Studiul Metodelor Si Tehnicilor Utilizate In Maturarea In Vitro A Ovocitelor LA Canide
CUPRINS
INTRODUCERE
PARTEA I – ASPECTE TEORETICE
Capitolul I – OVOGENEZA ȘI FOLOCULOGENEZA
1.1. Formarea și migrarea celuleor germinale în gonade
1.2. Perioada germinativă
1.3. Perioada de creștere și diferențiere a ovocitelor și dezvoltarea foliculară
1.4. Perioda de maturare ovocitară
1.5. Morfologia ovocitului matur
1.6. Interacțiile celulare de la nivelul foliculului ovarian
1.6.1. Rolul maturării ovocitare în selecția foliculară
1.7. Ovulația și formarea corpului galben
1.8. Atrezia foliculară
Capitolul II-PARTICULARITĂȚI ALE DEZVOLTĂRII OVOCITARE LA CANIDE
2.1. Aspecte endocrine ale ciclului estral la cățea
2.2. Caracteristici particulare ale foliculogenezei și ale ovocitului
2.3. Maturarea ovocitară la cățea in vivo și in vitro
2.3.1. Maturarea ovocitelor de cățea in vivo
2.3.2. Maturarea ovocitelor de cățea in vitro
2.4. Momentul ovulației și migrarea ovocitului
2.5. Viabilitatea ovulei și capacitatea sa de fecundare
Capitolul III – PRELEVAREA OVOCITELOR ȘI MATURAREA IN VITRO
3.1. Controlul ciclului estral și stimularea hormonală a femelelor
3.2. Metode de recoltare a ovocitelor în corelație cu stadiul lor de maturare
3.3. Factori care influențează maturarea ovocitelor in vitro
3.3.1. Vârsta femelei, rasa, stadiul reproductiv și mărimea foliculului ovarian
3.3.2. Compoziția mediului de cultură
3.3.2.1. Suplimentarea mediului cu hormoni
3.3.2.2 Suplimentarea mediului cu proteine
3.3.2.3. Suplimentarea mediului cu surse de energie
3.3.2.4. Suplimentarea mediului cu antioxidanți
3.3.2.5. Substanțe inhibitoare ale meiozei
3.3.3. Condițiile și intervalul de cultură
3.3.4. Cocultura
3.3.5. Influența spermatozoizilor
PARTEA a II-a – CERCETĂRI PROPRII
1. SCOPUL ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI
2. MATERIALE ȘI METODE
2.1. Materiale
2.2. Metode
2.2.1. Pregătirea vaselor și a mediilor de cultură
2.2.2. Recoltarea ovarelor și prelevarea ovocitelor
2.2.3. Evaluarea și perfecționarea metodelor de recoltare a ovocitelor de canide
2.2.4. Identificarea ovocitelor și evaluarea caracterelor morfologice
2.2.5. Cultivarea in vitro și maturarea ovocitelor
2.2.6. Aprecierea morfologică, morfocitometrică și clasificarea ovocitelor după cultură
3. REZULTATE EXPERIMENTALE
3.1. Evaluarea și perfecționarea metodelor de recoltare a ovocitelor de canide
3.2. Identificarea ovocitelor și evaluarea caracterelor morfologice
3.3. Aprecierea morfologică, morfocitometrică și clasificarea ovocitelor după cultură
4. CONCLUZII
BIBLIOGRAFIE
ABREVIERI
ADN – Acid deoxiribonucleic
AMPc – Adenozin-3,5-monofosfatul ciclic
ARN – Acid ribonucleic
BSA – Serumalbumină bovină
CMRL 1066– Mediu de cultură (Connaught Medical Research Laboratories)
COC – Complex cumulus-ovocitar
dbcAMP – dibutiril-cAMP
E2 – Estradiol
EBS – Ser estral de vacă
eCG – Gonadotropină corionică ecvină
ECS – Ser estral de cățea
EGF – Factor de creștere epidermal
FBS – Ser fetal bovin
FCS – Ser fetal de vițel (fetal calf serum)
FGF – Factor de creștere fibroblastic (Fibroblast Growth Factor)
FIV – Fertilizare in vitro
FSH – Hormon foliculostimulator
GnRH – Hormon de eliberare a gonadotropinelor
GP – Globul polar
hCG – Gonadotropină corionică umană
hMC – Gonadotropină de menopauză umană
HSA – Serumalbumină umană
ICSI – Injectarea Intracitoplasmatică a Spermatozoidului (IntraCytoplasmic Sperm Injection)
IVF – Fecundare in vitro
IVM – Maturare in vitro
LH – Hormon luteinizant
MAPK – Protein-kinază activatoare mitogenă
MI – Metafaza I
MII – Metafaza II
mKRB – Krebs Ringer bicarbonat
MPF – Factor de inducere a maturării
PBS – Phosphate-buffered saline
SCID – Imunodeficiență severă combinată (severe combined immunodeficiency)
SOF – Fluid oviductal sintetic
STB – Hormon somatotrop bovin
STH – Hormon somatotrop uman
TCM 199 – Mediu de cultură tisular
TYH – soluție Krebs-Ringer bicarbonat modificat
βME – Beta-mercaptoetanol
INTRODUCERE
Biotehnologiile de reproducție reprezintă la ora actuală un domeniu de mare interes atât pentru conservarea biodiversității speciilor, cât și pentru cercetarea fundamentală. Informațiile furnizate de experimentele de fecundare in vitro la familia Canidae (subspecia Canis familiaris) sunt considerate importante datorită posibilităților de a le extrapola pe baza similarității filogenetice în salvarea speciilor de carnivore sălbatice pe cale de dispariție.
Aptitudinea de dezvoltare a unui embrion, indiferent de specie, depinde în principal de potențialul de dezvoltare și maturare al ovocitului din care provine. Procesul de maturare ovocitară este un punct critic în dezvoltarea unor biotehnologii ca producerea de embrioni in vitro și clonarea la mamifere, eficacitatea maturării in vitro fiind în general redusă, iar capacitatea de fecundare a ovocitelor in vitro fiind mult mai mică decât in vivo.
În acest context, "maturarea in vitro" devine un subiect foarte atractiv pentru cercetare, ceea ce a determinat și alegerea ca temă a prezentei lucrări de diplomă.
Maturarea in vitro a ovocitelor la canide a fost prima dată descrisă în 1976 (Mahi și Yanagimachi, 1976). Numărul studiilor efectuate pe câini este redus, deoarece disponibilitatea materialului biologic este limitată, comparativ cu cele desfășurate pe alte specii. Ovarele de bovine, porcine sau ecvine se găsesc cu ușurință în abatoare, iar animalele mai mici (șoareci, șobolani) pot fi crescute ușor, cu costuri reduse.
Primele studii despre utilizarea biotehnologiilor de reproducere la canide datează din secolul al XVIII-lea, însă domeniul a înregistrat o dezvoltare spectaculoasă abia spre finalul secolului al XX-lea. Cercetările actuale sunt orientate către optimizarea procedurilor de maturarea ovocitară in vitro, fecundarea in vitro (FIV) și ICSI (IntraCytoplasmic Sperm Injection), transferul de embrioni obținuți in vitro, clonare și transgeneză, tehnici disponible deja la rumegătoare, porcine și pisici.
Deși în România aceste tehnici sunt încă la început de drum, literatura de specialitate indică faptul că pe plan internațional arealul respectiv constituie un segment în expansiune.
Părerea unanimă a celor care lucrează în această ramură a biotehnologiilor este aceea că rezultate satisfăcătoare se obțin cu mare dificultate. Principalii factori limitatori ai succesului sunt: înțelegerea precară a evenimentelor reproductive la cățea și a caracteristicilor unice la această specie, inclusiv a reglajului hormonal implicat, informații incomplete privind reluarea meiozei și desăvârșirea ei, lipsa unor medii de maturare adecvate pentru această specie și imposibilitatea de a depăși rolul oviductului în maturarea ovocitului.
Această lucrare prezintă în mod sintetic cunoștințele actuale în domeniul biologiei ovocitului și embrionului la canide și rezultatele obținute până în prezent cu ajutorul biotehnologiilor de reproducere. De asemenea, sunt prezentate detaliat materialele, metodele și rezultatele experimentelor realizate în cadrul studiului. Am urmărit optimizarea metodelor de prelevare și cultivare in vitro a ovocitelor de canide, în vederea creșterii indicelui de fecundație și de obținere a embrionilor prin tehnici de fertilizare in vitro. În acest scop, am realizat definirea unor noi criterii morfocitometrice de evaluare și de selecție a ovocitelor, dar și testarea și evaluarea unor parametri ce influențează direct maturarea in vitro. În plus, am încercat să creștem rata de viabilitate prin cultivarea în medii consacrate și/sau îmbunătățite și în anumite condiții de cultură modulate, care să asigure atingerea unui nivel corespunzător de maturare nucleară și citoplasmatică. La final, am realizat aprecierea morfocitometrică a ovocitelor de cățea și clasificarea lor în funcție de aceste caracteristici, din momentul recoltării până la maturarea in vitro, cu surprinderea în fiecare etapă a principalelor caracteristici biologice de etapă.
PARTEA I
ASPECTE TEORETICE
CAPITOLUL I
OVOGENEZA ȘI FOLICULOGENEZA
Ovogeneza cuprinde un ansamblu de procese celulare și moleculare prin care ovogonia (celula germinală primordială) se transformă în ovul (celulă sexuală specializată) apt pentru fecundare. Toate procesele implicate în ovogeneză se petrec în zona corticală a ovarului, în interiorul foliculilor ovarieni.
Ovogeneza parcurge patru perioade: formarea și migrarea celulelor germinale primordiale în gonade, perioada germinativă, perioada de creștere și perioada de diferențiere și maturare. Corespunzător segmentului aparatului genital în care aceste etape au loc, sunt descrise două stadii: stadiul ovarian al ovogenezei și stadiul tubar al acesteia (Zărnescu, 2002; Cornilă, 2000).
