Obtinerea Fermentativa A Etanolului CU Zymomonas Mobilis

Cuprins

Bibliografie 53

1. Introducere

Producția de bioetanol din materiale lignocelulozice prezintă potențialul de a reduce dependența mondială de petrol și descreșterea emisiilor de dioxid de carbon, principalul gaz cu efect de seră, obiectiv care poate fi atins cu ajutorul bacteriei Zymomonas mobilis. Se întâlnesc și situații în care etanolul nu poate concura economic cu benzina sau cu derivații petrolieri ai combustibililor fosili. Oportunitatea de a îmbunătăți procesele de conversie a biomasei la etanol există și se pot concretiza în producții economice mai favorabile. Fermentația pe încărcătură solidă reprezintă o îmbunătățire a procesului care are scopul de a crește atât rata fermentației, cât și concentrațiile finale în etanol, reducându-se astfel și costurile de producție. Avantajele economice asociate cu procesele de zaharificare pe încărcătură solidă includ costuri reduse de capital datorită volumului redus, energiei reduse necesare încălzirii și răcirii, micșorării și eliminării costurilor de tratament printr-o utilizare mai scăzută a apei.

2. Biologia microorganismului Zymomonas mobilis

2.1. Habitatul bacteriei Zymomonas mobilis

Zymomonas mobilis a fost identificată în regiunile tropicale și subtropicale, în plante bogate în zahăr, plante de agave (băutura obținută se numește pulque) în Mexic, trestie de zahăr în Brazilia și Insulele Fiji și în palmierul de vin din Africa Centrală. Acest microorganism mai este asociat cu fermentația sevei din trestia de zahăr, boabe de cacao fermentate și miere maturizată. În Europa, Z. mobilis s-a identificat, de asemenea, în bere degradată și vinul de mere.

Prima descriere a degradării vinului de mere (cider sickness) a fost realizată în 1903 și s-a observat prezența hidrogenului sulfurat în compoziția acestuia.

Barker și Hillier au fost primii care au descris, în 1912, vinul de mere (cidrul) refermentat și, implicit, bacteria răspunzătoare de acest lucru. Primele semne care indică refermentarea cidrului sunt spumarea, determinată de formarea abundentă de gaze, o schimbare tipică a aromei și a mirosului, reducerea cantității de substanțe cu gust dulce și apariția unei turbidități ce duce la formarea unui depozit cu densitate mare. Cei doi oameni de știință au izolat și purificat o bacterie din microflora complexă a vinului de mere degradat, care a produs aroma puternică în vinul de mere steril după infecție; din păcate, ei nu au dat o denumire latinească acestui microorganism.

În 1951 au fost izolate câteva bacterii din vinul de mere, asemănătoare cu tulpinile descoperite de Barker și s-a demonstrat că era vorba de Zymomonas. Unele tulpini au produs aproximativ 1.9 moli de etanol/mol de glucoză și aceeași cantitate de dioxid de carbon. S-a detectat, în plus, prezența unor produși secundari, ca hidrogenul sulfurat, acetaldehida și acidul lactic. pH-ul optim de dezvoltare a fost de 4.5-6.5, iar temperatura optimă cuprinsă între 25 și 31˚C.

2.2. Caracterizarea generală a bacteriei Zymomonas mobilis

Zymomonas mobilis poate fi încadrată taxonomic astfel: subclasa α Proteobacteria, familia I-Sphingomonadaceae, ordinul IV-Sphingomonadales, genul Zymomonas, specia mobilis. Zymomonas mobilis prezintă două subspecii: Zymomonas mobilis subsp. mobilis și Zymomonas mobilis subsp. pomaceae. În Tabelul 1 sunt redate câteva din caracteristicile celor două subspecii.

Zymomonas se prezintă sub formă de bastonaș cu capete rotunjite, uneori elipsoidale, de obicei în perechi, 2-6 de 1-1.4 μm. Sunt bacterii Gram negative, de obicei imobilizate. Dacă prezintă motilitate, mișcarea se realizează cu ajutorul flagelilor, în număr de 1-4. Motilitatea poate fi pierdută spontan. Sunt facultativ anaerobe, unele tulpini sunt obligatoriu aerobe. Temperatura optimă de dezvoltare este cuprinsă între 25 și 31˚C. Coloniile de pe mediul standard prezintă luciu, margini regulate, cu nuanțe de alb spre crom, de 1-2 mm în diametru după 2 zile de creștere la 30˚C. Nutriția este de tip chemoorganotrofă, bacteria crește și fermentează 1 mol de glucoză sau fructoză până la aproape 2 moli de etanol, 2 moli de dioxid de carbon și o cantitate mai mică de acizi organici, precum acidul lactic. Unele tulpini pot degrada și zaharoza, dar alte surse de carbon sunt excluse. Gluconatul poate fi descompus, însă nu servește ca sursă de carbon sau de energie. Sorbitolul și glucolactonatul sunt produși când bacteriile se dezvoltă pe zaharoză sau amestecuri de glucoză-fructoză de o singură enzimă, glucozo-fructozo -oxidoreductaza. Membranele conțin triterpenoide pentaciclice din seria hopanoidelor. Nitrații nu sunt reduși și nu se produce indol. Zymomonas tolerează etanolul 5% și are toleranță și față de acizi, dezvoltându-se la pH de 3.5-7.5. Creșteri bune sunt înregistrate doar când în mediu se găsesc amestecuri de aminoacizi, dar nici un aminoacid nu este esențial. Toate tulpinile necesită biotină și pantotenat. Procentul molar de guanina și citozină din ADN este cuprins între 47.5 și 49.5.

Tabelul 1. Diferențe ce deosebesc subspeciile de Zymomonas mobilis

Simboluri: +, tipic pozitiv, -, tipic negativ.

Celulele de Zymomonas au, de obicei, margini drepte cu capete rotunde sau ovoide, sunt dispuse în perechi sau solitare. Celulele nu formează spori și nu conțin lipide intracelulare detectabile, glicogen, sau poli-β-hidroxibutirat. Unele tulpini individuale se organizează în agregate celulare de tip rozetă, lanțuri celulare, curbate sau în forma literei U, sau filamanetoase. Majoritatea tulpinilor nu prezintă motilitate.

Deși Zymomonas are un metabolism de tip fermentativ, este capabilă de a se dezvolta aerob, și astfel poate fi clasificată drept bacterie facultativ anaerobă. Tulpinile deficiente în alcool dehidrogenază sunt obligatoriu aerobe. În membrana citoplasmatică se găsește un lanț transportor de electroni, dar nu se petrec fosforilări oxidative în prezența glucozei.

Zymomonas se dezvoltă la temperaturi cuprinse între 25-30˚C, 74% din tulpini cresc la 38˚C, dar rar se înregistrează cazuri de dezvoltare la 40˚C. Creșterea se petrece încet la 15˚C și este absentă la 4˚C. Membrii subspeciei pomaceae nu se dezvoltă la temperaturi care depășesc 36˚C, de aceea un test de înregistrare a temperaturii e o modalitate de distingere a subspeciilor de Z. mobilis.

Intervalul de pH la care se înregistrează creșterea celulelor este de 3.8-7.5. La pH 3.5, 40 % din tulpini se dezvoltă, ceea ce indică o toleranță bună față de acizi. Nu e ceva surprinzător, având în vedere că nișa bacteriei e reprezentată de palmierul de vin, vinul de mere sau berea la pH = 4.

Poate fi observată o rată crescută de mortalitate a celulelor în loturile de fermentație după ce toate zaharurile au fost degradate. Celulele bacteriene sunt menținute în viață pe un mediu complex la temperatura camerei și transferate săptămânal. Dacă sunt liofilizate, aceste microorganisme pot fi menținute viabile câțiva ani. Viabilitatea celulelor e rapid pierdută în prezența tampoanelor ionice diluate precum citratul de sodiu, clorura de sodiu, sau fosfatul de sodiu. O soluție tampon Tris (tri-hidroximetil-aminometan) 10mM (pH 8) ce conține 33 mM MgCl2 ar trebui folosită pentru diluții seriale la temperatură scăzută.

Zymomonas mobilis este o bacterie aerotolerantă, fermentativă, care reunește un număr de trăsături excepționale: peste 95% din glucoza folosită de către microorganism e convertită într-un amestec echimolar de etanol și dioxid de carbon și doar un procent foarte mic (<3% e încorporat în masa celulară). Catabolismul singurelor surse de carbon, glucoza și fructoza, e realizat pe calea Entner-Doudoroff, cu o producție netă de 1 mol ATP/moleculă de glucoză (fructoză) catabolizată. Nu prezintă alte căi de metabolizare a glucozei, este incapabilă de gluconeogeneză și prezintă o cale a acizilor tricarboxilici incompletă. Prezența piruvat decarboxilazei și a alcool dehidrogenazei permite microorganismului să producă etanol fermentativ (poate produce aproape 2 moli de etanol/mol de glucoză). Din cauza creșterii rapide a microorganismului, catabolismului zaharurilor (cam de 1 μmol glucoză * min-1 * mg-1 proteină celulară) și a toleranței crescute la concentrații mari ale substratului (pâna la 30% glucoză) și o producție de 13% etanol, Zymomonas mobilis produce etanol de fermentație eficient.

Z. mobilis nu e patologică pentru plante și animale. Lindner1 recomandă Zymomonas în alimentația umană ca și un sortiment de iaurt. Bacteria îsi găsește utilitate și în tratamentul contra unor bacterii și fungi patogeni ce produc infecții ginecologice (Swings, Falco de Morais).

Vinul de mere englezesc suferă o a doua fermentație sub acțiunea acestei bacterii, fenomen cunoscut sub denumirea generică “cider sickness” și descris prima dată de către Barker în 1912. Zymomonas este responsabilă și de degradarea berii, care prezintă o turbiditate mare și un miros neplăcut după contaminarea cu acidul sulfhidric.

2.3. Modalități de izolare ale bacteriei Z. mobilis

Barker și Hillier au recurs la izolarea microorganismului din vinul de mere acrit (cider sickness) pe mustul de bere gelatinizat și au obținut mici colonii după 11 zile de incubare la o temperatură de 22˚C.

Swings descrie izolarea bacteriei din vinul de palmier proaspăt, care conține o drojdie și un inhibitor (Difco). Probele au fost luate din mediu pe cutii Petri și incubate la 30˚C în sistem anaerob Gas Pak, obținându-se colonii de 1-4 mm după 4-5 zile. E important de menționat că s-a folosit vin proaspăt, cu o “vechime” de maxim 24 h, deoarece izolarea din vinul de peste 48 h este imposibilă.

Swings și De Ley descriu mediul de selecție folosit: 0.3% extract de malț, 0.3% extract de drojdie, 2% glucoză, 0.5% peptonă, și 0.002% ciclohexamidă. pH-ul a fost ajustat pâna la 4, s-a autoclavat și s-a suplimentat cu etanol pâna la concentrația finală de 3%.

Pentru cultivarea lui Z. mobilis se poate folosi un mediu de cultură cu următoarea compoziție (g/l apă distilată): glucoză-20, KH2PO4-3.5, (NH4)2SO4-2, MgSO4 * 7 H2O-1, FeSO4 * 7 H2O-0.01, 2 -[N-morfolino]-etansulfonat-19.52. Mediul a fost ajustat până la pH-ul de 5.5 și autoclavat. Pe urmă, s-a adăugat o soluție sterilă de biotină și pantotenat de calciu pentru a ajunge la o concentrație finală de 0.001g/l.

Un mediu complet cuprinde următoarele componente (g/l apă distilată): D-glucoză -20, extract de drojdie-10, KH2PO4-1, (NH4)2SO4-1, MgSO4 * 7 H2O-0.5.

3. Zymomonas mobilis – bacterie etanologenă

Bacteriile producătoare de etanol au atras atenția oamenilor de știință datorită ratei lor mai mari de creștere față de cea a microorganismului actual care e folosit pentru producerea de biocombustibil-Saccharomyces cerevisiae.

O mare parte a cercetării se axează pe găsirea unei biomase rentabile din punct de vedere economic, pentru obținerea de etanol ca și sursă regenerabilă de combustibil.

Printre microorganismele producătoare de biocombustibil se numără Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipidis, Candida shehatae, Candida tropicalis, Schizosaccharomyces pombe, Pachysolen tannophilus, Klebsiella oxytoca, Erwina chrysanthemi, Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Lactobacillus specie si Clostridium specie, dar nu toate prezintă trăsăturile așteptate pentru un etanologen ideal.

Zymomonas mobilis se utilizează din vechime la fabricarea băuturilor alcoolice, este cea mai eficientă dintre microorganismele pretendente la acest „titlu”, dar prezintă și inconvenientul de a fi limitată de sursele de carbon pe care le metabolizează (glucoză, fructoză și zaharoză).

