Utilizarea Tehnicii Fish In Diagnosticul Pacientilor cu Leucemie Mieloida Cronica

Utilizarea tehnicii FISH în diagnosticul pacienților cu leucemie mieloidă cronică

INTRODUCERE

Lucrarea de față se dorește a fi un preambul pentru tânara generație de biologi care dorește să studieze și să aprofundeze importanța utilizării tehnicilor de citogenetică în diagnosticul pacienților cu leucemie mieloidă cronică (LMC), mai exact utilizarea tehnicii FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation), ca metodă de diagnostic a pacienților cu LMC.

Citogenetica reprezintă un domeniu foarte interesant al geneticii medicale, un domeniu aflat într-o continua expansiune, evoluție și cercetare.

În cazul neoplaziilor, anomaliile cromozomale sunt prezente, iar identificarea acestora este extrem de importantă și extrem de esențială pentru un diagnostic corect și o estimare cât mai bună a evoluției și a prognosticului pacienților.

Analiza nucleilor interfazici proveniți din aspirate medulare sau sânge venos periferic utilizând tehnica FISH, poate caracteriza cu o foarte mare acuratețe diverse modificări specifice diferitelor tipuri de leucemii.

Lucrarea de față urmărește crearea unei imagini complete asupra diagnosticului leucemiei mieloide cronice utilizând tehnica FISH.

Astfel, primul capitol descrie procesul de malignizare celulară, tipurile de gene implicate în acest proces și mecanismele ce provoacă activarea acestor gene în celulel somatice.

Cel de-al doilea capitol introduce noțiunile de bază privind leucemia mieloidă cronică (LMC), manifestările clinice și fazele evolutive ale acestui tip de leucemie, principalele investigații paraclinice ce sunt frecvent utilizate în diagnostic, incidența maximă, precum și predominanța de apariție în funcție de sex. Tot aici sunt prezentate mecanismele de fuziune a genelor bcr-abl ce determină formarea cromozomului Philadelphia (Ph), a cărui prezență reprezintă un marker principal în diagnosticul LMC, cauzele instalării LMC și factorii de risc ce determină o predispoziție la această maladie neoplazică.

Cel de-al treilea capitol prezintă tipurile de tratamente ce pot fi aplicate la pacienții diagnosticați cu LMC, în funcție de faza evolutivă a bolii în care se află pacientul.

Cu toate că există un decalaj important față de alte state, totuși în ultimul deceniu România a făcut pași importanți în acest domeniu, în privința aplicării pe scară largă a tehnicilor de citogenetică pentru diagnosticarea pacienților cu LMC.

Literatura de specialitate publicată la nivel internațional menționează diferite tipuri de teste FISH ce sunt utilizate pentru identificarea cromozomului Ph și a anomaliilor citogenetice adiționale, însă la nivel național asemenea studii sunt doar sporadice.

În ultimii ani, Laboratorul de citogenetică al Institutului Clinic Fundeni – București, a primit finanțare pentru câteva proiecte de cercetare ce au avut ca scop implementarea tehnicii FISH în diagnosticarea pacienților cu LMC.

PARTEA TEORETICĂ

(Analiza bibliografică)

CAPITOLUL 1

MALIGNIZAREA CELULARĂ

În malignizare sunt implicate două mari categorii de gene: oncogenele și antioncogenele (gene supresor tumorale), a căror acțiune se manifestă în diferite stadii de apariție și evoluție a cancerului. Una din principalele caracteristici ale maladiilor maligne este multistadialitatea (Figura 1.1).

Oncogenele reprezinta gene ce joacă un rol important în controlarea proliferării celulare și codificarea factorilor de creștere și factorii transcripționali; promovează creșterea autonomă a celulelor maligne. Oncogenele se formează când structura și/sau nivelul de expresie al protooncogenelor suferă modificări. Genele celulare normale sunt denumite protooncogene, iar variantele lor activate se numesc oncogene celulare (c-onc). Aceste gene se activeaza in urma aparitiei unor mutații cu câștig de funcție. Aceste gene stimulează continuu si in mod exagerat creșterea, conducând la multiplicarea necontrolată și la transformarea malignă. Oncogenele au efect dominant la nivel celular ca atare o singură alelă mutantă (activată) este mai mult decat suficienta pentru modificarea fenotipului celular in unul malign. În prezent, sunt cunoscute peste 100 de oncogene din care 70% aparțin familiei Ras.

Figura 1. Reprezentarea schematică a etapelor procesului malign (după Weigant, 1990).

În funcție de nivelul celular la care acționează proteinele codificate de acestea, oncogenele se pot clasifica în mai multe categorii:

oncogene care codifică factorii de creștere celulari (ex. pdgfrb);

oncogene care codifică receptorii factorilor de creștere (ex. egfr, ret);

oncogene care codifică componentele ale căilor de semnalizare intracelulară (ex. ras, abl);

oncogene care codifică proteine nucleare în special factorii de transcripție (ex. myc);

oncogene care codifică proteine implicate în controlul ciclului celular (ex. mdm2).

Fiind gene dominante, majoritatea mutațiilor responsabile de activitatea oncogenelor survin la nivelul celulelor somatice, mutațiile germinale cel mai probabil sunt incompatibile cu dezvoltarea embrionară.

1.1.Activarea oncogenelor în celulele somatice – mecanisme:

activarea oncogenelor prin mutații punctiforme (ex. genele familiei Ras; protooncogena ras codifică o proteină membranară G responsabilă pentru transducția semnalului celular, produsele genei ras rămân activate în absența unui semnal adecvat din partea factorului de creștere; mutațiile genei ras sunt implicate în 30% din cancere inclusiv melanoame, plămân și pancreas);

activarea oncogenelor prin translocații cromozomale, cel mai adesea apar translocațiile (au fost descrise peste 40 de asemenea translocații cu potențial activator al unor oncogene, în special în limfoame și leucemii);

activare oncogenelor prin amplificare genică, amplificarea genică fiind fenomenul care are ca rezultat producerea de copii multiple ale unor oncogene normale din punct de vedere structural (ex. oncogenele myc și erb).

activarea oncogenelor prin inserție virală (mutație inserțională), în cazul retrovirusurilor oncogene de exemplu HTLV1 (3,4).

Protooncogenele reprezinta gene funcționale, ce pot fi activate și apoi transformate în gene oncogene prin intermediul unei mutații punctiforme, translocatii sau prin procesul de amplificare genică (Tabel 1.).

Tabel 1. Proto-oncogene și funcțiile lor (http://www.epathology.ro).

Mutațiile punctiforme consta în modificarea secvenței ADN prin înlocuirea unei baze azotate cu alta. Acestea pot fi de 3 feluri :

sinonime ( atunci când aminoacidul codificat rămâne neschimbat);

mis-sens (atunci când codifică alt aminoacid) și

non-sens (codonul stop codifică un aminoacid terminator).

Translocațiile implica un schimb de gene, realizat între 2 cromozomi omologi. Pot fi:

reciproce (nu presupune pierdere de material genetic),

nereciproce (presupune pierdere de material genetic) sau

de tip robertsonian ( http://www.epathology.ro/patologie-generala/neoplazia/biologia-molecular-in-neoplazie.html )

Consecințele translocațiilor:

– amplificare genică (prin insertia unui fragment ADN in proximitatea unui promotor) cu supraexpresie proteică;

– juxtapoziție genică (determinata de suprapunerea genelor) soldandu-se cu apariția unei proteine de fuziune.

Amplificarea genică se caracterizeaza prin creșterea numerica a copiilor unor gene în genom, prin alterări ale ADN-ului. Amplificarea poate fi fie intracromozomală (benzi colorate omogen), fie extracromozomală sub forma unor corpusculi double-minute (reprezentand fragmente cromatidice mici, fără centromere dispuse în perechi).(Gersen, 2005).

Genele supresor tumorale (GST), acestea isi pierd functiile în cursul carcinogenezei determinand inhibarea proliferării celulare (Tabel 2.). Versiunile mutante GST din celulele canceroase au activitatea pierdută. Ambele copii alele trebuie să fie inactivate înainte ca funcția genei supresoare tumorale să fie pierdută, rezultând absența unei proteine normale.

GST determina blocarea dezvoltarii neoplaziilor maligne prin reglarea creșterii și proliferării celulare. GST sunt deci gene normale a căror funcție este inactivată prin mutații care trebuie să se producă în ambele alele. Aceasta înseamnă că două evenimente sau mutații trebuie să se producă în prima și apoi în a doua alelă. Mutațiile cu pierderea funcției acestor gene conduc la proliferarea și creșterea celulară necontrolată și la apoptoza ineficientă. Genele supresoare ale creșterii tumorale se manifestă ca gene recesive la nivel celular, pentru convertirea fenotipului fiind necesară pierderea sau mutația ambelor alele (inactivare alelică).

Tabel 2. Anti-oncogene și tumorile implicate (http://www.epathology.ro).

Studiile citogenetice au permis identificarea mai multor mecanisme de inactivare a celei de-a doua copii a unei gene supresoare a creșterii tumorale în cancerele ereditare:

– deleții;

– recombinări somatice – prima dovadă a existenței acestui fenomen la nivelul celulelor somatice;

– pierderea unui cromozom asociată cu duplicarea cromozomului restant.

– pierderea unei copii funcționale a unei gene supresoare a creșterii tumorale a fost denumit pierderea heterozigozității (loss of heterozygosity, LOH).

Pierderea heterozigoției este mecanismul cel mai frecvent intalnit, de inactivare a celei de-a doua alelele produse prin moștenirea unei gene supresoare a creșterii tumorale mutante.

Genele supresoare ale creșterii tumorale codifică proteine cu funcții extrem de diverse: receptorii membranari (ex. PTCH), proteine citoplasmatice (ex. APC, NF1), proteine nucleare ( p53, Rb1, VHL, WT1, TM, BRCA1).

Genele supresoare ale creșterii tumorale au fost clasificate de Vogelstein și Kinzler (1996) în două categorii majore: gene gate-keeper („portar”) și gene caretaker („îngrijitor”).

Genele gate-keeper sunt gene ce codifică proteine implicate direct în controlul creșterii celulare, (inhibând mitoza sau promovând apoptoza). Funcția acestor gene este critică pentru supresia tumorală. Exemple de gene gate-keeper : APC, VHL, TP 53, NF1 sau PTEN. Mutațiile germinale ale tuturor acestor gene determină producerea unor boli genetice cu risc crescut de dezvoltare a malignizarii, acestea prezintand o transmitere dominantă (ex. sindromul Li-Fraumeni).

Genele care-taker sunt gene care codifică proteine implicate în menținerea stabilității genomului. Alterările acestor gene determina creșterea frecvenței mutațiilor la scara întregului genom, inclusiv a protooncogenelor și a genelor supresoare tumorale și determină fenomenul de instabilitate genomică.

O atenție particulară este acordată genelor implicate în repararea leziunilor ADN. Genele de reparare a ADN, ale căror funcții sunt inactivate în carcinogeneză, conduc la instabilitate genomică. Genele de reparare a ADN afectează proliferarea sau supraviețuirea indirect, prin influențarea capacității organismului de a repara leziuni neletale la nivelul altor gene incluzând protooncogenele și genele supresoare ale tumorilor.

Unele defecte în mecanismele de reparare a ADN pot predispune la menținerea unor mutații în genom și astfel, la transformarea neoplazică. Această predispoziție la mutații se numește fenotip mutator, iar genele implicate în mecanismele de reparare se numesc și gene mutator. Cu unele excepții, sunt necesare mutații în ambele alele ale genelor de reparare ale ADN pentru a induce ceea ce se numește instabilitate genomică – adică posibilitatea achiziției de mutații, sau reparare a mutațiilor în absența unor factori cauzatori. În acest sens, genele mutator pot fi considerate gene supresoare ale tumorilor.

În celulele canceroase mutațiile au fost identificate în genele care reglează ciclul celular (protooncogene și genele supresoare de tumori) sau de reparare a leziunilor ADN (genele de reparare). Mutațiile în genele de reparare a ADN accelerează acumularea de mutații în genele supresoare și protooncogene (Duenas și colab.,2013).

Tabelul 3. prezintă câteva anomalii citogenetice care afectează atât oncogenele, cât și antioncogenele și genetaker sunt gene care codifică proteine implicate în menținerea stabilității genomului. Alterările acestor gene determina creșterea frecvenței mutațiilor la scara întregului genom, inclusiv a protooncogenelor și a genelor supresoare tumorale și determină fenomenul de instabilitate genomică.

O atenție particulară este acordată genelor implicate în repararea leziunilor ADN. Genele de reparare a ADN, ale căror funcții sunt inactivate în carcinogeneză, conduc la instabilitate genomică. Genele de reparare a ADN afectează proliferarea sau supraviețuirea indirect, prin influențarea capacității organismului de a repara leziuni neletale la nivelul altor gene incluzând protooncogenele și genele supresoare ale tumorilor.

Unele defecte în mecanismele de reparare a ADN pot predispune la menținerea unor mutații în genom și astfel, la transformarea neoplazică. Această predispoziție la mutații se numește fenotip mutator, iar genele implicate în mecanismele de reparare se numesc și gene mutator. Cu unele excepții, sunt necesare mutații în ambele alele ale genelor de reparare ale ADN pentru a induce ceea ce se numește instabilitate genomică – adică posibilitatea achiziției de mutații, sau reparare a mutațiilor în absența unor factori cauzatori. În acest sens, genele mutator pot fi considerate gene supresoare ale tumorilor.

În celulele canceroase mutațiile au fost identificate în genele care reglează ciclul celular (protooncogene și genele supresoare de tumori) sau de reparare a leziunilor ADN (genele de reparare). Mutațiile în genele de reparare a ADN accelerează acumularea de mutații în genele supresoare și protooncogene (Duenas și colab.,2013).

Tabelul 3. prezintă câteva anomalii citogenetice care afectează atât oncogenele, cât și antioncogenele și generează diferite tipuri de tumori maligne.

Tabel 3. Tipuri de anomalii citogenetice ( http://www.epathology.ro )

CAPITOLUL 2

LEUCEMIA MIELOIDĂ CRONICĂ (LMC)

2.1. Considerații generale

Leucemia mieloidă cronică reprezintă o hemopatie mieloproliferativă clonală, fiind prima malignitate umană ce a fost asociată cu o anomalie la nivel cromozomal. Este prima malignitate ce a fost reprodusa pe un model animal, acest lucru bazându-se exclusiv pe cunoașterea exactă a leziunii moleculare generatoare. A fost descrisă pentru prima dată în 1845 de Wirchow și Bennet, LMC-ul fiind prima maladie maligna în care identificarea anomaliei cauzatoare a condus la terapie specifică. (Geary,2000).

Instalarea leucemiei mieloide cronice este cauzată de o mutație apărută la nivelul unei celule stem pluripotente, manifestându-se printr-o expansiune mieloidă necontrolată. Celulele leucemice rezultate păstrează capacitatea de diferențiere și maturare, cât și capacitatea funcțională, dar obținând o capacitate proliferativă necontrolată în special pe linie granulocitară.Acest proces se soldează cu creșterea numărului celulelor granulocitare în măduvă și trecerea acestora în sângele periferic. Boala se caracterizează prin creșterea la nivel înalt a seriei granulocitare, în toate stadiile de maturație.

Leucemia mieloida cronică reprezintă 15-20% din cazurile de leucemie existente la adult. Incidența mondială variază de la 0,1 la 2,0 cazuri la 100 000 de persoane. Morbiditatea acestei maladii crește odata cu vârsta. ( http://www.cancerresearchuk.org/health-professional/cancer-statistics/statistics-by-cancer-type/leukaemia/incidence )

Incidența maximă este cuprinsă la pacienții cu vârste între 25-50 ani. Leucemia mieloidă cronică este rar întalnită la persoane sub 18 ani și exceptională la persoane cu vârsta sub 5 ani (forma juvenilă, atipică). În ultimii ani, s-a semnalat o creștere a incidenței de aparitie a LMC la vârste tinere, existând chiar și la copii și nou născuți, totuși incidența rămâne rară la copii, sub 5%.

S-a constatat o predominanță ușoara de apariție a LMC-urilor la persoanele de sex masculin, raportul bărbați: femei= 1,7 : 1. A existat o ușoară diminuare a incidenței LMC între 1973 și 1991 (1,5/1,3). Până în prezent nu s-au descris cazuri familiale și nu s-au raportat transmiteri de la un caz la altul, precum nici particularități geografice de răspândire a acestei maladii.( Radivoyevitch și colab., 2015).

Factorii cauzali rămân încă necunoscuți, fapt ce alimentează cercetarea prin studii aprofundate, și astăzi. Implicarea radiațiilor ionizante rămâne un factor stabilit, fapt sugerat de creșterea bruscă a incidenței LMC la supraviețuitorii bombelor atomice din Japonia. Recent au fost sugerate ca fiind implicate ca si cauze de aparitie expunerea la benzen și fumatul, dar studiile extensive nu au reușit să confirme această asociere. Cert rămâne faptul că tutunul accelerează progresarea maladiei spre criza blastică, avand o influenta negativa asupra supravietuirii pacientilor cu LMC.

Studiile asupra supraviețuitorilor exploziilor atomice au demonstrat efectul radiațiilor, estimându-se că dezvoltarea unei mase de celule LMC de 10.000/μl necesită o perioadă de 6,3 ani. Accidentul de la uzina nucleară de la Cernobîl precum și introducerea unor tehnici sensibile pentru detectarea produșilor determinați de t(9;22) ne vor putea spune mai multe despre factorii de inițiere în patogenia LMC.

Instalarea clinică a fazei cronice este, în general, insidioasă. Din acest motiv, la unii pacienți, diagnosticul se stabilește în perioada în care aceștia sunt asimptomatici, în cursul unor examene de evaluare a stării de sănătate. Alți pacienți se prezintă la consultație cu stare generală alterată, oboseală și pierdere în greutate, sau prezintă simptome ce indica creșterea volumului splinei, cum ar fi senzație de sațietate precoce și prezența durerii sau a unor formațiuni tumorale în hipocondrul stâng. Simptomele determinate de disfuncțiile granulocitare sau plachetare sunt mai rare și includ infecții, tromboze sau sângerări. (Marica, 2007).

