasei, cultura pură de laborator se multiplică în secția de culturi pure a fabricii în vase speciale de drojdie, denumite și autoclave.
În fabricile de bioetanol din melasă, multiplicarea drojdiei se realizează în două faze:
– faza a-I-a în vase de drojdie mici,cu capacitatea de 100 litri și se realizează în plămadă de melasă de 14-15 grade Balling, acidulată la pH 4.4-4.6, corectată cu săruri nutritive, sterilizată prin barbotare de abur timp de 25-30 minute la temperatura de 90-95 grade Celsius și răcită la temperatura de 30 grade Celsius. La această temperatură se face însămânțarea cu cultură pură de laborator și se fermentează circa 12 ore la 30-32 grade Celsius sub aerare moderată;
-faza a-II-a în vase de drojdie mari,cu capacitatea de 1000 litri și are loc în plămada de melasă de 15-16 grade Balling, corectată cu săruri nutritive,sterilizată și răcită în același mod. La 30 grade Celsius se face însămânțarea cu drojdie din faza a-I-a și se fermentează timp de 7-8 ore în aceleași condiții de temperatură și aerare.
Prefermentarea plămezilor din melasă. Pentru obținerea cantitătți mari de drojdie de însămânțare a plămezii principale de melasă, este necesar să se multiplice în continuare cuibul obținut în vasele mari de drojdie, până ce se ajunge la o cantitate de plămadă de drojdie reprezentând 35-50 % din plămada principală. Deoarece în această ultimă etapă de multiplicare a drojdiei o cantitate importantă de zahăr se transformă în alcool etilic, ea poartă denumirea de prefermentare.
I.6.3. Fermentarea plămezilor din melasă
Pentru fermentarea melasei se folosesc atât procedee discontinue cât și continue. Spre deosebire de fermentarea plămezilor din materii prime amidonoase, care se realizează în cele mai multe cazuri discontinuu, se folosesc astăzi pe scară largă și diferite procedee continue, care se bazează pe folosirea antisepticilor la fermentare.
I.6.3.1. Procedee discontinue de fermentare
Fermentarea discontinuă a plămezilor din melasă se realizează în linuri de fermentare asemănătoare cu cele întrebuințate la prelucrarea materiilor prime amidonoase, răcite de obicei prin stropire exterioară.
Melasa pentru fermentare suferă numai o diluare la 28-32 grade Balling, fără să fie acidulată, corectată cu săruri nutritive și sterilizată termic. Temperatura plămezii de melasă pentru fermentare trebuie să fie cuprinsă între 20 și 24 grentului în alcool până la 64- alcool absoluți/ zaharoză din melasă.
Separarea drojdiei se face în ultimul lin de fermentare cu ajutorul unor separatoare centrifugale care concentrează drojdia într-un volum reprezentând 7-10 % din plămada fermentată. Prin separare se realizează și o purificare de bacterii, care au densitatea mai mică și trec în plămada separată. Laptele de drojdie obținut este tratat apoi cu acid sulfuric pentru purificare timp de 1-2 ore la pH 2.2-2.4 după care este introdus din nou la prefermentare.
I.6.3.3. Controlul fermentației plămezilor din melasă
În timpul fermentației se controlează temperatura,concentrația plămezii, aciditatea, concentrația alcoolică și zahărul rezidual. Particularitatea plămezilor din melasă pretinde o conducere a fermentației la temperaturi mai ridicate decât în cazul plămezilor din cereale sau cartofi.
Caracteristic fermentației plămezilor din melasă este aerarea, în special la prepararea drojdiei și la prefermentare, ceea ce nu era cazul la plămezile din cereale și cartofi, care înglobau suficient oxigen în timpul răcirii sub agitare în zaharificator.
Datorită conținutului mare în nezahăr al melasei, extractul aparent al plămezilor fermentate este mult mai mare decât la plămezile din cartofi sau cereale. Astfel pentru plămezile cu concentrația inițială de 20-22 grade Balling, extractul aparent al plămezii fermentate este de 6-7 grade Balling, iar pentru plămezi mai concentrate poate ajunge la 8-9 grade Balling.
În plămada fermentată se mai determină concentrația alcoolică prin distilare, care depinde în special de concentrația plămezilor, cât și conținutul plămezii fermentate în zahăr rezidual pentru a se vedea dacă plămada este fermentată corespunzător.
CAPITOLUL II.
BIOCHIMIA FERMENTAȚIEI
În înțelesul larg al cuvântului, sub numele de fermentații se înțeleg transformările suferite de substanța organică în prezența agenților specifici, numiți enzime. Aceste transformări, însoțite de degajări de dioxid de carbon și căldură, constă în desfacerea unei molecule complexe în alți compuși cu o greutate moleculară mai mică.
II.1. Primele teorii ale fermentației alcoolice.
Procesul intim al fermentației alcoolice precum și cauzele interne care determină procesul în sine a rămas multă vreme necunoscut încât se credea așa după cum arătau unele legende că acest fenomen se datorează unui mit.
