Studii Biotehnologice Privind Influența Sursei de Carbon și a Parametrilor de Fermentație Asupra Producerii de Exopolizaharide cu Tulpini de Bacterii Lacti

Cuprins

=== 1 ===

Rezumat

Lucrarea de față descrie studiile biotehnologice efectuate privind influența sursei de carbon și a parametrilor de fermentație asupra producerii de exopolizaharide la tulpinile de bacterii lactice Lactobacillus sp. IL1 , Lactobacillus sp.IL4.2 , Lactobacillus paracasei IL2 și Lactobacillus plantarum IL3 cultivate pe mediu Man-Rogosa-Sharpe ( MRS ) și mediu MRS + CaCO3, care conțin ca sursă de Carbon : glucoză, lactoză și sucroză.

Lucrarea este structurată în șase capitole, capitolele doi, trei și patru având mai multe subcapitole, urmate de o serie de concluzii și o listă cuprinzătoare de referințe bibliografice.

În primul capitol al lucrării sunt prezentate caracteristicile generale ale exopolizaharidelor și influența acestora asupra diferitelor afecțiuni ale organismului uman, și rolul acestora în diferite produse lactate.

În cel de-al doilea capitol sunt detaliate aspectele privind alte studii efectuate pe bacterii lactice producătoare de exopolizaharide, metodele actuale de izolarea ale exopolizaharidelor și aplicațiile acestora.

În al treilea capitol sunt reprezentate materialele și metodele utilizate în determinările asupra bacteriilor lactice producătoare de exopolizaharide.Determinările realizate au constat în:

– determinarea condițiilor de cultivare ( a sursei de Carbon );

– izolarea și determinarea cantității de exopolizaharide;

– determinarea densității optice;

– determinarea producerii de acid lactic.

În capitolul patru sunt prezentate rezultatele și discuțiile la care s-a ajuns în urma stabilirii sursei de Carbon, a temperaturii și a ph-ului la cultivarea tulpinilor de bacterii lactice.

În final sunt prezentate câteva concluzii, precum și ideile esențiale ale lucrării practice și teoretice.

Cuprins

Capitolul I. Introducere

Bacteriile sintetizează un număr de polizaharide care sunt definite după localizarea lor relativă în celulă. Unele sunt intracelulare localizate în citosol și utilizate ca sursă de carbon, altele sunt constituenți ai peretelui celular ca peptidoglicanii și acizii teicoici, iar al treilea grup este localizat în exteriorul celulei. Ultimul grup poate lua o formă aderentă, adesea legată covalent, formând o entitate morfologică numită capsulă sau polizaharide capsulare. Polimerul poate constitui un strat polizaharidic cu puține sau fără celule asociate sau atașate la suprafața celulară. În unele cazuri, polizaharidele capsulare sau cele neatașate sunt produse de către organism iar delimitarea dintre cele două forme poate fi dificilă. În funcție de relațiile structurale cu celula bacteriană, acești polimeri au diferite denumiri, ca strat polizaharidic, polizaharide capsulare sau polizaharide microcapsulare. Termenul de exopolizaharide a fost propus de Sutherland în 1972, fiind atribuit pentru acele forme de polizaharide bacteriene găsite la exteriorul peretelui celular. Astfel, bacteriile lactice și propionibacteriile sunt cunoscute că produc în principiu heteropolizaharide, compuse din unități repetitive ca formă de la dizaharide la heptazaharide.[ 13, 14 ]

Exoplizaharidele produse de către bacteriile lactice, care joacă un rol benefic în caracteristicile reologice și textura laptelui fermentat, sunt studiate intens în ultima perioadă de timp. Exopolizaharidele sintetizate de către bacteriile lactice au gasit cel mai valoros domeniu de aplicare prin îmbunătățirea reologiei, texturii produselor lactate fermentate, cum ar fi iaurtul. Există o mare cerere a consumatorilor pentru produse lactate și nu numai naturale, care sunt de obicei cunoscute prin creșterea conținutului de grăsimi, zaharuri, proteine sau stabilizatori (de exemplu, pectină, amidon, alginatului sau gelatină) din compoziția lor. Cererea consumatorilor pentru produse cu un nivel scăzut de grăsime, de zahăr și aditivi, precum și datorită factorilor de cost, fac din exopolizaharide o alternativă viabilă. Desi nu au nici un gust al lor, exopolizaharidele bacteriilor lactice cresc timpul petrecut de produsul din lapte în gură și, prin urmare, rezultă o mai bună percepție a gustului. Un alt beneficiu îl reprezintă efectele fiziologice ale exopolizaharidelor care rămân pentru o perioadă mai îndelungată în tractul gastro-intestinal, sporind astfel colonizarea cu bacterii probiotice. În plus, exopolizaharidele bacteriilor lactice au demonstrat a avea efecte antitumorale, activitate imunostimulatoare, precum și un rol deosebit în scăderea colesterolului din sânge. [ 36 , 37 ]

Scopul acestei lucrări a fost selecția de tulpini de bacterii lactice producătoare de exopolizaharide și stabilirea parametrilor optimi de cultivare a acestora pe medii de cultură adecvate în vederea obținerii de exopolizaharide. [ 1 ]

Pentru obținerea de exopolizaharide din tulpini de bacterii lactice principalele obiective ale studiilor au fost stabilirea sursei de Carbon, a temperaturii și a ph-ului la cultivarea acestora.

Capitolul II. Consideratii generale privind problematica exopolizaharidelor produse de catre bacterii lactice

Exopolizaharidele sunt un lung lanț de polizaharide ramificate, unități repetitive din glucide diferite sau nu. Aceste unități sunt în principal compuse din glucoză, galactoză și ramnoză, în diferite raporturi.

Exopolizaharidele produse de către tulpinile de bacterii lactice au fost determinate prin estimarea vâscozității mediului unde sunt sintetizate. Cu toate acestea utilizarea măsurătorilor de vâscozitate ca un indicator pentru producția de exopolizaharide în medii lichide sunt dificil de interpretat,ele sunt reprezintă singura posibilitate de a interpreta rapid și ușor. În ultimele decade, s-au impus noi metode de cuantificare mai precise a exopolizaharidelor care sunt bazate pe izolarea de exoplizaharide prin precipitare cu etanol. Majoritatea sunt laborioase, consumatoare de timp și necesită anumite dotări speciale pentru a determina structura polizaharidului și nu este întotdeauna disponibilă în laboratoarele de microbiologie. De aceea, pentru o analiză completă este necesară o cooperare a mai multor laboratoare, în principal, cele de analiză fizico – chimică. Dacă comparam tulpinile de Leuconostoc cu cele de bacterii lactice și propionibacterii, cele din urmă sunt producători slabi de exopolizaharide. Adică, cantitatea produsă este de ordinul miligramelor și nu de cel al gramelor, la litru de mediu. Aceasta aproximare analitică face ca izolarea exopolizaharidelor din mediul de fermentație să fie o operațiune destul de dificilă. [ 50 ]

Cantitățile de exopolizaharide produse în lapte de către diferite specii și tulpini variază foarte mult. Au fost raportate cantități de 50 până la 350 mg/litru pentru tulpini de Streptococcus thermophilus, de 60 până la 150 mg/litru pentru Lactobacillus bulgaricus și de 80 până la 600 mg/litru pentru Lactococcus lactis subsp. cremonis. Pentru Lactococcus lactis subsp. cremonis au existat și cercetări recente care arată că această tulpină poate sintetiza chiar și cantități mai reduse de exopolizaharide, de până la 25 mg/litru. Producția de exoplizaharide pentru tulpini de Lactobacillus casei, are valori mici în lapte degresat cuprinse între 50 și 60 de mg/litru, crește considerabil printr/o suplimentare cu glucoză sau cu sucroză și ajunge la un nivel de aproximativ 200 mg/litru. Pentru propionibacterii, valorile disponibile sunt foarte puține, iar cantitățile raportate sunt de aproximativ 15 mg/litru, în cazul unei precipitări directe, fără o deproteinizare anterioară. În consecință, în precipitatul analizat pot exista glucide, minerale, zer, deoarece toate pot precipita cu etanolul, dar în mod normal sunt eliminate înaintea unei analize complete a exopolizaharidelor.[ 51, 52 ]

Bacteriile lactice sunt utilizate în fermentații alimentare datorită abilității lor de a îmbunătăți aroma, textura și de a asigura conservarea unor materii prime perisabile ca laptele, carnea și vegetalele. Aceste bacterii sunt capabile să producă, în mod normal, cantități mici de exopolizaharide, 100 – 200 mg/l. O cantitate impresionantă (4 g/l) s-a obținut cu o tulpină de Lactobacillus sakei. Chiar dacă sintetizează cantități mici de exopolizaharide în timpul fermentării laptelui sau al fabricării brânzei, bacteriile lactice au un impact puternic asupra texturii și proprietăților acestor produse. Cantitatea sintetizată este mică în comparație cu exopolizaharidele comerciale utilizate frecvent, cum ar fi xantanul. În schimb, aceste polizaharide sunt o alternativă la cele produse de tulpini nealimentare datorită proprietăților lor de legare. De aceea, se caută noi tulpini cu proprietăți importante și cu o producție însemnată de polizaharide. [ 36 , 37 ]

Studiile arată că sinteza de exopolizaharide la bacteriile lactice termofile și mezofile au o mare doză de instabilitate. Această instabilitate este atribuită pierderilor de plasmide în cazul bacteriilor lactice mezofile. Pentru cele termofile cum ar fi Lactobacillus bulgaricus și Streptococcus thermophilus, nu este o explicație valabilă deoarece aparent aceste tulpini nu adăpostesc plasmide. Propionibacteriile se știe că au în componența lor plasmide, dar funcționarea lor nu a fost foarte clar stabilită, existând o serie de cercetări contradictorii. Astfel, faptul că propionibacteriile au ca centru de sinteză plasmidele nu este încă o certitudine.

