Studiul Profilului Lipidic Seric și Eritrocitar al Unor Pacienți Suferinzi de Diabet Zaharat

Medicina

Studiul Profilului Lipidic Seric și Eritrocitar al Unor Pacienți Suferinzi de Diabet Zaharat

Byadmin ianuarie 1, 2024

CUPRINS

Partea teoretica

Introducere

Capitolul 1. Diabetul

Pancreasul si insulina

Clasificarea diabetului

Diabetul zaharat de tip 1

Diabet zaharat de tip 2

Diabet autoimun latent la adulti (LADA)

Stil de viata

Capitolul 2. Eritrocitul uman

Caracteristici generale

Structura membranei eritrocitare

Capitolul 3. Profil lipidic seric

3.1. Colesterolul

3.1.1. Sinteza colesterolului

3.2. HDL-colesterol

3.3. LDL-colesterol

3.4. Trigliceride

Capitolul 4. Acidul sialic

4.1. Caracteristici generale

4.2. Biosinteza acidului sialic

4.3. Transferul acidului sialic

Partea practica

Capitolul 5. Determinarea markerilor biochimici in sistem automat

Capitolul 6. Studiul profilului seric si eritrocitar

6.1. Materiale si metode

6.1.1. Subiectii investigati

6.1.2. Metode de lucru

6.2. Rezultate si discutii

Concluzii

Bibliografie

Introducere

Impactul global al diabetului zaharat a atins proportii epidemice, afectand nu numai indivizii, cat si societatea în ansamblul ei. Pana în 2025, IDF (International Diabetes Federation) prognozeaza existenta a 380 de milioane de diabetici. In lipsa tratamentului sau a controlului, persoanele cu diabet zaharat pot suferi complicatii, precum afectiuni ale inimii sau ale rinichiului, inrautatind starea de sanatate si ridicand noi obstacole in calea tratamentului (www.MedLife.ro).

Se consideră că diabetul este una dintre cele mai frecvente boli cronice netransmisibile ale secolului XXI din categoria bolilor endocrine, având ca principale cauze de apariție moștenirea genetică, stresul, sedentarismul, alimentația nesănătoasă, fumatul sau consumul excesiv de alcool. Diabetul de tip 2 este mai frecvent la persoanele mai în vârstă, mai ales la cele supraponderale. Prevalența diabetului este foarte probabil în creștere din mai multe motive. Un motiv este că un segment din ce în ce mai mare al populației îmbătrânește datorită prelungirii speranței de viață. În același timp, alimentația noastră modernă este bogată în alimente cu grad înalt de procesare și conținut ridicat de aditivi chimici. Elementele nutritive și fibrele vegetale sunt eliminate, iar procesul de încălzire schimbă structura moleculară a alimentelor. Alimentația nesănătoasă de tip fast-food, lipsa activităților fizice, stresul, poluarea excesivă sunt doar câteva din cauzele care fac ca în societatea actuală diabetul să se răspandească și să fie descoperit tot mai frecvent și la persoanele tinere. Astfel, se constată necesitatea de educare a populației care suferă deja de diabet zaharat, în vederea conștientizării faptului că un tratament deficitar al acestei boli cronice poate duce la apariția complicațiilor diabetului, unele dintre ele fiind chiar letale (www.MedLife.ro).

Diabetul in cifre

In categoria „Medicina de familie” (MedLife) s-a publicat faptul ca la fiecare 10 secunde 2 oameni sunt diagnosticati cu diabet zaharat, iar in fiecare an 7 milioane de oameni dezvolta diabet zaharat. In fiecare an au loc 3.8 milioane de decese provocate de diabet sau complicatii determinate de diabet (boli cardiovasculare sau hipertensiune arteriala), iar la fiecare 10 secunde moare o persoana din cauze legate de diabet.

In 2025, 80% din totalul cazurilor de diabet zaharat vor fi intalnite in tarile cu venituri mici si medii. Aproape jumatate din persoanele cu diabet zaharat au varste cuprinse intre 40 si 59 de ani; mai mult de 70% dintre ei traiesc in tarile in curs de dezvoltare. Diabetul de tip 1 este in crestere alarmanta in intreaga lume, cu un procent de 3% pe an. Cercetarile arata existenta diabetului de tip 2 si la populatiile de copii, despre care se credea ca nu sunt in pericol sa fie afectate. 70.000 de copii in varsta de 14 ani sau chiar mai putin sunt diagnosticati cu diabet zaharat tip 1 in fiecare an. Tot mai multi copii sunt afectati de diabetul zaharat de tip 2, atat in tarile dezvoltate, cat si in cele in curs de dezvoltare (www.MedLife.ro).

Obiectivele acestei lucrari:

Tratarea teoretica a problemelor cauzate de diabet si efectul lor asupra calitatii sanatatii indivizilor

Studierea modificarilor morfologice ale membranei eritrocitare ce survin in urma instalarii diabetului zaharat

Corelarea rezultatelor experimentale cu date biochimice din laboratorul clinic

Scopul lucrarii: Evidentierea modificarilor structurale survenite la nivelul membranelor eritrocitare la pacienti suferinzi de diabet zaharat in vederea folosirii acestor date ca indicatori pentru diagnosticul precoce al bolii

Capitolul 1. Diabetul

Diabetul zaharat este un sindrom asociat cu absenta sau cu nivele scazute de insulina (hormon esential pentru reglarea metabolismului glucidelor si transportul glucozei in interiorul celulelor, ce are ca rezultat instalarea unei stari de hiperglicemie). Deoarece evolutia acestui sindrom este lenta si conduce in final la complicatii (modificari la nivelul ochilor, rinichilor, nervilor, inimii si vaselor de sange) care pun in pericol viata pacientului, sunt necesare studii aprofundate privind strategii diferite pentru preventie, screening de diagnostic si tratament.

Ocupă un loc în topul celor mai întâlnite 10 boli cunoscute în întreaga lume ca și cauzatoare de moarte. Diabetul este o boală progresiv-evolutivă, iar fără un control glicemic bun, complicațiile nu întârzie să apară.

Diabetul zaharat este un dezechilibru metabolic caracterizat printr-o hiperglicemie cronică însoțită de o perturbare a nivelului de carbohidrați, grăsimi și proteine ce apare ca urmare a defectelor în secreția de insulină, a acțiunii insulinei sau a ambelor (World Health Organization Department of Noncommunicable Disease Management Geneva, 2003). Este o afecțiune cronică ce apare atunci când pancreasul nu produce suficientă insulină sau nu o poate utiliza așa cum ar trebui pe cea pe care o produce ( World Health Organization, 2004).

Denumirea de “diabet” vine de la cuvântul din limba greacă veche care înseamnă “sifon”. Cu acesta a fost comparată cantitatea mare de urină pe care o elimină, ca printr-un “sifon”, numeroși diabetici. A doua parte a numelui, aceea de “zaharat” provine de la observația că acest lichid este lipicios ca și când ar conține miere (Șerban, 1993).

Diabetul a fost descoperit încă de prin anul 1500 înainte de Hristos de către vechii egipteni, care au considerat aceasta boală o afecțiune rară, în care o persoana urinează și pierde în greutate excesiv. Termenul de „diabet zaharat” reflectă faptul că urina celor afectați are un gust dulce și a fost folosit pentru prima dată de către medicul grec Aretaeus. Cu toate acestea, până în 1776 nu a fost măsurată efectiv concentrația de glucoză din urină; Dobson este cel care a măsurat concentrația de glucoză la astfel de pacienți și a constatat că este crescută (Polonsky, 2012).

Cele mai multe dintre alimentele pe care le mâncăm sunt transformate în glucoză, pentru ca ale noastre corpuri să o utilizeze pentru energie. Pancreasul, un organ care se află în apropierea stomacului, produce un hormon numit insulina care ajută glucoza să intre în celulele corpului nostru. Când aveți diabet zaharat, organismul fie nu produce suficientă insulină sau nu poate folosi insulina proprie, așa cum ar trebui. Acest lucru face ca zaharurile să se acumuleze în sânge. Acesta este motivul pentru care mulți oameni se referă la diabet ca "zaharat". ( World Health Organization, 2004).

1.1. Pancreasul si insulina

Pancreasul (Fig.1) este un organ de aproximativ 15 cm lungime si 70-105 grame. Este sutuat retroperitoneal in partea superioara a cavitatii abdominale. El primeste un aport vascular semnificativ din aorta. Indeplineste doua functii diferite. Este o glanda endocrina care sintetizeaza hormonii glucagon, insulina si gastrina. In acelasi timp serveste drept glanda exocrina furnizand enzime digestive ce faciliteaza digestia duodenala a hranei. Pancreasul endocrin consta din celule aranjate in insule ( insulele lui Langerhans). Exista 5 tipuri principale de celule insulare corespunzatoare diferitelor componente secretorii. Celulele β sunt cele mai comune si sunt responsabile pentru producerea de insulina. Celulele α produc glucagon, celulele delta produc gastrina si somatostatina, celulele PP produc polipeptidul pancreatic si celulele enterocromafine produc serotonina (Curs Biochimie clinica).