1.1. Formarea și migrarea celulelor germinale primordiale în gonade
Ovogeneza debutează cu formarea celulelor germinale primordiale care populează ovarul fetal.
Celulele germinale primordiale au origine extragonadală, în epiblast, într-o regiune localizată posterior de linia primitivă. Precursorii celulelor germinale migrează din mezodermul extraembrionar în embrion, prin alantoidă și sacul vitelin adiacent. Celulele germinale ce încep să migreze în sacul vitelin de la baza alantoidei se împart în două populații, direcționate spre gonada dreaptă și stângă. Migrarea continuă din sacul vitelin la nou-formatul intestin posterior și prin mezenterul dorsal, în creasta genitală. Se consideră că tranziția lor este datorată mișcărilor morfogenetice care au ca scop transformarea embrionului din discoidal în tubular. În cursul acestei transformări, o parte din sacul vitelin va fi încorporat în intestinul primitiv nou-format, ceea ce demonstrează că celulele germinale primordiale sunt transportate pasiv din regiunea extraembrionară în corpul embrionului. Celulele germinale se deplasează prin mișcări amiboidale, dependente de eliberarea unor substanțe chemoatractante, neidentificate, din primordia gonadei (Zărnescu, 2002).
Odată ajunse la ovar, celulele germinale primordiale își pierd mobilitatea, devin sferice și conțin puține organite. Aceste celule sunt cunoscute sub denumirea de ovogonii (Zărnescu, 2002).
1.2. Perioada germinativă (de înmulțire, mitoză) se desfășoară în timpul vieții embrionare, având ca punct de plecare ovogoniile (celule stem) din ovarul embrionar care se divid mitotic și sunt conectate prin punți intercelulare. Dimensiunea ovogoniei este de 15 – 20 μm, are o formă sferică sau ovoidă și o structură reprezentată printr-un nucleu veziculos, nucleolat și citoplasmă, în care se găsesc aparatul Golgi, mitocondrii, ribozomi și reticulul endoplasmatic (Cornilă, 2000).
În perioada embrio-fetală, în ovar se formează prin mitoze repetate întreaga rezervă de celule sexuale ale femelei pentru toată viața (60.000- 100.000 ovocite de ordinul I). Activitatea mitotică a ovogoniilor încetează înainte sau la scurt timp după naștere, împiedicând astfel înlocuirea ovocitelor pierdute. Ovocitele de ordinul I (ovocytus primarius) rămân în stare latentă biologică (status quiescent) până la pubertate, fiind blocate în profaza diviziunii meiotice (reducționale).
Doar o mică parte a populației de celule germinale originare supraviețuiește, un număr și mai mic ajunge să atingă momentul ovulației, deoarece majoritatea sunt destinate apoptozei, fie ca celule individuale, sau în foliculi (Zărnescu, 2002).
1.3. Perioada de creștere și diferețiere a ovocitelor și dezvoltarea foliculară
Perioada de creștere și diferețiere a ovocitelor (meioză) variază foarte mult ca durată, începând imediat după naștere, ajungând să se întindă ani de zile. Creșterea ovocitului și a celulelor foliculare are loc în paralel (Fig. 1).
Ovocitele în diploten, care au suferit recombinarea ADN, sunt mai mari decât ovogoniile și au mai multe organite citoplasmatice. În momentul inițierii meiozei, ovocitele din regiunea medulară a ovarului pierd punțile intercelulare și sunt înconjurate de un strat de celule foliculare aplatizate așezate pe o membrană bazală fină. Acest stadiu timpuriu al dezvolormarea embrionului din discoidal în tubular. În cursul acestei transformări, o parte din sacul vitelin va fi încorporat în intestinul primitiv nou-format, ceea ce demonstrează că celulele germinale primordiale sunt transportate pasiv din regiunea extraembrionară în corpul embrionului. Celulele germinale se deplasează prin mișcări amiboidale, dependente de eliberarea unor substanțe chemoatractante, neidentificate, din primordia gonadei (Zărnescu, 2002).
Odată ajunse la ovar, celulele germinale primordiale își pierd mobilitatea, devin sferice și conțin puține organite. Aceste celule sunt cunoscute sub denumirea de ovogonii (Zărnescu, 2002).
1.2. Perioada germinativă (de înmulțire, mitoză) se desfășoară în timpul vieții embrionare, având ca punct de plecare ovogoniile (celule stem) din ovarul embrionar care se divid mitotic și sunt conectate prin punți intercelulare. Dimensiunea ovogoniei este de 15 – 20 μm, are o formă sferică sau ovoidă și o structură reprezentată printr-un nucleu veziculos, nucleolat și citoplasmă, în care se găsesc aparatul Golgi, mitocondrii, ribozomi și reticulul endoplasmatic (Cornilă, 2000).
În perioada embrio-fetală, în ovar se formează prin mitoze repetate întreaga rezervă de celule sexuale ale femelei pentru toată viața (60.000- 100.000 ovocite de ordinul I). Activitatea mitotică a ovogoniilor încetează înainte sau la scurt timp după naștere, împiedicând astfel înlocuirea ovocitelor pierdute. Ovocitele de ordinul I (ovocytus primarius) rămân în stare latentă biologică (status quiescent) până la pubertate, fiind blocate în profaza diviziunii meiotice (reducționale).
Doar o mică parte a populației de celule germinale originare supraviețuiește, un număr și mai mic ajunge să atingă momentul ovulației, deoarece majoritatea sunt destinate apoptozei, fie ca celule individuale, sau în foliculi (Zărnescu, 2002).
1.3. Perioada de creștere și diferețiere a ovocitelor și dezvoltarea foliculară
Perioada de creștere și diferețiere a ovocitelor (meioză) variază foarte mult ca durată, începând imediat după naștere, ajungând să se întindă ani de zile. Creșterea ovocitului și a celulelor foliculare are loc în paralel (Fig. 1).
Ovocitele în diploten, care au suferit recombinarea ADN, sunt mai mari decât ovogoniile și au mai multe organite citoplasmatice. În momentul inițierii meiozei, ovocitele din regiunea medulară a ovarului pierd punțile intercelulare și sunt înconjurate de un strat de celule foliculare aplatizate așezate pe o membrană bazală fină. Acest stadiu timpuriu al dezvoltării foliculare este denumit folicul primordial. Toate ovocitele care nu sunt înconjurate de celule foliculare suferă apoptoza.
Ulterior, în cursul dezvoltării fetale se formează foliculul primar, în care celulele foliculare alcătuiesc un strat complet în jurul ovocitului. Celulele foliculare și ovocitul formează microvili conectați prin joncțiuni "gap", ceea ce permite trecerea substanțelor cu greutate moleculară mică de la o celulă la alta. În momentul în care stratul de celule foliculare periovocitare este complet, începe formarea zonei pellucida.
Stadiile timpurii ale dezvoltării foliculului primar (până la câteva straturi de celule foliculare) au loc fără intervenția hormonilor sexuali. Dincolo de acest stadiu, diferențierea foliculilor mamalieni depinde de acțiunea hormonilor asupra celulelor foliculare. Morfologia foliculilor pre-antrali este comparabilă la toate speciile.
Următorul stadiu al dezvoltării foliculare implică formarea printre celulele foliculare a unei cavități pline cu lichid, numite antrum sau cavitate foliculară. Faza de creștere a ovocitelor primare de ordinul I are loc la nivelul foliculului ovarian cavitar (folicul secundar).
Lichidul folicular este format inițial de secrețiile celulelor granuloasei – proteoglicani – însă mai târziu cea mai mare parte provine din capilare. Foliculul matur conține lichid folicular asemănător plasmei sangvine, dar cu o concentrație mai mică de fibrinogen, un pH ușor mai scăzut și un profil steroidic care poate fluctua cu starea metabolică a foliculului. Celulele granuloasei exprimă receptori pentru FSH, cele din granuloasa murală din jurul antrumului conținând în stadiile târzii receptori pentru LH, iar cele din cumulus oophorus și coroana radiata rămânând active din punct de vedere mitotic fără să exprime receptori LH.
În momentul în care s-a format antrumul, foliculul este cunoscut sub denumirea de folicul secundar, însă ovocitul din interiorul lui este încă un ovocit primar, ce rămâne blocat în diploten. Foliculul secundar este înconjurat de teaca foliculară (țesut ovarian modificat) care se diferențiază ulterior în: teaca internă, glandulară și bogat vascularizată și teaca externă ce păstrează caracteristicile țesutului conjunctiv.
Foliculii preantrali au o morfologie asemănătoare la diferitele specii de mamifere, în timp ce foliculii antrali variază considerabil în diametrul ovocitului și numărul de celule ale granuloasei. De asemenea, timpul necesar pentru încheierea foliculogenezei este specific de specie fiind condiționat de prezența FSH și estrogen produs de celulele foliculare.
Controlul hormonal al diferențierii foliculului secundar este complex. Atunci când sunt stimulate de LH, celulele tecii interne produc testosteron, care traversează membrana dintre granuloasă și teaca internă (membrana Slavjanski) spre celulele granuloasei care conțin receptori pentru FSH și un sistem de generare a AMPc, important în stimularea conversiei enzimatice a testosteronului în estradiol. În plus, estradiolul intră în nucleii celulelor foliculare și stimulează transcrierea receptorilor LH. Foliculul stimulat hormonal crește rapid și este cunoscut sub denumirea de folicul terțiar (folicul de Graaf). Creșterea cantității de lichid folicular determină localizarea lui sub epiteliul ovarian.
În folicul, ovocitele suferă o perioadă de creștere, care le permite să devină fertile. În timpul fazei de creștere ele capătă o organizare citoplasmatică complexă, dependentă atât de sinteza unor produși și organite, cât și de redistribuirea celor existente. Fidelitatea replicării organitelor citoplasmatice în timpul ovogenezei, în special mitocondrii și ADN, este crucială deoarece zigotul moștenește citoplasma ovulului (Zărnescu, 2002).
