Tehnici de Baza In Analiza Acizilor Nucleici Si a Proteinelor

TEHNICI DE BAZĂ ÎN ANALIZA ACIZILOR NUCLEICI ȘI A PROTEINELOR

Moleculele care sunt supuse analizei în investigațiile specifice biologiei moleculare, genomicii sau proteomicii sunt moleculele ADN, ARN sau proteine.

Moleculele ADN sunt extrase și purificate prin procedee specifice, după care pot fi supuse direct investigațiilor, datorită stabilității lor. Genomul este același în toate celulele unui organism, în orice fază de dezvoltare ontogenetică, în orice condiții de mediu și de aceea ADN poate fi extras din orice tip de celule sau țesuturi.

Astfel se pot obține informații cu privire la structura genomului, pot fi identificate și caracterizate gene, pot fi stabilite amprente genetice sau se poate stabili gradul de înrudire, diversitatea sau filiația intra sau interspecifică.

În cazul în care se urmărește investigarea moleculelor ARN o problemă importantă o prezintă instabilitatea acestora. De aceea, de cele mai multe ori se obțin molecule ADN complementar, care sunt copii fidele ale ARNm, dar care prezintă o stabilitate mai ridicată, ceea ce permite aplicarea tuturor metodelor de investigație specifice ADN. Populațiile de ARN din celule sunt specifice tipului de organ, etapei de dezvoltare și condițiilor de mediu și de aceea este necesară alegerea în prealabil a materialului de analizat în funcție de obiectivele urmărite.

Analizele care au ca obiect ARN permit evaluarea expresiei genelor și anume pot fi identificate genele care se exprimă la un anumit moment, poate fi analizată comparativ supra sau sub-expresia unor gene sau efectul unor factori externi asupra expresiei genelor.

Structura, proprietățile fizice și chimice specifice ale acizilor nucleici și ale proteinelor au permis de-a lungul anilor, o dată cu progresul biologiei moleculare și a echipamentelor specifice, dezvoltarea unor tehnici de analiză moderne, care au stat apoi la baza tehnicilor de investigație complexe.

4.1. DENATURARE/RENATURARE/HIBRIDIZARE

Denaturarea sau disocierea (“DNA melting”) este un proces în care o moleculă de acid dezoxiribonucleic (ADN) se separă în două lanțuri monocatenare prin desfacerea legăturilor de hidrogen formate între bazele azotate complementare. Ambii termeni menționați sunt utilizați cu referire la același proces, care are loc în general atunci când amestecul este încălzit (94-95ºC); denaturarea poate însă să se refere și la separarea catenelor ADN sub acțiunea unor agenți chimici cum ar fi ureea, sau prin supunerea la un mediu alcalin (pH>11).

Pentru copii multiple de ADN temperatura de disociere (“melting temperature”) – Tm este definită ca temperatura la care jumătate dintre catenele ADN sunt sub formă bicatenară și jumătate sunt monocatenare. Temperatura de disociere depinde atât de lungimea moleculei cât și de secvența nucleotidelor în fragmentul analizat.

Monitorizarea proceselor de denaturare este posibilă prin măsurarea absorbanței, ținând cont că moleculele de ADN au absorbția maximă în domeniul UV, la o lungime de undă de 260 nm. Atunci când moleculele de ADN se denaturează absorbanța va crește până la finalizarea procesului, când în amestec se găsesc numai molecule monocatenare, după care va rămâne constantă. Acest fenomen poartă numele de efect hipocromic, iar absorbanța ADN monocatenar este cu 50% mai mare decât a celui bicatenar.

Reacția de denaturare/disociere poate avea loc atunci când este compensată energia de legătură, stabilită între bazele azotate complementare. Se cunoaște că legăturile stabilite între citozină și guanină (3 legături de hidrogen) sunt mai puternice decât cele dintre adenină și timină (2 legături de hidrogen), prin urmare regiunile bogate în A/T pot fi mai ușor denaturate.

Au fost dezvoltate metode analitice care permit evaluarea proporției de citozină și guanină din genom, denumită conținut CG, care poate fi estimată prin măsurarea temperaturii la care ADN genomic se disociază. Temperaturi mai ridicate sunt asociate cu un conținut mai ridicat în CG (Fig. 4.1).

Regiunile care alcătuiesc promotorii genelor sunt alcătuite de secvențe de genul „TATATA”, care se denaturează mai ușor, furnizând fragmente ADN monocatenare, care permit începerea transcrierii.

Fig. 4.1. Variația procentului de molecule denaturate în funcție de temperatură, pentru polinucleotide alcătuite exclusiv din C/G, respectiv A/T, comparativ cu un fragment natural de ADN

Procesul de denaturare este reversibil, astfel că molecula bicatenară poate fi refăcută. Dacă fragmentele monocatenare care refac dublul helix au la origine aceiași moleculă ADN, procesul poartă numele de renaturare. Dacă fragmentele de ADN monocatenare au origini diferite (ex. secvență țintă, sondă moleculară) procesul poartă numele de hibridizare.

Prin scăderea temperaturii sau a pH este favorizată refacerea legăturilor de hidrogen între bazele complementare de pe cele două lanțuri unice de ADN, ARN sau ARN și ADN. Reacțiile de renaturare se produc de regulă la temperaturi care corespund unei diferențe de 20 – 30ºC față de temperatură de disociere (Tm) a acidului nucleic bicatenar; dacă temperatura însă scade brusc, catenele rămân separate.

Un factor important în procesul de hibridizare este stringența, sau intensitatea reacției. Dacă două catene unice de acid nucleic sunt formate pe toată lungimea din baze complementare, iar condițiile de reacție sunt favorabile, stringența (intensitatea) reacției de combinare este foarte puternică. Dacă pe cele două catene de acid nucleic există doar zone parțiale cu baze complementare, stringența este mai scăzută. Această situație apare în special atunci când cele două catene provin de la două organisme diferite.

Procesele de denaturare asociate cu renaturarea sau hibridizarea își găsesc o gamă largă de aplicații în dezvoltarea tehnicilor complexe de investigație în biologia moleculară.

APLICAȚII GENERALE

Evaluarea timpului de renaturare poate fi utilizată pentru a estima compoziția în baze azotate și totodată prezența unor fracții repetitive în secvența analizată. Această metodă a fost aplicată în anii 1960 pentru a evidenția diferențele apărute în compoziția bazelor azotate a moleculelor de ADN, provenite de la diferite organisme și totodată pentru a demonstra că ADN eucariot conține un procent mare de secvențe repetitive.

La scară de genom, metoda a fost folosită pentru a estima distanța genetică dintre două specii, proces care poartă numele de hibridizare ADN- ADN. Dacă se analizează regiuni izolate din genom, se pot utiliza geluri cu gradient de denaturare sau în gradient de temperatură pentru a detecta prezența unor mici nepotriviri. Totuși, în prezent, pentru ca informațiile cu privire la succesiunea bazelor azotate să fie mai precise se preferă utilizarea tehnicii de secvențializare.

Procesul de denaturare ADN este de asemenea utilizat în tehnicile de biologie moleculară, în special în cadrul PCR (Polymerisation Chain Reaction). Cunoașterea temperaturii de disociere (Tm) are o importanță deosebită în stabilirea temperaturii de legare a primerilor la catena matriță, ceea ce conduce la reacții de amplificare eficiente.

