Raspunsul Inflamator Indus de Nanoparticulele Dioxidului de Siliciu Asupra Liniei Celulare de Fibroblaste Umane Mrc 5
„Răspunsul inflamator indus de nanoparticulele dioxidului de siliciu asupra liniei celulare de fibroblaste umane MRC-5”
Partea I interacțiunea nanoparticule – celule
CAPITOLUL I: Nanotehnologie și Nanoparticule
1.1 Nanoparticule: etimologie, tehnologie și clasificare
1.1.1 Nanoparticulele
1.1.2 Nanotehnologia
1.1.3 Clasificarea nanoparticulelor
1.1.4 Proprietăți ale nanoparticulelor
1.2 Aplicații ale nanoparticulelor în medicină
1.2.1 Domeniul bio-nanosistemelor
1.2.2 Transportul țintit de medicamente
1.2.3 Nanoparticulele de aur în biomedicină
1.2.4 Nanofibrile și nanoparticule de carbon
1.2.5 Nanobiocompozite
1.2.6 Puncte cuantice (Q-dots)
1.2.7 Nanotuburi de carbon
1.3.1 Distribuția nanoparticulelor de siliciu în organe (in vivo)
1.3.2 Distribuția nanoparticulelor în țesutul tumoral
1.3.3 Căile de expunere ale nanoparticulelor în cadrul locului de muncă
1.3.4 Expunerea prin inhalare
2 CAPITOLUL II
2.1 Toxicitatea asociată nanoparticulelor
2.1.1 Generalitați
2.1.2 Răspunsuri celulare și moleculare la tratamentul cu nanoparticule
2.2 TOXICITATEA ASOCIATĂ NANOPARTICULELOR PE BAZĂ DE SILICIU
2.2.1 Siliciul și dioxidul de siliciu (SiO2)
2.2.2 Studii referitoare la citotoxicitatea NP pe bază de siliciu
Partea II Studiul experimental
3 CAPITOLUL III
3.1 Interleukina 6
3.2 Interleukina 8
3.3 PGE2-prostaglandine
3.4 Oxidul nitric
1 CAPITOLUL I
1.1 Scopul studiului
1.2 Obiectivele studiului
2 CAPITOLUL II
2.1 Cultivarea liniei celulare MRC-5
2.2 Caracterizarea nanoparticulelor și tratamentul celulelor
2.3 Testul de viabilitate celulară MTT
2.4 Obținerea lizatului celular
2.5 Tehnica Western Blot
3 CAPITOLUL III
3.1 Evaluarea citotoxicității nanoparticulelor de SiO2
3.2 Testul de viabilitate celulara MTT asupra fibroblastelor liniei MRC-5
Introducere
Dioxidul de siliciu (SiO2), este un mineral cu largă răspândire ce intră în constituția scoarței terestre. Se formează din siliciu și oxigen în condiții de presiune și temperatură crescute și se prezintă sub două forme: Formele cristaline ale dioxidului de siliciu reprezentate de: cuart, tridimit, cristobalit. Cristobalitul și tridimitul se găsesc în mod natural în lava vulcanică sau se formează prin încălzirea la temperaturi înalte a cuarțului sau a dioxidului de siliciu amorf. Aceste forme alomorfe sunt mai nocive pentru structura pulmonară comparativ cu cuarțul.
Formele amorfe sunt relativ netoxice pentru țesutul pulmonar. Din această categorie fac parte: diatomita si silicea amorfă (vitroasă). Prin calcinarea (tratarea cu alcali la temperaturi înalte) a pământului de diatomită care are un conținut foarte redus (0,3%) de cristobalit, se obțin pulberi cu conținut de cristobalit de aproximativ 35%, condiție în care crește considerabil riscul de îmbolnăvire. Există varietăți artificiale de silice amorfă (silicea coloidala) care au potențial fibrogen la nivel pulmonar, dar mult mai redus decât al cuarțului. (Rascu și colab., 2010)
Dioxidul de siliciu, este întânlit cel mai frecvent în natură ca nisip sau cuarț, precum și în pereții diatomeelor. Este o substanță chimică folosită ca material de umplere, aditiv sau modificator reologic în formulele multor produse cum ar fi vopselele, industria textilă, materiale plastice, cauciuc sintetic, materiale de izolare, etc. SiO2 în stare amorfă este adăugat în procesul de preparare a betonului, pentru îmbunătațirea rezistenței și durabilității, dar și pentru reducerea porozității sale. De asemenea este folosit în mixurile eutectice cu aditivi corespunzători, ca oxidul de bor sau ca oxidul de fosfor, pentru a reduce temeperatura necesară sinterizării și pentru a crește stabilitatea chimică a straturilor aliajelor de magneziu. Nanoparticulele de siliciu pot fi eliberate într-un mod depdendent de toate aceste materiale. Studii tribologice asupra nanocompozitelor SiO2 acrilat, au arătat că frecarea a dus la pierderea gradată a nanoparticulelor de siliciu. În același timp nanoparticulele de siliciu din compozitia anvelopelor de cauciuc sunt eliberate datorită interacțiunii dintre pneuri și drum. (Munteannu și colab., 2010).
Cercetările din ultimele două decade cu privire la toxicitatea silicei libere, configurează stresul oxidativ ca o verigă importantă în secvențialitatea mecanismelor inflamatorii, atât la nivelul parenchimului pulmonar, cât și la nivelul căilor aeriene. Producerea excesivă de radicali oxigenați liberi (ROL) este posibilă grație proprietăților chimice legate de reactivitatea chimică la suprafața particulelor de cuarț, dar și prin fagocitarea acestora de către macrofagele alveolare care, activate pe această cale, generează specii reactive ale oxigenului (SRO). Disponibilitatea în radicali ai silicei este strâns dependentă de prospețimea suprafețelor fracturate ale cristalului de cuarț. Sunt necesare încă cercetări care să confirme cu certitudine faptul că, ROL formați consecutiv inhalării silicei libere, dețin acest rol cheie în declanșarea și întreținerea inflamației cronice și, în consecință, a fibrozei silicotice.
Instalarea stresului oxidativ corespunde fazei în care producția excesivă de ROL nu mai poate fi neutralizată de sistemul antioxidativ, iar SRO stimulează secreția de citokine proinflamatorii și alți mediatori care întrețin inflamația și evoluția pneumoconiozei. ROL determină peroxidarea lipidelor din membranele celulare cu formarea de lipoperoxizi și aldehide, a căror determinare în ser sau în țesuturi permite aprecieri asupra intensității stresului oxidativ. ( (Bârsan și colab., 2013)
Dioxidul de siliciu este un potențial nanomaterial, ideal în aplicațiile biomedicale deoarece acesta poate fi ușor funcționalizat pentru bioconjugare, fiind îndeajuns biocompatibil și rezistent la biodegradarea în mediile celulare. Particulele SiO2 de dimensiuni nanometrice, sunt cunoscute ca având o sarcină negativă datorită disocierii grupărilor silanol de suprafață, care pot fi ușor modificate prin diverse grupări funcționale. Având în vedere faptul că nanoparticulele de siliciu modificate, pot penetra efectiv membrana celulară, s-a depus un efort considerabil în aprofundarea cercetărilor, în scopul de a le folosi ca purtătoare de medicamente sau livratoare de gene. Riscurile umane reprezintă o grijă majoră, deoarece nanoparticulele ar putea fi prezente la locul de muncă, în atmosfera înconjurătoare sau să fie utilizate în aplicații medicale. Mai multe studii în vitro au evidențiat o serie de factori cheie, în care nanoparticulele introduse în culturi celulare pot influența funcțiile biologice sau pot induce citotoxicitate. Toxicitatea lor depinde în mare măsură de o serie de parametrii, cum ar fi compoziția chimică, dimensiunea, formele lor de dozare, etc. Expunerea la nanoparitcule de siliciu ar putea genera potențiale riscuri asupra sistemului cardio-respirator. Retenția pulmonară și redistribuirea extrapulmonară a nanopariculelor de siliciu inhalate, au fost considerate importanți factori ce contribuie la bolile cardio-respiratorii.
Studiile anterioare, au arătat faptul că nanoparticulele SiO2 amorfe pot fi periculoase pentru oameni și de asemenea pot fi ecotoxice. Multe studii au arătat că toxicitatea materialelor insolubile, este invers proporțională cu dimensiunea pariculelor. Mecanismele exacte prin care aceste materiale prezintă niveluri mai înalte de toxicitate, la dimensiuni mai mici ale particulelor, nu au fost încă elucidate. Inflamația, activitatea sistemului nervos, efectele procoagulante, stimularea receptorilor de capsaicină și producția SRO, au fost luate în considerare, chiar dacă acum, este de înțeles că stresul oxidativ joacă un rol important în inițierea cascadelor de evenimente, atât la nivel celular cât și molecular, ducând la observarea efectelor asupra sănatății.
Toxicitatea speciilor reactive ale oxigenului (SRO), a fost luată în considerare ca un posibil mecanism responsabil pentru leziuni celulare induse de nanoparticule de siliciu la mamifere. SRO sunt molecule sau ioni formați prin reducerea incompletă a unui electron al oxigenului. Acești reactivi intermediari ai oxigenului includ oxigen-singlet, superoxizi, peroxizi și radicali hidroxil. SRO sunt formați continuu în celule ca urmare a ambelor reacții biochimice și a factorilor externi, cum ar fi anumiți poluanți din mediu. Organismele au elaborat numeroase mecanisme celulare de apărare, care în condiții metabolice normale, reglează nivelul SRO și protejează împotriva efectelor negative ale radicalilor liberi. Sistemul de apărare include atât captatori de radicali liberi cu greutate moleculară scăzută, cum ar fi glutation tripeptida (GSH), cât și enzime antioxidante, cum ar fi superoxid dismutaza (SOD), catalza (CAT) și glutation peroxidaza (GPX).
Când producția SRO în celule depășește capacitatea sistemului antioxidant de eliminare, se manifestă stresul oxidativ. Datorită reactivității ridicate a SRO, majoritatea componentelor celulare sunt susceptibile de a fi ținte ale degradării oxidative: peroxidarea lipidică, oxidarea proteică, epuizarea GSH, ruperea unei catene ADN, sunt toate inițiate de excesul SRO. Toate aceste evenimente în cele din urmă duc la disfuncții și degradări celulare (Munteannu și colab., 2010).
Lucrarea de față are ca scop studiul privind răspunsul indus de nanoparticulele dioxidului de siliciu în linia celulară de fibroblaste umane MRC5, pentru realizarea căruia au fost stabilite următoarele obiective:
Izolarea și cultivarea liniilor celulare MRC5 ce vor fi supuse unor concentrații specifice de nanoparticule de siliciu, la intervale de 24, 48, respectiv 72 de ore, în scopul evidențierii răspunsului adaptativ, ce apare in vitro;
Evaluarea efectelor tratamentului cu nanoparticule de SiO2 prin testarea citotoxicității, precum și analiza modificărilor proteinelor NRF2, IL6, IL 8;
Determinarea citotoxicității bazate pe determinarea activității lactat dehidrogenazei;
Testarea viabilității celulare MTT.
Partea I interacțiunea nanoparticule – celule
CAPITOLUL I
Nanotehnologie și Nanoparticule
Nanoparticule: etimologie, tehnologie și clasificare
Nanoparticulele
Prefixul „nano” provenit de la grecescul „nanos” care înseamnă „pitic”, devine din ce în ce mai frecvent în literatura de specialitate. Deși ideea de nanotehnologie: producerea de obiecte și manipularea cu succes la scală nanometrică, a fost imaginată de ceva timp, nașterea acestui concept, se leagă oarecum de discursul lui Richard Freynman, ținut în 1959 la reuniunea Societateății de Fizică Americană, unde a întrebat: „Ce s-ar întâmpla dacă am putea aranja atomii, unul câte unul în modul în care ne dorim?”