Fig. 1. Stadiile foliculare pe parcursul ciclului ovarian (după Parrish, 2013).
1.4. Perioda de maturare ovocitară
Începe la pubertatea animalului și este caracterizată prin formarea foliculilor maturi ovulatori și a ovulației. Cuprinde două diviziuni de maturare:
a. Prima de diviziune meiotică (reducțională), din ovocitul de ordinul I rezultând două celule inegale: una de talie mare (haploidă) – ovocitul de ordinul II și alta de talie mică, cu citoplasmă săracă, situată sub zona pellucida – primul globul polar, ce se poate divide. În funcție de specie, această diviziune poate avea loc înainte sau după ovulație. La cățea ovulația precede eliberarea primului globul polar.
În decursul fazei de maturație intervin hormonii gonadotropi: FSH pentru maturarea foliculară și LH pentru ovulație.
b. A doua diviziune meiotică (ecvațională), din ovocitul de ordinul II (ovocitul secundar) rezultând ovocitul matur (ovulul) și al doilea globul polar. Această diviziune are loc în oviduct (stadiul tubar), după dehiscența foliculară. Acest proces are loc numai în cazul fecundației. În acest fel, la sfârșitul periodei de maturare, dintr-un ovocit, rezultă un ovocit cu set haploid de cromozomi și trei globuli polari, dintre care unul degenerează.
Dehiscența (ruperea) foliculară și eliberarea ovocitelor are loc în momentul în care ovocitul primar (ovocitul de ordinul I) își formează fusul de diviziune, intrând în prima diviziune de maturare (meiotică), astfel că pavilionul oviductului captează deja ovocitul secundar (ovocitul de ordinul II). Posibilitățile de supraviețuire ale ovocitului secundar (ovocitul de ordinul II) sunt de 24 – 48 de ore, iar a doua diviziune de maturare se realizează numai dacă a avut loc penetrarea zonei pellucide de către spermatozoid. În caz contrar, ovocitul de ordinul II (secundar) rămâne blocat în metafaza celei de-a doua diviziuni de maturare.
În momentul dehiscenței, ovocitul secundar este înconjurat de oolemă, zona pellucida și corona radiata.
Oolema este o membrană plasmatică cu numeroși microvili.
Zona pellucida este o matrice extracelulară mucopolizaharidică, traversată de microvili lungi ai celulelor foliculare ce ajung la microvilii ovolemei.
Corona radiata este formată din 1-2 rânduri de celule foliculare. Se află imediat după zona pelucida (Cornilă, 2000).
1.5. Morfologia ovocitului matur
Ovocitul matur reprezintă celula sexuală femelă matură, haploidă, cu o formă sferică și un diametru de până la 200 μm. Comparativ cu celulele somatice rămân cele mai mari celule ale corpului datorită citoplasmei abundente. Ovocitul conține, pe lângă materialul genetic, și material nutritiv, molecule stocate și organite necesare pentru perioada de dezvoltare preimplantațională. Ovocitul acumulează apă, ioni și lipide, în timp ce viteza sintezei proteice și conținutul proteic total sunt mari.
Organitele citoplasmatice devin mai abundente în timpul creșterii ovocitare, cu excepția centriolilor care dispar la mijlocul stadiului de creștere. Inițial numeroase organite mici sunt grupate în jurul nucleului, la nivelul corpului Balbiani, iar odată cu creșterea ovocitului se dispersează către periferia celulei.
A. Nucleul celulei este sferic, situat central sau excentric și delimitat de o membrană dublă cu pori, al căror număr este corelat cu stadiile funcționale ale celulei. Lumenul porului este prevăzut cu un material electronodens, ce intervine selectiv în reglarea tranzitului nucleocitoplasmatic. Prin porii membranei nucleare trec în citoplasmă granule electronodense de 350 Ǻ (Cornilă, 2000).
B. Citoplasma ovocitului (ooplasma) este acidofilă și fin granulară. Conține, pe lângă organitele comune, aglomerate în zona perinucleară, ARN liber și proteine.
Complexul Golgi se extinde și în zona corticală a citoplasmei, unde este participă la formarea granulelor corticale, înconjurate de membrane. Complexul Golgi participă activ la exportul glicoproteinelor zonei pellucida și la sinteza lipidelor, procese în care sunt implicate și mitocondriile.
Granulele corticale sunt structuri retractile, sferice, ce măsoară 300-500 nm în diametru și conțin miez electronodens înconjurat de o membrană. La maturitate sunt prezente ~5000 de granule corticale localizate sub oolemă.
Reticulul endoplasmatic neted și rugos sunt prezente pe tot parcursul ovogenezei. Primul este de tip neted cu elemente dispuse lax, rar, iar al doilea devine mai puțin evident în ovocitul matur. Pe măsura creșterii ovocitare, reticulul endoplasmatic se localizează progresiv la periferia celulei și poate fi implicat în eliberarea calciului în momentul exocitozei granulelor corticale.
Ribozomii sunt liberi sau atașați de reticulul endoplasmatic rugos. Numărul lor se multiplică (108), însă poliribozomii sunt rari.
Mitocondriile sunt inițial alungite, cu numeroase criste orientate transversal, însă în timpul creșterii ovocitare devin sferice, vacuolizate, cu criste mai puține și dispuse concentric, alcătuind o coroană perinucleară incompletă, aspect care indică o activitate redusă.
Endocitoza (pinocitoza) are loc în toate stadiile ovogenezei și este indicată de prezența în ooplasmă a numeroase vezicule membranare, lizozomi primari, corpi multiveziculari și corpi cristalini, majoritatea reprezentând produși transportați prin membrana celulară.
Sinteza și preluarea macromoleculelor în ovocit sunt necesare pentru creșterea, dezvoltarea și maturarea ovocitului și pentru stocarea informației necesare în primele 24 de ore ale dezvoltării embrionare, până când se exprimă genomul embrionar (stadiul de două celule la șoarece, de patru celule la porc și de opt celule la om).
Ovocitul matur conține granule de glicogen, picături lipidice și acumulări proteice.
Acizii ribonucleici – inițial, ovocitul matur conține o cantitate foarte mare de ARN. Deoarece genomul embrionar este activat timpuriu și amplificarea genelor ribozomale nu este necesară, în stadiul de două celule majoritatea ARN stocat a fost degradat sau îndepărtat.
Proteine – ovocitul în creștere este foarte activ în sinteza proteinelor din transcripții nucleari și mitocondriali. Proteinele sunt necesare pentru diferențierea ovocitului, interacția cu celulele somatice înconjurătoare, formarea zonei pellucida, fecundare și dezvoltarea embrionară. Unele proteine detectate în ovocit sunt preluate prin endocitoză din lichidul folicular sau secrețiile granuloasei (Zărnescu, 2002).
C. Oolema ovocitului (membrana plasmatică) este de natură lipoproteică trilaminată și prezintă numeroase prelungiri, sub forma microvililor, care se angrenează cu prelungirile rare și groase ale celulelor foliculare. Se pare că formațiunile microviloase nu sunt permanente, apariția lor fiind legată de stadiul funcțional al celulei. La nivelul oolemei se observă numeroase vezicule de pinocitoză, ceea ce demonstrează schimbul intens de substanțe ce se efectuează între celulele foliculare ale coronei radiata și ovul (Cornilă, 2000).
D. Zona pellucida este o matrice extracelulară, glicoproteică. Glicoproteinele zonei pellucida au fost clasificate în trei familii, ZP1, ZP2 și ZP3, care nu sunt înrudite cu cele existente în mod obișnuit în matricea extracelulară. ZP2 și ZP3 sunt prezente în cantități echimolare și formează filamente, unite între ele prin intermediul unor heterodimeri ZP1.
ZP3 reprezintă receptorul primar pentru spermatozoid și este responsabilă de inducerea reacției acrozomale. ZP2 este receptorul secundar pentru spermatozoid și interacționează cu membrana acrozomală internă.
Prezintă un aspect electronomicroscopic striat, datorat joncțiunilor celulare de tipul „zonulei adherens” care se realizează între microvilii oolemei și cei ai celulele foliculare din corona radiata (Zărnescu, 2002).
1.6. Interacțiile celulare de la nivelul foliculului ovarian
Foliculul ovarian funcționează ca un tot unitar, toate celulele fiind cuplate metabolic prin intermediul joncțiunilor "gap".
Încă din stadiul primordial, ovocitele sunt înconjurate de celule foliculare care produc nu numai factori de creștere și hormoni, dar aprovizionează ovocitul cu nutrienți (ca de exemplu piruvat), precursori metabolici (aminoacizi și nucleotide) și alte molecule mici.
În plus, molecule specifice produse de celulele somatice participă în mecanismul blocării meiotice a ovocitelor.
Relațiile dintre ovocit și celulele granuloasei sunt reciproce: ovocitul influențează proliferarea, morfogeneza și diferențierea acestor celule deoarece secretă un factor solubil care stimulează mitoza lor. Factorul ovocitar afectează enzimele steroidogenezei din celulele granuloasei, pentru a crește secreția de estradiol și a o descrește pe cea de progesteron, într-o manieră dependentă de concentrație.
Îndepărtarea ovocitului are ca rezultat o luteinizare prematură și o secreție crescută de progesteron de către celulele foliculare (Zărnescu, 2002).
1.6.1. Rolul maturării ovocitare în selecția foliculară
Maturarea ovocitară depinde în general de trei componente:
– gonadotropine secretate în sistemul nervos central;
– hormoni/substanțe de inducere a maturării;
– factorul de inducere a maturării (MPF), care este identic la toate eucariotele.