Un salt în cunoașterea cauzelor care stau la baza acestui proces a fost făcut o dată cu descoperirea microscopului, când au putut fi cunoscute drojdiile, nevăzute până atunci cu ochiul liber.
În anul 1680, A. Loewenhoeck face o comunicare prin care arată că în spuma formată cu ocazia fermentării, el a observat, cu ajutorul microscopului său primitiv, o îngrămădire de corpuri mici, de formă rotundă și alungită. Aceasta a fost prima cunoștință cu drojdiile, cu toate că A. Loewenhoeck n-a știut că organismele descoperite de el stau la baza fermentației alcoolice [15].
Stahl, în 1697, a căutat să explice fenomenul fermentației prin mișcarea violentă a particulelor fermentescibile, cu care ocazie se slăbește legătura între ele și în felul acesta iau naștere noi compuși. Unii dintre ei se volatilizează (CO2), pe când alții rămân în masa lichidului în fermentație ( alcoolul).
După această teorie mecano-chimică, în procesul fermentației iau parte corpi în stare de descompunere – fermenți, care transmit această stare și zaharurilor, ce se desfac în alcool și dioxid de carbon.
Rolul drojdiilor în procesul fermentației n-a fost însă luat în seamă și procesul în sine era privit ca unul de natură pur chimică.
II.2. Teorii ulterioare ale fermentației alcoolice
Lavoisier stabilește compoziția compușilor organici (C, H, O) punând în evidență esența procesului fermentației alcoolice la baza căreia stă fenomenul de oxido-reducere, care a fost elucidat mai târziu [16].
În anul 1815, Gaz Lussac încearcă să precizeze prima formulă a fermentației alcoolice pusă în evidență de Lavoisier pe care au stabilit-o definitiv și precis în anul 1892 Dumas și Boulay.
Reacția fermentației alcoolice a fost redată astfel sub forma unei scheme succinte care a rămas neschimbată până în zilele noastre.
Pornind de la invertirea zaharozei, formula a fost redată astfel:
C12H22O11 + H2O = C6H12O6 + C6H12O6
Zaharoză apă glucoză fructoză
Pornind însă de la glucoză prin reacția care are loc se ajunge la următoarea formulă simplă:
C6H12O6 = 2 C2H5OH + 2 CO2
Glucoză alcool etilic dioxid
de carbon
Ceva mai târziu și anume în anul 1857 Louis Pasteur susține concepția fermentației biologice și prin valoroase lucrări a dovedit netemeinicia teoriilor lui Liebig. Pasteur, în lucrările sale, a mai dovedit că pe lângă alcool și dioxid de carbon se mai formează în urma fermentației alcoolice, glicerol, acid succinic, aldehidă acetică și alcooli superiori iar drojdiile se înmulțesc și se dezvoltă folosind oxigenul din mediul în care se găsesc. În acest fel dovedește că fermentația alcoolică este un fenomen biologic pe care-l definește „ viața drojdiilor în lipsa oxigenului ”.
În anul 1897 frații H. și Eduard Büchner au dovedit existența complexului enzimatic, zimaza și posibilitatea declanșării unei fermentații în absența organismelor celulare.
Prin triturarea celulelor de drojdii cu mijloace mecanice au reușit să obțină enzimele specifice fermentației alcoolice. În acest scop au frecat drojdiile cu nisip de cuarț și le-au supus la o presiune. Sucul obținut l-au adăugat într-un must sterilizat în prealabil, unde s-a declanșat fermentația alcoolică fără a fi prezente celule vii.
Prin aceasta, frații Büchner au dovedit că nu viața în sine a drojdiilor determină fermentația alcoolică a sucului zaharat (teoria vitalistă a lui Pasteur), ci substanța produsă de drojdii, de natură chimică foarte complexă, care prin simpla ei prezență produce desfacerea glucidelor în alcool, dioxid de carbon și alte produse secundare.
În felul acesta a luat naștere teoria enzimatică a fermentației, care a pus de acord cele două curente, unul susținut de Liebig și adepții săi, care socoteau fermentația alcoolică ca un proces de natură pur chimică, și altul, susținut de L. Pasteur cu școala lui, după care fermentația era privită ca un proces de natură pur vitală.
Totuși, întrucât numai drojdiile vii, capabile de a se înmulți, sunt în stare să producă astfel de substanțe care nu intervin în procesul fermentației decât prin puterea lor catalitică, rezultă că tot drojdiile în plină activitate sunt cauza primordială a fermentației alcoolice, prin enzimele ce le produc.
II.3. Enzimele
Sunt substanțe de natură proteică complexă, sunt cunoscute și sub denumirea de catalizatori biochimici [26, 27].
