Genul Escherichia

VII. Anexa foto

VI. Bibliografie selectiva

1. Tratat de microbiologie Clinica – D.Buiuc, M.Negut, Ed. Medicala, Bucuresti, 2008

2. Microbiologie clinica – D. Buiuc, Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1998

3. Microbiologie – [NUME_REDACTAT], E. [NUME_REDACTAT], Bucuresti, 2003

4. Bacteriologie medicala – V.Balbaie, N.Pozsgi, Ed. Medicala, Bucuresti, 1985

5. Bacteriologie medicala – Prof. N. Nestorescu, Ed. Medicala, 1961

6.SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerinte particulare pentru calitate si competenta

7. Bacteriologie-medicala – [NUME_REDACTAT] Sacarea, [NUME_REDACTAT] 2006

8. Bergey's Manual of [NUME_REDACTAT], Vol. 1. Baltimore, Williams and Wilkins, 1984

9. [NUME_REDACTAT] for Identification of [NUME_REDACTAT], 2nd ed. Williams and Wilkins, Baltimore, Bachoon, Dave S., and Wendy A. Dustman 1990.

10. [NUME_REDACTAT]: "Ghid pentru studiul si practica medicinei", Buiuc D,[NUME_REDACTAT].T.Popa, Iasi, 2003

11. http://www.microbiologyinpictures.com/escherichia%20coli.html

12. http://herlife.ro/escherichia-coli-e-coli/

13.http://www.readbag.com/medica-ro-reviste-med-download-bi-revista-romana-boli-infectioase-2007-nr-4

14. http://radhoo007.blogspot.ro/2012/06/enterobacteriaceae.html

15.http://biblioteca.regielive.ro/cursuri/medicina/bacili-gram-negativi-de-interes-medical-familia-enterobacteriaceae-150544.html

16. http://www.scritub.com/medicina/Bacili-gram-negativi-de-intere22383711.php

17. http://en.wikipedia.org/wiki/Theodor_Escherich

18. http://en.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae

I. [NUME_REDACTAT] diversității vieții este o provocare permanentă a biologiei. Pentru microorganisme, scopul este complicat de faptul că subiectul studiului nu este vizibil cu ochiul liber și nici nu se diferențiază pe criterii morfologice.

În ultimii 15-20 de ani, pe lângă criteriilor clasice au fost luat amploare metodele de analiză moleculară.

[NUME_REDACTAT] reprezintă o cauză majoră de aparite afectiunilor diareice, astfel microorganismele din genul Escherichia par să fie „redescoperite“.

Transferul de material genetic confera tulpinilor de E. coli proprietați patogenice noi, periculoase, fiind necesara o disociere între diagnosticul taxonomic și cel al patogenitatii. Astfel chiar daca se face indentificarea microorganismului ca fiind E. coli nu prezinta nici un interes daca nu a fost anexata o caracterizare de posibili factori de patogenitate. [13]

Astfel, E. coli devine capabila a produce o serie de factori de virulența și patogenitate noi, ca: adezine, invazine, toxine. Importul de gene ce confera rezistența la antibiotice, devine evident în baza de gene care codifica sinteza de beta lactamaze cu spectru extins (ESBL).

Noțiunea de patogenitate este relativa, multe microorganisme putand fi responsabile de aparitia bolii diareice, mai ales daca apararea imunitara a organismului este alterata.

Astfel, manifestarile digestive sunt frecvente la bolnavii infectați HIV. În explorarea bolii diareice la acești pacienți, o atenție cu totul particulara trebuie acordata și altor factori, cum ar fi: o serie de virusuri, protozoare, drojdiii, micobacterii. Acest lucru prezinta importanta deoarece un sistem imunitar scazut poate determina o susceptibilitate crescuta la infecții, legata de germenii reputați comensali, care pot deveni patogeni ocazionali de temut.

E. coli este considerat un „locuitor“ obișnuit al intestinului uman. Tulpinile saprofite sunt greu de distins de tulpinile intrinsec patogene.

Episoadele infecțioase asociate frecvent, accentuează deficitul nutrițional și accentuează alterațiile histologice și funcționale ale intestinului. Sindroamele enteritice reprezintă deseori modalități de debut pentru malabsorbțiile intestinale și în particular pentru celiachie după cum manifestările specifice APLV se prezintă în numeroase cazuri anticamera celiachiei.

Tabloul clinic polimorf, deseori sugestiv pentru gastroenteritele bacteriene este însă în cele mai multe ori neetichetabil etiologic, cu evoluție autolimitată în număr variabil de cazuri între 5 și 15% ce pot avea o evoluție trenantă.

Copilul suferind de sindromul diareic persistent prezinta perioade de acalmie și recădere ce intră într-un cerc vicios: diaree cronică – malabsorbție – malnutriție.

Acest model evolutiv a fost în timp denumit diferit ,,diaree postinfecțioasă” în anii 1980 (Navaro). Persistența fenomenelor gastroenteritice este legată de leziunile mucoasei intestinale care generează tulburările digestive secundare.

Pe de altă parte există tulburări ale motilității intestinale, fenomenul de poluare bacteriană prin multiplicarea unor bacterii ,,potențial” sau facultativ patogene. La acestea se adaugă, scăderea secreției pancreatice, tulburări imunologice ce pot activa sistemul imunitar local. În evoluție se pot constata tablouri clinice pentru IPLV sau APLV sau malabsorbție intestinală.

Aceste evoluții sunt legate de pătrunderea prin mucoasa intestinală lezată a unor proteine alimentare nehemolizate sau hidrolizate parțial. Malnutriția protein calorică se asociază constant și este asociată carențelor în vitamine, oligoelemente, acizi grași esențiali.

Pe plan mondial, diareea este una din cele mai comune cauze de morbiditate și mortalitate la copiii din întreaga lume. Se apreciază că aproximativ 5 milioane de copii mor anual prin această boală.

Această boală, a cărei frecvență și gravitate este strâns legată de sărăcie, este prezentă și în țările avansate economic.

Bolile inflamatorii intestinale au în trecutul apropiat sau îndepărtat ale copilului unul sau mai multe episoade enteritice.

Cuvântul “diaree” este derivat din cuvântul grec “diarrhoia”, care înseamnă “pierdere de fluide” pe cale digestivă (intestinală).

În termeni clinici, diareea se referă fie la creșterea frecvenței scaunelor, fie la scăderea consistenței acestora, respectiv caracterul apos al scaunelor care reprezintă totodată caracteristica esențiala pentru a defini scaunul diareic, sau ambele modificări: creșterea frecvenței și caracterul apos al scaunelor.

Diareea acută mai este definită și prin consecințele asupra organismului datorate pierderii de apă și electroliți pe cale digestivă. Aceste consecințe diferă, în funcție de severitatea și durata diareei, vârsta copilului, starea lui de nutriție, eventualele boli asociate și evident și în funcție de etiologie.

Diareea acută este definită și prin cauzele care o determină pentru că de aceasta depinde atât boala propriu-zisă al carei tablou clinic, evoluție și tratament se derulează într-un anumit fel – în strânsă relație cu agentul cauzal.

Se poate chiar afirma că etiologia definește cel mai cuprinzător diareea și o încadrează cel mai corect într-o anumită entitate, ceea ce justifică prezentarea unor entități clinico-etiologice de diaree, ca de exemplu diareea determinată de [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], vibrionul holeric, rotavirus, etc.

Expresivitatea clinică este complet diferită în funcție de agentul cauzal, neexistând o diaree globală, unică ( ceea ce face să nu aibă nici un fel de semnificație expresii de tipul: boală diareică acuta )

Sindromul clinic al bolii diareice acute (BDA) infecțioase este determinat de un numar mare și mereu în creștere de agenți etiologici.

Sindromul diareic infecțios implica preocupari în diverse domenii:

– clinice – prin intensitatea și gravitatea manifestarilor

– epidemiologice – prin manifestarile extensive (endemice și, mai ales, epidemice) ale procesului epidemiologic;

– sanatatea publica – prin nivelul de morbiditate și mortalitate, și îndeosebi a costurilor ridicate ale asistenței medicale.

Boala diareică este prezentă pretutindeni, de regulă cu manifestări benigne și autolimitante, nu însă și în rândul copiilor până la 5 ani, al bătrânilor și al pacienților imunodeprimați.

Enteritele de origine bacteriana reprezinta un constituie un domeniu vast , cu multe aspecte necunoscute, ceea ce incita microbiologul sa ia o atitudine critica în conduita investigației etiologice.[13]

Modalitatile din prezent de identificare a bacteriilor enteropatogene nu trebuie sa se se rezume doar la determinarea apartenenței la o specie bacteriană, ci trebuie să pună în evidență factorii de agresivitate implicați și la specii etichetate până nu demult ca „saprofite“.

În prezent sunt recunoscute 4 grupe aparent distincte în cadrul speciei

1. E. coli, care poate determina infecții oportuniste, ca: infecții de plăgi, infecții de tract urinar inferior și variate alte manifestări în organisme imunodeprimate,

2. E. coli, care produce septicemie sau meningite la nou- născuți,

3. E. coli, implicat în infecții de tract urinar superior sau pielonefrite.

4. E. coli care stă la baza mecanismelor care produc diaree, pseudo-dizenterie, colită hemoragică, sindrom hemolitic uremic.

Escherichia coli, considerat inițial germen comensal, are o capacitate de adaptare remarcabilă. Nici un alt germen nu a fost atât de bine studiat: E. coli – specia „cobai“, a făcut obiectul studiilor de biochimie, fiziologie și genetică, dovedindu-se permisivitatea în acceptarea de material genetic exterior, în prezența plasmidelor și fagilor.

În cazul culturilor monomorfe, cu predominanța clară a tulpinilor de E. coli, determinarea doar a caracterelor biochimice și încadrarea serologică într-un serogrup/serotip, fără determinarea factorilor de virulență și a genelor de patogenitate, nu este suficientă pentru încadrarea corectă într-un patotip enteric.

Încadrarea tulpinilor de E. coli în patotipurile digestive enunțate, necesită tehnici imunoenzimatice, de biologie moleculară, culturi celulare, care nu reprezintă practici de rutină în laboratorul clinic, din motive obiective de dotare și lipsa personalului calificat.

Studiile de microbiologie clinice din țara noastră ce folosesc de tehnici moderne de biologie moleculară, pun accent pe descrierea genotipului de enteroagresivitate a tulpinilor de E. coli izolate prin tehnica coproculturii standard sau folosind metode genetice aplicate direct pe prelevat

Importanța medicală – cea mai vastă unitate taxonomică (28 genuri, cu 125 specii) ce includ:

– specii cu habitat natural de predilecție în intestinul omului sau animalelor, – patogeni oportuniști care determină în special infecții extradigestive;

– specii patogene primare care cauzează infecții locale sau sistemice cu poartă de intrare digestivă;

– specii saprofite ale mediului extern, care pot coloniza pasager mucoasa tractusului digestiv sau alte suprafețe de înveliș, mai rar implicate în infecții.

I.1.Caractere generale ale [NUME_REDACTAT]

Escherichia este principalul gen al familiei Enterobacteriaceae.

Dintre genurile de interes medical fac parte: Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Enterobacter, Serratia, Proteus, Morganella, Providencia, Citrobacter, Edwarsiella.

Acestea includ :

specii cu habitat natural de predilecție în intestinul omului sau animalelor, patogeni oportuniști care determină în special infecții extradigestive;

specii patogene primare care cauzează infecții locale sau sistemice cu poartă de intrare digestivă;

specii saprofite ale mediului extern, care pot coloniza pasager mucoasa tractusului digestiv sau alte suprafețe de înveliș, mai rar implicate în infecții.

