Tipuri Enterice de Ecoli cu Rol In Boala Diareica Acuta

Medicina

Tipuri Enterice de Ecoli cu Rol In Boala Diareica Acuta

Byadmin ianuarie 1, 2024

LUCRARE

DE

DISERTAȚIE

TIPURI ENTERICE DE

E.COLI

CU ROL ÎN BOALA DIAREICĂ ACUTĂ

Cuprins

Index Abrevieri

I. Introducere

II. Caracterizare generală E. Coli

III. Tipuri de infecții. Diagnostic de laborator

IV. Materiale și Metode

V. Rezultate și Discuții

VI. Concluzii

VII. Bibliografie

Index Abrevieri

ESBL beta lactamaze cu spectru extins

BDA boala diareică acută

G( -) Gram negativ

G(+) Gram pozitiv

ETEC (enterotoxigenic Escherichia coli);

EPEC (enteropathogenic Escherichia coli);

EHEC (enterohaemorrhagic Escherichia coli);

EIEC (enteroinvasive Escherichia coli);

EAggEC (enteroaggregative Escherichia coli).

TL termolabil

TS termostabil

CFA Colonization Factor Antigen

Ag Antigen

LPZ Lipopolizaharid

CID Coagularea intravasculară diseminată

ZIE Zona de influența epidemiologica

ATB Antibiograma

AMX Amoxicilina

AM Ampicilina

UNASYN Ampicilina + Sulbactam

CEC Cefaclor

CN Cefalexin

CFP Cefoperazon

CAZ Ceftazidim

CRO Ceftriaxon

CXM Cefuroxim

CTX Cefotaxim

CIP Ciprofloxacin

DO Doxiciclina

GM Gentamicina

NA Acid Nalidixic

NOR Norfloxacin

OFX Ofloxacin

PIP Piperacilina

TIC Ticarcilina

SXT Trimetoprim + Sulfametoxazol

LEV Levofloxacin

S Sensibil

I Intermediar

R Rezistent

I. Introducere

Estimarea diversității vieții este o provocare permanentă a biologiei. In cazul microorganismelor, este complicat deoarece acestea nu sunt vizibile cu ochiul liber și diferitele criterii morfologice care le diferentiază pot fi evidențiate numai microscopic.

În ultimii 15-20 de ani, pe lângă criteriile clasice de analiză au luat amploare metodele de analiză moleculară.

Familia Enterobacteriaceae reprezintă cauza majoră de apariție a afecțiunilor diareice, astfe E. coli este considerat un „locuitor“ obișnuit al intestinului uman. Tulpinile saprofite sunt greu de distins de tulpinile intrinsec patogene astfel încât microorganismele din genul Escherichia par să fie „redescoperite“.(Baltimore et al 1990)

Transferul de material genetic conferă tulpinilor de E. coli proprietăți patogenice noi, periculoase, fiind necesară o disociere între diagnosticul taxonomic și cel al patogenității. (D. Buiuc 1998)

Astfel chiar dacă se face indentificarea microorganismului ca fiind E. coli această clasificare nu prezintă interes dacă nu a fost anexată o caracterizare a posibililor factori de patogenitate. (D. Buiuc 1998)

Astfel, E. coli devine capabilă să producă o serie de factori de virulență și patogenitate ca: adezine, invazine, toxine. Importul de gene care conferă rezistență la antibiotice, devine evident dacă genele sunt identificate în baza de gene care codifică sinteza de beta lactamaze cu spectru extins (ESBL). (Buiuc D,et al 2003)

Noțiunea de patogenitate este relativă, multe microorganisme putând fi responsabile de apariția bolii diareice, mai ales dacă apararea imunitară a organismului este alterată. (Buiuc D,et al 2003)

Această boală, a cărei frecvență și gravitate este strâns legată de sărăcie, este prezentă și în țările avansate economic.

În etiologia bolii diareice , o atenție cu totul particulară trebuie acordată și altor factori, cum ar fi: o serie de virusuri, protozoare, drojdiii, micobacterii.

Acest lucru prezintă importanță deoarece un sistem imunitar scăzut poate determina o susceptibilitate crescută la infecții, legată de germenii reputați comensali, care pot deveni patogeni ocazionali de temut. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Expresivitatea clinică este complet diferită în funcție de agentul cauzal, neexistând o diaree globală, unică ( ceea ce face să nu aibă nici un fel de semnificație expresii de tipul: boală diareică acuta ) (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Sindromul clinic al bolii diareice acute (BDA) infecțioase este determinat de un numar mare și mereu în creștere de agenți etiologici. (Buiuc D,et al 2003)

Sindromul diareic infecțios implica preocupari în diverse domenii:

– clinice – prin intensitatea și gravitatea manifestarilor

– epidemiologice – prin manifestarile extensive (endemice și, mai ales, epidemice) ale procesului epidemiologic;

– sanatatea publica – prin nivelul de morbiditate și mortalitate, și îndeosebi a costurilor ridicate ale asistenței medicale.

Enteritele de origine bacteriană constituie un domeniu vast , cu multe aspecte necunoscute, ceea ce incită microbiologul să ia o atitudine critică în conduita investigației etiologice (Felicia Toma Sacarea, 2006)

II. Caracterizare generală E. Coli

Denumirea genului a fost dată după numele cercetătorului Theodor Escherich care în 1885 a fost cel ce a izolat specia tip a genului.

Au fost considerate bacterii comensale ale intestinului gros pâna în 1935 când s-a demonstrat rolul etiologic jucat de o tulpina de E. coli implicată într- un episod de diaree la nou-născuti. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Habitatul natural al E. coli este tractul gastrointestinal al animalelor cu sânge cald și al oamenilor.

În intestinul omului E. coli reprezintă flora dominantă a intestinului gros având un rol important în menținerea unei fiziologii normale a acestuia și în sinteza unor proteine din grupul B si K. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Prezența constantă a tulpinilor de E.coli în intestinul uman și animal precum și în materiile fecale au facut din această bacterie indicatorul de poluare fecală a mediului, în special al apei. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Figura 1. E.coli (Microscopie electronica , Lefebvre et al, 2010)

Nici un alt germen nu a fost atât de bine studiat: E. coli este specia „cobai“, ce a făcut obiectul studiilor de biochimie, fiziologie și genetică, dovedindu-și permisivitatea în acceptarea de material genetic exterior, în prezența plasmidelor și fagilor. (Buiuc D,et al 2003)

Genul Escherichia, constituent al florei comensale intestinale, poate determina:

-infecții oportuniste intra-abdominale (colecistite, abcese hepatice, peritonite) si/sau

-extradigestive (infecții ale plăgilor, pneumonii, endometrite după avort septic), care pot evolua cu șoc endotoxinic. (Bacteriologie-medicală – Felicia Toma Sacarea).

E.coli este un bacil G(-) care prezintă uneori forme filamentoase. Majoritatea speciilor prezintă cili peritrichi și sunt necapsulate. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Există însă tulpini de E. coli imobile, unele prezentând capsulă.

Sunt bacili cu dimensiuni medii, cu capete rotunjite, cu o dispoziție în general necaracteristică. Nu prezintă fenomenul de sporulare. (Buiuc D,et al 2003)

Majoritatea enterobacteriilor sunt necapsulate.

Facultativ anaerobe, enterobacteriile nu sunt pretențioase nutritiv.(Lucia Debeleac et al 2003)

Posedă un mecanism complex de reglare a metabolismului celulei bacteriene care îi permite să-și asigure o viață ușoară: sintetizează doar acele enzime necesare utilizării compușilor din mediu.

Va opri sinteza enzimelor necesare obținerii unor metaboliți atunci când acestia sunt prezenți în mediul de unde îi poate folosi ca atare. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Ca răspuns la modificările de temperatură sau osmolaritate își pot modifica dimensiunea porilor prin modificări ale porinelor constituente ale membranei externe.

Astfel îsi pot mări dimensiunea porilor pentru a acumula moleculele mari de nutrienți sau pentru a elimina substanțele inhibitoare. (Lucia Debeleac et al 2003)

Au o capacitate deosebită de adaptare la modificarile de mediu cum ar fi prezenta unor minerale, modificari de pH, temperatura, osmolaritate. (Buiuc D,et al 2003)

Pot sesiza prezența sau absența unor substanțe chimice sau gaze în mediul său de viață și, cu ajutorul cililor, se poate apropia sau îndeparta de acestea.

Pot de asemenea să devină imobile și să producă fimbrii de adeziune care să le permită aderarea de substratul specific. (Lucia Debeleac et al 2003)

Tulpinile de E. coli posedă următoarele structuri antigenice:

– antigenul „O” sau antigenul somatic. Este antigenul cu specificitate de grup care corespunde poliozidelor fixate pe lipopolizaharidele peretelui bacterian.

Este termostabil și acido-alcoolo-rezistent. Prin reacții de aglutinare au fost identificate 180 de serogrupe antigenice „O”. Ag O din complexul LPZ imprimă specificitate de grup la tulpinile aparținând aceleiași specii. (Lucia Debeleac et al 2003)

Multe serogrupe „O” ale tulpinilor de E.coli prezintă reacții încrucișate cu antigene ale unor tulpini de Klebsiella, Salmonella, Providencia, Vibrio; iar altele sunt comune cu grupul Shigella. (Lucia Debeleac et al 2003)

– antigenul „H” sau antigenul flagelar. Ag H cu specificitate de tip, prezent numai la tulpinile mobile, diferențiază tulpinile aparținând aceluiași serogrup. Prezent doar la tulpinile ciliate, este format dintr-o proteină specifică numita flagelină.