Figura 1. Structura pancreasului

Celulele α (Figura 20) reprezinta 20-30 % din totalul celulelor din insule. Celule similare au fost identificate in mucoasa duodenala. Aceste celule produc glucagonul ce este constituit din 29 de aminoacizi. Hipoglicemia indusa de insulina este urmata de cresterea concentratiei de glucagon in pancreas si sangele periferic. Pancreozimina si polipeptidul gastro-inhibitor vor creste concentratia de glucagon. Hiperglicemia va determina supresia secretiei de glucagon. Glucagonul stimuleaza glicogenoliza hepatica care converteste glicogenul in glucoza. El stimuleaza gluconeogeneza prin promovarea asimilarii hepatice a aminoacizilor. Aceste mecanisme cresc concentratia plasmatica de glucoza. Glucagonul este capabil de stimularea eliberarii de insulina din celulele pancreatice beta independent de cresterea glucozei in sange. Celulele beta reprezinta 60-70 % din celulele pancreatice insulare. Ele sunt responsabile de sintetizarea insulinei si realizeaza acest lucru prin producerea unei molecule de pre-proinsulina care este depozitata in granulele beta. Aceasta molecula mare este degradata enzimatic oentru a elibera insulina activa, peptidul C si o varietate de produsi intermediari (Curs Biochimie clinica).

Figura 2. Celulele pancreatice (www.imgarcade.net)

Mentinerea unei concentratii normale a glucozei necesita o coordonare foarte bine controlata intre secretia insulinei si functia acesteia. In diabetul zaharat de tip 2, pierderea controlului glicemic presupune deficiente in functionarea ambelor procese (Rhodes si White, 2002).

Concentratia crescuta de glucoza din sange are diverse efecte in organismul uman, printre care putem enumera riscul crescut de boli coronariene si diabetul. Una din complicatiile pe termen lung ale diabetului este aditia non-enzimatica a glucozei la proteinele din sange care duce la formarea unor produsi de glicare avansata. Acest lucru a fost recunoscut ca fiind un proces patologic important in dezvoltarea complicatiilor diabetice (Goldin si colab., 2006).

1.2. Clasificarea diabetului

Sunt cunoscute mai multe tipuri de diabet cu o etiopatologie moleculara diferita: diabetul de tip 1 (distrugerea celulelor β ale insulelor lui Langerhans care conduce in general la o insulinopemie totala), diabetul de tip 2 (insulinorezistenta asociata sau nu unei insulinopemii relative), diabetul gestational etc. Conform noii clasificari a diabetului se recomanda acum sa se foloseasca termenii de diabet de tip 1 si tip 2.

1.2.1. Diabetul zaharat de tip 1 (insulino-dependent)

A fost denumit initial diabet juvenil deoarece apare in general in copilarie sau in adolescenta, desi nu este limitat numai la acesti pacienti. Insulina este fie absenta, fie se gaseste in concentratii scazute datorita unor defecte sau absentei celulelor β- pancreatice, producatoare de insulina. Netratat, diabetul de tip 1 este caracterizat prin hiperglicemie, hiperlipoproteinemie (chilomicroni si VLDL) si episoade severe de cetoacidoza (Curs Biochimie clinica).

Figura 3. Diabet zaharat de tip 1 (www.Sfatulmedicului.ro)

La pacientii cu acest tip de diabet se constata un dezechilibru nu numai in metabolismul glucidelor ci si in cel al proteinelor si lipidelor. Starea de hiperglicemie rezulta ca urmare a incapacitatii tesuturilor de a prelua glucoza din plasma, a gluconeogenezei accelerate care are ca precursori proteine musculare si aminoacizi. Cetoacidoza este rezultatul unei lipolize crescute in tesutul adipos si a β- oxidarii accelerate a acizilor grasi de la nivelul ficatului. Hiperchilomicronemia apare datorita activitatii scazute a lipoprotein lipazei din capilarele tesuratii scazute datorita unor defecte sau absentei celulelor β- pancreatice, producatoare de insulina. Netratat, diabetul de tip 1 este caracterizat prin hiperglicemie, hiperlipoproteinemie (chilomicroni si VLDL) si episoade severe de cetoacidoza (Curs Biochimie clinica).

Figura 3. Diabet zaharat de tip 1 (www.Sfatulmedicului.ro)

La pacientii cu acest tip de diabet se constata un dezechilibru nu numai in metabolismul glucidelor ci si in cel al proteinelor si lipidelor. Starea de hiperglicemie rezulta ca urmare a incapacitatii tesuturilor de a prelua glucoza din plasma, a gluconeogenezei accelerate care are ca precursori proteine musculare si aminoacizi. Cetoacidoza este rezultatul unei lipolize crescute in tesutul adipos si a β- oxidarii accelerate a acizilor grasi de la nivelul ficatului. Hiperchilomicronemia apare datorita activitatii scazute a lipoprotein lipazei din capilarele tesutului adipos, enzima insulin-dependenta pentru sinteza sa. Ca urmare a hiperglicemiei si diurezei osmotice, apar starile de poliurie, polidipsie si polifagie, concomitent cu pierderile in greutate. La copiii cu diabet de tip 1, caracteristicile tipice sunt: pierderea in greutate, hiperglicemia ridicata, cetonuria si chiar cetoacidoza sunt adesea prezente. In copilarie, simptomele sunt frecvent acute si nevoia de insulina este evidenta. La adulti, diabetul de tip 1 este caracterizat in principal prin indicele de masa corporala (IMC) mic si semnele generale ale functiei celulelor β la diagnostic- mai bine pastrata decat la copii (Curs Biochimie clinica).

Desi baza moleculara a instalarii diabetului de tip 1 nu este elucidata in detaliu, este unanim admis faptul ca evenimentul principal este distrugerea celulelor β-pancreatice printr-un proces autoimun (Polonsky K.S., 2012).

1.2.2. Diabetul zaharat de tip 2 (insulino-independent)

A fost denumit initial diabet de maturitate deoarece apare in general la persoanele supraponderale, cu stil de viata sedentar, in varsta de peste 45 de ani, reprezentand 80-90 % din cazurile de diabet diagnosticate. Se recomanda abandonarea termenului de diabet insulino-independent sau de maturitate deoarece diabetul de tip 2 apare si la oamenii mai tineri, iar unii bolnavi necesita insulina in tratamentul bolii.

In acest tip de diabet insulina este sintetizata in concentratii normale sau chiar crescute, defectul aparand de regula la nivelul receptorului insulinei de pe suprafata celulelor tinta (insulin-sensibile) ca hepatocitele, adipocitele si celulele musculare. Pacientii cu diabet de tip 2 au hiperglicemie si adesea hipertrigliceridemie, neobservandu-se o stare de cetoacidoza. Nivelurile crescute de VLDL sunt probabil rezultatul sintezei crescute a trigliceridelor hepatice, stimulata de starile de hiperglicemie si hiperinsulinemie. Obezitatea adesea precede dezvolatrea acestui tip de diabet, fiind un factor major care contribuie la debutul acestui sindrom, pacientii obezi fiind hiperinsulinemici. In diabetul de tip 2 s-a observat o relatie inversa intre nivelul insulinei si numarul de receptori ai acestuo hormon- unui nivel bazal mai mare de insulina corespunzandu-i un numar mai mic de receptori pe suprafata membranei plasmatice. In plus, in celulele insulin-sensibile s-au decelat si defecte ante-receptor in cascada de semnalizare a insulinei (Curs Biochimie clinica).

Figura 4. Tipuri de diabet (RoMedic)

Un astfel de defect poate aparea la nivelul capacitatii insulinei de a directiona transportorii de glucoza spre membrana plasmatica (Fig.4). Ca o consecinta, in ciuda nivelului mare al hormonului, glicemia este putin controlata datorita faptului ca celulele devin insensibile la insulina- fenomen numit rezistenta la insulina. Nivelul insulinei la un diabetic tip 2 este mai mic decat concentratia hormonului la un obez nediabetic, ceea ce sugereaza ca celulele β-pancreatice prezinta un deficit relativ in productia de insulina. In diabetul de tip 2, simptomele se instaleaza lent, iar testarea periodica a glicemiei poate depista din timp afectiunea. Cu cat diagnosticarea este mai precoce, cu atat tratamentul este mai eficient, prevenind aparitia complicatiilor. In ambele tipuri de diabet, starea cronica de hiperglicemie poate conduce la complicatii extrem de grave, ca de exemplu leziuni la nivelul retinei ochiului, rinichilor, nervilor sau vaselor de sange. Lezarea retinei la pacientii diabetici (retinopatia diabetica) conduce la orbire; lezarea rinichilor (nefropatia diabetica) conduce la insuficienta renala; afectarea nervilor (neuropatie diabetica) este cauza ulcerelor membrelor inferioare (piciorul diabetic). Diabetul accelereaza ateroscleroza sau formarea placilor de lipide in interiorul arterelor care pot conduce la tromboza, atac de cord, maladii vasculare periferice (World Health Organization Department of Noncommunicable Disease Management Geneva, 2003).