Hormonii gonadotropi sunt secretați de hipofiză și sunt reprezentați de hormonul luteinizant (LH) și hormonul foliculostimulator (FSH). Ambii sunt alcătuiți din două subunități glicoproteice, α și β. FSH este responsabil de creșterea ovocitară, în timp ce LH inițiază maturarea ovocitară prin stimularea celulelor foliculare înconjurătoare să producă un hormon de inducere a maturării.
Hormonul de inducere a maturării (derivat steroidic) interacționează cu un receptor din membrana ovocitului care inițiază prin intermediul proteinelor G o cale de semnalizare ce activează MPF. Activarea MPF reprezintă evenimentul esențial al maturării ovocitare. În timpul ciclului meiotic ovocitar, MPF este activat prima dată în meioza I, inactivat tranzitoriu între meioza I și II și reactivat în meioza II.
MPF este format dintr-o subunitate catalitică (Cdc2) și o subunitate reglatorie (ciclin B). activitatea sa este controlată prin fosforilare. În ovocitele blocate în G2, pre-MPF format din Cdc2 și ciclin B, este menținut în forma inactivă prin fosforilarea Cdc2 pe resturile de treonină 14 și tirozină 15.
Ovocitul mamalian este subordonat față de celulele somatice, în diferite faze ale ciclului celular. Ciclul meiotic al ovocitului este caracterizat prin existența a patru puncte de control:
1) Primul punct de control este impus la scurt timp după intrarea în profaza meiozei I, cand ovocitul primordial este înconjurat de un singur strat de celule foliculare. Ovocitul este incompetent meiotic – dacă este scos din folicul, ovocitul este incapabil să-și continue meioza spontan;
2) Al doilea punct de control apare spre sfârșitul fazei de creștere, în momentul în care ovocitul atinge dimensiunea maximă. Ovocitul devine competent meiotic, dar maturarea lui depinde de mediul somatic înconjurător, respectiv de celulele foliculare. Dacă ovocitul este scos din folicul și plasat într-un mediu de cultură corespunzător, se maturează spontan. Atâta timp cât se află în foliculul ovarian, meioza unui ovocit este blocată;
3) Al treilea punct de control implică primirea unui semnal hormonal reprezentat de LH, care determină continuarea meiozei;
4) Etapa finală este caracterizată de blocarea ovocitului în metafaza meiozei II .
Selecția foliculară
Foliculul dominant, care se va matura, este selectat la sfârșitul fazei luteale a ciclului ovarian, dintr-un grup de foliculi de Graaf. Din punct de vedere morfologic, fiecare folicul din grup conține un ovocit, aproximativ un milion de celule ale granuloasei, o teacă internă formată din câteva rânduri de celule și o bandă de celule musculare netede în teaca externă.
Selecția foliculară este un aspect esențial al fiziologiei ovariene și este caracterizată de o intensă mitoză a celulelor granulosei. La scurt timp după mijlocul fazei luteale, celulele granuloasei din foliculii cu diametrul cuprins între 0,4-0,9 mm, suferă mitoza. Celulele granuloasei continuă să se dividă foarte activ în foliculul selectat, în timp ce mitoza încetinește în ceilalți foliculi din grup.
Selecția foliculară depinde de FSH, care induce mitoza și diferențierea celulelor foliculare. Acestea produc estradiol, inhibin și lichid folicular. Celulele granuloasei sunt singurele care exprimă receptori pentru FSH. În foliculul dominant, acest hormon induce diferențierea celulelor foliculare. Celulele granuloasei din foliculul dominant au capacitatea de a se divide rapid pe tot parcursul fazei foliculare, numărul celulelor crescând de la 1×106 în momentul selecției la 50×106 la ovulație. Deși detaliile moleculare sunt incomplet înțelese, există dovezi că FSH stimulează diviziunea celulelor granuloasei in vivo și in vitro.
În prezența LH loc producerea de acid hialuronic, care determină expansiunea cumulusului oophorus și dispariția joncțiunilor "gap" dintre cumulus și ovocit. Pierderea comunicării intercelulare inițiază continuarea meiozei.
De asemenea, LH și FSH pot induce în celulele granuloasei producerea de inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3) liber și ioni de calciu. Transferul acestor compuși prin joncțiunile "gap" în ovocit ar putea mobiliza stocurile intraovocitare de calciu și ar conduce la activarea fosfodiesterazei. Activarea pre-MPF de către Cdc2 este suficientă pentru inducerea dezorganizării nucleului, însă pentru continuarea evenimentelor maturării, de tipul condensării cromozomilor și formării fusului de diviziune, este necesară activarea MPF prin activarea traducerii ARN ciclin B (Zărnescu, 2002).
1.7. Ovulația și formarea corpului galben
Ovulația reprezintă procesul de expulzie a ovocitului matur din ovar, după separarea foliculară și formarea unui orificiu prin care este eliberat gametul femel.
În timpul separării foliculare, microvilii ovocitari și foliculari se retrag, formând un spațiu larg între ovocit și granuloasă. S-au sugerat două mecanisme pentru expulzia ovocitului: a) creșterea presiunii intrafoliculare; b) acțiunea elementelor contractile ale foliculului. Prostaglandinele joacă un rol important în ovulație prin stimularea contracției foliculare.
Celulele foliculare rămase după expulzia ovocitului formează corpul galben sau luteal. Acesta reprezintă o glandă endocrină tranzitorie, care se formează în ovar după ovulație și secretă progesteron, esențial pentru menținerea gestației. În general, numărul de corpi galbeni este egal cu cel al foliculilor care au suferit ovulația. Progesteronul secretat de corpul galben acționează asupra uterului pregatindu-l pentru implantare și asupra centrilor nervoși superiori, pentru a împiedica ovulațiile ulterioare. Durata ciclurilor reproducătoare (perioada de timp de la o ovulație la alta) este dictată, în parte, de durata de viață a corpului galben. Dacă fecundarea nu are loc, corpul galben nu mai produce progesteron si regresează, transformându-se în corp alb.
LH și gonadotropina corionică activează cascada ovulatorie în foliculul dominant, proces ce depinde de exprimarea unui număr mare de receptori pentru LH pe celulele granuloasei.
LH inițiază modificări în metabolismul steriozilor și eicosanoizilor din celulele granuloasei foliculului dominant. Concomitent, crește concentrația locală de prostaglandine, lipoxine, kinin, factor activator plachetar și a altor agenți vasoactivi, determinând dilatarea capilarelor din teaca internă. Volumul vascular al ovarului crește astfel de patru ori. În același timp cu hiperemia, crește și permeabilitatea capilarelor pentru proteinele serice, care se acumulează în spațiile interstițiale, într-o manieră caracteristică țesuturilor inflamate. Preoteinele serice stimulează fibroblastele din teaca externă și albuginee să prolifereze. Fibroblastele activate încep să secrete metaloproteinaze, care degradează matricea extracelulară a peretelui folicular. În absența matricei extracelulare și datorită creșterii presiunii intrafoliculare, peretele folicular se rupe.
Semnalul endocrin ce induce ovulația (hormonul luteinizant) determină ruperea foliculului ovarian și diferențierea celulelor foliculare în celule luteale. Tranziția țesutului folicular în cel luteal este un proces dinamic, ce include diferențiere, migrare și proliferare celulară. După ovulație, membrana bazală este degradată, astfel încât celulele tecii interne și capilarele asociate invadează granuloasa avasculară. Se formează astfel corpul galben, alcătuit dintr-o populație heterogenă de celule, care diferă morfologic, fiziologic și biochimic. La canide, teaca internă invadează foliculul înaintea ovulației, concomitent cu producerea progesteronului, sugerând că luteinizarea precede ovulația. Celulele tecii interne și ale granuloasei se diferențiază în tipuri celulare diferite – celule luteale mici și mari – ambele producătoare de progesteron. Celulele luteale mari (≥20 µm) derivă predominant din granuloasă, în timp ce celulele luteale mici (<20 µm) derivă din teaca internă. Celulele luteale mari secretă mai mult progesteron decât cele mici, însă celulele luteale mici răspund mai bine la hormonul luteinizant, necesar pentru menținerea corpului galben și creșterea sintezei de progesteron.
În afară de celulele producătoare de progesteron, corpul galben mai conține celule endoteliale, pericite și fibroblaste. O caracteristică a dezvoltării luteale timpurii este viteza rapidă de proliferare celulară, în principal a celulelor endoteliale, asociată cu mitoza țesutului folicular.
Factorii implicați în reglarea proliferării celulelor luteale mici și a fibroblastelor sunt FGF (factor de creștere fibroblastic), hormoni de creștere și LH.
Luteoliza reprezintă degradarea corpului galben și transformarea lui în corp alb, alcătuit din țesut fibros cicatriceal. În timpul luteolizei au loc două evenimente: (1) pierderea capacității de a sintetiza progesteron; (2) degenerarea celulelor ce alcătuiesc corpul galben (Zărnescu, 2002).
1.8. Atrezia foliculară
În ovar, apoptoza poate afecta diferite tipuri de celule: celulele germinale (ovogonii sau ovocite), celulele granuloasei, celule tecale, celule endoteliale și luteale. Atrezia foliculară este un eveniment fiziologic major al funcției ovariene.
În cursul ovogenezei, celulele germinale suferă apoptoza în trei momente diferite: prima dată ovogoniile mitotice, apoi ovocitele în pachiten și diploten, din profaza meiozei I.
În fiecare ciclu ovarian, 6-12 foliculi încep dezvoltarea foliculară, însă aceasta este completă doar în foliculul dominant. Ovulația este condiționată de prezența LH și secreția de FSH. Hormonul luteinizant inițiază faza luteală a ciclului ovarian, inducând celulele granuloasei să secrete progesteron și blocând secreția de estrogen. Foliculii rămași suferă atrezia, cel mai frecvent în ultimul stadiu al dezvoltării foliculare. Atrezia foliculară se caracterizează prin fragmentarea ADN și morfologie specifică celulelor somatice în apoptoză, însă pot exista și aspecte particulare.