Nanoparticulele (Fig.1) sunt corpuscului (particule) cu cel puțin o dimensiune mai mică decât un micron și potențial la fel de mici ca scalele moleculare și chiar atomice. Nanoparticulele pot avea formă amorfă sau cristalină, iar suprafețele lor pot acționa ca purtători pentru încărcături lichide sau gazoase. Într-o anumită masură, indiferent de proveniența nanoparticulelor, ar trebui ca acestea să fie considerate stări distincte ale materiei, în adiție solidă, lichidă, gazoasă sau cu plasmă, datorită proprietăților sale distincte (suprafață mare și efecte de dimensiuni cuantice). Exemple de materiale sub forma nanoparticulelor cristaline sunt fulerenele și nanotuburile de carbon, în timp ce formele cristaline solide tradiționale sunt reprezentate de grfit și diamante. Mulți autori limitează dimensiunea nanomaterialelor la 100 nm sau 50 nm, alegerea acestui plafon fiind justificată de faptul că unele proprietăți fizice ale nanopaticulelor sunt diferite în funcție de dimensiune. Cu toate acestea, dimensiunea prag vrariază în funcție de tipul de material și nu poate fi baza unei clasificări. (Robbie și colab., 2007)
Nanotehnologia
Nanotehnologia este un termen colectiv pentru dezvoltările tehnologice la scară nanometrică. În sens larg, nanotehnologia reprezintă orice tehnologie al cărei rezultat finit este deratura de specialitate. Deși ideea de nanotehnologie: producerea de obiecte și manipularea cu succes la scală nanometrică, a fost imaginată de ceva timp, nașterea acestui concept, se leagă oarecum de discursul lui Richard Freynman, ținut în 1959 la reuniunea Societateății de Fizică Americană, unde a întrebat: „Ce s-ar întâmpla dacă am putea aranja atomii, unul câte unul în modul în care ne dorim?”
Nanoparticulele (Fig.1) sunt corpuscului (particule) cu cel puțin o dimensiune mai mică decât un micron și potențial la fel de mici ca scalele moleculare și chiar atomice. Nanoparticulele pot avea formă amorfă sau cristalină, iar suprafețele lor pot acționa ca purtători pentru încărcături lichide sau gazoase. Într-o anumită masură, indiferent de proveniența nanoparticulelor, ar trebui ca acestea să fie considerate stări distincte ale materiei, în adiție solidă, lichidă, gazoasă sau cu plasmă, datorită proprietăților sale distincte (suprafață mare și efecte de dimensiuni cuantice). Exemple de materiale sub forma nanoparticulelor cristaline sunt fulerenele și nanotuburile de carbon, în timp ce formele cristaline solide tradiționale sunt reprezentate de grfit și diamante. Mulți autori limitează dimensiunea nanomaterialelor la 100 nm sau 50 nm, alegerea acestui plafon fiind justificată de faptul că unele proprietăți fizice ale nanopaticulelor sunt diferite în funcție de dimensiune. Cu toate acestea, dimensiunea prag vrariază în funcție de tipul de material și nu poate fi baza unei clasificări. (Robbie și colab., 2007)
Nanotehnologia
Nanotehnologia este un termen colectiv pentru dezvoltările tehnologice la scară nanometrică. În sens larg, nanotehnologia reprezintă orice tehnologie al cărei rezultat finit este de ordin nanometric: particule fine, sinteză chimică, microlitografie, etc. Intr-un sens restrâns, nanotehnologia reprezintă orice tehnologie ce se bazează pe abilitatea de a construi structuri complexe respectând specificații la nivel atomic, folosindu-se de sinteza mecanică. Structurile nanometrice nu numai că sunt foarte mici, ajungandu-se chiar pană la scară atomică, dar ele posedă și unele proprietăți total deosebite și neașteptate, în comparație cu aceeași structură luată la nivel macroscopic. (Moghimi și colab., 2005)
Prin nanotehnologie se înțelege manipularea materialelor la scară atomică sau moleculară, de obicei în fracțiuni de ordinul a 1-100 nm, a așa numitelor nanoparticule.
Nanometrul este o unitate metrică de lungime și reprezintă a miliarda parte dintr-un metru sau 10-9 m.
Clasificarea nanoparticulelor
Nanoparticulele sunt, în general clasificate pe baza dimensiunii, morfologiei, compoziției, uniformității și agregării lor. Mișcarea nanoparticulelor libere nu este constrânsă, ele pot fi ușor răspândite în mediu, expunându-se omului, reprezentând astfel un risc grav pentru sănătate. Există multe obiecte ce conțin elemente nanostructurale, acestea fiind atașate ferm la un obiect de dimensiuni mai mari, unde nanoparticulele fixate nu ar trebui să reprezinte un risc pentru sănătate atunci când sunt manipulate în mod corespunzător. De asemenea este foarte important să recunoaștem că nu toate nanoparticulele sunt toxice. Toxicitatea depinde cel puțin de compoziția chimică și formă, în plus față de simpla mărime a particulei. De fapt mai multe tipuri de nanoparticule par a fi netoxice, altele se înfățișează ca fiind toxice, în timp ce altele par a avea efecte benefice pentru sănătate. O leccție importantă în procesul înțelegerii nanoștiinței este chiar știința comportamentului fizic și prin urmare, toxicitatea care este limitată. Trebuie să studiem din fiecare material cu fiecare morfologie pentru a obține informații precise pentru asigurarea unei politici acceptabile de utilizare și despre procesele fundamentale de reglementare magnetotactică. (Robbie și colab., 2007)
Nanoparticulele care se găsesc în mod accidental în atmosferă provin din activități industriale și din sisteme de ardere a combustibililor, cum ar fi automobilele și vehiculele cu motoare diesel.
Nanoparticulele sintetizate la nanoscală au o anumită compoziție și structură fizico-chimică, ce utilizează proprietățile și funcțiile asociate dimensiunii. Pot fi nanoparticulele cu structură regulată și compoziție omogenă, sau nanoparticule multi-funcționale. Acestea au fost numite “nanoparticule deștepte” (Liang și colab., 2008), cum sunt, de exemplu, cele sintetizate pentru diagnosticul și tratamentul unor boli.
O altă clasificare (Liang și colab., 2008) împarte nanoparticulele în două grupuri:
(1) labile, care se dezintegrează ulterior aplicării (lipozomi, micele, nanoemulsii, polimeri) și
(2) insolubile, cum sunt dioxidul de titaniu, dioxidul de siliciu, fulerenele și nanoparticulele quantum dots (QDs).
Lipozomii sunt nanoparticule alcătuite dintr-un bistrat lipidic, care înconjoară un interior apos, având o structură asemănătoare membranelor biologice și care au fost realiate cu scopul de a îmbunătăți eficiența unor medicamente. Mai recent s-a dezvoltat o nouă generație de lipozomi, cu un timp de înjumătățire mai mare, numiți „ascunși/clandestini” (fig. 2), deoarece au capacitatea de a nu induce un raspuns imun (Medina și colab., 2007).
Dimensionalitatea
Forma și morfologia nanoparticulelor, joacă un rol important în toxicitatea lor, fiind util în a le clasifica în funcție de numărul dimensiunilor. Acest lucru este o generalizare a conceptului de aspect proporțional.
Nanomaterialele 1D. Materialele cu o singură dimensiune în scala nanometrică sunt de obicei filme subțiri sau acoperiri de suprafață ce pot include circuite ale computerului sau antireflexii și aderențe dure pe ochelari. Filmele subțiri au fost dezvoltate și utilizate de zeci de ani în diverse domenii, cum ar fi electronica, chimia și ingineria. Filmele subțiri pot fi depuse prin diverse metode, putând crește controlat astfel încât să fie de grosimea unui atom (așa numitul monostrat).
Nanomaterialele 2D. Nanomaterialele bidimensionale au două dimensiuni în scala nanometrică. Acestea includ filme 2D nanostructurale, cu nanostructuri ferme atașate unui substrat, sau unui nanopor al unui filtru, utilizat pentru separarea și filtrarea particulelor mici. Particulele libere cu un aspect proporțional întins, cu dimensiuni în nanoscală, sunt de asemenea considerate materiale 2D. Fibrele de azbest sunt un exemplu de nanoparticule 2D.
Nanomaterialele 3D. Materialele care sunt la scală nano în toate cele 3 dimensiuni, sunt considerate nanomateriale 3D. Acestea înclud straturi subțiri depuse în condiții care generează, la scală atomică, coloizi și nanoparticule libere cu diverse morfologii.
Morfologia
Caracteristicile morfologice care ar trebui luate în considerare sunt: aplatizarea, sfericitatea și raportul proporțional. Există o clasificare generală între particulele cu rată înaltă sau scăzută din punct de vedere izodiametric. Raportul izodiametric ridicat al nanoparticulelor include nanotuburi și nanofire, cu forme variate, cum ar fi spirale, zig-zaguri, curele, sau poate nanofire cu diametre care variază în funcție de lungime. Raportul izodiametric scăzut include sfere, ovale, cuburi, prisme, elice sau stâlpi. Colecții ale multor particule există sub formă de pudră, suspensii sau coloizi.
Compoziția
Nanoparticulele pot fi compuse dintr-un singur consituent material, sau poate fi un compozit a mai multor materiale. Nanoparticulele găsite în natură, sunt adesea aglomerări de materiale cu compoziție variată, în timp ce materialele pure, cu compoziție unică, pot fi ușor sintetizate în zilele noastre prin diferite metode.
Uniformitatea și agregarea nanoparticulelor
Bazate pe proprietățile lor chimice și electromagnetice, nanoparticulele se pot întânli sub formă de aerosoli dispersați, ca suspensii sau soluții coloidale, sau în stări agregate. De exemplu, nanoparticulele magnetice, tind să se grupeze, formând o stare aglomerată, cu excepția cazului în care suprafețele lor sunt acoperite cu un material nemagnetic. În starea agregată, nanoparticulele se pot comporta ca particule mai mari, în funcție de dimensiunea aglomeratului. Prin urmare, este evident că agregarea nanoparticulelor, dimensiunea și reactivitatea de suprafață, împreună cu forma lor, trebuie să fie luate în considerare atunci când se decide sănătatea și reglementarea noilor materiale din mediul înconjurător. (Moghimi, 2005)
Proprietăți ale nanoparticulelor
Pentru a caracteriza nanomateriale tehnologice destinate în special utilizării farmacologice sau medicale, dar și pentru a evalua riscul expunerii umane, este necesară cunoașterea mai multor proprietăți fizico-chimice. Printre acestea se numară: dimensiunea, gradul de aglomerare, forma, structura cristalină, compoziția chimică, aria suprafeței, solubilitatea, încărcarea electrică și chimia suprafeței și porozitatea (Oberdörster și colab., 2005). Proprietățile unice ale nanoparticulelor sunt dependente în primul rând de dimensiune și determină caracteristici aparte, diferite de cele ale materialului de dimensiuni mai mari din care acestea provin. Practic, nanoparticula se comportă ca o substanță nouă, cu proprietați fizico-chimice distincte. La nanoparticulele mai mici de 30 nm devin foarte pronunțate modificările optice și capacitatea de legare a altor molecule, așa cum este cazul QDs (figura 3), unde dimensiunea controlează cuantificarea nivelurilor de energie în interiorul particulei (Borm și colab., 2006). De exemplu, nanoparticulele pot împraștia și absorbi radiații cu o lungime de undă mai scurtă din UV, lasând neafectate radiațiile din VIS. Când nanoparticulele absorb în UV și emit în vizibil culoarea emisă, ea este diferită în funcție de diametrul nanoparticulei.
De asemenea, creșterea activității biologice a nanoparticulelor este invers proporțională cu dimensiunea lor, datorită faptului că particulele mai mici ocupă mai puțin volum, rezultatul constând în creșterea numărului de particule cu o arie a suprafeței mai mare pe unitatea de masă și implicit cu un potențial de interacție biologică mai mare (Oberdörster și colab., 2005).
Variind compoziția, dimensiunea sau suprafața, se pot modifica proprietățile fizice și chimice ale nanoparticulelor. Astfel, aceleași nanoparticule, dar cu dimensiuni diferite, prezintă proprietăți diferite în ceea ce privește solubilitatea, transparența, culoarea, lungimea de undă de emisie sau absorbție și punctul de topire. Pe de altă parte, modificând suprafața se schimbă dispersibilitatea, conductivitatea sau proprietățile optice.
O nanoparticulă de formă sferică cu raza de 2,5 nm și densitatea de 5 g/cm3 are o suprafață de 240 m2/g, ceea ce înseamnă că aproximativ 20% din atomii care o compun se găsesc la suprafața particulei. Această suprafață însa nu este niciodată descoperită, ci, datorită forțelor de atracție cu energie mare de la suprafață, particulele sunt aglomerate între ele, „lipite” de suprafețele disponibile, sau funcționează ca un filtru de carbune activ față de alte molecule mici.
Compozitia chimică a nanoparticulelor este foarte variată, unele nanostructuri fiind o combinație a mai multor tipuri de compuși organizate în structuri de tip core-shell. În principiu o nanoparticulă poate fi împarțită în trei straturi (figura 4):
Suprafața care poate fi funcțională;
Învelișul care poate fi adăugat;
Miezul.
La suprafața nanoparticulor create pentru a interacționa cu sistemele biologice pot exista atașate grupări funcționale reactive potrivite pentru această funcție.
În anumite situații, de exemplu in vivo, unele nanoparticule pot forma agregate sau aglomerate. Aglomeratele sunt grupări de nanoparticule legate între ele prin forțe superficiale de adeziune. În cazul formării aglomeratelor, proprietățile lor sunt determinate de dimensiunea, distribuția și forma aglomeratelor și nu de dimensiunea sau forma particulelor individuale.