Uneori, pacienții se prezintă cu manifestări leucostatice, provocate de leucocitoza sau trombocitoza severă, inclusiv boală vasculară ocluzivă, accidente cerebro-vasculare, infarct de miocard, tromboze venoase, priapism, tulburări de vedere și insuficiență pulmonară. Evoluția progresivă a LMC se însoțește de înrăutățirea simptomelor. Apare febră inexplicabilă, pierdere semnificativă în greutate, nevoia administrării unor doze tot mai mari de medicamente pentru a controla boala, dureri articulare și osoase, sângerare, tromboze și infecții, toate sugerând trecerea în faza accelerată sau în stadiul blastic al bolii. Prezentarea la consultație în faza accelerată a bolii sau în faza blastică a LMC reprezintă 10-15% din cazurile nou diagnosticate.

La majoritatea pacienților, examenul fizic în momentul diagnosticului arată o splenomegalie minimă sau moderată; uneori, se asociază o hepatomegalie ușoară. Persistența splenomegaliei în ciuda tratamentului este un semn clar de evoluție accelerată a bolii. Limfadenopatia și determinările leucemice extramedulare (clorom) sunt rare înainte de faza tardivă a bolii, iar atunci când sunt prezente prognosticul este prost.

În momentul diagnosticului se constată prezența unui număr crescut de leucocite, cu grade variate de imaturitate a elementelor granulocitare. De obicei, numărul de celule blastice circulante este mai mic de 5%, și mai puțin de 10% celule blastice și promielocite. Atunci când se urmăresc pacienții care nu primesc tratament, se poate observa o evoluție ciclică a valorilor leucocitare. În momentul diagnosticului, numărul de plachete este aproape totdeauna crescut, și se constată și un grad ușor de anemie normocromă, normocitară. Fosfataza alcalină din celulele LMC este caracteristic scăzută. Nivelul seric al vitaminei B12 și al proteinelor care leagă vitamina B12 este în general crescut. În momentul diagnosticului funcțiile fagocitare sunt de obicei normale, și rămân normale în perioada cronică a bolii. În stadiile tardive, apare o creștere a producției de histamină, secundară bazofiliei. Aceasta poate provoca diaree și eritem.

La stabilirea diagnosticului se constată la aproape toți pacienții cu LMC o creștere a celularității medulare, interesând mai ales liniile mieloidă și megacariocitară, și un raport mieloid/ eritroid profund alterat. Procentul de blaști medulari este în general normal sau ușor crescut. Se poate observa bazofilie, eozinofilie și monocitoză în măduva osoasă sau în sângele periferic. În timp ce fibroza colagenică a măduvei este neobișnuită la prezentare, la aproximativ jumătate dintre pacienți se constată un grad semnificativ de fibroză reticulară, confirmată prin colorații specifice. (Leslie și colab., 2012).

Debutul oligosimptomatic, spectrul variat și caracterul puțin specific al manifestărilor clinice ale LMC determină adoptarea unei tactici prudente și scrupuloase în ceea ce privește depistarea și monitorizarea cazurilor de LMC. Începând de la senzații minore de fatigabilitate, astenie, scădere ponderală și terminând cu tulburări mai accentuate, cum ar fi hepatosplenomegalia, evoluția și progresia patologiei necesită monitorizare constantă și regulată, cu evaluarea gravității, fazei de evoluție, riscului, precum și a eficienței tratamentului urmat de pacient.

Urmărirea eficienței tratamentului include nu doar evaluarea clinică ci și cea paraclinică,analizând datele hematologice de laborator, precum și datele de imagistică medicală, astfel obținând un tablou complex și multilateral al evoluției bolii.

O foarte mare atenție este acordată diagnosticului cazurilor noi de LMC, rolul principal de aici revenindu-i hemogramei, care este sugestivă pentru diagnostic, depistând modificările caracteristice LMC-urilor, la nivel sanguin. Pe langă hemograma se realizează și mielograma, pentru a exclude transformarea blastică și pentru a putea concepe și examenul citogenetic. Totusi, tehnica decisivă în confirmarea diagnosticului de LMC este reprezentată de,tehnica FISH, care permite identificarea translocației genice și anomaliilor cromozomale.

Cele mai ample forțe sunt îndreptate totuși spre tratamentul LMC, iar cele mai multe studii sunt axate anume pe evaluarea eficienței terapiei. Un tratament cu randament înalt al LMC trebuie să indeplineasca două obiective principale: controlul manifestărilor hematologice ale bolii și suprimarea tipului de clona patologica. Până în 1980, tratamentul convențional cu hidroxyurea și busulfan era cel mai eficace în tratamentul pacienților cu LMC, asigurând un bun control al bolii cu toxicitate minimă, la un preț scăzut. Interferonul este utilizat din 1982 în tratamentul LMC, dar importanța sa s-a diminuat după apariția inhibitorilor de tirozin-kinază.

În ultima perioada s-au făcut progrese mari în tratamentul LMC. Există posibilitatea eradicării celulelor leucemice prin transplantul de celule stem, iar tratamentul cu Imatinib a dus la prelungirea semnificativă a supraviețuirii, comparativ cu tratamentele anterioare.

Atingerea răspunsurilor hematologic, citogenetic, molecular, creșterea supraviețuirii și limitarea efectelor adverse medicamentoase sunt atinse mai rapid și cu o eficacitate mai mare folosind inhibitorii de tirozin-kinază ca prima linie terapeutică. Totodată, tratamentul LMC necesită optimizare, deoarece indicațiile pentru opțiunile curative existente, durata utilizării și eficacitatea acestora sunt reflectate contradictoriu în literatura mondială pe temă. (Assouline și Lipton, 2011).

2.2. Particularități fiziologice ale LMC

Leucemia mieloidă cronică reprezinta o boală clonală a celulei stem hematopoietice ce se manifestă prin expansiunea comportamentului mieloid, apare la nivelul unei celule stem ce a suferit o mutație, dobândind o anomalie moleculară specifică-cromozomul Philadelphia (Ph), primind numele orașului în care a fost descoperit, la inceputul anilor 60’. Acest cromozom conferă celulelor un avantaj de proliferare accentuată, în raport cu celulele stem normale.

Figura 2. Cromozomul Philadelphia, t(9;22)

(https://en.wikipedia.org/wiki/Chromosomal_translocation )

Cromozomul Ph apare atât la nivelul liniei granulocitare cât și la nivelul liniei monocitare, megacariocitare, eritroide, în o parte a limfocitelor B și chiar în limfocitele T (în proporție foarte mică).

Cromozomul Ph rezultă dintr-o translocație reciprocă între brațul lung al cromozomului 9 și brațul lung al cromozomului 22- t(9;22). Prin unirea genei ABL existenta pe cromozomul 9 cu regiunea BCR de pe cromozomul 22 rezulta gena de fuziune BCR/ABL, ce are ca produs final o proteină anormală cu greutate moleculară de 210 kDa-p210, cu funcție de tirozin-kinază, ce este implicată în proliferarea celulară.

Există variante ale acestei proteine-p230, fiind o variantă foarte rară, întalnită la pacienții diagnosticați cu leucemie cu neutrofile și varianta p190 întalnită la pacienții cu LAL Ph+, în care punctul de ruptură din gena BCR este diferit, rezultând o genă de fuziune a carei transcripție va duce la sinteza unei proteine de fuziune mai mici.

Cromozomul Philadelphia a fost depistat la examenul citogenetic la aproximativ 90% din pacienții diagnosticați cu LMC, la 40% dintre pacienți, gena de fuziune BCR/ABL a fost pusă în evidență prin intermediul tehnicii FISH. La 5% dintre pacienții cu LMC nu se identifică modificări citogenetice sau moleculare. La foarte puțini pacienti s-au identificat alte anomalii citogenetice.

Cromozomul Philadelphia reprezinta un marker sugestiv al LMC, dar prezența lui a fost detectată și în cazurile de leucemii acute mieloblastice, leucemii acute limfoblastice, în special în cazul adulților.

Proteina himerică de fuziune p210 si p190 are o activitate tirozin kinazică mult mai accentuată și o capacitate crescută de autofosforilare. Proteina p210 este prezentă în citoplasmă, unde fosforileaza câteva substrate, activând o serie de cascade de semnale intracelulare ce vor influența foarte mult procesele de creștere și diferențiere celulară: activarea și cooperarea cu ciclina D permite tranziția dintre fazaele G1 și S din ciclul celular, activarea cascadelor de semnalizare intracelulară activate de citokine cu rol în procesul de creștere și diferențiere, perturbarea activității unor molecule cu rol în adeziunea celulelor precursoare și progenitoare hematopoietice la structurile stromale medulare, acest lucru duce la reducerea controlului lor asupra proliferării și diferențierii celulelor hematopoietice. Această perturbare poate fi responsabilă de eliberarea prematura în sânge a progenitorilor granulocitari Ph și a precursorilor prematuri, explicându-se astfel și invadarea leucemică a altor organe.

Toate aceste mecanisme determină ca celulele ce prezintă translocația BCR/ABL să nu mai prezinte control asupra creșterii și diferențierii celulare, devenind leucemice. Pe de altă parte, prezența fuziunii bcr-abl poate induce inhibarea apoptozei în celulele leucemice, aparent prin activarea genei ras,ducând la creșterea transcripției genei myc.

Se intuieste că produsul genei de fuziune rezultat din t(9;22) ar juca un rol central în dezvoltarea inițială a LMC. Această genă-himeră este apoi transcrisă într-un ARNm hibrid bcr-abl, în care exonul 1 al abl este înlocuit de un număr variabil de exoni 5’ bcr. Ulterior vor fi produse proteinele de fuziune Bcr-Abl, P210 BCR-ABL, ce conțin domeniile terminale -NH2 ale Bcr și domeniile terminale -COOH ale Abl. (Jorge Cortes și Michael Deininger, 2007).

Potențialul oncogen al acestor proteine de fuziune Bcr-Abl a fost confirmat de capacitatea de a transforma celule-sușe hematopoietice in vitro. Există și un model experimental în care refacerea șoarecilor iradiați letal cu celule medulare infectate cu retrovirusuri purtători ai genei care codifică P210 Bcr-Abl, conduce la dezvoltarea unui sindrom mieloproliferativ cu similitudine mare cu LMC, la 50% din animalele de experiență.

O altă observație care vine în sprijinul rolului Bcr-Abl în creșterea celulelor leucemice t(9;22)-pozitive presupune utilizarea oligomerilor anti-sens specifici la nivelul joncțiunilor BCR-ABL. După expunerea la BCR-ABL anti-sens, se observă scaderea formării de colonii leucemice, în timp ce formarea de colonii macrofagice din celule medulare normale nu a prezentat modificari. Acestea oferă date coerente privind participarea genei BCR-ABL la procesul de leucemogeneză.

Concluzionand, prezenta fuziunii Bcr-Abl conduce la existenta de procese de multiplicare si expansiune anormala, necontrolabila, a celulelor progenitoare si precursoare Ph, precum si la eliberarea lod prematura in circulatie; afecteaza linia mieloida, eritroida si limfoida; conduce achizitionarea in evolutie de noi anomalii cromozomale adiționale, conduc la inducerea fazei accelerate si blastice.( Lodish și colab., 2003).

2.3 Factorii de risc și cauzele instalării LMC

Cauzele instalarii LMC nu sunt pe deplin ințelese, însă cauza principală, asa cum am zis și anterior este reprezentată de expunerea îndelungata la radiații. Argumentele sunt de ordin statistic: incidența crescută este întalnită la personalul medical din radioterapie, radiologie, care au activat la locul de munca fără protecție adecvată, la pacienții tratati cu radioterapie , precum și în populația Hiroshima și Nagasaki, dupa explozia bombei atomice.

Studiile din ultimii ani au concluzionat că există o incidență mai mare a LMC la persoanele care locuiesc mai aproape de centrale nucleare.

Până în prezent nu au fost aduse dovezi în sprijinul ideii că agenții chimici sau virusurile ar reprezenta factori favorizanți pentru apariția LMC. Cercetătorii nu au gasit nicio corelatie între apariția acestei maladii maligne și expunerea la câmpuri electromagnetice, la câmpuri de înaltă tensiune și la radonul din gospodarii. (www.esmo.org).

2.4 Manifestările clinice și fazele evolutive ale LMC

În general, LMC prezintă un debut insidios, cu o evoluție lentă. În absența tratamentului, boala este progresivă, cu o medie de supraviețuire de 3-5 ani. În tabloul clinic al LMC, se evidențiază câteva simptome:

a) splenomegalie progresivă corelată cu numarul de leucocite- faza cronică

b) sindromul anemic caracterizat prin astenie, fatigabilitate, vertij, dispnee la efort fizic, paliditate tegumentară, tahicardie, palpitații-fază cronică tardiva, de accelerare și acuta

c) sindromul hemoragic: pete și echimoze pe piele și mucoase, gingivoragii, epistaxis, hemoragii conjunctivale, gastrointestinale, meno și metroragii, hematurie-faza de accelerare și acută

d) sindromul de complicații infecțioase: febra, stomatită, otită, bronșită, pneumonie, infecții perianale, abcese, sepsis- faza acută

Evoluția bolii include trei faze: faza cronică, faza de accelerare și faza de acutizare. Faza de accelerare mai este numită și de tranziție, iar faza de acutizare se mai numește și de transformare blastică, sau criză blastică. Bibliografia de specialitate grupează uneori ultimele doua faza într-una singură, faza avansată.

2.4.1 Faza cronică

În faza cronică, numită și faza mielocitara, hiperactivitatea mielopoietică de la nivelul splinei și a măduvei osoase conduce la apariția unei hiperleucocitoze cu mielemie și la un procent important de polinucleare cu funcție conservată. Această fază este controlată de terapia convențională, fiind întalnit un procent mic de celule ce conțin cromozomul Ph. Cu trecerea timpului, nu se mai constată eficacitate terapeutică, iar după un interval de 2-6 ani, boala evoluează spre urmatoarea fază.

Mai mult de 90% din pacienți sunt diagnosticați în faza cronică. În ultima perioadă, la aproximativ 25-37% din cazuri, diagnosticarea este întâmplătoare, printr-un examen sistematic al hemogramei.

În general, simptomele apar când leucocitele depășesc valoarea de 30 000/mm3.

Debutul clinic poate fi marcat de simptome specifice, cum ar fi astenia, anorexia, senzația de jenă la nivelul hipocondrului stâng, senzație de plenitudine gastrică sau de sațietate mult mai rapidă decât în mod normal, balonări, tulburări de tranzit, alterarea stării generale, datorate anemiei, splenomegaliei, sau a unui metabolism accelerat. Uneori debutează cu complicații, criză de gută, infarct splenic, priapism, hemoragii și tromboze.

Examenul clinic evidențiază : splenomegalie (70 – 85% la momentul diagnosticului) semn clinic major, adesea monstruoasă, putând fi uneori corelată invers proporțional cu durata fazei cronice; hepatomegalia este semnalată mai rar, în 20 – 45% din cazuri; adenopatii, rar semnalate, prezența lor putând semnifica un prognostic rezervat; dureri la compresiunea sternului în dreptul spațiului V intercostal (semnul lui Craver); febră; purpură. Mai rar, la pacienții cu hiperleucocitoză majoră pot apărea manifestări de hipervâscozitate sanguină (leucostază) cu cefalee, amețeli, vertije, tinitus, tulburări ale stării de conștiență cu stare de confuzie, neuropatie centrală și periferică, tulburări de vedere datorate hemoragiilor retiniene, edemului papilar și stazei venoase, gangrena extremităților, priapism, accidente vasculare cerebrale, insuficiența cardio-respiratorie, necroză medulară.

2.4.2 Faza de accelerare

Este caracterizată prin apariția semnelor de insuficiență medulară și o mai mare rezistență la tratamentul convențional ce este administrat. Examenul clinic va pune în evidență febra, scadere în greutate, transpirații nocturne, dureri și leziuni litice osoase, hepatosplenomegalie progresivă, trombocite.

Simptomatologia este foarte greu de controlat de către tratamentul uzual folosit. Această fază poate să nu existe, să fie urmată rapid de faza terminală( în 6-18 luni).

2.4.3 Faza de acutizare sau transformare blastică

În această faza se întâlnesc atât semne de insuficiență medulară cât și semne de sindrom tumoral, cu o evoluție îndreptată spre letalitate în 3-6 luni.

Reprezintă modul constant de evoluție al bolii dupa 1-10 ani, se instalează rapid, brutal sau treptat, etalată pe mai multe luni. Aproximativ 20-40% din pacienți evoluează fără a trece prin faza de accelerare.

Principala diferență dintre faza blastică și cea cronică o constituie gradul de diferențiere al celulelor precursoare mieloide. În faza cronică, mieloblaștii seamană cu cei normali, nu reacționează la reacțiile citochimice cu PAS, negru sudan sau peroxidază. În faza blastică, celulele au aspect patologic și reacții pozitive, apar noi anomalii cromozomale ce pot fi detectate în celulele din măduvă, din tumori extramedulare sau splină.

În urma examenului clinic se depistează anorexie, febră, transpirații, prurit. Instalarea insuficienței medulare poate avea drept consecință apariția de complicații infecțioase, hemoragii, manifestări neurologice etc.

2.4.4 Investigațiile paraclinice utilizate în LMC

Este indubitabil rolul semnelor și simptomelor în evaluarea LMC, însă valoarea lor rămâne una sugestivă în orientarea diagnosticului. În confirmarea patologiei sunt de neînlocuit investigațiile paraclinice. În funcție de rezultatele acestor investigații putem stabili fazele evolutive ale LMC.(Dingli și colab., 2010)

În faza cronică

Hemograma este sugestivă pentru diagnostic. În primul rând se evidențiază hiperleucocitoza (GA 20.000-200.000/mm3; uneori sub 12.000/mm3 sau peste 500.000/mm3).

Analiza frotiului de sânge periferic pune în evidență mielemie importantă, cu prezența precursorilor mieloizi în toate stadiile de maturație: mieloblaști (sub 10%), promielocite, mielocite, metamielocite și nesegmentate, neutrofile segmentate (30-40%). Bazofilele apar de obicei crescute (dar mai mult de 7% în mai puțin de 10-15% din cazuri; creșteri spre 15-20 % survin în faza accelerată). Eozinofilele sunt crescute (dar în mai mică măsură decât bazofilele).