Scăderea vâscozității și a cantității de exopolizaharide direct proporțional cu timpul de incubare a fost recent explicată prin aceea că rezultă o hidroliză a exopolizaharidelor determinată de către glicohidrolazele extracelulare în cazul Streptococcus thermophius și Lactococcus lactis subsp. cremonis, deși dovezile experimentale sunt puține. Observații asemănătoare au fost făcute și în cazul Propionibacterium acidi propionici într-un mediu bazat pe zer de lapte. [ 21 ]

Abilitatea de a produce polizaharide este larg răspândită printre bacterii, în special a celor producătoare de acid lactic. Există microorganisme care sintetizează polizaharidele sub formă de glicogen (localizat în citoplasmă), polizaharide structurale ale peretelui celular ca peptidoglican, acizi lipoteicoici în cazul bacteriilor Gram pozitive și lipopolizaharide legate de membrana externă a bacteriilor Gram negative (Figura 2.1.). Unele bacterii pot secreta straturi polizaharidice la suprafață care, împreună cu unele glicoproteine, se regăsesc sub denumirea de glicocalix. Acești polimeri exocelulari cuprind polizaharidele capsulare, care formează un strat aderent sau capsulă legată la suprafața celulară și exopolizaharide, care formează un strat mucoid strâns atașat la suprafața celulară sau eliminat în mediu. Este cunoscut faptul că polizaharidele exocelulare nu sunt folosite ca sursă de carbon și energie de către microorganismul producător. Rolul fiziologic al acestor molecule nu a fost încă stabilit cu exactitate. [13 , 16 ]

Figura 2.1. Localizarea celulară a polizaharidelor produse de către bacterii Gram negative și Gram pozitive (glicocalix – polizaharide capsulare și exopolizaharide)

Multe cercetări despre exopolizaharide sintetizate de către bacteriile acido lactice (BAL) au abordat caracteristicile fiziologice, fermentative, chimice și structurale ale moleculelor de exopolizaharide. De asemenea, au fost atinse și aspecte legate de biosinteza, ingineria metabolică și genetică și proprietățile funcționale ale acestor biomolecule. Câteva exopolizaharide microbiene sunt utilizate în industrie datorită faptului că proprietățile lor fizico-chimice sunt similare cu cele ale celulozei, pectinei și amidonului din plante. Un grup aparte îl reprezintă acele exopolizaharide similare alginatului și caragenanului. În industria alimentară, exopolizaharide produse de către BAL și alte bacterii sunt utilizate ca agenți de îngroșare, stabilizatori, emulsificatori și agenți de gelifiere datorită modificării proprietăților reologice și texturii produselor. Ca exemplu, se pot enumera xantanul, acetanul și gelanul produse de către bacteriile Gram pozitive Xanthomonas campestris, Acetobacter xylinum și Sphingomonas paucimovilis sau dextranul produs de către tulpini de Leuconostoc mesenteroides. Aceste exopolizaharide bacteriene sunt utilizate ca aditivi alimentari, iar culturile starter de BAL le pot produce in situ în timpul fermentării laptelui. Din această cauză, utilizarea tulpinilor producătoare de exopolizaharide ca o sursă naturală de bioaditivi a atras tot mai mult atenția în ultimii ani. Suplimentar, exopolizaharide produse de către BAL au efecte benefice asupra sănătății umane. Acestea se manifestă prin abilitatea de scădere a colesterolului, activități imunomodulatoare și antitumorale, precum și efecte prebiotice. Majoritatea BAL producătoare de exopolizaharide aparțin genurilor Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc și Pediococcus. De asemenea, a fost demonstrat că unele tulpini ale genului Bifidobacterium sunt capabile de a produce astfel de biopolimeri. [ 8, 10 ]

Exopolizaharidele bacteriilor lactice sunt secretate în mediul de cultură în timpul multiplicării celulare și nu sunt atașate permanent la suprafață a celulei microbiene. Acest lucru le distinge de polizaharidele capsulare structural similare, care rămân permanent atașate la suprafața celulei.

În funcție de compoziția chimică, exopolizaharide produse de către BAL sunt clasificate ca:

homopolizaharide (HoPZ) care conțin un singur tip de monozaharid;

heteropolizaharide (Hexopolizaharide) care sunt formate din unități repetitive de monozaharide diferite.

HoPZ care conțin glucoză sunt α – dextranul, α – mutanul, α – alternanul și β – glucanii. HoPZ care conțin fructoză sunt fructani (de tipul levanului și inulinei). Aceste HoPZ au grade diferite de polimerizare care diferă în funcție de tulpinile bacteriene sintetizatoare. Unitățile repetitive ale Hexopolizaharide variază ca număr de la trei până la opt. Adesea conțin combinații de D – glucoză, D – galactoză și L – ramnoză. În câteva cazuri, conțin N – acetilglucozamină, fucoză, acid glucuronic, substituenți ai carbohidraților (acetil și glicerol). Compoziția chimică, legăturile lanțurilor, structura acestor subunități și masa molară determină caracteristicile fizice și proprietățile lor de creștere a vâscozității. Mărimea Hexopolizaharide este de 4×104 – 6×106 Da, iar HoPZ pot fi chiar mai mari. Mărimea totală a exopolizaharide produse de către BAL poate fi influențată de compoziția mediului de cultură și condițiile de cultivare. HoPZ sunt produse în cantități mai mari decât hexopolizaharide. [ 34, 38 , 39 ]

Deoarece polizaharidele derivate din diferite bacterii lactice arăta o mare variație în compoziția, schimbul, aranjamentul spațial, rigiditatea și capacitatea de a interacționa cu proteine, nici o corelație între concentrațiile de exopolizaharide și vâscozitate nu a fost încă stabilite într-un mod foarte clar. Această corespondență este deosebit de importantă, pentru că va furniza o bază pentru o strategie care vizează producerea de polizaharide funcționale valoroase, care se va comporta într-o manieră relativ predictibilă atunci când sunt încorporate în produsele alimentare sau vin din produse funcționale. Pentru a realiza acest lucru sunt necesare, lanțuri de subunitati (masă moleculară ridicată) și/sau lanțuri rigide. Chiar dacă o relație între rigiditatea lanțului și compoziția exopolizaharidelor nu a fost încă stabilită, se susține că există premize pentru acest lucru. Legăturile de tipul β1-4 , au fost găsite în cazul Lactococcus lactis subsp. cremoris B40. Viscozitatea a fost, de asemenea, corelată cu creșterea masei moleculare în unele cazuri.[ 25 ]

Un element intermediar care leagă căi anabolice ale producției de exopolizaharide și căile catabolice de degradare pare a fi cel al glucozo-6-fosfat, , în care fluxul de carbon se împarte între formarea de fructozo-6-fosfat de către produsele de glicoliză, biomasă și formarea ATP și biosinteza de nucleotide glucidice și precursori. Fosfoglucomutaza, o enzimă implicată în conversie de glucozo-6-fosfat la glucozo-1-fosfat, are un rol important în trecerea între căile catabolice și anabolice. Glucozo-1-fosfat servește ca punct de plecare a nucleotidelor UDP-glucoza și dTDP-glucoză prin acțiunea UDP-glucoză pirofosforilazei și dTDP-glucoză pirofosforilazei. De reținut este că aceste nucleotide sunt utilizate pentru a forma o varietate de polizaharide în celule și, în consecință, enzimele asociate acestora sunt des utilizate. Conversia galactozei la glucozo-1-fosfat prin galactoză-1-fosfat (calea Leloir) este posibilă în cazul în care sistemul este prezent în celulă. Etapa ulterioară de sinteză a exopolizaharidelor în bacterii lactice – montarea monoglucidelor în unități repetitive – este realizată de mai multe enzime specifice, așa cum a fost identificat inițial în Streptococcus thermophilus S6 și în Lactococcus lactis NIZO B40. Această unitate repetitivă este asamblată de o moleculă de transport lipidică, care este anexată la membrana citoplasmică din celulă.

Glucidele sunt legate formând unităti repetitive sub acțiunea mai multor gene producătoare exopolizaharide. Mecanismul de polimerizare al unităților repetitive la bacterii lactice, și exportul din celulă, nu este clar. Nivelul ridicat de omologie între organismele Gram-pozitive și Gram-negativ cu privire la sinteza de unități repetitive înseamnă că un mecanism similar va avea loc la nivel de polimerizare al exopolizaharidelor și la export. Un model simplu pentru această acțiune presupune că pentru a muta unități repetitive se leagă de lipide de la partea citoplasmică la partea periplasmică. Folosind aceeași analogie, polimeraza putea cataliza o legatura între unitățile repetitive și o enzimă și se poate dispensa de legătura lipid-polimer și astfel poate controla lungimea lanțului. [ 44 ]

Genele ce codifică sinteza de exopolizaharide ar putea fi amplasat în plasmide, cum ar fi în Lactococcus lactis și Lactobacillus casei, sau localizat în cromozom, la fel ca în toate bacteriile lactice termofile studiate la ora actuală. Stingele și colaboratorii au identificat regiuni eps la Streptococcus thermophilus Sfi6, dezvăluind o regiune codificatoare de15,25 kb, în care o regiune codificatoare de 14,52 kb cu 13 gene (epsA până la epsM) capabile de a conduce sinteza de exopolizaharide. Omologia proteinelor a demonstrat un nivel ridicat de omologie (între 40 – 68%) pentru gene de codificare eps A, B, C, D și E, în Streptococcus pneumoniae și Streptococcus agalactiae. Van Kranenburg și colaboratorii au stabilit că toate informațiile esențiale necesare pentru biosinteza de exopolizaharide la Lactococcus lactis NIZO B40 au fost codificate într-un singur cluster de gene 12 kb situat într-o singură plasmida de 40 kb . [ 39,41]

Un nivel ridicat de similitudine între genele altor bacterii lactice este acum din ce în ce mai evident: un studiu recent al clusterilor genelor eps de la Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus dezvăluit o regiune de 18 kb, constând din 14 de gene, (eps de la A până la N), cu organizare genetică similară și la alte bacterii lactice. Genele în clustere sunt orientate într-o singură direcție și transcrise ca un singur mRNA. Secvențele functionale din aceste grupări de bacterii Gram-pozitive, care sintetizează polizaharide la suprafața celulelor, par să urmeze o tendință similară, determinarea lungimii lanțului, biosinteza unităților repetitive, polimerizare și export.

Unul dintre avantajele utilizării bacteriilor lactice pentru inginerie metabolică apare de la decuplarea completă de căile catabolice de bază și căile biosintetice celulare. Nu sunt clare principiile fundamentale ale ingineriei metabolice a bacteriilor lactice de a produce diferite exopolizaharide. Gama largă de structuri și compoziții de heteropolizaharide produse de bacteriile lactice, precum și diferite efecte funcționale, arată că nu există nici un mod cert de a stabili un punct de reper universal pentru nivelul de exopolizaharide dorite. Din punct de vedere economic nivelul de exopolizaharide produse în fermentație, pentru a fi folosite ca un aditiv alimentar ar trebui să fie în intervalul 10 – 15 g/litru. Cu toate acestea, din cauza limitărilor energetice celulare, cea mai mare cantitate de exopolizaharide raportată până în prezent este de 2,767 g /litru la Lactobacillus rhamnosus RW-9595M. În formularea unei strategii pentru supraproducția de exopolizaharide, este util pentru a afla de la experiențe trecute genetice și metabolice privind capacitatea acestor organisme pentru a genera diferite produse. Strategiile care au fost aplicate pentru a reutiliza carbonul pentru a determina o supraproducție de produse specifice includ, căile inginerești.[ 17, 22, ]

Un element cheie a metabolismului BAL este marea proporție de carbon care merge la lactat. Sa sugerat că, dacă producția de exopolizaharide s-a cuplat la creșterea celulară când are loc reducerea în formarea de lactat, care este cunoscut că inhiba creșterea, ar putea determina formarea de exopolizaharide. Mai mult de carbon ar putea fi transferat de la glycoliză și în formarea de exopolizaharide. Această strategie a fost utilizată pentru a obține supraproducție de produse finale de metabolism, cum ar fi de alanină prin supraexpresia genei pentru alanină dehidrogenazei de la Bacillus sphaericus alaD în tulpina deficitară LDH-un de Lactococcus lactis. Aceasta a fost, de asemenea, eficientă pentru producția de etanol, acetoină, manitol, 2,3 – butandiol, succinat piruvat și de a face o tulpină "dublu knockout" de Lactobacillus plantarum (NCIMB 8826), în care expresiile de L – LDH și D – LDH au fost atenuate. În cazul în care această strategie a fost adoptată pentru a realiza randamente mai mari de exopolizaharide, atunci este de așteptat că modificările suplimentare de reglementare să fie necesare pentru a se asigura că nu a fost excesiv deturnat volumul de carbon pentru a sintetiza metaboliți nedoriți, prin intermediul căii piruvatului. Această abordare a generat mutante LDH-deficiente fără greutăți fiind important să se ia în considerare impactul cu privire la echilibrul redox în celulă. În condiții anaerobe, bacteriile lactice transferă toți echivalenții reducători la produși finali de metabolism și NAD care se regenereaza de la NADH. În Streptococcus mutans, de exemplu, eliminarea activității LDH s-a dovedit letală pentru că organismul nu poate recicla NADH prin rute alternative. Restaurare acestui echilibru, teoretic, ar putea fi atins prin exploatarea unei oxidaze NADH (NOX), de a crea o rată NADH: NAD+ necesară pentru a sprijini nivelul metabolic necesar pentru supraproducția de exopolizaharide. De exemplu, supraproducția oxidazei NADH a fost efectuată prin clonarea genei Streptococcus mutans nox-2 de plasmida vectorului pNZ8020 în Lactococcus lactis, sub controlul promotorului endogen nisA. În mod similar, supraexpresia NOX a fost realizată de clonarea genei nox sub controlul unui promotor nisA, în Lactococcus lactis.[ 51, 54, 55 ]

În acest caz, o reducere semnificativă a producției de lactat implică o reducere concomitentă a căi glicolitice și un efect negativ asupra formarii ATP. Pentru că este nevoie de ATP pentru biosinteza de nucleotide glucidice și molecule lipidice de transport C55-izoprenoid, este necesar pentru polimerizare și exportul de exopolizaharide, o reducere de energie disponibilă ar putea fi de așteptat să compromită formarea exopolizaharidelor. Această opinie este susținută de Looijesteijn și colaboratorii, care au arătat că eficiența producției de exopolizaharide în Lactococcus lactis a fost mai mare atunci când ATP a fost în exces față de nivelul necesar pentru creșterea celulelor.