Fiecare enzimă este formată dintr-un suport proteic, numit apoenzimă și o parte activă, numită coenzimă sau complement anorganic, care se poate separa prin dializă. Apoenzima și coenzima formează împreună așa-numitul complex enzimatic; prima determină specificitatea reacției și a doua, efectuarea ei. Fiind separate, apoenzima și coenzima rămân inactive; ele acționează enzimatic numai în complex.
Reacțiile pe care le produc enzimele sunt exotermice, adică însoțite de degajări de căldură, care este folosită de drojdii la întreținerea funcțiilor lor vitale.
În cele mai multe cazuri, fiecare enzimă acționează numai asupra unui număr foarte restrâns de substanțe, înrudite structural, iar în unele cazuri chiar numai asupra unui singur substrat. Specificitatea enzimelor este însușirea lor caracteristică care diferențiază enzimele de catalizatorii neenzimatici.
Enzimele sunt sensibile la acțiunea temperaturii. La 0oC enzimele sunt aproape inactive. Odată cu creșterea temperaturii, activitatea lor crește însă și devine maximă la 30 – 50 oC. Această temperatură este cunoscută sub numele de temperatură optimă, peste a cărei limită activitatea enzimelor descrește. La temperatura de peste 80 oC cele mai multe enzime sunt distruse. Această temperatură este cunoscută sub numele de temperatură critică de inactivare. La acțiunea căldurii este sensibilă numai apoenzima, pe când coenzima este termostabilă.
Dintre numeroasele enzime produse de drojdii, amintim numai pe acelea care interesează în mod direct procesul de fermentație alcoolică și anume hidrolazele și oxidazele.
Enzimele fermentative
Unele din ele catalizează reacțiile de bază, care duc la desfacerea glucidelor în compuși mai simpli, pe când altele ajută numai diferitele etape ale procesului fermentativ. Acestea din urmă se numesc enzime auxiliare. Ca enzime fermentative mai importante se citează: aldoza, carboxilaza, sau mutaza.
2) Enzimele de respirație
Această categorie de enzime este reprezentată prin dehidrogenaze și oxidaze. Dehidrogenazele realizează transportul hidrogenului de la o moleculă organică la alta, iar oxidazele realizează activarea oxigenului molecular sau transportul lui de la o moleculă la altă moleculă.
Enzimele sunt implicate în metabolismul energetic al celulei de drojdie, prin care se obține energia necesară diferitelor activități biologice. Punctul de plecare al proceselor producătoare de energie este reprezentat de glucoză, al cărui metabolism are loc, de regulă, pe calea unor reacții catalizate de enzime corespunzătoare procesului de glicoliză (calea Embden-Meyerhof-Parnas) [29].
Calea enzimatică a fermentației alcoolice a fost elucidată pe parcursul multor ani de cercetare. S-a demonstrat că enzimele de fermentație pot funcționa și după eliberare din structuri celulare. Harden și Young au descoperit că, pentru ca fermentația alcoolică să aibă loc, este nevoie de două fracțiuni de extract de drojdie: o fracțiune termolabilă numită zimază, conținând probabil enzimele necesare procesului și o fracțiune termostabilă, cozimaza, necesară activității zimazei. Fracțiunea termostabilă a fost ulterior descrisă ca având două componente esențiale, coenzima de oxidoreducere nicotinamidadenin- dinucleotidul sau NAD și un amestec de adenin nucleotidele ADP și ATP .
Sub acțiunea complexului enzimatic al celulei de drojdie în stare activă, în condiții anaerobe are loc fermentația alcoolică, prin care se transformă D-glucoza, D-fructoza, D-manoza și după hidroliză enzimatică la nivelul membranei, zaharoza, maltoza și 1/3 din rafinoză, în alcool etilic, dioxid de carbon și o cantitate mică de energie.
II.4. Mecanismul fermentației alcoolice
Cu ocazia fermentației alcoolice, realizată de drojdii prin enzimele ce le produc, molecula de glucoză este descompusă în două molecule de etanol (alcool etilic) și două molecule de dioxid de carbon. De aceea , obișnuit, schema fermentației alcoolice este reprezentată prin ecuația:
C6H12O6 = 2 CH3CH2OH + 2CO2
Ecuația chimică de mai sus reprezintă însă numai bilanțul final și încă incomplet al unui șir de reacții, care au loc în timpul desfășurării acestui proces complex.
Într-adevăr, în timpul procesului de fermentație alcoolică au loc numeroase reacții intermediare și se formează o serie de noi compuși. În lumina cercetărilor de până acum, schema fermentației alcoolice trebuie privită ca o înlănțuire de reacții biochimice, din care unele au fost dovedite experimental, pe când altele sunt încă ipotetice.