Este foarte greu de preparat nanoparticule care se suspendă doar în mediul ales, acestea trebuie să aibă un înveliș care să faciliteze dispersia particulei. În unele cazuri aceste învelișuri sunt sub formă de surfactanți care formează interacții Van der Waals tranziente cu suprafață ce sunt în echilibru cu moleculele libere de surfactanți. În alte cazuri o moleculă sau ion este legat de suprafața particulei pentru stabilizarea suspensiei de particule (Oberdörster și colab., 2005).
Aplicații ale nanoparticulelor în medicină
Am putea spune că acest domeniu s-a născut odată cu experimentele lui Albert Einstein, care într-un capitol al lucrării sale de doctorat, a calculat mărimea unei singure molecule de zahăr într-un experiment de difuzie a zahărului în apă. Domeniul este relativ nou și a evoluat o dată cu creșterea necesității de a găsi noi materiale cu biocompatibilitate cât mai mare pentru reducerea intoleranței organismelor vii. Începând cu protezele și aliajele dentare, componente artificiale pentru înlocuirea de părți ale organelor sau chiar integral (rinichi, ficat, piele, componente ale inimii, ochi, etc.) au fost dezvoltate noi materiale cu proprietăți din ce în ce mai sofisticate.
Aria sintezei nanomaterialelor a permis o nouă abordare. Binecunoscute din știința coloizilor, nanomaterialele au surmontat principalul inconvenient și anume că pot fi stabile fără a fi necesare stabilizări în diferite micelii. Nanomaterialele nu sunt altceva decât tot ce cunoaștem ca materiale la scală macroscopică, dar reduse la nivel nanometric ele prezintă ori noi proprietăți, ori cele clasice sunt amplificate.
Dimensiunile lor fiind mai mici sau cumparabile cu cele ale virusurilor, activitatea lor este adeseori implicată datorită mesostructurii și forțelor superficiale total diferite de cele care se întâmplă la dimensiuni normale. Interesul în potențiale aplicații biomedicale ale nanoparticulelor și ale materialelor nanostructurate, provine din percepția că ele sunt capabile să interacționeze cu biomolecule individuale, celule și părțile lor individuale, sau alte structuri biologice. Pe o scală a mărimilor pentru inspecția microscopică se observă că domeniul dimensional al nanoparticulelor acoperă o vastă arie dimensională în scala nanometrilor compatibilă cu microorganismele și virusurile. (Stamatin, 2008)
Livrarea medicamentelor către țesuturile sau celulele-țintă este posibilă prin utilizarea nanoparticulelor special preparate. Etilenglicolul, atașat unor astfel de structuri le face relativ greu de identificat ca străine de către leucocite, astfel încât substanțele terapeutice pe care le vehiculează, se bucură de o remanență crescută în organism. Nanoparticulele “încărcate” cu agenți terapeutici pot fi protejate prin membrane celulare provenite de la elementele circulante pentru a prelungi efectul de la câteva ore la 2-3 zile, iar altele, pot fi făcute să reziste la sucurile digestive, devenind capabile să trimită substanțele active cu care sunt cuplate, direct în circulație, de exemplu pentru subiecții care suferă de belenofobie (teama de ace). Prin tehnici speciale, nanoparticulele sunt condiționate pentru a acționa mai selectiv în anumite circumstanțe terapeutice. Nonostructurile de carbon, cunoscute ca buckyballs, după numele unui joc popular cu magneți, permit capatrea radicalilor liberi generați în cursul reacțiilor antigen-anticorp, cu scopul de a combate inflamația indusă prin mecanisme imunologice. Așa-numitele nanoballs „îmbracă” celulele tumorale, pentru a le face selectiv vulnerabile la iradierea cu lumina infraroșie generată de un laser, în cazul tumorilor viscerale. Nanoparticulele din silicat de aluminiu, extrem de higroscopice, impregnează pansamente capabile să oprească hemoragiile în plăgi prin exicarea acestora. Inhalarea de nanoparticule poate stimula răspunsul imun la nivelul căilor respiratorii. Nanofibrele sunt utilizate pentru a stimula formarea de cartilaj în articulațiile deteriorate.
Quantum dots sau qdots sunt nanoparticule de material semiconductor (selenide sau sulfide de cadmiu sau zinc) cu proprietăți optice și electrice de excepție, care pot fi modulate pentru a obține imagini selective multicolore, capabile să evidențieze detalii ale proceselor biologice și să localizeze tumorile. Nanoparticulele de oxid de fier, cuplate cu peptide, servesc la îmbunătățirea imaginilor obținue prin rezonanță magnetică, iar cele cu aur sau materiale magetice ajută la identificarea cantităților infintezimale ale unor substanțe din produsele biologice supuse analizei de laborator.
Nanotehnologiile antimicrobiene utilizează de obicei particule de argint, oxid nitric sau antibiotice. În prezent sunt în utilizare pansamente, instrumente și cosmetice care încoroprează cu acest scop nanopaticule de argint. Apărarea celulară cu ajutorul nanoroboților (cromalocite), denumită terapie de înlocuire cromozomială, presupune substituirea întregului conținut de cromatină din nucleul unei celule cu un nou set de cromozomi preparați articifical fără defectele celor originali. Multe dintre aceste metode și numeroase altele nemenționate, care au revoluționat medicina sau o vor face în viitor, rămân pentru aplicațiile pe scară largă mai degrabă ca un deziderat decât ca o realizare. (Freitas, 2007).
Nanomedicina exploatează proprietățile fizice, chimice și biologice îmbunătățite și adesea noi ale materialelor la scară nanometrică. Cercetările în acest domeniu permit o intelegere mai aprofundată a funcționării corpului uman la nivel molecular și nanometric oferind posibilitatea prevenirii și diagnosticării timpurie a bolilor, precum și îmbunătățirea metodelor de tratament și monitorizare.
Domeniul bio-nanosistemelor
Bio-nanotehnologia reprezintă un subdomeniu deosebit de complex al nanotehnologiei, implicând utilizarea simultană a cunoștințelor din mai multe arii și discipline științifice, cum ar fi cercetarea din zona medicală și fizică, biologia și matematica sau științele inginerești și imunologia.
Domeniul bio-nanosistemelor este împărțit în șapte direcții de aplicație, după cum urmează:
▪ Medicină
▪ Stomatologie
▪ Medicamente
▪ Cosmetică
▪ Agricultură
▪ Nanosisteme naturale (de ex. lemn, biomasă etc.)
▪ Industrie alimentară (Nann, 2009)
Medicina
Una dintre cele mai importante arii ale bio-nanotehnologiei este nanomedicina, ce se referă la aplicarea nanotehnologiei în domeniul sanătății. Nanomedicina exploatează proprietățile fizice, chimice și biologice îmbunătațite și adesea noi ale materialelor la scară nanometrică.
Cercetările în acest domeniu permit o înțelegere mai aprofundată a funcționării corpului uman la nivel molecular și nanometric și oferă posibilitatea de prevenire și diagnosticare timpurie a bolilor, precum și îmbunătățirea metodelor de tratament și monitorizare.
Astfel, nanomedicina oferă o perspectivă pozitivă pentru găsirea unor tratamente mai
eficiente și mai puțin costisitoare pentru pacienți, având un impact pozitiv la nivelul întregii
societăți prin cresterea caliății vieții și a duratei de viată
Principalele direcții de cercetare din domeniul nanomedicinei, identificate de Platforma Tehnologică Europeană de Nanomedicină, sunt:
1. Diagnosticarea cu ajutorul nanotehnologiilor (inclusiv imagistica medicală);
2. Medicina regenerativă și
3. Administrarea și eliberarea controlată a medicamentelor (nanofarmaceutică și
nanoterapeutică).
Exemple de nanomateriale utilizate în nanomedicină: sisteme nanostructurate de eliberare controlată a medicamentelor, sisteme biocompatibile de înlocuire a părților corpului, precum acoperiri biocompatibile pentru implanturi și nanopolimeri pentru catetere, senzori pentru lab-on-a-chip, materiale pentru regenerarea țesutului și sistemului osos, etc.
Aplicațiile din domeniul medical și științele vieții pot deveni unele dintre cele mai populare și profitabile piețe de desfacere ale nanotehnologiei, de exemplu diagnosticarea și tratarea cancerului. Dispozitivele la scară nano pot interacționa cu biomoleculele și prezintă potențial în detectarea bolilor și furnizarea unor metode noi de tratament.
Stomatologie
Nanomateriale și nanotehnologiile sunt utilizate în stomatologie pentru diagnosticarea, tratarea și prevenirea bolilor dentare și pentru menținerea sănătății dinților. Domeniile de interes ale stomatologiei ce implică nanotehnologia pornesc de la dezvoltarea danturii (noi metode biomimetice avansate de reparare și regenerare), reconstrucția țesuturilor periodentale (biomembrane resorbabile pentru regenerarea direcționată a țesuturilor), tratamentul cariilor dentare (remineralizarea biomimetică pentru repararea danturii afectate), până la implanturile dentare.
Medicamente
Cercetarea medicamentelor și impactul acestora în medicină și farmacie se află la un punct de cotitură: direcția de dezvoltare a domeniului terapiei medicamentoase a fost axată până în acest moment pe stabilirea proporției optime a substanțelor active în medicamentul încapsulat, urmarea fiind îmbunătățirea acțiunii medicamentelor asupra pacienților. O alternativă o reprezintă dezvoltarea de noi dispozitive pentru eliberarea controlată a medicamentelor pe zone restrânse, în vecinătatea organelor afectate, evitându-se astfel efectul toxic al acestora asupra întregului organism.
Introducerea nanotehnologiei în domeniul farmaceutic a revoluționat acest domeniu prin dezvoltarea unor noi tratamente ce folosesc nanodispozitive pentru obținerea unui control în administrarea și respectiv eliberarea medicamentelor în organism. O abordare complementară este optimizarea transferului de medicamente, îmbunătățirea absorției medicamentelor, prin compartimentarea și protejarea lor împotriva degradării, dar și includerea unui sistem de monitorizare în timp real, pentru a permite captarea și transmiterea informațiilor, realizându-se astfel o conectare la realizările din domeniul electronic.
Cosmetica
Industria cosmeticelor exploatează proprietățile chimice și biologice îmbunătățite ale materialelor la scară nanometrică precum particulele de minerale, folosite pentru proprietățile lor optice în domeniul vizibil sau pentru compușii organici folosiți pentru modificarea suprafeței pigmenților anorganici.
Noile directți de cercetare se axează pe îmbunătățirea proprietăților fizico-senzitive, precum texturi unice, transparență, eliberarea controlată a ingredienților activi, optimizarea dimensiunilor particulelor și a morfologiei în cazul materialelor folosite în produsele de pigmentare și dezvoltarea de noi materiale ce își modifică proprietățile sub acțiunea stimulilor externi precum temperatura, lumina, câmpurile magnetice, etc.
Agricultura
Domeniul agricol reprezintă un alt domeniu de interes pentru nanotehnologie, prin dezvoltarea de pesticide la scară nanometrică ce pot fi ușor absorbite de către plante și pot avea o eliberare controlată, de asemenea prin dezvoltarea de nanosenzori dedicați monitorizării culturilor sau ale fermelor de animale (agrosenzorii), prin studiul nanoparticulelor metalice pentru decontaminarea solului (filtre la scară nanometrică pentru reducerea poluării) și îmbunătățirea calității culturii. Astfel, se pot constitui în direcții importante de cercetare dezvoltarea de pesticide la scară nanometrică, dar și de metode noi de decontaminare utilizând nanomaterialele.
Industria alimentară
În industria alimentară, nanotehnologia contribuie prin generarea de instrumente ce pot măsura nivelul de contaminare al alimentelor sau prezența patogenilor (toxicitatea), încapsularea aromelor și vitaminelor (pentru utilizarea în industria farmaceutică în cazul livrării controlate de medicamente în tractul digestiv), procesarea alimentelor (a acizilor grași, biofermentarea), rehidratarea alimentelor sau modificarea alimentelor deja existente pentru a oferi o alimentație alternativă (alimentația bazată pe derivați din proteinele vegetale).
Nanosisteme naturale (de ex. lemn, biomasa etc.)