Alte tipuri specifice de diabet includ diabetul provocat de defectele genetice sau de afecțiuni ale pancreasului exocrin sau diabetul gestațional (care apare pe perioada sarcinii unora dintre femei și care dispare de obicei de la sine după naștere) (World Health Organization Department of Noncommunicable Disease Management Geneva, 2003).

1.2.3. Diabetul autoimun latent la adulti LADA

Este un tip de diabet ce apare la pacientii adulti, care nu necesita tratament imediat cu insulina, de obicei nu sunt supraponderali si au rezistenta la insulina nula sau mica. Aceasta forma de diabet speciala este clinic similara cu diabetul de tip 2, dar cu pozitivitate pentru autoanticorpii pancreatici. Pentru un diagnostic corect si pentru a evita tratamente ineficiente si complicatiile frecvente cauzate de hiperglicemie, se recomanda diagnosticarea acestor pacienti in urma testarii autoanticorpilor insulari pancreatici. Analiza minimala consta in dozarea anticorpilor GADA (glutamic acid decarboxylase antibodies), care au capacitatea de a produce cele mai profunde modificari la nivelul celulelor β pancreatice. Spre deosebire de pacientii cu diabet de tip 1, majoritatea pacientilor LADA prezinta anticorpi ICA (islet cell antibodies), de aceea pentru siguranta diagnosticului se recomanda dozarea celor doi autoanticorpi.

Caracteristicile clinice ale pacientilor LADA sunt: pacientii au varste diferite, fiind de regula adulti; acestia prezinta cel putin un autoanticorp, dar care este nedefinit; pacientii au fenotip similar cu diabetul de tip 2. Cu toate acestea, pacientii LADA au si caracteristici similare cu diabetul de tip 1. Comparativ cu pacientii cu diabet de tip 1, pacientii LADA sunt mai in varsta, au IMC mai ridicat, nivelurile peptidei C mai crescute. Pacientii LADA prezinta o reactie autoimuna, ca in cazul diabetului tip 1 clasic, in sangele lor fiind detectata prezenta de regula a unui singur autoanticorp, fara a exista un anticorp specific acestui sindrom (Curs Biochimie clinica).

1.2.4. Stil de viata

Pacientii cu diabet zaharat sunt majoriatatea supraponderali sau obezi si au, in general, un stil de viata (obiceiuri alimentare, sedentarism) care a contribuit alaturi de alti factori la aparitia afectiunii. De aceea, se impune ca imediat dupa diagnosticare sa se identifice modalitatile de interventie asupra stilului de viata. Prin ameliorarea stilului de viata se urmareste atingerea si mentinerea greutatii corporale ideale, scaderea valorilor glicemice, normalizarea valorilor lipidelor serice si a acidului uric (sau aducerea cat mai aproape de normal), mentinerea unor valori optime ale tensiunii arteriale. Fumatul reprezinta un factor de risc cardiovascular independent, de aceea se va insista pentru renuntare la fumat. Se recomanda modificarea obiceiurilor alimentare anterioare si se asigura accesul la un dietetician, se individualizeaza dieta in functie de varsta, sex, inaltime, greutate etc., se restrictioneaza consumul de alcool si alimente bogate in zaharuri, grasimi si sare. Pacientii sunt instruiti pentru prevenirea si corectarea hipoglicemiilor. In efortul fizic sustinut, pacientul tratat cu insulina sau medicatie orala este instruit sa-si ajusteze medicatia sau dozele de insulina ori sa suplimenteze hidratii de carbon (www.Urbanstyle.ro).

Capitolul 2. Eritrocitul uman

2.1. Caracteristici generale

In mod obisnuit, 7-8 % din greutatea unui om este reprezentat de sange. Acest fluid esential indeplineste functii critice ce de exemplu transportul oxigenului si nutrientilor catre celulele organismului si elimina dioxidul de carbon, amoniul si alti produsi de catabolism. Joaca un rol vital in sistemul imunitar si in mentinerea constanta a temperaturii corpului. Sangele este un tesut specializat compus din mai mult de 4000 de componente diferite. Cele mai importante sunt eritrocitele, leucocitele, trombocitele si plasma.

Eritrocitele (Fig.5) sunt celule de forma unui disc biconcav, al căror diametru atinge circa 8 µm, suprafața membranară este de aproximativ 135 µm2, iar volumul este de 94 µm3 (Shin S., et al., 2007). Au o durată de viață cuprinsă între 3-4 luni (Smith J.E., 1987).

Figura 5. Eritrocitul uman (vedere superioara si anterioara)

Procesul de formare al eritrocitelor poartă numele de eritropoieză (Fig.6), sediul principal de formare fiind reprezentat de măduva roșie hematogenă. Sunt distruse în urma unui proces de hemoliză fiziologică, ce constă în degradarea hemoglobinei de către celulele fagocitare din sistemul reticulo-endotelial, sediile principale ale hemolizei fiind reprezentate de splină și ficat (Smith, 1987).

Figura 6. Eritropoieza (Rasfoiesc.com)

Eritrocitul este o celulă unică, care la maturitate devine anucleată (nivel scăzut al ADN, sinteza proteică fiind redusă, iar capacitatea de proliferare fiind inexistentă (Smith J.E:, 1987)), cu o citoplasmă constituită din 95% hemoglobină, proteină responsabilă pentru transferul de oxigen de la plămâni la restul corpului. Pentru ca eritrocitele să transporte hemoglobina și ulterior oxigenul pentru toate celulele, ea trebuie să călătorească prin sistemul circulator, inclusiv la nivel microcirculator, unde întâlnește spații capilare mici și tensiuni de forfecare mari (eritrocitele umane au un diametru mai mare decât cea mai mică rețea capilară, și deci intacte, eritrocitele nu pot trece prin rețeaua microvasculară fără o deformare fiziologică (Saito et al., 2012). Pentru ca celula să fie capabilă să supraviețuiască, este necesar ca membrana solidă să fie foarte deformabilă (Buys et al., 2013). Numărul hematiilor este direct proporțional cu intensitatea proceselor metabolice ( mai mare la copii).

Eritrocitele prezintă: (1) variații fiziologice – creșteri la : altitudine, în efort fizic; (2) scăderi : la presiuni parțiale ale O2 crescute; (3) variații patologice – policitemia vera, anemii.

2.2. Structura membranei eritrocitare

Forma de repaus a eritrocitelor este determinată de elasticitatea membranei, de suprafața ei și de volumul hematiei. Forma normală, biconcavă a eritrocitelor poate fi modificată sub acțiunea forțelor externe, ele revenind la forma inițială atunci când forțele sunt eliminate (Fischer, 2004).

Hematiile nu prezintă nucleu și organite. Membrana apare sub forma unui strat lipidic mai fluid care îi permite deformări reversibile (între straturile lipidice – colesterol liber). Organizarea structurala a membranei hematiilor ii confera proprietatea de deformabilitate reversibila cu mentinerea integritatii structurale pe tot parcursul vietii lor. Membrana eritrocitara prezinta elasticitate foarte ridicata, rezistenta structurala puternica si adaptare rapida in sistemul circulator. Anvelopa membranei plasmatice este formata din colesterol si fosfolipide, ancorata la reteaua de proteine citoscheletice ce traverseaza bistratul lipidic.

Lipidele membranare sunt aranjate simetric formand astfel un bistrat lipidic (Fig.7). In interiorul acestuia mai abundente sunt aminofosfolipidele, iar la exterior se intalnesc colinfosfolipide. Proprietatea de fluid a membranei eritrocitare este data de concentratiile de colesterol si fosfolipide. Modificarile ce apar in raportul acestor doua componente au ca rezultat modificari ale morfologiei membranei (Ballas si Krasnow, 1980).

Colesterolul intensifica rigiditatea membranei deoarece poseda o grupare polara si un nucleu steroid dispus in stratul bilipidic. In celulele eukariote exista cate o molecula de colesterol pentru fiecare molecula de fosfolipid (Solcan si colab., 2002).