Foliculii pot deveni atretici în orice stadiu, insă cel mai frecvent acest proces are loc la începutul formării antrumului. În foliculii primordiali, degenerarea ovocitelor precede modificările observate în granuloasă. În acest caz, are loc liza ovocitului și fagocitarea lui de către celulele granuloasei.
Evenimentele morfologice care apar în ovocit și granuloasa foliculilor antrali pot fi simultane sau independente.
Modificările majore ale ovocitului cuprind: contracția citoplasmei, pierderea microvililor ovocitari și foliculari, vacuolizarea zonei pellucida, creșterea granulațiilor citoplasmatice, dezorganizarea nucleului, aranjarea cromozomilor în metafază, fuziunea cromozomilor și uneori eliberarea unui globul polar
În celulele granuloasei, începutul atreziei este caracterizat prin prezența nucleilor picnotici, formarea de corpi apoptotici, apariția de picături lipidice și enzime lizozomale în citoplasmă.
Atrezia foliculară poate fi indusă și de o serie de factori externi, de tipul radiațiilor ionizante, agenți chimioterapeutici sau poluanți (Zărnescu, 2002).
CAPITOLUL II
PARTICULARITĂȚI ALE DEZVOLTĂRII OVOCITARE LA CANIDE
2.1. Aspecte endocrine ale ciclului estral la cățea
Canidele (Canis familiaris) constituie o specie monoestrală, poliovulatorie, nesezonieră. Ciclul lor este împărțit în 3 faze:
1) Perioada de călduri, ce include proestru (3 – 20 de zile, cățeaua nu acceptă monta) și estru (1 – 10 zile, cățeaua acceptă monta);
2) Diestru (2 luni, se mai numește metestru, corespunde pseudogestației sau gestației cu secreție de progesteron de către corpul galben);
3) Anestru (3 – 9 luni).
Endocrinologia pe parcursul ciclului este neobișnuită la această specie. În timpul proestrului, concentrația de estradiol crește progresiv. Pe perioada estrului, raportul dintre estradiol și progesteron se modifică. Estradiolul scade la începutul estrului, în timp ce progesteronul începe să crească, atingând momentul peak-ului de LH cu câteva zile înainte de ovulație (Fig. 2). Înspre sfârșitul proestrului, LH-ul stimulează creșterea rapidă în dimensiuni a foliculilor maturi. Această luteinizare preovulatorie, cu un nivel al progesteronului între 5 și 7 ng/ml la momentul ovulației, este tipic cățelei. Ca o consecință, ovocitele prezente în foliculii preovulatori sunt expuse la creșterea nivelului de progesteron înainte de ovulație, care apare spontan la 1-3 zile după peak-ul de LH (Reynaud și colab., 2004).
Comportamentul estral și ovulația apar în prezența unui nivel în declin a estrogenului circulant, și a progesteronului semnificativ crescut. Durata de persistență a corpului galben este de aproximativ 2 luni, indiferent dacă femela este gestantă sau nu. Luteoliza este urmată de o perioadă deosebit de lungă de inactivitate ovariană cu un nivel minim al concentrației de progesteron (Reynaud și colab., 2004) (Fig. 3). De la mijlocul anestrului până la sfârșitul lui, crește secreția hormonului de eliberare a gonadotropinelor (GnRH) la nivel hipotalamic, determinând o creștere a nivelului plasmatic de hormon foliculo-stimulator (FSH) și o eliberare episodică de LH. FSH-ul joacă un rol crucial în inițierea foliculogenezei și în debutul proestrului la cățea (Beijerink și colab., 2004).
Fig. 2. Modificări hormonale la cățeaua negestantă: anestru, proestru, estru (după Parrish, 2013).
Fig. 3. Modificări hormonale la cățeaua negestantă: metestru (după Parrish, 2013).
2.2. Caracteristici particulare ale foliculogenezei și ale ovocitului
Informațiile privind dezvoltarea foliculară la cățea sunt destul de sumare. Formarea ovogoniei poate fi observată în fetusul de canide în jurul zilei 42 de gestație.
Foliculii de canide pot fi împărțiți în 5 clase în funcție de morfologie, dimensiune, tipul și numărul de straturi de celule foliculare și de prezența și cantitatea lichidului folicular (Tabel 1, Fig. 4).
Tabel 1. Clasificarea și diametrul foliculilor în corelație cu vârsta fetală.
(după Songsasen și Wildt, 2007)
Foliculii primordiali se formează din ziua 17 până în ziua 54 după naștere și conțin ovocite mici (aproximativ 25 μm diametru) cu un singur strat de celule în granuloasă, dar fără zona pellucida în acest stadiu. Interconexiunea dintre ovocit și celulele foliculare este incomplet stabilită (Blackmore și colab., 2004).
Foliculii primari sau preantrali timpurii apar în jurul vârstei de 120 de zile după naștere și conțin ovocite mici, pale (78 ± 15 μm) cu zona pellucida distinctă. Dimensiunile foliculilor primordiali și primari nu sunt semnificativ diferite unele de celelalte, dar cresc în timpul transformării în foliculi secundari și terțiari. Aceste modificări au loc atât datorită proliferării și diferențierii celulelor foliculare, cât și creșterii ovocitelor și zonei pellucida (Barber și colab., 2001).
Fig 4. Stadiile de dezvoltare a foliculului ovarian (cățea de 16 săptămâni):
a) Foliculi primordiali; b) Foliculi primari; c) Foliculi secundari; d) Foliculi preantrali;
e) Foliculi antrali; f) Mai multe ovocite într-un singur folicul. Nu s-au găsit corpi galbeni, ceea ce denotă faptul că ovulația nu a avut încă loc la acest animal. Colorație hematoxilină-eozină. Bara = 50 μm. (după Blackmore și colab., 2004)
Citoplasma ovocitelor este granulară, conține reticul endoplasmatic neted, aparat Golgi dezvoltat și mai multe mitocondrii mari, rotunde. Picăturile lipidice apar prima dată în ovocitul primar al foliculilor în creștere. Pe parcursul întregului proces de ovogeneză ovocitul continuă să crească în dimensiuni și conține un număr tot mai mare de lipide, ceea ce îi conferă un aspect întunecat, semnificativ diferit față de alte specii de mamifere necarnivore. Până în prezent, nu este clar în ce mod influențează această cantitate mare de lipide intracelulare maturarea și dezvoltarea ovocitului de canide. Deși contactul dintre ovocit și celulele granuloasei este evident în acest moment, cele două membrane nu sunt fuzionate. Precursorii lipidelor sunt transportați din celulele foliculare prin zona pellucida. La câini din rase diferite, analiza lipidelor totale extrase din ovocite a arătat că lipidele intracelulare includ grăsimi saturate, trigliceride, colesterol, fosfolipide și glicolipide. În plus, tipurile și cantitățile fracțiilor lipidice sunt constante atât la indivizi din aceeași rasă, cât și din rase diferite (Durrant și colab., 1998).
Zona pellucida începe să se formeze la ovocitul din foliculul primar și devine mai evidentă odată cu creșterea celulei. La cățea, zona pellucida se caracterizează printr-o rețea fibroasă cu numeroase ochiuri de dimensiune intermediară (Fig. 5) (Ström Holst și colab., 2000). Grosimea zonei pellucida la un ovocit dezvoltat complet este de ≈10 μm, ce reprezintă doar două treimi din cea a ovocitului unui alt carnivor comun, pisica (Barber și colab., 2001).
Zona pellucida este ușor vizibilă în ovocitele din foliculii secundari în dezvoltare, dar este mai mică în foliculii primari și complet absentă în cei primordiali. Există glucide specie-specifice în zona pellucida și în celulele în care ea iși are originea. Spre deosebire de zona pellucida de la șoarece, care este sintetizată exclusiv de către ovocit, proteinele zonei pellucida la canide își au originea atât în celulele granuloasei, cât și în ovocit, și sunt sintetizate și exprimate într-un mod secvențial (Blackmore și colab., 2004).
În plus, expresia genei ZP3 la ovocitele de câine este dependentă de numărul de straturi de celule foliculare ce alcătuiesc cumulusul oophorus ce înconjoară ovocitul. Ovocitele cu un strat de celule de cumulus nu prezintă deloc (sau aproape deloc) transcripția ZP3 în timpul culturii in vitro, și ca o coincidență, nici una dintre aceste ovocite nu este capabilă să finalizeze maturarea nucleară in vitro. La ovocitele cu două sau mai multe straturi de celule de cumulus are loc o creștere în expresia genei ZP3, cu vârful transcrierii lui ZP3 la 24–48 de ore de cultură. Ovocitele înconjurate de mai mult de două straturi de celule de cumulus finalizează maturarea nucleară cu o frecvență mai mare decât cele înconjurate de mai puține straturi . Acest lucru sugerează că celulele de cumulus joacă un rol crucial în modularea maturării nucleare a ovocitului (Songsasen și colab., 2009)
Foliculii secundari sau preantrali avansați conțin ovocite cu un diametru mai mare de 100 μm, care prezintă lipide citoplasmatice de culoare închisă. Sinteza de lichid folicular apare la foliculii terțiari sau antrali timpurii care pot fi observați din ziua 120 până în ziua 160 după naștere (Barber și colab., 2001).
Fig. 5. Ovocit de cățea. (a) imagine panoramică; (b) zona pellucida. Microscop electronic cu scanare. Bara=10 µm. (după Ström Holst, 2000)
Astfel, timpul necesar pentru dezvoltarea foliculilor primordiali la foliculi antrali timpurii este în medie de 110 zile atât la cățelele prepubere, cât și la cele adulte. Foliculii antrali avansați sunt prezenți chiar la cățele tinere, de 6 luni, la mijlocul proestrului (Concannon și colab., 1989).
Mitocondriile sunt prezente în număr crescând pe întreaga perioadă de creștere a ovocitului, reflectând o creștere normală în activitatea metabolică.