Un alt domeniu de interes îl constituie dezvoltarea de nanosisteme naturale prin utilizarea materialelor naturale (biomaterialele, lemnul etc.) în industria alimentară, textilă, farmaceutică, de prelucrare a lemnului. Direcțiile de cercetare în cazul nanosistemelor naturale se axează pe dezvltarea de noi biomateriale nanostructurate obținute în urma autoasamblării moleculelor naturale pentru aplicațiile medicale (nanoparticule biodegradabile, nanoparticule pentru eliberarea controlată a medicamentelor), pe nano-biosenzori, nano-sisteme electromecanice, nano-roboți, folosirea de biomaterialele etc. (Van de Voorde și colab., 2009)
Transportul țintit de medicamente
Transportul țintit de medicamente s-a dezvoltat inițial în jurul chimioterapiei cancerului. Primul sistem de transport medicamentos la scară nano a fost realizat cu micelii lipidice descrise prima dată în 1960, primind apoi numele de lipozomi. În 1976 Langer și Folkman au demonstrat pentru prima dată eliberarea controlată de medicament din nanoparticule pentru ca în 1980 Leserman ș.a. să creeze primii lipozomi țintiți. Pe lângă lipozomi, mulți autori, printre care Pridgen în 2007, au studiat utilizarea ca și sisteme de transport a nanoparticulelor polimerice, a 4 dendrimeri, a conjugaților polimerici, a transportorilor proteici sau a nanoparticulelor anorganice. Sistemele de transport țintit al medicamentelor pot fi controlate astfel încât livrarea să se facă doar la nivelul regiunii de interes fără a afecta țesuturile sănătoase. Înfluențarea transportului de medicament în scopul eradicării tumorii se poate realiza prin aplicarea unui câmp magnetic. În cadrul terapiei magnetice țintite, medicamentul citotoxic este atașat unei nanoparticule magnetice purtătoare biocompatibile. Aceste tipuri de complexe (ferofluid biocompatibil) sunt injectate în pacient prin sistemul circulator. După injectarea particulelor, se folosesc gradienți de câmp magnetic externi pentru a concentra complexul format în zona de interes. În urma aplicării câmpului magnetic, vasul de sânge va avea un răspuns paramagnetic cauzat, cel mai probabil, de hemoglobină. În același timp se va înregistra și un răspuns diamagnetic deoarece proteinele din sânge conțin atomi de carbon, hidrogen, oxigen dar și azot. Aceste două răspunsuri vor fi mult mai mici comparativ cu răspunsul nanoparticulelor magnetice. În ceea ce privește tipul câmpului magnetic optim pentru acest tip de aplicație, s-a ajuns la concluzia ca un gradient de câmp magnetic asigură forța necesară pentru a conduce particulele în zona de interes. Eficacitatea acestei terapii depinde de anumiți parametri fizici cum ar fi, intensitatea câmpului sau proprietățile magnetice ale particulelor cât și parametrii hidrodinamici și fiziologici (concentrația de ferofluid utilizată, calea de administrare, ș.a). (Cojocariu și colab., 2013)
Nanoparticulele de aur în biomedicină
În ultimele decenii, domeniul AuNPs (Au Nanoparticles) a cunoscut o dezvoltare semnificativă. Acestea s-au dovedit a fi folositoare în numeroase aplicații biomedicale cum ar fi livrarea controlată a medicamentelor, detecție, imagistică biomedicală, biosenzoristică, diagnostic clinic sau terapia cancerului. AuNPs reprezintă a alegere convenabilă pentru efectuarea de teste biologice datorită dimensiunilor reduse, stabilității termice si chimice, simplității metodelor de sinteză cu un grad redus de toxicitate, precum și posibilității de a fi ulterior funcționalizate cu molecule de interes biologic. (Găbudean și colab., 2012)
Nanofibrile și nanoparticule de carbon
Sunt existente in mediul înconjurător, datorită emanațiilor de gaze incomplet arse. Acestea pot fi inhalate ajungând astfel localizate in diferite organe dar cel mai adesea în circuitul sanguin, unde cu glucoza, hemul și alți mediatori împreună cu microorganisme patogene, pot forma adevărate celule miniaturizate bioelectrochimice, ce pot produce electricitate, iar ca produși pot varia de la cei inofensivi (ex. CO2) la gaze combustibile, uneori accelerând formarea toxinelor. Astăzi, există largi studii de a crea miniroboți ce folosesc substanțele din circuitul metabolic ce produc electricitate și energia necesară pentru a transporta medicamantele la o țintă precizată. Ansamblul gastrorobot – medicament învelit în filme inteligente cu recunoaștere molculară a celulolor bolnave este intens studiat ca domeniu specific de „drug delivery” (transoprt inteligent de medicamente). Structura și activitatea specifică a nanoparticulelor de carbon rezultate din sinteză prin piroliză laser, a arătat că în anumite situații pot accelera transportul de oxigen spre microorganismele aerobe jucând rol de „pompe de oxigen”.
Nanobiocompozite
Dacă matricea conține materiale biologice sau biocompatibile ele capată denumirea generică de nanobiocompozite. Orice tip de materie de la gel până la polimeri sau alte solide care conțin materiale nanometrice dispersate, funcționalizate, legate chimic, etc., formează clasa nanocompozitelor (dispersiile lichide, coloizii sunt clase distincte). S-a constatat că o combinație de creșteri pe medii de cultură pe bază de nanocarboni și transferul acestora într-o celulă de biocombustie, cu electrozi pe bază de nanotuburi de carbon, se pot identifica tipurile de microorganisme datorită specificității lor în mecanismele de transfer de electroni.
Puncte cuantice (Q-dots)
Punctele cuantice sunt nanocristale ce au proprietatea de luminofori sau de coloranți lumineșcenți sub acțiunea radiației de la albastru spre ultraviolet. Diferențele sunt majore față de luminoforii și coloranții clasici biotinilați sau nu. Q-doturile au o emisie specifică, pe o anumită lungime de undă cu persistență îndelungată. Biotinilatele devin biocompatibile, putându-se atașa pe diferite structuri biologice, având capacitatea de indexare și identificare respectiv secvențiere. Punctele cuantice se utilizează în investigarea unor tipuri de preparate biologice, țintind spre analiza elementelor componente ale sângelui și a naturii paraziților.
Nanotuburi de carbon
Nanotuburile de Carbon (Fig.6) și microscopia de forțe atomice pot fi considerate promotorii nanotehnologiei. Posibilitatea funcționalizării lor a deschis calea spre noi funcții specifice conexiunii spre nanobiotehnologie și spre materialele avansate, econanotehnologie.
Nanotuburile de Carbon (CNT-carbon nanotubes) pot avea proprietăți metalice comparabile mai bune decât ale cuprului sau pot fi semiconductori, ca siliciul în tranzistori, totul depinzând de structura lor. CNT-urile au un potențial ridicat pentru aplicațiile posibile in ramura energiei. Totuși, datorită insolubilității nanotuburilor în solvenți, chimici, biochimici, și biologici, folosirea acestor materiale a fost mai degrabă limitată. CNT-urile solubile în apă și solvenții organici reprezintă un interes din moment ce pot deschide noi abordări în dezvoltarea de nanocompozite, nanosenzori și electronică moleculară. (Stamatin, 2008)
Preluarea și distribuția nanoparticulelor în organism
Deși s-a demonstrat că o serie de nanoparticule sunt toxice, se cunoaște foarte puțin despre mecanism. O serie de lucrări recente tratează despre acumularea nanoparticulelor în celule prokariotice si eukariotice precum si despre toxicitatea diferitelor tipuri de nanoparticule. Primul forum dedicat toxicității si determinării riscurilor asociate cu utilizarea nanoparticulelor a avut loc în 2007, la Stockolm, Suedia. Recent, grupuri de cercetare au fost implicate în cercetări privind interacția nanoparticulelor, cum ar fi nanotuburile de carbon cu celulele. Totuși, s-a acordat puțină atenție toxicității nanoparticulelor pe bază de metale grele și oxizi ai acestora. În încercarea de a întelege toxicitatea nanomaterialelor obținute pe cale sintetică, este necesară considerarea efectelor asupra celulelor și implicit a efectelor sistemice asupra întregului organism.
Nanoparticulele pătrund în organismul uman în primul rând prin inhalare sau prin contactul cu pielea și în al doilea rând prin injectare sau ingestie, dacă nanoparticulele sunt prezente în medicamente sau mâncare. (Weissleder și colab., 2005)
Distribuția nanoparticulelor de siliciu în organe (in vivo)
Biodistribuția nanoparticulelor de siliciu marcate fluoreșcent, a fost analizată într-un stiudiu in vivo pe șoareci și ex vivo asupra țesuturilor excizate folosind sistemul de imagistică IVIS 200. La 28 de zile după administrarea nanoparticulelor de siliciu de 70 nm, la șoareci, acestea au fost detectate la nivelul pielii, ganglionilor limfatici, hepatocitelor parenchimale, cortexului cerebral și hipocampusului. În hepatocite, nanoparticulele de siliciu au fost distribuite în toată citoplasma, în interiorul nucleului și mitocondriei. Nanoparticulele de siliciu de 20-25 nm în diametru, marcate cu fluorochrom și cu iod 124 radioactiv, pentru obținerea de imagini PET și optice, au fost folosite pentru a evalua distribuția in vivo la șoareci. S-a constatat că 75% din nanoparticulele de siliciu erau acumulate în ficat și splină, în timp ce în plamân, inimă și rinichi, sub 5%. Studiile clearance efectuate pe o perioadă de 15 zile au indicat excreția naoparticulelor pe cale hepatobiliară. Lipsa de orice efect advers sau de orice alte anomalii, a fost controlată prin metode de analiză histologică.
Timpul de eliminare și nivelul de acumulare în organe a nanoparticulelor de siliciu, depind de modificarea suprafeței chimice. Astfel, biodistribuția a 3 tipuri de suprafețe modificate de 45 nm ale unor nanoparticule de siliciu ( OH- nanoparticule de siliciu, COOH – nanoparticule de siliciu și PEG – nanoparticule de siliciu) a fost investigată cu ajutorul unui sistem de urmărire fluoreșcentă a imaginii. Acest studiu a arătat că, după administrarea intravenoasă la șoareci, nanoparticulele de siliciu PEG au avut perioade relativ lungi de circulație sanguină și o asimilare scazută, în cadrul sistemului reticulo-endotelial decât nanopaticulele de siliciu OH și COOH. Nanoparticulele de siliciu de 70 nm modificate cu amine și grupări carboxil, sau nemodificate, au fost folosite pentru a testa toxicitatea celulară. Nanoparticulele nemodificate au o localizare nucleară în timp ce nanoparticulele modificate nu.
Diferite doze de nanoparticule de siliciu mezoporoase (NSM), variind de la 10 mg·kg-1 la 200 mg·kg-1 au fost injectate intravenos la șoareci o dată pe zi timp de 10 zile. Analizele serologie din probe de sânge și imagistica fluoreșcentă a țesuturilor de șoarece (ficat, rinichi, plămâni, inimă, intestin, stomac, mezenter și splină) au arătat o bună toleranță. Efectul de încărcare de suprafață în asimilarea nanoparticulelor de siliciu mezoporoase, a fost de asemenea analizat în celulele 3T3-L1 și în celulele stem mezenhimale umane, fară evidențierea modificărilor de viabilitate, proliferare, sau diferențiere a celulelor tratate. (Parcellier și colab., 2003)
Distribuția nanoparticulelor în țesutul tumoral
Au fost efectuate studii de biodistribuție utilizând celule cancerigene ale sânilor umani MCF-7 cu xenogrefe in vivo și cu microscopie de imagistică fluoreșcentă, precum și cu spectroscopia de masă, cu plasmă cuplată inductiv. NSM-urile sunt acumulate preferențial în tumori. Intensitatea nanoparticulelor fluoreșcente a fost mai mare în tumori decât în alte țesuturi și mai mare la 4 ore decât la 24 de ore. Funcționalizarea este importantă pentru a viza o anumită celulă. MSN-urile funcționalizate cu acid folic întră exclusiv în celulele care exprimă receptor pentru acid folic. În 2 linii diferite de celule pancreatice canceroase umane (PANC-1 și MIAPaCa-2) xenografiate la șoareci, cercetătorii au observat supresia efectelor tumorale cu nanoparticule de siliciu, conjugate concomitent cu camptotecină și acid folic. Măsuri ale concentrației nanoparticulelor de siliciu în urină determinate de spectometria cu emisie optică cu plasmă cuplată inductiv (ICP-OES) au arătat că majoritatea nanoparticulelor au fost excretate în termen de 4 zile. (Leboeuf, 2012)
Căile de expunere ale nanoparticulelor în cadrul locului de muncă
Referindu-ne la expunerea la nanoparticule, lucrătorii din construcții vor fi în primul rând (aproape fără excepție) expuși la nanoproduse. Acest fapt se reflectă în expunerea efectivă a lucrătorului la nanoparticulele din produsul respectiv. De exemplu, atunci când un muncitor inhalează praf care conține nanoparticule, dozele efective de nanoparticule la care este expus muncitorul depind de solubilitatea prafului. Dacă praful este insolubil, o parte din nanoparticule vor rămâne încorporate în matrice și se va produce doar expunerea la acele nanoparticule expuse la suprafața firului de praf. Totuși, dacă praful este solubil, se va produce expunerea la întregul număr de nanoparticule, conținute de firul de praf.
