Tehnici Histologice

Medicina

Tehnici Histologice

Byadmin ianuarie 1, 2024

Cuprins

Partea generala

Introducere

Principii generale de tehnica histopatologica

Fixarea

Perlucrarea histopatologica ( deshidratare, clarificare si impregnarea cu parafina)

Includerea

Sectionarea la microtom

Etalarea sectiunilor

Colorarea lamelor

Montarea lamelor

Protocol de lucru imunohistochimie

Protocolul examenului extemporaneu

Artefacte histopatologice: Generalitati

3.1Artefacte pre-fixare

3.2 Artefacte de fixare

3.3 Artefacte de procesare si includere

3.4 Artefacte de sectionare

3.5 Artefacte de colorare

Artefacte de montare

3.7 Artefacte de congelație/postcongelație

Partea speciala

Introducere

Obiective si scopuri

Materiale si metoda

Discutii

Concluzii

Introducere

“Patologia este acea ramură a științelor naturale care studiază cauzele și natura bolilor, împreună cu modificările anatomice și funcționale implicate; practica patologiei umane este acea specialitate a medicinei care contribuie la diagnostic, tratament, observarea și înțelegerea progresului bolilor la subiecții umani prin informațiile obținute morfologic, microscopic, molecular, chimic, microbiologic, serologic sau prin orice alt tip de examen de laborator făcut pe pacient sau pe material obținut din organismul uman.”

(Definiția Anatomiei Patologice aprobată de Colegiul American pentru Patologie și preluată de OMS)

Principii generale de tehnica histopatologica

Tehnici histologice: Procesare tisulara

Tehnicile histopatologice reprezinta prin cipala etapa in diagnosticul histopatologic. Protocolul este rigid, bazat pe principii stiintifice cu scopul de a evita pe cat posibil artefacte procedurale.

Timpii de realizare

Recoltarea

Fixarea

Spalarea

Includerea

Sectionarea

Colorarea

Montarea

Recoltarea -> Orientarea

Rezectia chirurgicala

Rezectia endoscopica

Biopsia de organ

Punctia cu ac gros

Punctia cu ac fin

Recoltarea la necropsie

Principiul tehnicii histopatologice impune transformarea unui prelevat dintr-un organ sau țesut, dintr-o masa tisulară opacă într-un preparat fin, translucid care permite vizualizarea microscopica a detaliilor structurale tisulare. Pentru a realiza aceasta prelevatul suferă transformări succesive:

1. Fixarea – previne alterarea si autoliza țesutului

2. Prelucrarea histopatologică (deshidratare, clarificare și impregnare cu parafină)

3. Includerea in bloc de parafina

4. Secționarea la microtom a prelevatului inclus in parafina

5. Etalarea secțiunilor pe lame (obținerea preparatului histopatologic necolorat)

6. Colorarea lamelor

7. Montarea lamelor – permite protecția si conservarea preparatului histopatologic colorat

Produs final – preparatul histopatologic permanent care permite interpretarea corecta in vederea stabilirii diagnosticului anatomo-patologic.

Protocoalele de lucru histopatologie sunt orientative; pot fi folosiți reactivi diferiți, timpul de acțiune și concentrațiile menționate în rețete sunt orientative și se adaptează în funcție de condițiile locale (temperatură ambientală, duritatea și pH-ul apei de robinet etc). Tehnica folosită este considerată corectă dacă se obțin rezultatele preconizate prin colorația respectivă. La rețetele de colorații recomandate sunt admise variații, în funcție de structura care se dorește evidențiată; de asemenea, pot fi folosite alte colorații speciale pentru evidențierea aceleiași structuri (de exemplu colorație pentru colagen Roșu Sirius, colorație mixtă uzuală și pentru colagen – Hematoxilină eozină safran, mucicarmin pentru mucopolizaharide acide, auramină pentru bacili acid alcoolorezistenți și altele asemenea) sau colorații speciale pentru substanțe care nu pot fi identificate prin procedeele recomandate (de exemplu colorație von Kossa pentru calciu, colorație Scharlach, Sudan III, negru Sudan sau roșu ulei O pentru lipide, colorație cu rodanină pentru depozite de cupru și altele asemenea).

Preparatul microscopic permanent:

Este utilizat în anatomia patologică și reprezintă examenul unor celule cărora li s-au suprimat procesele vitale.

Timpii de realizare sunt :

1) Recoltare

2) Fixare

3) Spalare

4) Includere

5) Sectionare

6) Colorare

7) Montare

8) Etichetare

1) Recoltarea

Poate fi bioptică prin puncție, aspirație endoscopica etc., sau necroptică (de la cadavru). Condițiile pentru recoltare depind de timpul de lucru, dimensiunile piesei de rezecție și instrumentarul utilizat.

2) Fixarea

Este un proces fizic prin care se îngheață procesele biochimice, păstrându-se forma celulei și volumul molecular. Scopul îl reprezintă conservarea țesutului împotriva putrefacției, prevenirea pierderii de constituenți celulari, creșterea diferenței optice și mărirea rezistenței țesuturilor.

Fixatorii pot fi dupa natură : fizici sau chimici, iar după reacție : coagulanți sau necoagulanți.

Fixatori chimici pot fi simpli : formol, acetonă, alcool metilic, acid osmic sau amestecuri fixatoare : apoase sau alcoolice. După scopul urmărit pot fi : topografice sau

citologice.

Mecanismul fixării se poate face prin : insolubilizare prin precipitare, formarea produșilor de adiție, coagularea proteinelor.

Fixatorul trebuie să aibă următoarele calități : pătrunde în țesuturi, stabilizează structurile, nu provoacă artefacte, nu deformează țesutul, nu dizolvă constituenții, distruge microorganismele, extrage enzimele autolitice, conferă consistență, produce diferență optică, nu-și modifică compoziția.

Tratamentele postfixare sunt opționale și sunt reprezentate de: decalcifiere,

disocierea pieselor, mordansarea (substanță ce contribuie la colorare și la ameliorarea fixării).