Figura 7. Structura membranei eritrocitare (esanatos.com)

Colesterolul plasmatic poate intra in celule prin mai multe cai (absorbtie independenta sau mediata de receptori). Mecanismul exact nu se cunoaste, dar o posibila explicatie este asocierea moleculelor de colesterol cu exteriorul membranei plasmatice urmata de trecerea prin startul bilipidic si desprinderea colesterolului de membrana in spatiul citoplasmatic (Brasaemple, D.L.,1988).

Fosfatidilcolina si sfingomielina sunt localizate cu preponderenta in monostratul extern, in timp ce fosfatidilserina si fosfatidiletanolamina sunt situate in stratul intern al membranei.

Mentinerea distributiei asimetrice a fosfolipidelor are cateva implicatii functionale. Expunerea fosfatidilserinei la interiorul membranei este esentiala pentru supravietuirea celulei la intalnirea cu macrofagele din sistemul reticuloendotelial, deoarece acestea recunosc si fagociteaza eritrocitele care expun fosfatidilserina. Pierderea asimetriei lipidelor duce la expunerea fosfatidiserinelor la exteriorul membranei si se considera ca joaca un rol in distrugerea prematura a eritrocitelor in anemia falciforma si talasemie.

Proteinele membranei și cele ale citoscheletului au rol în configuratia hematiei, iar cele transmembranare poartă caracterul de grup sanguin. Eritrocitul nu are compuși majori de histocompatibilitate (H.L.A), ceea ce permite transfuzia. Membrana este : permeabilă pentru Cl- si HCO3, impermeabilă pentru Ca++ si slab permeabilă pentru Na+.

Citoplasma este aproape plină cu hemoglobină (100g hematie prin uscare – pierde 65 g apă și 35g reziduu uscat ; din care 34 g Hemoglobină +1 g substanțe anorganice + enzime).

Particularități metabolice: pe linie energogenetică – are nevoie de ATP ( nu are mitocondrii) și singura sursă este glicoliza care generează acizi și deci H+ , care dislocă O2 de pe hemoglobină, favorizând cedarea lui (efect Bohr).

Capitolul 3. Profilul lipidic seric

Colesterol

Steroizii cu catena laterala de 8-10 atomi de carbon in pozitia 17 si o grupare OH in pozitia 3 sunt denumiti steroli. Cel mai important reprezentant al acestei categorii este colesterolul (Fig.8). Se gaseste in toate grasimile animale, dar si in sange si bila. Prezenta acestui sterol in organism este asigurata atat prin dieta , cat si prin biosinteza, care se desfasoara foarte activ la nivelul ficatului, iar in proportii mai reduse in toate tesuturile. Este intalnit in stare libera cat si esterificat cu acizi grasi superiori saturati si nesaturati, aceasta fractiune fiind denumita colesterol esterificat.

Figura 8. Colesterolul

Sinteza colesterolului

Reactiile de biosinteza a colesterolului pot fi grupate in 3 etape:

Formarea izopentenil pirofosfatului (Fig.9) din acetil coezima A și alte substanțe intermediare

Biosinteza colesterolului începe prin cuplarea a 2 molecule de acetil CoA, care duc la formarea a unei molecule de acetoacetil CoA. Aceasta se combină cu o nouă moleculă de acetil CoA în prezența enzimei hidroximetilglutaril CoA sintaza și formează 3OH 3metil glutaril CoA, compus ce are în moleculă 6 atomide carbon(HMG CoA). În continuare acesta se reduce NADPH+H+ și a enzimei hidroximetilglutaril CoA reductaza la acid mevalonic (MVA), care suferă o fosforilare în prezența mevalonat kinazei formînd mevalonat5 fosfat. Acest compus se va transforma sub influența fosfomevalonat kinazei în mevalonat pirofosfat MVA-PP, compus care sufera o decarboxilare sub acțiunea difosfomevalonat dicarboxilazei, produsul final fiind IPP (izopentenilpirofosfat), denumit și izopren activ care constituie precursorul colesterolului, dar și a sterolilor, carotenoidelor, terpenelor, chinonelor, etc. (www.wikipedia.ro)

Figura 9. Sinteza izopentenil PP

IPP sub acțiunea unei izomeraze se trasformă în DMA PP (dimetilalilpirofosfat) (Fig.10)

Prin combinarea acestor izomeri are loc formarea unui alt precursor important în reacțiile biochimice GPP( geranilpirofosfatul cu 10 atomi de carbon în moleculă). GPP reacționează în continuare cu o moleculă de IPP formînd farnesil pirofosfat (C15). 2 molecule de farnesil pirofosfat se condensează cap-cap formînd scualenul (C30) (www.wikipedia.ro).

Figura 10. Sinteza scualenului

Scualenul prin procese de ciclizare și oxidare se transformă în lanosterol, iar acesta prin reacții de ciclizare si oxidare formează colesterolul (www.wikipedia.ro) (Fig.11)

Figura 11. Sinteza colesterolului

Face parte din lipidele mai complexe. Determinarea nivelului colesterolului evalueaza statusul lipidic si tulburarile metabolice, riscul de ateroscleroza, stenoza coronariana si infarct miocardic. Se recomanda analiza acestui parametru pentru monitorizarea factorilor de risc crescut pentru boala coronariana, screeningul si tratamentul dislipidemiilor primare si secundare.

Valori crescute ale colesterolului seric se mai intalnesc, pe langa diabetul zaharat, in alcoolism, hipotiroidie, colestaza, ciroza biliara, sindrom nefrotic, guta. Valori scazute indica malabsorbtie, maldigestie, carenta alimentara, boli hepatice, hipertiroidie, inflamatii sau arsuri severe.

HDL-colesterol

S-a demonstrat de nenumarate ori ca HDL (high density lipoproteins) este invers corelat cu riscul de aparitie a aterosclerozei sau a bolilor coronariene. Rolul protector al HDL este legat de transportul colesterolului de la tesuturi la ficat (pentru catabolizare si excretie) si de abilitatea lor de a inhiba oxidarea LDL (low density lipoproteins) si a membranelor biologice. S-a sugerat faptul ca proprietatile antioxidante ale HDL pot fi legate de capacitatea acestor molecule de a accepta si transporta fosfolipide continand hidroperoxizi proveniti din oxidarea membranelor sau lipoproteinelor. Un transfer de hidroperoxizi de la LDL oxidat la HDL si un schimb de produsi de peroxidare lipidica intre lipoproteine mentin acest fapt (Ferretti si colab., 2004).

Efectul antioxidant al HDL este legat partial de paraoxonaza, o enzima asociata de suprafata moleculelor HDL. Aceasta enzima este capabila de a hidroliza acesti hidroperoxizi si de a inhiba initializarea oxidarii indusa de ionii metalici asupra lipoproteinelor. Activitatea enzimatica a paraoxonazei variaza de la un individ la altul si s-a sugerat faptul ca subiectii cu activitate enzimatica mai scazuta au un risc mai mare de a dezvolta boli generate de alterarile produse de reactiile de oxidare si peroxidare lipidica comparativ cu cei cu activitate crescuta a acestei anzime.

Diabetul este asociat cu alterari oxidative, iar nivelurile ridicate a produsilor de peroxidare lipidica la pacientii diabetici pot fi legate de o mai mare susceptibilitate la oxidare a lipoproteinelor plasmatice si/sau o scadere a apararii antioxidante.

LDL- colesterol

LDL-colesterol este lipoproteina care contine cea mai mare cantitate de colesterol (60-70 % din colesterolul seric total). Rezulta in principal din degradarea VLDL, transportul major al trigliceridelor. Deoarece LDL are timp de injumatatire mai mare (3-4 zile) decat precursorul sau VLDL, este mai prevalent in circulatie decat acesta. Acizii grasi liberi circulanti formeaza in ficat trigliceride care sunt cuplate cu apoproteine si colesterol, urmand a fi exportate in sange ca lipoproteine VLDL (www.Sfatulmedicului.ro).

LDL este implicat in transportul colesterolului catre tesuturi, in principal in sistemul arterial, ceea ce explica incidenta crescuta a aterosclerozei si a bolii coronariene la pacientii cu niveluri serice crescute ale acestei lipoproteine. Astfel, determinarea LDL este specifica pentru estimarea riscului cardiovascular si stabilirea deciziei terapeutice. In conditii fiziologice, raportul LDL-colesterol/ HDL-colesterol are valoarea 2,9 la femei si 3,3 la barbati. Riscul dezvoltarii unei boli coronariene creste semnificativ daca valoarea acestui raport depaseste 3,5 la femei si 3,8 la barbati.

