Dozarea Unor Aminoacizi Prin Metoda Cinetica Landolt

cuprins

Introducere……………………………………………………………………….……………5

Capitolul I. Aminoacizi…………………………..……………………………………………6

1.1.Generalități…………………………………………………………….……………6

1.2.Clasificare………………………………………………………………………………………10

1.3.Proprietăți chimice și fizice……………………………………………………………..11

1.3.1.Reacții generale………………………………………………………………………..11

1.4.Rolul fiziologic al aminoacizilor………………………………………………………14

1.5.Aminoacizi ce se pretează la determinări cinetice…………………………….17

1.5.1.Cisteina……………………………………………………………………………………17

1.5.2.Metionina……………………………………………………………………………..18

1.5.3.Triptofanul…………………………….…………………………………..19

1.6. Metode comparative pentru determinarea aminoacizilor……………….20

1.6.1. Determinarea spectrofotometrică a metioninei din produsul MecoparForte, comprimate…………………………………………………..20

1.6.2 Determinarea spectrofotometrică a metioninei din produsul Metaspar, capsule………………………………………………………………20

1.6.3. Determinarea metioninei printr-o metodă de oxidare cu permanganat………………………………………………………………………21

Capitolul II. Metode de tip Landolt………..……………………….………………………28

2.1.Locul metodelor de tip Landolt în analiza cantitativă……………………….28

2.2. Aspecte generale asupra reacțiilor de tip Landolt……………………….30

2.3. Tipuri de reacții Landolt………………………………………………………35

2.3.1. Sistemul Landolt apǎ oxigenatǎ – iodurǎ – substrat……………………38

2.3.2. Reacția de tip Landolt a acidului ascorbic cu bromatul……………………40

2.3.3. Reacția de tip Landolt a cisteinei cu bromatul………………………….42

2.4. Cinetica reacțiilor de tip Landolt bromat-iodură și iodat-iodură………43

2.5. Aplicații ale metodelor de tip Landolt……………………………………………..51

Capitolul III. Parte experimentală…………………………………………………………57

3.1.Aparatură…………………………………………………………………………………..57

3.2.Determinarea stoichiometriei reacției ……………….……………………58

3.3.Determinarea condițiilor convenabile de lucru….. …………….………60

3.4.Trasarea dreptelor de etalonare……………………….. …………………61

3.5.Studiul interferențelor………………….……………………………………65

3.6.Dozarea metioninei din produse farmaceutice….………….………….65

Concluzii……………………………………………………………………………67

Bibliografie…………………………………………………………………..……..68

+ prezentare powerpoint ( si autoslide) , + referat de sustinere

=== 6.Bibliografie ===

BIBLIOGRAFIE

Ash M., Ash I., Chemical Products Desk References, Edward Arnold a division of Hodder & Stoughton, USA, 1990.

Awtray A. D., Connick R. E., J. Am. Chem. Soc., 1951, 73, 1341.

Baloescu C., Sterescu R., Metode spectrofotometrice de absorbție aplicată la controlul medicamentelor, Ed. Medicală, București, 1975, 70.

Bâldea I., Călin C., Rev. Chim., 1998, 49, 665.

Bâldea I., Some Advances Topics in Chemical Kinetics, Cluj University Press, 2000.

Bungău S., Dozarea prin metode cinetice a concentrațiilor mici, Referat doctorat, Universitatea Babeș-Bolyai, Cluj-Napoca, 1999, 40-6.

Bungǎu S., Tezǎ de doctorat, Cluj Napoca, 2002, 84-6.

Bungău S., Determinarea vitaminelor și aminoacizilor prin metode cinetice, Editura Universității din Oradea, 2003.

Bungău S., Merca V., Copolovici L., Analiză instrumentală și metode de separare, Editura Universității din Oradea, 2004.

Copolovici L., Bâldea I., Bâlc A., Determination of Aromatic Amines by Kinetic Methods, 7th International Symposium on Kinetic in Analytical Chemistry, Bucharest, 26-29 Sept., 2001.

Dushman S., J. Phys. Chem., 1904, 8, 453.

Espenson J. H., Chemical Kinetics and Reaction Mechanisms, McGraw-Hill, New -York, 1981, 5.

Georgescu D., Produse Farmaceutice, Editura Național, București, 1997.

Hill G., Holman J., Chemistry in context, Fourth edition, Nelson, 1995, 578.

Laitinen H. A., Chemical Analysis, McGraw-Hill, New-York, 1960, 431.

Mark H. B. Jr., Rechnitz G. A., Kinetics in Analytical Chemistry, vol. 24,, John Wiley & Sons, New York, !968.

Mottola H. A., Perez-Bendito D., Analytical Chemistry, 1994, 66, 131-62

Mottola H.A., Kinetic Aspects of Analytical Chemistry, vol. 96, John Wiley & Sons, New York, !988, 24-52.

Nenițescu C. D., Chimie organică, vol. II, Ed. Didactică și Pedagogică., București, 1980, 354.

Perez-Bendito D., Silva M., Kinetic Methods in Analytical Chemistry, Ellis Horwoord, Chichester, 1988, 146.

Perez-Ruiz T., Martinez–Lozano C., Tomas V., Ibarra I., Talanta, 1999, 39, 907.

Perez-Ruiz T., Martinez–Lozano C., Tomas V., Sidrach C., Analyst, 1997, 122, 115.

Pietrzyk D. J., Frank C. W., Chimie analitică, Ed. Tehnică, București, 1989.

Reynolds J. E. F., The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition, The Royal Pharmaceutical Society, Council of the Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, London, 1996, 1724, 1384.

Roman L., Săndulescu R., Chimie analitică, vol. II, Analiza Chimică Cantitativă, Ed. Didactică și Pedagogică R.A., București, 1999, 190.

Roman L., Săndulescu R., Chimie analitică, vol. III, Metode de separare și analiză instrumentală, Ed. Didactică și Pedagogică R.A., București, 1999, 190.

Schultz O. E., Schnekenburger J., Einführung in die Pharmazeutische Chemie, Verlag Chemie, Weinheim; Deerfield Beach, Florida; Basel, 1984, 464.

Skoog D. A., West D. M., Fundamentals of Analytical Chemistry, Third edition, Holt, Rinehart and Winston, United States of America, 1976.

Yatsimirskii K. B., Kinetic Methods of Analysis, Pergamon Press, Oxford, 1966.

Wegscheider W., Standardization quality control and education in analytical chemistry, Fressenius J Anal Chem, 1994, 349, (12), 784-93.

***, Agenda medicală 2000, Editura Medicală, București, 2000, P. 1070, 1249, 1269.

***, Analytical Method Committee, Analyst, 1987, 112, 199.

***, Basic Biochemical Calculations: Related Procedures and Principles, Finlayson J. S. Foundation for Advenced Education in the Sciences, Addison-Wesley Publishing Company, Inc., USA, 1969.

***, British Pharmacopoeia, 5th Edition, Vol. II., HM Stationary Office, London, 1988, 47-48.

***, Farmacopeea Română, Ed. A X-a, Ed. Medicală, București, 1993.

***, Nomenclatorul de medicamente și produse biologice de uz uman pentru anul 1988, Ed. Medicală, București, 1988, 58.

***, Fișa producătorului Berlin-Chemie Menarini Group, Infesol 40, soluție perfuzabilă.

***, Fișa producătorului Sicomed Romania, Mecopar Forte, comprimate filmate.

***, Fișa producătorului Sicomed Romania, Metaspar, capsule.

***, Peptide Pharmaceuticals, Edited by David J. Ward, Open University Press, Milton Keynes, Great Britain, 1991, 139.

***, Rote Liste, 1996, ECV-Editio Cantor-Aulendorf/Württ, Bonn, 1996.

***, Tables scientifiques, Rédaction: K. Diem, Ed. J. R. Geigy S.A., Département Pharmaceutique, Sixième édition, 1963, 479.

***, The International Pharmacopoeia, Third Edition, Vol. I, General methods of analysis, World Health Organization, Geneva, 1979.

***, The Merk Index, 11th Edition, Published by Merk&Co., Inc., Rahway, N. J. 1989, U.S.A.,

***, United States Pharmacopoeial Convention, Inc., 23, 12601, Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852, 1995, 130-1.

***, USP Dictionary of USAN and International Drug names, U.S. Pharmacopeia, 12601, Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852, 1997.

=== 3.Aminoacizi ===

Capitolul I

Aminoacizii

1.1. Generalitǎți

Proteinele sunt lanțuri lungi de molecule realizate prin legarea între ei a aminoacizilor. Există 22 de aminoacizi, de răspândire universală în natură, precum și numeroase proteine conținând câteva mii de unități de aminoacizi. Pentru o proteină care conține 5000 de asemenea unități, numărul posibil de aranjamente, folosind toți cei 22 de aminoacizi este de 22500, adică aproximativ 106700, ceea ce va face să nu ne surprindă faptul că proteinele apar în natură într-o diversitate imensă de forme [8].

ADN si ARN sunt baza materialului genetic al tuturor celulelor vii analizate pâna acum. Această echivalență între toate formele de viață este o dovada puternică în sprijinul unei singure surse a tuturor formelor de viață. Nu este plauzibil ca această analogie să fi apărut din întâmplare. 20 de tipuri diferite de aminoacizi sunt utilizați de natură pentru formarea proteinelor. Probabilitatea ca, din întâmplare, să se dedubleze două lanțuri de proteine identice, fiecare cu 100 de aminoacizi, este o șansă din 20100 [8].

Pentru a obține condiția probabilă ca o singură proteină să se poată dezvolta din întâmplare, ar fi fost necesar să se execute 10130 încercări, în fiecare secundă de la începutul timpului. A realiza aceste încercări simultane ar fi însemnat ca rezerva de hrană sa fie de 1090 grame de carbon. Dar, întreaga masa a Pământului (toate elementele combinate) este de numai 6×1027 (în grame). De fapt, 1090 depășește de multe miliarde de ori masa estimata a universului. Aceste diferențe arată clar că întâmplarea nu putea să fie forța motrice care să producă proteine asemănătoare la bacterii și la oameni [8].

Ceea ce poate fi într-adevăr surprinzător este cum un organism oarecare poate controla atât de precis formele de proteină pe care le produce. Prin urmare, aminoacizii care constituie aceste proteine sunt considerați esențiali pentru numeroase procese privind creșterea și formarea noilor țesuturi.

De menționat este faptul că toți sunt aminoacizi α-aminați, de configurație L. În unele plante și microorganisme au fost însă identificați și aminoacizi de configurație D [250].

Punctajul chimic

Cea mai evidentă metodă de a determina calitatea unei proteine este de a o descompune în aminoacizii individuali. Acest profil de aminoacizi este apoi comparat cu un profil considerat. Proteina din ou este proteina standard folosită în scara punctajului chimic, pentru determinarea calității proteinelor și are un scor de 100.

Să luăm de exemplu o proteină ce are o cantitate limitată dintr-un anumit aminoacid. Această cantitate este comparată cu cantitatea găsită în proteina din ou. Atunci când cantitatea din proteina de test este de 75% din cea găsită în proteina din ou, atunci proteina din test are un scor de 75. Astfel, se poate presupune că, dacă ai hrăni un om cu cantitatea exactă necesară organismului sau din aceasta proteină, se va observa nivelul de nitrogen din urină în proporție de 25% din nitrogenul ingerat.

Deși este relativ ușor și ieftin de a calcula punctajul chimic al oricarei proteine, acest punctaj nu prezice mereu, cu exactitate, căt de eficient va face folos corpul de ea. Așa că, avantajul punctajului chimic în determinarea calității proteinelor este ușurinta și costul redus. Dezavantajul este că nu poate spune nimic de digestibilitatea proteinei.

Punctajul chimic implică de asemenea o procedură care poate distruge anumiți aminoacizi și conduce astfel la valori greșite. Este de asemenea insensibilă la substanțe dintr-o proteină dată, care pot afecta negativ digestibilitatea. Pentru a descoperi această variabilă ar trebui folosite animale vii pentru test.

Valoarea biologică (BV)

Evaluarea după valoarea biologică (BV) utilizează testare in vivo. Pentru a determina cantitea exactă a unei proteine ce va fi folosită de organism, trebuie măsurate nu numai pierderile urinare de azot, dar și cele din fecale.

Această metodă este folosită pe plan internațional.

Când măsuram BV-ul unei surse de proteină, două studii diferite sunt efectuate:

– Primul studiu determină cât de mult nitrogen pierde corpul chiar și când nici o proteină nu este administrată. Această pierdere este considerată ca fiind inevitabilă și organismul o va pierde indiferent de cantitatea de nitrogen din dietă.

– În al doilea studiu, o cantitate de proteină, puțin sub necesitatile corpului, este administrată. Ca și înainte, pierderile de azot sunt măsurate, dar de data aceasta sunt comparate cu cantitatea de nitrogen consumată. Pentru a determina adevăratul BV al unei proteine, rezultatele sunt calculate utilizând această formulă:

BV=(Nreținut/ Nabsorbit)x100 (1.1)

Avantajul evident al acestei metode este utilizarea de subiecți umani pentru test. Totuși, există și câteva probleme legate de această metodă. Prima problemă este aceea că există diferențe fiziologice inter-individuale ce pot afecta rezultatele.

A doua problemă o constituie faptul că subiecții folosiți la test nu reprezintă mereu oamenii ce vor consuma proteina în viața reală. Finalmente, doar dacă nitrogenul este reținut nu înseamnă că este utilizat efectiv. De fapt, dupa o periodă cu un consum proteic redus, organele corpului au prioritate pentru aminoacizii noi veniți.

