Componente Proteice Multifunctionale Pentru Obtinerea de Biomateriale

Capitolul I

Forme proteice pentru obținerea de biomateriale cu acțiune de regenerare tisulară și proprietăți antimicrobiene

Introducere

În secolul XXI se pune tot mai mult accent pe înlocuirea materialelor artificiale (polimeri de sinteză) utilizate în medicina umană și veterinară ca implante, dispozitive

medicale, pansamente, etc. cu materiale așa-numite bioartificiale (materiale compozite pe bază de biopolimeri) Aceste materiale compozite conțin cel puțin un component‘ natural, care are scopul de a mări gradul de biocompatibilitate al materialului respectiv și de a grăbi procesul de vindecare.

Componenta naturală a materialelor compozite poate fi o proteină (colagen, cheratină, elastină, albumină), un polizaharid din clasa glicozaminoglicanilor (condroitin sulfat, heparină, heparin sulfat, acid hialuronic), o secvență peptidică cu rol în recunoașterea celulară sau în procesul de adeziune. Aceste componente sunt cel mai adesea macromolecule ale matricei extracelulare ale țesuturilor cu care materialele intră în contact și care sunt implicate în procesele de vindecare.

Cercetarea proteinelor din perspectiva științei materialelor este de dată mai recentă și reunește biochimiști, specialiști din domeniul biologiei moleculare, al științei polimerilor, al științei materialelor. Temele de interes sunt legate acum de proprietățile noilor materiale polimerice cu componentă proteică, controlul genetic al producerii de astfel de materiale și relația structură –comportare.

Fie că sunt utilizate direct ca materiale unitare, fie că servesc pentru obținerea de materiale compozite sau ca surse de “inspirație” pentru controlul proprietăților polimerilor de sinteză prin controlul structurii lanțului macromolecular, impactul proteinelor asupra științei materialelor va fi tot mai evident și va determina progrese în diverse domenii ale cercetării științifice.

Obținerea de materiale proteice presupune dispunerea de forme proteice cu caracteristici perfect definite în raport cu aplicația particulară căreia îi sunt destinate. Drumul de la sursa de proteine la utilizarea concretă a unei forme proteice implică parcurgerea următoarelor etape ( Figura nr 1) / 16/

Materialele bioartificiale, conținând o componentă naturală extrasă și purificată din țesuturi conjunctive, au un grad sporit de biocompatibilitate și de aceea ele nu irită locul de aplicare și pot fi menținute pentru un timp mai lung în contact cu organismul fără a provoca un răspuns negativ de respingere.

Colagenul îndeplinește în mare măsură condițiile enumerate, din acest motiv este larg utilizat în domeniul biomedical, având aplicații în diverse domenii, putând fi condiționat sub diferite forme (de la soluții injectabile la materiale spongioase). În plus, colagenul este un bun agent hemostatic, are un rol esențial în procesul de vindecare al rănilor, influențează refacerea cartilagiilor și a oaselor. De asemenea, acest biopolimer permite, prin structura sa, asocierea cu diferite substanțe cum sunt hormonii, enzimele, medicamentele și asigură eliberarea treptată a acestora în organism.

Multe studii subliniază proprietățile deosebite ale materialelor compozite pe bază de biopolimeri și anume: biocompatibilitate foarte bună, lipsa toxicității și perspective deosebite pentru eliberare controlată a unor principii active, motiv pentru care sunt foarte utilizate în medicină, industria alimentară, farmacie și cosmetică. În considerațiile actuale de evaluare ecologică a tuturor produselor utilizate în toate domeniile de activitate umană, biocompatibilitatea, biodegradabilitatea și toxicitatea ecologică sunt pe primul plan.

Se știe că, organismele vii sunt capabile să sintetizeze o varietate de polimeri ce pot fi clasificați, în funcție de structura chimică în: polizaharide, proteine, poliesteri. În prezent datorită biotehnologiilor avansate, compușii macromoleculari naturali pot fi obținuți prin fermentația microorganismelor sau sintetizați in vitro prin procese enzimatice [17]. Însă cea mai mare parte sunt extrași din surse naturale vegetale (organul plantei, cereale, alge) și animale (piele, oase, tendoane, ligamente, păr, pene, copite, albuș de ou, etc)

Figura nr. 1

Capitolul II

Biopolimeri naturali. Structură și proprietăți fizico-chimice

Biopolimerii sunt compuși macromoleculari naturali, constituiți din macromolecule cu dimensiuni comparabile ca ordin de mărime cu dimensiunile particulelor coloidale. Acest lucru le conferă proprietăți asemănătoare dispersiilor coloidale. Soluțiile de polimeri pot fi obținute prin dizolvarea acestora în solvenți compatibili, cu formarea unui sistem omogen, care nu diferă prea mult de soluțiile moleculare, însă dimensiunile macromoleculelor sunt de ordinul zecilor sau sutelor de nm. Prin modificarea interacțiunilor dintre polimer și mediul de dispersie, soluțiile de polimeri pot fi transformate ușor în dispersii coloidale.

Biopolimerii naturali sunt derivați din:

surse animale: colagenul, gelatina, cheratina, albumina, chitina (din care se procesează chitosanul) etc;

surse vegetale: amidonul (biopolimer hidrocoloid găsit într-o varietate de plante: grâu, porumb, cartofi, fasole, orez, banane etc), celuloza, fibroina din mătasea de viermi de mătase, draglina de păianjen, etc.