Cresteri ale LDL- colesterol se intalnesc, pe langa diabetul zaharat, in hipotiroidism, sindrom nefrotic, mielom multiplu, colestaza, insuficienta renala cronica, porfirie sau anorexie nervoasa. Scaderi ale LDL-colesterol se intalnesc in boala Tangier, hipertiroidie, anemii cronice, afectiuni hepatocelulare severe, sindrom Reye, stres acut sau afectiuni pulmonare cronice (www.Sfatulmedicului.ro).

Trigliceride

Trigliceridele din tesutul adipos si din celelalte tesuturi reprezinta cel mai important depozit de rezerve energetice ale organismului. In tesutul adipos sunt depozitate sub forma de glicerol, acizi grasi si monogliceride, care sunt convertite in ficat in trigliceride ce intra in constitutia VLDL (80%) si LDL (15 %). Hipertrigliceridemia si hipercolesterolemia sunt factori de risc independenti pentru boala aterosclerotica. Cresteri ale trigliceridelor se intalnesc in guta, pancreatita, boli hepatice, alcoolism, cat si in diabet zaharat. Scaderi ale trigliceridelor sunt in abetalipoproteinemie, malnutritie, hipertiroidism sau boala pulmonara cronica obstructiva (www.Sfatulmedicului.ro).

Capitolul 4. Acidul sialic

Caracteristici generale

Acizii sialici (Fig.12) sunt o familie de monozaharide cu 9 atomi de carbon care se intalnesc, de obicei, la sfarsitul lanturilor polizaharidice atasate de suprafata celulelor sau de proteine solubile. In corpul uman, cea mai mare concentratie de acid sialic o intalnim in creier unde participa ca parte integranta a structurii gangliozidelor in sinapse si transmisie neuronala.

Figura 12. Acidul sialic

Acidul sialic seric este corelat semnificativ cu prezența complicațiilor macroangiopate cardiovasculare la diabeticii cu complicatii de natura vasculara comparativ cu diabeticii fără afecțiuni cardiovasculare. Aceste rezultate concordă cu alte cercetari, ce atesta rolul acidului sialic seric de marker predictiv pentru complicațiile cardiovasculare.

Acidul sialic seric a prezentat valori crescute ce s-au corelat pozitiv si semnificativ cu prezenta microalbuninuriei si implicit prezenta nefropatiei diabetice, de unde si ipoteza ca acidul sialic seric crescut poate fi un marker al nefropatiei diabetice incipiente. Ramane ca studii mai ample sa confirme aceasta ipoteza si mai ales sa stabileasca daca raspunsul inflamator de faza acuta, reprezentat de cresterea nivelelor de acid sialic seric, precede instalarea microalbuninuriei la diabetici (Faur Lucian, 2005).

Nivelele serice ale acidului sialic au fost semnificativ crescute la diabeticii cu retinopatie comparativ cu cei fara retinopatie, intarind si mai mult ipoteza ca nivelele crescute ale acidului sialic seric sunt un marker al microangiopatiei diabetice.

Acidul sialic seric nu este corelat semnificativ cu glicemia dar există asocieri semnificative cu hemoglobina glicozilata HbA1C, de unde si observatia ca nivelele acidului sialic seric pot sugera starea echilibrului metabolic al diabetului, cresteri ale acidului sialic seric asociindu-se cu un control metabolic necorespunzator.

La bolnavii diabetici, depistarea unor nivele serice crescute de acid sialic poate obiectiva prezenta complicatiilor micro si macroangiopate degenerative nemanifestate clinic la acel moment, situatie ce confera dozarii acidului sialic seric valoare de test screening pentru aparitia complicatiilor cronice (Faur Lucian, 2005).

La bolnavii cu risc de DZNID, de sindrom metabolic, depistarea acidului sialic seric crescut sugereaza posibilitatea utilizarii acestuia ca un test precoce de diagnosticare a acestor afectiuni in faza incipienta.

Evidentierea unor nivele crescute ale acidului sialic seric la diabetici , in special la tipul 1 de diabetici, ar putea fi un marker precoce al aparitiei microalbuminuriei si implicit instalarii nefropatiei diabetice (Faur Lucian, 2005).

Dozarea acidului sialic seric la diabetici, la cei cu risc de DZNID, poate avea si valoare practica terapeutica. Decelarea nivelelor serice crescute ale acidului sialic, sugereaza disfunctia endoteliala, in cazul nostru la diabetici, situatie ce impune un control metabolic corect si de durata a diabetului zaharat si instituirea unei terapii adecvate cu efect benefic, dovedit ,asupra functiei endoteliale (aspirina, inhibitorii enzimei de conversie, tratament hipolipemiant și antioxidant).

Totusi, intrucat mecanismele intime, biologice ale implicarii acidului sialic seric in aparitia complicatiilor cronice angiopate diabetice sunt doar partial cunoscute, sunt necesare studii mai ample, pe un numar reprezentativ de cazuri, pentru elucidarea rolului acidului sialic seric de marker al complicatiilor cronice dibetice, de precursor al albuminuriei la diabetici, depistarii precoce a diabetului zaharat de tip 2 si sindromului de insulinorezistenta.

Acizii sialici si glicoproteinele/ glicosfingolipidele sialilate au fost asociate cu dezvoltarea normala si imunitatea organismului. Acidul sialic impreuna cu proteinele legate de acesta joaca rolul de component al sistemului imunitar innascut, in scopul de a preveni infectia cu virusuri si bacterii care se pot lega de asemenea la reziduuri de acid sialic. Modificarile ce apar in expresia acidului sialic genereaza boli patogene umane inclusiv cancerul si diabetul, dar nu se cunosc cauzele.

Acizii sialici difera de celelalte zaharuri prin faptul ca sunt mai putin utilizati ca sursa de energie dar sunt critici in dezvoltarea si recunoasterea celulara, atasarea celula-celula si semnalizare. Toate sistemele eucariote si procariote exprima acizi sialici; bacteriile patogene, virusurile si parazitii utilizeaza acizii sialici de suprafata ca liganzi in aderarea la celule, virusul gripal fiind cel mai cunoscut exemplu de agent patogen ce se leaga la acidul sialic.

Ciclul de viata al acizilor sialici (Fig.13) la vertebrate urmeaza o cale clara , trecand de la sinteza la transport, atasare, indepartare. Dupa ultima etapa, acizii sialici pot fi reciclati ptin atasare la CTP ( citidin 5’ trifosfat) in vederea reutilizarii ca substrat, sau poate fi degradat prin actiunea esterazelor si piruvat-liazelor specifice (Altheide si colab.).

Figura 13. Acidul sialic si ciclul de viata metabolic

Biosinteza- sinteza acidului sialic pornind de la precursori

Activare, transport si transfer – generarea substratelor donoare de acid sialic si atasarea la glicani cu ajutorul transferazelor

Modificare – aditia si relocarea modificarilor acidului sialic

Recunoastere – proteine de legare si recunoastere la sialoglicani

Reciclare si degradare- procesul de indepartare enzimatica a resturilor de acid sialic si degradarea acidului sialic liber

Biosinteza acidului sialic

Sinteza acidului sialic are loc in principal in citosol si implica 4 enzime ce participa in acest proces in 5 pasi (Fig.14):

Figura 14. Biosinteza acidului sialic ( enzima cu activitate duala UDP-GlcNac 2 – epimeraza / ManNac- 6- kinaza converteste substratul uridin 5’ difosfat N acetil D glucozamina (UDP-GlcNac) la N acetil D manozamina (ManNac) cu indepartarea fragmentului UDP si epimerizarea carbohidratului. Functia kinazica a aceeasi enzime fosforileaza glucidul pentru a produce N acetil D manoza 6 fosfat (ManNac 6 P). Reactia de condensare dintre fosfoenolpiruvat (PEP) si Man Nac 6 P initiata de Neu Ac 9 P sintetaza duce la precursorul fosforilat al acidului sialic – acid N acetilneuraminic 9 fosfat. Acest precursor este defosforilat de catre Neu5Ac 9 P fosfataza pentru a produce acidul sialic (acid N acetil neuraminic))

Transferul acidului sialic

Dupa biosinteza, Neu5Ac trebuie inclus ca substrat nucleotidic donor pentru transferul la o structura oligozaharidica. Acest lucru are loc in nucleul celulelor eucariote. Acidul sialic este transportat la nucleu dupa care este atasat la citidin 5’-trifosfat (CTP) pentru a produce substratul donor CMP-Neu 5 AC cu pierderea pirofosfatului prin cataliza enzimei CMP-NeuAC sintetaza. Substratul CMP-Neu5Ac este apoi transportat inapoi la citoplasma la aparatul golgi pentru a fi utilizat de catre sialiltransferaze (BioFiles).