Procesele de renaturare/hibridizare au stat la baza dezvoltării tehnicilor Southern și microarray, în care atât ADN fixat pe suport cât și sonda moleculară sunt denaturate, iar reacția de hibridizare se desfășoară în condiții prestabilite, pe baza complementarității bazelor.

În prezent se poate aplica metoda de “hibridizare in situ” controlabilă cu ajutorul tehnicilor de fluorescență. În acest caz sonde moleculare marcate se leagă la secvențe complementare de ADN care se găsesc în cromozomii prometafazici etalați pe o lamă microscopică și denaturați în prealabil.

4.2. SECȚIONAREA MOLECULELOR ADN CU ENDO-NUCLEAZELE DE RESTRICȚIE

Enzimele de restricție sau endonucleazele de restricție sunt endonucleaze de origine bacteriană. În mod natural ele clivează moleculele de ADN străin (de exemplu ADN viral pătruns în celula bacteriană respectivă), fără a cliva însă ADN bacterian propriu, deoarece acesta poartă un semn de recunoaștere, reprezentat de niște situsuri specifice, metilate. Metilarea reprezintă un mecanism de apărare al celulei bacteriene față de propriile nucleaze.

Nomenclatura enzimelor de restricție a fost stabilită de către Nathans și Smith (1973) astfel: Prima literă indică genul bacterian de proveniență, literele 2, 3 indică specia; alte litere indică tulpina bacteriană de proveniență a enzimei; numerele indică ordinea de descoperire.

Luând ca exemplu enzima de restricție denumită EcoR I, putem spune că litera E provine de la gen – Escherichia, grupul de litere co provine de la specie, coli, litera R de la tulpina RY13. Cifra romană I arată că EcoR I a fost prima enzimă izolată din această tulpină.

După izolarea primei enzime de restricție – Hind III, în anul 1970 și descoperirea și caracterizarea ulterioară a numeroase alte enzime de restricție, în 1978 a fost decernat premiul Nobel pentru Fiziologie și Medicină lui Daniel Nathans, Werner Arber și Hamilton Smith. Descoperirea lor a condus la dezvoltarea tehnologiei ADN recombinant care a permis, de exemplu producerea pe scară largă a insulinei umane utilizînd bacteria E. coli. De atunci au fost studiate în detaliu mai mult de 3000 de enzime de restricție dintre care mai mult de 600 sunt disponibile comercial și sunt utilizate în procesele de manipulare a ADN în laborator.

4.2.1. CLASE GENERALE DE ENZIME-ENDONUCLEAZE DE RESTRICȚIE

Până în prezent au fost caracterizate trei sisteme de restricție-metilare (R-M), dintre care cea mai mare răspândire o are sistemul II (95%).

ENZIME DE RESTRICȚIE – tipul I

Enzimele de restricție de tipul I au fost identificate prima dată și sunt caracteristice pentru două tulpini K 12 și B din E. coli. Aceste enzime secționează la un situs care este amplasat la o anumită distanță (cel puțin 1000 bp) de situsul de recunoaștere. Situsul de recunoaștere este asimetric, compus din două porțiuni, una alcătuită din 3-4 nucleotide și cea de-a doua din 4-5 nucleotide, separate de o sevență de separare („spacer”), cu o lungime 6-8 nucleotide.

Din punct de vedere structural, enzimele de restricție de tipul I sunt alcătuite din trei subunități denumite HsdR, HsdM și HsdS. Subunitatea HsdR este implicată în procesul de secționare, HsdM este necesară pentru metilare (ex. adăugarea de grupări metilice la ADN gazdă, ceea ce reprezintă o activitate metil-transferazică); subunitatea HsdS are un rol în stabilirea specificității situsului de recunoaștere, ca o completare la activitatea metiltransferazei.

Activitatea acestor enzime este asigurată de câțiva cofactori enzimatici și anume S-Adenosyl methionina (AdoMet), adenozin-trifosfatul (ATP) și ionii de magneziu (Mg2+).

ENZIME DE RESTRICȚIE – tipul II

Enzimele de restricție de tipul II, cele mai comune și mai utilizate tipuri de enzime, sunt compuse dintr-o singură subunitate, iar situsurile de recunoaștere sunt de obicei nedivizate și palindromice, cu o lungime de 4-8 nucleotide. Aceste enzime recunosc și secționează secvențe specifice din molecula ADN bicatenar și nu necesită ATP sau S-Adenosyl methionina (AdoMet) pentru funcționare, dar Mg2+ acționează ca și cofactor.

In anii 1990 și la începutul anilor 2000 au fost descoperite noi tipuri de enzime din aceiași familie, care nu urmează criteriile clasice ale acestei clase de enzime.

Astfel, enzimele care nu respectă întru-totul caracteristicile specifice acestei clase au fost catalogate în subgrupe, definite prin adăugarea unei litere la sfârșit.

Tipul II B de enzime de restricție (Bcg I și Bpl I) sunt multimeri, alcătuiți din mai mult de o subunitate. Acestea secționează molecula ADN de o parte și de alta a situsului de recunoaștere și necesită prezența ambilor cofactori AdoMet și Mg2+.

Tipul II E (Nae I) secționează molecula ADN în urma interacțiunii cu două copii ale secvenței de restricție. Un situs de recunoaștere acționează ca țintă pentru secționare, în timp ce cel de-al doilea acționează ca activator alosteric mărind eficiența de secționare a enzimei.

Similar cu tipul II E, tipul II F (Ngo M IV) interacționează cu două copii ale situsului de restricție, dar secționează ambele secvențe în același timp.

Tipul II G (Eco 57I) are o singură subunitate la fel ca tipul II clasic de enzime de restricție , dar necesită cofactor AdoMet pentru a fi activ.

Tipul II M, cum ar fi Dpn I, este capabil să recunoască și să secționeze ADN metilat.

Tipul II S (Fok I), având o structură dimerică, secționează ADN la o distanță definită de situsul de recunoaștere care este asimetric și non-palindromic.

Similar, tipul II T (Bpu 10I și Bsl I) este compus din două subunități diferite. Unele recunosc secvențe palindromice în timp ce altele au situsuri de restricție palindromice.

ENZIME DE RESTRICȚIE – tipul III

Enzimele de restricție de tipul III (Eco P15) recunosc două secvențe separate, non-palindromice care sunt orientate invers, secționând la 20-30 perechi de baze după situsul de recunoaștere. Aceste enzime conțin mai mult de o subunitate și necesită AdoMet și ATP ca și cofactori, datorită rolului lor în metilare și restricție.

4.2.2. ASPECTE GENERALE PRIVIND ENZIMELE DE RESTRICȚIE CU UTILIZARE COMUNĂ ÎN TEHNICILE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

Enzimele cele mai utilizate sunt enzimele de tip II, care recunosc o secvență specifică din molecula ADN dublu catenar, se atașează la nivelul acelei secvențe, producând secționarea.

Aceste secvențe, denumite situsuri de recunoaștere sunt alcătuite dintr-un număr redus 4, 6 sau 8 perechi de nucleotide ce formează două secvențe palindromice situate în jurul unui punct de simetrie. Cele mai uzuale sunt enzimele care au situsuri de recunoaștere alcătuite din 6 bp.

Enzimele al căror situs de recunoaștere este alcătuit dintr-un număr redus de perechi de baze secționează moleculele de ADN mai des, deoarece probabilitatea de a întâlni acele secvențe în genom este mai mare. Cu cât lungimea unui situs de recunoaștere este mai mare, cu atât se va regăsi în mai puține poziții în genom.