3) Spălarea

Oprește fixarea prin îndepărtarea fixatorilor pentru a împiedeca reacția cu alte substanțe ce vor fi utilizate. Se poate fi folosi : apa, alcool 700.

4) Includerea

Se creează condiții pentru secționarea în secțiuni subțiri, plane, transparente.

Se imobilizează componentele tisulare, iar raporturile rămân la fel. Substanțele folosite se numesc mase de incluziune.

După modul de realizare a includerii : După solubilitatea în apă :

– penetrarea celulei – anhidre (parafina)

– rămâne în spațiul interstițial – apoase (gelatina)

Etapele includerii sunt :

– deshidratarea în concentrații crescute de alcool

– clarificarea în alcool amilic sau hidrocarburi aromate

– impregnarea = pătrunderea în profunzime a parafinei topite

– turnarea blocurilor

5) Secționarea

Se face cu ajutorul microtomului la 5-7 m. Elementele necesare sunt : suportul pentru cuțite, portobiectul, capul mobil, micrometru. Aderarea se face cu albumina Meyer. Secțiunile se usucă și se pun în stativ.

6) Colorarea

Este etapa în care se urmărește creșterea contrastului prin modificarea indicelui de refracție cu coloranți (ce se leagă electrostatic de preparat).

Colorantul histologic este o substanță organică ce pătrunde în celule și se atașează de componentele celulare permițând diferențierea optică. Poate conține:

– grupări cromofore – sunt purtătoare de culoare

– grupări auxocrome – au capacitate de a colora. Acestea la rândul lor pot fi ionizate (formează legături electrochimice cu substratul) sau neionizate (formează legături de hidrogen cu substratul).

Etapele colorării sunt :

a) Deparafinarea = dizolvarea parafinei cu hidrocarburi aromatice (xilol). Se trece prin 3 băi diferite.

b) Hidratarea = eliminarea solvenților parafinei. Se trece prin 3 băi succesive de alcool metilic cu concentrații scăzute timp de 2-5 min.

c) Mordansarea (pentru colorații indirecte)

d) Colorarea cu soluție apoasă sau alcoolică

e) Spălarea = îndepărtarea excesului de colorant cu apă distilată

f) Deshidratarea se face cu alcool absolut (100%), pentru îndepărtarea apei

g) Clarificarea = se îndepărtează alcoolul cu xilol.

Colorantii pot fi acizi [au o grupare auxocromă (-) și se atașează pe substrat (+)], bazici [au o grupare auxocromă (+) și se atașează pe substrat (-)] sau neutri (au grupări auxocrome +\).

Celulele au : apă, substanțe minerale (sunt îndepărtate prin spalare), glucide, lipide (tetraoxidul de osmiu le insolubilizează) și proteine (substratul pe care se așează coloranții).

7) Montarea

Se face pentru protejarea de deteriorări, conservare și asigurarea unui mediu omogen. Mediile de montare pot fi apoase (glicerina, sirop Apathy) sau anhidre (balsam de Canada, colofoniu ).

8) Etichetarea – se notează : sursa de preluare, tipul fixatorului, metoda de colorare, data efectuării preparatului.

PROTOCOL DE LUCRU EXAMENUL EXTEMPORANEU

1. Se verifică documentele de insotire a fragmentului tisular și fragmentul tisular similar protocolului de lucru pentru prelucrare histopatologică. În plus se verifica daca fragmentul tisular este de dimensiuni suficiente examenului extemporaneu

2. se înregistrează cazul

3. se orientează macroscopic piesa; se dimensioneaza si se descrie fragmentul tisular; se preleveaza fragmente tisulare pentru examenul extemporaneu

4. se congelează fragmentului tisular – se monteaza fragmentul tisular pe suportul metalic și se îngheață în criostat la temperatură sub minus 40C până devine perfect opac

5. se secționează la criomicrotom – se niveleaza blocul tisular înghețat, efectuandu-se sectiuni la 2-10μ

6. Sectiunile obtinute se etalează pe lame de sticla cu ajutorul unui port-ac sau direct cu ajutorul plăcței anti-rol

7. Lamele cu material histopatologic sectionat la gheata se coloreaza cu hematoxilină-eozină sau solutie de albastru de toluidina (coloratii uzuale) sau Scharlach (coloratie speciala pentru lipide).

8. Se monteaza în apă, glicerină sau medii de montare solubile în solvenți organici

Protocol de lucru imunohistochimie (metoda tristadială indirectă, evidențiere cu DAB)

Principiu: Tehnicile de imunohistochimie au la bază reacția antigen-anticorp, antigenul urmărit aflându-se în materialul bioptic, iar anticorpii utilizați în scopul evidențierii acestora sunt comercializați sub diverse forme – mono- sau policlonali, concentrați sau diluați (gata de a fi utilizați „ready-to-use”). Situsul legării cu anticorpul poate fi identificat fie prin legarea directă a antigenului de un anticorp marcat, deci vizibil (de exemplu fluorescent), fie printr-o metodă indirectă de legare, prin intermediul unui lanț de alte reacții, cu anticorpi secundari marcați prin reacție indirectă în 2 sau mai multe faze. Ultima metodă este folosită în laboratorul nostru și folosește un substrat cromogen care este atașat la anticorpul secundar. Anticorpul primar este nemarcat, de acesta se leagă un anticorp secundar marcat cu peroxidază, de care este legat un sistem de relevare. Această tehnică este mai sensibilă deoarece permite vizualizarea antigenelor existente în concentrații mici.

Medicul anatomo-patolog solicită această tehnică specială în cazurile dificil de soluționat, pe lame selecționate, pentru completarea diagnosticului histopatologic din colorația uzuală (HE) și/sau histochimice finalizând astfel diagnosticul.

Condiția primordială pentru reușita reacțiilor imunohistochimice este fixarea corectă a preparatului bioptic, astfel încât epitopii (situsurile antigenice) să nu fie distruși sau inactivați. Fixarea optimă durează 24 de ore; fixarea care depășește 48 de ore inactivează majoritatea epitopilor, determinând reacții fals negative. Fixatorul optim este formolul tamponat 10%.