Acizii sialici si glicoproteinele/ glicoconjugatele sialilate sunt necesare pentru o dezvoltare normala a mamiferelor. Deoarece acestia sunt de obicei intalniti la capatul terminal al structurii glicanilor si datorita caracterului lor acid si incarcarii negative, glicoconjugatele sialilate pot inhiba multe reactii intermoleculare si intercelulare. Acidul polisialic este o modificare post-translationala a glicoproteinei de adeziune celulara neuronala, iar prezenta lui este necesara pentru dezvoltarea neuronala postnatala, in timp ce acidul sialic este un component critic al gangliozidelor cerebrale; acidul sialic din dieta este necesar pentru dezvoltarea normala a creierului mamiferelor (BioFiles).

Acidul sialic este o componenta importanta al sistemului imunitar innascut la vertebrate. Acidul N acetil neuraminic este capabil de a elimina radicalii liberi formati in timpul reactiilor de oxidare (proxizi si hidroperoxizi lipidici) si are activitate antioxidanta (BioFiles).

Capitolul 5. Determinarea markerilor biochimici in sistem automat

Pentru analiza profilului lipidic din ser al subiectilor investigati s-a utilizat analizorul DiaLab Autolyser 450 din cadrul laboratorului clinic „Centrul Medical Victoria & Diagnostic”. Metoda de determinare a concentratiei colesterolului si lipidelor serice este cea colorimetrica.

În tabelul de mai jos este descris principiul reacției pentru fiecare din analiții determinați în această procedură.

Tabel 1. Metode de determinare a parametrilor biochimici din serul uman

Capitolul 6. Studiul profilului lipidic seric și eritrocitar al unor pacienți suferinzi de diabet zaharat

6.1. Materiale si metode

6.1.1. Subiectii investigati

In acest studiu s-a folosit masa eritrocitara obtinuta de la 7 pacienti diabetici de la Centrul Medical Victoria & Diagnostic si 4 pacienti control de la acelasi Centru. Sangele s-a recoltat in vacutainere cu EDTA, in mai multe serii. Studiul a fost efectuat in sediul Facultatii de Biologie, laboratorul de Biochimie.

In prima etapa s-a realizat o serie de teste biochimice precum dozarea colesterolului, lipidelor totale si acidului sialic din membrana eritrocitara, pentru evidentierea modificarilor survenite la acest nivel, din punct de vedere al concentratiei acestora.

In a doua etapa a studiului, aceste date au fost corelate cu cele obtinute in urma analizelor efectuate in laboratorul clinic pentru emiterea unor concluzii referitoare la importanta mentinerii integritatii structurale a eritrocitelor pentru indeplinirea functiilor biologice.

6.1.2. Metode de lucru

Izolarea eritrocitelor din sânge total periferic

In scopul studiului membranei eritrocitare s-a eliminat continutul celular, urmarindu-se urmatorul protocol (Arias si colab., 1978). S-a lucrat pe gheata.

Reactivi

Solutia 1: NaCl 120 mM

EDTA 10 mM

Citrat de Na 5 mM

TRIS 5 mM ph 7,4

Pentru 100 ml se cantaresc intr-un pahar Berzelius 0,701 g NaCl, 0,3722 g EDTA, 0,0605 g TRIS si 0,178 g citrat. Se adauga 50 ml apa distilata, se aduce la pH 7,4 cu NaOH si apoi se aduce la semn cu apa distilata intr-un balon cotat de 100 ml.

Solutia 2: NaCl 150 mM

TRIS 5 mM

Pentru 100 ml se cantaresc intr-un pahar Berzelius 0,876 g NaCl si 0,0605 g TRIS. Se adauga 50 ml apa distilata, se aduce la pH 7,4 cu HCl si apoi se aduce la semn cu apa distilata intr-un balon cotat de 100 ml.

Solutia 3: solutie saponina 0,5 mg/ml preparata in mediu izotonic (solutia 2)

MOD DE LUCRU

1,5 ml sange + 6 ml solutie 1 (volumul de sange luat in lucru poate varia dar trebuie pastrat raportul de volum intre sange si solutia 1)

Centrifugare 1500 rpm, la 4° C, 10 minute

Se preia si se arunca supernatantul, iar sedimentul se resuspenda in 6 ml solutie 2

Centrifugare 1500 rpm, 4° C, 10 minute (procesul de spalare a eritrocitelor se repeta de 2 ori)

Peste sedimentul obtinut se adauga 1,2 ml solutie saponina (solutie 3)

Incubare pe gheata 2 ore si 30 minute

Centrifugare 1500 rpm, 4° C, 10 minute

Se preia supernatantul si se repartizeaza in tuburi (Supernatantul contine hemoglobina ce poate fi utilizata pentru analize ulterioare)

Peste sedimentul eritrocitar obtinut s-a adaugat tampon TRIS-EDTA(5mM TRIS x HCl, 2 mM EDTA) diluat 10x (raport 1:4 v/v). Tamponul s-a preparat in 200 ml apa distilata si s-a adus la pH 7,4 cu HCl 37%

S-au agitat probele pe gheata timp de 20 de minute

Au urmat 3 ultracentrifugari la 24.700 rpm, la 10° C, 15 minute

Dupa prima ultracentrifugare s-a pastrat supernatantul reprezentat de extractul citoplasmatic necesar pentru diverse analize

Sedimentul obtinut in urma celei de-a treia ultracentrifugari contine membranele eritrocitare necesare studiului.

S-a resuspendat in 0,5 ml tampon TRIS-EDTA si a fost conservat la – 30° C

Determinarea lipidelor serice totale prin reactia cu sulfo-fosfo-vanilina (metoda imbunatatita de C.S. Frings si T.W. Frendley in 1972)

Reactivi

Reactiv vanilina 6 g/l (6 g vanilina in 1 litru apa distilata; stabil 2 luni in sticla bruna la temperatura camerei)

Reactiv fosfo-vanilina ( 350 ml reactiv 1 si 50 ml apa distilata intr-un balon Erlenmeyer de 2 litri peste care de adauga 600 ml acid fosforic concentrat cu agitare continua; stabil 2 luni in sticla bruna la temperatura camerei)

Standard 600 mg/dl (600 mg trioleina intr-un balon cotat de 100 ml diluat cu etanol absolut si amestecat bine; stabil 1 luna la 4-7 ° C)

MOD DE LUCRU

Se pipeteaza in conuri de 15 ml cate 60 µl apa distilata (blank), standard si membrane (proba)

Se adauga 0,2 ml acid sulfuric concentrat

Se vortexeaza si se pun in baia de apa la fierbere pentru 10 minute

Se racesc pe gheata timp de 5 minute

Se adauga 5 ml reactiv fosfo-vanilina

Se vortexeaza si se incubeaza in baia de apa la 37° C timp de 15 minute

Se racesc la temperatura camerei

Se citeste densitatea optica fata de blank la 540 nm

Dozarea colesterolului seric prin tehnica Rappaport

Colesterolul impreuna cu acidul sulfuric concentrat si anhidrida acetica formeaza un compus colorat albastru (reactia Liberman Burchard).

Reactivi:

Anhidrida acetica

Aacid sulfuric solutie 12 % in acid acetic glacial

Acid sulfuric concentrat

Solutie standard de colesterol in acid acetic glacial 250 mg/100 ml

MOD DE LUCRU

S-a pipetat conform Tabelului 2. : blank-ul (B), standardul (S) si probele (P).

Se omogenizeaza probele prin agitare si se racesc 10 minute pe gheata.

Se adauga:

Se omogenizeaza si se lasa probele 20 de minute la intuneric.

Se masoara extinctia probelor (EP) si a standardului (ES) fata de blank la 610 nm.

Calculul s-a realizat dupa formula:

EP/ES × 250 = mg colesterol/ 100 ml ser

Determinarea acidului sialic legat prin hidroliza (Metoda Lorant Skoza si Steven Mohos)

Probele cu glicoproteine se hidrolizeaza in acid sulfuric 0,05 M, pH-ul fiind mentinut riguros intre 1,6 si 2. Hidroliza se face la 80° C timp de o ora. Standardul este o solutie de NANA (acid N-acetilneuraminic) 4 mg/10 ml solubilizat in apa distilata.