Există schimburi considerabile de proteine între tesuturi, ce nu pot fi detectate când este măsurată doar cantitatea de nitrogen administrată și eliminată. Un țesut poate fi privat (de exemplu – mușchii scheletici), iar un test de determinare a valorii biologice nu va detecta acest lucru.

Utilizarea netă a proteinelor (NPU)

Utilizarea netă a proteinelor (NPU) este un alt test folosit pentru determinarea calității proteinelor. Ca și testul valorii biologice, testul NPU implică două studii ale balanței nitrogenului. Unul dintre ele implică măsurarea azotului când nu este administrată nici o proteină, iar celălalt – la administrarea submaximală.

Formula de calcul folosită este:

NPU=(Nreținut/Nconsumat)x100 (1.2)

Această metodă implică mai mult utilizarea animalelor ca subiecți de test și este folosită mai des. Dezavantajul este că, dacă se obține un scor mic, nu se poate ști dacă acst lucru se datorează unui profil slab de aminoacizi sau digestibilității grele.

Rata de eficiență a proteinelor (PER)

Rata de eficiență a proteinelor (PER) este procedura cea mai cunoscută pentru evaluarea calității unei proteine și este folosită în Statele Unite ca bază a regulilor privind etichetarea alimentelor și RDA (recommended daily allowance – rația zilnică recomandată) de proteină.

Aceasta metodă implică șoareci ce sunt hrăniți cu o cantiate măsurată de proteină și se evaluează periodic greutatea, pe măsură ce cresc. PER-ul este exprimat conform relației:

PER=câștigurile în greutate (g)/aport proteic (g) (1.3)

Avantajele acestei metode sunt costul și simplitatea. Dezavantajele sunt durata lunga de testare; necesitățile de aminoacizi ale șoarecilor nu corespund cu cele umane; mai mult, nici necesitățile de aminoacizi ale animalelor în creștere nu corespund cu cele ale animalelor adulte (animalele în creștere și oamenii au nevoie de mai multă lisină, de exemplu).

PER-ul este folosit pentru a sprijini afirmațiile în legatură cu consumul zilnic de proteine în USA. Se presupune că trebuie să mănânci proteine cu PER-ul egal sau mai mare decât caseina, proteina din lapte; dacă PER-ul acestei proteine este mai mic, trebuie să mănânci mai mult, pentru a îndeplini cerințele RDA.

Etichetele alimentare trebuie să țină seama de calitatea proteinei, utilizând PER-ul caseinei ca referință. Dacă o proteină are PER-ul egal sau superior caseinei, recomandarea RDA este de 45g. Când calitatea proteinei este mai mică decât calitatea caseinei, recomandarea RDA este de 65g.

Întrebarea care se pune este dacă există vreo diferență atunci când îți iei porția zilnică de proteine din mâncare sau suplimente. Atunci când ajung în sânge, corpul uman știe doar ce cantitate din fiecare aminoacid a fost prezent în mâncare. (Dacă financiar este posibil, este mult mai convenabil să bei un shake proteic de înaltă calitate. Nu contează din ce îți iei proteinele, atâta timp cât este o proteină completă și ușor digerabilă).

Digestibilitatea proteinelor – punctajul corect de aminoacizi (PDCAA)

Cum am subliniat și mai devreme, calitatea proteinelor poate fi măsurată prin cantitatea de aminoacizi indispensabili pe care îi conțin. Dacă o proteină conține toți aminoacizii necesari susținerii vieții, este considerată o proteină completă și primește un scor mare.

Pentru că unele proteine nu sunt ușor digerabile, apare nevoia de a testa proteina și din punt de vedere al digestibilității, nu numai după compoziția de aminoacizi. Acest tip de test este numit PDCAA. Este curent considerat un standard federal, acceptat de determinarea calității proteinelor pentru copii preșcolari.

1.2. Clasificare

Amino-acizii sunt combinatii organice care conțin în molecula una sau mai multe grupe amino și una sau mai multe grupe carboxil. Prin urmare, clasificarea acestor substanțe se poate face pe baza mai multor criterii.

Dupa structură, amino-acizii se impart in doua mari categorii [8]:

Alifatici: unde grupele funcționale sunt legate de o catena alifatică, chiar dacă in moleculă există un nucleu aromatic.

Aromatici: unde grupele funcționale sunt legate de un ciclu aromatic.

Chimic, deși prezintǎ caracter neutru, se împart în trei categorii:

bazici (cu mai multe grupǎri aminice decât carboxilice – ornitina, lizina);

neutri (cu ambele tipuri de grupǎri în numar egal – glicocolul, alanina);

acizi (cu mai multe grupǎri carboxilice decât aminice – acidul aspartic, acidul glutamic);

iar din punct de vedere fiziologic, în douǎ categorii:

esențiali (pe care organismul uman este incapabil sǎ-i sintetizeze și-i preia integral din hranǎ): arginina, histidina, izoleucina, leucina, lizina, metionina, fenil-alanina, treonina, triptofan și valina;

neesențiali (pe care organismul uman este capabil sǎ și-i sintetizeze singur): alanina, acid aspartic, citrulina, cistina, acid glutaric, glicina, hidroxiprolina, prolina, serina și tirozina.

După așezarea relativă a grupelor funcționale, se deosebesc α-amino-acizi, β-amino-acizi, γ-amino-acizi etc. Dintre amino-acizii alifatici, cei mai importanti sunt α-amino-acizi, adică acei amino-acizi care conțin grupele funcționale legate de același atom de carbon. Se deosebesc mai multe categorii mari de α-amino-acizi alifatici:

monocarboxilici; 4. tioamino-acizi;

dicarboxilici; 5. diamino-acizi;

hidroxi-amino-acizi; 6. amino-acizi heterociclici.

1.3. Proprietăți chimice și fizice

1.3.1. Reacții generale

Așa cum am menționat deja, aminoacizii sunt substanțe organice, naturale sau de sinteză, conținând, fără excepție, grupările amino – și carboxil -, uneori și alte grupări funcționale în moleculă. Sunt substanțe solide, incolore , mulți dintre ei solubili în apă, alții mai puțin sau greu solubili. Cu excepția proteinei, aminoacizii sunt puțin solubili în alcool și insolubili sau greu solubili în solvenți nepolari.

Având pe moleculă grupe amino- și carboxil, care disociază în mediu apos,, aminoacizii formează amfioni, la anumite valori de pH numite punct izoelectric (pHi); la valori pH diferite, de pHi diferite, moleculele lor capătă o sarcină electrică netă, manifestând proprietăți electroforetice. Aminoacizii reacționează atât cu acizii cât și cu bazele – proprietăți amfotere – și pot funcționa ca sisteme tampon.

Datorită grupărilor amino – și carboxil – cât și a altor grupări din moleculă, aminoacizii prezintă o serie de reacții generale însă și unele reacții particulare care stau la baza multor metode de identificare și dozare a lor [19].

Reacția cu ninhidrina

Aminoacizii reacționează cu ninhidrina, la pH 4-8, formând compuși colorații în albastru-violet.

Într-o primă etapă a reacției, ninhidrina reacționează ca oxidant, reducân-du-se la hidrindantină, iar aminoacidul format suferă o reacție de hidroliză, urmată de o decarboxilare. În etapa următoare hidrindantina reacționează cu o moleculă de ninhidrină și amoniacul eliberat din reacția de hidroliză a aminoacidului, conducând la un produs de condensare colorat caracteristic.

Această reacție fiind foarte sensibilă este utilizată în cadrul metodelor de identificare și dozare ale aminoacizilor.

Reactivi: soluții de aminoacizi 0,1%, soluție de ninhidrină 0,2% în etanol.

Mod de lucru

Într-o eprubetă se introduce 1 ml soluție de aminoacid și se aduce la pH neutru. Se adaugă 5 picături din soluția de ninhidrină, după care se încălzește 2 minute pe o baie de apă, adusă la fierbere. În condițiile reacției se observă o colorație în galben.

Reacția cu acidul azotos

Ca și aminele primare alifatice, aminoacizii reacționează cu acidul azotos, eliberând azot molecular. Reacția are loc cu randament practic cantitativ, la un mol de aminoacid degajându-se un mol de azot. Această reacție permite dozarea azotului aminic din aminoacizii cu gruparea amino- liberă.

Reactivi: aminoacizi, soluție de azotit de sodiu 10%, soluție de acid clorhidric 2M.

Mod de lucru

Se iau 2 eprubete curate, iar în prima se introduc 0,5 g dintr-un aminoacid și 2 ml acid clorhidric 2M. În a doua eprubetă, se introduc 2 ml acid clorhidric de aceeași concentrație, fără a introduce aminoacid. Conținutul eprubetelor se tratează cu 1 ml azotit de sodiu 10%, prin picurare, după o răcire prealabilă în baie de gheață. Se urmărește degajarea azotului.

1.3.2. Reacții specifice

Reacția xantoproteică

Aminoacizii care conțin în moleculă radicali aromatici reacționează cu acidul azotic concentrat, la încălzire, formând nitroderivați de culoare galbenă.

Reactivi: tirozină sub formă de soluție apoasă 0,5%, acid azotic concentrat, soluție de amoniac sau hidroxid de sodiu 20 %.

Mod de lucru

Într-o eprubetă conținând 1 ml soluție tirozină se adaugă, prin prelingere, 1 ml acid azotic concentrat. Se încălzește ușor pe o baie de apă adusă la fierbere, timp de 1 minut, apoi se răcește. În eprubetele care conțin aminoacid cu caracter aromatic se observă o colorație galbenă.

După răcire și alcalinizare cu hidroxid de sodiu sau amoniac, culoarea trece în portocaliu.

Reacția cu acid glioxilic

Triptofanul reacționează, prin restul indolic, cu acidul glioxilic, în prezența acidului sulfuric concentrat, conducând la un compus colorat violet. Reacția poate avea loc și cu acid acetic glacial, care, după expunere la lumină, conține acid glioxilic.

Reactivi: Aminoacizi (triptofan, tirozină, glicină) sub formă de soluție 0,1%,, acid acetic glacial, acid sulfuric concentrat.

Mod de lucru

Peste 2 ml soluție triptofan se adaugă 2 ml acid acetic glacial. În soluția formată se introduc 2 ml acid sulfuric concentrat, prin prelingere înceată pe peretele interior al eprubetei, fără agitare. La limita de separație dintre cele 2 straturi apare un inel violet caracteristic.

Reacția Pauly

Tirozina și histidina dau reacții de cuplare cu acidul sulfanilic diazotat, formând compuși colorați în roșu.

Reactivi: aminoacizi (turozina, histidină, triptofan, glicină) sub formă de soluție 0,1%, soluție de acid sulfanilic 1% în acid clorhidric 0,1M, soluție de azotit de sodiu 5%, soluție carbonat de sodiu 1%.

Mod de lucru

Un amestec format din 2 ml. soluție aminoacid și 1 ml soluție acid sulfanilic (în HCl), răcit într-o baie de gheață, se tratează la rece cu 1 ml soluție azotit de sodiu. După 2-3 min conținutul eprubetei se alcalinizează cu 2 ml soluție carbonat de sodiu. Reacția este pozitivă pentru tirozină și histidină (colorație roșie).

Determinarea azotului aminic prin titrare cu formol

Aminoacizii adoptă, în soluții apoase, structură amfionică, deci se comportă ca acizi (donori de protoni) sau ca baze (acceptori de protoni).

Titrarea aminoacizilor cu hidroxid de sodiu se face în prezența aldehidei formice luată în exces, reacționând cu gruparea amino liberă.

Aciditatea mediului care apare în urma acestui proces poate fi titrată cu hidroxid de sodiu, în prezența fenolftaleinei, datorită faptului că valoarea pH a punctului final de titrare este micșorată.

Reactivi: soluția aminoacidului de analizat cunoscut, având concentrația pe domeniul 0,07-0,13 M, soluție de hidroxid de sodiu 0,1N cu factor cunoscut, soluție de fenolftaleină în etanol 96%, soluție formaldehidă 40%.

Mod de lucru

Într-un pahar Erlenmeyer de 150 ml se introduc 10 ml formaldehidă 40%, 20 ml apă, 2-3 picături soluție de fenolftaleină și se adaugă dintr-o biuretă hidroxid de sodiu 0,1 N, încet, prin picurare, până când apare o colorație roz persistentă. Cantitatea de hidroxid de sodiu utilizată în această operație fiind necesară pentru neutralizarea acidului formic conținut în soluția de aldehidă formică, nu se va lua în calcul.

Într-un alt pahar Erlenmeyer, de 150 ml, se introduc 25 ml soluție aminoacid, 2-3 picături soluție fenolftaleină și se adaugă încet, cu picătura, hidroxid de sodiu 0,1 N dintr-o biuretă până când apare o colorație roz persistentă. În acest stadiu, peste conținutul paharului se adaugă soluția de formalehidă neutralizată anterior. Culoarea roz dispare. Se titrează soluția incoloră obținută, cu hidroxid de sodiu 0,1 N, până la reapariția culorii roz persistentă, caracteristică domeniului de viraj al fenolftaleinei.

Se citește volumul de hidroxid de sodiu 0,1 N cu care s-a făcut titrarea.

14 VFM= mg N2 în 25 ml soluție aminoacid (1.4)

unde V- volumul soluției de NaOH 0,1N consumat;

F- factorul soluției de NaOH 0,1N;

M- molaritatea soluției NaOH cu care s-a făcut titrarea.