Denumirea genului a fost data dupa numele cercetatorului [NUME_REDACTAT] care în 1885 a fost cel ce a izolat specia tip a genului [17]

Au fost considerate bacterii comensale ale intestinului gros pâna în 1935 când s-a demonstrat rolul etiologic jucat de o tulpina de Escherichia coli implicata într- un episod de diaree la nou-nascuti. [7]

[NUME_REDACTAT] (-), optional anaerobe care crescute pe medii nutritive fermenteaza glucoza si reduc nitratul la nitrit.

Genul cuprinde 5 specii. E. coli este singura specie a genului de interes medical major; asemănătoare genetic cu specii Shigella; genul Escherichia constituent al florei comensale intestinale; poate determina infecții oportuniste intra-abdominale (colecistite, abcese hepatice, peritonite) sau extradigestive (infecții ale plăgilor, pneumonii, endometrite după avort septic), care pot evolua cu șoc endotoxinic.

Unele tulpini posedă factori particulari de patogenitate codificați de gene plasmidice sau de bacteriofagi, responsabile de 3 sindroame clinice:

boală diareică acută;

infecții ale tractusului urinar;

infecții bacteriemice, urmate de meningite neo-natale.

I.1.1 [NUME_REDACTAT] cuprind aproximativ 27 de genuri și 127 de specii, la care mai putem adauga alte 8 grupuri enterice. Fiind o taxonomie destul de controversata controversată, familia Enterobacteriaceaelor se afla intr-o permanenta schimbare.[15]

Enterobacteriile sunt microorganisme care se gasesc peste tot in natura si se pot izola din pamant , apă, suprafata plantelor, precum si din intestinul omului și al animalelor.

Majoritatea acestora (E. coli, Klebsiella sp, Proteus sp. etc.) fac parte din flora normală a organismului și pot produce infecții cu caracter oportunist. Unele specii ca, de exemplu Salmonella typhi au habitatul exclusiv uman (fieca acesta este purtator bolnav sau sănătos).

Patogenic vorbind toti germenii ce apartin aceastei familii se clasifica in microorganisme inalt patogene (Salmonella, Shigella, Yersinia), microorganisme condiționat patogene (E.coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Serratia, ) sau fara importanță în patologie.

Habitatul natural al E. coli este tractul gastrointestinal al animalelor cu sânge cald si al oamenilor. În intestinul omului E. coli reprezinta flora dominanta a intestinului gros având un rol important în mentinerea unei fiziologii normale a acestuia si în sinteza unor proteine din grupul B si K. [7]

Eliminat în mediul extern cu materiile fecale contamineaza apa, solul, alimentele etc.

Prezenta constanta a tulpinilor de E.coli în intestinul uman si animal si în materiile fecale au facut din aceasta bacterie indicatorul de poluare fecala a mediului, în special a apei.[7]

I.1.2. Caractere morfotinctoriale

Escherichia coli este un bacil Gram negativ care prezinta uneori forme filamentoase. Majoritatea speciilor prezinta cili peritrichi si sunt necapsulate. Exista însa tulpini de Escherichia coli imobile, unele prezentând capsula.

Foto 1.

I.1.3. Caractere de cultura

Bacili gram-negativi de dimensiuni medii cu capetele rotunjite, cu dispoziție în general necaracteristică. Pot fi mobili (cili peritrichi) sau imobili. Nu sporulează. Majoritatea enterobacteriilor sunt necapsulate. Unele pot avea o capsulă proeminentă (Klebsiella), iar altele (Salmonella, E.coli) pot fi învelite de un material capsular. [15]

Facultativ anaerobe, enterobacteriile sunt nepretențioase nutritiv. Se dezvoltă cu ușurință atât pe mediile uzuale (bulion, geloză, geloză-sânge), cât și pe mediile selective lactozate ([NUME_REDACTAT], AABTL, ADCL, XLD, Istrati-Meitert), pe care putem diferenția enterobacteriile lactozo-pozitive de cele lactozo-negative.[7]

Tulbură uniform mediile lichide (bulionul). Pe medii solide se dezvoltă sub formă de colonii S sau R. Între cele două tipuri pot exista și forme intermediare sau uneori colonii mucoase de tip M (Klebsiella, E.coli). Proteusul prezintă pe unele medii solide (geloză, geloză-sânge) fenomenul de invazie.

E.coli este un germen bine adaptat mediului sau de viata. Nu este pretentios. Creste pe medii simple în care glucoza este singurul constituent organic.

Este un germen aerob, facultativ anaerob care poate avea deopotriva metabolism fermentativ sau respirator. Pe medii solide creste sub forma de colonii de tip „S” iar în mediul lichid determina tulburare uniforma si inel aderent pe peretele tubului. [7]

[NUME_REDACTAT] (EMB)

Categoria: Mediu slab selectiv si diferențial

Contine: Eozina Y si albastru de metilen, care inhiba bacteriile Gram (+)

Utilizare: cultivarea enterobacteriilor (E. coli)

Proprietati de cultura – Lactozo – negativ ([NUME_REDACTAT])

Proprietati de cultura – Lactozo -pozitiv ([NUME_REDACTAT] Conkey )

I.1.4 Caractere biochimice si de metabolism

Enterobacteriile prezintă unele caractere biochimice comune, care le permit încadrarea în familia Enterobacteriaceae:

• fermentează glucoza

• reduc nitrații la nitriți

• sunt catalazo-pozitivi

• sunt oxidazo-negativi (testul oxidazei permite diferențierea enterobacteriilor de alți bacili gram-negativi).[7]

Verificarea activității catalazei și a oxidazei.

S-a folosit cultura de pe un tub inclinat cu mediu în condiții optime de crestere. La 3-4 zile de la inocularea tubului înclinat s-a determinat catalaza și oxidaza.

Catalaza: pe o lama de microscop se pune o picatură de apă oxigenată 30%. Se ia cu ansa cultura din tub și se pune în picatură. După 30 de secunde – 1 minut au apărut, bule de oxigen în picatura de apă ce au evidențiat activitatea catalazică.

Oxidaza: s-a prelevat cu ansa cultura din tub și s-a aplicat ansa pe o hârtie îmbibată cu soluție de tetramethyl-p-phenylendiamine. Culoarea albastră care ar fi evidentiat un rezultat pozitiv nu a aparut, prin urmare rezultatul a fost negativ. Benzile pentru oxidază au fost confecționate din hârtia de filtru bucatele de 0.5 cm lățime și 2 cm lungime, îmbibate cu soluție de tetramethyl-p-phenylendiamine 1%.

Producerea indolului.

S-a preparat un preinocul cu 3 zile inainte. Mediul de cultură a conținut 5g/l yeast extract și 10g/l triptonă. S-au eliminat cazaminoacizii. Mediul a fost autoclavat normal, pH înainte de autoclavare este de 7.0-7.2. S-a inoculat iar la sfarșitul incubării (cu agitare) s-a amestecat 1ml cultură cu 1ml reactiv Kovac's. ([NUME_REDACTAT]'s: /(100 ml) p-dimethylaminobenzaldehyde – 3g, pentanol sau butanol – 75ml, HCl concentrat – 25m. S-a dizolvat aldehida în alcool la 50-55○C. S-a racit si s-a adaugat acidul. S-a puns în sticlă brună și a fost pastrat la frigider)

Apariția (după o scurtă agitare) a culorii roșii a evidențiat faptul ca tulpina izolată este producătoare de indol . Ca martor a fost utilizat mediul neinoculat .

Foto . producerea de indol

O parte dintre aceste microorganisme produc fermentatia lactozei (lactozo+), iar alții nu (lactozo -). Acest aspect constituie un criteriu foarte bun de separare preliminară a microorganismelor genului Enterobacteriilor. Prin folosirea mediilor de cultura selective cu lactoza, cum ar fi [NUME_REDACTAT] se reuseste separarea germenilor in

-lactozo (+) (E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia etc.) care formează colonii roșii

-lactozo (-) (Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia) care formează colonii transparente.

Escherichia coli produce fermentatia glucozei si a altor carbohidrati cu producere de acid si gaz. Majoritatea tulpinilor sunt oxidaza negative, sunt capabile sa reduca nitritii în nitrati.

Nu produc ureaza, nu descompun proteinele cu formare de H2S, nu folosesc citratul ca unica sursa de carbon.

Descompun lactoza cu eliberare de acid, descompun proteinele cu formare de indol, dau reactia rosu – metil pozitiva.

Foto: rosu -metil

Unele tulpini, de obicei cele implicate în infectii urinare, determina hemoliza beta pe geloza sânge.

Tulpinile de Escherichia coli care poseda plasmidul „col” elibereaza colicine, substante toxice pentru alte tulpini bacteriene.

Descompunerea glucozei pe cale fermentativă și testul oxidazei negativ permit diferențierea de bacili gram-negativi din alte unități taxonomice ;

Identificarea la nivel de specie se realizează inițial pe medii multitest – MIU, TSI (teste de triaj) și apoi pe o baterie extinsă de teste biochimice [7]

I.1.5 Rezistenta fata de agentii fizici, chimici si biologici. Rezistenta germenilor patogeni la medicamente antimicrobiene (Antibiograma).

Enterobacteriaceele sunt rezistente în mediul extern. Rezistă 5-6 luni în apele poluate cu materii fecale (genul Shigella rezistă doar 2-6 săptămâni). Supraviețuiesc și se multiplică la temperatura camerei în medii umede, în alimente, în soluții perfuzabile. De aici decurg posibilitățile largi de răspândire a lor în colectivități și în spitale (enterobacteriile se izolează frecvent din infecții nosocomiale).

Sunt distruși de căldură (în 30' la 55-60C și instantaneu la fierbere), antiseptice și dezinfectante, si de coloranti ca verde de malachit, cristal violet.

Din ce în ce mai multe specii sunt rezistente la numeroase antibiotice, în special prin transfer de plasmide.[15]

Au o capacitate deosebita de adaptare la modificarile de mediu cum ar fi prezenta unor minerale, modificari de pH, temperatura, osmolaritate.

Pot sesiza prezenta sau absenta unor substante chimice sau gaze în mediul sau de viata si, cu ajutorul cililor, se poate apropia sau îndeparta de acestea. Pot de asemenea sa devina imobile si sa produca fimbrii de adeziune care sa le permita aderarea de substratul specific.

Ca raspuns la modificarile de temperatura sau osmolaritate îsi pot modifica dimensiunea porilor prin modificari ale porinelor constituente ale membranei externe. Astfel îsi pot mari dimensiunea porilor pentru a acumula moleculele mari de nutrienti sau pentru a elimina substantele inhibitoare.

Poseda un mecanism complex de reglare a metabolismului celulei bacteriene care îi permite sa-si asigure o viata usoara: sintetizeaza doar acele enzime necesare utilizarii compusilor din mediu. Va opri sinteza enzimelor necesare obtinerii unor metaboliti atunci când acestia sunt prezenti în mediu de unde îi poate folosi ca atare.

Sunt un microorganisme care dezvolta rezistenta fata de substantele antibacteriene prin elaborarea de enzime care hidrolizeaza betalactaminele (penicilinaze, cefalosporinaze) sau prin mutatii care afecteaza porinele devenind astfel rezistente fata de aminozide. [14]

Antibiograma consta in determinarea sensibilitatii /concentratiei minime inhibitoare (CMI) – cantitatea cea mai mica de medicament antimicrobian care inhiba tulpina/bacteria testata.

Spectrul de sensibilitate la antibiotice al unei specii – suma antibioticelor fata de care sunt sensibile majoritatea sau toate tulpinile unui lot reprezentativ.

O cantitate de substanta antimicrobiana este depusa pe suprafata unui mediu de cultura pe care s-a insamantata in prealabil bacteria testata (3-5 colonii bacteriene se preleveaza si se omogenizeaza in ser fiziologic).