Unele enzime de restricție taie simultan ambele catene în același punct, rezultând fragmente cu capete netede, în timp ce altele taie catenele după o schemă defazată, rezultând fragmente ADN cu capete coezive monocatenare (Fig. 4.2). Dacă fragmentele monocatenare se află situate la capetele 3’, extremitățile poartă numele de „capete coezive 3’”, iar dacă rămân fixate în zona 5’ sunt denumite „capete coezive 5’”.

Aceste aspecte referitoare la extremitățile fragmentelor formate în urma secționării cu o enzimă de restricție au o importanță deosebită în procesele de formare a moleculelor de ADN recombinat, deoarece pot fi legate numai fragmente care au capete netede, iar cele cu capete coezive trebuie să fi fost secționate cu aceiași enzimă de restricție, pentru a avea extremități monocatenare complementare.

Fig. 4.2. Mecanismul de acțiune al enzimelor de restricție

Săgețile reprezintă legăturile fosfodiesterice care vor fi desfăcute de către enzimele de restricție

În continuare sunt prezentate trei tipuri de enzime de restricție care generează capete diferite.

În urma acțiunii enzimelor de restricție ambele catene ale moleculei ADN sunt secționate. De fiecare dată enzima secționează o legatură fosfodiesterică generând grupări -OH la capetele 3’ și fosfat la capetele 5’ formate în urma reacției.

Fiecare enzimă de restricție prezintă o activitate optimă în anumite condiții de temperatură, care coincid cu temperatura mediului de viață al tulpinii bacteriene din care a fost extrasă.

În general enzimele de restricție izolate din surse diferite recunosc secvențe de nucleotide diferite. Există însă enzime care au situsuri identice, deși nu au fost izolate din aceiași tulpină bacteriană, prin urmare au și denumiri diferite. Atsfel de enzime poartă numele de izoschizomeri. De exemplu enzimele Cla I și Bsu I, au același situs de recunoaștere: ATCGAT.

În plus, există unele enzime care recunosc o secvență de patru nucleotide, iar această secvență se află în interiorul unei secvențe de 6 nucleotide, care reprezintă situsul de recunoaștere al altei enzime. De exemplu Mbo I și Bam H I. Situsurile de recunoaștere pentru aceste enzime sunt următoarele.

Mbo I 5’ ↓ G A T C 3’ Bam H I 5’ G ↓ G A T C C 3’

3’ C T A G ↑ 5’ 3’ C C T A G↑G 5’

APLICAȚII GENERALE

Enzimele de restricție sunt foarte mult utilizate în tehnicile de genetică moleculară. Ele stau la baza tehnologiei ADN recombinat și de asemenea sunt folosite în alcătuirea hărților de restricție și evidențierea polimorfismului cu ajutorul markerilor RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) sau CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic DNA).

4.3. SINTEZA ADN, CU AJUTORUL ADN POLIMERAZELOR

ADN polimerazele sunt reprezentate de un grup de enzime care asigură sinteza unei noi catene de ADN, utilizând o altă catenă ca matriță.

În cadrul procesului de replicare a ADN, in vivo, la un moment dat are loc desfacerea legăturilor de hidrogen dintre cele două lanțuri polinucleotidice, care devin astfel independente și servesc fiecare ca matriță pentru formarea unui lanț polinucleotidic complementar. În acest proces este implicat un sistem enzimatic complex, în care ADN polimeraza ocupă un loc central.

Astfel, pentru sinteza ADN, atât in vivo cât și in vitro, trebuie să existe o catenă de ADN care să funcționeze ca matriță, un fragment (primer) care să pună la dispoziție o grupare OH la un capăt 3’ și cei patru nucleozid trifosfați (dATP, dTTP, dCTP și dGTP), care să furnizeze moleculele din care va fi sintetizată noua catenă.

ADN polimeraza catalizează adiția unităților mononucleotidice la capătul 3’- hidroxil liber al catenei ADN primer, direcția procesului de sinteză a ADN fiind întotdeauna 5’→3’. Reacția are loc printr-un atac nucleofil, în care gruparea 3’-hidroxil din restul nucleotidic terminal al catenei de ADN în creștere, reacționează cu atomul fosfat aflat în poziția 1 a nucleozid-5’-trifosfatului următor, determinând formarea legăturii fosfo-diesterice și eliminarea de pirofosfat (Fig. 4.3).

În biologia moleculară, caracteristica ADN polimerazelor de a sintetiza noi catene de ADN a fost exploatată foarte mult, permițând dezvoltarea unei game largi de investigații.

Astfel, descoperirea ADN polimerazelor stabile termic a permis introducerea la scară largă a proceselor PCR – amplificarea prin reacția în lanț a polimerazei, revoluționând astfel biologia moleculară.

Fig. 4.3 Mecanismul alungirii catenei prin acțiunea ADN polimerazei

4.3.1. METODA AMPLIFICĂRII PRIN REACȚIA ÎN LANȚ A POLIMERAZEI

Amplificarea prin reacția în lanț a polimerazei este o metodă analitică de investigare a acizilor nucleici, care constă din amplificarea enzimatică in vitro a unui fragment ADN, cu secvență necunoscută, poziționat între două regiuni cu secvențe cunoscute. Astfel este posibilă amplificarea unei singure copii ADN în milioane de copii în numai câteva ore.

Metodă este cunoscută în limba franceză sub numele de”méthode d‘amplification électivé în vitro de séquences d‘acides nucléiques” – metoda amplificării selective in vitro a secvențelor de acizi nucleici, iar în limba engleză sub numele de “Polymerase Chain Reaction” – reacția în lanț a polimerazei – abreviată prin acronimul PCR. Această abreviere este acreditată în literatura de specialitate de circulație internațională, implicit în literatura de limba franceză.

Această nouă metodă a fost inițiată în perioada 1980-1983 de către Kerry Mullis (Mullis, 1990), care a primit premiul Nobel pentru Chimie în anul 1993. Metoda, percepută ca o revoluție metodologică în biologia moleculară se remarcă prin faptul că face posibilă obținerea unui număr impresionant de copii ale unor secvențe specifice din ADN care pot fi gene, fragmente de gene sau alte secvențe ADN.

Pentru a fi posibilă desfășurarea unei reacții de amplificare sunt necesare două oligonucleotide cu secvențe specifice, denumite uzual “amorse” (fr. amorces) sau “primeri” (engl. primers), complementare cu secvențele care flanchează fragmentul ADN de amplificat. Aceste oligonucleotide furnizează grupările libere OH, la capetele 3’, necesare ADN polimerazei pentru a începe sinteză. Dezvoltarea acestei tehnici a cunoscut o amploare deosebită după ce a fost izolată o ADN polimerază termostabilă, care să rămână activă pe parcursul tuturor etapelor de încălziri și răciri repetate.

4.3.1.1. COMPONENTELE UNEI REACȚII DE AMPLIFICARE – CARACTERISTICI ȘI MOD DE UTILIZARE

Componentele (reactivii) necesari desfășurării unei reacții de amplificare sunt ADN matriță, primerii, ADN polimeraza, cei patru nucleozid-trifosfați și o soluție tampon, care asigură condițiile optime de reacție (pH, tărie ionică, MgCl2). Fiecare dintre aceste componente trebuie să îndeplinească o serie de caracteristici pentru ca, după derularea programului de amplificare să rezulte un număr suficient de fragmente, care să permită vizualizarea în gel de agaroză.