Pentru a diminua acest neajuns s-a apelat la ingineria genetică și s-a reușit creșterea numărului de substraturi degradate de Zymomonas.

Unele tulpini de Z. mobilis care au suferit o mutageneză chimică au reușit să utilizeze drept sursă de carbon manitolul. Introducerea genelor heteroloage de la diverse microorganisme la Zymomonas a dus la utilizarau reușit să utilizeze drept sursă de carbon manitolul. Introducerea genelor heteroloage de la diverse microorganisme la Zymomonas a dus la utilizarea de D-xiloză, D-manoză, L-arabinoză, β-glucozidază, sau lactoză.

Prin manipulare genetică s-au realizat sisteme de vectori-gazdă, care introduși în celulele de Zymomonas au dus la metabolizarea unor substraturi ca rafinoza, melobioza, galactoza sau lactoza.

3.1 Influența substratului asupra producției de etanol

Z. mobilis utilizează doar trei surse de carbon: glucoză, fructoză și zaharoză. Zaharoza nu are nevoie de un sistem de captare deoarece este clivată extracelular, iar produșii săi, glucoza și fructoza sunt preluați ulterior în celule prin difuzie facilitată de o proteină comună de transport (glucozo-facilitatoare).

Datele de literatură arată că acest microorganism pare a fi singurul care se bazează exclusiv pe asimilarea zaharurilor într-un sistem uniport (echilibrarea concentrațiilor interne și externe de zaharuri). Încă nu a fost detectat nici un sistem fosfoenolpivuruvat (PEP) dependent de asimilare a zaharurilor. Sistemul uniport nu are nevoie de energie metabolică, dar nu poate acumula substanțe.

Ulterior fosforilării, oricum distrage hexoze libere astfel ca asimilarea efectivă de zaharuri să fie justificată. În afară de glucoză și fructoză, diferite alte hexoze și pentoze sunt substraturi pentru proteina glucozo-facilitatoare (GFL), însă D-manoza și D-xiloza nu reprezintă substraturi de creștere pentru forma sălbatică de Z. mobilis (astfel se recurge la ingineria genetică). Glucoza este preferată ca și substrat (Km 4mM) fructozei sau xilozei (Km 40mM pentru fiecare). Proteina GFL transportă substratul cu o viteză maxima ridicată Vmax (peste 1 μmol substrat * mg-1 celulă proteină * min-1), D-xiloza fiind substratul cel mai potrivit, urmat de glucoză și fructoză. Creșterea pe fructoză duce la o creștere în transcrierea proteinei GLF, iar această creștere poate compensa afinitatea scăzută cu fructoza.

Obținând rate mai ridicate de transport ale glucozei și fructozei, echilibrarea concentrațiilor interne și externe poate fi rapidă și poate contribui la ajustare osmotică. Deși nu e un substrat de creștere pentru Z. mobilis, sorbitolul solubil compatibil se acumulează (peste 1M, concentrație intracelulară) și, în plus, îmbunătățește dezvoltarea lui Z. mobilis în medii bogate în zaharuri. Transportul de sorbitol este dependent de forța motrice a protonului. Difuzia etanolului pe partea cealaltă a membranei celulare a fost determinată prin rezonanță magnetică nucleară (13C-RMN).

Fluxul glicolitic și reglarea metabolismului

Enzimele glicolitice ale căii Entner-Doudoroff și enzimele fermentative, piruvat decarboxilaza și alcool dehidrogenaza, ale bacteriei Z. mobilis reprezintă mai bine de jumătate din proteinele solubile ale organismelor. Se presupune că aceste enzime acționează în vecinătatea substraturilor saturate și nu reprezintă subiectul reglărilor majore, de exemplu controlul alosteric. Activitatea catabolică generală a lui Z. mobilis duce la un flux aproape nelimitat de carbon pe calea glicolitică. Astfel, în fiecare minut, Zymomonas consumă o cantitate de glucoză, egală cu o treime din masa ei. Reglarea activității enzimatice a fost demonstrată pentru glucokinază printr-o cerere absolută de fosfat anorganic și într-un grad mai mic, printr-un feedback de inhibare cu ajutorul glucozo-6-fosfatului. Fructokinaza este inhibată de glucoză (Ki 0.14 mM). Piruvat kinaza, care este reglată alosteric la multe alte organisme, nu pare a fi ținta niciunui activator alosteric. Creșterea pe fructoză induce aproximativ de două ori transcrierea genelor pentru metabolismul zaharurilor periferice, ceea ce duce la introducerea fructozei în glicoliză (de exemplu, prin asimilarea fructozei via GFL, fosforilarea fructozei de către fructokinază FRK, și izomerizarea la glucozo-6-fosfat de către fosfoglucozoizomerază PGI). În Figura 1 este redată prezentarea generală a principalelor căi metabolice ale unei celule de Z. mobilis.

Controlul fluxului glicolitic este exercitat, în principal, de glucozo-6-fosfat dehidrogenază după cum s-a arătat în mai multe studii privind câteva enzime glicolitice pentru Z. mobilis. La transcrierea fiecăreia din primele gene (glf – transportor glucoză/fructoză, zwf – glucozo-6-P-dehidrogenază, edd – 6-fosfogluconat dehidratază, glk – glucokinază) ale căii Entner-Doudoroff, numai recombinanții cu nivele crescute de glucozo-6-fosfat dehidrogenază au un flux glicolitic mai mare cu 10-13% decât cel al organismelor native, întrucât creșterea exprimării altor operoni glicolitici provoacă o descreștere semnificativă a fluxului glicolitic și a ratei de creștere. Mai târziu a fost atribuit efectul unei proteine povară. Dovezi suplimentare ale unui rol major al glucozo-6-fosfat dehidrogenazei în flux de control au fost aduse de investigațiile cinetice care au arătat că enzima e inhibată alosteric de fosfoenol piruvat. Mai mult, diferențele în stabilitatea transcrierii enzimelor glicolitice ale bacteriei Z. mobilis reprezintă un mecanism de echilibrare a nivelului înalt a enzimelor etanologenice. De aici înainte, expresia enzimelor glicolitice și fermentative se bazează, în principal, pe stabilitatea ARNm (timpul de înjumătățire al transcripților pentru enzimele glicolitice s-a încadrat în categoria 8-18 minute).35 Stabilitatea relativă a ARNm poate distinge gene glicolitice înalt exprimate de genele biosintetice. Diferența de exprimare a genelor gap (Ga 3-P dehidrogenaza) și pgk (fosfoglicerat kinaza), care formează un operon, a fost atribuită, de asemenea, diferențelor de stabilitate a ARNm.

Figura1.31 Prezentarea generală a principalelor căi metabolice într-o celulă de Z. mobilis. Pașii din metabolismul carbohidraților (asimilarea și metabolismul zaharozei, glucozei, fructozei, gluconatului, sorbitolului) sunt redați împreună cu reacțiile anabolice (ciclul acizilor tricarboxilici incomplet (TCA), formarea de bioproduși, formarea de hopanoide). Abrevieri: DXR-deoxixilulozo-5-fosfat reductizomeraza, DXS-1-deoxixilulozo-5-fosfat sintaza, GNT K-gluconat kinaza, ME-enzima malică, PGL-fosfoglucolactonaza, PPC-fosfoenolpiruvat carboxilaza, TKT-transketolaza.

Când sunt folosite în fermentația in vitro, enzimele căii Entner-Doudoroff sunt extrem de rezistente la inactivarea cu etanol și produc pâna la 16.5% etanol. În celulele vii, 3-fosfogliceratul s-a acumulat în prezența a 10% etanol și a fost detectat prin spectroscopie RMN cu 31P. Enzimele de testare au confirmat că fosfoglicerat mutaza și enolaza au fost inhibate în proporție de 31%, respectiv 40% de prezența etanolului 10% în sistemul de testare.

Enzime implicate în producția de etanol

Piruvat decarboxilaza (PDC, EC 4.1.1.1), o enzimă cheie în fermentația etanolului, catalizează conversia piruvatului la acetaldehidă și dioxid de carbon și depinde de tiamindifosfat și ionii de Mg în activitatea sa catalitică. Deși PDC este extrem de întâlnită la fungi și plantele superioare, apare rar la procariote, iar la animale este necunoscută. Înainte de a se întâlni la Z. mobilis, enzimele bacteriene au fost găsite la Sarcina ventriculi, Acetobacter specie și Erwinia amylovora. La Z. mobilis, PDC este una din cele mai abundente proteine, contribuind cu 4-6% la conținutul celular proteic solubil.30 Enzima este reprezentată de un homotetramer cu o subunitate moleculară masică de 60.79 kDa calculată din secvența de ADN. În contrast cu genele din Saccharomyces cerevisiae, doar o singură genă pare să codifice pentru PDC în Z. mobilis. PDC de la Z. mobilis expune condiții cinetice normale Michaelis-Menten cu o Km pentru piruvat de 0.3-0.4mM.15 Acesta e un lucru deosebit deoarece toate celelalte PDC care au fost caracterizate până acum sunt reglate alosteric de substrat sau alte molecule activatoare, de exemplu piruvamida. Recent, realizarea structurii tridimensionale a cristalului de PDC de la Z. mobilis a dezvăluit că aria interfeței dintre dimerii enzimei este mult mai mare decât cea din PDC drojdiilor. În plus, dimerii sunt mult mai strâns împachetați în PDC bacteriei, ceea ce previne rearanjări mari în structura cuaternară și privirea enzimei în conformația activată. Reziduurile critice aminoacidice implicate în legarea cofactorului (Asp440, Asn467, Gly469), legarea substratului (Asp27, His113, His114, Tyr290, Thr388, Glu473) și cataliză (Glu473) ale PDC din Z. moblis au fost identificate prin mutageneză direcționată pe situs. O reacție secundară catalizată de PDC este activitatea carboligazei, unde acetaldehida activată, legată de cofactorul tiamindifosfat este condensată la o a doua moleculă de aldehidă. Această condensare este folosită industrial la producerea fenilacetilcarbinolului, ([R]-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-onă), un intermediar în sinteza L-efedrinei. În PDC din Z. mobilis, înlocuirea alaninei cu triptofan (Trp392) localizată aproape de centrul activ sporește activitatea carboligazei, crescând producția de fenilacetilcarbinol.

Izoenzimele alcool dehidrogenazei. Z. mobilis posedă două izoenzime pentru alcool dehidrogenază (ADH, EC 1.1.1.1): ADH I (enzimă ce conține zinc) și ADH II (enzimă ce conține fier). Activitatea ADH este esențială pentru metabolismul obligatoriu fermentativ al lui Z. mobilis, reprezentând 2-5% din proteinele celulare solubile. ADH I, codificată de adhA, este un homotetramer cu o subunitate moleculară masică de 36 kDa și conține un atom de zinc per subunitate. Nivelul proteinelor ADH I, care este mult mai activ în fazele timpurii ale creșterii, cunoaște un declin în celulele aflate în faza staționară. Gena adhB codifică ADH II, tot o enzimă homotetramerică cu o subunitate moleculară masică de 40 kDa și un atom de fier per subunitate. Această enzimă catalizează jumătate din reducerea acetaldehidei în Z. mobilis. În condiții aerobe, activitatea ADH I este conservată deplin, dar activitatea ADH II descrește pe măsură ce complexul enzimă-Fe2+ este oxidat. Când ADH I oxidează, de asemenea, butanolul, ADH II nu are activitate aproape deloc pe acest substrat. S-a observat că enzima transferă hidrogenul pro-R al NADH pe acetaldehidă. Împreună cu ADH IV din Saccharomyces cerevisiae și propandiol oxidoreductaza din Escherichia coli, ADH II din Z. mobilis formează un grup de enzime înrudite structural ce aparțin grupului III de dehidrogenaze activate de fier. Aceste proteine nu prezintă homologie cu ADH-le ce conțin zinc. Producerea ADH II în Z. mobilis, catalogată drept o mare proteină de stres, este indusă atât prin expunerea la etanol, cât și de temperaturi ridicate. Enzima este exprimată dintr-un singur șir de promotori cooperanți care prezintă o indentitate parțială de secventă cu secvența consens pentru proteinele de șoc termic din Escherichia coli. Printr-o reacție în lanț a polimerazei (PCR) mediată de o mutageneză întâmplătoare, ADH II din Z. mobilis a fost modificată pentru a produce mai multe variante stabile termic. La fel, prin tehnici de mutageneză întâmplătoare in vitro s-au izolat diferite enzime care au specificitate diferită de substrat de cea a enzimei tipului sălbatic, de exemplu, enzime mutante active cu butanol sau NADP.