Concomitent se produc doua fenomene respectiv difuzarea antibioticului si cresterea bacteriei. In zonele unde antibioticul realizeaza concentratii mai mari decat CMI, bacteria nu creste. O data cu intrarea culturii in faza exponentiala (momentul critic), bacteria se divide mai repede decat difuzeaza medicamentul si se acumuleaza o panza vizibila de cultura care nu mai este influentata de modificari ulterioare ale concentratiei de antibiotic. Circumferinta zonei de inhibitie se stabileste din primele ore de incubatie ca locul geometric al punctelor in care antibioticul a atins CMI in momentul critic al culturii. Astfel diametrul zonei de inhibitie variaza invers proportional cu CMI.

Bacteria testata este clasificata in categorii de sensibilitate in functie de marimea diametrului de inhibitie si anume: sensibila, intermediara, rezistenta, utilizand raportarea la testele interpretative.

Diametrul zonelor de inhibitie determinat de fiecare substanta antimicrobiana se raporteaza la tabelul interpretativ al discurilor de antibiotice pentru a le transforma in categorii de sensibilitate (sensibil, intermediar si rezistent).

Testarea sensibilitatii la antibiotice.

[NUME_REDACTAT] 

Amoxicilina AMX sensibil 
Ampicilina AM sensibil 
Amoxicilina+[NUME_REDACTAT] sensibil 
Ampicilina+Sulbactam (UNASYN) sensibil 
Cefaclor CEC sensibil 
Cefalexin CN sensibil 
Cefalotin CF sensibil 
Cefoperazon CFP sensibil 
Ceftazidim CAZ sensibil 
Ceftriaxon CRO sensibil 
Cefuroxim CXM sensibil 
Cefepim sensibil 
Cefotaxim CTX sensibil 
Ciprofloxacin CIP intermediar 
Doxiciclina DO rezistent 
Gentamicina GM sensibil 
[NUME_REDACTAT] 
[NUME_REDACTAT] NA rezistent 
Norfloxacin NOR intermediar 
Ofloxacin OFX intermediar 
Piperacilina PIP sensibil 
Ticarcilina TIC sensibil 
Trimetoprim+Sulfametoxazol SXT sensibil 
Levofloxacin LEV sensibil 
Nitrofurantoin rezistent 

Escherichia coli din figură este:

• Sensibil la ceftriaxonă (CRO) – zona clară din jurul discului are diametrul de 25 mm (mai mare de 21 mm, conform cu tabelul de evaluare);

• Intermediar la cefuroxim (CXM) – zona clară din jurul discului are diametrul de 15 mm (între 15-17 mm, conform cu tabelul de evaluare);

Această metodă de efectuare a antibiogramei (metoda Kirby-Bauer) se folosește în majoritatea laboratoarelor. Laboratoarele dotate cu analizoare automate de microbiologie pot efectua antibiograma într-un timp mai scurt de 24 de ore oferind și informații mai precise – calculul concentrației minimă la care antibioticul este eficient pentru tratarea infecției respective (concentrația minimă inhibitorie).

Pe baza antibiogramei, medicul clinician care primește rezultatul analizei poate recomanda antibioticul cel mai potrivit pentru tratarea infecției respective, ținând cont de factorii anatomo-fiziologici ai pacientului (gravidă sau nu), vârsta acestuia (copil, adult, vârstnic), sediul infecției (urinară, genitală, intestinală etc.), modul de administrare (injectabil intravenos, intramuscular, administrat pe cale orală etc.) precum și de alți factori (disponibilitatea antibioticului în farmacii, efecte adverse etc.).

I.1.6. Structura antigenica

Tulpinile de Escherichia coli poseda urmatoarele structuri antigenice:

– antigenul „O” sau antigenul somatic.

Este antigenul cu specificitate de grup care corespunde poliozidelor fixate pe lipopolizaharidele peretelui bacterian.

Este termostabil si acido-alcoolo-rezistent. Prin reactii de aglutinare au fost identificate 180 de serogrupe antigenice„O”. Ag O din complexul LPS imprimă specificitate de grup la tulpinile aparținând aceleiași specii

Multe serogrupe „O” ale tulpinilor de Escherichia coli prezinta reactii încrucisate cu antigene ale unor tulpini de Klebsiella, Salmonella, Providencia, Vibrio; iar altele sunt comune cu grupul Shigella.

– antigenul „H” sau antigenul flagelar.

Ag H cu specificitate de tip, prezent numai la tulpinile mobile, diferențiază tulpinile aparținând aceluiași serogrup. Prezent doar la tulpinile ciliate, este format dintr-o proteina specifica numita flagelina. Are specificitate de tip, este termolabil si este inactivat de alcool. Prin reactii de aglutinare au fost evidentiate, greu, 56 de serotipuri „H”:

– antigenul „K” sau antigenul capsular.

Este de natura polizaharidica, are specificitate de tip, a fost identificat la tulpini uropatogene de Escherichia coli si la tulpini implicate în cazuri de meningita neo-natala (antigen K-1). Determina O-inaglutinabilitatea tulpinilor care-l poseda. Se cunosc 103 antigene K. Ca exemple se pot mentiona Ag K (E.coli, Klebsiella) sau [NUME_REDACTAT] ([NUME_REDACTAT], S. Paratyphi C, Citrobacter), cu specificitate de tip, de natură polizaharidică;

Antigenul F de natură proteică, prezent la nivelul fimbriilor. Antigenele de aderenta (adezine, pili, fimbrii), de natura proteica. Pe baza antigenelor O, H si K au fost identificate peste 700 de serotipuri de E.coli.

Serotipia este utila în identificarea acelor tulpini implicate în procese patologice umane. [7]

I.1.7. Caractere de patogenitate

Pricipalii factorii de virulență ai enterobacteriilor sunt:

Endotoxina sau lipopolizaharidul (LPZ) face parte din structura peretelui celular și se eliberează în mediu numai după distrugerea celulei. Efectele ei nu sunt specifice speciei, ci sunt identice la toate bacteriile gram-negative:

Dozele mici produc "reacții de alarmă" benefice organismului, care cresc rezistența antiinfecțioasă;

Dozele mari produc efecte nocive organismului, cu șoc endotoxic, hipotensiune, CID.

Capsula, prezentă la enterobacteriile capsulate, este un factor de virulență – asigură rezistența la fagocitoză.

Sinteza de exotoxine.

Enterotoxine termolabile au fost evidențiate la E.coli și ocazional la Klebsiella, Salmonella.

Enterotoxine termostabile au fost evidențiate la E.coli și ocazional la Yersinia enterocolitica și Citrobacter freundii. Ambele tipuri de enterotoxine sunt responsabile de apariția unor scaune diareice. Shigella dysenteriae elaborează o exotoxină cu efect neurotoxic, enterotoxic și citotoxic.

În cadrul speciei se disting numeroase variante care exprima caractere de patogenitate, variante numite patovaruri, patotipuri. Escherichia coli este patogena prin virulenta si/sau toxigenitate.

Determinantii de patogenitate sunt variati ( tabel I.1.7.1a si I.1.7.1b ).

Tabel I.1.7.1a

Tabel I.1.7.1b

În functie de determinantii de patogenitate pe care îi au tulpinile de Escherichia coli pot cauza diferite afectiuni.

Tulpinile uropatogene de Escherichia coli poseda urmatorii factori de patogenitate:

fimbriile P sau PAP

fimbrii tip 1

siderofori

hemolizine alfa si beta

antigenul K

Tulpinile de Escherichia coli implicate în cazuri de meningita neonatala sunt patogene prin:

antigenul capsular K-1

siderofori

endotoxina

Factorii de patogenitate ai tulpinilor diareigene de Escherichia coli au fost exemplificati în tabelul Tabel I.1.7.1c.

Tabel I.1.7.1c.

II. Tipuri de infectii. Diagnostic de laborator

Enterobacteriile din [NUME_REDACTAT] sunt, în marea majoritate, saprofite sau conditionat patogene. Cu toate acestea exista patotipuri (fenotipuri patogene) de Escherichia coli implicate în patologia umana:

patotipuri diareigene

patotipuri uropatogene

alte patotipuri

Membrii acestui gen pot determina infectii intestinale si extraintestinale.

II. 1 Infectii intestinale

Infectiile intestinale, sau enterocolitele infectioase, sunt determinate de cele cinci patotipuri diareigene recunoscute, fiecare având subgrupe serologice si determinând manifestari clinice distincte:

ETEC (enterotoxigenic Escherichia coli);

EPEC (enteropathogenic Escherichia coli);

EHEC (enterohaemorrhagic Escherichia coli);

EIEC (enteroinvasive Escherichia coli);

EAggEC (enteroaggregative Escherichia coli).

Tulpinile ETEC afecteaza toate categoriile de vârsta desi reprezinta etiologia majora a diareei copiilor si turistilor în tarile cu sanitatie deficitara, numita si „diareea turistilor”. Sursa de infectie este reprezentata de om si animal iar calea de transmitere o reprezinta alimentele si apa contaminate.

Factori de patogenitate (codificați plasmidic): enterotoxina termolabilă (TL) de tip A-B, asemănătoare structural și funcțional cu toxina holerică, activează adenilatciclaza cu creștera secreției de apă și electroliți; enterotoxina termostabilă (TS) activează guanilatciclaza, cu efect asemănător ; adezine fimbriale (CFA I – [NUME_REDACTAT] Antigen, CFA II, CFA IV)

Odata patrunsa pe cale orala, ETEC colonizeaza intestinul subtire si elaboreaza o serie de enterotoxine care determina cresterea secretiei de apa si electroliti în lumenul intestinal (toxina TL) si inhibarea absorbtiei de lichid intestinal (toxina TS).

Dupa o incubatie de 24-72 de ore se instaleaza simptomele: diaree apoasa fara febra, colici abdominale, greturi, varsaturi. Tulpinile ETEC apartin serogrupelor O 6, 8, 15, 20, 25, 63, 78, 80, 85, 115, 128, 139.

Tulpinile EPEC induc o diaree apoasa asemanatoare cu cea din infectiile cu ETEC afectând cu precadere copiii. Factorii de patogenitate sunt reprezentati de adezine fimbriale și proteine din membrana externă (intimina) ce determină aplatizarea microvililor de la nivelul intestinului subțire și modificări de infrastructură celulară, cu răspuns inflamator local.

Reprezinta primul fenotip diareigen descris, aparținând anumitor serotipuri care cauzează diaree apoasă la copilul sub vârsta de 2 ani, uneori cu evoluție prelungită; evolueaza cu febră, vărsături și sindrom inflamator (celule inflamatorii în scaun) si poate fi la originea unor episoade epidemice nosocomiale.

EPEC nu produce enterotoxine TL sau TS ci doar cantitati mici de toxina Shiga-like cu efect enterotoxic si citotoxic.

Prin intermediul adezinelor Bfp se leaga de epiteliul intestinal la nivelul colonului determinând distrugerea microvilozitatilor cu raspuns inflamator, fara semne de invazie. Ca urmare se instaleaza malabsorbtia, diareea apoasa, persistenta acompaniata de febra si varsaturi. Tulpinile EPEC apartin serogrupelor O 26, 55, 86, 111, 119,125, 126, 127, 128, 142.

Tulpinile EAggEC au capacitatea de a adera agregativ de celulele mucoasei intestinale cauzând diaree fara fenomene invazive sau inflamatorii. Este patogena prin adezine fimbriale (fimbrii de adeziune) (AAF I și II), citotoxine care determină necroza microvililor și răspuns inflamator în submucoasă; enterotoxina agregativa codificata plasmidic si prin hemolizina asemanatoare celei sintetizate de tulpinile uropatogene. Tulpinile de Escherichia coli enteroagregative sunt asociate cu diareea apoasa, persistenta instalata la sugari, copii mici si imunodeprimați (SIDA).

Tulpinile EIEC adera la celulele epiteliale ale colonului cu ajutorul unor adezine non-fimbriale. Sunt patogene prin invazivitate: penetreaza si se multiplica în interiorul enterocitului pe care îl distrug. Nu produc enterotoxina. Sunt apropiate din punct de vedere biochimic si antigenic de Shigella.

