Analiza Urmelor de Colchicină și Separarea Izomerilor Săi Optici Prin Tehnici de Separare Electroforetice

Introducere

Multiplele utilizări ale colchicinei în medicină și genetică, în tratamentul și prevenirea crizelor acute de gută, în studiul cariotipului uman, animal sau vegetal, constituie o justificare pentru interesul pe plan mondial față de această moleculă. Cu toate acestea, metodele de analiză cantitativă moderne descrise în literatură sunt relativ puține și multe dintre ele nu prezintă garanția aplicabilității practice, în lipsa unor protocoale de validare analitice corect conduse. De asemenea, este nevoie de metode analitice de separare a izomerilor optici ai colchicinei, cunoscându-se faptul că (+)-colchicina prezintă o acțiune farmacologică atenuată, datorită unei interacțiuni mai slabe cu beta-tubulina. Aproximativ jumătate din medicamentele utilizate astăzi sunt chirale și doar 25% sunt administrate sub forma enantiomerilor puri. Cu toate acestea, se cunoaște faptul că, în cele mai multe cazuri, activitatea farmacologică se limitează la unul dintre enantiomeri (eutomer), întrucât celălalt enantiomer (distomer) poate să nu aibă nici un efect, să prezinte reacții adverse sau chiar poate să fie toxic.[1]

Analiza substanțelor medicamentoase presupune alegerea și utilizarea unor tehnici analitice prin care substanțele studiate sunt separate, identificate și/sau dozate din amestecuri complexe sau probe biologice, în concentrații cât mai scăzute. În alegerea metodei de analiză se ține seama de o serie de factori obiectivi, cei mai importanți fiind natura probei, limitele de detecție și respectiv de cuantificare, timpul de analiză și nu în ultimul rând, costul analizei.

În lucrarea de față s-a dorit separarea și determinarea cantitativă a colchicinei din alimente de origine animală și lichide biologice. Colchicina a fost inclusă în anexa IV a Consiliului European EEC Nr. 2377/90 alături de alte substanțe cum ar fi cloramfenicol, nitrofurani și nitroimidazoli. Substanțele incluse în această anexă trebie să lipsească din furajele folosite în fermele animale pentru că acumularea lor în produsele alimentare de origine animală reprezintă un pericol pentru consumatori, indiferent de concentrație. Datorită legislației stricte a Uniunii Europene monitorizarea urmelor acestor substanțe a devenit o necesitate. În cazul colchicinei însă există și o cale naturală de a pătrunde în lanțul trofic în cazul în care brândușa de toamnă (Colchicum autumnale) este consumată de animalele ținute pe pășune [2].

De asemenea, în continuare s-a încercat și separarea izomerilor optici ai colchicinei.

Din aceste motive, s-a ales o tehnică de separare foarte eficientă, și cum ar fi electroforeza capilară (EC), deoarece prezintă o serie de avantaje:

dezvoltarea și optimizarea metodelor de analiză este foarte simplă,

permite separarea unei mari varietăți de analiți, de la ioni metalici și molecule neutre până la macromolecule de interes biologic,

eficiență mare (N > 105 – 106),

timp de analiză scurt,

selectivitate excelentă,

operează atât în mediu apos cât și în mediu neapos,

necesită volume mici de reactivi și de probă (1 – 50 nL),

este o tehnică complet automatizată, etc.

De la introducerea instrumentelor de electroforeză capilară comerciale, acum două decenii, aplicațiile EC s-au înmulțit vertiginos. Astăzi, EC este o tehnică analitică versatilă, folosită cu succes pentru separarea ionilor mici, moleculelor neutre și biomoleculelor mari dar și pentru studiul parametrilor fizicochimici a diferitelor molecule.

În afară de un număr tot mai mare de publicații, creșterea în popularitate a EC, în special pentru separările chirale, s-a realizat prin punerea în aplicare a acesteia ca o tehnică de analiză în Farmacopeea Statelor Unite și în Farmacopeea Europeană. Totodată, metodele electroforetice sunt tot mai frecvent utilizate în primele etape ale dezvoltării unor noi medicamente, în controlul de rutină al calității și în protocoalele de documentare ale acestora. Metodele electroforetice au ajuns să fie acceptate de către autoritățile de reglementare, cum ar fi Administrația pentru Alimentație și Medicamente (FDA) și Agenția Europeană pentru Evaluarea Produselor Medicinale (EMEA) [3].

Lucrarea de față este structurată în trei părți. În prima parte sunt prezentate generalități despre colchicină, precum și sinteza racemicului acestuia.

În a doua parte, este descrisă metoda de separare a izomerilor optici ai protoalcaloidului prin cromatografie în strat subțire.

Ultima parte este dedicată electroforezei capilare și aplicării acesteia în analiza în urme a protoalcaloidului din diferite probe și prin diferite tehnici electroforetice. Tot în această parte s-a realizat separarea racemicului colchicinei prin EC, utilizând diferiți selectori chirali.

Colchicina

Generalități

Sursa

Colchicina este compusul majoritar din Colchicum autumnale (brândușa de toamnă), familia Liliaceae, făcând parte din grupa alcaloizilor derivați de tropolonă. Brândușa de toamnă (figura 1) era cunoscută de greci și romani, pentru marea sa toxicitate. Discoride descria acțiunea acestei plante astfel: „ingerată, ea ucide prin sufocare, ca și ciupercile” [4].

Fig. 1 Colchicum autumnale L.

Acțiunea farmacologică

Colchicina a fost folosită pentru prima dată acum 2000 de ani, de către medicii arabi, fiind și astăzi medicația de elecție pentru tratamentul durerilor intense ce apar în crizele acute de gută. În medicația europeană a intrat abia în secolul XVII.

Colchicina are acțiune antimitotică, blocând mitoza în metafază prin împiedicarea formării fusului nuclear. Aceasta se realizează prin fixarea alcaloidului pe tubulină și inhibarea formării microtubulilor, indispensabili formării fusului. În lipsa fusului nuclear, cromozomii continuă să se dividă normal, luând naștere celule cu număr dublu de cromozomi (celule diploide) sau cu număr mai mare de cromozomi (celule poliploide). Această proprietate a colchicinei permite utilizarea sa în agronomie, în vederea creării de linii poliploide.

Pentru celula animală însă colchicina este foarte toxică și nu se poate utiliza ca medicament antitumoral. Doza toxică la om este de aproximativ 10 mg.

Colchicina are proprietăți antiinflamatoare valorificate în artritele microcristaline provocate de cristalele de urați de sodiu, fiind un medicament eficient în tratamentul crizelor acute de gută. Mecanismul său de acțiune este simptomatic, antiinflamator, și nu intervine în metabolismul acidului uric.

Colchicina se poate administra și în febra mediteraneană, care în lipsa unui tratament poate să fie letală [4].

Structura

Colchicina (figura 2), este un compus cu schelet triciclic tropolonic cu atomul de azot într-o catenă laterală, fiind considerată de unii autori ca aparținând alcaloizilor, alții încluzând-o în categoria amidelor [5].

Fig. 2 Colchicina, (S)-N-(5,6,7,9-tetrahidro-1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxobenzo [a]-heptalen-7-il) acetamida

În biogeneza acestui alcaloid sunt implicați aminoacizii fenilalanină (care stă la originea nucleului benzenic) și tirozină (precursorul nucleului tropolonic), intermediar fiind un derivat fenil-etil izochinolinic, autumnalina.

Proprietăți fizico-chimice

Colchicina se prezintă sub forma unei pulberi microcristaline sau amorfe, alb-gălbuie sau gălbuie prin cristalizare din acetat de etil. Colchicina pură este incoloră. Nu are miros caracteristic, dar are gust amar.

Este ușor solubilă în cloroform și etanol, solubilă în apă (45 mg/mL) și benzen (10 mg/mL), puțin solubilă în eter etilic (4,5 mg/mL) și practic insolubilă în eter de petrol. Spre deosebire de alcaloizii tipici, colchicina nu prezintă caracter alcalin, soluția apoasă fiind neutră (pKa = 1,85 în apă [6]). Prezintă punctul de topire între 140 – 141,5 °C, dar acesta diferă foarte mult în funcție de puritate și starea de hidratare [7].

Colchicina prezintă patru maxime de absorbție în domeniile 340-355, 240-260, 234 și 199-204 nm [8].

Sub acțiunea luminii (radiații UV), colchicina se fotoizomerizează transformându-se în α-, β- și δ-lumicolchicină, de culoare brună [9]. Acești compuși sunt inactivi din punct de vedere fiziologic, de aceea soluția de colchicină trebuie protejată de lumină în cazul analizei sau păstrării acesteia. Soluția etanolică de colchicină păstrată în timp în flacoane brune la -15 °C nu prezintă semne de degradare chimică [10].

Izomerie optică

Molecula de colchicină prezintă un singur centru stereogenic, la carbonul 7. Aceasta rotește planul luminii polarizate, având puterea rotatorie specifică -230 ° până la -250 ° (1% m/V în alcool etilic 70c), -429 ° în soluție apoasă și -121 ° în soluție cloroformică. În urma stabilirii conformației absolute, conform regulilor Cahn-Ingold-Prelog, s-a constatat că izomerul „S” este cel cu activitate biologică.

Deoarece ciclul A (benzenic, aromatic) și ciclul C (metiltropolonic) ale moleculei de colchicină sunt legate printr-o legătură simplă cu rotație restricționată, aceasta prezintă o asimetrie suplimetară, denumită de către Kahn atropizomerie, notată cu „aS” sau „aR” de la chiralitate axială. Datorită existenței acestei axe chirale, colchicina prezintă 4 stereoizomeri (conformerii „aS,7S”, „aR,7S”, „aR,7R”) (figura 3).

În urma unor degradări chimice controlate și a analizei cu raze X și RMN, s-a stabilit că izomerul natural, și totodată singurul cu acțiune fiziologică, este (-)-(aS,7S)-colchicina [11-13], care în cazul unor energii suficient de mari, poate trece în forma „aR”.

Fig. 3 Stereoizomerii colchicinei.

Parte experimentală

Introducere

Unul din scopurile lucrării a fost separarea izomerilor optici ai colchicinei prin EC. Pentru aceasta, aveam nevoie de ambii izomeri ai acesteia. Izomerul natural este (-)-colchicina. Principala problemă în realizarea separării s-a dovedit a fi obținerea celuilalt enantiomer, (+)-colchicina, deoarece acesta nu se comercializează și nici nu sunt descrise în totalitate metodele de sinteză ale acestuia. Prin urmare, am fost nevoiți să îl sintetizăm în laborator, pornind de la datele descrise în literatură. Cea mai simplă metodă de racemizare a colchicinei a fost descrisă de către Artur Bladé-Font, sinteza constând în refluxarea colchicinei naturale timp de 24 de ore în acid acetic anhidru [14].

Materiale și metode

Reactivii

Toți reactivii folosiți în acest studiu au fost de puritate analitică. Colchicina, acidul clorhidric, anhidrida acetică și acetatul de etil au fost achiziționați de la Merck (Darmstadt, Germany). Acetatul de sodiu, etanolul, metanolul au fost achiziționate de la Sigma Aldrich.

S-a folosit apă deionizată (18 mΩ) produsă de un sistem de purificare al apei Barnstead EasyPure RoDi, (Barnstead, Thermolyne, SUA).

Aparatura

Refluxarea s-a realizat într-un balon cu fund rotund, căruia i s-a atașat un refrigerent răcit cu apă. Balonul s-a încălzit într-un cuib de încălzire prevăzut cu un termostat.

Evaporarea solventului s-a realizat într-un rotavapor.

Condițiile de lucru

S-a refluxat colchicina (100 mg) într-un balon cotat cu fund rotund în 6 mL de anhidridă acetică, la diferite temperaturi: 40 °C, 80 °C și 140-150 °C. Soluția a fost protejată de lumină pe tot parcursul studiului.

După răcire, s-a adăugat apă (0,915 – 0,973 mL) pentru a hidroliza 80 – 85 % din anhidrida acetică și s-a continuat refluxarea pentru încă 5 ore. Amestecul lichid a fost evaporat la sec cu rotavaporul, iar reziduul s-a reluat cu 5 mL de acetat de etil. După păstrarea soluției rezultate la frigider, colchicina precipitată s-a redizolvat în acetat de etil sau etanol.

Rezultate și discuții

Inițial s-a realizat sinteza la temperatura de 140-150 °C, însă în urma separării amestecului rezultat prin CSS, s-a observat că nu s-a obținut un amestec racemic. A apărut în schimb o cantitate mare de derivați ai colchicinei (figura 4).

Fig. 4 Separarea racemicului obținut la diferite temperaturi: A. 145 °C; B. 80 °C.

Astfel, din cauza acestei incertitudini asupra obținerii racemicului, s-a încercat realizarea racemizării la temperaturi mai scăzute: 40 °C și 80 °C (figura 4).

Apoi, s-a încercat adaptarea metodei prin crearea unui mediu catalitic acid și bazic. Pentru realizarea mediului acid, s-a adăugat HCl concentrat (10L/6mL anhidridă acetică) iar pentru realizarea catalizei bazice s-au adăugat câteva cristale de CH3COONa. Prima diferență, și cea mai vizibilă a fost faptul că soluția în care s-a creat un pH acid, a fost mult mai intens colorată decât cea în care pH-ul a fost bazic.

Toate aceste soluții obținute au fost analizate prin CSS și apoi prin EC.

Din punct de vedere chimic, în urma tratării colchicinei cu anhidridă acetică în exces, la temperatura de refluxare, se obține inițial un compus diacetilat la atomul de N legat de C7. Compusul 2, un acetat enolic al N-diacetil colchicinei, rezultă probabil în urma următoarelor reacții:

Acest lucru este confirmat prin dispariția, în timpul sintezei, a activității optice și a grupărilor cromofore tropolonice. În urma fierberii cu acid acetic (format prin hidroliza anhidridei acetice în urma adăugării de apă), compusul 2 se transformă în (±)-colchicină [14].

Concluzii

S-a încercat obținerea racemicului colchicinei pornind de la o metodă descrisă în literatură. S-a încercat optimizarea acesteia atât prin realizarea sintezei la diferite temperaturi cât și modificând pH-ul mediului (acid și bazic).

S-a lucrat la temperaturile de 40 °C, 80 °C și 140-150 °C. Temperaturile mai scăzute nu duc însă la obținerea racemicului. Odată cu creșterea temperaturii însă are loc formarea în cantități tot mai însemnate de produși de degradare ai colchicinei mai puțin polari, ce dau o colorație tot mai intensă amestecului de sinteză.

Mediul bazic nu este favorabil obținerii enantiomerului (+) al colchicinei. În schimb, pH-ul acid ajută racemizarea, racemicul astfel obținut fiind supus separării prin CSS și EC.

Chiralitate

Simetria apare ca una dintre cele mai prevalente caracteristici ale ființelor vii [1]. Privind la majoritatea dintre ele, am observa elemente de simetrie în apariția lor externă, în ciuda conștientizării faptului că în structura lor internă de multe ori nu există echivalente ale unor astfel de elemente. Dacă privim mai atent la cel mai mic constituent ce formează organismele vii, chiar dacă e să mergem până la nivel molecular, vom observa că de multe ori nu există obiecte (molecule) având orice fel de simetrie. Cel mai frecvent, dintre două molecule reciproc simetrice numai una dintre ele se află într-un organism viu.

Chiralitatea este unul dintre cele mai mari mistere ale naturii. Întâlnim acest fenomen în toate moleculele găsite în forme de viață. Această proprietate trebuie să fi fost importantă chiar și pentru cele mai timpurii forme de viață, dar nu este bine înțeles, de ce, chiar și în prezent Ladik și Szekeres [8] au demonstrat, cu ajutorul simulării moleculare dinamice, dacă schimbându-se chiralitatea unei enzime prin câțiva centri chirali, se modifică total structura sa secundară și, în consecință, conduce la dispariția activității catalitice.

Până relativ recent, interesul pentru chimia chirală a fost în cea mai mare parte academic, deși izomerii optici se cunosc încă de la începutul anilor 1800. Emil Fisher [5] a fost primul care a încercat să determine stereochimia izomerilor optici și a descoperit configurația (+)-glucozei pentru care a primit premiul Nobel. Fischer a prezis că izomerul (+) al gliceraldehidei este izomerul D și arbitrar i-a atribuit dispoziția sterică prezentată în figura 6:.

Fig. 6 Reprezentarea spațială a D-(+)-gliceraldehidei

Presupunerea lui Fisher a fost mai târziu demonstrată de către Bijovet [6] folosind un cristalograf cu raze X. Studiul stereochimiei a progresat în mod continuu. Prin anii 1980, a existat o creștere bruscă a interesului comercial pentru substanțele chirale, în special pentru substanțele medicamentoase chirale. Acest entuziasm a fost hrănit de către descoperirea că activitatea fiziologică a izomerilor poate diferi radical, mai ales de către mult cunoscutul caz al Talidomidei. Medicamentul a fost produs și vândut ca un amestec racemic al imidei acidului N-ftalilglutamic. S-a descoperit mult prea târziu că activitatea fiziologică dorită aparține numai izomerului R-(+) și că enantiomerul S-(-) este teratogenic, provocând numeroase cazuri de malformații fetale. Dezastrul talidomidei a evocat interesul producătorilor farmaceutici și al organismelor de reglementare. Activitatea de cercetare în domeniul stereochimiei a fost frenetică. Administrația Medicamentului și a Alimentelor din Statele Unite (FDA) a recomandat ca fiecare izomer al noilor medicamente să fie testat individual, forțând companiile să trimită posibilele probleme legate de amestecurile racemice. Cererea pentru medicamente pure din punct de vedere enantiomeric a crescut rapid și cu câțiva ani în urmă (1993), piața mondială a medicamentelor pure din punct de vedere enantiomeric a depășit 35 milioane de dolari și din acest total, aproape două treimi au fost medicamente cardiovasculare și antibiotice.

Necesitatea de a testa diferiții enantiomeri ai medicamentelor a evocat nevoia unor proceduri analitice pentru separarea și determinarea cantitativă a acestora. Cu 20 de ani în urmă, existau foarte puține tehnici eficiente. La începutul anilor 1980, erau disponibile puține faze staționare comerciale pentru gaz cromatografie sau pentru cromatografia de lichide. Cu toate acestea, în 1966 Gil-AV Av și colab. au descris prima fază staționară chirală pentru gaz-cromatografie și în 1976 Sogah și Cram [8] au introdus eterii coroană chirali ca și fază staționară. În 1978, Harada și colab. [9] a introdus ciclodextrinele ca și selectori chirali și, în 1980, Armstrong [10] a folosit ciclodextrinele ca și aditivi în faza mobilă pentru separarea chirală prin cromatografie pe strat subțire (CSS). Astăzi, ciclodextrinele sunt unele din cei mai utilizați selectori chirali utilizați în cromatografie și în electroforeză pentru separarea enantiomerilor [2].

Noțiuni despre stereochimie

Stereochimia este una dintre cele mai importante ramuri ale chimiei. Ea investighează formarea spațială a compușilor chimici, în principal biologici, precum și a complecșilor și a compușilor de coordonare care se află la limita dintre chimia organică și anorganică.

Considerente stereochimice se pot aplica moleculelor mici, precum și polimerilor obținuți în laborator, sau compușilor macromoleculari naturali (de exemplu, proteine, acizi nucleici, și polizaharide). Vecinătățile unui singur atom de carbon, azot, fosfor sau siliciu nu trebuie să fie de mare importanță pentru o singură moleculă izolată. Cu toate acestea, în cazul în care o astfel de moleculă este prezentă într-o reacție chimică controlată de către un catalizator sau enzimă, o astfel de ambiguitate ar putea duce la perturbări grave în procesele chimice controlate de acești factori. Acest fel de relații cu mult timp în urmă a forțat chimiștii și tehnologii să dezvolte metode care să permită obținerea de produse având proprietăți precis determinate din punct de vedere stereochimic. Tehnologiile contemporane de obținere a compușilor ce găsesc aplicare în biochimie, biologie moleculară, medicină, farmacologie sau nanotehnologie nu pot fi imaginate fără metode stereochimice de control a produselor formate.

Natura a oferit numeroase exemple cu privire la importanța stereochimiei nu numai în cazul în care apare numai o singură moleculă, dar și în cazul interacțiunilor reciproce ale acestora. Asemenea interacțiuni sunt subiectul stereochimiei supramoleculare. Este dificil să se clasifice aceasta din urmă într-o ramură a chimiei. Subiectul acesteia este reprezentat de investigarea interacțiunilor dintre polimeri, cristale, dendrimeri, precum și cele găsite în nanochimie, chimie bioorganică, etc. De asemenea, se ocupă cu analiza conformațională și chimia recunoașterii moleculare. Stereochimia supramoleculară este unul dintre domeniile stereochimiei în curs de dezvoltare, cu cea mai rapidă evoluție. Stereochimia compușilor chimici este asociată cu chiralitatea acestora. Anterior, aceasta din urmă a fost legată de asimetria compușilor, care, la rândul ei a fost asociată cu un atom de carbon ce are patru substituenți (pentru azot sau fosfor (III), trei substituenți, figura 7). Nu este nici un element de simetrie prezent (centru, axă sau plan de simetrie) într-o astfel de moleculă.

Fig. 7 Exemple de molecule cu structură asimetrică:

A. atom de carbon legat de patru subtituenți diferiți și

B. atom de azot legat de trei suttituenți diferiți

Compușii de acest tip arată activitate optică, care a fost asociată anterior cu asimetria acestora. S-a dovedit, totuși, că asimetria unui compus nu este o condiție necesară pentru ca activitatea optică să fie prezentă. Molecula de acid tartric oferă un exemplu clasic aici: este optic activă în ciuda faptului că are o axă dublă de simetrie (figura 8).

Fig. 8 Structura acidului D-(+)-tartric prezentând:

A. axă dublă de simetrie și

B. una din conformațiile posibile, înfățișată aici ca și proiecție Newman

După cum putem vedea, moleculele optic active pot avea o axă de simetrie, însă nu pot avea un centru de simetrie sau un plan de simetrie. Aceste molecule au fost etichetate ca fiind chirale (de la un cuvant grec cheir, ce înseamnă mână). Numele se aplică în cazul acelor molecule care nu pot fi suprapuse peste imaginea lor în oglindă (la fel cum mâna noastră stângă nu poate fi suprapusă peste mâna dreaptă) și care arată activitate optică, adică care au proprietatea de a roti planul luminii polarizate.

Atomul de carbon legat de patru substituenți diferiți se numește chiral. Apariția acestui tip de atom de carbon într-o moleculă nu este o condiție necesară pentru ca un anumit compus chimic să prezinte activitate optică [1]. Se consideră un atom de carbon legat de 4 atomi sau grupări de atomi diferite (ex.: acid lactic) și structura amplasată în fața unei oglinzi, ca în figura 9.

Fig. 9 Structura acidului lactic

Se poate observa că moleculele nu sunt superpozabile și nu sunt interconvertibile. În consecință, sunt substanțe diferite deși au aceeași structură chimică. Aceste tipuri de izomeri sunt optic activi și acești stereoizomeri specifici sunt numiți enantiomeri [2]. Sensul de chiralitate și activitatea optică a enantiomerilor sunt determinate de configurația absolută a acestora, adică de aranjamentul spațial al atomilor în moleculă. Spre deosebire de conformația acestora, configurația enantiomerilor nu poate fi schimbată decât prin modificarea legăturilor dintre atomi. Desemnarea configurației enantiomerilor ar trebui să fie făcută ținând cont de sistemul R,S Cahn-Ingold-Prelog. Se mai folosesc de asemenea notările Delta-Lambda pentru enantiomerii complecșilor octaedrici și notațiile D,L Fischer-Rosanoff pentru aminoacizi și zaharuri [3].

În cazul în care există un număr mai mare de atomi de carbon chirali într-o moleculă, compușii care prezintă imagine în oglindă, sunt denumiți enantiomeri. Compușii enantiomerici, în afară că rotesc planul luminii polarizate, nu diferă prin proprietăți fizice sau chimice. Toți ceilalți compuși ce posedă atomi chirali, dar nu sunt enantiomeri, sunt numiți diastereoisomeri. Configurația substituenților într-o moleculă chirală nu are impact direct asupra direcției de rotație a luminii polarizate. Se întâmplă des ca molecule foarte asemănătoare din punct de vedre chimic să prezinte semne opuse de rotație optică. Nu există nici o metodă simplă pe baza unei formule chimice pentru determinarea rotației optice. Pentru compuși puri din punct de vedere optic, puterea rotatorie poate fi determinată experimental.

Procesul de cristalizare a compușilor organici achirali poate genera, de asemenea chiralitate. Compuși care cristalizează în forme chirale, aparțin diferitelor clase de compuși organici, inclusiv derivați substituiți de benzen, derivați poliaril și policiclici, compuși heterociclici, etc. Acești compuși au fost expuși pe scurt în literatură. Este evident că acest tip de chiralitate se produce numai în formă cristalină și dispare la dizolvare [1].

Amestecul enantiomerilor (+) și (-) în proporții egale este denumit amestec racemic și este optic inactiv. Inactivitatea optică rezultă din rotația cu un anumit unghi al planului luminii polarizate, de către un enantiomer ce anulează rotația produsă de enantiomerul complementar. Amestecul racemic se notează cu (±) (ex. (±) acid lactic). Deoarece enantiomerii unei substanțe au proprietăți fizice identice, nu se pot separa ușor folosind tehnicile uzuale de separare, ca de exemplu distilarea fracționată. În consecință, izolarea izomerilor optici pune deseori probleme de separare și este de obicei necesar să se recurgă la tehnici speciale pentru a obține o rezoluție satisfăcătoare [2].

Tehnici de separare chirală

Sintezele chimice convenționale, spre deosebire de sintezele asimetrice, se folosesc mai mult pentru obținerea compușilor achirali. Dacă în uma acestor reacții rezultă un element de chiralitate în moleculă, produsul de reacție se pare că este un amestec de perechi de enantiomeri, un amestec racemic, care este optic inactiv. Acesta se mai poate forma și prin racemizarea compușilor chirali.

Separarea enantiomerilor din amestecul racemic este o problemă des întâlnită în analiza stereochimică, ca de altfel și la prepararea compușilor biologic activi, a medicamentelor. Problema este că, spre deosebire de diastereoizomeri și de alte tipuri de specii izomerice, enantiomerii, într-un mediu achiral, prezintă proprietăți fizice și chimice identice. Inechivalența energetică a speciilor enantiomerice, ce poate rezulta din violarea parității interacțiunilor slabe, este neglijabil de mică, de ordinul 10-14 J·mol-1 [3]. Diferitele tehnici de separare chirale sunt prezentate în figura 10.

Fig. 10 Diferitele tehnici de separare chirală:

galben – analitice; verde – analitice și preparative; violet – preparative

Problemele de separare asociate cu sinteza enantiomerilor pot fi adesea rezolvate prin utilizarea intermediarilor puri din punct de vedere optic. Această abordare nu face altceva decât să mute problema purificării la un punct mai înalt al lanțului sintezei. O soluție mai frecventă este folosirea unei proceduri biosintetice și alegerea unui organism (ex. o drojdie sau bacterie) care clivează selectiv sau alterează chimic numai unul dintre enantiomeri.

O altă abordare a separării chirale, uneori denumită separare enantiomerică indirectă, implică cuplarea enatiomerilor cu un agent chiral secundar pentru a forma diastereoizomeri. Diastereoizomerii astfel formați pot fi separați ulterior prin orice tehnică de separare achirală clasică.

Astăzi, cele mai des folosite metodele de separare chirale sunt cele directe, care apelează la plasarea enantiomerilor într-un mediu chiral. În principiu, doar selectorii chirali sau un fascicul chiral (ex. un fascicul de lumină polarizată care constă din două componente chirale polarizate circular) pot face diferența între doi enantiomeri. Selectorii chirali pot fi molecule sau o suprafață chirală (ex.: un cristal chiral promotor al unuia din enantiomeri). Datorită interacțiunii enantioselective cu cei doi antipozi optici, selectorul chiral fie transformă cu viteze diferite enantiomerii în compuși chimici noi (enantioselectivitate cinetică), fie formează cu enantiomerii aducți moleculari labili cu stabilități diferite (enantioselectivitate termodinamică). Transformarea enzimatică selectivă a enantiomerilor L dintr-un amestec racemic al D,L-aminoacizilor este un exemplu tipic al unui proces enantioselectiv cinetic (rezoluție cinetică). Cromatografia chirală nu modifică speciile enantiomerice pentru a le separa, de aceea reprezintă un exemplu de proces enantioselectiv termodinamic.

Separările enantiomerice directe sunt fezabile numai în sistemele cromatografice care conțin un selector chiral potrivit. Selectorul chiral poate fi încorporat în faza staționară (fază staționară chirală) sau poate fi imobilizat pe suprafața materialului ce acoperă coloana (faze staționare chirale fixate sau lipite). În ambele cazuri este recomandabil să ne referim la coloanele cromatografice ca și la coloane enantioselective (chirale). Cromatografia enantioselectivă se poate realiza de asemenea pe coloane cromatografice achirale folosind selectorul chiral potrivit ca și fază mobilă chirală sau ca și aditiv al fazei mobile. Este de asemenea posibil să se folosească o combinație de câțiva selectori chirali în faza mobilă sau ca și fază mobilă sau staționară.

În cazul fazelor staționare chirale, enantiomerul care formează cea mai stabilă asociere cu selectorul chiral va fi cea mai reținută specie din racemic. Enantioselectivitatea sistemului chiral cromatografic este apoi exprimată ca și raport al factorilor de retenție al celor doi enantiomeri. Acest raport se poate apropia de valoarea enantioselectivității termodinamice a asocierii dintre selectorul chiral și enantiomeri. Această situație apare când asocierea cu selectorul chiral este superioară retenției enantiomerilor în sistemul cromatografic și alte tipuri de interacțiuni solut-adsorbant neselective sunt neglijabile. Pe de altă parte însă, o fază mobilă chirală reduce retenția enantiomerului dizolvat care formează o asociere mai puternică cu selectorul chiral. Aici din nou, limita enantioselectivității sistemului cromatografic chiral este legată de enantioselectivitatea asocierii selector-solut (în faza mobilă). Cu toate acestea, în majoritatea sistemelor cu faze mobile chirale, selectorul chiral, ca și asocierile acestuia cu enantiomerii dizolvați, sunt distribuite între fazele mobile și staționare. Enantioselectivitatea efectivă a sistemului cromatografic va fi proporțională cu rata enantioselectivităților proceselor de asociere din fazele mobilă și staționară.

Interacțiunea selectorului chiral cu enantiomerii solutului conduce la formarea a doi diastereoizomeri labili cu stabilitate termodinamică diferită. Condiția este ca cel puțin trei puncte active ale selectorului să participe în interacțiunea cu locurile corespunzătoare ale moleculei solutului. În general, în cromatografia enantioselectivă, regula interacțiunii în trei puncte este validă, cu o mică extensie, și anume, una din interacțiunile necesare poate fi mediată de adsorbția celor doi componenți din perechea ce interacționează la suprafața adsorbantului.

Din cauza multitudinii și complexității interacțiunilor enantiomerilor cu selectorul chiral, cu suprafața adsorbantului și cu alte componente ale sistemului cromatografic, enantioselectivitatea totală poate depinde puternic de compoziția, pH-ul și temperatura fazei mobile.

Cromatografia și electroforeza capilară chirală sunt utilizate frecvent în analiza raportului enantiomeric (excesul de enantiomeri, puritatea optică) din compușii chirali. La scară preparativă în izolarea compușilor chirali din amestecul racemic se utilizează cromatografia lichidă și cu fluide supercritice. Separări enantioselective au fost realizate folosind toate tehnicile de separare posibile, inclunzând gaz-cromatografia, cromatografia de lichide pe coloană, cromatografia pe strat subțire, cromatografia cu fluide supercritice, dar și metode de electroseparare, cromatografia lichidă în contracurent și extracția lichid-lichid.