Are specificitate de tip, este termolabil și este inactivat de alcool. Prin reacții de aglutinare au fost evidențiate, 56 de serotipuri „H”: (Lucia Debeleac et al 2003)

– antigenul „K” sau antigenul capsular. Este de natură polizaharidică, are specificitate de tip, a fost identificat la tulpini uropatogene de E.coli și la tulpini implicate în cazuri de meningită neo-natală (antigen K-1). (Lucia Debeleac et al 2003)

Determină inaglutinabilitatea tulpinilor care-l posedă. Se cunosc 103 antigene K. Ca exemple se pot mentiona Ag K (E.coli, Klebsiella) sau Ag Vi (Salmonella Typhi, S. Paratyphi C, Citrobacter), cu specificitate de tip, de natură polizaharidică. (Microbiologie – Lucia Debeleac, Ed. Medicală Amaltea, București, 2003)

Antigenul F de natură proteică este prezent la nivelul fimbriilor. Antigenele de aderență (adezine, pili, fimbrii), de natură proteică.

Pe baza antigenelor O, H si K au fost identificate peste 700 de serotipuri de E.coli. (Lucia Debeleac et al 2003)

Serotipia este utilă în identificarea acelor tulpini implicate în procese patologice umane.O caracteristică aparte o constituie factorii de virulență.

LPZ-ul (Lipopolizaharid) este o endotoxină ce face parte din structura peretelui celular bacterian și este eliberat în mediu în momentul pierderii integrității celulare.

Efectele provocate de LPZ sunt comune la toate bacteriile G(-). În cantități mari are ca efect coagularea intravasculară diseminată (CID) și scade tensiunea .

O altă categorie este constituită de endotoxinele termolabile și termostabile ambele evidentiate atât la E.coli cât și la alte microorganisme.

Ambele tipuri de enterotoxine sunt responsabile de apariția unor scaune diareice. În cadrul speciei se disting numeroase variante care exprimă caractere de patogenitate, variante numite patotipuri.

E.coli este patogenă prin virulență și/sau toxigenitate. (Lucia Debeleac et al 2003)

Determinanții de patogenitate Tabel 1.

Determinanții de patogenitate Tabel 2.

III. Tipuri de infecții. Diagnostic de laborator

Studiile de microbiologie clinice din țara noastră ce folosesc tehnici moderne de biologie moleculară, pun accent pe descrierea genotipului de enteroagresivitate a tulpinilor de E. coli izolate prin tehnica coproculturii standard sau folosind metode genetice aplicate direct pe prelevat. (D.Buiuc et al 2008)

Enterobacteriile din Genul Escherichia sunt, în marea majoritate, saprofite sau conditionat patogene.

Cu toate acestea există patotipuri (fenotipuri patogene) de E. coli implicate în patologia umană:

patotipuri diareigene

patotipuri uropatogene

alte patotipuri

Membrii acestui gen pot determina infecții intestinale și extraintestinale.

Infecții intestinale

Infecțiile intestinale, sau enterocolitele infecțioase, sunt determinate de cele cinci patotipuri diareigene recunoscute, fiecare atui gen pot determina infecții intestinale și extraintestinale.

Infecții intestinale

Infecțiile intestinale, sau enterocolitele infecțioase, sunt determinate de cele cinci patotipuri diareigene recunoscute, fiecare având subgrupe serologice și determinând manifestări clinice distincte:

ETEC (enterotoxigenic Escherichia coli);

EPEC (enteropatogenic Escherichia coli);

EHEC (enterohemoragic Escherichia coli);

EIEC (enteroinvasiv Escherichia coli);

EAggEC (enteroaggregativ Escherichia coli).

Tulpinile ETEC afecteaza toate categoriile de vârstă deși reprezintă etiologia majoră a diareei copiilor și turiștilor în țările cu educație sanitară deficitară, numită și „diareea turiștilor”. Sursa de infecție este reprezentată de om și animal iar calea de transmitere o reprezintă alimentele și apa contaminate. (D.Buiuc et al 2008)

Factori de patogenitate (codificați plasmidic):

– enterotoxină termolabilă (TL) de tip A-B, asemănătoare structural și funcțional cu toxina holerică, activează adenilatciclaza cu creștera secreției de apă și electroliți;

– enterotoxina termostabilă (TS) activează guanilatciclaza, cu efect asemănător; adezinei fimbriale (CFA I – Colonization Factor Antigen, CFA II, CFA IV)

Odată patrunsă pe cale orală, ETEC colonizează intestinul subțire și elaborează o serie de enterotoxine care determina cresterea secretiei de apa si electroliti în lumenul intestinal (toxina TL) si inhibarea absorbtiei de lichid intestinal (toxina TS).

Dupa o incubație de 24-72 de ore se instalează simptomele: diaree apoasă fără febră, colici abdominale, grețuri, vărsături. (D.Buiuc et al 2008)

Tulpinile EPEC induc o diaree apoasă asemanatoare cu cea din infecțiile cu ETEC afectând cu precadere copiii. Factorii de patogenitate sunt reprezentați de adezine fimbriale și proteine din membrana externă (intimina) ce determină aplatizarea microvililor de la nivelul intestinului subțire și modificări de infrastructură celulară, cu răspuns inflamator local. (D.Buiuc et al 2008)

EPEC reprezintă primul fenotip diareigen descris, aparținând anumitor serotipuri care cauzează diaree apoasă la copilul cu vârstă sub 2 ani, uneori cu evoluție prelungită; evolueaza cu febră, vărsături și sindrom inflamator (celule inflamatorii în scaun) și poate fi la originea unor episoade epidemice nosocomiale.

EPEC nu produce enterotoxine TL sau TS ci doar cantitati mici de toxină Shiga-like cu efect enterotoxic și citotoxic.

Prin intermediul adezinelor se leagă de epiteliul intestinal la nivelul colonului determinând distrugerea microvilozitatilor cu răspuns inflamator, fără semne de invazie.

Ca urmare se instalează malabsorbția, diareea apoasă, persistentă, acompaniată de febră și vărsături. (D.Buiuc et al 2008)

Tulpinile EAggEC au capacitatea de a adera agregativ de celulele mucoasei intestinale cauzând diaree fără fenomene invazive sau inflamatorii. Este patogenă prin adezine fimbriale (fimbrii de adeziune) (AAF I și II), citotoxine care determină necroza microvililor și răspuns inflamator în submucoasă; enterotoxina agregativa codificata plasmidic si prin hemolizina asemanatoare celei sintetizate de tulpinile uropatogene. Tulpinile de Escherichia coli enteroagregative sunt asociate cu diareea apoasa, persistentă instalată la sugari, copii mici și imunodeprimați (HIV).

Tulpinile EIEC aderă la celulele epiteliale ale colonului cu ajutorul unor adezine non-fimbriale. Sunt patogene prin invazivitate: penetrează și se multiplică în interiorul enterocitului pe care îl distrug. Nu produc enterotoxina. Sunt apropiate din punct de vedere biochimic si antigenic de Shigella. (D.Buiuc et al 2008)

Afectează adultii și copiii care vor prezenta colici abdominale, febră, scaune diareice muco- sanguinolente asemanatoare celor din dizenterie.

Aceste tulpini au fost recent recunoscute ca agenti etiologici ai sindromului hemolitic și uremic asociat consumului de alimente contaminate.

Prin intermediul intiminei aderă de celulele epiteliului colonului. Aceste tulpini sunt moderat invazive patogenitatea lor fiind datorată în principal producerii unei toxine „Shiga- like” numita și vero-toxină a carei sinteză este stimulată de deficienta de fier. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Toxina este responsabila de raspunsul inflamator local intens produs de tulpinile EHEC si de anemia hemolitica, trombocitopenia si insuficienta renala acuta determinate de lezarea endoteliului capilarelor. Scaunele diareice cu putin lichid, mult sânge si mucus continând polimorfonucleare sunt însotite de febra, greturi, varsaturi si colici abdominale. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Tabel 3. E.coli diareigen: factori de patogenitate

Infectii extraintestinale

Infectii urinare ( Patotipul uropatogen )

Tulpinile uropatogene de E.coli (UPEC) sunt responsabile de 90% din infectiile tractului urinar.

Factorii de patogenitate sunt reprezentati de:

– fimbrii de tip P (manozo-rezistente) și tip 1 (manozo-sensibile); fimbriile tip P, numite așa deoarece aderă specific de antigenul de grup sanguin P),

– adezine din membrana externă;

– capsula polizaharidică (anumite serotiopuri capsulare – K1, 2, 3, 5, 12 și 13);

– siderofori;

– hemolizine;

Colonizează intestinul, regiunea periuretrală și uretra distală si determină >90% din infecțiile urinare necomplicate.

