Biosenzor cu Detectie de Amoniac

Titlu: Biosenzori cu detecție de amoniac

Cuprins:

Introducere

Biosenzori: Definiție, Componente, Funcționare.

Clasificare: Definiție, Istoric și Aplicații.

Biosenzori cu detecție de amoniac: Definiție, Principiu de Funcționare.

Exemple și Aplicații.

Avantaje, Dezavantaje, Tendințe și Concluzii.

Bibliografie.

1. Introducere

Este nevoie de metodă simplă, rapidă și mai puțin reactivă pentru anumite determinări, atât calitativă și cantitativă, de diverși compuși în diverse aplicații. Un număr mare de astfel de cereri există în clinice de diagnostic și în domeniul biotehnologiei. Cerința de precizie și inteligența chimice rapid este deosebit de importantă în metodele de ingrijire a sanatatii. Ea a devenit, de asemenea, din ce în ce mai importantă și în alte câteva domenii, cum ar fi medicina veterinară, produse agroalimentare, horticultură, produse farmaceutice, industriile petrochimice, de supraveghere a mediului, de apărare și securitate.

Metodele chimice convenționale suferă din cauza lipsei de specificitate și o serie de interferențe, în afară de a fi lente si costisitoare.

Ce este un biosenzor?

Un biosenzor reprezintă convergența a două discipline contrastante – combină specificitatea și selectivitate a sistemelor biologice cu puterea de calcul a microprocesorului. Un biosenzor este un dispozitiv care încorporează un element de recunoaștere biologic, fie direct legat sau integrat cu un traductor. Biosenzori clasici pot fi definiți ca dispozitive analitice în care o componentă biologică este cuplată cu un traductor pentru a converti un semnal biologic într-unul electric. Este o domeniu foarte divers, ceea ce face utilizarea de expertiză în biochimie, imunologie, optică fizică, electrochimie, stiința materialelor, semiconductori, electronica si o multime de alte științe și alte discipline de inginerie. O reprezentare schematică a unui biosenzor tipic poate fi văzut în Figura 1.

Figura 1. Componentele unui biosenzor, reprezentare schematică.

2. Biosenzori: Definiție, Componente, Funcționare.

Conceptul de biosenzor a fost propus mai mult de patru decenii în urmă. Astăzi există mai mult de 60 de dispozitive comerciale disponibile pentru aproximativ 120 de analizat diferite. Printre acestea sunt senzori pentru conținut molecular scăzut – substanțe în masă, senzori pentru componente de enzime și senzori pentru macromolecule (cum ar fi virusii, micro-organisme) (Meixner 1995). În jurul valorii de 12 – 15 milioane dolari SUA pe an se cheltuiesc pe scopuri analitice în întreaga lume. Acestea includ utilizarea de enzime în chimie clinică, industria alimentara și cosmetica și biotehnologie pentru măsurarea a 80 de substanțe diferite. Probleme fundamentale referitoare la costul de biomolecule și intermediare, de depozitare, operațional etc., de stabilitate poate contribui la o astfel de dezvoltare relativ lentă. Imobilizarea biomoleculelor permite reutilizarea materialelor costisitoare și permite o simplificare semnificativă a aparatului analitic. Componentele unui biosenzor sunt după cum urmează:

(1) element sensibil din punct de vedere biologic sau biocatalizator: aceasta este, în general, un sistem biologic imobilizat sau o componentă care este capabilă să recunoască în mod specific molecula țintă, printre multe altele. Biocomponente utilizate în principal în proiectarea de biosenzori sunt enzime, anticorpi, organite, bacterii, celule întregi, straturi de țesut,etc

(2) Traductor: traductorul convertește într-o informația bio într-un semnal electric măsurabil, cum ar fi valori de curent sau tensiune. Semnalele înregistrate de traductor pot fi afișate în mod direct pe un ecran/dysplay, sau pot fi prelucrate de către un microprocesor sau de amplificator sau cu alte tehnici de procesare a semnalelor. Traductoarele cele mai cunoscute și utilizate în mod obișnuit sunt enumerate în Tabelul 1.

(3) Amplificarea și procesarea semnalelor: acestea sunt repreyentate de componente electronice standard folosite pentru a procesa semnalul de la traductor într-un afișaj/ecran, care este cea mai mare parte o concentrare în unele unități convenabile. Uneori ecranul poate fi simplu, indicând doar dacă dispozitivul funcționează sau nu.

Cei mai timpurii biosenzori utilizau electrozi convenționali (electrod de pH; oxigen electrod, electrozi ion-selectivi, etc) și funcționau ca un traductor în conjuncție cu un biocatalizator adecvat. Electrodul enzima este o combinație de electrod senzor cu unul imobilizat (sau indisolubilizat prins) enzimă, care oferă o metodă extrem de selectivă și sensibile pentru determinarea unui anumit substrat. Unul dintre cei mai vechi tipuri de biosenzori pentru glucoză folosește electrodul de oxigen pentru măsurarea scăderii concentrației de oxigen.

Primul biosenzor, creat de Clark și Lyon (1962) a introdus conceptul de „electrod enyimatic solubil”. Următorul model de biosenzor dezvoltat este cel al lui Updike și Hicks (1967), care a imobilizat oxidaza de glucoză într-un gel prin intermediul unui electrod de oxigen polarografic, cu scopul de a măsura concentrațiile de glucoză în fluidele biologice. Electrozi enzimatici timpurii au utilizat traductoare cu sonde voltametrice sau amperometrice, de exemplu, cu care au măsurat curentul produs la cererea a aplicat un potențial constant (metoda amperometrică) sau de producție spontanț a unui potențial în în condiții de curent zero (metoda voltametrică sau potențiometrică). De exemplu, un electrod pH este o sondă voltametrică, în timp ce, un electrod de oxigen este o sondă amperometrică.

Primul electrod enzimatic potențiometric (fără potențial extern aplicat, tensiunea produsă este monitorizată) a fost descris de Guilbault și Montalvo pentur studiul ureei în 1969. De atunci, peste 100 de modele diferite de electrozi au apărut în literatura de specialitate (Guilbault 1984). Cel mai vechi biosenzor pentru glucoză este prezentat schematic în Figura 2.

Figura 2. Schema de biosenzor de glucoză original. Electrodul Ag / AgCl este înfășurat în jurul corpului a electrodului de lucru. Electrodul de bază este stabilit la un potențial de -0.6 V (adecvat pentru reducerea de oxigen) și curentul actual se măsoară prin metoda amperometrică.

Diagrama ilustrează toate componentele esențiale. Traductorul este un electrod de oxigen, de exemplu, scăderea tensiunii de oxigen din cauza oxidarii de glucoză de enzima este de fapt măsurată. Acest senzor prezintă mai multe dezavantaje: (i) în cazul în care alte specii sunt prezente redox (care poate fi reversibil redusă la potențialul de operare), sunt așteptate să aibă loc anumite interferențe și (ii) în cazul în care concentrația de oxigen inițială este mică din anumite motive, atunci valorile citite nu pot fi exacte, acurate. Acesta este un exemplu de biosenzori de primă generație, cei actuali sunt de departe biosenzori modemi în determinarea glucozei și sunt mult mai rezistente la interferențe și nu depind în mod critic de concentrația de oxigen inițială. Răspunsul de la electrod este relativ lent, datorită existenței unei bariere de difuzie. În Figura 2, biocatalizatorul poate fi o pastă de enzime, un strat de șesut, o emzimă imobilizată într-o matrice organică, etc..

Manșonul izolator pe partea de electrod asigură că aceste contacte soluția electrod numai prin biocatalizator. Electrodul de bază poate fi fie de Pt sau Au sau o tijă de carbon sticloasă. Acest electrod de bază acționează ca un electrod de oxigen și poate fi utilizat în modul amperometric la un potențial adecvat. O membrană semipermiabilă, ca de exemplu, un nailon subțire, celofan sau alte materiale subțiri adecvate, țin biocatalizator bine apăsat în poziție contrar electrodului de bază. "O" inel poate fi o bandă de cauciuc pentru a menține membrana întins bine pe catalizator. Electrodul auxiliar (Ag / AgCl) este înfășurat în jurul electrodului principal. Trecerea curentului prin electrod este proporțională cu concentrația de oxigen de la suprafața electrodului. Acest set-up poate fi însă adaptat în funcție de specificitate dacă este necesar. Folosind enzime adecvate (care catalizează o reacție în care oxigenul este consumat), acest lucru poate fi folosit pentru o serie de diferite substraturi.

Membranele introduc o barieră difuzivă care încetinește răspunsul. Cu toate acestea, sunt foarte de dorit deoarece acestea împiedică depunerea a macromoleculelor biologice (de exemplu, proteine ​​și polizaharide), pe suprafața electrodului. Cu inhibitori de enzima de glucoză amestecat cu agar-agar, gelatină, BSA sau de un alt tip diferit de matrice care formează o pastă sau un gel, se poate obține un biocatalizator simplu stabil. Pastă sau gel se poate aplica în strat subțire pe partea de sus a electrodului, care ăn acest fel este protejat cu o membrană impermiabilă. Fiecare electrod are nevoie de calibrare frecventă și de multe ori există un drift considerabil în valorile curentului măsurat. Acest analizor poate măsura conținutul de glucoză din tot sângele, plasmă sau ser, fiind necesare cantități foarte mici de probă. În electrozi enzimatici, enzima este imobilizată aproape de suprafața electrodului. Acest lucru reduce cantitatea de material necesară pentru a efectua o de analiză de rutină și elimină necesitatea de a analiza frecventă a preparării enzimei în scopul de a obține rezultate reproductibile. În plus, stabilitatea enzimei este de multe ori îmbunătățit, atunci când este încorporat în un sistem corespunzător de matrice de gel. De exemplu, un electrod pentru determinarea glucoză pregătit prin acoperirea unui electrod de platină cu oxidaza de glucoză legată chimic, ar putea fi folosit pentru o perioadă mai mare de 300 de zile (Guilbault și Lubrano 1973).

Electrodul enzimatic funționează printr-un proces strcturat în cinci etape:

Substratul trebuie sa difuzeze prin membrana semipermeabilă la biocatalizator, substratul trebuie să fie transportate la site-ul activ al biocatalizatorului; o reacție biochimică apare la site-ul activ și astfel produsele sunt formate, produsele la întreagul biocatalizator la suprafață traductorului, concentrația produsului este măsurată la suprafața electrodului prin procedeu electrochimic. Toate procesele de mai sus pot fi rata de-limitarea, și cel mai lent pas determină rata globală a întregului sistem (de exemplu, curentul produs). Condițiile ar trebui să fie optimizate, astfel încât actualul curent produs să fie proporțional cu substrat (glucoza) de concentrație.

Pe scurt, un biosenzor este un dispozitiv de analiză care cuprinde un element biologic interfațat direct la un traductor de semnal de recunoaștere, care se referă, împreună concentrarea unui analit sau grup de analiți la un răspuns măsurabil. O modalitate mai definite pentru a vizualiza biosenzori este ca un sub-tip de senzori chimici care se bazează pe biochimic de recunoaștere. Biosenzori de fibră optică sunt dispozitive analitice, în care un dispozitiv de fibră optică servește pe post de element traducător de semnal. Scopul este de obicei pentru a produce un semnal care este proporțional cu concentrația unei substanțe chimice sau biochimice, cu care elementul biologic reactionează.

Componenta bioactivă ar putea fi o enzimă, un anticorp, o celulă (bacteriene sau fungice), un strat de țesut, un receptor, de acid nucleic. Acesta este utilizat pentru a recunoaște și de a interacționa în mod specific cu materialul analizat în cauză.

În general, există două categorii de de biosenzori, după cum urmează:

•biosenzori catalitici.

În acest tip de biocatalizatorilor biosenzor, cum ar fi enzimele și Celulele microbiologice, sunt folosite pentru a recunoaste, lega, și converti o molecula chimic.

•biosenzori afini.

În acest tip de molecule biosenzor receptorilor, cum ar fi anticorpi, acizi nucleici, lectine și receptori de hormoni, sunt folosit pentru a lega molecule ireversibil și non catalitic.
Elementul transducing de un biosenzor este folosit pentru a converti recunoașterea pas biochimice într-un semtip de molecule biosenzor receptorilor, cum ar fi anticorpi, acizi nucleici, lectine și receptori de hormoni, sunt folosit pentru a lega molecule ireversibil și non catalitic.
Elementul transducing de un biosenzor este folosit pentru a converti recunoașterea pas biochimice într-un semnal optic cuantificabile care are o relație directă cu concentrația de analit. La data, mai multe tipuri de traductoare au fost utilizate în biosenzor aplicații pe scară largă și pot fi grupate în electrochimică, optice, piezo-electrice, acustice, și calorimetrice dispozitive.

3. Clasificare: Definitie si Aplicatii.

2.1. Clasificarea de biosenzori în funcție de tipul de transducție

Există mai multe tipuri de traductoare. Unele frecvent utilizate metode de transducție sunt prezentate în Tabelul 1.

Tabel 1. Tipuri de traductoare utilizate in prelucrarea informației biologice în semnale electrice măsurabile.

2.1.1 Traductoare electrochimice

Acestea se bazează pe monitorizarea electrochimică a răspunsului de la biosenzori.

Există trei tipuri de traductoare: potențiometrice, amperometrice și conductometrice.
(i) transducția potențiometrică: Un biosenzor potențiometric monitorizează potențialul în condiții de curent zero. Potențial generat este direct proporțional cu logaritmul concentrației analitului.
Baza a acestui tip de monitorizare electrochimică este ecuația lui Nernst, care se referă la potențialul de electrod (E) a concentrațiilor speciilor oxidate și reduse, așa cum se vede din relația:

(1)

(ii) transducția amperometrică: amperometria cuprinde un grup de tehnici electroanalitice. Acesta monitorizează curentul generat la un potențial bias fix. Se obține relația liniară între concentrația analitului și a curentului generat. Mai multe tehnici de cum ar fi voltametria ciclică, studii de analiză a fluxului de injectare, etc sunt frecvent utilizate. Majoritatea biosenzorilor se bazează pe tehnici amperometrice de detectare.

(iii) transducția conductometrică: Aceasta este o tehnică în care măsoară modificarea concentrției ionilor. Dacă biocatalizator produce sau consumă ioni, și soluție de suport are coeficient scăzut de conductivitate electrica, aceasta este adesea un mod convenabil cea mai simplă tehnică de utilizat.