II.1. Biopolimeri de origine animală.

În cele ce urmează se prezintă următorii biopolimeri, colagenul, ovalbumina, ovotransferina și lizozimul.

II.1.1. Colagenul

Datorită biocompatibilității și biodegradabilității excelente, structurii bine definite, caracteristicilor biologice și modului în care interacționează cu organismul, colagenul reprezintă unul dintre cele mai utilizate biomateriale [18]. Colagenul este polimerul natural de bază din țesuturile conjunctive. Ca proteină principală structurală, constituie circa o treime din totalul proteinelor corpului. Se prezintă sub forme diferite în pielea animalelor, în funcție de specie, vârstă, țesut, iar repartiția în diferitele organe variază de la 25-35% în tendon, 20-30% în piele, 10-20% în oase, cartilagii și până la 0,2-0,45% în sistemul nervos central.

Țesuturile conjunctive, din punct de vedere morfologic, se caracterizează prin varietatea elementelor constitutive care sunt reprezentate prin celule conjunctive, fibre colagenice, fibre elastice, fibre de reticulină, substanță interfibrilară, vase sanguine, nervi etc. Substanța interfibrilară este gelatinoasă și elastică în dermă și hipodermă, dură și elastică în cartilaje și tendoane sau dură și pietroasă în țesutul osos. O sursă importantă pentru obținerea unor forme colagenice cu utilizări multiple este pielea animală [19 – 21].

Pielea este un organ complex și cel mai extins ca suprafață (aproximativ 2 m2). Grosimea pielii este variabilă și este în funcție de regiunea anatomică, respectiv zona topografică a unei piei, de tipul animalului, de vârstă, etc. Pielea este organul cel mai expus la mediul exterior și în consecință, la traumatismele de toate felurile. Ea reprezintă un organ “barieră”, care protejează organismul de agresiuni fizice, chimice, termice și microbiologice, dar care limitează pierderile de apă din inetrior spre exterior. Mai mult, acest organ are rol senzorial și de hrănire. Pielea este constituită, din punct de vedere morfo-histologic din trei straturi distincte, așa cum arată în figura nr.2.

Marea familie a colagenurilor (26 de tipuri de colagen) este foarte complexă și prezintă o mare diversitate, atât la nivelul organizației moleculare și supramoleculare, cât și la nivelul distribuției tisulare și a funcțiilor biologice. Are patru nivele de organizare de o complexitate ascendentă:

Structura primară

Este determinată de natura și succesiunea (secvența) specifică a aminoacizilor în catena polipeptidică. O catenă polipeptidică este compusă din două porțiuni:

– o porțiune elicoidală alcătuită dintr-o succesiune de regiuni polare (amorfe) cu secvența (- Gly – X – Y -)n , glicina apărând mereu pe poziția trei, iar în pozițiile X și Y pot apărea fie prolina fie hidroxiprolina, și regiuni apolare (cristaline) alcătuite din secvențe – Gly – Pro – X –, în care X este un alt aminoacid nepolar. Regiunile polare prezintă afinitate pentru speciile chimice ionice, pe când regiunile apolare sunt hidrofobe.

– o porțiune neelicoidală (zona telopeptidelor), în care glicina nu mai apare obligatoriu în poziția trei, iar aminoacizii polifuncționali dețin un rol important. este reprezentată de succesiunea repetitivă de aminoacizi ce posedă catene laterale cu structuri chimice, mase și grupări ionizabile diferite.

Compoziția unui lanț se exprimă prin numărul de resturi dintr-un total de 100. Tipurile de colagen conțin 20 de resturi diferite, aranjate în secvență regulată unică, lanțul fiind format din 1050-1100 resturi de aminoacizi.

Structura secundară

Este determinată de conformația spațială a catenelor polipeptidice individuale. În cazul colagenului, aceasta are forma unei spirale, cu o înfășurare de la stânga spre dreapta, numită α-helix. Distanța dintre două spire este de 5,28 Å, iar o spiră conține 3,28 unități aminoacidice. Spirala este stabilizată de legăturile de hidrogen dintre spire. Această formă este cea mai stabilă dintre toate configurațiile ce pot fi adoptate, din punct de vedere energetic. (Pauling și Corey, 1951).

Structura terțiară

Definește modul de alcătuire a macromoleculei de colagen, ca ansamblu a trei catene polipeptidice α-helicale. Triplul-helix cu această structură poartă denumirea de helix major, sau tropocolagen (figura nr.. Acesta este format din două lanțuri te tip α1 și unul de tip α2. Diferența dintre acestea constă doar în compoziția și secvența aminoacizilor din catene. Masa moleculară a triplu-helixului este de circa 300 kDa, lungimea sa este de 2800Å, iar forma generică este aceea de bastonaș rigid. Prima explicitare a structurii tropocolagenului este atribuită lui Astbury (1930), corectată apoi succesiv de Pauling și Corey, Crick și Randall (1950), Rich și Crick, Ramachandran și Kartha (1955).

Figura nr.5. Structura terțiară a colagenului

Structura cuaternară

Descrie formarea agregatelor supramoleculare ale tropocolage-nului, pe două direcții: longitudinală sau unidirecțională (rezultând protofibril), respectiv laterală (ce conduce la formarea fibrilelor). Forțele responsabile pentru stabilizarea elementelor fibrilare sunt legăturile electrovalente (ionice), legăturile de hidrogen, iar apoi, odată cu maturarea țesuturilor conjunctive, legăturile covalente.