Ca urmare a nivelului crescut de LH, foliculii antrali avansați cresc rapid și devin foliculi preovulatori de 4–13 mm (Concannon și colab., 1989), iar ovulația are loc aproximativ 48 de ore mai târziu.
Vârsta cățelei influențează semnificativ numărul de foliculi din ovar. Ovarele de cățele peripubere (în vârstă de 6–10 luni) conțin semnificativ mai mulți foliculi decât cele prepubere (mai mici de 6 luni) și decât cele mature (mai mari de 10 luni). Dezvoltarea foliculilor cu diametrul > 100 μm nu apare decât cu puțin înainte de primul ciclu. Numărul de foliculi scade de la ≈ 85 000 la cățelele de 1–2 ani, la numai 3 000 la cele de 7–11 ani. Prin urmare, există o creștere marcantă a atreziei foliculare înainte de primul estru și apoi urmează o pierdere continuă în viabilitate pentru prima decadă din viață (McDougall și col., 1997).
O caracteristică specifică a biologiei gameților la canide este faptul că rata de producere a foliculilor poliovulatori este neobișnuit de mare comparativ cu alte specii (11% din canide produc mai mult de un ovocit/folicul). Astfel, rata este de 4% la felide, 3% la specia umană și 2% la maimuta rhesus. Cauza și semnificația ratei de producere a foliculilor poliovulatori rămâne neclară. Ea poate rezulta dintr-o densitate mai mare a foliculilor primordiali aflați în structura cortexului ovarian al cățelelor tinere, astfel încât unii foliculi fuzionează de fapt cu cei adiacenți (Luvoni și colab., 2005). Foliculii poliovulatori nu apar decât puțin înainte de primul estru, și numărul lor în ovar nu este influențat de vârsta cățelei (McDougall și colab., 1997). Interesant este faptul că ovocitele din același folicul fi pot în stadii diferite de dezvoltare sau, simultan, una poate fi viabilă în timp ce cealaltă este atretică (Barber și colab., 2001).
Cei mai mulți foliculi în creștere suferă atrezia înainte de a ajunge în stadiul preovulator.
Foliculii secundari (sau foliculii preantrali avansați) prezintă două tipuri de modele de regresie: (1) degenerescența se caracterizează prin modificări necrotice ale ovocitelor și ale zonei pelucida; (2) implică necroza celulelor granuloasei.
Degenerescența foliculară de tipul (2) duce la formarea unui pseudoantrum, o structură similară cu cea întâlnită într-un folicul terțiar. Condensarea cromozomilor și plierea membranei nucleare a ovocitului este un indicator al atreziei la foliculii în creștere. Acest lucru este important pentru evaluarea corectă a calității ovocitului. În timpul recuperării ovocitelor din ovarele de canide prelevate chirurgical, observarea unui număr mare de celule în stadiul de dezorganizare a veziculei germinale reprezintă în realitate o incidență deosebit de mare a proceselor degenerative, mai degrabă decât o reluare reală a meiozei (Bolamba și colab., 2002).
Maturarea ovocitară la cățea in vivo și in vitro
2.3.1. Maturarea ovocitelor de cățea in vivo
La cățea, maturarea ovocitară este foarte diferită comparativ cu alte specii (șoarece, bovine, porcine, ovine, feline, etc.). La marea majoritate a mamiferelor, maturarea nucleară are loc în foliculii preovulatori și ovocitele sunt ovulate în stadiul de metafază II când sunt deja apte pentru fecundație. La cățea însă, ovocitele sunt ovulate în stadiul imatur de veziculă germinală și ating stadiul MII după mai mult sau mai puțin de 48 de ore petrecute în oviduct (Saint-Dizier și colab., 2001a).
La această specie ovulația poate să apară începând cu 2 zile înainte de debutul estrului și până în ziua a 7-a de estru. Majoritatea cățelelor ovulează cu trei zile înainte de a se observa receptivitatea sexuală.
O caracteristică distinctivă a reproducerii la cățea este aceea că ovocitele sunt la debutul primei diviziuni meiotice la momentul ovulației (Fig. 6). Foliculii preovulatori (4 – 13 mm) eliberează ovocite (118 – 135 μm diametru) în oviduct, unde se petrece stadiul de dezorganizare a veziculei germinative în următoarele 48 de ore. Nici rasa, nici vârsta cățelei nu influențează cinetica maturării ovocitelor de cățea. Maturarea nucleară este completă în 48 – 72 de ore după ovulație, în prezența unui nivel ridicat de progesteron circulant, când ovocitul ajunge în porțiunea mijlocie a oviductului (Reynaud și colab., 2005).
O analiză a ovocitelor/embrionilor recoltați între 17 și 138 de ore post-ovulație a demonstrat că primul ovocit în metafaza a II-a a fost observat la 54 de ore după ce ovocitele au fost eliberate din folicul (Reynaud și colab., 2005). La ovocite mature din oviduct a fost observată expansiunea cumulusului, dar stratul cel mai intim al coronei radiata rămâne atașat de ovocit după fecundație și pe parcursul dezvoltării embrionare, până la stadiul de morulă.
Ovocitele de canide fecundate rămân în oviduct timp de 9 – 10 zile, iar embrionii ajung în uter abia în stadiul de morulă (Renton și colab., 1991), deci cu 3 – 5 zile mai târziu decât la pisică, vacă și șoarece.
Deoarece împerecherea nu poate avea loc mai devreme de 3 zile înainte de la ovulație (Renton și colab., 1991), ovocitul de cățea imatur și spermatozoidul se întâlnesc în oviduct. Penetrarea spermatozoidului poate fi implicată în inducerea maturării nucleare, respectiv în reluarea meiozei (Saint-Dizier și colab., 2001a,b). Studiile in vivo au raportat faptul că fecundația nu are loc decât la 44 – 120 de ore după ovulație, când ovocitul și-a finalizat maturarea (Reynaud și colab., 2005).
Aceste observații in vivo le contrazic pe cele efectuate in vitro. Mahi și Yanagimachi (1976) au demonstrat că penetrarea zonei pellucida de către spermatozoid nu este o condiție pentru maturarea ovocitului de cățea și că aceasta precede decondensarea nucleului. În schimb, Saint-Dizier și colab. (2001a) au raportat faptul că ovocitele de cățea penetrate de către spermatozoizi in vitro iși reiau meioza și se dezvoltă mai departe de stadiul MI într-o proporție mai mare decât cele aflate în mediu fără spermatozoizi.
Fig. 6. Etapele principale ale meiozei la canide în comparație cu majoritatea animalelor domestice. (după Christensen, 2011)
Până în prezent nu există nici o explicație clară pentru discrepanța dintre observațiile in vivo, comparativ cu cele in vitro. Este cunoscut faptul că celulele oviductale pot menține longevitatea spermatozoizilor de câine prin inhibarea fluxului de calciu care, la rândul său, previne capacitarea spermatozoizilor (Kawakami și colab., 2001). În plus, spermatozoizii de câine rămân viabili in vivo timp de 11 zile după împerechere. Pe baza acestor observații, discrepanța dintre studiile in vivo și in vitro pare să fie legată mai degrabă de capacitarea întârziată a spermatozoizilor în oviduct, decât de incapacitatea ovocitelor de a fi fecundate.
Există desigur studii privind modificările structurale și biochimice în timpul maturării ovocitului de cățea care semnalează faptul că ovocitele de cățea suferă modificări ale citoscheletului similare celor observate la alte specii de mamifere (Velilla și colab., 2005).
Ovocitele în stadiul de veziculă germinativă conțin o mare varietate de microtubului subcorticali și tubuline perinucleare. Cu toate acestea, nu este detectată nici o rețea bine organizată de microtubuli în acest stadiu de dezvoltare. La ovocitele în stadiul de dezorganizare a veziculei germinative, apare o rețea clară de microtubuli, și în ooplasmă sunt vizibile fibre încrucișate de tubulină. În stadiul MI, cromozomii sunt foarte compactați, și microtubulii sunt restrânși pe axul meiotic (Saint-Dizier și colab., 2004).
Există, de asemenea, informații privind controlul ciclului celular la ovocitele de canide ce au demonstrat că activarea factorului de promovare a fazei M (MPF) și a protein-kinazei activatoare mitogene (MAPK) este dependentă de stadiul meiotic (Saint-Dizier și colab., 2004). Activitatea kinazei este minimă la ovocitele în stadiul de veziculă germinativă și stadiul de dezorganizare a veziculei germinative, și crește semnificativ când ovocitele se dezvoltă la stadiile MI și MII. Celulele din cumulus oophorus controlează activarea MAPK și fosforilarea: ovocitele înconjurate complet de mai multe straturi de celule de cumulus prezintă activități mai intense ale MAPK decât cele înconjurate numai de corona radiata. Din nou, această observație confirmă rolul semnificativ pe care îl au celulele din cumulus în reglarea dezvoltării și maturării ovocitelor de canide. (Songsasen și Wildt, 2007; Pereira și colab., 2012)
2.3.2. Maturarea ovocitelor de cățea in vitro
Maturarea și fecundarea ovocitelor in vivo sunt fenomene particulare la specia canidă. Cățeaua eliberează în momentul ovulației ovocite imature în stadiul de veziculă germinală, fiind necesare 48 de ore pentru a ajunge la maturitate (Silva și colab., 2003). Intervalele de timp raportate pentru IVM a ovocitelor de cățea variază enorm (în jurul a 120 de ore), iar rezultatele pentru maturarea completă sunt încă controversate și nesatisfăcătoare. Deci, aprecierea reluării meiozei este de importanță majoră pentru evaluarea maturării nucleare pe toată perioada de cultivare in vitro (Luvoni și colab., 2003).