ADN MATRIȚĂ („Template”)

Referitor la moleculele ADN de amplificat trebuie să se țină cont de mai multe aspecte referitoare în special la calitatea acestora și mai puțin la cantitate, deoarece pe parcursul desfășurării reacției sunt parcurse cicluri în care amplificarea este exponențială.

De obicei pot fi amplificate fragmente cu lungimi mai mici de 10 kb, dar randamente foarte bune se obțin atunci când fragmentele sunt mai mici de 3kb.

Nu sunt necesare cantități mari de ADN, deoarece are loc o amplificare a fragmentelor țintă, iar cantitățile mari de ADN favorizează obținerea de produși PCR nespecifici. Calitatea ADN este însă importantă, deoarece prezența unor urme din anumiți compuși folosiți în procedurile de extracție (fenol, EDTA, proteinază K) pot să inhibe activitatea Taq polimerazei.

Totodată fragmentele ADN trebuie să fie intacte pe o lungime mai mare decât cea care urmează a fi amplificată, în caz contrar amplificarea nefiind posibilă. Acest aspect apare mai ales atunci când sursă din care se realizează extracția este reprezentată de ADN fosil, urme biologice etc.

PRIMERI

Primerii sunt fragmente monocatenare de ADN (oligonucleotide)

Cu o lungime de 15-30 nucleotide, Cu cât lungimea primerilor crește, cu atât crește și specificitatea legării lor.

Aceste secvențe flanchează fragmentul țintă de interes din ADN matriță, fiecare primer legându-se la capătul 3’al unei catene. Legarea primerilor este antiparalelă, aceștia furnizând grupări OH la capetele 3’, care permit alungirea ulterioară a catenelor ADN (Fig. 4.4).

Procesul de legare a primerilor este hotărâtor în desfășurarea unei reacții de amplificare și de aceea este supus unor procese de optimizare. De aceea trebuie să fie acordată o atenție deosebită atât secvenței stabilite pentru fiecare primer, cât și stabilirii unei temperaturi optime de legare.

Fig. 4.4. Modul de atașare și de stabilire a secvenței primerilor

Secvența primerilor

La stabilirea secvenței primerilor trebuie să fie respectate o serie de condiții, pentru ca reacțiile de amplificare să se desfășoare în condiții optime.

Conținutul în nucleotide GC (numărul de baze C și G, ca un procent din numărul total de baze) trebuie să se încadreze în intervalul 40-60%.

Prezența bazelor G și C printre ultimele baze de la capătul 3' favorizează legarea specifică, datorită legăturilor puternice dintre bazele complementare C și G. Dar un număr mai mare de trei G sau C trebuie să fie evitat între ultimele cinci baze de la capătul 3'.

Structura secundară a primer-ului are o importanță deosebită; se poate stabili atât intra cât și intermolecular și poate afecta afecta eficiența reacției. Structurile care trebuiesc evitate sunt prezentate în continuare:

Formarea structurilor „ac de păr” („hairpin”) datorită interacțiunilor intramoleculare trebuie să fie evitate.

Formarea unui dimer prin interacțiunea intermoleculară dintre doi primeri, de același sens;

Formarea unor dimeri prin interacțiunea celor doi primeri – sens și antisens, datorită complementarității bazelor.

În secvența primerilor trebuie să fie evitată prezența unor di-nucleotide care se repetă consecutiv de mai multe ori (ex. ATATATAT) deoarece conduc la atașări eronate la ADN matriță.

Trebuie să fie de asemenea evitată o secvență de forma AGCGGGGGATGGGG, în care o bază se repetă de cinci ori. Numărul maxim de repetiții acceptat este de 4 nucleotide.

Temperatura de legare a primerilor

Un aspect foarte important în procesele PCR este temperatura de atașare a primerilor la secvențele complementare, secvențele țintă („target”) de pe catena matriță, deoarece este un parametru critic în procesul de amplificare.

Temperatura de disociere – Tm („melting temperature”) a unui primer cu o lungime mai mică de 25 de nucleotide se poate estima cu ajutorul relației:

Tm =4(G+C) + 2(A+T),

Unde G, C, A și T reprezintă numărul nucleotidelor respective în structura primerului.

Dacă primerul are o lungime mai mare de 25 de nucleotide, temperatura de disociere trebuie să fie calculată cu ajutorul soft-urilor speciale (Ex: Primer Premier, PrimerPlex), în care sunt evaluate interacțiunile dintre bazele adiacente, influența concentrației sărurilor etc.

Temperatura de disociere a celor doi primeri trebuie să nu difere prin mai mult de 5ºC, deci conținutul în bazele GC și lungimea lor trebuie să fie apropiate.

Temperatura optimă de legare a primerilor se stabilește la o valoare cu 5ºC mai redusă comparativ cu media temperaturilor de disociere (Tm) ale celor doi primeri.

ADN POLIMERAZĂ

În general, în reacțiile de amplificare se utilizează Taq polimeraza, care este o polimerază termostabilă, denumită după numele bacteriei termofile Thermus aquaticus din care a fost izolată inițial de către Thomas D. Brock în 1965.

Thermus aquaticus este o bacterie care trăiește în izvoare termale prin urmare posedă o polimerază stabilă la temperaturi ridicate. Această enzimă este capabilă să reziste la condițiile de denaturare a ADN (temperatură ridicată) necesare în timpul desfășurării reacției PCR. Astfel, a fost posibilă înlocuirea ADN polimerazei din E. coli, care era utilizată inițial în reacțiile PCR.

Taq polimeraza are o activitate optimă în intervalul de temperatură 75-80ºC, cu un timp de înjumătățire de 9 minute la temperatura de 97,5ºC și poate replica 1000 de baze perchi în mai puțin de 10 secunde la 72°C.

Un dezavantaj al Taq polimerazei este fidelitatea relativ redusă în procesul de replicare deoarece îi lipsește activitatea 3' – 5' exonucleazică (are o rată a erorii cuprinsă între 1 și 9000 de nucleotide). De aceea au fost izolate și alte ADN polimeraze termostabile și din alte bacterii termofile, cum ar fi Pfu ADN polimeraza, care posedă activitate exonucleazică. Aceste enzime pot fi utilizate în locul sau împreună cu Taq polimeraza, pentru o fidelitate mai înaltă a amplificării.

Taq polimeraza conduce la sinteza unor produși care au o grupare deoxi-adeninfosfat (A) la capetele 3’. Prezența acestei grupări poate fi exploatată în procesul de clonare directă a produșilor PCR în vederea secvențializării.

DEZOXI-NUCLEOZIDTRIFOSFAȚI (dNTP)

Prezența dezoxi-ribonucleozid trifosfaților (dNTP) în amestecul de amplificare furnizează moleculele de bază pentru sinteza noilor catene ADN. Este foarte important ca toți cei patru nucleozid trifosfați (dATP, dTTP, dCTP și dGTP) să fie prezenți în concentrații egale, bine stabilite, pentru ca reacția de amplificare să se desfășoare în condiții optime.

CLORURA DE MAGNEZIU (MgCl2)

MgCl2 are rolul de a forma complecși solubili cu dNTP, proces esențial pentru încorporarea acestora în noua catenă ADN și totodată stimulează activitatea polimerazei. O cantitate redusă de ioni de Mg2+ conduce la cantități mici de produși PCR. O coincentrație ridicată favorizează însă formarea produșilor nespecifici. Cantități reduse de Mg2+ sunt recomandate atunci când este importantă fidelitatea sintezei ADN. Dacă probele ADN conțin EDTA sau alte substanțe care pot să lege ionii Mg2+, concentrația acestora în amestecul de reacție trebuie să fie crescută corespunzător.