Sunt afectate cu precadere femeile tinere, active sexual, colonizate initial în intestin cu tulpini UPEC. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Tulpinile uropatogene apartin serotipurilor O 1,2,4,6,7,16,18,75 si serotipurilor K 1,2,3,12,13 care poseda adezine ce permit aderarea de epiteliul urinar. Infecțiile urinare înalte pot evolua bacteriemic. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Infectii intra-abdominale

E. coli este responsabila de supuratii peritoneale, biliare, apendiculare, genitale. Tulpinile respective au proprietati antifagocitare, au actiune citotoxica asupra polinuclearelor, poseda sisteme de captare a fierului. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Bacteriemie ( Patotipul bacteriemic )

Este cauzata de tulpini de Escherichia coli cu mare capacitate invaziva. Aceste tulpini poseda siderofori, citotoxine, capsula si lipopolizaharide care asigura protectia fata de actiunea bactericida a serului. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Soc endotoxinic

Apare în urma distrugerii masive de celule de catre Escherichia coli eliberându-se brusc o cantitate mare de endotoxina ceea ce determina sindromul de raspuns inflamator sistemic provocat de eliberarea masiva de interleukina-1 si factor de necroza tisulara (TNF). Pacientul prezinta febra, hemoragii, colaps circulator. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Meningita neonatala

Este cauzata de tulpini de Escherichia coli care sintetizeaza antigenul capsular K-1 si constituie factorul major de patogenitate.

Este un polimer de acid N-acetil neuraminic, asemănător cu antigenul capsular de grup B al N. meningitidis, asociat cu unele antigene, ca O7 și O18.

Aceste tulpini ajung din naso- faringe sau din tractul intestinal în torentul sanguin si pe aceasta cale la meninge. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Infectii nosocomiale

Apar datorita raspândirii infectiei de catre personalul medical sau prin instrumentarul medical la pacienti care prezinta factori predispozanti: diabet, traumatisme, boli pulmonare cronice etc. (Felicia Toma Sacarea, 2006)

Diagnostic de laborator

Pentru stabilirea diagnosticului etiologic și patogenic al bolii diareice este necesară realizarea într-o primă etapă a unui cadru anamnestico-clinic cât se poate de corect obținut prin relația cu părinții. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Datele furnizate de aceștia stau la baza efectuării unui număr variabil de investigații paraclinice și de laborator, unele fiind ușor de efectuat, altele presupunând o dotare superioară. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Diagnosticul de laborator este bacteriologic si se bazeaza pe identificarea tulpinilor de Escherichia coli în variate produse patologice: sânge, urina, materii fecale, bila, puroi, exsudate, lichid cefalo-rahidian, alimente, varsaturi, probe de organe recoltate de la cadavru. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Diagnosticul de laborator presupune cultivarea pe medii pentru enterobacterii. Identificarea pe baza caracterelor biochimice se completeaza cu serotipia pentru tulpinile EPEC si EHEC.

În ser, lichid cefalo-rahidian sau urina poate fi identificat antigenul K-1 prin reactii de latexaglutinare realizându-se astfel un diagnostic rapid mai ales la nou – nascut sau sugar.

Exista însa posibilitatea unor reactii încrucisate cu antigenul de grup B al meningococului.

Se pot evidentia de asemenea adezinele datorita capacitatii lor de a aglutina hematiile umane sau animale.

Efectul citotoxic al verotoxinei produse de E. coli O157:H7 se studiaza pe culturi monostrat Vero, verotoxina ducând, dupa intrarea ei în celule, la rotunjirea si separarea celulelor între ele.

Procedeele ELISA se pot folosi pentru detectarea unei proteine de pe membrana exterioara a celulelor EIEC (antigen marker pentru virulenta), dar si la evidentierea altor serotipuri de E. coli prin detectarea antigenelor specifice de grup, de tip si a exotoxinelor.

Capacitatea invaziva a tulpinilor EIEC este studiata prin testul Sereny pe cobai sau pe culturi de celule HeLa. Materiile fecale mai pot fi examinate si prin imunofluorescenta. (Lucia Debeleac et al 2003)

Prin reactii de hibridizare si PCR se pot identifica diferite tulpini de E. coli.

Dintre pacienții cu vârste cuprinse între 0-4 ani, 141 (47%) au fost de sex masculin, iar 159 (53%) de sex feminin. Această observație este în concordanță cu semnalările din literatură care atribuie participarea patotipurilor intestinale de E.coli mai frecvent la copii decât la adulți. (Lucia Debeleac et al 2003)

Figura 1. Repartiția pe sexe a pacienților încadrați în grupele de vârstă de 0-4 ani și peste 4 ani

S-a introdus noțiunea de „zona de influența epidemiologica“ (ZIE), de care depinde laboratorul de analize bacteriologice și noțiunea de „ecologie bacteriana“, pentru a defini parametrii care caracterizeaza coprocultura standard și pe cea complementara. (Lucia Debeleac et al 2003)

Deosebirile între zonele temperate și calde, diareea copilului și cea a adultului, nivelurile diferite de dezvoltare economica, pot fi considerate criterii importante de aplicare a coproculturii complementare sau coproculturii standard (Lucia Debeleac et al 2003)

Coprocultura standard si complementara

Conceptul de coprocultura tradiționala este uneori confundat cu acela de coprocultura standardizata, în timp ce coprocultura complementara se poate confunda cu cercetarea factorilor de virulența. (Lucia Debeleac et al 2003)

Acest lucru provine din faptul ca inițial, analiza „standardizata“ s-a suprapus peste studierea speciilor bacteriene cu caracter enteropatogen cu ajutorul tehnicilor clasice de bacteriologie. (Lucia Debeleac et al 2003)

Microorganismele cu caracter comensal, care au dobandit caractere enteropatogene, sunt studiate folosind tehnici complementare, abordand aspectele legate de factorii de virulența elaborați. (Lucia Debeleac et al 2003)

Din rațiuni legate de raportul eficiența-cost, laboratorul nu poate cerceta sistematic, de rutina, toți agenții susceptibili a fi enteropatogeni.

În funcție de circumstanțe, microbiologul deruleaza investigațiile progresiv, parcurgând etapele coproculturii standard și ale celei complementare, doua tehnici care nu se exclud una pe cealalta, ci doar se completeaza. (Lucia Debeleac et al 2003)

Directiile trasate de clinician si microbiolog hotarasc tipurile de examinari ce trebuie efectuate. (D.Buiuc et al 2008)

Tehnica coproculturii standardizate pentru copil și adult trebuie sa constituie un „standard local“ bazat pe metodologii și tehnici alese conform caracteristicilor epidemiologice care apartin zonei de activitate a laboratorului, microorganismelor enteropatogene din aceasta zona, nivelului economico-social si alimentatiei. (D.Buiuc et al 2008)

În zonele temperate, aceasta analiza se bazeaza doar pe studierea patogenilor ca Salmonella sp. și Shigella sp., în timp ce în zonele intertropicale, este necesar sa fie incluse în coprocultura standardizata și alte bacterii, cu incidența crescuta: ex. Fam.Vibrionaceae. (D.Buiuc et al 2008)

Coprocultura complementara este în principal practicata în caz de eșec al analizei standardizate sau daca pacientul a contractat boala diareica în afara zonei de influența epidemiologica, de care depinde laboratorul (diaree dupa un sejur într-o zona endemica, unde etiologia bacteriana poate fi diferita de cea din care provine pacientul).

În realizarea efectiva a unei coproculturi, se ține cont de:

– Bacteriile a caror virulența este legata de caracterele de specie, la care identificarea se face prin metode tradiționale (caractere enteropatogene constitutive și exprimate). (Lucia Debeleac et al 2003)

– Stabilitatea caracterelor de patogenitate asociata cu anumite proprietați culturale,metabolice sau structurale, ce au permis o analiza bazata pe tehnici de identificare morfologica, biochimica și antigenica (Lucia Debeleac et al 2003)

Bacteriile cu un caracter enteropatogen câștigat și/sau parțial sub control cromosomic a caror identificare se bazeaza pe punerea în evidența a factorilor de virulența exprimati.

Daca caracterele de cultura și proprietațile biochimice sau antigenice nu permit separarea lor de microorganismele endogene; se poate analiza prezența unor factori de patogenitate particulari, ramânând doar ca si diagnostic de prezumpție. (Lucia Debeleac et al 2003)

Observarea riguroasa a izolatelor asociata cu anumite manifestari clinice și o buna cunoaștere a condițiilor epidemiologice locale, permit suspectarea prezenței acestor bacterii (Lucia Debeleac et al 2003)

IV. Materiale și metode

Examen coproparazitologic :

Constituie examenul de bază pentru evidențierea unor infecții parazitare.

Prelevarea eșantioanelor de materii fecale se face la debutul bolii când se presupune că pacientul este în faza acută, agenții patogeni fiind în numar mare în produsul patologic și de asemenea înaintea oricărui tratament antibiotic, antiparazitar sau cu pansamente digestive. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Procedura se aplică în laboratorul clinic pentru examinarea helminților sau a altor elemente suspecte. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Examenul probei de materii fecale prezintă ca și etape

examenul macroscopic;

examenul microscopic (preparat direct in soluție Lugol ,ser fiziologic)

La nivel de laborator se pot identifica:

protozoare din genul: Entamoeba, Giardia, Blastocystis;

sporozoare: coccidioze intestinale;

trematode hepatice si intestinale, schistosomioze;

cestode din genul: Taenia, Hymenolepis-ouă și proglote;

nematode: Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ancylostoma duodenale/Necâtor americanus, Strongyloides stercorălis-ouă, larve și parazit adult. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Examenul macroscopic al materiilor fecale

Materiale :

Manuși de protectie

baghetă de plastic de unică folosință sau ansa de plastic.

capac / placi Petri;

recipient de recoltare

Se apreciază:

cantitatea scaunului – se asigură o cantitate suficientă de probă (10 g materii fecale);

culoare, miros, prezența de elemente deosebite sau suspecte de a fi parazitare, elemente patologice ca mucus, puroi, sânge etc.

consistența:

scaun format (pastrează forma intestinului);

scaun semiformat (se turtește în vas);

scaun moale (curge în vas);

scaun diareic (apos).