Protocolul de imunohistochimie

Asistentul de laborator prelucrează materialul bioptic, secționează blocul de parafină selecționat pentru investigațiile imunohistochimice și realizează corect tehnica de colorarea imunohistochimică. Medicul anatomo-patolog examinează lamele la microscop și stabilește diagnosticul histopatologic final în coroborare cu colorația uzuală (și/sau colorații speciale histochimice), respectiv furnizează informații esențiale oncologului (chimioterapeut) privind statusul hormonal al diverselor tumori sau supraexpresia unor oncoproteine, cu impact decisiv în strategia terapeutică adjuvantă din domeniul oncopatologiei.

Secțiunile la parafină se aplică pe lame special tratate (încărcate electrostatic sau silanate), cu o mare adezivitate, în majoritatea cazurilor tehnica impunând metode de relevare termică a epitopilor.

Lamele se pun la deparafinat in toluen – 1 h la termostat;

Se trec prin băi de alcooli de concentrație descrescândă (100%, 96%, 80%) câte 5 min;

Se aduc lamele la apă;

În funcție de tipul anticorpului și specificațiile tehnice ale producătorului este necesară sau nu (se trece la punctul 8) pretratarea enzimatică (tripsină 5 min, apoi se trece la punctul 8) sau termică a secțiunilor;

Pretratarea termică presupune imersionarea secțiunilor în solutie Target Retrieval (pH = 6 sau 9) prealabil încălzită în cuptorul cu microunde la 95 grade (se controleaza cu termometrul de laborator) 20 minute la 600 W;

Se lasă la răcit până la temperatura camerei;

Se scot și se spală în apă distilată;

Se trec în tampon TRIS 10 minute;

Se șterg lamele de excesul de tampon, se marcheaza secțiunea cu un creion special;

Se pun într-un mediu umed si se acoperă fiecare secțiune cu o picatura de peroxid – pentru blocarea peroxidazei endogene 5 min;

Se scurg de peroxid și se introduc din nou în tampon TRIS ca să se spele și apoi se lasă într-un recipient cu tampon curat TRIS (5 min);

Incubarea lamelor cu anticorpul primar între 10 min și 30 min, în functie de instrucțiunile producătorului;

Se scurg de anticorp și se spală într-un recipient cu tampon TRIS și se lasă în tampon curat 5 min;

se pune Link (picatura galbenă) peste secțiunile încercuite cu marker special, lamele se mențin în mediu umed 10 min;

Se spală în tampon TRIS și apoi se lasă 5 min în tampon curat;

Se șterg de tampon și se pune Streptavidin (picatura roșie) peste secțiunile încercuite cu marker special, lamele se mențin în mediu umed 10 min;

Se spală cu tampon TRIS și se lasă 5 min în tampon curat;

Se aplică DAB (cromogenul) peste secțiunile încercuite cu marker special, lamele se mențin în mediu umed 10 min;

Se spală în apă distilată și apoi se contracolorează cu hematolixină 1-2 min;

Secțiunile se deshidratează obișnuit (acooli de concentrație crescătoare 80%, 96%. 100% – 5 min in fiecare;

Se montează și se examinează la microscop

materialului biopsic (Anexa 3) din incaperea unda s-a efectuat examenul extemporaneu si le duce in sala unde medicul anatomopatolog examineaza la microscop;

– medicul anatomopatolog examinează la microscop secțiunile efectuate, notează pe buletinul de însoțire al piesei diagnosticul histopatologic, semnează și parafează;

registratorul medical notează rezultatul histopatologic de pe fisa de insotire a materialului biopsic în registrul unic de evidență a biopsiilor;

prin intermediul cadrului medical delegat de sectia care a adus piesa în Serviciul de Anatomie Patologică, diagnosticul histopatologic al examenului extemporaneu este comunicat chirurgului in cel mai scurt timp.

Artefacte ale preparatelor histopatologice

Definitie: Preparatele histopatologice perimit examinarea microscopica a structurilor tisulare, si, in diagnosticul patologic, aprecierea alterarilor caracteristice fiecarui proces patologic. Numarul si varietatea artefactelor este foarte mare, astfel incat aproape nici un preparat nu poate fi ‘’perfect’’. Oricum medicul anatomopatolog, are drept scop, urmarirea unui nivel tehnic acceptabil, astfel incat preparatele histopatologice sa permita un diagnostic corect.

O calitatea superioara a preparatelor histopatologice (coloratie uzuala hematoxilina eozina), se caracterizeaza printr-o varietatea a patternurilor cromatiniene nucleare cu membrana nucleara ondulata, albastra fara aparitia bulelor nucleare, fara pete sau decolorare si cu prezervarea citoplasmei eozinofile.. Nu trebuie sa existe sopatii artefactuale intre celulele individuale sau contractari celulare.Artefactele pot rezulata in urma oricarui pas inadecvat in timpul procesarii.

Artefacte de manipulare/pre-fixare

Artefactele se pot datora procedurilor clinice efectuate in timpul interventiei chirurgicale (de exemplu includerea materialelor de sutură, pudră de talc sau particule de carbon), dar ṣi deshidratarea termică si chimică. Deshidratarea termică rezultă prin excizia pieselor cu cauterul, ce determină coagularea proteinelor, si deshidratarea chimica ce rezulta datorita utilizarii substantelor caustice, utilizate pentru sterilizarea instrumentarului folosit pentru excizia biopsiilor.

Arderea dea lungul marginilor pieselor biopsice, cauzate de utilizarea laserului sau termo-cauterului, determina colorarea intensa acidifila cu stergerea detaliilor nucleare si citoplasmatice. Fibrele de tesut conjunctiv sunt coagulate si incretite. Denaturea proteinelor, determină acidofilia țesutului conjunctiv si stergerea detaliilor citologice.

Distructia termica focala sau difuza a pieselor poate apărea de asemenea in orice etapă a procesarii histologice, începând cu fixarea, cand blocurile tisulare sau secțiunile sunt expuse la o temperatură peste 700C, în special în timpul penetrării parafinei supraîncălzite, când se include cu ajutorul forcepsului încălzit, ṣi în timpul uscării lamelor pe o placă încălzită sau în incubator.