De-a lungul timpului, au fost propuse mai multe de modele ale asocierii tropocolagenului în structuri fibrilare (cilindrică și cilindric-spiralată, de către Ramachandran și Sasisekharan, în 1957; hexagonală, de către Burge, în 1963; prin decalare liniară cu un sfert din lungime, de către Veis și Steven, în 1970, figura nr.6). Zona telopeptidelor joacă un rol esențial în agregarea laterală, cu formarea protofibrilelor.

Figura nr.7 : Corespondența dintre tipul de analize instrumentale și organizarea supramoleculară a colagenului

La nivelul realizărilor actuale, comercializate în diverse domenii materialele pe bază de colagen se pot prezenta sub diverse forme: de geluri, bureți, paste, filme sau membrane de diverse forme și dimensiuni.

II.1.2. Proteinele din albușul de ou

Albușul de ou este o sursă naturală de proteine cu o valoare nutrițională, biologică, funcțională și tehnică ridicată [ 22,23]. Dintre componentele oului, albușul de ou, imunoglobulinele (anticorpii) Ig Y din gălbenuș au potențial în aplicațiile biotehnologice.

Albușul de ou este un gel translucid și reprezintă circa 58 % din greutatea oului, conține 88 % apă și 9 % proteine. Albușul de ou se prezintă sub două stări: albușul situat imediat în jurul gălbenușului, care este dens și gelatinos și o peliculă de albuș, subțire din jurul albușului dens. Această peliculă este delimitată la rândul ei de două membrane, care înconjoară întregul ou și previne contaminarea bacteriană. Principalele componente ale albușului de ou sunt proteinele, care au multiple proprietăți funcționale (spumare, emulsificare, coagulare, adeziune, efect antimicrobian,etc.) Proprietățile fizico-chimice și biologice ale proteinelor din albușul de ou, sunt prezentate în tabelul numărul 1.

II.1.2.1. Ovalbumina

Ovalbumina este o proteină de referință, etalon în biochimie, acționează ca și stabilizator, ca proteine de legare, de transport. Are o compozițe elementală asemănătoare cu serul bovin, ca atare este larg utilizat în dezvoltarea unor medii de cultură celulară [ 24-26].

Tabel nr.1: Proprietățile principalelor proteine din albușul de ou

Ovalbumina nativă funcție de temperatura mediului și de valoarea pH-ului se poate transforma în două forme intermediare, S-ovalbumina și I-ovalbumina. Forma S-ovalbumina asigură condițiile stocării și nefertilizării ouălor pentru o lună de zile, la temperaturi de 30 °C. Această formă are stabilitate termică mai ridicată și este mai electronegativă decât forma nativă, este mai susceptibilă la hidroliză datorită prezenței în situsul reactiv a unui lanț elicoidal mai distorsionat ( figura nr.8)

Forma I-ovalbumina (ovalbumina inhibitoare) izomeră cu S-ovalbumina, se obține prin denaturarea termică la 97 °C, conține cu 8 % mai multe structuri α helicoidale, și cu 9 % mai multe structuri pliate β, decât forma nativă Această formă a ovalbuminei inhibă activitatea elastazei din neutrofilelele umane, a tripsinei bovine, a chemotripsinei și a elastazei porcine.

II.1.2.2. Ovotransferina

Ovotransferina este a doua proteină principală din albușul de ou, reprezintă 12 – 15 % din totalul de proteine. Este o glicoproteină monomeră, conține 686 resturi de aminoacizi pe un singur lanț polipeptidic, are masa moleculară de 78 kDa. Punctul izoelectric se situează în jurul valorii de 6,73 pentru forma liberă de ioni ferici (Fe3+), apo-form , și de 5,78 la forma complexată cu ioni ferici. Forma apo este labilă, instabilă la aplicarea unor tratamente fizice și chimice, în schimb forma holo este foarte stabilă la denaturarea termică și la hidroliza proteolitică [27-34].

II.1.2.3. Lizozimul

Este o proteină, o enzimă, ce reprezintă 3,5 % din totalul de proteine prezente în albușul de ou, conține 129 de resturi de aminoacizi, are o masă moleculară de 14,4 kDa. Se află în strânsă legătură cu celelalte proteine, cu ovalbumina, ovotransferina și ovomucoida [35-37]. Compușii tiolici prezenți în albușul de ou, la o temperatură de 60 °C au o acțiune rapidă de inhibare a activității enzimei.

Capetele N-terminale conțin 40- 88 de resturi de aminoacizi, cu conformația α- helicală, grupele funcționale hidrofobe au o tendință de orientare spre interiorul moleculei, iar cele hidrofile spre exterior.

Lizozimul este o enzimă larg răspândită în natură (secreții, lichid interstițial, etc.) și poate fi izolat din plante, bacterii, se află sub formă monomeră, dar există și sub formă dimeră, reversibilă. Sursa cea mai abundentă în lizozimă este albușul de ou 2500 – 3200 µg/ml și secrețiile lacrimale de 3000 – 5000 µg/ml.