Anemia este normocitară, normocromă . (Trombocitoza (500.000-600.000/mm3, rar mai importantă) apare la 35-50% dintre pacienți; se asociază adesea un deficit funcțional al trombocitelor. în faza cronică însă, când se constată toate etapele de maturație ale granulocitului în sângele periferic, cu eritroblaști și chiar cu nuclei de megakariocite, frotiul de sânge periferic se poate confunda cu măduva hematopoietică.

Mielograma nu este necesară pentru a confirma diagnosticul, dar efectuarea ei ajută la excluderea transformarii blastică și la examenul citogenetic. Se depistează o măduvă hiperplazică, cu o rata de celule de 75-90% și cu o scadere a procentului de adipocite medulare. Granulocitele, în toate etapele de maturație, sunt net predominante (80-90%), cu o deviere levogiră a curbei de maturație, mult mai evidentă ca în periferie. Sunt prezente un număr crescut de eozinofile și bazofile.

Se poate remarca prin investigațiile făcute, o hiperplazie megakariocitară (celule mici, hipolobulate) și modificări displazice pe toate liniile celulare.

Uneori se întâlnesc nuclei megakariocitari și în sângele periferic. În măduva (și splina) a 10-20% dintre pacienți se evidențiază celule ce seamănă cu celulele Gaucher (fagocite mononucleare care au fagocitat sfingolipide leucocitare eliberate în exces de granulocitele leucemice). Biopsia medulară confirmă hiperplazia țesutului hematopoietic cu dispariția completă a spațiilor grase medulare și prezența fibrelor de reticulină în proporție normală sau ușor crescută.

Depistarea translocației și a transcriptului BCR/ABL este examenul decisiv pentru diagnosticul pozitiv și diferențial al LMC, și în monitorizarea răspunsului terapeutic. Aici se includ:

a. analiza citogenetică convențională – studiul cariotipului celulelor tumorale, cu evidențierea crs Ph1;

b. fluorescența cu hibridizare în situ (FISH) și polymerase chain reaction (PCR) – aceste tehnici permit efectuarea de studii în biologie moleculară, studiul cariotipului, pentru confirmarea translocației la pacienții Ph1+, și evidențierea ei la cei Ph1–;

c. revers-transcriptaza–PCR (RT-PCR) și PCR cantitativă (QT-PCR) – pot evidenția trancriptul BCR/ABL în sângele periferic.

Alte criterii sugestive importante:

1. fosfataza alcalină leucocitară (FAL) are o valoare scăzută, chiar absentă, în 90% din cazuri; în caz de infecții, procese inflamatorii, sarcină, evoluția spre faza acutizată, , FAL revine la normal sau crește la niveluri patologice. Scăderea scorului FAL nu este un indicator pentru LMC, fiind intalnita și în hemoglobinuria paroxistică nocturnă, hipofosfatasia congenitală, in unele cazuri de mielofibroză idiopatică, sindrom mielodisplazic și LAM;

2. creșterea importantă a concentrației serice a vitaminei B12 și a lizozimului seric;

3. trombopatie dobândită, cu alungirea TS și scăderea adezivității și agregabilității plachetare,

4. creșterea uricemiei și uricuriei, creșterea LDH;

5. creșterea histaminemiei și a nivelului metaboliților urinari ai histaminei;

6. hiperpotasemie

7. hipercalcemie

8. studiul în vitro al funcțiilor granulocitare ce pun in evidență adezivitate scăzută la stroma medulară, încetinire a migrării extravasculare, scaderea activităților de fagocitoză și bactericidie, reducerea conținutului în lactoferină și lizozim. Totuși, la pacienții în faza cronică a LMC riscul infecțios nu este crescut (spre deosebire de cei cu leucemie limfatică cronică)

În faza accelerată

Hemograma creionează hiperleucocitoză progresivă, prezentând și anomalii ale celorlalte linii de celule (anemie progresivă, trombocitopenie/trombocitoză), dar cu persistența mielemiei; creșterea procentului de eozinofile și bazofile peste 20%; procent de blaști crescut în sânge și măduvă, fără a depăși 20%; fibroză medulară mai accentuată.

Examenul cariotipului evidențiază apariția de anomalii cromozomale suplimentare pe lângă crs Ph1: trisomia 8, izocromozomul 17, un al doilea crs Ph etc.

În faza de acutizare (criza blastică)

Hemograma evidențiază eozinofilele și, mai ales bazofilele (peste 20%), ce prezintă un progres numeric în sângele periferic – bazofilia extremă se poate asocia cu hiperaciditate și ulcer peptic; blaști cu sau fără promielocite mai mult de 30% în măduvă sau în sângele periferic; creșterea fibrozei medulare.

Aproximativ 70% dintre pacienți au blaști de linie mieloidă (Mo-M2, M4-M7), 20% au blaști de linie limfoidă B, iar restul de 10% au blaști de lineaj mixt, mieloid și limfoid. De asemenea, se depistează anomalii citogenetice suplimentare crs Ph1 – 70-80 % dintre pacienții în faza blastică prezinta hiperdiploidie (68%), pseudodiploidie (23%), hipodiploidie (8%), trisomie 8 (50%), duplicare Ph1 (40%), izocromosom 17 (25%), pierderea crs Y (12%). (Cortes și Deininger, 2007).

CAPITOLUL 3

MODALITĂȚI DE TRATAMENT AL LMC

Tratamentul leucemiei mieloide cronice în faza cronică și de accelerare fără complicații poate fi efectuat în condiții de ambulator sau ale staționarului de zi. Tratamentul leucemiei mieloide cronice în faza de accelerare cu complicații (hemoragice, trombotice, infecțioase) și în faza acută se efectuează în secțiile specializate de hematologie. Luând în considerație concepția clonală de patogenie a hemoblastozelor, ca tratament de elecție a leucemiei mieloide cronice se consideră chimio- sau / și imunoterapia, urmate de transplant medular alogeneic în cazurile de ineficacitate a lor.

Scopurile principale ale tratamentului leucemiei mieloide cronice înrolează reducerea proliferării celulelor mieloide și micșorarea dimensiunilor splinei, obținerea remisiunii clinico-hematologice complete și remisiunii citogenetice majore sau complete, preîntâmpinarea recidivelor, reabilitarea fizică a bolnavilor și reîncadrarea lor în viața socială. (Joshua și colab., 2014).

3.1. Modalități terapeutice utilizate la ora actuală:

Tratamentul convențional

Până în 1980, hidroxyurea și busulfan au reprezentat agenții cei mai eficace în tratamentul pacienților cu LMC, determinand un bun control al bolii (remisiuni hematologice la >70% dintre pacienți în faza cronică a bolii), cu toxicitate minimă, la un preț scăzut. Aceste tipuri de tratament nu produc remisiune citogenetică semnificativă și de aceea sunt considerate paliative. Tratamentul cu hidroxyuree este de preferat datorită capacitatii de a prelungiri durata fazei cronice și a supraviețuirii, și a unei toxicități mai reduse.

Hidroxyurea (HyU/Hydrea) este recomandata în prima fază, imediat după diagnostic, ca prim tratament citoreductor. Doza de HyU administrata este de 1,5-3g/zi. Se adaugă Allopurinol 600 mg prima zi, apoi 300mg/zi.

Acest tratament se va continua până la obținerea scăderii leucocitelor <10.000/mmc și până la inceperea tratamentului cu inhibitori de tirozin-kinaze (ITK). În general se consideră că nu reprezinta o problemă administrarea tratamentului cu Hidroxyuree până la 3-6 luni, înaintea începerii tratamentului cu ITK. Se indică în special în formele cu hiperleucocitoză, sau la pacienții în vârstă, refractari sau intoleranți la ITK, neeligibili pentru transplant. Doza de atac este de 50 mg/kg/zi; în priapism, infarct splenic: 80-100 mg/kg/zi; întreținere: 15-30 mg/zi sau 30-80 mg/kg x 2/săpt

Busulfanul (Myleran) este un agent alchilant ce face parte din categoria esterilor sulfonici. Este activ asupra celulelor stem primitive – mecanismul de acțiune implică legarea încrucișată a lanțurilor de ADN, ceea ce poate interfera cu creșterea celulelor normale și neoplazice. Acest medicament a ieșit din uz, datorită mielosupresiei severe și de durata pe care o determină, cu posibilitatea instalării fibrozei retroperitoneale și pulmonare.

b) Inhibitorii tirozinkinazei (ITK)

Imatinib mesylate (Gleevec) este un agent terapeutic e are ca acțiune specifică inhibarea tirozin-kinazei BCR/ABL, și unii dintre receptorii tirozin-kinază din subgrupul III și receptorul factorului celulelor stem, ceea ce îl face un agent terapeutic activ în LMC și în tumorile gastrointestinale stromale (TGIS). Imatinibul este un inhibitor de tirozin-kinază de generația I, din clasa 2-fenilaminopirimidine, ce acționează prin blocarea legării ATP pe tirozin-kinaza BCR/ABL, inhibând astfel acțiunea enzimei. În absența activității tirozin-kinazice ale BCR/ABL, substratele nu mai pot suferi procesul de fosforilare, ceea ce determină întreruperea evenimentelor ulterioare și, deci, a proliferării aberante.

Tratamentul cu Imatinib este net superior tratamentelor de primă linie, comparativ cu asocierea de interferon cu ara-C, prezentand o rată a răspunsului citogenetic major la verificarea de 1 an, de 83% vs. 20%. S-a constatat de asemenea că tratamentul cu Imatinib conduce la o rata scăzută a progresiei pacienților către faza blastică, producand un răspuns citogenetic complet și răspuns molecular major la un procent important de pacienți în fază cronică (69% și respectiv 40%) după 12 luni de tratament.

ITK de generația II se prescriu de regulă in momentul în care pacientii eșueaza din punct de vedere terapeutic tratamentului cu Imatinib. Dasatinibul (Sprycell) este o tiazolecarboxamidă, diferit fata de imatinib.

Dasatinib este un inhibitor de tirozin kinaza de 325 de ori mai potent al fuziunii BCR-ABL in vitro comparativ cu Imatinib, prezinta un avantaj foarte important, anume avantajul ca se poate lega atât de forma activă conformațională a tirozin-kinazei, cât și de forma inactivă. Este activ în toate mutațiile asociate cu rezistență la Imatinib, exceptând T3151. Dasatinib este un inhibitor multi-kinazic și inhibă și alte kinaze, cum ar fi familia Src kinazelor (SFK) și factorul de creștere β derivat din plachete (PDGFR-B). Studiile în vitro care evaluează rolul kinazelor SRC în rezistența la Imatinib au sugerat că și kinazele Src activate au un rol în liniile celulare non-mutante rezistente la Imatinib.

Dasatinibul poate trece bariera hematoencefalică și poate fi util pacienților Ph+ care au afectat sistemul nervos central. Este indicat în prezent în special ca tratament de linia 2, în caz de intoleranță/răspuns suboptim sau eșec la Imatinib. Doza optimă este de 100 mg/zi. Poate fi indicat și ca tratament de linia 1 (date fiind studiile care arată superioritatea față de Imatinib)

Nilotinibul (Tasigna) este o aminopirimidină derivată structural din Imatinib. Ca și Imatinibul, Nilotinib se leagă de domeniul kinazic ABL în conformația inactivă, dar cu potență de aproximativ 25 de ori mai crescută față de acesta. S-a arătat eficiența Nilotinibului împotriva a 32 din 33 de mutații găsite în domeniul kinazic BCR-ABL. Singura mutație care nu e afectată de Nilotinib este, ca și în cazul Dasatinib, T315I. Este indicat în cazurile de intoleranță la Imatinib sau rezistență la acesta, doza uzuală fiind, la fel ca și în cazul Imatinibului, de 400 mg/zi.

Tratamentul cu inhibitori de tirozin-kinază a revoluționat tratamentul pacienților cu LMC. (Vargas și colab,, 2013).

Imunoterapia

Interferonul (IFN) 3-5 MU/m2/zi este utilizat din 1982 în tratamentul LMC, insa după apariția Imatinib și a altor inhibitori de tirozin-kinază nu mai este utilizat ca si tratament.

Acest medicament reduce proliferarea celulelor leucemice prin stimularea sistemului imunitar. Se pare că acționează mai bine atunci cand este asociat cu Citarabină (ara-C) 15 mg/m2/zi, pe o perioada de 7 zile, în cicluri de cate 28 zile, sau în doze de 10 mg/zi continuu. Aceast rezultat este datorat faptului că ara-C acționează asupra celulelor în fază S și se pare că este citotoxică numai pe progenitorii leucemici, în timp ce IFN este toxic pe celulele Ph1+ și protejează celulele stem normale, blocându-le în faza G0-G1.

Grefa de celule stem hematopoietice

Grefa alogenică reprezintă la ora actuală singura modalitate terapeutică cu potențial curativ al LMC. Sunt recunoscuți doi factori importanți ce pot limita grefa: vârsta pacientului și existența unui donor potențial. În general, grefa este indicată la pacienții sub 40-50 ani, cu donor compatibil; totuși, poate fi propusă și la pacienți de 50-60 ani, fără tare viscerale majore.

Rezultatele sunt influențate de vârsta pacientului, faza bolii, intervalul de timp de la diagnostic până la realizarea grefei și histocompatibilitate donor-primitor, genul donorului față de cel al primitorului, criterii esentiale ce trebuie indeplinite pentru o mai buna reactie a complexului imun de histocompatibilitate . Cele mai bune rezultate se obțin la pacienții sub 20 ani, aflați în faza cronică a bolii, în primul an de la diagnostic.

Rata recăderilor postgrefă prezinta un procent de 10-20% în faza cronică,de 25% în faza accelerată și de până la 60% în faza blastică, majoritatea cazurilor apărând în primii 2-3 ani de la grefă. În cazul recăderii se poate recurge la o nouă alogrefă, sau doar la injectarea de limfocite T prelevate de la donor, care s-a constatat că pot induce o reacție “grefă-contra-leucemie” determinand distrugerea celulelor monoclonale. Rezultatul obtinut este superior pentru recăderea citogenetică față de recăderea hematologică. La cei grefați se impune neaparat o supraveghere citogenetică (prin tehnici de biologie moleculară) periodică: la 3 luni în primul an, apoi la 6 luni în următorii 2 ani, iar ulterior anual.

Grefa autologă. Observațiile clinice și experimentale indică persistența de celule stem hematopoietice normale (Ph1–) în măduva și chiar sângele periferic al pacienților cu LMC. Precursorii hematopoietici normali poseda un avantaj de tip proliferativ față de cei leucemici. Aceste constatari au condus la realizarea autogrefei la pacienții cu LMC, fără donori potențiali.

Șansa de a găsi progenitori hematopoietici normali este mult mai mare la debutul bolii. Aceasta impune recoltarea lor cât mai repede din momentul diagnosticului.

Autogrefa poate fi facuta în perioadele de transformare blastică, permitand reinstalarea unei faze cronice, cu durată variabilă, sau în fază cronică, cu celule prelevate în momentul diagnosticului, la cei cu un scor prognostic crescut și fără a avea un donator potențial. (Franck și colab., 2013).

e) Alte considerații terapeutice

Splenectomia are rare indicații în LMC. De obicei este indicată atunci cand apar complicații splenice. Poate fi indicată si în situațiile de menținere a splenomegaliei în condițiile unui tratament optim, sau suboptim datorită anemiei si/sau trombocitopeniei. În aceste ultime situații pot fi însă eficace câteva ședințe de iradiere splenică.

Leukafereza. Se utilizează un separator de celule pentru a determina scăderea rapidă a leucocitelor atunci când numărul lor se situează peste 100.000/mmc și pentru ameliorarea sindromului de hipervâscozitate. Este o terapie paliativă, de urgență, care necesită a fi completată cu chimioterapia citostatica.

Trombocitafereza este indicată în trombocitoza extremă în combinație cu hidroxyuree.(Iordan, 2004).

f) Terapii inovative și experimentale

Inhibitorii de farnesiltransferază inhibă multiplicarea celulelor BCR/ABL pozitive, chiar și a celor ce sunt rezistente la Imatinib, dar studiile indică răspunsuri slabe la monoterapia cu acești agenți. (Talpaz M și colab., 2014).

Homoharringtonină este o substanță alcaloidă (derivat din Cephalotaxus fortuneii), ce a fost utilizată pentru prima dată de medicii chinezi. Este administrata în doze de 2.5 mg/m2/zi i.v. (perfuzie continuă), timp de 14 zile ca tratament inductor, apoi 7 zile pe lună, singură sau în asociere cu ara-C. (Yaoyu Chen, 2014).

Decitabina (DAC, 5-aza-2’-deoxicitidina) reprezinta un analog de citidină care are un efect crescut hipometilant asupra ADN-ului, prin legarea covalentă la ADN-metiltransferază. Hipermetilarea ADN de la nivelul celulelor tumorale este asociata cu progresia și agresivitatea acesteia, și a fost semnalată la >50% dintre pacienții cu LMC. Medicamentul este în studiu și ar putea fi util mai ales în fazele tardive ale bolii.( Hagop M. Kantarjian și colab., 2003).

PARTEA EXPERIMENTALĂ

Folosirea metodelor de citogenetică moleculară în diagnosticul clinic a devenit, în ultima perioadă o necesitate, realizându-se cu ajutorul acestor metode tabloul complet privind cauzele, tratamentul, și nu în ultimul rând monitorizarea pacienților cu leucemie mieloidă cronică (LMC).

Lucrarea de fața își propune stabilirea eficienței utilizării tehnicii FISH în diagnosticul LMC.

Pentru atingerea acestui scop au fost stabilite mai multe obiective.

– Stabilirea protocolului de lucru pentru a obține culturi celulare de o bună calitate, atât din sange periferic cât și din maduvă osoasă;

– Efectuarea testelor FISH

– Compararea rezultatelor FISH de la probe provenite din măduvă osoasă și sânge periferic;

-Evidențierea avantajelor și a dezavantajelor tehnicii FISH în diagnosticul leucemiilor mieloide cronice.