4.3.1.2. MECANISMUL DE AMPLIFICARE PRIN REACȚIA PCR

Reacția PCR are la bază mecanismul de replicare a ADN in vivo. ADN dublu catenar este denaturat, copiat și renaturat. Această tehnică presupune desfășurarea mai multor cicluri alcătuite fiecare din 3 etape. În plus, la începutul reacției are loc o etapă de denaturare inițială, iar la sfârșit o reacție de extensie finală (Fig. 4.5).

Etapa de denaturare inițială

Denaturarea completă a ADN matriță la începutul reacției PCR are loc la temperatura de 94-95ºC, având ca scop desfacerea moleculelor bicatenare de ADN inițial și formarea moleculelor monocatenare. Timpul de denaturare este cu atât mai mare cu cât conținutul de guanin-nucleozid fosfat (G) și citozin-nucleozid fosfat (C) este mai mare.

B. Ciclu de amplificare, alcătuit din trei etape:

B.1. Etapa de denaturare

Fiecare ciclu de amplificare demarează cu o etapă de denaturare, care conduce la desfacerea moleculelor dublu catenare, atât a celor inițiale, cât și a celor formate pe parcursul derulării procesului. Timpul de denaturare depinde din nou de conținutul de guanin-nucleozid fosfat (G) și citozin-nucleozid fosfat (C).

B.2. Etapa de legare a primerilor (“annealing”) – atașarea celor două oligonucleotide utilizate ca primeri la secvențele complementare din ADN matriță.

B.3. Extensia, sinteza ADN, proces care are loc prin adăugarea de nucleotide la capetele 3’ ale primerilor, cu ajutorul ADN polimerazei, în prezența ionilor de Mg2+.

De obicei etapa de extensie are loc la temperatura de 70-75ºC, rata de sinteză la această temperatură, în prezenta Taq polimerazei fiind ridicată. Timpul recomandat pentru extensie este de 1 minut, pentru sinteza unor fragmente cu lungime mai mare de 2 kb. Dacă se sintetizează fragmente mai mari, timpul de extensie este de obicei mărit cu 1 minut pentru fiecare 1000 bp.

Fig. 4.5. Etapele care alcătuiesc un proces de amplificare amplificare prin reacția în lanț a polimerazei – PCR

1 – etapa de denaturare

2- etapa de legare a primerilor

3- etapa de sinteză ADN, în prezența ADN polimerazei (P)

4- ciclurile repetate, care conduc la amplificarea ADN

Numărul de cicluri

Numărul de cicluri PCR depinde de cantitatea de ADN matriță de la care se pornește și de cantitatea de produși de amplificare așteptată. Pentru mai puțin de 10 copii inițiale ale ADN matriță ar trebui să fie derulate 40 de cicluri. Dacă inițial cantitatea de ADN matriță este mai mare, sunt suficiente 25-35 de cicluri.

C. Etapa de extensie, sinteză ADN finală

După ultimul ciclu, este necesară menținerea amestecului la 72ºC, timp de 5-15 minute pentru a completa toate golurile din produșii de amplificare obținuți. De asemenea, de-a lungul acestei etape activitatea de transferază terminală a Taq polimerazei permite adăugarea de nucleotide A la capetele 3’ale produșilor PCR. Astfel, dacă fragmentele PCR urmează să fie clonate în vectori T/A această etapă poate să fie prelungită la 30 minute.

Cele trei etape: denaturarea, legarea primerilor și extensia alcătuiesc un singur ciclu al amplificării. După fiecare ciclu, fragmentul de ADN nou sintetizat va servi ca matriță într-un nou ciclu de amplificare. Produsul major al acestor reacții exponențiale este un segment ADN dublu catenar, ale cărui extremități sunt date de capetele 5’ ale primerilor și a cărui lungime este determinată de distanța dintre primeri.

După primul ciclu de amplificare produșii sintetizați au lungimi diferite, care depășesc distanța dintre situsurile de legare ale celor doi primeri. După al doilea ciclu aceste molecule generează fragmente ADN cu lungime bine definită, care se vor acumula exponențial de-a lungul ciclurilor de reacție și vor forma produșii de reacție predominați (Fig.4.6). După amplificare numărul de copii al fragmentului de interes este dat de relația:

2n x, unde n este numărul de cicluri și x numărul inițial de copii

Fiecare dintre componentele unei reacții de amplificare este hotărâtoare în desfășurarea unei reacții de amplificare eficientă.

ADN polimerazele stabile termic au o largă utilizare în tehnicile de biologie moleculară, dar au fost identificate și alte enzime, cu utilizări în alte domenii, cum ar fi completarea unor fragmente ADN parțial monocatenare (formate în urma secționării cu enzime de restricție) sau în marcarea unor fragmente ADN.

APLICAȚII GENERALE

Pe baza principiilor tehnicii PCR s-au dezvoltat o serie de metode de investigație, cum ar fi PCR cu punct final ”End-point PCR”, PCR în timp real („Real-time PCR”), PCR asociat cu revers-transcrierea (”Reverse transcription polymerase chian reaction”, cu largi aplicații în domeniul evidențierii prezenței sau absenței unei gene, sau secvențe ADN, amplificarea unui fragment ADN, generarea unor markeri moleculari, detectarea și cuantificarea unei secvențe ADN și studiul expresiei genelor.

4.3.2. SINTEZA ADN ÎN SCOPUL COMPLETĂRII UNOR EXTREMITĂȚI MONOCATENARE

In cadrul proceselor de secționare cu enzime de restricție există posibilitatea formării unor capete coezive, compuse din fragmente scurte monocatenare. Completarea acestor secvențe poate să aibă loc printr-o reacție de sinteză, catalizată de o ADN polimerază.

În acest scop se utilizează fragmentul Klenow al ADN polimerazei I, care reprezintă un fragment mare (75 kDa) al acestei enzime, care și-a păstrat activitatea 5'-3' polimerazică și 3'-5' exonucleazică, dar și-a pierdut activitatea exonucleazică 5'-3'. De aceea, această enzimă se utilizează atunci când este necesară evitarea degradării moleculelor ADN nou sintetizate.

Mecanismul de reacție este similar cu al celorlate polimeraze, prin urmare necesită o grupare – OH liberă, la un capăt 3’.

În cazul fragmentelor monocatenare formate în urma secționării cu enzime de restricție, gruparea de inițiere a reacției este furnizată chiar de capetele 3’, care mărginesc secvențele monocatenare. ADN polimeraza adaugă la acestea nucleozid-trifosfați, ținând cont de complementaritatea bazelor, astfel încât are loc formarea unor capete netede.

APLICAȚII GENERALE

Metoda de completare a secvențelor monocatenare de ADN se aplică în cazul în care se dorește formarea unor molecule de ADN recombinat, pornind de la fragmente ADN care au fost secționate cu enzime de restricție generatoare de capete coezive, diferite. În această situație este necesară completarea capetelor monocatenare, permițând astfel ADN ligazei să refacă legăturile fosfodiesterice între fragmente cu capete netede.

4.3.3. SINTEZA ADN ÎN PROCESE DE MARCARE A SONDELOR MOLECULARE

În cadrul proceselor de marcare radioactivă sau enzimatică a fragmentelor de ADN utilizate ca sonde moleculare se folosesc drept matrițe catene unice de ADN, rezultate dintr-o denaturare prealabilă a unei catene, iar enzima implicată este ADN polimeraza I, fragment Klenow.