Examenul microscopic al probei de materii fecale pe preparatul proaspăt

În scaun, se pot evidenția microscopic un numar foarte mare de specii de paraziți ai tubului digestiv, mai rar ai organelor anexe, excepțional din alte organe sau din tranzit, proveniți de la animale, din mediul exterior și îngerați odată cu alimentele de origine animală sau vegetală. Preparatele din scaun se examinează microscopic cu obiectivul uscat X10 și apoi cu X20, X40 .

Proba de materie fecală se studiază microscopic pe preparat direct în ser fiziologic și preparat în soluție Lugol

Suspensia de materii fecale se face în ser fiziologic, care pastrează viabilitatea trofozoiților protozare sau a larvelor de helminți, precum și culoarea naturală a probei.

Soluția Lugol colorează membrana chiștilor și detaliile interne de structură. Colorează de asemenea amidonul în diferite stadii de digestie. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Materiale și reactivi :

mănuși de protectie;

microscop

lamă;

lamelă;

baghetă de plastic de unică folosință sau ansa de plastic.

capac / placi Petri;

recipient de recoltare,

ser fiziologic;

alcool pentru degresarea lamelor;

soluție Lugol: se dizolvă 2 g iodură de potasiu într-o cantitate mică de apă distilată, se adaugă 1g iod, se dizolvă, se completează cu apă la 100ml (de multe ori soluția se cumpără gata preparată) (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Mod de lucru :

Se folosesc eșantioane proaspete de materii fecale, recoltate în recipiente de unică folosință, comerciale, prevăzute cu o spatulă pentru prelevarea produsului.

Dacă eșantionul de materii fecale nu este analizat în decurs de o oră de la recoltare, proba respectivă se sigilează și se refrigerează. Înainte de a fi lucrată proba respectivă trebuie să fie adusă la temperatura camerei.

Se examinează între lamă și lamelă o cantitate mică de materii fecale, prelevată din diferite parti ale scaunului, amestecată în ser fiziologic.

Preparatul trebuie să cuprindă aproximativ 1,5 – 2 mg materii fecale

se protejează probele și reactivii de razele solare;

condițiile de mediu optime sunt: 15 – 32ºC și 80 % umiditate maximă relativă,

există pericol de contaminare a platinei microscopului, mâinii sau mesei de lucru; fiecare probă poate reprezenta o sursă potențială de infecție și ca atare se utilizează mănuși de protecție pentru a preveni expunerea la diverși patogeni;

materialele folosite trebuie curațate minuțios, condiție esențială pentru obținerea unor rezultate cât mai reale.

sticlăria care prezintă defecțiuni (zgârieturi, fisuri) se scoate din uz.

Lamele, lamelele și alte materiale utilizate sunt de unică folosință (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Preparat direct în ser fiziologic

Pe o lamă se pune o picătura de ser fiziologic.

Cu ajutorul unei baghete sau anse, se prelevează o mică cantitate din probă și se amestecă pe lamă în picătură de ser fiziologic apoi se acoperă cu o lamelă și se examinează la microscop.

Preparatul trebuie examinat cât mai repede, deoarece odată uscat, devine imposibil de citit. Trebuie să se utilizeze lamele cu dimensiuni de 20/20 mm, astfel încât marginile lor sa fie cuprinse înăuntrul marginilor lamei.

Suspensia trebuie să fie uniformă, iar lamela trebuie asezată orizontal și nu înclinată pe reziduurilele celuluozice din probă.

Preparatul se examinează în întregime, deplasând lama, fâșii orizontale, cu ajutorul cursorilor platinei. Examinarea se face cu obiectivul10x iar identificarea fiecărui element parazitar se face cu obiectivul 20x, 40x. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Preparatul în soluție Lugol

Tehnica este asemănătoare cu cea a preparatului direct (în loc de ser fiziologic se pune soluție Lugol).

Examinarea se face cu obiectivul 10x iar identificarea cu 20x, 40x.

Metoda în care se utilizează soluția Lugol este indicată în special pentru evidențierea chisturilor de protozoare, care se coloreaza în brun.

Examenul microscopic al probei de materii fecale pe frotiul colorat

Se efectuează pe două frotiuri colorate cu albastru de metilen sau colorația Gram (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Colorația cu albastru de metilen

Materiale si reactivi :

– lame de microscop,

– anse bacteriologice de metal sau de unică folosință

– bec de gaz

– mănuși

– cronometru

– stativ

– alcool medicinal

– soluție de albastru de metilen

Mod de lucru :

Pe frotiul fixat se adaugă soluție de albastru de metilen timp de 2 minute.

Se îndepartează colorantul și se spală cu apă, se usucă apoi pe hartie de filtru sau în stativ.

Se observă prezența leucocitelor bazofile,a celulelor epiteliale și a eritrocitelor specifice proceselor invazive. (Maria D. Delost et al 2014)

La microscopul electronic prin colorația Gram vor apărea ca și bacili gram negativi, cu capete rotunjite și dimensiuni medii, neavând o dispoziție caracteristică .Pot fi mobili (formele cu cili) sau imobili, necapsulati, nesporulati. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Colorația Gram este o tehnică folosită în microbiologie,care permite clasificarea bacteriilor în funcție de afinitatea tinctorială a peretului bacterian în bacterii gram negative care se colorează în roz până la roșu și bacterii gram pozitive care apar colorate în albastru – violet . (Maria D. Delost et al 2014)

Principiul metodei se bazează pe faptul că violetul de gențiană care este un colorant bazic, pătrunde în celula bacteriană și reacționează cu componenții acizi din citoplasmă, formând apoi un complex stabil intracelular după tratarea cu soluție lugol.

Acest complex insolubil este caracteristic bacteriilor Gram pozitive care nu se decolorează cu alcool – acetonă. (Maria D. Delost et al 2014)

Bacteriile Gram negative în care nu se formează complexul stabil intracelular se vor decolora și trebuie recolorate cu alt colorant de contrast ( de ex.fuxină).

Materiale și reactivi :

– lame de microscop,

– anse bacteriologice de metal sau de unică folosință

– bec de gaz

– mănuși

– cronometru

– stativ

– alcool medicinal

– trusa gram formată din: violet de gențiană, soluție lugol (iodură de potasiu), alcool-acetonă și fuxină diluată 1/10 .

Mod de lucru:

Pe o lamă de microscop se etalează colonii de 2-3 zile sau material proaspăt.

Se întinde uniform în strat subțire. Se usucă și se fixează prin treceri deasupra flăcării de 2-3 ori .

în prima etapă frotiul uscat și fixat se acoperă cu soluție de violet de gențiană timp de 1 minut;

se îndepartează colorantul se spală cu apă și se adaugă soluție lugol timp de 1-2 minute;

se îndepartează soluția lugol fără a se spala și se decolorează cu alcool-acetonă până când soluția devine incoloră

se spală cu apă și se adaugă fuxină timp de un minut, se spala apoi cu apă și se usucă pe hartie de filtru sau în stativ . (D.Buiuc et All 2008)

Coprocultura

Examenul coprobacteriologic reprezintă examenul de baza al diagnosticului microbiologic al sindromului diareic infecțios este reprezentat de cultivarea materiilor fecale – coprocultura. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Aceasta presupune izolarea agentului microbian/micotic pe medii adecvate și identificarea lui pe baza caracteristicilor : morfologice, de cultivabilitate , enzimatice și antigenice.

Materiale și reactivi :

Termostat

Etuva

Autoclav

Microscop

Hota cu flux laminar

Ph metru

placi Petri cu diametrul de 90 mm cu medii de cultură

tuburi cu bulion selenit

anse calibrate de unică folosință de 0,01 ml sau de 0,001 ml sterile;

anse metalice, pense

mănuși de protectie,masca

recipiente sterile din plastic (utilizare unica) cu mediu de transport Carry-Blair

container pentru deșeuri contaminate

medii de însamânțare: solide (SS/ADCL/MC) și lichide (Bulion selenit)

mediu de transport Carry – Blair cel mai folosit

Mod de lucru :

Probele se recoltează de către pacient și se transportă numai în coprorecoltoare sterile cu mediu de transport Carry-Blair. În cazul copiilor cu episoade diareice, scaunul poate fi prelevat și din scutece sau lenjerie . De asemenea se practică la nou nascuți și copii prelevarea cu tamponul rectal . (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Figura 2. Mod de lucru Coprocultura (D.Buiuc et al 2008)

Daca proba nu este supusă examinării microbiologice în maximum 2 ore de la recoltare, coprorecoltorul cu proba respectivă se pastrează la frigider 2-80 C, iar înainte de a o examina microbiologic este necesar aducerea probei la temperatura camerei.