Cercetările ale căror rezultate sunt prezentate în această teză de dizertație, au fost realizate în Laboratorul de Citogenetică al Institutului Clinic Fundeni, din București, sub directa îndrumare a Doamnei Doctor Cerasela Jardan – medic, specialist în diagnosticul citogenetic al bolilor hematologice.

.

CAPITOLUL 4

MATERIALE ȘI METODE

4.1 Lotul de pacienți

Lotul ce a fost luat în studiu a fost alcătuit din 144 de pacienți de la care au fost recoltate probe biologice. Dintre acești pacienți, 20 au prezentat LMC în diferite faze de evoluție ( fază cronică, accelerată sau criza blastică), pacienții având vârsta medie de 45 de ani, internați în Institutul Clinic Fundeni, secția de Hematologie, în perioada martie 2015- mai 2015.

Pacienții care au alcatuit lotul de studiu, au fost selectați dintr-un număr de 168 de cazuri cu diverse neoplazii hematologice. Ei au fost atent investigați clinic și hematologic, au fost supuși examenului clinic pentru a observa simptomele caracteristice bolii.

Pacienților din lotul de studiu li s-a efectuat analiza hemoleucogramei (HLG), analiză ce presupune dozarea hemoglobinei, determinarea hematocritului, a numărului de trombocite, leucocite și analiza frotiului făcut din sânge periferic, dar nu în ultimul rând și efectuarea formulei leucocitare.

S-a realizat, de asemenea, puncție aspirativă a măduvei osoase, în condiții de asepsie, din creasta iliacă sau stern. Din măduva aspirată s-au realizat examene de citologie, stabilindu-se celularitatea medulară pentru o mai bună orientare a diagnosticului și a stabilirii fazei de evoluție în LMC, precum și examen citogenetic pentru a detecta prezența cromozomului Philadelphia (Ph) și a altor anomalii citogenetice aditionale (ACA).

Pacienții au fost informați despre investigațiile la care vor fi supuși în vederea stabilirii corecte a diagnosticului. Aceștia și-au dat acordul în cunoștiintă de cauză, pentru efectuarea respectivelor investigații, semnând consimțământul.

Toți pacienții au fost investigati la debut prin tehnica FISH, pentru a detecta fuziunea BCR/ABL, pentru a evidenția translocațiile criptice, dar și pentru a identifica delețiile de la nivelul bratului q al cromozomului 9 din regiunea BCR/ABL.

4.2 Material biologic

Analiza citogenetică din bolile hematologice maligne se realizează pe preparate citologice reprezentate de celule ce se divid spontan. Țesutul ideal pentru un studiu la pacienții cu leucemie mieloidă cronică este reprezentat de măduva osoasă. Se poate utiliza și sânge venos periferic.

Măduva osoasă : sunt necesari 1-3 ml de măduva osoasă aspirată în condiții sterile în seringă heparinizată sau pe vacutainer prevăzut cu heparină sodică. Proba din măduva a fost transportată fără mediu de cultura ( maduvă transportată rapid) la temperatura camerei, sau în cazul în care transportul este tardiv, atunci se va folosi mediu de cultură (RPMI 1640 + 5% ser fetal bovin (SFB)+ 1% penicilină(pen)/ streptomicină (strep), fiind interzis transportul ce durează mai mult de 24 de ore , precum și congelarea probei.

Sânge periferic: sunt necesari 3-5 ml de sânge periferic recoltat steril, pe seringă heparinizată sau in vacutainer cu heparină sodică.

4.3 Metode de lucru utilizate

În continuare, vor fi prezentate metodele utilizate în Laboratorul de Citogenetică al Institutului Clinic Fundeni, din București, privind: obținerea, din proba de aspirat medular sau din cea de sânge periferic, a unor culturi celulare; prelucrarea acestor culturi și obținerea preparatelor citogenetice; marcarea specifica tehnicii FISH (Fluorochrome In Situ Hybridization).

4.3.1 Estimarea numărului de celule din proba de măduvă osoasă primită

Înainte de inițierea culturilor celulare, este necesară estimarea numărului de celule prezente în probă (sub forma de suspensie de celule) recoltată de la pacient.

Leucocitele din măduva osoasă trebuie cultivate pornind de la o densitate (la inițierea culturii) de 1x 106 celule/ml. Pentru a putea face această estimare se determină numărul total de celule utilizând un hemocitometru.

S-au preluat 10 μl de măduvă osoasă și s-au pus într-un tub Eppendorf ce a conținut 90 μl de acid acetic glacial 3%. S-a mixat și s-au preluat 10 μl.

Cu o foarte mare atenție cei 10 μl s-au pus prin capilaritate în camera Turk, astfel încât lichidul să fie împrăștiat uniform pe suprafața camerei.

S-a așezat camera la microscop și cu ajutorul obiectivului de 10X s-a captat imaginea grilei la nivelul căreia s-au numărat celulele din 4 pătrate

Numărul final de celule/ml este reprezentat de formula (numar total de celule numărate / 4x 10 6. Daca numărul de celule este mare, atunci este necesară efectuarea unei diluții la punerea în cultură, dacă numărul este mic, trebuie concentrat.

S-a suspendat cantitatea de măduvă osoasă în 5 ml de mediu RPMI 1640 cu L-glutamină (fara HEPES sau piruvat de sodiu)pentru a spăla măduva osoasă. S-a agitat ușor și s-a centrifugat 10 min la 1500 rpm.

S-a aruncat supernatantul și s-au resuspendat celulele în mediul de cultură.

Au fost inițiate culturile celulare.

Măduva osoasă provenită de la pacienții cu LMC în faza cronică, prezintă o creștere a numărului de celule mieloide tinere, inclusiv a celor blastice. Durata unui ciclu celular în cazul celulelor maligne variază foarte mult de la pacient la pacient, putând dura între 16 și 29 de ore. Mediul de cultură și tipul de cultură trebuie să îndeplinească anumite caracteristici, pentru a obține un index mitotic mare în doar 24 h, fără a induce anomalii citogenetice de cultură.

4.3.2 Tipuri de culturi celulare folosite în diagnosticul LMC

Cultura de tip “A”, (ONC), cultură peste noapte (Overnight culture)

Materiale necesare:

1. RPMI 1640 în care s-au adaugat 1% L-glutamina și 24 mM Hepes (GIBCO, Invitrogen), suplimentat cu ser fetal bovin (SFB) 20% (GIBCO, Invitrogen) și 1 ml de penicilină/streptomicină.

2. Colcemid: 10 mg/ml (GIBCO, Invitrogen).

Mod de lucru:

La sfârșitul zilei, s-a adaugat în cultură colcemid, apoi s-a incubat peste noapte și s-au sacrificat a doua zi dimineața. Colcemidul inhibă formarea fusului de diviziune și cu cât este lăsat mai mult în cultura, cu atât vor fi prezente mai multe metafaze, însa cromozomii vor fi foarte scurți. Acest tip de cultură este folosit deoarece se obține un index mitotic mare, cultura fiind denumită și cultură hipermetafazică.

S-a lucrat în hota sterilă, s-au etichetat tuburile de cultură cu numărul de identificare al laboratorului, numele pacientului și tipul culturii celulare, în acest caz ONC.

S-a preluat cantitatea de maduvă stabilită ca număr de celule și s-au adaugat 10 ml de RPMI suplimentat cu ser fetal bovin (SFB) (GIBCO Invitrogen), 1 ml de L-glutamină, 1 ml de penicilină/streptomicină și 25 μl de colcemid, în tubul de cultura ONC.

Tuburile au fost incubate la 37 °C în incubator, peste noapte.

A doua zi dimineața, cultura celulara s-a prelucrat în vederea obținerii preparatelor citogenetice.

Culturi cu sincronizarea ciclului celular (SYN, cultura “B”)

Materiale necesare:

1.Mediu RPMI 1640 și 25 mM HEPES (GIBCO, Invitrogen), în care s-au adaugat 20% ser fetal bovin (SFB) (GIBCO, Invitrogen), 1 % de L-glutamină si 1 ml de penicilină/ streptomicină.

2. 5-Fluoro-2-Deoxiuridină (FdU): s-au dizolvat 25 mg FdU (Sigma-ALdrich) în 10 ml H20 bidistilată (100 mM). Soluția s-a diluat 1:10 cu H2O bidistilată (10 MM soluție stoc), apoi diluată 1:100 ( 10 mM soluție de lucru), stocată în tuburi Eppendorf câte 1 ml la – 20°C pentru 3 ani. Soluția de lucru este stocată timp de o lună la 4 °C.

3.Uridină: s-a dizolvat 100 mg uridină (Sigma-Aldrich) în 10 ml dd H2O ( 40 mM soluție stoc), apoi s-a diluat 1:100 ( 400 mM soluție de lucru), stocată în tuburi Eppendorf de câte 1 ml, timp de 2 ani, la -20 °C. Soluția de lucru este stocată la 4 °C timp de o lună.

4. Timidină: se dizolvă 24.22 mg thimidină (Sigma-Aldirch) în 100 ml dd H2O ( 1 mM soluție de lucru), stocată în tuburi Eppendorf câte 1 ml la -20 °C, timp de un an. Soluția de lucru este stocată la 4 °C, timp de o luna.

5. Colcemid: 10 mg/ ml (GIBCO, Invitrogen).

Mod de lucru:

Cel mai probabil, culturile celulare nu prezintă diviziuni sincronizate, astfel fiind necesară sincronizarea temporară prin blocarea ciclului celular în faza G1. Acest tip de cultură a fost introdus în vederea obținerii unor metafaze care să prezinte cromozomi lungi, datorită expunerii unui timp scurt la colcemid( o oră), însă numărul de metafaze scade considerabil, putând chiar sa absenteze uneori.

Durata ciclului mitotic la celulele leucemice este foarte variabilă și cu o expunere la colcemid de scurtă durată, din această cauză metafazele putând să nu existe. Agenții folosiți în culturile cu sincronizarea ciclului celular sunt: uridina și fluorodeoxiuridina, precum și un exces de timidină.

S-a preluat cantitatea de maduvă osoasă stabilită după numărarea celulelor în camera Turk și s-au adaugat peste aceasta 10 ml de RPMI 1640 cu L-glutamina și 25 mM HEPES (GIBCO, Invitrogen), care s-a suplimentat apoi cu 20% ser fetal bovin(SFB) (GIBCO, Invitrogen), 1 ml de L-glutamină și 1 ml de penicilină/streptomicină, în tubul de cultura SYN, și se incubează la 37 °C.

S-au adaugat agenții de blocare ai replicării ADN, la ora 15:00 dupa amiază. S-au adaugat 50 μl de FdU și 50μl de Uridină. Tuburile de cultură au fost repuse imediat în incubator, la aceeași temperatură, pentru 17 ore.

A doua zi dimineața s-a îndepartat efectul blocant prin adaugarea a 100 μl Timidina și s-au incubat probele la 37°C pentru 5 ore.

Dupa 5ore s-a adaugat 50 μl de colcemid și s-au incubat 1 ora înainte de procesarea culturii.

4.3.3. Procesarea culturilor

Soluții necesare:

Soluție hipotonă: 74 mM KCl în dd H2O, soluția de lucru s-a stocat timp de câteva săptâmani la 37 °C.

Fixator: 3:1 metanol/ acid acetic glacial. S-a preparat proaspăt pentru fiecare fixare.

Protocol de lucru:

Probele au fost centrifugate 10 minute la 1500 rpm, s-a aruncat supernatantul până la 1 ml, iar sedimentul celular rămas a fost resuspendat cu ajutorul unei pipete sterile Pasteur.

S-au adaugat până la 10 ml soluție hipotonă, s-a resuspendat cu ajutorul pipetei, tuburile au fost apoi incubate 10min la 37 °C. S-au preparat 30ml fixator pentru fiecare cultură și s-au lasă în hotă la temperatura camerei.

Probele au fost din nou centrifugate 10 minute la 1500 rpm, s-a aruncat supernatantul până la 1ml, s-a resuspendat sedimentul celular cu ajutorul pipetei Pasteur și apoi s-au omogenizat tot cu ajutorul pipetei, apoi s-a adaugat picătură cu picătură (5 picături), fixator, s-au agitat și apoi s-a adaugat în continuare fixator până la volumul de 10 ml.

S-au centrifugat probele 10min la 1500 rpm și s-a repetat pasul 3.

În cazul culturilor cu sincronizare de ciclu celular, lamele ce urmează să fie analizate se picură în aceeasi zi. La culturile over night, lamele se picură a doua zi după ce tubul a stat peste noapte la congelator la -20°C.

Prepararea lamelor:

Materiale necesare:

Fixator 3:1 metanol/ acid acetic glacial

Lame de microscop: lamele au fost degresate și clătite cu apă, apoi puse în cutii de sticlă în alcool etilic 100% la care s-au adaugat 2 picături de HCl (1 N). Înainte de utilizare lamele s-au scurs și au fost sterse cu șervețele uscate.

Protocol de lucru

Celulele au fost centrifugate imediat după ce s-a făcut ultima fixare, 10 minute la 1500 rpm. S-a aruncat supernatantul și s-a adaugat fixator proaspăt astfel încât suspensia de celule finala a aratat ca un lichid dens, matefiat. S-a resuspendat cu pipeta Pasteur.

Au fost scris lamele după ce s-au spălat și șters în prealabil, s-au trecut datele de identificare ale pacientului.

S-a preluat o cantitate foarte mică de produs în pipeta Pasteur și s-au picurat pe lamă câteva picături care să acopere suprafața lamei.

Lama a fost lăsată să se usuce în hotă la temperatura camerei, apoi a fost pusă pe plită la 60°C. Lama a fost colorată și analizată la microscop. S-a analizat distribuția celulelor, în cazul în care au fost prea dense s-a mai adaugat fixator, daca sunt prea rare atunci se centrifughează 10 min la 1500 rpm și se resuspendă într-un volum mai mic de fixator.

Au fost picurate câte 3 lame din fiecare cultură, pentru fiecare pacient, care ulterior au fost analizate.

4.3.5 Tehnica FISH (fluorescence in situ hybridization)

Citogenetica moleculară descrie analiza modificărilor genomice utilizând ca tehnică de bază hibridizarea in situ, sau tehnica FISH. Tehnica poate fi aplicată pe metafaze, dar și pe nuclei interfazici.

Aceasta permite analiza anomaliilor genomice pe nuclei interfazici, având un avantaj colosal față de citogenetica clasică, al carei mare dezavantaj este reprezentat de lipsa metafazelor la pacienții cu leucemie.

Lamele obținute inițial sunt tratate în prealabil cu proteaze pentru a îndeparta proteinele ce pot impiedica accesul la regiunea de cromozom analizată, o astfel de protează este și pepsina.

Ulterior, ADN-ul nuclear este denaturat și apoi are loc hibridizarea cu sonda marcată fluorescent. Semnalele sunt apoi analizate cu ajutorul unui microscop de fluorescență.

Evaluarea pacienților cu LMC prin citogenetică clasică și FISH variază în funcție de stadiul bolii și de tratament. La diagnostic este importantă evaluarea pacienților prin ambele metode.

Utilizarea tehnicii FISH pune în evidență prezența genei de fuziune BCR-ABL, sau prezența de deleții genomice. Tehnica FISH are un rol foarte important în elucidarea unor anomalii ce nu pot fi detectate prin citogenetică clasică( translocații criptice, deleții submicroscopice, rearanjamente cromozomale complexe).

În ultimul timp, se urmărește introducerea tehnicii FISH ca tehnică de monitorizare a pacienților.

Există foarte multe tipuri de sonde comerciale sau “home-made” ce sunt aplicate pentru gena de fuziune BCR-ABL, dar sensibilitatea cea mai mare o au cele dublu colorate, dublu-fuzionate, ce pun în evidență semnale atât pentru gena de fuziune BCR-ABL, cât și pentru gena ABL-BCR. Aceste sonde includ sonda BCR marcată cu verde (V) și sonda ABL marcată cu roșu(R). Fuziunea celor doua gene BCR și ABL este reprezentată de suprapunerea celor doua culori formând culoarea galbenă( F-fusion). O celulă normală este reprezentată prin 2 semnale roșii și 2 verzi (2R2V), iar acele celule ce prezintă translocație sunt reprezentate de un semnal roșu, unul verde și 2 semnale galbene(1R1V2F).

Analiza citogenetică conventională este considerată foarte valoroasă în monitorizarea pacienților cu LMC, prezintă foarte multe avantaje în depistarea anomaliilor citogenetice complexe și a anomaliilor citogenetice adiționale cu rol asupra prognosticului pacienților, însă acestea pot fi depistate doar daca sunt prezente în procent de 5-10 %.

O mare parte din pacienți prezintă cromozomul Philadelphia detectabil, dar în doar 5% din cazuri aceștia prezintă și o inserție submicroscopica nedetectabilă prin analiza citogenetică standard ci, numai prin tehnica FISH sau PCR.

Această tehnică are sensibilitatea scăzută din cauza faptului că sunt analizate 20 sau 50 metafaze per pacient. Există de asemenea și o mare probabilitate să nu se obțină metafaze.

O altă limitare a acestei tehnici constă în faptul că este laborioasă, consumă foarte mult timp și necesită maduvă osoasă obținută printr-o intervenție destul de neplacută pentru pacient.

Tehnica FISH este foarte importantă în urmărirea pacienților cu LMC, neprezentând multe din problemele pe care le ridică citogenetica conventională. Avantajul acestei tehnici este că poate analiza de 10 ori mai multe celule decât citogenetica clasică, permite detectarea genei de fuziune la pacienții care prezintă cromozom Philadelphia negativ la examenul citogenetic.

În plus, tehnica FISH permite și detectarea rapida a unor rearanjamente cromozomale în metafaze și nuclei interfazici, în ultimul caz existând avantajul că se poate evita cultura celulară. Această tehnică permite și examinarea celulelor din sânge periferic atunci când maduva osoasă nu poate fi prelevată. Totuși, tehnica FISH care utilizează sânge periferic are o sensibilitate limitată, deoarcere majoritatea celulelor din sângele periferic sunt Ph negative comparativ cu cele din măduva osoasă.