Afecteaza adultii si copiii care vor prezenta colici abdominale, febra, scaune diareice muco- sanguinolente asemanatoare celor din dizenterie. Tulpinile EIEC apartin serogrupelor O 28, 112, 124, 136, 143, 144,147, 152.

Tulpinile EHEC sunt reprezentate în principal de serotipul O157H7, ca si de tulpini apartinând serotipurilor O26 si O111. Aceste tulpini au fost recent recunoscute ca agenti etiologici ai sindromului hemolitic si uremic asociat consumului de alimente contaminate.

Prin intermediul intiminei adera de celulele epiteliului colonului. Aceste tulpini sunt moderat invazive patogenitatea lor fiind datorata în principal producerii unei toxine „Shiga- like” numita si vero-toxina a carei sinteza este stimulata de deficienta de fier.

Toxina este responsabila de raspunsul inflamator local intens produs de tulpinile EHEC si de anemia hemolitica, trombocitopenia si insuficienta renala acuta determinate de lezarea endoteliului capilarelor.

Scaunele diareice cu putin lichid, mult sânge si mucus continând polimorfonucleare sunt însotite de febra, greturi, varsaturi si colici abdominale. [13][7]

II.2 Infectii extraintestinale

Infectii urinare ( Patotipul uropatogen )

Tulpinile uropatogene de Escherichia coli (UPEC) sunt responsabile de 90% din infectiile tractului urinar. Factorii de patogenitate sunt reprezentati de

fimbrii de tip P (manozo-rezistente) și tip 1 (manozo-sensibile); fimbriile tip P, numite așa deoarece aderă specific de antigenul de grup sanguin P),

adezine din membrana externă;

capsula polizaharidică (anumite serotiopuri capsulare – K1, 2, 3, 5, 12 și 13);

siderofori;

hemolizine;

Colonizează intestinul, regiunea periuretrală și uretra distală si determină >90% din infecțiile urinare necomplicate.Sunt afectate cu precadere femeile tinere, active sexual, colonizate initial în intestin cu tulpini UPEC.

Tulpinile uropatogene apartin serotipurilor O 1,2,4,6,7,16,18,75 si serotipurilor K 1,2,3,12,13 care poseda adezine ce permit aderarea de epiteliul urinar. Infecțiile urinare înalte pot evolua bacteriemic[13][7]

Infectii intra-abdominale

Escherichia coli este responsabila de supuratii peritoneale, biliare, apendiculare, genitale. Tulpinile respective au proprietati antifagocitare, au actiune citotoxica asupra polinuclearelor, poseda sisteme de captare a fierului.

Bacteriemie ( Patotipul bacteriemic )

Este cauzata de tulpini de Escherichia coli cu mare capacitate invaziva. Aceste tulpini poseda siderofori, citotoxine, capsula si lipopolizaharide care asigura protectia fata de actiunea bactericida a serului.

Soc endotoxinic

Apare în urma distrugerii masive de celule de Escherichia coli eliberându-se brusc o cantitate mare de endotoxina ceea ce determina sindromul de raspuns inflamator sistemic provocat de eliberarea masiva de interleukina-1 si factor de necroza tisulara (TNF). Pacientul prezinta febra, hemoragii, colaps circulator.

Meningita neonatala

Este cauzata de tulpini de Escherichia coli care sintetizeaza antigenul capsular K-1 si constituie factorul major de patogenitate. Este un polimer de acid N-acetil neuraminic, asemănător cu antigenul capsular de grup B al N. meningitidis, asociat cu unele antigene, ca O7 și O18. Aceste tulpini ajung din naso- faringe sau din tractul intestinal în torentul sanguin si pe aceasta cale la meninge.

Infectii nosocomiale

Apar datorita raspândirii infectiei de catre personalul medical sau prin instrumentarul medical la pacienti care prezinta factori predispozanti: diabet, traumatisme, boli pulmonare cronice etc. [13][7]

II.3 Diagnostic de laborator

Pentru stabilirea diagnosticului etiologic și patogenic al bolii diareice este necesară realizarea într-o primă etapă a unui cadru anamnestico-clinic cât se poate de corect obținut prin relația cu părinții.

Datele furnizate de aceștia stau la baza efectuării unui număr variabil de investigații paraclinice și de laborator, unele fiind ușor de efectuat, altele presupunând o dotare superioară.

Diagnosticul de laborator este bacteriologic si se bazeaza pe identificarea tulpinilor de Escherichia coli în variate produse patologice: sânge, urina, materii fecale, bila, puroi, exsudate, lichid cefalo-rahidian, alimente, varsaturi, probe de organe recoltate de la cadavru. [1]

Diagnosticul de laborator presupune cultivarea pe medii pentru enterobacterii. Identificarea pe baza caracterelor biochimice se completeaza cu serotipia pentru tulpinile EPEC si EHEC.

În ser, lichid cefalo-rahidian sau urina poate fi identificat antigenul K-1 prin reactii de latexaglutinare realizându-se astfel un diagnostic rapid mai ales la nou – nascut sau sugar. Exista însa posibilitatea unor reactii încrucisate cu antigenul de grup B al meningococului.

Se pot evidentia de asemenea adezinele datorita capacitatii lor de a aglutina hematiile umane sau animale.

Efectul citotoxic al verotoxinei produse de E. coli O157:H7 se studiaza pe culturi monostrat Vero, verotoxina ducând, dupa intrarea ei în celule, la rotunjirea si separarea celulelor între ele.

Procedeele ELISA se pot folosi pentru detectarea unei proteine de pe membrana exterioara a celulelor EIEC (antigen marker pentru virulenta), dar si la evidentierea altor serotipuri de E. coli prin detectarea antigenelor specifice de grup, de tip si a exotoxinelor.

Capacitatea invaziva a tulpinilor EIEC este studiata prin testul Sereny pe cobai sau pe culturi de celule HeLa. Materiile fecale mai pot fi examinate si prin imunofluorescenta.

Prin reactii de hibridizare si PCR se pot identifica diferite tulpini de E. coli.

Dintre pacienții cu vârste cuprinse între 0-4 ani, 147 (48,2%) au fost de sex masculin, iar 158 (51,8%) de sex feminin. Această observație este în concordanță cu semnalările din literatură care atribuie participarea patotipurilor intestinale de E.coli mai frecvent la copii decât la adulți.

S-a introdus noțiunea de „zona de influența epidemiologica“ (ZIE), de care depinde laboratorul de analize bacteriologice și noțiunea de „ecologie bacteriana“, pentru a defini parametrii care caracterizeaza coprocultura standard și pe cea complementara.

Deosebirile între zonele temperate și calde, diareea copilului și cea a adultului, nivelurile diferite de dezvoltare economica, pot fi considerate criterii importante de aplicare a coproculturii complementare sau coproculturii standard [7]

II..3.1 Coprocultura standard si complementara

Conceptul de coprocultura tradiționala este uneori confundat cu acela de coprocultura standardizata, în timp ce coprocultura complementara se poate confunda cu cercetarea factorilor de virulența.

Acest lucru provine din faptul ca inițial, analiza „standardizata“ s-a suprapus peste studierea speciilor bacteriene cu caracter enteropatogen cu ajutorul tehnicilor clasice de bacteriologie.

Microorganismele cu caracter comensal, care au dobandit caractere enteropatogene, sunt studiate folosind tehnici complementare, abordand aspectele legate de factorii de virulența elaborați.

Din rațiuni legate de raportul eficiența-cost, laboratorul nu poate cerceta sistematic, de rutina, toți agenții susceptibili a fi enteropatogeni.

În funcție de circumstanțe, microbiologul deruleaza investigaț iile progresiv, parcurgând etapele coproculturii standard și ale celei complementare, doua tehnici care nu se exclud una pe cealalta, ci doar se completeaza.

Directiile trasate de clinician si microbiolog hotarasc tipurile de examinari ce trebuie efectuate.

Tehnica coproculturii standardizate pentru copil și adult trebuie sa constituie un „standard local“ bazat pe metodologii și tehnici alese conform caracteristicilor epidemiologice care apartin zonei de activitate a laboratorului, microorganismelor enteropatogene din aceasta zona, nivelului economico-social si alimentatiei.

În zonele temperate, aceasta analiza se bazeaza doar pe studierea patogenilor ca Salmonella sp. și Shigella sp., în timp ce în zonele intertropicale, este necesar sa fie incluse în coprocultura standardizata și alte bacterii, cu o incidența este crescuta: ex. Fam.Vibrionaceae.

Coprocultura complementara este în principal practicata în caz de eșec al analizei standardizate sau daca pacientul a contractat boala diareica în afara zonei de influența epidemiologica, de care depinde laboratorul (diaree dupa un sejur într-o zona endemica, unde etiologia bacteriana poate fi diferita de cea din care provine pacientul). [13][7]

În realizarea efectiva a unei coproculturi, se ține cont de:

Bacteriile a caror virulența este legata de caracterele de specie, care beneficiaza de identificare prin metode tradiționale (caractere enteropatogene constitutive și exprimate).

Stabilitatea caracterelor de patogenitate asociata cu anumite proprietați culturale,metabolice sau structurale, au permis o analiza bazata pe tehnici de identificare morfologica, biochimica și antigenica[13]

Bacteriile cu un caracter enteropatogen câștigat și/sau parțial sub control cromosomic a caror identificare se bazeaza pe punerea în evidența a factorilor de virulența exprimati.

Daca caractere de cultura și proprietațile biochimice sau antigenice nu permit separarea lor de microorganismele endogene; se poate analiza prezența unor factori de patogenitate particulari, ramânând doar ca si diagnostic de prezumpție.

Observarea riguroasa a izolatelor asociata cu anumite manifestari clinice și o buna cunoaștere a condițiilor epidemiologice locale, permit suspectarea prezenței acestor bacterii [14]

II.3.2. Metodologia investigatiilor de laborator

Coprocultura beneficiaza azi de o evoluție tehnologica calitativa și cantitativa prin numarul factorilori de virulența ce pot fi identificați, dar și prin dezvoltarea de metode rapide de identificare din mai multe eșantioane de produs.

Astfel exista metode ce fac diagnosticarea directa in cazul unor microorganisme sau pentru factorii de virulența pe care îi exprima.

Aceste tehnici se bazeaza pe principii diverse (imunodiagnostic, hibridizare moleculara, amplificare genica), iar microbiologul este cel ce evalueaza din punct de vedere clinic sau epidemiologic pentru a putea pune în aplicare aceste metode rapide: urgența de a demonstra prezența toxinelor din familia Shiga în prelevate fara a aștepta izolarea bacteriana.

Obtinerea unui rezultat care sa permita nedicului indicatia unui tratament adecvat.Intenția medicului microbiolog este de a stabili daca este prezenta sau nu o bacterie enteropatogena.

Stabilirea caracterelor de enteropatogenitate sau punerea în evidența a unui factor de virulența cunoscut pentru un microorganism studiat nu constituie aspecte care sa mai puna probleme omului de laborator.

Un microorganism este suspectat de a avea un rol enteropatogen daca este izolat în cultura pura sau predominanta (dismicrobism marcat) și contextul epidemiologic este evocator.

Daca nici un factor de virulența cunoscut nu a fost identificat, clinicianul împreuna cu microbiologul integreaza datele clinice, epidemiologice și microbiologice pentru a interpreta rezultatele disponibile, știindu-se ca virulența enterica este un fenomen evolutiv și ca nu toți factorii de virulența sunt cunoscuți. [13]

Rezultatul trebuie sa cuprinda: rezultatele examinarilor macroscopice, microscopice, germenii și factorii de virulența studiați, prezența sau absența lor trebuie menționata, precum și metoda de lucru aplicata. Antibiograma trebuie efectuata pe germeni identificați ca potențiali patogeni.