Mecanismul fermentației alcoolice produse de drojdii cuprind 5 etape principale, catalizate de enzimele complexului zimazic:
formarea esterilor fosforici, formă sub care glucidele fermentescibile sunt transportate prin membrana celulară și metabolizate;
scindarea esterului fructofuranozo 1-6 difosfat, în prezența aldolazei, în două trioze: aldehida fosfoglicerică și fosfodioxiacetona, aflate în echilibru tautomer;
metabolizarea triozelor cu formare de acid piruvic, component de bază format în cadrul metabolismului microbian;
decarboxilarea acidului piruvic, cu eliberarea dioxidului de carbon ca produs principal și formarea acetaldehidei;
formarea alcoolului etilic ca urmare a faptului că aldehida acetică devine acceptor de hidrogen.
Desfășurarea în etape a procesului de fermentație alcoolică decurge după cum urmează:
Fig. II.1. Procesul de fermentație alcoolică (http://en.wikipedia.org/wiki/Alcoholic_fermentation#mediaviewer) [31]
Această reacție, catalizată de enzima alcooldehidrogenaza, formează veriga de bază în fermentația alcoolică și cu ea se încheie desfășurarea în etape a fermentării glucidelor, efectuată de drojdii prin mijlocirea enzimelor [30].
Bilanțul masic al fermentației alcoolice este următorul:
180 g glucoză = 2 x 46 g alcool etilic + 2 x 44 g dioxid de carbon
Randamentul teoretic este de 51,1% (92/180 x 100). Randamentul practic este de 0,64÷0,67 din randamentul teoretic, deoarece nu toată cantitatea de zahăr este transformată în alcool. O parte din cantitatea de zahăr este transformată în produse secundare, în produși de biosinteză intracelulari (biomasă), iar o altă cantitate este transformată prin respirație în produși finali.
În condiții de aerare, drojdiile asimilează glucidele producând oxidare până la produși finali prin respirație, procurându-și astfel o cantitate mai mare de energie folosită în procese de biosinteză ale compușilor celulari:
C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 2840 kj
Ca urmare a cantității mai mari de energie, este intensificată creșterea și înmulțirea celulelor, deoarece toate procesele de biosinteză sunt procese endogene, consumatoare de energie.
În funcție de condițiile de dezvoltare, drojdiile din genul Saccharomyces își pot schimba metabolismul său de la o cale fermentativă la una oxidativă, ambele sisteme producând energie celulei, dar în cantități diferite. Metabolizarea moleculei de glucoză în condiții aerobe, la CO2 și H2O furnizează celulei de drojdie cantitatea maximă de energie. În lipsa oxigenului, producerea de energie este mică, astfel încât în condiții anaerobe fermentația glucidelor duce în primul rând la formarea etanolului.
Această comportare metabolică pregnant diferențiată, în funcție de prezența oxigenului este folosită în industrie, unde se creează, după caz, condiții de anaerobioză atunci când produsul dorit este alcoolul sau condiții de aerobioză, atunci când se urmărește creșterea biomasei celulare. În condiții de aerobioză proporția substratului asimilat este mult mai mare decât cea realizată în condiții de anaerobioză.
Producția de celule crescute aerob poate fi de 10 ori mai mare decât cea obținută în condiții de anaerobioză pentru aceeași cantitate de glucoză utilizată. S-a stabilit că de la inoculul inițial la propagarea finală acesta a crescut cu un factor de 109 în 5÷7 zile. Încă din timpul lui Pasteur s-a stabilit că oxigenul accelerează mult multiplicarea drojdiilor. Contactul celulelor cu oxigenul le “întineresc”, stimulează multiplicarea lor, întreținând activitatea lor vitală. Pasteur a demonstrat primul că o drojdie fermentativă când este ținută în condiții aerobe își micșorează activitatea fermentativă și parte din glucoză este transformată prin respirație în CO2 si H2O.
Capacitatea oxigenului de a interfera cu procesele anaerobe, inhibând prin prezența sa procesul de fermentație și determinând o sporire simultană a respirației, este cunoscută sub numele de efect Pasteur [26].
Principalele etape ale ciclului acizilor tricarboxilici sunt:
formarea acidului citric, prin condensarea acetil~ CoA cu acidul oxalil-acetic;
izomerizarea acidului citric la acid izocitric;
oxidarea acidului izocitric în acid oxalilsuccinic și decarboxilarea acestuia în acid α-cetoglutaric;
decarboxilarea oxidativă a acidului α-cetoglutaric, cu formare de succinil ~ CoA;
formarea acidului succinic și sintetizarea ATP;
oxidarea acidului succinic la acid fumaric;
hidratarea acidului fumaric la acid malic;
oxidarea acidului malic cu formare de acid oxalilacetic.
Catabolizarea aerobă a glucozei pe calea ATC necesită degradarea ei la acid piruvic. Acesta se formează printr-un mecanism comun cu a glicogenului, dar care are loc în condiții aerobe. Acidul piruvic format în etapa a III-a a glicolizei se decarboxidează oxidativ și va forma acetil-CoA. Acest compus intră apoi într-un proces ciclic, numit ciclul ATC sau ciclul lui Krebs, în care se va forma bioxidul de carbon și hidrogen, care va fi oxidat și va forma apa într-un proces numit catena de respirație. Procesul are loc în mitocondrii. Cantitatea de energie rezultată este mult mai mare decât cea rezultată la glicoliză.