Conversia de glucozo-6-fosfat la glucozo-1-fosfat de către fosfoglucomutază și, ulterior, formarea de UDP-glucoza, care este catalizată de UDP-glucozo pirofosforilază, au fost propuse ca potențiale puncte de control în producția de exopolizaharide. Supraexpresia genei pgm (pentru fosfoglucomutază) și genei gal_U (pentru UDP-glucozo pirofosforilază) duce la o acumulare de UDP – glucoză și UDP – galactoză, în Lactococcus lactis. Mai recent, supraexpresia genei galU, în combinație cu gena pgm în Streptococcus thermophilus LY03 (Gal-), a condus la o creștere a nivelului de exopolizaharide de la 0,17 la 0,31 g/mol carbon din lactoză. Mutanta Gal+ a Streptococcus thermophilus LY03 a determinat obținerea de cantități mari de exopolizaharide față de tulpina sălbatică (0,24 g/mol carbon de la lactoză). Acest fapt determină posibilitatea de decuplare a căii Leloir de la glicoliză: glucoza din lactoză și galactoză poate fi folosită pentru reacțiile de glicoliză și pentru formarea de exopolizaharide. Acesta a arătat că galactoza ar putea fi utilizată exclusiv pentru funcțiile celulare în tulpinile ce folosesc galactoză prin calea galactozo-6-fosfat, și glucoza ar putea fi utilizată pentru sinteza de exopolizaharide. Enzima Leloir, UDP-galactoză-4-epimerază, ar putea fi o țintă specifică pentru supraexpresia în unele bacterii lactice; UDP-galactoza are un rol crucial în formarea exopolizaharidelor în Lactobacillus casei. [ 33 ]

O altă abordare pentru a spori producția de exopolizaharide există la nivelul biosintezei polimerului exopolizaharidic, și, în special, prin creșterea activității asociate glicosiltransferazei. Un exemplu în acest sens este o creștere mică în producția de exopolizaharide obținute prin supraexpression genei epsD în Lactococcus lactis. Supraexpresii similare s-au prezentat pentru Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus și Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

O metodă alternativă ar putea presupune clonarea întreagii gene eps pe o singură plasmidă cu un mare număr de copii, dar stabilitatea tulpinei în producție va rămâne un element cheie de luat în considerare. Alternativ, plasmide conținând operon eps ar putea fi transferate într-un alt organism pentru a genera niveluri ridicate de exopolizaharide, ca o consecință a fluxului metabolic endogen mai mare. De exemplu, expresia completa a genei eps de la Streptococcus thermophilus Sfi6 într-o tulpina de Lactobacillus lactis (MG 1363) a fost realizată. Valoarea comercială a folosirii clonării întreagului operon sau a grupurilor de gene asociate cu producția de exopolizaharide este reflectată de brevete și publicații. Piața unor astfel de tulpini, trebuie să fie supusă controalelor și acceptării publice a acestor tipuri de produse. [35 ]

În afară de importanța de a crește producția de exopolizaharide în cazul bacteriilor lactice, acestea trebuie să aibă efect funcțional dorit. Centrul acestui obiectiv este înțelegere interacțiunii între diferite structuri ale exopolizaharidelor și componentele matricei alimentare la nivel molecular. Modelarea moleculara a fost folosită ca un instrument valoros în această privință. Faber și colaboratorii au descris o metodă pentru construcția unui model conformational a unei heteropolizaharide și au aplicat-o la o exopolizaharidă produsă de Lactobacillus helveticus 766. Cercetarea în sinteza de polizaharide din bacterii lactice se află încă în fază incipientă, iar cea mai mare parte a activității se referă la controlul structurii exopolizaharidelor din BAL prin intermediul glicosiltransferazei. S-a propus ca informațiile colectate de la genele care exprimă aceste enzime, împreună cu informațiile specificității donor-acceptor să fie utilizate într-o manieră combinatorială de asamblare a unor mecanisme biosinthetice, care ar putea genera polizaharide, cu atribute structurale dorite. Există potențial pentru controlul formării structurii exopolizaharidelor prin introducerea de noi sau deja existente glicosiltransferaze în bacteriile lactice. În plus, manipularea funcțiilor genelor implicate în exportul, polimerizarea, și determinarea lungimii lanțului ar putea reprezenta un mijloc de a modifica structura exopolizaharidelor. Producția de o exopolizaharide dorite ar putea fi, de asemenea, realizată prin controlul condițiilor de cultură.

În unele cazuri, structura exopolizaharidelor a fost găsită că ar depinde de sursa de carbon. Structural, analiza producerii de exopolizaharide la Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772 crescută în cultură continuă a arătat că exopolizaharidele au fost constituite prin repetarea de unități de glucoză și galactoză (în raport de 1:2,4) când au fost crescute în mediu cu fructoză; și de glucoză, galactoză și rhamnoză într-o proporție de 1:70:0,8 când au fost crescute într-un amestec de fructoză și glucoză. Această abordare ar putea să nu fie aplicabilă tuturor tulpini de bacterii lactice. De exemplu, compoziția exopolizaharidelor la tulpina Lactobacillus sakei 0-1 este independentă de tipul sursei de carbon folosite.

În concluzie, conversia relativ ineficientă a energiei din glucide de către bacterii lactice, comparativ cu producători aerobi de polizaharide prezintă o barieră în calea producției economice. Cea mai valoroasă aplicare a ingineriei metabolice de producție a exopolizaharidelor în bacterii lactice este, cel mai probabil, ceea ce rezultă dintr-o combinație de cantității și structurii, ceea ce dă o valoare funcțională sau anumite caracteristici alimentului în care există. Pâna acum, nu au fost raportate îmbunătățiri semnificative în producția de exopolizaharide din bacterii lactice, din punct de vedere economic. Sunt necesare mai multe informații în legătură cu reglarea sintezei exopolizaharidelor înainte ca un impact important să fie observat în cantitatea specifică de polizaharide microbiene. O abordare integrată care necesită soluții metabolice multiple constrângerilor căilor metabolice ale exopolizaharidelor produse va fi probabil necesară, necesitând abilități de combinare experimentale la nivel metabolic, molecular. Acest lucru va necesita un efort de cercetare, disponibilitate de energie, concurența pentru precursori și substraturi, de expresia genelor și interacțiuni fizico-chimice. [ 49, 28, 16, 15 ]

2.1. Screeningul tulpinilor producătoare de exopolizaharide

Nomenclatura utilizată la descrierea diferitelor tipuri de tulpini de BAL producătoare de exopolizaharide este dificilă. Nu toate tulpinile ce produc stratul mucoid sau mucilaginos reprezintă tulpini producătoare de exopolizaharide. La ora actuală, creșterea nevoilor consumatorilor pentru noi produse lactate determină industria alimentară să definească efectele exopolizaharidelor în produsele tradiționale și să caute noi tulpini producătoare. Izolarea de noi tulpini de BAL din medii pe bază de lapte sau nu, necesită utilizarea metodelor specifice de detecție a tulpinii dorite. În ultimii ani, s-au publicat câteva studii referitoare la screeningul de tulpini de BAL producătoare de exopolizaharide din alimente tradiționale fermentate.

Mediul utilizat a fost mediul ESM (g/l): 90 g lapte degresat , 3,5 g extract de drojdie, 3,5 g peptonă, 10 g glucoză pentru izolarea de BAL din murături, cârnați, măsline, brânză și alte produse nelactate. După izolare și cultivare, din peste 600 de tulpini testate, doar 30 au manifestat această proprietate. Rezultă un procent de aproximativ 5%. Dacă se crește concentrația de glucoză la 50 g/l, s-a reușit izolarea a 11 tulpini producătoare. [ 34 ]

De asemenea, s-au utilizat și alte glucide pentru izolarea și îmbunătățirea capacității de detecție a tulpinilor producătoare de exopolizaharide. Au fost izolate tulpini diferite din genul Lactobacillus din alimente fermentate, sistem digestiv animal, placă dentară umană care produc exopolizaharide în mediu MRS suplimentat cu o concentrație (100 g/l) ridicată din diferite glucide, ca: glucoză, fructoză, maltoză, rafinoză, sucroză, galactoză sau lactoză.

Testele s-au realizat cu o incubare de 3 zile, la 370C și o precipitare ulterioară realizată cu etanol păstrat la rece. S-a observat că cea mai bună sursă de carbon a fost sucroza, obținându-se peste 100 mg/l exopolizaharide. S-a observat că, cu cât sursa de carbon în mediu este mai mare, cu atât se determină mai multe tulpini producătoare și se realizează o cantitate mai mare de exopolizaharide la litru de mediu.

Studiile efectuate au demonstrat că sursa de carbon adăugată mediilor de cultură joacă un rol important în detectarea tulpinilor ce sintetizează exopolizaharide. Cantitatea totală de polizaharide produse demonstrează că sunt puternic influențate de glucidele disponibile din mediu. Nu un glucid unic în mediul de cultură contează în obținerea rezultatului, de cele mai multe ori. Aceste constatări sunt determinate de rezultatele testelor efectuate. [ 27 ]

De exemplu, o tulpină de Lactobacillus casei în mediul minimal ce conține glucoză a avut o producție mai mare decât în cazul utilizării aceluiași tip de mediu, dar cu un conținut de lactoză sau galactoză. În schimb, o altă tulpină de Lactobacillus casei a produs de 1,7 ori mai multe exopolizaharide prin utilizarea galactozei, în comparație cu glucoza. În acest caz, diferențele au fost corelate cu variația activității enzimelor implicate în sinteza nucleotidelor glucidului ce acționează ca precursori ai unităților repetitive care construiesc Hexopolizaharide. O tulpină de Lactobacillus lactis var. cremonis produce cantități însemnate de exopolizaharide prin folosirea glucozei, în comparație cu fructoza.

Acest aspect a fost explicat prin activitatea scăzută a enzimei fructozobifosfatazei, care catalizează conversia fructozo – 1, 6 – difosfat în fructozo – 6 – fosfat, un pas esențial în biosinteza lanțului glucidic de la fructoză, dar nu și de la glucoză. Alte diferențe în producția de exopolizaharide bazate pe sursa de carbon din mediul de cultură au fost atribuite prezenței diferitelor sisteme de transport al glucidelor în tulpinile BAL. Dacă intră ca mono – și dizaharide în celulă acesta reprezintă pasul inițial al sintezei exopolizaharide.