Reacțiile de sinteză a noilor catene de acid nucleic pornesc de la primeri cu o lungime de 6 nucleotide, cu secvență întâmplătoare, care găsesc secvențe complementare în mai multe puncte în fragmentul care urmează a fi copiat. Acestea furnizează grupările OH, la capetele 3’, necesare ADN polimerazei pentru a începe sinteza. În catena nou formată vor fi înglobați nucleozid-trifosfații, în funcție de complementaritatea bazelor, dintre care numai unul a fost marcat în prealabil (radioactiv sau chimic) (Fig. 4.7).

APLICAȚII GENERALE

Marcarea radioactivă sau enzimatică a unor fragmente ADN, se realizează în scopul utilizării ulterioare a acestora ca sonde moleculare. Este astfel posibilă identificarea prezenței unor fragmente ADN într-un amestec, care poate să fie fixat fie pe o membrană – transfer Southern, fie într-un preparat microscopic – hibridizare in situ.

Fig. 4.7. Etapele reacției de marcare chimică sau enzimatică

a. Moleculele ADN dublu catenare care urmează să fie marcate sunt mai întâi denaturat;

b. Hexanucleotide cu secvențe de baze total întâmplătoare se vor lega la lanțurile monocatenare pe baza complementarității bazelor; Aceste nucleotide au rol de primeri pentru sinteza noii catene de ADN; Se adaugă ADN polimeraza Klenow, si cei patru nucleozid trifosfați, dintre care numai unul a fost marcat în prealabil (dATP, DTTP,

dGTP și dCTP*)

c. Enzima leagă nucleotidele la capătul 3’ al primerului (hexanucleotid), respectând complementaritatea bazelor.

Lanțul ADN originar servește drept matriță pentru sinteza fragmentelor ADN marcate. Reacția are loc sub acțiunea ADN polimerazei Klenow; întotdeauna noile nucleotide se adaugă la capătul 3’, alungirea lanțului realizându-se în direcția 5’→3’.

4.4. LEGAREA MOLECULELOR ADN, CU AJUTORUL ADN LIGAZELOR

In vivo, ADN ligazele sunt enzime implicate în legarea fragmentelor de ADN, având rol în refacerea punților fosfodiesterice între grupările OH de la capetele 3’ și grupările fosfat de la capete 5’, intervenind în unirea fragmentelor Okazaki și totodată acționează în procesele reparatorii în urma acțiunii radiațiilor UV.

In vitro, modul lor de acțiune este similar, fiind necesar ca fragmentele de ADN care urmează să fie legate să aibă capete compatibile – netede sau coezive complementare (generate prin secționarea cu aceiași enzimă de restricție) (Fig. 4.8).

Fig. 4.8. Mecanismul de acțiune al ADN ligazelor

Conform mecanismului de acțiune al ADN polimerazei, gruparea OH de la capătul 3’ al unui fragment se leagă covalent la atomul de fosfor de la capătul 5’ al celui de-al doilea fragment, catalizând formarea unei legături fosfodiesterice, cu ajutorul energiei furnizate de hidroliza ATP.

În cazul în care fragmentele care urmează să fie legate au fost secționate cu enzime de restricție care au generat capete netede este necesar ca secvențele monocatenare să fie complementare. Astfel, în prima etapă se formează legăturile de hidrogen între bazele azotate complementare, după care intervine acțiunea ADN ligazei, care leagă ambele catene, formând o moleculă bicatenară de ADN (Fig. 4.9).

Fig. 4.9. Reacția de refacere a legăturilor fosfodiesterice între capete coezive generate în urma secționării cu enzime de restricție

APLICAȚII GENERALE

Ligazele au o largă utilizare în tehnologia ADN recombinat, deoarece catalizează formarea moleculelor hibride, alcătuite din vectorii de clonare și fragmentele de ADN care urmează a fi multiplicate. Ligazele utilizate în acest scop sunt cele de natură bacteriană, izolate din tulpini de E. coli, infectate sau neinfectate cu bacteriofagul T4.

4.5. SINTEZA ADN COMPLEMENTAR

Investigațiile din domeniul studiului expresiei genelor se orientează spre analiza populațiilor de ARNm, care reprezintă 1 – 2% din totalul de ARN celular și sunt constituite din câteva mii de tipuri diferite, corespunzătoare proteinelor prezente în acel moment în celulă.

Datorită cantității foarte reduse, extracția și purificarea ARNm nu este posibilă și de aceea se lucrează cu ARN total. Apoi, moleculele ARNm pot fi separate pe baza pe structurii lor specifice și anume resturile adenilate (100-250) prezente la extremitatea 3’ – secvența poly A.

Capetele poly(A) nu sunt codificate de ADN, dar sunt adăugate post translațional, înainte ca ARNm să fie exportat din nucleu în citoplasmă. Un complex enzimatic, care include o endonuclează și o polimerază poly(A), recunoaște o secvență semnal (5’ – AAUAAA’) din apropierea capătului 3’ al produsului de transcriere, secționează pre-ARNm în aval de acest semnal și adaugă 100-250 de resturi adenilate la capăzul 3’. Capetele poly(A) facilitează exportul ARNm din nucleu, stabilizează ARNm împotriva degradării exonucleazice și par să fie implicate în inițierea translației.

Pentru separarea ARNm dintr-un amestec de ARN total se utilizează oligonucleotide dT (poly T), care sunt fixate pe un suport solid. Acest suport este amplasat fie ca umplutură în coloane sau se fixează pe particule magnetice.

În primul caz amestecul de ARN total se trece pe coloane, ARNm se leagă de oligonucleotidele dT, datorită complementarității bazelor iar celelalte tipuri de molecule ARN sunt eliminate. Recuperarea ARNm are loc printr-o simplă eluare cu solvenți specifici.

În cel de-al doilea caz soluția ARN total este pusă în contact cu particulele magnetice atașate la oligonucleotidele dT, pe care se fixează ARNm. Are loc apoi separarea într-un câmp magnetic, după care moleculele de acid nucleic se recuperează cu solvenți specifici.

În cazul aplicării unor tehnici mai avansate nu este necesară separarea ARNm, ci se analizează direct ARN total.

În continuare are loc sinteza moleculelor de ADN complementar (ADNc), care reprezintă numai informația pură formată din secvențele de exoni care alcătuiesc anumite gene. Fragmentele de ADNc se sintetizează artificial în laborator, pe o moleculă de ARNm, drept copie complementară, în prezența enzimei reverstranscriptaza.

Reverstranscriptaza denumită și ADN polimeraza dependentă de ADN este o polimeraza care transcrie o moleculă monocatenară de ARN într-o moleculă monocatenară de ADN. Această enzimă a fost descoperită de doi cercetători care au lucrat independent, Howard Temin și David Baltimore în 1970, care au primit premiul Nobel pentru Fiziologie și Medicină în anul 1975. În mod natural reverstranscriptaza se găsește în virusurile ARN (ribovirusuri), iar descoperirea ei a adus un argument împotriva așa numitei dogme a geneticii conform căreia informația genetică este transferată întotdeauna în direcția ADN →ARN→proteine.

Pentru ca revers-transcriptaza să fie activă este necesară prezența unei secvențe scurte dublu catenare la capătul 3’, care acționează ca un primer pentru polimerază.