1.4. Rolul fiziologic al aminoacizilor [8]

În afarǎ de rolul lor în formarea proteinelor, anumiți aminoacizi îndeplinesc în organismul animal unele funcțiuni fiziologice specifice sau sunt precursori ai unor compuși cu rol esențial în funcționarea organismului.

Aminoacizii sunt de asemenenea și precursorii aminelor biogene și ai aminoalcoolilor, substanțe cu rol fiziologic de mare importanțǎ pentru buna funcționare a organismului.

Este indicat sǎ consumǎm proteine ce conțin cât mai mulți aminoacizi, deoarece fiecare își are rolul sǎu în organism. Iatǎ, în continuare rolul cǎtorva aminoacizi în organism:

Arginina determinǎ creșteri ale secreției de: insulinǎ, glucagon, somatrotop etc. Contribuie la menținerea imunitǎții și intervine în formarea colagenului.

Este precursorul creatinei, a acidului gamma-aminobutiric, utilizat drept neurotransmițǎtor. Crește secreția tubilor seminiferi și intensificǎ acțiunea limfocitelor T.

Ornitina și arginina (guanidino-ornitina) au un rol important în eliminarea amoniacului provenit prin degradarea aminoacizilor, sub formǎ de uree în organismul animal.

Sinteza ureei are loc în ficat. Ornitina fixeaza NH3 și CO2, enzimatic, dând citrulina, care, cu o nouǎ moleculǎ de NH3 trece în argininǎ. Arginina este apoi hidrolizatǎ de arginazǎ în uree și cruitina.

Fenil-alanina este utilizatǎ de cǎtre creier în formarea epinefrinei, cu efecte antidepresive. De asemenea, intervine în mecanismul reținerii informațiilor de cǎtre creier și la prevenirea obezitǎții.

Histidina intervine în creșterea, dezvoltarea, repararea țesuturilor, formarea elementelor figurate ale sângelui. Contribuie la menținerea stratului de mielinǎ.

Izoleucina intrǎ în componența țesutului muscular, ajutând la creșterea și refacerea sa; intervine în formarea hemoglobinei, în stabilizarea glicemiei.

Leucina intervine într-un mare numǎr de procese metabolice, precum și în formarea leucocitelor, a eritrocitelor și a anticorpilor.

Lizina este un aminoacid important în creșterea și dezvoltarea oaselor, a țesuturilor moi, ajutǎ la formarea anticorpilor, a colagenului, precum și a unor hormoni și enzime. Menține scǎzut nivelul trigliceridelor, ajutǎ la refacerea mușchilor dupǎ un efort fizic susținut. Intervine în lupta împotriva virusului herpetic.

Metionina eliminǎ deșeurile din ficat și ajutǎ la regenerarea acestuia și a rinichiului.

Treonina detoxificǎ organismul și previne creșterea concentrației de grǎsimi în ficat.

Tirosina este precursorul tiroxinei (tetraiod- derivatul eterului p-hidroxifenilic al tirosinei). Tiroxina este un hormon ce se gǎsește în glanda tiroidǎ, alǎturi dediiodtirosina.

Iodul din alimente este fixat în glanda tiroidǎ care conține un sistem enzimatic capabil sǎ oxideze ioni de iod la iod elementar. Lipsa iodului în organismul animal duce la o scǎdere a facultǎților mintale (cretinism); excesul de iod provoacǎ o creștere a arderilor în organism (boala lui Basedow).

Triptofanul stimuleazǎ secreția de serotoninǎ, cu efecte calmante; serotonina regleazǎ ritmul circadian, care, la om, este de circa 24 de ore și 30 de minute, producand somnul natural în caz de insomnie.

Valina intervine în creșterea și refacerea muscularǎ, în formarea hemoglobinei și în stabilizarea glicemiei.

Acidul aspartic intervine în convertirea glucozei în energie muscularǎ și intrǎ în componența anticorpilor.

Acidul glutamic ajutǎ sistemul nervos central sǎ reținǎ informațiile, intrǎ în reacțiile de neutralizare a efectelor catabolice ale cortizolului, hrǎnește creierul, prevenind oboseala și depresia; crește secreția de acid gamma-aminobutiric pânǎ la concentrațiile optime. Combate necesitatea de alcool, reduce pofta de ciocolatǎ; este considerat a înlǎtura efectele îmbǎtrânirii, precum și a avea efecte benefice în tratamentul impotenței.

Alanina este un component principal al țesutului conjunctiv, reprezentând și aminoacidul cel mai des utilizat pentru gliconeogeneza.

Glicina stǎ la baza formǎrii altor aminoacizi în corp și a eritrocitelor. Glicocolul este precursor al sarcosinei (N-metilglicocol) și al creatinei (guanidino-sarcosina), care sub forma fosfatului, fosfocreatinei sau acidului creatinfosforic, constituie rezerve de energie ale organismului.

Energia necesarǎ contracției musculare este furnizatǎ de acidul adenosintrifosforic (ATP), care trece în ADP și fosfat anorganic, proces catalizat de miosinǎ. Refacerea acidului adenosintrifosforic din ADP și fosfat anorganic, se face pe seama energiei furnizate de glicolizǎ. Acest proces fiind lent, într-un mușchi suprasolicitat, refacerea ATP-ului necesar unei noi contracții musculare se face pe baza acidului creatinfosforic. Acesta din urmǎ cedeazǎ restul de fosfat bogat în energie acidului adenosindifosforic, trecând în creatininǎ, ce se eliminǎ prin urinǎ.

Prolina este un component de bazǎ al țesutului conjunctiv.

Serina ajutǎ la buna funcționare a sistemului nervos; este utilizat la eliberarea energiei celulare și în formarea acetilcolinei.

Cum se știe, aminoacizii se grupeazǎ în lanțuri numite peptide, primul pas spre alcǎtuirea proteinelor. Unii dintre ei, ajunși în ficat, suferǎ procese de dezaminare, pierzând amoniac, care, cu CO2, formeazǎ ureea (glutamina), principalul element de reciclare a azotului din corp. Aminoacidul dezaminat se numește cetoacid, care este de mare importanțǎ deoarece:

prin transaminare (primirea de grupǎri aminice), dǎ naștere la un nou aminoacid;

poate fi descompus în apǎ, CO2 și energie;

poate fi transformat în glucozǎ (100 g cetoacizi dau 58 g glucozǎ);

formeazǎ corpi cetonici, din care iau naștere acizii grași;

prin decarboxilare (pierderea grupǎrii carboxilice), rezultǎ amine, unele cu importanțǎ biologicǎ mare în producerea de noi aminoacizi.

1.5. Aminoacizi ce se preteazǎ la determinǎri cinetice

Metode specifice de determinare pentru aminoacizii importanți din punct de vedere biologic sunt relativ rar folosite [3,6,7,8,10]. În analiza amestecurilor de aminoacizi, aceste metode sunt de obicei combinate cu metode de separare cromatografică (pe hârtie, în strat subțire, cu schimbător de ioni, gaz sau lichid cromatografie).

Dintre acești aminoacizi, numai câțiva se pretează la determinări folosind sisteme de tip Landolt: cisteina s-a determinat cu sistemul Landolt iodură-apă oxigenată, iar cu sistemul bromat-bromură s-a reușit determinarea cisteinei, metioninei și triptofanului. Cisteina și metiona fac parte din grupa aminoacizilor cu sulf (tio-aminoacizi), iar triptofanul este unul dintre aminoacizii heterociclici [254].

Câteva dintre caracteristicile mai importante ale acestor aminoacizi sunt amintite în cele ce urmeazǎ.

1.5.1. Cisteina

Cisteina are urmǎtoarea formulǎ structuralǎ:

Denumiri: cys (abrev. IUPAC), β-mercaptoalanina, acid 2-amino-3-mercapropropanoic, acid 2-amino-3-mercaptopropionic, acid α-amino-β-tiol-propionic.

Obținere: prin hidroliza proteinelor, prin reducerea electroliticǎ a cistinei, prin sinteza simplǎ a racemicului cisteinei.

Proprietǎți fizice și chimice: cristale albe; solubilã în apǎ, alcool, acid acetic, hidroxid de amoniu; insolubilã în eter, acetonǎ, benzen, acetat de etil, disulfurǎ de carbon, tetraclorurǎ de carbon etc. În soluții apoase neutre sau slab alcaline se auto-oxideazǎ ușor la L-cistinǎ. Soluțiile acide pot fi păstrate câteva zile sub azot. Produsul pur este mult mai stabil decât cel impurificat cu urme de metale. Cuprul și fierul sunt cele mai puternice elemente contaminante.

Nu se gǎsesc produse farmaceutice în care cisteina sǎ fie formulatǎ ca atare, ci numai sub formǎ de cistinǎ.

Acțiune farmacoterapeuticǎ: detoxifiant.

1.5.2. Metionina

Formula de structurǎ a metioninei este:

Denumiri: Met (abrev IUPAC), acid 2-amino-4-(metiltio)butiric; acid α-amino-γ-mercaptobutiric; acid2-amino-4-metiltiobutanoic;

Proprietǎți fizice și chimice: plãci hexagonale, descompunere la 280-2820C; solubilã în apã, alcool diluat cald; insolubilã în alcool absolut, eter, eter de petrol, benzen, acetonã. Sursă de atomi de sulf necesari la biosinteza cisteinei.

Obținere: izolarea L-metioninei naturale din caseina hidrolizatǎ, prin extracție cu butanol; digestia caseinei cu pancreatinǎ; sinteza esterului ftalimidomalonic și alte sinteze etc.

Denumiri comerciale: Meonina, Methilanin, Neston, Lobamine, Mertionin, Neo-methidin, Thimedon, Cynaron, Dyprin, Metione, banthionine, Acimetion, Mecopar, Metaspar etc.

Acțiune farmaco-terapeuticǎ: Este un aminoacid esențial pentru menținerea creșterii la șobolani. Constituie un component esențial în nutriția umanã, deoarece este nesintetizat de organism. Are rol important în metilarea biologicǎ. Contribuie la procesele de sulfoconjugare, stimulând funcția antitoxică hepaticã. Forma D- determinã dezaminarea și ketocompusul este apoi trans-aminat, cu inversia corespunzǎtoare la forma naturalã L- (izolatǎ din caseina hidrolizatǎ, prin extracție cu butanol).

De asemenea, reprezintǎ un agent lipotropic și un nutrient esențial, ce se utilizeazǎ la reglarea pH-ului urinar etc.

1.5.3. Triptofanul

Are urmǎtoarea formulǎ structuralǎ:

Denumiri: L-TRP (abrev. IUPAC), acid l-α-aminoindol-3-propionic; acid l-α-amino-3-indolpropionic; acid 2-amino-3-indolil- propanoic; l-β-3-indolilalaninǎ; l(-)triptofan.

Proprietǎți fizice și chimice: solubil în apã 11,4 g/L la 250C, alcool fierbinte, hidroxizi alcalini, insolubil în cloroform. Distrus de păstrarea prelungită în mediu acid. Dă reacția Millon, Follin, precum și reacția Ehrlich.

Obținere: izolarea din caseinǎ, unde se gǎsește în proporție de 1,2%; sinteza pornind de la β-indolilaldehida și acidul hipuric; din hidantoinǎ; cale alternativǎ pornind de la 3-indolacetonitril; proces pornind cu acid α-cetoglutaric fenilhidrazona.

Denumiri comerciale: Ardeydorm, Kalma, Neurocalm, Optimax, Pacitron, Sedanoct, Trofan, Tryptan etc.

Acțiune farmacoterapeuticǎ: Antidepresiv, nutrient. În cazul plantelor, triptofanul este precursorul unor alcaloizi indolici simpli (Psilocibe mexicana, Piptadeniae semen) sau de mai multe tipuri: fiziostigminic (Physostigmae semen) ergolinic (Secalae cornutum); ajmalicinic, iohimbinic și ajmalinic (Ranwolfiae radix, Yohimbae cortex); chinolinic (Chinae cortex) [11,46,50,55,79,134].

1.6. Metode comparative pentru determinarea aminoacizilor

1.6.1. Determinarea spectrofotometrică a metioninei din produsul MecoparForte, comprimate [8,38]

Reactivi. Mod de lucru

Reactivii folosiți sunt: soluție NaOH 10% proaspăt preparată; soluție apoasă nitroprusiat de sodiu 1% proaspăt preparată; soluție HCl 5%; soluție etalon metionină: 0,1 g metionină, cântărite exact, și 0,002 g vitamina B2 se aduc în balon cotat de 100 ml cu 60 ml apă și 10 ml NaOH 10%, se agită până la dizolvare și se completează la semn cu apă.

Pentru determinare, se cântăresc cu precizie de 0,0002 g, cantitatea de comprimate corespunzătoare greutății medii, se aduce într-un balon cotat de 100 ml cu 40 ml apă. Se adaugă 10 ml soluție NaOH 10%. Se agită 5 minute, se aduce la semn cu apă, se omogenizează. Se filtrează printr-un filtru uscat într-un vas uscat, cca.10-20 ml soluție.

În două eprubete se introduc câte 1ml soluție probă, 1ml soluție etalon, 2 ml apă și 1 ml soluție nitroprusiat. Se introduc ambele eprubete timp de 5 minute într-o baie de apă, la 400C. După răcire se adaugă în ambele eprubete câte 5l HCl 5%. Soluțiile se citesc la spectrofotometru, în cuva de 1cm, față de apă ca martor, după 15 minute.

Calcularea rezultatelor

g/comprimat (1.5)

în care: Ep-extincția probei, Ee-extincția etalonului.