Pentru tulpini de Streptococcus thermophilus s-a demonstrat abilitatea de a produce exopolizaharide în medii bazate pe zer, precum și în medii complexe de laborator. Cantitatea de exopolizaharide nu a depășit, în mod normal, 400 mg/l, dar sunt studii care arată și obținerea a 1,1 – 3 g/l. exopolizaharide produse de către Streptococcus thermophilus care sunt heteropolizaharide ce conțin lanțuri de glucoză, galactoză și manoză și uneori N – acetil – glucozamină. Masa moleculară a acestor exopolizaharide variază între 1 – 9×106 Da. [ 26 ]

Producția de exopolizaharide este stimulată de temperatura scăzută pentru tulpinile de Streptococcus thermophilus, deși în mod normal acest lucru nu stimulează sinteza, la fel ca și de cantitățile scăzute de glucide adăugate în fermentații semicontinue. Efectul pH a fost puțin studiat, deoarece în puține fermentații acesta a fost controlat. Se știe că, în mediile de cultură ce conțin lactoză pH ideal trebuie să fie 7, iar în cele cu sucroză pH ideal este 5,5. Lactoza dintr-un mediu de cultură influențează atât cinetica producției de exopolizaharide, cât și compoziția exopolizaharidelor. Sinteza de exopolizaharide cu tulpini de Streptococcus thermophilus a avut valori maxime în medii ce conțin glucoză și fructoză și a avut valori scăzute în prezența lactozei și a sucrozei. [37 ]

Secreția și sinteza de exopolizaharide are loc în perioade diferite ale fazelor de creștere bacteriene și tipul polimerului este influențat de condițiile de creștere, cum ar fi temperatura și timpul de incubare. Cantitatea de exopolizaharide sintetizate nu este direct proporțională cu creșterea microbiană. În schimb, s-a găsit că producția de exopolizaharide este adesea mai mare la temperaturi scăzute. Schellhaass, Taggatz și Mozzi au arătat că producția de exopolizaharide crește la tulpinile de Streptococcus thermophilus și Lactobacillus bulgaricus la temperaturi de fermentație cuprinse între 32 și 370C, față de o temperatură de 420C.

Producția de exopolizaharide a bacteriilor lactice mezofile este cu peste 50% mai mare când tulpinile sunt crescute la 250C, față de 300C. Pentru unele tulpini de Lactococcus lactis subsp. cremonis, temperaturile de sub 200C sunt utilizate pentru a sintetiza cantități sporite de exopolizaharide. Propionibacterium acidi propionici produce mai multe exopolizaharide la 250C, o temperatură mai scăzută decât cea optimă de creștere. La aceste tulpini de propionibacterii, Skogen a demonstrat că vâscozitatea crește cu 100% când sunt crescute la 150C față de 210C sau la 210C față de 320C. Din aceste cercetări reiese că scăderea creșterii celulare determină o sinteză mai scăzută a polimerilor peretelui celular, lasând metabolismul să sintetizeze exopolizaharide. [ 11 ]

Corectarea pH la 6 la un mediu de cultură pe bază de zer pentru cultivarea tulpinilor de Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus și Lactococcus lactis se presupune că determină sinteza de exopolizaharide deoarece are loc și o creștere a vâscozității. Skogen și colaboratorii au arătat că variația nivelului pH inițial al mediului are un efect direct asupra vâscozității mediului. Astfel, cea mai ridicată vâscozitate într-un mediu pe bază de zer s-a obținut la un pH de 6.

Multe cercetări asupra formării de exopolizaharide de către bacteriile lactice, utilizate la realizarea de produse probiotice, se realizează prin utilizarea de lactoză, ca și glucid fermentescibil. Astfel, se încearcă realizarea sintezei de exopolizaharide, în general, într/un mediu de cultură ce provine din lapte sau care are laptele ca și component principal, acesta fiind ultrafiltrat sau zerul concentrat. De curând, mediile de cultură cu compoziție strict definită au fost utilizate cu scces la sinteza de exopolizaharide utilizând tulpinile Lactobacillus casei și Lactococcus lactis subsp. cremonis. Făcând o comparație între lapte sau zer, mediile sintetice determină o izolare mai rapidă și mai ușoară a exopolizaharidelor. De asemenea, facilitează studierea influenței componentelor individuale ale mediului, în special a sursei de carbon reprezentată de glucide.

Rezultate contradictorii au fost prezentate cu referire la efectul factorilor ce stimulează sinteza de exopolizaharide. Creșterea producției de exopolizaharide și a multiplicării celulare s-a obținut când cazeina a fost suplimentul adăugat la laptele degresat, în cazul culturilor de Lactobacillus bulgaricus. Deși nu s-a găsit o legătură directă între prezența cazeinei sau a proteinelor din zerul de lapte în mediile de cultură ale bacteriilor lactice termofile și mezofile și creșterea celulară la Lactobacillus bulgaricus, acestea au o influență certă asupra sintezei de exopolizaharide. Este demonstrat faptul că tulpinile de Lactobacillus bulgaricus sunt capabile să producă cantități reduse de exopolizaharide în lapte și lapte ultrafiltrat, pe când cele de Streptococcus thermophilus nu. [ 4 ]

Se știe că suplimentarea laptelui ultrafiltrat cu glucoză sau sucroză stimulează producție de exopolizaharide și conduce la modificări ale structurii exopolizaharidelor la tulpinile de Lactobacillus casei. Studiile realizate cu tulpinile de Lactococcus lactis subsp. cremonis au arătat că se sintetizează cantități relativ similare în medii de cultură cu compoziii standard în comparație cu laptele.

Experimentele fermentative pentru producerea și analiza de exopolizaharide s-au realizat în principal în medii de cultură pe bază de zer suplimentat cu clorură de amoniu și lactoză. Mediile ce conțineau extract de drojdie se suplimentează cu lactat, glucoză sau sucroză. Prin testarea a numerose surse de carbon, Skogen a demonstrat o creștere considerabilă a vâscozității atunci când se folosețte glucoza, maltoza și rafinoza ca sursă de carbon. De asemenea, există studii care arată capacitatea tulpinilor de Streptococcus thermophilus de a sintetiza exopolizaharide în asociere cu tulpini de Lactobacillus delbrueckii var. bulgaricus.

Exopolizaharidele sunt sintetizate în diferite faze ale curbei de creștere și sub o diferite condiții de creștere în funcție de tulpina utilizată la realizarea studiilor. Astfel, se cunosc două mecanisme principale ale sintezei de exopolizaharide. Homopolizaharidele, de tipul levanului și dextranului, de către leuconostoci și streptococi sunt procese extracelulare ce implică enzime care sunt secretate de către bacterii.

Heteropolizaharidele sunt sintetizate printr-un sistem complex în care ele sunt produse la nivelul membranei citoplasmatice prin utilizarea de precursori formați intracelular. În contrast cu exopolizaharidelor și polizaharidele capsulare din bacterii gram negative, exopolizaharidele bacteriilor lactice sunt încă un aspect mereu nou de cercetate. Există cercetători care declară că mecanismul propus pentru sinteza de exopolizaharide la bacteriile gram negative, este similar cu cel de la sinteza de exopolizaharide la bacteriile gram pozitive. Aceasta este pusă pe seama faptului că structura de bază pentru polimerizare are cam aceleași unități glucidice repetitive.

Sinteza exopolizaharidelor bacteriene implică multe enzime care nu sunt unice la formarea acestor polimeri. Nucleotidele glucidice joacă un rol important în sinteza exopolizaharidelor: ele sunt forma activată a monoglucidelor și provin prin conversia monoglucidelor prin epimerizare, dehidrogenare și reacții de decarboxilare.

Lipidele sunt implicate în sinteza exopolizaharidelor. Lipidul implicat în sinteza polimerilor peretelui celular de tipul lipopolizaharidelor, peptidoglicanului și aciziilor teicoici este identic. Aceasta explică de ce producția de exopolizaharidele este redusă în cazul condițiilor în care este stimulată producția de lipopolizaharide sau acid teicoic, rezultând o competiție pentru același mod de transport. Astfel, în general producția de exopolizaharide la bacteriile lactice este mai semnificativă la temperaturi scăzute. Dacă multiplicarea bacteriană este scăzută, formarea polimerilor peretelui celular este scăzută și fac ca o cantitate mai mare de izoprenoid fosfat să fie disponibil pentru sinteza de exopolizaharide.

2.2. Metode actuale de izolare a exopolizaharidelor

Diferite medii de cultură au fost utilizate la studierea cantitativă și calitativă a exopolizaharide și la determinarea influenței nutrienților în producția tulpinilor, biosinteza și genetica acestor biopolimeri în BAL. Mediile care sunt cel mai des menționate conțin lapte degresat și zer. A fost stabilit că anumite condiții de cultivare și compoziția mediului de cultură (nu doar sursa de carbon) influențează cantitatea de exopolizaharide, dar și caracteristicile moleculare ale biopolimerilor. Alegerea unui mediu adecvat are o mare importanță dată de faptul că unele dintre aceste componente pot interfera cu producția de exopolizaharide. Astfel, extractul de drojdie, extractul de carne și peptona sunt responsabile pentru 94% din exopolizaharide sintetizate prin folosirea MRS ca mediu de creștere și sinteză a Lactobacillus delbrueckii var. bulgaricus. Studiile au arătat că glucomananii prezenți în extractul de drojdie și peptonă sunt materialul polimerului – glucidic care interferă cu cuantificarea exopolizaharide într-un mediu de cultură complex. Mediile semisintetice elimină componentele care interferă cu o cuantificare a exopolizaharide. Mediile care conțin strict sursa de carbon, aminoacizi, vitamine, săruri minerale facilitează analiza exopolizaharide. [ 17, 20 ]

În general, complexitatea metodei utilizate pentru izolarea și purificarea exopolizaharide depinde de compoziția mediului de cultură utilizat. O procedură simplă constă în dializa mediului de cultură (după îndepărtarea celulelor), urmată de liofilizare. Această tehnică a fost utilizată la izolarea exopolizaharide sintetizate de către Lactoccocus lactis var. cremonis care a fost cultivată în mediu semisintetic. Precipitarea cu etanol poate fi utilizată la izolarea exopolizaharide sintetizate de tulpini termofilice (Lactobacillus delbrueckii var. bulgaricus, Streptococcus thermophilus) și mezofilice de BAL (lactococi și lactobacili). Cu cât mediul de cultură crește în complexitate, o etapă suplimentară de purificare este necesară pentru a reduce conținutul în proteină și alți compuși. Pentru exopolizaharidele obținute din medii cu conținut proteic ridicat se utilizează precipitarea cu cantități diferite de TCA (cuprinse între 4 și 14%), digestia cu proteaze sau o combinație a acestora.

O singură precipitare a proteinelor cu TCA 12% urmată de o dializă și liofilizare a supernatantului se utilizează la izolarea exopolizaharide produse de către BAL din iaurt. Aceeași procedură se folosește și la izolarea de exopolizaharide produse în lapte de Lactococcus lactis var. cremonis. Cel mai utilizat protocol pentru mediile de cultură complexe implică precipitarea cu TCA și îndepărtarea proteinelor prin precipitare, urmată de concentrarea exopolizaharide prin precipitare cu etanol. Diferențele obținute prin această metodă sunt cuprinse între 5 și 15%. Mai puțin utilizată este precipitarea exopolizaharidelor după adăugarea de TCA cu acetonă, în locul etanolului.