Lizozimul prezintă stabilitate la temperatură ridicată, până la 100 °C, precum și în medii acide (pH = 3,0 – 4,0), este stabil în prezența solvenților, iar activitatea enzimatică este optimă în domeniul de pH cuprins între 5,3 și 6,4 și este potențată de includerea în compoziția biomaterialului a unor substanțe ca: EDTA, Butilparaben, Tripolifosfat. Toate aceste proprietăți îi conferă o largă aplicabilitate practică, în diverse domenii.

Astfel în medicină și în farmacie, forma dimeră a lizozimului are o puternică activitate antibacteriană, în special pentru bacteriile Gram-pozitive, este utilizat ca și component bioactiv cu efect antiviral și antiinflamator, în aerosoli pentru tratarea afecțiunilor bronho-pulmonare, pentru protejarea mucozităților nazale.

În industria alimentară, este utilizat ca agent antibacterian, lizozimul este încorporat în diverse preparate semi sau avansat procesate, în compoziția unor membrane, filme, folii în vederea conservării alimentelor alterabile, și ca agent în controlul proceselor microbiene la fabricarea brânzeturilor, vinului și a berii.

II.2. Procedee de extracție și purificare a formelor proteice

II.2.1. Extracția și purificarea formelor colagenice

Sursa principală de colagen fibrilar tip I este pielea animală, țesut conjunctiv dens. Pentru a putea fi utilizat ca biomaterial, forma de colagen extrasă trebuie să aibă structură cât mai apropiată de cea nativă, de triplu helix, caracteristică moleculei de colagen (tropocolagenului).

La ora actuală extracția colagenului se face prin diverse tehnologii. În funcție de intensitatea tratamentelor, de agresivitatea agenților chimici, se pot obține în general următoarele forme:

forme colagenice în stare denaturată, când circa 90% din molecule sunt în stare denaturată;

forma colagenice în stare nedenaturată când aproximativ 70% din molecule sunt în stare nedenaturată (adică cu păstrarea structurii elicoidale).

Tehnologiile de extracție a colagenului în stare nedenaturată permit obținerea colagenului sub formă de suspensii de fibre – pastă de colagen, gel fibrilar și soluții coloidale.

Colagenul nedenaturat se poate izola și purifica prin două tehnologii, în funcție de nivelul structural dorit : în stare moleculară și fibrilară. Acestea permit extragerea colagenului tip I din piele de bovină în mediu apos cu păstrarea structurii triplu helicoidale a moleculelor, respectiv microfibrilelor și fibrilelor.

Cele mai utilizate extracte colagenice care stau la baza obținerii biomaterialelor sunt gelurile și soluțiile de colagen tip I. Gelul este definit ca un sistem cu proprietăți intermediare între ale unui lichid și ale unui solid. Astfel, gel poate fi un fluid puțin viscos, dar și un material foarte viscos. La pH-ul izoelectric gelul de colagen separă fibrile și fibre, devenind dispersie.

Obținerea biomaterialelor pe bază de colagen pleacă de la extracte de colagen nedenaturat – geluri sau soluții – care se condiționeză prin modificări chimice și fizice, uscare liberă sau liofilizare. Pentru păstrarea conformației de helix triplu, procedeele de condiționare nu trebuie să utilizeze o temperatură mai mare de 300C.

Posibilități de extracție a formelor colagenice

Datorită diferențelor structurale și funcționale ale diverselor tipuri de colagen, extracția propriu-zisă nu poate fi standardizată. Pe baza modificărilor structurale ale colagenului extras comparativ cu cel nativ au fost evidențiate trei grupe de metode de extracție:

– Extracția cu săruri neutre și soluții diluate de acizi (NaCl, fosfat de sodiu, citrat de sodiu; acid acetic, acid citric,; soluții tampon acid acetic – acetat de sodiu, acid citric . citrat de sodiu.);

– Extracția cu agenți chimici denaturanți;

– Extracția enzimatică;

Extracția cu săruri neutre și soluții diluate de acizi este o tehnică eficientă

pentru prepararea formei de soluții de colagen nativ, dacă se folosesc inhibitori de proteaze ca: EDTA-disodică (20 mM), diizopropilfluorofosfat (1-5 mM), N-etilmaleimid‘ (2-5 mM), pepstatină (1 µg/mL), iar temperatura de lucru nu trebuie să depășească 40°C.

Extracția colagenului de tip nativ folosind tratamentul cu săruri neutre și acizi slabi se caracterizează, în general, printr-un randament scăzut, care este rentabil numai în vederea obținerii unor forme colagenice cu aplicații în domenii speciale, pretențioase. Cantitatea de colagen care se poate extrage în aceste condiții este de 2-5% din țesuturi adulte și de aproximativ 20% din țesuturi foarte tinere.

Întrucât aplicațiile din multe domenii necesită o cantitate mai mare de material proteic decât cel furnizat prin acest tip de extracție, s-a pus problema găsirii unor metode care să mărească randamentul în produs solubil dar fără a produce modificări la nivelul moleculelor de colagen. Această metodă presupune folosirea unor enzime specifice.

Extracția cu agenți chimici / fizici denaturanți

Acest procedeu afectează structura proteinelor, au loc ruperi atât a legăturilor peptidice, cât și a punților de reticulare dintre catenele laterale ale macromoleculei.