1.6.2 Determinarea spectrofotometrică a metioninei din produsul Metaspar, capsule [8,39]

Reactivi. Mod de lucru

Reactivii folosiți sunt: soluție NaOH 10% proaspăt preparată; Soluție apoasă nitroprusiat de sodiu 1% proaspăt preparată; soluție HCl 5%; soluție etalon metionină: 0,125 g metionină, cântărite exact, și 0,003g vitamina B2 se aduc în balon cotat de 100 ml cu 60 ml apă și 10 ml NaOH 10%, se agită până la dizolvare și se completează la semn cu apă.

Pentru determinare, se cântăresc cu precizie de 0,0002 g, 0,8 g pulbere de comprimate, se aduc într-un balon cotat de 100 ml cu 40 ml apă. Se adaugă 10 ml soluție NaOH 10%. Se agită 5 minute, se aduce la semn cu apă, se omogenizează. Se filtrează, aruncând primii mililitrii de filtrat.

În două eprubete se introduc câte 1ml soluție probă, 1ml soluție etalon, 2ml apă și 1ml soluție nitroprusiat. Se introduc ambele eprubete timp de 5 minute într-o baie de apă, la 400C. După răcire, se adaugă în ambele eprubete câte 5l HCl 5%. Soluțiile se citesc la spectrofotometru, în cuva de 1cm, față de apă ca martor.

Calcularea rezultatelor

g/capsulă (1.6)

în care:

Ep-extincția probei;

Ee-extincția etalonului;

Ce-concentrația etalonului (0,125);

M-greutatea medie a capsulei, în grame;

G-greutatea substanței luată în lucru, în grame.

1.6.3. Determinarea metioninei printr-o metodă de oxidare cu permanganat [7,8]

În reacția cu permanganatul de potasiu, în mediu acid, metionina absoarbe doar sub 250 nm. Procesul poate fi observat prin dispariția culorii permanganatului, spectrele celor douǎ substanțe nesuprapunându-se.

Volumul total al amestecului de reacție a fost 15 ml. Pornirea reacției s-a făcut prin injectarea a 5 ml KMnO4. Compoziția amestecului de reacție, în ordinea de adăugare a reactivilor, este prezentată în tabelul 1.1.

Tabel 1.1. Compoziția amestecului de reacție

Stoichiometria reacției de oxidare

S-a determinat prin metoda titrării spectrofotometrice, măsurând absorbanța remanentă după definitivarea reacției, pentru amestecuri de reacție cu raporturi molare crescătoare, la aciditate constantă.

Stoichiometria reacției de oxidare a metioninei cu permanganat este prezentată în figura 1.1.

O curbă cinetică este prezentată în figura1.2.

Această curbă poate fi descrisă ca variație exponențială, adică cu o cinetică de ordinul întâi în raport cu permanganatul (culoarea), în exces de metionină.

Aceasta înseamnǎ cǎ:

(1.7)

În consecințǎ, se poate corela kobs cu concentrația de metionină (analitul). Determinarea lui kobs se face din panta dreptei obținută prin liniarizarea ecuației (1.1). Un astfel de grafic este prezentat în figura 1.3.

Alegerea condițiilor convenabile de lucru

S-a încercat varierea concentrației de Mn2+ pentru a vedea cât se poate scădea concentrația de Mn2+ pentru a mări viteza de reacție și implicit sensibilitatea metodei. Constanta observată nu depinde de concentrația de Mn(VII), ceea ce sugerează intervenția acestuia într-o etapă ce urmează etapei determinante de viteză.

Un alt parametru a fost concentrația de permanganat. După cum se vede din legea de viteză precum și din tabelul 1.2, concentrația acestuia nu influențează valoarea constantei observate, fiind o dovadă suplimentară pentru dependența de ordinul întâi în raport cu permanganatul.

Tabel 1.2. Constantele de viteză observate pentru diverse concentrații de

permanganat la [metionină] = 210-3 M, pH=2

S-au calculat 1,42.10-3 s-1 și s0=4,2.10-5, pentru t0,95.

S-a ales o valoare optimă pentru determinări (1,6.104 M), valoare ce asigură o absorbanțǎ care se află cuprinsă între 1 și o zonă în care aparatul de măsură este cel mai precis. În aceste condiții a fost trasată curba de etalonare pentru metionină, prezentată în figura 1.4.

Pe domeniul concentrațiilor mici apare liniaritate (proporționalitate cu concentrația de metionină). De asemenea, și pentru domeniul concentrațiilor mai mari apare liniaritate.

Totuși acest domeniu nu poate fi exploatat analitic, deoarece panta este mică (sensibilitatea redusă). În figura 1.5. este prezentată dreapta de etalonare pentru metionină, în domeniul concentrațiilor mici

Ecuația dreptei este:

(1.8)

cu r = 0,9963; s0=0,032; N=4.

Dependența constantei de ordin pseudoîntăi din figura 1.5 sugerează tot o cinetică de tip Michaelis-Menten.

Cum partea exploatată analitic a întregului domeniu seamănă cu modelul amintit mai sus, s-ar putea încerca o potrivire a datelor experimentale cu o ecuație de acest tip:

(1.9)

Se obține o curbă cu coeficientul de corelare r = 0.999.

Din punctul de vedere al mecanismului, dacă acest model este operabil în cazul de față, înseamnă o schemă complexă de etape elementare, cu formarea unui complex intermediar, în concentrații mici (aproximativ staționare), urmată de transferul electronic (sau transferul de oxigen la substrat).

Cercetările de mecanism sunt în afara scopului acestei lucrări, dar cu siguranță apar interesante. Aceasta și pentru faptul că, în cazul când nu se adaugă Mn (II) de la bun început, se obține o dependență de același tip.

Corelarea între concentrația de metionină și constanta observată este prezentată în figura 1.6.

Ecuația este următoarea:

(1.10)

Chimiștii analiști utilizează de regulă drepte de etalonare. Este posibilă obținerea unei astfel de dependențe prin reprezentări dublu reciproce (figura 1.7):

(1.11)

unde a=(0,038±0,06).10-3; b=(0,13±0,02).103; r=0,9975; s0=0,16 pentru N=12.

Metode specifice pentru determinarea aminoacizilor importanți din punct de vedere biologic sunt relativ rar utilizate. În analiza amestecurilor de aceste substanțe, metodele de determinare sunt de obicei combinate cu metode de separare (pe hârtie, în strat subțire, schimbǎtor de ioni, cromatografie de lichide sau gaze etc).

Este evident cǎ numǎrul și varietatea acestor metode de determinare pentru aminoacizi sunt mult mai restrânse, decât în cazul vitaminelor.

=== 4.Landolt ===

Capitolul II

Metode de tip Landolt

2.1. Locul metodelor de tip Landolt în analiza cantitativǎ

Procedurile analitice cantitative se bazeazǎ pe mǎsurǎtori în funcție de vitezǎ sau de cantitǎți. Din punct de vedere al practicii experimentale, aceasta înseamnǎ cǎ mǎsurǎtorile de timp și concentrație trebuie sǎ fie fǎcute simultan. Metodele publicate, care aplicǎ diferite tehnici în acest scop, pot fi clasificate în douǎ categorii principale:

a. Concentrația poate fi aleasǎ ca variabilǎ independentǎ, iar timpul scurs de la amestecarea reactivilor pânǎ ce concentrația unui reactant dat scade sau crește se ia ca o valoare mǎsuratǎ pre-determinatǎ (metode cronometrice). În toate cazurile însǎ se fac douǎ mǎsurǎtori: una cu o soluție cunoscutǎ, etalon, sau o probǎ oarbǎ, iar cea de-a doua cu o soluție necunoscutǎ; din cele douǎ valori ale timpului se poate calcula concentrația necunoscutǎ, folosind graficul de etalonare. Procedurile de acest tip necesitǎ indicatori specifici pentru a ști când concentrația speciilor atinge o valoare pre-determinatǎ.

b. Un alt grup de metode catalitice cantitative se referǎ la tehnicile în care timpul este ales ca variabilǎ independentǎ. În acest caz concentrațiile sunt citite dupǎ anumite intervale de timp fixate. Din graficul concentrației în funcție de timp se poate obține o mǎsurǎ potrivitǎ pentru viteza de reacție. Vitezele de reacție pot fi reprezentate ca funcții de concentrația catalizatorului și vor da graficul de etalonare.

Cercetǎrile asupra diferitelor reacții oxido-reducǎtoare au arǎtat cǎ existǎ numeroase reacții în care, dupǎ o serie de procese succesive care decurg într-un timp bine determinat și reproductibil, apare un produs al reacției care poate fi pus în evidențǎ cu ajutorul unui indicator. Toate acestea au fost numite reacții de tip Landolt.

Aplicarea reacțiilor Landolt furnizeazǎ o nouǎ categorie de metode cronometrice. Landolt [11] a cercetat reacția care are loc între sulfit și iodat, în mediu acid. Când concentrațiile inițiale sunt astfel alese încât, dupǎ amestecarea reactivilor, iodatul este în exces, la început nu se observǎ nici o schimbare, dar dupǎ scurgerea perioadei de inducție, apare colorația caracteristicǎ iodului. Acest ultim proces este ușor de vizualizat și se observǎ imediat. Fenomenul este adesea utilizat sub denumirea de ,,efect Landolt" [4-12].

Dacǎ volumele de reactivi sunt mǎsurate precis cu pipeta sau biureta, temperatura menținutǎ constantǎ, valorile de timp sunt ușor reproductibile, iar abaterea mǎsurǎtorilor de timp nu depǎșește 1%. Aparatura necesarǎ constǎ într-un termostat, un spectrofotometru sau un pH-metru. Adesea se pot face mǎsurǎtori subiective, cu un indicator, fǎrǎ a necesita vreun instrument de mǎsurǎ, altul decât un cronometru.

Și alte reacții lente pot fi transformate în procese care sǎ manifeste efect Landolt. Aceste reacții se numesc reacții Landolt. Majoritatea sunt reacții de oxido-reducere, implicând halogenuri în diferite stǎri de oxidare, dar și reacțiile acid-bazǎ sau de complexare pot fi convertite în reacții Landolt.

Unele sisteme de tip Landolt, care implica oxidanți anorganici și iodura ca agent reducǎtor, sunt folosite adesea la determinarea catalizatorilor [6,7]. Timpul de reacție scade în prezența catalizatorilor. Aplicațiile analitice ale reacțiilor Landolt se bazeazǎ pe urmǎtorul principiu: timpii de reacție sunt mǎsurați în prezența și în absența catalizatorilor, iar concentrația catalizatorului se poate obține din graficul de etalonare.

Datele teoretice ale metodei sunt prezentate pe baze cinetice. În timpul analizei, reacțiile catalizatǎ și necatalizatǎ au loc simultan. Reacția necatalizatǎ poate fi observatǎ și separat dacǎ mǎsurǎtorile timpului de reacție se fac în absența catalizatorului. Având constanta de vitezǎ a reacției necatalizate, rezultatele mǎsurǎrilor timpilor de reacție la reacțiile simultane pot fi evaluate pentru a obține constanta de vitezǎ numai pentru reacția catalizatǎ.

Graficul de etalonare obținut experimental, dovedește o corelație liniarǎ între inversul timpului de reacție și concentrația de catalizator. Cercetǎrile cinetice riguroase conduc la o corelație exponențialǎ parțialǎ. Dezvoltând în serie Taylor exponențialǎ și examinând erorile datorate neglijǎrii membrilor neliniari, se poate explica corelația liniarǎ.

Sensibilitatea, selectivitatea și precizia metodei sunt factori importanți, atunci când se ia în considerare aplicarea metodelor de tip Landolt, fațǎ de alte metode. Un aspect deloc de neglijat îl constituie aparatura simplǎ (mǎsurǎtori potențiometrice) și controlarea simplǎ a temperaturii.

2.2. Aspecte generale asupra reacțiilor de tip Landolt

În cazul metodelor bazate pe reacții de tip Landolt, mǎsurǎtorile se bazeazǎ pe lungimea perioadei de inducție și pot fi aplicate în cazul reacțiilor în care existǎ o perioadǎ de timp scurs între amestecarea reactanților (timpul zero) și apariția unei modificǎri în concentrație a speciei indicator (schimbare în semnalul monitorizat).

Dupǎ cum se observǎ din figura 2.1, lungimea perioadei de inducție t este direct corelatǎ cu concentrația de catalizator [6].

Pentru reacția IO3-+SO32-, Landolt propune urmǎtoarele etape:

IO3- + 3 SO32- = I- +3 SO42- foarte lentǎ (2.1)

IO3- + 5 I-+6 H+ = 3 I2 +3 H2O lentǎ (2.2)

I2 + SO32- + H2O = 2 I- + SO42- +2 H+ rapidǎ (2.3)

Reacția (2.3) este rapidǎ, astfel încât cinetica de consum a oxidantului este determinatǎ de etapele (2.1) și (2.2), iar legea de vitezǎ este de forma urmǎtoare [53,57,143-145]:

(2.4)

Studiile întreprinse [19,58,59,82,172-174] pentru izolarea reacției (2.1) prin diferite procedee cum sunt precipitarea I- cu ajutorul unei soluții saturate de clorurǎ de argint, sau cu ajutorul pH-ului, au condus la urmǎtoarea formulare pentru ecuația vitezei (2.5):

mol/Ls

În soluții relativ acide, predominǎ primul membru și numai în soluții mai alcaline are loc în mod apreciabil și transformarea dupǎ termenul al doilea. Ecuația (2.2) este valabilǎ pentru domeniul de pH = 4-9. Pentru pH 4, ecuația (2.2) ia cu totul altǎ formǎ.