2.1.2. Traductoare optice

Metode optice au fost folosite pentru a monitoriza concentrațiile analitului. Proprietăți ca cea de absorbție, indici de refracție, fluorescență, fosforescen, chemiluminescență, etc, pot fi folosite în scopul de a monitoriza recunoaterea biologice în biosenzori. Dispozitivele pot fi miniaturizat, prin utilizarea fibrelor optice, care acionează ca ghiduri de lumină.
Detectoarele sunt de multe ori fotodiode semiconductoare. Aceste dispozitive sunt de multe ori utile pentru analiza de la distanță deoarece semnalul luminos este rezistent la zgomotul electric.

2.1.3. Traductoare piezoelectrice

Piezoelectricitatea este o proprietate posedată de cristalele anizotrope (lispește simetria) cum ar fi de cuarț. Când un astfel de cristal este stresat, se creiază un câmp electric. Într-un mod similar, atunci când un câmp electric este aplicat cristalului, acesta suferă o deformare mecanică. La o tensiune alternativă, cristalul oscilează la frecvența aplicată.

Frecvena natural a cristalului este legatț de masa și constantele elastice ale cristalului.
Fenomene, cum ar fi de electrodepunerea sau dizolvarea, care au loc cu modificarea masei cristaline, sunt studiate. Mulți biosenzori biosenzori bazați pe microbalanțe sunt, de asemenea, utilizati.

2.1.4. Termistoare

Acestea sunt dispozitive folosite pentru a monitoriza schimbarea entalpiei unei reacții enzimatice de bază. Dacă modificarea entalpiei în procesul de biocatalitice este semnificativă, atunci temperatura de traductor (termistorului) se modifică și această schimbare poate fi monitorizată. Un termistor este altceva decât un termometru cu rezistență în miniatură, cu sensibilitate ridicată.

2.1.5. Semiconductor pe bază de electrozi

Acestea sunt tranzistor-cum ar fi dispozitive ( de tip npn, de obicei), sunt cele mai cunoscute configurații de Tranzistori cu efect de câmp (TEC). Elementul biologic poate fi imobilizat la suprafața de intrare a TEC pentru a obține TECE (Tranzistor cu Efect de Câmp Emzimatic). Ele funcionează în mod potențiometric.

2.2. Clasificarea biosenzorilor pe baza elementului biologic

2.2.1. Senzori de enzime

Așa cum am menționat mai devreme de utilizare biosenyorilor pe bază de glucoză, este studiată extensiv. De obicei, este utilizată metoda convențională cu detecție de oxigen în molecula de peroxid este monitorizată. Utilizarea de enzima reconstituite conectate printr-o legătură moleculară direct la suprafața electrodului pentru un mai bun transfer de electroni între enzimă și electrod. În plus față de oxidaza de glucoză, se pregătesc alte enzime pentru biosenzori. Un exemplu important este utilizat electrod cu penicilină să monitorizeze conținutul de penicilină de ciorbe de fermentație. Acest electrod se bazează pe o sonda pH-ul acoperită cu penicilină imobilizată (Kobos 1980). Sonda răspunde la schimbările din [H+] rezultate din disocierea acidului penicilloic format. Un alt metabolit adesea monitorizat, este nivelul de urină în sânge (SUN), pentru evaluarea problemelor renale sau insuficiență. Acest senzor este pe bază de enzima ureazei și, de obicei, se bazează pe modificările pH-ului în timpul procesului de hidroliză a ureei. Petersson et al (1987) au dezvoltat un analizatoa ureei pentru probe nediluate prin utilizarea unui electrod selectiv ammonium ion urează acoperit într-un sistem de analiză a fluxului de injecție. Determinarea conținutului lactat este importantă pentru diagnosticul de șoc și a infarctului miocardic, neonatologie și în medicina sportivă. Un exemplu de un senzor de lactat este poliuretanul imobilizat lactat dehidrogenazei utilizat pentru determinarea conținutului lactat a întregului sânge cu glukometerul ECA20 (ESAT660) (Schubert et al. 1989).

2.2.2. Immunosenzori

Imunodozarea electrochimică este de asemenea de importanță majoră. Excelente limitele de detecție au fost realizate pe eșantioane de volum mic. Tehnici electrochimice moderne au stimulat dezvoltarea imunosenzorilor electrchimici. Enzimele pot fi folosite ca un sistem eficient de etichetă pentru imunoteste. Imunotestele cu enzime omogene constau în schimbarea intensității semnalului atunci când Ag * (etichetate), se leaga cu Ab pentru a forma AB:Ag *. Capacitatea de a distinge electrochimic Ag * de * Ag: AB este utilizată fără a fi nevoie de separare.

Broyles și Rechnitz (1986) au conceput un teste imunologice pentru anticorpi din medicamente. Testul se bazează pe inhibarea enzimei de antigen conjugat (E-Ag), în substrat corespunzător de către AB, care este analitului. Activitate este monitorizată prin detecție amperometrică a ratei de oxidare NADH la electrodul de platină. Un electrod magnetic de lucru a fost folosit de Robinson et al (1985), în scopul de a separa enyimele libere și legate în scopul de a monitoriza răspunsul electrochimic. Anticorpi monoclonali pentru chorionogonadotropin umană (hCG) au fost utilizați. Particule magnetice au fost folosite ca faza solidă.

Au existat rapoarte privind conectarea directă a Ab pe suprafata electrodului de carbon, astfel încât electrodul magnetic nu este necesar (Robinson et al. 1986). A fost dezvoltat un biosezor pentru măsurarea on-line de progesteron în lapte de bovine și de detectare a călduri de către Claycomb și Delwiche (1998). Ea se bazează pe un format modificat de EIM (Imunoenzimatică), format de recunoaștere moleculară, concepute pentru a opera online într-un salon de produse lactate, cu un timp de răspuns de aproximativ 8 minute.

2.2.3. Senzori pe bază de celule

Muncă semnificativă a fost făcută pe senzorii electrochimici, amperometeric precum și potențiometric, folosind microorganisme (Corcoran și Rechnitz 1985). Celulele sunt fixate pe suprafata electrodului între membrana de detectare a sondei și membrana de fixare a acesteia.
O membrana semipermeabilă este folosită pentru acest scop. Principiul general de funcționare și de răspuns pe bază de celule este asemănător și comparabil cu cel de electrozilor pe bază de enzime preparate prin detecția electrochimică. Cu toate acestea, aceste dispozitive au unele avantaje față de electrozi enzimatici (de exemplu, un cost redus, activitate mai mare și catalitice îmbunătățit de stabilitate). Ele pot fi regenerate în scopul de furnizare de celule active, prin urmare, durata de viață a electrodului este crescut. Dezavantajul major este selectivitatea slabă a microbilor din cauza comportamentului multireceptor a celulelor intacte. Ei au, de asemenea, nevoie de un timp de recuperare mai lung între măsurători din cauza creșterii numărul de celule de pe suprafața electrodului care duce la constrângeri de difuzie.

Acest tip de biosenzori pot fi utilizași în procesele de fermentație și de analiza clinică de fluide biologice. Comentarii excelente pe biosenzori pot fi găsite în articole scrise de către Thompson și Krull (1991) și Frew și Hill (1987). Acest tip de biosenzori pe bază de analizor depinde în principal de utilizarea sa specifică în medicină, industrie, mediu sau de apărare. În cadrul fiecărui sector, cerința poate fi, de asemenea, total diferită ca urmare a site-ului specific în cazul în care sistemul trebuie să fie utilizat. Necesitatea de biosenzori pentru analiza clinică a fost extinsă de la patul de monitorizare sau de implantare directă într-un tip de organe, datorită ingineriei biomedicale. Cu toate acestea, dificultăți grave trebuie să fi depășite, și anume cele de biocompatibilitate, durata de viață, sterilizare, etc.
În general, pentru biosenzori următoarele linii de aplicații sunt de importanță sporită:
– Diagnostice medicale, inclusiv monitorizarea pacientului în medicina intensiva pat și partea de analiză.

– Analiza de mediu, mai presus de toate poluării cu deșeuri-apă și apă de control.
-Controlul calității alimentelor, de exemplu, pentru puritate și prospețime.
– Procesul de control și testarea substanței, și utilizarea în altele chimic-farmaceutic.
– Detectare de droguri.

2.3. Istoric: Trei generații de Biosenzori

De-a lungul anilor, biosenzorilor au parcurs un drum lung. În cazul electrozilor amperometrici enzimatici și de o oxidoreductaza este de obicei implicatș și oxidaza de glucoză este una dintre cele mai larg și studiat extensiv enzime pentru utilizare în senzori de glucoza.

Cazul 1 (prima generație). Enzima glucoză oxidază (GOD) reacționează cu glucoza pentru a produce H2O2 în prezența oxigenului. Astfel, concentrația de oxigen la suprafața electrodului scade. Grupul redox în GOD este FAD (Flavin adenin dinucleotid), care trece printr-o 2e- 2H+ reducere. Reacția generală este descrisă după cum urmează:

Atât FAD și FADH2 sunt foarte solubile în apă, dar sunt puternic legate în enzime si se schimbă FAD/FADH2 în soluție. În reacție de mai sus am arătat, prin urmare, procesul redox de FAD cât și a enzimei. Scădere a concentrației de O2 este proporțională cu concentrația de glucoză (în condiții experimentale adecvate). Alternativ, la produsul format (H2O2) poate fi, de asemenea, măsurată la un potențial adecvat.

Cazul 2 (a doua generație). O dificultate în procesul de oxidoreductază este concentrația de oxigen limitată. Acest lucru poate fi o problemă acută în aplicații vivo, în care, pe o baza moleculară, concentrația de oxigen nelegat poate fi mai mică decât că a analitului, având consecință limitari stoichiometrice ale enzimei în reacție cu oxigenul. O metodă pentru a depăși această problemă este de a sunstitui oxigenul, cu un mediator artificial. Mediatori de electroni măresc rata la care transferul de electroni are loc (Carr și Browers 1980, Cass et al. 1984). Rolul lor este de a asigura transferul electronilor între enzima și electrod, ața cum se poate vedea în Figura 3. Cu toate acestea, una dintre problemele majore este faptul că, în general, este dificil să se obțină un potențial redox al moleculei adecvat pentru a avea un randament ridicat (în așa fel încât molecula mediator poate face același lucru în mod repetat, ca un catalizator). În cazul în care nu sunt potentiale adecvate, atunci ar rezulta ineficiență energetică și mediatorul ar suferi reacții adverse. Prin urmare, molecula mediator selectată trebuie să aibă un anumit potențial redox adaptat la condițiile specifice experimentale.

Figura 3. Transportul de electroni reprezentat schematic într-o reacție mediată.

Unii dintre mediatori de electroni frecvent utilizați sunt Ferro / Ferri hidrochinonă cianuri, ferocen, coloranți diverse redox, etc. Una dintre limitările întâlnite în acest caz, este datoratâ faptului că orice alte specii redox electroactive pot provoca unele interferențe. Oxigen poate concura, de asemenea, cu mediatorilor pentru electroni, dar natura cinetica (potențial aplicată) și chimică a colorantului va determina gradul de interferență.

Cazul 3 (a treia generație). În caz de mediere scăzută, electrodul schimbă electroni direct cu enzima și, prin urmare, cu substratul. Astfel, potențialul redox al enzimei este realizat. Cu toate acestea, acest lucru este adesea dificil deoarece site-ul activ al enzimei este situat la distanță de suprafata electrodului. Pe de altă parte, dacă enzima este foarte aproape de suprafața electrodului, acesta va avea puțină libertate conformatională și acces limitat la substrat, va rezulta mediul înconjurător deshidratat. Prin urmare, acesta este doar la alegere foarte atentă și judicioasă că se poate a obține transferul de electroni direct la și de la electrod. O altă alegere, recent a pledat, este utilizarea de fire moleculare, care pot fi folosite pentru a conecta site-ul enzima activ la suprafața electrodului cu ajutorul unei legături chmice. Acest sistem de reacție poate fi descris după cum urmează:

(spre electrod)

Acest proces nu implică un mediatior sau oxigen, depinde direct de reacția de oxido-reducere a emzimei cu electrodul. Aceasta este metode da lucru preferată, dar în acleați timp și cea mai complexă. În această schemă, eliminarea interferenței, unul din obiectivele principale, este realizat.

Un starea de echilibru electrochimic semnal este primit după o scurtă întârziere, atunci când rata de ormare a produsului este egală cu rata la care produs difuzează din membrana enzimei. Alternativ, poate fi utilizată o măsură cinetică în care rata de schimb a semnalului electrochimic este monitorizată în funcție de timp. Prin urmare măsurarea semnalului în timp real este foarte importantă.

A treia generație biosenzori este promițătoare, în scopul de a oferi o alternativă puternică și necostisitoare pentru strategiilor convenționale analitice în determinarea speciilor chimice prezente în matrici complexe. Acest lucru este po sibildatorită capacității lor de a discrimina analitul țintă de specii inerte, cu potențial de interferență, fără obligația de a le separarea și de a identificarea, ulterior, toate elementele constitutive ale probei. Acest lucru poate fi pur și simplu, realizat prin utilizarea mai multor enzime diferite pe același traductor și același potențial de scanare (ca în tehnica polarografică), astfel încât să detecteze diferite componente, în condiții de potentiale distincte.

4. Biosenzori cu detecție de amoniac: Definiție, Principiu de Funcționare, Avantaje și Aplicații.

4.1. Definiție.

Figura 4. Diagrama schematică indicând principalele componente ale unui biosenzor. Biocatalizatorul (a) convertește substrat în produs. Această reacție este determinată de traductor (b), care îl transformă în semnal electric. La ieșire din traductor, semnalul este amplificat (c), prelucrat (d) și afișat (e).