Unele celule (de exemplu celulele limfoide, celulele tumorale ṣi in mod deosebit celulele specifice carcinoamelor pulmonare cu celulă mică) sunt susceptibile pentru distrucția datorita strivirii cu forcepsul. Celulele strivite îṣi pierd aspectele celulare ṣi nucleare ṣi pot apare ca filamente bazofile.Aceste artefacte de presiune nu pot fi corectate în timpul procesării preparatelor tisulare; oricum ele pot fi împiedicate printr-o manipulare adecvată a pieselor proaspete anterior fixării.

Contaminarea preparatelor histopatologice este relativ frecventă, dar în acelasi timp foarte periculoasă. Contaminarea poate fi prezentă in bloc sau numai pe secțiune. Contaminarea în bloc, apare in timpul orientării atunci când tesutul de la o piesă anterioară este transferată pe pensă/ lama cuțitului sau de la fragmentele care ramân pe suprafața de pus în lucru. Este necesară curațirea suprafeței pe care se orientează după fiecare piesă. Dacă ăpare contaminarea în acest stadiu, fragmentul tisulare ar trebui sa fie în acelaṣi plan cu țesutul adiacent. Este posibil care unele fragmente foarte mici sa treaca de la o casetă la alta în timpul procesării sau de la un reactiv contaminat.

Elementele străine, ca fibrele de celuloză, pot contamina preparatul fiind prezent în asociere cu suprafața luminala țesutului tractului gastro-intestinal care nu a fost spălat adecvat înainte de procesare. Celuloza poate apare de asemenea dintr-o hârtie, de la un tifon de bumbac sau de la o plută utilizată în timpul preparării specimenului. În acest caz, se găseṣte de obicei la suprafața specimenului, dar poate fi implantat mecanic în timpul disectiei.

Modificările autolitice datorită ischemiei încep imediat ce țesutul a fost lipsit de sânge, fiind produse prin eliberarea de enzime hidrolitice când membrana lizozomala se rupe. Țesutul autolizat de obicei prezintă picnoză, kariorexix si karioloză nucleară alături de vaculizări citoplasmatice, ṣi eventual dezintegrarea structurii tisulare. Țesuturile [prezintă susceptibilitate variabilă la aceste modificări: epitelii glandulare bogate în enzime (de exemplu pancreasul exocrin), care sunt foarte rapid afectate, în timp ce țesutul conjunctiv ṣi, în particular, fibrele țesutului conjunctiv sunt mai rezistente. Piesele de la autopsie prezintă mai frecvent autoliză comparativ cu piesele chirurgicale.

Microorganismele prezente în țesuturile postmortem pot avea origine în flora naturala prezentă în timpul vieții sau sunt contaminate din variate surse după deces. Aceste microorganisme se colorează slab cu hematoxilină.

Suprafața externă a pieselor chirurgicale proaspete sau fixate, corespunzătore marginilor de excizie, se marcheaza cu agenți coloranți (tuṣ) în timpul orientării, pentru a permite orientarea adecvată a preparatului, în vederea stabilirii microscopice a limitelor chirurgicale. Reactivii cel mei des utilizați, sunt tuṣul de India, nitrat de argint, albastru Alcian sau verde Alcian si mulți alți produși de colorare, și apar ca mici depozite la nivelul marginilor tisulare. Agenții nu numai colorează suprafața piesei, dar poate penetra artefactual țesutul.

Carcinom bazocelular . Colorație uzuală hematoxilină-eozină. Limite de rezecție marcate cu tuṣ.

Copy (http://www.images.missionforvisionusa.org/anatomy/2006/07/what-is-basal-cell-carcinoma.html)

Margini de rezecție marcate cu tuṣ, penetrarea tuṣului la nivelul țesutului.

Copy ( http://www.leica-microsystems.com/uploads/media/Artifacts_Handbook.pdf)

Tampoanele de spuma/ bureței se introduc frecvent în casetele de plastic pentru a preveni ieṣirea pieselor foarte mici în timpul procesării. Dacă pisele sunt proaspete sau parțial fixate, un pattern fin de efect de presiune locală sau suprapunere poate apărea, devenind un aspect permanent al arhitecturii tisulare dupa ce fixarea s-a încheiat.

Soluția: Aceste tipuri de artefacte pot fi evitate doar prin garantarea faptului că tehnicienii/intervenționiṣtii sunt pe deplin conștienți de consecințe care determina specimen de contaminarea ṣi deteriorarea preparatului histopatologic.

Artefacte de strivire

Piesele proaspete, in special limfoganglionii, sunt foarte susceptibili la distrucția deterimnată de artefactele de strivire efectuate cu forcepsul sau alte instrumente chirurgicale. Acest artefact se observă tipic la periferia specimenului, ṣi este de obicei mic, localizat la o anumită zonă.

Artefacte de strivire, cu prezența constantă a unei distorsiuni marcate a celulelor ṣi striațiilor nucleare. Limfocitele pot prezenta aspecte similare. Cateva celule din colțul stânga sus, sugereaza neoplazia.

(Copy http://pathhsw5m54.ucsf.edu/case23/cytology.html)

Artefacte bureților absorbabili cu gelatină

Filmele de gel sau berețeii cu gel sunt constituiți din gelatină absorbabilă, sub formă de filme subțiri sau bureți, utilizați pentru rolul hemostatic in diverse proceduri chirurgicale. Ele pot apărea pe secțiuni, aderând la suprafața specimenului. Bureții de gelatină are un aspect caracteristic cu pereți gelatinoṣi uṣor bazofili, de grosimi variabile ce înconjoară spații distorsionate ce pot conține hematii sau alte tipuri de celule. Tipic, nu există nici o reacție tisulară la prezența acestui material.

Sectiune hematoxilina-eozina. Capsula splenică cu artefact determinat de spuma gelatinoasă (Copy http://www.ihcworld.com/royellis/artefacts/ans3.htm)

Necroza datorită soluției Monsel

Soluția Monsel este un agent hemostatic topic utilizat pentru controlul sângerării în urma biopsiilor de piele sau ale mucoaselor. Soluția se aplică în mod normal pe partea carea rămane liberă după recoltarea biopsică, unde determină coagulare ṣi necroză la o profunzime maximă de 0,6 mm.