Sondele FISH utilizate de noua generație sunt dublu fuzionate și chiar triplu fuzionate, îmbunătățind mult sensibilitatea și specificitatea metodei.

În acest studiu s-a evaluat tehnica FISH ca fiind o metodă rapidă și neinvazivă, folosită pentru diagnosticul pacienților cu LMC. A fost analizată concordanța rezultatelor obținute prin citogenetică moleculară utilizând FISH pe maduvă osoasă și FISH pe sânge periferic.

Materiale necesare :

Sonde FISH: sonde dublu colorate, dublu fuzionate provenite de la Cytocell. Sonda BCR marcată cu fluorocrom Spectrum Green (semnal fluorescent verde cu filtru FITC), acoperă o regiune genomică de 1,5 Mb pe cromozomul 22 și începe cu segmentul variabil al imunoglobulinei lambda(IGLV) și se extinde aproximativ 900kb până la regiunea telomerică. Sonda include 2 fragmente de 600 kb separate de o regiune de 300kb, de la exonul 14 din interiorul M-BCR și include porțiunea 3’ a genei BCR, care este deletată din sonda. Sonda ABL1 este marcată fluorescent Spectrum Orange (semnal fluorescent rosu-orange cu filtrele Texas Red și Rhodamina). Sonda este reprezentată de un fragment de aproximativ 650kb situat pe cromozomul 9q34, ce se extinde de la centromer și cuprinde gena argininsuccinat sintetaza (ASS1) până în regiunea telomerică la ultimul exon al genei ABL1. (Figura 3)

Figura 3. Structura sondelor utilizate pentru marcarea FISH. Reprezentare schematică a sondei BCR/ABL. (http://www.cytocell.co.uk/products/aquarius/haematology-probes/BCR-ABL-probe.asp)

Un nucleu normal ce nu prezintă fuziune BCR/ABL, prezintă două semnale verzi (cromozomul 22 normal) și două semnale roșii (cromozomul 9 normal). Prezența translocației t(9;22) este reprezentată de un semnal verde (cromozomul 22 normal), un semnal roșu (cromozomul 9 normal) și două semnale galbene de fuziune( cromozomul Ph și derivatul 9) (Figura 4).

Figura 4. În imaginea din partea stânga este prezent un nucleu normal, cu formula FISH conform ISCN,

Nuc ish (ABL1,BCR)x2, ce prezintă două semnale roșii și două semnale verzi, iar în imaginea din partea

dreaptă este prezent un nucleu ce prezintă fuziunea BCR/ABL, avănd un semnal roșu, unul verde și două

semnale galbene de fuziune, formula FISH conform ISCN, Nuc ish (ABL1x3), (BCRx3),

(ABL1 con BCR x 2). (Orig.)

Pepsina: soluție stoc -10% în apă distilată (ddH2O) și stocată în tuburi de 1 ml la -20°C. Soluția de lucru (100 mg/ml) se obținut prin diluarea soluției stoc 1:100 cu 0.01 N HCl. Soluția s-a preparat proaspăt. Soluția stoc poate fi inghețată pentru câțiva ani.

2xSSC

Paraformaldehidă 4% în 1 x PBS: s-au preparat 50ml- 2g paraformaldehidă cu 22,5mL ddH2O, 2,5 mL 1 M MgCl2 și ~3–5 picaturi de 1N NaOH și s-au lăsat la dizolvat la 65°C timp de 1 h. S-au adaugat 25 mL de 2 x PBS și s-au agitat bine.

Etanol: 70%, 80% și 90% în ddH2O. Soluțiile preparate se pun în coplin jaruri de 50mL și se țin la temperatura camerei și se utilizează de câteva ori.

Soluție de spalare posthibridizare I: 4 x SSC tert-octilphenoxi poli(oxietilena) etanol (IGEPAL) (Sigma–Aldrich).

Soluție de spălare posthibridizare II: 2 x SSC/0,1% IGEPAL.

Antifade mediu de montare: 10mL 0,1% p-phenilenediamina (PPD, Sigma–Aldrich) în 9;1 mix de Glicerol:1 x PBS s-a agitat pe agitator 1-2 h până s-a dizolvat. Se corectează pH-ul daca este cazul

DAPI counterstain (Sigma–Aldrich): se prepară 1mg/mL 4’,6-diamidino-2-phenilindol (DAPI) soluție stoc în ddH2O și se stochează în tuburi de 100mL la −20°C. Pentru a prepara soluția de lucru: (250ng/mL), s-au adaugat 7.5mL soluție stoc la 30 mL antifade, s-a agitat bine, și s-au stocat câte 1 mL la −20°C.

După preparare, toate soluțiile au fost ținute la temperatura camerei.

Protocol de lucru:

Obținerea preparatelor: pentru diagnosticul LMC și pentru monitorizarea bolii minime reziduale prin FISH se utilizeaza atât măduvă osoasă cât și sânge periferic. Sângele periferic fost recoltat în vacuteiner pe EDTA. Protocolul de obținere a lamelor este urmatorul : peste1mL de sânge periferic s-au adaugat 9mL de RBC buffer (Red Blood Lysis Buffer) (Qiagen). Celulele au fost ținute pe gheață timp de 10 minute și ulterior centrifugate 10 minute la 1500 rpm. S-a aruncat supernatantul și celulele s-au resuspendat în 1 x PBS și apoi s-au centrifugat 10 minute la 1500rpm. S-a aruncat supernatantul și celulele au fost apoi resuspendate în soluție hipotonă de KCl (0.075M) timp de 10 minute la 37°C și apoi fixate în soluție de metanol: acid acetic – 3:1. Ultimul pas s-a repetat de 3 ori. După obținerea lamelor acestea pot fi îmbătrânite rapid punându-le la 60 C timp de 30 de minute sau incubate peste noapte la 37° C. Pentru analiza FISH pe măduvă osoasă s-au folosit lamele obținute prin culturi necesare examenului citogenetic (protocolul de obținere este detaliat în capitolul precedent).

Sondele FISH au fost preparate pentru hibridizare conform recomandărilor firmei producatoare. Sondele trebuiesc protejate de lumină ( sunt stocate la −20°C) pentru a preveni scăderea intensității semnalului.

Pretratare cu Pepsina: s-a preparat soluția de lucru și s-au incubat pentru tratament de predigerare la 37°C timp de 1–2 h.

Au fost incubate lamele în soluție preincalzită de pepsină timp de 10 minute

Lamele au fost spălate de 2 ori în soluție proaspată 2 x SSC, câte 3 minute fiecare.

Lamele au fost dehidratate în soluții successive de alcooli: 70,80 și 90%, timp de 2 minute.

Lamele au fost lasate la uscat și apoi stocate înainte de a fi hibridizate, la −20°C în cutii de plastic pentru o perioadă lungă de timp sau la temperatura camerei pentru 1-2 săptămâni.

Hibridizarea: sondele FISH au fost aplicate pe lama denaturată și s-a creat o cameră de hibridizare etanșa prin plasarea unei lamele și sigilarea cu gumă siliconată. Volumul final de sondă este calculat în funcție de mărimea lamelei. Hibridizarea s-a facut într-un aparat special (Hybrite de la EuroClone) care asigură umiditatea necesară și programul de hibridizare: 75°C timp de 2 min apoi răcirea până la 37°C timp de 12–16 h ( respectând recomandarea producătorului pentru sondele specifice unor regiuni genomice restrânse

După hibridizarea de peste noapte, lamele au fost scoase din camera de hibridizare și s-a îndepărtat lamela. Lama a fost introdusă în soluția posthibridizare I (4 X SSC) ce a fost ținută în baia de apa la 73°C pentru 2 minute apoi lamele au fost introduse pentru câteva secunde în soluția posthibridizare II (2 x SSC) la temperatura camerei. Lamele au fost uscate la temperatura camerei apoi s-a aplicat soluția antifade ce conține DAPI și in final s-a pus lamela care s-a sigilat cu guma siliconată. Lamele au fost puse ulterior la frigider la 4°C până au fost citite.

Examinarea lamelor a avut loc într-o cameră întunecoasă utilizând microscopul cu fluorescență. S-a folosit obiectivul de 100X, o cameră digitală și un soft de analiză (AxioImager, Zeiss, Germany).

Pentru sondele locus specific BCR-ABL1 se citesc 10 metafaze pentru a confirma sau exclude anomalia și 200 de nuclei interfazici pentru a pune în evidență clona malignă (49cacy). Cu cât numărul de celule analizate este mai mare cu atât crește sensibilitatea metodei pentru a valida un rezultat.

CAPITOLUL 5

REZULTATE ȘI DISCUȚII

5.1 Caracteristicile pacienților din lotul de studiu

Pacienții care au fost incluși în lotul de studiu, au vârste cuprinse între 7 și 74 de ani, vârsta medie a lotului fiind de 46 de ani; 13 dintre pacienti sunt bărbați și 7 – femei, raportul dintre cele doua sexe fiind de 1,85:1.( Graficul 1).

Grafic 1. Distributia pe sexe, a pacientilor care au format lotul de studiu.

5.2 Rezultate

5.2.1 Anomalii citogenetice adiționale (ACA)

Pe lângă leucemia mieloidă cronică, la care prezența cromozomului Philadelphia reprezinta o caracteristica a acestei maladii, există și alte boli mieloproliferative cronice în care sunt implicate translocații care activează tirozinkinaze.

Tabel 4. Anomalii citogenetice care implică tirozinkinaze în boli mieloproliferative cronice

FGFR1-factorul 1 de creștere pentru fibroblaste ,PDGFRA-factorul de creștere pentru receptorul de trombocite alfa, ZNF198-proteina zinc-finger 198,FOP FGRF1 partener oncogenic, CEP110-proteina 110 asociată centrozomului, HERV-K proteină endogenă a retrovirusului uman (familia K),TEL –translocația E26 transformatoare a proteinei leucemic specifice, PDGFRB receptorul de creștere beta legat de trombocite, HIP 1 proteina 1care interacționează cu huntignina, RAB5-rabapina 5, H4-histona 4, JAK2 janus kinaza 2.

Din lotul de pacienți luat în studiu, 13 pacienți au prezentat cromozomul Philadelphia fără anomalii citogenetice adiționale, iar 7 din ei au prezentat pe lângă cromozomul Ph+, și anomalii citogenetice adiționale (ACA). Anomaliile citogenetice adiționale au constat în anomalii numerice și anomalii structurale.

La majoritatea pacienților cu LMC, singura modificare citogenetică este reprezentată de translocația standard t(9;22) și doar un procent restrâns din cazuri prezintă anomalii citogenetice adiționale la diagnostic. (Di Bacco A. și colab., 2000).

5.3 Cromozomul Philadelphia . Produsul genei de fuziune bcr-abl

5.3.1 Structurile și funcțiile celor două componente de fuziune

Proteina BCR/ABL este efectul translocației reciproce echilibrate între cromozomii 9 și 22. Cromozomii 9 și 22 se fracturează la nivelul brațelor lungi, în zonele unde sunt plasați locii protooncogenei ABL(la 9q34) și ai genei BCR1 (la 22q11).

Gena abl este omologul uman al oncogenei v-abl care este răspunzatoare de leucemia murină Abelson (A-MuLV) și codifică un nonreceptor de tirozinkinază. Măsoară 230 Kb și conține 12 exoni dintre care primii 2 sunt numiți 1b și 1a, deoarece în procesul de maturare al ARN m pot fii excizati alternativ. Produsul său este o proteină de 145 Kda (p145) exprimată ubiquitar, ce face parte din familia tirozin-kinazelor nonreceptori și are două izoforme care rezultă din splicingul alternativ al primului exon.

Figura 4. Structura proteinei ABL: Tipul Ia de izoformă este ușor mai scurt decât tipul Ib, care conține un sit myr care este un loc de atașare la membrana plasmatică. De notat cele3 domenii SRC de omologie(SH) situate aproape de capătul NH2 terminal. Y393 este locul major de autofosforilare între domeniile kinazice, iar fenilalanina 401(F401) este conservată în partea SH. Mijlocul fiecărei proteine este dominată de regiunile bogate în prolină, capabile să se lege de domeniile SH 3. Capătul carboxiterminal conține ADN, care aparține domeniilor G și F actinic. Sunt vizualizate locurile de fosforilare Alm, cdc2 și PKC. Săgeata indică poziția punctului de rupere în proteina de fuziune BCR-ABL.

Conține mai multe domenii funcționale înșiruite în direcția NH2-COOH ; trei domenii SRC (SH3-SH2-SH1) localizate aproape de capătul NH2 terminal, trei domenii bogate în prolină (ab1,ab2,ab3), un domeniu cu rol de semnal de localizare nucleară (NLS), un domeniu de atașare la actină. SH1 conține activitatea tirozinkinazică. Celelalte două domenii SH și domeniile ab servesc la cuplarea proteinei ABL la secvențele specifice, sau complementare din structura altor molecule partenere: SH2 cu fosfotirozine ,SH3 cu segmente bogate în prolină. Secvențele bogate în prolină din centrul moleculei pot să interacționeze cu domeniile SH3 ale altor proteine ca Crk. Aproape de capătul 3 se gasesc locuri pentru semnale nucleare, locuri de legare pentru ADN, și locuri de legare pentru actină.

Proteina normală ABL este implicată în reglarea ciclului celular, în răspunsul la stresul genotoxic și în transmiterea informațiilor de la micromediu celular prin calea integrinelor. De asemenea, se pare că proteina ABL are un rol complex ca modul celular care integrează semnalele de la surse variate extra și intracelulare ce influențează deciziile cu privire la ciclul celular și la apoptoză. De remarcat că aceste date sunt bazate pe studii in vitro pe fibroblaste și nu pe celule hematopoietice, astfel încat sunt înca controversate.

Punctele de ruptură ale genei ABL în regiunea 9q34 pot aparea oriunde, pe o porțiune de 300kb la capătul 5 terminal la nivelul exonului 2, mai sus decât primul exon alternativ Ib și mai jos de al doilea exon alternativ Ia, mai frecvent între cele două.

Materialul genetic situat în aval de punctul de rupere, migrează pe cromozomul 9. Punctele de rupere ale genei ABL sunt plasate către extremitatea 5 ‘, înaintea exonului 2. Fragmentul distal al genei care migreaza pe cromozomul 22 cuprinde exonii 2-11(marcati cu “a”). Prin rearanjarea pe cromozomul 22 fragmentul distal al genei abl fuzionează cu segmental proximal din gena bcr rămas pe loc.

Gena bcr ca și gena abl, este exprimată ubicuitar și codifică pentru o proteină de 160 kd. Gena BCR 1 este inclusă într-un megalocus complex în care sunt înșiruite în direcția centromer-telomer 8 gene: BCR2-gena pentru sindromul di George, BCR5, BCR4 gena pentru lanțul  de imunoglobulină, BCR1- BCR3- BCR6 .

Pot fi definite câteva structuri. Prima cu exon N- terminal codifică pentru o serintreoninkinază. Singurul substrat pentru această kinază este Bap-1, un membru al familiei de proteine 14-3-3 și posibil BCR însusi. Domeniul coiled-coin al capătului N terminal BCR permite formarea de dimeri in vivo. Centrul moleculei conține o regiune asemănătoare pleckstrinei (PH), care stimulează schimbul de guanidintrifosfat (GTP) și guanidinbifosfat (GDP) pe factorii de schimb Rho guanidine care în schimb poate activa factorii de transcripție ca NF-kB. Capatul C terminal are activitate GTP-azică pentru Rac și o activitate GTP-azică scăzută pentru superfamilia Ras care reglează polimerizarea actinei și activitatea NADPH oxidazei în celulele fagocitare.

De asemenea, BCR poate fi fosforilata de câteva reziduri de tirozină, mai ales tirozina 177 care leagă Grb-2, o molecula importantă implicată în activarea căii Ras. De remarcat că ABL s-a dovedit ca fosforilează BCR în celulele COS1, ceea ce determină o reducere a activitații kinazice a BCR. Aceste date reprezintă un argument pentru rolul BCR în transducția semnalelor, dar rolul ei biologic rămane să fie dovedit.

Figura 5. Proteina BCR se poate autofosforila, sau mai multe tirozine din structura sa pot servi ca substraturi pentru tirozinkinaze din diverse surse moleculare. Spre deosebire de gena Abl, în care punctul de ruptură este la nivelul exonului 2, gena BCR are trei mari puncte de ruptură, așa numitele breakpoint cluster region (BCR).

În LMC și în aproximativ o treime din cazurile de leucemie acută limfoblastică Ph+, linia de ruptură a genei bcr 1 se produce într-o zonă mică de 5,8 Kb denumită M-bcr (Major- breakpoint cluster region), care cuprinde aria exonilor 12-16 (denumiți și b1-b5). Gena de fuziune (5’ bcr-abl 3’) care se asamblează pe cromozomul Ph 1 se transcrie într-un ARN m hibrid primar. Acesta poate suferi excizii alternative ale exonilor bcr 13 (b2) sau 14 (b3), care au ca rezultat diferite variante de fuziune b2a2 sau b3a2. Acestea sunt traduse în proteina himerică P 210. Gena de fuziune, transcriptul hibrid și proteina himerică, împreună constituie baza diagnosticului la nivel molecular al LMC. (Aamir Rana și colab, 2011).

Saglio și colaboratorii au descris o nouă poziție pentru punctul de rupere al genei BCR, care este localizat în direcție 3’ față de punctual major M-bcr, între exonii e19 și e20, creând astfel un nou transcript de fuziune e19a2. Acest transcript conține o parte din gena BCR și codifică pentru o proteină de fuziune p230.