Ureea și guanidina sunt principalii agenți folosiți pentru extracția colagenului atât din țesuturile tinere cât și din cele mature. Metoda este eficientă și pentru izolarea unor tipuri de colagen din culturi de celule. Are loc o puternică fragmentare a moleculei de colagen, chiar până la resturi de aminoacizi, polipeptide, forme colagenice ce nu pot reforma fibra (gelatină, hidrolizate de colagen). Aceste forme de colagen au utilizări în domenii mai puțin pretențioase.

Efect denaturant provoacă și utilizarea unor temperaturi mai mari de 40° C. Entitățile moleculare aparținând acestor cazuri de extracție se numesc gelatină, hidrolizate de colagen.

Extracția enzimatică

Este cea mai utilizată tehnică de extracție a formelor colagenice, bazată pe hidroliza legăturilor peptidice, folosind enzime proteolitice, enzime care acționează la nivelul telopeptidelor și nu atacă regiunea de triplu helix. Procesul de extracție se conduce la o valoare de pH și de temperatură , la care activitatea enzimatică este maximă. Se lucrează la pH-ul optim al enzimei și la temperaturi mai scăzute decât temperatura de denaturare a colagenului. Recomandat este folosirea pepsinei în mediu de acid acetic la pH 2-3. Raportul dintre pepsină și greutatea țesutului supus extracției este de 1:10, iar

timpul optim de extracție este de 24 ore. Alte enzime proteolitice care pot solubiliza colagenul din țesuturi sunt: tripsina, chimotripsina și pronaza. Preparatele enzimatice pe bază de pronază din mucegaiuri conțin atât aminopeptidaze, cât și carboxipeptidaze care desfac în totalitate telopeptidele colagenului.

În cazul aplicațiilor de înaltă exigență, indiferent de strategia și de tehnicile utilizate pentru solubilizare, se impune purificarea solului atelocolagenic. Principalele obiective ale etapei de purificare sunt:

asigurarea eliminării totale a telopeptidelor, a macromoleculelor de colagen prezente în volumul solului;

asigurarea eliminării fracțiilor polipeptidice rezultate ca urmare a degradării macromoleculelor colagenice, survenite în operațiile și tratamentele specifice, aplicate în scop de solubilizare;

reducerea până la limite permise a conținutului de săruri anorganice și de specii chimice organice mic-moleculare;

După parcurgerea etapelor de purificare, solul atelocolagenic dobândește caracteristicile impuse de viitoarele game de utilizare și își mărește capacitatea de stocare. Aceste caracteristici se vor păstra o durată limitată, funcție de natura speciilor chimice partenere macromoleculelor de atelocolagen în sol, de modalitatea de ambalare și de condițiile de stocare. De regulă însă, durata garantată pentru păstrarea funcționalității atinse nu depășește câteva luni, decât dacă modul de ambalare prevede izolarea completă de mediul exterior și menținerea în contact cu un gaz inert.

Metode de purificare

Extractul de colagen este supus operației de purificare atât în vederea îndepărtării substanțelor necolagenice (purificarea inițială), cât și pentru separarea selectivă a tipurilor de colagen.

Purificarea inițială constă în precipitarea selectivă a colagenului cu soluție saturată de NaCl. Concentrațiile de sare necesare precipitării sunt determinate de metoda de solubilizare folosită, după cum urmează:

– Colagenul prezent în soluțiile cu pH acid precipită la concentrația de 2M NaCl;

– Colagenul din soluțiile cu pH neutru precipită cantitativ la concentrația de 4M NaCl.

Separarea tipurilor de coalgen se realizează atât prin precipitări selective cu NaCl, cât și prin folosirea tehnicilor de cromatografie. Precipitarea selectivă cu NaCl este cea mai utilizată metodă și se bazează pe diferențele de solubilitate a diferitelor tipuri de colagen în soluții.

Purificarea prin tehnici de cromatografie se face, în general, după precipitarea selectivă a colagenilor cu NaCl și permite o separare completă a acestora. Se realizează pe coloane cu schimbători de ioni, ca: Carboximetilceluloză (CMC) și DEAE-celuloză.

II.2.2. Obținerea și purificarea formelor proteice din albușul de ou

II.2.2.1. Extracția și purificarea ovalbuminei

În vederea extracției formelor proteice din albușul de ou, lichidul vâscos mai întâi, se supune agitării mecanice timp de 30 minute pentru distrucția membranelor. Lichidul rezultat se filtrează grosier (prin trei straturi de tifon), apoi i se adaugă un volum egal de soluție saturată de sulfat de amoniu. Se agită 5 minute, iar precipitatul rezultat se separă prin centrifugare la 4000 x G, timp de 20 minute. Supernatantul se colectează și i se adaugă lent acid acetic 2 M, sub agitare continuă, până când se atinge valoarea pH-ului de 4,7 (pH-ul izoelectric al ovalbuminei). Precipitatul se separă prin centrifugare la 4000 x G, timp de 20 minute, apoi se solubilizează într-o soluție tampon de fosfat de sodiu de concentrație 50 mM la un pH 7.

Ovalbumina nativă se purifică prin cromatografie de afinitate, utilizând Cibacron Blue Sepharose. Această matrice nu reține ovalbumina, dar reține cea mai mare parte a proteinelor din albușul de ou. Prin urmare ovalbumina va părăsi coloana cromatografică odată cu eluentul. Eluentul folosit este tot soluția de fosfat de sodiu 50 mM.

Fracțiile de proteină din eluent au fost detectate pe un spectrofotometru UV-VIS,

la absorbanța de 280 nm.