Numeroase recenzii și monografii descriu detaliile tehnice precum și realizările și potențialul acestor tehnici moderne de separare [3].

Dintre metodele electroforetice de separare chirală, au fost descrise diferite forme de electroforeză capilară, cum ar fi electroforeza capilară zonală (CZE), izotacoforeza (CIF), electroforeza capilară pe gel (CGE), electroforeza capilară isoelectrică prin concentrare (CIEF), electroforeza capilară de afinitate (ECA), precum și separări cu ajutorul microcipurilor au fost utilizate. Cu toate acestea, spre deosebire de altele, modelul CZE a fost utilizat cel mai frecvent în acest scop [44]. Pe de altă parte, dezavantajele asociate cu tehnica electroforetică, cum ar fi lipsa de dezvoltare a unor faze chirale moderne au limitat aplicarea acestora. Mai mult decât atât, tehnicile electroforetice nu pot fi utilizate la scară preparativă, reprezentând o nevoie urgentă a separărilor chirale [4].

Cromatografia pe strat subțire

Cromatografia pe strat subțire (CSS) este cunoscută în general printr-o eficiență a separării mai redusă față de metodele de separare în totalitate automatizate (ex. cromatografia de gaze (GC), cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) și electroforeza capilară (CE)), observându-se numărul cel mai mic de talere teoretice (N). Cu toate acestea, rezoluția oferită de sistemele CSS, care includ combinația dintre zona de separare de centru-la-centru (selectivitate) și densitatea zonelor în direcția de developare (N), este suficientă pentru a separa orice pereche de enantiomeri. CSS este cea mai versatilă și flexibilă tehnică cromatografică. Se aplică la aproape toate clasele de compuși și prezintă multiple avantaje privind enantioseparările și analizele de rutină în comparație cu GC, HPLC și CE. Astfel, de exemplu, GC s-a dovedit a fi cea mai potrivită tehnică de separare chirală doar pentru aminoacizi și derivați ai acestora.

Deși HPLC poate fi aplicată pentru a separa un spectru mai larg de compuși, comparativ cu GC, este de multe ori nevoie de utilizarea unei faze staționare din polizaharide speciale esterificate. Aceste polizaharide solide sunt relativ moi, cu o tendință marcată și indezirabilă de a se umfla în contact cu fazele mobile. Această proprietate împiedică adesea buna curgere a fazei mobile prin coloană (ex. presiune mică și neperturbată) și afectează negativ rezultatul final al enantioseparărilor. Enantiomerii separați prin CSS pot fi vizualizați direct pe plăcile cromatografice după evaporarea fazei mobile, evitând problemele cauzate de absorbția radiațiilor ultraviolete (UV) de către aditivii chirali din faza mobilă din HPLC. În CSS este disponibilă o mai mare varietate de faze staționare și mobile, iar metodele de detecție sunt mai flexibile și mai variate. Numărul de analize efectuate pe unitate de timp este mai mare în TLC (analiza pe eșantion este mai rapidă), precum și posibilitatea de a folosi diferite tipuri de interacțiuni în developarea bidimensională poate duce la separări de rezoluție foarte înaltă. CSS cuplată cu densitometria "in situ" oferă un mijloc excelent de analiză calitativă și cantitativă a enantiomerilor separați. Avantajul major îl reprezintă în cazul unui număr mare de analize, iar relativa simplitate și costurile scăzute ale CSS fac ca aceasta să fie ideală pentru o simplă reacție de control a sintezei, direct pe spot, de către personalul de laborator.

Datorită acestor avantaje, importanța CSS pentru separarea și analiza cu succes a enantiomerilor este în creștere constantă. Aceasta a fost aplicată nu numai pentru aminoacizi, dar și la un spectru larg de diferite clase de substanțe medicamentoase, de la medicamente de origine vegetală la antibiotice sau alte clase de compuși chirali. Aceasta tehnică poate fi aplicată cu succes pentru diverse separări precum controlul rapid al compoziției enantiomerice a produselor farmaceutice și pentru enantioseparări micropreparative [1].

Mecanismul retenției solutului

Enantiomerii unei singure substanțe sunt în esență identici din punct de vedere chimic și diferă numai în aranjamentul spațial al atomilor sau al grupelor de atomi legate de centrii de chiralitate. Asemenea diferențe exprimă variații fizio-chimice foarte subtile între izomeri și astfel trebuie să fie exploatate cu grijă pentru a obține separarea cromatografică a acestora. În orice sistem cromatografic, parametrul care determină cât de bine este separată o pereche de substanțe apropiate din punct de vedere chimic, este retenția relativă a celor doi compuși. Cu cât diferența de retenție între perechea de analiți e mai mare, cu atât mai bună va fi rezoluția și cu atât mai departe vor fi unul față de celălalt pe cromatogramă. În consecință, o expresie algebrică a volumului de retenție a unui solut va arăta cum este controlată retenția și astfel cum poate fi obținută sau îmbunătățită aceasta.

Cromatograma, care prezintă eluția analiților dintr-o coloană este de fapt un grafic care indică concentrația solutului în faza mobilă părăsind coloana în timpul scurs.

Atâta timp cât rata de curgere este constantă, relația reală este exprimată printr-o curbă ce reprezintă concentrația solutului în faza mobilă ce părăsește coloana pe volumul de fază mobilă ce trece prin coloană. În figura 11, cromatograma arată eluția unui singur pic. Expresia f(v) va fi ecuația curbei de eluție care va fi derivată folosind teoria talerelor. Odată ce ecuația curbei de calibrare este derivată și natura lui f(v) identificată, prin diferențierea lui f(v) și egalarea acestuia cu zero, poate fi determinată poziția maximului picului și expresia volumului de retenție (Vr). Această expresie a (Vr) va dezvălui acei factori care controlează dimensiunea retenției solutului [2].

Fig. 11 Curba de eluție a unui singur pic [2]

Mecanismele de recunoaștere chirală

Mecanismele de recunoaștere chirală sunt aproximativ similare pentru toți selectorii chirali cu excepția schimbătorilor de liganzi chirali. Toți selectorii chirali oferă o suprafață chirală enantiomerilor, formând astfel complecși temporari cu diferite energii de legare. Enantiomerii diferă prin energiile de legare deoarece ei se încadrează diferit în structurile chirale formate din selectori, din cauza diferitelor stereoconfigurații ale enantiomerilor. Acești complecși temporari sunt stabilizați prin diferite interacțiuni, cele mai importante fiind legăturile de hidrogen, π-π, dipol-dipol indus, ionice, complexări de incluziune și interacțiuni sterice. Cu toate acestea, și alte forțe mai slabe (forțe van der Waals) joacă un rol crucial în mecanismele de recunoaștere chirală. Mecanismele de recunoaștere chirală ale schimbătorilor de liganzi sunt diferite de ale celorlalți selectori. Aceasta se datorează în cea mai mare parte schimbării liganzilor prin legături coordinative pe un ion metalic, nefiind posibile pe alți selectori chirali. Pe scurt, în general, mecanismul de recunoaștere chirală a unui selector chiral se bazează pe un aranjament cheie-broască (figura 12) [4].

Fig. 12 Reprezentarea schematică a mecanismului de recunoaștere chirală

Siturile de legare: modelul de recunoaștere chirală în trei puncte

Enantioselectivitatea este produsă în urma diferitelor interacțiuni între un selector chiral și cei doi enantiomeri. În cazul în care este utilizat un selector chiral, mecanismul principal de retenție este complexarea antipozilor de către selectorul chiral. Se formează astfel doi aducți diastereoizomerici enantiomer-selector diferiți.

Conceptul de "fixat în trei puncte", a fost propus în 1933 [11]. În acest model, diferențele stereochimice în ceea ce privește activitățile farmacologice au rezultat ca urmare a diferenței de legare a enantiomerilor de situl comun de pe o suprafață a receptorilor. Modelul de interacțiune "în trei puncte" a fost revizuit de Ogston [12]. Cu toate acestea, de cele mai multe ori este citat modelul propus de Dalgliesh [13], care a invocat o interacțiune "în trei puncte" care explică separarea enantioselectivă a aminoacizilor, pe hârtie de celuloză. Regula ”celor trei puncte de interacțiune” diferă de regula ”celor trei puncte de atașare”, așa cum a fost subliniat de către Davankov [14], care prevede ca o condiție de recunoaștere a enantiomerilor de către selectorul chiral, ca cel puțin în trei puncte active dependente de configurația moleculei selectorului să interacționeze cu trei puncte complementare active dependente de configurația moleculelor de enantiomer.

Fig. 13 Enantiomerul 1: Modelul de interacțiune în trei puncte.

Enantiomerul 2: oferă o asociere mai slabă a complexului diastereoizomeric

Un exemplu tipic de model de interacțiune în trei puncte este prezentat în figura 13. În cazul în care trei grupări dintr-o moleculă se pot potrivi în trei situri din selectorul chiral, atunci imaginea sa în oglindă, după toate posibilele rotații, poate prezenta doar două grupări care pot interacționa cu selectorul chiral. În figura13, enantiomerul 1 interacționează cu selectorul chiral de pe A-A`, B-B și C-C`. Enantiomerul 2 (antipodul) nu interacționează cu selectorul chiral de pe C-C`. În acest mod, în cazul în care complexul diastereomeric selector chiral – enantiomer 1 este stabilizat printr-o interacțiune cu C-C`, enantiomerul 1 este mai reținut de selectorul chiral decât enantiomerul 2. Dimpotrivă, în cazul în care interacțiunea C-C` destabilizează complexul selector chiral – enantiomer 1, enantiomerul 2 este mai reținut. Cele trei interacțiuni dintre selectorul chiral și enantiomeri nu trebuie să fie neapărat de atracție, unele dintre ele putând fi de repulsie. Numai rezultatele compuse din însumarea acestora (combinația diastereoizomerică favorizată) ar trebui să producă o legare mai favorabilă. Două interacțiuni pot fi respingătoare dacă cea de-a treia este destul de puternică pentru a promova formarea unuia dintre cei doi posibili complecși diastereoizomerici selector-ligand.

Regula celor trei puncte de atașare este în mare măsură calitativă și valabilă doar în procesele bimoleculare (ex. selectori schimbători de liganzi sau Pirkle mici). Alt dezavantaj al acestui model de abordare este acela că nu poate fi aplicat pentru enantiomerii cu mai multe centre de chiralitate. Sundaresan și Abrol [15] au propus un model nou de recunoaștere chirală pentru a explica stereoselectivitatea substraturilor cu două sau trei centri sterici care necesită un număr minim de patru sau cinci puncte de interacțiune. În același mod, Davankov [16] a subliniat că mult mai multe puncte de contact sunt realizate cu cavitățile chirale ale solidelor. Tabelul 7.1 enumeră principalele forțe intermoleculare, care pot apărea între două perechi de enantiomeri și un anumit selector chiral.

După cum se arată în tabelul 1, cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) și separările chirale prin CSS implică diferite tipuri de interacțiuni necovalente de atracție sau repulsie. Aceste interacțiuni combină atât efectele cu rază lungă de acțiune (electrostatice, de inducție și de dispersie) cât și pe cele cu rază mică de acțiune (de repulsie și cu transfer de sarcină) [1].

Tabel 1 Cele mai comune tipuri de interacțiuni implicate în separarea chirală

Termenul de forțe van der Waals acoperă interacțiunile de atracție (dipol, dipol indus, de dispersie și de dispersie London), precum și interacțiunile sterice repulsive. Interacțiuni hidrofobe sunt, de asemenea, critice în cromatografia de lichide chirală. Ele nu sunt rezultatul forțelor de atracție, ci o consecință a interacțiunilor nefavorabile dintre moleculele de apă și moleculele nonpolare. Forțele intermoleculare pot fi clasificate în funcție de scăderea relativă a tăriei (de la stânga la dreapta): ion-ion > ion-dipol > legături de hidrogen > dipol-dipol > π-π > dipol – dipol indus > de dispersie. Cele mai puternice interacțiuni sunt reprezentate de forțele coulombiene și produc cea mai bună rezoluție. Acest lucru presupune existența unui ion (de exemplu, în schimbul de liganzi). Legăturile de hidrogen sunt implicate în mai multe sisteme, atracția putând fi puternică sau slabă, în funcție de distanța dintre situl negativ și de atomul de hidrogen. Legăturile de hidrogen sunt singurele responsabile pentru mecanismul de recunoaștere chirală; ele sunt întotdeauna asociate cu un alt mecanism, cum ar fi de incluziune (ex. CD și polizaharide) sau interacțiuni π. Acest lucru este bine ilustrat de un număr relativ mic de aplicații HPLC care implică selectori chirali bazați numai pe legături de hidrogen, în comparație cu alte faze aromatice Pirkle.

Impedimentele sterice sunt întotdeauna repulsive (excluderea Pauli) și sunt în principal întâlnite la faze staționare chirale (CSP) adaptate. Niveluri ridicate de recunoaștere chirală pot fi atribuite prezenței de grupuri voluminoase [17]. Multe studii au arătat că efectul steric poate fi interacțiunea determinantă în recunoașterea chirală [18-20]. Interacțiunile π-π sunt asociate cu cicluri aromatice și joacă un rol important în dezvoltarea de faze Pirkle [21]. În funcție de natura și numărul substituenților, se produce o grupare π-donoare sau acceptoare este produsă. Substituenții bogați în electroni, cum ar fi NO2, produc unități π-acceptoare, iar în schimb substituenții săraci în electroni produc unități π-donoare. În recunoașterea chirală cu complexele π este adesea implicată o pseudo-interacțiune în două puncte. Aceste interacțiuni nu sunt populare în CSS din cauza problemelor de detecție UV, din moment ce lumina este cel mai utilizat mod de detecție.

Descoperirea lui Pirkle [24] din 1966 a semnalelor de rezonanță magnetică nucleară (RMN) neechivalente care provin de la enantiomeri în prezența unui agent de solvatare chiral, a avut un efect dramatic în cursul separărilor enantiomerice. Modelul propus presupune un complex chelat în două puncte cu analiții, conținând două situri de interacțiune, diferit bogate în electroni. Spectroscopia RMN este adesea folosită pentru a confirma modelul propus în urma rezultatelor cromatografice [25].

Astăzi, designul rațional al selectorilor chirali specifici este una dintre cele mai dificile probleme cu care se confruntă separarea chirală. Tendința actuală se distanțează de „rational" spre abordări combinatoriale [26,27]. O posibilă explicație pentru această tendință este lipsa unui sistem de clasificare clar și informativ al selectorilor chirali care ar face clară relația dintre ei.

Wainer [28] a fost în măsură să introducă un prim sistem de clasificare pentru fazele staționare chirale (CSP) utilizate în HPLC ce se bazează pe modul de formare a complexului solut-CSP:

1. Complexul solut-CSP este format prin interacțiuni de atracție, cum ar fi legături de hidrogen, interacțiuni π-π și stivuire dipol («dipol stacking») (ex. faza Pirkle);

2. Complexul solut-CSP este format prin interacțiuni de atracție și prin includerea într-o cavitate chirală (ex. orice CSP pe bază de celuloză sau amiloză);

3. Principalul mecanism implică formarea de complecși de incluziune (ex. CD);

4. Solutul este implicat într-un complex schimbător de liganzi (selectori chirali Davankov);

5. CSP este o proteină și complexul solut-CSP se formează printr-o combinație de interacțiuni hidrofobe și polare.

Astăzi, ar trebui să fie propusă o clasificare mai relevantă în conformitate cu numărul mare de selectori chirali descriși în LC (circa 1500 de faze staționare chirale au fost colectate în baza de date ChirBase) și noile cunoștințe legate de mecanismele de separare chirală. Rezultatele cromatografice sugerează sunt în mod clar că sistemele bimodale și supramoleculare ar trebui să fie colectate separat [1].

Constantele de complexare și retenție

Selectori chirali imobilizați pe fază solidă

În cazul în care un selector chiral este utilizat în calitate de fază staționară și apare un complex 1:1 solut-selector (cum apare de obicei), constanta de echilibru a complexului Kc este scrisă ca

(1)

unde [solut], [selector] și [solut – selector] reprezintă concentrațiile de echilibru ale solutului liber, selectorului liber și respectiv a complexului solut-selector. În cromatografia de lichide, el poate fi scris ca

(2)

unde k este factorul de retenție și φ este raportul de fază. Factorul de retenție k [29] este proporțional cu

(3)

Cu toate acestea, Kc este dificil de estimat, pentru că sunt implicați mulți parametrii în controlul acestuia. Determinarea Kc este chiar mai dificilă din datele exacte colectate de sistemul de achiziție al sistemului cromatografic, deoarece este anevoioasă determinarea exactă a φ.

Separarea cromatografică a enantiomerilor este cauzată de diferența de energie liberă Gibbs −∆R,S(∆G0) din asocierea diastereomerică la echilibru între selectorul chiral și solut și este, deci, termodinamică în natura ei. Trebuie subliniat și faptul că este necesară o cinetică rapidă pentru o separare eficientă a enantiomerilor.

Ecuația Gibbs-Helmholtz se poate scrie, după cum urmează:

(4)

unde R se referă în mod arbitrar la cel de-al doilea enantiomer eluat și S la primul enantiomer eluat, iar α este enantioselectivitatea.

Termenii entalpic și entropic au un efect opus în procesele de recunoaștere chirală. Termenul entropic nefavorabil apare în esență din pierderea gradului de libertate de către cel mai reținut enantiomer.

Temperatura dependentă de enantioselectivitatea α poate fi utilizată pentru a calcula parametrii Gibbs-Helmholtz ∆R,S(∆H) și ∆R,S(∆S) din recunoașterea chirală, în conformitate cu următoarea ecuație:

(5)

După cum este indicat de către aceste ecuații, atât factorul de retenție cât și cel de separare sunt controlați de către o contribuție entalpică, care scade cu creșterea temperaturii, precum și o contribuție entropică, care este independentă de temperatură. Selectivitatea este un compromis între diferențele de entalpie de legare enantiomerică și efectele entropice distructive. Termenul de entalpie este o funcție a ansamblului de interacțiuni între fiecare enantiomer și selectorul chiral. Prin reprezentarea grafică a ln(α), în funcție de 1/T, toate procesele care nu contribuie la discriminarea enantiomerică se anulează și graficul devine liniar, panta fiind diferența dintre entalpia de asociație a enantiomerilor cu faza staționară. Relația inversă liniară între lnα și temperatură demonstrează îmbunătățirea selectivității cu scăderea temperaturii. Există în plus o temperatură izocinetică (Tiso) unde −∆R,S(∆G0) = 0, datorită compensației entalpie/entropie. Cu toate acestea, au fost raportate multe efecte neobișnuite ale modificării temperaturii, iar relația van't Hoff poate fi nonlinear în cazul utilizării polizaharidelor ca selectori chirali [31].

În ciuda utilității sale, această procedură este rar utilizată în CSS. Prezența fazei de vapori și evaporarea asociată a fazei mobile exclude orice variație de temperatură. Cu toate acestea, se poate încerca scăderea temperaturii [1].

Selectori chirali în faza mobilă

Când un selector este încorporat în faza mobilă, retenția solutului este rezultatul interacțiunilor concurente ce au loc în fazele mobile și staționare. Valoarea Rf-ului este în mod evident între valoarea Rf0 fără selector chiral prezent și valoarea Rf∞-ului în momentul în care întreg solutul este prezent ca și complex solut-selector.

Utilizând factorul de retenție

(6)

cu

(7)

unde k0 este factorul de retenție al solutului fără selector în faza mobilă, iar k∞ este factorul de retenție când întreg solutul este prezent ca și complex solut-selector.

Ca un exemplu, ar putea fi ciclodextrinele (CD) utilizate în CSS ca aditivi în faza mobilă. Se poate scrie următorul echilibru, dacă complexarea apare în interiorul fazei mobile și presupunând că faza staționară este hidrofobă, iar molecula de solut (S) este neionizată:

(8)

În conformitate cu afinitatea CD-lor față de faza staționară, două procese sunt posibile: fie recunoaștere chirală în interiorul fazei mobile, fie formarea unei faze staționare chirale dinamice. Primul proces este implicat într-un sistem cu o fază staționară hidrofobă în care echilibrul (2) poate fi neglijat. Echilibrul în faza mobilă are loc după cum urmează:

(9)

și

(10)

Factorul de retenție este

(11)

unde φ este raportul de fază.

În ecuația de mai sus, K0 este neglijat. Această presupunere este valabilă din moment ce CD ca și un solut, nu sunt reținute pe o fază inversă C18. În plus, K1 poate fi de asemenea neglijat, fiindcă concentrația solutului este scăzută (cromatografie analitică). În acest mod,

(12)

și

(13)

unde k0 este factorul de retenție, fără CD în sistem.

Un neajuns al fazei mobile chirale este, de obicei, o selectivitate mai mică decât cea observată în cazul utilizării unei faze staționare chirale [1].

Stoechiometria complexării

Mulți complecși solut-selector rezultă dintr-o asociere 1:1. Cu toate acestea, unii complecși arată multiple stoichiometrii (a se vedea, de exemplu, 4-L-phenilalanilaminopiridina și acidul metacrilic sau terpen-α-CD).

În cazul general, de complex m:n solut-selector, avem:

(14)

Stoechiometria este determinată de o schimbare în echilibrul concentrației complexului, atunci când concentrația selectorului variază. Adăugarea selectorului în faza mobilă induce o schimbare în retenția solutului. Această metodă este folosită în cromatografia de lichide pe coloană, dar nu și în CSS. Măsurătorile RMN oferă o abordare mai rapidă a stoechiometriei, dar este nevoie de disponibilitatea solutului pur [1].

Mecanismele supramoleculare și de incluzie

Ciclodextrinele

Ciclodextrinele sunt produse sub acțiunea CD-glicozil-transferazei pe amidon. Ele sunt molecule oligozaharidice ciclice de glucoză legate în poziția α-(1,4). Cele care conțin șase, șapte, sau opt unități de glucoză (α-, β-, respectiv γ-CD, respectiv) sunt cele mai frecvente. Ciclodextrinele naturale se aseamănă cu un con trunchiat având o cavitate axială cu grupările hidroxil primare [în pozițiile C(6)] în jurul marginii mai înguste și cu grupările hidroxil secundare [în pozițiile C(2) și C(3)] pe marginea opusă mai largă (figura 14).

Fig. 14 Structura ciclodextrinelor și

câțiva complecși de incluziune a acestora cu arenele

Având în vedere densitatea mare de electroni de la perechile de electroni liberi ai oxigenului glicozidil, cavitatea internă a CD tinde să fie mai hidrofobă decât în exterior. Grupările 2- și 3-hidroxil de la marginea cavității sunt orientate spre exteriorul moleculei în sensul acelor de ceasornic și sunt responsabile pentru solubilitatea apoasă a oligozaharidelor. Adâncimea cavității este aceeași (7,8 Å) pentru toate CD. Ciclodextrinele prezintă numeroase centre chirale provenite de la unitățile de glucoză (fiecare unitate prezintă cinci centre asimetrice). De exemplu, β-CD dispune de 35 de centre diferite de chiralitate. Forma răsucită explică de ce CD oferă o gamă largă de abilități de recunoaștere.

Mecanismul de recunoaștere chirală a CD este destul de bine înțeles și se bazează pe mai multe fenomene. La început, fenomenul de incluziune s-a considerat a fi o interacțiune-cheie în recunoașterea chirală de către CD. Moleculele de dimensiuni mici generează de obicei complecși de incluziune 1:1, pe când cu molecule de dimensiuni mari se pot forma complecși 2:1. Cu toate acestea, datele obținute prin cromatografia de gaze și cele din separarea enantiomerilor cu ajutorul CD de dimensiuni diferite au dovedit că formarea complexului de incluziune poate să lipsească în unele cazuri. Recunoașterea chirală poate implica legături de hidrogen cu grupările hidroxil orientate spațial aflate pe marginea cavității [40-42]. Partea hidrofobă a solutului poate încăpea în cavitate în timp ce cealaltă parte a enantiomerului poate interacționa (sau nu) cu unități de glucoză la fel ca un șurub. Cu toate acestea, fenomenul de incluziune nu este întotdeauna singura interacțiune chirală necesară întrucât unii racemați au fost separați cu CD de diferite dimensiuni. CD își pot schimba distribuția spațială pentru a putea interacționa cu enantiomerii prin așa-numita "potrivire indusă".

Procesul de incluziune gazdă-oaspete implică și factori legați de solut, cum ar fi hidrofobicitatea și mărimea acestuia:

(15)

unde CD reprezintă ciclodextrina, S molecula oaspete (solutul) și CD-S complexul de incluziune.

Constanta de stabilitate este:

(16)

cu

(17)

unde KD este constanta de disociere.

Parametrii care influențează acest proces sunt după cum urmează:

interacțiunile van der Waals dintre jumătatea hidrofobă a moleculei de solut și cavitatea hidrofobă;

legăturile de hidrogen dintre grupările polare ale moleculei de solut și grupările hidroxil de pe CD;

eliminarea de molecule de apă din cavitate.

Dimensiunea moleculei de solut este de o importanță maximă. O moleculă de solut cu un inel fenil se potrivește în cavitatea unei α-CD destul de bine. O moleculă cu două inele fenil se potrivește în cavitatea β-CD iar pirenul sau moleculele cu raport lungime-lățime similar se potrivesc mai bine cu mărimea cavității γ-CD.

Procesul de complexare poate fi îmbunătățit prin utilizarea de CD modificate chimic. În plus, alchilarea sau acilarea parțială sau completă a hidroxililor poate crește, de asemenea, solubilitatea CD în faza mobilă organică.

Ciclodextrinele au fost mai întâi folosite ca aditivi în faza mobilă în CSS pentru a separa compușii izomerici. Mai târziu, ele au fost imobilizate sau fixate pe suporturi cromatografice, formând faze staționare chirale foarte eficiente. CD sunt bine adaptate pentru cromatografie întrucât:

procesul de incluziune este stereoselectiv și reversibil;

ele sunt stabile pe o gamă largă a pH-ului

ele nu absorb de obicei la lungimile de undă de detecție UV uzuale

cinetica de complexare este de aceeași mărime ca și difuzia.

De obicei, fazele staționare chirale cu CD fixate sunt utilizate în HPLC, în timp ce CD ca aditivi în faza mobilă sunt utilizate de cele mai multe ori în CSS. Separarea a doi enantiomeri depinde de concentrația de CD în faza mobilă și de valorile KD. K este o funcție hiperbolică a concentrației de CD. Graficul 1/k în funcție de [CD] este liniar, cu o pantă de 1/KDk0. Enantiomerul care formează cel mai puțin stabil complex va fi reținut preferențial. [1]

Fazele staționare chirale

Plăci cu silicagel impregnate ex tempore în laborator

Silicagelul este de departe cel mai frecvent utilizat material în CSS, și de obicei, în cazul utilizării silicagelului ca atare, fără modificări, mecanismul de separare este adsorbția în fază normală. Proprietățile tipice ale silicagelului utilizat în CSS clasică sunt: (a) o grupare silanol (Si – O – H) de suprafață cca. 8 μmol/m2 și cu diametrul porilor de 4, 6, 8, și 10 nm; (b) volumul specific al porilor 0,5-2,0 mL/g; și (c) suprafețe specifice cuprinse între 200-800 m2/g. Silicagelul utilizat pe scară largă în CSS clasică este cel cu diametrul porilor de 6 nm (60 Å). Grupările siloxan (Si – O – Si) pot fi, de asemenea, expuse la suprafața particulelor de silicagel, dar ele nu reprezintă centri de adsorbție-activă. Centrii activi de silanol în schimb, pot să difere ușor în funcție de natura acestora: izolați, vicinali sau geminali. Plăcile CSS de înaltă performanță (HPTLC) (10 × 10 sau 10 x 20 cm) sunt realizate cu adsorbanți cu pori mici și o distribuție a particulelor redusă. Totodată ele prezintă o dimensiune medie a particulelor de 2-10 μm față de 5,17 μm în cazul plăcilor CSS clasice de 20 × 20 cm (valori pentru plăcile cromatografice comerciale Macherey-Nagel, Germania). Grosimea stratului este, de obicei, de 100-200 μm pentru plăcile CSS de înaltă performanță, comparativ cu 250 μm pentru cele CSS clasice.

Stratul de adsorbant în cazul plăcilor CSS de înaltă performanță este mai eficientă, conducând la zone de separare (spoturi) mai înguste, la o rezoluție mai bună și la o detecție mai sensibilă. Rezistența fluxului este mai mare (timp de migrare/cm este mai mic), dar timpul global de developare este mai scurt deoarece în cazul utilizării plăcilor CSS de înaltă performanță distanțele de migrare sunt mai mici, comparativ cu CSS clasică (de obicei 3-8 cm față de 10-16 cm). Lianții utilizați de către producători pentru plăcile comerciale preacoperite sunt, de obicei, compuși organici polimerici înrudiți cu alcoolul polivinilic, polivinil pirolidona sau compuși similari. Plăcile cu silicagel G conțin ca și ligand gips anorganic (sulfat semihidratat de calciu).

Impregnarea straturilor cu un selector chiral în vederea utilizării pentru separări enantiomerice, a fost de obicei efectuată prin amestecarea acestuia cu silicagelul, iar peste amestecul solid s-a adăugat o cantitate bine determinată de apă. Suspensia astfel formată se omogenizează mecanic cu ajutorul unui mixer și este depusă cu un dispozitiv manual într-un strat cu grosimea bine controlată pe un suport de sticlă. Plăcile astfel obținute au fost lăsate la temperatura camerei până ce marea parte a apei s-a evaporat, după care acestea au fost introduse într-o etuvă la o temperatură dată până la uscarea completă. De exemplu, Bhushan și Martens [18] au raportat folosirea acestei metode pentru pregătirea plăcilor cromatografice modificate cu selectori chirali, cum ar fi acid (+)-tartric sau acid (+)-ascorbic, eritromicină, vancomicină, L-lizină, L-arginina și (-)-brucină. Utilizarea plăcilor comerciale preacoperite cu silicagel și impregnate ulterior cu un selector chiral a fost mult mai puțin frecventă. Separări chirale îmbunătățite au fost realizate pentru (+/-)- ibuprofen și propranolol pe plăci cromatografice comerciale cu silica gel TLC 60F (strat de 0,25 mm), impregnate cu o soluție de 3 × 10-2 M L-arginină, comparativ cu adiția directă a L-argininei în suspensia de silica gel înainte de depunerea stratului adsorbant pe plăcile de sticlă [1]. Diferența valorilor Rf a fost de 0,03 unități pentru developarea unidimensională și de 0,07 pentru developarea bidimensională folosind plăci comerciale impregnate.

Enantiomerii ai (+/-)-tartratului de metoprolol au fost separați pe plăci de silicagel 60F utilizând ca și selector chiral acidul D-(-)-tartric (soluție 11,6 mM) atât impregnat în stratul cromatografic cât și ca aditivi în faza mobilă. Faza mobilă a fost reprezentată de etanol / apă (70:30, v/v), iar temperatura de developare a fost de 25 oC. Stratul a fost impregnat la temperatura ambiantă, timp de 90 de minute înainte de aplicarea probei. Zonele separate au fost detectate prin: vizualizare sub lampă UV la 254 nm, scanare fotodensitometrică la 230 nm și expunerea la vapori de iod. Valorile Rf au fost de 0,65 și 0,50 pentru enantiomerii S-(-) și respectiv R-(+) [19].