Alte cercetări prezintă o izolare a exopolizaharidelor din lapte după precipitarea proteinelor cu pronază E provenită de la Streptomyces griseus, care are o specifitate mare a substratului. Se folosește la izolarea exopolizaharide produse de către tulpini starter termofilice și mezofilice, precum și de către tulpini de Bifidobacterium longum. După inactivarea termică a pronazei și etapa de concentrare (evaporare sau ultrafiltrare), exopolizaharidele se precipită cu etanol. Rezultatele prezintă variații de aproximativ 10%. În final, o combinație a precipitării cu TCA și digestia cu protează a fost utilizată pentru culturile iaurtului.

Pe lângă îndepărtarea proteinelor și precipitarea exopolizaharide, alte metode au fost utilizate pentru purificarea lor, cum ar fi tehnicile de filtrare ca microfiltrarea, ultrafiltrarea și diafiltrarea. Filtrarea prin membrane sintetice permite separarea exopolizaharide de molecule cu greutate mică prezente în mediile de cultură complexe. Diferențele dintre tehnicile de filtrare se bazează în principal pe variațiile dimensiunilor porilor membranelor. După îndepărtarea celulelor prin centrifugare, protocolul de izolare include:

microfiltrarea supernatantului printr-o membrană ceramică (dimensiunea porilor de 14 mm, factor de concentrare 14);

ultrafiltrarea microfiltratului cu membrană de polisulfonat (limita de excludere molară 10kDa, factor de concentrare 10);

diafiltrarea cu aceeași membrană de ultrafiltrare, împreună cu 20 volume apă deionizată, după care produsul este liofilizat.

După un astfel de proces de purificare, pudra liofilizată conține 63% exopolizaharide, 18% proteine, 8% cenușă, 6% resturi bogate în manan și 5% apă. Se mai poate realiza o purificare a liofilizatului cu 80% etanol, ce conține 0,1% acid formic pentru a favoriza solubilizarea proteinelor. Urmează o spălare cu etanol 96%, conținutul de exopolizaharide crescând la 72%, iar cel de proteine scăzând la 6%. Celelalte componente rămân cu aceleași procente. În unele cazuri, alte tratamente pot fi aplicate pentru creșterea conținutului în exopolizaharide, cum ar fi coloanele schimbătoare de ioni, digestia cu DNA-ză.

În general, metoda utilizată la izolarea fracției exopolizaharidice exercită o influență puternică asupra cantității totale de exopolizaharide obținute. Diferite metode au fost utilizate pentru a determina exopolizaharide bacteriilor kefirului în lapte și mediu bazat pe zer.

Metodele au necesitat 1 până la 2 etape de precipitare cu etanol, o etapă de precipitare cu etanol urmată de dializă cu membrane de 1000, 6000 și 12000 Da și precipitare cu TCA. Rezultă că tratamentul termic al probei ca prim pas al izolării exopolizaharidelor este critic pentru recuperarea completă a polimerului. [ 33, 42, 50 ]

O singură precipitare cu etanol nu elimină în totalitate lactoza reziduală. Precipitarea cu TCA reduce cu aproximativ 50% cantitatea de exopolizaharide recuperată, rezultând un biopolimer coprecipitat cu proteine. Aceasta este procedura aleasă când o întreagă caracterizare fizico-chimică a exopolizaharide este cerută, deoarece rezultă fracția polizaharidică cu impurități.

2.3. Aplicațiile exopolizaharidelor produse de către tulpini de bacterii lactice

Funcția biologică exactă a exopolizaharidelor sintetizate de către celulele bacteriene nu a fost complet elucidată, nici până în acest moment. Până la ora actuală există rezultate care arată că exopolizaharidele microbiene au un rol important în pierderea apei de către celulele microbiene și, în general, extrapolând, la nivelul organismului prin fecale.

De asemenea, aceste polizaharide previn fagocitoza și atacul fagilor, având și rol de protecție împotriva antibioticelor și a numeroase substanțe toxice (ioni metalici, dioxid de sulf, etanol). Pe lângă toate aceste aspecte general acceptate, exopolizaharidele aduc numeroase beneficii sănătății umane prin sinteza directă a lor la nivelul intestinului uman. În mod indirect, prin utilizarea lor în industria produselor lactate fermentate, acestea prin consum ajung să își exercite efectul pozitiv.

Aceste polizaharide s-a demonstrat că au unele efecte imunostimulatoare, antitumorale, efecte antiulcer și de scăderea a colesterolului. Exopolizaharidele au o contribuție consistentă la absorbția ionilor metalici. Homopolizaharidele (glucanii și fructanii) sunt implicați în aderența bacteriilor la altele sau la suprafața intestinală, prin modularea difuziei substanțelor și prin faptul că pot servi ca rezerve energetice extracelulare. [ 1, 2 ]

De exemplu, în industria alimentară și farmaceutică se utilizează multe tipuri de polizaharide și stabilizatori datorită proprietăților de legare a apei, formării de gel, ca și agenți de îngroșare, precum și celor de formare de vâscozitate. Cele mai des întâlnite sunt carbohidrații din plante (amidonul, gumele, pectina și alginatul) sau hidrocoloizi de origine animală (gelatina și cazeina). Xantanul produs de către bacteria Xanthomonas campestris a fost prima exopolizaharidă microbiană utilizată în industria alimentară, cosmetică și farmaceutică. Cu toate acestea, utilizarea sa nu este permisă în majoritatea țărilor europene și în USA.

În schimb, exopolizaharidele produse de către bacterii lactice și-a câștigat o popularitate ridicată, datorită faptului că sunt considerate sigure și sunt utilizate ca și stabilizatori naturali. Pe lângă toate acestea, în ultima perioadă de timp se observă un interes crescut pentru exopolizaharidele produse de către culturile probiotice de bacterii lactice datorită cererii crescute a consumatorilor pentru produse lactate fermentate cremoase și cu un conținut scăzut în grăsimi. Astfel sinteza de exopolizaharide determină realizarea de produse cu o consistență corespunzătoare.

La ora actuală, tulpinile de Streptococcus thermophilus și Lactobacillus bulgaricus sunt indispensabile de la fabricarea produselor de tipul iaurtului din șările Uniunii Europene, deoarece suplimentarea cu aditivi este strict interzisă. Sunt utilizate deoarece cresc vâscozitatea și îmbunătățesc textura laptelui fermentat. De foarte multe ori vâscozitatea mediului nu este influențată de către cantitatea de exopolizaharide, dar datorită structurii lor diferite rezultă un comportament reologic caracteristic.

Exopolizaharidele sunt formate de către bacteriile lactice în timpul fabricării produselor din lapte fermentat, acționând ca și agent de îngroșare și emulsificator sau la creșterea proprietăților reologice. De asemenea, se sintetizează în timpul colonizării intestinului de către bacteriile lactice probiotice, dar au și un rol extrem de important în creșterea capacității de formare a biofilmului. Se consideră, că această proprietate este una esențială în formarea biofilmului de către o tulpină probiotică lactică. [ 37 ]

Orice studiu a biofilmelor trebuie să accepte că acestea se pot dezvolta într-un număr foarte mare de medii, și că structurile intrinseci al unui singur biofilm constituit în conformitate cu toate caracteristicile pot fi unice pentru un mediu și microfloră. Un număr foarte mare de specii microbiene sunt capabile de a forma biofilm. În condiții naturale, biofilmele formate de către o singură specie sunt relativ rare. Astfel, cele mai multe biofilme sunt compuse din amestecuri de microorganisme. Aceasta adaugă la interacțiunile interspecifice și intraspecifice și complexitatea generală a amestecului macromolecular prezent.

Exopolizaharidele sintetizate de celule microbiene variază foarte mult în compoziția lor și, prin urmare, în proprietățile chimice și fizice. Unele sunt neutre macromolecular, dar majoritatea sunt polianionice datorită prezenței fie a acizilor uronici sau legate de piruvat. Reziduurile anorganice, cum ar fi de fosfat sau, rareori, sulfat, pot, de asemenea, conferi statutul de polianionic.

Foarte puține exopolizaharide pot fi chiar policationice, ca exemplu polimerul adeziv, obținut din tulpini de Staphylococcus epidermidis asociate cu biofilmele. Compoziția și structura exopolizaharidelor determină structura primară a biofilmelor. Mai mult, configuratia secundară se prezintă sub forma de agregate helicale. Polizaharidele pot astfel forma diferitelor tipuri de structuri în cadrul unui biofilm. Cu toate acestea, în biofilme polizaharidele nu există libere, dar pot interacționa cu o gamă largă de alte specii moleculare, inclusiv lectine, proteine, lipide, etc, precum și cu alte polizaharide. Structura terțiară cuprinde o rețea de polizaharide și alte macromolecule, în care celulele și produsele celulare sunt, de asemenea, prinse în acea rețea.

În ciuda unor relatări că existența biofilmului este specific anumitor polizaharide, există puține dovezi concludente pentru a sprijini astfel de afirmație. O problemă majoră este de a obține suficiente exopolizaharide, care sunt cu adevărat componente ale biofilmului.

În prezent exopolizaharidele biofilmului sunt componenți siguri corespunzătoare polimerilor sintetizați de către celulele planctonice. Acest lucru a fost demonstrat prin utilizarea de anticorpi împotriva exopolizaharidelor celulelor planctonice și, de asemenea, prin comparație a produselor de digestie planctonice și exopolizaharidelor biofilmului folosind polizaharaze specifice. Astfel poate fi crescută în exces producția de polizaharide, ca parte a unui răspuns la stres, așa cum este văzut în sinteza acidului colanic de la Escherichia coli și alte specii de enterobacteriene. Aceste bacterii capabile de a forma mai multe tipuri de polizaharide pot produce cantități mai mari față de culturile planctonice; acest lucru din nou, este, probabil, parte a unui răspuns de stres.

Un rezultat ale acestui efect a fost rapotat în compoziția polizaharidelor, aproape sigur, datorită proporției variabile de diferite polizaharide sintetizate în biofilm. Acest lucru este valabil în biofilmele care conțin un amestec de specii microbiene. În acestea, trebuie amintit faptul că tipurile relativ diferite de polizaharide și proporțiile celulelor microbiene prezente va depinde foarte mult de statutul fiziologic din biofilm. Astfel de biofilme sunt, de asemenea, puțin probabile să aibă o compoziție uniformă. În consecință, nici o probă luată pentru analiză nu va reprezenta numai o singură parte a compoziției de exopolizaharide. Astfel, rezultă variații în compoziția amestecului fiind rezultatul diferenței de sinteză din componența polimerilor. De asemenea, este foarte posibil ca în biofilme subpopulațiile diferite ar putea avea diverse micro-medii care să conducă la producerea de diferite amestecuri de polizaharide. [36 ]

Cantitatea exopolizaharidelor sintetizate în biofilm va depinde foarte mult de disponibilitatea substratului de carbon (atât din interiorul, cât și din afara celulelor), iar echilibrul constă în raportul dintre substratul de carbon și alte substanțe nutritive. Prezența în exces a substratului de carbon și limitări în alte elemente nutritive, cum ar fi azot, fosfat de potasiu, va promova sinteza exopolizaharidelor. Creșterea bacteriană lentă observată în cele mai multe biofilme, de asemenea, sporesc producția exopolizaharidelor. Este clar dintr-o serie de studii că mutantele ce prezintă imposibilitatea de a sintetiza exopolizaharide nu sunt în măsură să-și formeze biofilmul. În biofilmele naturale izolate, cea mai mare parte a bacteriilor ce nu sintetizează biofilme se prezintă ca și celule separate.