Reactivi

Solutie standard NANA 4 mg/10 ml A.D (STD)

Solutie acid sulfuric 0,05 M

Solutie acid periodic 0,57 %

Solutie arsenit de Na 2 % in HCl 0,5 N

Solutie acid tiobarbituric (TBA) 0,1 M

Solutie butanol acid 5 % (v/v) in HCl concentrat

MOD DE LUCRU

In conuri de 15 ml se pipeteaza 1,92 ml H2SO4 0,05 M si 0,08 ml proba

In paralel se pregateste STD: 1,92 ml H2SO4 0,05 M + 0,08 ml solutie stoc NANA 4 mg/10 ml

Se pun probele la hidroliza pe baia de apa timp de 1 ora

Se racesc la temperatura camerei

Din aceste probe se iau 0,5 ml si se pun in alte conuri de 15 ml peste care se adauga 0,25 ml acid periodic 0,57 %

Se pun la incubat pe baia de apa la 37° C timp de 30 de minute

Se aduc probele la temperatura camerei apoi se adauga 0,2 ml arsenit de Na 2 % si 2 ml TBA 0,1 M

Se pun la fierbere pe baia de apa timp de 7,5 minute

Se racesc pe gheata

Se adauga 5 ml butanol acid

Se centrifugheaza 10 minute la 5000 rpm

Se citesc densitatile optice fata de blank la 549 nm

Calculul se face dupa formula :

C= 8 x EP/ES x 10 mg/dl

6.2. Rezultate si discutii

Eritrocitul este un bun exemplu de membrana celulara ce se foloseste ca model de studiu pentru ilustrarea rolului exercitat de colesterol la acest nivel. Interesul pentru un astfel de studiu deriva din cunoasterea faptului ca membrana eritrocitului este sursa cea mai mare de colesterol in comparatie cu alte celule din organismul uman. Structura membranei eritrocitare poate suferi modificari in diferite situatii patologice. Diabetul zaharat poate produce o serie de alterari la nivelul constituentilor membranei eritrocitelor, fapt care duce la afectarea functiilor eritrocitelor prin deformabilitatea acestora.

Colesterolul este considerat un component important in grupul lipidelor membranare si cel mai important element structural. Ii revine un rol important in reglarea fluiditatii membranare, previne cristalizarea lanturilor acil ale acizilor grasi care fac membranele mai putin fluide. Efectul colesterolului asupra membranelor se efectueaza prin intercalarea gruparilor sale hidroxil, polare, in stratul lipidic, care interactioneaza cu lanturile de acizi grasi din vecinatate. Colesterolul previne transformarea membranelor normale din faza de fluid in faza de gel la temperaturi joase.

In studiul nostru am demonstrat ca eritrocitele indivizilor suferinzi de diabet sunt afectate din punct de vedere functional din cauza modificarilor survenite la nivelul constituentilor membranari, respectiv la nivelul concentratiei acestora. O cantitate mai mica de fosfolipide sau colesterol pot avea efecte ireversibile asupra fiziologiei eritrocitelor.

Colesterolul, componenta moderatoare a membranelor, se deplaseaza de-a lungul bistraturilor lipidice. Analiza acestuia s-a realizat in vederea evaluarii modificarilor concentratiei membranare. Distribuit la nivelul bistratului lipidic, colesterolul ofera membranei stabilitate si flexibilitate. Orice alterare a concentratiei acestuia poate duce la alterari de forma si functie a hematiei.

In figura 15 sunt reprezentate valorile concentratiei colesterolului membranar obtinute la pacientii control si cei diabetici. Aceste rezultate pot fi corelate cu raportul colesterol membranar/ colesterol total seric reprezentat in figura 16. Se observa o scadere semnificativa a concentratiei colesterolului membranar la pacientii diabetici, comparativ cu cei control, dar si a lipidelor din membrana (Fig. 18).

Figura 15. Nivelul colesterolului membranar la pacientii control comparativ cu cei diabetici

Scaderea observata de noi a concentratiei de colesterol din membrana eritrocitara poate influenta semnificativ aranjamentul molecular al acesteia, confirmand perturbarile asociate cu modificarile structurale, organizationale si functionale ale membranei eritrocitului diabetic. In urma acestui rearanjament compozitional se modifica vascozitatea intracelulara ce duce la deformarea hematiei.

Deformarea hematiilor este importanta in eliminarea si distrugerea ulterioara a celulelor anormale din sangele circulant. Factorii care afecteaza aceasta deformabilitate si impiedica circulatia acestor celule sunt corelati cu scurtarea vietii eritrocitelor. Acesti factori includ alterari de suprafata (modificarea volumului celular, incluziuni intracelulare, rigidizarea membranei eritrocitare) (Durocher, J.R. si colab, 1975).

Variatia interpopulationala a concentratiei de colesterol seric poate fi determinata in principal prin diferentele in obiceiurile alimentare. Astfel, o schimbare in dieta unei populatii de indivizi care are o concentratie ridicata de colesterol la una cu o concentratie mai redusa de colesterol duce la o reducere semnificativa a nivelului de LDL- colesterol din totalul profilului lipidic. Cu toate acestea, caracteristice metabolice individuale in metabolismul colesterolului contribuie la reglarea concentratiei acestuia in fiecare dintre noi (Miettinen si Kesaniemi, 1989).

Figura 16. Raportul colesterol membranar/ colesterol total seric la pacientii control si cei diabetici

Diferenta dintre nivelul colesterolului total seric la pacientii control si cei diabetici (Fig.17) este nesemnificativa, dar se observa un nivel mai ridicat in cazul pacientilor diabetici.

Colesterolului ii revine un rol important in reglarea fluiditatii membranare si previne cristalizarea lanturilor acil ale acizilor grasi care fac membranele mai putin fluide. Efectul colesterolului asupra membranelor se efectueaza prin intercalarea gruparilor sale hidroxil, polare, in bistratul lipidic, nucleul sterolic rigid, care interactioneaza cu lanturile de acizi grasi din vecinatate. Dupa Smith (1992), colesterolul previne transformarea membranelor normale din faza de fluid in faza de gel la temperaturi joase. In membrana hematiei, colesterolul se gaseste mai mult sub forma libera decat esterificata si reflecta variatiile colesterolului plasmatic. Colesterolul liber neesterificat se afla intr-o continua dinamica in membrana hematiei, fiind repede metabolizat intre eritrocit si plasma sanguina. Procesul se desfasoara neenzimatic, fara consum de energie si fara modificarea continutului sterolic din membrana eritrocitului. Schimburile se efectueaza mai repede in anumite zone ale membranei hematiei si mai lent in altele, probabil in cauza unei distributii inegale a colesterolului pe membrana celulara eritrocitara sau naturii fosfolipidului invecinat. Colesterolul esterificat se afla in cantitate redusa in membrana hematiei si nu intra in schimburile cu plasma sanguina.

Figura 17. Nivelul colesterolului total seric la pacientii control si cei diabetici

Nivelul fosfolipidelor este de asemenea foarte important pentru mentinerea fluiditatii membranei in functionarea hematiei. Studii pe loturi de bolnavi de diabet zaharat au evidentiat perturbarea acestui nivel (Fig.18). Constatarea explica cel putin partial existenta de modificari ale permeabilitatii pentru apa si ioni, care pot antrena tulburari de flexibilitate eritrocitara. Investigatii prin metodologia RMN asupra permeabilitatii membranei eritrocitare in relatie cu lipidele totale si colesterolul din membrana hematiei la bolnavii diabetici in diferite stadii de evolutie a bolii au evidentiat diferente semnificative in privinta cantitatii lipidelor totale din membrana eritrocitului la diabetici in raport cu lotul martor.

Deosebiri mai exista si in raport de forma clinica de boala diabetica. De exemplu, la bolnavii care au suferit si un accident vascular cerebral, membrana eritrocitului manifesta o tendinta de ingrosare. Modificarile cantitative ale lipidelor din membranele eritrocitare pot influenta echilibrul membranar, flexibilitatea membranei, schimburile dintre celule si plasma sanguina.

Figura 18. Nivelul lipidelor membranare la pacientii control si diabetici

Acidul sialic plasmatic (Fig.19) este un marker al raspunsului de faza acuta. Rezultatele studiului nostru sunt conform celor obtinute de Nayak si Bhaktha in 2005, conform carora se observa o crestere semnificativa a acidului sialic membranar corelat cu riscul de aparitie a mai multor complicatii (nefropatia, hipertensiunea, retinopatia). Este corelat cu nivele mari de creatinina, colesterol si trigliceride, dar si cu concentratii ridicate de microalbumina urinara. Aceasta reprezinta, la randul ei, un factor de risc pentru dezvoltarea bolilor cardiovasculare si poate fi asociata cu inflamatia cronica.

Figura 19. Nivelul acidului sialic membranar la pacientii control si cei diabetici

CONCLUZII

Studiul cu privire la rolul colesterolului din membrana eritrocitului in diabetul zaharat ne-a ajutat in atingerea obiectivelor noastre si anume evaluarea si interpretarea proprietatilor morfofunctionale ale membranei eritrocitului in conditii fiziologice si patologice. Optiunea pentru aceasta investigatie s-a bazat pe faptul ca membrana eritrocitului este considerata un bun model de studiu si reprezinta sursa cea mai mare de colesterol in comparatie cu celelalte celule ale organismului.