Enantioseparări prin cromatografie planară folosind faze staționare chirale necomerciale

Până în prezent, numeroase faze staționare chirale (CSP) au fost utilizate pentru separarea directă a izomerilor optici prin cromatografia planară, așa cum a fost raportat în diverse recenzii publicate în ultimii 10 ani [1-3].

Cu toate acestea, doar câteva faze staționare (ex. triacetat de celuloză și celuloză) au ajuns să fie comercializate, ca și plăci preacoperite, din cauza costurilor ridicate a celor mai mulți adsorbanți chirali și dificultatea de a detecta analiții pe aceste faze staționare, ele prezentând o puternică adsorbanță în timpul expunerii la lumină UV.

Utilizarea plăcilor comerciale ar trebui să fie preferată față cea a plăcilor preparate ex tempore în laborator, pentru că primele oferă o mai bună reproductibilitate și nu au nevoie de tratamente sau operații suplimentare. Cu toate acestea, aceste plăci ar putea prezenta o versatilitate redusă datorită naturii sau compoziției eluentului sau datorită unor adsorbanții chirali cu enantioselectivitate mică. Luând în considerare toate aceste motive, plăcile necomerciale sunt utile pentru a rezolva amestecurile racemice, care altfel nu ar fi rezolvate de către această tehnică, pentru a înțelege mai bine mecanismele enantiorezoluției adsorbanților chirali, în diferite condiții experimentale [1].

Diverse tipuri de faze staționare chirale

Cele mai populare faze staționare chirale (CSP) folosite sunt polizaharide, ciclodextrine, antibiotice glicopeptidice macrociclice, tipuri Pirkle, proteine, schimbători de liganzi și pe bază de coroană de eteri. Au mai fost raportate separări ale unor amestecuri de compuși racemici folosind și alte CSP conținând diferite molecule chirale sau polimeri, cum ar fi: alcaloizi, amide, amine, acizi sau polimeri sintetici. Aceste CSP s-au dovedit a fi foarte utile pentru rezoluțiile chirale din cauza unor cerințe specifice. Mai mult decât atât, rezoluția chirală poate fi prezisă în cazul CSP obținute prin tehnici de imprimare moleculară.

Faze staționare chirale de tipul aminelor și amidelor

Multe din moleculele chirale care conțin grupări amidice au fost impregnate pe un suport solid în vederea preparării de CSP [16-19]. Compușii racemici ce se pot separa pe aceste CSP includ α-hidroxicarbonili, ß-hidroxicarbonili, aminoacizi, amino-alcooli, amine și derivați de diol. Faza chirală preliminară ce conține o diamidă [(N-formil-L-valil) aminopropil) silicagel] este eficientă în separarea racemicului de esteri N-acilați ai aminoacizilor, dar nu și pentru alte tipuri de enantiomeri [16]. Cea mai mare parte a eluenților folosiți cu aceste CSP sunt cei folosiți în mod normal, incluzând aici n-hexan, 2-propanol, solvenți organici clorurați și acetonitril.

Allenmark și colab. [20] a pregătit o fază staționară chirală conținând diamida acidului N, N-dialil-(R,R)-tartric ca și monomer chiral. Acești monomeri au fost imoblizați cu ajutorul unor hidrosilani multifuncționali, obținând o rețea de polimer care a fost utilizată pentru separarea chirală a amino-alcoolilor, profenilor, ß-blocantelor, benzodiazepinelor și benzotiadiazinelor.

Mecanismele de recunoaștere chirală

Așa cum s-a discutat mai devreme, diversele tipuri de CSP conțin diferite tipuri de structuri constituite din diferite grupări și atomi. Există doar câteva articole care se ocupă cu determinarea mecanismelor de recunoaștere chirală cu privire la aceste CSP. Cu toate acestea, Allenmark și colab. [20] au încercat să explice mecanismele de recunoaștere chirală pentru separarea amino-alcoolilor, profenilor, ß-blocantelor, benzodiazepinelor și benzotiadiazinelor pe faze staționare modificate cu diamida acidului N, N-dialil-(R, R)-tartric. Autorii au raportat existența diferitelor tipuri de interacțiuni, cum ar fi: legături de hidrogen, interacțiuni dipol-dipol și complecși de transfer de sarcină între CSP și racemic. Într-un alt studiu, Franco și colab. [7] au sintetizat nouă noi dimeri de carbamați de chinină pe care i-au imobilizat pe silicagel. Mecanismele de recunoaștere chirală au fost evidențiate folosind spectroscopia în infraroșu cu transformanta Fourier (FT-IR) și analiza cu raze X, observându-se că legăturile de hidrogen și interacțiunile π-π sunt responsabile pentru separarea chirală.

Prin urmare, recunoașterea chirală pe aceste CSP depinde atât de structura CSP cât și de compușii racemici. Separările chirale sunt controlate de către diferite tipuri de forțe și interacțiuni, cum ar fi legături de hidrogen, interacțiuni π-π, formarea de complecși de transfer de sarcină și de incluziune, interacțiuni dipol și forțe sterice. De asemenea și interacțiunile slabe joacă un rol crucial în cazul enantioseparărilor pe aceste faze staționare chirale, cum ar fi forțele van der Waals și legăturile coordinative. Prezența unei funcțiuni chirale pe CSP este esențială, oferind mediul chiral necesar separării compușilor racemici. Enantiomerii interacționează cu funcțiunea chirală în mod diferit, iar complecși rezultați sunt stabilizați prin forțele mai sus citate, prezentând valori diferite a energiilor de legare. Ca urmare a fluxului de fază mobilă, cei doi enantiomeri eluează la timpi diferiți de retenție și în consecință, se produce separarea chirală [4].

Partea experimentală

Într-o primă etapă, s-a urmărit reproducerea protocolului de separare chirală a colchicinei descrisă de către Bhushan [5], pentru a putea confirma sinteza amestecului racemic al protoalcaloidului. Separarea s-a realizat prin cromatografie pe strat subțire impregnând materialul adsorbant cu un selector chiral potrivit. Pentru separarea colchicinei autorii au folosit ca și selector chiral acidul L-aspartic. Acesta a fost încorporat în faza staționară, reprezentată de silicagel G, în momentul preparării stratului adsorbant, într-o concentrație de 0,3 g% (m/m). După depunerea manuală a fazei staționare modificate, plăcile astfel preparate au fost uscate peste noapte la temperatura de 60°C. Soluția racemicului colchicinei a fost preparată în etanol, în concentrație de 10-4M, fiind apoi aplicată cu ajutorul unei seringi Hamilton, o cantitate de 500 ng colchicină. Developarea s-a realizat la 0°C, timp de 3,5 ore, într-o cameră de sticlă rectangulară ce a fost în prealabil preechilibrată cu amestecul de solvenți timp de 10-15 min, folosind o fâșie de hârtie de filtru. Faza mobilă utilizată a fost reprezentată de n-butanol : cloroform : acid acetic : apă într-un raport de 3 : 6 : 4 : 1 (v/v). Spoturile au fost vizualizate prin expunere la vapori de iod. Colchicina standard naturală și izomerul corespunzător (-) din amestecul racemic au prezentat un Rf de 0,7, iar izomerul (+) al colchicinei din amestecul racemic 0,65. Experimentele s-au derulat la diferite temperaturi, cuprinse între 0°C și 28°C, însă interesant a fost faptul că separarea a avut loc numai în jurul valorii de 0°C. Acest fapt indică o contribuție entalpică puternică în interacțiunea dintre selectorul chiral și enantiomerii colchicinei, temperatura, în acest caz, fiind un factor decisiv în realizarea cu succes a enantioseparării. Faza mobilă a rămas omogenă până la temperaturi de -5oC, cel mai probabil datorită faptului că temperatura scăzută ajută echilibrarea și împiedică evaporarea.

Mecanismul separării propus de autori se bazează pe interacțiuni puternice, de natură electrostatică ion-ion, dintre enantiomeri și selectorul chiral. Acidul aspartic are un pI de 3,01 și este anionic peste acest punct. Din moment ce pH-ul amestecului de solvenți este de asemenea mai mare de 3,0, se consideră că are loc formarea diastereoizomerilor între acidul aspartic optic pur (forma anionică) și componenții amestecului racemic al protoalcaloidului care există sub formă cationică.

Separarea chirală observată este de fapt rezultatul separării celor doi diastereizomeri: acidul L-aspartic – (-)-colchicina și acidul (L)-aspartic – (+)-colchicina.

În laboratorul nostru s-a urmărit atât reproducerea condițiilor din articolul descris mai sus, cât și îmbunătățirea separării chirale prin: folosirea unor plăci HPTLC, modificarea plăcilor comerciale prin impregnare și nu prepararea ex tempore a acestora pornind de la o suspensie de silicagel, compararea separării orizontale cu cea verticală, folosirea altor selectori chirali, aplicarea probelor în bandă cu ajutorul unui aplicator automat de probe.

folosirea unor plăci HPTLC

Așa cum cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) a crescut prin îmbunătățirea coloanelor cromatografice, cromatografia în strat subțire de înaltă performanță (CSS de înaltă performanță) a crescut prin îmbunătățirea calității adsorbanților și reproductibilității plăcilor cromatografice produse, prin utilizarea de tehnici și echipamente optimizate pentru aplicarea probelor, prin standardizarea developării plăcilor și a aplicațiilor de detecție, prin introducerea și perfecționarea evaluării fotodensitometrice și printr-o mai bună înțelegere a teoriilor cromatografice. Plăcile CSS de înaltă performanță (HPTLC) sunt caracterizate prin particule mici (<10 μm), straturi adsorbante subțiri (<150 μm) și plăci mai mici (distanța de developare <10 cm) (tabel 2). De asemenea, distribuția granulometrică a particulelor de adsorbant este mai mică decât pentru straturile CSS convenționale (figura 15). Plăcile HPTLC oferă o putere de separare mai bună pe unitatea de distanță, permite o developare mai rapidă și un consum mai redus de solvenți. Cu toate acestea, difuzia probei în direcția migrării trebuie să fie menținută la minim pentru a preveni extinderea benzilor, iar volumul de probă ce poate fi aplicat pe placa HPTLC este dictat de stratul subțire de adsorbant, acesta trebuind să fie menținut la maxim 1μL pe bandă aplicată [6].

Tabel 2 Caracteristicele plăcilor HPTLC față de cele CSS

Fig. 15 Compararea distribuției mărimei particulelor de silica gel utilizat

pe plăcile prefabricate de CSS și HPTLC

Fig. 16 Separare CSS (stânga) și separarea corespunzătoare din HPLC (dreapta)

Sunt disponibile materii prime identice atât pentru fazele staționare din CSS cât și pentru cele din HPLC, rezultând o selectivitate cromatografică echivalentă pentru ambele tehnici (figurile 16, 17).

Separările HPTLC și HPLC prezintă aceleași rezultate dacă cele două tehnici sunt aplicate în aceleași condiții cromatografice:

aceeași adsorbanți

aceleași faze mobile [7].

Fig. 17 Separarea unei probe reale (extract din salată) folosind CSS și HPLC în aceleași condiții. (Dinocap (1), Parathion (2), Iprodon (3),Mathylparathion (4), Metobromuron (5) and Dimethoat (6)) (Condițiile cromatografice:a) Placa HPTLC: HPTLC-Silica gel 60 RP-18 F254s b) Coloana: LiChroCART® LiChrospher® 100 RP-18) Faza mobilă: acetonitril/apă 70/30 [7].

Cele mai mici particule, similare ca mărime și calitate cu materialele din HPLC, dau o înălțime mai mică a talerelor teoretice (H) și, prin urmare, o mai mare eficiență. Cu toate acestea, acest lucru are loc numai în cazul în care plăcile nu sunt supraîncărcate cu probă, dimensiunea spoturilor este păstrată minim (în jur de 1.0 mm) iar placa este developată pe distanța minimă necesară separării complete (adesea doar 5 cm și rareori mai mult de 8 cm) [8].

Deoarece diferența între Rf-ul colchicinei (-) și Rf-ul colchicinei (+) este foarte mică (0,70 și respectiv 0,65) [5], este important să se utilizeze orice metodă de îmbunătățire a rezoluției separării enantiomerilor. În acest articol s-au folosit plăci de silicagel G preparate în laborator, cu o grosime a stratului de adsorbant de 0,5 mm. În laboratorul nostru au fost reproduse aceste plăci, dar au fost utilizate și altele ce oferă o mai bună separare. Vizualizarea spoturilor separate s-a realizat sub lampa UV, la lungimea de undă dictată de indicatorul de fluorescență încorporat în stratul adsorbant (254 sau 366 nm). Astfel, printre altele, au fost testate și plăcile HPTLC 5×10 cm Kieselgel 60 WRF254s 0,1 mm (Merck). În figura 18, se pot vedea comparativ performanțele separării cromatografice obținute pe plăci comerciale clasice, precum și cele obținute pe plăcile HPTLC.

Fig. 18 Cromatogramă realizată pe: A. placă HPTLC 5×10 cm Kieselgel 60 WRF254s 0,1 mm (Merck) (în stânga: colchicină standard Merck; la mijloc: colchicină racemic purificată prin recristalizare; în dreapta: colchicină racemic nerecristalizată) B. placă TLC 5×10 cm Alugram SIL G / UV 254 Mocherey-Nogel (în stânga: colchicină standard Merck, în dreapta: colchicină racemic).

Se pot vedea foarte clar diferențele între spoturile obținute pe cele două cromatograme. În cromatograma obținută pe placă HPTLC, spoturile derivaților colchicinei sunt mult mai bine separați comparativ cu cele de pe placa TLC. Distanța de migrare cât și timpul de separare la cromatograma HPTLC este mai mic decât cel din cromatograma TLC. Deoarece stratul de adsorbant de pe placa HPTLC este foarte subțire, s-a aplicat o cantitate mai mică de probă comparativ cu placa TLC. Din păcate nu se poate observa nici o separare a enantiomerilor, ceea ce poate însemna că, ori în cursul sintezei nu se formează racemic și astfel metoda ar trebui optimizată, ori va trebui ales un alt selector chiral sau vor trebui modificate condițiile de separare cromatografice.

modificarea plăcilor comerciale prin impregnare

Impregnarea selectorului chiral în faza staționară se poate realiza în două feluri:

Impregnare înaintea acoperirii plăcilor

În această procedură, suspensia de silicagel care este utilizată în mod normal la prepararea stratului adsorbant este amestecată cu un modificator potrivit (în cazul nostru un selector chiral). De obicei se utilizează în acest tip de impregnare soluții tampon, reactivi de complexare, acizi, baze, săruri sau compuși organici solubili în apă. După ce a fost pregătită suspensia modificată, aceasta poate fi aplicată într-o grosime bine controlată (deobicei 200 m) pe placa de sticlă în modul obișnuit, cu ajutorul unui aplicator manual Desaga (Germania) sau Camag (Elvetia). Tehnica este limitată la agenții solubili în apă. Pentru că pregătirea plăcilor TLC în laborator este acum rar realizată, aceasta nu este o tehnică foarte populară.

Impregnarea plăcilor comerciale

Acest lucru se poate face în trei moduri:

Imersarea plăcii pre-acoperite în soluția agentului de impregnare (de obicei 5-10%) dizolvat într-un solvent adecvat, volatil. Majoritatea solventul este evaporat la temperatura mediului ambiant, urmată de evaporarea completă la o temperatură crescută.

Pulverizarea unei soluții a reactivului de impregnare pe placa cromatografică, urmată de evaporarea solventului conform protocolului descris mai sus.

Developarea plăcii TLC într-o camera cromatografică folosind soluția de reactivului de impregnare ca și solvent de developare. Migrarea are loc până când frontul solventului a ajuns la partea de sus a plăcii, menținând placa încă o perioadă suplimentară de timp, pentru ca frontul ”real” al solventului să ajungă la partea superioară al adsorbantului. Solventul este apoi eliminat conform protocolului descris mai sus [8].

Impregnarea plăcilor comerciale s-a realizat cu ajutorul unui pulverizator Desaga Sprayer SG1 (Germania) (figura 19). Acesta generează un jet de aerosol ultrafin, cu diametru picăturii de 15-20 μm.

Fig. 19 Pulverizator Desaga SG1

compararea separării orizontale cu cea verticală

Cromatografia planară diferă de toate celelalte tehnici lichid-cromatografice prin faptul că există o fază gazoasă în plus, față de fazele staționară și mobilă. Această fază gazoasă (vaporii solvenților din componența fazei mobile) poate influența semnificativ rezultatul obținut în urma separării.

Modul "clasic" de developare a unei cromatograme este de a pune placa într-o cameră care conține o cantitate suficientă de solvent de developare. Partea inferioară a plăcii trebuie imersată doar câțiva milimetri. Cu ajutorul capilarității solventul urcă pe stratul adsorbant până când distanța dorită este atinsă și developarea este întreruptă.

În cazul în care camera este bine închisă, au loc patru procese parțial concurente (figura 20):

Echilibrul stabilit între componentele solventului de developare și faza de vapori a solventului (1). În funcție de presiunea de vapori a componentelor individuale, compoziția fazei gazoase poate diferi semnificativ de compoziția solventului de developare.

În zona plăcii unde faza staționară este încă uscată, aceasta adsoarbe molecule din faza gazoasă. Acest proces se apropie de un echilibru numit saturație adsorptivă. Astfel, în special componentele polare ale fazei mobile vor fi scoase din faza gazoasă și adsorbite pe suprafața fazei staționare.

Fig. 20 Procesele ce au loc într-o cameră de developare

Cu excepția eluenților monocomponent (solvenți puri), solvenții de developare și faza mobilă sunt, strict vorbind, diferiți. Compoziția lor se modifică pe măsură ce cromatografia progresează. Din păcate, termenii de "solvent de developare" și "fază mobilă" sunt adesea folosiți ca sinonime. În adevăratul sens al cuvântului, numai lichidul din camera de developare ar trebui să fie numit solvent de developare, în timp ce lichidul care se deplasează prin faza staționară constituie faza mobilă. Componența solventului de developare este cunoscută numai în momentul în care acesta este plasat în cameră.

Procesele (1) și (2) pot fi afectate experimental de către:

• inserarea în camera cromatografică mai multă sau mai puțină hârtie de filtru îmbibată în solvent de developare;

• așteptarea unei anumite perioade de timp între introducerea solventului de developare în cameră și începutul cromatografiei – saturarea camerei;

• interacțiunea dintre placă și faza gazoasă înainte de a începe developarea, adică fără contact cu solventul de developare – precondiționare.

O interacțiune în conformitate cu procesele (2) și (3) poate fi împiedicată în mod eficient prin plasarea unei contra-plăci, la o distanță de unul sau câțiva milimetri de stratul cromatografic. Aceasta se numește "configurație Sandwich".

Cu cât echilibrul (1) și/sau (2) (figura 20) se stabilește mai repede și cu cât mai puțin diferite sunt componentele fazei mobile în ceea ce privește comportamentul lor de adsorbție, cu atât mai puțin pronunțată este formarea de fronturi secundare rezultate din procesul (4). În camerele saturate și pe straturile cromatografice precondiționate, fronturile secundare de multe ori nu sunt observate. În configurațiile sandwich și, în special în cromatografia planară cu suprapresiune (Overpressure Layer Chromatography – OPLC), fronturile secundare sunt foarte proeminente.

În timpul cromatografiei, componentele solventului de developare, care au fost adsorbite pe stratul uscat din faza gazoasă, (procesul (2), figura 20), sunt împinse înainte de frontul invizibil dar existent de solvent. Excepțiile sunt componentele foarte polare, cum ar fi apa, metanolul, acizii sau bazele. Acest lucru duce la valori ale Rf-ului mai mici în camerele saturate și, în special, pe straturile precondiționate față de cele obținute în camerele nesaturate și în configurațiile sandwich. Nu există nici camere „bune”, nici camere „rele”! Cu toate acestea, în unele camere parametrii pot fi mai bine controlați și astfel și mai bine reproduși, decât în altele.

Fig. 21 Componentele unei camere de developare orizontale.

1- placă HPTLC (cu fața în jos); 2- placă de sticlă pentru configurația sandwich; 3- rezervorul pentru solventul de developare; 4- placă de sticlă foarte subțire pentru transferul eluentului pe placa cromatografică; 5- placă de acoperire; 6- compartimentul de condiționare.

Principiul camerei de developare orizontale (figura 21):

Placa HPTLC este plasată în camera cromatografică cu fața în jos. Rezervorul (3), figura 21, este umplut cu solvent de developare – placa poate fi developată orizontal fie numai dintr-o parte, sau simultan din cele două părți opuse, în acest mod dublându-se numărul de probe per placă. Cromatografia este începută când placa de sticlă subțire (4), figura 21, este adusă în pozitție verticală [9].

În laboratorul nostru s-a încercat separarea amestecului racemic atât în cameră de developare verticală Desaga cu fund plat (figura 22), cât și în cameră orizontală Camag 10×10 cm (figura 23). S-a observat avantajul pe care îl oferă camera de developare orizontală față de cea verticală, prin faptul că benzile colchicinei și a derivaților acesteia sunt mai bine separate și prezintă o difuzie mai redusă. Astfel, în cazul separării enantiomerice este esențial să se folosească orice posibilitate de distanțare a benzilor enantiomerilor de colchicină, pentru o diferențiere cât mai clară a acestora.

Fig. 22 Camere de developare verticale cu fund plat

Fig. 23 Camere de developare orizontale pentru plăci 10×10 cm sau 20×10 cm CAMAG (Elveția)

folosirea altor selectori chirali

Prin cromatografia în strat subțire, pe lângă acidul L-aspartic, s-au testat și următoarele substanțe ca și selectori chirali: acidul (+)-1S-camfor-10-sulfonic, acidul (-)-1R-camfor-10-sulfonic, acidul (-)-ascorbic, acid (-)-o-ditoluoil tartric, acid (+)-p-ditoluoil tartric, ß-ciclodextrina, γ-ciclodextrina, hidroxipropil-ß-ciclodextrina (figura 24).

Fig. 24 Selectorii chirali utilizați în separarea racemicului colchicinei

A. acidul (+)-1-S-camfor-10-sulfonic B. acidul (-)-1-R-camfor-10-sulfonic C. acid (-)-o-ditoluoil tartric D. acid (+)-p-ditoluoil tartric E. ß-ciclodextrina

F. γ-ciclodextrina G. Hidroxipropil-ß-ciclodextrina

Folosirea acizilor (+)-1S-camfor-10-sulfonic, (-)-1R-camfor-10-sulfonic, (-)-o-ditoluoil tartric, (+)-p-ditoluoil tartric, s-a bazat pe informațiile extrase din unele articole care descriu separarea unor produși înrudiți chimic ai colchicinei folosind acești compuși ca și selectori chirali (cel mai probabil prin metoda diastereizomerilor) [10]. Astfel, se dorește impregnarea plăcilor TLC cu acești compuși și s-a încercat separarea aceluiași amestec racemic sintetizat [11]. Ciclodextrinele sunt compuși utilizați cu mare succes în separările chirale a unei game foarte largi de substanțe medicamentoase, mai ales prin tehnici electroforetice capilare (CE). Câțiva reprezentanți ai ciclodextrinelor au fost investigate de către noi ca selectori chirali și prin cromatografia pe strat subțire.

Singurul selector chiral menționat în literatură care poate realiza separarea enantiomerilor de colchicină este acidul L-aspartic [5]. Pentru a confirma obținerea racemicului colchicinei s-a încercat enantiosepararea acestuia prin CSS.

Fig. 25 Cromatogramele enantioseparării racemicului de colchicină utilizând ca și selector chiral acidul L-aspartic.

A. placă HPTLC 5×10 cm Kieselgel 60 WRF254s, 0,1 mm; impregnată cu acidul L-aspartic; B. TLC 5×10 cm Alugram SIL G / UV 254 Mocherey-Nagel impregnată cu acid L-aspartic; camera cromatografică: Desaga tip N 10×10 cm; F.M.: n-butanol:cloroform:acid acetic:apă 3:6:4:1 v/v; temperatura: 0-2°C.

Din păcate, nu s-a observat separarea enantiomerilor protoalcaloidului folosind ca și selector chiral acidul L-aspartic în condițiile menționate (figura 25).

Principalele cauze ar putea fi:

fie în urma sintezei efectuate nu a avut loc transformarea izomerului natural (-) al colchicinei în izomerul (+), deși s-a încercat adaptarea și optimizarea sintezei descrise de Artur Bladé-Font în anul 1977 [11] prin realizarea sa la diferite temperaturi, atât în cataliză acidă, cât și bazică;

fie acidul L-aspartic nu este capabil să realizeze de fapt separarea enantiomerilor, ceea ce contravine cu datele din literatură [5].

Acizii (+)-1-S-camfor-10-sulfonic, (-)-1-R-camfor-10-sulfonic, (-)-o-ditoluoil tartric, (+)-p-ditoluoil tartric nu oferă nici un avantaj asupra separării enantiomerice, cel mai probabil din cauza lipsei unei interacțiuni specifice cu enantiomerii colchicinei (figura 26).

Fig. 26 Separarea amestecului racemic de colchicină; selectori chirali: A. impregnată cu L-acid aspartic; B. impregnată cu acid (-)-o-ditoluoil tartric

(placă TLC 5×10 cm Kieselgel 60 impregnarea s-a realizat cu un pulverizator Desaga SG1, developare verticală în cameră Desaga tip N 10x10cm, saturare cu vapori 15 min, temperatura 0-2°C, în stânga: colchicină standard Merck, la mijloc: colchicină racemic recristalizat, la dreapta: colchicină racemic nerecristalizat).

Literatura menționează interacțiunea ß-ciclodextrinei cu colchicina, fapt exploatat în creșterea stabilității la lumină a preparatelor farmaceutice cu acest protoalcaloid [12]. În lumina acestor informații și în speranța formării unor complecși cu stabilitate termodinamică diferită între enantiomerii colchicinei și ciclodextrinele studiate, s-a investigat utilitatea unor derivați de ciclodextrine (ß-ciclodextrina, hidroxipropil-ß-ciclodextrina, γ-ciclodextrina) ca și selectori chirali atât prin cromatografie pe strat subțire (figura 27) cât și prin electroforeză capilară în fază apoasă și neapoasă.

Fig. 27 Studiul interacțiunii colchicinei cu ß-ciclodextrina prin HPTLC.

(1-soluție standard colchicină+apă distilată; 2-soluție standard colchicină+soluție ß-ciclodextrină; 3-soluție amestec racemic+apă distilată; 4-soluție amestec racemic+soluție ß-ciclodextrină; placă: HPTLC 5×10 cm Kieselgel 60 WRF254s 0,1 mm; F.M.: n-butanol:cloroform:acid acetic: apă 3:6:4:1 v/v; camera cromatografică: Desaga 10×10 tip N; temperatura: 0-2°C; aplicare cu aplicator automat Desaga AS 30).

Din păcate nici în urma acestor studii CSS nu s-au obținut rezultate concludente care sa confirme o interacțiune benefică între enantiomerii colchicinei și ß-ciclodextrina în sensul obținerii unei separări chirale. Posibilele cauze ale nereușitei ramân cele menționate la acidul L-aspartic.

aplicarea probelor cu un aplicator automat

Prepararea adecvată a probei și aplicarea atentă a acesteia pe placa TLC sau HPTLC sunt imperios necesare pentru buna separare cromatografică. Frecvent, pentru separările proaste sunt învinuite în primul rând calitatea stratului adsorbant sau tehnica analitică, decât modul în care proba a fost prelucrată sau aplicată pe suprafața adsorbantului. Fără atenție la detalii, pot fi ușor aleși solvenți incorecți rezultând spoturi sau benzi mari și/sau neregulate. Dispozitivele de aplicare, cum ar fi pipetele, capilarele, etc. pot deteriora stratul de adsorbant în timpul aplicării spoturilor sau benzilor. Aplicarea benzii poate fi neuniformă și cu variații de concentrație a analitului de-a lungul ei, ceea ce poate genera spoturi duble în urma separării cromatografice.

Deteriorarea stratului poate apărea atunci când capilarele de sticlă ascuțite, ciobite sau seringile înțeapă sau zgârie suprafața stratului de adsorbant pe măsură ce proba este în curs de aplicare. Acest fenomen este accentuat în cazul aplicărilor multiple, în același loc, mai ales în cazul unei uscări insuficiente a stratului, care fiind impregnată de un solvent este mult mai moale. Ca regulă generală, cu cât e mai polar solventul utilizat, cu atât mai ușor se produc daune. În astfel de cazuri de deteriorare a adsorbantului (gaură în stratul de adsorbant), proba se concentrează circular în jurul zonei afectate, iar în urma developării, zonele cromatografice de multe ori apar triunghiulare sau, uneori, în formă de semilună.

De multe ori, rezultatele unor astfel de evenimente nedorite, cum ar fi supraîncărcările de probă, nu sunt întotdeauna evidente imediat. Acestea devin observabile doar în cursul developării cromatogramei, observându-se de obicei, forme specifice cu benzi alungite și subțiri sub zona probei (figura 28).

Fig. 28 Efectele aplicării incorecte a probei pe stratul de adsorbant

Metode de aplicare ale probei

Aplicarea probei pe stratul de adsorbant se poate face manual, cu o instrumentațíe foarte simplă sau automată, folosind echipamente instrumentale sofisticate. Ca regulă generală, cu cât este mai precisă poziționarea sistemului de livrare și rata de livrare, cu atât de mai încredere vor fi în final rezultatele cromatografice. Instrumentele de aplicare parțial și complet automatizate sunt disponibile comercial, îmbunătățind dramatic calitatea aplicării probelor.

Metode manuale

Cea mai simplă metodă de aplicare a soluției probei pe placa TLC este prin folosirea unei capilare de sticlă de volum cunoscut. O capilară de 1-2 µL va da un spot de aproximativ 3-4 mm. Capilare de sticlă calibrate sunt disponibile comercial, cum ar fi „Microcaps” (Drummond Scientific Co.) sau sistemul cu dozator de capilare (Camag). Ultimul are un set de capilare de volume curpinse între 0,5-5 mL cu reproductibilitate înaltă (˃0,25%) .

Microseringile oferă un volum de aplicare a probei variabil și este important ca acul microseringii să aibă un vârf drept. Ar fi preferabil ca acul să fie acoperit cu politetrafluoroetilenă (PTFE) pentru a se evita distrugerea stratului de adsorbant. Toate aceste dispozitive de aplicare a probelor trebuie să fie ținute vertical, iar proba trebuie administrată la o rată de curgere controlată într-o singură aplicare.

Aplicarea de benzi cu tehnicile manuale este aproape imposibilă fără distrugerea stratului adsorbant. Este de asemenea foarte greu de obținut o concentrație uniformă de-alungul lungimii și lățimii benzii.

Tehnicile automate

Echipamentul automat poate fi folosit la aplicarea probei în spoturi sau benzi. Echipamentul poate varia de la semi-automat până la un sistem robotizat complet controlat de un calculator, toate setările fiind introduse prin intermediul unui program.

Figura 30 Aplicator automat Desaga AS 30

Pentru determinări cantitative corecte ale analiților sunt recomandate astfel de echipamente. Deși un anumit grad de precizie se poate asigura și prin aplicații manuale, (aproximativ 1-2% abatere standard relativă), aplicările automate ale spoturilor și benzilor conferă o excelentă reproductibilitate și separări cuantificabile, de încredere. Echipamentele automate permit aplicarea probelor în benzi foarte înguste pe măsură ce seringa trece pe o lungime pre-determinată de-alungul plăcii cromatografice, cu o viteză constantă, livrând un volum de probă prestabilită prin pulverizare cu ajutorul unui gaz (aer sau azot comprimat) – tehnica spray-on (figura 30). Un flux constant de gaze asigură atât o aplicare într-o bandă foarte subțire cât și uscarea rapidă a benzii, dacă se folosesc solvenți volatili. În acest fel, suprafața stratului cromatografic nu intră în contact cu seringa. O astfel de aplicare automatizată a 1-20 l conduce la o bandă extrem de subțire, cu difuzare foarte redusă a probei. Echipamentul poate fi cel mai bine descris ca fiind semi-automat, întrucât seringa este curățată și reumplută cu fiecare soluție de probă manual.