Ocazional soluția Monsel se aplică greṣit aplicat inainte ca biopsia să se recolteze.. Acesta poate determina o bazofilie generală, descuamarea parțiala a epiteliului de suprafață ṣi despicături ale epiteliului cu semne de necroză precoce.

Soluția: Tratarea secțiunii cu restituția soluției ce constă din acid clorhidric 0,5% în etanol 70% la 600 C pentru o oră, înaintea colorării, pentru a îmbunătății calitatea secțunii.

Proliferare de celule fusiforme usor atipice la nivelul pielii. Colorație

Copy (http://ebooks.cambridge.org/content/978/11/3913/720/1/html_chunk/Images/02283fig5_9dhi-res.jpeg)

Artefacte de fixare

Fixarea adevcată previne autoliza ṣi îmbunătațeṣte abilitatea de colorare a țesutului.

Fixarea incompletă poate fi cauzată de un timp de fixare prea scurt, cantitatea inadecvată de fixator în funcție de volumul de țesut, secțiuni tisulare foarte groase recoltate în timpul orientării, sau epuizarea soluției de formol.

Suprafixarea ( țesut fixat prea mult timp) poate avea impact auspra detectabilității epitopilor proteinelor la imunohistochimie. Timpul recomndat pentru fixare in formol tampon neutru pentru testarea adecvata a HER 2, este de exemeplu, 6-72 ore ( ghidurile ASCO- CAP 2013).

Fixarea ar trebui sa fie promptă (cat mai repede după excizia chirurgicala a țesutului) pentru a preveni autoliza. Ca rezultat al spatiilor artefactuale aparute în Tesut ṣi in jurul celulelor (artefacte de retracție) ṣi pierderea detaliilor citologice si nucleare (acestea din urmă, apărând ca niste ‘’puncte colorate’’). Pigmentul din formol apare de la brun la negricios, fin granular, birefringent, depozite fier-negative, asociate in vecinătate cu hematii extravazate. Cel mai frecvent se observă în organele bogate în sânge, ca splina sau țesuturile cu fixare prelungită, ca în majoritea pieselor recoltate postmortem. Artefactele pot fi îndepărtate prin tratarea secțiunilor cu soluție de acid picric, alcool saturat, anterior colorării, sau se poate preveni prin utilizarea unei soluții tampon de formol ṣi rectricționare timpului de fixare.

Fixarea zonala

Acest artefact se observă cel mai frecevnt pe piesele mari, în particular cele înconjurate de capsulă sau țesuturile care se degenerează rapid (de exemplu țesutul glandular). Apar atunci când fixatorul penetrează lent țesutul, producând grade diferite de fixare, la diferite niveluri ale piesei. Cauzele frecvente sunt reprezentate de fixarea insuficientă, datorită faptului că secțiunea este mult prea groasă, Si mare, sau prin utilizarea unui reactiv cu rată de penetrrare slabă.

Colorație tricrom. Grade diferite de fixare la niveluri diferite. Țesut hepatic, cu evidențierea unui spațiu port.

Copy (http://www.leica-microsystems.com/uploads/media/Artifacts_Handbook.pdf/page 21)

Artefacte determinate de pigmentul din formol

Acest pigment este brun sau negricios, fin granular, depozite birefringente asociate cu, sau în vecinătatea unor extravazări hematice. Se observă cel mai frecvent în țesuturile bogate în sânge, ca splina si țesuturile cu timp de fixare prelungit, ca majoritatea pieselor recoltate la necropsie. Apar cand acidul formic reacționează cu hemoglobina pentru a formarea complexului hematin-acid formaldehidă.

In timp, formolul se descompune natural, pentru a forma acidul formic ce poate determina probleme. In soluțiile non-tampon, scăderea pH-ului se face rapid, dar chiar ṣi formolul tamponat poate determina apariția pigmentului în condiții de pH acid.

Soluția: Acest artefact poate fi îndepărtat prin tratarea secțiunii cu alcool-acid picric saturat sau prevenție prin utilizarea unei soluții tampon de formol ṣi restricționarea timpului de fixare.

Reacție hemoglobina cu formol netamponat (pH acid), cu apariția unui pigment brun/negricios asociat cu extravazări hematice (Rinichi) . Colorație uzuala hematoxilina-eozina.

Copy (http://www.leica-microsystems.com/uploads/media/Artifacts_Handbook.pdf page 24)

Artefacte de procesare ṣi includere

În timpul procesării, sectiunile tisulare fixate sunt deshidratate ṣi penetrate cu xilen si parafină. Dacă aceste țesuturi sunt deshidratate excesiv, pot apărea crăpături fine la marginile tisulare.

Pe de altă parte, procesarea proastă sau insuficientă poate determina variații de colorare nucleară cu pierderea detaliilor nucleare. Aceasta poate fi cauzată atât de resturile apoase reziduale intratisular cât si de infiltrarea incompletă a parafinei. Pierderea excesivă a detaliilor arhitecturale si a clarității în țesutul conjunctiv lax, poate reprezenta fixarea inadecvată, dar ṣi alte probleme de procesare tisulară. Aceste probleme de procesare, pot fi ciclul de procesare prea scurt (în special timpul de infiltrare a parafinei), reactiv nepotrivit, utilizarea unui reactiv expirat, probleme mecanice din timpul procesării, sau plasarea eronată a reactivilor in procesor. Deshidrtarea excesivă poate duce de asemnea la contractarea celulelor, în special în piesele slab fixate.

Fixare inadecvată, cu pierderea extensivă a detaliilor arhitecturale ṣi a clarității; ruperea țesutului conjunctiv. (parenchim mamar- colorație uzuală hematoxilina-eozină).