Reacția globală a catabolismului glucozei pe această cale este următoarea:
Schematic, procesul poate fi redat și astfel:
Fig. II.2. Metabolizarea glucozei [32]
Etapele fermentației alcoolice sunt redate în următoarea schemă de reacții (reacțiile din primele sapte etape sunt cunoscute și sub denumirea de glicoliză):
Fig.II.3. Catabolismul glucozei
http://en.wikipedia.org/wiki/Fermentation#mediaviewe [32]
Prin produși secundari ai fermentației alcoolice se înțeleg acele componente care apar alături de alcool etilic și CO2, considerați ca produși principali. Dintre produșii secundari se amintesc glicerolul, acizii lactic, acetic, ozaloacetic, malic, succinic, propionic, și citromalic, acetoina și butandiolul-2,3 [33].
CAPITOLUL III
PARTE EXPERIMENTALĂ
DETERMINAREA INFLUENȚEI UNOR CATIONI ASUPRA ACTIVITĂȚII ALCOOLDEHIDROGENAZEI LA FABRICAREA BIOETANOLULUI
Alcool dehidrogenaza (EC1.1.1.1.) catalizează reacția reversibilă de oxidare a etanolului în acetaldehidă în prezența sistemului redox de coenzime NAD+/NADH + H+, după reacția:
R – CH2 – OH + NAD+ ↔ R – CH=O + NADH + H+
Enzima izolată din drojdii are o masă moleculară de 141 000, un pH izoelectric de 5,4 și este un tetramer. Pe fiecare subunitate prezintă grefat un atom de zinc și două grupări tiolice, esențiale pentru procesul catalitic [11,12].
Fig. III.1. Alcool dehidrogenaza [29]
III.1. Principiul metodei
Viteza de reacție a alcool dehidrogenazei este determinată spectrofotometric prin urmărirea creșterii valorii de extincție a amestecului de reacție la 340 nm, determinat de reducerea corespunzătoare de NAD+ la NADH.
O unitate enzimatică corespunde reducerii unui micromol de NAD+ pe minut la 25°C, în condițiile definite [13].
Aparatură:
Spectrofotometru UV-VIS Secord 210 Plus Analytic Jena, Germania (figura III.2.)
Software WinAspect Plus, Germania- pentru prelucrarea datelor experimentale;
Fig. III.2 Aparatura utilizată pentru determinările experimentale
Reactivi chimici
Soluție tampon 50 mM pirofosfat de sodiu pH 8,8
Etanol 2M
Soluție apoasă NAD+ 15 mM
Soluție tampon fosfat de sodiu 10 mM
Albumină serică bovină 500 mg în 500 NAD+
Alcool dehidrogenază (0,1mg/ml în soluție tampon 4) izolată din Asppergillus niger
Soluție tampon fosfat de sodiu + albumină serică (0,1%)
Mod de lucru
In cuva spectrofotometrului se introduc reactivii chimici în cantitățile prevăzute în tabelul III .1. In paralel cu proba de analizat se execută și o probă martor în care nu se introduce enzimă.
Software-ul aparatului este setat pentru determinarea cineticii alcooldehidrogenazei la lungimea de undă de 340 nm, caracteristică NADH format în reacția de oxidare a etanolului la interval de 10 secunde, pentru un ciclu de 60 de determinări.
Calculul rezultatelor
Se reprezintă variația de densitate optică la 340 nm în funcție de timp pe porțiunea liniară inițială a curbei.
Unde,
6,2 x 106 cm2/ml reprezintă coeficientul de extincție al NADH la 340 nm.
Activitatea specifică a enzimei este exprimată în unități/mg proteină și ia în considerare factorul de diluație aplicat.
III.2. Construirea curbelor etalon
Se determină activitatea alcool dehidrogenazei izolată din Asppergillus niger pe o scară etalon de alcool etilic cu concentrațiile cuprinse între 1 și 60%.
In cuva spectrofotometrului se introduc reactivii chimici în cantitățile prevăzute în tabelul III .1. In paralel cu proba de analizat se execută și o probă martor în care nu se introduce enzimă.
Software-ul aparatului este setat pentru determinarea cineticii alcooldehidrogenazei la lungimea de undă de 340 nm, caracteristică NADH format în reacția de oxidare a etanolului la interval de 10 secunde, pentru un ciclu de 60 de determinări.
Tabelul III.1. Mod de lucru 1. Curba etalon
*Soluții de etalon cu concentrații intre 1 si 60 %
Rezultatele experimentale sunt prezentate în figura III. 2.
Fig. III.2. Curba etalon
Activitatea etalon a alcool dehidrogenazei pe o solutie de etanol 2M a fost determinată conform modului de lucru prezentat in tabelul III.3 și este prezentată în figura III.3.