Acest punct de pornire poate fi furnizat de către o nucleotidă dT, de dimensiuni scăzute, care se leagă la capătul poly(A) al moleculei de ARNm funcționează ca un primer.

Apoi, revers-transcriptaza adaugă deoxi-nucleotide la capătul 3’ al primerului, în direcția specifică 5’→3’, ținând cont de complementaritatea bazelor.

Produsul de reacție este o moleculă hibridă ADNc –ARNm, alcătuită deci din ARN matriță și o moleculă complementară de ADN monocatenar.

La capătul 5’ al moleculei ARNm, reverstranscriptaza poate cauza o răsucire a noii catene ADN prin utilizarea ultimelor baze ale acesteia ca matriță pentru sinteza unui alt lanț complementar, cu o lungime de 12-20 bp. Acest fragment formează o buclă, care furnizează, un primer (o grupare –OH la un capăt 3') de la care începe sinteza ADN polimerazei.

Apoi, molecula ARNm este degradată prin tratare cu substanțe alcaline sau prin fierbere (procese care conduc la degradarea exclusivă a ARN), iar molecula ADNc monocatenară care va reprezenta matrița de copiat pentru ADN polimerază.

Bucla formată la capătul 3' al moleculei ADNc monocatenară furnizează un primer natural pentru următoarea etapă în care este utilizată ADN polimeraza I, fragment Klenow, pentru a transforma molecula monocatenară într-una bicatenară. În această reacție polimeraza utilizează molecula monocatenară de ADNc pentru a sintetiza o secvență identică cu ARNm original.

Produsul obținut este un dublu helix, cu o buclă la unul dintre capete. Pentru a se genera o moleculă bicatenară de ADN bucla este degradată de către nucleaza S1, care secționează în special fragmente de ADN monocatenar (Fig. 4.10).

Fig. 4.10. Sinteza moleculei bicatenare de ADNc

Fig. 4.10. Sinteza moleculei ADNc, cu ajutorul unui primer oligo dT și a reverstranscriptazei

Metodele de sinteză a ADN complementar se bazează pe capacitatea enzimei revers transcriptaza de a transcrie ARN mesager într-o moleculă de ADN complementar monocatenară, într-o reacție denumită de sinteză a primei catene. Totuși, datorită faptului că revers transcriptaza nu poate transcrie întreaga moleculă de ARNm, capătul 5’ tinde să rămână nereprezentat în populația de ADNc.

Această sinteză incompletă apare mai ales atunci când moleculele ARNm au o lungime mare sau sunt împachetate datorită structurilor secundare care se formează. Prin urmare se formează molecule ADNc incomplete deoarece acțiunea revers-transcriptazei încetează înainte de realizarea completă a transcripției. Pentru a corecta aceste dezavantaje pot fi aplicate tehnici mai avansate de sinteză, care sunt prezentate în capitolul 5.1.3.

APLICAȚII GENERALE

Moleculele de ADNc sunt sintetizate ori de câte ori se dorește efectuarea unor investigații la nivel de ARN. Astfel, este posibilă obținerea unor biblioteci ADNc, care să fie utilizate în procesele de cartare genetică, fizică sau în scopul identificării genelor. Totodată ADNc permite evaluarea cantitativă sau calitativă a expresiei genelor prin tehnici de amplificare PCR sau microarray.

4.6. IDENTIFICAREA PROTEINELOR SPECIFICE CU AJUTORUL ANTICORPILOR

Analizele moleculare se efectuează în general la nivelul acizilor nucleici, ceea ce conferă informații cu privire la structura genomului sau la transcrierea genelor. De miâulte ori prezintă interes și obținerea de informații cu privire la procesele translaționale, respectiv post-translaționale.

În cazul din urmă, dacă se dorește identificarea anumitor proteine este necesară utilizarea anticorpilor specifici, care formează cupluri cu proteina de interes.

Anticorpii sunt proteine, având ca unitate de bază un monomer constituit din patru structuri polipeptidice, organizate în regiuni simetrice. Structura tridimensională este conferită de legăturile disulfidice. Două dintre structuri sunt lanțuri grele H („heavy”), cu greutate moleculară mare și două sunt lanțuri ușoare L („light”), asocierea între ele realizându-se în ordinea L-H-H-L. La rândul lor aceste lanțuri se subdivid în regiunea V (variabilă) de la capătul NH2 terminal și C (constantă) din zona C-terminală, repartizându-se astfel: pe lanțul H-VH, CH 1, CH2 și CH3, iar pe lanțul L-VL și CL (Fig. 4.11.) În structura anticorpilor se diferențiază două regiuni, Fab și Fc, care prezintă diferențieri din punct de vedere funcțional.

Fig. 4.11 Structura anticorpilor utilizați pentru identificarea proteinelor

În structura anticorpilor se diferențiază două regiuni, Fab și Fc, care prezintă diferențieri din punct de vedere funcțional.

Fragmentul Fab („fragment antigen binding”), situat în regiunea aminoterminală a lanțurilor grele și ușoare are rol în legarea proteinei. Fragmentul Fc, situat la extremitatea distală, la capătul carboxi, interacționează cu receptorii specifici, fiind implicat în fixarea pe celule.

În funcție de modul lor de producere, anticorpii pot fi împărțiți în două categorii: policlonali sau monoclonali.

Anticorpii policlonali sunt produși în animale de talie medie, în urma injectării cu proteină de interes. În urma imunizării, în organismul animal se sintetizează anticorpi specifici care sunt apoi purificați din sânge.

Anticorpii policlonali. au o sensibilitate ridicată dar o specificitate de recunoaștere mai redusă, comparativ cu anticorpii monoclonali.

Anticorpii monoclonali sunt sintetizați în culturi de celule hibride, obținute prin fuzionarea in vitro a unor celule producătoare de anticorpi (splenocite sau limfocite obținute de la animale imunizate cu o anumită antigenă) cu celule neoplazice obținute din mieloame sau limfoame. Sunt astfel exploatate caracteristicile ambelor tipuri de celule – capacitatea de diviziune nelimitată, preluată de la celulele tumorale și proprietatea de a produce anticorpi, preluată de la splenocite (Fig. 4.12).

Fig. 4.12. Procedura de obținere a anticorpilor monoclonali în celule hibride, obținute prin fuzionarea unor celule producătoare de anticorpi cu celule tumorale

Anticorpii monoclonali au unele avantaje deoarece ei exprimă o afinitate și specificitate uniformă față de un singur determinant antigenic sau epitop și pot fi produși în cantități mari, in vitro, în culturile de celule.

După sinteză, ambele tipuri de anticorpi necesită etape suplimentare de purificare, după care pot să fie utilizați pentru identificarea unor proteine specifice.

APLICAȚII GENERALE

Anticorpii permit identificarea oricărei proteine prin testări imunologice cum sunt: Western Blotting și ELISA (“Enzyme Linked Immunosorbent Assay”). În funcție de tipul proteinei țintă este posibilă detectarea unei afecțiuni induse enzimatic, prezența unor patogeni sau a unor organisme modificate genetic.

4.7. ANALIZA MOLECULELOR DE ACIZI NUCLEICI/PROTEINE PRIN ELECTROFOREZĂ

Electroforeza este o metodă analitică de separare a particulelor încărcate electric sub acțiunea unui câmp electric uniform aplicat din exterior.