Așa cum aminteam mai sus, un biosenzor este un dispozitiv de analiză, care transformă un raspuns biologic într-un semnal electric (Figura 4). "Biosenzor" Termenul este adesea utilizat pentru a defini dispozitivele utilizate de senzori pentru a determina concentrația de substanțe și a altor parametri de interes biologic, chiar în cazul în care nu utilizează un sistem biologic direct. Această definiție foarte largă este folosit de unele reviste stiintifice (de exemplu, Biosenzori, Elsevier Applied Science). Acest capitol va fi dedicat la enzime ca material biologic receptiv, dar trebuie recunoscut faptul că alte sisteme biologice pot fi utilizate ca biosenzori, de exemplu, metabolismul celular, cu caracter obligatoriu ligandului și reacția antigen-anticorp. Biosenzori reprezintă un domeniu care se extinde rapid, în momentul de față, cu o rată de creștere estimată de 60% anual; impuls major vine de la industria de sănătate (de exemplu, 6% din lumea occidentală sunt diabet zaharat și ar beneficia de disponibilitatea unei rapide , corecte și simplu pentru biosenzor de glucoză), dar cu unele presiuni din alte domenii, cum ar fi evaluarea calității produselor alimentare și de monitorizare a mediului. Piața mondială estimată de analiți este de aproximativ 12 miliarde ani-1, din care 30% este în zona de îngrijire a sănătății. Există în mod clar un potențial de expansiune piață vastă în mai puțin de 0,1% din această piață este prezent, folosind biosenzori. Cercetare și dezvoltare în acest domeniu este largă și multidisciplinară, se întinde biochimie, bioreactor știință, chimie fizică, electrochimie, electronică și inginerie software. Cele mai multe din acest curent demers se referă la biosenzori potentiometrici și amperometrică și benzi de hârtie colorimetrice enzimatice. Cu toate acestea, toate tipurile principale de traductoarelor sunt susceptibile de a fi examinate, pentru utilizarea în biosenzori, în următorii câțiva ani.

4.2. Principiu de funcționare a unui Biosenzor

Un biosenzor de succes trebuie să posede cel puțin unele dintre următoarele caracteristici benefice:

Biocatalizator trebuie să fie foarte specific cu scopul de analizelor, să fie stabil în condiții normale de depozitare și, cu excepția, în cazul de benzi de enzime colorimetrice și tijelor de nivel (a se vedea mai târziu), arată o bună stabilitate pe un număr mare de teste (adică mult mai mare decât 100).

Reacția trebuie să fie cât mai independentă de astfel de parametri fizici ca difzie, pH-ul și temperatura pentru a fi ușor de gestionat. Acest lucru ar permite analiza a probelor, cu minim de pre-tratament. Dacă reacția implică cofactori sau coenzime acestea ar trebui, de preferință, să fie, de asemenea, co-imobilizat cu enzime.

Răspunsul trebuie să fie corect, precis, reproductibil și liniar în intervalul de analiză efectuat, fără diluare sau concentrare. Ar trebui să fie, de asemenea, liber de zgomot electric.

În cazul în care este biosenzor utilizat pentru monitorizarea invazivă în situații clinice, sonda trebuie să fie mică și biocompatibilă, să nu aibă efecte toxice sau antigenice. Dacă trebuie să fie utilizat în fermentoare, biosenzorul trebuie să fie sterilizat. Aceasta se realizează de preferință prin autoclavare, dar nu în cazul unui biosenzor cu enzime utilizat în prezent, a cărei rezinstență este scăzută și care se modifică drastic la tratament termic. În orice caz, biosenzorul nu ar trebui să fie predispus la murdărirea sau proteoliza.

Biosenzorul complet indicat trebuie să fie ieftin, mic, portabil si capabil de a fi utilizate de către operatorii de semi-calificați.

Ar trebui să existe o piata pentru biosenzor. Există un scop puțin clar pentru dezvoltarea unui biosenzor dacă alți factori (de exemplu, subvenții guvernamentale, ocuparea forței de muncă continuă de analiști calificați, sau percepția clientului slabă) să încurajeze utilizarea metodelor tradiționale și descuraja descentralizare a testelor de laborator.

Răspunsul biologic al biosenzorului este determinat de membrana biocatalitică care realizează conversia reactantului în produs. Enzimele imobilizate posedă o serie de caracteristici avantajoase care le face deosebit de aplicabile pentru utilizarea în astfel de sisteme. Ele pot fi re-utilizate, care asigură faptul că aceeași activitate catalitică este identică pentru o serie de analize. Acest lucru este un factor important în asigurarea unor rezultate reproductibile și evită capcanele asociate cu pipetare reproduce de enzimă liber altfel necesar, în protocoalele analitice. Mai multe enzime sunt intrinsec stabilizate prin procesul de imobilizare, dar chiar și în cazul în care acest lucru nu se întâmplă, de obicei, nu este de stabilizare considerabilă aparentă. Este normal să fie utilizat un exces de enzime în cadrul sistemului de senzorul imobilizat. Aceasta oferă o redundanță catalitică (și anume h << 1), care este suficientă pentru a asigura o creștere în stabilizarea aparentă a enzimei imobilizate (a se vedea, de exemplu, Figurile 5 și 6).

Figura 5. Variația ratei de reacție catalizată concentrația unei enzime imobilizate. Relația arată trei faze (a) controlul cinetic al enzimei, extrapolat (––), pentru a arăta activitatea cantității echivalente a enzimei libere, (b) controlul mixt intermediar; (c) controlul de ratei transportului extern de substrat.

Figura 6. Stabilizarea aparentă a unei enzime imobilizate, în cazul difuziei controlate. Activitatea utilizabile; –––- activitatea intrinsecă, nerealizabilă peste plafonul impus de activitatea mai lentă (rata de control), difuziei de la substrat la enzimă.

Chiar și acolo unde există o inactivitate a enzimei imobilizate pe o perioadă de timp, aceasta inactivare este de obicei constantă și previzibilă. Orice activitate de degradare este ușor de încorporat într-un sistem de analiză prin interpolarea regulată între analizele standard și analizele de probe necunoscute. Pentru aceste motive, mai multe astfel de sisteme de enzime imobilizate sunt refolosibile de până la 10.000 de ori într-o perioadă de câteva luni. În mod evident, acest lucru duce la o economie considerabilă din punct de vedere relativ costul de enzime de la utilizarea analitică a enzimelor libere solubile.

Când reacția, care apare la membrana enzimatică imobilizată a biosenzorului, este limitată de rata de difuzie externă, procesul de reacție va avea o serie de active valoroase analitice. În special, acesta va fi conformă cu relația 2.

    (2)

Unde: vA reprezintă rata de reacție catalitică pe unitatea de suprafață a enzimei imobilizate.

Constanta de proporționalitate (KL), este cunoscută ca fiind coeficientul (faza locală lichidă) de transfer de masă (cu unități de ms-1), care depinde de difuzibilitatea substratului și distanța efectivă dintre suprafață și restul fazei. KL se definește astfel:

(3)

cu DS reprezintă coeficientul de difuzie în substrat

și δ este grosimea efectivă a substratului,

iar S0 reprezintă concenztrația substratului enzimatic in stare de echilibru.

Rezultă că biocatalizatorul oferă o modificare proporțională în viteza de reacție, ca răspuns la rconcentrația de reactant (substrat), pe un interval liniar substanțial, de mai multe Km ori intrinsecă (a se vedea Figura 7 linia e).

Figura 7. Aceasta arată variația ratei de reacție catalizată de o enzimă imobilizată și concentrația substratului în întregime (B0, care este egal cu [S0] / Km) cu modulul substratului (m, cunoscut sub denumirea de Numărul lui Dankhler și reprezintă raportul adimensional a vitezei de reacție cu viteza de transport). (A), enzimă liberă; (b) m = 1; (c) m = 3; (d) m = 10; (e) m = 100. Sunt stabilite, de asemenea ratele maxime de difuzare de la substrat la suprafață, dat de vA / Vmax = KLB0 (b ', c', d "și e", care arată efectul de scădere coeficienților de transfer de masă, KL = 1,00, 0,33, 0,10 și 0,01, corespunzător la curbe b, c, d și e, respectiv). Ar trebui să fie remarcat faptul că curbele b, c, d și e sunt delimitate atât de curba A cît și de liniile b, c, d și e, respectiv. Control sporit diffusional extinde gama de liniaritate la concentrații mai mici de substrat, dar aceeași Vmax este atinsă în toate cazurile, în cazul în care o concentrație de substrat suficient de mare poate fi realizată.

Acest lucru este foarte util în concentrații ale analitului care de multe ori sunt aproximativ egale cu Km ale enzimelor corespunzătoare, care este de aproximativ de 10 ori mai concentrat decât de obicei, fără diluare, prin utilizarea de enzime în soluție. De asemenea, din ecuația 2, reiese independența vitezei de reacție față de pH, tăria ionică, temperatura și inhibitori. Acest lucru pur și simplu evită problemele dificile cu care se confruntă de multe ori din cauza variabilității de probe reale de analiză (de exemplu, bulion de fermentare, sânge și urină) și condițiile externe. Răspunsul biosenzorului poate fi controlat prin difuzia externă a analitului, care poate fi îmbunătățită prin utilizarea de membrane permeabile între enzima si soluție. Grosimea acestuia poate varia, în funcție de efectele asociate asupra constantei de proporționalitate dintre concentrația substratului și rata de reacție (de exemplu grosimea membranei crește cu stratul de creșterea neagitată (fără diuzie) (δ), care, la rândul său, scade proporțional cu constanta KL, după cum se vede din ecuația 2). Chiar dacă dependența totală a ratei de difuzie externe nu este realizată (sau realizabile), orice creștere a dependenței vitezei de reacție la difuzia externă sau interne va determina o reducere a dependenței de pH-ul, de tăria ionică, de temperatura și de concentrațiile inhibitor.
O componentă fundamentală a unui biosenzor este traductorul (indicat ca "cutie neagră", în Figura 4), care face uz de o schimbare fizică care însoțește reacția. Acest lucru poate fi reprezentat de:

1. Producția de căldură degajată sau absorbită de reacție (biosenzori calorimetrice),

2. Schimbări în distribuția sarcinilor care generează un potențial electric (biosenzori potentiometrici),

3. Mișcarea electronilor produși într-o reacție redox (biosenzori amperometrici),

4. lumina obținută în timpul reacției sau diferență de absorbție de lumină dintre reactanți și a produșiie de reacți (biosenzori optice),

5. Efectele datorate masei reactanților sau a produșilor de reacție (piezo-electrice biosenzori).

După cum am precizat in primul capitol, există trei așa-numite generații de biosenzori; biosenzori prima generație în cazul în care produsul de reacție difuzează la traductor și provoacă răspunsul electrice, biosenzori de a doua generație, care implică mediatori specifici "între reacție și traductor, în scopul de a a genera răspuns îmbunătățit, și biosenzori de generația a treia în cazul în care reacția în sine cauzează un răspuns și nu este necesar nici un produs sau mediator de difuzie.

Semnalul electric de la traductor este adesea scăzut și suprapus pe un nivel relativ ridicat și zgomotoas (de exemplu, conține o componentă mare semnal de frecvență de natură aparent aleatoriu, din cauza interferențelor electrice sau generate în cadrul componentelor electronice ale traductorului) de referință. Prelucrarea semnalului în mod normal, implică scăderea un semnal "de referință" de bază, derivat dintr-un traductor similar, fără nici o membrană biocatalitică, de la semnalul de probă, amplificând diferența de semnal rezultat și în format electronic de filtrare (uniformizare) din zgomotul de semnal nedorit. Natura relativ lentă a răspunsului biosenzor reduce considerabil problema de filtrare de zgomot electric. Semnalul analogic produs în această etapă poate fi de ieșire în mod direct, dar este, de obicei, convertit într-un semnal digital și este trecut la un stadiu microprocesor în cazul în care datele sunt prelucrate, transformate în unități de concentrație și de ieșire la un dispozitiv de afișare sau depozitul de date.

4.3. Biosenzori amperometrici

Biosenzori amperometrici funcționează prin producerea unui curent atunci când se aplică un potențial între doi electrozi. Ei au, în general, timpi de răspuns, zone dinamice și sensibilitățile similare cu cele ale biosenzorilor potentiometrici. Cei mai simpli biosenzori amperometrici în utilizarea comună implică electrodul de oxigen Clark (Leland C. Clark Jr. așa-numitul părintele biosenzorilor, care a trăit în perrioada1918–2005), așa cum se poate vedea în (Figura 8).

Figura 8. Diagrama schematică a unui biosenzor amperometric simplu. Un potențial este aplicat între catod de platină central și anodul de argint inelar. Acest lucru generează un curent (I), care se propagă între electrozi prin intermediul unei soluții saturate de KCl. Acest compartiment electrod este separat de biocatalizator (oxidaza de glucoza aici arătată, GOD), printr-o membrană subțire de plastic, care permite doar oxigenului să treacă. Soluția analitului este separat de biocatalizator de către o altă membrană, permeabil la substrat (e) și produs (e). Acest biosenzor are de obicei, aproximativ 1 cm in diametru, dar a fost redus la 0.25 mm diametru folosind un catod de Pt într-un anod de argint placat cu ac de oțel și cu utilizarea membrane acoperite.

Acesta constă într-un catod de platină la care oxigenul este redus și un electrod de referință de argint/clorură de argint. Atunci când un potențial de -0.6 V, în raport cu electrodul de Ag/AgCl se aplică la catodul de platină, un curent proporțional cu concentrația de oxigen este produs. În mod normal, cei doi electrozi sunt introduți într-o soluție de clorură de potasiu saturată și separat de soluția cea mai mare parte printr-o membrană de plastic de oxigen-permeabil (de exemplu, teflon, politetrafluoretilenă). Vor avea loc următoarele reacții:

La anodul de Ag: 4Ag0 + 4Cl- 4AgCl + 4e- 

La catod: O2 + 4H+ + 4e- 2H2O 

Reducerea eficientă a oxigenului la suprafața catodului determină concentrația de oxigen la punctul zero. Rata aceastei reduceri electrochimice, prin urmare, depinde de rata de difuzie a oxigenului din toată soluția, care este dependentă de gradientul de concentrație și, prin urmare, de întreaga concentrație de oxigen (a se vedea, de exemplu, ecuația 3).

  (3)

unde: v este rata de producere a reacției,

A reprezintă suprafața totală,

KL este coeficientul de transfer de masă

S0 reprezintă concentrația substratului enzimatic in stare de echilibru,

iar S este concentrația finală a substratului complex.