Mediul tubar joacă un rol important în maturarea ovocitară la canide. Spre deosebire de alte specii, la canide oviductul este responsabil pentru menținerea și supraviețuirea ovocitelor imature pe perioada în care acestea se dezvoltă, sunt fecundate și ajung în stadiul de blastocist (Luvoni și colab., 2005), ceea ce sugerează că în cazul maturării in vitro mediile de cultură trebuie să reproducă compoziția acestui mediu de tranziție tubar.
Ovocitele de cățea recoltate din foliculi de talie mare au nevoie de cel puțin 48 de ore pentru a ajunge in vitro la stadiul MII (spre deosebire de 18 – 24 de ore la ovocitele de șoarece sau bovine). Maturarea in vitro la ovocitele de cățea este dificilă și cercetătorii nu au reușit să obțină un număr mare de ovocite în stadiul de metafază II și, în consecință, un număr mare de embrioni canini. (Chastant-Maillard și colab., 2011)
Rata de maturare ovocitară in vitro la canide poate varia între 0–39 % (stadiile MI și MII grupate), cu o medie de 10–20 %. Ovocitele recoltate din foliculii preovulatori prezintă o rată de IVM și IVF mai mare (până la 32 % în metafaza II), dar, așa cum am menționat mai sus, ele sunt un material rar, explicând de ce marea majoritate a studiilor sunt efectuate cu ovocite de la cățele în anestru.
În plus față de rolul stadiului folicular în maturarea ovocitelor, a fost sugerat și un posibil rol pozitiv al penetrării de către spermatozoid (Saint-Dizier și colab, 2001a).
O altă dificultate legată de maturarea in vitro este aceea că ovocitele canine (ca și ovocitele porcine sau feline) prezintă o citoplasmă densă din cauza conținutului ridicat de lipide, care îngreunează vizibilitatea și determinarea stadiului nuclear după maturare. Aceasta explică de ce frecvent cercetătorii raportează rezultate ale maturării cu o rată mare de ovocite în stadiu nuclear „nedeterminat”.
Diferite metode de colorare au fost testate pentru a evalua stadiul nuclear al ovocitului, între care și aceto-orceina sau Hoechst 33258. Microscopia confocală este considerată metoda cea mai bună de a evalua stadiul nuclear cu o acuratețe mare (Reynaud colab., 2004), metodă microscopică puțin accesibilă laboratoarelor de rutină.
2.4. Momentul ovulației și migrarea ovocitului
La cățea ovulația apare la 1-2 zile după ce hormonul luteinizant (LH) atinge concentrația maximă, la începutul estrului, și foliculii ovarieni încep luteinizarea înainte de ovulație. Ovocitele sunt ovulate imature, la începutul primei diviziuni meiotice (veziculă germinală), iar maturarea durează 2-5 zile (Rocha și colab., 2007; Lee, 2014).
La majoritatea mamiferelor ovulația are loc la sfârșitul estrului. Ovocitul eliminat este captat de către pavilionul oviductului, moment în care se creează un flux descendent spre cavitatea tubară, iar ovocitul este antrenat de acest fluid.
Mișcările cililor din epiteliul franjurilor tubare întrețin un curent format din lichidul peritoneal și folicular, care antrenează ovocitul la intrarea în trompe.
Pasajul tubar nu se face cu aceeași viteză: traversarea ampulei este foarte rapidă, iar apoi ovocitele stau în joncțiunea dintre ampulă și istm. Durata tranzitului ovocitelor prin oviduct este la cățea în medie de 168 de ore.
2.5. Viabilitatea ovocitului și capacitatea sa de fecundare
Viabilitatea medie a ovocitului este apreciată la 6–8 ore. Timpul de migrație între ovar și ampulă diferă de la specie la specie, la cățea fiind de 20 de minute. Există diferențe privind viabilitatea ovulului, la cățea ea fiind de 5–6 zile. După acest interval, ovulul trece în treimea mijlocie și posterioară a oviductului unde se înconjoară cu substanțe albuminoide care îl izolează de spermatozoizi și apoi este fagocitat.
CAPITOLUL III
PRELEVAREA OVOCITELOR ȘI MATURAREA IN VITRO
3.1. Controlul ciclului estral și stimularea hormonală a femelelor
În prezent nu există un protocol fiabil, simplu și eficient care să permită inducerea căldurilor și a ovulației fertile într-un moment imediat și precis.
Hormonii gonadotropi, în diferite combinații și scheme terapeutice, induc căldurile la femelele tratate, însă fertilitatea obținută este redusă în special datorită unei evoluții anormale a funcției luteale.
Utilizarea antagoniștilor GnRH este mult mai eficace, însă necesită administrări multiple și rămâne prea scumpă pentru a putea fi utilizată în clinică și/sau în crescătorii. Implantarea subcutanată de microcapsule cu antagoniști ai GnRH (acetat de leuprolid) înlătură primul obstacol. Fertilitatea obținută este bună în cazul estrului indus la femele în anestru sau prepubere. Același tratament, administrat la vulpi la sfârșitul anestrului, a provocat călduri sincronizate, însă fertilitatea a fost nulă.
Un protocol mai eficient și mai sigur aplicat la cățea este administrarea substanțelor antiprolactinice, ca bromocriptina, metergolina și cabergolina (Jeukenne și Verstegen, 1997), care promovează scurtarea intervalului dintre estrusuri. Eficacitatea supresiei prolactinei însă este foarte variabilă, ea fiind dependentă de stadiul ciclului când se începe tratamentul. Cu cât tratamentul este început mai târziu în timpul anestrului, cu atât mai repede apar căldurile. Deci, într-un grup de femele, estrul este greu de sincronizat prin acest tratament.
Dintre protocoalele utilizate, cele mai frecvente sunt: administrarea intravenoasă a dozelor mari de GnRH la fiecare 90 de minute (Concannon și colab., 1997); administrarea de FSH sau eCG (equine chorionic gonadotropin) pentru a induce dezvoltarea foliculară și manifestarea proestrului, administrarea de FSH sau eCG pentru a promova ovulația foliculilor dezvoltați și administrarea de estrogen sau gonadotrofină umană de menopauză (hMG) pentru sensibilizarea prealabilă a axului hipotalamo-hipofizar înaintea administrării medicamentelor menționate anterior.
La ora actuală sunt în curs studii privind optimizarea protocoalelor de inducere a estrului la cățele bazate pe administrarea de antagoniști GnRH. Rezultatele obținute prin administrarea subcutanată a acetatului de buserelină s-au dovedit inferioare cabergolinei (Rota și colab., 2003); rezultate promițătoare au fost observate cu implanturi subcutanate cu eliberare continuă de lutrelină (Concannon și colab., 2006) sau deslorelină (Volkman și colab., 2006).
Din păcate, inducerea artificială a căldurilor (creștere foliculară) și superovulația sunt dificil de controlat la cățea și implică protocoale dificile. S-au testat protocoale cu estronă, gonadotropină corionică ecvină (eCG) + gonadotropină corionică umană (hCG), estradiol, și hCG sau cu un agonist al dopaminei (cabergolina), dar rezultatele au fost limitate (Reynaud și colab., 2004).
3.2 Metode de recoltare a ovocitelor în corelație cu stadiul lor de maturare
Ovarul conține în timpul ciclului sexual ovocite în stadii de maturare foarte variate, începând cu stadiile foarte timpurii, până la ovocitele din foliculii preovulatori, încă imature pentru că ele nu și-au reluat meioza. Așa cum am menționat anterior, etapele mai avansate de maturare a ovocitului in vivo se regăsesc în oviduct, după ovulație.
Toate aceste stadii ovocitare, care au suferit deja o maturare de grade diferite in vivo, pot fi folosite în biotehnologiile de reproducere, și necesită mijloace adecvate de recoltare. Punerea în aplicare a acestor metode poate fi dificilă, deoarece fertilitatea viitoare a femelei poate fi afectată și au un randament foarte variabil.
A. Rezerva cortexului ovarian
Această sursă de ovocite foarte imature este folosită rareori la cățea și pisică. Fragmente din cortexul ovarian sunt prelevate și apoi transplantate (cu sau fără crioconservare) la șoareci SCID (severe combined immunodeficiency) sau Nude (linii imunodepresate care nu resping grefele), în scopul de a reconstrui o foliculogeneză in vivo. Două teste preliminare au evaluat dezvoltarea fragmentelor crioconservate de țesut ovarian de canide, transplantate pe capsula renală sau în bursa ovariană la șoareci SCID (Ishijima și colab., 2006). În final, nu s-a observat dezvoltarea niciunui folicul până la stadiul antral, dar monitorizarea transplanturilor a fost efectuată doar pentru perioade între 30 și 56 de zile. Se știe însă că numai foliculii primordiali și primari rezistă la procesul de congelare/decongelare, și durata foliculogenezei complete, este de ordinul a 5 – 6 luni la canide (Driancourt și colab., 2001). Ambele experimente arată o supraviețuirea a grefei, și chiar o producție endocrină. În cele din urmă, în cazul în care ar putea fi obținut stadiul de foliculi antrali sau preovulatori, acești foliculi s-ar putea puncționa chiar la șoarece. Ovocitele colectate pot fi plasate apoi pentru maturare in vitro.
O alternativă la această xenogrefă, ar putea fi foliculogeneza in vitro: această tehnică permite utilizarea unor fragmente de ovare pentru a obține o creștere a foliculilor primordiali până la stadiul de foliculi preovulatori și selecția unui ovocit fecundabil (Miyano, 2005). Această tehnică nu este încă pusă la punct decât la om (femeie) (Songsassen și colab., 2012).
Pentru cazurile de sterilizare precoce (în caz de tratament antitumoral sau pentru câinii care ajută persoanele cu dizabilități sau cei de lucru), fragmentele ovariene crioconservate ar putea fi transplantate înapoi chiar la cățeaua donatoare, în mod similar, prin autogrefă ortopică (poziția anatomică normală, care să permită o reproducere prin împerechere sau inseminare) sau heterotopică (sub piele, de exemplu, care necesită apoi puncție foliculară, urmată de producție de embrioni in vitro).