Tabelul III.2. Mod de lucru 2. Activitatea etalon a ADH
Figura III.3 Activitatea etalon a ADH
III.3. Determinarea influenței unor cationi asupra activității enzimatice a alcooldehidrogenazei
S-a studiat influența unor cationi Ca2+, K +, Mn2+, Ni2+, Co2+, Pb2+, Fe3+, Sn2+, Hg2+, Zn2+ asupra activității alcool dehidrogenazei folosind metoda spectrofotometrică, după modul de lucru prezentat în tabelul III.3.
Tabel III.3. Mod de lucru 3
*Cationi Ca2+, K +, Mn2+, Ni2+, Co2+, Pb2+, Fe3+, Sn2+, Hg2+, Zn2+
Rezultatele experimentale sunt prezentate în figura III.4 .
Fig. III.4. Influența unor cationi asupra activității alcool dehidrogenazei
Se observă din datele experimentale obținute faptul că, prezența cationilor în mediul de reacție enzimatică influențează activitatea alcool dehidrogenazei in mod diferit. Astfel:
– ionii de mercur, fier și de cadmiu denaturează enzima prin precipitare;
– ionii de plumb și staniu sunt puternic inhibitori pentru activitatea alcool dehidrogenazei;
– ioni de cobalt și nichel acționează ca și inhibitori moderați pentru activitatea enzimatică a enzimei;
– ionii de calciu, potasiu, mangan nu influențează activitatea enzimatică a alcool dehidrogenazei:
-ionii de zinc sunt activatori ai alcool dehidrogenazei.
CONCLUZII
Industria bioetanolului se bazează în principal pe activitatea fermentativă a drojdiilor, care transformă zaharurile fermentescibile din substrat în alcool etilic ca produs principal de fermentație și respectiv în biomasă. Pe plan mondial, cea mai mare cantitate de bioetanol se obține prin fermentație, materiile prime folosite fiind: trestia de zahăr, melasa, cartofii, cerealele, (îndeosebi porumbul), sfecla de zahăr, fructele, etc.
Bioetanolul are multiple utilizări în diferite industrii, dar în ultimii ani el este tot mai des utilizat în amestec cu benzina drept carburant pentru motoare, ceea ce a dat o nouă dezvoltare industriei bioetanolului..
Alcool dehidrogenaza este o enzimă „cheie” în procesul de fermentație al proceselor biotehnologice care influențează decisiv calitatea produsului finit. Activitatea ei depinde de o serie de factori tehnologici dar și de compoziția mediului de fermentare.
Astfel, prezența în sistemul biochimic de fermentare a unor cationi (Ca2+, K +, Mn2+, Ni2+, Co2+, Pb2+, Fe3+, Sn2+, Hg2+, Zn2+ ) influențează profund cinetica reacției enzimatice a alcool dehidrogenazei, de la creșterea vitezei de reacție a acesteia, până la inhibarea moderată, puternică sau chiar inactivarea enzimei.
Aceste rezultate experimentale pot fi utilizate pentru conducerea tehnologică a operației de fermentare în sensul dorit, (activare sau frânare) pentru obținerea unor produse finite de calitate superioară.
BIBLIOGRAFIE
Cachiță, Dorina; Constantin, Deliu; Lenuța, Rakosy-Tican; Aurel, Ardelean (2004) Tratat de biotehnologie vegetală, vol.I Editura “Dacia”, Cluj-Napoca
Skoog, et al.(2007) Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. Thomson Brooks/Cole., 169-173.
L. Sooväli, E.-I. Rõõm, A. Kütt, I. Kaljurand, I. Leito (2006). Uncertainty sources in UV-Vis spectrophotometric measurement. Accred. Qual. Assur. 11, 246-255
E. S. C. O'Connor-Cox, J. Paik and W. M. Ingledew (1991) – Improved ethanol yields through supplementation with excess assimilable nitrogen, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, Volume 8, No.1
Singh, D.; Dahiya, J. S.; Nigam, P (1995). Simultaneous raw starch hydrolysis and ethanol fermentation by glucoamylase from Rhizoctonia solani and Saccharomyces cerevisiae. J. Basic Microbiol. 35, 117-121.
Conway T, Ingram LO (1989). "Similarity of Escherichia coli propanediol oxidoreductase (fucO product) and an unusual alcohol dehydrogenase from Zymomonas mobilis and Saccharomyces cerevisiae". J. Bacteriol. 171 (7): 3754–9.
Leuchs S, Greiner L (2011). "Alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis: A versatile catalyst for enenatioselective reduction". CABEQ: 267–281.
Foulkes, Christopher (2001) Larousse Encyclopedia of Wine. Larousse. ISBN 2-03-585013-4.