Este clar că un procent mic, dar semnificativ, din prezența oxigenului în bulk este consumată de acest proces; electrodul de oxigen de măsurare a ratei de un proces, care este departe de echilibru, în timp ce electrozii de ioni-selectivi sunt folosiși aproape în condițiile de echilibru. Acest lucru face ca electrodul de oxigen să fie mult mai sensibil la schimbările de temperatură decât senzorii potentiometrici. O aplicație tipică pentru acest tip simplu de biosenzor este determinarea concentrațiilor de glucoză prin utilizarea unei membrane imobilizate din oxidază de glucoză. Reacție (a se vedea schema de reacție din Figura 9), rezultată duce la o reducere a concentrației de oxigen, deoarece difuzează prin membrana biocatalitică la catod, acest lucru fiind detectat de o reducere dintre electrozi (Figura 10). Alte oxidaze care pot fi utilizate într-un mod similar pentru a analiza substraturilor lor sunt (de exemplu, oxidaza de alcool, D-si L-amino-acid oxidază, de colesterol, oxidaza galactoză, și oxidază de urați).

Figura 9. Procesul de oxidoreductază, care implică reacții redox, în care atomii de hidrogen sau de oxigen sau electronii sunt transferați între molecule. Această categorie extinsă include dehidrogenazelor (transfer de hidrură), oxidază (transferul de electroni de oxigen molecular), oxygenare (transferul de oxigen din oxigen molecular) și peroxidaze (transferul de electroni de peroxid). De exemplu: oxidaza de glucoză (CE 1.1.3.4, denumirea sistematică, BD-glucoză: 1-oxidoreductaza oxigen).

β-D-glucose + oxygen D-glucono-1,5-lactone + hydrogen peroxide

Figura 10. Răspunsul unui biosenzor amperometric care utilizează oxidaza de glucoză în soluție de glucoză. Între analizorul biosenzorului este plasat ca un tampon oxigenat lipsite de glucoză. Ratele stabile de epuizare de oxigen pot fi folosite pentru a genera curbe standard de răspuns și de a determina cele pentru probe necunoscute. Timpul necesar pentru un test poate fi redus considerabil redus, dacă este luată în considerare numai curba inițială, ca parte a răspunsului care este necesar să fie folosit, printr-un model adecvat și un software. Timp de spălare-out, care este egal aproximativ cu timp în care electrodul stă în soluția de probă, este, de asemenea, redus în mod semnificativ prin acest proces.

Curent (I) produs de astfel de biosenzori amperometrici este legat de rata de reacție (vA) prin expresia:

(4)

în cazul în care n reprezintă numărul de electroni transferați, A este suprafața electrodului, iar F este Faraday. De obicei, rata de reacție se face prin difuzie controlată (a se vedea ecuația 2), prin utilizarea de membrane externe. În aceste condiții, curentul electric produs este proporțional cu concentrația de analit și independent, atât de enzime cît și de cinetica electrochimică. Din categoria biosenzorilor amperometrici fac parte si biosenzorii cu detecție de amoniac, așa cum se va vedea în cele ce urmează.

5. Exemple de Biosenzori cu detecție de Amoniac. Aplicații

Un biosenzor de amoniu pe baza de amoniac bacteriene oxidarea cu oxigen a fost construit. Biosenzor conține o rezervă internă de oxigen de la care a fost furnizat oxigen pentru biomasa de bacterii de amoniac oxidante (AOB). Biosenzorul a fost astfel conceput pentru a
da cea mai bună performanță în condiții ambientale anoxice. Un microsenzor de oxigen a fost folosit pentru a monitoriza gradientul de oxigen intern. Datorită amoniac-oxidant și activitatea respiratorie a AOB semnalul de la acest microsenzor de oxigen a fost proporțională cu concentrația de amoniu înconjurătoare într-o gamă de 0-200 μM. Oxigenul din mediul înconjurător a interferat cu citirea, dar a fost posibil, în principiu compensarea acesteia pentru o concentrație de oxigen constantă în mediul analizat. O creștere a pH-ului de la 6 la 8.5 a fost înregistrată. Un număr total de patru biosenzori au fost construiși, și unul a fost expus o durata de viata de 2> luni. Senzorii care conțin bacterii au consumat amoniul, pentur a putea fi revitalizați în termen de 2 zile, prin plasarea lor într-un mediu cu conșinut de amoniu. 90% din timpul de răspuns de la senzori a fost de aproximativ 2 min, iar diferența dintre semnalul obținut în condiții de difuzie energic și fără difuzie, a corespuns
la aproximativ 10 μM NH4 + în domeniul linear. Un senzor a fost testat într-o instalație de tratare a apelor uzate. Semnalul senzorul în timpul perioadelor de anoxice
corespuns bine la concentrația de NH4 + analizate de colorimetrie.

Biosenzorii pe bază de celule întregi au fost utilizați pentru analiza unei game largi de compuși relevanți pentru monitorizarea mediului. Bacteriile oxidante de amoniac (BOA) prin urmare, a fost folosit pentru biosenzorii de NH4+. Înalta sensibilitate de oxidare a BOA la substanțe toxice poate fi folosită pentru teste de astfel de produse chimice toxice, și are chiar s-a încercat să se utilizeze pentru biosenzorii de NH4+ pentru astfel de teste de toxicitate. Biosenzorii de NH4+ construiți astfel pare că nu au avut caracteristici suficient de bune, pentru a fi utilizate in mod curent și nici comercializarea de astfel de senzori pare să nu fi fost cu succes. Biosenzor realizat de Tanaka et al., constă dintr-un senzor de oxigen de tip Clark, cu un strat de celule Nitrosomonas Europaea imobilizate în fața senzorului. Acesta poate fi utilizat numai într-un sistem complet oxigenat, are nevoie în plus, a unui sistem de buffering pentru a menține constant pH-ul, și este liniar doar până la doar 70 μM NH4+. Pentru a fi eficienț pentru analize in situ, un biosenzor NH4+ trebuie să fucționeze mai bine decât cele descrise anterior. Aceasta ar trebui de asemenea, să dea o mai bună măsurare a caracteristicilor decît biosenzorii NH4+ bazați pe schimbul de ioni, de optode-senzori, și de dispozitivele in situ cu flux de injectare, cum ar fi senzorii Evita NH4+ (Danfoss analitici A/S), și ar trebui să fie mai ieftini.

Domeniul cel mai mare de aplicatii a analizelor in situ NH4+ este cel de tratare a apelor reziduale, în care implanturi moderne de azot pentru îndepărtare, operează în perioade alternative oxice și anoxice pentru prima nitrifiere a amoniului în nitriți și/sau nitrați, și
reducerea în consecință a NOx în N2. Anterior s-au dezvoltat senzori bacterici de NO2 și NOX care sunt capabili să monitorizeze în apele uzate de luni de zile, cu foarte puține modificări de precizie. Acești biosenzori au un interval de măsurare de 0-1 mM, și de puțin timp sunt disponibili în comerț (Unisense A/S). Stabilitatea pe termen lung a biosenzorilor de NO2- și NOx se datorează suportului electrochimic și a principiului de cultură continuă, în cazul în care bacteriile sunt continuu furnizate cu nutrienți de la un rezervor intern.
Prin urmare, s-a decis să se aplice o cultură similară continuă abordare pentru un biosenzor NH4+. Necesitatea de a măsura NH4+ în apele reziduale este cea mai mare în condiții anoxice, atunci când concentrațiile de NH4+ sunt cele mai mare și, de aceia s-a decis
pentru a dezvolta un biosenzor de NH4+ care ar funcționa în conformitate cu condițiile anoxice folosind principiul difuziei contrare anterior aplicat pentru un tip de biosenzor CH4.
Prin plasarea de bacterii sub un flux constant de oxigen de la un rezervor de oxigen intern s-a propus optimizarea condițiile de creștere pentru AOB și prin urmare, îmbunătățirea
caracteristicile generale de măsurare a biosenzorilor NH4+ față de cei cunoscuți pînă acum.

5.1 Construcția unui biosenzor NH4+

Biosenzorul a fost realizat în conformitate cu principiile enunțate de Damgaard et al., dar în contrast cu versiunea microscară cu diametre de 30-50 vârful făcute de acelați autor, de biosenzori NH4+ au fost făcute la o macroscară cu un diametru de 7 mm. amera de bacterii și elementul de O2 de diametre de 0.28 mm (Figura 11). Microsenzorul de oxigen descris de către Revsbech.. Capilarul a fost fixat cu epoxidice. Cauciuc siliconic (Dow Corning 734) a fost, ulterior, introdus în capilar la o adâncime de 0,5 mm, și excesul de material, au fost șterse cu o bucată de folie de plastic. După întărire, asamblul care conține un capilar umplut cu aer a fost introdus în camera de bacterii. Carcasa camerei de bacteriene a fost alcătuită dintr-o bucată lungă de 5 cm din tub 7mm de sticlă. AOB au fost cultivate în mediu de săruri minerale, cu 5mM NH4+ si 20mm tampon Hepes la un pH de 7.8 și 25◦C.

Figura 11. Reprezentarea schemstică a componentelor unui biosenzor NH4+, care sunt următoarele: membrană ion-permeabilă, bandă, biomasa bactericidă, placă frontală de poliester, cauciuc siliconic, microsenzor de oxigen, carcasă de sticlă, rezervor de aer.

După construcție, biosenzorii de NH4+ au fost incubați pentru 2-3 săptămâni, în mediu de săruri minerale, cu 1mM NH4+ și 5mm Hepes-tampon la un pH de 7.5 pentru a obține cea mai mare posibilă biomasă de bacterii active metabolic. În timpul acestor
2-3 săptămâni mediu a fost schimbat de două ori pe săptămână. Diferite culturi de AOB au fost folosite pentru a umple biosenzorul NH4+: Nitrosomonas europaeaATCC19718, cultura de îmbogățire G5-7, și o cultură care nu caracterizată în continuare de îmbogățire
de la un eșantion de nămol.

Figura 12. Reprezentarea schematică a unui biosenzor NH4+ și modelul gradientului de O2
în interiorul vârfului biosenzorului. (A) Concentrație înaltă de NH4+ concentrare se onține la
o presiune parțială scăzută de O2 la vârful microsenzorului intern de O2. (B)
Concentrație scăzută de NH4+ se găsește la o concentrație mare de O2. Semnalele
de microsenzori de oxigen intern sunt indicate prin săgeți.

Principiul de modul în care funcționează biosenzorul de NH4+, sunt ilustrate în Figura 11. Biosenzorul NH4+ difuzează în jurul membranei ion-permeabile și la o anumită adâncime în camera bacteriene se întâlnește cu oxigenul difuzat din rezervorul de gaz în interiorul
senzorului. Datorită activității AOB, consumul de oxigen va fi proporțional cu influxul de amoniu, și maximul concentrației de oxigen din interiorul interne microsenzorului se va schimba, prin urmare, în funcție de externe concentrația externa a biosenzorului de NH4+. Acesta poate fi demonstrat că semnalul de la senzorul de oxigen intern al unui biosenzor este invers proporțional cu concentrația de analit, chiar în cazul în care există o zonă de suprapunere între oxigen și analizat, atâta timp cât toată concentrația analitului este consumată înainte la elementul senzorial. Senzori funcționează în conformitate cu principiul difuziei inverse, putând fi citit semnalul pentru concentrațiile scăzute și vice-versa. Acest raport invers dintre semnalul absolut dat de senzor și concentrașia de NH4+, se poate vedea în Figura 12, unde săgeata simbolizează concentrația de oxigen în funcție de tipul de microsenzorul de oxigen intern. Săgeată este scurtă (adică un nivel scăzut de concentrație de O2) atunci când concentrația de NH4+ este mare, și pe când NH4+ este scăzută, concentrația de oxigen este mare. Microsenzorul de oxigen intern a fost conectat la un picoamperometer, și semnalul a fost înregistrat pe un înregistrator de strip-diagramă. Pentru testare și de calibrare senzorul a fost plasat într-o cameră de calibrare în timp ce a fost difuzat N2.

5..1.1. Calibrarea biosenzorilor de NH4+

Primele teste de calibrare au fost realizate în mediu de săruri minerale tamponat cu Hepes 5 mm și la pH 7,5. Crescător cantități de NH4+ au fost adăugate, și după fiecare adăugare
semnalul a fost înregistrat timp de 5 min până ce un nou nivel de echilibru de stare a fost atins. Influența pH-ului a fost testat într-un mediu similar cu Hepes-tampon de săruri minerale ajustat la valorile pH-ului de 6-8.5. Influența câtorva componente ca NH2OH, NO2-, NO3-, NaCl, PO43-, glucoză, acetat și a fost testat prin adăugarea compușilor la mediul de minerale de sare, iar o curbă de calibrare a fost înregistrată. Efectul de O2 și CH4 au fost testate prin amestecarea acestor gaze în fluxul N2 epurat prin navă de calibrare. Efect datorat temperaturii a fost investigat prin calibrarea în incubatoare cu temperaturi diferite (6, 13, 25, 0, și 36◦C). Sensibilitatea de agitare a fost determinată de înregistrarea semnalului în timpul tranziției de la unul stagnat, la un mediu puternic barbotat. Timpul de răspuns la schimbările de concentrație NH4+ a fost determinată în condiții de agitație.

Culturi pure de bacterii nitrificatoare sunt foarte dificil de crescut, astfel încât se pare că cele îmbogățite ar fi mai active. S-au testat, prin urmare, doi senzori care au fost umpluți cu două tipuri de culturi îmbogățite, în plus față de doi senzori umplut cu N. europaea (Figura 13). La prima vedere se pare că există diferențe mari în răspuns, dar o mare parte din această diferență este cel mai probabil din cauza sensibilității diferite de la senzorul intern de O2. Senzori 1 și 3 dau aproape un răspuns liniar până la 0,3 mm NH4+, în timp ce senzorul 2 dă răspuns liniar numai până la doar 0,1 mm. Intervalul liniar de răspuns pentru senzorul de 4 nu a fost determinat, dar răspunsul a fost, cel puțin liniar până la 0.13mM
cum se vede în Figura 13b, unde, de asemenea, este ilustrat răspunsul în detaliu al senzorului la concentrații reduse de NH4+. La concentrații mai mari de NH4+, senzorii nu se opresc, dar răspunsul se diminuează din ce în ce mai mult, ducând la saturarea senzorului. Culturile pure/ îmbogățite astfel toate dau un răspuns similar. Prin urmare, s-a ales să continue
pentru a testa senzori numai cu N. Europaea. Ar trebui să fie a subliniat, totuși, că în aceast experiment, diversele bacterii heterotrofe invadează senzorii de-a lungul interfeței benzii-membrana în cazul în care măsuri speciale nu sunt luate, precum și dacă culturile
în interiorul senzoriilor nu presupun a fi axenice.