Însămanțările mediilor de cultura se fac în interiorul hotei cu flux laminar vertical

Materiile fecale, emise spontan, aduse la laborator în coprorecoltoare cu mediu de transport sunt însămânțate cât mai curand posibil.

Pentru aceasta, se prelevează mici porțiuni de fecale din locuri diferite, (în special din porțiunile mai moi cu striuri sanguinolente sau mucus, dacă acestea există) care vor fi amestecate și omogenizate în 2-5 ml ser fiziologic steril (dacă scaunul este lichid, aceasta operație este mult mai ușoară). Cu aceasta suspensie se însamanțează mediile de cultură utilizate.

Însămânțarea suspensiei de materii fecale

Pentru însămânțarea suspensiei de materii fecale se folosesc trei medii de cultura, doua solide (ADCL si SS) –selective- si unul lichid (Bulion selenit) –de imbogatire, care a doua zi se trece pe medii solide (SS si MC); la copii sub 2 ani se face si o prima trecere pe un mediu mai putin selectiv (MC) pentru EPEC. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

insamantarea mediilor solide se face cu ansa in striuri paralele suprapuse.

se omogenizeaza, cu grija, prin agitare fara a produce spuma, suspensia de materii fecale.

se imerseaza ansa imediat sub nivelul fluidului si i se imprima câteva miscari pe verticala in sus si in jos. Se retrage ansa din fluid in pozitie verticala si cu viteza moderata a miscarii .

se descarca ansa in striuri paralele suprapuse, pe sfertul de placa cu mediul ADCL si SS. Placa Petri cu mediu SS se imparte in patru cadranesi se incubeaza la termostat 370C timp de 24 de ore.

se mai repeta o data operatiunea de incarcare a ansei cu prelevat (suspensie de materii fecale) si se descarca pe mediul ADCL folosind aceiasi tehnica.

însămânțarea mediului lichid Bulion selenit se face asa cum s-a mai specificat prin realizarea amestecului dintre suspensia de materii fecale ramasa de la insamantarea mediilor solide si 2,5-3 ml de Bulion selenit.

incubarea mediilor selective se face la 370C timp de cel putin 24 de ore.

dupa terminarea perioadei de incubare se face identificarea preliminara si se trece la replicarea coloniilor patogene si eliminarea celor nepatogene.

Replicarea se face din coloniile bine individualizate in scopul obtinerii unor culturi pure necesare testelor finale de identificare biochimică si antibiogramei izolatelor clinic semnificâtive atunci cand ea este ceruta. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

in cazul mediului ADCL se replica coloniile semitransparente, necolorate, lactozo – negative cu sau fara centru negru (Salmonella, Shigella,Yersinia).

in cazul mediului SS se replica coloniile semitransparente, necolorate, lactozo – negative,cu suprafata umeda,usor bombata,cu sau fara centrul coloniei negre (Salmonella, Shigella, Yersinia)

in cazul mediului MC se replica coloniile lactozo-pozitive (EPEC), roz, sau coloniile mici, convexe, lactozo–negative, necolorate, transparente fara modificari de culoare a mediului (Salmonella, Shigella, Yersinia).

Replicarea coloniilor de pe mediile selective se face respectand urmatoarele reguli:

Din coprocultura efectuata unui copil sub 2 ani se replica cel putin 3 colonii lactozo-negative. Atunci cand nu există colonii lactozo – negative se replica minimum 10 colonii lactozo – pozitive, de preferat de pe mediile slab selective.

Din coprocultura unui adult se repica minimum 3 colonii lactozo – negative, de preferat de pe mediile moderat selective (mediul SS/ADCL)

In focare epidemice de boala diareica se repica minimuum 3 colonii lactozo – negative pentru o coprocultura. Cand nu există lactozo – negativi se replica minimum 10 colonii lactozo – pozitive pentru identificare si testarea patogenitatii.

Repicarea coloniilor de pe mediile selective se face de regula pe mediul de cultura MC sau SS

Urmatoarea etapă o constitue incubarea placilor cu coloniile replicate, incubare ce dureaza 24 de ore. Dupa terminarea incubarii se scot placile si are loc identificarea preliminara. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Identificarea izolatelor

In functie de aspectele de cultivabilitate pe mediile selective sau diferentiale, se prefigureaza una sau alta din gruparile de patogeni enterici in care izolatul a fost incadrat. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Coloniile lactozo pozitive de pe mediul selectiv sunt repicate pe mediile de identificare biochimică – TSI, MIU, MILF, SIM. In ziua urmatoare, de pe mediul TSI, daca se sugereaza o Salmonella, Shigella sau Yersinia, se identifica cu seruri de aglutinare specifice. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Pentru lucrarea de fata au fost studiati germenii apartinand genului E.Coli.

Caractere de cultura

E.Coli este un germen putin pretentios, creste pe medii avand glucoza in compozitie.Pe mediile lichide(bulion) produce tulburarea mediului iar pe cele solide formeaza colonii de tip S sau R. Este aerob , facultativ anaerob. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Creste atat pe medii clasice(bulion, geloza simpla, geloza-sange)cât si pe medii selective care contin lactoza: mediu Mac Conkey, mediu ADCL, mediu AABTL, Istrati-Meitert etc.

Pe aceste medii lactozate se vor diferentia coloniile lactozo-pozitive de cele lactozo-negative . Pe mediul de cultura selectiv cu lactoza ex.Mac Conkey formeaza colonii rosii sunt lactozo pozitivi .

Cei lactozo negativi (Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia) formează colonii transparente.

Tulpinile de E.Coli care produc infectii urinare determina hemoliza beta pe mediul geloza-sange adica liza hematiilor, o zona completa (clara) in jurul coloniilor, cu diametrul variabil, in functie de grupul antigenic din care fac parte . (Lucia Debeleac et al 2003)

Caractere biochimice si de metabolism

Germenii din familia Enterobacteriaceae prezinta urmatoarele proprietati biochimice :

– fermenteaza glucoza de asemenea si alti carbohidrati, producand acid si gaz ;

– fermenteaza lactoza sunt lactozo pozitivi – E.Coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia etc.

– sunt oxidazo negativi

Verificarea activitatii oxidazei

Materiale si reactivi : cultura de 2-3 zile

– ansa bacteriologica de metal sau de unică folosință

– hartie de filtru

– soluție de tetramethyl-p- phenylendiamine sau benzi gata impregnate

– mănuși

– bec de gaz

Mod de lucru :

Se preleveza 2-3 colonii si se aplica cu ansa pe hartia de filtru imbibata cu soluția de tetramethyl-p- phenylendiamine. Daca apăre culoare albastra rezultatul este pozitiv deci colonii oxidazo pozitive. In cazul de fata nu a apărut culoare albastra rezulta ca sunt oxidazo negativi . (Lucia Debeleac et al 2003)

Sunt germeni catalazo pozitivi

Verificarea activității catalazei

Materiale si reactivi : cultura de 2-3 zile

– ansa bacteriologica de metal sau de unică folosință

– lame de microscop

– mănuși

– cronometru

– apă oxigenata 30%

– alcool medicinal

– bec de gaz

Mod de lucru :

Pe o lamă de microscop se pune o picătură de apă oxigenata: se prelevează 2-3 colonii si se omogenizeaza in picătură . Dupa 30'' – 1 minut apar bule de oxigen ceea ce evidentiaza activitatea pozitiva a catalazei . ( Lucia Debeleac et al 2003)

Producerea de indol

Materiale si reactivi : cultura de 2-3 zile, mediul de cultura folosit contine extract de drojdie si triptona . ph-ul mediului este 7.0-7.2

– ansa bacteriologică de metal sau de unică folosință

– mănuși

– bec de gaz

– sticla bruna

– Reactiv Kovac”s

– aldehida

Mod de lucru :

Se prepara Reactivul Kovac's: /(100 ml) p-dimethylaminobenzaldehyde – 3g, pentanol sau butanol – 75ml, HCl concentrat – 25m.

S-a dizolvat aldehida în alcool la 50-55○C. S-a racit si s-a adaugăt acidul. S-a pus în sticlă brună și a fost pastrat la frigider)

Se amesteca 1 ml cultura cu 1 ml reactiv Kovac's: Dupa o usoara agitare apare culoarea rosie ceea ce arata ca tulpina este producâtoare de indol .

Pe mediul multitest MIU mobilitate – indol –uree nu produc ureaza, nu innegresc mediul deci nu produc H2S.

Pe mediul Simmons cu citrat culoarea ramane neschimbata – verde deci nu folosesc citratul ca sursa de carbon .

Au reactia rosu-metil pozitiva.Tulpinile de E.Coli posesoare ale plasmidului ‘col’ elibereaza colicine care sunt toxice pentru alte tulpini . ( Lucia Debeleac et al 2003)

Identificarea patotipurilor (tipurilor patogene) enterice de E.Coli

Este o identificare de certitudine care se poate face prin mai multe metode si anume :

-Metode imunologice:aglutinare(latex-aglutinare,coaglutinare), imunodifuzie, imunofluorescenta etc.

-Metode genetice: PCR, real time PCR,amplificare genica,hibridare acizi nucleici.

In practica laboratorului clinic insa nu sunt accesibile mijloace laborioase si costisitoare. In primul rand rezultatele trebuiesc rapid eliberate data fiind gravitatea afectiunii si necesitatea instituirii rapide a unei scheme de tratament .