Fermentația alcoolică

Zymomonas mobilis realizează fermentații înalt productive în etanol și conferă un număr de avantaje comparative cu fermentația tradițională a drojdiilor (randamente mai bune în etanol din zaharuri, producții de biomasă scăzute și independență față de oxigen). Fermentația cu Zymomonas abordează, comparativ cu cea a drojdiilor, un spectru redus de substraturi, restrâns la glucoză, fructoză și zaharoză.3 În plus, toleranța scăzută a bacteriei la sare ridică probleme la fermentarea melasei, care, de obicei, prezintă un conținut ridicat de sare.11 S-a demonstrat că glucoza, precum și β-amidonul hidrolizat nesteril pot fi convertite eficient la etanol în urma proceselor continue dintr-un reactor cu pat fluidizat. În plus s-au dezvoltat procesele pentru zaharificarea simultană și fermentația amidonului sau a trestei de zahăr la etanol. Când glucoza este fermentată de culturi anaerobe, se formează cantități nesemnificative de bioproduși. Oricum, în timpul creșterii Z. mobilis pe medii ce conțin fructoză formarea de acetoină, acid acetic, acetaldehidă, glicerol și dihidroxiacetonă a fost mai pronunțată, iar randamentul celulelor a fost mai redus decât pe mediile cu glucoză. Diferite gene ce codifică enzime necesare pentru utilizarea altor surse de carbon (amidon, celuloză, rafinoză, lactoză, xiloză sau manoză) au fost transferate la Z. mobilis. O altă strategie pentru fermentația eficientă a acestor surse de carbon la etanol este transferul în Escherichia coli, alte bacterii enterice și, de asemenea, la bacterii Gram-pozitive transferul genelor PDC și ADH B ce codifică piruvat decarboxilaza și alcool dehidrogenaza II de la Z. mobilis.

Biomasa lignocelulozică reprezintă o resursă regenerabilă ieftină care poate fi utilizată pentru a satisface cererea tot mai crescută de etanol (combustibil). Aceste resurse înglobează celuloza, hemiceluloza și lignina. Produșii de hidroliză lignocelulozică, fie chimică, fie enzimatică, cuprind atât pentoze, cât și hexoze. Glucoza derivată din celuloză reprezintă hexoza majoritară, iar pentozele derivate din hemiceluloză sunt xiloza și arabinoza. Dacă fermentația glucozei la etanol poate fi realizată de o serie de microorganisme, conversia xilozei și a arabinozei la etanol decurge mai greu. Deoarece pentozele, care conțin predominant xiloză, pot însuma de la 8-28% din materia brută, este necesară conversia lor eficientă pentru a avea un proces economic rentabil. Studiile de inginerie genetică au condus la obținerea câtorva microorganisme fermentatoare de xiloză. Acestea include tulpini bacteriene recombinante de Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Zymomonas mobilis și drojdie recombinantă de Saccharomyces.

Deși biocombustibilul obținut din compușii bogați în hemiceluloză nu este încă competitiv economic cu benzina, s-au înregistrat îmbunătățiri tehnologice în configurația procesului și performanțele biocatalizatorilor care să ducă la o reducere progreisvă a costurilor de producție.

3.1.1. Producerea de etanol din fibra de porumb

În Statele Unite ale Americii peste 1.3 miliarde de galoane de etanol sunt produse anual, în principal, din amidonul de porumb. Diverse deșeuri agricole, provenite din porumb sau cereale, pot servi ca sursă ieftină și abundentă în producerea de etanol. În general, acestea conțin cam 30-50% celuloză, 20-35% hemiceluloză și 5-25% lignină. Fibrele de porumb reprezintă o resursă regenerabilă care este disponibilă în cantități suficiente din industria de măcinare a porumbului până la a servi ca și sursă ieftină de producere a biocombustibilului. În mod curent, utilizarea fibrelor de porumb în producerea de etanol reprezintă o încercare atât din punct de vedere tehnic, cât și economic, iar succesul depinde în mare de dezvoltarea procedurilor de pretratament, sisteme de enzime foarte eficiente în conversia fibrelor pretratate la zaharuri fermentabile, și microorganisme eficace pentru fermentarea amestecurilor de zaharuri la etanol.

Amidonul reprezintă cea mai abundentă sursă regenerabilă de carbon și a fost utilizată pe scară largă în producția de etanol. Din păcate, cele mai bune două organisme producătoare, Saccaromyces cerevisiae și Zymomonas mobilis nu pot utiliza amidonul. Astfel, conversia amidonului la etanol necesită două etape: hidroliza amidonului la glucoză, fie acidă, fie enzimatică, după care să aibă loc conversia la etanol. Se pot economisi resurse economice importante dacă ambele etape se realizează într-un singur reactor. O abordare implică integrarea genei care codifică glucoamilaza (GA) în cromozomul tulpinii producătoare de etanol. Organismul recombinant poate astfel converti direct amidonul la etanol. O altă posibilitate necesită coimobilizarea GA, sau un organism care să posede această funcție enzimatică, și un microorganism producător de etanol în straturi mici. Biocatalizatorul poate fi folosit astfel în conversia amidonului la etanol într-un singur reactor.

Fibra de porumb ca și materie primă

În Statele Unite, în prezent, atât morăritul umed, cât și cel uscat, sunt procese de producere a etanolului din porumb. Morăritul umed ocupă 60% în producția de etanol. Într-un proces tipic umed, porumbul curat se scufundă în apă circulantă, ușor acidifiată cu 0.1-0.2% SO2 la 51-54˚C, timp de 24-28 h pentru atenuarea granulelor, afânarea germenilor și a cocăi și umflarea în endosperm. Fibra de porumb este un amestec de cocă de porumb și amidon rezidual neextras în timpul proceselor de măcinare, însumănd până la 11% din greutatea uscată a granulelor de porumb. În prezent, fibra de porumb este comercializată sub formă de gluten și folosită în furajarea animalelor. O compoziție tipică a fibrei este redată în Tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziția fibrei de porumb

aConcentrația medie a fiecărui component este exprimată în wt% din totalul solid uscat.

bConținutul de zaharuri este exprimat pe bază anhidră.

cNumerele din paranteze se referă la deviațiile standard.

Aceasta conține aproximativ 70% zaharuri fermentabile, din care aproximativ 20% provin din amidon. În mod obișnuit, din 56 kg de porumb se obțin 32 kg de amidon Din același bu de porumb, se obțin cam 4.5 lb de fibre, iar din acestea 3.15 lb de zaharuri fermentabile. Aceste zaharuri vor da un randament teoretic de 0.3 galoane de etanol. În practică, se poate obține un randament de 0.24 galoane de etanol/bu de porumb. Costul redus și conținutul ridicat de carbohidrați al fibrelor de porumb fac din acesta o materie primă atractivă pentru conversia în biocombustibili.

Pretratamentul și zaharificarea enzimatică a fibrelor de porumb

Fibrele native de celuloză și hemiceluloză din plantele de porumb sunt rezistente la hidroliza enzimatică. Pretratamentul fibrelor este extrem de important înainte de a se trece la hidroliza enzimatică. Diferite opțiuni de pretratament pot fi folosite pentru solubilizare, hidroliză, și separarea amidonului, celulozei, hemicelulozei, și ligninei componente din fibrele de porumb. Un număr de proceduri de pretratament, cu acizi diluați, alcali, amoniac, peroxid alcalin, și apă fierbinte lichidă au fost încercate pe fibrele de porumb.

Fiecare din acestea prezintă avantaje și dezavantaje. Fracția amidonului din coca de porumb a fost complet hidrolizată de glucoamilază după ce coca a fost încălzită cu abur timp de 5 minute, iar fracția hemicelulozei fără amidon din cocă a fost ușor hidrolizată cu acid sulfuric la 135˚C.

Zaharificarea fibrei de porumb s-a realizat, mai întâi, prin tratare cu acid sulfuric diluat (100-160˚C), apoi cu enzime (celulază și glucoamilază, 45˚C), după o neutralizare parțială. Tratamentul secvențial a realizat conversia ( ˜ 85%) polizaharidelor din fibra de porumb la zaharuri monomerice. Formarea compușilor cu efect inhibitor pentru microorganismele fermentative a fost evidentă pentru toate pretratamentele testate între 140-160˚C.

Optimizarea condițiilor necesare pentru pretratamentul fibrelor de porumb cu un conținut mare de umezeală (150% umiditate raportat la masa uscată) se face prin explozia fibrelor cu amoniac (ammonia fiber explosion-AFEX). Cele mai bune rezultate au fost obținute la 90˚C cu amoniac și fibre de porumb uscate în raport de 1:1 și cu un timp de staționare de 30 minute (presiunea reactorului cca. 200 psig). Mai mult de 80% din randamentul teoretic în zaharuri a fost obținut în timpul hidrolizei enzimatice a AFEX-fibre de porumb pretratate cu un amestec de enzime comerciale (α-amilază, glucoamilază, celulază, hemicelulază și β-glucozidază). Xilooligozaharidele reprezintă cam 30-40% din produșii degradării xilanilor, și xiloza se produce în cantitate foarte mică. Recent, au fost semnalate pretratamente ale fibrei de porumb cu peroxid alcalin51 și s-a observat o susceptibilitate dublă a fibrelor de porumb hemicelulozice la digestia enzimatică.

Hidroliza celulozei la glucoză, care necesită acțiunea sinergetică a endoglucanazei, celobiohidrolazei și a β-glucozidazei, este foarte lentă din cauza inhibițiilor de produs și de substrat. În plus, celulazele sunt scumpe din cauza costurilor ridicate de producție și greu de refolosit. Deși β-glucozidaza hidrolizează celobioza la glucoză, cele mai multe β-glucozidaze sunt inhibate de glucoză, cât și de celobioză. Freer a purificat și a caracterizat o β-glucozidază unică de la Candida wickerhamii și a studiat cinetica enzimei în detaliu. Enzima a desfășurat o activitate optimă la un pH = 4-5 și a fost stabilă sub 40˚C. Celodextrinele au fost un substrat bun pentru enzimă. Nu s-a înregistrat inhibiția hidrolizei p-nitrofenil β-D-glucozidei cu 50 mM glucoză de către enzimă. Gena care codifică această β-glucozidază insensibilă la glucoză în Escherichia coli a fost izolată, clonată și introdusă în Saccharomyces cerevisiae și are potențialul de a multiplica drojdii care fermentează celodextrinele. Într-o continuă căutare pentru o β-glucozidază termofilică indiferentă față de inhibiția glucozei, Saha și Bothast au ecranat o varietate de drojdii din colecția de culturi a Agricultural Research Service (ARS). Enzime din 15 tulpini de drojdii au manifestat o toleranță extrem de ridicată față de glucoză (inhibiție <50% la 30% glucoză). Temperatura optimă pentru prepararea acestor 15 β-glucozidaze a variat de la 30 la 65˚C, iar pH-ul de la 4.5-6.5. β-glucozidaza de la Debaryomyces yamadae NRRL Y-11714 a manifestat cea mai înaltă temperatură optimă la 65˚C, urmată de enzimele produse de Candida chilensis NRRL Y-17141 și Kluyveromyces marxianus NRRL Y-1195 la 60˚C. pH-ul optim pentru aceste trei enzime a fost 6.5, 6 și, respectiv, 6.5. β-glucozidazele de la aceste 3 tulpini au hidrolizat celobioza. Β-glucozidaza de la Candida peltata NRRL Y-6888 a fost purificată și caracterizată. Producția de enzime nu a fost represată de glucoză, glucoza fiind o bună sursă de carbon în producerea acestor enzime. pH-ul optim și temperatura pentru acțiunea enzimei purificate au fost de 5, respectiv, 50˚C. Enzima a hidrolizat foarte bine celobioza și celooligozaharidele și a fost extrem de tolerantă la glucoză, cu o Ki de 1.4M (252 mg/mL). β-glucozidaza nu a fost inhibată de celobioză (15%). Celobioza (10%) a fost hidrolizată aproape în totalitate la glucoză de β-glucozidaza purificată, atât în prezența, cât și în absența glucozei 6% (Figura 2).

Figura 2. Timpul curs al hidrolizei celobiozei (10%, w/v) cu β-glucozidază purificată (1.5 U/mL) de la C. peltata Y-6888 în absența și în prezența glucozei (6% w/v) la pH 5 și 50˚C. Simboluri: (o) – doar celobioză; () – glucoză formată din celobioză; (∆) – celobioză cu glucoză.

β-glucozidaza dintr-o tulpină colorată de Aureobasidium pullulans a fost purificată, caracterizată și s-a descoperit ca e foarte termostabilă și optim activă la 75˚C. Timpul de înjumătățire al enzimei brute a fost de 72 h la 75˚C și de 24 h la 80˚C. Enzima a hidrolizat foarte bine atât celobioza, cât și celooligozaharidele, dar a fost puternic inhibată de glucoză la Ki de 5.65 mM.