Datorită înseși naturii activităților zilnice efectuate de lucrătorii din construcții și a produselor cu care aceștia lucrează în mod normal, expunerea prin inhalarea de nanomaterial care produce praf (rezultat în urma tăierii, șablării, excavării sau prelucrării) sau de aerosoli proveniți din pulverizarea vopselurilor sunt cauzele predominante asociate cu riscurile pentru sănătate. Penetrarea pielii poate de asemenea juca un rol (deși mult mai mic) și poate deveni problematică atunci când părți mai mari ale corpului sunt neacoperite. Expunerea prin ingerare primară nu este de așteptat să devină o problemă atâta vreme cât igiena personală este respectată. Expunerea prin ingerare secundară (produsă în urma inhalării de nanomateriale datorită mecanismelor naturale de curățare a căilor respiratorii) prezintă totuși un risc atunci când are loc inhalarea. (Broekhuizen et al., 2009)
Expunerea prin inhalare
Ca regulă generală cu privire la inhalarea prafului și aerosolilor: cu cât particulele sunt mai mici, cu atât mai adânc pot penetra plămânii până când se depun, și cu atât mai grav poate fi efectul lor asupra sănătății. Printre efectele tipice asupra sănătății care au fost observate menționăm:
– Inflamarea căilor respiratorii;
– Bronșite;
– Astm;
– Efecte cardiovasculare;
– Silicoză.
Oricum, pentru nanoparticule, această regulă generală nu mai este valabilă și o parte importantă a nanoparticulelor inhalate se depozitează în nas. În ceea ce privește transportarea ulterioară în corp, s-a observat că unele dintre aceste nanoparticule se transmit către sistemul nervos, țesuturile creierului și alte organe cum ar fi sângele, inima, ficatul și măduva osoasă, unde pot cauza efecte inflamatorii care pot conduce la o cascadă de efecte secundare asupra sănătății (Oberdorster et al. 2004), cum ar fi iritații, inflamații, moartea celulelor, creșterea extraordinară a celulelor, deteriorarea ADN-ului și modificări hormonale (Donaldson et al., 1996).
Capitolul II
Efectul citotoxic și modificările induse la nivel celular
Toxicitatea asociată nanoparticulelor
Generalitați
Deși s-a demonstrat că o serie de nanoparticule sunt toxice, se cunoaște foarte puțin despre mecanism. Primul forum dedicat toxicității și determinării riscurilor asociate cu utilizarea nanoparticulelor a avut loc în 2007, la Stockholm, Suedia. Recent, grupuri de cercetare au fost implicate în cercetări privind interacția nanoparticulelor, cum ar fi nanotuburile de carbon cu celulele.
Totuși, s-a acordat puțină atenție toxicității nanoparticulelor pe baza metalelor grele și oxizii acestora. În încercarea de a înțelege toxicitatea nanomaterialelor obținute pe cale sintetică este necesară considerarea efectelor asupra celulelor și implicit a efectelor sistemice asupra întregului organism.
Nanoparticulele pătrund în organismul uman în primul rând prin inhalare sau prin contactul direct cu pielea și în al doilea rând prin injectare sau ingestie, dacă nanoparticulele sunt prezente în medicamente sau mâncare.
Unul dintre efectele dăunatoare ale nanoparticulelor pentru oameni a fost prezentat în 1997 de cercetătorii britanici care au arătat că nanoparticulele de dioxid de titan/oxid de zinc din ecranele solare, duc la formarea radicalilor liberi în celulele pielii si astfel distrug ADN, ceea ce ulterior poate conduce la mutații care ulterior produc modificări ale structurii și funcției proteinelor. Acest lucru poate favoriza dezvoltarea tumorilor și cancerului.
Agenția pentru Protecția Mediului din SUA a descoperit că nanoparticulele de dioxid de titan prezente în ecranele solare pot provoca distrugera creierului la șoareci. Grupul profesorului Shunho Jin de la Universitatea California, San Diego, USA, a demonstrat că în prezența nanoparticulelor magnetice, atăt timp cât sunt mai mici de 10 nm, celulele neuronale înceteaza să raspundă la semnale chimice și în loc de semnale traducătoare, ele intră în stare latentă. Experimente la nivele de laborator au arătat că fulerenele pot omorî culturile celulare de ficat, piele și creier.
Un important aspect ce este luat în considerare în nanotoxicologie, este validarea biocompatibilității nanoparticulelor.
Au fost identificate trei cauze principale ale toxicității nanoparticulelor în contact cu celulele vii:
– datorită toxicității chimice a materiilor prime din care sunt fabricate;
– datorită dimensiunilor lor mici pot pătrunde în membrana celulară și în celulă;
– datorrită formei (de ex: nanotuburile de carbon pot pătrunde ușor în membrana celulară);
– modificările suprafeței pot de asemenea afecta agregarea și aglomerarea nanoparticulelor cu efect asupra toxiciății si comportării în mediu.
In conformitate cu estimările realizate la nivelul anului 2008 numărul de produse de consum de pe piață, care conțin nanoparticule sau nanofibre depășește 800 și continuă să crească (Project on Emerging Nanotechnologies, 2008). În conformitate cu “The Nanotechnology Consumer Products Inventory” – 2006, cel mai comun material menționat în descrierea produselor a fost carbonul (29 de produse care includ fulerene și nanotuburi); argintul a fost al doilea (25 produse) urmat de dioxidul de siliciu (14), dioxidul de titan (8), oxidul de zinc (8) oxidul de ceriu (1). Producția curentă de nano TiO2 este de 5000 t/a, pentru nano Ag 500 t/a, și pentru nanotuburi de carbon 350 t/a. În SUA s-a reportat în anul 2005 o producție de dioxid de titan de aproximativ 2 milioane de tone și trecerea întregii producții de la dioxid de titan bulk la dioxid de titan nano până în 2025. Datorită creșterii producției de nanoparticule sintetice, expunerea publicului la nanoparticule va crește dramatic în egală masură cu eliminarea lor în mediu. (Ostiguy, 2006)
Nanotehnologia este încă o tehnologie nouă, într-o continuă formare, motiv pentru care există numeroase controverse cu privire la posibilele efecte adverse derivate din utilizarea particulelor la scala nanometrică.
Potențialul toxicologic al nanoparticulelor este în opoziție cu posibilele aplicații ale nanoparticulelor sintetizate în cadrul tehnologiei, dar și medicinei si farmaceuticei. Din acest motiv este deosebit de importantă cunoașterea căilor de intrare a nanoparticulelor în organism și mecanismele moleculare ale citotoxicitații induse de acestea.
Nanoparticulele pot ajunge în organism pe trei căi: prin tegument, prin căile respiratorii și prin tractul gastrointestinal.
Odată intrate în organism pot trece, datorită dimensiunii mici, direct în celule sau se pot transloca la nivelul altor țesuturi (Mühlfeld și colab., 2008), unde se pot depozita, cauzând ulterior efecte biologice adverse (figura 6) prin modificarea proprietăților fizico-chimice ale structurilor vii. Astfel, studiile epidemiologice indică faptul că poluarea cu nanoparticule din mediu este asociată nu doar cu boli respiratorii, ci și cu efecte adverse cardiovasculare.
Nanoparticule inhalate pot ajunge de la nivelul epiteliului nazal chiar și la nivelul sistemului nervos central (Oberdörster și colab., 2005) pe calea nervului olfactiv, după cum s-a observat în cazul animalelor expuse la oxid de mangan (Elder și colab., 2006) și argint.
Epiteliul pulmonar se află în contact direct cu mediul, motiv pentru care este calea cea mai accesibilă intrarii în organism a poluanților din atmosferă, a microorganismelor și a virusurilor. La nivelul alveolelor pulmonare, după contactul cu surfactantul pulmonar, nanoparticulele se deplasează catre hipofaza pulmonară unde pot interacționa cu proteinele surfactante și cu glicoproteinele, sau sunt preluate de macrofagele alveolare. Studii recente arată că nanoparticulele interferă cu metabolismul macrofagelor determinând creșterea peroxidării lipidice și ineficientizează inactivarea bacteriilor (Mühlfeld și colab.., 2008). Nanoparticulele de aur sechestrează surfactanții pulmonari putând să interfere cu funcțiile normale ale alveolelor. Nanoparticulele nu sunt fagocitate de către macrofagele alveolare într-o manieră la fel de eficientă precum particulele cu dimensiuni mai mari de 100 nm. Probabil că nanoparticulele devin inaccesibile sistemului imunitar prin legarea la proteinele de la suprafața epiteliului, prin preluarea lor de către celulele epiteliale sau translocarea prin epiteliul alveolar. Calea pe care o urmează nanoparticulele care nu sunt preluate de macrofage este încă incertă. Există studii in vivo care arată că, după inhalarea nanoparticulelor de TiO2, un procent semnificativ din acestea se găsesc localizate în spațiul interstițial pulmonar (Oberdörster și colab., 1994) sau pot penetra endoteliul capilar pentru a ajunge în circulația sangvină.
Răspunsuri celulare și moleculare la tratamentul cu nanoparticule
Au fost descrise trei tipuri principale de răspuns celular la expunerea nanoparticulelor:
generarea de specii reactive de oxigen (ROS) și de azot (RNS),
eliberarea proteinelor asociate inflamației, proinflamatorii,
alterarea/deteriorarea ADN.
Inducerea spontană de ROS de către nanoparticule, este un eveniment cheie în inducerea răspunsurilor celulare toxicologice. Un efect direct a fost sugerat de constatarea că ROS generate nonenzimatic, apar în extractele celulare după adiția nanoparticulelor de negru de fum (Wilson și colab., 2002). La fel, TiO2 poate genera în mod spontan ROS în medii acelulare, sub acțiunea razelor UV. În special nanoparticulele provenite din combustie conțin metale de tranziție și compuși organici, iar eliberarea lor de la suprafața particulei generează ROS prin reacții de tip Fenton, respectiv reacții redox ciclice (Xia și colab., 2004). Există studii în care s-a utilizat tratamentul celulelor cu N-acetilcisteină, și s-a constat că acesta suprimă formarea de H2O2 în prezența nanoparticulelor, acționând ca un scavenger pentru radicalii liberi (Xia și colab., 2006).
La nivelul nucleului și mitocondriei au fost localizate diferite tipuri de nanoparticule: nanoparticule din mediul ambiant, SiO2, dar și particule ultrafine de TiO2 generate prin scânteie.
Acest tip de interacție se pare că nu este obigatoriu, Singh arătând că nanoparticulele de TiO2 sunt endocitate de către celulele epiteliale pulmonare umane prin intermediul veziculelor tapetate cu clatrină, ele nefiind observate la nivelul structurilor subcelulare (Singh și colab., 2007)
Interacția directă a nanoparticulelor cu structurile subcelulare puternic implicate în reacțiile redox, precum membrana plasmatică, mitocondria, sau reticulul endoplasmatic (RE) determină creșterea producerii de ROS. Tehnica prin care se monitorizează de obicei producerea speciilor reactive de oxigen utilizează 2’,7’-diclorofluorescin diacetat (DCF), intensitatea fluoreșcenței fiind proporțională cu cantitatea de specii reactive de oxigen formate intracelular (Poma, Di Giorgio, 2008).
Răspunsul la ROS constă în inițierea apoptozei, deoarece scade potențialul membranar mitocondrial și crește producerea de anioni superoxid, consecința fiind eliberarea citocromului c. Interacția nanoparticulelor cu membrana RE conduce la pierderea reactivității membranare, o consecință foarte gravă fiind dereglarea homeostaziei Ca2+.
ROS poate afecta în mod direct integritatea moleculelor, conducând la pierderea funcționalitații proteinelor citoscheletului și a enzimelor, sau determină mutații ale ADN.
Radicalii liberi pot determina peroxidarea lipidelor prin reacția cu acizii grași polinesaturați din fosfolipidele membranare. Malondialdehida care rezultă din aceste interacții se folosește ca indicator al peroxidării lipidice (Marquis și colab., 2009). Stresul oxidativ poate modifica și structura aminoacizilor din proteine sau determina creșterea nivelului produșilor de oxidare avansată a proteinelor (Witko-Sarat și colab., 1996), ceea ce afectează adeziunea celulelor, cu implicații în procesul de ateroscleroză (Liu și colab., 2006). Modificările oxidative determină alterarea funcțiilor proteinelor și creșterea susceptibilității acestora la atacul proteazelor, iar în stadii avansate la fragmentarea chimică (Droge W, 2002).