De aceea testele imunoenzimatice si latex aglutinarea s-au impus foarte repede datorita accesibilitatii si sensibilitatii lor pentru detectarea toxinelor la patotipurile enterice EPEC si EHEC .

Patotipul EPEC este detectat la copii in grupa de varsta 0-2 ani iar patotipul EHEC peste aceasta varsta . ( Lucia Debeleac et al 2003)

Materiale si metode

– Cultura de 2-3 zile

– ansa bacteriologica de metal sau de unică folosință

– lame

– ser fiziologic

– pipete sterile

– bec de gaz

-seruri polivalente anti E.Coli enteropatogen(EPEC) si anti E.Coli enterohemorăgic(EHEC serogrupele O157 si H7)

Mod de lucru :

– se reconstituie serurile polivalente conform indicâtiilor din prospect,

– într-o eprubeta se amesteca 2-3 colonii intr-un ml de ser fiziologic,

– din aceasta suspensie se iau cu o pipeta sterila 2,3 picaturi si se pun pe lamă, peste acestea se adaugă 2 picâturi ser polivalent anti E.Coli EPEC sau EHEC .

Antibiograma – reprezinta determinarea sensibilitatii si a rezistentei germenilor patogeni la medicamente antimicrobiene.

Concentratia minima inhibitoare (CMI) reprezinta cantitatea cea mai mică de medicament antimicrobian care inhiba cresterea tulpinii/bacteriei testate.

Spectrul de sensibilitate la antibiotice al unei specii reprezinta antibioticele fata de care sunt sensibile majoritatea sau toate tulpinile unui lot reprezentativ.

Tulpina de control – tulpina indicată pentru controlul de calitate in microbiologia clinica.

Tulpina / bacterie sensibila – tulpina/bacterie pentru care CMI este de cel putin 2 – 4 ori mai mică comparativ cu nivelul produsului medicamentos din ser, sange sau alte umori, in conditiile unor doze unice sau repetate normale. Efectul terapeutic este posibil.

Tulpina/bacterie rezistenta- tulpina/bacterie pentru care CMI este mai mare decât nivelul produsului medicamentos din ser, sânge sau alte umori. Nu există efect terapeutic, medicamentul prezentând fenomene de toxicitate ce se manifestă asupra pacientului inainte de a avea efect toxic pentru microorganism.

Tulpina/bacterie cu sensibilitate intermediara – tulpina/bacterie pentru care CMI este apropiata de nivelul medicamentului in ser, sange sau alte umori. Efectul terapeutic poate fi intermediar sau imprevizibil, exceptand acele situatii in care se administreaza doze foarte mari, medicamentul concentrandu-se la nivelul focarului de infecție sau poate avea administrare locală. ( Lucia Debeleac et al 2003)

Materiale si reactivi:

Termostat

Etuva

Autoclav

Hota cu flux laminar

Ph metru

Densitometru

tampoane de vata cu tija de lemn sterile

dispensere pentru microcomprimate

rigla gradata milimetric

anse sterile, pense

lampa de gaz

mănuși de protectie

container pentru deseuri contaminate

placi cu mediu MH sau Geloza simpla;

tuburi cu câte 2-4 ml ser fiziologic steril;

microcomprimate impregnate cu antibiotice/antifungice. Se alcâtuiesc seturi/truse de antibiotice in functie de produsul patologic

cultura tulpinii de testat si a tulpinii martor.

Pentru realizarea antibiogramei tulpinilor de streptococ beta hemolitic se utilizează GS, iar pentru hemofili Geloza Chocholat

Mod de lucru

Într-o eprubeta cu ser fiziologic se amesteca circa 5 colonii bine individualizate, reprezentative pentru bacteria testata si se masoara turbiditatea cu ajutorul densitometrului la 0,5 MCF; daca nu este aceasta valoare, se ajusteaza dupa caz cu cultura (turbiditate < 0,5) sau cu ser fiziologic steril (turbiditate > 0,5)

placile trebuie inoculate in maximum 15 minute din momentul etalonarii.

se procedeaza la fel cu tulpina de referinta.

se scot din frigider microcomprimatele cu antibiotic si se tin la temperatura camerei 1-2 ore pentru echilibrare termică.

se usuca suprafata agarului MH/GS/S/GCh mentinand placile cu capacul întredeschis cca. 20-30 min la 37ºC in termostat cu fata posterioara a cutiei Petri in sus (eventualele picaturi de condens se vor scurge in capac si nu pe suprafata mediului ).

Se insamanteaza placile cu ajutorul tamponului de vata astfel:

se imerseaza tamponul in soluția cu suspensia bacteriană etalonata;

se elimină excesul de lichid prin rotirea ferma a tamponului pe peretele tubului;

se descarcă tamponul in striuri paralele pe toata suprafata mediului, succesiv, in trei directii, prin intoarcerea placi cu câte 60 º;

se parcurge la final cu varful tamponului toata circumferinta mediului, la limita cu placa;

sau se poate descarca continutul tubului pe suprafata mediului si se fac apoi striuri la fel ca mai sus;

se lasa placa insamantata in repaus 3-5 min pentru absorbtia inoculului.

se pun discurile cu antibiotic manual cu o penseta sterilizata prin flambare cu grija pentru a nu atinge suprafata mediului si se preseaza apoi usor discul cu antibiotic, sau cu ajutorul dispenserului la distante de minim 1,5 cm. fata de marginea placii si 3 cm între doua discuri vecine ;

se incubeaza placile 18-24 ore sau pana a doua zi in termostat.

dupa realizarea si citirea tuturor culturilor si testelor, acestea si toate materialele utilizate sunt neutralizate prin autoclavare si apoi incinerate conform procedurilor si a legislatiei in vigoare . SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007

Această metodă de efectuare a antibiogramei se numeste metoda Kirby-Bauer si se folosește în majoritatea laboratoarelor.

Există si laboratoare dotate cu analizoare automate de microbiologie care pot efectua antibiograma într-un timp mai scurt de 24 de ore, oferind informații precise asupra calculului concentrației minime la care antibioticul este eficient pentru tratarea infecției respective (concentrația minimă inhibitorie).

Se pot folosi de asemenea metode automate de identificare si anume : truse API 20E, kituri cu citire rapida, sistem VITEK 2 COMPACT.

Identificare tulpini de E.Coli cu ajutorul trusei API 20 E

Sistemul API este un sistem standardizat folosit pentru identificarea germenilor din familia Enterobacteriaceae .

Trusa utilizează teste biochimice miniaturizate si o baza de date adiacenta .

Materiale si reactivi :

-Trusa API 20 E

-Cultura de 2-3 zile

-Medii de imbogatire : bulion selenit, medii de crestere Istrati-Meitert, Mac-Conkey, ADCL,AABTL

– anse bacteriologice din metal sau de unică folosință

– termostat

Mod de lucru :

Trusa API 20E, contine flacoane cu bulion in care se omogenizeaza 2-3 colonii, cultura de 2-3 zile.O conditie esentiala pentru obținerea unui rezultat corect, este utilizarea unei culturi bacteriene pure, provenita dîntr-o singura colonie izolata, pe mediu neinhibitor .

Din aceasta soluție se pun câteva picâturi in fiecare godeu coform indicatiilor producatorului .

Se introduc la termostat si se citesc dupa 24 h.

Identificare tulpini de E.Coli cu ajutorul sistemului VITEK 2 COMPACT

Este un sistem automat cu performanta ridicata, care identifica si testeaza sensibilitatea la antibiotice a bacteriilor izolate din produsele patologice, perfect adaptat unui laborator modern de bacteriologie .

Figura xxx Card Vitek 2

In cazul identificarii, principiul este identificarea biochimica, pe cartelele VITEK care contin substraturile depuse sub forma deshidratata .

Citirea cardurilor are la baza metoda colorimetrică, pentru identificarea speciilor bacteriene și metoda turbidimetrică, pentru testarea rezistenței la antibiotice

Identificarea si antibiograma se realizeaza in 4 pina la 6 ore, comparativ cu 18 sau 24 de ore cum se realizeaza in cazul metodelor clasice.

In cazul germenilor cu crestere rapida (Klebsiella, Proteus, E.coli,E.faecalis) identificarea poate fi deja obtinuta incepind cu primele 2 ore.

Prezenta beta lactamazei cu spectru largit sau rezistenta heterogena a stafilococilor pot fi detectate incepind de la primele 5 ore. Citirea incepe odata cu prima ora de incubare.

Pentru optimizarea rapiditatii rezultatelor testele sint interpretate in timpul fazei de crestere exponentiala a culturii bacteriene, in cazul unei cresteri lente, sistemul prelungind automat timpul de incubare pina la obtinerea rezultatelor fiabile.

Cu ajutorul cartelelor de identificare VITEK se pot diagnostica peste 300 de specii: bacili Gram negativi ,coci Gram pozitivi , levuri, anaerobi Neisseria, Haemophilus si alte bacterii .

Tehnologia PCR

Pe lângă utilizarea ca alternativă în diagnosticul bacteriologic convențional al tulpinilor de E. coli, metodele moleculare și-au dovedit utilitatea în tiparea acestora în scopuri epidemiologice.

Tehnologia PCR a pătruns cu succes în laboratorul clinic, răspunzând prin caracteristicile sale exigențelor diagnosticului microbiologic definite prin rapiditate, sensibilitate și specificitate.