Figura 13. Performanța diferiților biosenzori de NH4 testați : ( a ) patru senzori pe tot intervalul și (b ) doi senzori la concentrații scăzute de NH4+.

Senzorul a fost proiectat pentru utilizarea în sistemele de anoxice, și semnalul este afectat de O2. Pentru a obține o introspecție în modul în care senzorul reacționează la prezența de O2, au fost efectuate calibrări în mediu de minerale saline cu bule de aer, de diferite amestecuri N2/O2 (Fig. 14). Prezența O2 extern a mutat linia de bază la un nivel mai ridicat, indicând faptul că mai mult O2 a fost prezent în camera bacteriană (fig. 14b). După scăderea nivelului zero, curbele de calibrare au aproape aceeași formă, indicând faptul că prezența oxigenului nu limitează oxidarea amoniului în camera bacteriană. În principiu, ar fi posibilă sustragerea semnalului pentru O2 extern de la citire și, prin urmare, acest lucru ar compensa interferența O2, dar, în practică, o astfel de procedură ar putea introduce un număr de erori prea mari.

Figura 14. Influența diferitelor presiuni parțiale de O2 privind performanța biosenzorilor
de NH4+ umpluți cu N. Europaea. Mediul de săruri minerale a fost
barbotat cu diferite amestecuri O2/N2: (a), curent, după scăderea
fondului; (b), curenții măsurați.

5.1.2. Testarea biosenzorilor de NH4+ în apele reziduale

Unul dintre biosenzori de NH4+, a fost testat într-un rezervorul de nămol activat de o instalație-pilot la scară de epurare a apelor uzate care a fost operat cu perioade alternative oxice și anoxice. Cisterna a fost utilizat pentru testul general a senzorilor de calitate a apei, și
mai mulți parametri, inclusiv a apelor uzate cu NH4+ (biosenzorul NH4+ Danfoss Analitic
Evita) și O2 (O2 Danfoss senzor analitic) au fost înregistrate simultan. Nămol activat a fost alimentat cu ape uzate artificiale cum este descris de către Balslev et al.

Metoda de analiză utilizată este determinarea colorimetrică de NH4+ pentru calibrare de în laborator a biosenzorilor NH4+ a fost realizată prin metoda de Kandeler și Gerber.

5.1.3. Proba într-o instalație de tratare a apelor uzate

Biosenzorul NH4+ a fost testat într-un rezervor cu nămol activat, de epurare a apelor reziduale. Nămolul a fost expus la cicluri alternative de 1,5 h oxic-1.5 h anoxice (fig. 15). În timpul perioadelor de oxic O2 a fost menținut la o concentrație de 1 mg / l, deși există
a fost o depășire inițială de până la 2 mg/l. Concentrația de NH4+ măsurată cu analizorul Evita NH4+, au arătat că NH4+ a scăzut la concentratii nedetectabile în timpul
inițială de 15 min a perioadei de oxic, în cazul în care aceasta a fost oxidat de bacterii nitrificatoare în nămol. Datele calculate a semnalului de la biosenzor NH4+ în timpul perioadei oxice indică o concentrație NH4+ mai jos de zero, din cauza interferențelor de la
O2 din lichid în toată masa.

Figura 15. Concentrațiile de NH4+ (a) și O2 (b), în nămol activat a unui implant de tratare a apelor uzate. Nămol a fost expus la cicluri de oxic / anoxic. Concentrațiile NH4+ au fost determinate prin metoda colorimetrică (•) și calculate de la citirea de la biosenzorul NH4+ umplut cu N. europaea (-).

Ambele metode au aratat că concentrația de NH4+ a crescut pe parcursul perioadei anoxice și metodele au dat rezultate practic identice. La sfârșitul perioadei anoxice, semnalul de biosenzorului NH4+ a scăzut mai rapid decât semnalul de la analizor colorimetric, iar acest lucru a fost din nou datorat cel puțin parțial, interferențelor de la O2. În general, biosenzorii NH4+ prezintă un răspuns liniar, dar pentru concentrații scăzute, răspunsul se diminuează treptat până dispare. Intervalul mic de răspuns liniar poate fi explicat printr-o activitate scăzută a bacteriilor, și diminuarea treptată a răspunsului poate fi cauzată de concentrațiile Relativ ridicate la jumătate a biosenzorului NH4+ cuplat cu o oxidarea NH4+ de asemenea, în spatele vârfului a senzorului O2. Pentru toți senzorii, răspunsul a fost abordat saturant la 0.6mM NH4+ la pH-ul aplicat de 7,5, și chiar la o astfel de concentrare saturarea NH4+ semnalul de la senzorul de oxigen a indicat concentrații mari de oxigen ceea ce înseamnă că oxigenul nu a ajuns niciodată la limită. În principiu, este posibil pentru a detecta concentrații de până la 1 μM prin utilizarea de acești senzori, ca semnal de O2 poate fi citit la 0,1 rezoluție pA. În termeni practici, limita de detecție este mai degrabă > 10 μM, pentru ca schimbările de temperatură și de advecție în fața senzorului să afecteze semnalul. Un astfel de efect este văzut la toți senzorii amperometrici, dar impactul asupra preciziei este mai mare în cazul biosenzorilor cu contro-difuzie, cum ar fi acest NH4+ în comparație cu alți senzori. Sensibilitatea ridicată pentru ondiții de mediu, este o caracteristică inerentă în principiu de măsurare, în cazul în care semnalul absolut este mare pentru concentrații scăzute
de analit și reduse pentru concentrații ridicate. Orice factor care va afecta curentul de zero înalt, la concentrație zero va afecta astfel limita de detecție. Ca de exemplu, descrețterea temperaturii cu un 1◦C, pentru un senzor specific, poate genera o schimbare a semnalului de oxigen de 200 până la 195 pA, și această schimbare semnal de biosenzor poate fi greșit interpretat la o creștere a concentrației NH4+ de aproximativ 20 μM.

5.2. Determinarea de Ionilor de Amoniu folosind un biosenzor amperometric puțin reactiv, bazat pe Dehydrogenase Alanin imobilizate

Utilizarea enzimei de alanin dehidrogenază (AlaDH), pentru determinarea ionilor de amoniu (NH4+), necesită de obicei adăugarea de substrat piruvat și reducerea nicotinamidei adenine dinucleotidice (NADH), simultan pentru ca reacția să fie efectuată. Acest plus de reactivi este incomod atunci când un biosenzor enzimatic pe bază de AlaDH este utilizat. Pentru a rezolva acest inconvenient, este necesară utilizare unui biosenzor puțin reactiv amperometric care utilizeayă un sistem acoperti cu o membrană metacrilicăcu ajutorul unui sistem de stivuit membrană metacrilic pe un ecran-electrod imprimat cu pastă de carbon (SPE) pentru determinarea ionilor de NH4+.

Măsurarea precisă a NH4+ într-un mediu acvatic este de interes semnificativ în studii de biologice de mediu și în evaluarea de mediu a apei, deoarece este cunoscut pentru a fi toxic pentru organismele acvatice. În acest sens, mai multe metode au fost propuse, cele mai multe dintre ele implicând cromatografie ionică Thomas, D.H. et al. 2002; Kuo, C.T. et al. 2005; Martinez, Y.M. et al. 2005; potențiometrie Deyhimi, F. Et al. 2005; Hassan, S.S.M. et al. 2001, sau sisteme de injecție de flux Andrew, K.N et al. 1995; Haghighi, B. Ez al. 2004; Oliveira, S.M. et al. 2007; Staden, J.F.V. et al. 1997.

Cele mai multe dintre procedurile de cromatografie ionică propuse pentru determinarea acesteia implica elaborat o derivatizare de pre-coloană în anumite tipuri de matrice. Mori et al. a descris o metodă de cromatografie ion senzitivă și rapidă ion pentru a determina ionii de NH4+ în apele râurilor. Cu toate acestea, separarea de bază a ionilor de NH4+ de metale alcaline și alcalino-pământoase din probele de apă nu a fost realizată. Pentru detectarea potențiometrică a ionilor de NH4+, nonactina a fost utilizată pe scară largă ca material senzitiv. Chiar dacă electrozii de selectivi de ioni pe bază de nonactinp arată o sensibilitate bună față de ionii de NH4+, aceștia sunt afectați de interferența altor ioni, cum ar fi K+. Sisteme cu injecție de flux, combinate cu metodele spectrofotometrice, de exemplu, reacțiea Berthelot care implică o schimbare de culoare, în prezența ionilor de NH4+, au o cinetică foarte lentă de reacție, în timp ce analiza fluorimetrică prin injectare in flux necesită pretratare a probelor, cu timpuri de difuzie lungi, pentru a evita interferențele de fundal.
Astăzi, există o tendință bine recunoscută spre simplificarea și miniaturizarea proceselor analitice. O abordare amperometrică arată că. un SPE miniaturizat cu enzima imobilizată ca tranductor, îmbunătățește considerabil costul operațiunii, oferind o procedură de analiză simplă, de încredere, rapidă și reproductibilă. Unii biosenzori utilizați pentru determinarea amperometrică de ioni de NH4+ utilizează dehidrogenază glumtamată (GLDH), au fost raportați în cazul în care enzima a fost imobilizată pe electrodul de lucru în mai multe moduri Abass, A.K. et al. 1998; Bertocchi, P. et al. 1996; Kwan, R.C.H. et al. 2005.

Cu toate acestea, pentru a efectua reacția de natură enzimatică GLDH, un substrat și co-factor în mod normal este necesar să fie introdus și acest lucru duce la un pas suplimentar în timpul testului de ioni NH4+. În scopul de a evita necesitatea de tratament a reactivului extern în timpul măsurătorilor, care poate provoca de asemenea contaminarea electrodului de referință, se utilizează un sistem de membrane suprapuse pentru imobilizarea enzimei, co-factor și, de asemenea, că în cele din urmă duce la un biosenzor puțin reactiv pentru determinarea ionilor de NH4+.

Conceptul de biosenzor carea funcționează pe baza AlaDH, reprezintă procesul reversibil a aminației piruvatului în L-alanină de către AlaDH în prezența co-factorului NADH și a ionilor de NH4+. Curentul generat în procesul electrochimic se măasoară pe baza oxidării NADH, în timp ce reacția rtedox emzimatică consumă ionii de NH4+ în proces. Deși curentul generat în urma reacției redox este proporțional cu variașia concentrației de ioni de NH4+ în condiții optime la aplicarea unui potențial de 0.55V. Pentru o mai bună înțelegere simplificată procesului descris mai sus sunt redate următoarele reacții:

Pentru a construi biosenzor cu membrane suprapuse, enzima de AlaDH a fost prinsă în membrana photoHEMA,care s-a fost format prin procesul de photopolymerizare UV a monomerului de metacrilat de 2-hydroxylethyl. Studiile anterioare au arătat că utilizarea de photoHEMA este compatibilă cu mai multe enzime, fără probleme de percolare. Pentru a imobiliza piruvatul și NADH,o membrană  (2-hydroxylethyl metacrilat) pHEMA cu greutate moleculară mică  care conține ambele substanțe a fost montată pe partea de sus a membranei enzimei după photocuring. Utilizarea acestei membrane a permis atât piruvatului cât și NADH să fie imobilizate, dar difuzia lor liberă în membrana ar fi, de asemenea, asigurarea de a menține o rată de reacție rapidă. Biosenzor a fost în acest fel conceput pentru a oferi un sistem specific pentru puțin reactiv pentru determinarea ionilor de NH4+.

Figura 16 reprezintă mecanismul de reacție de natură enzimatică implicată în dezvoltarea unui biosenzor de ioni de NH4+  bazat pe un sistem de membrane suprapuse.

5.2.1. Procedura experimentală

Reagenții

Substanțe chimice au fost obținute din surse comerciale și au fost utilizate fără ulterioare purificări. β-nicotinamida adenina dinucleotidică, sub formă redusă (NADH, 98%), a fost achiziționată de la Sigma. Soluție stoc de enzimă dehidrogenază L-alanină (AlaDH, CE 1.4.1.1, de la Bacillus subtillis, Sigma), a fost preparată prin amestecarea unei cantități corespunzătoare de soluție de enzimă AlaDH cu 10 mM soluție tampon de fosfat pH 7 într-un tub Eppendorf și depozitate la 4 ° C, detalii în Ohashima, T. et al. 1979. Piruvatul de sodiu (C3H3NaO3, 99%, Sigma), soluția de stoc a fost pregătită prin dizolvarea unei cantități adecvate de sare a piruvatului în apă deionizată. Cei 10 mM de soluție tampon de fosfat pH 7, au fost pregătiți prin adăugarea a 10 mM de hidrogen fosfat de dipotasiu (K2HPO4, 98%, Fluka), la 10 mm, dihidrogenofosfat de potasiu (KH2PO4, 99,5%, Fluka) și ajustarea la valoarea pH-ului necesar, (Ohashima, T. et al. 1979). O soluție standard de amoniac de stoc a fost pregătită prin dizolvarea cantitatea necesară de de soluție concentrată de amoniac (NH4OH, 25%, Merck), în apă deionizată. Soluția de amoniac folosită a fost standardizată prin metoda Nessler utilizând soluție de sare de clorură de amoniu (NH4Cl, 99,5%). O soluție stoc omogenă a monomerului de metacrilat de 2-hidroxietil (HEMA, C (CH3) COOCH2CH2OH, 97%, Aldrich) a fost pregătită prin amestecul de cantități adecvate de monomer HEMA și  de inițiatorul (2,2-dimetoxi-2-phenylacetophenone, DMPP, C16H16O3, 98%, Fluka), într-un flacon învelit într-o folie de aluminiu. Amestecul a fost apoi agitat ușor timp de câteva minute și depozitat la o temperatură de 4 ° C. Poli (2-hidroxietil metacrilat) (pHEMA) a fost obținut comercial de la Aldrich.