Pentru sistemele complet automatizate, programe de aplicare a probelor pot fi stocate pe un computer. Atât aplicarea benzilor cât și a spoturilor poate fi programată, alături de detalii cu privire la numărul, dimensiunea și poziția aplicării. Un exemplu al unui astfel de robot este sistemul prezentat în figura 31. Benzile sunt aplicate cu ajutorul unei tehnici spray-on într-un mod similar cu unitățile semi-automate. Spoturile pot fi aplicate fie prin această tehnică, fie prin transfer direct. Probele sunt preparate în flacoane cu dop, cu închidere etanșă. În conformitate cu programul pre-stabilit, brațul robotic se va muta de la flacon la flacon prin rotirea caruselului, aspirând soluția de analizat în seringa de aplicare. Între aplicări are loc spălarea acului de dozare a probelor cu ajutorul unor solvenți de spălare.

Fig. 31 Aplicator automat Desaga AS 30 cu autsampler.

[8]

Pentru a observa avantajul aplicării automate a probelor, s-a realizat comparația între aplicarea automată și cea manuală a probelor (figura 32). Aplicarea manuală s-a realizat cu ajutorul unei capilare de sticlă de volum cunoscut (5 µL, Desaga, Germania), iar cea automată s-a realizat cu ajutorul unui aplicator automat Desaga AS 30.

Fig. 32 Studiul comparativ al aplicării: A. manuale (placă TLC 5×10 cm Kieselgel 60) B. automate (placă TLC Alugram 5×10 cm Sil G / UV 254 Mocherey-Nogel; aplicator: Desaga AS30)

Se poate observa că spoturile de pe placa pe care s-au aplicat probele automat au difuzat mai puțin, sunt mai bine separate, iar linia aplicată este mult mai subțire și uniformă.

Electroforeza capilară

Noțiuni introductive

Electroforeza capilară (CE) este o familie de tehnici înrudite ce folosește capilare de calibru mic (20-200 μm d.i.) pentru a efectua separări de înaltă rezoluție atât a moleculelor cu masa moleculară mare cât și a celor cu masa moleculară mică. Separarea este realizată prin aplicarea unui voltaj ridicat care va genera un flux electroosmotic și electroforetic de soluție tampon și specii ionice, înăuntrul capilarei. Mecanismul separării și electroforegrama rezultată reprezintă oarecum o tranziție între electroforeza pe gel de poliacrilamidă (PAGE) clasică și cromatografia de înaltă performanță (HPLC) modernă [1].

Electroforeza, ca tehnică analitică, a fost introdusă prima dată de către Tiselius în 1930 (1). În lucrarea sa, el descrie separarea proteinelor plasmatice, adică albuminele, de cea a globulinelor α, ß și γ, folosind electroforeza. Pentru această muncă de pionerat, Tiselius a fost răsplătit cu premiul Nobel în 1948. De atunci, multe progrese s-au realizat în electroforeză, cum ar fi electroforeza pe hârtie și pe gel. De la sfârșitul anilor 1940 a fost folosită ca și suport pentru separarea compușilor ionizați cum ar fi: aminoacizii, lipidele, nucleotidele și zaharurile încărcate electric (2). Pentru a crește rezoluția separărilor, a fost introdusă electroforeza bidimensională prin schimbarea pH-ului tamponului: inițial, ca primă dimensiune se utilizează electroforeza la un anumit pH, apoi cea de-a doua dimensiune e reprezentată de electroforeza la alt pH.

În 1967, Hjertén (5) a arătat că este posibil să aibă loc separările electroforetice și într-un tub de sticlă de 300 μm iar detecția compușilor separați să se realizeze prin spectrofotometrie de absorbție în ultraviolet (UV) și a numit această tehnică electroforeză zonală liberă (free zone electrophoresis). Deși alți cercetători au folosit electroforeza în tuburi de sticlă, de teflon (6-8), acest tip de electroforeză a devenit populară doar după 1981 când Jorgenson și Lukacs (9) au publicat rezultatele lor și prin care au demonstrat marea capacitate de separare a electroforezei capilare zonale (CZE). Ansamblul instrumental de lucru simplu și eficient, care este baza a celor mai multe intrumente comerciale de pe piața de azi, a fost reprezentată dintr-o capilară de silice topită cu diametru intern îngust, mai mic de 100 μm, voltaj ridicat, 30 kV și detecție UV in situ (pe coloană) folosită pentru separarea speciilor ionice. În 1984, Terabe și colab. (10) au introdus cromatografia electrocinetică micelară (MEKC) pentru separarea compușilor neutri prin adăugarea miceliilor de SDS tamponului de lucru. În 1988, primul instrument comercial a fost lansat pe piață. De atunci, s-au realizat multe progrese și s-au demonstrat multe aplicații ale acestei tehnici de separare. O recenzie importantă despre aplicațiile electroforezei capilare (EC) în științele biologice a fost publicat de către Karger și colab. (11) în 1989 [2].

Terminologie

Electroforeza. Electroforeza este definită ca migrarea ionilor sub influența unui câmp electric. Forța (FE = qE) împărțită la câmpul electric este proporțională cu sarcina efectivă, q și cu puterea câmpului electric, E. Circulația translațională a ionilor este împiedicată de o forță de fricțiune (Ff = fep), care este proporțională cu viteza ionilor, ep, precum și cu coeficientul de frecare, f. Ionul ajunge la o viteză de echilibru aproape instantaneu, în care accelerația este egală cu forța de frecare.

(18)

Rearanjând ecuația (18):

(19)

Mobilitatea electroforetică a ionilor, (μep) este o constantă de proporționalitate între viteza ionilor și puterea câmpului electric. Mobilitatea electroforetică este proporțională cu sarcina ionilor și invers proporțională cu coeficientul de frecare.

Coeficientul de frecare al ionilor aflați în mișcare depinde de raza hidrodinamică, r a ionului și de vâscozitatea, a mediului înconjurător,

(20)

deoarece μep = q/f, o rază hidrodinamică mai mare se traduce într-o mai mică mobilitate electroforetică.

Electroosmoza. Electroosmoza se referă la deplasarea soluției tampon în tubul capilar sub influența câmpului electric. Suprafața interioară a unei capilare de siliciu topit este acoperită cu grupări silanol (Si-OH), care ionizează, la pH> 2. Suprafața încărcată negativ este contrabalansată de ioni pozitivi din soluția tampon, care formează așa-numitul strat dublu electric. Sub influența câmpului electric, ionii pozitivi din părțile difuze ale dublului strat migrează spre catod; în acest timp antrenează moleculele de apă din stratul de hidratare, ceea ce duce la formarea fluxului electroosmotic [3]. Principiul de formare al fluxului electro-osmotic (EOF) este ilustrat în figura 33. Acest mecanism de pompare a solventului controlat electric duce la un profil de curgere drept, în contrast cu cel laminar (parabolic) obținut cu ajutorul pompelor mecanice folosite în cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC).

Fig. 33 Principiul fluxului electroosmotic

Fluxul electro-osmotic este uniform pe întreaga capilară și nu depinde de proprietățile analiților. Toți analiții sunt uniform afectați de către EOF, iar acest proces nu contribuie la mecanismul de separare. Prin urmare, numai diferențele în viteza electroforetică sunt responsabile de separarea compușilor încărcați dintr-o capilară de silice topită, în prezența unui câmp electric aplicat. De fapt, EOF-ul este în detrimentul procesului de separare, pentru că transportă speciile încărcate pozitiv prin capilară mai repede, oferind astfel mai puțin timp pentru evidențierea diferențelor între vitezele electroforetice în vederea separării a două specii cu mobilități similare. Ordinea de migrare a probei prin capilară este după cum urmează: cationii > compușii neutri > anionii. Deoarece atât compușii cationici cât și cei anionici pot avea mobilități electroforetice diferite, ei pot fi astfel separați. Cu toate acestea, speciile neutre din punct de vedere electric sunt transportate prin capilară numai pe baza fluxului electro – osmotic, astfel încât acești compuși vor migra toți cu aceeași viteză și, prin urmare, nu pot fi separați prin electroforeză capilară (CE) [4].

Ecuațiile fluxului electroosmotic sunt identice cu cele dezvoltate pentru electroforeză, deoarece ambele fenomene sunt complementare. Viteza electroosmotică, eo este definită de

(21)

unde μeo este mobilitatea electroosmotică, o constantă de proporționalitate între viteza electroosmotică și forța câmpului electric. Mobilitatea electroosmotică este proporțională cu constanta dielectrică, , a mediului și cu potențialul zeta, , la interfața capilară-tampon și invers proporțională cu vâscozitatea mediului, .

(22)

Potențialul zeta depinde în mare măsură de natura electrostatică a suprafeței capilarei și, într-o mică măsură, de natura ionică a tamponului. În capilarele de siliciu topit, electroosmoza este diminuată la pH scăzut pentru că protonii transformă suprafața încărcată negativ (SiO-) la SiOH lipsit de sarcină, determinând o scădere a potențialului zeta. Electroosmoza scade odată cu creșterea concentrației ionice, din cauza colapsului dublului strat. Fluxul electroosmotic poate fi redus prin acoperirea capilarei cu un material care suprimă ionizarea grupărilor silanol, cum ar fi poliacrilamida sau metilceluloza.

Mobilitatea aparentă. Mobilitatea aparentă, μapp, a unui solut este un vector sumă de mobilități electroforetice, μep, a solutului plus mobilitatea electroosmotică, μeo, a soluției.

(23)

Viteza aparentă, app, a unui solut este direct proporțională cu μapp și tăria câmpului electric, E, de-alungul capilarei.

(24)

Analiții neutri migrează în aceeași direcție și au aceeași viteză de curgere ca și fluxul electroosmotic, fără să fie separați. Cationii și anionii sunt separați pe baza diferențelor de mobilitate aparentă. Pentru cationi, care circulă în aceeași direcție ca și fluxul electroosmotic, μep și μeo au același semn, deci μapp > μep. Electroforeza anionilor, pe de altă parte, este în direcția opusă electroosmozei, așa că pentru anioni μep și μeo au semne opuse. La valori moderate ale pH-ului (pH> 3), fluxul electroosmotic este, în general, mai mare decât fluxul electroforetic cauzând anionii să migreze spre catod, capătul la care se află de obicei detectorul. La pH mai mic, electroosmoza este slabă și anionii pot să nu ajungă la detector niciodată decât dacă polaritatea instrumentului este inversată, cu scopul de a schimba locația detectorului de la capătul catodic la capătul anodic al capilarei [3].

Aspecte generale ale instrumentației

Efectul de încălzire Joule. Problema principală a sistemului închis este că la aplicarea unei tensiuni ridicate, odată cu trecerea curentului prin soluția de electrolit, are loc generarea de căldură Joule. Căldura generată poate de multe ori cauza descompunerea probei, sau, mai frecvent, duce la o creștere a difuziei moleculare, care conduce la extinderea zonei împiedicând separarea între benzile adiacente. Prin urmare, pentru ca aceste experimente să poată fi conduse într-un format tubular, este necesar să se utilizeze tuburi capilare cu diametre de 100 µm sau mai puțin în cele mai multe cazuri. Pentru disiparea rapidă a căldurii generate, se recomandă utilizarea unor capilare de silice topită, similare cu cele dezvoltate pentru cromatografia de gaze, însă având un diametru intern mai mic. Un al doilea avantaj al capilarei de siliciu topit este faptul că se pretează pentru detecția on-line directă, deoarece este optic transparentă la radiațiile ultraviolete (UV) și la cele vizibile [4].

Energia termică produsă, H, este direct proporțională cu tensiunea aplicată între electrozi, V; I, curentul electric; și cu timpul, t.

(25)

Pereții capilarelor utilizate în EC pot disipa căldura mult mai eficient decât gelurile folosite în electroforeza convențională ca urmare a raportului mare dintre suprafață și volum. Drept urmare, se pot aplica tensiuni de separare înalte în electroforeza capilară, cu tehnologia de azi, putându-se aplica până la 30 kV, pentru separări extrem de rapide și eficiente.

Injectarea probei. Unul dintre principalele avantaje ale EC este capacitatea sa de a injecta volume extrem de mici de probă. Volumul injectat în mod obișnuit variază de la picolitri la nanolitri.

Există două metode de injectare folosite în EC: hidrodinamică și electrocinetică. Injectarea hidrodinamică se realizează prin aplicarea unei diferențe de presiune dintre cele două capete ale capilarei. Cantitatea de probă care poate fi injectată se calculează cu ajutorul ecuației Poiseuille,

(26)

unde, Vc este volumul calculat de injectare, P este diferența de presiune de la capetele capilarei, d este diametrul interior al capilarei, t este timpul de injectare, este vâscozitatea probei și Lt este lungimea totală a capilarei.

Injectarea electrocinetică se face prin simpla aplicare a tensiunii, pentru o anumită perioadă de timp. Numărul de moli de analit injectat, Qi, este determinat de viteza electroforetică aparentă a analitului, app; t timpul de injectare; și kb/ks raportul dintre conductivitățile tamponului de separare și probă.

(27)

Raza capilarei este reprezentată de r, iar Ci este concentrația molară a analitului i.

Pentru că analiți diferiți prezintă mobilități diferite, injecția electrocinetică este distorsionată. Pentru analize calitative, acest lucru nu este de obicei, o problemă. Pentru analize cantitative însă, concentrația probei injectate este diferită față de cea a probei originale. În ciuda acestui neajuns, injectarea electrocinetică este utilă pentru electroforeza capilară pe gel, în care polimerul din interiorul capilarei este prea vâscos pentru injectarea hidrodinamică.

Moduri de detecție. Cu unele modificări, cele mai multe moduri de detecție din HPLC pot fi aplicate la EC [3]. Tabelul 3 conține o listă de detectori frecvent utilizați în EC fiind prezentate și limitele lor de detecție (LODs) [4].

Tabel 3 Modurile de detecție din EC și limitele de detecție ale acestora

Descrierea aparaturii

Sursa de curent. Această parte alimentează cu tensiune înaltă sistemul. În general, experimentele se realizează în jurul valorii de 30 kV. Cele mai multe surse au și un ampermetru pentru măsurarea curentului ce trece prin sistem.

Electrozii. Aceste componente sunt în general niște fire tubulare de platină, servind ca punct de contact între lichid (soluția de tampon) și sursa de voltaj ridicat. Este de dorit un metal inert pentru a evita reacțiile electrochimice sau depunerile electrolitice excesive la suprafața electrodului, împiedicând trecerea curentului prin sistem.

Rezervoarele de tampon. Aceste recipiente conțin tamponul de lucru realizând un circuit electric complet prin capilară. Din cauza fluxului electro-osmotic, flacoanele folosesc de asemenea și la menținerea electroneutralității în sistem.

Capilara. Capilara este cea mai importantă parte din sistem, deoarece aici are loc separarea analiților [4]. Dioxidul de siliciu topit este de departe cel mai frecvent folosit material, deși coloanele au mai fost realizate și din teflon și din sticlă borosilicată. Utilizarea pe scară largă a silicei topite se datorează proprietăților sale intrinseci, care includ transparență pe o gamă largă a spectrului electromagnetic și o mare conductanță termică. Silicea topită este, de asemenea, ușor de fabricat în capilare cu diametru de câțiva micrometri. Multe rapoarte descriu atașarea covalentă de grupările silan a substituenților neutri sau hidrofili de pe peretele interior al capilarei în scopul de a reduce fluxul electroosmotic și de a preveni adsorbția analitului; acoperirile, de asemenea, tind să stabilizeze pH-ul.

O capilară de silice topită este pregătită pentru prima utilizare în electroforeză prin clătire cu 10 – 15 volume de coloană de NaOH 0,1 M, urmată de 10 – 15 volume de coloană de apă și de 5 – 10 volume de coloană de tampon de lucru. Pentru o capilară acoperită, procedura de pregătire este aceeași cu excepția faptului că NaOH 0,1 M se înlocuiește cu metanol. În instrumentele comerciale, transportorul lichid este forțat prin capilară fie prin aplicarea de presiune la capătul dinspre probă sau prin reducerea presiunii la capătul dinspre detector.

Prin adăugarea unui agent tensioactiv cationic, cum ar fi bromură de cetiltrimetilamoniu (CTAB), în tamponul de separare, direcția de curgere electroosmotică poate fi inversată. Gruparea terminala încărcată pozitiv a CTAB interacționează cu grupările silanolice încărcate negativ de pe suprafața capilarei, în timp ce lanțurile de hidrocarburi sunt îndreptate departe de suprafața internă a capilarei. Un al doilea strat de CTAB se orientează în direcția opusă, astfel încât lanțurile hidrofobe formează un strat nonpolar. Acest tensioactiv bistratificat aderă bine la peretele capilarei și inversează efectiv sarcina peretelui de la negativă la pozitivă, rezultând un flux electroosmotic inversat. Această procedură este, de asemenea, cunoscută ca acoperire dinamică [3].

Capetele capilarei sunt plasate în flacoanele cu tampon. Capilara este umplută cu tamponul de lucru înainte de începerea analizei. Dimensiunile tipice ale capilarei în condiții experimentale sunt: un diametru exterior (od) de 375 μm, un diametru interior (id) de 50 – 100 μm și o lungime totală de 50 – 100 cm. Pentru a proteja tubul fragil de silice topită, capilara este acoperită cu un strat exterior de poliimidă, care permite acesteia să fie flexibilă și manipulată într-o varietate de forme geometrice. O fereastră de detecție se poate crea prin înlăturarea unei mici cantități de strat protector.

Detectorul. Acest dispozitiv măsoară o proprietate a analitului, înregistrând astfel trecerea fiecărui compus prin dreptul ferestrei de detecție. Acesta nu este plasat la capătul capilarei, deoarece aceasta trebuie să fie imersată în soluția tampon. Proprietățile ce pot fi detectate sunt absorbanța și fluorescența, însă EC poate fi cuplată și cu spectometrul de masă.

Sistemul de înregistrare a datelor. Cel mai simplu dispozitiv ce poate servi acest scop este un înregistrator analog .Un integrator de date va oferi mai multe infomații despre picuri (timp și arie). Cel mai sofisticat aparat este un calculator, care poate procesa și evalua datele. Acesta poate fi folosit si pentru a manipula instrumentul [4].

Avantajele EC

Utilizarea metodelor din EC în analizele farmaceutice a devenit din ce în ce mai populară în ultimii ani. Larga gamă de aplicații pentru care utilizarea sa s-a dovedit a fi de succes include analiza medicamentelor, determinarea impurităților, analiza fizico-chimică a subtanțelor medicamentoase, separarea chirală și analiza excipienților farmaceutici [1]. Pentru unele aplicații farmaceutice, cum ar fi analiza chirală sau determinarea proprietăților fizico-chimice, EC este o tehnică superioară metodelor convenționale din punct de vedere al costurilor, ușurinței de utilizare și a posibilităților de automatizare [5]. Avantajul EC față de gaz cromatografie (GC), cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC), cromatografia în strat subțire (TLC) și față de electroforeza pe gel planar (SGE) este aplicabilitatea acesteia în separarea unui număr foarte variat de compuși, ioni anorganici, molecule organice și biomolecule mari, folosind același instrument și în cele mai multe cazuri aceeași coloană, schimbând doar compoziția tamponului de lucru. În plus, EC posedă cea mai mare putere de separare dintre toate tehnicile de separare lichidă datorită curgerii în bloc și a difuziei minime. Capacitatea de separare ridicată a EC este ilustrată în figura 34, care compară separarea a 66 peptide atât prin HPLC cât și prin EC. Dacă o comparăm cu SGE, EC este mai rapidă, mai simplă, mai ușoară, poate fi automatizată și oferă inclusiv date cantitative. Spre deosebire de SGE și TLC, unde se pot realiza ușor separări în două dimensiuni, în EC ca și în HPLC și GC asemenea separări nu pot fi efectuate. Totuși, EC poate fi folosită on-line cu alte tehnici instrumentale ca HPLC, spectrometrie de masă (MS) și rezonanță magnetică nucleară (RMN). Cantitatea de probă necesară pentru un experiment în EC este reprezentată de microlitri sau chiar nanolitri, spre deosebire de alte tehnici de separare lichidă care necesită micrilotri sau chiar mililitri de probă. Astfel, în EC rezultă cantități mici de reziduuri, ce provin de obicei în urma folosirii tampoanelor apoase, sau câteodată cu un procentaj mic de modificator organic, fiind sigure pentru mediul înconjurător. Acest lucru nu se aplică și pentru TLC sau HPLC, metode prin care sunt produse cantități mari de reziduuri de solvenți organici, sau GC, unde compuși volatili cu potențial toxic sunt emiși în atmosferă [2].

Fig. 34 Separarea comparativă a unui reziduu de 66 peptide prin A: HPLC și B: CZE

EC oferă, de asemenea, posibilitatea ca un singur set de condiții de separare să poată fi aplicate pentru o gamă largă de compuși, oferind eficiență ridicată analizelor. Sistemele de EC sunt flexibile și pot fi în mod automat preprogramate pentru a varia parametrii cum ar fi tensiunea, lungimea de undă, temperatura și operează utilizând flacoane conținând electroliți de diverse compoziții.

Detecția la lungimi de undă mici (190-200 nm) poate fi folosită în EC datorită drumului optic scurt al capilarei. Acest lucru poate permite detecția directă a analiților care în mod obișnuit ar avea nevoie de derivatizare (sau un sistem alternativ de detecție) pentru a putea fi detectați în urma separării prin HPLC. EC, prin urmare, este o metodă de elecție pentru analiza unor ioni organici mici și anorganici, cum ar fi aminoacizii, ionii metalici, acizii organici simpli și anionii anorganici cum ar fi ionii de clorură și nitrat. Acești analiți sunt de multe ori contraioni ai substanțelor medicamentoase sau se află în constituția excipienților. Aceste analize sunt, în general, efectuate cu ajutorul truselor standard comerciale de reactivi, în condițiile unei metode standard, și ele sunt, în general, mai simple și mai rapide decât cele din ioncromatografie. Aceste analize se desfășoară pe echipamente standard de EC, care elimină necesitatea de echipament specializat de ioncromatografie [5].

CE și-a demonstrat potențialul și în separările ultrarapide. Cu ajutorul CE timpul de analiză a moleculelor de ADN scade de cel puțin 10 ori în comparație cu metoda clasică folosită până acum de separare pe gel [6].

Dezavantajele EC

Electroforeza capilară (CE) este în curs de dezvoltare rapidă ca o metodă de separare alternativă tradiționalei cromatografii lichide de înaltă performanță (HPLC) [7]. Cu toate acestea, condițiile din interiorul capilarei variază ușor între injectări, ceea ce duce la o mai mare variabilitate a timpilor de migrare și a ariei decât în HPLC. O serie de abordări pot fi luate pentru a depăși această problemă. Timpii de migrare și ariile picurilor pot fi calculate în raport cu cele ale unui standard intern, rezultând o ameliorare a repetabilității metodei. O reproductibilitate mai mare a timpilor de migrare poate fi, de asemenea atinsă prin aplicarea unei tensiuni de separare pentru un timp foarte scurt, înainte de injecție și separare. Un tratament comercial al capilarei cu tampoane și soluții de clătire s-a dovedit a îmbunătăți repetabilitatea în EC, ca și acoperirea capilarei cu un dublu strat de tensioactivi, asigurându-se că suprafața de acoperire și EOF sunt în concordanță între injectări, precum și între capilare.

EC nu este utilizată pe scară largă de către analiștii din industria farmaceutică comparativ cu alte tehnici de separare, dar cu creșterea aplicațiilor în analizele de rutină, acest raport va fi cu siguranță îmbunătățit [5].

Sensibilitatea EC este substanțial mai mică decât cea din HPLC, în cazul utilizării celui mai comun detector (detector UV-VIS), ceea ce o face inadecvată pentru multe aplicații practice. Acest fapt se datorează dimensiunilor reduse ale capilarei din EC, de obicei, având un diametru de 25-75 μm și 30-100 cm în lungime, limitând atât volumul de probă care poate fi injectat dar mai ales datorită drumului optic foarte redus în cazul utilizării detecției spectrofotometrice. Lungimea drumului optic poate fi crescută prin utilizarea capilarelor cu un diametru mai mare, dar apare o reducere a eficienței separării și a rezoluției [7].

Există însă soluții pentru îmbunătățirea sensibilității, și anume: creșterea cantității de analit introdus în capilară (se va discuta această abordare în capitolul XXX) și îmbunătățirea sensibilității detectorului prin modificări ale zonei de detecție.

Îmbunătățirea detecției

Capilare cu zonă de detecție cu drum optic extins (Bubble cell)

O fereastră de detecție mărită cu de 3 până la 5 ori față de diametrul interior al capilarei, poate fi gravată în capilarele de silice topită folosind acid fluorhidric [12]. Îmbunătățirea sensibilității este de 2-3 ori mai mare, fără a se pierde din eficiența separării. Fereastra de detecție mărită este prezentată în figura 35.

Fig. 35 Fereastra de detecție a unei capilare cu drum optic extins (bubble cell)

Celule de detecție în formă de Z (Z-shaped cell)

Prin realizarea unei zone curbate sub forma literei Z de-alungul capilarei, având o zonă de câțiva milimetri paralelă cu axa de detecție, se obține o extindere substanțială a drumului optic. Pe de altă parte, din cauza extinderii drumului optic, rezoluția este micșorată, ceea ce poate cauza probleme cu picurile foarte apropiate. Este evident că distanța dintre picuri trebuie să fie cel puțin cât lungimea drumului optic. În 1991, Chevret și colab. [16] a introdus o celulă în formă de Z cu un drum optic de 3 mm (figura 36). Îmbunătățirea raportului semnal/zgomot de fond cu un factor de 6 a fost mai mic decât se aștepta, ținând cont de creșterea drumului optic, posibil din cauza unor fenomone de dispersie a radiației incidente [16]. Recent, Hewlett-Packard a introdus o așa numită celulă de înaltă sensibilitate, conținând o capilară în formă de Z în apropierea ferestrei detectorului. Problemele legate de împrăștierea luminii au fost rezolvate, dispozitivul de detecție fiind conectat capilarei cu ajutorul unor garnituri de etanșare similare cu cele din cromatografia de gaze. Cu toate acestea, aceste conexiuni pot cauza probleme prin perturbări ale fluxului de fluid dintre celula de detecție și restul capilarei.

Fig. 36 Diagrama unei celule de detecție în formă Z

A: vedere frontală; B: secțiune transversală (1. Suport, 2. Discuri de plastic, 3. Capilară) [8]

Detecție prin fluorescență laser indusă (LIF)

În prezent, detecția prin fluorescență laser indusă este aplicabilă doar anumitor analiți, deoarece laserele disponibile spre comercializare prezintă lungimi de undă de 325 sau 488 nm. O alternativă detecției directe este derivatizarea analiților cu markeri fluorescenți, însă acest procedeu duce la o pierdere în selectivitate și de aceea frecvent nu este aplicabilă. Aplicațiile detecției LIF în EC sunt în principal în domeniul ADN-ului, peptidelor și aminoacizilor, folosindu-se markeri fluorescenți selectivi [8].

Detecție prin spectrometrie de masă (SM)

Deși spectrometria de masă este de departe mult mai sensibilă decât detecția în UV, interfețele actuale EC/SM necesită utilizarea unor lichide purtătoare care preiau efluentul din capilara sistemului EC pentru a crește debitul până la 10 µL/min. Astfel rezultă sensibilități mai scăzute comparativ cu cele din LC-SM sau GC-SM, sau chiar cu cele din EC-UV. Din această cauză, în momentul de față, EC-SM nu este o soluție pentru a compensa lipsa de sensibilitate din EC. EC-SM este totodată accesibilă laboratoarelor specializate deoarece detectorii SM sunt încă foarte scumpi, iar interfața este dificil de manipulat [8].

Tehnici de separare în EC

Aplicații cantitative

Noțiuni teoretice

Principalele modalități de separare folosite în EC sunt prezentate în tabelul 4, precum și diferitele clase de compuși ce pot fi analizate.

Tabel 4 Tehnici de electroforeză capilară și aplicațiile lor

Cromatografia capilară zonală (CZE) este una dintre cele mai simple metode de electroforeză capilară. Mecanismul separării se bazează pe diferențele dintre raporturile sarcină/masă ale ionilor analizați. Fundamental pentru CZE sunt omogenitatea soluției de tampon și intensitatea constantă a câmpului electric de-alungul întregii capilare [1]. În această metodă proba este introdusă în capilară sub forma unei zone înguste care este delimitată de tamponul de separare. La aplicarea unui câmp electric fiecare component din zona probei migrează în funcție de mobilitatea electroforetică proprie. Ideal este ca fiecare component al probei să se separe și să formeze zone sau benzi pure de analit. Moleculele neutre nu pot fi separate prin această metodă deoarece ele migrează cu viteza și în direcția fluxului electroosmotic. Separarea moleculelor încărcate este cu atât mai eficientă cu cât diferențele dintre vitezele de migrare ale diferiților analiți sunt mai mari și dispersia termică a zonelor individuale pure este mai redusă [3]. Această tehnică prezintă ca principal dezavantaj sensibilitatea scăzută, cea mai ușoară posibilitate de creștere a acesteia fiind metodele de preconcentrare a probei în capilară.

În ultimele două decenii, au fost dezvoltate câteva tehnici de preconcentrare a probei in-line prin creșterea volumului de probă injectat în capilară. Toate strategiile de preconcentrare on-line exploatează diferențele relative între proprietățile fizico-chimice ale matricei probei și ale tamponului de lucru. Aproape toate tehnicile de concentrare în coloană din EC, folosesc schimbările vitezei electroforetice ale analiților la granița dintre zona probei și porțiunea de tampon de lucru. Aceste tehnici pot fi clasificate în două grupe, în funcție de fenomenele fizice folosite pentru a concentra analiții. Una implică manipularea vitezei electroforetice a analitului, iar cealaltă repartizează analiții într-o fază staționară sau pseudostaționară pentru a realiza preconcentrarea.

Eficiența preconcentrării în EC este afectată de doi factori. Primul ar fi îngustarea benzilor de analit în capilară. Odată cu scăderea lățimii picului analitului, are loc creșterea înălțimii, ce duce la un raport semnal-zgomot mai mare, îmbunătățind limitele de detecție (LOD). Cel de-al doilea este cantitatea de probă încărcată pe coloană. Deoarece procedura de stivuire reduce semnificativ lățimea picurilor, pot fi injectate volume mult mai mari de probă fără a se pierde din eficiența separării. De asemenea, cantitatea mai mare de analit introdusă în capilară va genera un răspuns mai mare la detector. În general, atunci când metodele de preconcentrare in-line sunt folosite în EC, trebuie să se realizeze un compromis între gradul maxim de sensibilitate și rezoluția ridicată necesară pentru amestecurile complexe de probe. Tehnicile de preconcentrare in-line raportate în EC sunt prezentate în tabelul 5. Fiecare metodă se bazează pe un mecanism de concentrare distinct, pe baza diferențelor dintre proprietățile electroliților între probă și zona tamponului de lucru, cum ar fi conductivitatea (concentrația ionică), mobilitatea co-ionului din electrolit, concentrația aditivilor (interacțiuni analit-aditiv) și pH-ul tamponului.