Mecanismele care provoacă t (9:22)(q34;q11) nu sunt cunoscute în detaliu. Analizând expresia G6PD în celulele bolnavilor cu LMC, Fialkow și colaboratorii aduc argumente în sprijinul originii clonale a bolii, și a faptului că proliferarea clonală precede apariția translocației. Cu ajutorul RT-PCR s-a demonstrat că celulele sanguine ale unor persoane normale pot exprima titruri mici de ARNm hybrid BCR/ABL (cca.1-10 transcripte /10 8 celule ) cu o frecvență individuală ce crește paralel cu vârsta. În anumite condiții experimentale s-au indus fuzionări ale genelor BCR și ABL. S-au înregistrat diverse variante hibride dintre care numai unele îndeplineau condițiile corecte de respectare a cadrului de lectură care permite în continuare transcripția și translația. S-a sugerat că fuzionarea BCR/ABL ar putea avea loc in vivo în mod continuu în celulele hematopoietice primitive normale, dar numai fuzionările corecte s-ar traduce în formarea proteinei himerice funcționale și s-ar asocia în acest mod cu un avantaj selectiv, soldat cu expansiunea clonală. S-ar părea că recombinarea celor două gene nu ar fi doar un eveniment întamplator. In nucleii celulelor CD 34+, ele sunt dispuse la distanță destul de mică una față de cealaltă, iar la momentul tranziției S-G2, ajung chiar să se învecineze, ceea ce ar favoriza producerea translocației. În faza cronică de debut a LMC, translocația afectează numai câte un cromozom ai perechilor 9 și 22. Conform unor argumente de ordin citogenetic s-a sugerat că participanții la schimbul de material genetic ar fi cromozomul 9 de proveniență paternă și cromozomul 22 de origine maternă.

Fragmentul distal al genei care migrează pe cromozomul 22 cuprinde exonii 2-11. Prin rearanjarea pe cromozomul 22, fragmentul distal al genei ABL1 fuzionează cu segmental proximal din gena BCR rămas pe loc. Tranlocația reciprocă t(9; 22) se soldează cu o pierdere mare de material genetic din zestrea primară a cromozomului 22, care se strămută pe cromozomul 9. Morfologic, cromozomul 22 rearanjat, apare micșorat ca și cum ar fi suferit o deleție (22q-). Nowell și Hungerford au fost primii care au sesizat în 1960 anomalia de talie a cromozomului 22, pe care l-au denumit cromozomul Philadelphia (ph1), fiind corespondentul citogenetic al LMC.

Proteina P 210 generează fenotipul LMC prin domeniile funcționale ale proteinelor primare (BCR si ABL), care se regăsesc în produsul de fuziune. Două zone ale componentei BCR, (codificate în primul exon al genei), contribuie în mod decisiv la capacitatea transformatoare a proteinei himerice. Prima care cuprinde aminoacizii 1-63 de la capătul aminoterminal (corespunzând domeniului DD al genei) produce homodimerizarea proteinei BCR/ABL și este implicată în activările unor funcții ale componentei ABL: Tk și atașarea de actină. Cea de-a doua, ce corespunde aminoacizilor 176-426 conține secvențele necesare pentru legarea la domenii SH2 și pentru atașarea adaptorului Grb 2. Funcțiile specifice ABL esențiale pentru activarea Tk (fosforilează tirozine din diverse substrate și tirozine proprii – efect autoactivator) de conservare intactă a domeniului SH2 și de activare a domeniului de atașare la actină.

Deși pare să fie clar rolul proteinei P210 în procesul de leucemogeneză, există numeroase întrebari ce nu au încă un răspuns.(Cortes, 2007)

Singurul factor cunoscut ca fiind predispozant, îl reprezinta radiațiile ionizante. Pentru cei mai multi pacienți nu se identifică un factor predispozant, iar cauza translocației cromozomale este obscură. De asemenea, este greu de înțeles mecanismul prin care apare inevitabil progresia din faza cronică în faza accelerată și criză blastică fatală. Heterogenitatea clinică a acestei boli este încă neexplicată. Cu terapie standard, durata medie de supraviețuire este de 6 ani, dar există pacienți care mor în primul an de la diagnostic, iar alții supraviețuiesc mai mult de 20 de ani. La unii pacienți boala debutează cu o fază cronică agresivă, iar la alții boala este indolentă. (Oliver Hantchel și colab, 2004).

Au fost luate în studiu 20 de probe provenite de la pacienți cu LMC, internați în Institutul Clinic Fundeni, din care 17 au fost de maduvă osoasă și 3 probe provenite din sânge periferic.

În toate cazurile s-a folosit măduvă osoasă aspirată prin puncție, pe seringă heparinată și sânge periferic pe vacutainer cu EDTA.

Toate probele au fost supuse investigațiilor prin tehnica FISH.

Probele de maduvă osoasă recoltate au fost supuse protocolului de lucru explicat anterior, s-au utilizat culturi peste noapte și culturi cu sincronizare de ciclu celular.

Analiza FISH a fost realizată pe nuclei interfazici utilizând sonde dublu-fuzionate BCR/ABL, provenite de la firma Cytocell, Cambridge, UK. După preparare lamele au fost incubate peste noapte la 370C

S-a realizat o comparație între probele provenite din maduvă osoasă și cele colectate din sânge periferic de la pacienții cu LMC. Analiza datelor a pus în evidență o corelație foarte bună cu excepția identificării unui procent mai mic de celule Ph pozitive prin analiza FISH pe sânge periferic. Aceste diferențe ar putea fi cauzate de dinamica diferențiată a celulelor luecemice în maduva osoasă și sângele periferic. În 7 cazuri au fost observate rezultate atipice ale semnalelor la analiza FISH.

Există studii care demonstrează acuratețea folosirii tehnicii FISH în diagnosticul pacienților cu LMC, aceste studii arată că folosirea sondelor dublu colorate este foarte utilă și permite identificarea tuturor tipurilor de fuziune. Aceste studii pot pune în evidență inclusiv inserția criptică la nivelul genei de fuziune ce nu poate fi pusă în evidență prin tehnicile standard. Analiza prin FISH permite de asemenea și o mai mare sensibilitate față de citogenetica clasică, aceasta poate analiza 200 de nuclei sau chiar mai mult.

Tehnica FISH aplicată pe nuclei interfazici face ca această tehnică să fie prioritară în folosire, mai ales când nu se pot obține metafaze, sau atunci când există un numar mic de diviziuni. Detectarea BCR/ABL prin analiza FISH pe sânge periferic a devenit o tehnică alternativă pentru citogenetica convenționala clasică.

Diagnosticul la pacienții cu LMC utilizând sânge periferic permite analiza leucocitelor în vederea punerii în evidență a genei de fuziune BCR/ABL și nu necesită aspirat medular.Aspiratul medular este o tehnică invazivă și mulți pacienți refuză această procedură.

Alt avantaj al acestei tehnici este reprezentat de costul redus și de lipsa artefactelor de cultură, celulele sunt obținute prin metode directe de laborator. Tehnica necesită timp redus și rezultatele pot fi obținute în 24-48 de ore.

Comparând analiza FISH pe măduvă osoasă și cea pe sânge periferic a dus la concluzia că din maduvă osoasă se vede un rezultat mult mai bun privind numarul de nuclei analizați cu prezența genei de fuziune.

Analiza FISH a fost realizată pe lame obținute prin protocolul uzual de citogenetică conventională. Lamele au fost dehidratate în serii de alcooli. Co-denaturarea a fost facută 2 minute la 750C urmată de hibridizarea peste noapte la 370C. După hibridizarea peste noapte, lamele au fost spălate în 0,4X SSC la 730C pentru 2 minute și respălate în 2 X SSC. Evaluarea semnalelor FISH a fost făcută cu un microscop cu fluorescență (AxioImager, Zeiss, Germany). Pentru fiecare caz au fost evaluați minim 200 de nuclei interfazici (detalii despre metodă –în capitolul anterior).

La majoritatea pacientilor(13/20) a fost pus în evidență semnalul tipic pentru gena de fuziune prin tehnica FISH, anume 1 semnal roșu, unul verde și 2 semnale fuzionate. (Imagine 1.)

Imagine 1 (Orig.)

Nucleu interfazic tipic fuziunii Philadelphia, cu un semnal roșu, unul verde și două semnale fuzionate galbene.

Nuc ish (ABL1 x3), (BCR x 3), (ABL1 con BCR x 2[100]

În cazul a 7 pacienți au fost puse în evidență aspecte atipice ale genei de fuziune BCR/ABL prin analiza FISH pe nuclei interfazici. În tabelul de mai jos sunt aratate tipurile de aspecte atipice ale semnalelor, întâlnite la cei 7 pacienti Ph pozitivi

Tabel 5. ACA prezente la 7 dintre pacienții investigați

Primul pacient este reprezentat de un bărbat, cu vârsta de 43 de ani, proba a fost prelucrată din măduvă osoasă, în urma testului FISH a prezentat anomalii citogenetice adiționale Ph pozitive, reprezentate de 1semnal roșu,unul verde și trei semnale de fuziune. (Imagine 2.)

Imagine 2

Nucleu cu ACA, reprezentate de 1semnal roșu,unul verde și trei semnale de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 4), (BCR x 4), (ABL1 con BCR x 3) [100]

Pacientul cu numărul 3 din lotul de pacienți are vârsta de 43 de ani, sexul masculin. Proba a fost prelucrată din inocul din măduvă osoasă, în urma testului FISH a prezentat cromozomi Philadelphia și anomalii citogenetice adiționale, puse în evidență prin două semnale roșii, două semnale verzi și un semnal de fuziune. (Imaginea 3).

Imagine 3

Nucleu cu ACA reprezentate de două semnale roșii, două semnale verzi și un semnal de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 3),(BCR x 3), (ABL1 con BCR x 1) [100]

Pacientul numărul 4 a fost reprezentat de o persoana de sex feminin, cu vârsta de 47 de ani, proba a fost prelucrată pornind de la inocul din măduvă osoasă, iar în urma testului FISH a prezentat 1 semnal roșu, unul verde și unul de fuziune. (Imagine 4).

Imagine 4

Nucleu cu ACA, 1 semnal roșu, unul verde și unul de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 2), (BCR x 2), (ABL1 con BCR x 1) [100]

Pacientul numărul 10 din lotul de pacienți luat în studiu a fost un barbat cu vârsta de 33 de ani, a prezentat în urma testului FISH făcut din proba provenită din sânge periferic, nuclei Ph pozitivi cu două semnale roșii, unul verde și unul de fuziune.(Imagine 5).

Imagine 5

Nucleu cu ACA, prezintă două semnale roșii, unul verde și unul de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 3), (BCR x 2), (ABL1 con BCR x 1) [100]

Pacientul numărul 13 din lotul de studiu este reprezentat de o persoana de sex masculin, de 63 de ani, a cărui proba a fost prelucrată pornind de la inocul de măduvă osoasă. În urma testului FISH a prezentat anomalii citogenetice adiționale Ph pozitive, pe lângă procentul de 35% de nuclei cu un semnal roșu, unul verde și doua semnale fuziune( Ph pozitiv clasic)(Imagine 6) s-a identificat și un procent de 25% nuclei cu un semnal roșu, două verzi și unul de fuziune.( Imagine 7)

Imagine 6

Nucleu tipic fuziunii Philadelphia cu un semnal roșu, unul verde și două semnale de fuziune

Nus ish (ABL1 x 3),(BCR x 3), (ABL1 con BCR x 2) [100]

Imagine 7

Nucleu cu ACA, prezintă un semnal roșu, două semnale verzi și un semnal de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 2), (BCR x 3),(ABL1 con BCR x 1)[100]

Pacientul cu numărul 16 din lotul de studiu are 35 de ani, sexul masculin, proba de analizat a provenit din măduvă osoasă, în urma testului FISH s-au pus în evidență anomalii citogenetice adiționale, reprezentate de doua semnale roșii, unul verde și unul de fuziune. (Imagine8).

Imagine 8

Nucleu cu ACA, prezintă două semnale roșii, unul verde și unul de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 3),(BCR x 2), (ABL1 con BCR x 1)[100]

Pacientul cu numărul 18 din lotul de studiu a fost reprezentat de un bărbat cu vârsta de 63 de ani, proba de laborator a fost prelucrată pornind de la inocul din măduvă osoasă.

În urma testului FISH a prezentat pe lângă semnalele clasice Ph pozitive( unul roșu, unul verde, 2 fuziune-35%) (Imagine 9) și anomalii citogenetice adiționale în procent de 32%, reprezentate de un semnal roșu, două verzi și unul de fuziune. (Imagine 10).

Imagine 9

Nucleu cu ACA, prezintă două semnale verzi, unul roșu și două de fuziune

Nuc ish (ABL1 x3), (BCR x3), (ABL1 con BCR x 2)[100]

Imagine 10

Nucleu cu ACA, prezintă un semnal roșu, două verzi și unul de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 2),(BCR x 3),(ABL1 con BCR x 1)[100]

5.4 Discuții

5.4.1 Mecanisme de leucemogeneză

Ideea că leucemia mieloidă cronică ca și alte cancere este rezultatul unei evoluții secvențiale patogenice multistep, este cunoscută de aproximativ 20 de ani, dar nu se știe foarte mult despre modificările moleculare care preced apariția cromozomului Philadelphia. Se pare că generarea unei gene BCR-ABL în celula stem pluripotentă apare în condițiile reducerii supravegherii imunologice. Opinia că apariția genei de fuziue BCR-ABL este primul pas în geneza leucemiei mieloide cronice este susținută și de experimentele efectuate pe șoarece, la care transfectarea de celule stem cu gena BCR-ABL produce o boală asemanatoare cu leucemia mieloida cronică. Odată debutată afecțiunea, faza cronică a bolii variază de la pacient la pacient și trebuie să fie influențată de alți factori.

Mecanismul prin care apare cromozomul Philadelphia și modul în care se ajunge la afecțiune este necunoscut. A fost formulată ipoteza potrivit căreia apropierea genelor BCR și ABL în celulele hematopoietice în interfază, poate favoriza translocațiile între cele două gene. Recent s-a identificat un duplicon (două copii de ADN repetitiv ) de 76 kb pe cromozomul 9, aproape de gena ABL și pe cromozomul 22, aproape de gena BCR care poate fi implicat în translocație, dar mecanismul rămâne pur speculativ.

Oricare ar fi mecanismul inițial, este cunoscut faptul că are loc creșterea masei mieloide atât a celulelor mature, cât și a precursorilor mieloizi. Până în anii 80 nu era foarte clar dacă există celule mieloide stem Ph- la pacienții nou diagnosticați. Oricum, cercetările făcute au demonstrat prezența progenitorilor mieloizi normali în măduva osoasă și s-a observat că progenitorii Ph- pot fi identificați după doze mari de chimioterapie, sau după scheme de tratament care includeau Interferon. Concluzia a fost că, clona mieloida Ph+ înlocuiește celulele hematopoietice normale, dar nu distruge celulele stem normale reziduale.

În general, se crede că leucemia mieloidă cronică se dezvoltă dintr-o singură celulă stem pluripotentă, care achiziționează un cromozom Philadelphia cu gena de fuziune BCR-ABL care conferă celulelor progenitoare avantaje de proliferare față de elementele hematopoietice normale.

Această clonă Ph+, cu timpul dislocă hematopoieza normală reziduală. Nu se cunosc mecanismele moleculare și citogenetice prin care apare de fapt boala. De asemenea, bazele moleculare ale acestui avantaj de proliferare nu sunt bine cunoscute dar pot fi legate în parte de expresia în progenitorii leucemici a factorilor de creștere, mai ales interleukina 3 și factorul de creștere al coloniilor mieloide. Oricum, celulele leucemice supraviețuiesc mai mult decât cele normale, ca rezultat al defectului apoptotic care le impiedică maturizarea și moartea fiziologica.

Modificarea cea mai importantă în leucemia mieloidă cronică o reprezintă prezența proteinei himerice BCR/ABL P210, în celulele leucemice. P 210 induce trei mecanisme cu importanță majoră în leucemogeneza; activarea sistemelor de transmitere intracelulară a semnalelor care promovează proliferarea, reducerea adeziunii celulelor leucemice în micromediul celular (celulele stromale și matricea extracelulară) și inhibiția apoptozei.

Potențialul transformator al proteinei BCR/ABL se datorează activitații de tirozinkinază a segmentului ABL din componența sa. Activitatea tirozinkinazică este promovată de unele secvențe ale segmentului BCR. BCR acționează prin promovarea dimerizarii oncoproteinei, astfel încât cele două molecule adiacente BCR-ABL fosforilează fiecare un reziduu tirozinic și astfel activitatea sa crește. Activitatea kinazică a BCR-ABL devine necontrolabilă, astfel încât uzurpa funcțiile fiziologice ale enzimei normale ABL și interacționează cu o varietate de efectori și proteine, rezultatul final fiind dereglarea activității celulare proliferative cu scăderea aderenței celulare în măduva osoasă și reducerea răspunsului apoptotic la stimulii oncogeni mutageni. Din păcate, contribuția relativă a acestor efecte la desfășurarea fazei cronice a leucemiei mieloide cronice este puțin cunoscută.

BCR-ABL tirozinkinaza provoacă activarea unor substraturi prin transferul unor grupări fosfat (provenite din ATP) la diverse tirozine din structura acestora.

Proteina BCR/ABL activează prin acest mecanism mai multe proteine intracelulare (molecule adaptoare, factori de transcripție, proteine ale scheletului celular ,enzime și în plus posedă capacitatea de autoactivare prin fosforilarea unor tirozine proprii (autofosforilare).

5.5 Proteina BCR/ABL: rol, structură și funcții

Structura proteinei BCR-ABL și rolul său au fost intens studiate. Cunoștiințe despre rolul și funcțiile domeniilor conținute care derivă de la cele două proteine inițiale BCR și ABL sunt utile pentru a întelege rolul proteinei de fuziune rezultate. Tirozinkinaza codificată de domeniul SH1 al componentei ABL a fuziunii BCR este importantă pentru transformarea oncogenetică. Alte domenii importante ale porțiunii ABL sunt proteinele de interacțiune SRC homology 2(SH2) și domeniile C –terminale legate de actină.

Proteina P210 conține elementele necesare pentru activarea directă a componentelor

funcționale ale căilor de semnalizare: proteine adaptoare, enzime și factori de transcripție, în

plus fosforilează sau reglează proteine componente ale scheletului celular și proteine

reglatoare ale apoptozei. Prin aceste proprietăți, P210 se substituie etapei de inițiere a

semnalelor care implică în celule normale asocierea citokinelor cu receptorii. Se pare ca, în

această substituție funcțională nu este perfectă, întrucât s-a demonstrat asocierea proteinei

BCR/ABL cu lanțul lambda-c al receptorului IL3.