Instrumentația utilizată

Comportamentul electrochimic al biosenzorilor puțin reactivi a fost caracterizat folosind o tehnică de cronoamperometrie cu un PG12 AUTOLAB (AUT 71681) potențiostat/galvanostat.  O celulă electrochimică tri-electrod convențională a fost folosită împreună cu un electrod de carbon sticlos ca un electrod auxiliar. Un electrod Ag/AgCl saturat cu KCl a fost folosit ca electrod de referință și electrod de pastă de carbon modificată a fost folosit ca un electrod de lucru. SPE-urilor utilizate au fost concepute de Universiti Kebangsaan Malaezia și fabricat de Scrint Print Co. Toate potentialele au fost măsurate și raportate față de un electrod de Ag/AgCl (saturate cu KCl). În timpul experimentelor efectuate la valori constante de potențial, un bară  magnetică a fost folosită și curent de fundal a fost permis să scadă la o valoare constantă înainte. Ionii de NH4 + au fost adăugați în soluția tampon. Măsurători ale pH-ului au fost făcute cu un pH-metru (MeterLab PHM 210). AlaDH enzima care conțin photoHEMA membrană a fost pregătită prin procesul de  photopolymerisation UV-a inițiat cu o unitate de UV-expunere (RS Components 196-5251).

Construcția unui Biosenzor

Biosenzorii mai puțin reactivi pentur determinarea ionilor de NH au fost construiți prin depunerea 3 μL de 2.98 mg de amestec de monomer AlaDH / g de HEMA pe SPE și expunerea la radiații ultraviolete cu lungime de unda de 500 S ți epurați cu azot. Prima dată cantitățile corespunzătoare de NADH și piruvat au fost dizolvate într-o cantitate adecvată de soluție preparată prin dizolvarea pHEMA 50 mg de polimer în 20% 1,4-dioxan în apă. Acestea au fost apoi depozitate pe membrana photocured ce conține enzima de AlaDH și lăsate să se usuce la 4 °C timp de 24 de ore pentru a forma al doilea strat de membrană.

Optimizarea răspunsului biosenzorului

Toate experimentele electrochimice s-au efectuat la temperatura camerei, într-o celulă tri-electrod nedivizată care conține soluție suport de electrolit (4 ml din 10 mM soluție tampon fosfat pH 7), în condiții constante de agitare (100 rpm). Ionii de NH4+ au fost injectați la suprafața electrodului, în celula de măsurare, după stabilizarea curent de prag. Măsurătorile luate au fost exprimate ca diferența actuală în absența și prezența de ioni de NH4+.

Răspunsul biosenzorului a fost studiat folosind tehnica de voltametrie ciclică între -1.00-1.00 V față de Ag/AgCl, la o rată de scanare de 0,02 V/s. Dependența semnalului amperometric pe potențialul aplicat a fost examinat în intervalul de 0.45-0.65 V față de Ag/AgCl. Efectul pH-ul a fost studiată prin variația pH-ul solutiei de electrolit, în intervalul de pH 5.8-8.0 cu 10 mM soluție tampon de fosfat de potasiu. Pentru optimizarea enzimei încărcate în membrana photoHEMA, membrana enzimatică a fost preparată din amestecuri de 5 μL de AlaDH și HEMA monomer (1:1) în cantități de enzime diferite (0.44-4.10 mgAlaDH / g photoHEMA).

Electrozi enzimatici cu grosimi diferite au fost pregătiți prin schimbarea volumelor de amestec de monomeri HEMA și AlaDH (1:1), în intervalul de 2-6 μL în timp ce enzima de încărcare a fost menținută constantă la 2.98 mg/g photoHEMA. Grosimile membranelor au fost măsurate cu ajutorul unui dispozitiv digital Vernier, după expunerea membranelor senzoriale la radiații UV. 

Răspunsul biosenzorului la schimbările de temperatură în intervalul de 10-50 °C, a fost determinat variind temperatura solutiei de electrolit într-o baie termostatată. Pentru acest studiu, aproximativ 21 de biosenzori au fost pregătiți cu o zi înainte și depozitați peste noapte la 4 °C înainte ca testarea să fie efectuată.

Pentru optimizarea NADH respectiv și încărcările Pyruvate în stratul de pHEMA, diverse cantități de piruvat (3.74 – 163.11 mg / g pHEMA) și NADH (22.98-1,149.11 mg / g pHEMA) au fost utilizate. După optimizarea condițiilor experimentale, efectul asupra performanțelor biosenzorului puțin reractiv a fost investigat pentru diferite concentrații de ioni de NH4+, în intervalul de 10-600 mM.

Reproductibilitatea biosenzorului a fost evaluată pentru diferiți biosenzori și fiecare biosenzor a fost testat o dată, prin utilizarea de 30 mm ioni de NH4+, în timp ce repetabilitatea de biosenzor a fost examinată folosind același biosenzor testat într-o concentrație de 30 mm ioni de NH4+ și cinci măsurători consecutive au fost luate pentru fiecare biosenzor.

Perioada de valabilitate a biosenzorului a fost examinată prin determinarea 30 mm ioni de NH4+ pe o perioadă de 30 de zile. Toți electrozii au fost testați o dată în prima zi și păstrați la 4 °C, nu în timp ce în utilizare. După aceea, fiecare dintre acești biosenzori au fost testați de două ori numai în funcție de o dată specificată.

Interferențe cu biosenzorii de NH4+ au fost investigate prin utilizarea de materiale interferente, cum ar fi Na+, K+, metilamină (CH3NH2) și ethylamine (C2H5NH2). Raportul molar de interferență cu ionii de NH4+  a fost variat în intervalul 0.01-10. Gradul de interferență a acestor materiale a fost evaluat separat cu măsurători amperometrice înregistrate în prezența și absența de interferent în determinarea de 30 mm de ioni de NH4+. Testele t-statistice au fost folosite pentru a compara răspunsurile obținute în absența și prezența de interferent. Analiza probelor de apă a fost realizată prin intermediul a cinci probe reale de apă colectate la diferite puncte de-a lungul unui râu. Probele de apă care prezentau particule în suspensie au fost filtrate printr-o membrană de 0.45 microni filtru de acetat de celuloză (Whatman) și pH-ul a fost ajustat la pH 7 utilizând 10 mM K2HPO4 și KH2PO4. Testele de recuperare au fost efectuate prin adăugarea de concentrații standard de ioni de NH4+ în domeniul liniar la probele de apă. Rezultatele au fost apoi validate prin procedura stabilită de metoda lui Nesslers.

Studii de Optimizare a Funcționării unui biosenzor

Optimizarea pH-ului soluției tampon, după cum se poate observa in Figura 17, maximul reacției enzimatice este la pH 7 și reprezintă valoarea optimă la care are loc procesul reversibil al AlaDH.

Figura 17. Efectul pH-ului asupra răspunsului unui biosenzor în soluție ce conține 100 mM ioni de NH4+.

Rata de producere a reacției enzimatice în marea majoritate din cazuri, atinge maximul în funcție de pH. Din Figura 18 se poate vedea clar că pentru valori ale pH-ului mai mari decât 7, enzima poate suferi o denaturare ireversibilă, chiar cu ajustarea valorii acestuia.

Figura 18. Dpendența răspunsului unui biosenzor cu potențialul aplicat la electrod într-o soluție ce conține 100 mM ioni de NH4+.

Optimizarea încărcăturii emzimatice a biosenzorului

Efectul creșterii cantității de enzime asupra răspunsului biosenzorului este ilustrat în Figura 19. După cum se poate vedea, răspunsul biosenzorului crește cu cea a încărcaturii enzimatice pâna ce este atinsă valoatrea de saturație aproximativ 3 mg AlaDH/g HEMA. După atingerea acestei valori, răspunsul biosenzorului s-a diminuat.

Figura 1

Figura 19. Efectul creșterii cantității de enzime asupra răspunsului unui biosenzor în soluție care conține 100 mM ioni NH4+

De obicei, rata de reacție enzimatică este direct proporțională cu enzima de încărcare. Există mai multe condiții în care acesastă proporționalitate nu poate apărea. Atunci când cantități mari de enzime sunt utilizate, cofactorul adăugat NADH se poate lega la enzimă dar să nu fie disponibil pentru reacție [29]. O încărcare mare de enzimă, de asemenea, duce la blocarea site-urilor de enzime active, în special pentru enzima care se află departe de suprafața membranei, făcând astfel parte din enzima nu participa la reactii enzimatice. În plus, încărcarea excesivă a enzimei va crea, de asemenea, o barieră de difuzie pentru circulația în substraturi și a produselor de reacție, ceea ce va reduce, de asemenea, răspunsul obținut. Astfel, enzima de încărcare optimizat de 2.98 mg / g photoHEMA a fost folosită de-a lungul experimentelor. Kwan et al. 2004 au raportat folosind aceleași enzime prinse de un poli (carbamoil) hidrogel sulfonat pe o membrană de teflon pentru determinarea amperometrică de alanină. Reacția enzimatică inversă a implicat dehidrogenarea specifică a alanină care a consumat NAD+. Produsele de reacție, piruvat și NADH au fost folosite pentru a iniția două alte reacții care urmează, care au implicat hidroxilaza salicilaților și inhibitori de piruvat.

Optimizarea grosimii membranelor pentru fabricarea biosensorilor

Efectul grosimii membranelor care conțin photoHEMA 2.98 mg AlaDH/g HEMA asupra răspunsului biosenzorului este prezentat în Figura 20. Grosimea optimă a AlaDH enzime care conține membrana photoHEMA sa dovedit a fi 0,18 mm, din cauza semnalului de mare consecventă atins pentru aceeași concentrație de ioni de NH4 + (RSD = 5,6%). O membrană de grosime de 0,15 mm, a dat un răspuns puțin mai mic datorită reproductibilității reduse în prepararea unei astfel de membrane subtiri (RSD = 14,2%). Mai mult decât atât, o membrană subtire poate duce la scurgerea enzimei imobilizate. Cea mai groasă membrană, între 0.22-0.26 mm, a dat răspunsuri inconsecvent scăzute ca aceste membrane la site-urile active ale enzimei au devenit din ce în ce mai puțin accesibile, în plus a împiedicat difuzia de rectanți și a produșilor de reacție.

Figura 20. Efectul grosimii membranelor asupra răspunsului dat de biosenzor în soluție de 100 mM ioni de NH4+ la valoare pH-ului 7.

Optimizarea temperaturii de funcționare a unui biosenzor

Răspunsul biosenzorului a crescut rapid, cu temperatura și a atins valoarea maximă, la temperatura de 35 °C (Figura 21). Acest lucru se explică prin creșterea ratei de o reacție enzimatică cu creșterea temperaturii.

Figura 21. Efectul temperaturii asupra răspunsului biosenzorului de ioni de NH4 + în soluție ce conține 100 mM NH4 + ion la pH 7. Biosenzorii au fost pregătiți cu o zi înainte și depozitați la 4 °C, înainte de a fi testați la temperaturi diferite.

Cu toate acestea, răspunsul biosenzorului s-a diminuat atunci când temperatura a crescut peste 35 °C. În această stare, denaturarea a enzimei are loc în cazul în care aderența slabă, cum ar fi hidrogenul si legaturile ionice sunt defalcate la temperaturi ridicate [31]. 25 ° C, a fost aleasă ca temperatura de lucru pentru toate experimentele ulterioare de sensibilitate a biosenzorilor pentru a avea rezultate suficient de bune utilizabile și pentru studii ulterioare.

Intervalul de răspuns al unui biosenzor

Răspunsul biosenzorului a fost examinat în intervalul 10-600 mM ioni de NH4+ iar rezultatele sunt ilustrate în Figura 21.

Figura 21. Răspunsul biosenzorului la diferite concentrații de ioni de NH4+ în intervalul 10-600 mM la pH 7.

Răspunsul biosenzorului a crescut cu creșterea concentrației de ioni  de NH în intervalul 10 – 500 mm, si a ajuns la saturație în jurul valorii de 500 mm. Acest fenomen se datorează faptului că, piruvatul disponibil, cofactorul NADH, și site-uri de enzime active au fost consumate treptat, odată cu creșterea concentrației de ioni de NH4+ pânăca a fost atinsă o stare de saturație. În plus, la niveluri ridicate de concentrații de ioni de NH4+, tăria ionică a mediului de reacție crește și, prin urmare, reduce reacția enzimatică, care este, de asemenea, influențată de încărcarea de la site-urile de enzime active. Un răspuns liniar a fost observată în intervalul 1-10 mM, cu o limită de detecție de 0,18 mm. Valoarea estimată a km obținută din graficul Lineweaver-Burk a fost de 34.01 mm (Figura 22).

Figura 22. Reprezentarea liniarț a răspunsului unui biosenzor ,ai puțin reactiv.

Reproductibilitatea și repetabilitatea unui biosenzor

Reproductibilitatea și repetabilitatea unui biosenzor mai puțin reactiv a fost evaluat la 30 mm  de ioni de NH4 +. Diferența obținută dintre măsurătorile actuale folosind diferiți electrozi, au dat valori scăzute pentru DSR de la 1.4 – 4.9% . Aceste valori au fost suficient de scăzute pentru a considera că membranele au fost reproduse și fabricate prin metoda propusă. Cu toate acestea, valori ușor mai ridicate de repetabilitate RSD (21.7-26.4%) au fost obținute folosind aceeași biosenzor, au fost atribuite procesului de oxidare ireversibil a NADH imobilizate la suprafata electrodului, care a dus la o diferență de curent descrescătoare de cinci ori pentru același electrod (Figura 23). Repetabilitatea diminuată este un efect inerent de la scurgerea de NADH imobilizate și a piruvatului. Ambii reactanți sunt în mod deliberat  în stare să se infiltreze în membrană pentru ca acestea să difuzeze în membrana enzimatică să reacționeze cu enzima AlaDH. Prin urmare, repetabilitatea diminuată este atribuită pierderii și consumul acestor reactanți atunci când biosenzorul este utilizat de mai multe ori. Biosenzorul este folosit în principal pentru a analiza la fața locului și, deoarece se face din SPE, care pot fi fabricate la costuri reduse, prin urmare, se poate utiliza pentru un electrod de unică folosință.

Figura 23. Reproductibilitatea și repetabilitatea unui biosenzor de NH4+ puțin reactiv care a fost expus la 30 mM de ioni de NH4+ la pH 7.

Stabilitatea unui biosenzor

În termeni de stabilitatea unui biosenzor, pe o perioadă de 30 de zile și utilizarea 30 mm ioni de  NH4+, biosenzorul mai puțin reactiv, prima dată a aratat o scădere a sensibilității de aproximativ 67% în primele patru zile, după care sensibilitatea a fost menținută până la 20 de zile înainte de a începe deteriorarea răspunsului acestuia. După perioada de depozitare de 30 de zile, biosenzorul încă mai păstrează aproximativ 50% din sensibilitatea inițială. (Tabelul 1). Un biosenzor amperometric care utilizează enzimă AlaDH pentru determinarea alaninei a raportat o stabilitate operațională de numai două zile și răspunsul senzorului a scăzut la 50% din sensibilitatea inițială în a 13 a zi.