Hidroliza totală a xilanilor necesită endoxilanaze, β-xilozidaze, și câteva enzime accesorii, cum ar fi α-L-arabinofuranozidaza, α-glucoronidaza, acetilxilanesteraza, ferulolil esteraza, și p-cumaril esteraza (pentru hidroliza diferiților xilani substituiți). Multe xilanaze nu clivează legătura glicozidică dintre unitățile de xiloză care sunt substituite. De aceea, părțile lanțurilor trebuie clivate înainte ca lanțul de bază xilanic să poată fi complet hidrolizat. Pe de altă parte, câteva enzime accesorii doar înlătură capetele lanțurilor din xilooligozaharide. Aceste enzime au nevoie de xilanaze pentru a hidroliza parțial hemiceluloza înainte ca lanțurile de capăt să fie clivate. Fibra de porumb hemicelulozică a fost rezistentă la hidroliza la zaharuri fermentabile de către hemicelulaze preparate comercial. Analiza structurală a fibrelor de porumb xilanice sugerează că peste 70% din reziduurile xilozei lanțului de bază au una sau mai multe arabinoze, acid 4-O-metilglucoronic, sau alte părți de lanțuri. Ca și rezultat, sunt puține regiuni în fibrele de porumb xilanice unde câteva reziduuri continue de xiloză nu sunt substituite, ceea ce face ca hidroliza enzimatică a xilanilor să fie dificilă.

Fermentația fibrelor de porumb hidrolizate

Majoritatea drojdiilor fermentatoare de xiloză și glucoză, precum Pichia stipidis, Candida shehatae și Pachysolen tannophylus nu au abilitatea de a produce etanol din L-arabinoză. Deoarece fibra de porumb conține 12% L-arabinoză, Dien a verificat 116 L-arabinoze utilizând drojdii pentru obținerea de etanol din L-arabinoză, și a descoperit următoarele specii capabile de a fermenta zaharuri: Ambrosiozyma monospora (NRRL Y-1484), Candida sp. (NRRL Y-2248), Candida auringiensis (NRRL Y-11848) și Candida succiphila (NRRL Y-11998). Aceste drojdii produc nivele scăzute de etanol (până la 4.1 g/L), și sunt potențiale candidate pentru mutații sau alte modalități de ameliorări genetice în creșterea producției de etanol. Multe drojdii sunt ineficiente în regenerarea cofactorului necesar în conversia L-arabinozei la etanol. Saha și Bothast au studiat producerea de L-arabitol din L-arabinoză de către doi producători superiori de L-arabitol (Candida entomaea NRRL Y-7785 și Pichia guilliermondii NRRL Y-2075). Aceste două tulpini au produs L-arabitol (0.70 g/g) din L-arabinoză (50g/L) la 34˚C și pH 5, respectiv 4. Ambele drojdii au produs etanol (0.32-0.33 g/L) din glucoză (50g/L), și doar xilitol (0.43-0.51 g/L) din xiloză (50 g/L). Drojdiile au coutilizat xiloză (6.2-6.5 g/L) și L-arabinoză (4.9-5 g/L) dintr-o fibră de prorumb hidrolizată acid simultan, și au produs xilitol (0.10 g/g xiloză) și L-arabitol (0.53-0.54 g/g L-arabinoză). Tulpina P2 de Klebsiella oxytoca este un organism recombinant în care au fost integrate genele piruvat decarboxilaza (pdc) și alcool dehidrogenaza (adh B) de la Z. mobilis în gena pfl împreună cu cromozomul M5A1 de la K. oxytoca și exprimat la nivele înalte. Această tulpină redirecționează metabolismul piruvatului la etanol, și produce o cantitate mai mică de acid acetic. Bothast a evaluat acest organism pentru abilitatea lui de a de a fermenta L-arabinoza, xiloza și glucoza, solitare și în amestec în loturi de fermentație cu pH controlat. Acest microorganism recombinant produce 0.34-0.43 g etanol/g zahar la pH 6 și 30˚C pe un substrat cu 8% zaharuri și utilizează L-arabinoza foarte bine. Dintr-un amestestec de zaharuri, tulpina P2 manifestă preferință pentru glucoză. Xiloza a fost utilizată foarte lent și aproximativ 47 și 29% din xiloza livrată a rămas neutilizată în amestecul A (glucoză:xiloză:arabinoză, 1:1:1) și amestecul B (glucoză:xiloză:arabinoză, 1:2:1), chiar și după 114 h de fermentație. Zaharurile utilizate au fost glucoza > arabinoza > xiloza, iar pentru producția de etanol xiloza > glucoza > arabinoza.

Bothast a investigat fermentația a 15% reziduuri din fibrele de porumb la hidroliză cu acid diluat folosind E. coli recombinant K011, derivat din E. coli B, în care au fost integrate genele pdc și adhB de la Z. mobilis. Fermentația a fost condusă într-un bioreactor cu cu agitare magnetică continuă de 2L (MultigenTM 2000 fermenter, New Brunswick, Edison, NJ) dotat cu controlor de pH, temperatură și agitare. Concentrația finală de etanol a depășit 3% w/v în 3 zile, iar randamentul a crescut, teoretic, de la 19-62%. Formarea compușilor inhibitori a devenit ușor aparentă pentru toate pretratamentele între 140-160˚C.

Hidroliza hemicelulozei din reziduurile agricole, frunze și pedunculi de porumb, coca de porumb împreună cu fibre au fost ușor fermentate la etanol de tulpina recombinantă K011 de E. coli. Extractul de porumb și autolizatele brute de drojdii pot servi drept nutrienți foarte buni. Fermentația s-a finalizat în 48 h, adesea obținând peste 40 g/L etanol.

Dien a tratat fibrele de porumb cu acid sulfuric diluat (1%, v/v H2SO4) la 121˚C timp de 1h. După hidroliză, materialele insolubile au fost îndepărtate prin filtrare și hidrolizații au fost neutralizați la pH 6.5 cu Ca(OH)2. CaSO4 insolubil a fost îndepărtat prin filtrare. Totalul de zaharuri reducătoare prezent într-un preparat tipic de hidrolizați a fost de 89.9 g/L cu glucoză (26.1 g/L), xiloză și galactoză (40.9 g/L)și L-arabinoză (22.8 g/L). Acest preparat a fost fermentat la etanol folosind tulpini recombinante de E. coli K011 și SL40. E. coli. SL 40 este un mutant rezistent fosfomicinic al tulpinii K011 care a produs 60 g/L etanol din 120 g/L xiloză în 60 h, cu 20% mai mult decât K011 în condiții identice. Randamentele în etanol au fost de 0.38-0.41 g/g de zahar consumat, și fermentația a fost completă în 60 h. Ambele tulpini au fermentat bine glucoza și L-arabinoza, dar fermentația xilozei a fost lentă și incompletă (Figura 3).

Ambele tulpini produc cantități mici de acizi organici: acid lactic (2.1-2.2 g/L), acid acetic (0.5-0.8g/L) și acid succinic (0.4-0.5 g/l). Suma de baze (2 M KOH) adăugată culturii pentru a menține pH-ul la 6.5 a fost 163 mmol/L pentru tulpina K011 și 120 mmol/L pentru tulpina SL40. Tulpina K011 a tins să utilizeze mai bine zaharurile decât SL40. Prezența glucozei în mediul de fermentație a inhibat utilizarea xilozei de către tulpina K011 de E. coli.

3.1.2. Producerea de etanol din amidonul de porumb într-un bioreactor cu pat fluidizat

Utilizarea sistemelor continue cu densitate mare a celulelor poate îmbunătăți productivitatea volumetrică în etanol comparativ cu sistemul de loturi tradiționale. Imobilizarea în gel este o metodă de retenție biocatalitică în sistemele continue. Productivitățile volumetrice în etanol a peste 60 g/L-h cu o conversie completă esențială a unei alimentări cu dextroză 15% au fost atinse folosind Z. mobilis imobilizată într-un bioreactor cu pat fluidizat (FBR). Aceasta este o îmbunătățire semnificativă comparativ cu productivitățile tipice de 2-5 g/L-h obținute la folosirea proceselor cu loturi de hrănire. Zaharificarea și fermentarea simultană (SSF) a amidonului la etanol a fost investigată de o serie de cercetători și are aplicație, de asemenea, în procesele comerciale folosind biocatalizatori „liberi”.

Figura 3. Fermentația fibrelor de porumb hidrolizate acid cu tulpina recombinantă K011 E. coli (A) și SL40 (B). Simboluri: -glucoza, -L-arabinoza, -etanol, o-xiloză și galactoză. Xiloza și galactoza au comigrat în timpul analizei HPLC

Aplicațiile utilizării FBR-ului folosind glucoamilaze coimobilizate de la Saccharomyces cerevisiae și Zymomonas mobilis au arătat că productivitățile volumetrice tipice din intervalul 15-40 g/L-h pot fi atinse. Temperatura maximă la care Z. mobilis poate fermenta eficient într-un proces continuu este de 35˚C, mult sub temperatura optimă a glucoamilazei, de 55˚C. De aici înainte un proces SSF va avea de suferit datorită activității scăzute a enzimei. De fapt, s-a observat că într-un astfel de proces, hidroliza enzimatică a fost componentul limitativ.

Producția de etanol din amidonul uscat și măcinat de porumb a fost întâi studiată într-un proces SSF folosind glucoamiliza coimobilizată din Z. mobilis într-un BFR. Producția de etanol prin hidroliză separată și fermentație (SHF) a fost studiată folosind glucoamilază în reactor cu strat fix și Z. mobilis imobilizată într-un FBR.

Microorganismele folosite

În realizarea fermentării s-a folosit Z. mobilis NRRL-B-14023. Cultura stoc a fost menținută la -70˚C în soluție de glicerol 25%. Pentru imobilizare, celulele au fost crescute într-un fermentor de 75 L (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) la 30˚C și pH = 5 (menținut prin folosire de NaOH 2.5M). Volumul de lucru a fost de 50 L. Cultura (4L) a fost preparată în două recipiente. Mediul de cultură a conținut 50 g/L glucoză, 5 g/L extract de drojdie Tasteone 900 AG și 5 g/L KH2PO4. Acidul fosforic concentrat s-a folosit pentru ajustarea pH-ului mediului la 5. Mediul a fost sterilizat la 121˚C timp de 20 de minute și fiecare cultură a fost inoculată cu 1.5 mL cultură stoc. Cultura a fost incubată într-un agitator la 30˚C și 50 rpm timp de 36 h. După inoculare, celulele au fost crescute în fermentor (mediul a fost identic cu cel al culturii) până când concentrația glucozei a scăzut între 5-10 g/L. Celulele au fost apoi recoltate cu o centrifugă Sharples și depozitate la 4˚C până au fost gata pentru imobilizare.

Enzimele necesare

Pentru lichefierea amidonului și dextrinizare s-a folosit α-amilaza. Glucoamilaza a fost imobilizată pe suport de pământ poros diatomaceu. Particulele de enzimă imobilizată au avut un diametru cuprins între 1 și 1.5 mm. Activitatea specifică a enzimei imobilizate la 55˚C și pH 4.2 este de 881 U/g greutate usctă. O unitate de activitate reprezintă cantitatea de enzimă care va produce un micromol de glucoză într-un minut în condițiile de testare.

Hidroliza amidonului de porumb

S-a folosit amidon de porumb uscat și măcinat. Umiditatea măsurată a fost de 13%. Lichefierea și hidroliza au fost conduse la 95˚C și pH = 6.3-6.5 cu α-amilază 0.2% timp de 1.5 h. Activitatea enzimei din amidon a fost menținută prin adaosul a 150 ppm ioni de calciu sub formă de Ca(OH)2. Hidroliza a fost continuată din loturi de 10 L într-un container de oțel de 20 L. Agitarea s-a realizat la 700-1000 rpm. Hidroliza a fost continuată până la răspunsul negativ al amidonului cu soluție de iod (nu a apărut o colorație violet). Experimentele au fost conduse cu 15% și 28% încarcătură solidă. Pentru un proces de conversie a amidonului uscat și măcinat la etanol, 28% este folosit de obicei. În experimentele preliminarii, s-a observat că încărcătura solidă de 28% nu a putut să circule prin FBR. Astfel a fost necesar folosirea debitului de 15% în FBR. Oricum, solidele au cauzat tamponarea FBR-ului după câteva ore de operații continue. Aceste solide au fost îndepărtate prin centrifugare folosind o centrifugă Sorvall la 4000 rpm timp de 10 minute. Materialele solide umede au fost spălate bine cu 1:1 (w/w) apă și recentrifugate. Lichidul recuperat din această etapă a fost amestecat cu lichidul obținut din primul pas de centrifugare. Amestecul de dextrine a fost folosit ca și substrat pentru experimentele de producere a etanolului. Trebuie menționat că raportul de 1:1 (w/w) apă – solide umede a fost folosit în experimentele de laborator pentru a minimiza diluția de alimentare. Experimentele de extracției au indicat că recuperarea dextrinelor în acest caz a fost de ˜ 57% din dextrinele captive în materialul solid. În operații la scară largă, folosirea unei cantități mai mari de apă îmbunătățește recuperarea dextrinelor. Fluxul diluat de dextrine obținut poate fi reciclat în tancul de lichefiere a amidonului. Această schemă a procesului va minimiza pierderea substratului fermentabil asociat cu îndepărtarea solidelor.