Protocoalele ce folosesc tehnici de PCR concepute pentru a studia si diagnostica pana la nivel de patotip E. coli țintesc individual sau concomitent (PCR multiplex) anumite structuri genetice cromosomale sau plasmidice ce codifica factorii de virulență (adezine fimbriale, afimbriale, toxine, siderofori etc.).

Aceste metode, deși nestandardizate, se pot aplica atât izolatului clinic, în cultură pură, cât și direct produsului patologic (Lucia Debeleac et al 2003)

Pentru că se pretează mai bine la standardizare, varianta „real time PCR“ tinde să ia locul testului PCR tradițional, datorită capacității acesteia de a cuantifica și identifica în timp real infecția/contaminarea cu tulpini patogene de E. coli. (Lucia Debeleac et al 2003)

V. Rezultate și Discuții

Această lucrare a avut drept scop elaborarea unei metodologii cu aplicabilitate practică in diagnosticul bacteriologic al bolii diareice acute, în special pentru situații de urgență .

S-a izolat agentul microbian pe medii adecvate si identificat pe baza caracteristicilor : morfologice, de cultivabilitate, enzimatice și antigenice .

S-a evaluat incidenta patotipurilor enterice de E.Coli dintr-un lot de pacienti, diagnosticati clinic cu boala diareica acuta .

Au fost luate in studiu un numar de 300 de tulpini de E.Coli izolate si identificate prin metode fenotipice, biochimice bazate pe proprietatile exoenzimatice ale genului Enterobacteriaceae, dar si prin metode microtest API 20 E si VITEK 2 C .

La examenul macroscopic al materiilor fecale pentru patotipul diareigen de E.Coli s-au urmarit si izolat acele tulpini care au prezentat :

– mirosul cu tenta fetida pentru E.Coli enteropatogen (EPEC);

– culoare galben necaracteristica sau cu aspect hemoragic (EHEC,EIEC);

– tenta de lichid, ca apa de orez (E.Coli enterotoxigen);

– aspectul mucos, purulent si sanvinolent (EIEC)

La examenul microscopic al materiilor fecale

– frotiul colorat cu albastru de metilen a aratat prezenta leucocitelor bazofile, celule epiteliale frecvente, eritrocite sugerand un proces invaziv

– la frotiul colorat gram concluziile au fost: – dezechilibrul florei intestinale , dismicrobism, abundenta florei gram negative cu bacili drepti cu capete rotunjite fara o dispozitie caracteristica, prezenta unei morfologii microbiene tipice pentru E.Coli.

Figura 3. Preparat microscopic si dimensiune E.coli (Lippincott et al 2000)

Daca flora gram negativa ar fi fost dominanta dar cu bacili incurbati sub forma de virgula inclina diagnosticul spre Campylobacter spp., predominanta florei gram pozitive cu coci gram pozitivi in tetrade si gramezi conduce spre diagnosticul de toxiinfectie alimentara cu Staphylococcus aureus. (Buiuc D,et al 2003)

Flora gram pozitiva cu bacili gram pozitivi cu capete taiate drept, dispusi in lanturi scurte, cu spor oval, situat central sau subterminal – posibil toxiinfectie alimentara cu Bacillus cereus . (Buiuc D,et al 2003)

Foarte grava este prezenta bacililor garm pozitivi in scaunul pacientilor care se afla sub terapie cu antibiotice posibil Clostridium difficile etc.

Caractere de cultura – pe mediile de cultura specifice s-au obtinut urmatoarele caracteristici:

– E.Coli tulbura uniform mediile lichide(bulion)

– Mac Conkey – colonii mari, cremoase , bine delimitate , cu margini regulate, rozalii-rosii

– Istrati-Meitert – colonii mari, cremoase , nu invadeaza mediul de cultura, de culoare galbena cu miros caracteristic .

– ADCL- colonii mari, de culoare crem spre maroniu, bombate, usor lucioase, in functie de perioada de incubare capata miros fetid.

– Geloza-sange – colonii mari, alb-galbui, cremoase, bine delimitate; fenotipul uropatogen determina hemoliza. (Buiuc D,et al 2003)

Figura 4. Caractere de cultura E.coli (Warren Levinson et al 2014)

Figura 5. Caractere de cultura E.coli (Warren Levinson et al 2014)

La testele biochimice s-au obtinut urmatoarele rezultate care au permis incadrarea in aceeasi familie Enterobacteriaceae:(SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

– fermenteaza glucoza cu producere de acid si gaz,

– reduc nitratii la nitriti,

– reactia pozitiva a catalazei

– testul oxidazei negativ,

– lactozo pozitive- descompun lactoza cu eliberare de acid,

– descompun proteinele cu formare de indol,

– nu produc ureaza,

– nu descompun proteinele cu formare de H2S,

– nu folosesc citratul ca unica sursa de carbon,

– reactia rosu-metil pozitiva,

– produc uneori lizindecarboxilaza si nu produc fenilalanindeaminaza .

(Surinder Kumar et al 2012 )

Din Figura 6. se poate observa reactia rosu-metil pozitiva.

Figura 6. Reactia rosu-metil pozitiva (foto experiment)

Bulele de oxigen în picatura de apă ce au evidențiat activitatea catalazică se pot observa in Figura 7.

Figura 7. Reactia pozitiva a catalazei

Apariția (după o scurtă agitare) a culorii roșii a evidențiat faptul ca tulpina izolată este producătoare de indol . Ca martor a fost utilizat mediul neinoculat .

Figura 8. Producerea indolului

(proba si martor fara cultura microorganism)

Pentru observarea producerii de H2S s-a incubat fără agitare iar dupa 3-5 zile hârtia s-a înnegrit (s-a format PbS) fapt ce a evidențiat un rezultat pozitiv.

Figura 9. Producerea de H2S din tiosulfat de sodiu

Tabel 4 Identificarea biochimica a tulpinilor de E.coli

In urma testelor imunoenzimatice si de latex aglutinare :

Din cele 300 tulpini de E.Coli selectate pentru identificare serologica, 130 au aglutinat cu ser polivalent EPEC, 3 tulpini cu ser anti – EIEC si 2 tulpini cu ser anti-EHEC(O157 si H7).

Figura 10. Reactia de aglutinare pe lama

Din cele 130 de tulpini care au aglutinat cu seruri polivalente EPEC, 40 au fost incadrate in serogrupuri EPEC care au aglutinat cu seruri monovalente .

Tabel 5. Serogrupuri izolate care fac parte din patotipul enteric EPEC

Conform tabelului, cele mai frecvente serogrupuri izolate care fac parte din patotipul enteric EPEC au fost : 14 tulpini O26B6(35%), 9 tulpini O55B5(22,5%), 8 tulpini O127B8 (20%), 5 tulpini O128B12(12,5%) și 4 tulpini O126B(10%).

Cele 2 tulpini E.Coli care au aglutinat cu serul polivalent anti-EIEC, nu s-au confirmat in urma reactiei de aglutinare in tuburi, posibil datorita faptului ca serurile comerciale nu reusesc sa acopere toata gama de entitati EIEC.

Din cele 12 serogrupe EPEC, serogrupul O26B26 a fost dominant. Multe tulpini apartinand grupelor „O” nu au activitate patogena, asa cum tulpini apartinand altor serogrupe pot fi enteropatogene .

Din tulpinile incadrate in serogrupul O26B6, 6 tulpini (42,8%) au provenit de la copii de pana la 2 ani, 4 tulpini (28,5%) de la copii intre 4 si 10 ani, 3 tulpini (21,4%) de la grupa de varsta cuprinsa intre 12 – 38 ani si doar o tulpina (7,3%) de la persoane de peste 50 ani

Figura 11. Proportia pe grupe de varsta

In patotipul EHEC cu serogrupele patogene O 157 si H7, au mai fost incluse recent serogrupele O126 si O111, care altadata erau incluse in patotipul EPEC.

Urmatorul serogrup important ca frecventa, a fost O55B55, in care s-au incadrat 9 tulpini de E.Coli izolate de la pacienti cu varste cuprinse intre 6 luni si 38 ani .

Tabel 6. Serogrupuri pe grupe de varsta

Rezulta astfel ca serogrupul EPEC este un patotip enteric infantil care poate fi ocazional implicat in etiologia BDA la adulti si persoane in varsta .

Rezultatele investigatiilor bacteriologice ale materiilor fecale prelevate de la copii si semnalizarea frecventa a serogrupelor EPEC, indeosebi la copilul sub 4 ani, incadreaza statistic acest serogrup pe primul loc.

Patotipurile enterice de E.Coli au fost izolate mai frecvent la copii decat la adulti, datorita frecventei si efectelor asupra acestora .

Multe tulpini apartinand grupelor „O” nu au activitate patogena, asa cum tulpini apartinand altor serogrupe pot fi enteropatogene .(SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Antibiograma:

Exista seturi de antibiotice si sulfamide, antifungice care se testeaza pentru fiecare germene patogen apartinand unei clase, in functie de raspunsul acestuia in timp.(SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

In general se testeaza cam aceleasi in toate laboratoarele, cu mici diferente datorate urmatorilor factori :

– mediu urban sau rural,

– spital sau policlinica,

– boli cronice sau stadii terminale etc.