Cromatografia electrocinetică (EKC) este un mod al EC, în care se adaugă tamponului de lucru un aditiv, numit fază pseudostaționară (FPS). Faza pseudostaționară poate fi reprezentată de micelii, polimeri, dendrimeri, etc. Repartiția analiților între FPS și soluția de electrolit conduce la separarea acestora. Analiții neutri sunt separați numai pe baza repartiției, în timp ce analiții încărcați sunt separați pe atât pe baza repartiției, cât și a electroforezei. Două faze pseudostaționare pot fi utilizate în EKC: cele încărcate electric și cele neutre, dintre care primele sunt cele mai folosite. EKC cu micelii este de obicei denumită cromatografie electrocinetică micelară (MEKC) [9].

Tabel 5 Tabel al tehnicilor de preconcentrare in-line în electroforeza capilară

Focalizare în cromatografia electrocinetică micelară

(MEKC)

Cromatografia electrocinetică micelară, notată MEKC și adesea numită cromatografie electrocinetică micelară capilară (MECC), a fost inițial dezvoltată de Terabe (1), pentru separarea compușilor neutri, care nu pot fi separați prin electroforeză capilară zonală (CZE). Folosirea unui tensioactiv ionic, cum ar fi dodecil sulfatul de sodiu într-o concentrație mai mare decât concentrația micelară critică și o valoare a pH-ului mare, face posibilă o separare pe baza partiției diferențiate a analiților între tamponul de lucru și micelele tensioactivului.

Micelele formează o fază pseudostaționară ce se deplasează cu o viteză proprie și într-o direcție diferită față de cea a tamponului de lucru. Prin urmare, MEKC poate fi privită ca un hibrid între cromatografie și electroforeza capilară, iar termeni precum soluție electrolitică și fază mobilă, timp de migrare și timp de retenție, eluție și migrare, sunt la fel de mult folosiți.

Separarea analiților este posibilă datorită diferențelor dintre viteza tamponului de lucru, care, la valori mari ale pH-ului, este identică cu cea a fluxului electroosmotic (EOF) și viteza efectivă a micelelor de tensioactiv. Astfel, analiții care rămân doar în soluția electrolitică nu pot fi separați. Ei migrează cu EOF-ul în momentul teo. De asemenea, analiții care rezidă în exclusivitate în micelii nu sunt separabili și eluează din capilară la timpul de migrare a miceliilor, tmc. În cazul în care constantele de complexare între diferiții analiți și micelii sunt diferite, poate fi realizată o separare cu un timp de migrare caracteristic (ta), în care teo < ta < tmc (figura 37). Ordinea de migrare a compușilor neutri este de cele mai multe ori legată de hidrofobicitatea acestora; ca urmare a unei interacțiuni mai puternice cu miceliile, analiții mai hidrofobi migrează mai lent decât cei mai puțin hidrofobi.

Pentru analiții neutri, selectivitatea separării este sensibilă la diferențele în constantele de distribuție între soluțiile electrolitice și micelii, iar în cazul analiților ionizați, la diferențele în constantele de distribuție între amândouă fazele și mobilitatea electroforetică efectivă.

Proprietățile cinetice favorabile au ca rezultat o eficiență mare și o valoare corespunzătoare a factorului de capacitate, în special pentru sisteme cu o fereastră de migrare îngustă. Prin urmare, alegerea sistemului de tensioactivi este de mare importanță pentru o separare satifăcătoare. Separările pot fi optimizate prin variația raportului de fază pseudostaționară / fază mobilă și prin adăugarea de modificatori de diferite concentrații sistemului, precum: solvenți organici, uree, agenți de complexare (de exemplu, ciclodextrine, etc). De multe ori modificatorul reduce constanta de distribuție și lărgește fereastra de migrare. În plus, concentrația tamponului, concentrația ionică, pH-ul, ar putea ajuta la micșorarea în continuare a ferestrei de migrare pentru o mai bună separare [10].

Fig. 37 Reprezentarea schematică a mecanismului de separare al cromatografiei electrocinetice micelare (MEKC), folosind micele anionice. teo = timpul de migrare unui analit neutru „nereținut”, ta = timpul de „retenție” în MEKC, tmc = timpul de migrare al unei micele

În figura 38 se poate observa diagrama de separare în cazul utilizării SDS (dodecil sulfat de sodiu) ca și surfactant în MEKC cu focalizare normală.

Fig. 38 Diagramele schematice Focalizare normală în cromatografia electrocinetică micelară.[20]

proba este dizolvată în apă sau într-un tampon cu conductibilitate redusă, STL, constând în SDS pentru formarea miceliilor; după ce soluțiile STL și soluția probă sunt injectate, este aplicat un voltaj pozitiv.

miceliile de SDS de la începutul capilarei intră în zona probă și atunci permit analitului să migreze și să devină concentrat.

apoi analiții prinși în miceliile de SDS sunt separați prin metoda MEKC.

Agenți formatori de micelii

Tensioactivii sunt factorul determinant pentru selectivitate. Aceștia pot fi clasificați în surfactanți anionici, cum ar fi sulfați, sulfonați sau carboxilați, săruri biliare, tensioactivi cationici ce conțin grupări cuaternare de amoniu și tensioactivi neionici. Tensioactivii neutri și zwitterionici sunt utilizați ca amestecuri de tensioactivi prin adăugarea de tensioactivi ionici. Altfel, mobilitatea acestora este identică cu mobilitatea electroosmotică (4). Tabelul 6 oferă o imagine de ansamblu a celor mai folosiți agenți formatori de micelii. Ar fi de preferat ca tensioactivii utilizați în MEKC să aibă o concentrație micelară critică mică deoarece o concentrație mare a tensioactivului ar crea un curent excesiv de ridicat și o vâscozitate mărită a soluției. Concentrațiile uzuale ale tensioactivului pentru MEKC sunt cuprinse între 10-200 mM. Tensioactivii trebuie să fie disponibili într-o formă pură, ar trebui să aibă o bună solubilitate și o absorbanță în ultraviolet (UV) mică și ar trebui să fie stabili în intervalul de pH 6.0 – 9.0, necesar existenței fluxului electroosmotic.

Ca urmare a volumului mic al celulei de detecție, limitele de detecție sunt întotdeauna mai mari în comparație cu cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC). Sensibilitatea poate fi îmbunătățită prin focalizarea probei, care se bazează pe diferențele dintre conductivitățile electrice din zonele de graniță. Pe măsură ce ionii trec prin granița de separare a regiunilor cu forțe diferite ale câmpului electric, acestea vor fi concentrate într-o zonă mai restrânsă decât au fost injectate inițial. În plus, poate fi aplicat și procedeul prin stivuire, prin "alegerea și acumularea moleculelor de analit de către faza pseudostaționară care pătrunde în zona probei" (5). Aceasta, de asemenea, conduce la o focalizare a probei și, astfel, într-o creștere a sensibilității [10].

Tabel 6 Surfactanți utilizați în cromatografia electrocinetică micelară și concentrația micelară critică (CMC) a acestora în apă distilată la temperatura camerei

Concentrare prin mecanism de stivuire în cromatografia electrocinetică micelară

(Sweeping-MEKC)

Termenul de „stivuire” („sweeping”) a fost introdus de Quirino și Terabe în 1999 pentru a descrie o nouă manieră pentru preconcentrarea analiților neutri în MEKC, pe baza asocierii cu un surfactant [11].

În figura 39 sunt prezentate schematic diagramele acestei tehnici. Efectul de concentrare a probei depinde de modul în care faza pseudostaționară (miceliile) intră în zona cu probă (soluție tampon fără micelii) și stivuiește analiții. În această metodă, soluția tampon de lucru (STL) constă dintr-un tampon micelar, compus din surfactant (de exemplu SDS, un surfactant încărcat negativ) și un electrolit. Probele se vor dizolva într-un tampon care nu conține micelii. pH-ul acestor soluții va fi ținut la o valoare mică pentru a suprima fluxul electroosmotic, din moment ce această metodă este independentă de EOF. Când injectarea STL și a soluției probă este completă, capetele capilarei se introduc în STL și se aplică o polaritate negativă în scopul separării electroforetice. Cationii migrează spre capătul de injectare, iar anionii se îndreaptă în direcția opusă. În consecință miceliile SDS-ului anionic intră în capilară și “stivuiesc” analiții. În momentul în care analiții sunt concentrați de SDS din zona de probă injectată, separarea continuă prin MEKC.

Fig. 39 Diagramele schematice ale metodei de concentrare prin mecanism de măturare în cromatografia electrocinetică micelară (reversed-sweeping MEKC model)[13]

A. STL constă dintr-un tampon micelar, compus din surfactant (de exemplu SDS, un surfactant încărcat negativ) și un electrolit. Probele se vor dizolva într-un tampon care nu conține micelii.

B. Când injectarea STL și a soluției probă este completă, capetele capilarei se introduc în STL și se aplică o polaritate negativă în scopul separării electroforetice

C. Cationii migrează spre capătul de injectare, iar anionii se îndreaptă spre direcția opusă. În consecință miceliile SDS-ului anionic intră în capilară și “mătură” analiții

D. Analiții sunt concentrați de SDS din zona de probă injectată, separarea continuând prin concentrare prin mecanism de măturare în cromatografia electrocinetică micelară (MEKC).

Lungimea zonei concentrate a analitului (lsweeping) se poate calcula prin formula:

unde: linj – este lungimea zonei injectate a probei

k – este factorul de retenție al analitului

Valoarea lui k în zona probei întru-un câmp cu fază pseudostaționară, se presupune a fi egală cu aceea din zona de separare. În comparație cu o injectare normală s-a raportat o creștere de 2-3 ori a sensibilității detecției.[13]

Concentrare prin cromatografie electrocinetică microemulsionară

(MEEKC) prin mecanim de stivuire

Cromatografia electrocinetică microemulsionară (MEEKC) este o tehnică specială a electroforezei capilare (EC), folosind o microemulsie ca transportor electrolitic. Spre deosebire de multe alte tehnici de EC, MEEKC este potrivită pentru separarea analiților neutri. În plus, aceasta poate fi, de asemenea, folosită pentru separarea speciilor încărcate electric, selectivitatea fiind destul de diferită față de cea obținută prin alte tehnici de EC. Posibilitatea de a utiliza microemulsiile în EC a fost demonstrată pentru prima dată în 1991 de către Watarai (1).

Microemulsia este dispersia a două lichide nemiscibile și constă fie din picături de ulei în apă (microemulsie ulei în apă [U/A]) sau din picături de apă într-o fază de ulei (microemulsie apă în ulei [A/U]).

Microemulsiile ulei în apă sunt de preferat pentru MEEKC și, adesea, constau din picături de octan dispersate într-un tampon apos. Pentru formarea unui microemulsii stabile, se adaugă tensioactivi care formează un strat în jurul picăturilor de octan, scăzînd astfel tensiunea la suprafața dintre cele două lichide. Tensiunea superficială poate fi diminuată și mai mult prin adăugarea de un alcool cu lanț scurt, cum ar fi n-butanolul, care se numește cosurfactant. Diametrul picăturilor în astfel de microemulsii este sub 10 nm. Prin urmare, microemulsia este optic transparentă și arată ca un solvent omogen, deși este un sistem format din două faze.

Dodecil sulfatul de sodiu (SDS) este frecvent folosit pentru stabilizarea microemulsiilor. Ca urmare a acestui tensioactiv anionic, picăturile de ulei vor avea o sarcină negativă și vor manifesta o mobilitate electroforetică îndreptată spre anod. Faza apoasă constă în general din tampon fosfat sau borat având un pH alcalin. În interiorul capilarelor de siliciu topit, aceste tampoane generează un flux electroosmotic (EOF) îndreptat spre catod. În condiții alcaline, magnitudinea EOF-ului depășește mobilitatea picăturilor de ulei (care este îndreptată în sens opus față de EOF). Prin urmare, EOF-ul este destul de puternic pentru a antrena și picăturile de ulei spre catod.

Analiții neutri foarte solubili în apă, injectați la capătul anodic al capilarei, vor fi reținuți preponderent în faza apoasă, astfel încât aceștia vor fi transportați de către EOF cu viteza acestuia, la detectorul situat la capătul catodic al capilarei. Momentul în care ajung la detector după injectare, poate fi numit tEOF. În schimb, analiții foarte hidrofobi vor fi menținuți preponderent în picăturile de ulei și vor fi transportați la detectorul situat la partea catodică în funcție de mobilitatea aparentă a picăturilor și vor atinge detectorul la timpul tME. Alți analiți de polaritate medie, vor fi supuși unui echilibru de partiție între faza apoasă și cea uleioasă, astfel încât vor ajunge la detector la un interval de timp între tEOF și tME. Prin urmare, compușii neutri pot fi separați în funcție de hidrofobicitățile acestora. Evident, aceast mecanism de separare depinde de principiile cromatografice. Faza uleioasă poate fi numită fază pseudo-staționară. În analogie cu cromatografia, pot fi definiți factorii de retenție k pentru analiți:

(28)

În cazul unei faze staționare adevărate, cum sunt întâlnite în cromatografia lichidă, valoarea pentru tME ar deveni infinită și tEOF ar fi timp mort, astfel încât ecuația de mai sus ar avea ca rezultat faptul că k este timpul de retenție net raportat la timpul mort, relație bine cunoscută în separările cromatografice.

O prezentare schematică a procesului de separare MEEKC este dată în figura 40. Trebuie subliniat faptul că mecanismele de separare în MEEKC sunt similare celor din cromatografia electrocinetică micelară (MEKC), care utilizează micele (agregate ale moleculelor de tensioactiv), ca fază pseudostaționară. Cu toate acestea, atunci când se caută avantaje ale MEEKC față de MEKC, două aspecte ar trebui să fie luate în considerare: (1) picăturile de ulei prezintă o rigiditate redusă comparativ cu miceliile, astfel încât analiții hidrofobi pot pătrunde mai ușor prin suprafața picăturilor și (2) MEEKC poate oferi o mai mare fereastră de separare (fereastra de timp între tEOF și tME), care poate fi controlată prin utilizarea de amestecuri de tensioactivi constând din specii încărcate și neutre, în diferite compoziții. În acest fel, pot fi manipulate sarcina totală a picăturilor și mobilitatea acestora. Tampoanele acide pot fi folosite în loc de tampoane bazice, iar EOF-ul în acest caz având un nivel foarte scăzut nu mai poate transporta o fază pseudostaționară, spre capătul de detecție catodic. În acest caz, capătul de detecție al capilarei trebuie să fie la anod, fiind posibilă, de asemenea, realizarea unei preconcentrări considerabile prin mecanism de stivuire (sweeping) în timpul injectării. Detalii ale acestei proceduri sunt prezentate în capitolul / paragraful.

Separările MEEKC ale analiților anionici sunt guvernate atât de mobilitățile electroforetice, precum și de interacțiunile acestora cu faza pseudostaționară [12].

Fig. 40 Principiul procesului de separare în cromatografia electrocinetică microemulsionară pentru un analit neutru într-o microemulsie alcalină stabilizată de către dodecil sulfat de sodiu încărcat negativ [12]

Partea experimentală

Introducere

Într-o primă etapă s-a urmărit alegerea celei mai potrivite tehnici de analiză electroforetice pentru a fi aplicată analizei colchicinei, apoi optimizarea și validarea acesteia. Contrar proprietăților generale ale alcaloizilor, colchicina nu prezintă un caracter bazic pronunțat (pKa = 1,85), nu formează săruri cu acizi minerali și este foarte solubilă în apă, metanol, etanol, acetonitril, cloroform. Datorită acestor proprietăți, molecula de colchicină nu prezintă sarcină electrică în soluție apoasă (pH > 3). S-a urmărit inițial protonarea acesteia în mediu apos puternic acid pentru a putea fi aplicată tehnica de separare CZE. Apoi, studiile au fost orientate spre separările prin cromatografie electrocinetică micelară (MEKC), deoarece această tehnică permite separarea atât a speciilor încărcate electric, cât și a celor neutre. Condițiile de separare electroforetice au fost optimizate prin identificarea factorilor care pot influența viteza, sensibilitatea, rezoluția și eficiența separării protoalcaloidului, iar apoi metoda a fost validată.

Sensibilitatea redusă este una dintre cea mai mari limitări ale metodelor de separare electroforetice în special în comparație cu tehnicile cromatografice tradiționale și de aceea s-a încercat preconcentrarea ei cu ajutorul mecanismului de focalizare prin stivuire (sweeping). Metoda a fost optimizată în vederea creșterii la maxim a eficienței preconcentrării și a limitei de detecție, a scăderii timpului de migrare și a timpului total de analiză și nu în ultimul rând a repetabilității și reproductibilității analizei. Metoda a fost validată conform normelor ICH descrise înregistrării produselor farmaceutice de uz uman [134], din punct de vedere a liniarității, exactității, a limitei de detecție și cuantificare.

Cromatografia electrocinetică microemulsionară a fost aplicată cu succes pentru separarea unor compuși neutri sau încărcați electric, motiv pentru care s-a încercat și pentru preconcentrarea și separarea colchicinei. Eficiența preconcentrării va fi determinată de gradul de interacțiune a colchicinei neutre cu microemulsia. S-a optimizat metoda cu preconcentrare in-line prin cromatografie electrocinetică micelară cu fază mixtă.

Pentru verificarea aplicabilității practice a metodei, aceasta a fost utilizată cu succes la dozarea colchicinei din probe de urină și lapte de vacă, contaminate cu protoalcaloid.

Materiale și metode

Reactivii

Toți reactivii folosiți în acest studiu au fost de puritate analitică. Colchicina, n-butanolul, n-octanolul, acetonitrilul, acidul clorhidric, acidul acetic glacial, acidul formic au fost achiziționați de la Merck (Darmstadt, Germany). Acidul fosforic, hidroxidul de sodiu, TRIS, acidul boric, acetatul de sodiu, etanolul, metanolul, lauril sulfatul de sodiu, 1,3 hidroxi-naftalina, ninhidrina, xilenol-ftaleina, fenolftaleina au fost achiziționate de la Sigma Aldrich.

La prepararea tuturor soluțiilor apoase s-a folosit apă deionizată (18 mΩ) produsă de un sistem de purificare al apei Barnstead EasyPure RoDi, (Barnstead, Thermolyne, SUA).

Laptele de vacă (grăsime 3,5%) a fost cumpărat din comerț iar proba de urină a provenit de la voluntari.

Aparatura

Studiile au fost efectuate pe un sistem de electroforeză capilară Agilent 3D-CE (Agilent Technologies, Germania) (figura 41), cu sursă de înaltă tensiune variabilă ± 30 kV și control riguros al temperaturii capilarei, prevăzut cu un sistem de detecție cu șir de diode (190-600 nm) și autosampler. Sistemul este capabil să efectueze injecție hidrodinamică (cu presiune sau vid) și electrocinetică a probelor. Achiziția digitală a datelor a avut loc cu ajutorul 3D-CE Chemstation Rev. A. 08.03(847) (Agilent Technologies, Germania).

Fig. 41 Sistem de electroforeză capilară Agilent 3D

În tehnica CZE, s-au utilizat capilare de silice topită nemodificată cu drum optic extins (B.F.=3), cu o lungime totală L=64,5 cm și lungime efectivă l=56 cm, diametru intern = 50 µm (Agilent Technologies, Germania).

În MEKC, s-a folosit o capilară de silice topită nemodificată cu și fără drum optic extins (B.F.=3), cu o lungime totală L=64,5 cm și lungime efectivă l=56 cm, diametru intern = 50 µm.

Pentru a putea crea condițiile necesare de flux electroosmotic nul, în cromatografia electrocinetică micelară cu preconcentrare in-line prin mecanism de stivuire (Sweeping-MEKC) s-a utilizat o capilară de silice topită acoperită cu alcool polivinilic (PVA), cu L=68,5 cm, l=60 cm, i.d.=75 μm. Pentru a obține o creștere suplimentară a sensibilității s-a încercat utilizarea capilarelor de silice modificate cu alcool polivinilic de L=64,5 cm, l=56 cm, i.d.=75 μm (Agilent Technologies, Germania), cuplate la o celulă de detecție de înaltă sensibilitate (Agilent Technologies, Germania). În aceste celule de detecție canalul de scurgere prezintă un aranjament sub formă de „Z” pentru a crește drumul optic al fantei de detecție și ai cărei pereții sunt de quarț. În analizele ce au urmat s-au utilizat capilarele de silice topită nemodificate. Pentru a crește volumul de probă injectabil, s-a utilizat o capilară mai lungă (L = 88,5 cm; l = 80 cm, d.i.=50m, Alltech, SUA) cu un volum total de 1,737 L.

În cromatografia electrocinetică microemulsionară s-a utilizat o capilară de silice topită cu precondiționare acidă, având L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm (Alltech, SUA).

Prepararea probelor și a tampoanelor

Soluțiile apoase ale colchicinei au fost preparate zilnic prin dizolvarea a 2 mg protoalcaloid într-un balon cotat de 25 mL, obținându-se o soluție stoc, din care s-au preparat soluții de concentrațiile dorite prin diluare cu apă.

Probele de urină contaminate cu o cantitate cunoscută de colchicină au fost analizate printr-o diluție și filtrare simplă, urmând să fie injectate direct în sistemul electroforetic.

Analiza unor probe de lapte de vacă contaminate cu colchicină este complicată de prezența unei cantități ridicate de lipide care îngreunează procesul de extracție al analitului și al standardului intern. Deși proprietățile acido-bazice ale protoalcaloidului nu o cer, s-a efectuat ajustarea pH-lui la valori între 8 – 12 a probelor de lapte cu soluție de NaHCO3 10%, tampon fosfat 1M sau NaOH 1M.

S-au încercat toate tipurile de extracție în fază lichidă sau solidă. Pentru extracția în fază lichidă s-a încercat extracția cu cloroform, diclormetan, amestec de diclormetan:izopropanol (95:5 v/v), acetat de etil, eter etilic, amestec eter etilic:diclormetan (7:4 v/v), etc. în raport de 3 părți probă și 10 părți solvent organic, cu rezultate variabile în funcție de gradele diferite de gelificare observate. Gelificarea probei de lapte poate fi evitată prin adăugarea de HCl concentrat (12 L HCl 37% la 1 mL lapte) cu rolul de a precipita grăsimile și proteinele emulsionate în lapte [155].

Soluțiile standard și probă s-au preparat proaspete în fiecare zi.

S-au utilizat diverse tampoane de lucru, de diverse compoziții, concentrații, pH: tampon fosfat, tampon borat + lauril sulfat de sodiu, tampon TRIS+ lauril sulfat de sodiu, tampon acetat+ lauril sulfat de sodiu, tampon formiat + lauril sulfat de sodiu. Acestea au fost realizate prin dizolvarea cantității corespunzătoare de acid în apă și ajustat apoi pH-ul la valoarea dorită cu NaOH 1M. În tehnicile ce se bazează pe cromatografie electrocinetică, s-a adaugat și surfactantul la tamponul creat anterior. În cromatografia electrocinetică microemulsionară, microemulsia se prepară prin amestecarea componentelor într-un raport bine determinat (aproximativ 0,8% m/m fază uleioasă) și ultrasonarea amestecului timp de 10-15 minute. Amestecul rezultat este omogen, transparent și foarte stabil la păstrare.

Precondiționarea capilarei și condițiile de lucru

Detecția s-a realizat la cele două maxime de absorbție ale colchicinei, la 243 și 350 nm, cu fanta radiației transmise de 30 nm.

Electroforeza capilară zonală

În vederea hidratării grupărilor silanolice ale suprafeței interne, capilara a fost spălată cu NaOH 1M timp de 10 minute, urmată de o spălare cu NaOH 0,1 M și cu apă distilată timp de 5 minute. Proba a fost introdusă în capilară prin injectare hidrodinamică prin presiune 250 mbar · s.

Cromatografia electrocinetică micelară

Pentru a obține faza pseudostaționară micelară s-a utilizat lauril sulfatul de sodiu la o concentrație superioară concentrației micelare critice (9 mM).

Capilara a fost precondiționată prin spălare 2 minute cu tamponul de lucru, înaintea fiecărei analize. Tensiunea de separare a fost de +30 kv (465 V/cm), iar injectarea hidrodinamică prin presiune, la 250 mbar · s.

Cromatografia electrocinetică micelară cu preconcentrare in-line prin mecanism de stivuire

Pentru a putea crea condițiile necesare de flux electroosmotic nul au existat două posibilități, fie utilizarea unei capilare cu pereții interiori acoperiți de un substrat inert (ex. alcool polivinilic), fie prin scăderea potențialului zeta () al stratului dublu electric de la interfața capilară-lichid prin precondiționarea suprafeței interne cu un acid tare ce va determina protonarea completă a grupărilor silanolice. Astfel, prin condiționarea capilarei la începutul fiecărei zile de analiză cu HCl 0,1M timp de 15 min, repetat la intervale de 5 – 10 analize prin cicluri a câte 5 minute se asigură un flux electroosmotic nul pe parcursul etapelor de preconcentrare și separare ale colchicinei. Capilara a fost precondiționată prin spălare 2 minute cu tamponul de lucru, înaintea fiecărei analize. Tensiunea de separare a fost de -30 kv (339 V/cm), iar injectarea hidrodinamică prin presiune, la 33480 mbar · s.

Cromatografia electrocinetică microemulsionară

Condiționarea capilarei s-a realizat la începutul fiecărei zile de analiză cu HCl 0,1M timp de 15 min, repetat la intervale de 5 – 10 analize prin cicluri a câte 5 minute. Tensiunea de separare a fost de -30 kv (339 V/cm), iar injectarea hidrodinamică prin presiune, la 33480 mbar · s.

Rezultate și discuții

Electroforeza capilară zonală

Știind că protoalcaloidul prezintă o constantă de bazicitate foarte mică (Kb = 10-14) s-a încercat analiza în mediu neapos folosind acid acetic glacial spre ai exalta caracterul bazic. Pentru facilitarea conductibilității electrice s-a adăugat acetat de sodiu în tamponul de lucru. Teoretic în aceste condiții fluxul electroosmotic este mult redus, astfel migrarea colchicinei ar trebui să se datoreze exclusiv încărcării sale electrice (formă protonată). Din păcate nu s-a observat o deplasare a analitului spre capătul catodic al capilarei, făcând imposibilă separarea pe baza mărimii și încărcării electrice a colchicinei prin electroforeză capilară zonală.

Totuși pentru a confirma această teorie s-a încercat și analiza în mediu apos puternic acid, tampon fosfat 25 mM (pH = 2,50) și tampon fosfat 25 mM (ajustat cu HCl 1M la pH = 1,3). La utilizarea tamponului fosfat cu pH=2,50 se observă picul colchicinei la aproximativ 4,47 minute cu același timp de migrare cu al apei distilate purtate de EOF. La dizolvarea colchicinei în apă, pH-ul acestei soluții fiind aproape de neutru permite apariția și a formei neutre a moleculei ceea ce determină o distorsionare a picului (Figura 42 A.), analitul fiind purtat tot de fluxul electroosmotic. Spectrele de absorbție în UV ale colchicinei din cele două picuri prezintă mici diferențe datorate doar solventului, indentificând în ambele cazuri lungimile de undă specifice la 243 nm și 350 nm (Figura 42 B.). La utilizarea tamponului fosfat 25 mM (pH=1,30), condiții în care EOF este practic nul, picul corespunzător colchicinei se observă la aproximativ 12 minute, dar acesta migrează concomitent cu frontul de solvent organic (etanol).

Situația se schimbă la continuarea studiilor în mediu neapos, folosind solvenți organici (ex. metanol, acetonitril) care pot induce deplasări ale pKa-ului colchicinei. Aceste deplasări de pKa apar în principal datorită unei mai bune stabilizării a moleculei solutului de către solventul organic, față de apă, și este determinat de coeficientul de transfer [Anne Varenne, Stephanie Descroix, Recent strategies to improve resolution in capillary electrophoresis — A review, Analytica chimica acta 628 (2008) 9–23]. Astfel, prin electroforeză capilară zonală în mediu neapos (NACE – non-aqueous capillary electrophoresis), folosind un amestec de metanol:acetonitril (1:2, v/v) cu un adaos de 10mM HClO4 și 60mM NH4COOH se observă picul corespunzător colchicinei ionizate, la un timp de migrare de aproximativ 13 minute (figura 42 A.). Folosind acizi organici mai slabi, cum ar fi acidul formic (pKa=3,75), nu se observă ionizarea colchicinei nici măcar la concentrații de acid superioare a 0,5M în metanol. Folosind acid tricloracetic la concentrații superioare de 40mM, ionizarea protoalcaloidului determină apariția unui pic în electroferogramă. Totuși, se preferă utilizarea unui acid mai puternic la concentrații minime, astfel studiile prin electroforeză capilară zonală în mediu neapos vor continua folosind HClO4 10mM. Formiatul de amoniu adăugat, joacă rolul electrolitului, care nu este solubil în acetonitril pur. Astfel, s-a realizat un amestec de metanol:acetonitril (1:2, v/v), păstrând procentul de metanol la minimul necesar dizolvării electrolitului. S-a dorit păstrarea unei nivel cât mai ridicat în acetonitril, în primul rând datorită unei vâscozități inferioare comparativ cu metanolul, iar în al doilea rând, acetonitrilul prezintă o selectivitate superioară față de metanol [Anne Varenne, Stephanie Descroix, Recent strategies to improve resolution in capillary electrophoresis — A review, Analytica chimica acta 628 (2008) 9–23].

Rezultatele obținute prin această metodă vor servi separării enantiomerilor colchicinei folosind diferiți derivați de sinteză ai ciclodextrinelor, insolubile în mediu apos, care pot prezenta o selectivitate mai bună la interacțiunea lor cu cei doi antipozi optici ai protoalcaloidului.

Fig. 42 A. Electroforegramele obținute prin electroforeză capilară zonală în mediu de tampon fosfat 25 mM (pH=2,50) pentru colchicina standard dizolvată în tamponul de lucru (negru); colchicina standard dizolvată în apă distilată (concentrație diferită) (roșu); blanc cu apă distilată (verde); și colchicină standard separat prin electroforeză capilară în mediu neapos (10mM HClO4 in metanol) (albastru). (capilară silice topită L=64,5 cm, l=56 cm, d.i.=50 μm B.F.=3; 20oC; 25 kV, injectare hidrodinamică prin presiune 250 mbar · s; tampon fosfat 25 mM (pH=2,50), detecție 243 nm/30)

B. Spectrele de absorbție în UV ale picurilor obținute prin electroforeza capilară zonală în mediu de tampon fosfat 25 mM (pH=2,50) pentru colchicina standard dizolvată în tamponul de lucru (negru); colchicina standard dizolvată în apă distilată (concentrație diferită) (roșu); și blanc cu apă distilată (verde).

Cromatografia electrocinetică micelară

În următoarea etapă studiile au fost orientate spre separările prin cromatografie electrocinetică micelară (MEKC).

Condițiile de separare electroforetice au fost optimizate prin identificarea factorilor care pot influența viteza, sensibilitatea, rezoluția și eficiența separării protoalcaloidului (tabelul 7), obținându-se un timp de migrare de 7,64 minute.

a) pH-ul, natura și concentrația electrolitului

Pentru că pH nu influențează disocierea moleculei de colchicină pe domeniul de lucru uzual (pH = 2 – 12), s-a ales o valoare la care fluxul electroendosmotic (flux electroosmotic, EOF) contribuie la creșterea vitezei de migrare. Totuși la valori prea mari, EOF poate deteriora performanțele separării, astfel pH-ul a fost ajustat la valoarea 9,30 la care capacitatea de tamponare a boratului este maxim (pKa1 acid boric = 9,14). În plus tamponul borat (10 mM) a fost preferat față de alții datorită curenților de analiză reduși și a absorbanței minime în domeniul ultraviolet [133].