Prepararea stratului de biocataliză

Prepararea stratului a fost inițiată prin dizolvarea a 40 g κ-carrageenan în 600 ml apă deionizată la aproximativ 75˚C. Gelul dizolvat a fost plasat în baie de apă la 35˚C. Pentru a prepara biocatalizatorul coimobilizat, 150 mL glucoamilază a fost introdusă în mortar ceramic și apoi în baie de gheață pentru a reduce dimensiunea particulelor sub 0.1 mm. Primele studii63 nu au arătat nici o pierdere a activității enzimatice de pe suport în timpul procesului de măcinare. Enzima „teren” a fost adaugată pe urmă soluției gelului. La aceasta s-au adăugat 40 g (greutate umedă) pastă de celule de Z. mobilis. Volumul final de soluție a fost adus la 1 L cu apă deionizată. În prepararea straturilor imobilizate de Z. mobilis, glucoamilaza imobilizată a fost exclusă din gel și s-au adăugat 30 g Fe2O3 pentru a crește densitatea straturilor. Formarea staturilor fixe (paturi) s-a făcut cu ajutorul unei pompe peristaltice. Un traducător de vibrații a fost atașat tubului flexibil de livrare. Frecvența vibrațiilor a foat acordată pentru a monodispersa picăturile. Picăturile gelului care conțineau glucoamiloză și Z. mobilis au fost colectate într-un vas cu agitate perfectă ce conținea KCl 0.3 M și au fost lăsate să se „vindece” 24 h la 4˚C. După acest pas, straturile fixe au fost scanate pentru a fi îndepărtate cele de peste 2.8 mm în diametru. Cele care au rămas au fost stocate în KCl 0.3 M la 4˚C până la folosire.

Măsurarea nivelului de proteine din straturile de biocatalizatori

Conținutul de proteine din straturile proaspete și cele folosite s-a măsurat după modelul de mai jos: 10 ml de strat fix au fost amestecați puternic în apă deionizată. Suspensia a fost centrifugată la 4000 rpm timp de 5 minute, iar supernatantul aruncat. 10 mL de HCl 1N s-au adăugat peste granule și s-a amestecat bine. 10 mL de soluție (NaOH 1N și NaCl 0.47% masice) au fost adăugați peste granule și amestecați bine într-o eprubetă, care a fost apoi introdusă într-o baie de apă fierbinte 15 minute pentru a dizolva proteinele. Soluția a fost răcită în apă. Suspensia a fost centrifugată, apoi supernatantul a fost testat pentru uzul proteinelor prin metoda Bio-Rad, care determină natura proteinelor prin metoda Bradford. Albumina s-a utilizat drept standard.

Reactorul cu strat fix și cu pat fluidizat – caracterizare generală

Reactorul cu strat fix conține particulele de enzimă imobilizată introduse într-o coloană prin care soluția de substrat este pompată în mod continuu (Figura 4).

Figura 4. Schema unui reactor cu strat fix

Ca urmare a circulației ascendente în coloană, enzima situată la baza coloanei este expusă unor concentrații mai mari de substrat, în timp ce enzima situată la partea superioară este în contact cu o soluție concentrată în produs. Din aceste motive, reactorul nu este recomandat pentru efectuarea reacțiilor în care apare inhibiția de substrat a enzimei. Problema majoră a reactorului o constituie menținerea constantă a debitelor și a temperaturii.

Productivitatea se calculează cu relația:

– timpul de staționare în reactor, = volumul de lichid/debit

volumul de lichid = volumul total-volumul suportului

F- conversia fracțională, F=(CS0-CS)/CS0

Relația permite calcularea conversiei în funcție de debit pentru un reactor dat sau a dimensiunilor reactorului în care poate fi atinsă o anumită conversie, pentru o enzimă imobilizată dată.

Reactorul cu pat fluidizat (Figura 5) are un comportament intermediar între reactorul cu strat fix și cel continuu cu amestecare. Caracteristica sa este fluidizarea catalizatorului solid, prin alimentarea reactorului cu substratul pe la bază. Sunt utilizate în special în reacții care utilizează sau conduc la formarea unui gaz

Figura 5. Prezentarea schematică a unui reactor cu pat fluidizat

Bioreactorul cu pat fluidizat (Figura 6) folosit a prezentat o coloană de sticlă cu diametrul interior de 5.1 cm și o lungime de 47 cm. Volumul FBR-ului a fost de 9 L. FBR-ul a fost curățat cu etanol 50% și apă fierbinte înainte ca straturile fixe să fie încărcate. Volumul ocupat de straturi a fost de 600 mL. pH-ul din partea superioară a FBR-ului a fost menținut la 5 folosind NaOH 0.5 M. Injectarea cu bază a fost plasată foarte aproape de proba pH pentru a evita abaterile de pH. Temperatura în FBR a fost menținută la 35˚C când s-au folosit biocatalizatori coimobilizați și la 30˚C când s-a folosit doar Z. mobilis coimobilizată.

Z. mobilis a fost lăsată să crească împreună cu straturile fixe 4-5 zile. Când au fost folosite straturi cu glucoză imobilizată-Z. mobilis, aceasta s-a realizat prin pomporea soluției de alimentare ce conține 150 g/L StarDri 100 amidon, 0.05 M KCl și 5 g/L extract de drojdie prin FBR cu un timp de retenție de 2-3 h. pH-ul alimentării a fost ajustat la 5.8 folosind tampon fosfat, apoi totul s-a autoclavat timp de 1h la 121˚C. Când straturile fixe de Z. mobilis au fost utilizate, amidonul solubil din alimentare a fost înlocuit cu 150 g/L dextroză.

Urmărind colonizarea straturilor de către microorganism, soluțiile de alimentare ale maltodextrinei cu 5 g/L extract de drojdie sau amidon de porumb hidrolizat au fost pompate prin FBR pentru a da un timp de retenție cuprins în intervalul 1-4 h. Toate soluțiile de alimentare au conținut KCl 0.05 M pentru stabilizarea straturilor biocatalitice. Liniile de alimentare au fost schimbate când rezervorul gol de alimentare a fost schimbat. Pentru fiecare set de condiții experimentale, cel puțin șase timpi de retenție au fost permiși pentru ca FBR să atingă starea de echilibru înainte ca probele să fie analizate pentru dextrine, glucoză și etanol.

Activitatea straturilor cu biocatalizatori coimobilizați

Studiile precedente cu biocatalizator Z.mobilis-glucoamilază coimobilizată au demonstrat că productivitatea maximă în etanol de 37 g/L-h a fost atinsă. Oricum, productivitatea a scăzut cu timpul chiar și când au fost menținute aceleași condiții experimentale. Un lot repetat experimental a fost condus folosind malodextrină ca și substrat prioritar în FBR. Ciclul fiecărui lot a durat aproximativ 24 h și s-au realizat 22 de cicluri. La intervale periodice de timp s-au luat probe pentru analiza malodextrinei, glucozei și a etanolului. Media lotului a constat în 100 g/L malodextrină, 25% (v/v) soluție apoasă de săruri ca nutrienți și 0.05 M KCl.

Figura 6. Procesul scematic de conversie a amidonului de porumb uscat și măcinat la etanol prin SHF și SSF folosind biocatalizatori imobilizați. În procesul SHF, sunt utilizate un reactor cu strat fix cu glucoamiloză imobilizată și FBR ce conține paturi cu Z. mobilis imobilizată. În procesul SSF, se folosește un FBR ce conține straturi cu glucoamiloză coimobilizată-biocatalizator Z. mobilis.

Experimentul s-a realizat într-un vas Erlenmeyer de 250 mL la 35˚C, 100 rpm și pH 5. Diametrul paturilor a fost de 1-2 mm. Vasul a conținut 20 ml de straturi biocatalizator în 100 mL de mediu. La sfârșitul fiecărui ciclu straturile au fost recuperate și spălate cu apă deionizată înainte de a fi puse în mediu proaspăt pentru următorul ciclu. pH-ul mediului de reacție a scăzut în medie de la 5 la 4.3 în timpul rulării fiecărui lot. Conversia maltodextrinelor și concentrațiile în etanol la sfărșitul fiecărui ciclu au fost în medie de 80-95%, respectiv 37-48 g/L. Randamentele medii în etanol au fost 0.46 g etanol/g maltodextrină (aceasta corespunde unui randament teoretic de 81%).

Încărcătura celulelor straturilor folosite după 22 de cicluri pe lot și a straturilor proaspete a fost determinată prin măsurarea conținutului lor de proteine. Conținutul straturilor proaspete și a celor folosite a fost de 0.352 g/L, respetiv, 0.444 g/L. Această creștere de 26% în conținutul proteic a indicat o creștere semnificativă a lui Z. mobilis în interiorul straturilor biocatalitice. Pentru compararea conversiei maltodextrinei, celulele din straturile folosite și proaspete au fost inactivate prin tratare cu etanol 40%. În aceste condiții, straturile au reținut doar activitatea glucoamilazei. După inactivarea Z. mobilis imobilizate, straturile au fost testate pentru hidroliza maltodextrinei în loturi experimentale la 35˚C și pH 5. Rezultatele experimentului sunt redate în Figura 7. S-au obținut concentrații aproape identice pentru maltodextrină și glucoză cu straturi proaspete și folosite, ceea ce a indicat că dezvoltarea bacterie Z. mobilis în interiorul straturilor nu a restricționat difuzia substratului în straturi. Datele experimentale au arătat că glucoamilaza imobilizată a fost stabilă și ș-a păstrat activitatea 22 de zile la 35˚C.

Straturile biocatalitice au fost, de asemenea, testate într-un lot experimental de un ciclu folosind același mediu descris anterior, dar la pH 4. Obiectivul acestui experiment a fost determinarea fezabilității din punct de vedere al operării cu FBR excluzând controlul pH-ului. Concentrația inițială a maltodextrinei a fost de 91.4 g/L, iar după 23 h, s-a realizat conversia a 80% maltodextrină. Doar 0.8 g/L etanol a fost produs și până la 76.7 g/L glucoză s-a acumulat în mediu. Deși celulele de Z. mobilis au prezentat o activitate foarte redusă, nu au fost ireversibil dezactivate. Aceasta s-a verificat calitativ prin evoluția dioxidului de carbon când straturile au fost spălate și resuspendate în mediu la pH 5. Rezultatele au indicat că va apărea o scădere în producția de etanol folosind FBR cu procese continue când pH de 5 nu este menținut.

Zaharificarea și fermentarea simultană (SSF)

Atât soluțiile de malodextrine sintetice, cât și cele obținute prin hidroliza amidonului de porumb uscat și măcinat s-au folosit în alimentarea FBR-ului. În ultimul caz, amidonul de porumb uscat și măcinat 15% a fost hidrolizat la dextrine prin intermediul α-amilazei. După separarea materialelor solide și spălarea lor, materialele solide libere de alimentare au fost folosite în experimentele cu FBR. Rezultatele pentru maltodextrină și amidon de porumb hidrolizat pentru alimentare sunt sumarizate în Tabelul 3.

Figura 7. Comparație între profilele concentrațiilor de maltodextrină și glucoză de pe straturi fixe proaspete și folosite cu biocatalizatori coimobilizați după 22 cicluri/lot. Simboluri: -straturi proaspete cu maltodextrină, straturi folosite cu maltodextrină, -straturi proaspete cu glucoză, o-straturi folosite cu glucoză.

Pentru maltodextrina sintetică, s-au folosit două concentrații de alimentare: 108.7, respectiv 188.1 g/L. Aceste rate de alimentare reprezintă concentrațiile dextrinelor obținute prin hidroliza a 15%, respectiv 28% amidon de porumb uscat și măcinat. Extractul de drojdie (5 g/L) a fost prevăzut ca sursă de nutrienți. Pentru alimentarea de 108.7 g/L, un singur pas de conversie de 66.6% a fost atins la timpul de retenție de 2.2 h. Pentru alimentarea de 188.1 g/L, singurul pas de conversie de 31.3% a fost obținut la un timp de retenție similar, 1.9 h. Prin mărirea timpului de retenție la 3.7 h, conversia maltodextrinei s-a îmbunătățit, crescând la 53.1%. Productivitățile volumetrice în etanol au fost în medie de 12-15 g/L-h. S-a obținut un randament mediu în etanol de 0.47 g etanol/g amidon, corespunzător la un randament teoretic de 84% (0.56 g etanol/g amidon).