Copy (http://www.leica-microsystems.com/uploads/media/Artifacts_Handbook.pdf page 25)

Artefacte de secționare

Artefactele rezultate în urma procedurilor de secționare includ unghiularea improprie a lamei de microtom, pierderea ṣuruburilor cuțitului sau a menghinei, utilizarea cuțitelot teṣite sau prin contaminarea marginilor de secțiune la cuțitului de microtom cu pigmenți sau bacterii luate de la un alt bloc si plasate pe alte țesuturi si detritusuri tisulare străine.

Faldurile secțiunii de la nivelul lamei după flotare sunt artefacte frecvente, în special la țesuturile dure (os, cartilaj). Aceste artefacte se identifică si macroscopic. Secționarea atentă cât si a tehnicilor de flotare minimizează această problemă.

Câteva artefacte se datorează atât a secționării la microtom căt si a flotării secțiunilor în baia de apă.

Artefactele de secțiobare au câteva cauze:

alternarea secțiunilor groase cu cele subțiri se datorează înclinării suficiente a unghiului cât si slăbirea blocului/lamei de microtom.

Crăpăturile fine artefactuale se produc datorită vibrației lamei de microtom, lama/blocul slăbite în holder sau unghiulația abruptă a lamei de microtom.

Despicarea secțiunii la unghi drept se poate datora prezenței unei crestături în lama cuțitului, sau prezența unei particule dure, calcificate în blocul tisular.

Efectul Venețian orb poate fi observat când blocurile sunt dure sau sfărâmicioase, sau când lama nu este susținută suficient în holder.

Secțiunea poate fi incompletă. Aceasta se datorează impregnării incomplete sau includerii incomplete a țesutului în bloc, sau cel mai frecvent, secționarea este prea superficiala.

Artefactele datorate țesutului flotant în baia de apă. Principalele trei tipuri de artefacte datorate flotarii secțiunii în baia de apă:

Atenție la prevenirea formării bulelor de apă sub secțiune. Acest artefact apare în principal datorită tehnicii proaste de flotare când secțiunile sunt aruncate mai de grabă în loc sa fie împinse uṣor dea lungul suprafaței apei sau datorită bulelor deja existente în baia de apă care sunt strămutate de secțiune ṣi adăugate pe secțiune. Aceste bule de aer prinse în secțiune dupa flotare ṣi montare pot dispărea la uscare, lasând o zonă care nu mai aderă adecvat la lamelă.

Temperatura crescută a băii de apă determină expansiunea țesutului peste limite determinând efectul de ‘’Pamânt uscat (fisuri)’’

Artefactele de plutire ale secțiunilor tisulare care se ataṣează pe lamă dar nu aparține țesutului: sunt secțiuni flotante din timpul procesării sau se datorează băii de apă murdară, necurățată.

Contaminarea pieselor cu celule sau fragmente tisulare de la alte cazuri este o sursă de artefacte relativ frecventă ṣi în acelaṣi timp periculosă. Contaminarea poate fi prezentă în bloc sau numai pe secțiuni.

Contaminarea lamelor poate apărea pe secțiuni sau pe frotiurile citologice: fie prin secțiuni flotante pe baia de apă sau în timpul colorării dacă celulele au căzut de la o altă secțiune sau al frotiu citologic ṣi este depozitat pe o altă lamă. În aceste cazuri, artefactele nu vor apărea în acelaṣi plan focal cu tesutul înconjurător; acceptându-se că aceste artefacte se datorează sectiunii tisulare flotante în timpul montării.

Artefacte de colorare

Artefactele de colorare de datorează clarificării cât si a depozitelor de coloranți.

Parafina reziduala în tesut va determina colorare neregulată Când un vas de colorare conține ca soluție de lucru hematoxilina, va sta la temperatura camerei pentru o perioadă lunga de timp, pe suprafața soluției se va acumulua o substanță cu aspect metalic. Aceasta substanța constă în mordant oxidat si hematina, putând contamina secțiunile tisulare colorate în soluția afectată.

Fulgii de eozină, se observă focal în planul secțiunilor tisulare, reprezintă colorant precipitat rezultat de la depozitele de soluție nefiltrată.

Artefacte de montare

Artefacte de colorare imunohistochimica

Artefacte de montare

Exemple de artefacte de montarenclud contaminarea lamelor cu grăunți de polen, spori, ouă, praf, mizerii, fibre de bumbac, contaminarea mediului de montare, utilizarea lamelelor prea mici, poziția greṣită a lamelelor, soluție de montare insuficientă, ce duce la uscarea secțiunii ṣi prinderea aerului între lama ṣi lamelă, cât si utilizarea unei cantități pre mari de soluție de montare.

Artefactele brune (fulgi), caracterizate prin depozite brune deasupra celulelor scuamoase, se crede că apar daca apare o întârziere între trecere lamei intre ultimul xilen si montare cu mediu de montare. Aceasta se datorează prinderii aerului în scizurile celulelor scuamoase mature.

Reținerea picăturilor de alcool ṣi apă. Aceste bule artefactuale, care ṣterg detaliile morfologice ale secțiunii subiacente, rezultă din utilizarea xilenului care a devenit saturat de către soluția de deshidratare utilizată anterior montării.

Artefacte ale pieselor înghețate

Cristale de gheață artefactuale

Se datorează inghețarii lente a tesutului

Soluția: ingheinghețare rapidă cu cât inghețarea este mai rapidă cu atât vor fi mai mici cristalele de gheață, iar țesutul distrus va fi redus (cea mai bună metodă de inghețare este fără îndoială lichidul de nitrogen)ț

Țesuturile mici prezintă artefacte mai puține- țesutul optim ar trebui sa fie 0,5×0,5x 0,3 cm sau mai putin

Nu se ingheață fragmente mai mari decât diametrul rozetei

Cristale de gheață într-o stromă edematoasă (imaginea din stânga) congelațieș (dreapta) colorație Hematoxilina-eozina (postcongelație).