În practica actuala a diagnosticului bacteriologic al sindromului diareic sunt conturate doua tipuri de metodologii:

Metodologii convenționale: bazate pe postulatele lui Koch, care urmaresc „izolarea și identificarea agentului cauzal“, deci cultivarea și caracterizarea sa fenotipica: coprocultura

II.3.3. Recoltarea și însamânțarea prelevatelor.

Prelevarea eșantioanelor de materii fecale se efectueaza la debutul bolii (faza acuta), atunci agenții patogeni sunt în numar mare în scaun și, desigur, înaintea administrarii unui tratament cu antibiotice sau pansamente digestive.

Cantitatea minima prelevata trebuie sa fie in jur de 10 g. Pentru un pacient cu un episod diareic acut sunt necesare 2 sau 3 eșantioane, în timp ce pentru determinarea portajului cronic (în medicina preventiva) este considerata suficienta o singura proba.

Recomandari de care trebuie sa se țina cont:

– analiza bacteriologica a materiilor fecale trebuie sa porneasca, cel putin din punct de vedere teoretic, de la analiza scaunului spontan sau, daca acest lucru nu este posibil, prin examinarea a 3 – 4 tampoane rectale,

– biopsia mucoasei rectala sau colica, precum și biopsia ganglionilor mezenterici, efectuata printehnica de rectoscopie, se analizeaza ca și materiile fecale,

– în cazul copiilor afectati de episoade diareice, prelevarea scaunului poate fi efectuata și din scutece sau lenjerie; o atenție deosebita fiind acordata prelevarii de mucus, lambouri de epiteliu, striuri de sânge.

Prelevarea materiilor fecale obtinute prin emisie naturala (spontana):

Materiile fecale ce sunt emise spontan trebuie sa fie recoltate în recipiente sterile de unica utilizare, comerciale, închise ermetic, prevazute cu o spatula pentru prelevarea produsului.

Se aleg asfel fragmentele ce prezinta un aspect purulent, mucos, sanguinolent. Eșantionul odata sosit în laborator este recepționat, înregistrat și prelucrat în mai puțin de o ora de la recoltare. [13]

Tamponul rectal

Prelevarea cu tamponul se practica la copii nounascuți sau adulți, la care se observa prezenta unui sindrom dizenteric, in momentul in care microorganismele invadeaza mucoasa recto-sigmoidiana, iar izolarea acestora de pe mucoasa rectala este recomandata.

Tampoanele sterile se umecteaza în soluție de transport, lipsita de activitate bacteriostatica. Se recolteaza minim 3 tampoane pentru: examen microscopic, însamânțare pe medii neselective și pe medii de îmbogațire.

Tamponamentul rectal nu amplifica frecvența izolarii bacteriilor enteropatogene.[13]

II..3.4. Conservarea esantionului recoltat

Probele prelevate sunt trimise catre analiza la laborator în ora imediat urmatoare recoltarii.

Aceasta cerința, adesea neglijata, a stat la originea unui numar important de eșecuri ale diagnosticului bacteriologic. Dupa emisia de materii fecale se petrec urmatoarele fenomene:

– prelevatul se acidifica în 30 minute de la recoltare; aceasta modificare de pH pericliteaza supraviețuirea bacteriilor enteropatogene,

– proliferarea bacteriilor comensale duce la izolari aleatorii și face dificil studiul dismicrobismului.

Eșantioanele de materii fecale care nu pot fi analizate si diagnosticate (examinare microscopica, însamânțare culturi), în interval de o ora, trebuie refrigerate la 4°-8°C, pentru a se evita deshidratarea și scaderea volumului. În aceste condiții, probele nu trebuie sa stea mai mult de 4h.

Este de menționat ca se prefera utilizarea unui mediu de transport pentru germenii care supravieț uiesc mai puțin de 2 ore. Bacteriile enteropatogene rezista câteva zile (o saptamâna) în mediu de transport, la o temperatura de 15°C.

Medii de transport

La o temperatura exterioara de peste 20°C este de preferat sa se refrigereze mediul de transport ce a fost însamânțat in prealabil , la o temperatura de 4°-8°C. Mediile ce au fost folosite la transport sunt:

– mediul Cary-Blair recomandat și utilizat de rutina în laboratoarele din țara noastra, pentru Salmonella, E. coli, Vibrionaceae, Yersinia enterocolitica,

– soluție salina glicerolata și tamponata (folosit pentru pacientii cu sindrom dizenteriform) pentru Shigella sp si E. coli EIEC. Nu exista un mediu de transport ideal care sa permita prezervarea tuturor bacteriilor potențial enteropatogene.[13][7]

II.3.5. Examinarea macroscopica

Aceasta examinare nu trebuie neglijata, pentru ca orienteaza diagnosticul bacteriologic și decizia de a pune în practica o tehnica particulara de lucru.

Daca e sa ne raportam la prelevat din punct de vedere macroscopic , se poate alege trecerea pe un mediu imbogatit cu sorbitol a bacteriei E. coli – EHEC, cercetarea unui microorganism invaziv sau producator de citotonina, utilizarea de medii imbogatite .

Principalele aspecte ale unui scaun anormal sunt:

Miros: – fecaloid (salmoneloze, shigeloze, campilobacterioze),

– fetid: (caracteristic V. cholerae, E. coli enteropatogen),

Culoare: – verzuie (V. cholerae),

– galben necaracteristica (E. coli, Salmonella),

– roșu-viu („sindromul scutecului roșu“ – colonizare anormala cu Serratia marcescens la nou-nascut, rarisima),

– hemoragica-sindrom enterohemoragic (EHEC, EIEC, Shigella).

Aspect: – moale, fecaloid neformat (Salmonella, Campylobacter),

– moale, cu grunji fecaloizi (Yersinia, Aeromonas),

– lichid ca apa de orez, nefecal (Vibrio, E. coli enterotoxigen),

– muco-sanguinolent (Shigella),

– hemoragic cu lambouri de epiteliu (E. coli enterohemoragic),

– mucopurulent și sanghinolent sau scaun înglobat în mucus (Shigella, E. coli enteroinvaziv) [1,2]

Aceste observații releva mecanismul fiziopatologic legat de factorii de virulența exprimați de bacterie precum și de faza bolii.

II.3.6. Examinarea microscopica si preparatul proaspat

Dupa studierea buletinului însoțitor al prelevatului și examinarea macroscopica, se trece la examinarea microscopica. Se efectueaza pe doua frotiuri (albastru metilen și Gram) și un preparat proaspat. In aceasta etapa au putut fi trase concluzii reliminare cu privire la tipul procesului fiziopatologic teoretic, foarte important pentru orientarea omului de laborator.

Frotiul colorat folosind albastru metilen: se urmarește prezența granulocitelor, celulelor epiteliale, hematiilor,apreciate ca fiind caracteristice într-un proces invaziv.

În holera, infecții cu ETEC, viroze, numarul de PMN este foarte redus: 2-5/câmp. Frotiul colorat Gram: este mult mai sarac în informații din cauza abundenței florei Gram negative.

El pune în evidența un eventual dismicrobism, dezechilibru al florei bacteriene, apreciaza densitatea relativa a diferiților germeni, permite observarea prezenței (majoritare sau nu) unei morfologii bacteriene caracteristice. Aspectul monomorf și dominanța (>75%) unei categorii de germeni orienteaza diagnosticul bacteriologic.

[NUME_REDACTAT] negativa dominanta cu bacili incurbați sub forma de virgula, indica posibil Campylobacter spp. ca agent etiologic,

[NUME_REDACTAT] pozitiva: coci Gram pozitivi în tetrade și gramezi (posibil toxiinfecție alimentara cu Staphylococcus aureus), bacili Gram pozitivi cu capete taiate drept, așezați frecvent în lanțuri scurte, cu spor oval central sau subterminal (posibil toxiinfecție bacteriana cu Bacillus cereus), bacili Gram pozitivi în scaunul pacienților sub terapie orala cu antibiotice (posibil Clostridium difficile).

Dominanta fungilor, absența leucocitelor și a hematiilor sugereaza prezența unei diarei al carei mecanism fiziopatologic se bazeaza pe un proces citotonic ce orienteaza etiologia spre bacterii care nu altereaza vilozitațile sau nu implica emisia de citotoxine în procesul patologic .[13]

Preparatul proaspat

Un eșantion de materii fecale (în funcție de consistența, se practica și o diluție în ser fiziologic) sau tamponul rectal (mucus, sânge) se suspensioneaza suspensioneaza într-o picatura de ser fiziologic și se aplica pe doua lame curate. Preparatul proaspat se examineaza imediat, cu obiectiv 40X.

Se are în vedere examinarea coproparazitologica, calitatea digestiei și identificarea mobilitații bacteriene majoritare și caracteristice: Campylobacter, Vibrionaceae, care orienteaza etiologia.

II.4. Izolarea E. Coli, in cultura pura

Consta din însamânțarea prelevatului direct pe mediile selective, pentru obținerea de colonii izolate caracteristice, în scopul identificarii lor. Mediile selective sunt întotdeauna medii solide (agarizate), cu componente nutritive, factori selectivi și diferențiali.

Identificare preliminara: are ca scop încadrarea taxonomica a izolatelor printr-un minim de teste, compus din asocierea de medii multitest, TSI, MIU, MILF. E. coli produce gaz din glucoza în cantitați moderate, nu produce H2S și acidifica partea înclinata a mediului TSI (lactoza/zaharoza).

Este, în general, o grupare de germeni mobili (sunt frecvente și tulpinile imobile), care produce constant indol și variabil, lizindecarboxilaza; nu produc fenilalanindeaminaza.

Coprocultura orientata

În prezența unui scaun de consistența redusa, cu aspect mucosanguinolent, în context epidemiologic, dar și cu examen microscopic de aspect caracteristic (neutrofile, hematii, preponderența de bacili Gram negativi monomorfi), orientarea diagnosticului de laborator trebuie sa se faca spre izolarea și identificarea E. coli enterohemoragic (EHEC/STECShiga- Toxin E. coli).

Pentru aceasta, se urmarește schema de diagnostic:

-scaun diareic hemoragic sau, eventual, apos (în faza inițiala, de diaree apoasa, febrila, șansa izolarii EHEC este mai mare, probabilitatea izolarii tulpinilor scade dupa apariț ia scaunelor hemoragice),

– însamânțare, izolare bacteriana pe mediu cu sorbitol. Prepararea mediului MacConkey cu sorbitol: la MacConkey, mediu de baza (fara lactoza), se adauga 1% sorbitol.

– selectarea coloniilor sorbitol negative (incolore pe MacConkey cu sorbitol),

– o parte dintre colonii sunt supuse unei reacții de aglutinare, pentru a identifica E. coli serogrup O157 (latex sensibilizat sau aglutinare directă cu ser anti O157). [13]

Identificarea de certitudine: s-a bazat pe caracterizarea exoenzimatică a izolatelor. Se pot folosi diverse metode automate de identificare și anume: galerii API 20E, kituri cu citire rapidă, ID32E, precum și sistem VITEK 2 Compact. Întrucât costurile pentru identificare sunt relativ înalte, pentru identificarea izolatelor dintr-o coprocultură (3+10 colonii), în practică s-a preferat „screeningul“ prealabil al coloniilor suspecte pe baza asocierii mediilor multitest TSI, MIU, MILF, citrat Simmons.

Sistemul API: sistem standardizat de identificare a germenilor din familia Entero-bacteriaceae, utilizează teste biochimice miniaturizate, precum și o bază de date adiacentă.

O condiție esențială în obținerea unei identificări corecte, este utilizarea de cultură bacteriană pură, provenită dintr-o singură colonie izolată, pe mediu neinhibitor.

Sistemul VITEK 2 Compact: sistem automat cu performanță ridicată, care identifică și testează sensibilitatea la antibiotice a bacteriilor izolate din prelevatele clinice.