Efectul interferenței asupra răspunsului unui biosenzor

Posibilele interferențe în determinarea ionilor de NH4+ a biosenzorilor puțin reactivi au fost investigate, iar rezultatele pot fi văzute în Tabelul 2. Biosenzorul nu suferă nici o interferență din partea ionilor metalici alcaline în ape naturale. Considerând raportul molar de 1:1, interferența s-a produs datorită concentrației mari de ioni ți a înaltei rigidități ionice la măsurarea mediului care diminuează reacția enzimatică. Stabilitatea AlaDH este mai mare în prezența NaCl, în comparație cu KCl, în timp ce ionii de Na+ nu dau nici o interferență în comparație cu ionii de K+ chiar la un raport molar de 1:1. CH3NH2 și C2H5NH2 produc interferență semnificativă la valori ale raportului molar mai mare de 0.1. Interferența determină creșterea răspunsului biosenzorului cât și a proprietăților fizico-chimice a aminelor. Oricum interferența aminelor nu are loc în apele naturale datorită nivelului scăzut de ioni de NH4+.

Comparație cu biosenzori similari

Biosenzorii amperometrici de natură enzimatică pentru determinarea ionilor de NH4 + folosind GLDH enzime sunt frecvent menționați în literatura de specialitate (vezi lista de referințe) (Tabelul 3), cu toate acestea, toți au nevoie ca substraturile implicate în reacția de natură enzimatică cu enzima GLDH, să fie introduse în soluțiile de testare. Domeniile de detecție  liniară a ionilo de NH4+ pentru biosenzori folosind GLDH sunt oarecum limitate în comparație cu utilizarea de enzime AlaDH. Sistemul enzimatic GLDH a fost de asemenea utilizat pentru detectarea optică a ionilor de NH4+ în probele de apă la nivel mM bazează pe oxidarea NADH. O matrice de chitosan a fost folosită pentru imobilizarea enzimei GLDH pe o lamelă suport de sticlă, dar acest sistem optic biosenzor pentru determinarea ionilor de NH a  suferit interferențe de la alți cationi prezenși în probele de apă.

6. Avantaje, Dezavantaje, Tendințe, Conclutii

Avantajele și dezavantajele Biosenzorilor sunt următoarele:

În comparație cu senzorii analitici convenționali, biosenzori de fibră optică oferă mai multe avantaje, cum ar fi:

1. Biosenzorii de fibră optică nu sunt supuși la interferențe electrice.
Absența de conectori electrici îi face mai siguri decât biosenzorii electrochimici.
2. Nu este nevoie de un electrod de referință, dar o sursă dde referință este utilă.

3. Un reactiv imobilizat nu trebuie să fie în contact cu fibrele optice, acesta poate fi înlocuit cu ușurință.

4. Biosenzori de fibră optică pot fi miniaturizați și utilizați pentru monitorizarea parametrilor în vivo.

5. Sunt extrem de stabili, în ceia ce privește calibrarea, în special în cazul în care un biosenzor poate măsura raportul dintre intensitățile a două lingimi de undă.

6. Pot răspunde simultan la mai mult de un analit folosind reactivi multipli imobilizați.

7. Pierderile mici de fibre optice permit monitorizarea de la distanță a mediilor periculoase. 8. Ei au un potențial pentru un conținut mai mare de informații în comparație cu traductoarele electrice.

Cu toate acestea, există câteva dezavantaje, și sunt prezentate ca urmează:

Biosenzorii vor funcționa doar dacă au reactivi adecvați.

Sunt supuși la interferențe de lumină ambientală. Acest lucru poate fi exclus, folosind un mediu întunecat sau un medi de radiații modulate.

Prezintă un interval de funcționare limitat în comparație cu bioenzorii electronici.

Timpul de răspuns ar putea fi lent din cauza timpului de transfer de masă de analizat la faza de reactiv.

Ireversibilitate poate fi o problemă dacă reactivul este scump.

Forme chmice imobilizate pot deveni o problemă pentru lungimi de undă inadecvate, lungimi de undă instabile din cauza creșterii în volum a matricii, photolabilității reactivului, și levigarea reactivului.

Este nevoie de indicatori mai selectivi și de mai multă reproductibilitate a proecedurilor de imobilizare pentru a activa și pentru a obține înaltă sensibilitate a bosenzorilor ți de a avea un sistem stabil pe termen lung.

Este necesară limitarea stabilității a componentului biologic imobilizat pe suprafața traductorului. Odată cu dezvoltarea continuă a traductoarelor optice, a celor electronice, precum și îmbunătățirea metodelor de imobilizare, biosenzorii de fibră optică sunt din ce în ce mai mult utilizați în aplicațiile industriale, în cele de monitorizare a mediului înconjurător, de prelucrare a produselor alimentare, și de aplicatii în domeniul clinic.

Un nou biosenzor amperometric mai puțin reactiv pentru determinarea ionilor de NH4 bazat pe AlaDH enzima și care implică utilizarea unui sistem de membrană suprapuse pentru imobilizarea tuturor reactivilor de a fost dezvoltat cu succes. Utilizarea unui strat de pHEMA cu greutate moleculară mică pentru NADH și imobilizarea piruvatului si o membrana photoHEMA cu enzima AlaDH captivă, oferă o procedură simplă și rapidă de fabricatie a unui biosenzor, în plus este convenabil pentru analizele de NH, în special pentru efectuarea analizelor in-situ, fără necesitatea de a adăuga reactivi. Biosenzorul mai puțin reactiv a demonstrat un interval larg de răspuns liniar între 10-100 mM ioni de NH4+, cu o limită de detecție de 0,18 mm și selectivitate bună asupra unor cationi majori. Un astfel de biosenzor are potențialul de a depăși problema analiză in-situ a ionilor de NH4+, deoarece acesta poate fi folosit pentru analizarea canalizată a ionilor de NH4 +, fără diluare suplimentară (concentrații de ioni NH4+ de canalizare sunt, de obicei 65 – 170 mM).

7. Referințe

Abass, A.K.; Hart, J.P.; Cowell, D.C.; Chappell, A. Development of an amperometric assay for NH4+ based on a chemically modified screen-printed NADH sensor. Anal. Chim. Acta 1998, 373, 1-8.

Albery, J., Haggett, B. & Snook, D. (1986). You know it makes sensors. New Scientist 13th Feb., 38-41.

Aminot, A.; Kerouel, R.; Birot, D. A flow injection-fluorometri method for the determination of ammonium in fresh and saline waters with a view to in situ analyses. Wat. Res. 2001, 35, 1777-1785.

Andrew, K.N.; Worsfold, P.J.; Comber, M. On-line flow injection monitoring of ammonia in industrial liquid effluents. Anal. Chim. Acta 1995, 314, 33-43.

Balslev P., A. Lynggaard-Jensen, C. Nickelsen, Nutrient sensor based real-time on-line process control of a wastewater treatment plant using recirculation, Water Sci. Tech. 33 (1996) 183–192.

Bertocchi, P.; Compagnone, D. Amperometric ammonium ion and urea determination with enzyme-based probes. Biosens. Bioelectron. 1996, 11, 1-10.

Bollmann A., H.J. Laanbroek, Continuous culture enrichments of ammonia-oxidizing bacteria at low ammonium concentrations, FEMS Microbiol. Ecol. 37 (2001) 211–221.

Bergmeyer, H.U. ed. (1974). Methods of Enzymatic Analysis 3rd edn, New York: Verlag Chemie, Academic Press.

Carr, P.W.; Bowers, L.D. Immobilised Enzymes in Analytical and Clinical Chemistry; John Wiley & Sons: New York, NY, USA, 1980.

Carville, M.; Robinson, H. Leachate treatment. Available online: http://www.leachate-treatment.com (accessed on 14 July 2011).

Damgaard L. A., N.P. Revsbech, A microscale biosensor for methane containing methanotrophic bacteria and an internal oxygen reservoir, Anal. Chem. 69 (1997) 2262–2267.

De Beer D., A. Schramm, C.M. Santegoeds, M. K¨uhl, A nitrite microsensor for profiling environmental biofilms, Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997) 973–977.

Deyhimi, F.; Choobar, B.G. Potentiometric determination of activity coefficients for NH4Cl in the ternary NH4Cl/LiCl/H2O mixed electrolyte system. J. Electroanal. Chem. 2005, 584, 141-146.

Dubas, S.T.; Pimpan, V. Green synthesis of silver nanoparticles for ammonia sensing. Talanta 2008, 76, 29-33.

Guilbault, G.G. & de Olivera Neto, G. (1985). Immobilised enzyme electrodes. In USES45,1Immobilised cells and enzymes A practical approach ed. J.Woodward, pp 55-74. Oxford: IRL Press Ltd.

Hall, E.A.H. (1986). The developing biosensor arena. Enzyme and Microbial Technology  8, 651-657.

Groeneweg J., B. Sellner, W. Tappe, Ammonia oxidation in Nitrosomonas at NH3 concentrations near km: effects of pH and temperature, Water Res. 28 (1994) 2561–2566.

Grunditz C., L. Gumaelius, G. Dalhammar, Comparison of inhibition assays using nitrogen removing bacteria: application to industrial wastewater, Water Res. 32 (1998) 2995–3000.

Grunditz C., G. Dalhammar, Development of nitrification inhibition assays using pure cultures of Nitrosomonas and Nitrobacter, Water Res. 35 (2001) 433–440.

Haghighi, B.; Kurd, S.F. Sequential flow injection analysis of ammonium and nitrate using gas phase molecular absorption spectrometry. Talanta 2004, 64, 688-694.

Hassan, S.S.M.; Marei, S.A.; Badr, I.H.; Arida, H.A. Novel solid-state ammonium ion potentiometric sensor based on zirconium titanium phosphate ion exchanger. Anal. Chim. Acta 2001, 427, 21-28.

Hunik J. H., H.J.G. Meijer, J. Tramper, Kinetics of Nitrosomonas europaea at extreme substrate, product and salt concentrations, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37 (1992) 802–807.

Joachim, C. (1986). Biochips: dreams…and realities. International Industrial Biotechnology 79:7:12/1, 211-219.

Jonsson K., C. Grunditz, G. Dalhammar, J.L. Jansen, Occurrence of nitrification inhibition in Swedish municipal wastewaters, Water Res. 34 (2000) 2455–2462.

Kandeler E., H. Gerber, Short-term assay of soil urease activity using colorimetric determination of ammonium, Biol. Fertil. Soils. 6 (1988) 68–72.

Kjær T., L.H. Larsen, N.P. Revsbech, Electrophoretic sensitivity control of microscale biosensors, Anal. Chim. Acta 391 (1999) 57–63.

Kazanskaya, N.; Kukhtin, A.; Manenkova, M. FET-based sensors with robust photosensitive polymer membranes for determination of ammonium ion and urea. Biosens. Bioelectron. 1996, 11, 253-261.

Kernevez, J.P., Konate, L. & Romette, J.L. (1983). Determination of substrate concentration by a computerized enzyme electrode. Biotechnology and Bioengineering 25, 845-855.

Kerouel, R.; Aminot, A. Fluorometric determination of ammonia in sea and estuarine waters by direct segmented flow analysis. Mar. Chem. 1997, 57, 265-275.

Kricka, L.J. & Thorpe, G.H.G. (1986). Immobilised enzymes in analysis. Trends in Biotechnology4, 253-258.

Krőnig A., J. Secker, K. Riedel, J. Metzger, A microbial sensor for measuring inhibitors and substrates for nitrification in wastewater, Int. Lab. July (1998) 15–19.

Kuo, C.T.; Wang, P.Y.; Wu, C.H. Fluorometric determination of ammonium ion by ion chromatography using postcolumn derivatization with o-phthaldialdehyde. J. Chromatogr. A 2005, 1085, 91-97.

Kwan, R.C.H.; Hon, P.Y.T.; Renneberg, R. Amperometric biosensor for rapid determination of alanine. Anal. Chim. Acta 2004, 523, 81-88.

Larsen L. H., T. Kjær, N.P. Revsbech, A microscale NO3− biosensor for environmental applications, Anal. Chem. 69 (1997) 3527–3531.

Li, P.Q.; Zhang, J.Z.; Millero, F.J.; Hansell, D.A. Continuous colorimetric determination of trace ammonium in seawater with a long-path liquid waveguide capillary cell. Mar. Chem. 2005, 107, 73-85.

Ludwig C., S. Ecker, K. Schwindel, H.-G. Rast, K.O. Stetter, G. Eberz, Construction of a highly bioluminescent Nitrosomonas as a probe for nitrification conditions, Arch. Microbiol. 172 (1999) 45–50.

Lynggard-Jensen A., Trends in monitoring of waste water systems, Talanta 50 (1999) 707–716.

Lowe, C.R. (1984). Biosensors. Trends in Biotechnology 2, 59-64.

Martinez, Y.M.; Hernandez, R.H.; Falco, P.C. Improved detection limit for ammonium/ammonia achieved by Berhelot’s reaction by use of solid-phase extraction coupled to diffuse reflectance spectroscopy. Anal. Chim. Acta 2005, 534, 327-334.

Mori, M.; Tanaka, K.; Helaleh, M.I.H.; Xu, Q.; Ikedo, M.; Ogura, Y.; Sato, S.; Hu, W.; Hasebe, K. Selective determination of ammonium ios by high-speed ion-exclusion chromatography on a weakly baic anion-exchange resin column. J. Chromatogr. A 2003, 997, 191-197.

Nielsen M., N.P. Revsbech, L.H. Larsen, A. Lynggaard-Jensen, Online determination of nitrite in wastewater treatment by use of a biosensor, Water Sci. Tech. 45 (2002) 69–76.

North, J.R. (1985). Immunosensors: antibody-based biosensors. Trends in Biotechnology 3, 180-186.

Nur Ellina, A.; Jaafar, A.; Musa, A.; Heng, L.Y.; Hamidah, S.; Nadarajah, K. Biosensor based on glutamate dehydrogenase immobilized in chitosan for the determination of ammonium in water samples. Anal. Biochem. 2009, 388, 28-32.