Fracțiile proteice se separă prin electroforeză, folosind metoda gel electroforeză (SDS PAGE) cu dodecilsulfat de sodiu și 10 % gel de acrilamidă (figura nr.12).

Obținerea formelor izomere de ovalbumină

Ovalbumina- S se prepară prin incubarea ovalbuminei native în soluție tampon de fosfat de sodiu 50 mM la 55 °C, și pH 10, timp de 16 ore.

Ovalbumina – I se obține prin incubarea ovalbuminei native în aceeași soluție tampon, la 97 °C și pH 7, timp de 30 minute.

Toate izoformele ovalbuminei ( 20-25 µmoli ) se supun incubației în uree 0,9 M la 25°C, timp de trei ore.

II.2.2.2. Izolarea și purificarea ovotransferinei

Protocolul pentru izolarea și purificarea ovotransferinei implică etapele: [ ]

Diluarea albușului de ou cu un volum egal de apă distilată, după a prealabilă

agitare mecanică;

Adaosul unor soluții de bicarbonat de sodiu, clorură de sodiu și clorură ferică, până la ajustarea pH-ului la valoarea 9,0, sub agitare continuă timp de 30 de minute;

Precipitare cu o soluție de alcool etilic 43%, apoi pentru separare se supune centrifugării la 3 220 x g, timp de 20 minute; se reține supernatantul, iar precipitatul se resuspendă în soluție de 43% etanol, urmată de o nouă centrifugare în aceleași condiții;

Fracțiile proteice din supernatantul colectat se precipită cu alcool etilic 59 %, se centrifughează, precipitatul colectat se resuspendă în apă distilată și se ajustează pH-ul la valoarea de 4,7 cu o soluție 50 mM de acid citric; se obține forma holo-ovotransferina;

Pentru obținerea formei apo-ovotransferina se agită mecanic soluția obținută timp de o oră și se filtrează prin hârtie cantitativă Whatman 1,apoi se supune liofolizării;

Prin acest procedeu se atinge un randament de 99,03 %.

II.2.2.3. Izolarea și purificarea lizozimului

Multe studii relatează metode și procedee de izolare și purificare a lizozimului din albușul de o, însă cele mai utilizate metode pentru extracție sunt:

Precipitarea directă și cristalizarea ( Alderton, Felvold, 1946);

Filtrarea directă prin membrană (Chang et.al. 1986, Chiang et al. 1993, Lesnierowschi 1997);

Metoda cromatografică prin schimb ionic ( Chiang et. Al. 1993);

Prima metodă, cea de izolare prin precipitare directă și cristalizare este un procedeu simplu și necesită o etapă de precipitare a albușului de ou cu o soluție 5% de clorură de sodiu. În vederea purificării, precipitatul obținut se desalinizează prin diafiltrare, respectiv ultrafiltrare. Această metodă asigură un randament de 60 – 80 %. Metoda cromatografică prin schimb ionic este un procedeu eficient pentru izolarea lizozimului, se folosesc rășinile schimbătoare de ioni (cationi), de tipul Amberlite, CMC, CM.Sephadex, Duolit C 464. Ultrafilrarea este o metodă laborioasă, costisitoare și oferă un randament mic de separare a lizozimului, de circa 20 %.

Capitolul III

Obținerea și caracterizarea formelor proteice cu acțiune de regenerare tisulară și cu proprietăți antimicrobiene

În procedeele elaborate pentru obținerea biomaterialelor pe bază de colagen nedenaturat, operații cheie sunt considerate renaturarea, modificarea chimică, compatibilitatea cu compuși bioactivi, uscarea sau condiționarea sub formă finală.

Obținerea biomaterialelor se bazează pe metode de reticulare a matricii colagenice și conduc la crearea de legături chimice suplimentare între moleculele și/sau fibrilele de colagen, mărind stabilitatea mecanică și chimică și, în consecință, reducând biodegradabilitatea.

Reticularea chimică constă în reacția colagenului cu aldehide, diizocianați, carboimide, acil-azide, compuși poliepoxidici și polifenolici, care conduc la formarea de legături ionice sau covalente între molecule sau fibrile.

Dintre agenții de reticulare chimică, aldehida glutarică (AG) este cea mai utilizată datorită eficienței mari în ceea ce privește stabilizarea biomaterialelor colagenice.

Reticularea cu AG implică reacții ale grupelor-aminice libere ale lizinei sau hidroxilizinei din lanțurile polipeptidice cu grupele aldehidice, dialdehidice. Alt agenți foarte utilizați în industria prelucrării pieilor, dar și în creșterea stabilității structurii tridimensionale din hidrogeluri sau matrici spongioase sunt tananții vegetali, niște polifenoli care de fapt sunt tot agenți de reticulare, măresc stabilitatea structurală a matricii fibroase colagenice, datorită formării multiplelor legături de hidrogen cu grupele funcționale ale colagenului.

După reticulare, gelurile de colagen pot fi condiționate prin procedeele de uscare, cele mai utilizate fiind liofilizarea și uscarea liberă la temperaturi de cca 25°C. Nici unul din procedee nu produce denaturarea extractelor.