Citirea cardurilor se bazează pe metoda colorimetrică, pentru identificarea speciilor bacteriene și metoda turbidimetrică, pentru testarea rezistenței la antibiotice.

Identificarea biochimică trebuie completată de o identificare serologică, pentru precizarea apartenenței la un serogrup „O“, utilizând seruri aglutinante polivalente și monovalente.

Metodologii neconvenționale: ce pun în evidență prezența agentului etiologic în prelevat, prin identificarea unor elemente structurale (antigenice ori genetice) caracteristice [9]

Metode imunologice (identificarea structurilor antigenic caracteristice):

– imunofluorescența (directă, indirectă),

– aglutinare (latex-aglutinare, coaglutinare),

– imunodifuzie, imunobloting,

– imunoenzimatice,

– alte imunoteste.

Metode genetice (recunoașterea agentului etiologic):

– amplificare genică,

– hibridare acizi nucleici.

Identificarea de certitudine

Identificarea patotipurilor de Escherichia coli: în tabelul 1 sunt grupate metodele ce pot fi utilizate pentru identificarea fenotipurilor diareigene.

Alegerea metodelor în practică depinde de accesibilitatea laboratoarelor la unul sau mai multe mijloace de testare . Testele imunoenzimatice și latex aglutinarea s-au impus îndeosebi prin sensibilitatea și accesibilitatea lor, pentru detectarea toxinelor la patotipurile ETEC și EHEC .[9]

Încadrarea serologică într-un grup „O“ este frecvent aproximativă, din cauza neconcordanței între activitatea patogenă și apartenența la serovar.

Multe tulpini aparținând grupelor „O“ listate nu dovedesc activitate patogenă, așa cum tulpini aparținând altor serogrupe pot fi enteroaderente ori enteropatogene. Chiar în patotipul EHEC, alături de serogrupul O157, cunoscut și acceptat ca patogen, au mai fost incluse recent alte două serogrupe: O126 și O111, altădată acceptate ca EPEC [5,6].

Citotoxicitatea: studiata pe mai multe linii celulare este accesibilă laboratoarelor cu o dotare corespunzătoare, care pot produce, întreține și testa culturi celulare.

Aprecierea efectului citopatogen pozitiv precum si cel aderent difuz sau localizat, se face corespunzator de persoane cu experiență .

III. Investigarea caracterelor genotipice de enteropatogenitate la E. coli

Tehnica de hibridizare moleculară este folosita frecvent la identificarea tulpinilor cu caracter patogen de E. coli. Folosirea sondelor ADN în detectarea genelor codante pentru entero-toxinele produse de tulpinile patotipului ETEC, respectiv toxina termolabilă (LT) și cea termostabilă (ST), a revoluționat studiul acestor microorganisme, contribuind la înlocuirea unor metode fenotipice, care se dovediseră greoaie și costisitoare.[7]

Metoda cel mai frecvent utilizată este hibridizarea pe colonii, care necesită, în prealabil, izolarea tulpinilor de E. coli din produsul patologic (materii fecale).

Deoarece atât tulpinile patogene, cât și cele comensale prezintă caractere tinctoriale, culturale și exoenzimatice identice, există riscul pierderii tulpinii de interes clinic în cadrul etapelor de diagnostic bacteriologic clasic.

Identificarea prezenței genelor de virulență prin hibridizare se poate realiza și folosind cultura primară, obținută direct din produsul patologic (ex. materii fecale).

Teoretic, metoda este mai avantajoasă datorită rapidității, fiindcă eludează etapa de izolare, cât și a sensibilității, tulpina patogenă fiind detectată chiar în condițiile în care nu domină cantitativ.

Se susține că pragul limită al concentrației patogenului țintă trebuie să fie de aproximativ 100.000-1.000.000 UFC/g materii fecale pentru ca rezultatul hibridizării să fie edificator.

În plus, nu întotdeauna folosirea bloturilor, efectuate direct din produsul patologic, ușurează munca de laborator, deoarece fără o izolare a tulpinii, deci fără cultura pură, nu se poate realiza concomitent și analiza fenotipică a acesteia.

Tehnologia PCR a pătruns cu succes în laboratorul clinic, răspunzând prin caracteristicile sale exigențelor diagnosticului microbiologic definite prin rapiditate, sensibilitate și specificitate.

Protocoalele ce folosesc tehnici de PCR concepute pentru studia si diagnostica pana la nivel de patotip E. coli țintesc individual sau concomitent (PCR multiplex) anumite structuri genetice cromosomale sau plasmidice ce codifica factorii de virulență (adezine fimbriale, afimbriale, toxine, siderofori etc.).

Aceste metode, deși nestandardizate, se pot aplica atât izolatului clinic, în cultură pură, cât și direct produsului patologic (tabelul 2).

Pentru că se pretează mai bine la standardizare, varianta „real time PCR“ tinde să ia locul testului PCR tradițional, datorită capacității acesteia de a cuantifica și identifica în timp real infecția/contaminarea cu tulpini patogene de E. coli. [7].

Atenția se concentrează în principal pe tulpinile O157:H7 și non O157:H7 aparținând patotipului Shiga-like Toxin E. Coli (SLTEC), recunoscute ca deosebit de patogene pentru om. Analiza tulpinilor EHEC/SLTEC reprezintă una dintre cele mai importante aplicații PFGE, metoda fiind considerată „standardul de aur“ pentru tipajul molecular al tulpinilor de E. coli. [14]

Pe lângă utilizarea ca alternativă în diagnosticul bacteriologic convențional al tulpinilor de E. coli, metodele moleculare și-au dovedit utilitatea în tiparea acestora în scopuri epidemiologice.

Pentru a permite identificarea cu succes a tulpinilor de E. coli cu fond genetic comun , în investigarea unor focare de toxiinfecție alimentară asociate cu consumul de apă, alimente sau în anchetele epidemiologice declanșate pentru identificarea căilor de transmitere și a factorilor de risc în cazuri izolate de boală, se aplică tehnici diverse, în funcție de avantajele pe care le oferă în respectivul context.

Se folosesc următoarele metode: analiza prin PFGE, ribotipia și o serie de metode bazate pe tehnica PCR (RAPD, rep-PCR, PCR-RFLP, AFLP) (7).

Ribotipia, folosită multă vreme ca prima metodă de analiză epidemiologică, și-a demonstrat utilitatea în identificarea tulpinilor de E. coli. Tulpini de EPEC și SLTEC au fost studiate prin ERIC–PCR și ribotipie, în scopul evaluării metodelor din punct de vedere al specificității și reproductibilității.

Tulpini aparținând la 26 de serotipuri au fost încadrate în 24 de ribotipuri și 25 de tipuri ERIC. Clonele înrudite de O55:H7 și O157:H7 au prezentat ribotipuri similare și au fost încadrate în același cluster în dendrogramă, în timp ce tulpini cu evoluție divergentă de EPEC și EHEC au fost incluse în clustere diferite.

Rezultatele au demonstrat faptul ca asocierea a două metode în studiul clonalității tulpinilor prezinta o utilitate deosebita. Tehnicile de biologie moleculară se recomandă prin specificitate, selectivitate și rapiditate ca metode de analiză epidemiologică.

Extracția și secvențierea automată a acizilor nucleici au redus considerabil consumul de reactivi și timp de execuț ie, iar aparatele pentru PCR au revoluționat diagnosticul infecțiilor microbiene, reacțiile putându- se efectua direct pe produsul patologic

V. Materiale si metode

Coprocultura standardizată pentru copil de 0-4 ani trebuie să constituie un „standard local“ care se bazează pe metodologia și protocoalele alese conform caracteristicilor epidemiologice ale zonei de activitate a laboratorului .

Coprocultura complementară permite evidențierea factorilor de patogenitate-virulență câștigați, la bacteriile enterice comensale .

Schema propusă pentru ierarhizarea etapelorde diagnostic bacteriologic:

a) Determinarea circumstanțelor care preced sau acompaniază diareea: contextul epidemiologic și clinic;

b) Aprecierea aspectelor macroscopice și microscopice ale materiilor fecale;

c) Alegerea metodologiei potrivite;

d) Izolarea și identificarea patogenilor enterici;

e) Obținerea unui rezultat care să permită medicului

indicația unui tratament adecvat:

Metodologii neconvenționale. Sunt acele tehnici de evidentiere a prezenței agentului etiologic în prelevat, prin identificarea unor elemente structurale (antigenice ori genetice) specifice:

1. Metode imunologice :

– aglutinare (latex-aglutinare, coaglutinare);

– imunoenzimatice;

2. Metode genetice – tehnici PCR :

– amplificare genică;

– hibridizare acizi nucleici;

– multiplex PCR .

a) Rezultatele diagnosticului bacteriologic clasic (convențional)

Prelevatele recoltate de la pacienții internați cu diagnosticul clinic de boală diareică, au fost transportate în maximum o oră la laborator. S-au recoltat probe de materii fecale în 2 recipiente: un coprorecoltor steril simplu și unul cu mediu de conservare și transport [NUME_REDACTAT].

Toate prelevatele au fost examinate macroscopic (pentru aprecierea consistenței, culorii, prezenței sângelui sau al mucusului) și microscopic, datele fiind înregistrate în fișele completate pentru fiecare caz clinic.

S-au efectuat frotiuri colorate albastru de metilen și Gram pentru fiecare probă de materii fecale recoltată de la pacienții internați, reprezentând primul prelevat nepereche, din momentul prezentării la medic

Figura 1. Repartiția pe sexe a pacienților încadrați în grupele de vârstă de 0-4 ani și peste 4 ani

Figura 2. Repartiția pe grupe vârstă, sex, pacienți cu BDA

Examinarea microscopică a frotiurilor colorate albastru de metilen a fost efectuată pentru aprecierea prezenței leucocitelor în materiile fecale recoltate de la pacienți.

Identificarea preliminară a tulpinilor de bacili Gram (-) din familia Enterobacteriaceae s-a bazat pe interpretarea reacțiilor biochimice, utilizând medii de cultură politrope (TSI, MIU, MILF, citrat Simmons).

Pentru identificarea de certitudine s-au utilizat kit-uri complexe de diagnostic, API 20E, ID 20E, carduri Vitek.

Din 410 tulpini de E. coli selectate pentru identificare serologică, 130 (31,7%) au aglutinat cu ser polivalent EPEC, 3 tulpini (0,7,%) au aglutinat cu ser anti-EIEC și numai 2 tulpini (0,5%) cu ser anti-EHEC (O157:H7). (figura 6)

Dintre cele 130 tulpini de E. coli pozitive prin reacția de aglutinare pe lamă cu seruri polivalente EPEC, 7 au fost izolate de la pacienți infectați HIV, iar 123 au fost izolate de la pacienții non-HIV.

Din cele 130 de tulpini aglutinante cu seruri polivalente EPEC, 46 (35,4%) au fost încadrate în serogrupuri EPEC prin reacții de aglutinare în tub, cu seruri monovalente.

Așa cum reiese din tabel, cele mai frecvente serogrupuri izolate, aparținând patotipului enteric EPEC au fost: O26B6/28,2%, O55B5/15,2%, O127B8/13,0%, O128B12 și O126B16/8,7%, O111B4/6,5%.

Mai precis, 46 tulpini de E. coli s-au încadrat în serogrupurile circulante semnalate în zona noastră geografică, iar restul de 84 au fost negative la reacția de aglutinare în tuburi cu seruri monovalente.

Acest fapt se explică prin apartenența lor la alte serogrupuri netestate, înrudite antigenic, circulante în țara noastră pentru care nu există încă seruri aglutinante comercializate.

Cele 2 tulpini de E. coli care au aglutinat cu ser polivalent anti-EIEC nu s-au confirmat prin reacția de aglutinare în tuburi.