Referitor la reacția (2.2), cunoscutǎ sub numele de reacția Dushman [6-8,11] a fost gǎsitǎ urmǎtoarea expresie pentru ecuația de vitezǎ:

(2.6)

În cazul în care [I3-] [I-] (sistemul Landolt), înaintea virajului indicatorului, primul membru îl depǎșește cu mult pe cel de-al doilea, ecuația devenind:

(2.7)

Ulterior, reluându-se cercetǎrile [11], s-a constat cǎ, deși la concentrații mari de I- (2.10-4 M) este valabilǎ ecuația (2.7) de tipul celei gǎsite de Dushman, la concentrații mai mici de I- (10-8 M) se obține:

(2.8)

astfel încât pentru reacția globalǎ este valabilǎ urmǎtoarea ecuație cineticǎ:

mol/Ls (2.9)

În cazul prezenței clorurilor și bromurilor se constatǎ cǎ în procesul global al reacției Landolt, acestea au o acțiune cataliticǎ specificǎ, asemǎnǎtoare cu iodura [8,11].

Alǎturi de reducerea iodatului de cǎtre sulfit au loc alte șase procese. Produșii acestor reacții oxideazǎ instantaneu sulfitul. Corespunzǎtor acestor reacții simultane, paralele și succesive, a fost stabilitǎ ecuația (2.10):

Reacția (2.3) din procesul global Landolt decurge nemǎsurabil de rapid. În schimb, se poate cerceta reacția redox a dioxidului de sulf cu iodul în prezența apei:

SO2 +2H2O + I2 = SO4 + 4 H+ +2 I- (2.11)

Studiile întreprinse asupra acestei reacții aratǎ cǎ:

– viteza reacției în soluție de SO2 pur este independentǎ de temperaturǎ. în prezența acizilor tari, durata reacției scade apreciabil cu creșterea temperaturii;

– viteza este pronunțat influențatǎ de aciditatea soluției, creșterea [H+], respectiv scǎderea [OH-], determinǎ încetinirea reacției, ceea ce pledeazǎ în favoarea urmǎtoarei formulǎri a reacției:

SO2 +2OH- +I2 = SO42- + 2 H+ + 2 I- (2.12)

SO32- + OH- +I2 = SO42- + H+ + 2 I- (2.13)

În condițiile experimentale ale reacției Landolt, în ciuda caracterului sǎu de fenomen cinetic mǎsurabil, acțiunea iodului asupra sulfitului se produce totuși foarte rapid, astfel încât nu influențeazǎ durata fenomenului global.

Pe lângǎ studiile referitoare la ecuațiile vitezelor proceselor de tip Landolt, o serie de cercetǎri urmǎresc stabilirea mecanismelor de reacție.

Pentru reacția (2.1), transferul de electroni de la IO3- la SO32- are locprin formarea unei asociații strânse între oxidant și reducǎtor [58]. Aceastǎ legǎturǎ formatǎ este de tipul acid-bazǎ (în sens Lewis). Anionii au în primul rând un caracter bazic, dar pot manifesta și proprietǎți acide, în urma alipirii a mai mult de patru perechi de electroni la elementul central al anionului.

Astfel pentru reacția SO32-+BrO32- [81], intermediarul pare a fi:

în care, la atomul de sulf, s-au alipit cinci perechi de electroni, sulfitul acționând ca o bazǎ. Aceasta a fost doveditǎ prin folosirea de bromat marcat cu O18. Se constatǎ cǎ dintre cei patru atomi de oxigen ai sulfatului, numai unul a aparținut bromatului. Un mecanism similar pentru reacția SO32- + IO32- poate fi valabil în aceeași mǎsurǎ.

Acest tip de mecanism a fost denumit de cǎtre Taube „mecanism de sferǎ interioarǎ“ sau „cu punte de ligand“ (aici oxigen), care se transferǎ cu formarea produsului sulfat [82].

Referitor la reacția (2.2), existǎ mai multe încercǎri de explicare a mecanismului de reacție:

în condițiile unei concentrații nu prea mari de iodurǎ [2], procesul determinant de vitezǎ este:

IO3- + 2 H+ + 2 I- 2 HIO + IO- (2.14) sau

IO3- +2 H+ +I- +I3- 2 HIO + I2O- (2.15)

La concentrații mici de iodurǎ este posibilǎ și o a treia reacție:

IO3- +I- +2 H+ HIO + HIO2 (2.16) urmatǎ de o serie de alte etape foarte rapide printre care și:

HIO2 + HI 2 HIO (2.17)

În toate cazurile însǎ, are loc în cele din urmǎ reacția:

HIO + H+ + I- I2 + H2O (2.18)

Acest mecanism propus, deși explicǎ ordinul de reacție cinci al ecuației de vitezǎ este puțin probabil, întrucât din punct de vedere cinetic este greu de presupus ca cinci particule sǎ se ciocneascǎ simultan, pentru ca reacția de mai sus sǎ aibǎ loc.

b) Dupǎ alți autori [6-8], reacția inițialǎ este totdeauna aceea de formare a compusului H2I2O3 (sau a anhidridei sale I2O2), care poate fie sǎ se descompunǎ, fie sǎ reacționeze mai departe cu excesul de iodurǎ conform reacțiilor:

IO3- + I- + 2 H+ H2I2O3 I2O2 +H2O echilibru rapid (2.19)

urmând apoi procesul:

H2I2O3 HIO + HIO2 (2.20) sau:

I2O2 +I- I3O2- (2.21)

c) O altǎ încercare de a explica datele cinetice referitoare la reacția Dushman [6-8], pleacǎ de la presupunerea cǎ singurele procese inițiatoare ar putea fi interacțiunile: IO3- + I-, HIO3 + I-, H+ + IO3-. Dintre acestea, prima este mai puțin probabilǎ decât celelalte douǎ, deoarece implicǎ ioni de aceeași sarcinǎ.

În ceea ce privește reacția HIO3 + I-, deși constanta de disociere a acidului iodic are valoarea Ka=0,169, ceea ce înseamnǎ cǎ în soluții de concentrații relativ moderate existǎ cantitǎți apreciabile de HIO3, n-a fost posibilǎ formularea unui mecanism de reacție pe baza interacțiunii HIO3- + I- care sǎ satisfacǎ cinetica observatǎ.

Interpretarea procesului s-a fǎcut admițând ruperea heteroliticǎ a grupǎrii OH (2.22.a), urmatǎ de reacția IO2+ cu I- și formarea complecșilor A și B (2.22.b)

H+ + IO3- HIO3 IO2+ + OH- (2.22.a)

Formarea complexului B este favorizatǎ de prezența unei concentrații ridicate de iodurǎ. Pe baza celor arǎtate s-au formulat douǎ cǎi de reacție conform schemei de reacție:

H+ + IO3- IO2+ + HO- k (2.23)

Aplicând metoda stǎrilor staționare asupra speciilor active din grupul de reacții (I), se gǎsește relația (2.24):

În mod asemǎnǎtor, pentru calea (II) se obține:

(2.25)

Astfel, viteza totalǎ de reacție este datǎ de expresia (2.26), care este identicǎ cu cea gǎsitǎ experimental:

(2.26)

La concentrații ridicate de iodurǎ, viața medie a complexului IO2+…I- este suficientǎ pentru a-i permite sǎ reacționeze cu excesul de iodurǎ, astfel încât primul termen din expresia vitezei predominǎ, iar ordinul de reacție referitor la iodurǎ este doi. Când concentrația iodurii este micǎ, crește posibilitatea descompunerii complexului IO2+…I-, ceea ce face ca termenul al doilea al expresiei vitezei sǎ devinǎ hotarâtor și ordinul de reacție în raport cu iodura sǎ tindǎ cǎtre valoarea limitǎ unu.

Lipsa unei dovezi directe a disocierii bazice a acidului iodic face ca aceastǎ discuție pur cineticǎ sǎ nu poate fi luatǎ ca un argument cert asupra mecanismului de reacție, cu toate cǎ rezultatele teoretice concordǎ cu cele gǎsite experimental. Cu alte cuvinte, intervenția intermediarului este argumentatǎ numai de date cinetice. Cu toate acestea, reacțiile cu transfer de proton în soluție sunt rapide și este posibilǎ eliminarea de OH- (din acidul protonat) sau apǎ.

Într-un studiu asupra reacțiilor halogenat-halogenurǎ [58], se presupune cǎ în primul rând, se produce interacțiunea:

HOXO2 + H+ H2OXO2+ (2.27)

H2OXO2 + X- X2O2 +H2O (2.28)

Treapta urmǎtoare depinde de natura lui X -, dar este evident cǎ baza X- a deplasat baza H2O din oxidant.

2.3. Tipuri de reacții Landolt

În funcție de viteza etapelor elementare, reacțiile Landolt se pot clasifica în trei grupe:

a) Reacții în care etapa a treia are constantǎ de vitezǎ elementarǎ mai mare de-a lungul întregului proces. La viraj, reducǎtorul este consumat complet de oxidantul aflat în exces cum este și cazul sistemelor: IO3-+S2O32-; BrO3-+acid ascorbic [2,7,56]; IO3-+SO32- [6-8];

b) Reacții în care etapa a treia poate fi mai lentǎ decît etapa a doua. La viraj este consumatǎ numai o parte a reducǎtorului, colorarea producându-se când viteza de formare a iodului dupǎ prima și a doua reacție depǎșește viteza de consumare a lui dupǎ cea de-a treia. Un asemenea exemplu sunt sistemele: IO3-+AsO33- [58]; IO3-+[Fe(CN)6]4- [6-8].

c) Reacții în care etapa a doua este de la început mai rapidǎ decât reacția a treia. La aceste reacții nu apare un efect Landolt propriu zis, ca și în cazul sistemelor: IO3-+NH2OH; IO3-+NH2-NH2; IO3-+p-fenilendiaminǎ [6]; IO3-+C6H8O6 [6];

Multe din cercetǎrile efectuate asupra reacției Landolt, au ca subiect efectul diferitelor substanțe asupra perioadei de inducție. Astfel iodul, acidul arsenios, acidul sulfuric, acidul clorhidric, acidul azotic, acidul iodhidric și acidul formic scurteazǎ perioada de inducție. Acest comportament asemǎnǎtor se datoreazǎ acțiunii catalitice a ionului de hidrogen. Acidul acetic exercitǎ numai o acțiune neînsemnatǎ asupra reacției.

Reacția IO3-+SO32- a fost cercetatǎ în prezența diferiților catalizatori. S-a gǎsit cǎ acizii accelereazǎ reacția, pe când bazele o opresc complet. De asemenea, Cl- Br-, I-, SCN- grǎbesc reacția în mod considerabil, iar tartrații, sulfații, carbonații și oxalații o suprimǎ. Cationii au în general o acțiune mult mai pronunțatǎ decât anionii. A fost cercetatǎ și influența tiosulfatului asupra reacției Landolt. Acesta, în cantitǎți mici, accelereazǎ reacția. S-a propus urmǎtoarea ecuație pentru V0 a acestei reacții catalizate:

(2.29)

unde: k=3,2.108 L4/mol4s =constanta de vitezǎ a reacției Dushman;

k,=8,6.1014 L5/mol5s=constanta de vitezǎ a reacției catalizate;

c=concentrația tiosulfatului exprimatǎ în mol/L.

Este posibilǎ o distincție între urmǎtoarele tipuri de reacții:

reacția Dushman:

IO3- + 5I- + 6H+ 3I2 + 3H2O (2.30)

reacția Dushman T în prezența tiosulfatului ca reducǎtor (viteza Vt, durata de reacție Tt);

reacția Dushman S: în prezența sulfitului ca reducǎtor (viteza Vs, timpul de reacție Ts);

reacția Dushman ST: în prezența sulfitului ca reducǎtor și a tiosulfatului cu rol catalitic.

Mǎsurǎtorile efectuate aratǎ cǎ, atâta timp cât concentrația tiosulfatului este micǎ fațǎ de cea a sulfitului, procesul determinant este reacția ST. Durata reacției scade cu creșterea concentrației de tiosulfat și atinge un minim când aceasta este egalǎ cu concentrația sulfitului. De aici „reacția Dushman T“ devine determinantǎ și durata procesului crește cu creșterea concentrației de tiosulfat. Expresia duratei reacției este:

(2.31) unde: a = concentrația de sulfit;

c = concentrația de tiosulfat;

k = constanta de vitezǎ a reacției „Dushman S “;

k, = constanta de vitezǎ a reacției „Dushman ST “;

k,, = constanta de vitezǎ a reacției „Dushman T “.

Cu aceastǎ ecuație se poate calcula durata reacției, atât în prezența sulfitului sau a tiosulfatului, cât și în prezența amândurora. Pe baza celor observate se încearcǎ interpretarea mecanismului de catalizǎ cu tiosulfat, afirmându-se cǎ tiosulfatul acționeazǎ asupra complexului critic [IO3-2I-2H+]-.