Cu toate acestea, în cazul în care bacteriile sunt componente ale biofilmului, prezența unor specii care produc cantități mari de exopolizaharide sporesc stabilitatea altor tipuri de celule, chiar dacă ele însele nu sintetizează exopolizaharide. Aceste efecte au fost considerate ca stabilizator de James și colaboratorii.

Așa cum s-a arătat de către Skillman și colaboratorii, proporțiile diferitelor exopolizaharide în biofilm nu reflectă proporțiile dintre celulele prezente, cum exopolizaharidele nu contribuie în mod egal la structura și proprietățile biofilmului.

Multe dintre aceste polizaharide sunt relativ solubile, și din cauza masei moleculare mari, rezultă solutii apoase foarte vâscoase.

Câteva vor forma geluri slabe, care se dizolvă în exces de solvent, pe suprafața expusă a biofilmului. Modificările se pot produce când ionii sunt prezenți. Unii ioni mai specifici pot interacționa cu grupările expuse ale acizilor carboxilici. Diverși cationii pot concura pentru același sit, așa cum au demonstrat Loaec și colaboratorii.

Ioni obligatorii pot fi mai puțin specifici. Cationii uneori pot fi importanți în determinarea gradului de interacțiune între lanțurile de polimer. În cele mai multe cazuri, prezența cationii multivalenți, cum ar fi Ca2+ va duce la formarea de helixuri mai extinse decât ioni monovalenți, cu toate că unele polizaharide seamănă cu carragenanul și dezvăluie agregate dublu helicale în prezența K+.

Exopolizaharidele contribuie direct la proprietățile biofilmului, în sensul că în mod normal, permită o cantitate considerabilă de apă de a fi legată. Aceasta nu este o caracteristică larg examinată. Cu toate acestea, polizaharide pot lega până la 1 kg de apă/g polizaharide. Este probabil ca multe dintre EPS, în biofilm leagă cantități mai mici, în timp ce unele, exclud de cele mai multe ori apa din structura lor terțiară. EPS vor contribui de asemenea la stabilitatea mecanică a biofilmului,care să le permită să reziste la forțele de forfecare considerabile. În unii polimeri, interacțiunea cu ionii pot genera geluri relativ rigide, care sunt mai puțin deformate de forfecare, astfel producând un biofilm mult mai stabil. [25 ]

Mayer și colaboratorii au sugerat că biofilmele s-ar putea prezenta, ca structuri de tip gel, dar acestea pot fi foarte slabe și, prin urmare, pot fi ușor distruse de forfecare sau prin dizolvarea polizaharidelor.

Nu trebuie uitat faptul că un număr mic de EPS, din cauza compoziției lor și structurii terțiare, ar putea fi de fapt hidrofobe. Alții au localizate regiuni hidrofile și hidrofobe care le conferă proprietăți foarte diferite la multe tipuri de biofilme.

În concluzie, un biofilm (Figura 2.3.2.) este bine organizat prin cooperarea comunitatii de microorganisme. Celulele microbiene se atașează la suprafețele existente și dezvoltă un biofilm. Celule asociate biofilmului se diferențiată de cele în suspensie prin rata de creștere redusă, și generarea de matrice extracelulară polimerică. Studiile genetice au arătat că biofilmele se formează în mai multe etape. Ele necesită semnalizare intracelulară și transcriu seturi diferite de gene diferite de la celulele planctonice.

Prin urmare, formarea biofilmelor poate fi privită ca un proces de dezvoltare, care își împarte unele dintre caracteristici cu alte procese de dezvoltare bacterienă. Dezvoltarea bacteriilor și activitatea este substanțial îmbunătățită prin includerea unor suprafețe de care microorganisme s- ar putea atașa (efect de sticla). Unele cercetări, au observat că numărul de bacterii de la nivelul diferitelor suprafețe a fost mult mai ridicat decât în medii înconjurătoare.

Odată cu utilizarea de tehnici noi ce folosesc, roșu ruteniului și tetraoxid de osmiu, au fost, de asemenea, în măsură să demonstreze că substanța extracelulară polimerică (EPS) este formată din polizaharide. O mare parte din sdudiile din ultimele două decenii au elucidat multe aspecte cu privire la biofilme, prin utilizarea microscopului electronic și cercetarea genelor implicate în adeziunea celulară. [ 11 ]

Formarea biofilmelor are loc treptat și constă în formarea stratului de condiționat, dezvoltarea bacteriilor, adeziunea bacteriană (Figura 2.3.2.) și expansiunea biofilmelor. Biofilmele pot exista pe toate tipurile de suprafete, cum ar fi plastic, metal, sticlă, particule de sol, lemn, materiale medicale – implant, țesuturi și produse alimentare. Atașamentul bacterian este mediat de fimbriae, pilli, flagella și exopolizaharide care actioneaza prin formarea de punți între bacterii. Biofilmele, în natură, pot avea un nivel ridicat de organizare și în ele pot exista comunitățile de specii unice sau multiple, s-au poate fi format dintr-un singur strat sau dintr- o structură tridimensională.

Important din perspectiva sănătății publice este rolul biofilmelor în rezistenta la medicamentele antimicrobiene și combaterea acesteia prin integrarea sau înlocuirea cu cele din bacterii lactice. Diverse efecte asupra sănătății au fost atribuite bacteriilor lactice, cum ar fi prevenirea și tratamentul diareei acute la copii, prevenirea diareei asociate antibioticelor, prevenirea și tratamentul diferitelor alergii, precum si, ocazional, efecte benefice pentru alte tulburări. Cu toate acestea, modul de acțiune al bacteriilor lactice legat de aceste efecte de îmbunătățire a sănătății este, în principal necunoscut. Capacitatea de aderența și colonizarea sunt considerate ca fiind factori ce contribuie la modularea răspunsului imunitar, excludere de patogeni și îmbunătățirea contactului cu mucoasa de către bacteriile probiotice.

În acest fel, probioticele ar fortifica rezistența microbiotei ca o barieră împotriva agenților patogeni. În studii comparative, bacteriile lactice determină o aderență bună in vitro la celulele epiteliale și mucus. Astfel, bacteriile lactice studiate sunt capabile să adere la mucoasa intestinală și să persiste peste o săptămână după o administrare orală în cazul adulților.

În plus, administrarea orală de bacterii lactice la gravide a fost raportată că duce la colonizarea la copiii până la 24 luni. În plus, bacteriile lactice sunt, de asemenea, în măsură să colonizeze gura și pot persista în salivă timp de 2 săptămâni după ingestie.

Acestă capacitate de colonizarea ar fi legată de efectul inhibitor al bacteriilor lactice asupra dezvoltării clinice a cariilor dentare la copii. Cu toate că majoritatea bacteriilor lactice au fost inițial izolate de la oameni, ele sunt, de asemenea, în măsură să colonizeze tractul digestiv al șoarecilor. Lactobacillus rhamnosus s-a dovedit a fi asociat atât cu mucoasa stomacului și intestinului acestor șoareci.

Multe bacterii lactice aderente apar în medii naturale, în componența biofilmelor în cazul în care acestea sunt conținute în matricea extracelulară care să le protejeze împotriva condițiilor ostile de mediu. Biofilmele, de asemenea, joacă un rol în relația dintre corpul uman și microbii găzduiți, la nivel intestinal. [ 11 , 12 ]

Capitolul 3. Materiale și metode

3.1. Mediile utilizate pentru izolarea și cultivarea acestor tulpini au fost medii specifice bacteriilor lactice:

Pentru izolarea bacteriilor lactice s-a folosit mediu Man-Rogosa-Sharpe (MRS) g/l: peptonă-10.0; extract de carne-5.0; extract de drojdie-5.0; glucoză-20.0; K2HPO4-2.0; Tween 80-1ml; citrat de amoniu dibazic-2.0; acetat de sodiu-5.0; MgSO4 x 7H2O-1.0; MnSO4 x H2O -0.5; pH = 6,5 (De Man J.C., 1960).

Pentru selecția tulpinilor care biosintetizează acid lactic s-a utilizat mediu MRS + CaCO3 1%. Deoarece în momentul adăugării CaCO3 are loc o alcalinizare a mediului, a fost necesară ajustarea pH-ului mediului MRS înainte de sterilizare la pH 6,5 cu soluție de HCl 37%.

3.2. Material biologic:

Tulpinile utilizate la realizarea studiilor propuse sunt :

Lactobacillus rhamnosus 1

Lactobacillus rhamnosus 4.2

Lactobacillus paracasei IL 2

Lactobacillus plantarum IL 3

Tulpinile sunt păstrate la -820C, în glicerol 20%. Revitalizarea tuturor tulpinilor s-a făcut prin două cultivări succesive pe mediu MRS.

3.3. Condiții de cultivare:

Următoarea etapă a studiului a fost determinarea, pentru fiecare tulpină, a sursei de carbon (glucoză, lactoză, sucroză) în scopul obținerii unei cantități mai mari de exopolizaharide, precum și a timpului maxim de fermentație. Odată glucidul stabilit, se va determina concentrația optimă prin creșterea valorii la 5, 10, 15 și 20%.

Toate testele se vor realiza pornind de la mediul standard MRS și prin înlocuirea glucozei cu lactoză și sucroză Testele s-au desfășurat pe o perioadă de 72 de ore, cu probe luate la fiecare 24 de ore.

3.4. Izolarea și determinarea cantității de exopolizaharide:

Fiecare probă a fost ținută 10 minute la 1000C într-o etuvă Memmert, după care răcită pe baie de gheață. Precipitarea proteinelor s-a făcut prin adăugare de 15% acid tricloracetic. Celulele microorganismului și proteinele s-au îndepărtat prin centrifugare la 5.000 rpm, timp de 10 minute într-o centrifugă Hettich Eba 32R cu răcire.

Exopolizaharidele sintetizate au fost precipitate din supernatantul rezultat prin adăugare de două volume de etanol 100%. Amestecul se lasă peste noapte la 40C și polizaharidul se îndepărtează prin centrifugare cu acceași centrifugă la 13.000 rpm, timp de 15 minute.

3.5. Determinarea densității optice

Pentru a se urmări gradul de dezvoltare al celulelor de bacterii din mediul de fermentație, se face o determinare colorimetrică la un spectrofotometru de tip Heidolf (λ = 600 nm) după o prealabilă diluare cu apă distilată. În acest scop 1 ml de mediu de fermentație omogen, se diluează cu 9 ml de apă distilată, se agită și se citește extincția la spectrofotometru în cuvă de un cm față de martor reprezentat de apă distilată. Calculul densității optice se realizează după următoarea formulă: D.O. = E600 × 10, unde:

E600 – extincția citită la 600 nm;

10 – diluția probei.

Se menționează faptul că pe parcursul procesului de fermentație se pot utiliza și alte diluții în funcție de capacitatea de creștere,pentru a putea efectua măsurătorile.

3.6. Determinarea producerii de acid lactic:

Se urmărește acumularea de acid lactic în cazul mediilor de cultură utilizate. Aciditatea s-a determinat prin titrare cu NaOH 0,1N, prin utilizarea unui titrator automat. Pentru determinare se ia în considerație faptul că 1 ml NaOH 0,1N corespunde la 0,009008 g acid lactic.