Tabel 7 Condiții optime de separare a colchicinei prin MEKC

b) tensiunea aplicată (curentul de lucru)

Prin creșterea tensiunii aplicate are loc o scădere a timpului de separare, care în schimb duce la o creștere a curentului de lucru ce poate determina o scădere a rezoluției prin lățirea picurilor electroforetice datorat efectului Joule. Aparatul permite aplicarea unei tensiuni constante sau în gradient liniar. Evoluția comportamentului electroforetic a colchicinei în funcție de tensiunea aplicată este prezentată în figura 43.

Fig. 43 Electroforegramele obținute la diferite tensiuni de separare ale soluției extractive din semințe de Colchicum autumnale prin procedeul Soxhlet.

(negru: 30 kV, gradient tensiune 0-10min; roșu: 30 kV; verde: 15kV; capilară silice topită L=64,5 cm, l=56 cm, d.i.=50 μm; 20oC; injectare hidrodinamică prin presiune 1000 mbar · s; tampon borat 25 mM (pH=9,30)+25mM SDS, detecție 243 nm/30)

c) concentrația surfactantului (lauril sulfat de sodiu)

Separarea speciilor neutre, printre care și a colchicinei, este determinată de coeficientul de partiție micele/soluție tampon. Cu cât concentrația micelelor crește cu atât crește posibilitatea interacțiunii analitului cu faza pseudostaționară ceea ce conduce la creșterea retenției și scăderea sau modificarea selectivității și rezoluției. Creșterea cantității de surfactant duce și la scăderea fluxului electroosmotic ceea ce accentuează creșterea timpilor de retenție. Concentrația mare de micelii duce și la scăderea sensibilității detecției datorită dispersiei fasciculului optic incident. Influența concentrației de surfactant dizolvat în tamponul de lucru este prezentată în figura 44, picul principal fiind reprezentat de colchicină.

Fig. 44 Electroforegramele obținute la diferite concentrații de SDS ale soluției extractive din semințe de Colchicum autumnale prin procedeul Soxhlet,

(negru: 25mM SDS; roșu: 50mM SDS; verde: 100 mM SDS; capilară silice topită L=64,5 cm, l=56 cm, i.d.=50 μm; 30 kV; 20oC; injectare hidrodinamică prin presiune 1000 mbar · s; tampon borat 25 mM (pH=9,30), detecție 243 nm/30)

d) temperatura

Atât volumul de injectare cât și timpul de migrare sunt dependente de temperatură. Creșterea temperaturii duce la scăderea vâscozității tamponului de lucru, ce va determina o scădere a timpului de migrare și o creștere a fluxului electroosmotic. Colchicina fiind termostabilă, creșterea acestui parametru este benefică reducerii timpului de analiză și creșterii eficienței separării. Influența temperaturii asupra separării colchicinei este prezentată în figura45.

Fig. 45 Electroforegramele obținute la diferite temperaturi de separare ale soluției extractive din semințe de Colchicum autumnale prin procedeul Soxhlet;

(negru: 20 oC; roșu: 30 oC; verde: 35 oC; albastru: 40 oC; capilară silice topită L=64,5 cm, l=56 cm, i.d.=50 μm; 30 kV; injectare hidrodinamică prin presiune 1000 mbar · s; tampon borat 25 mM (pH=9,30)+100 mM SDS, detecție 243 nm/30)

e) volumul de injectare

Volumul de injectare este determinat de timpul și presiunea de injectare și el depinde de temperatură, vâscozitate și de diametrul interior al capilarei. Cunoscând valorile factorilor mai sus amintiți se poate calcula volumul de injectare pe baza legii lui Poiseuille. Pentru transferul facilitat al metodelor analitice de la un instrument la altul uzual volumul de injectare se exprimă ca produsul timpului și presiunii aplicate în mbars sau psis. Creșterea volumului de injectare duce la creșterea sensibilității detecției, dar poate duce la o scădere a rezoluției și a simetriei picului. Datorită injecției hidrodinamice prin presiune pozitivă sau negativă, volumul de injectare este puternic dependent de vâscozitate. Astfel este foarte important ca soluția probă să prezinte o vâscozitate foarte apropiată cu cea a soluței standard sau aceste posibile erori să fie corectate cu ajutorul unor standarde interne. S-a încercat injectarea unui volum maxim de soluție fără a compromite rezoluția separării; variația semnalului corespunzător colchicinei în funcție de timpul și presiunea de injectare fiind prezentată în figura 46.

Se poate observa că o creștere semnificativă a volumul de injectare poate modifica ușor și timpul de retenție a colchicinei.

Fig. 46 Electroforegramele obținute la diferite volume de injectare ale soluției extractive din semințe de Colchicum autumnale prin procedeul Soxhlet;

(negru: 1000 mbar · s; roșu: 250 mbar · s; verde: 25 mbar · s; capilară silice topită L=64,5 cm, l=56 cm, i.d.=50 μm; 35 oC; 30 kV; injectare hidrodinamică prin presiune 1000; tampon borat 25 mM (pH=9,30)+100 mM SDS, detecție 243 nm/30)

Validarea metodei electroforetice prin cromatografie micelară electrocinetică

Metoda propusă a fost validată conform normelor ICH descrise înregistrării produselor farmaceutice de uz uman [134], din punct de vedere a liniarității, exactității, a limitei de detecție și cuantificare pentru două domenii diferite de concentrație folosind volume de injectare diferite.

a) Domeniul 200 – 2500 ng mL-1 colchicină, injectare 250 mbars

S-au folosit trei serii a câte cinci soluții standard de colchicină pe domeniul de concentrații amintit, preparate dintr-o soluție stoc proaspătă înaintea fiecărei analize, în trei zile diferite. Timpul de migrare mediu înregistrat pentru colchicină în condițiile de separare optimizate a fost de 7,64 minute, cu o deviație standard cuprinsă între 0,53-4 %.

1. Liniaritate

Curbele de calibare s-au realizat pe cinci nivele de concentrație prin reprezentarea ariilor corectate ale picurilor la 243 nm (= arii citite/timp de migrare electroforetică) în funcție de concentrația protoalcaloidului (figura 47). Punctele obținute au fost corelate cu o dreaptă de calibrare cu ecuația Y[mAU min-1] = 0,0004 X[ng mL-1] – 0,0196, R2 = 0,998.

Fig. 47 Ariile corectate ale picurilor în funcție de concentrația de colchicină standard, pe domeniul 200 – 2500 ng/mL colchicină, pentru trei serii (n = 3), trei zile diferite; (capilară silice topită L=64,5 cm, l=56 cm, i.d.=50 μm B.F.=3; 20oC; 30 kV; injectare hidrodinamică prin presiune 250 mbar · s; tampon borat 10 mM (pH=9,30)+25mM SDS, detecție 243 nm/30)

2. Exactitate

Exactitatea metodei a fost evaluată pe toate cele cinci nivele de concentrație de colchicină standard folosind trei serii din trei zile diferite (tabelul 8), obținându-se un interval de încredere a regăsirii în domeniul 100,47±2,84%.

3. Limitele de detecție și cuantificare

Limitele de detecție (LOD) și de cuantificare (LOQ) au fost calculați pe baza raportului deviației standard a interceptului dreptei de calibrare și a pantei medii. Acest raport a fost înmulțit cu 3,3 pentru limita de detecție și cu 10 pentru limita de cuantificare și rezultatul a fost exprimat în unități de concentrație, LOD = 31,41 ng mL-1, iar LOQ = 95,2 ng mL-1.

b) Domeniul 200 – 4000 ng mL-1 colchicină, injectare 2000 mbars

Curbele de calibrare s-au stabilit cu ajutorul a trei serii a câte șapte nivele de concentrație, preparate dintr-o soluție stoc de colchicină proaspătă, în trei zile diferite. S-au urmărit aceeași parametrii de validare ca mai sus. Diferența a constat în utilizarea unei injecții hidrodinamice cu presiune mai de 2000 mbars pentru a observa dacă are loc creștere a sensibilității metodei (scăderea LOD și LOQ) fără a sacrifica rezoluția separărilor. Capilara utilizată era aceeași (L=64,5 cm, l=56, tip balon, BF=3, id=50μm) cu un protocol de precondiționare mai îndelungat, capilara fiind spălată înaintea fiecărei analize prin căte un ciclu de 2 minute cu apă distilată, apoi tampon de lucru (tampon borat 10 mM (pH=9,30) + 25 mM SDS). În acest caz timpul de migrare mediu al colchicinei a fost de 6,76 minute, cu o deviație standard de 0,67 %. După cum se vede prin acest protocol de spălare mai îndelungat s-a obținut o condiționare mai bună a capilariei și o reducere a timpului de migrare. Totuși timpul de analiză efectiv nu s-a redus (11 minute, față de 10 minute la metoda cu o singură etapă de precondiționare).

Fluctuațiile mai mari ale timpilor de migrare de la prima metodă nu au afectat în mod negativ exactitatea sau liniaritatea metodei, datorită utilizării ariilor corectate pentru calibrare.

1. Liniaritate

Curbele de calibrare s-au realizat în același mod prin reprezentarea ariilor corectate înregistrate la 243 nm (= arii citite/timp de migrare electroforetică) în funcție de concentrația alcaloidului (figura 48). Punctele obținute au fost corelate cu o dreaptă de calibrare cu ecuația Y[mAU min-1] = 0,002756 X[ng mL-1] + 0,0738, R2 = 0,9955. Testul de omogenitate a varianțelor (Ccalc. < Cteor.) nu a fost îndeplinit probabil datorită variabilității mai mari a injectării unui volumui mai ridicat de probă.

Fig. 48 Ariile corectate ale picurilor în funcție de concentrația de colchicină standard, pe domeniul 200 – 4000 ng/mL colchicină, pentru trei serii (n = 3), trei zile diferite; (capilară silice topită L=64,5 cm, l=56 cm, i.d.=50 μm B.F.=3; 20oC; 30 kV; injectare hidrodinamică prin presiune 2000 mbar · s; tampon borat 10 mM (pH=9,30)+25mM SDS, detecție 243 nm/30)

2. Exactitate

Exactitatea metodei a fost evaluată pe cinci nivele de concentrație de colchicină standard folosind trei serii din trei zile diferite (tabelul 9), obținându-se un interval de încredere a regăsirii în domeniul 101,08±2,97%.

3. Limitele de detecție și cuantificare

Limitele de detecție (LOD) și de cuantificare (LOQ) au fost calculați în mod identic, obținându-se următoarele valori: LOD = 81,51 ng mL-1, iar LOQ = 274,01 ng mL-1. Se poate observa că ciuda injectării unui volum mai mare de probă și obținerea unei pante mai mari a dreptei de calibrare, sensibilitatea metodei nu crește tocmai datorită lipsei de reproductibilitate a injectării.

Pentru a obține un timp de migrare mai reproductibil se recomandă două etape de precondiționare a câte 2 minute fiecare (cu apă distilată și tampon de lucru).

Pentru analiza probelor reale se recomandă prima variantă propusă, cu o injectare hidrodinamică cu presiune de 250 mbar·s, utilizând dreapta de regresie pe domeniul 200 – 2500 ng/mL colchicină, cu un interval de încredere a regăsirii de 100,47 ± 2,84%. Limita de detecție calculată a acestei metode de analiză este de 31,41 ng/mL, iar limita de cuantificare 95,20 ng/mL colchicină.

Pentru că analiza colchicinei prin MEKC la concentrații de ordinul zecilor de nanograme pe mililitru fără o etapă preliminară de preconcentrare nu oferă o sensibilitate satisfăcătoare analizei probelor biologice (ex. plasmă, urină, lapte matern), respectiv pentru analiza urmelor de protoalcaloid din alimente (ex. lapte de oaie) s-a trecut la dezvoltarea și optimizarea unor metode electroforetice cu preconcentrare in-line prin diferite mecanisme de focalizare.

Cromatografia electrocinetică micelară cu preconcentrare in-line prin mecanism de măturare

A. Utilizarea capilarei cu pereții interiori modificați cu alcool polivinilic

Condițiile de separare electroforetice au fost optimizate prin identificarea factorilor care pot influența viteza, sensibilitatea, rezoluția și eficiența separării protoalcaloidului.

a) pH-ul, natura și concentrația electrolitului

Pentru că peretele interior al capilarei nu prezintă grupări silanolice susceptibile ionizării, iar fluxul electroosmotic este suprimat indiferent de pH-ul soluției tampon, s-a utilizat un tampon TRIS 25 mM cu pH=7,93. În acest caz natura electrolitului prezintă interes în principal sub aspectul unei absorbanțe UV cât mai reduse, fapt pentru care s-a preferat utilizarea tamponului TRIS sau fosfat (λcutoff < 200 nm) față de tamponul citrat (λcutoff = 230 nm).

b) modificatorul organic

Modificatorul organic este de regulă un solvent organic de polaritate medie (ex. acetonitril) care poate crește solubilitatea analiților, poate modifica selectivitatea separării sau modifica fluxul electroosmotic. S-a urmărit influența acetonitrilului adăugat în tamponul de lucru asupra timpului de migrare și profilului picului colchicinei (figura 49).

Fig. 49 Influența acetonitrilului adăugat în tamponul de lucru asupra electroforegramei unei soluții standard de colchicină 194,8 ng mL-1;

(tampon de lucru 25 mM TRIS (pH=7,93) + 25 mM SDS (negru); tampon de lucru 25 mM TRIS (pH=7,93) + 25 mM SDS + 5% (v/v) acetonitril (roșu); capilară silice topită acoperită cu PVA, L=68,5 cm, l=60 cm, i.d.=75 μm; 45oC; -30 kV; injectare hidrodinamică prin presiune 33480 mbar · s; detecție 243 nm/30)

Solventul organic poate influența timpul de migrare al colchicinei prin scăderea gradului de agregare a miceliilor. Astfel, după adăugarea ei în tamponul de lucru are loc creșterea mobilității electroforetice a miceliilor, ce duce la scăderea timpului de migrare al colchicinei. De asemenea se observă scăderea ariei corectate a colchicinei pentru aceeași concentrație și volum de injectare, fapt explicabil prin modificarea polarității fazei apoase, ce va determina o scădere a interacțiunii protoalcaloidului cu faza pseudostaționară și implicit la o scădere a gradului de preconcentrare obținut.

Astfel, adăugarea acetonitrilului la tamponul de lucru este nefavorabilă, conducând la o creștere a limitei de detecție și cuantificare.

c) natura surfactantului

Natura și concentrația surfactantului pot influența gradul de interacțiune a fazei pseudostaționare cu protoalcaloidul și mobilitatea electroforetică a miceliilor.

Fig. 50 Influența surfactanților anionici adăugați în tamponul de lucru asupra electroforegramei unei soluții standard de colchicină 194,8 ng mL-1;

(tampon de lucru 25 mM TRIS (pH=7,93) + 25 mM SDS (negru); tampon de lucru 25 mM TRIS (pH=7,93) + 25 mM SDS + 25 mM sarea de sodiu al acidului heptan-1-sulfonic (SHS) (roșu); capilară silice topită acoperită cu PVA, L=68,5 cm, l=60 cm, i.d.=75 μm; 45oC; -30 kV; injectare hidrodinamică prin presiune 33480 mbar · s; detecție 243 nm/30)

S-a urmărit influența unor surfactanți cationici mai hidrofili (sulfat acid de tetra-n-butil-amoniu) sau mai hidrofobi (sulfat acid de cetil-trimetil-amoniu) și anionici mai hidrofili (sarea de sodiu al acidului heptan-1-sulfonic) simplu sau în amestec cu SDS asupra preconcentrării și separării colchicinei utilizând capilara acoperită cu alcool polivinilic. Ținând cont de inversarea tensiunii aplicate și de înregistrarea unui curent de separare foarte ridicat, la utilizarea a detergenților cationici ca fază pseudostaționară, nici după 30 de minute nu s-a observat picul colchicinei. Sarea de sodiu al acidului heptan-1-sulfonic nu a adus îmbunătățiri eficienței preconcentrării sau separării, obținându-se o creștere a timpului de migrare, fenomen explicabil prin creșterea gradului de agregare micelară (figura 50).

Pentru a obține o creștere suplimentară a sensibilității s-a încercat utilizarea capilarelor de silice modificate cu alcool polivinilic cuplate la o celulă de detecție de înaltă sensibilitate (Agilent Technologies, Germania). În aceste celule de detecție canalul de scurgere prezintă un aranjament sub formă de „Z” pentru a crește drumul optic al fantei de detecție și ai cărei pereții sunt de quarț. Astfel, pe acea mică suprafață are loc generarea unui flux electroosmotic ce se poate opune migrării miceliilor. Aria picului corectat este de 467 de ori mai mare decât cea obținută pentru aceeași concentrație de colchicină prin metoda MEKC simplă, dar a dus la o creștere foarte mare a timpului de migrare (tm=45,078 min) (figura 51). Acest fenomen a împiedicat aplicarea practică a acestui ansamblu.

Fig. 51 Electroforegrama unei soluții standard de colchicină 200 ng mL-1 utilizând capilara de silice topită acoperită cu PVA cu celula de detecție de înaltă sensibilitate; (capilară silice topită acoperită cu PVA, L=64,5 cm, l=56 cm, i.d.=75 μm; 25oC; -30 kV; tampon de lucru 20 mM fosfat (pH=4,00) + 50 mM SDS; injectare hidrodinamică prin presiune 22320 mbar · s; detecție 243 nm/30)

B. Utilizarea capilarei de silice topită nemodificată

După precondiționarea capilarei cu o soluție puternic acidă, datorită cineticii de ionizare lente și a efectului de histereză a pH-lui asupra ionizării grupărilor silanolice [151,152], fluxul electroosmotic rămâne suprimat pe parcursul a mai multor analize chiar dacă ulterior precondiționării se lucrează cu soluții tampon cu valoarea pH-lui mai ridicată (între 2 și 7). Se pare că acest fenomen se datorează unui proces foarte lent de reechilibrare a sarcinilor de la suprafața interioară a capilarei [153].

Astfel, prin condiționarea capilarei la începutul fiecărei zile de analiză cu HCl 0,1M timp de 15 min, repetat la intervale de 5 – 10 analize prin cicluri a câte 5 minute se asigură un flux electroosmotic nul pe parcursul etapelor de preconcentrare și separare a colchicinei.

Profilul mult mai bine definit al picului colchicinei la utilizarea capilarelor nemodificate precondiționate conform metodologiei descrise mai sus indică o focalizare mai bună față de cea oferită de capilarele acoperite cu PVA (figura 52). Astfel, în analizele ce au urmat s-au utilizat capilarele de silice topită nemodificate.

Fig. 52 Picurile colchicinei obținute pentru preconcentrare in-line prin cromatografie electrocinetică

(utilizând capilară de silice topită precondiționată cu tampon fosfat pH=1,50, tampon de lucru fosfat 20 mM (pH=4,0) + 50 mM SDS (roșu) și capilară de silice topită acoperită cu alcool polivinilic (PVA) fără precondiționare, tampon de lucru TRIS 25mM (pH=7,93) + 25 mM SDS (negru))

Capilarele cu drum optic extins (B.F.=3) pot duce la creșterea suplimentară a sensibilității detecției datorită compresiei zonelor separate pe direcție axială. Din păcate, utilizarea capilarelor tip balon în această tehnică specială de preconcentarare comportă dezavantaje, observându-se o scădere a semnalului în urma diluției frontului de micelii ajunse în zona mai largă a capilarei. Compresia radială nu are loc în acest caz pentru că nu se înregistrează o deplasare a întregului solvent cum se observă în cazul existenței fluxului electroosmotic. De aceea pentru această tehnică s-a utilizat în continuare o capilară de silice topită nemodificată cu diametrul intern de 50 m. Pentru a crește volumul de probă injectabil s-a utilizat o capilară mai lungă (L = 88,5 cm; l = 80 cm) cu un volum total de 1,737 L.

Metoda a fost optimizată în vederea creșterii la maxim a eficienței preconcentrării și a limitei de detecție, a scăderii timpului de migrare și a timpului total de analiză și nu în ultimul rând a repetabilității și reproductibilității analizei.

Condițiile optime de precondiționare, preconcentrare și separare a colchicinei sunt prezentate în tabelul 10.

Tabel 10 Condiții optime de separare a colchicinei prin Sweeping-MEKC

a) timpul și volumul de injectare

Timpul, respectiv volumul de injectare a probei este direct proporțională cu cantitatea de analit introdusă în capilară și implicit cu sensibilitatea maximă care se poate obține pentru o capilară dată. Dacă la tehnicile clasice de electroforeză capilară zonală sau cromatografie electrocinetică micelară volumul maxim de probă introdusă în capilară nu depășește ~ 0,5-1% din volumul total al capilarei [154], prin această tehnică se umple aproximativ 60% din capacitatea totală. Cel mai important lucru este să se identifice volumul maxim de probă introdusă care să mai permită separarea cu rezoluție bună a colchicinei de alți compuși existenți în probele analizate. Folosind protocolul de injectare la presiune maximă (50 mbar) al sistemului electroforetic Agilent 3D, pentru injectarea unui astfel de volum de probă ar fi nevoie de aproximativ 11 minute. Timpul necesar injectării însumat cu timpul necesar precondiționării și a separării propriu-zise ar crește timpul unei singure analize la aproximativ 30 de minute. Din acest motiv, în vederea reducerii timpului total de analiză s-a efectuat injectarea prin procedura de spălare al sistemului electroforetic, ceea ce permite introducerea probei la 930 mbar (figura 53). Pentru a nu pierde reproductibilitatea injectărilor soluțiilor probă li s-a adăugat un standard intern potrivit. S-a studiat influența timpului de injectare la 930 mbar între 18 și 66 secunde.

Fig. 53 Electroforegramele unei soluții standard de colchicină 76,8 ng mL-1 la diferite volume de injectare hidrodinamice;

(capilară silice topită cu precondiționare acidă, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; 40oC; -30 kV; tampon de lucru 20 mM fosfat (pH=4,00) + 50 mM SDS; gradient presiune 10 mbar, 0-10 minute; detecție 243 nm/50)

Se poate observa că la creșterea volumui de injectare, pe lângă creșterea semnalului analitic, are loc și creșterea timpului de migrare datorită distanței mai mari pe care trebuie să o străbată miceliile în vederea focalizării.

La un timp de injectare mai mare de 36 secunde la 930 mbar distanța disponibilă pentru separare a colchicinei focalizate prin cromatografie electrocinetică micelară este mult prea redusă pentru a putea fi aplicată analizei probelor reale. Astfel, în ceea ce a urmat s-a utilizat injectarea a 33480 mbar s soluție probă, ceea ce corespunde la un volum de injectare de aproximativ 1059 nL (aproximativ 67% din volumul capilarei până la fereastra de detecție).

b) modificatorul organic

S-a urmărit influența acetonitrilului adăugat ca modificator organic în tamponul de lucru (între 0 și 20% v/v) asupra timpului de migrare și profilului picului colchicinei (figura 54). Acetonitrilul poate modifica selectivitatea separării prin modificarea polarității tamponului, influențând astfel eficiența preconcentrării și a timpului de migrare.

Fig. 54 Electroforegramele unei probe de urină contaminate cu colchicină 164,2 ng/mL

(utilizând soluții tampon 20 mM fosfat (pH=4,00) + 50 mM SDS cu diferite concentrații de acetonitril (ACN), 0%(v/v) (negru), 1%(v/v) (roșu), 5%(v/v) (verde), 10%(v/v) (albastru), 20%(v/v) (albastru deschis); capilară silice topită cu precondiționare acidă, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; 25oC; -30 kV; injectie hidrodinamică de 33480 mbars; gradient presiune 10 mbar, 0-10 minute; detecție 243 nm/50)

Creșterea concentrației de acetonitril din tamponul de lucru duce la creșterea distanței dintre frontul de micelii și picul colchicinei, fenomen datorat modificărilor de polaritate survenite și scăderii gradului de agregare micelară. Totodată se observă o dispersie crescătoare a picului, dar acest fenomen poate fi datorat creșterii timpului de migrare.

Concentrația mică de acetonitril (1-3% v/v) pare să fie benefică focalizării și preconcentrării colchicinei, obținându-se un pic mai îngust la bază și cu o arie corectată mai mare comparativ cu cel obținut prin utilizarea tamponului de lucru fără adaos de acetonitril. Acest fenomen poate fi datorat scăderii adsorbției colchicinei de pereții capilarei sub influența solubilizantă a acetonitrilului. În schimb la concentrații mai mari se observă exact fenomenul invers, de scădere a ariilor corectate ale colchicinei, datorită scăderii interacțiunii protoalcaloidului cu faza pseudostaționară.

În cazul în care s-a adăugat acetonitril și soluției probă (20% v/v) nu s-a mai înregistrat picul colchicinei datorită distrugerii miceliilor, ce nu a mai permis focalizarea analitului.

c) natura și concentrația surfactantului

Prin prepararea unor amestecuri de surfactanți de polaritate diferită (sarea de sodiu al acidului heptan-1-sulfonic, lauril sulfat de sodiu, etc.) nu se înregistrează îmbunătățiri ale performanțelor preconcentrării sau separării electroforetice a colchicinei. Astfel, studiile au continuat prin utilizarea unei faze pseudostaționare monocomponent utilizând lauril sulfatul de sodiu în diverse concentrații.

Prin creșterea concentrației de surfactant în tamponul de lucru are loc creșterea agregării micelare, ce poate duce la creșterea densității de sarcini pe suprafața exterioară a miceliilor. Acesta la rândul său poate duce la creșterea mobilității electroforetice a miceliilor și la o scădere a timpului de analiză. Din păcate, prin creșterea exagerată a concentrației de detergent, odată cu creșterea concentrației cationilor de Na+, crește foarte mult curentul de separare și se poate induce formarea fluxului electroosmotic cu efecte nefavorabile asupra preconcentrării și timpului de migrare.

De asemenea, concentrația ridicată a detergentului determină o scădere a sensibilității detecției datorită dispersiei radiației incidente și totodată duce la o scădere a selectivității separării electroforetice (figura 55).

Fig. 55 Electroforegramele unei soluții standard de colchicină 76,8 ng mL-1 la diferite concentrații de SDS dizolvat în tamponul de lucru (20 mM fosfat (pH=4,00), 100 mM (negru), 50 mM (roșu);

(capilară silice topită cu precondiționare acidă, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; injectare hidrodinamică 61380 mbars; 50oC; -30 kV; gradient presiune 10 mbar, 0-10 minute; detecție 243 nm/50)

d) temperatura

Datorită creșterii temperaturii are loc o scădere a vâscozității tamponului de lucru ce va duce la o scădere a timpului de migrare (figura 56). Suplimentar, odată cu creșterea temperaturii are loc o scădere a gradului de agregare micelară. Acesta duce la scăderea dispersiei radiației incidente, la creșterea ariei corectate a picului și la o creștere a sensibilității detecției. S-a urmărit influența temperaturii asupra timpului de migrare al colchicinei între 15 și 50oC.

Fig. 56 Electroforegramele unei soluții standard de colchicină 76,8 ng mL-1 la diferite temperaturi de lucru, 25oC (negru), 40oC (roșu);

(capilară silice topită cu precondiționare acidă, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm;injectare hidrodinamică 33480 mbars; -30 kV; tampon de lucru 20 mM fosfat (pH=4,00) + 50 mM SDS; detecție 243 nm/50)

Pentru că molecula colchicinei este relativ termostabilă, se recomandă efectuarea determinărilor la temperaturi ridicate în vederea scăderii timpului de analiză. Pentru o scădere suplimentară a acestuia s-a aplicat un gradient liniar de presiune (0-10 minute, 10 mbar) pe capilară, fără să se observe modificări ale profilului picului datorat unei curgeri parabolice.

e) natura, concentrația și pH-ul soluției tampon de lucru

S-a avut în vedere studiul influenței naturii electrolitului asupra curentului de separare, eficienței separării (numărul de talere teoretice) și a timpului de migrare al colchicinei (figura 57). S-au preparat soluții tampon acetat, fosfat și formiat 20 mM (pH=4,00) cu o concentrație de lauril sulfat de sodiu 50 mM.

Fig. 57 Electroforegramele unei soluții standard de colchicină 80 ng mL-1 utilizând diferite soluții tampon de lucru 20 mM, cu un conținut de 50 mM SDS; tampon acetat (verde), tampon fosfat (negru), tampon formiat (roșu);

(capilară silice topită cu precondiționare acidă, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; injectare hidrodinamică 33480 mbars; 50oC; -30 kV; gradient presiune 10 mbar, 0-10 minute; detecție 243 nm/50)

Se poate observa că dintre cele trei soluții tampon utilizate, tamponul fosfat oferă o eficiență a separării deosebită (N = 1581167 talere teoretice/m), secondat de o absorbanță în domeniul UV foarte redusă.

O creștere a concentrației soluției tampon (200 mM) conduce la curenți de separare foarte mari, producând o dispersie termică accentuată a picului colchicinei datorită efectului Joule.

pH-ul soluției tampon a fost aleasă cu minim două unități peste pKa-ul colchicinei (pKa = 1,85) pentru a asigura forma neutră a moleculei.

f) natura standardului intern

Alegerea standardului intern potrivit este un punct critic în dezvoltarea unei metode analitice de separare. De obicei se alege un compus cu proprietăți fizico-chimice similare analitului pentru a avea un comportament foarte asemănător cu acesta în etapele de extracție din diverse probe reale, respectiv în etapele de separare electroforetice. Cel mai recomandat ar fi alegerea unui derivat structural al colchicinei. În acest caz însă ar fi contraindicat, pentru că se dorește aplicarea metodei analitice la dozarea probelor vegetale și biologice, unde posibilitatea de a regăsi acești derivați (produși secundari ai biogenezei colchicinei, produși de degradare, produși de metabolizare, etc.) este foarte mare.

S-au testat diferiți compuși utilizați ca standard intern în metodele de separare prin cromatografie de lichide de înaltă performanță pe baza referințelor din literatura de specialitate (ex. diazepam, acetat de hidrocortizon, etc.) sau alți compuși (α-nitrozo-β-naftol, clorhidrat de berberină, acid picric, acid β-naftil sulfonic, clorhidrat de papaverină, chinină, chinolină, aminoantrachinonă, 1,3-hidroxi-naftalina, toluen, clorhidrat de α-naftil-amina, xilenol-ftaleină, ninhidrină, p-dimetilamino-benzaldehidă, fenolftaleină), însă acestea nu au putut fi aplicate cu succes datorită mecanismelor de separare diferite care guvernează în tehnica electroforetică propusă.

1,3-hidroxi-naftalina, ninhidrina, xilenol-ftaleina sau fenolftaleina ar fi unele din substanțele care ar putea fi utilizate ca standard intern, prezentând un pic cu timp de migrare inferior colchicinei, dar bine separat de acesta. Celelalte substanțe datorită hidrofobicității lor pronunțate au migrat cu frontul de micelii, făcând imposibilă utilizarea lor (figura 58).

Fig. 581 Electroforegrama unei soluții standard de colchicină și 400 ng mL-1 1,3-hidroxi-naftalină (negru), 500 ng mL-1 ninhidrină (roșu), 500 ng mL-1 xilenol-ftaleină (verde), 400 ng mL-1 fenolftaleină utilizând tampon de lucru cu 3% v/v ACN (albastru); (capilară silice topită cu precondiționare acidă, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; tampon de lucru fosfat 20mM (pH=4,00) + 50mM SDS; injectare hidrodinamică 33480 mbars; 50oC; -30 kV; gradient presiune 10 mbar, 0-10 minute; detecție 243 nm/50)

Totuși dintre cele patru substanțe fenolftaleina s-a dovedit a fi cel mai potrivit standard intern pentru că nu apare în mod natural în probele vegetale, biologice sau farmaceutice cu conținut de colchicină și datorită extracției cu randament mare, alături de colchicină, în cazul etapelor de pretratare a probelor.