De altfel, apartenența la serogrupele EIEC este privită cu o oarecare rezervă, întrucât serurile comerciale, și așa numeroase și imperfecte sub aspectul specificității, nu reușesc să acopere gama largă de entități EIEC.

Atunci când particularitățile clinice și biochimice conturează un sindrom „Shigella – like“, se impune confirmarea prin testul Sereny, toxigenicitate pe culturi celulare, tehnici de biologie moleculară.

Figura 5. Tulpină de Escherichia coli identificată pe trusa API 20E

Dintre cele 12 serogrupe EPEC, serogrupul O26B6 a fost dominant: 28,2% (Tabel II).

Distribuția individuală pe vârstă și sex a pacienților confirmați etiologic este prezentată în tabelul II.

Dintre celelalte serogrupe, O55B5, O127B8, O126B16 și O128B12, au fost prezente într-o proporție semnificativă, variind între 8,7 și 15,2%.

Numai 5 dintre tulpinile încadrate în serogrupul O26B6, au provenit de la pacienți în vârstă de până la 2 ani, 5 de la persoane adulte (8-38 ani) și două de la persoane de peste 50 ani.

Figura 6. Reacția de aglutinare pe lamă cu seruri anti -E. coli

Se conturează astfel ipoteza că serogrupul EPEC este un patogen diareic infantil. Incriminarea lui în etiologia BDA la adulți și chiar persoane în vârstă, nu este însă ocazională.

Gravitatea clinică a sindromului diareic la copil, din cauza dezechilibrării hidroelectrolitice rapide, a făcut ca investigarea bacteriologică a scaunului la copil să se facă mai frecvent și semnalizarea serogrupelor EPEC, îndeosebi la copilul sub 4 ani, să apară, statistic, pe primul loc

În figura 8 se poate remarca că din totalul de tulpini EPEC confirmate, 43,48% au fost izolate de la copiii sub 1 an și 26,17% de la copiii până la 10 ani. Celelalte grupe de vârstă, însumând 30,35%, au fost adulți, dintre care, 10,87% de peste 50 ani.

Un serogrup, de asemenea important ca frecvență, a fost O55 B5, în care s-au încadrat 7 tulpini de E. coli, izolate de la pacienți cu vârste cuprinse între 5 luni și 37 ani.

Dintre cele 41 tulpini de E. coli izolate de la pacienți cu boală diareică trenantă, asociată infecției HIV, 2 (4,9%) tulpini au fost încadrate serologic în serogrupurile O26 B6 și O128 B12, aparținând astfel patotipului enteric EPEC (enteropatogen).

b) Rezultate ale investigatiilor genotipice

Cele 410 de tulpini de E. coli izolate în coprocultură, identificate prin metode fenotipice au fost investigate și prin metode de biologie moleculară, pentru detecția prezenței factorilor genetici de patogenitate, prevalența genelor codante ale unor factori de virulență (adezine,toxine) .

În tabelul III este prezentată o listă a factorilor de virulență recunoscuți la patotipurile intestinale de Escherichia coli. Corespunzători fiecăruia dintre acești factori sunt menționați determinanții genetici codanți.

Se situează pe primul loc prezența intiminei, al cărei determinant genetic codant a fost pus în evidență la 7,8% dintre tulpinile serologic identificate ca aparținând patotipului EPEC.[13]

În 11 cazuri (2,7%) s-a evidențiat prezența factorului de virulență Stx II, al cărui determinant genetic codant stx II este corespunzător patotipului EHEC [16]. Corespunzător patotipului EAEC, factorul de virulență este adezina AAF1; numărul de gene

Figura 7. Încadrarea tulpinilor de E. coli izolate, în serogrupuri aparținând patotipului enteric EPEC

Figura 8. Proporția pe grupe de vârstă a tulpinilor de E.Coli EPEC comfirmate codante depistate a fost de 18, ceea ce a corespuns la o frecvență de 4,4%. Între alți factori de virulență depistați, s-au numărat: adezina Bfp (caracterizând patotipul EPEC) și toxina Stx I (produsă de patotipul EHEC) .

Nu au fost depistate gene codante răspunzătoare de producerea de enterohemolizină (patotip EHEC), toxine LT și ST (patotip ETEC), invazina (EIEC), absență care poate fi pusă în legătură cu lipsa de participare a patotipurilor respective în determinismul etiologic al cazurilor de BDA investigate.

Gena eaeA, determinant cromozomal al intiminei, răspunzătoare de leziuni specifice „attaching – effacing“, s-a întâlnit cel mai frecvent singură la 21 dintre tulpini și în asociere cu alte gene la încă 11 tulpini.

Gena agg a fost detectată singură la 18 tulpini și în asociere cu eaeA la 3 tulpini. (20) Prezența genelor stx I și stx II a fost întotdeauna determinantă pentru patotipurile STEC, cu sau fără gena eaeA.

Identificarea doar a genei eaeA, fără localizarea genei plasmidice bfpA, permite încadrarea acestor tulpini în patotipul EPEC atipic (5,12%).

Numai 1,5% dintre tulpini poartă doar gena stxII, în timp ce gena stxI unică, a fost identificată în proporție de 0,3%. 0,9% dintre tulpini au prezentat asociere de 2 gene: eaeA + stxII și o singură tulpină de E. coli a prezentat o asociere triplă de gene eaeA + stxI + stxII. Aceste tulpini de E. coli se încadrează în patotipul STEC ([NUME_REDACTAT] E. coli) sau VTEC (2,9%).

Gena agg s-a regăsit în genomul a 18 (4,4%) dintre tulpinile testate prin PCR, ca singura reprezentantă a genotipului de virulență EAggEC (E. coli enteroagregativ).

Profilurile rezultate din asocierea a două gene au fost în număr de 3, la 10 (2,4%) dintre tulpinile E. coli studiate.

În fiecare dintre ele gena eaeA s-a asociat fie cu bfpA (specific patotipului EPEC tipic), fie cu stx II (în patotipul EHEC/ STEC), fie cu gena agg (enteropatogen atipic asociat cu enteroagregativ EAggEC).

O singură triplă asociere (eaeA + stxI + stxII) s-a înregistrat la o tulpină de E. coli: s-au identificat 3 determinanți genetici țintiți prin metoda multiplex

PCR, respectiv genele eaeA, stxI, stxII, care au confirmat suspiciunea clinică, precum și mecanismul de acțiune bacterian, permițând încadrarea tulpinii în patotipul enteric STEC.

Confirmarea prin PCR a tulpinilor de E. coli – patotip EPEC este prezentată în tabelul IV.

Deși aceste tulpini au aparținut mai multor serotipuri (5 serotipuri) ele au fost confirmate prin tehnica PCR ca purtătoare ale aceluiași factor de virulență, eaeA, și catalogate drept patotip EPEC tipic (eaeA + bfp+, la 3 tulpini din 46) și, respectiv EPEC atipic (eaeA + bfp -, la 7 tulpini din 46).

Dintre cele 130 tulpini E. coli care au prezentat reacție pozitivă la tehnica aglutinării cu seruri polivalente anti-EPEC, 9 tulpini s-au încadrat serologic în serogrupe EPEC și doar 10 (7,7%) tulpini au fost confirmate genetic, prin punerea în evidență a genelor eaeA și bfpA, prin tehnica multiplex PCR.

Tabelul 3. Incidența structurilor genetice implicate în patogenitatea tulpinilor diareigene de E. coli studiate și corelarea cu patotipurilor enterice cunoscute

Nici una dintre tulpinile de E. coli izolate de la pacienții infectați HIV nu a prezentat gene cromosomiale sau plasmidice codante pentru factorii de virulență suspicionați, după încadrarea serologică în patotipul EPEC.

c) Profilul genotipului de virulență la tulpinile enterice de E. coli izolate în boala diareică acută Genotipul de virulență detectat la screeningul prin PCR al tulpinilor de E. coli izolate a evidențiat prezența uneia sau mai multor gene codante pentru factorii de virulență.

În genomul tulpinilor de E. coli selectate din sindroamele diareice, s-au țintit 11 regiuni specifice pentru determinanții de virulență: lt, st, ipaH, stxI, stxII, ehxA, bfpA, eaeA, agg, astA, afa.

În tabelul 4. este redat profilul genomic de enterovirulență identificat la tulpinile de E. coli.La aceeași tulpină au fost identificate 1 sau maximum 3 gene determinante ale profilului de virulență. În total au fost evidențiate 8 profiluri genomice: eaeA, agg, stx II, stx I, eaeA + bfpA, eaeA + stx II, eaeA + agg, eaeA + stx I + stx II.

Este de reținut că la 24 tulpini (din 410 testate, 5,8 %) de E. coli izolate, s-a pus în evidență, prin tehnica PCR, prezența genelor eaeA și bfpA: 21 de tulpini au prezentat factori de virulență atipici pentru patotipul EPEC (eaeA+) și numai 3 au fost genetic, tipice: eaeA+ bfp+ (22).

Important de subliniat este însă faptul că numai 9 din 24 tulpini genetic definite ca purtând factori de virulență au corespuns încadrării serologice de patotip EPEC.

Această observație susține superioritatea metodelor genetice, mult mai sensibile decât metodele fenotipice, prin capacitatea lor de a detecta tulpini cu semnificație etiologică potențial agresive, fără expresie de factori antigenici incriminatori.

Tabelul 4. Profilul genomic de enterovirulență identificat la tulpinile de E. coli izolate din coprocultura pacienților internați cu diagnostic clinic de BDA

Abordarea investigării prin metode de biologie moleculară (metode genetice) a sindromului diareic determinat de E. coli pare a fi mult mai eficientă decât cea serologică și, în perspectivă, va diminua consistent eșecul „rezultatelor negative“ raportate în mare proporție ca urmare a abordării diagnosticului bacteriologic, prin metode fenotipice. [14]

În tabelul V am surprins un alt fenomen: la 14 din cei 24 pacienți la care s-au izolat tulpini de E. coli purtătoare de factori de virulență, vârsta a fost de peste 8 ani și numai 10 au avut vârsta sub 3 ani.

Conceptele anterioare evidențiau patotipul EPEC ca un patogen intestinal infantil.

Patotipurile intestinale de E. coli au fost izolate mai frecvent de la copii decât de la adulți, mai ales ca urmare a faptului că investigarea bacteriologică a BDA la copil este mai frecvent solicitată de pediatrii decât de către infecționiști la adulți .

Tabelul 5. Repartiția pe vârste a tulpinilor de E. coli EPEC tipic și atipic, confirmate genetic

În tabelul VI am sintetizat observații pe care le-am considerat importante: la 12 tulpini EHEC, non-O157H7 izolate din sindrom diareic clinic „atipic“ (fără scaune sanghinolente și sindrom hemoragic), prin mijloace de investigare genetică am pus în evidență prezența genelor stx I sau stx II, singure sau în asociere cu gena eaeA.

Absența sau neexprimarea genetică a locusului de patogenitate din cromozom, respectiv absența genei eaeA, dar cu exprimarea genelor codante pentru una sau ambele toxine Shiga- like, au permis încadrarea celor 7 tulpini de E. coli în patotipul EHEC atipic. [14]

Din totalul tulpinilor studiate prin metode moleculare, multiplex PCR, 11 tulpini E. coli s-au încadrat în patotipul enteric STEC atipic (proporție de 2,7%). Surprinzător apare însă faptul că la 86,8% dintre cele 410 tulpini de E. coli nu au putut fi puși în evidență factori genetici de patogenitate, deși proveneau de la pacienți cu sindrom diareic infecțios.

Alte etiologii, patotipuri neidentificate, ori alți factori genetici de patogenitate, încă neidentificați, au fost implicați în determinarea agresivității lor.

Figura 9. Tulpina de E. coli intestinal purtatoare de gena bfpA (patotip enteric EPEC)

Tabelul 6. Asocieri genetice la tulpini de E. coli non-O157 încadrate în patotipul enteric EHEC

Izolare ADN.