O altǎ substanțǎ cu acțiune cataliticǎ asupra reacției Landolt este acidul ascorbic [6-8]. La amestecarea cu iodat, aceastǎ substanțǎ nu dǎ naștere unui efect Landolt, ci unei separǎri rapide de iod. Reacția (2.3) este mult mai rapidǎ decât reacția (2.2) a procesului global Landolt. În schimb, adaosul unei cantitǎți foarte mici de acid ascorbic, scurteazǎ considerabil perioada de inducție a reacției IO3- + SO32-. Mecanismul catalizei este urmǎtorul:

HIO3 + 3 C6H8O6 = HI + 3 C6H6O6 + 3 H2O

HIO3 + 5 HI = 3 I2 + 3 H2O

2 I2 + H2SO3 + 2 H2O = 4 HI + 2 H2SO4

3 C6H6O6 + 3 H2SO3 = 3 C6H8O6 + 3 H2SO4

3 HIO3 +5 H2SO3 = I2 + 5 H2SO4 + H2O (2.32)

Acțiunea cataliticǎ a acidului ascorbic asupra reacției Landolt este inhibatǎ de un mic adaos de HgCl2, efect mai mult decât compensat cu o cantitate de catalizator. Aceeași observație este valabilǎ și pentru reacția IO3- + AsO33- încetinitǎ de HgCl2. Acțiunea acidului ascorbic asupra acestor reacții încetinite de HgCl2 se explicǎ astfel:

– înlǎturarea influenței încetinitoare a HgCl2 prin reacția (2.5) unde Hg22+ nu influențeazǎ reacția;

2 HgCl2 + C6H8O6 2 Hg2Cl2 + C6H6O6 + 2 HCl (2.33)

-acțiunea cataliticǎ propriu zisǎ pe care o exercitǎ și în absența HgCl2.

Efecte catalitice asemǎnǎtoare au fost constatate și în cazul unor alte substanțe ca: acidul α,α,-dioxo-adipic, pirocatechol reductona, acidul hidroxicumenic.

Printre factorii care influențeazǎ reacțiile Landolt este și temperatura. Temperatura soluției acționeazǎ atât asupra reacției IO3- + I- pe care o accelereazǎ, cât și asupra [H+] care, o datǎ cu creșterea temperaturii, scade, fiind deci posibil ca acțiunea pozitivǎ a temperaturii sǎ fie anihilatǎ de scǎderea [H+]; astfel se obține o influențǎ micǎ a temperaturii asupra reacției (2.2). În schimb, reacția dintre HIO3+3 H2SO3=3 H2SO4+ HI decurge relativ încet și este evident influențatǎ de temperaturǎ.

De asemenea, s-a constatat cǎ reacția Landolt decurge mai încet în apropierea peretelui vasului. Fenomenul a fost explicat prin aceea cǎ, ionii de iodurǎ sunt adsorbiți pe peretele vasului, astfel cǎ viteza reacției în vecinǎtatea lui va fi mai micǎ. Acest lucru a fost dovedit [143] prin filtrarea unei jumǎtǎți din soluție peste vatǎ de sticlǎ, constatându-se cǎ iodul apare mai rapid în partea nefiltratǎ.

Diferiți solvenți, cum este alcoolul, au influențǎ asupra momentului apariției iodului în reacția Landolt, în raport direct cu cantitatea adǎugatǎ. De asemenea, reacția efectuatǎ în apǎ grea decurge cu vitezǎ mai mare decât în apa obișnuitǎ.

2.3.1. Sistemul Landolt apǎ oxigenatǎ – iodurǎ – substrat

În mediu acid are loc reacția lentǎ între H2O2 și I-, cu formare de iod.

(2.35)

Cinetica reacției a fost deja studiatǎ de un numǎr mare de cercetǎtori [4-12] și se cunoaște mecanismul ei:

(lent) (2.36)

(foarte rapid) (2.37)

(lent) (2.38)

(foarte rapid) (2.39)

Viteza de reacție obținutǎ experimental și rezultatǎ din mecanism este:

(2.40)

unde valorile constantelor de vitezǎ la 250C sunt k=0,690,01 M-1min-1 și kH=10,50,01 M-2min-1. Energiile de activare ale celor douǎ reacții sunt Ea=13400cal/mol și ΔH# =10450 cal/mol. Conform cu ecuației (2.40) și lucrând la pH constant, legea de vitezǎ devine:

(2.41)

unde: (2.42)

Pentru a transforma aceastǎ ecuație într-una de tip Landolt, se adaugǎ amestecului acid ascorbic, care joacǎ rol de agent de captare a speciei I2, conform reacției:

rapid (2.43)

care se adaugǎ sistemului de reacții 2.36-2.39.

În acest caz, datoritǎ reacției rapide (2.43), I2 odatǎ format este retransformat în I- de cǎtre C6H8O6. Când tot acidul ascorbic este consumat, iodul este eliberat și are loc efectul Landolt. Acest lucru este ușor de observat chiar și vizual, deoarece amestecul de reactie își schimbǎ brusc culoarea, devenind din incolor, galben (tipic pentru iod), albastru (în prezențǎ de amidon) sau violet (în prezențǎ de albastru de variaminǎ).

Reacția (2.35) este catalizatǎ de numeroși ioni metalici în stǎrile lor superioare de oxidare și a fost propusǎ ca posibilǎ reacție indicator în analiza cineticǎ pentru unele specii ionice provenind de la Zr, Hf, Th, Ta, Mo, W, Fe, Pb și Ag. De asemenea s-au semnalat câteva metode de determinare a catalizatorilor nemetalici, cum sunt Cr2O72- și PO43- [163].

Punctul de final al reacției poate fi detectat vizual [4-12], spectrofotometric, potențiometric, termometric și amperometric. Multe dintre metode prezintǎ o mare sensibilitate; s-au atins limite de detecție de 0,7 μg/L.

Metoda poate fi utilizatǎ la analiza unei mari varietǎți de probe, cum sunt: apa, alimentele, materiile vegetale, produse farmaceutice, mineralele, oțelul.

2.3.2. Reacția de tip Landolt a acidului ascorbic cu bromatul

Pe lângǎ sistemul Landolt Iodurǎ-apǎ oxigenatǎ, un altul de același tip este sistemul bromat-bromurǎ de potasiu [4-12]. Reacția de oxidare a acidului ascorbic cu bromatul face parte din prima grupǎ de reacții Landolt.

Procesele redox succesive în sistemul BrO3-/Br- +C6H8O6 sunt:

BrO3-+5Br-+6H+ = 3Br2+3H2O k1, lent (2.44)

3Br2+3 C6H8O6 = 6Br-+ 6H++3C6H6O6 k2, rapid (2.45)

BrO3-+3C6H8O6=Br-+3C6H8O6+3H2O k3, lent (2.46)

Reacțiile (2.44) și (2.46) determinǎ viteza de consum a bromului. Cinetica reacției (2.45) este cunoscutǎ. Reacția (2.45) decurge foarte rapid. S-a urmǎrit o probǎ fǎrǎ bromurǎ pentru a demonstra cǎ acidul ascorbic este oxidat lent de bromat, dar rapid de brom. Când acidul ascorbic este complet consumat, bromul se acumuleazǎ rapid în amestec. Sfârșitul reacției poate fi observat utilizând o-toluidina sau metilorange, ca indicatori, sau poate fi sesizat potențiometric.

Legea de vitezǎ a procesului de generare a bromului (2.44) este:

(2.47)

Procesul prezintǎ o cineticǎ de ordinul patru. Deoarece concentrația [H+] este mult mai mare decât concentrația de BrO3-, concentrația acestuia scade nesemnificativ mai ales pentru grade de transformare mici. Consumul de bromat este la rândul lui foarte mic în aceste condiții, datoritǎ stoechiometriei.

Pe de altǎ parte, datoritǎ reacției (2.45) care este mult mai rapidǎ decât reacția (2.44), bromura este refǎcutǎ în permanențǎ și concentrația ei rǎmâne constantǎ atâta timp cât existǎ acid ascorbic în sistem. Prin urmare, viteza de reacție este constantǎ la grade mici de consum a bromatului. Aceasta înseamnǎ cǎ, în intervale de timp egale, se genereazǎ aceeași cantitate de brom și aceleași cantitǎți de acid ascorbic sunt oxidate la acid dehidroascorbic.

Se poate deci scrie:

(2.48)

Viteza fiind constantǎ, conținutul de acid ascorbic din amestecul de reactie este proporțional cu timpul pânǎ la care concentrația bromului crește brusc.

Dacǎ este prezent acidul acetilsalicilic, bromurarea la inelul aromatic al acestuia este rapidǎ și poate însoți sau chiar înlocui oxidarea, ceea ce duce la un consum suplimentar de brom. S-a constatat cǎ perioada de inducție este scurtatǎ de prezența halogenurilor și a urmelor de vanadați care au efect catalitic asupra reacției. Punctul final al reacției este marcat de apariția bromului și poate fi evidențiat cu ajutorul o-toluidinei, care în prezența bromului dǎ fenomenul de fluorescențǎ.

În legǎturǎ cu dependența timpului de reacție de pH, existǎ o relație liniarǎ între pH și logaritmul timpului de reacție. Odatǎ cu dublarea sau triplarea [H+], viteza este de patru, respectiv de nouǎ ori mai mare. Aceasta aratǎ cǎ [H+] apare la puterea a doua. Fǎcând un calcul al aportului acidului ascorbic asupra [H+] pe baza gradului de disociere, s-a gǎsit cǎ este de 0,2-0,6 %. Ca urmare, concentrația experimentalǎ a acidului ascorbic are un efect neglijabil asupra [H+]. De asemenea, în procesul de oxidare a acidului ascorbic se formeazǎ 2H+, care în timpul reducerii bromatului se transformǎ în apǎ, ceea ce înseamnǎ cǎ în procesul Landolt nici nu se consumǎ și nici nu se formeazǎ ioni H+. Tabelul 2.1 cuprinde rezultatele influenței diferiților acizi asupra timpului de reacție.

Tabel 2.1. Influența diferiților acizi asupra timpului de reacție dintre bromat (0,05 M; 10 ml), bromurǎ și acid ascorbic (0,01M; 10 ml)

Conform datelor din tabel, HCl și HNO3 se comportǎ la fel în condiții identice. Acidul bromhidric micșoreazǎ puțin timpul de reacție, deoarece mǎrește concentrația de bromurǎ.

Totuși se remarcǎ o micǎ dependențǎ între k, concentrația de Cl- și concentrația de Br-. Dependența se presupune cǎ s-ar datora reducerii BrO3- nu numai de Br-, ci și de Cl-.

Reacția BrO3-, Br-, H+, este însoțitǎ și de reacția BrO3-, Cl-, H+, iar viteza de reacție este rezultatul celor douǎ procese ce se desfǎșoarǎ în paralel.

2.3.3. Reacția de tip Landolt a cisteinei cu bromatul

În cazul celui mai simplu sistem de tip Landolt, procesele successive și paralele care consumǎ bromura (și brom), pentru BrO3–Br–cisteinǎ [6-10], sunt:

BrO3-+5Br-+6H+3Br2+3H2O relativ lent (2.49)

Br2+2Cys 2Br-+2H++(Cys)2 rapid (2.50)

BrO3-+ 6Cys Br-+3(Cys)2+3H2O lent (2.51)

În acest caz, Cys semnificǎ cisteina (HS)CH2CH(NH2)COOH, iar (Cys)2 simbolizeazǎ cistina care este o disulfurǎ (HOOCCH(NH2)CH2)2S2, produsul de oxidare al cisteinei.

Cinetica reacției (2.49) este cunoscutǎ. Oxidarea cisteinei de cǎtre brom (2.50) este un proces rapid, pe când oxidarea cisteinei de cǎtre bromat este un proces lent, în aceste condiții experimentale de reacție. O reacție test, în absența bromurii dovedește cǎ, mǎsurând un timp mai îndelungat, are loc o modificare insesizabilǎ a potențialului de electrod.

Când bromura este prezentǎ chiar de la început, reacția are loc mult mai rapid. Astfel, oxidarea cisteinei are loc în principal pe seama bromului.

Aminoacidul este agentul de captare pentru brom, aceasta înseamnând cǎ [Br2] atinge o valoare joasǎ a stǎrii staționare, atâta timp cât existǎ cisteinǎ în amestec. Când cisteina este complet consumatǎ, bromul se acumuleazǎ în amestec și are loc o modificare a potențialului de electrod. Alegând concentrații apropiate pentru BrO3-, Br- și H+, viteza de reacție este menținutǎ aproximativ constantǎ, pentru grade mici de consum a bromatului.

Bromura se reformeazǎ în decursul reacției (2.50), cantitatea de bromat reacționatǎ fiind micǎ, datoritǎ stoichiometriei. Concențrația în ioni de hidrogen poate fi menținutǎ constantǎ, fie folosind soluții tampon, fie un exces mare.

Astfel, în intervale de timp egale, este generatǎ aceeași cantitate de brom și, în consecințǎ, aceeași cantitate de cisteinǎ este oxidatǎ. Prin urmare, se poate scrie:

(2.52)

În aceste condiții, viteza de reacție fiind constantǎ, concentrația de cisteinǎ din amestec este proporționalǎ cu timpul scurs, pânǎ când concentrația de brom crește brusc.

Metionina are un comportament similar, oxidarea ducând la sulfoxid.

2.4. Cinetica reacțiilor de tip Landolt bromat-iodură și iodat-iodură

Există numeroase investigații cinetice ale reacțiilor dintre bromat -iodură (2.53) și iodat-iodură (2.54) în soluții apoase [40], iar mai recent, în sisteme de amestecuri de solvenți și topituri de săruri.

BrO3- + 9I- + 6H+ Br- + 3I3- + 3H2O (2.53)

IO3- + 8I- + 6H+ 3I3- + 3H2O (2.54)

Legea de viteză pentru prima dintre reacții se consideră a fi:

(2.55)

iar pentru cea de-a doua reacție s-au propus legi de viteză de ordin patru, cinci și șase, dar ordinul cinci este cel general acceptat.