Tabelul 3. Zaharificarea și fermentarea simultană (SSF) a maltodextrinei și a dextrinelor din amidonul uscat și măcinat de porumb la etanol folosind glucoamilază coimobilizată-Z. mobilis într-un FBR.

aGlucoza în efluenții acestei etape a fost de 11.7 g/L ca urmare a eșecului în controlul pH-ului. pH-ul ascăzut la 4.60 înainte de a fi readus la 5.

În alimentarea cu amidon hidrolizat, nu s-au suplimentat tradițional nutrienții. Singurul pas de conversie a avut un randament de 54-89%, iar productivitățile volumetrice în etanol au atins 9.1-15.1 g/L-h. Randamentele medii în etanol au fost identice cu cele obținute în alimentarea cu maltodextrine sintetice.

Experimentele descrise mai sus, cu maltodextrină sintetică și amidon hidrolizat au fost condus continuu timp de 22 de zile. În acest timp, nu s-a înregistrat nici un eșec structural al biocatalizatorului. În toate experimentele efectuate, starea de echilibru a concentrației de glucoză în efluenți a rămas la nivele scăzute (sub 4g/L). Totodata, s-a observat că în efluenți concentrația glucozei a crescut în absența controlului de pH (de exemplu, când pH-ul a scăzut sub 5). Datele privind starea de echilibru din Figura 3 au indicat că hidroliza amidonului solubil la glucoză a fost componentul limitativ. Glucoamilaza folosită a manifestat activitatea cea mai ridicată la temperaturi cuprinse între 55-65˚C. Experimentele au fost conduse la 35˚C pentru a evita inactivarea termică a bacteriei imobilizate Z. mobilis. La această temperatură, activitatea enzimei este doar de 16% din cea maximă. Pentru a atinge conversii mai ridicate a amidonului hidrolizat la etanol, este nevoie de timpi de retenție mai ridicați. Aceasta se poate realiza fie prin creșterea lungimii coloanei sau descreșterea fluxului ratei de alimentare. Oricum, la timpi ridicați de retenție șansele de contaminare în timpul operațiilor continue ale FBR-ului cresc și apare ecranarea alimentării, ceea ce duce la o slabă fluidizare. Se poate folosi, de asemenea, un aranjament în cascadă a FBR-ului. Pe lângă asigurarea timpilor de retenție mai mari, configurația poate fi, de asemenea, de folos în naturalețea dioxidului de carbon. Acesta poate micșora reținerea gazului în FBR, îmbunătățind astfel transferul de masă între substrat în faza lichidă și straturile biocatalizatorului.

Hidroliza și fermentația separată (SHF)

Prin realizarea pașilor secvențiali de hidroliză a dextrinelor și fermentație, este posibil ca ambii pași să se realizeze în condiții optime.

Soluția materialelor libere solide a 150-160 g/L dextrine (obținute prin hidroliza amidonului de porumb uscat și măcinat 28%) la pH 5 a alimentat coloana de glucoamilază imobilizată cu o rată de 0.3 L/h, dând astfel un timp de retenție de 1h. Temperatura coloanei a fost menținută la 55˚C. Conversia amidonului solubil la glucoză a fost mai mare de 95% și a avut un flux de produs de 162-172 g/L glucoză, flux utilizat pentru alimentarea FBR-ului ce conține Z. mobilis imobilizată la 30˚C. pH-ul alimentării FBR-ului a fost ajustat la 5.8 flosind NaOH 50%, iar pentru stabilizarea straturilor s-a folosit KCl 0.05 M. În Tabelul 3 s-au sumarizat concentrațiile de alimentare ale glucozei (din coloana de enzimă imobilizată) și concentrațiile de etanol obținute la diferite rate de diluție. Rezultatele sunt, de asemenea, redate în Figura 8.

La un timp de retenție de 2 h, s-a atins un singur pas de conversie al glucozei de alimentare și o concentrație efluent de etanol de 70.3 g/L la starea de echilibru fără a adăuga alți nutrienți adiționali în alimentare. La timpi de retenție mai mici, de 1.56 h și 1h, conversia glucozei a scăzut la 59.3, respectiv 47.7 %. Limitarea nutrienților poate fi o posibilă cauză pentru această observație. După ce s-a folosit soluția de săruri 15% ca și o sursă adițională de nutrienți, s-au înregistrat îmbunătățiri în conversia glucozei de alimentare de 75 și 75.6% la timpii de retenție de 1.5, respectiv 0.9 h. Aceste rezultate au arătat că efectele de limitare ale nutrienților pot limita conversiile de alimentare la timpi mici de retenție în FBR cu procese continue.

Figura 8. Productivitățile volumetrice în etanol (A) și conversiile în glucoză (B) ca funcții de rată de diluție pentru procesul SHF.

Performanțele straturilor cu celule de Z. mobilis imobilizate în FBR au fost testate, de asemenea, după schimbarea cu glucoza sintetică de alimentare care a constat din 165-172 g/L și 5 g/L extract de drojdie ca și sursă de nutrienți. Performanțele procesului la diferiți timpi de retenție în FBR sunt prezentate în Tabelul 4.

Conversiei glucozei într-un singur pas a variat de la 89.2% la un timp de retenție de 2 h la 70.8% cu un timp de retenție de 0.9 h. Rezultatele s-au comparat cu cele obținute la alimentarea suplimentată cu dextrine hidrolizate cu 15% soluție apoasă. Cea mai ridicată productivitate volumetrică în etanol atinsă a fost de 68.8 g/L-h la un timp de retenție de 1h cu o conversie de alimentare cu glucoză sintetică de 82.2%.

Tabelul 4. Fermentația glucozei sintetice la etanol folosind FBR cu celule imobilizate de Z. mobilis

În aceste experimente s-a ajuns la un randament mediu de 0.43 g etanol/g glucoză. Pentru a controla pH-ul în FBR, s-a folosit o soluție diluată de NaOH 0.5 M (s-au evitat variațiile de pH). Folosirea acestei soluții diluate a cauzat niște efecte de diluare a efluentului din cauza injectării periodice de bază. Pe baza consumului zilnic de hidroxid, s-a estimat că efluentul a fost diluat între 5-10%. Aceasta ar putea fi cauza pentru aparentele randamente scăzute în etanol deoarece acidului lactic (<5 g/L) a fost singurul produs diferit detectat în probele efluent. În unele din aceste experimente au fost obținute randamente în etanol, în medie de 0.47-0.49 g etanol/g glucoză (corespunzătoare la 92-97% randament teoretic). FBR cu Z. mobilis imobilizată a funcționat continuu alimentat utilizînd glucoză sintetică și dextrine hidrolizate timp de peste 27 de zile fără afectarea structurii stratului de biocatalizator.

Productivitățile volumetrice totale în etanol pentru proces au fost calculate luând în considerare timpul de retenție al alimentării în coloana cu glucoamilază imobilizată a FBR-ului. Productivitățile totale și concentrațiile în etanol ca funcții ale timpului total de retenție pentru alimentarea cu amidon hidrolizat sunt redate în Figura 9.

La un timp total de retenție de 9 h, s-a atins o stare de echilibru a concentrației de etanol de 70.3 g/L la o conversie de alimentare de 94.2%, ceea ce s-a concretizat într-o productivitate totală de 23.4 g etanol/L-h. Aceasta este o îmbunătățire substanțială, peste productivitatea volumetrică totală obținută în procese tipice industriale ce includ loturi (2-3 g/L-h). Rezultatele au arătat, de asemenea, productivități mai mari și concentrații în etanol în SHF cu operații continue în comparație cu procesele continue SSF din FBR.

Figura 9. Productivitățile volumetrice totale în etanol și concentrațiile de etanol obținute prin alimentare cu amidon de porumb hidrolizat prin procese de hidroliză și fermentație separată (SHF) folosind glucoamilază imobilizată și Z. mobilis. Rezultatele sunt redate ca funcție de timpul total de retenție.

Atât procesele SSF cât și SHF a amidonului de porumb uscat și măcinat la etanol au fost conduse folosind glucoamilază imobilizată și Z. mobilis. În procesele continue SSF, care au utilizat biocatalizatori coimobilizați, hidroliza dextrinelor la glucoză a reprezentat componentul limitativ, în primul rând datorită activității scăzute a glucoamilazei la 35˚C. În procesele SHF, a fost posibilă realizarea ambilor pași la temperaturile lor optime de 55˚C, respectiv 30˚C. Îmbunătățiri semnificative în productivitățile volumetrice în etanol au fost obținute în comparație cu procesele tradiționale care includeau loturi.

3.1.3. Influența zaharazelor intracelulare și extracelulare ale bacteriei Z. mobilis asupra producției de etanol și a formării bioprodușilor

Formarea bioprodușilor, de exemplu levan și sorbitol scade randamentul în etanol din zaharoză. Din acest motiv a fost studiat metabolismul zaharozei în Z. mobilis pentru a îmbunătăți producția de etanol. Studiile efectuate au scos la iveală prezența a trei zaharaze diferite: zaharaze intracelulare (SacA), levanzaharaze extracelulare (SacB) și zaharaze extracelulare (SacC). Genele care codifică cele trei tipuri de zaharaze au fost clonate, secevnțate și s-a realizat caracterizarea enzimelor. Funcția SacA încă nu este bine cunoscută, în timp ce SacC este responsabilă de hidroliza zaharozei, iar SacB este implicată în sinteza levanilor, în plus, față de hidroliza zaharozei. Analiza secvenței de aminoacizi relevă strânsa homologie între SacB și SacC, dar cele două nu prezintă similaritate cu SacA. Genele care le corespund, sacB și sacC sunt aranjate într-un cluster, iar sacA este plasată la distanță.

Pentru acest studiu s-a folosit Z. mobilis LS1A, un mutant spontan al sacA derivat din Z. mobilis LS1 sacB- și tulpina lui parentală Z. mobilis B-806; cultura s-a dezvoltat pe RM (glucoză 20 g/L, extract de drojdii 10 g/L și KH2PO4 2 g/L) la pH 6, 30˚C și agitare continuă. Pentru experimentele fermentative, glucoza din mediu a fost înlocuită cu 100g zaharoză/L.

Semințele de culturi au fost crescute în mediul de fermentație 18 h la 30˚C, iar 15 mL din această cultură au fost centrifugați (3000 g timp de 10 minute la 4˚C), celulele au fost colectate și folosite apoi ca inocul. Experimentele fermentative au fost realizate cu 100 ml mediu de fermentație într-un vas Erlenmeyer de 250 mL la 30˚C în condiții statice.

Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 3000 g timp de 15 minute la 4˚C. Cultura filtrată a fost folosită drept sursă enzimatică. Proteinele din cultura filtrată au fost separate. Celula granulă a fost spălată și suspendată în soluție tampon acetat 50 mM (pH 5) ce conține 1 mM fluorură de fenil metil sulfonil (PMSF). Celulele au fost dezintegrate

ultrasonic și supernatantul s-a folosit ca sursă de enzimă. Activitatea zaharazei a fost testată prin determinarea conținutului de zaharuri reducătoare eliberate la hidroliza zaharozei.

Biomasa s-a determinat turbidimetric și a fost convertită la greutate uscată din curba standard.

Sinteza și nivelul zaharazelor în diferite tulpini de Z. mobilis pare a fi dependentă de tulpină. Puține tulpini au eșuat în creșterea pe zaharoză, probabil din cauza absenței zaharazelor extracelulare. Una din tulpini, Z. mobilis Ag11 nu a produs levan din cauză că nu sintetizează levanzaharaze, în timp ce tulpinii Z. mobilis UQM 2716 i-a lipsit extracelular invertaza. Majoritatea tulpinilor au sintetizat toate cele trei zaharaze.