Segmentul intracitoplasmatic al lambda-c funcționează ca transductor de semnale.

Domeniile structurale ale proteinei BCR/ABL au o contribuție nuanțată în inducerea transformării celulelor mutante:

1) domeniul de oligomerizare NH2 terminal este necesar pentru

fosforilarea secvenței TK și pentru autofosforilare; -autofosforilarea implică o autoactivare a

la longue independentă de stimularea prin citokine și totodată fosforilarea tir, care devine situl

de recrutare a Grb2, în esență BCR/ABL se comportă ca o tirozinkinază nonreceptor

2) domeniul SH3 ( care în proteina nativă c-ABL inhibă activitatea TK) este inhibat în proteina de fuziune, fie printr-o autoinhibiție legată de o rearanjare conformațională după fuzionarea ABL cu BCR, fie ca urmare a formării homodimerilor BCR/ABL;

3)domeniul SH2 este necesar pentru transformarea tumorală prin BCR/ABL în diverse modele experimentale in vivo. Activarea Myc indusă de BCR/ABL este dependentă de domeniul SH2. Semnalul ar fi transmis prin intermediul Ras/Raf și al factorilor de transcripție care activează promoterul oncogenei c-myc ;

4)domeniul TK (SH1) este esențial pentru inducerea transformării maligne. Situl enzimatic este integrat într-o bucla de activare. Activarea Tk produce printre altele autofosforilarea unor Tir din componența buclei. În P210 autofosforilarea Tir este esențială pentru stabilizarea buclei în conformație activă întrucât mutația sa compromite efectul transformator al BCR/ABL;

5) domeniul de prindere la actină mediază localizarea proteinei BCR/ABL la nivelul membranei celulare. BCR/ABL induce creșterea numerică a moleculelor de F-actină, anomalii în organizarea scheletului celular și în expresia receptorilor pentru integrine. Asocierea BCR/ABL cu F-actină induce tirozinfosforilarea proteinelor citoscheletale și a unor molecule de adeziune focală (paxilina, tensina, vinculina, talina, FAK-“focal adhesion kinase”,cas-“Crk associated substrate ,Hef 1) care se asociază în complexe multimerice. Legarea acestor complexe multimoleculare cu proteina BCR/ABL se produce prin intermediul paxilinei și al unei proteine adaptoare denumită Crkl. Legarea Crkl de proteina BCR/ABL este atât directă -la secvențele bogate în prolină ale acesteia, cât și indirectă, prin intermediul altei proteine, Cbl care se fixează pe domeniul SH2 al BCR/ABL și pe Grb2 atașată de Tir. Crkl este un substrat de importanță majoră al proteinei BCR/ABL întrucât creează legături funcționale și susține activarea altor adaptori (Shc, SOS, Grb2) sau enzyme (PI-3K)cu funcții în transducția semnalelor, sau atașează proteinele Cas și hef 1, implicate în funcția receptorilor pentru integrine. Crkl joacă deci rolul central în orchestrarea semnalelor intracelulare induse de BCR/ABL și în recrutarea acesteia la scheletul celular.

5.5.1 Proteina BCR/ABL: rolul în leucemogeneză

Trei mecanisme majore ar fi implicate în transformarea malignă indusă de proteina BCR/ABL: activarea semnalelor de proliferare, reducerea adeziunii celulelor progenitoare mutante la stroma și la matricea extracelulară și deprimarea apoptozei.

Proteina BCR/ABL este capabilă să activeze direct proteine care mijlocesc conectarea sa cu căile de semnalizare Ras și PI-3K 1)Shc si Grb 2 care inițiază calea ras-MAPK și calea PI-3K prin complexa Shc/PI-3k,2) Crkl care formează complexele multimerice cu proteinele BCR/ABL, Cbl și Grb2 prin care se deschide calea SOS-Ras_MAPK, 3)PI-3K activata direct (în complexele cu Crkl-BCR/ABL) conectată cu Ras în amonte și Akt în aval,4) proteina 14-3-3 care interacționează cu Raf.

De asemenea, proteina BCR/ABL poate activa direct ( eludând etapa jak) și proteinele STAT 1 și 5 prin intermediul domeniilor sale SH2 și SH3. Activarea STAT 5 ar contribui la transformarea maligna în experimente cu unele linii celulare. Efectele acestor activări in vivo sunt greu de disecat, întrucât majoritatea observațiilor au fost făcute pe celule transfectate cu proteine BCR/ABL mutante la care s-a indus deficiența unor segmente constitutive. Se acceptă însă ideea conform căreia BCR/ABL activează mai multe căi prin intermediul proteinelor Ras, STAT și Akt pentru a genera semnale multidirecționale ce stimulează continuu proliferarea și supraviețuirea. Unul dintre acesti stimulatori ar putea fi c-Myc care este produsă în cantitate mare în celulele BCR/ABL pozitive. Activarea Myc este dependentă de domeniul SH2 al BCR/ABL. În experimente cu celule normale, Myc poate elibera semnale de proliferare sau semnale proapoptotice, în funcție de condțiile create. În leucemia mieloidă cronică semnalele apoptotice sunt însa neutralizate cel mai probabil prin intermediul caii PI-3K.

Apoptoza ( moartea programata a celulelor ) este un proces fiziologic care operează în faza G1 a ciclului celular când în funcție de stimuli ambientali, celulele optează pentru trecerea în faza S, sau pentru moarte. Sistemul este reglat de proteinele familiei BCL2 Bcl-xL și din promotoarele apoptozei (Bax,Bak,Bik Bad). Unele proteine ale familiei (Bcl2,Bcl-xL,Bax,Bad ) sunt localizate pe membrana mitocondrială .Celulele BCR/ABL pozitive sunt mai rezistente la apoptoza decât cele normale. Sunt discutate mai multe posibilități;1) activarea Bcl 2 prin intermediul căilor Ras și IP-3K/Akt; 2)stimularea transcripției Bcl-xL de către STAT 5, posibil prin intermediul Crkl care poate funcționa ca un adaptor pentru STAT5; 3)fosforilarea Bad indusă de Akt si Raf; 4) blocarea eliberării citocromului C din mitocondrii. De asemenea, alt mecanism antiapoptotic ar fi inhibiția unei proteine de legare a IFN , ICSBP( interferon consensus secquence binding protein).

Aderența celulelor progenitoare din LMC la structurile stromei medulare este mult diminuată. Aceasta explică descărcarea în sângele periferic a precursorilor granulocitari. Celulele hematopoietice normale exprimă receptori din familiile integrinelor și selectinele (E -selectina sau ELAM 1) care se cuplează cu moleculele adeziotrope expuse pe celule ale stromei (VCAM 1,ICAM 2), sau constituiente ale matricei extracelulare (fibronectina,trombospondina ,vitronectina,laminina ,colagenul). Aceste legături slăbesc progresiv în cursul maturării celulelor normale, ceea ce permite desprinderea acestora și diabaza. Contactul celulelor primitive cu elementele adeziotrope stromale influențează semnificativ unele funcții celulare, cum ar fi proliferarea, transducția semnalelor și organizarea scheletului celular. În culturi de lungă durată s-a observat inhibarea proliferării progenitorilor normali, sub influența productelor stromale. Mecanismul ar fi mediat de interacțiunea dintre receptorii integrinei și fibronectina. Dupa stimulare, receptorii integrinici se aglomerează în mănunchiuri și formează complexe multimoleculare cu elemente citoscheletale, iar PI-3K ar fi implicată în rearanjarea actinei și în formarea complexelor citate. Interacțiunea receptorului integrinic influentează atât legarea sa cu liganzii externi cât și transmiterea unor semnale în celule.

Celulele leucemice prezintă defecte în expresia pe suprafață a moleculelor de integrine și selectine, iar aderarea lor la fibronectină, laminină și colagen (tipul IV) este diminuată. Ele exprimă o variantă moleculară a lanțurilor 1 de integrină care inhibă parțial adeziunea lor la stromă și prezintă o mobilitate crescută pe fibronectină. Defectul cuplării integrină-fibronectină poate fi corectat experimental prin inhibiția exprimării genei BCR/ABL cu ajutorul oligonucleotidelor antisens, ceea ce demonstrează legătura între defectul genetic și cel al adeziunii. Proteina P 210 se atașează de membrana celulară prin intermediul legăturii sale cu actina și induce: defect de grupare a recptorului integrinic, deficiența formării complexelor receptorului cu proteinele citoscheletului, polimerizarea defectuoasă a actinei și afectarea transferului semnalelor de reglare a proliferarii. Există relații între proteina P210 și Crkl. Se pare că Crkl influențează o rețea de influențe prin care proteina BCR/ABL ar altera funcțional receptorii integrinici. Crkl induce fosforilarea directă a unui număr mare de proteine: paxilina, talina, vinculina, FAK, Cas, Hef 1 și Cbl. Shc activată de Cbl produce împreună cu FAK fosforilarea PI-3K, care la rândul său activează proteina Rac implicată în reglarea interacțiunilor dintre scheletul celular și integrine, și în generarea anomaliilor motilității celulelor BCR/ABL+. Aceste anomalii pot fi anihilate de către interferonul. (Maria Perez Caro și colab, 2006).

5.5.2 Mecanismele de transformare celulară induse de BCR_ABL pot fi grupate în :

1) Dereglarea activității tirozinkinazice a proteinei ABL

2) Acțiunea pe căile de transmitere intracelulară

Dereglarea activității tirozinkinazice a ABL

Proteina himerică BCR-ABL are o activitate tirozin-kinazică mai mare fața de a proteinei p145 ABL. Diverse zone ale proteinei himerice sunt esențiale pentru transformarea celulară. În ABL acestea implică domeniul SH1, SH2 și domeniul de legare al actinei. În BCR sunt importante domeniul coiledcoil de oligomerizare care conține aminoacizii 1-63, tirozina în poziția 177 și secvențele bogate de fosfoserina-treonina între aminoacizii 192-242 și 298-413. Formele cărora le lipsește situsul tirozinkinazic, sau care au mutații în domeniul SH1 de autofosforilare a părții ABL, nu au potențial transformator.

Kinaza ABL este strict reglată în condiții fiziologice, fie de mecanisme care acționează în poziție cis, fie de mecanisme care acționează în poziție trans. Domeniul SH3 are un rol cheie în procesul de inhibiție, deoarece deleția sa, sau orice alterare pozițională activează kinaza.

In vivo există diverse proteine care leagă ABL. ABL-1 și ABL-2 (proteinele de interacție ABL) activează funcția inhibitorie a domeniului SH3.

Un alt inhibitor al ABL este Pag/Msp23 care în urma expunerii celulelor la stres oxidativ ca radiații, este oxidat și se disociază de ABL.

În alternativ, domeniul SH3 poate lega intern regiunea bogată în prolină a centrului proteinei ABL determinând o modificare conformațională, care inhiba interacțiunea cu substratele. Fuziunea secvenței 5 a BCR cu domeniul SH3 al ABL elimină funcția fiziologică inhibitorie.

Anumite studii au demonstrat că secvențe ale genei BCR sunt esențiale pentru autofosforilarea in vivo a P210 și pentru a-i conferi o capacitate transformantă. Se presupune că este implicată o interacțiune directă între secvențe de aminoacizi codificate de primul exon al BCR și domeniul reglator tirozin-kinazic SH2 al ABL. Secvența BCR poate substitui din punct de vedere funcțional miristilarea și sau deleția domeniului SH3 în activarea oncogenei ABL.

Regiunile cele mai importante sunt cele care cuprind aminoacizii 1-63 și amoniacizii 176-242.

Prima regiune are o structură de elice care determină formarea unui complex tetramolecular în proteina nativă. În proteina hibridă p210, partea care aparține c-ABL, care are o structură monomerică suferă un proces de tetramerizare, tocmai în această regiune cu fosforilări consecutive intermoleculare ale reziduurilor tirozin-kinazice.

Aceasta oligomerizare crește activitatea legăturii dintre ABL și proteina F-actinică conferindu-i lui p210 posibilitatea să interacționeze cu proteinele care, la rândul lor leagă moleculele de adeziune având funcția de a transmite semnalele de inhibiție a creșterii și diferențierii.

A doua regiune aminoacidică a primului exon BCR, se leagă cu mare afinitate de domeniul SH” al c-ABL crescând eficiența de interacțiune cu regiunile tirozin-fosforilate.

Substratele BCR-ABL pot fi regrupate în funcție de rolul lor fiziologic în adaptorii moleculari ca Crkl și p62, care sunt proteine implicate în organizarea citoscheletului și a menmbranei celulare ca paxilina, talina și proteine cu funcție catalitică ca Fas.

Alegerea substratelor depinde de contextul celular –de exemplu Crkl este proteina fosforilată de neutrofile, în timp ce p62 este fosforilată mai ales în celulele progenitoare.

Se presupune că, BCR-ABL poate avea un rol în instabilitatea genomică și transformarea leucemieie mieloide cronice în criza blastică.

Cu timpul, clona leucemică îsi pierde capacitatea de diferențiere și apar anomalii cromozomale secundare, care duc inevitabil la criza blastică.

5.6 Căile și mecanismul de acțiune a BCR-ABL

Există trei mecanisme importante care sunt implicate în transformarea malignă și în partea BCR-ABL

alterarea adeziunii la celulele stromale și la matricea extracelulară

activarea semnalului mitogen

inhibarea apoptozei

Împreună, aceste procese duc la alterarea maturării celulare, care caracterizează leucemia mieloida cronică

5.6.1 Alterarea proprietăților adezive

În leucemia mieloidă cronică, celulele progenitoare au o adeziune diminuată a celulelor la stroma medulara și la matricea extracelulară.

A fost evidențiată în mod paticular o adeziune diminuată între celulele care au p210 și fibronectină, care reprezintă una dintre cele mai importante molecule ale microambientului medular.

Adeziunea la stroma medulară este în general reglată în contratimp cu proliferarea celulară, dar celulele leucemice se sustrag acestui mecanism de reglare în virtutea alterării proprietăților lor adezive. În interacțiunea dintre stromă și celulele progenitoare, un rol important îl au integrinele .

În leucemia mieloidă cronică, celulele exprimă o variantă a integrinei 1, care este inhibitoare a adeziunii, ce nu este prezentă în celulele normale.

Integrinele legându-se de receptorii lor, sunt în gradul de a induce semnalul normal de transducție din exteriorul în interiorul celulei. Se poate deci presupune, că transferul semnalului care inhibă proliferarea în leucemia mieloidă cronică este împiedicat.

P 210 fosforilează diverse proteine implicate în mecanismele de adeziune celulară printre care paxilina ,FAK și Crkl provocând o alterare a activității lor. Modificările proprietăților de adeziune celulara în celula Ph + se exprimă prin eliberarea în circulație a precursorilor hematopoietici cu infiltrarea organelor nonhematopoietice ca splina și cu pierderea inhibiției de contact.

Tratamentul cu Interferon sau cu inhibitori specifici ai funcției tirozin-kinazice (imatinib) a p210 determină revenirea la un comportament adeziv normal din partea celulelor Ph+ și o reducere a mobilitatii cu regăsirea capacității de legare cu integrinele.

5.6.2 Activarea semnalului mitogenic

Ras si cascada MAP/kinazelor

Au fost evidențiate diverse legături între BCR-ABL și Ras. Mecanismul de activare a Ras este mediat de proteine adaptatoare ca Grb-2 și SHC. Autofosforilarea Tyr177 furnizează un loc de ancorare pentru adaptorul molecular Grb-2, care apoi fiind legat de proteina Sos stabilizează Ras în forma sa activă care leagă GTPul.

De asemenea, alți doi adaptori moleculari ca SHC și Crkl pot să activeze Ras, ambii find substrate ale proteinei BCR-ABL și o pot lega cu domeniile SH2(SHC) și SH3(Crkl). Dovada că activarea Ras este importanta pentru patogeneza leucemiei granolocitare cronice deriva din observația ca în leucemia mieloidă cronică mutațiile Ras sunt absente chiar și în faza blastică a bolii, spre deosebire de alte tumori în care această mutație este mai frecvent întalnită. Aceasta înseamnă că, calea Ras este constitutiv activă și nu există mutații ulterioare.

Stimularea receptorilor de citokine ca Interleukina 3 (IL-3) determină activarea Ras și la recrutarea serin-treonin kinazei Raf, pe membrana celulară.

Raf induce cascada de semnale prin intermediul serin-treonin kinazelor Mek1/Mek2 și Erk, care în final duc la activarea transcriptiei genice.

Semnalul Ras poate fi transmis pe calea Rac care este un factor de schimb al GDP-ului cu GTP-ul și a Gckr (germinal center kinase related) și in final Jnk/Sapk.

Este posibil ca BCR-ABL să utilizeze căi ale factorilor de creștere în mod direct. S-a observat asocierea cu subunitatea c a receptorului interleukinei 3 cu receptorul c-kit. (Gustafsson B și colab., 2005)

Calea Jak-Stat

În celulele BCR-ABL pozitive există o fosforilare constitutivă a factorilor de transcripție Stat (Stat 1 si Stat 5) și în mod deosebit activarea Stat 5 pare să contribuie la transformarea malignă. Se știe că, funcția fiziologică a Stat5 este pleiotropică și efectul său pe celulele transformate este în principal antiapoptotic și implică activarea trascripțională a Bcl-Xl.

În mod normal, în urma stimulilor fiziologici, kinazele Janus fosforilează factorii transcripționali STAT, activându-i. Proteina BCR-ABL poate activa Stat1 și Stat5 fără o fosforilare precedentă.

Pentru a explica rolul jucat de căile Ras și Jak-Stat în răspunsul celular e importantă observația că, BCR-ABL este capabilă să facă independente liniile celulare, care sunt dependente de factorii de creștere. În timpul fazei cronice a leucemiei mieloide cronice, celulele progenitoare sunt dependente pentru supraviețuirea lor și proliferarea lor de factorii de creștere externi în mica măsura față de celulele normale. (Alister C.W., 2000).