Oliveira, S.M.; Lopes, T.I.M.S.; Toth, I.V.; Rangel, A.O.S.S. A multi-commuted flow injection system with a multi-channel propulsion unit placed before detection: Spectrophotometric determination of ammonium. Anal. Chim. Acta 2007, 600, 29-34.

Revsbech N. P., T. Kjær, L.R. Damgaard, J. Lorenzen, L.H. Larsen, in: J. Buffle, G. Harvai (Eds.), In Situ Monitoring of Aquatic systems: Chemical Analysis and Speciation, John Wiley, 2000, pp. 195–222.

Revsbech N. P., An oxygen microelectrode with a guard cathode, Limnol. Oceanogr. 34 (1989) 472.

Russell, L.J. & Rawson, K.M. (1986). The commercialisation of sensor technology in clinical chemistry: An outline of the potential difficulties. Biosensors 2, 301-318.

Scheller, F.W., Schubert, F., Renneberg, R. & Mes82,5~ller, H-G. (1985). Biosensors: Trends and commercialization. Biosensors 1, 135-160.

Senillou, A.; Renault, N.J.; Griffe, C.M.F. A miniaturized ammonium sensor based on the integration of both ammonium and reference FETs in a sungle chip. Mater. Sci. Eng. C 1998, 6, 59-63.

Staden, J.F.V.; Taljaard, R.E. Determination of ammonia in water and industrial effluent streams with the indophenol blue method using sequential injection analysis. Anal. Chim. Acta 1997, 344, 281-289.

Stein L. Y., D.J. Arp, Loss of ammonia monooxygenase activity in Nitrosomonas europaea upon exposure to nitrite, Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998) 4098–4102.

Stehr G., B. B¨ottcher, P. Dittberner, G. Rath, H.P. Koops, The ammonia-oxidizing nitrifying population of the River Elbe estuary, FEMS Microbiol. Ecol. 17 (1995) 177–186.

Strőmberg N., S. Hulth, Ammonium selective fluorosensor based on the principles of coextraction, Anal. Chim. Acta 443 (2001) 215–225.

Tanaka H., E. Nakamura, H. Hoshikawa, Y. Tanaka, Development of the ammonia biosensor monitoring system, Water Sci. Tech. 28 (1993) 435–445.

Thomas, D.H.; Rey, M.; Jackson, P.E. Determination of inorganic cations and ammonium in environmental waters by ion chromatography with a high-capacity cation-exchange column. J. Chromatogr. A 2002, 956, 181-186.

Turner, A.P.F. (1987). Biosensors: Principles and potential. In Chemical aspects of food enzymes, ed. A.T.Andrews, pp 259-270, London: Royal Society of Chemistry.

Turner, A.P.F., Karube, I. & Wilson, G.S. eds. (1987). Biosensors: Fundamentals and applications, Oxford, U.K: Oxford University Press.

Vadgama, P. (1986). Urea pH electrodes: Characterisation and optimisation for plasma measurements. Analyst111, 875-878.bp.

Verhagen F.J.M., H.J. Laanbroek, Competition for ammonium between nitrifying and heterotrophic bacteria in dual energy limited chemostat, Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 3255–3263.

7. Referințe

Abass, A.K.; Hart, J.P.; Cowell, D.C.; Chappell, A. Development of an amperometric assay for NH4+ based on a chemically modified screen-printed NADH sensor. Anal. Chim. Acta 1998, 373, 1-8.

Albery, J., Haggett, B. & Snook, D. (1986). You know it makes sensors. New Scientist 13th Feb., 38-41.

Aminot, A.; Kerouel, R.; Birot, D. A flow injection-fluorometri method for the determination of ammonium in fresh and saline waters with a view to in situ analyses. Wat. Res. 2001, 35, 1777-1785.

Andrew, K.N.; Worsfold, P.J.; Comber, M. On-line flow injection monitoring of ammonia in industrial liquid effluents. Anal. Chim. Acta 1995, 314, 33-43.

Balslev P., A. Lynggaard-Jensen, C. Nickelsen, Nutrient sensor based real-time on-line process control of a wastewater treatment plant using recirculation, Water Sci. Tech. 33 (1996) 183–192.

Bertocchi, P.; Compagnone, D. Amperometric ammonium ion and urea determination with enzyme-based probes. Biosens. Bioelectron. 1996, 11, 1-10.

Bollmann A., H.J. Laanbroek, Continuous culture enrichments of ammonia-oxidizing bacteria at low ammonium concentrations, FEMS Microbiol. Ecol. 37 (2001) 211–221.

Bergmeyer, H.U. ed. (1974). Methods of Enzymatic Analysis 3rd edn, New York: Verlag Chemie, Academic Press.

Carr, P.W.; Bowers, L.D. Immobilised Enzymes in Analytical and Clinical Chemistry; John Wiley & Sons: New York, NY, USA, 1980.

Carville, M.; Robinson, H. Leachate treatment. Available online: http://www.leachate-treatment.com (accessed on 14 July 2011).

Damgaard L. A., N.P. Revsbech, A microscale biosensor for methane containing methanotrophic bacteria and an internal oxygen reservoir, Anal. Chem. 69 (1997) 2262–2267.

De Beer D., A. Schramm, C.M. Santegoeds, M. K¨uhl, A nitrite microsensor for profiling environmental biofilms, Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997) 973–977.

Deyhimi, F.; Choobar, B.G. Potentiometric determination of activity coefficients for NH4Cl in the ternary NH4Cl/LiCl/H2O mixed electrolyte system. J. Electroanal. Chem. 2005, 584, 141-146.

Dubas, S.T.; Pimpan, V. Green synthesis of silver nanoparticles for ammonia sensing. Talanta 2008, 76, 29-33.

Guilbault, G.G. & de Olivera Neto, G. (1985). Immobilised enzyme electrodes. In USES45,1Immobilised cells and enzymes A practical approach ed. J.Woodward, pp 55-74. Oxford: IRL Press Ltd.

Hall, E.A.H. (1986). The developing biosensor arena. Enzyme and Microbial Technology  8, 651-657.

Groeneweg J., B. Sellner, W. Tappe, Ammonia oxidation in Nitrosomonas at NH3 concentrations near km: effects of pH and temperature, Water Res. 28 (1994) 2561–2566.

Grunditz C., L. Gumaelius, G. Dalhammar, Comparison of inhibition assays using nitrogen removing bacteria: application to industrial wastewater, Water Res. 32 (1998) 2995–3000.

Grunditz C., G. Dalhammar, Development of nitrification inhibition assays using pure cultures of Nitrosomonas and Nitrobacter, Water Res. 35 (2001) 433–440.

Haghighi, B.; Kurd, S.F. Sequential flow injection analysis of ammonium and nitrate using gas phase molecular absorption spectrometry. Talanta 2004, 64, 688-694.

Hassan, S.S.M.; Marei, S.A.; Badr, I.H.; Arida, H.A. Novel solid-state ammonium ion potentiometric sensor based on zirconium titanium phosphate ion exchanger. Anal. Chim. Acta 2001, 427, 21-28.

Hunik J. H., H.J.G. Meijer, J. Tramper, Kinetics of Nitrosomonas europaea at extreme substrate, product and salt concentrations, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37 (1992) 802–807.

Joachim, C. (1986). Biochips: dreams…and realities. International Industrial Biotechnology 79:7:12/1, 211-219.

Jonsson K., C. Grunditz, G. Dalhammar, J.L. Jansen, Occurrence of nitrification inhibition in Swedish municipal wastewaters, Water Res. 34 (2000) 2455–2462.

Kandeler E., H. Gerber, Short-term assay of soil urease activity using colorimetric determination of ammonium, Biol. Fertil. Soils. 6 (1988) 68–72.

Kjær T., L.H. Larsen, N.P. Revsbech, Electrophoretic sensitivity control of microscale biosensors, Anal. Chim. Acta 391 (1999) 57–63.

Kazanskaya, N.; Kukhtin, A.; Manenkova, M. FET-based sensors with robust photosensitive polymer membranes for determination of ammonium ion and urea. Biosens. Bioelectron. 1996, 11, 253-261.

Kernevez, J.P., Konate, L. & Romette, J.L. (1983). Determination of substrate concentration by a computerized enzyme electrode. Biotechnology and Bioengineering 25, 845-855.

Kerouel, R.; Aminot, A. Fluorometric determination of ammonia in sea and estuarine waters by direct segmented flow analysis. Mar. Chem. 1997, 57, 265-275.

Kricka, L.J. & Thorpe, G.H.G. (1986). Immobilised enzymes in analysis. Trends in Biotechnology4, 253-258.

Krőnig A., J. Secker, K. Riedel, J. Metzger, A microbial sensor for measuring inhibitors and substrates for nitrification in wastewater, Int. Lab. July (1998) 15–19.

Kuo, C.T.; Wang, P.Y.; Wu, C.H. Fluorometric determination of ammonium ion by ion chromatography using postcolumn derivatization with o-phthaldialdehyde. J. Chromatogr. A 2005, 1085, 91-97.

Kwan, R.C.H.; Hon, P.Y.T.; Renneberg, R. Amperometric biosensor for rapid determination of alanine. Anal. Chim. Acta 2004, 523, 81-88.

Larsen L. H., T. Kjær, N.P. Revsbech, A microscale NO3− biosensor for environmental applications, Anal. Chem. 69 (1997) 3527–3531.

Li, P.Q.; Zhang, J.Z.; Millero, F.J.; Hansell, D.A. Continuous colorimetric determination of trace ammonium in seawater with a long-path liquid waveguide capillary cell. Mar. Chem. 2005, 107, 73-85.

Ludwig C., S. Ecker, K. Schwindel, H.-G. Rast, K.O. Stetter, G. Eberz, Construction of a highly bioluminescent Nitrosomonas as a probe for nitrification conditions, Arch. Microbiol. 172 (1999) 45–50.

Lynggard-Jensen A., Trends in monitoring of waste water systems, Talanta 50 (1999) 707–716.

Lowe, C.R. (1984). Biosensors. Trends in Biotechnology 2, 59-64.

Martinez, Y.M.; Hernandez, R.H.; Falco, P.C. Improved detection limit for ammonium/ammonia achieved by Berhelot’s reaction by use of solid-phase extraction coupled to diffuse reflectance spectroscopy. Anal. Chim. Acta 2005, 534, 327-334.

Mori, M.; Tanaka, K.; Helaleh, M.I.H.; Xu, Q.; Ikedo, M.; Ogura, Y.; Sato, S.; Hu, W.; Hasebe, K. Selective determination of ammonium ios by high-speed ion-exclusion chromatography on a weakly baic anion-exchange resin column. J. Chromatogr. A 2003, 997, 191-197.

Nielsen M., N.P. Revsbech, L.H. Larsen, A. Lynggaard-Jensen, Online determination of nitrite in wastewater treatment by use of a biosensor, Water Sci. Tech. 45 (2002) 69–76.

North, J.R. (1985). Immunosensors: antibody-based biosensors. Trends in Biotechnology 3, 180-186.

Nur Ellina, A.; Jaafar, A.; Musa, A.; Heng, L.Y.; Hamidah, S.; Nadarajah, K. Biosensor based on glutamate dehydrogenase immobilized in chitosan for the determination of ammonium in water samples. Anal. Biochem. 2009, 388, 28-32.

Oliveira, S.M.; Lopes, T.I.M.S.; Toth, I.V.; Rangel, A.O.S.S. A multi-commuted flow injection system with a multi-channel propulsion unit placed before detection: Spectrophotometric determination of ammonium. Anal. Chim. Acta 2007, 600, 29-34.

Revsbech N. P., T. Kjær, L.R. Damgaard, J. Lorenzen, L.H. Larsen, in: J. Buffle, G. Harvai (Eds.), In Situ Monitoring of Aquatic systems: Chemical Analysis and Speciation, John Wiley, 2000, pp. 195–222.

Revsbech N. P., An oxygen microelectrode with a guard cathode, Limnol. Oceanogr. 34 (1989) 472.

Russell, L.J. & Rawson, K.M. (1986). The commercialisation of sensor technology in clinical chemistry: An outline of the potential difficulties. Biosensors 2, 301-318.

Scheller, F.W., Schubert, F., Renneberg, R. & Mes82,5~ller, H-G. (1985). Biosensors: Trends and commercialization. Biosensors 1, 135-160.

Senillou, A.; Renault, N.J.; Griffe, C.M.F. A miniaturized ammonium sensor based on the integration of both ammonium and reference FETs in a sungle chip. Mater. Sci. Eng. C 1998, 6, 59-63.

Staden, J.F.V.; Taljaard, R.E. Determination of ammonia in water and industrial effluent streams with the indophenol blue method using sequential injection analysis. Anal. Chim. Acta 1997, 344, 281-289.

Stein L. Y., D.J. Arp, Loss of ammonia monooxygenase activity in Nitrosomonas europaea upon exposure to nitrite, Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998) 4098–4102.

Stehr G., B. B¨ottcher, P. Dittberner, G. Rath, H.P. Koops, The ammonia-oxidizing nitrifying population of the River Elbe estuary, FEMS Microbiol. Ecol. 17 (1995) 177–186.

Strőmberg N., S. Hulth, Ammonium selective fluorosensor based on the principles of coextraction, Anal. Chim. Acta 443 (2001) 215–225.

Tanaka H., E. Nakamura, H. Hoshikawa, Y. Tanaka, Development of the ammonia biosensor monitoring system, Water Sci. Tech. 28 (1993) 435–445.

Thomas, D.H.; Rey, M.; Jackson, P.E. Determination of inorganic cations and ammonium in environmental waters by ion chromatography with a high-capacity cation-exchange column. J. Chromatogr. A 2002, 956, 181-186.

Turner, A.P.F. (1987). Biosensors: Principles and potential. In Chemical aspects of food enzymes, ed. A.T.Andrews, pp 259-270, London: Royal Society of Chemistry.

Turner, A.P.F., Karube, I. & Wilson, G.S. eds. (1987). Biosensors: Fundamentals and applications, Oxford, U.K: Oxford University Press.

Vadgama, P. (1986). Urea pH electrodes: Characterisation and optimisation for plasma measurements. Analyst111, 875-878.bp.

Verhagen F.J.M., H.J. Laanbroek, Competition for ammonium between nitrifying and heterotrophic bacteria in dual energy limited chemostat, Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 3255–3263.