Izolarea mutantului sacA

O levanzaharază mutantă foarte stabilă (LS1) a fost izolată din tulpina B-806 de Z. mobilis după mutageneza NTG (50 μg/mL pentru 45 minute la 30˚C). A fost repetat crescută în mediu cu glucoză și plasată pe medii cu agar RM. Extractul celular al coloniilor selectate întâmplător a fost supus zimogramei pentru detectarea zaharazei (Figura 10). Una din cele izolate nu a produs banda de zaharază corespunzătoare SacA și a fost simbolizată drept LS1A. Pentru confirmarea stabilității mutației sacA-, tulpina LS1A a fost subcultivată ( 5 timpi a câte 18 h de creștere) pe mediu cu zaharoză, și apoi transferată pe medii cu agar. Coloniile selectate întâmplător (25 de colonii pentru fiecare subcultură) au fost crescute în medii cu zaharoză, iar fracțiile celulare au fost analizate prin metoda PAGE-nativă și zimograma tulpinilor. Niciuna din culturi nu a revenit la mutația sacA-. Cum această tulpină a derivat din tulpina LS1, fracția celulară nu a exponat banda de zaharază corespunzătoare levanzaharazei SacB. Astfel, ambii mutanți LS1 și LS1A au fost fenotipic neproducători de levani.

Creșterea și sinteza zaharazei de către tulpini

Tulpinile de Z. mobilis B-806, LS1 și LS1A au fost crescute separat pe medii nutritive cu zaharoză (100 g/L), determinându-se creșterea și sinteza zaharazei. A fost produsă o biomasă maximă de 1.64-1.68 g/L de către toate tulpinile după 16 h, fără mari diferențe între tulpini. Absența SacA sau SacB, sau a ambelor nu a influențat creșterea. Zaharaza SacC produsă de tulpini a fost suficientă pentru hidroliza zaharozei încât să susțină creșterea. Cantitatea maximă produsă de activitatea zaharazei (SacC) de tulpina LS1A (2.07 U/mL) a fost considerată mai mică decât activitatea zaharazei (SacA, SacB și SacC) tulpinii B-806 (3.01 U/mL) (Figura 11).

Figura 10. Comparație între hidroliza zaharozei enzimelor tulpinilor de Z. mobilis. Proteinele din extractele celulare ale tulpinilor de Z. mobilis B-806 (banda 1), LSI (banda 2) și LSIA (banda 3) au fost separate prin PAGE-nativă și analizate prin intermediul zimogramei pentru activitatea zahazazei.

Oricum, activitatea zaharazei tulpinii LS1A nu a fost semnificativ diferită de cea a tulpinii LS1 (2.1 U/mL). Activitatea zaharazei intracelulare a tulpinii LS1A (0.45 U/mL) a fost mai redusă decât cea a tulpinii B-806, dar aproape egală cu a tulpinii LS1 (0.50 U/mL). Astfel, SacA nu contribuie la hidroliza zaharozei sau la creșterea tulpinilor. Mai mult, în absența unei treimi din activitatea totală a zaharazei (la fel când SacB) este absentă toate tulpinile au crescut similar (Tabelul 5) și de aceea SacB nu este importantă pentru hidroliza zaharozei și fermentație.

Efectul zaharazelor asupra producției etanolului și sorbitolului

Cinetica fermentării zaharozei de către tulpini este comparată în Tabelul 5. Deși biomasa produsă de tulpini nu este semnificativ diferită, producția etanolului de către mutanții LS1 sau LS1A (44.2 g/L) a fost mult mai mare decât a tulpinii parentale B-806 (37.5 g/L). Parametrii cinetici, de exemplu, rata de creștere, asimilarea de zaharuri, productivitatea de etanol la fel ca și parametrii randamentului (randamentul în celule și randamentul în etanol) al mutanților LS1 și LS1A au fost similari. Nu a fost nici o diferență în producțiile de etanol ale celor două tulpini, sugerând astfel că SacA nu are nici un efect în fermentația etanolică. Îmbunătățirea producerii de etanol de către mutanți comparativ cu tulpina parentală poate fi corespunzătoare pierderii producției de levan și descreșterii producției de sorbitol.

Figura 11. Activitatea zaharazei cu Z. mobilis B-806, LS1 și LS1A în timpul fermentării zaharozei. Activitatea zaharazei tulpinii B-806 (, ), LS1 () și LS1A (,0). Simbolurile apropiate reprezintă activitatea zaharazei intracelulare, iar simbolurile deschise reprezintă activitatea zaharazei extracelulare.

SacbB în tulpina B-806 a favorizat producția levanilor. Producția levanilor și sinteza sorbitolului sunt antagonsite între ele. Sinteza levanilor este dependentă de monozaharidele libere, în special, fructoză formată după hidroliza zaharozei. Când rata de hidroliză a zaharozei este mai mare decât rata de consum a zaharurilor, monozaharidele se acumulează în mediu. Pe măsură ce rata de asimilare a glucozei este mai mare decât a fructozei, fructoza se acumulează în cantități mai mari și va fi redusă mai repede la sorbitol decât glucoza care se oxidează. Oricum, ratele de hidroliză a zaharozei tulpinilor LS1 și LS1A au fost mai mici decât a tulpinii parentale B-806, care pot face obiectul descreșterii cantității de sorbitol produse de ele. Din aceste rezultate, se înțelege că zaharaza SacC este suficientă pentru hidroliza completă a zaharozei în fermentații fără producere de bioproduși, iar zaharaza SacA nu e importantă pentru hidroliză. De aceea, mutanții zaharazei se pare că sunt cei mai buni candidați pentru producerea etanolului din zaharoză.

Tabelul 5. Compararea caracteristicilor de fermentare ale Z. mobilis B-806 și ale tulpinilor mutante LS1 și LS1A după dezvoltarea pe zaharoză la 100 g/L timp de 18 h

3.1.4. Performanțele plasmidului imobilizat Zymomonas mobilis 31821 (pZB5) pe hidrolizați produși prin tehnologia Arkenol

Prin aplicarea proceselor Arkenol care utilizează acid sulfuric foarte concentrat, diverse biomase de sinteză, ce includ cedrii, paie de orez, ziare, au fost procesate cu succesc și convertite la glucoză și xiloză în scop fermentativ într-un reactor de fermentație cu Z. mobilis 31821 (pZB5). Mediul de imobilizare a constat într-o rășina legată fotochimic realizată din polietilen glicol sau polipropilen glicol. Z. mobilis recombinant folosit în acest experiment a fermentat eficient glucoza și xiloza la o concentrație relativ ridicată (12-15%), tipic pentru materiile prime celulozice hidrolizate.

În programul R&D inițiat de National Renewable Energy Laboratory (NREL) din Yokohama, Japonia resturile de lemn din cladiri (cedrul japonez, de exemplu), paiele de orez, și hârtia ( ziare vechi nefolosite), cea mai simplă materie primă disponibilă din Japonia, au fost preluate ca materiale lignocelulozice pentru producția de etanol combustibil.

Ca și pretratament pentru biomasa materialelor, s-a folosit hidroliza cu acid sulfuric foarte concentrat, metodă dezvoltată de Arkenol, descrisă în Figura 12.

Figura 12. Conversia celulozei/hemicelulozei la un amestec de zaharuri folosind hidroliza acidă.

Folosind Z. mobilis de la NREL, a fost selectată o colonie printr-o metodă convențională de aplicare a mediului cu agar. Colonia a fost introdusă în mediul lichid ce a constat din 29 g/L glucoză, 10 g/L extract de drojdie, 2 g/L KH2PO4, 20 g/L tetraciclină și cultivată într-un incubator de 5 L la 30˚C timp de 48 h. După aceea, lichidul a fost concentrat printr-un separator centrifugal și diluat de 20 părți la 1 cu apă purificată pentru a forma o suspensie celulară (imobilizarea microorganismului).

În selectarea unui substrat de imobilizare, este nevoie ca substratul să prezinte caracteristici satisfăcătoare de dispersie a apei în soluția microorganismului și să aibă suficientă tărie mecanică să asigure uz practic pentru o periodă mai lungă de timp. După ce au fost studiate diverse substraturi de imobilizare la drojdii și bacterii s-a convenit că cel mai potrivit substrat pentru acest sistem de reacție ar fi tipul polietilenglicolic al rășina reticulata fotochimic. Z. mobilis imobilizată a fost preparată după cum urmează: 10 părți rășină (ENT-3800), 0.03 părți inițiator dde fotopolimerizare, 4 parți alginat de sodiu, 2 părți soluție Zymomonas.

În programul R&D, aproximativ 2000mL straturi de aproximativ 2.5 mm în diametru au fost preparate folosind aparate de iradiere luminoasă. În Figura 13 este redat fluxul proceselor din fermentatoarele continue luminoase.

Figura 13. Fluxul stratului în procesul continuu de fermentație asistată de lumină

Fermentorul principal a avut o capacitate de 5 L și a fost creat pentru a permite loturi continue și fermentații asistate luminos continue.

Soluția zaharificată ca principală sursă de alimentare, precum și o cantitate mică de extract de drojdii și KH2PO4 ca surse auxiliare, au alimentat continuu fermentatorul încărcat cu Z. mobilis imobilizată, apă caldă și soluție de NaOH menținute la 30˚C și pH 4.5-5.5.

În cazul acestui tip de fermentație, partea lichidă este extrasă din fermentator, încălzită la 50˚C, apoi introdusă într-un rezervor iluminat, care este menținut la aproximativ 13.300 Pa, unde lichidul este vaporizat, vapori ce conțin etanol, și rămăne bulion de carne. Vaporii ce conțin o cantitate ridicată de etanol sunt răciți și recuperați ca etanol condensat, iar supa de carne lichidă e returnată fermentatorului, unde e asigurată fermentația asistată luminos.

Când microorganisme imobilizate sunt supuse unui sistem de fermentare, este nevoie de preculturi de 100 h.

În Figura 14 este prezentată o serie de microfotografii a celulelor imobilizate de Z. mobilis din interiorul straturilor în care sunt cultivate.

Figura 14. Imagini fotomicroscopice ale celulelor de Z. mobilis imobilizate în straturi

Microfotografiile relevă clar că nu se observă virtual celule la suprafața paturilor imediat după imobilizare (micrografia din stânga). Oricum, colonii de Z. mobilis s-au format la suprafață după 3 zile de la cultivare (micrografia din mijloc), iar din micrografiile realizate în secțiune transversală s-a observat că grosimea coloniilor este de aproximativ 200 μm.

Prin contrast suprafețele sunt complet acoperite cu colonii după 1000 h de cultivare (micrografia din dreapta). În acest caz, imaginea realizată în secțiune transversală asugerează: colonia adâncită de la suprafață este de doar 200 μm; astfel, doar suprafețele straturilor sunt eficace pentru Z. mobilis recombinat, în contrast cu drojdiile imobilizate.

Figura 15. Comparație între drojdia imobilizată și Z. mobilis folosind hidrolizați acizi din cedrul japozez. Inițial GLU 41.2g/L, XYL 12.2 g/L, pH 4.5-5.5, 30˚C.

Figura 15 ilustrează diferențele rezultatelor de fermentație dintre Z. mobilis imobilizată și drojdia imobilizată, (41.2 g/L glucoză și 11.2 g/L xiloză) obținute din hidroliza acidă a cedrului japonez folosind un fermentor de 300 mL cu agitare și iradiere luminoasă. S-a observat că fermentabilitatea zaharurilor C6 este la fel atât la drojdie, cât și Z. mobilis. Oricum, zaharurile C5 sunt fermentate de Z. mobilis recombinant, diferit față de drojdie.

Figura 16. Rezultatele fermentației cu Z. mobilis imobilizată 31821 (pZB5) folosind un hidrolizat acizi din paie de orez pe mediu sintetic. Pentru comparație se folosește glucoza de fermentație. Timpul mediu de staționare: 7-8 h, pH 4.5-5.5, 30˚C

În Figura 16 sunt redate rezultatele obținute folosind un amestec de produși de hidroliză din paiele de orez și un mediu sintetic (14.5% glucoză și 4.60% xiloză, în total) într-un fermentator de 5 L cu un timp mediu de fermentație de 7-8 h la 30˚C. Linia notată cu asterix în Figura 16 prezintă rata de asimilare a glucozei într-o stare suspendată a Z. moblis recombinant. Rata de fermentație a Z. mobilis recombinant imobilizat în stadiul inițial este de câteva ori mai rapidă decât cea din stadiul suspendat. După cum se vede din grafic, este nevoie de 10 h de fermentație a glucozei ca timp mediu, 20 h pentru xiloză, în procesul continuu de fermentație. Astfel, se confirmă fermentabilitatea inferioară a C5 față de C6. În fermentator, după fermentații continue repetate, concentrația etanolului a condensatului luminos este în exces de 300 g/L, iar cea din fermentator este redusă de la 65 la 50 g/L.

După cum se poate observa în Figura 15, în fermentația hidrolizatelor folosind drojdii convenționale, zaharurile C5 precum xiloza nu au fost fermentate. Z. mobilis recombinat furnizat de către NREL permite hidroliza acestor zaharuri. Astfel, se furnizează un randament mai bun în etanol la utilizarea unei materii prime ca lemnul, paiele de orez, permițând o viteză mai ridicată de extracție a zaharurilor C5.