Calea fosfoinozitol-3-kinazei(PI 3 -kinaza)

Activitatea PI 3 kinazei este cerută de proliferarea celulelor BCR-ABL pozitive. PI13 kinazele fosforilează fosfatidilinozitolul (PI) în poziția D3 in vivo și produce în principal PI-(3,4)-bifosfat și PI-(3,4,5)-trifosfat care pot să funcționeze ca mesageri secundari. PI3K este implicată în reglarea funcțională a proteinei Akt (supraviețuire și creștere), Rac (motilitate și supraviețuire), S6K (sinteza proteică).

PI3K poate de asemenea să fie reglată de Ras și poate să regleze ea însăsi funcția Ras. Proteina BCR/ABL formează complexe multimerice cu PI3-kinaze și cu moleculele adaptatoare Crk și Crkl care o activează.

Succesiv, substratul activat în această cascadă este serin-treonin kinaza Akt implicată în semnalul antiapoptotic. Proteina proapoptotică Bad este substratul cheie al Akt.

Când Bad este fosforilată și inactivă nu este capabilă să lege proteine apoptotice.

BCR-ABL este capabilă să fosforileze activând două tipuri de inozitolfosfataza, Ship1 și Ship2, care sunt fiziologic activate în răspunsul la factorii de creștere.

Se pare că acțiunea principală a proteinei Ship nu este aceea de a pune în strictă relație acțiunea fosfatazică care ar fi constituțional activată când interactionând prin intermediul domeniului SH2 și prin regiunea bogată în prolină cu alte proteine de semnal ca SHC, SHP2 și Grb-2 care ar duce la efectul final antitumoral. (John C. Byrd și colab., 2014)

Calea MYC

Gena Myc este supraexprimată în multe tipuri de tumori umane, codifică pentru o proteină de 439 kda, localizată mai ales în nucleu.

MYC este un factor transcripțional care poate lega ADN-ul prin intermediul domeniului sau “leucin zipper” și motivul “elice –loop-elice”.

Aceasta proteină poate regla expresia genelor țintă, legându-se de secvențe de ADN dupa dimerizare cu o altă proteină, ca MAX.

Complexul MYC/MAX activează și promovează proliferarea și transformarea celulei.

Activarea MYC din partea BCR-ABL nu este încă bine cunoscută și depinde de domeniul SH2.

Rezultatele obținute din studiul celulelor transformate cu v-ABL sugerează că semnalul este transmis prin intermediul kinazei ciclice dependente (cdks) ca Ras/Raf și factori de trasncripție ca e2F care activează promotorul MYC.

Mutațiile în domeniul SH2 și în regiunea de legatură cu Grb-2, domenii implicate în activarea c-MYC determină o pierdere a potențialului transformant al p210 care poate fi restabilit prin intermediul unei expresii crescute a c-Myc. (Linsey Reavy și colab., 2013).

Inhibarea apoptozei

Expresia BCR-ABL determină apoptoza în relație directă cu activitatea tirozin-kinazica și prin intermediul activării Ras.

Mai multe studii au evidențiat că celulele Ph+ sunt rezistente la apoptoza indusă de leziunile ADN-ului.

Mecanismele biologice ale acestui efect nu sunt încă bine știute. BCR-ABL poate bloca eliberarea citocromului C din mitocondrii și deci să impiedice activarea caspazelor Aceasta ar putea fi mediată de proteinele din familia Bcl2 în dependență Ras sau PI3K.

O altă legatură între inhibiția apoptozei și BCR-ABL ar putea fi fosforilarea proteinei proapototice bad.

Bad are funcție antiapoptotică și determină moartea celulara. Semnalele de supraviețiuire mediate de citokine ca IL-3, NGF(nerve growth factor) sau IGF (insului-like growth factor) determină fosforilarea Bad în două reziduri (Ser112 si Ser136) prin intermediul unei căi dependente de PI3K/Akt. Consecința fosforilării și inhibiției legăturii Bcl-XI este sechestrul în citoplasma.

E posibil ca BCR-ABL să inhibe apoptoza prin intermediul subreglării proteinei legate de secvența consens a interferonului (ICSBP).

CONCLUZII

În această lucrare s-a aratat că majoritatea cazurilor prezintă aspectul normal clasic al semnalelor de FISH-1R1V2F, corespunzând unui cromozom Philadelphia tipic.

Utilitatea analizei folosind tehnica FISH în diagnostic a fost de asemenea pusă în evidență în foarte multe studii de specialitate.

Într-un număr mic de cazuri( 7 din 20), rezultatele obținute în urma aplicării tehnicii FISH, au prezentat aspecte atipice ale semnalelor. Cu toate acestea, diagnosticul doar prin tehnica FISH când întâlnim și aceste anomalii citogenetice adiționale, s-ar putea face eronat fără citogenetica clasică.

Rezultatele obținute au arătat că prin tehnica FISH se pot diagnostica corect majoritatea cazurilor cu leucemie mieloidă cronică ce prezintă cromozom Philadelphia. În cazuri rare interpretarea exactă a semnalelor necesită și aplicarea sondelor pe metafaze și chiar examinarea metafazelor prin citogenetică clasică. Achiziția de anomalii citogenetice adiționale detectate prin tehnica FISH ( observarea semnalelor atipice Ph pozitive), pot avea implicații severe asupra diagnosticului și a prognosticului pacienților cu LMC.

BIBLIOGRAFIE

Assouline S. și J.H. Lipton, 2011, Monitoring response and resistance to treatment in Chronic Myeloid Leukemia, Current Oncology, Vol.18, nr 2, e71-e83

Byrd C. John, Jones J. Jeffrey, Woyach A.Jennifer, Johnson J.Amy și Flynn M. Joseph, 2014, Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician, Journal of Clinical Oncology, Volumul 32, Numarul 27, 3039-3047

Campbell J. Lynda, 2011, Chronic Myeloid Leukemia: Cytogenetic Methods and Applications for Diagnosis and Treatment, Cancer Cytogenetics, Humana Press, Editia a 2-a, Capitolul 4, 38-40

Caro Perez Maria și Sanchez- Garcia Isidro, 2007, BCR-ABL and human Cancer, Humana Press Inc., Volumul 1, 1-31

Cortes Jorge și Deininger Michael, 2007, Allogeneic Hematopoietic Stemm Cell Transplantation for Chronic Myelogeneous Leukemia; Molecular targets Other Than BCR-ABL: How to incorporate them into the CML Therapy?, Myeloid Leukemia, Informa, Capitolul 2, 11-16; Capitolul 9, 106-11

Crews A. Leslie și Catriona H. M. Jamieson, 2012, Chronic Myeloid Lekemia Stem Cell Biology, Current Hematologic Malignancy Reports Springer, 7, 125-132

Di Bacco Alessandra, Keeshan Karen, Mc.Kenna Sharon și Cotter . Thomas,2000, Molecular Abnormalities in Chronic Myeloid Leukemia: Deregulation of Cell Growth and Apoptosis, The Oncologist, 5, 405-415

Dingli David, Traulsen Arne, Lenaerts Tom și Pacheco M. Jorge, 2010, Evolutionary Dynamics of Chronic Myeloid Leukemia, Genes and Cancer, I(4), 309-315

Geary C.G., 2000, The story of Chronic Myeloid Leukemia, British Journal of Haematology, 110, 2-11

Hantschel Oliver și Superti Furga Giulio, 2004, Regulation of the C-ABL and BCR-ABL Tyrosine Kinase, Nature, Volumul 5, 33-44

Kantarjian M., Hagop Obrien Susan, Cortes E. Jorge, Smith L.Terry, Rios Mary Beth, Jianqin Shan, Ying Yang, Giles J. Francis, Thomas A. Deborah, Faderl Stefan, Garcia Manero Guillermo, Sima Jeha, Wierda William, Pierre J. Jean Issa, Kornblau M.Steven, Keating Michael, Debra Resta, Capdeville Renaud și Talpaz Moshe, 2002, Treatment of Philadelphia Chromosome-positive, Accelerated phase Chronic Myelogenous Leukemia with Imatinib Mesylate, Clinical Cancer Research, Vol 8, 2176-2176

Keagle S.L.Gersen, 2005, The Principles of Clinical Cytogenetics, second Edition, Humana Press Inc. Towa, New Jersey

Lodish Harvey, Berk Arnold, Zipursky S. Lawrence, Matsudaira Paul, Baltimore David și Darnell James, 2007, Cancer, Molecular Cell Biology, Media Connected, Editia a 5-a, 944-960

Marica M., 2007, Oncologie generală, Editura UMF Iași, p. 90-123

Nicolini Franck Emmanuel, Basak W.Grzergov, Soverini Simona, Martinelli Giovanni, Mauro J. Michael, Muller C. Martin, Hochhaus Andreas, Chuan Charles, Dufva H.Inge, Rege- Cambrin Giovanna, Saglio Giuseppe, Michallet Mauricette, Labussiere Helene, Morisset Stephane, Hayette Sandrine, Etienne Gabriel, Olavarria Eduardo, Wei Zhou, Senaka Peter, Apperly F.Jane și Jorge Cortes, 2011, Allogenic stem cell transplantation for pacients harboring T3151 BCR-ABL mutated leukemias, BLOOD, Vol.118, Number 20, 5697-5700

Rana Aamir, Hussain Sabir Shah, Rehman Nazia, Shaukat Ali, Ghulam Muhammad Ali, Shahzad Bhatti și Ammad Farooqi, 2011, Chronic myeloid Leukemia: Attributes of break point cluster region-abelson (BCR-ABL), Journal of Cancer Research and Experimental Oncology, vol.3, 62-66

Radivoyevitch Tomas, Jankovic M. Gradimir, Tiu V. Ramon, Sauthararajah Yogen, Jackson C. Robert, Hlatky R. Lynn, Gale Peter Robert și Sachs K. Rainer, 2014, sex differences in the incidence of chronic myeloid leukemia, Nature, 53(1), 55-63

Reavie Linsey, Buckley M.Shannon, Loizou Evangelia, Takeishi Shoichiro, Aranda orgilles Beatriz, Ndiaye Lobry Delphine, Abdel Wahab Omar, Ibrahim Sherif, Nakamaya I. Keiichi și Iannis Aifantis, 2013, Regulation of c-Myc Ubiquitination Controls Chronic Myelogeneous Leukemia Initiation and Progression, Cancer Cell, 23, 362-373

Talpaz M., Hehlmann R., Quintas- Cardama A., Mercer J. și Cortes Jorge, 2013, Re-emergence of interferon-a in the treatment of chronic myeloid leukemia, Leukemia, 27, 803-812

Vargas L., Hamasy A., Nore B.F. și I.E Smith, 2013, Inhibitors of BTK and ITK: State of the New Drugs for Cancer, autoimmunity and Inflammatory Diseases, John Wiley and Sons Ltd, 131-139

Vicente-Duenas Carolina, Romero-Camarero Isabel, Cobaleda Cesar și Sanchez-Garcia Isidro, 2013, Function of Oncogenes in cancer development: a changing paradigm, The EMBO Journal, 32, 1502-1513

Vogelstein B. și Kinzler K.W., 1996, The genetic base of Human Cancer, McGraw Hill Professional ,241-242

Ward C. Alister , Touw Ivo și Akihiko Yoshimura, 2000, The Jak –Stat pathway in normal and perturbed hematopoiesis, Blood, Vol.95, 1-19

Yaoyu Chen și Shaogung Li, 2014, Omacetaxine mepesuccinate in the treatment of intracectable chronic myeloid leukemia, Dove press Journal :Onco Targets and Therapy, 177-186

http://www.cancerresearchuk.org/health-professional/cancer-statistics/statistics-by-cancer-type/leukaemia/incidence

http://www.cytocell.co.uk/products/aquarius/haematology-probes/BCR-ABL-probe.asp

https://en.wikipedia.org/wiki/Chromosomal_translocation

http://www.esmo.org/

http://www.epathology.ro/index.php

BIBLIOGRAFIE

Assouline S. și J.H. Lipton, 2011, Monitoring response and resistance to treatment in Chronic Myeloid Leukemia, Current Oncology, Vol.18, nr 2, e71-e83

Byrd C. John, Jones J. Jeffrey, Woyach A.Jennifer, Johnson J.Amy și Flynn M. Joseph, 2014, Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician, Journal of Clinical Oncology, Volumul 32, Numarul 27, 3039-3047

Campbell J. Lynda, 2011, Chronic Myeloid Leukemia: Cytogenetic Methods and Applications for Diagnosis and Treatment, Cancer Cytogenetics, Humana Press, Editia a 2-a, Capitolul 4, 38-40

Caro Perez Maria și Sanchez- Garcia Isidro, 2007, BCR-ABL and human Cancer, Humana Press Inc., Volumul 1, 1-31

Cortes Jorge și Deininger Michael, 2007, Allogeneic Hematopoietic Stemm Cell Transplantation for Chronic Myelogeneous Leukemia; Molecular targets Other Than BCR-ABL: How to incorporate them into the CML Therapy?, Myeloid Leukemia, Informa, Capitolul 2, 11-16; Capitolul 9, 106-11

Crews A. Leslie și Catriona H. M. Jamieson, 2012, Chronic Myeloid Lekemia Stem Cell Biology, Current Hematologic Malignancy Reports Springer, 7, 125-132

Di Bacco Alessandra, Keeshan Karen, Mc.Kenna Sharon și Cotter . Thomas,2000, Molecular Abnormalities in Chronic Myeloid Leukemia: Deregulation of Cell Growth and Apoptosis, The Oncologist, 5, 405-415

Dingli David, Traulsen Arne, Lenaerts Tom și Pacheco M. Jorge, 2010, Evolutionary Dynamics of Chronic Myeloid Leukemia, Genes and Cancer, I(4), 309-315

Geary C.G., 2000, The story of Chronic Myeloid Leukemia, British Journal of Haematology, 110, 2-11

Hantschel Oliver și Superti Furga Giulio, 2004, Regulation of the C-ABL and BCR-ABL Tyrosine Kinase, Nature, Volumul 5, 33-44

Kantarjian M., Hagop Obrien Susan, Cortes E. Jorge, Smith L.Terry, Rios Mary Beth, Jianqin Shan, Ying Yang, Giles J. Francis, Thomas A. Deborah, Faderl Stefan, Garcia Manero Guillermo, Sima Jeha, Wierda William, Pierre J. Jean Issa, Kornblau M.Steven, Keating Michael, Debra Resta, Capdeville Renaud și Talpaz Moshe, 2002, Treatment of Philadelphia Chromosome-positive, Accelerated phase Chronic Myelogenous Leukemia with Imatinib Mesylate, Clinical Cancer Research, Vol 8, 2176-2176

Keagle S.L.Gersen, 2005, The Principles of Clinical Cytogenetics, second Edition, Humana Press Inc. Towa, New Jersey

Lodish Harvey, Berk Arnold, Zipursky S. Lawrence, Matsudaira Paul, Baltimore David și Darnell James, 2007, Cancer, Molecular Cell Biology, Media Connected, Editia a 5-a, 944-960

Marica M., 2007, Oncologie generală, Editura UMF Iași, p. 90-123

Nicolini Franck Emmanuel, Basak W.Grzergov, Soverini Simona, Martinelli Giovanni, Mauro J. Michael, Muller C. Martin, Hochhaus Andreas, Chuan Charles, Dufva H.Inge, Rege- Cambrin Giovanna, Saglio Giuseppe, Michallet Mauricette, Labussiere Helene, Morisset Stephane, Hayette Sandrine, Etienne Gabriel, Olavarria Eduardo, Wei Zhou, Senaka Peter, Apperly F.Jane și Jorge Cortes, 2011, Allogenic stem cell transplantation for pacients harboring T3151 BCR-ABL mutated leukemias, BLOOD, Vol.118, Number 20, 5697-5700

Rana Aamir, Hussain Sabir Shah, Rehman Nazia, Shaukat Ali, Ghulam Muhammad Ali, Shahzad Bhatti și Ammad Farooqi, 2011, Chronic myeloid Leukemia: Attributes of break point cluster region-abelson (BCR-ABL), Journal of Cancer Research and Experimental Oncology, vol.3, 62-66

Radivoyevitch Tomas, Jankovic M. Gradimir, Tiu V. Ramon, Sauthararajah Yogen, Jackson C. Robert, Hlatky R. Lynn, Gale Peter Robert și Sachs K. Rainer, 2014, sex differences in the incidence of chronic myeloid leukemia, Nature, 53(1), 55-63

Reavie Linsey, Buckley M.Shannon, Loizou Evangelia, Takeishi Shoichiro, Aranda orgilles Beatriz, Ndiaye Lobry Delphine, Abdel Wahab Omar, Ibrahim Sherif, Nakamaya I. Keiichi și Iannis Aifantis, 2013, Regulation of c-Myc Ubiquitination Controls Chronic Myelogeneous Leukemia Initiation and Progression, Cancer Cell, 23, 362-373

Talpaz M., Hehlmann R., Quintas- Cardama A., Mercer J. și Cortes Jorge, 2013, Re-emergence of interferon-a in the treatment of chronic myeloid leukemia, Leukemia, 27, 803-812

Vargas L., Hamasy A., Nore B.F. și I.E Smith, 2013, Inhibitors of BTK and ITK: State of the New Drugs for Cancer, autoimmunity and Inflammatory Diseases, John Wiley and Sons Ltd, 131-139

Vicente-Duenas Carolina, Romero-Camarero Isabel, Cobaleda Cesar și Sanchez-Garcia Isidro, 2013, Function of Oncogenes in cancer development: a changing paradigm, The EMBO Journal, 32, 1502-1513

Vogelstein B. și Kinzler K.W., 1996, The genetic base of Human Cancer, McGraw Hill Professional ,241-242

Ward C. Alister , Touw Ivo și Akihiko Yoshimura, 2000, The Jak –Stat pathway in normal and perturbed hematopoiesis, Blood, Vol.95, 1-19

Yaoyu Chen și Shaogung Li, 2014, Omacetaxine mepesuccinate in the treatment of intracectable chronic myeloid leukemia, Dove press Journal :Onco Targets and Therapy, 177-186

http://www.cancerresearchuk.org/health-professional/cancer-statistics/statistics-by-cancer-type/leukaemia/incidence

http://www.cytocell.co.uk/products/aquarius/haematology-probes/BCR-ABL-probe.asp

https://en.wikipedia.org/wiki/Chromosomal_translocation

http://www.esmo.org/

http://www.epathology.ro/index.php