Liofilizarea este o tehnică de condiționare avantajoasă, care constă în uscarea probelor congelate prin sublimarea în vid a gheței. Procesul de liofilizare a gelurilor/soluțiilor de colagen are loc în două etape: înghețare rapidă, urmată de uscare. Prin uscare se îndepărtează la început apa liberă, apoi cea legată de grupele polare ale colagenului. În locul cristalelor de gheață se formează pori, iar colagenul se renaturează în fibrile și fibre. Biomaterialele obținute sunt spongioase, se numesc matrici și au proprietăți similare matricei extracelulare.

Biomaterialele pe bază de colagen au o varietate de forme: hidrogeluri, membrane, matrici, fire, tuburi, compozite, obținute din extracte de colagen nedenaturat

Pentru a realiza biomateriale (pansamente) cu rol de regenerare a țesutului conjunctiv și epitelial este primordial obținerea mai întâi a formelor proteice necesare. Hidrogelurile colagenice proiectate, vor funcționa pe rol de suport, iar efectul antibactericid va fi oferit de ovotransferina, extrasă din albușul de ou.

III.1. Obținerea soluțiilor de colagen prin solubilizare enzimatică pornind de la derma pieilor de bovine

Soluția de colagen prezentată în această lucrare de disertație este obținută de colectivul de cercetare din cadrul Departamentului de Inginerie chimică în textile și pielărie. Datorită proprietăților remarcabile, recunoscute de toți specialiștii din domeniu, biomaterialele pe bază de colagen se bucură de o atenție deosebită și în continuare, datorită biocompatibilității cu organismul uman.

Obținerea soluțiilor de colagen din derma pieilor de bovine implică operații fizico-chimice și mecanice agresive, dar controlabile, urmărind afectarea doar a structurii cuaternare a colagenului, fără afectarea triplului helix și fără modificarea funcționalității chimice a macromoleculei.

S-a optat pentru o tehnică de solubilizare mixtă, în patru etape, capabilă se asigure dezideratele obținerii unei soluții colagenice utilizabilă în domeniul biomedical și farmaceutic. Cele patru etape sunt :

Pretratament în stare brută (aducerea pieilor brute de bovine la o fază de prelucrare, cu grad de rehidratare avansată și depărate, cu caracteristici optime în vederea solubilizării);

Labilizare enzimatică în mediu ușor alcalin (indepărtarea componentelor necolagenice);

Solubilizare enzimatică în mediu acid (inducerea unei hidrolize la nivelul structurilor colagenice, cu efect asupra scindării telopeptidelor macromoleculelor de colagen, precum și asupra gradului de hidratare a structurilor colagenice;

tratament fizico-mecanic (Individualizarea avansată a macromoleculelor de atelocolagen);

III.2. Obținerea formelor proteice din albușul de ou

III.2.1. Protocolul pentru izolarea și purificarea ovotransferinei

Protocolul pentru izolarea și purificarea ovotransferinei implică următoarele etape: [ ]

Diluarea albușului de ou cu un volum egal de apă distilată, după a prealabilă

agitare mecanică (figura nr.15);

Adaosul unor soluții de bicarbonat de sodiu, clorură de sodiu și clorură ferică, până la ajustarea pH-ului la valoarea 9,0, sub agitare continuă timp de 30 de minute (figura nr.16);

Precipitare cu o soluție de alcool etilic 43%, apoi pentru separare se supune centrifugării la 3220 x g, timp de 20 minute; se reține supernatantul, iar precipitatul se resuspendă în soluție de 43% etanol, urmată de o nouă centrifugare în aceleași condiții (figura nr.17);

Fracțiile proteice din supernatantul colectat se precipită cu alcool etilic 59 %, se centrifughează, precipitatul colectat se resuspendă în apă distilată și se ajustează pH-ul la valoarea de 4,7 cu o soluție 50 mM de acid citric; se obține forma holo-ovotransferina;

Pentru obținerea formei apo-ovotransferina se agită mecanic soluția obținută timp de o oră și se filtrează prin hârtie cantitativă Whatman 1,apoi se supune liofolizării;

Observații pe parcursul derulării experimentului:

Prin dozarea FeCl3. la valoarea de pH=9,0, forma apo–ovotransferina se transformă în forma holo-ovotransferina, mult mai stabilă în condiții de mediu acid și temperatură ridicată, ceea ce permite utilizarea ei în domenii diverse

(medicină, farmacie, industria alimentară) ;

În vederea purificării ovotransferinei, soluția obținută se precipită cu etanol 59 %, apoi pentru îndepărtarea fierului în general se aplică metoda cromatografică de schimb ionic;

Avantajele extracției ovotransferinei din albușul de ou prin metoda precipitării:

Este o procedură simplă, ușor de condus și implică costuri reduse;

Ovotranferina este o formă proteică biocompatibilă cu organismul uman;

Extracția ovotransferinei prin metoda descrisă reprezintă o formă de valorificare superioară a ouălor,este un agent antimicrobian natural;

III.3. Caracterizarea electroforetică a formelor proteice obținute

Metode electroforetice de analiză a proteinelor

Principiul metodei de electroforeza SDS-PAGE o reprezintă mișcarea diferențiată a speciilor chimice încărcate electric (a ionilor) prin atracție sau respingere într-uun câmp electric, în funcție de raportul sarcină//masă

v = µ v = µe · E

unde µ unde:

– µe reprezntă mobilitatea electroforetică a speciilor chimice

Electroforeza este o metodă analitică și preparativă de separare a particulelor și ansamblurilor de particule încărcate electric, sub acțiunea unui câmp electric uniform aplicat din exterior. Metoda are la bază fenomenul fizico-chimic de deplasare sau migrare diferențială a diferitelor particule într-un câmp electric [9,10,11].