Capitolul 4. Rezultate și discuții:

4.1 Stabilirea sursei de carbon, temperaturii și pH la cultivarea tulpinilor Lactobacillus rhamnosus 1 și Lactobacillus rhamnosus 4.2

Influența sursei de carbon (glucoză, lactoză, sucroză) asupra celor două tulpini de Lactobacillus a fost studiată prin determinarea densității optice, a producției de acid lactic și de exopolizaharid. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 4.1.1.

Din datele prezentate reiese că sucroza este sursa de carbon cu ajutorul căreia se obține cea mai mare cantitate de exopolizaharide, la 48 de ore de fermentație. Aceste constatări sunt valabile pentru ambele tulpini, 41 mg/L pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus 1, și respectiv 74 mg/L pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus 4.2.

De remarcat pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus 4.2 este faptul că, la utilizarea sucrozei, la 48 de ore de fermentație, se obține o cantitate de exopolizaharide cu aproximativ 50% mai mare. Pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus 1 nu se observă același fenomen. Din contră, cantitatea de exopolizaharide obținute se menține constantă.

Prin utilizarea de glucoză se obține cea mai mică cantitate de exoplizaharide, chiar și la 72 de ore de fermentație. Prin utilizarea de lactoză, pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus 1, cantitatea de polizaharid este apropiată de cea realizată cu sucroză, 38 mg/L.

Sinteza de acid lactic este maximă tot la utilizarea sucrozei ca sursă de carbon. Aceasta se constată pentru ambele tulpini utilizate, cu un plus pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus 4.2 la 72 de ore de fermentație.

Din determinarea densității optice reiese faptul că valoarile mici se obțin acolo unde sinteza de exopolizaharide este maximă. Aceasta înseamnă că tulpinile utilizează cu preponderență sursa de carbon pentru sinteza de exopolizaharide și nu pentru multiplicarea lor. În cazul celorlalte două surse de carbon , predomină creșterea celulară, în special atunci când se utilizează glucoză. Prin utilizarea de lactoză se creează un echilibru relativ între creșterea celulară și sinteza de exopolizaharide.

Tabelul 4.1.1. Influența sursei de carbon asupra sintezei de exopolizaharid

În Tabelul 4.1.2. este prezentată cantitatea de exopolizaharid sintetizată de către cele două tulpini în cazul creșterii concentrației de sucroză la 5, 10, 15 și 20%. Din analiza datelor prezentate reiese că, la o concentrație de 15% sucroză, se obține cantitatea maximă de polizaharid. Pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus IL1 cantitatea maximă obținută este de 55 mg/L. Pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4.2 cantitatea maximă obținută este de 145 mg/L. Pentru ambele tulpini timpul necesar sintezei maxime de polizaharid este de 48 de ore.

Din datele prezentate reiese că, pentru Lactobacillus rhamnosus IL1, suplimentarea cantității de sucroză la 15% determină o creștere a sintezei de polizaharid cu aproximativ 25%. Pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4 creșterea realizată este cu aproximativ 51% mai mare. În general, tulpina Lactobacillus rhamnosus IL1 sintetizează doar 38% din cantitatea obținută prin cultivarea tulpinii Lactobacillus rhamnosus IL4.

Și în cazul densității celulare se observă o creștere semnificativă a valorilor realizate pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4. Din rezultatele obținute rezultă că sinteza de exopolizaharide are loc în timpul fazei exponențiale de creștere, în ultima perioadă a sa. Sinteza are loc atunci când tulpinile tind să intre în faza staționară.

Tabelul 4.1.2. Influența concentrației de sucroză asupra sintezei de exopolizaharid

Dacă temperatura scade sau crește, pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus IL1 se observă o scădere a cantității sintetizate de exopolizaharide. Maximul obținut se regăsește la 370, fapt observat la ambele tulpini (Figura 4.1.3. și Figura 4.1.4.). La temperaturi de 30 sau 450C, sinteza de exopolizaharide aproape că încetează. Această constatare este corelată și cu aceea că multiplicarea tulpinilor Lactobacillus rhamnosus IL1 și Lactobacillus rhamnosus IL4.2 este extrem de scăzută, fapt confirmat de o densitate optică foarte mică.

Făcând o comparație între cele două tulpini, rezultă că Lactobacillus rhamnosus IL4.2 este mai puternic influențată de creșterea sau scăderea temperaturii, față de Lactobacillus rhamnosus IL1. La tulpina Lactobacillus rhamnosus IL1 scăderea sau creșterea temperaturii determină doar scăderi ale sintezei de exopolizaharide. Tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4.2 are o variație foarte mare a capacitatii de sinteză a polizaharidelor la 24, 48 și 72 de ore de fermentație.

Din punct de vedere al pH, se observă că scăderea sau creșterea sa inhibă semnificativ sinteza de exopolizaharide (Figura 4.1.5. și Figura 4.1.6.). O cantitate mai mică de exopolizaharide rezultă dacă pH scade sub valoarea 7.

De asemenea, valorile extreme de pH (2, 4 și 10) inhibă total sinteza, fapt corelat în mod direct și cu inhibiția creșterii celulare. Tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4.2 are o capacitate de sinteză mai mare atât la pH 8, cât și la pH 6, la 48 de ore de fermentație.

Scăderea sau creșterea pH cu o unitate, la tulpina Lactobacillus rhamnosus IL4.2, determină obținerea unei cantități similare de exopolizaharide, reprezentând doar aproximativ 30% din cantitatea obținută la pH 7, de 145 mg/L.

4.2. Stabilirea sursei de carbon, temperaturii și pH la cultivarea tulpinilor Lactobacillus paracasei IL2 și Lactobacillus plantarum IL3

Influența sursei de carbon (glucoză, lactoză, sucroză) asupra celor două tulpini de Lactobacillus a fost studiată prin determinarea densității optice, a producției de acid lactic și de exopolizaharid. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 4.2.1

Tabelul 4.2.1 Influența sursei de carbon asupra sintezei de exopolizaharid

Pentru tulpina Lb. bulgaricus 2 prin utilizarea celor 3 surse de carbon rezultă că glucoza este cea mai bună. Se observă un maxim la 48 de ore de fermentație de 201 de mg/L. Pentru lactoză și sucroză maximul cantității de exopolizaharide se observă la 24 de ore de fermentație, 122 și respectiv 117 mg/L. Din datele prezentate reiese că utilizarea glucozei, în comparație cu celelalte două surse de carbon, determină obținerea unei producții de exopolizaharide cu aproximativ 50% mai mari. Utilizarea glucozei determină și obținerea valorii maxime a densității optice, tot la 48 de ore de fermentație. Aceasta înseamnă că sinteza de exopolizaharide se realizează în timpul fazei logaritmice de creștere.

Pentru lactoză și sucroză, sinteza exopolizaharidului are loc în prima parte a fazei de creștere logaritmice. Această constatare reieșind din aceea că faza de creștere continuă și după obținerea cantității maxime de polizaharid. Sinteza de acid lactic urmează profilul celei de exopolizaharid. Excepție este atunci când se folosește glucoza când nu există o sincronizare.

Odată stabilită sursa de carbon, glucoza, cu ajutorul căreia se obține cea mai mare cantitate de exopolizaharide, în Figura 4.2.3. și Figura 4.2.4 este prezentată cantitea de polizaharid obținută în prezența a diferite concentrații de glucoza. Testele s-au realizat atât pentru tulpina Lactobacillus paracasei IL2, cât și pentru tulpina Lactobacillus plantarum IL3.

Pentru ambele tulpini folosite rezultă că la o concentrație de 10% glucoză la 48 de ore de fermentație rezultă cea mai mare cantitate de exopolizaharide sintetizate. Indiferent de ce cantitate de polizaharid se folosește rezultă că tot la 48 de ore de fermentație se obține valoarea maximă.

În cazul cultivării la diferite valori de temperatură nu se observă o creștere a cantității de exopolizaharid sintetizat, în comparație cu cea de la 370C. Același lucru se observă și în cazul pH. La pH 7 se obține cantitatea maximă de polizaharid sintetizat. Scăderi semnificative ale sintezei se observă atât la creșterea, cât și la scăderea valorilor de temperatură și pH. Aceste constatări sunt valabile pentru ambele tulpini testate.

În cazul cultivării tulpinii Lactobacillus paracasei IL2, la 35 și 400C, Figura 4.2.5, sinteza scade cu aproximativ 92% pentru ambele valori de temperatură. Pentru tulpina Lactobacillus plantarum IL3, Figura 4.2.6., se observă o scădere cu 60% a sintezei exopolizaharide, la aceleași valori de temperatură.

Din Figura 4.2.7. reiese că scăderea sau creșterea pH cu o unitate determină o scădere cu aproximativ 75% a sintezei de exopolizaharid, în cazul tulpinii Lactobacillus paracasei IL2. Pentru tulpina Lactobacillus plantarum IL3, Figura 4.2.8., scăderea pH cu o unitate reduce sinteza de exopolizaharide tot cu aproximativ 75%. Pe când, creșterea pH cu o unitate, determină o scăderea cu peste 90%. Aceste constatări sunt făcute la 48 de ore de fermentație, atunci când în condițiile prezentate, tulpinile au o sinteză maximă.

Din datele obținute rezultă că ambele tulpini produc cantități însemnate de exopolizaharide, dacă sursa de carbon (glucoza) are concentrații mari, de 10 g/L.

De asemenea, reies unele diferențe referitoare la multiplicarea tulpinilor la diferite concentrații de glucoză. Cea mai semnificativă diferență este aceea că la 10 g/L glucoză, se obține cea mai mare cantitate de biomasă (exprimată prin densitate optică). Aceasta este corelată și cu cantitatea de exopolizaharide obținute. La creșterea concentrației de glucoză, cantitatea de biomasă obținută remâne constantă, în schimb are loc o scădere a exopolizaharidelor sintetizate.

Concluzii

1. Din testele efectuate rezultă că tulpinile Lactobacillus sp. IL1 și Lactobacillus sp.IL4.2 sunt capabile să sintetizeze exopolizaharide atunci când sursele de carbon sunt reprezentate de glucoză, lactoză și sucroză. Cea mai mare cantitate de exopolizaharide se obține atunci când se utilizează sucroza, în concentrație de 15%, la 48 de ore de fermentație. Se obțin 55 mg/L, pentru tulpina Lactobacillus sp. IL1 și 145 mg/L, pentru tulpina Lactobacillus sp. IL4.2. Scăderea sau creșterea valorii 7 a pH și a temperaturii de fermentație, 370C, determină scăderea sintezei de exopolizaharide. Această constatare este corelată cu o multiplicare mai redusă, indiferent de valorile de pH sau temperatură folosite.

2. Lactobacillus paracasei IL2 și Lactobacillus plantarum IL3 sunt capabile să producă exopolizaharide, atunci când sursa de carbon diferă, în mediul MRS. Cele mai bune rezultate fiind găsite atunci când se folosește glucoză. Odată cu creșterea cantității de glucide, crește și cantitatea de exopolizaharide sintetizate, aceasta fiind corelată și cu o creștere a cantității de biomasă obținută. O mărire a cantității de glucide, peste 10%, nu are ca efect și creșterea capacității de sinteză a tulpinilor sau a numărului de celule viabile.

3. Pentru realizarea părții experimentale s-au utilizat tulpinile de bacterii lactice Lactobacillus sp. IL1 , Lactobacillus sp.IL4.2 , Lactobacillus paracasei IL2 și Lactobacillus plantarum IL3 cultivate pe mediu Man-Rogosa-Sharpe ( MRS ) și mediu MRS + CaCO3, care conțin ca sursă de Carbon : glucoză, lactoză și sucroză.