Din păcate nu s-a găsit nici o substanță cu caracter mai polar, neutră din punct de vedere electric în condițiile date, care să prezinte un pic electroforetic după cel al colchicinei, în zona cea mai puțin expusă apariției de picuri parazite din probele reale.

Prevalidarea metodei electroforetice prin cromatografie micelară electrocinetică cu preconcentrare prin mecanism de măturare

Metoda propusă a fost validată conform normelor ICH descrise înregistrării produselor farmaceutice de uz uman [134], din punct de vedere a liniarității, exactității, a limitei de detecție și cuantificare.

S-au folosit trei serii a câte cinci soluții standard de colchicină pe domeniul de concentrații 10 – 160 ng mL-1 colchicină, preparate dintr-o soluție stoc proaspătă înaintea fiecărei analize, în trei zile diferite. Timpul de migrare mediu înregistrat pentru colchicină în condițiile de separare optimizate a fost de 10,73 minute, cu o deviație standard relativă de 2,10 %.

1. Liniaritate

Curbele de calibare s-au realizat pe cinci nivele de concentrație prin reprezentarea ariilor corectate ale picurilor la 243 nm (= arii citite/timp de migrare electroforetică) în funcție de concentrația protoalcaloidului (figura 60). Punctele obținute au fost corelate cu o dreaptă de calibrare cu ecuația Y[mAU min-1] = 0,0068088 X[ng mL-1] – 0,0036641, R2 = 0,9954.

Fig. 60 Ariile corectate ale picurilor în funcție de concentrația de colchicină standard, pe domeniul 10 – 160 ng/mL colchicină, pentru trei serii (n = 3), trei zile diferite; (capilară silice topită L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; 50oC; -30 kV; injectare hidrodinamică prin presiune 33480 mbar · s; tampon fosfat 20 mM (pH=4,00)+50mM SDS+3%v/v ACN, detecție 243 nm/30)

2. Exactitate

Exactitatea metodei a fost evaluată pe cele cinci nivele de concentrație de colchicină standard folosind trei serii din trei zile diferite (tabelul 11), obținându-se un interval de încredere a regăsirii în domeniul 100,98 ± 3,29%.

3. Limitele de detecție și cuantificare

Limitele de detecție (LOD) și de cuantificare (LOQ) au fost calculați pe baza raportului deviației standard a interceptului dreptei de calibrare și a pantei medii. Acest raport a fost înmulțit cu 3,3 pentru limita de detecție și cu 10 pentru limita de cuantificare și rezultatul a fost exprimat în unități de concentrație, LOD = 2,84 ng mL-1, iar LOQ = 8,62 ng mL-1.

Aplicații practice ale metodei metodei electrocinetice micelare cu preconcentrare

Pentru verificarea aplicabilității practice a metodei, aceasta a fost utilizată cu succes la dozarea colchicinei din probe de urină contaminată cu protoalcaloid.

Probele de urină contaminate cu o cantitate cunoscută de colchicină au fost analizate printr-o diluție și filtrare simplă, urmând să fie injectate direct în sistemul electroforetic (figura 61).

Fig. 61 Electroforegrama unei probe de urină contaminate cu colchicină (roșu) și a probei de urină după adaos standard de colchicină etalon (negru);

(cromatografie electrocinetică micelară cu preconcentrare prin mecanism de măturare, silice topită cu precondiționare acidă, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; tampon de lucru fosfat 20mM (pH=4,00) + 50mM SDS; injectare hidrodinamică 33480 mbars; 50oC; -30 kV; gradient presiune 10 mbar, 0-10 minute; detecție 243 nm/50)

Analiza unor probe de lapte de vacă contaminate cu colchicină este complicată de prezența unei cantități ridicate de lipide care îngreunează procesul de extracție al analitului și al standardului intern.

Din păcate aceste extracții nu au permis extracția standardului intern (xilenol-ftaleina) ce scade acuratețea dozării protoalcaloidului din aceste probe. Nici deproteinizare simplă cu adaos de acetonitril sau metanol (3:1) și centifugare, aplicată uzual probelor de plasmă, nu a adus îmbunătățiri procesului de extracție.

Cromatografia electrocinetică microemulsionară

În figura 63, se poate observa comparația cu metoda cromatografică electrocinetică micelară. Timpii de migrare ai colchicinei și fenolftaleinei sunt mai mari, dar aria corectată este mai scăzută. Putem spune astfel că preconcentrarea colchicinei are loc, dar fie datorită interacțiunii mai slabe cu microemulsia, fie datorită vâscozității mai ridicate a soluției tampon ce scade volumul de probă introdus în capilară, eficiența acestui proces este mai mică. Curenții de separare (60 – 70 A) precum și zgomotul de fond sunt mai ridicați ca la metoda cromatografică electrocinetică micelară.

Fig. 63 Separarea colchicinei prin cromatografie electrocinetică micelară și microemulsionară cu preconcentrare in-line; Sweeping-MEKC, tampon fosfat 20mM (pH=4,00) + 50mM SDS + 3% v/v ACN (roșu); Sweeping-MEEKC, 1788 mg tampon fosfat 20mM (pH=4,00) + 66 mg SDS + 147 mg n-butanol + 17 mg n-octan (negru); Sweeping-MEEKC, 1788 mg tampon fosfat 20mM (pH=4,00) + 66 mg SDS + 135 mg n-butanol + 17 mg CH3Cl (verde);

(silice topită cu precondiționare acidă, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; soluție probă – 250 ng mL-1 colchicină + 800 ng mL-1 fenolftaleină; injectare hidrodinamică 33480 mbars; 40oC; -30 kV; detecție 243 nm/50)

Pentru a încerca creșterea limitei de detecție a metodei s-a investigat influența timpului de injectare asupra semnalului electroforetic al colchicinei.

Fig. 64 Influența timpului (volumului) de injectare asupra separării electroforetice a colchicinei prin tehnica cromatografică electrocinetică microemulsionară cu preconcentrare in-line;

(silice topită cu precondiționare acidă, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; tampon de lucru – 1788 mg tampon fosfat 20mM (pH=4,00) + 66 mg SDS + 147 mg n-butanol + 17 mg n-octan; soluție probă – 250 ng mL-1 colchicină + 800 ng mL-1 fenolftaleină; injectare hidrodinamică 33480 mbars; 40oC; -30 kV; detecție 243 nm/50)

Cum era de așteptat, la creșterea timpului (volumului) de injectare are loc creșterea ariei corectate a colchicinei. Însă prin creșterea zonei de probă introdusă în capilară crește foarte mult distanța pe care trebuie să se deplaseze microemulsia și implicit timpul de migrare al protoalcaloidului. Astfel, la un volum de injectare util (la 84 s timp de 930 mbar, când se mai observă semnal analitic pentru o soluție de colchicină 10 ng mL-1) timpul de migrare al colchiciei (27 minute) este prea mare pentru a fi aplicabilă analizei de rutină. Acest neajuns al metodei MEEKC cu preconcentrare in-line se datorează unei mobilități electroforetice mai mici a acestor vezicule uleioase încărcate electric față de cea a miceliilor. Totodată datorită necesității unor condiții de preconcentrare și separare cu flux electrosomotic nul, acesta nu poate contribui la creșterea mobilității globale a microemulsiei.

Totuși se poate despinde o concluzie foarte importantă, și anume faptul că selectivitatea separării este diferită față metoda micelară, obținându-se o separare mult mai netă între picuri. Acest fenomen se datorează unei penetrări mai facile a solutului în picătura de ulei din microemulsie față de penetrarea prin peretele rigid al miceliilor [156]. Suprafața miceliilor este mai rigidă datorită unei agregări foarte dense ale monomerilor de surfactant, comparativ cu dispunerea lor mai laxă, în alternanță cu moleculele de n-butanol pe suprafața veziculelor de n-heptan din microemulsii.

Astfel s-a testat efectul adăugării cosurfactantului la tamponul de lucru folosit în cazul metodei cromatografice electrocinetice micelare cu preconcentrare asupra separării colchicinei (figura 65). Prin adaosul n-butanolului la tamponul fosfat 20 mM (pH=4,00) cu 50 mM SDS se obțin micelii umflate, cu pereții mai penetrabili și mai polari, similare veziculelor uleioase din microemulsii, dar cu o mobilitate electroforetică superioară [158].

Fig. 65 Preconcentrarea și separarea unei soluții sintetice de colchicină și standard intern prin cromatografie electrocinetică micelară (negru), cromatografie electrocinetică microemulsionară (roșu) și cromatografie electrocinetică micelară cu fază mixtă (verde);

(silice topită cu precondiționare acidă, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; soluție probă – 250 ng mL-1 colchicină + 800 ng mL-1 fenolftaleină; injectare hidrodinamică 33480 mbars; 40oC; -30 kV; 10 mbar, gradient liniar de presiune 0-10 min; detecție 243 nm/50)

După cum se poate observa soluția tampon micelară cu fază mixtă (SDS și n-butanol) oferă o separare foarte bună (Rs=10,7) într-un timp relativ scăzut (12,5 minute), iar eficiența preconcentrării este mult superioară metodei cromatografice electrocinetice microemulsionare.

Astfel s-a trecut la optimizarea metodei cu preconcentrare in-line prin cromatografie electrocinetică micelară cu fază mixtă.

Concluzii

Din cauza ionizării insuficiente a colchicinei chiar și la pH=2, electroforeza capilară zonală nu oferă posibilitatea analizei acesteia prin această metodă.

Separarea și cuantificarea protoalcaloidului s-a realizat în mediu micelar, deoarece acesta permite analiza compușilor neutri din punct de vedere electric. S-au dezvoltat, optimizat și validat două metode electroforetice bazate separări în mediu micelar: cromatografie electrocinetică micelară și cromatografie electrocinetică micelară cu preconcentrare prin stivuire. Prima dintre acestea, a fost validată pe domeniile de concentrație de 200 – 2500 ng/mL și 200 – 4000 ng/mL colchicină, obținându-se o limită de detecție de 31,41 ng/mL și o limită de cuantificare de 95,20 ng/mL. Deși separarea electroforetică prin această tehnică este impresionantă (N = 327000 talere teoretice/m), sensibilitatea obținută nu permite analiza colchicinei din probe biologice.

Astfel, s-a recurs la a doua metodă, cromatografie electrocinetică micelară cu preconcentrare prin stivuire, ce permite preconcentrarea in-line a protoalcaloidului, obținându-se o sensibilitate de 10 ori mai mare decât cea din metoda MEKC, o limită de detecție de 2,84 ng/mL și o limită de cunatificare de 8,62 ng/mL. Metoda a fost validată pe domeniul de concentrație de 10 – 200 ng/mL și apoi aplicată analizei colchicinei din extracte vegetale, alimente și probe biologice.

Selectivitatea separării în cromatografia electrocinetică microemulsionară este diferită față de metoda micelară, obținându-se o separare mult mai netă între picuri. Acest fenomen se datorează unei penetrări mai facile a solutului în picătura de ulei din microemulsie față de penetrarea prin peretele rigid al miceliilor. Suprafața miceliilor este mai rigidă datorită unei agregări foarte dense ale monomerilor de surfactant, comparativ cu dispunerea lor mai laxă, în alternanță cu moleculele de n-butanol (co-surfactant) pe suprafața veziculelor de n-heptan din microemulsii. S-a optimizat astfel metoda pentru a crește la maxim sensibilitatea acesteia. Prin creșterea procentului de cosurfactant din tamponul de lucru are loc creșterea sensibilității, ce duce în paralel la creșterea timpilor de analiză. Creșterea vâscozității soluției tampon implică și optimizarea timpilor de injectare a probelor. De asemenea ar fi indicat să se lucreze la temperaturi cât mai mari cu rolul scăderii la minim al vâscozității.

Tehnicile electroforetice cu preconcentrare, oferă sensibilitate comparabilă cu metodele cromatografice de înaltă performanță (HPLC-UV, HPLC-MS).

Tehnica prin focalizare în mediu micelar nu prelungește cu mult timpul de analiză, pretându-se astfel pentru analizele de rutină.

Separări chirale prin electroforeză capilară

Noțiuni teoretice

Analiza chirală a devenit una dintre cele mai studiate domenii ale CE, aceasta fiind o tehnică de separare puternică a compușilor chirali și de o importanță majoră pentru aplicațiile farmaceutice. Cercetările în acest domeniu s-au accentuat în ultimii ani, dezvoltându-se metode rapide, eficiente, sensibile și selective. Ample cercetări au arătat că analiza chirală prin EC poate fi cu mult superioară tehnicilor convenționale, cum ar fi HPLC și GC, cu rapotul cost-beneficiu superior în EC, deoarece selectorul chiral este adăugat în tamponul de lucru în loc să se folosească coloane chirale scumpe. Posibilitatea utilizării în EC a detecției la lungimi de undă scăzute, permite, de asemenea, separarea și detecția analiților cu grupări cromofore sărace, care sunt greu de detectat prin HPLC [13].

Primul care a realizat separări chirale prin EC a fost Gassmann și colab. (70). Ei au separat un amestec de derivați de dansil ai unor aminoacizi D și L, prin adăugare de Cu(II)-L-histidină tamponului de lucru. De atunci multe studii legate de separările chirale au fost publicate, folosind diferiți compuși capabili să separe antipozii optici [2].

Metode de separare chirală

Multe din principiile de separare chirală folosite cu succes în HPLC, au fost transferate către EC. În principiu, atât aplicarea separării directe cât și indirecte este posibilă. Separarea indirectă se bazează pe utilizarea unui reactiv de derivatizare chiral care formează diastereoizomeri [14].

Metode indirecte

Deoarece diastereoizomerii aceluiași compus posedă proprietăți fizico-chimice diferite, aceștia pot fi, în principiu, separați prin EC, folosind un sistem electroforetic achiral. Acest principiu poate fi aplicat separării unei perechi de enantiomeri. Însă e necesar un mediu chiral ce va modifica proprietățile fizico-chimice ale celor doi analiți, transformând enantiomerii în diastereoizomeri.

Metoda separării indirecte se bazează pe reacția înaintea analizei a unui amestec racemic cu un selector chiral (R sau S), producând un amestec de doi diastereoizomeri ce pot fi separați folosind un sistem electroforetic achiral. Produsul de reacție este un amestec a doi compuși stabili, în care sunt implicate legături puternice (covalente).

Metoda prezintă însă unele dezavantaje, precum: este consumatoare de timp, necesită folosirea selectorilor chirali foarte puri, enantiomerii trebuie să conțină grupări reactive (hidroxil, amino) iar cinetica reacției poate duce la arii diferite ale celor doi diastereoizomeri formați. Probabil datorită acestor dezavantaje, metoda directă de separare este foarte populară în realizarea separărilor prin EC [15].

Metode directe pentru separarea chirală prin EC

În metoda separării directe, selectorul chiral poate fi adăugat tamponului de lucru, legat de peretele capilarei sau inclus într-o matrice de gel. Interacționează cu enantiomerii în timpul procesului electroforetic, formând complecși diastereoizomerici labili. Sunt implicate legături relativ slabe: de hidrogen, π-π, hidrofobice.

Separarea celor doi enantiomeri poate avea loc numai dacă cei doi diastereoizomeri fomați posedă diferite constante de stabilitate, determinând cei doi analiți să migreze cu viteze diferite. Mobilitatea efectivă a celui mai stabil complex enantiomer-selector chiral este mai mică decât a complexului format cu celălalt izomer (aceasta nu se întâmplă dacă selectorul chiral este încărcat negativ).

Separarea directă a enantiomerilor prin EC este mai ușor să se realizeze decât cea indirectă. Metoda directă necesită mai puțin timp deoarece derivatizarea și purificarea nu mai sunt necesare, este disponibil un număr mare de selectori chirali ce pot fi utilizați și pot fi folosiți cantități mici ale acestora [15]. Tipurile de metode de separare chirale directe sunt prezentate în figura 66.

Fig 66 Separări chirale prin metode directe și clasele de selectori chirali utilizați

Ciclodextrinele

Există mai multe tipuri de selectori chirali care pot fi aplicați la enantioseparări, dar cei mai comuni sunt CD naturale și derivații acestora. Primul care a folosit CD în EC este Terabe (71) (72) pentru separarea izomerilor de poziție. Mai târziu, Guttman și colab. (73) a obținut separări chirale prin încorporarea CD într-o capilară umplută cu gel de poliacrilamidă iar Fanali (74) a raportat separări chirale în EC prin adăugarea CD tamponului de lucru. Issaq (75) a comparat separarea compușilor chirali prin EC cu alte metode [2].

Fig. 67 Structura schematică a β-ciclodextrinei

CD naturale și derivații acestora sunt glucide de forma unei găleți (figura 67), fiind utilizați în analizele de rutină pentru enantioseparări. În interiorul capilarei, analiții pot fi incluși în cavitatea CD prin complexare iar timpul de migrare este dependent de mobilitatea analitului și de gradul de interacțiune cu CD. Grupările hidroxil chirale de pe marginea CD pot interacționa enantioselectiv cu analiții chirali care încap în interiorul cavității CD, conducând la separarea enantiomerilor. Există trei tipuri – α-, ß- și γ- CD, diferențele dintre acestea fiind numărul de subunități de glucoză din care sunt compuse. ß-CD este cea mai puțin solubilă în apă, dar solubilitatea acesteia poate fi îmbunătățită prin adăugare de uree. Deoarece enantioselecția se bazează pe formarea de complecși de incluziune între CD-gazdă și analitul chiral, tipul de CD aleasă este un factor important pentru realizarea eficientă a separării enantiomerilor.

Relativ recent a fost prezentată o abordare sistematică a dezvoltării de metode chirale în EC pentru compușii farmaceutici bazici, folosind CD sulfatate (56). Au fost realizate o serie de de dezvoltări de metode pentru mai mulți compuși, prin modificarea parametrilor metodelor, selectorilor chirali și a concentrațiilor, pH-ului tamponului, tipului de modificator organic, tipului de tampon, temperaturii și tensiunii aplicate [13].

Cromatografie electrocinetică micelară chirală

(Chiral MEKC)

Separarea enantiomerilor prin MEKC implică adăugarea unui agent chiral ca: tensioactivi chirali, eteri-coroană sau CD tamponului de lucru ce conține micele chirale / achirale. MEKC chirală cu tensioactivi chirali este un important mod de separare pentru compușii chirali, putându-se folosi tensioactivi chirali inclusiv compuși naturali, cum ar fi săruri biliare (67), aminoacizi (68) și glucoză (69). Separarea chirală în MEKC este afectată de afinitatea enantiomerilor față de micele precum și de concentrația fazei micelare, care depinde de proprietățile de agregare ale tensioactivilor chirali [13].

CD pot fi folosite, de asemenea, ca și aditivi chirali în MEKC. Acest mod de abordare, numit cromatografie electrocinetică micelară mediată de ciclodextrine (MEKC-CD), utilizează în principal CD neîncărcate în combinație cu micele încărcate electric ale detergenților, cum ar fi dodecil sulfatul de sodiu (SDS).

În astfel de sisteme, separarea chirală este cauzată de complexarea enantiomerilor analitului cu CD, în timp ce micelele încărcate ce migrează în sens invers EOF-ului, permit analiza compușilor neutri. În plus, MEKC – CD poate fi adecvată analizei amestecurilor complexe, prin partiționarea analiților între micelele lipofile și tamponul apos, adăugând un plus de selectivitate separării. CD au fost, de asemenea, combinate cu selectori perechi de ioni pentru enantiorezoluție [16].

Selectori perechi de ioni

Selectorii perechi de ioni sunt folosiți ca aditivi în tampon pentru a optimiza separările chirale din EC, însă, cu câteva excepții, enantioseparările au fost raportate numai în medii neapoase. Ca urmare a constantei dielectrice scăzute și a interferențelor mai puține cu interacțiunile electrostatice, solvenții organici oferă un mediu mai bun decât apa pentru formarea perechilor de ioni. Mecanismul separării se bazează pe formarea de perechi de ioni diastereoizomerice între enantiomerii analitului și selectorul chiral. Analiții și contra-ionii chirali posedă sarcini opuse, rezultând în migrarea partenerilor în direcții opuse. Din moment ce perechile de ioni sunt electroneutre, mobilitățile electroforetice sunt zero. De aici rezultă că singurul motiv pentru enantioselectivitate în aceste sisteme este diferența între constantele de legare ale enantiomerilor cu reactivul chiral.

Acizii, cum ar fi acizii (R)- și (S)-camforsulfonic [35] sau acidul (-)-2,3,4,6-di-O-izopropiliden-2-keto-L-gulonic [36] au fost aplicați pentru separarea enantiomerilor substanțelor medicamentoase bazice, printre care simpatomimeticele și β-blocantele [16].

Mecanismele de separare chirală

Moleculele cu structuri diferite, precum și diastereoizomerii, în cazul în care sunt realizate densități de sarcină diferite, prezintă mobilități diferite. Cu toate acestea, enantiomerii nu diferă în proprietățile fizico-chimice cu excepția interacțiunii lor cu un mediu chiral înconjurător. Într-un astfel de sistem, separarea se bazează pe formarea de complexe diastereomerice tranzitorii între enantiomerii R- și S- (notate R și S) și agentul chiral de complexare C. Echilibrele termodinamice sunt caracterizate prin constantele de complexare KR și KS, presupunând formarea unui complex 1:1 între enantiomeri și selectorul chiral:

(28)

(29)

În general, mobilitatea efectivă a unui analit, µeff, adică mobilitatea aparentă corectată față de mobilitatea EOF-ului, este egală cu suma mobilităților electroforetice a tuturor speciilor în care poate exista analitul raportat în funcție de fracția molară ϕ a respectivelor specii:

(30)

unde n este numărul speciilor prezente în condițiile experimentale. Presupunând că pentru o separare chirală dată enantiomerii există numai într-o formă complexată și necomplexată, ec. (30) devine pentru enantiomerul R:

(31)

unde µf este mobilitatea enantiomerului liber, µcR este mobilitatea complexului analit-selector iar f este fracția speciilor necomplexate. Considerând constanta de complexare, KR iar concentrația selectorului, [C], mobilitatea efectivă a enantiomerului R poate fi exprimată ca:

(32)

Ecuații analoage cu ec. (31) și (32) pot fi de asemenea scrise și pentru enantiomerul S. Pentru enantioseparările prin EC, mobilitățile efective ale enantiomerilor trebuie să fie diferite, adică , rezultând ecuația fundamentală, dezvoltată de Wren și Rowe [12]:

(33)

Aceasta se produce ca urmare a unei diferențe în constantele de formare ale complexului (KR ≠ KS) sau o diferență în mobilitățile complexelor enantiomer-selector (µcR ≠ µcS). În plus, mobilitățile enantiomerului liber și a complexului enantiomer-selector trebuie să fie diferite (µf ≠ µc). Constantele de complexare reflectă recunoașterea enantioselectivă de către selectorul chiral și sunt baza enantioseparărilor în cele mai multe cazuri. Mobilitățile diferite ale complecșilor diastereoizomerici tranzitorii pot fi explicate printr-o diferență în forma acestora, de exemplu, "fixarea mai bine" a unui enantiomer poate duce la un complex cu un volum molecular mai mic. În plus, complecșii diastereoizomerici pot să difere prin valorile pKa ale acestora, care se traduce în general prin diferite sarcini totale și, astfel, diferite mobilități ale complecșilor.

Presupunând mobilități egale ale complecșilor diastereoizomerici, adică µcR = µcS, ec. (33) poate fi transformată în:

(34)

Însă, dacă se presupune că µcR ≠ µcS și nu există nici o diferență între constantele de complexare, ec. (33) poate fi rescrisă:

(35)

În EC, principiul de migrare (forțele ce conduc analiții prin capilara de separare), se bazează pe mecanismele electroforetice. În contrast, după cum se menționează mai sus, o separare chirală se bazează pe interacțiunile enantioselective între enantiomerii analitului și selectorul chiral și este, prin urmare, un principiu de separare cromatografic. Faptul că în EC, selectorul este în aceeași fază cu analiții și nu face parte dintr-o fază staționară nemiscibilă cu faza mobilă cum se întâmplă în cromatografie, nu reprezintă o diferență conceptuală între cele două tehnici. În EC, selectorul chiral este numit pseudofază, deși nu reprezintă o fază diferită și poate, de asemenea, să posede mobilitate electroforetică [16].

Fig 68 Schema modurilor de migrare din EC

Separările chirale directe necesită prezența unui selector chiral, care este o moleculă pură din punct de vedere stereoizomeric, capabilă să formeze complecși diastereoizomerici tranzitorii cu enantiomerii analitului. În EC, acest selector este întotdeauna adaugat electrolitului de lucru. Prin urmare, separarea chirală se bazează pe un principiu cromatografic, spre deosebire de migrarea analiților care este electroforetică.

Unul dintre cele mai mari avantaje ale EC față de cromatografie, este faptul că selectorul chiral în sine poate să posede o mobilitate electroforetică. Acest lucru este imposibil în cromatografie. Ulterior, pot fi aplicate diferite scheme de separare pot fi aplicate.

Cele mai frecvente abordări sunt prezentate în figura 68. În cazul selectorilor neutri, doar analiții încărcați pot fi separați, cu excepția cazului în care un al doilea principiu de migrare este introdus, cum ar fi tehnica MEKC. Atunci când se dorește analiza compușilor bazici, sunt utilizate tampoane de lucru acide (figura 68 A.). În aceste condiții, analitul este protonat și migrează la detectorul de la capătul catodic al capilarei, întrucât selectorul nu dispune de mobilitate electroforetică, fiind transportat de EOF. La valori scăzute ale pH-ului acid, EOF-ul este în mare măsură suprimat. Ulterior, enantiomerul analitului care este complexat mai puternic, migrează al doilea, acesta fiind complexat pentru o mai mare perioadă de timp. Cu cât raza hidrodinamică a complexului enantiomer-CD este mai mare decât raza analitului liber, complexul migrează mai încet. Analiții acizi pot fi separați la valori ale pH-ului alcalin (figura 68 B.). Datorită sarcinii lor negative, acizii migrează la anod dar sunt transportați la catod de către EOF-ul puternic ce există la valori alcaline ale pH-ului. În acest caz, cu cât enantiomerul complexat mai puternic prezintă o mobilitate electroforetică mai mare, cu atât mobilitatea acestuia în direcție opusă este mai mică.

Selectorii chirali încărcați sunt mai versatili și oferă mai multe posibilități deoarece ei posedă o mobilitate electroforetică în sine. Cu ajutorul lor pot fi separați și analiții neutri. La valori acide ale pH-ului, selectorul încărcat negativ migrează la anod, în timp ce analiții încărcați pozitiv migrează spre catod unde sunt detectați (figura 68 C.). În acest caz, enantiomerul complexat mai puternic migrează al doilea. Un avantaj general al selectorilor cu sarcină opusă analiților este mobilitatea în sens opus, care permite utilizarea unor concentrații scăzute de selector chiral. În cazul unor concentrații mari ale selectorului sau legarea puternică a acestuia de enantiomerii analitului, analiții nu pot ajunge la detectorul dinspre catod, deoarece izomerii sunt transportați de către selectorul încărcat negativ la anod. În acest caz, polaritatea tensiunii aplicate este inversată și detectarea este efectuată la capătul anodic al capilarei (figura 68 D.). Enantiomerul care formează complecși mai puternici cu selectorul chiral este detectat primul, deoarece este transportat mai rapid spre anod de către selectorul încărcat negativ.

La pH alcalin, selectorii încărcați negativ pot fi de asemenea utilizați în enantiorezoluția analiților neutri și bazici, folosind polaritate normală (figura 68 E.).

La valori alcaline ale pH-ului, compușii bazici sunt neîncărcați și sunt transportați la detectorul de la catod, la fel ca și compușii neutri. Selectorul anionic migrează spre anod și încetinește enantiomerul cel mai puternic complexat, comparativ cu enantiomerul mai slab complexat. De aceea enantiomerul mai slab legat este primul detectat [16].

Partea experimentală

Introducere

S-a urmărit separarea chirală a amestecului obținut în urma unei sinteze de racemizare a colchicinei [17], folosind diverși selectori chirali, prin cromatografie electocinetică micelară chirală.

S-a încercat realizarea enantioseparării prin folosirea ca și selectori chirali a acizilor (+)-1S-camfor-10-sulfonic, (-)-1R-camfor-10-sulfonic, (-)-o-ditoluoil tartric, (+)-p-ditoluoil tartric, pe baza informațiilor extrase din unele articole care descriu separarea unor produși înrudiți chimic ai colchicinei folosind acești compuși ca și selectori chirali prin cristalizare selectivă (metoda diastereoizomerilor) [18]. O altă clasă de selectori chirali folosită au fost ciclodextrinele, acestea fiind compuși utilizați cu mare succes în separările chirale a unei game foarte largi de substanțe medicamentoase, mai ales prin tehnici electroforetice capilare (CE). Reprezentanții ciclodextrinelor investigați, au fost: ß-ciclodextrina, hidroxipropil-ß-ciclodextrina, γ-ciclodextrina.

Un alt motiv pentru care s-a optat pentru alegerea ciclodextrinelor ca și selectori chirali au fost datele din literatură, conform cărora ß-ciclodextrina poate crește stabilitatea colchicinei prin formarea unui compus de incluziune cu aceasta [19]. A fost investigat efectul ß-ciclodextrinei asupra spectrului de absorbție în UV al colchicinei, observându-se o scădere în densitatea optică a acesteia în prezența ß-ciclodextrinei. Totodată, presiunea de vapori a soluțiilor conținând colchicină și ß-ciclodextrină în concentrații echimolare este mai mică decât suma valorilor corespunzătoare ale speciilor luate separat (figura 69). Aceste două chestiuni confirmă formarea unui complex 1:1 între colchicină și ß-ciclodextrină.

Fig. 69 A. Spectrul de absorbție în ultraviolet diferențial al colchicinei (0,02 mmol/L) (în prezența diferitelor concentrații de β-CD (mmol/L): 1:0, 2:10, 3:15);

B. Presiunea de vapori a complexului colchicină-β-ciclodextrină la 37 °C (1- β-ciclodextrină, 2- colchicină, 3- colchicină-β-ciclodextrină (valori măsurate), 4- colchicină-β-ciclodextrină (valori calculate)) [19]

S-au studiat de asemenea derivații de ß-ciclodextrină (hidroxipropil-ß-ciclodextrina), în ideea că derivații subtituiți ai acesteia, pot interacționa diferit cu enantiomerii colchicinei, ceea ce va duce la separarea acestora.

În urma utilizării cu succes a acidului L-aspartic la separarea enantiomerilor protoalcaloidului prin cromatografie pe strat subțire [20], s-a experimentat și folosirea acestuia în tehnicile electroforetice, ca și selector chiral.

Materiale și metode

Reactivii

Toți reactivii folosiți în acest studiu au fost de puritate analitică. Colchicina, acetonitrilul, acidul clorhidric, au fost achiziționați de la Merck (Darmstadt, Germany). Acidul boric, hidroxidul de sodiu, etanolul, metanolul, lauril sulfatul de sodiu, a procurate de la Sigma-Aldrich, Germania.

Ciclodextrinele au fost procurate de la Cyclolab, Ungaria, iar acizii L-aspartic, (+)-1S-camfor-10-fsulfonic, (-)-1R-camfor-10-sulfonic, (-)-o-ditoluoil tartric și (+)-p-ditoluoil tartric au fost cumpărați de la Sigma-Aldrich, Germania.

La prepararea tuturor soluțiilor apoase s-a folosit apă deionizată (18 mΩ) produsă de un sistem de purificare al apei Barnstead EasyPure RoDi (Barnstead, Thermolyne, SUA).