Figura de mai jos reprezintă schematic metoda de gel electroforeză a proteinelor.

Figura nr. 18: Reprezentare schematică a gel electroforezei proteinelor

Factori care afectează mobilitatea particulelor:

mărimea și semnalul sarcinii nalitului

natura suportul

suprafața interioară a porilor suportului

tensiunea aplicată

natura și concentrația electrolitului suport (soluțiilor tampon)

forța ionică a soluției de analit și pH acesteia

temperatura și vâscozitatea soluției

Gelurile de poliacrilamidă se formează prin polimerizarea acrilamidei monomerice în lanțuri polimerice șilegarea între ele a lanțurilor prin bis-acrilamidă. SDS ( sodium dodecylsulfat) este un agent tensioactiv care disociază proteina ( dacă este formată din mai multe subunități) și desfășoară complet fiecare lanț polipeptidic, formând un complex SDS – polipeptid. În acest complex, lanțul polipeptidic este acoperit cu un strat de molecule SDS, astfel încât lanțurile hidrocarbonate ale acestora (ale moleculelor SDS) sunt într-o strânsă asociere hidrofobă cu lanțul polipeptidic.

Când proteinele sunt tratate cu SDS și apoi sunt supuse electroforezei într-un gel de acrilamidă ( cu rol de sită moleculară), viteza lor de migrare este dată de masa moleculară a particulei SDS – polipeptid, pe baza principiului excluderii moleculare. Câmpul electric furnizează forța, care dirijează „ cernerea” moleculară. Pentru calibrarea unui gel se supun migrării, comparativ și proteine de masă moleculară cunoscută ( markerii). Localizarea proteinelor în gel poate fi determinată prin colorarea cu Coomassie Blue, urmată apoi de decolorare, uscare. [ 38-41]

III.3.1. Caracterizarea electroforetică a soluției de colagen

Caracterizarea electroforetică a soluției de colagen s-a realizat prin tehnica SDS-PAGE în sistem continuu, în prezența reducătorilor, în tampon TRIS cu pH 8,3 ± 0,2. Proba s-a supus denaturării cu clorhidrat de guanidină și a fost saturată cu dodecilsulfat de sodiu (SDS), prin încălzire la 90C, timp de 30 minute, sub agitare intermitentă. Sistemele tampon anodic și catodic au fost identice, conținând 25 mM TRIS și 192 mM glicină/litru, precum și 0,1 % SDS. Migrarea electroforetică a fost realizată sub curent constant, de 20 mA. În paralel cu proba de analizat, a fost supus electroforezei și un amestec etalon de proteine de tip Roti-Mark Standard. După stoparea migrării, gelul a fost fixat cu soluție 400mL/l alcool etilic și 100mL/l acid acetic, apoi colorat cu soluție alcoolică de 0,025% Comassile Brilliant Blue. Ulterior s-a procedat la decolorarea în două etape, în soluții alcoolice de acid acetic (prima conținând 400 mL/l alcool etilic și 70 mL/l acid acetic, iar cea de-a doua 50 mL/l alcool etilic și 70 mL/l acid acetic). După decolorare, gelul s-a supus zvântării pe uscător sub vid, iar apoi s-a fotografiat.

În figura următoare se prezintă distribuția benzilor de migrare electroforetică a probelor de colagen. Se remarcă prezența celor trei tipuri de agregate polipeptidice specifice formelor colagenice nedenaturate, intacte, respectiv două benzi cu mase molară de circa 128 și 116 kDa, două benzi cu masă molară corespunzătoare dimerilor alcătuiți din polipeptidele (11, generată de asocierea covalentă a două catene polipeptidice 1 și 12, generată de agregatul covalent al câte unei catene polipeptidice de tip 1 și 2), precum și o bandă γ, corespunzând hetero-trimerului AC de tip I, asociat cu agregate supramoleculare.

Soluția de colagen prezentată în această lucrare de disertație este obținută de colectivul de cercetare din cadrul Departamentului de Inginerie chimică în textile și pielărie. Datorită proprietăților remarcabile, recunoscute de toți specialiștii din domeniu, biomaterialele pe bază de colagen se bucură de o atenție deosebită în continuare, datorită biocompatibilității cu organismul uman.

Realizarea biomaterialelor pe bază de colagen sub formă de suporturi pentru cedare locală de medicamente în cantitatea și cu viteza dorită are ca motivație utilizarea acestora în tratamentul diferitelor afecțiuni ale pielii (răni, arsuri, infecții provocate de diferite bacterii,etc. ) și/sau țesuturi moi (boli paradontale, ulcerații ale mucoaselor)

Colagenul pe lângă funcția de suport de cedare, acționează ca pansament biologic pentru regenerarea țesuturilor.

III.3.2. Caracterizarea electroforetică a proteinelor din albușul de ou

În figura 20 se prezintă distribuția benzilor de migrare electroforetică a probelor de proteină, în paralel cu cele ale etalonului de masă molară. Se remarcă prezența celor două tipuri de agregate polipeptidice specifice formelor proteice native din albușul de ou, intacte, respectiv ovalbumina și ovotransferina cu masele molare de circa 45 și 78 kDa.