H Alexandre and C Charpentier (1998) Biochemical aspects of stuck and sluggish fermentation in grape must Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology
H. Queiroz and A. Pareilleux (1990) Growth kinetics of Schizosaccharomyces pombe under various culture conditions: influence of pH, malate, ethanol and oxygenation, Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 33, Number 5 / August, 1990
Johnson, Hugh (2003) Hugh Johnson's Wine Companion, 5th edition, Mitchell Beazley.“The Encyclopaedia of Wines, Vineyards and Winemakers”
Moore CM, Minteer SD, Martin RS (2005). "Microchip-based ethanol/oxygen biofuel cell". Lab on a Chip 5 (2): 218–25.
http://www.jbc.org/content/184/1/313.full.pdf
Theorell H, McKee JS (October 1961). "Mechanism of action of liver alcohol dehydrogenase". Nature 192 (4797): 47–50.
http://en.wikipedia.org/wiki/Ethanol_fermentation#cite_note-stryer-1
Najafpour, G., Younesi, H., Ismail, K. S. K.(2004): Ethanol fermentation in an immobilized cell reactor using Saccharomyces cerevisiae, Bioresource Technology, (92) 251-260
P. N. Pimenta-Braz, J. M. Ricardo-da-Silva and O. Laureano (1998) – Evaluation of pectolytic activities of enological interest in industrial enzyme preparations Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und -Forschung A, Volume 206, Number 1 / January, 1998,
Bai, F. W., Anderson, W. A., Moo-Young, M (2008).: Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks, Biotechnology Advances, (26) 89-105
P. Ribéreau-Gayon (1986) – The scientific basis for the production of quality wines, Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS), Volume 42, Number 8 /1986
P. Sanchez-Torres, L. Gonzalez-Candelas and D. Ramon (1998) – „Construction of Aspergillus nidulans strains producing enzymes of potential use in enology”, Biotechnology Letters, Volume 20, Number 1 / January, 1998
Sumio Michnick and Jean-Michel Salmon (1994) – Glycerol production from sugars with phosphoglycerate mutasedeficient Saccharomyces cerevisiae partially resistant to glucose repression, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, Volume 13, Number 1 / January, 1994
Gibreel A., Sandercock, J.R., Lan, J. Goonewardene, L.A., Ruurd T. Zijlstra, R.T., Curtis, J.M. and David C. Bressler D.C.:(2009) Fermentation of Barley by Using Saccharomyces cerevisiae: Examination of Barley as a Feedstock for Bioethanol Production and Value-Added Products, Appl Environ Microbiol., 75(5) 1363- 1372
Pimentel D., Patzek T.W.:(2005) Ethanol production using corn, switchgrass, and wood; biodiesel production using soybean and sunflower, Natural resources research, 14(1) 65-76
Tetlow, I. J.(2006) Understanding storage starch biosynthesis in plants: a mean to quality improvement, Can. J. Bot.,(84) 1167-1185
Milner, J. A., Martin, D. J., Smith, A.(1997): Two-stage inocula for the production of alpha-amylase by Bacillus amyloliquefaciens, Enzyme and Microbial Technology, 1997 (21) 382-386
Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswam, V. K., Chauhan, B (2003).: Microbial α-amylases: a biotechnological perspective, Process Biochemistry, (38) 1599-1616
Verma, G., Nigam, P., Singh, D., Chaudhary, K.:(2000) Bioconversion of starch to ethanol in a single-step process by coculture of amylolytic yeasts and Saccharomyces cerevisiae 21, Bioresource Technology, (72) 261- 26
Bodner, George M.(1986): Metabolism Part I: Glycolysis for the Embden-Meyerhoff pathway, J. Chem. Educ., 63 (7), p 566
http://courses.cit.cornell.edu/biomi290/MOVIES/GLYCOLYSIS.HTML
http://books.google.com/books
Lehninger, A.(1987 si 1992): Biochimie, vol I-II Editura tehnică, Bucuresti
http://en.wikipedia.org/wiki/Alcoholic_fermentation#mediaviewer/File:Ethanol_fermentation-1.svg
http://en.wikipedia.org/wiki/Fermentation#mediaviewer/File:Cellular_respiration.gif
BIBLIOGRAFIE
Cachiță, Dorina; Constantin, Deliu; Lenuța, Rakosy-Tican; Aurel, Ardelean (2004) Tratat de biotehnologie vegetală, vol.I Editura “Dacia”, Cluj-Napoca
Skoog, et al.(2007) Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. Thomson Brooks/Cole., 169-173.
L. Sooväli, E.-I. Rõõm, A. Kütt, I. Kaljurand, I. Leito (2006). Uncertainty sources in UV-Vis spectrophotometric measurement. Accred. Qual. Assur. 11, 246-255
E. S. C. O'Connor-Cox, J. Paik and W. M. Ingledew (1991) – Improved ethanol yields through supplementation with excess assimilable nitrogen, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, Volume 8, No.1
Singh, D.; Dahiya, J. S.; Nigam, P (1995). Simultaneous raw starch hydrolysis and ethanol fermentation by glucoamylase from Rhizoctonia solani and Saccharomyces cerevisiae. J. Basic Microbiol. 35, 117-121.