În mod indirect, ROS pot acționa prin căi de semnalizare sensibile la modificarea echilibrului redox. Într-un studiu uman in vivo realizat la nivelul epiteliului bronhial s-a arătat că particulele provenite din gazele de eșapament determină producerea citokinelor proinflamatorii prin activarea factorului de transcripție nuclear NF-kB, a proteinei activatoare-1 (AP-1) și a cascadei de semnalizare a MAP kinazei, prin p38 și JNK (Pourazar și colab., 2005).
În stare inactivă NF-kB se găsește sechestrat în citoplasmă în asociere cu proteina inhibitoare IkB, iar activarea și translocarea sa sunt inițiate după ce IkB este fosforilat și degradat prin sistemul ubiquitină-proteasom (Fan și colab., 2001). S-a arătat că activarea NF-kB este reglată nu doar de ROS, ci și de concentrația de Ca2+ intracelular, proces important la nivelul macrofagelor alveolare expuse la nanoparticule. În acest caz, verapamilul, un blocant al canalelor de Ca2+, a inhibat translocarea NF-kB în nucleu și legarea AP-1 la ADN, ceea ce demonstreaza implicarea Ca2+ în activarea și translocarea subunitaților p50 și p65 ale NF-kB și a proteinei AP-1 (Brown și colab., 2004).
Un alt studiu arată că nanoparticulele de carbon induc o creștere a expresiei genice și proteice în cazul interleukinei IL-8. La acest nivel, expunerea la nanoparticule nu induce activarea NF-kB în cultura primară de celulele epiteliale bronhiale deoarece nu se produce degradarea IkB și nici complexarea ADN. Se pare deci că expresia IL-8 este indusă prin altă cale de semnalizare, probabil prin activarea AP-1 (Kim și colab., 2004).
Foarte multe cercetări, se axează în momentul de fată pe studiul potențialului toxicologic al QDs, însa nu s-au elucidat pe deplin efectele pe care acestea le au la nivelul celulelor.
Citotoxicitatea QDs este dependentă de un numar mare de factori incluzând dimensiunea nanoparticulelor, compozitia acestora și concentrația utilizată precum și compoziția suprafeței active, tipul de încapsulare și parametrii de procesare implicați în sinteza acestor nanoparticule.
Au fost descrise o serie de mecanisme ca fiind responsabile de inducerea citotoxicității QDs, în special prin inducerea stresului oxidativ. De exemplu, QDs pe bază de CdSe induc producerea radicalilor liberi precum și apoptoza celulelor tratate, printr-o cale dependentă de caspaze. Citotoxicitatea în acest context a fost corelată cu eliberarea ionilor Cd2+ din rețeaua de nanoparticule. Efectele citotoxice au fost reduse semnificativ prin adiția unui înveliș de ZnS sau SiO2 (Derfus și colab., 2004). De exemplu, tratamentul celulelor derivate din neuroblastom cu QDs pe bază de CdSe/ZnS nu are efect asupra viabilității celulare, și nici nu generează ROS, în timp ce tratamentul cu CdSe scade viabilitatea cu aproximativ 50% (Chan și colab., 2006). Din același studiu reiese faptul că CdSe induce citotoxicitatea stimulând activarea caspazei-3, caspazei 9 și a proteinei JNK (c-Jun N-terminal kinaza), și în același timp induce scăderea potențialului membranar la nivelul mitocondriei și eliberarea citocromului c. Toate aceste proteine proapoptotice nu au fost activate în cazul QDs cu înveliș de ZnS.
Interacția nanomaterialelor cu microorganismele reprezintă un alt aspect de interes major, având în vedere efectele detrimentale ale utilizarii materialelor nanostructurate în aplicațiile medicale (Moreau și colab., 2007). De exemplu, bacteriile din genul Mycoplasma reprezintă o problemă pentru culturile celulare și pot forma ușor nanobiocompozite, determinând obținerea unor răspunsuri celulare diferite și rezultate citotoxicologice eronate (Suh și colab., 2009).
Deși potențialul toxicologic crescut datorat proprietăților unice ale nanomaterialelor este atestat de un numar tot mai mare de studii, mecanismele prin care acestea acționează la nivelul celulelor nu sunt pe deplin elucidate, în literatura de specialitate existând date contradictorii. Sunt necesare multe alte studii, în special in vivo, pentru ca nanoparticulele să poată fi aplicate la scară largă.
TOXICITATEA ASOCIATĂ NANOPARTICULELOR PE BAZĂ DE SILICIU
Siliciul și dioxidul de siliciu (SiO2)
Siliciul a fost prima dată identificat de Antoine Lavoisier în anul 1787.
Siliciul are următoarele caracteristici:
• Simbol chimic: Si
• Număr atomic: 14
• Masă atomică: 28.08 g/mol
• Densitate (la 20 °C): 2,33 g/cm3 , (puțin inferioară titanului)
• Electronegativitate (pe scala Pauling): 1.9
• Punct de topire: 1.414 °C
• Punct de fierbere: 3.265 °C
• Stare: solidă
• Culoare: gri deschis
Ca răspândire, după oxigen, siliciul este cel mai abundent element din natură, alcatuiește 25,7 % din scoarța terestră și se întalnește cel mai adesea sub formă de SiO2 (Fig. 7) sau silicați. Dioxidul de siliciu se gasește atât în stare pură, cât și ca o componentă a multor roci. Există în trei forme cristaline polimorfe care se transformă extrem de greu dintr-una într-alta (cuarț, tridimită și cristalobalită), precum și în diferite forme amorfe sau microcristaline.
Siliciul este un semiconductor; conductibilitatea electică, foarte mică la Si pur, crește cu temperatura și cu conținutul în impurități. Atomul de Si, spre deosebire de atomul de carbon, poate folosi orbitalii d, care contribuie la formarea orbitalilor hibrizi (SiF5- folosește orbitalii sp3d pentru cele 5 legături Si-F, iar SiF6- folosește orbitalii sp3d2 pentru cele 6 legături Si-F). Tendința de a forma catene prin legături covalente, este foarte mică la Si. Silanii (SinH2n+2) reacționează rapid cu oxigenul deoarece legăturile Si-O sunt mai stabile decât cele Si-Si. Totuși, în absența aerului, au fost sintetizate câteva tipuri de compuși care conțin legături de Si simple sau duble. Deși Si poate avea numărul de coordinare între 3 și 6, în cei mai mulți compuși Si este coordinat tetraedric.
Dioxidul de siliciu este un polimer, (SiO2)n, cu o rețea tridimensională infinită, unde, la fel ca în toți silicații, fiecare atom de Si este legat tetraedric de patru atomi O (Wai-kee Li și colab., 2008).
SiO2 poate forma conglomerate de diverse forme, numite flori ale deșertului.
Silicații sunt săruri ale acidului silicic. Siliciul stabilește legături și cu alte elemente ca aluminiul, formând aluminosilicați (de exemplu: feldspat, mică, zeoliți etc.) și borul (borosilicați).
Siliciul nu conduce curentul electric deoarece nu are electroni liberi în rețea. Prin încălzire sau prin bombardare cu particule (neutroni, protoni), el devine bun conducător de electricitate.
Siliciul amorf este mai reactiv decât cel cristalizat, fiind mai fin divizat. Siliciul este un element stabil, puțin reactiv la temperatură joasă:
reacționează numai în condiții de lucru energice;
nu reacționează cu oxigenul din aer la temperatura obișnuită dar la temperatura ridicată formează SiO2, care acoperă cu un strat protector suprafața siliciului;
la temperatura obișnuită reacționează cu fluorul formând terafluorura de siliciu (SiF4);
la temperatură ridicată reacționează cu clorul formând tetraclorura de siliciu, SiCl4, și cu azotul, formând azotura de siliciu;
nu reacționează cu acizii tari, precum acidul azotic, clorhidric și sulfuric;
reacționează cu hidroxidul de sodiu conducând la silicat de sodiu, Na2SiO3.
Siliciul are numeroase întrebuințări în domenii foarte diferite, de exemplu la obținerea unor oțeluri: oțel obișnuit, oțel-siliciu folosit în transformatoarele electrice, fierul dur, rezistent la coroziune, din care se fabrică echipamentele industriale ce vin în contact cu substanțele chimice corozive.
Siliciul, fiind un semiconductor, stă la baza numeroaselor aplicații în domeniul tranzistorilor, circuitelor integrate folosite în industria electronică și pentru microcipuri.
Dioxidul de siliciu și silicații sunt folosiți în industria sticlei, a cimentului, a porțelanurilor.
Studii referitoare la citotoxicitatea nanoparticulelor pe bază de siliciu
Aspecte generale
Nanoparticulele de SiO2 pot fi ușor eliberate din materialele nanocompozite în aer datorită densitații foarte joase. De exemplu, un studiu tribologic (Devaprakasam și colab., 2008) arată faptul că SiO2 poate fi eliberat gradual din nanocompozite datorită forței de frecare. În același mod nanoparticulele de SiO2 folosite la tratamentul anvelopelor sunt eliberate prin interacția cu asfaltul.
Expunerea excesivă la siliciul cristalin este corelată cu afecțiuni pulmonare, precum silicoza, tuberculoza, bronșita cronica, boala pulmonară obstructivă cronică (COPD), artrita reumatoidă, boala cronică renală, lupus, dar și anumite forme de cancer, astfel încât, având la bază mai multe studii toxicologice, Agenția pentru Cercetarea Cancerului (IARC) a încadrat siliciul cristalin în Grupul 1 de carcinogeni. Particulele de siliciu amorf cu dimesiuni de ordin micrometric, deși prezintă patogenitate scazută față de forma cristalină, induce inflamație pulmonară substanțială, însă tranzientă. În schimb, patologia asociată nanoparticulelor de siliciu amorf este incertă și necesită și alte investigații.
În general se consideră că, dintre nanoparticulele utilizate în momentul de față, cele de SiO2 amorf prezintă cea mai mică citotoxicitate și sunt deasemenea biocomatibile (Suh și colab., 2009). În scopul determinării viabilitații celulare și a modificărilor unor căi biologice se utilizează diverse linii celulare mamaliene, foarte adesea macrofage alveolare sau fibroblaste pulmonare, deoarece plămânii reprezintă primele organe afectate în cazul inhalării de nanoparticule. Expunerea la nanoparticulele de SiO2 poate determina, la nivel celular, apoptoza și apariția unor modificări la nivelul ciclului celular.
Contradicțiile și rezultatele diferite obținute în urma studiilor se datorează în mare parte diferențelor între proprietațile fizico-chimice ale nanoparticulelor și metodelor de determinare utilizate, însă cele mai multe indică efecte negative atât in vitro cât și pe modele animale. Totuși, există date în literatură care susțin lipsa de riscuri a utilizării acestor nanoparticule. De exemplu, un studiu in vitro arată că viabiliatea nu a fost afectată în urma tratamentului cu SiO2 la nivelul liniilor celulare epiteliale derivate din adenocarcinom pulmonar uman, fibroblastelor, celulelor derivate din feocromocitom și hepatocitelor umane, sugerând lipsa citotoxicitații nanoparticulelor de SiO2 (Wagner și colab., 2009).
Pe de altă parte s-a demonstrat că inhalarea timp de patru săptămâni a aerosolilor de nanoparticule de SiO2 obținute prin sinteză produce la șoareci inflamație pulmonară, ischemie miocardică, blocaj atrio-ventricular, creșterea concentrației de fibrinogen și creșterea vâscozitații sângelui (Chen și colab., 2008)
Interacția dintre particulele de SiO2 și sistemele biologice depinde de diametrul particulei, de potențialul zeta și de puritatea chimică. Expunerea la nanoparticule scade viabilitatea celulară într-un mod dependent de mărime și de concentrație. Astfel, studiul in vitro a liniilor celulare epiteliale indică faptul că rata apoptotică este mai mare în cazul celulelor tratate cu nanoparticulele de dimensiuni mai mici, SiO2 cu diametrul de 15 nm, decât în cazul celor expuse la nanoparticule de 30 nm, sau la nanoparticule mai mari de 100 nm (O’Farrell și colab., 2006). Nanoparticulele de SiO2 cu diametrul de 15 nm sunt mai puțin stabile decât cele de 30 nm și cele mai mari de 100 nm (Yang și colab., 2010). Waters și colab. a observat, la nivelul macrofagelor, că există un grad ridicat de similaritate prin care nanoparticulele de siliciu amorf de 10 nm, respectiv de 500 nm, modulează anumite gene și răspunsuri celulare, astfel încât mecanismele prin care aceste particule acționează se suprapun. El a concluzionat că diferențele induse de nanoparticulele de diferite dimensiuni se datorează în primul rând unui cumul al ariilor suprafețelor.
Generarea speciilor reactive de oxigen
Radicalii liberi sunt posibil toxici pentru celule, deoarece deteriorează toate tipurile de macromolecule, inclusiv carbohidrați, acizi nucleici, lipide și proteine.