Pentru a determina compoziția în specii într-o comunitate microbiană mixtă, cea mai utilizată metodă este clonarea ADN amplificat prin PCR. Această metodă este laborioasă și consumatoare de timp și nu este adaptată pentru a urmări modificările succesive ale populației dintr-o comunitate, unul din scopurile importante ale ecologiei microbiene.

Din acest punct de vedere devin utile tehnicile de amprentă genetică. Ele furnizează un profil al diversității comunității pe baza separării fizice a acizilor nucleici.

Metodele sunt rapide, relativ ușor de realizat și fac posibilă compararea diversității genetice a comunității microbiene din diferite habitate sau studiul comunității în timp.

Metodele se pot clasifică în:

– metode directe în care acidul nucleic este extras și analizat,

– metode indirecte în care markerul molecular este mai întâi extras și amplificat prin PCR și apoi analizat.

Izolarea și purificarea ADN premergătoare procesului PCR au fost realizate folosind kiturile Nucleospin și QiaGen.

Reacția de polimerizare în lanț (PCR) este o reacție enzimatică de amplificare exponențială a unei gene de ADN și presupune realizarea unor cicluri succesive de replicare a unei secvențe din ADN genomic.

Programul PCR a avut următoarele etape :- 2 min la 95○ C, 1 min la 94○ C – 1,5 min la 60○ C – 2 min la 72○ C ( 5 cicluri , la fiecare ciclu s-a redus temperatura cu 1○ C astfel încât la ultimul ciclu s-a ajuns la 55○ C și nu 60○ C), 1 min la 94○ C, 1,5 min 55○ C, 2 min la 72○ C (25 cicluri), 10 min la 72○ C, urmată de coborârea temperaturii la 4○ C până am luat probele din aparat. ( Bio-Rad C1000 [NUME_REDACTAT]). Primerii folosiți, Preverse și Pfoward au fost adaugati la un volum total de 50 μl.Produsul de PCR este un fragment sau fragmente de ADN de lungime definită. Ulterior, efectuând electroforeza în gel de agaroză se face vizualizarea fragmentelor amplificate la UV- transiluminator după colorarea cu bromură de etidiu. Prin compararea benzilor obținute cu benzile unui martor molecular de greutate ([NUME_REDACTAT]) s-au identificat și separat fragmentele de aceeași greutate moleculară.

[Fig.]. Electroforeză – agaroză 1%

Figura 10. PCR pentru identificare izolate de STEC

În figura 11 s-a prezentat frecvența patotipurilor intestinale determinată prin investigarea factorilor de virulență, la cele 410 tulpini de E. coli luate în studiu.

În mod evident, patotipul EPEC (5,82%), îndeosebi varianta EPEC atipic (5,12%), a fost izolat cel mai frecvent, urmat de E. coli EAEC (4,4%) și STEC tipic și atipic (2,9%).

Deși diferența de numai două procente tulpini detectate prin metode genotipice nu este mare, semnificația ei în diagnosticul bacteriologic de certitudine, de confirmare a metodelor fenotipice, este deosebită.

Identificarea factorilor de patogenitate prin metode genetice este mult mai puțin laborioasă și mult mai specifică întrucât nu este influențată de potențiale înrudiri antigenice, așa cum se întâmplă la identificarea serologică.[14]

V. Rezultate și Discuții

S-a urmarit elaborarea unei metodologii accesibile și aplicabile în diagnosticul bacteriologic al bolii diareice acute, prin coroborarea metodelor fenotipice, cu cele complementare și genotipice, în scop diagnostic, epidemiologic, în special pentru situații de urgență.

S-au evidențiat unele caractere fenotipice și genotipice asociate virulenței intestinale, care constituie argumente în favoarea potențialului enteropatogen al tulpinilor de E. coli.

S-a evaluat incidența patotipurilor enterice de E. coli dintr-un lot aleator de pacienți, clinic diagnosticați cu boala diareică acută, imunocompetenți și infectați HIV

Au fost luate în studiu 410 tulpini de E. coli izolate și identificate prin metode fenotipice, bazate pe proprietățile exoenzimatice ale genului Escherichia, dar și prin metode microtest API și Vitek 2C.

Referitor la etiologia bacteriană a bolii diareice acute, rezultatele studiului nostru, în cazul patotipurilor digestive EPEC, EHEC/VTEC, EaggEC, se încadrează în limitele datelor de incidență, raportate în literatură, respectiv: 2,12% față de 2-7% în unele țări africane, 5-15% în țări din [NUME_REDACTAT], 10% în Franța.

Metodele convenționale de studiu serologic al celor 410 tulpini de E. coli (tehnica de aglutinare cu seruri polivalente, respectiv monovalente) au permis identificarea a 28,2% tulpini serogrup O26B6; 15,2% serogrup O55B5; 13,0% O127B8; 8,7% O128B12 și O126B16; 6,5% O111B4, dar și 0,7% tulpini E. coli cu reacție de aglutinare ser

Figura 12. PCR pentru pentru identificarea genei agg (patotip enteric EAEC)

Cele 410 tulpini de E. coli izolate din coprocultură, au fost investigate prin metode fenotipice metabolice și prin metode de biologie moleculară. În genomul tulpinilor digestive de E. coli, cuprinse în lotul studiat, s-au țintit 11 regiuni specifice determinanților de virulență: lt, st, ipaH, stxI, stxII, ehxA, bfpA, eaeA, agg, astA, afa. S-au identificat asocieri variate de 2 până la maximum 3 gene, care codifică factori de virulență.

Gena eae A a fost identificată prin tehnica multiplex PCR la 32 (7,8%) tulpini E. coli, proteina piliară BfpA la 3 (0,7%) tulpini, gena codantă pentru toxina StxII la 11 (2,7%), iar pentru toxina StxI la 2 (0,5%) dintre tulpini și gena codantă pentru adezina AAF/ I la 18 (4,4%) tulpini E. coli.

Nici una dintre tulpinile de E. coli izolate nu a prezentat gene cromozomiale sau plasmidice codante pentru factorii de virulență posibili.

Genotipul de virulență detectat la screeningul prin PCR al tulpinilor de E. coli de proveniență intestinală a evidențiat prezența în genomul aceleiași tulpini de E. coli a uneia sau mai multor gene codante pentru factori de virulență.

La 21 de tulpini E. coli a fost evidențiată numai gena eaeA, responsabilă de leziunile attacing/effacing, specifice patotipului EPEC. Identificarea doar a genei eaeA, fără localizarea genei plasmidice bfpA, permite încadrarea acestor tulpini în patotipul EPEC atipic (5,12%).

O proporție de 1,5% dintre tulpini au fost purtătoare doar ale genei stxII, în timp ce gena stxI unică, a fost identificată în proporție de 0,3%. 0,9% dintre tulpini au prezentat asociere de 2 gene: eaeA + stxII și o singură tulpină de E. coli o asociere triplă de gene eaeA + stxI + stxII. Aceste tulpini de E. coli se încadrează în patotipul STEC ([NUME_REDACTAT] E. coli) sau VTEC (2,9%).

Gena agg s-a regăsit în genomul a 18 (4,4%) dintre tulpinile testate prin PCR, ca singura reprezentantă a genotipului de virulență EAggEC (E.coli enteroagregativ).

Profilurile rezultate din asocierea a două gene au fost în număr de 3, la 10 (2,4%) dintre tulpinile E. coli studiate. În fiecare dintre ele, gena eaeA s-a asociat fie cu bfpA (specific patotipului EPEC tipic), fie cu stxII (în patotipul EHEC/ STEC), fie cu gena agg (enteropatogen atipic asociat cu enteroagregativ EAggEC). Astfel, s-au identificat 3 (0,7%) tulpini EPEC tipice, 12 (2,9%) EHEC/ STEC și 3 (0,7%) tulpini de E. coli cu mecanism patogen tip EPEC atipic asociat cu mecanism enteroagregativ.

Incidența patotipurilor enterice de E. coli izolate din coproculturile pacienților internați în Spitalul „Dr. V. Babeș“ cu diagnosticul clinic de boală diareică acută sau trenantă, în intervalul studiat, a fost: E. coli EPEC: 5,8% (EPEC tipic: 0,7% și EPEC atipic: 5,1%), E. coli EHEC/ STEC/ VTEC: 2,9% (STEC tipic: 0,2% și STEC atipic: 2,7%), E. coli enteroagregativ (EaggEC): 4,4%.

Conform rezultatelor studiului, E. coli EPEC tipic sau atipic, constituie 2 grupuri distincte de microorganisme, care au în comun insula de patogenitate LEE. Serogrupurile mai frecvent întâlnite au fost O26B6, O55B5, O127B8. Serotipurile EPEC tipice (eaeA+, bfpA+) sunt în mod tradițional responsabile de boala diareică la copii; frecvent izolate în țările industrializate în trecut, acum sunt foarte rare. Tulpinile de EPEC atipice (eaeA+) sunt mai apropiate de patotipul STEC cu care se aseamănă: au serogrupuri comune (O26B6, O55B5, O127B8).

Din 410 tulpini E. coli 74, 3% au aparținut grupelor de vârstă 0-4 ani. S-au identificat serogrupurile EPEC: O26B6/ 28,2%, O55B5/ 15,2%, O127B8/ 13,0%, O128B12 si O126B16/ 8,7%, O111B4/ 6,5%, O157H7/0,5%.

Considerăm că rezultatele acestui studiu îndreptățesc efortul de a introduce în practica de microbiologie clinică investigații genomice, contribuind astfel nu numai la îmbogățirea datelor de epidemiologie moleculară, dar și la creșterea acurateței diagnosticului bacteriologic al infecțiilor digestive cu Escherichia. coli.

Identificarea factorilor de virulență și agresivitate bacteriană poate servi atât microbiologului cât și clinicianului, pentru terapia infecțiilor digestive bacteriene.

VI. Bibliografie selectiva

1. Tratat de microbiologie Clinica – D.Buiuc, M.Negut, Ed. Medicala, Bucuresti, 2008

2. Microbiologie clinica – D. Buiuc, Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1998

3. Microbiologie – [NUME_REDACTAT], E. [NUME_REDACTAT], Bucuresti, 2003

4. Bacteriologie medicala – V.Balbaie, N.Pozsgi, Ed. Medicala, Bucuresti, 1985

5. Bacteriologie medicala – Prof. N. Nestorescu, Ed. Medicala, 1961

6.SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerinte particulare pentru calitate si competenta

7. Bacteriologie-medicala – [NUME_REDACTAT] Sacarea, [NUME_REDACTAT] 2006

8. Bergey's Manual of [NUME_REDACTAT], Vol. 1. Baltimore, Williams and Wilkins, 1984

9. [NUME_REDACTAT] for Identification of [NUME_REDACTAT], 2nd ed. Williams and Wilkins, Baltimore, Bachoon, Dave S., and Wendy A. Dustman 1990.

10. [NUME_REDACTAT]: "Ghid pentru studiul si practica medicinei", Buiuc D,[NUME_REDACTAT].T.Popa, Iasi, 2003

11. http://www.microbiologyinpictures.com/escherichia%20coli.html

12. http://herlife.ro/escherichia-coli-e-coli/

13.http://www.readbag.com/medica-ro-reviste-med-download-bi-revista-romana-boli-infectioase-2007-nr-4

14. http://radhoo007.blogspot.ro/2012/06/enterobacteriaceae.html

15.http://biblioteca.regielive.ro/cursuri/medicina/bacili-gram-negativi-de-interes-medical-familia-enterobacteriaceae-150544.html

16. http://www.scritub.com/medicina/Bacili-gram-negativi-de-intere22383711.php

17. http://en.wikipedia.org/wiki/Theodor_Escherich

18. http://en.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae

VII. Anexa foto