In urma testarii sensibilitatii se produc concomitent dou fenomene : difuzarea antibioticului si cresterea bacteriei .

In zonele in care concentratia antibioticului este mai mare decat concentratia minima inhibitoare, bacteria nu creste.

In faza exponentiala a culturii (faza critica) bacteria se divide mai repede decat are loc difuzia medicamentului si se obtin zone de cultura care nu mai sunt influentate de modificarile ulterioare ale concentratiei de antibiotic . (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Bacteria testata este clasificata, in functie de marimea diametrului de inhibitie si anume: sensibila, intermediara, rezistenta , raportata la tabelul interpretativ al discurilor de antibiotice .

Rezultatul unei antibiograme clasice este gata dupa 48 h.

Laboratoarele care dispun de analizoare automate pot obtine un rezultat in timp mai scurt 12-24 h si de asemenea informatii mai precise – calculul concentratiei minime inhibitoare la care antibioticul este eficient. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Pe baza antibiogramei se poate recomanda antibioticul cel mai potrivit pentru tratarea infectiei respective. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

De asemenea se iau in calcul : factori anatomo-fiziologici(gravida sau nu), varsta, localizarea infectiei, modul de administrare(intravenos,intramuscular,oral etc).

In ultimii ani din ce in ce mai multe specii sunt rezistente la antibiotic, in special datorita transferului de plasmide. (SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007)

Tabel 7. Antibiotice folosite la ATB pentru Enterobacteriaceae

Figura 12.. Antibiograma pentru E.coli

Escherichia coli din figură este:

• ceftriaxonă (CRO) – S- zona clară din jurul discului cu diametrul de 2,5 cm (mai mare de 2,1 cm)

• cefotaxim (CTX) – S- zona clară din jurul discului cu diametrul de 2,5 cm (mai mare de 2,1 cm)

• levofloxacin (LEV) – S- zona clară din jurul discului cu diametrul de 2,5 cm (mai mare de 2,1 cm)

• cefuroxim (CXM) – I – zona clară din jurul discului cu diametrul de 1,5 cm (între 1,5-1,7 cm,)

ceftazidim (CAZ) – I – zona clară din jurul discului cu diametrul de 1,5 cm (între 1,5-1,7 cm, conform cu tabelul de evaluare);

trimetoprim+sulfametoxazol (SXT) – I – zona clară din jurul discului cu diametrul de 1,5 cm (între 1,5-1,7 cm).

Sistemul API :

Utilizarea lui a dus la identificarea rapida a germenilor din familia Enterobacteriaceae si a antibiogramei de electie .

Figura 13. Tulpină de E.coli identificată pe trusa API 20E

Gravitatea clinica a sindromului diareic la copil, este datorata dezechilibrului hidroelectrolitic care se instaleaza rapid .

VI. Concluzii și Perspective

In acest studiu a fost evaluata incidenta patotipurilor enterice de E.Coli izolate din coproculturile pacientilor care au fost diagnosticati cu boala diareica acuta.

Boala diareică este prezentă pretutindeni, de regulă cu manifestări benigne dar poate deveni fatala în rândul copiilor până la 5 ani, al bătrânilor și al pacienților imunodeprimați, in lipsa unui tratament adecvat.

Putem spune ca diareea este una din cele mai frecvente cauze ale morbiditatii și mortalitatii la copii.

Se apreciază că aproximativ 5 milioane de copii mor anual din cauza acestei boli.In trecut se credea ca aceasta boala este cauzata de saracie, dar s-a demonstrat ca este prezenta si in tarile avansate economic.

Sindromul diareic este o entitate clinica , o urgenta medicala prin consecintele grave si rapide asupra copilului. Se caracterizeaza prin scaune frecvente (3 pana la 30 de scaune in interval de 24 de ore), cu o consistenta redusa (de cele mai multe ori apoase) insumand volume mari de pierderi de lichide (uneori peste 20 l lichid in interval de 24 de ore) ce pot duce la dezechilibrari hidroelectrolitice insotite de tulburari hemodinamice grave (colaps cardio – vascular) cauzatoare de deces.

Sindromul febril insoteste sindromul diareic infectios iar fenomenele digestive (inapetenta, greata, dureri abdominale, balonare, flatulenta) sunt in diferite grade de intensitate.

Aceste manifestari difera, in functie de severitatea si durata bolii, varsta copilului, starea lui de nutritie, eventualele complicatii , etiologie etc.

Etiologia definește cel mai clar diareea și o încadrează corect într-o anumită entitate, ceea ce indreptateste prezentarea unor entități clinico evolutive si etiologice ale diareei, ca de exemplu diareea determinată de E.coli, Shigella Flexneri, vibrionul holeric, rotavirus, etc.

Conform rezultatelor acestui studiu cele mai frecvente serogrupuri izolate care fac parte din patotipul enteric EPEC au fost : O26B6, O55B5, O127B8, O128B12, O126B.

Din acestea sau impus cele facand parte din serogrupurile O26B6, O55B5, O127B8, din care serogrupul O26B6, a fost dominant.

Noțiunea de patogenitate este relativă, multe microorganisme putând fi responsabile de apariția bolii diareice, mai ales dacă apararea imunitară a organismului este alterată.

Enteritele de origine bacteriana constituie un domeniu vast , cu multe necunoscute, ceea ce determina microbiologul sa ia o atitudine critica în conduita investigației etiologice.

Modalitatile din prezent de identificare a bacteriilor enteropatogene nu trebuie sa se limiteze doar la determinarea apartenenței la o specie bacteriană sau alta, ci trebuie să pună în evidență factorii de agresivitate implicați și la specii considerate până nu demult „saprofite“.

E. coli, considerat inițial germen comensal, are o capacitate de adaptare remarcabilă. Fiind foarte mult studiat: E. coli – specia „cobai“, a făcut obiectul studiilor de biochimie, fiziologie și genetică, dovedindu-se usurinta în acceptarea de material genetic exterior, în prezența plasmidelor și fagilor.

Posibilitatea transferului de material genetic confera tulpinilor de E.coli proprietati patogenice noi, periculoase.

De exemplu includerea in patotipul EHEC cu serogrupele patogene O 157 si H7, a serogrupelor O126 si O111, care altadata erau incluse in patotipul EPEC .

Încadrarea tulpinilor de E. coli în patotipurile digestive enunțate, necesită tehnici imunoenzimatice, de biologie moleculară, culturi celulare, care nu sunt practici de rutină în laboratorul clinic, din motive obiective de dotare și lipsa personalului calificat.

Studiile de microbiologie clinica din țara noastră, care folosesc tehnici moderne de biologie moleculară, pun accent pe descrierea genotipului de enteroagresivitate al tulpinilor de E. coli izolate prin tehnica coproculturii standard sau folosind metode genetice aplicate direct pe prelevat.

VII. Bibliografie

1. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1. Baltimore, Williams and Wilkins, 1984

2. Roy CC, Silverman A, Alagille D – Diarrheal Disorders. In: Pediatric Clinical Gastroenterology, ed.a4-a, Mosby, 1995,

3. Bacteriologie medicală – V.Balbaie, N.Pozsgi, Ed. Medicală, Bucuresti, 1985

4. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2nd ed. Williams and Wilkins, Baltimore, Bachoon, Dave S., and Wendy A. Dustman 1990.

5. Microbiologie Clinică – D. Buiuc, Ed. Didactică si Pedagogică, București, 1998

6. Microbiology for the health sciences – Gwendolyn R. Wilson Burton, Paul G. Engelkirk,Lippincott Williams & Wilkins, 2000

7. Foundations in Microbiology – Kathleen P. Talaro, Arthur Talaro,McGraw-Hill, 2001

8. Microbiologie Medicală: "Ghid pentru studiul si practica medicinei", Buiuc D,Editura Gr.T.Popa, Iași, 2003

9. Microbiologie – Lucia Debeleac, Ed. Medicală Amaltea, București, 2003

10. Medical Microbiology & Immunology – Warren E. Levinson, McGraw Hill Professional, 2004

11.Textbook of Microbiology – Ananthanarayan And Paniker,Orient Blackswan, 2005

12. Bacteriologie Medicală – Felicia Toma Sacarea, Târgu Mureș, 2006

13. SR EN ISO 15189:2007 – Laboratoare medicale. Cerințe particulare pentru calitate și competență 2007

14. Tratat de Microbiologie Clinică – D.Buiuc, M.Negut, Ed. Medicală, București, 2008

15. Medical Microbiology – Patrick R. Murray, Ken S. Rosenthal, Michael A. Pfaller, Mosby/Elsevier, 2009

16. Alcamo's Fundamentals of Microbiology – Jeffrey C. Pommerville,Jones & Bartlett Publishers, 2010

17.Medical Microbiology, Lefebvre et al, 2010

18. Burton's Microbiology for the Health Sciences – Paul G. Engelkirk, Janet L. Duben-Engelkirk, Gwendolyn R. Wilson Burton,Lippincott Williams & Wilkins, 2011

19. Textbook of Microbiology – Surinder Kumar,JP Medical Ltd, 2012

20. Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology – Elsevier Health Sciences, 2013 .

21. Introduction to Diagnostic Microbiology for the Laboratory Sciences – Maria D. Delost, University Youngstown Ohio , 2014

22. Medical Microbiology and Immunology – Warren Levinson, McGraw Hill Professional, Jun 27, 2014