Aparatura

Studiile au fost efectuate pe un sistem de electroforeză capilară Agilent 3D-CE (Agilent Technologies, Germania), cu sursă de înaltă tensiune variabilă ± 30kV și control riguros al temperaturii capilarei, prevăzut cu un sistem de detecție cu șir de diode (190-600 nm) și autosampler, iar achiziția digitală a datelor s-a realizat cu ajutorul 3D-CE Chemstation Rev. A. 08.03(847) (Agilent Technologies, Germania).

S-au utilizat capilare de silice topită nemodificată cu diametru intern de 50 µm și diferite lungimi.

Prepararea soluțiilor și tampoanelor de lucru

Soluțiile apoase ale colchicinei standard au fost preparate prin dizolvarea a 2,5 mg protoalcaloid în apă într-un balon cotat de 25 mL, obținându-se o soluție stoc, din care prin diluare cu tampon borat pH=9,30 au fost preparate toate celelalte soluții necesare analizelor electroforetice.

Probele de racemic al colchicinei s-au realizat prin diluarea acestuia cu tampon borat, urmând să fie injectat direct în sistemul electroforetic.

Soluțiile standard și racemicului s-au ținut la temperatura de +4°C.

S-a utilizat ca și tampon de lucru, tampon borat 10 mM + lauril sulfat de sodiu 50 mM, pH=9,3. Acesta a fost realizat prin dizolvarea cantității corespunzătoare de acid boric în apă și ajustat apoi pH-ul la valoarea dorită cu NaOH 0,1M. S-a adaugat apoi și surfactantul și selectorul chiral la tamponul creat anterior. Soluțiile care conțineau ciclodextrine, au fost filtrate prin filtre Millipore Millex-Hvcu diametrul porilor de 0,45µm, SUA.

Precondiționarea capilarei și condițiile de lucru

Detecția s-a realizat la cele două maxime de absorbție ale colchicinei, la 243 și 350 nm, cu fanta radiației transmise de 30 nm.

Separarea amestecului racemic a fost realizat prin cromatografie electrocinetică micelară chirală. Pentru a obține faza pseudostaționară micelară s-a utilizat lauril sulfatul de sodiu la o concentrație superioară concentrației micelare critice (9 mM).

La începutul fiecărei zile, în vederea hidratării grupărilor silanolice ale suprafeței interne, capilara a fost spălată cu NaOH 1M timp de 10 minute, urmată de o spălare cu NaOH 0,1 M și cu apă distilată timp de 10 minute. Proba a fost introdusă în capilară prin injectare hidrodinamică prin presiune 250 mbar · s.

Capilara a fost precondiționată prin spălare 2 minute cu tamponul de lucru, înaintea fiecărei analize. Tensiunea de separare a fost de +30 kv (465 V/cm), iar injectarea hidrodinamică prin presiune, la 250 mbar · s.

Rezultate și discuții

Colchicina prezintă un singur centru de chiralitate, structurile celor doi enantiomeri ai acesteia fiind prezentate în figura 70.

Fig. 70 Structurile spațiale ale enantiomerilor colchicinei:

S-a urmărit inițial aplicarea în electroforeza capilară a enantioseparării cu ajutorul acidului L-aspartic ca și selector chiral. S-a încercat separarea atât a amestecului racemic obținut la temperatura de refluxare a anhidridei acetice (140-150°C), cât și a celui obținut la diferite temperaturi: 40°C, 80°C precum și în cataliză acidă și bazică. În figura 71, este prezentată electroferograma separării racemicului de colchicină realizat la 80°C. S-a utilizat un tampon borat 10 mM cu lauril sulfat de sodiu 50 mM și 5 mM acid L-aspartic. Tensiunea de separare a fost de + 30 kV (465 V/cm) iar injectarea probei s-a realizat hidrodinamic, prin presiune, la 250 mbar s.

Fig. 71 Electroferograma racemicului realizat la 80°C (tampon borat 10 mM cu lauril sulfat de sodiu 50 mM și 5 mM acid L-aspartic, silice topită cu precondiționare bazică, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; injectare hidrodinamică 250 mbars; 20oC; +30 kV; 10 mbar, gradient liniar de presiune 0-10 min; detecție 243 nm/50)

Din păcate, nu s-a observat separarea enantiomerilor protoalcaloidului folosind ca și selector chiral acidul L-aspartic în condițiile menționate.

Principalele cauze ar putea fi:

fie în urma sintezei efectuate nu a avut loc transformarea izomerului natural (-) al colchicinei în izomerul (+), deși s-a încercat adaptarea și optimizarea sintezei descrise de Bladé-Font prin realizarea sa la diferite temperaturi, atât în cataliză acidă, cât și bazică;

fie acidul L-aspartic nu este capabil să realizeze de fapt separarea enantiomerilor, nefiind capabil să realizeze unele interacțiuni specifice cu enantiomerii colchicinei, acest fapt datorându-se cel mai probabil lipsei formei ionizate a colchicinei, deoarece interacțiunea chirală se presupune a se realiza prin formare de perechi de ioni diastereoizomerice între enantiomerii analitului și selectorul chiral. Pentru că aceste interacțiuni sunt mai puternice în mediu neapos, ca urmare a constantei dielectrice scăzute și a interferențelor mai puține cu interacțiunile electrostatice, ar exista posibilitatea unei separări chirale a colchicinei prin NACE-CZE în mediu acid.

Totuși, au loc unele interacțiuni între acidul L-aspartic și colchicină, deoarece la concentrații de peste 10 mM ale selectorului chiral, picul colchicinei nu apare nici dupa 25 minute, însă aceste interacțiuni sunt probabil nespecifice pentru un anumit enantiomer.

Aceeași situație este și în cazul acidului (+)-1-S-camfor-10-sulfonic, (-)-1-R-camfor-10-sulfonic, neobservându-se o separare a celor doi enantiomeri (figura 72).

Fig. 72 Separarea amestecului racemic al colchicinei obțínut în cataliză acidă și bazică, folosind tampon borat 10 mM cu lauril sulfat de sodiu 50 mM și 10 mM (+)-1-S-camfor-10-sulfonic

(silice topită cu precondiționare bazică, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; injectare hidrodinamică 250 mbars; 20oC; +30 kV; 10 mbar, gradient liniar de presiune 0-10 min; detecție 243 nm/50)

În continuare s-a încercat folosirea ciclodextrinelor ca și selectori chirali. Prin studii de chimie computațională s-a obținut complexul de asociere 1:1 al colchicinei, enantiomerul natural, cu γ-ciclodextrina (a se vedea figura 73), rezultând posibilitatea separării izomerilor cu acest compus. γ-ciclodextrina prezintă o cavitate mai mare decât cea a ß-ciclodextrinei, ceea ce poate conduce la o stabilitate superioară a complexului 1:1 dintre colchicină și γ-ciclodextrina, crescând teoretic timpul în care separarea poate avea loc.

Fig. 73 Complex 1:1 al (-)-colchicinei și γ-ciclodextrinei

Din nefericire, același rezultat apare și în cazul ß-ciclodextrinei și al γ-ciclodextrinei (figura 74 electroferograma + colch naturala).

Fig. 74 Separarea amestecului racemic al colchicinei obțínut în cataliză acidă și bazică, folosind tampon borat 10 mM cu lauril sulfat de sodiu 50 mM și 10 mM γ-ciclodextrină (silice topită cu precondiționare bazică, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; injectare hidrodinamică 250 mbars; 20oC; +30 kV; 10 mbar, gradient liniar de presiune 0-10 min; detecție 243 nm/50)

În cazul hidroxipropil-ß-ciclodextrinei, mai apare un pic înaintea picului colchicinei în cazul amestecului racemic realizat în cataliză acidă (figura 75), dar pentru că nu s-a realizat o purificare avansată a produsului obținut prin recristalizări repetate datorită cantităților foarte mici de (-)-colchicină disponibile, este dificilă alocarea picurilor. .

Fig. 75 Separarea amestecului racemic al colchicinei obțínut în cataliză acidă și bazică, folosind tampon borat 10 mM cu lauril sulfat de sodiu 50 mM și 10 mM hidroxipropil-ß-ciclodextrina

(silice topită cu precondiționare bazică, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; injectare hidrodinamică 250 mbars; 20oC; +30 kV; 10 mbar, gradient liniar de presiune 0-10 min; detecție 243 nm/50)

În figura 76 se poate vedea separarea comparativă a racemicului protoalcaloidului obținut în mediu acid (HCl) folosind diferiți selectori chirali.

Fig. 76 Separarea amestecului racemic al colchicinei obțínut în cataliză acidă, folosind tampon borat 10 mM cu lauril sulfat de sodiu 50 mM și 10 mM selector chiral (β-CD, γ-CD, HP-β-CD), precum și tampon borat 10 mM cu lauril sulfat de sodiu 50 mM, fără selector chiral (silice topită cu precondiționare bazică, L=88,5 cm, l=80 cm, i.d.=50 μm; injectare hidrodinamică 250 mbars; 20oC; +30 kV; 10 mbar, gradient liniar de presiune 0-10 min; detecție 243 nm/50)

Oricum, și separarea colchicinei de ceilalți derivați este mai evidentă, ceea ce dovedește interacțiunile mai puternice dintre colchicină și hidroxipropil-ß-ciclodextrina. Apariția acelui pic suplimentar în cazul racemicului obținut în cataliză acidă ne duce cu gândul la posibilitatea separării enantiomerilor protoalcaloidului, idee întărită de spectrele aproape identice ale celor doi compuși.

Confirmarea unei separări chirale se va putea face doar după o nouă sinteză și purificare a racemicului fie prin cromatografie pe coloană, fie prin cromatografie pe strat subțire preparativă. Racemicul astfel purificat va putea fi confirmat prin măsurarea puterii rotatorii în etanol 70c ([]D = -220 – -250 o în soluție 1% în etanol 70c) și efectuarea unei caracterizări fizico-chimice complete (punct de topire, spectre UV, IR, RMN, SM).

Concluzii

Posibilitățile de separare chirală ale racemicului obținut au fost studiate prin cromatografie eletrocinetică micelară chirală, utilizând în principal CD neîncărcate în combinație cu micele încărcate electric ale detergenților, cum ar fi dodecil sulfatul de sodiu (SDS). Mai pot fi folosiți ca aditivi în tampon și selectori perechi de ioni, mecanismul separării bazându-se pe formarea de perechi de ioni diastereoizomerici între enantiomerii analitului și selectorul chiral. Însă, cu câteva excepții, enantioseparările au fost raportate numai în medii neapoase, ca urmare a constantei dielectrice scăzute și a interferențelor mai puține cu interacțiunile electrostatice.

Separarea chirală este cauzată de complexarea enantiomerilor analitului cu CD, în timp ce micelele încărcate ce migrează în sens invers EOF-ului, permit analiza compușilor neutri. În plus, MEKC – CD poate fi adecvată analizei amestecurilor complexe, prin partiționarea analiților între micelele lipofile și tamponul apos, adăugând un plus de selectivitate separării.

Compușii utilizați ca selectori chirali pentru separarea colchicinei au fost reprezentați de ciclodextrine (β-ciclodextrina, γ-ciclodextrina și hidroxipropil-β-ciclodextrina) și selectori perechi de ioni (acidul L-aspartic, acidul (+)-1S-camforsulfonic), singurul care a oferit rezultate promițătoare fiind hidroxipropil-ß-ciclodextrina, pe racemicul obținut în cataliză acidă.

Urmează să se confirme separarea celor doi enantiomeri și prin alte tehnici după o purificare avansată a racemicului.

Bibliografie

Gübitz G, Schmid MG. Chiral separation by capillary electromigration techniques. J Chromatogr A 2008;1204:140-156.

Gerd H., Beate P. Heinz N., ,,Determination of colchicine residues in sheep serum and milk using high-performance liquid chromatography combined with electrospray ionization ion trap tandem mass spectrometry’’, Analytical Chemistry, 2005, 77, 2421-2425

Scriba GKE. Enantiomer separation by capillary electrophoresis. In: Subramanian G, eds. Chiral separation techniques. Third edition. Weinheim:WILEY-VCH, 2007:333-368.

Oniga I. Farmacognozie. Alcaloizi. Cluj-Napoca 2001:104-109.

Bodea C. Tratat de biochimie vegetală. București: Editura Academiei R.S.R. 1966.

Poole CF, Cooke M, Wilson ID. Encyplopedia of separation science. 1st edition. Academic Press 2000.

Colchicine – Safety Data Sheet [database on the Internet]. Office of Research Services. [cited. Available from: http://dohs.ors.od.nih.gov/pdf/Colchicine%20REVISED.pdf

Hosoya H, Tanaka J, Nagakura S. Ultra-violet absorbtion spectra of tropone, troponium ion, tropolone and 2,4,6-octatrienal. Tetrahedron 1962;18:859-74

Sabnis DD. Lumicolchicine as a tool in the study of plant microtubules: some biological effects of sequential products formed during phototransformation of colchine. Journal of Experimental Botany. 1981;32(126):271-8.

Ertel NH, Wallace SL. Purification of colchicine, its photoisomer(s), and some congeners by Paper and Thin-Layer Chromatography. Biochemical Medicine. 1970;4:181-92.

Brossi A, Boyé, Muzaffar A, Yeh HJC, Toome V, Wegrzynski B, George C. aS,7S-absolute configuration of natural (-)-colchicine and allocongeners. FEBS Letters 1990;262:5-7.

Brossi A. Bioactive alkaloids. 4. Results of recent investigations with colchicine and Physostigmine. Journal of Medicinal Chemistry 1990;33:2311-9.

Brossi A, Yeh HJC, Chrzanowska M, Wolff J, Hamel E, Lin CM, Quin F, Suffness M, Silverton J. Colchicine and its analogues: recent findings. Medicinal Research Reviews 1988;8:77-94.

Bladé-Font A. New chemistry of colchicine and related compounds. I. Reaction with aliphatic anhydrides leading to achiral compounds. Tetrahedron Lett 1977;34:2977-2980.

Kowalska T, Sherma J. Thin layer chromatography in chiral separations and analysis. vol. 8. Boca Raton: CRC Press, 2007:420.

Beesley TE, Scott RPW. Chiral Chromatography. Chichester: John Wiley & Sons Ltd., 1998:1-30.

Davankov VA. Analytical chiral separation methods (IUPAC recommendations 1997). Appendix 4. Moscow, 1997:4681-4684

Aboul-Enein HY, Ali I. Chiral separations by liquid chromatography and related technologies. vol. 90. New York: Marcel Dekker, Inc., 2003:376.

Bhushan R, Ali I. Resolution of Racemic Mixtures of Hyoscyamine and Colchicine on Impregnated Silica Gel Layers. Chromatographia 1993;35:679-680.

http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/analytical-products.html?TablePage=8674336

http://www.merck-chemicals.ro/tlc-and-hptlc-plates/c_66.b.s1OZaMAAAEdpKM1tlJu

Wall PE, Royal Society of Chemistry. Thin-layer Chromatography A Modern Practical Approach. Gateshead:Athenaeum Press Ltd, 2005:185.

http://camag.com/v/support/what_chromatogram_development.html

Dumont R, Brossi A, Silverton JV. Facile conversion of natural colchicine into (±)-congeners and (+)-enantiomers including 2-demethyl analogues. J Org Chem 1986;51:2515-2521.

Bladé-Font A. New chemistry of colchicine and related compounds. I. Reaction with aliphatic anhydrides leading to achiral compounds. Tetrahedron Lett 1977;34:2977-2980.

Ammar HO, El-Nahhas SA. Improvement of some pharmaceutical properties of drugs by cyclodextrin complexation. Pharmazie 1995;50:269-272.

[1]

1. Hargittai I, Hargittai M. Eds., Symmetry Through the Eyes of a Chemist, VCH Publishers, Inc., New York, 1987.

8. Ladik JJ, Szekeres Z. J Mo. Model 2006;12:462

[2]

5. Davankov VA, Meyer VR, Rais M. A vivid model illustrating chiral recognition induced by achiral structures. Chirality 1990;2:208-210.

6. Krstulovic AM. Chiral Separations by HPLC, Applications to Pharmaceutical Compounds. Ellis Horwood 1989:548 pp.

7. Davankov VA, Kurganov AA, Bochkov AS. Resolution of racemates by high-performance liquid chromatography. Adv Chromatogr 1983;22:71-116.

8. Schreier P, Bernreuther A, Huffer M. Analysis of Chiral Organic Molecules. Walter de Gruyter & Co. 1995:331.

9. Armstrong DW, Han SM. Enantiomeric Separations in Chromatography. CRC Critical Reviews in Analytical Chemistry 1988;19:175-224.

10. Pirkle WH, Pochapsky TC. Consideration of chiral recognition relevant to the liquid chromatographic separation of enantiomers. Chem Rev 1989;89:347-362.

[1]

4. Matsuura T, Koshima H. J Photochem Photobiol C Photochem Rev., 6, 7, 2005.

[4]

44. Chankvetadze B. Capillary Electrophoresis in Chiral Analysis. New York: John Wiley & Sons, 1997:353.

84. Ramos L, Bakhtiar R, Majumdar T, Hayes M, Tse F, Rapid Commun Mass Spectrom 1996;13:2054.

85. Stahl E. Thin Layer Chromatography. 2nd ed. Berlin: Springer-Verlag, 1969.

[1]

11. Easson LM, Steadman E. Studies on the relationship between chemical constitution and physiological action. Biochem J 1933;27:1257.

12. Ogston AG. Interpretation of experiments on metabolic processes, using isotopic tracer elements. Nature 1948;162:963.

13. Dalgliesh CR. Optical resolution of aromatic amino acids on paper chromatograms. J Chem Soc 1952:3940.

14. Davankov VA. The nature of chiral recognition: Is it a three-point interaction? Chirality 1997;9:99.

15. Sundaresan V, Abrol R. Towards a general model for protein–substrate stereoselectivity. Protein Sci 2002;11:1330.

16. Davankov VA. Chiral selectors with chelating properties in liquid chromatography: Fundamental reflections and selective review of recent development. J Chromatogr A 1994;666:55.

17. Huang J, Li T. Highly efficient chromatographic resolution of alpha-alpha’- dihydroxybiaryls. Org Lett 2005;7:5821.

18. Pirkle WH, Hyun MH. Alpha-arylalkylamine-derived chiral stationary phases: Evaluation of urea linkages. J Chromatogr 1985;322:295.

19. Hyun MH, Na MS, Jin JS. Chiral recognition models for the liquid chromatographic resolution of pi-acidic racemates on a chiral stationary phase derived from N-phenyl-N-alkylamide of (S-naproxen). J Chromatogr A 1996;752:77.

20. Hyun MH, Ryoo JJ, Pirkle WH. Experimental support differentiating two proposed chiral recognition models for the resolution of N-(3,5-dinitrobenzoyl)-alpha-arylalkylamines on high-performance liquid chromatography chiral stationary phases. J Chromatogr A 2000;886: 47.

21. Pirkle WH, Liu Y. On the relevance of face-to-edge pi–pi interactions to chiral recognition. J Chromatogr A 1996;749:19.

24. Pirkle WH. The nonequivalence of physical properties of enantiomers in optically active solvents. Differences in nuclear magnetic resonance spectra. I J Am Chem Soc 1966;88:1837.

25. Pirkle WH, Welch CJ. Chromatographic and 1HNMR support for a proposed chiral recognition model. J Chromatogr A 1994;683:347.

26. Murer P et al. On-bead combinatorial approach to the design of chiral stationary phases for HPLC. Anal Chem 1999;71:1278.

27. Welch CJ, Protopopova MN, Bhat GA. Microscale synthesis and screening of chiral stationary phases. Enantiomer 1998;3:471.

28. Wainer IW. Proposal for the classification of high-performance liquid chromatographic chiral stationary phases: How to choose the right column? TrAC 1987;6:125.

29. Schlitt H, Geiss F. Thin-layer chromatography as a pilot technique for rapid column chromatography. J Chromatogr 1972;67:261.

31. Persson BA, Andersson S. Unusual effects of separation conditions on chiral separations. J Chromatogr A 2001;906:195.

40. Armstrong DW, DeMond W. Cyclodextrin bonded phases for the liquid chromatographic separation of optical, geometrical and structural isomers. J Chromatogr Sci 1984;22:411.

41. Armstrong DW, DeMond W, Czech BP. Separation of metallocene enantiomers by liquid chromatography: Chiral recognition via cyclodextrin bonded phases. Anal Chem 1985;57:481.

42. Chang SC et al. Evaluation of a new polar-organic high-performance liquid chromatographic mobile phase for cyclodextrin-bonded chiral stationary phases. TrAc 1993;12:144.

[1]

18. Bhushan R, Martens J. Amino acids and their derivatives, in Handbook of Thin Layer Chromatography. 3rd edition. Sherma J, Fried B, eds. New York: Marcel Dekker, Inc., 2003:373–415.

1. Sajewicz M, Pietka R, Kowalska T. J Liq Chromatogr Relat Technol 2005;28:2499–2513.

19. Lucic B, Radulovic D, Vujic Z, Agbaba D. J Planar Chromatogr 2005;18:294–299.

1. Günther K. Enantiomer separations, In:, Sherma J, Fried B, eds. Handbook of Thin Layer Chromatography. New York: Marcel Dekker Inc., 1991:541.

2. Lepri L, Del Bubba M, Cincinelli A. Chiral separations by TLC, In:, Nyiredy Sz, eds. Planar Chromatography, A Retrospective View for the Third Millenium, Budapest: Springer Scientific Publishers, 2001:517.

3. Siouffi AM, Piras P, Roussel C. Some aspects of chiral separations in planar chromatography compared with HPLC. J Planar Chromatogr 2005;18:5–13.

[4]

16. Dobashi A, Oka K, Hara S. J Am Chem Soc 1980;102:7122.

17. Dobashi Y, Hara S. J Org Chem 1987;52:2490.

18. Dobashi A, Dobashi Y, Kinoshita K, Hara S. Anal Chem 1988;60:1987.

19. Brain K, Rao KRN, Lloyd MJB. Novel chiral stationary phases, In:, Krstulovic AM, eds. Chiral Separations by HPLC Chichester: Ellis Horwood, 1989.

20. Allenmark SG, Andersson S, Mӧller P, Sanchez D. Chirality 1995;7:248.

21. Lepri L, Boddi L, Del Bubba M, Cincinelli A. Reversed phase planar chromatography of some enantiomeric aminoacids and oxazolidinones. Biomed Chromatogr 2001;15:196–201.

7. Franco P, Lӓmmerhofer M, Klaus PM, Lindner W. J Chromatogr A 2000;869:111.

Introduction to Capillary Electrophoresis, Capillary Electrophoresis Primer, Beckman Coulter, http://www.beckmancoulter.com/literature/Bioresearch/360643-CEPrimer1.pdf

Hallem JI. A decade of capillary electrophoresis. Electrophoresis 2000;21:1921-1939.

Xu Y. Tutorial: capillary electrophoresis. The Chemical Educator 1996;1:1-14.

Pesek JJ, Matyska MT. Capillary Electrophoresis: Introduction and Overview. In: Cazes J, eds. Encyclopedia of Chromatography. New York: Marcel Dekker, Inc., 2002:1-3.

Altria K, Marsh A, Sänger-van de Griend C. Capillary electrophoresis for the analysis of small-molecule pharmaceuticals. Electrophoresis 2006;27: 2263–2282.

Keith R. M., Jing Cheng, ,,Capillary Electrophoresis of Nucleic Acids Volume II Practical Applications of Capillary Electrophoresis’’, editura Humana Press 2001.

Breadmore MC, Haddad PR. Approaches to enhancing the sensitivity of capillary electrophoresis methods for the determination of inorganic and small organic anions. Electrophoresis 2001;22: 2464–2489.

Hempel G. Strategies to improve the sensitivity in capillary electrophoresis for the analysis of drugs in biological fluids. Electrophoresis 2000;21:691-698.

Quirino JP, Kim JB, Terabe S. Sweeping: concentration mechanism and applications to high-sensitivity analysis in capillary electrophoresis. J Chromatogr A 2002; 965:357–373.

Holzgrabe U, Laug S, Wienen. Micellar Electrokinetic Chromatography of Aminoglycosides. In: Schmitt-Kopplin P, eds. Capillary Electrophoresis Methods and Protocols. New Jersey:Humana Press, 2008:735-750.

Breadmore MC. Recent advances in enhancing the sensitivity of electrophoresis and electrochromatography in capillaries and microchips. Electrophoresis 2007;28:254-281.

Buchberger WW. Microemulsion Electrokinetic Chromatography. In: Schmitt-Kopplin P, eds. Capillary Electrophoresis Methods and Protocols. New Jersey:Humana Press, 2008:717-734.

Marsh A, Broderick M, Altria K, Power J, Donegan S, Clark B. Capillary Electrophoresis for Pharmaceutical Analysis. In: Schmitt-Kopplin P, eds. Capillary Electrophoresis Methods and Protocols. New Jersey:Humana Press, 2008:205-246.

Gübitz G, Schmid MG. Chiral separation by capillary electromigration techniques. J Chromatogr A 2008;1204:140-156.

Fanali S. An introduction to chiral analysis by capillary electrophoresis. New York:BIORAD, 1973:52.

Scriba GKE. Enantiomer separation by capillary electrophoresis. In: Subramanian G, eds. Chiral separation techniques. Third edition. Weinheim:WILEY-VCH, 2007:333-368.

Bladé-Font A. New chemistry of colchicine and related compounds. I. Reaction with aliphatic anhydrides leading to achiral compounds. Tetrahedron Lett 1977;34:2977-2980.

Dumont R, Brossi A. Facile conversion of natural colchicine into (±)-congeners and( + )-enantiomers including 2-demethyl analogues. J Org Chem 1986;13:2515-2521.

Ammar HO, El-Nahhas SA. Improvement of some pharmaceutical properties of drugs by cyclodextrin complexation. Pharmazie 1995;50:269-272.

Bhushan R, Ali I. Resolution of Racemic Mixtures of Hyoscyamine and Colchicine on Impregnated Silica Gel Layers. Chromatographia 1993;35:679-680.

[2]

1. Tiselius A. Thesis, Nova Acta Regiae Sociates Scientiarum Upsaliensis. 1930;4.

2. Camilleri P. Capillary electrophoresis, Theory and practice. Boca Raton: CRC Press, 1997:1-22.

3. Swank RT, Munkers KD. Anal Biochem 1971;39:462-466.

4. O’Farrell PH. Cell 1978;14:545-557.

5. Hjertén S. Chromatogr Rev 1967;9:122-219.

6. Neuhoff V, Schill WB, Sternbach H. Biochem J 1970;117:623-627.

7. Virtanen R. Acta Polytech Scand 1978;123:1.

8. Mikkers FE, Everaerts FM, Verhegen TPEM. J Chromatogr 1979;169:11-20.

9. Jorgensen J, Lukacs KD. Anal Chem 1981;53:1298-1302.

10. Terabe S, Otsuka K, Ichikawa K, Tsuchuya A, Ando T. Anal Chem 1984;56:111-113.

11. Karger BL, Cohen AS, Gutman A. J Chromatogr 1989;492:585-614.

[3]

4. Ewing AG, Wallingford RA, Olefirowicz TM. Anal Chem 1989;61:293A.

[5]

1. Altria KD. Quantitative Analysis of Pharmaceuticals by Capillary Electrophoresis. Wiesbaden: 1998:1–285.

[8]

12. Adam S, Beck W, Engelhardt H. Würzburger Kolloqium – Kapillarelektophorese – Fortschrittsberichte 94, Bertsch Verlag, Straubing 1994:97.

16. Chevret JP, Van Soest REJ, Ursern M. J Chromatogr 1991;543:439-449.

[20] Philip BM, Shigeru T. High-Sensitivity Analyses of Metabolites in Biological Samples by Capillary Electrophoresis Using Dynamic pH Junction-Sweeping. The Chemical Record 200 ;2:397-404; Published online in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com)

[10]

4. Poole CF. The Essence of Chromatography. Amsterdam: Elsevier, 2003:644.

5. Quirino JP, Terabe S. Sweeping of the analyte zones in electrokinetic chromatography. Anal Chem 1999;71:1638–1644.

[13] Cheng-Huang L, Takashi K. On-line sample concentration techniques in capillary electrophoresis: Velocity gradient techniques and sample concentration techniques for biomolecules. Electrophoresis 2004;25:4058–4073.

[12]

1. Watarai H. Microemulsion capillary electrophoresis. Chem Lett 1991:391–394.

[134] Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), Current Step 4 version, November 2005, International Conference on Harmanisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. (2005).

155. Bjørhovde A, Halvorsen TG, Rasmussen KE, Pedersen-Bjergaard S. Liquid-phase microextraction of drugs from human breast milk. Analytica Chimica Acta 2003;491:155-61.

[Anne Varenne, Stephanie Descroix, Recent strategies to improve resolution in capillary electrophoresis — A review, Analytica chimica acta 628 (2008) 9–23]

133. Kevin AD. Capillary electrophoresis guidebook. Principles, operation and applications. Totowa, NJ: Humana Press Inc., 1996.

151. William J, David L, Middleton L. pH Hysteresis effect with silica capillaries in capillary zone electrophoresis. Analytical Chemistry 1990;62:1587-91.

152. Hitoshi Hoshino NI, Yotsuyanagi T. A capillary electrophoretic reactor with an electroosmosis control method for measurement of dissociation kinetics of metal complexes. Analytical Chemistry 2000;72:4812-20.

153. Bohlin Lars ME, Blomberg G, Heegaard NHH. Utilizing the pH hysteresis effect for versatile and simple electrophoretic analysis of proteins in bare fused-silica capillaries. Electrophoresis 2005;26:4043-9.

154. Weinberger R. Practical Capillary Electrophoresis. Second ed. San Diego: Academic Press, 2000.

156. Terabe S, Matsubara N. Microemulsion electrokinetic chromatography: comparison with micellar electrokinetic chromatography. J Chromatogr 1992;608:23-9.

158. Kevin D, Mahuzier APE, Clark BJ. Background and operating parameters in microemulsion electrokinetic chromatography. Electrophoresis 2003;24:315-24.

[2]

70. Gassmann E, Kuo JE, Zare RN. Science 1985;230:813-815.

71. Terabe S. Trends Anal Chem 1989;8:129-134.

72. Terabe S, Ozuaki H, Otsuka K, Ando T. J Chromatogr 1985;332:211-217.

73. Gutman A, Paulus A, Cohen AS, Grinberg N, Karger BL. J Chromatogr 1988;448:41-53.

74. Fanali S. J Chromatogr 1989;474:441-446.

75. Isaaq HJ. Instrum Sci Technol 1994;22:119-149.

[13]

56. Zhou L, Thompson R, Song S, Ellison D, Wyvratt JM. A strategic approach to the development of capillary electrophoresis chiral methods for pharmaceutical basic compounds using sulfated cyclodextrins. J Pharm Biomed Anal 2002;27:541–553.

67. Terabe S, Shibata M, Miyashita YJ. Chiral separation by electronkinetic chromatography while bile salt micelles. J Chromatogr A 1989;480:403–411.

68. Dobashi A, Ono T, Hara S, Yamaguchi J. Optical resolution of enantiomers with chiral mixed micelles by electrokinetic chromatography. Anal Chem 1989;61:1984–1986.

69. Tickle DC, Okafo GN, Camilleri P, Jones RFD, Kirby J. Glucopyranoside-based surfactants as pseudostationary phases for chiral separations in capillary electrophoresis. Anal Chem 1994;66:4121–4126.

[16]

35 Bjornsdottir I, Hansen SH, Terabe S. J Chromatogr A 1996;745:37–44.

36 Carlsso, Y, Hedeland M, Bondesson U, Pettersson C. J Chromatogr A 2001;922:303–311.

12 Wren SAC, Rowe RC. J Chromatogr 1992;603:235–241.