Rezultatele evidentiaza diferente in concentratia de colesterol, lipide si acid sialic din membrana eritrocitului la bolnavii de diabet zaharat fata de martori. Modificarile din spectrul lipidic de la nivelul membranei evidentiate la diabetici pot influenta functionalitatea ei. Totodata, sugereaza o posibila participare a modificarilor in concentratia colesterolului si celorlalte componente la etipatogenia complicatiilor cardiovasculare legate de diabetul zaharat.

Prezenta unor modificari ale spectrului lipidic la nivelul membranei eritrocitare in corelatie cu alte teste de la acest nivel ar putea contribui la optimizarea diagnosticului precoce al diabetului zaharat, la monitorizarea evolutiei bolii si la aplicarea unui tratament de prevenire a complicatiilor.

BIBLIOGRAFIE

Accurso, A., Bernstein, R.K., Dahlqvist, A., Draznin, B., Feinman, R.D., Fine, E.J., Jacobs, D.B., Larson, G., Dietary carbohydrate restriction in type 2 diabetes mellitus and metabolic syndrome: time for a critical appraisal, 2008

American Diabetes Association, Diagnosis and Classification of Diabetes mellitus, Diabetes Care, vol. 31, 2008

Ball, W.L, Bartman, B., Clark, C.M., Dempster, J., Gadon, M., Gavin, J.R., Gonzalez, A., Goolsby, M.J., Gurenlian, J., National diabetes education program, 2009

Brasaemle, D.L., Robertson, A.D., Attie, A.D., Transbilayer movement of cholesterol in the human erythrocyte membrane, 1988

Buys A.V., Van Rooy M.J., Soma P., Papendorp D.V., Lipinski B., Pretorius E., Changes in red blood cell membrane structure in type 2 diabetes: a scanning electron and atomic force microscopy study, 2013, Cardiovascular Diabetology.

Capaldi, R.A., The structure of erythrocyte membranes- A partial separation of intrinsic and extrinsic membrane proteins, 1972

Cazzola, R., Rondanelli, M., Russo-Volpe, S., Ferrari, E. And Cestaro, B., Decreased membrane fluidity and altered susceptibility to peroxidation and lipid composition in overweight and obese female erythrocytes, vol. 45, 2004

Chabanel, A., Flamm, M., Sung, K.L.P., Lee, M.M., Schachter, D., Chien, S., Influence of cholesterol content on red cell membrane viscoelasticity and fluidity, 1983

Cooper, R. et al., Modification of Red Cell Membrane Structure by Cholesterol-Rich Lipid Dispersions-A MODEL FOR THE PRIMARY SPUR CELL DEFECT, The Journal of Clinical Investigation Volume 55 January 1975

Diagnosis and classification of diabetes mellitus, American diabetes association, vol. 35, 2012

Duncan, J.L., Schlegel, R., Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes and lipid dispersions, 1975

Durocher, J.R., Payne, R.C. and Conrad, M.E., Role of sialic acid in erythrocyte survival, 1975

Faur Lucian, Rezumatul lucrarii de doctorat, 2005

Ferretti, G., Bacchetti, T., Busni, D., Rabini, R.A., Curatola, G., Protective Effect of Paraoxonase Activity in High- Density Lipoproteins against Erythrocyte Membranes Peroxidation: A Comparison between Healthy Subjects and Type 1 Diabetic Patients, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 89(6):2957–2962, 2004 by The Endocrine Society

Fisher, K.A., Analysis of membrane halves: Cholesterol, 1975

Google Imagini

Gray, L.J., Barros, H., Raposo, L., Khunti, K., Davies, M.J., Santos, A.C., The development and validation of the Portuguese risk score for detecting type 2 diabetes and impaired fasting glucose, 2013

Handelsman, Y., Mechanick, J.I., Blonde, L., Bloomgarden, Z., Einhorn, D., Garber, A., Ismail-Beigi, F., Jovanovic, L., Vinik, A.I., American association of clinical endocrinologists medical guidelines for clinical practice for developing a diabetes mellitus comprehensive care plan, 2011

Hermanns, N., Caputo, S., Dzida, G., Khunti, K., Meneghini, L.F., Snoek, F., Screening, evaluation and management of depression in people with diabetes in primary care, 2012

Khaw, K.T., Wareham, N., Luben, R., Bingham, S., Oakes, S., Welch, A., Day, N., Glycated haemoglobin, diabetes, and mortality in men in Norfolk cohort of European Prospective Investigation of cancer and nutrition (EPIC- Norfolk), 2001

Krolewski, A., Laffel, M.B., Krolewski, B.A., Quinn, M., Warram, J., Glycosylated hemoglobin and the risk of microalbuminuria in patients with insulin-dependent diabetes mellitus, vol. 332, no. 19, 1995

Lange, Y., Dolde, J., Steck, T. L., The rate of transmembrane movement of cholesterol in the human erythrocyte, 1981

Larsen, M. L., Horder, M., Mogensen, E., Effect of long-term monitoring of glycosylated hemoglobin levels in insulin-dependent diabetes mellitus, 1990

Life Science BioFiles, vol. 5, nr. 1

Lim, E.L., Hollingsworth, K.G., Aribisala, B.S., Chen, M.J., Mathers, J.C., Taylor, R., Reversal of type 2 diabetes: normalisation of beta cell function in association with decreased pancreas and liver triacylglycerol, 2011

Management of diabetes, Federal Bureau of Prisons, Clinical Practice Guidelines, 2012

Management of diabetes, Scottish intercollegiate guidelines network, 2010

Meiloud, G., Arfa, I., Kefi, R., Abdelhamid, I., Veten, F., Lasram, K., Halim, N.B., Mhamed, A.S., Samb, A., Abdelhak, S., Houmeida, A.O., Type 2 diabetes in Mauritania: Prevalence of the undiagnosed diabetes, influence of family history and maternal effect, 2013

Needham David and Nunn Rashmi, Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol, vol. 58, 1990

Owen, J.S., Bruckdorfer, K.R., Day, R.C. and McIntyre, N., Decreased erythrocyte membrane fluidity and altered lipid composition in human liver disease, vol. 23, 1982

Polonsky K.S., The Past 200 Years in Diabetes, 2012, The new England journal of medicine.

Rose, H.G. and Oklander, M., Improved proceduce for the extraction of lipids from human erythrocytes, vol. 6, 1965

Saito K., Odashiro K., Maruyama T., Akashi K., Mawatari S., Fujino T., Improvement of diabetic or obese patients’ erythrocyte deformability by the program of the brain-oriented obesity control system (BOOCS), 2012, Springer.

Saudek, C.D., Herman, W.H., Sacks, D.B., Bergenstal, R.M., Edelman, D., Davidson, M.B., A new look at screening and diagnosing diabetes mellitus, 2008

Saydah, S. and Lochner, K., Socioeconomic status and risk of diabetes-related mortality in the U.S, Public Health Reports, vol. 125, 2010

Shapiro, R., McManus, M.J., Zalut, C., Bunn, F., Sites of nonenzymatic glycosylation of human hemoglobin A, 1979

Shin S., Ku Y., Babu N., Singh M., Erythrocyte deformability and its variations in diabetes mellitus, 2007, Indian journal of Experimental Biology.

Smith J.E., Erythrocyte Membrane: Structure, Function, and Pathophysiology, 1987, Veterinary Pathology.

Sudha, R. Et al., Serum sialic acid in relation to erythrocyte sedimentation rate and hba of type 2 diabetic patients, vol. II, issue 4

Șerban V.V., Diabetul zaharat pe înțelesul tuturor, 1993, Editura Excelsior-Timișoara

The new england journal of medicine, The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus, 1993

Translated resources for the management of diabetes, National diabetes servoces scheme

Tuomilehto, J., Lindstrom, J., eriksson, J.G., Valle, T.T., Laakso, H., Rastas, M., Uusitupa, M., Prevention of type 2 diabetes mellitus by changes in lifestyle among subjects with impaired glucose tolerance, The new england journal of medicine, vol 344, 2001

Type 2 diabetes in children and adolescents, American diabetes association, 2000

Whitaker, J., Reducing the risk of complication from diabetes, Non-traditional treatment

World Health Organization Department of Noncommunicable Disease Management Geneva, Screening for Type 2 Diabetes. Report of a World Health Organization and International Diabetes Federation meeting World, 2003.

World Health Organization, Diabetes action now, 2004.

www.contributors.ro

www.MedLife.ro

www.SfatulMedicului.ro

www.UrbanLifestyle.ro