Artefacte de tăiere la gheață

Neregularitățile lamei vor produce desoicături/lacrimi pe secțiune

Soluția: se recomandă schimbarea lamei după câteva cazuri

Artefact de tăiere (spațiile optic clare/ Albastru de Toluidina ob 40x)

Artefacte de supra/inghețare insuficientă

Suprainghețarea poate determina rupturi pe secțiune

Soluția: poliṣarea blocului tisular, prin intrarea în bloc pentru a crea fricțiune ṣi încălzirea acestuia cu atingerea cu degetul 5-10 secunde

Inghețarea insuficientă poate crea probleme, în special țesuturilor adipoase

Soluția: se pune un radiator peste bolcul tisular sau se selecteaza, de la criostat (dacă există această funcție), inghețare rapidă.

Artefacte de colorare

Mizeriile sau petele de la colorare pot determina apariția țesuturilor straine care aderă la lamă; coloranții prea diluați ṣi alcooli pot diminua calitatea lamei

Colorarea defectuoasă împiedică diagnosticul secțiunilor congelate, detaliile nucleare fiind compromise

Soluții: menținerea curată a coloranților prin schimbarea frecventă a soluțiilor; se recomandă respectarea timpilor de colorare; nu va grabiți.

Notă: Țesutul cerebral se colorează cel mai bine în eozină 60 de secunde

Apa: ar trebui schimbată după fiecare secțiune

Alcooli si coloranți: se schimbă la cel putin o săptămână; alcoolii necesită o schimbare mai freceventă, în funcție de volumul de secțiuni.

Artefacte de congelație a țesutului adipos

Inclusiv ganglionii, sânul si pielea pot fi prea moi pentru a fi secționați

Soluția: este necesară o temperatură de secționare foarte scăzută (-200 C)

Ganglionii fermi, splina, creierul si ficatul se secționează mai bine la

-100 C; secțiunile se pot sfărâma dacă temperatura este mai scăzută.

Bulele de aer

Bulele de aer se pot identifica intre lama ṣi lamelă ce poate determina uscarea țesutului

Soluția: Este necesară o cantitate suficientă de răṣină (2 picături); se scoate aerul usor cu degetul sau cu ajutorul unei pense.

Secțiunile prea groase

Pot determina căderea țesutului de pe lamă

Soluția: Reducerea grosimii de sectionare din funcțiile criostatului.

Artefacte de decalcifiere

Artefactele osoase apar în timpul tâierii, forajului, ṣi a procedurilor de decalcifiere. Prafuf osos se poate observa în două forme- în prima formă ca ṣi aṣchii de os sau cartilaj, în forma a doua, ca mase rotunde de detritus. Pe secțiunile decalcificate, interpretarea microscopică este dificilă ce poate duce la un diagnostic eronat, cel mai frecvent in metastazele calcificate.

Defectele de decalcifiere se pot identifica în timpul fixării specimenului înaintea decalcificării, pe radiografiile anterioare1.

Secțiunile nedecalcificate conțin praf osos, fin, nisipos-like sau pudră în asociere cu trabeculele osoase sau în proximitatea acestora. Praful osos aparea atât pe secțiunile realizate cu cuțite de sticlă sau diamant ṣi nu există o metodă care ar putea interveni în corectarea acestui artefact2.

Artefactele de reprecitare sunt cauzate de lipsa agitării ṣi a volumului neadecvat al fluidului de decalcifiere. Aceste artefacte se observă ca niṣte granule rotunde sau mase cristaline care se identifică în principal în țesuturile moi sau măduva osoasă3,4.

Supradecalcificarea poate împiedica calitatea secționării, afectează propietățile de colorare, fiind distruse detaliile histologice.

Artefactele osoase nedecalcificate constau în matrice fracturată în secțiunile de răṣină.

Aceasta este virtual imposibil de eradicat, dar poate fi minimalizat prin extensia timpului de procesare pentru a îmbunătății infiltrarea, dar ṣi prin polimerizarea lentă de răṣini epoxidică, pentru a promova polimerii liniari ṣi pentru a produce o răṣină mai flexibilă. Alternarea utilizării cuțitului de diamant în locul cuțitului de sticlă pot rectifica aceste artefacte4.

1 Bancroft JD, Marilyn Gamble. Theory and practice of histological technique. 6th edition. Churchill Livingstone: Elsevier Health Sciences; 2008. pp. 53–105.

2 Rolls OG, Farmer JN, Hall BJ. Artifacts in Histological and Cytological Preparation. Scientia Leica Microsystems Education Series. April 2008;21

3. Carleton HM, Drury RAB, Wallington EA. Carleton’s Text book of histological techniques. 5th ed. 88. Vol. 41. The University of Michigan: Oxford university press; 1967. p. 269.

4 Culling CFA, Allison RT, Barr WT. Cellular Pathology Technique. 4th edition. Vol. 78. Butterworths (London, Boston): 1985. p. 611.p. 18.

PARTEA SPECIALĂ

Introducere

Histopatologia este o știintă complet dependentă de examinarea ṣi interpretarea microscopică. Cerințele de bază pentru stabilirea unui diagnostic de certitudine sunt reprezentate de procedurile corecte de recoltarea a biopsiilor, fixare ṣi tehnici de procesare adecvate cât ṣi secționare ṣi colorare corespunzătoare. Identificarea detaliior structurale ṣi morfologice la nivelul componentelor tisulare, este foarte importantă pentru susținerea unui diagnostic corect. Uneori, prezența unor substanțe străine sau alterarea detaliilor tisulare poate crea confuzii, putând duce la o interpretare incorectă sau neconcludentă. Aceste entități sau modificări sunt larg denumite ’’ artefacte’’.

Termenul de artefact histologic poate fi definit ca o structură anormală în țesuturile histopatologice. Problema, o reprezintă recunoaṣterea acestora artefacte aṣa cum ele apar ṣi necesitatea de nu le confunda cu componentele țesutului normal sau ca o modificare patologica. În unele situații prezența acestor artefacte poate compromite acuratețea diagnosticului.

Artefactele pot fi minore, ce implică mici porțiuni din specimen, ṣi care nu inteferă cu acuratețea diagnosticului. În unele cazuri, artefactele pot fi atât de extinse astfel încât periclitează diagnosticul.