Formarea radicalilor liberi constituie un prim eveniment care inițiază o cascadă de răspunsuri celulare, activând căi de semnalizare, eliberarea citokinelor inflamatorii, activarea unor factori transcripționali. De exemplu, la nivelul liniei celulare de fibroblaste de șoarece, siliciul induce formarea ROS printr-un mecanism dependent de flavoenzime și activează calea de semnalizare prin ERK (kinaza activată de semnale extracelulare) și MEK. Stresul oxidativ indus de siliciu a fost corelat și cu activarea NF-kB și AP-1 (Fubini B & A Hubbard, 2003).
Factorii transcripționali AP-1 sunt proteine compuse din heterodimeri aparținând familiilor Jun, Fos, ATF și JDP. Genele c-jun și fos sunt inductibile în condițiile stimulării de către factori de stres. AP-1 se leagă la ADN la nivelul promotorilor ce conțin secvențe TRE (TRA response elements) și care aparțin genelor de răspuns la procese inflamatorii, proliferare și apoptoză. Fiind implicat în transformarea malignă, progresia tumorală și metastază, este posibil ca AP-1 să fie responsabil de efectele carcinogene ale SiO2. ROS sau razele UV induc activarea căilor de semnalizare prin familia MAP kinazelor (ERKs, JNKs și p38), AP-1 reprezentând o țintă downstream pentru acestea. Luciferaza a fost folosită ca genă reporter pentru a evidenția activarea AP-1 prin căile de semnalizare ale p38-MAPK și ERK (Ding și colab., 1999).
Mai multe studii realizate la nivelul liniei celulare de macrofage RAW 264.7 au demonstrat că expunerea la siliciu induce activarea NF-kB la scurt timp după stimulare și intr-un mod diferit de lipopolizaharide (LPS) cu privire la calea de semnalizare implicată. Atât siliciul cât și LPS induc creșterea expresiei ARNm pentru ciclooxigenaza II, oxid nitric sintaza, TNF-α si IL-1α. (Chen și colab, 1995). Folosind o serie largă de inhibitori ai ROS, numai SOD (superoxid dismutaza) nu a putut inhiba activarea NF-kB, ceea ce conduce la ipoteza conform căreia radicalul HO- este în principiu responsabil de activarea NF-kB (Shi și colab., 1999).
Un răspuns al macrofagelor alveolare la expunerea la SiO2 ar mai putea fi creșterea activității fosfolipazei C specifice fosfatidilcolinei (PC-PLC), care catalizează formarea diacilglicerolului, un activator al protein kinazei C (Hamilton și colab., 2008). Studii recente au demonstrat că aceasta este implicată în activarea căilor de semnalizare mediate de NF-kB și eliberarea citokinelor proinflamatorii TNF-α și IL-1β. În celulele supuse tratamentului cu siliciu, PC-PLC este activată de peroxidul de hidrogen și inhibată de către enzime antioxidante (SOD, catalaza). Tratamentul cu SiO2 determină și creșterea concentrației de Ca2+ intracelular, mecanismele fiind însă neclare. Această creștere este blocată prin tratamentul cu antioxidanți, iar pe de altă parte chelatorii de Ca2+ blochează activarea PC-PLC. Aceste evenimente sugerează că ROS produse de expunerea la SiO2 afectează fosfolipaza C, și că aceasta este reglată intr-un mod Ca2+ – si redox-dependent (Liu și colab., 2007).
Alte efecte induse de nanoparticulele de SiO2
La nivelul liniei celulare epiteliale HaCaT s-a observat alterarea expresiei mai multor proteine asociate stresului oxidativ, asociate citoscheletului și a unor molecule chaperon, cu precădere la nivelul celulelor expuse la SiO2 cu cel mai mic diametru (Yang și colab., 2010).
Peroxiredoxinele Prx I și Prx VI sunt tiol-proteine cu acțiune antioxidantă, dar care controlează și nivelul de peroxid indus de citokine, mediind transmiterea semnalelor celulare (Rhee și colab., 2005 ). Un rol al Prx constă în reducerea H2O2 și alchil-hidroperoxidului la apă și alcool printr-un sistem catalitic care utilizează tioredoxina (Trx), Trx reductaza (TR) și NADPH. În celulele epiteliale pulmonare, stresul oxidativ asociat nanoparticulelor de SiO2 induce scăderea expresiei Prx I, și nu și a altor peroxiredoxine II-VI (Lee și colab., 2008). Scăderea expresiei proteice a acestora la nivel celular indică reducerea capacității antioxidante a celulelor, această scădere fiind negativ corelată și cu dimensiunile reduse ale nanoparticulelor de SiO2.
Tioredoxina (Trx) este deasemenea o enzimă oxidoreducătoare care acționează ca antioxidant, și a cărei subexpresie proteica a fost indusă de nanoparticule. Are un rol esential în promovarea creșterii celulare și în inhibarea apoptozei, astfel încât menține homeostazia celulei în condiții fiziologice ( Ahsan și colab., 2009). Astfel, expresia anormală a enzimelor asociate stresului oxidativ ar putea reprezenta un mecanism important prin care nano-SiO2 induc citotoxicitatea. Modificarea expresiei ciclofilinei la nivelul liniei celulare HaCaT deasemenea sugerează inducerea unei forme de stres, deoarece ciclofilinele acționează ca molecule chaperon, fiind responsabile de plierea proteinelor și de stabilizarea polipeptidelor nepliate sau pliate parțial.
Metabolismul celular poate fi afectat de expunerea la nanoparticule de SiO2 prin subexprimarea unor enzime precum enolaza 1 sau fosfoglicerat mutaza, afectând în acest mod glicoliza sau fosforilarea oxidativă (Yang și colab., 2010).
Maspina este un supresor tumoral care promovează apoptoza celulelor tumorale prin reglarea proteinelor din familia Bcl-2 (Zhang și colab., 2005). Sub acțiunea nanoparticulelor de SiO2, această proteină este puternic subexprimată, ceea ce ar putea indica implicarea maspinei în procesele pro-apoptotice pe parcursul expunerii la nanoparticule, și că expunerea la SiO2 poate promova tumorigeneza.
Nanoparticulele de SiO2 pot determina efecte negative și prin interacția cu ADN sau cu proteinele nucleare. Deși informațiile cu privire la efectele biologice la nivel nuclear ale nanoparticulelor sunt limitate, există date care indică preluarea lor în celule pe cale endozomală. S-a arătat că nanoparticulele micelare cu dimensiuni între 20 și 45 nm se pot localiza la nivelul organitelor citoplasmatice, precum mitocondrii, aparatul Golgi, reticulul endoplasmatic, lizozomi, dar nu și în nucleu. În schimb, nanoparticulele de polietilenimină (PEI) marcate fluorescent, odată endocitate, sunt translocate în nucleu, formând structuri ordonate, ceea ce îi explică proprietățile excelente ca vector pentru livrarea de gene. Evidențierea translocării nanoparticulelor în nucleu ridică o serie de întrebări referitoare la influența lor asupra funcției și structurii nucleare. Chen și colab. arată intr-un studiu că SiO2 alterează structura nucleară prin inducerea unor corpi de incluziune agresom-like aberanți în nucleoplasmă (Chen & Mikecz, 2005). Ei au arătat că tratamentul cu SiO2 induce o redistribuire anormală a topoizomerazei I și a altor proteine nucleare, în clustere nucleoplasmice aberante. Formarea acestor agregate proteice nu corespunde cu structurile clasice ale nucleului în interfază, și are loc într-o manieră indepedentă de tipul celular.
Capitolul III
Interleukina 6
Interleukina 8
PGE2-prostaglandine
Oxidul nitric
Partea II
Studiul Experimental
CAPITOLUL I
OBIECTIVELE ȘI SCOPUL STUDIULUI
Scopul studiului:
Lucrarea de față își propune să investigheze citotoxicitatea indusă de către nanoparticulele de SiO2 la nivelul liniei celulare de fibroblaste pulmonare umane MRC-5 asupra nvelului de expresie a proteinelor Nrf2, IL6, IL8.
Obiectivele studiului:
Studiul pe culturi celulare de fibroblaste pulmonare umane a fost realizat în vederea evidențierii răspunsului adaptativ care apare in vitro la nivelul fibroblastelor pulmonare umane, sub acțiunea nanoparticulelor de SiO2.
Lucrarea de față iși propune evalurea efectelor tratamentului cu SiO2, prin testarea citotoxicității, precum și analizarea modificărilor de expresie a proteinelor Nrf2, IL6, IL8;
Izolarea și cultivarea liniilor celulare MRC5 ce vor fi supuse unor concentrații specifice de nanoparticule de siliciu, la intervale de 24, 48, respectiv 72 de ore, în scopul evidențierii răspunsului adaptativ, ce apare in vitro;
Determinarea citotoxicității bazate pe determinarea activității lactat dehidrogenazei;
Testarea viabilității celulare MTT.
CAPITOLUL II
MATERIALE ȘI METODE
Cultivarea liniei celulare MRC-5
Linia celulară MRC-5 (ATCC CCL-171) a fost derivată din țesut pulmonar normal de la un fetus de 14 săptămani. Celulele sunt diploide și au capacitatea de a-și dubla populația timp de 42 până la 46 de splituri, înainte de a ajunge la senescență (Jacobs JP, 1970). Celulele însămanțate la o concentrație de 4×104 celule/cm2 ajung la o confluență de 100% în 7 zile.
Reactivi și soluții:
Mediu MEM (Eagle’s Minimal Essential Medium), pH 7.4;
10% ser fetal bovin;
0.25% tripsină (w/v) – 0.53 mM EDTA;
Tampon fosfat alcalin (PBS – Phosphate – Buffer Saline).
Mod de lucru:
Fibroblastele pulmonare au fost cultivate în mediu la o densitate de 5×104 celule/mL în flaskuri de 75 cm2;
Aspirarea și îndepărtarea mediului din plăci;
Spălarea flask-ului cu 2 mL tampon fosfat salin – PBS (flask 75cm2);
tripsinizare 2 mL tripsină (flask 75 cm2) și incubare la 37C, 1-2 minute;
Inactivarea tripsinei cu 4 mL mediu MEM, 10% ser fetal;
Spălarea flask-ului cu 2 mL mediu MEM, 10% ser fetal;
Centrifugarea celulelor la 1500 rpm, 10 minute, 4C;
Resuspendarea celulelor in 8 mL mediu MEM, 10% ser fetal;
Incubarea celulelor la 37C, in atmosfera 5% CO2 ;
Schimbarea mediului de cultură s-a realizat la 48 ore.
Caracterizarea nanoparticulelor și tratamentul celulelor
Nanoparticulele de dioxid de siliciu amorfe au fost obținute în laborator prin metoda ablației laser la Institutul Național de Fizica Laserilor, Plasmei și Radiațiilor, București-Măgurele, România.
Nanoparticulele de SiO2 (NP SiO2) au fost sintetizate prin metoda ablației reactive laser care constă în iradierea cu un fascicul laser focalizat de foarte mare putere (1-100 MW) a unei ținte din materialul al cărui compus vrem să-l realizăm.
Acestea sunt particule nanometrice, cu dimensiuni mai mici 100 nm NP SiO2 ce prezintă dimensiuni de până la 14 nm cu maxime între 5 și 8 nm. În vederea testării toxicității acestora in vitro au fost realizate soluții de SiO2 a căror densitate de particule (concentrație) suspendate în apă Milli-Q a fost 6.28×1013 particule/mL.
Testul de viabilitate celulară MTT
Studiul pe culturi celulare de fibroblaste pulmonare umane a fost realizat în vederea evidențierii in vitro a efectului citotoxic indus de către nanoparticulele pe bază de siliciu la nivelul fibroblastelor pulmonare umane, sub acțiunea nanoparticulelor de SiO2. În acest sens s-au utilizat diferite tipuri de nanoparticule de SiO2, in mediu Eagle’s Minimal Essential Medium (MEM) cu 2mM L-glutamină, suplimentată pentru a conține: 1 mM piruvat de Na, 1,5 g/L bicarbonat de Na, 0,1 mM amonoacizi neesentiali si 10% ser fetal bovin.
Testul MTT în prezența suspensiilor de nanoparticule de SiO2
Viabilitatea celulară a fost analizată pe baza testului de citotoxicitate folosind MTT [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu]. Acesta permite evaluarea metabolismului oxidativ, pe baza transformării MTT-ului într-un formazan sub acțiunea enzimelor mitocondriale NAD(P)H-dependente.