4. Principalii parametrii analizați au fost : determinarea sursei de Carbon, a temperaturii , a ph-ului, a densității optice și a producerii de acid lactic.

Bibliografie

Alan D. Welman1,2 and Ian S. Maddox, 2003, Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges, TRENDS in Biotechnology, 21, 269 – 274.

Al-Tahhan, R. A., Sandrin, T. R., Bodour, A. A. & Maier, R. M., 2000, Rhamnolipid-induced removal of lipopolysaccharide from Pseudomonas aeruginosa: effect on cell surface properties and interaction with hydrophobic substrates. Appl Environ Microbiol, 66, 3262±3268.

Burne, R. A., Wen, Z. T., Chen, Y.-W. M. & Penders, J. A. E. C., 1999, Regulation of expression of the fructan hydrolase gene of Streptococcus mutans GS-5 by induction and carbon catabolite repression. J Bacteriol, 181, 2863-2871.

Boels, I.C. et al., 2001, Sugar catabolism and its impact on the biosynthesis and engineering of exopolysaccharide production in lactic acid bacteria. Int. Dairy J., 11, 723–732.

C. Ni Mhurchu, C. Dunshea-Mooij, D. Bennett, A. Rodgers, Effect of chitosan on weight loss in overweight and obese individuals: A systematic review of randomized controlled trials, Obesity, 6 (2005) 35–42.

C.C. Lim, L.R. Ferguson, G.W. Tannock, Dietary fibres as prebiotics: Implications for colorectal cancer, Mol. Nutr. Food Res. 49 (2005) 609–619.

C.S. Brennan, L.J. Cleary, The potential use of cereal (1-3, 1-4)-beta-D-glucans as functional food ingredients, J. Cereal Sci. 42 (2005) 1–13. J. WARRAND: Healthy Polysaccharides, Food Technol. Biotechnol. 44 (3) 355–370 (2006) 369

C. Delattre, P. Michaud, B. Courtois, J. Courtois, Oligosaccharides engineering from plants and algae applications in biotechnology and therapeutics, Minerva Biotec. 17 (2005) 107–117.

Chabot, S. et al., 2001, Exopolysaccharides from Lactobacillus rhamnosus RW-9595M stimulate TNF, IL-6 and IL-12 in human and mouse cultured immunocompetent cells, and IFN-g in mouse splenocytes., Lait 81, 683–697.

Cui, W., Winter, W. T., Tanenbaum, S. W. & Nakas, J. P., 1999, Purification and characterization of an intracellular carboxylesterase from Arthrobacter viscosus NRRL B-1973. Enzyme Microb Technol 24, 200-208.

C R Kokare, S Chakraborty, A N Khopade and K R Mahadik, 2009, Biofilm: Importance and applications, Indian Journal of Biotechnology, 8, 159-168.

Duboc, P. and Mollet, B., 2001, Applications of exopolysaccharides in the dairy industry. Int. Dairy J., 11, 759–768.

De Vuyst, L. and Degeest, B., 1999, Exopolysaccharides from lactic acid bacteria. Technological bottlenecks and practical solutions.Macromol. Symp., 140, 31–41.

De Vuyst, L. et al., 2001, Recent developments in the biosynthesis and applications of heteropolysaccharides from lactic acid bacteria. Int. Dairy J., 11, 687–707.

Degeest, B. and De Vuyst, L., 2000, Correlation of activities of the enzymes a-phosphoglucomutase, UDP-galactose 4-epimerase, and UDP-glucose pyrophosphorylase with exopolysaccharide biosynthesis by Streptococcus thermophilus LY03. Appl. Environ. Microbiol., 66, 3519–3527.

De Ruyter, P.G. et al., 1996, Controlled gene expression systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin. Appl. Environ. Microbiol., 62, 3662–3667.

De Vos, W.M. et al., 1998, Making more of milk sugar by engineering lactic acid bacteria. Int. Dairy J. 8, 227–233.

.

Faber, E.J. et al., 2002, Modelling in aqueous solution of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus helveticus 766. Biopolymers, 63, 66–76.

German, B. et al., 1999, The development of functional foods: lessons from the gut. Trends Biotechnol., 17, 492–499.

G.G. Gelders, J.P. Duyck, H. Goesaert, J.A. Delcour, Enzyme and acid resistance of amylose-lipid complexes differing in amylose chain length, lipid and complexation temperature, Carbohydr. Polym. 60 (2005) 379–389.

H. Taniguchi, Carbohydrate research and industry in Japan and the Japanese society of applied glycoscience, Starch/ Stärke, 56 (2004) 1–5.

Grobben, G.J. et al., 1996, Influence of fructose and glucose on the production of exopolysaccharides and the activities of enzymes involved in the sugar metabolism and the synthesis of sugar nucleotides in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772. Appl. Microbiol. Biotechnol., 46, 279–284.

Hosono, A. et al., 1997, Characterization of a water-soluble polysaccharide fraction with immunopotentiating activity from Bifidobacterium adolescentis M101-4. Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 312–316.

Hugenholtz, J. and Kleerebezem, M., 1999, Metabolic engineering of lactic acid bacteria: overview of the approaches and results of pathway rerouting involved in food fermentations. Curr. Opin. Biotechnol., 10, 492–497.

Hols, P. et al., 1999, Conversion of L. lactis from homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering. Nat. Biotechnol., 17, 588–592.

I.A. Brownlee, A. Allen, J.P. Pearson, P.W. Dettmar, M.E. Havler, M.R. Atherton, E. Onsoyen, Alginate as a source of dietary fiber, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 45 (2005) 497–510.

Ian W. Sutherland, 2001, Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework, Microbiology, 147, 3–9.

J. Warrand, H.G. Janssen, b-lactoglobulin glycoconjugates: Impact of the degree of polymerization of sugars on the Maillard reaction kinetic, Abstracts of Glyco XVIII, Florence, Italy (2005).

.J. Galvez, M.E. Rodriguez-Cabezas, A. Zarzuelo, Effects of dietary fiber on inflammatory bowel, Mol. Nutr. Food Res. 49 (2005) 601–608.

J. Rudolfova, L. Curda, Galactooligosaccharides as prebiotics and their production from lactose, Chemicke Listy, 99 (2005) 168–174.

Jolly, L. et al., 2002, Exploiting exopolysaccharides from lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek, 82, 367–374.

Jolly, L. and Stingele, F., 2001, Molecular organization and functionality of exopolysaccharide gene clusters in lactic acid bacteria. Int.Dairy J., 11, 733–745.

Kitazawa, H. et al., 1998, Phosphate group requirement for mitogenic activation of lymphocytes by an extracellular phosphopolysaccharide from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Int. J. Food Microbiol., 40, 169–175.

Kleerebezem, M. et al., 1999, Exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis: from genetic engineering to improved rheological properties? Antonie Van Leeuwenhoek 76, 357–365.

Kleerebezem, M. et al., 2002, Metabolic engineering of Lactococcus lactis: the impact of genomics and metabolic modelling. J. Biotechnol., 98, 199–213.

Laws, A. et al., 2001, Biosynthesis, characterisation, and design of bacterial exopolysaccharides from lactic acid bacteria. Biotechnol. Adv., 19, 597–625.

Laws, A.P. and Marshall, V.M., 2001, The relevance of exopolysaccharides to the rheological properties inmilk fermented with ropy strains of lactic acid bacteria. Int. Dairy J. 11, 709–721.

Looijesteijn, P.J. et al., 2000, Influence of different substrate limitations on the yield, composition, and molecular mass of exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis subsp. Cremoris in continuous cultures. J. Appl. Microbiol., 89, 116–122.

Lamothe, G.T. et al., 2002, Genetic and biochemical characterization of exopolysaccharide biosynthesis by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Arch. Microbiol., 178, 218–228.

Lopez De Felipe, F. et al., 1998, Cofactor engineering: a novel approach to metabolic engineering in Lactococcus lactis by controlled expression of NADH oxidase. J. Bacteriol., 180, 3804–3808.

Levander, F. et al., 2002, Enhanced exopolysaccharide production of Streptococcus thermophilus. Appl. Environ. Microbiol., 68, 784–790.

Levander, F. and Ra°dstro¨m, P., 2001, Requirement for phosphoglucomutase in exopolysaccharide biosynthesis in glucose- and lactoseutilizing Streptococcus thermophilus. Appl. Environ. Microbiol., 67, 2734–2738.

M. McIntosh, B.A. Stone, V.A. Stanisich, Curdlan and other bacterial (1-3)-beta-D-glucans, Appl. Microbiol. Biotechnol. 68 (2005) 163–173.

Macedo, M.G. et al., 2002, Effect of medium supplementation on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus RW-9595M in whey permeate. Int. Dairy J., 12, 419–426.

Mozzi, F. et al., 2003, UDP-galactose 4-epimerase: a key enzyme in exopolysaccharide formation by Lactobacillus casei CRL 87 in controlled pH batch cultures. J. Appl. Microbiol., 94, 175–183.

Mollet, B. and Stingele, F., 1996, Genes of exopolysaccharide biosynthesis of Streptococcus and their use in the development of novel exopolysaccharide-producing lactic acid bacteria. European Patent Application EP 750042.

Osterreicher-Ravid, D., Ron, E. Z. & Rosenberg, E., 2000, Horizontal transfer of an exopolymer complex from one bacterial species to another. Environ Microbiol 2, 366-372.

R.N. Tharanathan, Starch-value addition by modification, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 45 (2005) 371–384.

78.R.F. Tester, J. Karkalas, X. Qi, Starch-composition, fine structure and architecture, J. Cereal Sci. 39 (2004) 151–165.

Ruas-Madiedo, P. et al., 2002, An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. Int. Dairy J., 12, 163–171.

Rallu, F. et al., 2001, Streptococcus thermophilus operons involved in exopolysaccharide synthesis. PCT International Application WO179500.

Rickard, A. H., Leach, S. A., Buswell, C. M., High, N. J. & Handley, P. S., 2000, Coaggregation between aquatic bacteria is mediated by specific growth phase dependent lectin saccharide interactions. Appl Environ Microbiol 66, 431-434.

S.S. Koide, Chitin-chitosan: Properties, benefits and risks, Nutr. Res. 18 (1998) 1091–1101. 370 J. WARRAND: Healthy Polysaccharides, Food Technol. Biotechnol. 44 (3) 355–370 (2006)

Stingele, F. et al., 1996, Identification and characterization of the eps (exopolysaccharide) gene cluster from Streptococcus thermophilus Sfi6. J. Bacteriol., 178, 1680–1690.

Stingele, F. et al., 1999, Lactic acid bacterial genes involved in exopolysaccharide biosynthesis and encoded glycosyltransferases. PCT International Application WO 9954475.

Tuinier, R. et al., 1999, Isolation and physical characterization of an exocellular polysaccharide. Biopolymers, 49, 1–9.

Van Kranenburg, R. et al., 1997, Molecular characterization of the plasmid-encoded eps gene cluster essential for exopolysaccharide biosynthesis in Lactococcus lactis. Mol. Microbiol., 24, 387–397.

Van Kranenburg, R. et al., 1999, Genetics and engineering of microbial exopolysaccharides for food: approaches for the production of existing and novel polysaccharides. Curr. Opin. Biotechnol., 10, 498–504.

V. Fogliano, P. Vitaglione, Functional foods: Planning and development, Mol. Nutr. Food Res. 49 (2005) 256–262.

Villain-Simonnet, A., Milas, M. & Rinaudo, M., 2000, A new bacterial polysaccharide (YAS34). I. Characterization of the conformations and conformational transition. Int J Biol Macromol 27, 65-75.