(2.56)

Nici o altă lege propusă nu a fost confirmată prin rezultate experimentale evidente, cu excepția cazului când concentrația de iodură este mai mică de 10-7 M, iar legea de viteză are aproximativ următoarea expresie:

(2.57)

Multe studii, anterioare celui citat, în asemenea sisteme s-au realizat în soluții acide cu adaos de tampon, și recent s-a observat că această cataliză a tampoanelor poate fi la fel de bine una dintre explicațiile discrepanțelor dintre diferitele expresii ale legilor de viteză. Un alt factor ce contribuie, este domeniul limitat al concentrației fiecărui reactant, accesibil oricărei tehnici aplicabile acestor reacții de ordin global mare.

Metoda stării de pH elimină cu succes cataliza tamponului ca posibilă sursă de erori, cu toate că anterior nu există date referitoare la o posibilă aplicație a acestei metode experimentale la studiul asupra cineticii reacțiilor halogenat-halogenură. Totuși metoda nu este complet satisfăcătoare la determinarea legilor de viteză pentru reacții de ordin relativ ridicat, dar furnizează rezultate suficient de interesante pentru a ne opri asupra ei. Ea poate fi folosită pe două căi:

– calitativ, pentru a menține pH-ul constant;

– cantitativ, pentru a monitoriza gradul de desfășurare al reacției și prin urmare, viteza reacției, precum și menținerea constantă a pH -ului.

Experimental, s-a folosit metoda vitezelor inițiale, deoarece reacțiile sunt de ordin global mare, iar concentrațiile de iodură, ioni de hidrogen, iodat sau bromat au fost variate succesiv pe parcursul experiențelor.

Avansarea reacției studiate a fost în general mai mică de 1% din total, astfel încât concentrațiile inițiale au fost virtual nealterate și reacțiile se pot considera de pseudo zero ordin.S-a stabilit o relație liniară între concentrația de iod produs (sau de ioni hidrogen consumați) și timpul de reacție. Această simplă relație nu mai este valabilă în cazul reacției iodat-iodură la pH=7, când se urmează un procedeu matematic alternativ.

Inițial, pentru reacția iodat-iodură la pH neutru, tehnica stării de pH a fost utilizată cantitativ, atât la menținerea constantă a pH-ului , cât și la monitorizarea gradului de reacție.

Pentru reacțiile bromat-iodură și iodat-iodură în domeniul de pH de la 3 la 4 aparatura a fost folosită numai la menținerea constantă a pH-ului; gradul de reacție a fost determinat printr-o tehnică amperometrică. Prolemele întâlnite în folosirea tehnicii stării de pH la determinarea gradului de reacție în studiile cinetice pot fi însumate după cum urmează:

Amestecarea ineficientă sau adăugarea prea rapidă de acid din biuretă se soldează cu un amestec de reacție neomogen. Dacă este micșorată concentrația acidului din biuretă pentru a minimaliza acest efect, apare problema b).

Diluarea datorată acidului adăugat modifică concentrația reactivilor ceea ce duce la devierea de la pseudo zero ordin și necesită aplicarea de proceduri de corecție matematică.

Folosirea cantitativă a stării pH pentru monitorizarea gradului de avansare al reacției depinde de sensibilitatea de răspuns a instrumentului la modificări mici de pH și de o lungă stabilitate în timp, ambele deteriorându-se cu creșterea pH-ului.

Viteza de reacție tipică a fost 1,2.10-8 M (H+) s-1 sau 2.10-9M (ion halogenat) s-1 în studiile amperometrice; acestea nu pot crește în reacția bromat-iodură din cauza solubilității limitate a bromatului de potasiu, precum și alți factori. Cele mai mari viteze de reacție în cazul iodat-iodură la pH=7, cu valori de 10-6 M (H+)s-1, sunt însoțite de problema a).

În domeniul de pH 3 -4, dependențele sistemelor bromat-iodură-ion de hidrogen au fost determinate experimental, iar rezultatele sunt cuprinse în tabelul 2.2.

Reprezentarea grafică arată că dependența față de ionul de hidrogen nu este de ordin unu, doi sau trei, dar reprezentarea v /[H+][BrO3-]funcție de [H+] arată că viteza de reacție poate lua forma de mai jos, cu o eroare experimentală de 5%.

(2.58)

Tabel 2.2. Dependențele sistemelor bromat-iodură-ion de hidrogen

Valorile constantelor de viteza obținute grafic sunt: k0 = 42 3 M-3s-1 și k1 = 0,0112 0,0006 M-2s-1.

Studii anterioare, care analizează rezultatele cu ajutorul legii de viteză ce conține numai primul termen al ecuației [2.57], au avut ca rezultat valori ale lui k0 de 50 M-3s-1 (pentru KNO3 1M) și 49 M-3s-1 (pentruNaClO4 1M).

În domeniul de pH scăzut al acestui studiu, expresia matematică [2.57] a legii de viteză pare să fie valabilă în cazul unui k0 = 54 M-3s-1; neglijând cel de-al doilea termen al ecuației, se obține o creștere aparentă a valorii lui k0. În același domeniu de pH (3-4), dependențele sistemului iodat-iodură-ion de hidrogen au fost determinate separat (tabel 2.3).

Tabel 2.3. Dependențele sistemului iodat-iodură-ion de hidrogen

Dintr-o analiză grafică a rezultatelor, constanta din legea de viteză s-a găsit a fi (2,2 0,2).108 M-4s-1, valoare ce poate fi comparată cu aceea de 3,0.108 M-4s-1, găsită anterior într-un mediu electrolitic de perclorat de sodiu.

La pH 7, într-un sistem iodat-iodură, problemele diluarii prin adăugare de acid și abaterea de la viteza inițială de pseudo zero ordin, au fost depășite aplicând corecții matematice.

În loc de a discuta despre panta inițială a fiecărui grafic, a acidului adăugat funcție de timp, se consideră tangenta dusă la curbă, la un timp de 5 minute după începutul reacției, precum și panta luată ca viteză de reacție.

Este de asemenea posibilă calcularea concentrației ionului de iodat și iodură în amestecul de reacție la acest timp, din cantitatea de acid care a fost adaugată, astfel observându-se efectul diluției.

Pe baza graficelor logaritmice cu respectarea ionilor de iodat și iodură, ordinele apar în tabelul 2.4. Graficul logaritmic al dependenței ionului de hidrogen (figura 2.2) demonstrează o schimbare a ordinului de la 1 (la concentrații mai mari de ion de hidrogen) la 3 (în cazul unor concentrații mai scăzute de ion hidrogen).

Tabel 2.4. Ordinele ce apar cu respectarea ionilor de iodat și iodură

Ordinele, cu respectarea celor trei reactanți, au fost determinate separat; nu a fost posibilă determinarea unei legi de viteză unice, complete, pentru soluția neutră.

Datele cinetice pot fi exprimate în termenii unei expresii empirice de forma:

(2.59)

unde primul termen apare din studiile anterioare, cu k0, =3,0.108 M-4s-1, iar k1, a fost determinat în urma a șaizeci de experimente ca fiind (8 5).10-10 M-6,5 s-1. Datele nu concordă cu ecuația (2.57) în cadrul erorii experimentale estimate la 5% în v,, deoarece adevărata lege de viteză este mult mai complicată. Ecuația (2.57) servește ca o descriere semicantitativă pentru scopuri practice. Primul, termenul ,,clasic “, contribuie mai puțin de 5% la valoarea lui v, în aproape toate cazurile.

Aceasta este prima relatare a doi termeni cu o dependența a concentrației scăzute de ion de hidrogen în reacția bromat-iodură. Legea de viteză (2.58) arată că la valori înalte ale pH-ului, viteza acestei reacții este mai mare decât cea la care ne-am aștepta conform legii de viteză (2.57); de asemenea, are semnificație practică în aplicarea acestei reacții la analiza iodometrică.

Pentru reacția iodat-iodură, la valori mari ale pH-ului și concentrație moderată de ioni iodură și iodat, rezultatele confirmă informațiile anterioare asupra legii de viteză, apărând un singur termen descris de ecuația (2.57). În regiunea neutră, reacția a fost studiată la concentrații de iodat și iodură mult mai înalte decât până acum. Aceasta a evidențiat un termen în legea de viteză care a fost de ordin doi la iodat și de ordin patru la iodură, alături de o dependență a ionului de hidrogen care crește de la primul ordin la al treilea, o dată cu creșterea pH-ului. În studiile anterioare nu a fost prezentat nici un ordin de reacție pentru iodură mai mare de doi în reacția iodat-iodură, iar dependența iodatului este de asemenea mai ridicată decât ordinul întâi găsit până aici. La concentrații foarte scăzute ale ionului iodură, dependența iodurii scade la unu.

Această nouă observație are aceeași semnificație ca și termenul al doilea în legea de viteză a reacției bromat-iodură. În aplicațiile analitice ale acestor reacții, viteza nu poate fi estimată, indiferent de condiții, din legile de viteză simple, clasice, (2.56) și (2.57), ci numai din mecanismul dominant, particular. În principal, problemele ce apar în studiile cinetice ale reacțiilor ionilor oxidanți, ce au loc în mai multe trepte și cu produși intermediari, pot combate afirmațiile și comparațiile unei legi de viteză și constante de viteză unice. Dovezile experimentale asupra cineticii reacției bromat-iodură nu au evidențiat aspecte importante ale mecanismului față de informațiile de până acum.

Întrucât ionul de hidrogen este labil, schimbarea în dependența ionului de hidrogen de la doi la unu nu este la fel de importantă ca și schimbarea dependenței în bromat sau iodură. Două seturi posibile de trepte determinante de viteză sunt următoarele:

BrO3- + H+ + I- produși lent (2.60)

BrO3- + 2H+ + I- produși lent (2.61)

BrO3- +H+ + I- HBrO3I- rapid (2.62)

HBrO3I- produși lent (2.63)

HBrO3I- + H+ produși lent (2.64)

Modul de atac al iodurii asupra bromatului este încă nerezolvat, cu toate că influența solventului sugerează mai degrabă o substituție nucleofilă asupra bromurii, decât asupra oxigenului. În mecanismul discutat anterior pentru reacția iodat-iodură în soluție acidă, ducând la o lege de viteză de ordinul cinci (2.56), produsul IO2- s-a presupus a trece rapid prin reacție împreună cu ionul iodură:

IO3- + 2H+ + I- I2O2 (sau H2I2O3) (2.65)

I2O2 + I- I2 +IO2- (2.66)

IO2- + I- 2IO- rapid (2.67)

Ordinul cel mai mare pentru iodat și iodură, observat în acest studiu, indică faptul că cinetica ultimei trepte poate fi luată în considerare în aceste condiții. Iată de ce, viteza de reacție în soluție neutră a fost găsită ca fiind considerabil mai mare decât cea presupusă în soluție acidă. Legea de viteză indică, de asemenea, un mecanism adițional care este necesar pentru producerea de IO2-. O asemenea cale de reacție probabil că întârzie eliminarea unui atom de oxigen, sub formă de H2O, de la atomul de iod (V), după cum evidențiază lipsa paralelă a creșterii ordinului ionului de hidrogen.

O dependență de ordin secund a iodatului va rezulta dacă IO2-, o dată format prin reacția (2.66), suferă o disproporționare lentă, conform reacției de mai jos:

2IO2- IO3- + IO- (2.68)

Au existat câteva relatări asupra cineticii reacțiilor iodatului, dar un astfel de postulat nu poate argumenta rezultatele altor studii cinetice. Altă cale de reacție care sugerează o dependență de ordinul al doilea privind iodatul, este formarea și reacționarea unui dimer al iodatului, mai degrabă decât reacția inițială a iodatului:

2IO3- I2O62- (2.69)

Aceasta dovedește încă o dată problema controversată a naturii speciilor prezente în soluțiile de iodat, în particular la concentrații scăzute ale ionului de hidrogen. Pot fi formulate structuri ale dimerului, cu unul sau doi atomi de oxigen legați în punte și sunt realizabile în termenii numerelor de coordinare manifestate de atomul de iod.

Explicația dependenței de ordin patru pentru iodură devine posibilă în condițiile unui atac succesiv al ionului iodură asupra dimerului I2O6-. Dacă astfel de reacții devin progresiv mai lente datorită eliminării atomilor de oxigen, atunci această cale de reacție va conduce direct la un termen în [I-]4 și [IO3-]2. Distrugerea dimerului, după ce câțiva atomi de oxigen au fost îndepărtați, evidențiază o cale de reacție alternativă în care I2O42- format astfel se poate desface pentru a da IO2-, aceasta furnizând (după cum o cere și cinetica observată) o alternativă a importanței formării iodatului. Termenul în [I-]4 [IO3-]2 se naște de asemenea dintr-un mecanism implicând formarea unui dimer de către speciile [I3O33-], ce rezultă din două atacuri succesive ale I- asupra IO3-, având efect de întârziere la îndepărtarea oxigenului.

Ordinele de reacție ridicate ale legilor de viteză pentru reacțiile halogenat-halogenură aduc argumente puternice în favoarea formării complecșilor donor-acceptor; speciile formate în diferite trepte ale reacției iodat-iodură în soluție neutră sunt probabil de aceasta formă, mai degrabă decât complexul activat de tranziție.

În tabelul 2.5 apar constantele de viteză pentru legile de viteză ale reacțiilor bromat-iodură și iodat-iodură în soluții de perclorat de sodiu, respectiv azotat de sodiu, ce au tăria ionică de 1,00 M la 250C.