Conway T, Ingram LO (1989). "Similarity of Escherichia coli propanediol oxidoreductase (fucO product) and an unusual alcohol dehydrogenase from Zymomonas mobilis and Saccharomyces cerevisiae". J. Bacteriol. 171 (7): 3754–9.
Leuchs S, Greiner L (2011). "Alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis: A versatile catalyst for enenatioselective reduction". CABEQ: 267–281.
Foulkes, Christopher (2001) Larousse Encyclopedia of Wine. Larousse. ISBN 2-03-585013-4.
H Alexandre and C Charpentier (1998) Biochemical aspects of stuck and sluggish fermentation in grape must Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology
H. Queiroz and A. Pareilleux (1990) Growth kinetics of Schizosaccharomyces pombe under various culture conditions: influence of pH, malate, ethanol and oxygenation, Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 33, Number 5 / August, 1990
Johnson, Hugh (2003) Hugh Johnson's Wine Companion, 5th edition, Mitchell Beazley.“The Encyclopaedia of Wines, Vineyards and Winemakers”
Moore CM, Minteer SD, Martin RS (2005). "Microchip-based ethanol/oxygen biofuel cell". Lab on a Chip 5 (2): 218–25.
http://www.jbc.org/content/184/1/313.full.pdf
Theorell H, McKee JS (October 1961). "Mechanism of action of liver alcohol dehydrogenase". Nature 192 (4797): 47–50.
http://en.wikipedia.org/wiki/Ethanol_fermentation#cite_note-stryer-1
Najafpour, G., Younesi, H., Ismail, K. S. K.(2004): Ethanol fermentation in an immobilized cell reactor using Saccharomyces cerevisiae, Bioresource Technology, (92) 251-260
P. N. Pimenta-Braz, J. M. Ricardo-da-Silva and O. Laureano (1998) – Evaluation of pectolytic activities of enological interest in industrial enzyme preparations Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und -Forschung A, Volume 206, Number 1 / January, 1998,
Bai, F. W., Anderson, W. A., Moo-Young, M (2008).: Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks, Biotechnology Advances, (26) 89-105
P. Ribéreau-Gayon (1986) – The scientific basis for the production of quality wines, Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS), Volume 42, Number 8 /1986
P. Sanchez-Torres, L. Gonzalez-Candelas and D. Ramon (1998) – „Construction of Aspergillus nidulans strains producing enzymes of potential use in enology”, Biotechnology Letters, Volume 20, Number 1 / January, 1998
Sumio Michnick and Jean-Michel Salmon (1994) – Glycerol production from sugars with phosphoglycerate mutasedeficient Saccharomyces cerevisiae partially resistant to glucose repression, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, Volume 13, Number 1 / January, 1994
Gibreel A., Sandercock, J.R., Lan, J. Goonewardene, L.A., Ruurd T. Zijlstra, R.T., Curtis, J.M. and David C. Bressler D.C.:(2009) Fermentation of Barley by Using Saccharomyces cerevisiae: Examination of Barley as a Feedstock for Bioethanol Production and Value-Added Products, Appl Environ Microbiol., 75(5) 1363- 1372
Pimentel D., Patzek T.W.:(2005) Ethanol production using corn, switchgrass, and wood; biodiesel production using soybean and sunflower, Natural resources research, 14(1) 65-76
Tetlow, I. J.(2006) Understanding storage starch biosynthesis in plants: a mean to quality improvement, Can. J. Bot.,(84) 1167-1185
Milner, J. A., Martin, D. J., Smith, A.(1997): Two-stage inocula for the production of alpha-amylase by Bacillus amyloliquefaciens, Enzyme and Microbial Technology, 1997 (21) 382-386
Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswam, V. K., Chauhan, B (2003).: Microbial α-amylases: a biotechnological perspective, Process Biochemistry, (38) 1599-1616
Verma, G., Nigam, P., Singh, D., Chaudhary, K.:(2000) Bioconversion of starch to ethanol in a single-step process by coculture of amylolytic yeasts and Saccharomyces cerevisiae 21, Bioresource Technology, (72) 261- 26
Bodner, George M.(1986): Metabolism Part I: Glycolysis for the Embden-Meyerhoff pathway, J. Chem. Educ., 63 (7), p 566
http://courses.cit.cornell.edu/biomi290/MOVIES/GLYCOLYSIS.HTML
http://books.google.com/books
Lehninger, A.(1987 si 1992): Biochimie, vol I-II Editura tehnică, Bucuresti
http://en.wikipedia.org/wiki/Alcoholic_fermentation#mediaviewer/File:Ethanol_fermentation-1.svg
http://en.wikipedia.org/wiki/Fermentation#mediaviewer/File:Cellular_respiration.gif
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Studiul Influentei Unor Cationi Asupra Activitatii Alcool Dehidrogenazei In Procesul de Obtinere a Bioetanolului (ID: 166407)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.