În funcție de mediul în care se efectuează separarea, metodele electroforetice se împart în două clase: electroforeza în mediu liber – proces care se bazează pe electromigrarea liberă a speciilor ionice într-o soluție tampon corespunzătoare și electroforeza în mediu stabilizant – proces care presupune utilizarea unor medii suport care pot fi inerte: hârtie de filtru, acetat de celuloză, silicagel, alumină sau dimpotrivă pot participa activ în separare, interacționând cu particulele care migrează: geluri de amidon, agaroză, poliacrilamidă.

4.7.1. ELECTROFOREZA ÎN GEL DE AGAROZĂ

Separarea acizilor nucleici se realizează de obicei prin electroforeză în gel de agaroză care este cea mai avantajoasă metodă de analiză atât pentru ADN cât și pentru ARN.

Agaroza este un polizaharid inert, care conduce la formarea unui gel cu pori de anumite dimensiuni, în funcție de concentrație. Sub acțiunea câmpului electric acizii nucleici care sunt macromolecule încărcate parțial negativ (datorită reziduurilor fosfat) migrează spre anod (+).

Rata de migrare a moleculelor de acizi nucleici liniari, într-un câmp electric este invers proporțională cu lungimea moleculelor, astfel că pot fi separate fragmente de dimensiuni diferite, iar lungimile lor pot fi apreciate prin compararea cu un marker ADN/ARN, pentru care se cunosc dimensiunile fragmentelor.

Benzile de acizi nucleici prezente în gelul de agaroză se vizualizează direct, prin colorare cu o substanță fluorescentă, bromura de etidiu și iluminare UV. Această metodă de vizualizare este foarte sensibilă, permițând detectarea unor benzi de ADN care conțin până la 2 ng de ADN.

Bromura de etidiu, abreviată în general ca BrEt este un colorant fluorescent pentru acizi nucleici, cu o moleculă plană (Fig.4.13). Aceasta se intercalează între bazele azotate ale unei molecule de acid nucleic, formând complecși care absorb radiația în domeniul UV și o retransmit în vizibil. Astfel este posibilă vizualizarea fragmentelor de acizi nucleici, în urma expunerii la o lumină UV. Bromura de etidiu are o acțiune mutagenă, cancerigenă sau teratogenă în funcție de organism și de condițiile externe.

Fig. 4.13 Structura bromurii de ertidiu (a) și modul de intercalare în molecula ADN (b)

Rata de migrare electroforetică a ADN depinde de mai mulți parametri importanți și anume:

Dimensiunea fragmentelor de ADN

Fragmentele de ADN migrează cu viteze care sunt invers proporționale cu logaritmul greutății lor.

Concentrația gelului

Cantitatea de agaroză prezentă în gel determină dimensiunile porilor care se formează, influențând rata de migrare a fragmentelor de acizi nucleici. De aceea concentrația gelului trebuie să fie aleasă cu grijă, pentru a permite separarea optimă a fragmentelor analizate.

Fragmentele mari de acizi nucleici (5-60 kb) pot fi separate în geluri cu concentrație redusă 0,3 – 0,5 %, iar fragmentele mici (0,1-3,0 kb) pot fi analizate în geluri cu concentrație mare 2%. O concentrație medie, de 0,8% poate să conducă la o separare bună a fragmentelor din domeniul 0,5-10 kb. Concentrația gelului de agaroză se alege deci în funcție de intervalul în care se încadrează fragmentele analizate.

Conformația ADN

Formele circulare sau liniare de acizi nucleici cu aceiași greutate moleculară migrează diferit, nefiind posibilă compararea lor.

Tensiunea la care are loc migrarea

La tensiuni scăzute viteza de migrare a fragmentelor liniare este proporțională cu tensiunea. Dacă se utilizează tensiuni prea ridicate rata de separare scade. Pentru a obține o rezoluție maximă, migrarea trebuie să se producă la o tensiune de 3-10V/h/cm.

Temperatura

Temperatura nu afectează mobilitatea electroforetică, dacă se menține în intervalul 4-30°C. În general electroforeza în geluri de agaroză are loc la temperatura camerei. Dacă se utilizează geluri cu concentrații mai mici de 0,5% este necesară menținerea gelului la temperaturi scăzute, deoarece la temperaturi mai ridicate acesta se poate lichefia.

4.7.2. ELECTROFOREZA ÎN GEL DE POLIACRILAMIDĂ

În cazul electroforezei în gel de poliacrilamidă pot fi analizate fragmente de acizi nucleici cu dimensiuni mici (<1kb), sau fracții proteice în formă denaturată.

Față de alte medii suport, gelul de poliacrilamidă are următoarele avantaje practice: putere mare de rezoluție, reproductibilitate; posibilitatea controlului dimensiunilor porilor pe un domeniu larg; inerția, stabilitatea chimică la variații mari de pH, temperatură și forță ionică, transparență perfectă, rezistență și flexibilitate.

Obținerea gelurilor de poliacrilamidă se realizează printr-o reacție de polimerizare ireversibilă a doi monomeri: acrilamidă și bisacrilamidă, având ca inițiator persulfatul de amoniu (NH4) S2O8 și catalizator tetra metilen-diamina (TEMED). Bisacrilamida funcționează ca agent de reticulare.

Mărimea efectivă a porilor în gelurile de poliacrilamidă depinde de concentrația totală a monomerilor (acrilamidă si bisacrilamidă) (T%) și de gradul de reticulare (C%), care reprezintă raportul dintre cantitatea de agent de reticulare (bisacrilamidă) și cantitatea totală de monomeri (acrilamidă si bisacrilamidă).

Concentrația gelurilor de poliacrilamidă, respectiv gradul de reticulare se stabilesc în funcție de dimensiunile particulelor care urmează să fie separate.

Fracțiunea reprezentată de proteinele de analizat este extrasă și analizată apoi prin electroforeză în gel de poliacrilamidă. Benzile, care reprezintă fracțiile proteice sunt fixate și developate din gel cu soluții de coloranți speciali.

După extragere în soluții de extracție specifice, proteinele analizate, sunt denaturate în prezența dodecilsulfatului de sodiu (SDS). Acesta este un detergent anionic care distruge aproape toate legăturile necovalente. Se mai poate adaugă mercaptoetanol pentru distrugerea punților de sulf.

SDS-ul mai are proprietatea de a se lega în raport constant (1,4g SDS/1g proteină) la toate proteinele. Se formează astfel complexe SDS-proteină denaturată, încărcate negativ. Sarcinile intrinseci ale polipeptidelor sunt nesemnificative comparativ cu sarcinile electrice negative rezultate după legarea SDS-ului, fiind astfel posibilă separarea strict în funcție de dimensiunile polipeptidelor.

Desfășurarea electroforezei se urmărește vizual, datorită introducerii în probele analizate a unei soluții colorant de migrare.

După terminarea migrării, fracțiile proteice separate în gel se vizualizează în prezența colorantului Comassie Brillant Blue sau a azotatului de argint. Colorarea cu azotat de argint este mai laborioasă, dar permite vizualizarea unor cantități foarte mici de proteină – 0,02 μg, comparativ cu colorantul menționat – 0,1μg.

APLICAȚII GENERALE

Analizele prin electroforeză a acizilor nucleici și a proteinelor au o gamă foarte largă de utilizare, deoarece permit vizualizarea fragmentelor ADN formate în urma secționării cu enzime de restricție, a amplificării PCR, a produșilor pentru secvențializare, a evaluării moleculelor de ADN recombinat. Totodată această tehnică stă la baza dezvoltării tehnicilor Southern, Northern și Western, care sunt prezentate în capitolul 5.2