Tabel 2.5. Constantele de viteză pentru legile de viteză ale reacțiilor bromat-iodură și iodat-iodură în soluții de perclorat de sodiu, respectiv azotat de sodiu

Concordanța apropiată dintre perechile de constante de viteză obținute în cele două soluții de electroliți, justifică folosirea tehnicii ,,electrolitului mlăștinos“ în evitarea efectului tăriei ionice și indică absența efectelor ionului marcat specific în aceste reacții datorită Na+, K+, NO3- și ClO4-.

În final, este necesară sublinierea unui punct menționat anterior. Alegerea unui set particular de concentrații ale reactanților, permite focalizarea atenției asupra unei trepte determinantă de viteză particulare în reacțiile oxido-reducătoare ale oxiionilor, dar aceasta introduce o simplificare arbitrară artificială. Astfel, în reacția iodat-iodură, (la concentrații de 10-7, 10-3, 10-1M ale iodurii), dependența iodurii este de unu, doi, respectiv patru.

2.5. Aplicații ale metodelor de tip Landolt

Metodele cinetice de analizǎ sunt frecvent utilizate, atât pentru determinarea unei singure specii chimice, cât și a mai multor specii în amestec.

Sistemele de reacții catalitice cu interes analitic au avantajul unor limite de detecție foarte mici, în comparație cu alte metode, furnizând în același timp mijloace de urmǎrire foarte simple, în unele cazuri.

Determinǎrile cinetice ale reactanților folosind metode necatalizate sunt justificate de faptul cǎ noile descoperiri în manipularea instrumentelor și datelor, oferǎ alternative competitive pentru metodele care nu se bazeazǎ pe cineticǎ.

Studiile privind analiza chimicǎ prin metode cinetice folosește o gama foarte variatǎ de metode cum sunt: tehnicile de chemo- și bioluminescențǎ în chimia clinicǎ, fosforescența suprafețelor solide, cromatografia lichidǎ, separǎrile electroforetice, injecția în flux, folosirea micelelor în sisteme catalizate și necatalizate, utilizarea electrozilor chimici modificați, complexarea ionilor metalici, cromatografia pe coloanǎ.

Tabelul 2.6 însumeazǎ cele mai remarcabile trǎsǎturi ale metodelor cinetice utilizate la determinarea directǎ a catalizatorilor, pe baza efectului Landolt [19,28,164].

Este de remarcat cǎ metalele prețioase sunt excelenți catalizatori, metodele catalitice cinetice ale acestor metale fiind studiate și luându-se în considerare cele bazate pe modificǎrile chimice ale reacției indicator, catalizatǎ tocmai de ionul care urmeazǎ a fi determinat.

În aceste metode, reacția indicator este de obicei urmǎritǎ fotometric, iar tehnicile cu detecție electrochimicǎ au început sǎ fie utilizate numai în studii mai recente.

Asemenea metode, fiind foarte sensibile, furnizeazǎ limite de detecție de 0,01-0,1 ng/ml.

=== 4.Tabel 2.6 ===

Tabel 2.6. Catalizatori determinați utilizând metode de tip Landolt

=== 5.Experimental Concluzii ===

Capitolul III

PaRte experimentalǎ

Acest capitol este dedicat în exclusivitate aplicațiilor metodelor de tip Landolt, metode ce se pot utiliza nu numai pentru determinǎri de substanțe anorganice ori catalizatori, ci și în cazul substanțelor de interes biochimic, tratate în capitolele I și II: vitamine și aminoacizi.

În continuare se vor prezenta aparatura, etapele și modul de lucru, finalizate cu determinarea substanțelor mai sus amintite din probe reale, cum sunt, fructele, sucurile naturale, produse farmaceutice etc.

3.1. Aparaturǎ

Măsurătorile din cadrul metodelor cinetice care folosesc sisteme de tip Landolt, se realizeazǎ potențiometric. Principiul metodei constă din măsurarea forței electromotoare a unei pile, între o pereche de electrozi potriviți, imersați în soluția care urmează a fi analizată [6-8].

Determinările se pot efectua cu ajutorul unei pile electrice [8]. Electrodul de măsură imersat în amestecul de reacție a fost o plăcuță de Pt, semipila constând dintr-un vas termostatat și prevăzut cu agitare continuă. Celălalt electrod, cel de referință, a fost unul de calomel saturat.

Pentru înregistrarea curbelor potențial funcție de timp s-a utilizat un potențiometru Digitronix DXP-2040 (Seiko) legat prin placa de achiziție la un calculator DTK.

Schema aparaturii este prezentată în figura 3.1.

O aparaturǎ mai puțin pretențioasǎ, ce poate fi utilizatǎ în lipsa unui calculator prevǎzut cu placǎ de achiziție, presupune un montaj descris în figura 3.2.

Fig.3.1. Schema aparaturii

Fig.3.2. Schema aparaturii simplificate (în lipsa calculatorului)

Cisteina și metionina fac parte din grupa aminoacizilor cu sulf (tio-aminoacizi), iar triptofanul este unul dintre amino-acizii heterociclici [19]. Cisteina s-a determinat cu sistemul Landolt iodură-apă oxigenată, iar cu sistemul bromat-bromură s-a reușit determinarea cisteinei, metioninei și triptofanului.

3.2. Determinarea stoichiometriei

Stoichiometria reacției metioninei cu bromul a fost determinată prin titrare spectrofotometrică, bromul fiind generat de către sistemul bromat – bromură în prezența metioninei, respectiv a triptofanului.

Graficul A=f(metionină :brom) este prezentat în figura 3.3. Se observă că raportul molar a fost de 1 :1.

În cazul triptofanului, acesta reacționează rapid cu bromul, într-un proces de bromurare la nucleul aromatic. Determinarea raportului molar a fost făcută tot prin titrare spectrofotometrică (figura 3.4.).

Se obține un raport molar triptofan:brom de 1:2, fapt care indică o dibromurare, conform reacției:

Acest proces este cu siguranță compus din două etape succesive, ambele consumând brom cu viteze relativ mari. Se va realiza o concentrație de stare staționară a bromului diferită de cazul cisteinei, și prin urmare, la aceeași concentrație ca și a cisteinei, timpul de consum este ușor diferit.

Un exemplu de realizare a amestecului de reacție este prezentat în tabelul 3.1.

Tabel 3.1. Componența amestecului de reacție în ordinea de adăugare a reactivilor

3.3. Determinarea condițiilor convenabile de lucru

Influența acidității

Dependența de aciditate a timpului de generare a bromului a dus la alegerea unei valori optime de 0,1 M.

Influența bromurii de potasiu

Dependența reciprocii timpului de concentrația de reactant este liniară. A fost aleasă o valoare optimă de 0,2 M.

Influența conversiei bromatului asupra determinărilor

Formula de calcul pentru conversie este:

(3.1)

A fost aleasă o valoare de 2,6 %, valoare ce se află sub limita impusă pentru utilizarea vitezei inițiale și nici prea mică, astfel ca timpii să fie prea scurți, scăzând astfel sensibilitatatea metodei.

3.4. Trasarea dreptelor de etalonare

Au fost trasate drepte de etalonare pentru fiecare dintre cei trei aminoacizi. Dreapta de etalonare pentru triptofan este prezentată în figura 3.5.

Ecuația dreptei este:

sec (3.2)

cu un coeficient de corelare r = 0,9995 ; s0=4,15 sec.

Limita de detecție pentru triptofan a fost stabilită la 1,9 10-6 M.

Cel de-al doilea aminoacid pentru care s-a trasat dreapta de etalonare, cu sistemul Landolt bromat-bromură, a fost metionina.

Stoichiometria reacției conduce la sulfoxid și, în consecință, fiind un mecanism diferit, atât viteza cât și concentrația de stare staționară a bromului sunt diferite. În consecință apare o altă pantă a dreptei.

Dreapta de etalonare pentru metioninǎ, prelucrată statistic, este prezentată în figura 3.6.

Ecuație dreptei este următoarea:

sec (3.3)

cu r=,9991; s0=3,6 sec; n = 11. Limita de detecție este: 4.10-6 M.

În aceleași condiții, și anume: [KBr] = 0,2 M, [H+] = 0,1 M, [KBrO3] = 3,0.10-3M și T = 293 K, folosind zece concentrații diferite de cisteină ca agent de captare, fiecare experiment fiind repetat de câte 3-5 ori, s-a trasat dreapta de etalonare pentru cisteină și este prezentată în figura 3.7.

Ecuația statisticǎ a dreptei este datǎ de relația:

[cisteina]sec (3.4)

cu r=0,9992; s0=5,75 sec; N=13. Limita de detecție este 1,7.10-6M.

Suprapunerea dreptelor de etalonare pentru cei trei aminoacizi: cisteinǎ, metioninǎ și triptofan, ce se preteazǎ la acest tip de determinǎri, duce la obținerea figurii 3.8.

Diferența în pantă se datorează reactivității fiecărui aminoacid, în conformitate cu structura și produșii de reacție.

Pentru a demonstra aditivitatea determinărilor, s-a trasat dreapta de etalonare pentru metionină, singură și în prezența unei concentrații de 3,2.10-5 cisteină.

Se observă din figura 3.9. că dreptele sunt paralele, iar cele două pante aproximativ egale, ceea ce explică efectul cumulativ.

Ecuațiile celor două drepte prelucrate statistic sunt:

– pentru metionină:

[metionină]sec (3.5)

cu r=0,9992; s0=3,5 sec.; N=11.

– pentru metionină, în prezența cisteinei:

[metionină]sec (3.6)

cu r=0,9992; s0=3,6 sec.; N=11.

Așa cum se poate observa, paralelismul este perfect pentru că și stoichiometriile celor două procese sunt 1:1, cu toate că, o dată se formează cistina și o dată se formează sulfoxid.

Deviația relativă standard pentru un punct este 2,8 %, folosind 7 măsurători individuale. Limita de detecție este 1,7.10-6 M.

Trebuie amintit faptul că cisteina poate fi determinată cu un alt sistem de reacții de tip Landolt, folosind reacția apă oxigenată – iodură, în care rolul cisteinei este acela de agent de captare pentru iod.

Metionina și triptofanul nu reacționează în asemenea condiții, deci concentrația de cisteină va putea fi obținută dintr-un amestec conținând acești trei aminoacizi, prin diferență.

3.5. Studiul interferențelor

Au fost testați câțiva aminoacizi ce ar putea interfera. După cum se observă din tabelul 3.2, histidina, tirosina, guanina și fenilalanina nu interferă măsurătorile, chiar și la concentrații mai mari de 10-3 M.

Tabel 3.2. Aminoacizi care nu interferă determinările de metionină 10-5M

3.6. Dozarea metioninei din produse farmaceutice

Metionina a fost dozată din produsele farmaceutice Mecopar Forte, Metaspar și Infesol. Determinările s-au efectuat cu metoda Landolt propusă, iar pentru comparație s-au folosit metoda spectrofotometrică de dozare prevăzută în normele interne ale fiecăruia dintre aceste medicamente [244,246].

S-au obținut datele prezentate în tabelele 3.3. și 3.4.

Tabel 3.3. Conținut în metionină Tabel 3.4. Conținut în metionină pentru produsul farmaceutic produsul farmaceutic Mecopar Forte Metaspar

În cazul determinărilor de metionină din produsele Mecopar Forte și Metaspar s-au obținut valori foarte apropiate, atât de cele prevǎzute de prospectul medicamentului, cât și cu cele ce au fost determinate prin metoda propusă de norma internă de determinare.

În tabelul 3.5. este prezentatǎ o situație a acestor determinări, cu precizarea că rezulatele se referă la conținutul de metionină pe comprimat, respectiv capsulă. Prelucrarea probei a fost foarte simplă și anume dizolvarea sa în 100 ml apă și filtrarea prin frită.

De asemenea s-a realizat determinarea metioninei și din soluția perfuzabilă de Infesol 40, producător Berlin-Chemie Menarini Group cu un conținut complex de aminoacizi [219,228], din care s-au luat 0,125 ml soluția perfuzabilă de bază și s-au făcut determinări fără nici o separare sau filtrare prealabilă.

Este evident că dintre toți aminoacizii prezenți nu există interferent.

Tabel 3.5. Determinarea conținutului de metionină din MecoparForte, Metaspar și Infesol.

Prin toate aceste cercetări s-a regăsit legea cinetică la formarea agentului de halogenare și prin urmare, viteza fiind practic aceeași, concentrația de analit este proporțională cu timpul măsurat.

Datorită stoechiometriilor diferite, mai ales unde există reacții consecutive, valoarea pantelor la dreptele de etalonare depinde de natura analitului, cu toate că, din punct de vedere analitic, acest lucru nu ar trebui să apară.

Concluzii

Metoda cinetică este simplă, rapidă și utilizează aparatură la îndemână ușor de manevrat și de întreținut, cu un cost deosebit de redus (spre deosebire de alte metode propuse în literatura de specialitate, foarte eficiente și performante, dar și foarte scumpe). În cazul în care avem la îndemână un calculator care are inserată o placă de achiziție, graficele sunt trasate în mod automat, iar prelucrarea datelor necesită mult mai puțin timp. Precizia rezultatelor obținute este însă aceeași.

Metoda se poate utiliza la determinarea metioninei din medicamente ce nu conțin alte substanțe active sau adjuvanți cu caracter reducător și care pot să perturbe sistemul redox utilizat (bromat-bromurǎ); de asemenea, permite dozarea celor trei aminoacizi discutați din probe sintetice.

Metoda permite dozarea din probe sau amestecuri de substanțe în care cisteina, metionina și triptofanul se află prezenți doar sub formă de urme, deoarece această metodă este deosebit de sensibilă .