4. Concluzii

deși prezintă un metabolism fermentativ, Z. mobilis se poate dezvolta și aerob (facultativ anaerobă);

în mod obișnuit metabolizează doar glucoză, fructoză și zahazoză; prin manipulare genetică s-a mărit spectrul substratelor metabolizate (D-xiloză, D-manoză, L-arabinoză, lactoză, rafinoză, melobioză, galactoză);

transformă peste 95% din glucoza utilizată într-un amestec echimolar de etanol și dioxid de carbon și doar un procent mic (<3%) este încorporat în masa celulară;

spre deosebire de Saccharomyces cerevisiae, micoorganismul folosit în mod tradițional în fermentația alcoolică, Z. mobilis prezintă o rezistență mai mare la inactivarea cu etanol;

biocombustibilul obținut cu ajutorul acestei bacterii poate duce la micșorarea emisiilor de dioxid de carbon, principalul gaz cu efect de seră.

Bibliografie

Lindner, P., Garrungsstudine uber Pulque in Mexico, Bericht des Westpreussichen Botanisch – Zoologischen Vereins, 50, 1982, 253 – 255.

Falco de Morais, J. O.; Rios, E. M. M. M.; Calzanas, G. M. T. Z., and Lopez, C. E., Zymomonas mobilis research in the Pernambuco Federal University J. Biotechnol. 31, 1993, 75 – 91.

Swings, J., and De Ley, J., The biology of Zymomonas. Bacteriol. Rew. 41, 1977, 1 – 46.

Goncavales de Lima, De Aranjo, O. J. M.; Schumacher, J. E., and Cavalcanti Da Silva, E., Estudos de microorganismos antagonistas presentes nas bebidas fermentadas usades pelo povo do Recife. I.: Sobre una variedade de Zymomonas mobilis Rev. Inst. Antobiot. Univ. Recife 10, 1970, 3 – 15.

Ruiz – Argueso, T., and Rodriguez – Navaro, A., Microbiology of ripening honey. Appl. Microbiol. 30, 1975, 893 – 896.

Lloyd, F. J., Reports on the result of investigations into cider – making – HMSO for the Board of Agriculture and Fisheries, London, 107, 1903.

Barker, B. T. P., and Hillier, V. F., Cider sickness J. Agric. Sci. 5, 1912, 67 – 85.

Millis, N. F., Some Bacterial fermentations of cider. University of Bristol, Bristol, U. K., 1951.

Dworkin, M., The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria, 3 rd edition, vol. 5: Protobacteria, Alpha and Beta Subclasses, 2006.

Garrity, G. M.; Brenner, D. J.; Krieg, N. R.; Staley, J. T., Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd edition, Springer, New York, 2005.

Montecourt, B. S., Zymomonas, a unique genes of bacteria. In A. L Demain and N. A. Solomon (Eds.), Biology of Industrial Micoorganisms Biotechnol. Series 6, 1985, 261- 289.

Gibbs, M., and De Moss, R. D., Anaerobic dissimilation of C14 – labelled glucose and fructose by Pseudomonas lindneri, J. Biol. Chem. 207, 1954, 689-694.

Arfman, N.; Worell, V., and Ingram, L., Use of the tac promotor and lacIq for the controlled expressions of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis. J. Bacteriol. 174, 1992, 7370-7378.

Fein, J. E.; Charley, R. C.; Hopkins, K. A.; Lavers, B., and Lawford, H. G., Development of a simple defined medium for continuos ethanol production by Zymomonas mobilis Biotech. Lett., 5, 1983, 1-6.

Bringer – Meyer, S. M., Scollar, M., and Sahm, H., Z. mobilis mutant blocked in fructose utilization. Appl. Microbiol. Biotech. 23, 1986, 134-139.

Dien, B. S.; Cotta, M. A., and Jeffries , T. W., Appl. Microbiol. Biotechnol. 63, 2003, 258-266.

Picataggio, S. K.; Zhang, M., and Finkelstein, M., in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuel Production, ACS Symp. Ser. 566, 1994, 342-362.

Stotnicki, M. L.; Warr, R. G.; Goodman, A. E.; Lee, K. J.; Rogers, P. L., High-productivity alcohol fermentation using Zymomonas mobilis, Biochem. Soc. Symp. 19, 1982, 53-86.

Buchholz, S.; O’Mullan, P., and Eveleigh, D. E., Growth of Zymomonas mobilis CP4 on mannitol. Appl. Microbiol. Biotechnol. 29, 1988, 275-281.

Feldmann, S. D.; Sahm, H., and Sprenger, G. A., Pentose metabolism in Zymomonas mobilis wild-type and recombinant strains. Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 1992, 354-361.

Weisser, P., and Kramer, R., Expression of the Escherichia coli pmi gene encoding phospomannose-isomerase in Zymomonas mobilis leads to utilization of mannose as a novel growth substrate which can be used as a selective marker. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1996, 4155-4161.

Deanda, K.; Eddy, C., and Picataggio, S., Development of arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathwaz engeneering. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1996, 4465-4470.

Sprenger, G. A., Approaches to broaden the substrate and product range of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis by genetic engineering. J. Biotechnol. 27, 1993, 225-237.

Yanase, H.; Tamaki, T.,and Tonomura, K., Expression of the Escherichia coli α-galactosidase and lactose permease genes in Zymomonas mobilis and its raffinose fermentation. J. Ferment Bioeng. 70, 1990, 1-6.

Parker, C., and Conway, Z., Kinetics of sugar transport and phosphorilation influence glucose and fructose cometabolism by Zymomonas mobilis. Appl. Environ. Microbiol. 63, 1997, 3159-3525.

DiMarco, A., and Romano, H., D-glucose transport system of Zymomonas mobilis. Appl. Environ. Microbiol. 49, 1985, 151-157.

Schoberth, S., AND Chapman, B.E., Ethanol transport in Zymomonas mobilis measured by using in vivo nuclear magnetic resonance spin transfer. J. Bacteriol. 178, 1996, 1756-1761.

An, H., Scopes, R. K., and Ingram, L. O., Gel electrophoretic analysis of Zymomonas mobilis glycolytic and fermentative enzymes: identification of alcohol dehrydrogenase II as a stress protein. J. Bacteriol. 174, 1991, 7370-7378.

Snoep, J. L.; Arfman, N.; Yomano, L. P., and Conway, T., Control of the glycolytic flux in Zymomonas mobilis by glucose 6-phosphate dehydrogenase activity. Biotech. Bioeng. 51, 1996, 190-197.

Steiner, P.; Bailey, J. E., and Sauer U., Cloning and expression of the Zymomonas mobilis pyruvate kinase gene in Escherichia coli. Gene 220, 1998, 31-38.

Barnell, W. O.; Hesman, T. L., and Conway, T., The Zymomonas mobilis gfl, zwf, edd and glk genes from an operon: Localization of the promotor and identification of a conserved sequence in the regulatory region. J. Bacteriol. 89, 1992, 2816-2823.

Scopes, R. K., Allosteric control of Zymomonas mobilis glucose-6-phosphat dehrydogenase by phosphoenolpyruvat. Biochem. J. 326, 1997, 731-735.

Meija, J. P.; Burnett, M. E., and Keshav, K. F., Coordination of the expression of Zymomonas mobilis glycolytic and fermentative enzymes: a simple hypothesis based on mRNA stability. J. Bacteriol. 174, 1992, 6438-6443.

Strohhacker, J. A., and Witting, R. M., 31P nuclear magnetic resonance studies of ethanol inhibition in Z. mobilis. Arch. Microbiol. 159, 1993, 489-490.

Candy, J. M., and Duggleby, R. G., Structure and properties of pyruvate decarboxylase and site-directed mutagenesis of the Zymomonas mobilis enzyme. Biochim. Biophys. Acta 1385, 1998, 323-338.

Lowe, S., and Zeikus, J. G., Purification and characterization of pyruvate decarboxylase from Sarcina ventriculi. J. Gen. Microbiol. 138, 1992, 803-807.

Konig, S., Subunit structure, function and organisation of pyruvate decarboxylases from various organisms. Biochim. Biophys. Acta 1385, 1998, 271-286.

Dobritzsch, D.; Konig, S., and Lu, G., High resolution crystal structure of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis. J. Biol. Chem. 273, 1998, 20196-20204.

Chang, A. K.; Nixon, P. F., and Duggleby, R. G., Aspartate-27 and glutamate-473 are involved in catalysis by Zymomonas mobilis pyruvate decarboxylase. Biochem. J. 339, 1999, 255-260.

Bruhn, H., and Kula, M. R., The replacement of Trp392 by alanine influences the decarboxylase/carboligase activity and stability of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis Eur. J. Biochem. 234, 1995, 650-655.

Neale, A. D.;Scopes, R. K.; Wettenhall, R. E. H., and Hoogenraad, N.J., The two alcohol dehydrogenases of Zymomonas mobilis Eur. J. Biochem, 154, 1986, 119-124.

Tamarit, J.; Cabiscol, E.; Aguilar, J., and Ros, J., Differential inactivation of alcohol dehydrogenase isoenzymes in Zymomonas mobilis by oxygen. J. Bacteriol. 179, 1997, 1102-1104.

Reid, F. M., and Fewson, C. A., Molecular characterization of microbial alcohol dehydrogenases. Crit. Rev. Microbiol. 20, 1994, 13-56.

Rogers, P. L.; Lee, K. J.; Stotnicki, M. L., and Tribe, D. E., Ethanol prodcution by Zymomonas mobilis. Adv. Biochem. Eng. 23, 1982, 27-84.

Weuster – Botz, D.; Aivasides, A., and Wandrey, C., Continuous ethanol production by Zymomonas mobilis in a fluidized bed reactor. Part II: process development for the fermentation of hydrolised β – starch without sterilization. Appl. Microbiol. Biotechnol. 39, 1993, 685-690.

Krishna, S. H.; Prasanti, K., and Ayyanna, C., Simultaneous saccharification and fermentation of pretreated sugar cane leaves to ethanol. Process Biochem. 33, 1998, 825-830.

Lee, G. M.; Kobayashi, F.; Ohnaga, F., Sawada, T., Biotechnol. Bioeng. 53, 1997, 21-25.

Sun, M.; Bienkowski, Y.; Davison, P. R., and Webb, O. F., Appl. Biochem. Biotech. 63–67, 1997, 483– 493.

Grohmann, K., and Bothast, R. J., Process Biochem. 32, 1997, 405-415.

Leather, T. D., and Gupta, S. C., Appl. Biochem. Biotechnol. 59, 1996, 334-347.

Grohmann, K., and Bothast, R. J., Process Biocehem. 32, 1997, 405-415.

Moniruzzaman, M.; Dale, B. E., and Bothast, R. J., Appl. Biochem. Biotechnol. 67, 1998, 113-126.

Freer, S. N., J. Biol. Chem. 268, 1993, 9337-9342.

Saha, B. C.; Freer, S. N., and Bothast, R. J., Appl. Environ. Microbiol. 60, 1996, 155-158.

McMillan, J. D., and Boynton, B. L., Appl. Biochem. Biotechnol. 45-46, 1994, 569-584.

Ohta, K.; Beall, D. S.; Meija, J.P., and Ingram, L. O., Appl. Environ. Microbiol. 57, 1996, 2810-2815.

Beall, D. S., Ohta, K., and Ingram, L. O., Biotechnol. Bioeng. 38, 1991, 296-303.

Asghari, A., J. Ind. Microbiol. 16, 1996, 42-47.

Dien, B. S., Hespell, R. B., Ingram, L. O.,and Bothast, R. J., World J. Microbiol. Biotechnol. in press. 1998.

Maiorella, B. L.; Blanch, H. W., and Wilke, C. R., Biotechnol. Bioeng. 26, 1984, 1003-1025.

Davison, B. H., and Scott, C. D., Appl. Biochem. Biotech. 18, 1988, 19-34.

Sun, M. Y.; Nghiem, N. P.; Davison, B. H.; Webb, O. F., and Bienkowski, P. R., Appl. Biochem. Biotech., 70-72, 1998, 429–439.

Scott, C. D.; Woodward, C. A., and Thomson, J. E., Enzyme Microb. Technol. 11, 1988, 258-263.

Lantero, O.J., and Sarber, S. M., U.S. Patent, 5, 1995, 472, 861.

Viikari, L., and Gisler, R., Appl. Microbiol. Biotechnol. 23, 1986, 240-244.

Gunasekaran, P.; Mukundan, G.; Kannan, R., and Baratti, J., Biotechnol. Lett. 17, 1995, 635-642.

Kannan, T. R., Mujundan, G., and Gunasekaran, P., J. Ferm. Bioeng., 75, 1993, 265-270.

Yamada, T., J. Synthetic Organic Chem., 1983, 1098.