Scop si obiective

Scopul unei tehnici histopatologice adecvate este de a produce preparate tisulare microscopice. Scopul acestei teze este

identificarea timpului de apariție a artefactelor: excizie chirurgicala, fixare, procesare, includere, secționare la microtom ṣi proceduri de colorare.

de a susține ṣi de a conṣtientiza aceste artefacte care apar pe preparatele histopatologice,

furnizarea a cât mai multe informații pentru recunoaṣterea acestor artefacte,

evidentierea cauzelor acestora

clasificarea principalelor tipuri de artefacte

acolo unde este posibil găṣirea unor soluții pentru a putea repara aceste artefacte.

Identificarea tipului de artefact, in special în biospii, unde pot ridica probleme în diagnosticarea invaziei tumorala locală, sau poate duce la un diagnostic respectiv tratament greṣit.

Material ṣi metodă

În vederea realizării studiului asupra artefactelor histopatologice ṣi imunohistochimice am analizat 100 cazuri diagnosticate în decursul a 1 an în cadrul Serviciului de Anatomie Patologică a Spitalului Clinic Colțea Bucureṣti (iulie 2014 – iulie 2015).

Am selectat cazurile respectând ca unic criteriu prezența confirmată a artefactelor pe preparatele histopatologice atât pe piese mari cât ṣi pe biospii.

Metode histopatologice utilizate

Piesele chirurgicale au fost orientate macroscopic conform protocoalelor în vigoare ale specialității.

Fragmentele tisulare recoltate au fost imersate în formol 10% tamponat imediat după recoltare. Prelucrarea histopatologică s-a efectuat prin deshidratare, clarificare și impregnare cu parafină prin procedură manuală sau automată după următoarele rețete:

Protocol de lucru PRELUCRARE HISTOPATOLOGICĂ manuală

piese mari

1. Spălare în apă de robinet 1½ – 2ore

2. Deshidratare alcool etilic (3 bai – 70°, 80°, 90° – peste noapte )

3. Deshidratare alcool etilic 96° ( 3 bai – I, II, III – peste noapte)

4. Deshidratare alcool etilic absolut ( 3 bai – I, II, III – peste noapte)

5. Deshidratare acetonă 30 minute – facultativ – numai pentru fragmente f. mari

6. Clarificare toluen ( 3 bai – I si II cate 1½ ore – la cald, III – peste noapte, la temperature camerei)

7. Parafinare ( 4 bai – I, II, III, IV – peste noapte)

8. Includere

Protocol de lucru PRELUCRARE HISTOPATOLOGICĂ manuală

piese Cutanate mici

Spălare în apă de robinet 1½ ore

Deshidratare alcool etilic 96° ( 3 băi – I, II, III – peste noapte)

Deshidratare alcool etilic absolut ( 2 băi – I si II – 2 x 1 oră)

Clarificare toluen ( 3 băi – I și II , 2 x 30 minute –la cald; III – peste noapte la temperatura camerei)

Parafinare ( 3 băi – 5 ore); includere

Protocol de lucru PRELUCRARE HISTOPATOLOGICĂ Automată (histoprocesor Thermo fischer microm stp 420d)

Spălare piese 1½ h apă curentă, apoi introducere în aparat

Protocol de lucru PRELUCRARE HISTOPATOLOGICĂ Automată (histoprocesor Leica asp 200s)

Spălare piese 1½ h apă curentă, apoi introducere în aparat

Fragmentele impregnate cu parafină au fost incluse în blocuri de parafină cu ajutorul unor stații de includere la parafină Thermo Fisher Microm EC 1150 H și Leica EG 1150H și secționate la 3μ cu ajutorul unor microtoame rotative Leica RM 2255 și RM 2265; secțiunile au fost etalate pe lame simple pentru colorații de rutină (Hematoxilină Eozină – HE) sau speciale (PAS, Giemsa, Perls, Fontana-Masson, Gomori) sau acoperite cu polilizină petru colorațiile imunhistochimice (IHC). Colorația HE a fost efectuată manual sau cu ajutorul coloratoarelor automate Leica ST 5020 și Microm HMS 760; lamelele au fost montate fie manual, fie cu ajutorul montatoruui automat Leica CV 5030. Rețetele pentru colorația HE și colorațiile speciale respectă prevederile Ghidurile de practică medicală pentru specialitatea Anatomie Patologică.

PROTOCOL DE LUCRU COLORATIA HEMATOXILINA-EOZINA

Deparafinare

Hidratare alcool etilic absolut, 96°, 70°

Spălare în apă robinet

Colorare cu hematoxilină (hemalaun) Mayer – 30sec. – 5 minute*

Spălare în apă robinet

Diferențiere rapidă în alcool- acid clorhidric

Spălare în apă robinet

Contrastare în apă litinată – 10 min

Colorare cu eozină 10-90 secunde*

Deshidratare

Clarificare

Montare.

Reactivi:

Hematoxilina (hemalaun) Mayer: hematoxilina + alaun de potasiu 75g + iodat de sodiu 0,3g + apa distilata .

Eozina: eozina galbena 6g + eozina albastra 6g + orange G 0.4g + alcool etilic 70° 700 ml + solutia saturata carbonat de litiu 80 ml + acid acetic glacial 3 ml.

Alcool- acid clorhdric: 99 ml alcool etilic 70°+ 1 ml acid clorhidric 1N

Apă litinată : 99 ml apă de robinet + 1 ml sol. saturată de carbonat de litiu

Pentru testele imnohistochimice au fost folosiți mai mulți anticorpi primari pentru evidențierea unor citokeratine, a unui marker nuclear de celulă scuamoasă, a unor proteine fibriliare din componența țesutului conjunctiv și a factorului de proliferare nulceară Ki67. Pentru developare au fost folosiți anticorpi secundari și complex streptavidină din kitul Novolink (Leica) precum și cromogen DAB lichid (Leica).

Colorațiile IHC au fost efectuate fie manual, fie cu ajutorul imunocoloratorului automat Leica Bond III. Rețetele pentru colorațiile IHC respectă prevederile Ghidurile de practică medicală pentru specialitatea Anatomie Patologică.

Protocol de lucru imunohistochimie

(metoda tristadială indirectă, evidenȚiere cu DAB)

Deparafinare