Principiul metodei
Celulele aflate în faza de creștere exponențială sunt expuse acțiunii unui compus citotoxic. Timpul de expunere este determinat astfel încât să se producă vătămarea maximă. Viabilitatea celulelor este determinată prin intermediul dehidrogenazelor mitocondriale. Enzimele mitocondriale din celulele viabile sunt capabile să cliveze nucleul de tetrazoliu cu formarea cristalelor de formazan solubile în izopropanol. Numărul celulelor viabile este astfel determinat indirect prin reducerea colorantului MTT(BCIP (5 brom-4 clor-3indolil-1 fosfat) / NBT (nitro blue tetrazoliu)). Cantitatea de MTT-formazan poate fi determinată spectrofotometric, după ce a fost dizolvată într-un solvent potrivit.
Reactivi și soluții:
soluție MTT(BCIP (5 brom-4 clor-3indolil-1 fosfat)/NBT(nitro blue tetrazoliu)) 1mg/mL preparat în PBS;
tampon fosfat salin (PBS);
izopropanol 100%.
Mod de lucru:
însămânțarea celulelor în placa cu 96 de godeuri la o densitate de 5×104 celule/mL/godeu în prezența suspensiilor de nanoparticule SiO2 cu diferite concentrații;
incubare 24h, 48h și respectiv 72h la 37oC, 5% CO2 pentru aderarea și proliferarea celulelor;
după aceste intervale celulele aderate se spală de 2 ori cu PBS;
se îndepărtează PBS-ul;
se adaugă 1 mL soluție MTT (1mg/mL)/godeu;
incubare 2h/37oC;
se aruncă MTT-ul;
se adaugă izopropanol, omogenizându-se până la solubilizarea cristalelor;
citirea plăcii la mullti reader TECAN GENious 595nm.
Obținerea lizatului celular
Reactivi și solutii:
Soluție Tripsină 1x- preparat din tripsină stoc 10x (reactiv σ tripsină EDTA 10 x – 5 g tripsină porcină și 2 g EDTA tetrasodic în 0,9 %NaCl);
Tampon PBS;
Modul de lucru:
tripsinizarea celulelor;
spălarea peletului obținut în urma centrifugării cu PBS;
centrifugare 1500 rpm/10 minute;
liza celulelor prin sonicare 30 secunde /3 cicluri / amplitudine maximă;
Concentrația proteică totală a fost determinată prin metoda Bradford.
Tehnica Western Blot
Pentru a determina modificările de expresie proteică apărute la nivelul liniei de fibroblaste pulmonare în urma tratamentului cu SiO2 s-a utilizat tehnica Western Blot.
Principiul metodei:
Western Bolttingul este o metodă de electrotransfer a proteinelor fracționate mai întâi prin electroforeză pe membrană și evidențierea uneia de interes în urma interacției cu un anticorp specific (denumit anticorp primar) de care se va lega anticorpul secundar care îl recunoaște specific pe primul. Anticorpul secundar prezintă proprietatea de a fi detectat, deoarece este modificat chimic.
Această metodă este foarte utilizată în special în lucrul cu proteine insolubile, greu de marcat sau ușor digerabile, imunoprecipitarea nefiind indicată în aceste situații.
Un protocol Western Blot are ca pași principali:
a) pregătirea probei;
b) electoforeza în gel de poliacrilamidă (PAA);
c) transferul pe membrană;
d) blocarea membranei și revelarea.
Pregătirea probei
Se poate pleca atât de la probe de țesut cât și de la celule menținute în cultură.
Dacă se lucrează cu țesuturi trebuie efectuat mai întâi un tratament mecanic cum ar fi omogenizarea cu un omogenizator Potter. Pentu celule, liza se poate realiza prin sonicare. Sonicarea este cea mai elegantă metodă de liză celulară dar care prezintă dezavantajul că starea nativa a proteinei poate fi afectată datorită încălzirii probei în timpul tratamentului. De aceea se realizează și o etapă de racire. Se pot utiliza și metode chimice care presupun folosirea unor detergentți sau soluții saline.
Electroforeza în gel de poliacrilamidă în condiții denaturante și reducătoare
Principiul metodei:
Electroforeza în gel de poliacrilamidă s-a realizat în condiții denaturante și reducătoare cu scopul de a obține o migrare a proteinelor în principal doar în funcție de masa lor moleculară. Prezența SDS (dodecil sulfat de sodiu) în tamponul de electroforeză și în gelul de poliacrilamidă conferă moleculelor proteice o sarcină electrică netă negativă. Interacțiunea SDS cu proteinele are ca rezultat denaturarea proteică, anulând conformația spațială a proteinei și disocierea subunităților. Tratamentul probelor cu β-mercaptoetanolul din tamponul de încărcare la (100ºC), determină ruperea punților disulfurice existente în structura proteinelor supuse electroforezei. În aceste situații migrarea și separarea proteinelor se realizează exclusiv în funcție de masa lor moleculară.
Reactivi și soluții:
-Soluție stoc 30% acrilamidă-bisacrilamidă
-Tampon Tris/HCl/ SDS pH=8,8 (1,5 M Tris 0,4% SDS)
-Tampon Tris/HCl/SDS pH=6,8 (0,5 M Tris 0,4% SDS)
-APS 10% (persulfat de amoniu)
-TEMED (N,N,N’,N’ tetrametilendiamină 99% ; reactiv σ)
-Tampon de electroforeză 1x (0,05M Tris, 0,05M glicină, 1% SDS)
-Tampon de încărcare (10 mL tampon încărcare 4x conțin: 3,6mL glicerol, 1 g SDS, 0,6mL β-mercaptoetanol, 1,2mg bromfenol)
-Marker de masă moleculară precolorat See Blue Plus2 Prestained Standard 1x
Modul de lucru:
prepararea gelurilor de poliacrilamidă:
Gelul de migrare 10% (30% poliacrilamidă, tampon Tris/HCl/SDS pH 8.8, apă distilată, APS 10% TEMED )
Gelul de concentrare 4.5% (30% acrilamidă bisacrilamidă, tampon Tris/HCl/ SDS pH 6,8, apă distilată, APS 10% TEMED; turnarea gelului)
etapa de premigrare a gelurilor 70 V ct/20min/ temperatura camerei;
denaturarea probelor în tamponul de încărcare la 100ºC/10 minute; răcire la temperatura camerei;
încărcarea probelor și a markerului de masă moleculară – 30 μg/godeu ;
migrarea la 90V constant/ temperatura camerei.
Transferul pe membrana de blot
Principiul metodei:
Proteinele separate prin SDS-PAGE pot fi transferate pe o membrană sintetică PVDF (difluorură de poliviniliden) – s-a apelat la tehnica transferului umed; în prezența tamponului de transfer sub acțiunea curentului elctric; membrana poate fi apoi incubată cu anticorpi specifici in vederea punerii în evidență a proteinelor de interes, în cadrul proceseului de revelare.
Reactivi și solutii:
-tamponul de transfer (Tris 25mM, glicina 192mM, metanol 20%, SDS 0.1%)
-membrana PVDF (difluorură de ploviniliden)
Modul de lucru:
se activează membrana PVDF – 30 secunde în metanol 100%
se realizează sandvișul pentru transferul umed, în ordinea: burete (umectat în tamponul de transfer), 3 hârtii de filtru (umectate în tamponul de transfer), membrana PVDF (activată prin incubare în metanol), gelul de PAA, 3 hârtii de filtru, burete
transferul se realizează la 350mV / 3h30min / 4°C.
Revelarea
Principiul metodei:
Membrana pe care s-a realizat transferul proteinelor este incubată cu o soluție de anticorpi (Ac) primari care recunosc specific proteinele de interes, după care se incubează și cu Ac secundari (care recunosc specific Ac primari). Ac secundari sunt conjugați cu o enzimă reporter (fosfatază alcalină). Fosfataza alcalină asociată chimic cu anticorpul secundar va transforma substratul cromogen cu care este incubată membrana ducând la formarea unui compus insolubil ce se va depune la locul de legare al anticorpilor, determinând apariția unor spoturi ce indică prezența și concentrația proteinelor de interes.
Reactivi și soluții:
S-a utilizat kit-ul Invitrogen Western Breeze, Chromogenic Immunodetection System, care furnizează tamponul de blocare, soluțiile de diluție a Ac și soluția de spălare a Ac
-Soluție de blocare (apă MilliQ: soluție blocker A: soluție blocker B = 5:2:3)
-Soluție diluție anticorpi (apă MilliQ : soluție diluent A : soluție diluent B = 7:2:1)
-Soluție spălare anticorpi: (apă MilliQ: soluție spălare = 15:1)
-Anticorpi primari –Nrf2
-Anticorpi secundari anti-mouse cuplați cu fosfataza alcalină
-Cromogen – soluție BCIP/NBT (5 brom-4 clor-3indolil-1 fosfat / nitro blue tetrazoliu)
Modul de lucru:
blocare membrană cu Soluție de blocare – shaker rotativ / 30 minute sau peste noapte
spălare (de 2 ori) cu AD –shaker rotativ / 5 minute
incubare cu 10 mL soluție Ac primar – shaker rotativ / 1 h
spălare (de 3 ori) cu soluție de spălare anticorpi / 5 minute
incubare cu anticorp secundar 10 mL/ 30 minute
spălare (de 2 ori) cu soluție spălare anticorpi 20mL/ 5 minute
spălare (de 2 ori) cu AD / 2 minute
incubare 5 mL cu Substrat Cromogen până când apar benzile / 1-60 minute
spălare (de 2 ori) cu AD / 2 minute
uscarea membranei
fotografiere membrană și densitometrare cu ajutorul programului BioCaptMW Bio1D.
Capitolul III
Rezultate și discuții
Evaluarea citotoxicității nanoparticulelor de SiO2
Anterior utilizării nanoparticulelor de SiO2 în cadrul tratamentului efectuat, a fost necesară caracterizarea morfo-structurală a acestora. În acest sens a fost utilizată microscopia electronică de transmisie cu rezoluție înaltă – HRTEM (figura 1). Aceasta metodă de caracterizare permite obținerea de informații referitoare la forma și cristalinitatea NP, două proprietăți care pot influența nivelul de toxicitate al NP.
În figura 1 sunt prezentate imaginile HRTEM ale nanoparticulelor de SiO2. Acestea sunt particule nanometrice, cu dimensiuni mai mici 100 nm. Datorită forțelor Van der Waals și a celor electrostatice ele se aglomerează sub forma unor agretate.
Dimensiunea reprezintă un parametru de mare interes al particulelor. Distribuția după mărime a particulelor a fost dedusă prin statistica a numeroase imagini de microscopie electronică.
Nanoparticulele de SiO2 au prezentat o distribuție log normală, după cum este arătat în figura 2.
Se observă că SiO2 prezintă dimensiuni de până la 14 nm cu maxime între 5 și 8 nm. Au fost realizate soluții de SiO2 a căror densitate de particule (concentrație) suspendate în apă Milli-Q a fost 6.28×1013 particule/mL.
Testul de viabilitate celulară MTT asupra fibroblastelor liniei MRC-5
În vederea evaluării efectului citotoxic al nanoparticulelor pe bază de siliciu la nivelul fibroblastelor pulmonare, celulele liniei MRC-5 au fost tratate 24h, 48h și respectiv 72h cu diferite concentrații de suspensii, în prezență de mediu MEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin dupa cum urmează:
Testul de citotoxicitate a indicat un efect de reducere a viabilității celulare a fibroblastelor pulmonare apărut în urma tratamentului cu suspensii de SiO2 (Figura 3). S-a constat că efectele sunt dependente de concentrația de nanoparticule utilizată cât și de intervalul de expunere al celulelor. Rezultatele sunt prezentate în figura 3; de asemenea s-a observat că la concentrații mari, nanoparticulele de SiO2 afectează în mod negativ viabilitatea fibroblastelor. De asemenea, cea mai mare scădere a viabilității are loc după 72 de ore de expunere. Totuși, tratamentul cu SiO2 pare a induce un efect de proliferare celulară, la intervale mici de expunere în prezența unei concentrații mici de nanoparticule.
Fenotipul fibroblastelor pulmonare se modifică în cazul expunerii la nanoparticule, efectele fiind dependente ca și în cazul testului MTT de concentrația de nanoparticule aplicată ca tratament (figurile 4, 5, 6 și 7).
Deoarece scăderea viabilității celulare precum și modificările fenotipice au fost evidențiate cel mai bine în cazul tratamentului cu concentratia de nanoparticule de SiO2, cea mai mare, s-a ales utilizarea acestei concentrații pentru experimentele ulterioare. Astfel, menținând constantă doza de tratament și variind intervalul de tratament, s-au analizat modificările la nivel de expresie proteică pentru proteinele de interes, prin tehnica Western Blot.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Raspunsul Inflamator Indus de Nanoparticulele Dioxidului de Siliciu Asupra Liniei Celulare de Fibroblaste Umane Mrc 5 (ID: 163298)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.