B. Foliculii antrali mici
În literatură sunt descrise mai multe protocoale pentru recoltarea ovocitelor din foliculi antrali mici. Acești foliculii sunt prea mici pentru a fi vizualizați cu ochiul liber, iar metoda puncționării cu acul ce dă rezultate bune la șoareci, nu poate fi folosită la cățea. Metoda cea mai utilizată și care dă cel mai bun randament, implică extragerea ovocitelor din foliculi dilacerând ovarele cu o lamă de ras și apoi agitând fragmentele de ovaru într-un mediu lichid. Populația de ovocite astfel obținută este foarte heterogenă și trebuie să se efectueze o selecție riguroasă pentru a elimina ovocitele degenerate sau de calitate slabă. Toate studiile privind maturarea in vitro la carnivore subliniază importanța a trei criterii majore de selecție a ovocitelor:
1) Citoplasma ovocitului trebuie să fie sferică, întunecoasă și omogenă;
2) Diametrul citoplasmatic trebuie să fie de minim 100 de μm;
3) Cumulus oophorus trebuie să conțină cel puțin două straturi complete de celule (Reynaud și colab., 2004; Luvoni și colab., 2005).
Otoi și colaboratorii au arătat în anul 2001 că diametrul ovocitului are un rol mai important decât stadiul ovarian. Ovocitele au fost încadrate în trei categorii în funcție de dimensiunea lor: diametru <100 μm, de 100 – 110 μm și ≥ 120 μm. Pentru ovocitele cu același diametru, ratele de obținere a metafazei II după maturarea in vitro sunt independente de stadiul ovarian (anestru, proestru/estru sau metestrus). Diferențele dintre ratele de maturare in vitro sunt corelate cu diferențele de dimensiune dintre ovocite: diametrul mediu al ovocitului este de 104 μm în anestru față de 119 μm în timpul fazei de creștere foliculară. În urma selecției, din cele trei categorii prezentate mai sus, au fost eliminate în medie 60 % dintre ovocitele recoltate.
Metoda de dilacerare a ovarului permite obținerea a aproximativ 75 de ovocite de la fiecare cățea în anestrus, după prelucrare și selectare din punct de vedere morfologic. Această tehnică de lucru este cea mai frecvent utilizată pentru studiile fundamentale efectuate pe ovocitele de carnivore. În schimb, în contextul practicii clinice, această tehnică nu prezintă un real interes decât imediat după moartea unui câine sau eventual, înainte de efectuarea unui tratament ce duce la sterilitate (chimio- sau radioterapie).
C. Foliculii antrali mari aflați în ultima fază de creștere
Foliculii preovulatori cu diametrul de 2-8 mm se observă ușor pe suprafața ovarului în timpul proestrului și estrului și, prin urmare, pot fi puncționați după ovariectomia femelei (Reynaud și colab., 2005). Cu toate acestea, ovariectomia nu poate fi reținută ca tehnică de recoltare a ovocitelor de la subiecții sănătoși la care se dorește păstrarea potențialului de reproducere.
La bovine, colectarea ovocitelor intrafoliculare se realizează prin puncție sub control ecografic sau, mai rar, prin laparoscopie. La bovine ovocitele se pot preleva o dată sau de două ori pe săptămână timp de mai multe luni, fără vreo consecință asupra fertilității lor ulterioare.
Această tehnică nu a fost încă descrisă la câine, care are mai multe bariere anatomice și fiziologice ce complică realizarea ei: dimensiunea mică a foliculilor (maxim 7 mm față de 20 mm, la bovine sau 45 mm la ecvine), precum și perioada scurtă în care foliculii ar putea să fie aspirați (circa o săptămână din cele șase luni ale unui ciclu).
Recoltarea ovocitelor prin laparoscopie poate fi luată în considerare și la canide. Inconvenientul metodei este acela că bursa ovariană nu permite exteriorizarea ovarului și ar trebui să fie incizată, acțiune ce ar putea cauza formarea de aderențe care vor împiedica repetarea acestei proceduri.
Ambele variante de colectare (puncția ghidată ecografic și recoltarea laparoscopică) necesită anestezie generală la canide, care nu este necesară nici la bovine și nici la ecvine. La canide, o altă dificultate în derularea procedurilor este legată de lipsa de eficiență a protocoalelor de superovulație ce nu permit creșterea numărului de foliculi puncționabili per ciclu.
Indiferent de metoda utilizată, recoltarea ovocitelor prin aspirarea foliculilor în faza de creștere terminală (proestru si estru) permite obținerea unui număr mic de ovocite (maxim 12), și aceasta numai după o activitate dificilă de monitorizare ecografică și hormonală a femelei pentru a determina corect momentul optim de recoltare.
D. Oviductul în perioada post-ovulatorie
În mod normal, la câteva ore după ovulație, ovocitele trec prin oviduct pentru a-și finaliza maturarea. După ovariectomie, oviductul poate fi ușor individualizat și el poate fi apoi spălat cu ajutorul unui cateter introdus la unul dintre capete (Reynaud și colab., 2005). Această tehnică permite recoltarea ovocitelor care au ajuns în metafaza II, dar are aceleași dezavantaje ca și puncția foliculilor preovulatori, și anume: o monitorizare dificilă a femelei pentru a stabili momentul recoltării și numărul limitat de ovocite (maxim 12). Mai mult decât atât, femela trebuie sterilizată pentru că manipularea oviductului intraabdominal este delicată (Lee, 2014). Un studiu recent a evaluat recoltarea intra-oviductală a ovocitelor prin laparotomie, la 72 de ore de la ovulatie (Hossein și col., 2008). Procentul de ovocite recoltate a fost de aproximativ 90% (prin raportare la numărul de corpi galbeni numărați la laparotomie după incizia bursei ovariene), și 63 – 75 % din aceste ovocite au fost în general de bună calitate din punct de vedere morfologic. Recoltarea intraoviductală prin laparotomie este fezabilă, însă nu se cunosc date cu privire la repetabilitatea sa la aceeași femelă și nici impactul asupra potențialului ulterior de reproducere al femelei respective.
3.3. Factori care influențează maturarea ovocitelor in vitro
Ovocitele de cățea, ca și cele de la alte specii, sunt capabile să reia meioza in vitro, dar nu sunt în totalitate competente pentru a finaliza maturarea nucleară. De la primul studiu raportat de Mahi și Yanagimachi (1976), alte numeroase studii au fost efectuate cu privire la impactul unor factori care afectează competența meiotică a ovocitelor la diferite specii (Songsasen și Wildt, 2007).
Reluarea și completarea meiozei (tranziția de la profaza I la metafaza II) sunt ușor de obținut in vitro la unele mamifere, inclusiv femeie, dar nu și la canide: la bovine, de exemplu, 90% dintre ovocite au devenit haploide după 24 de ore de cultură într-un mediu suplimentat (estradiol, FSH, LH). La câine, după 72 – 96 de ore de cultură, indiferent de mediul utilizat, doar 5 – 10% dintre ovocitele colectate din ovare în anestru au ajuns în metafaza II. Cele mai multe ovocite aflate în cultură (60%) nu și-au reluat meioza. Chiar și în cazul ovocitelor obținute din foliculi preovulatori (care și-au început deja maturarea in vivo), procentul celor care ajung în metafaza II este redusă, fiind de numai 32% (Luvoni și col. 2005).
Comunicarea intercelulară dintre ovocite și celulele din cumulus oophorus este întreruptă la 3 zile după ovulație (Viaris de Lesegno și col., 2008). Reducerea joncțiunilor gap este legată cronologic de maturarea ovocitară, deci aceste joncțiuni joacă un rol important în coordonarea maturării nucleare și citoplasmatice. Studiile au arătat că în timp ce COC-urile (complexe cumulus-ovocitare) de la cățele în anestru au joncțiuni gap strânse, cele de la cățele la sfârșitul proestrului mai au doar 89% dintre joncțiunile de comunicare deschise (Luvoni și col., 2001). Această observație ar putea explica randamentul scăzut de maturare la ovocitele de la cățele în anestru, chiar și după 72 sau 96 de ore de cultură. Randamentele mai bune de maturare obținute la ovocitele de la cățele în estru sau proestru se pot datora diametrului ovocitar mai mare observat în aceste stadii ale ciclului reproductiv, acest factor fiind direct asociat cu competența meiotică.
Maturarea ineficientă a ovocitelor de cățea in vitro este probabil legată de întârzierea specifică observată între vârful de LH și reluarea meiozei in vivo. Reluarea meiozei la cățea, probabil, implică factori oviductali. Aproximativ 25% dintre ovocitele canine degenerează în timpul culturii, cu toate că această rată este foarte scăzută la alte specii. Factorii secretați de oviduct în cursul primelor 72 de ore după ovulație sunt necesari atât pentru supraviețuirea ovocitelor, cât și pentru reluarea meiozei. Cultura ovocitelor colectate din ovare în anestru în oviducte menținute în cultură ex-vivo, a condus la îmbunătățirea ratei de atingere a metafazei până la 32% (Luvoni și col., 2003), ceea ce indică importanța acestor factori oviductali. (Chastant-Maillard și colab., 2011)
Există la ora actuală numeroase studii privind maturărea ovocitului la canide, derulate în scopul de a încerca să adapteze condițiile de cultură la fiziologia reproducției. Sunt astfel disponibile numeroase date privind efectele compoziției mediului și condițiile fizice de cultură (Reynaud și colab., 2004; Luvoni și colab., 2005). Aceste studii evidențiază randamente foarte diferite ale culturii, și nici unul nu a permis o îmbunătățire semnificativă în maturarea ovocitului la canide.
Morfologia COC-urilor și diametrul ovocitar sunt parametrii utilizați curent pentru evaluarea nivelului de competență. Diametrul ovocitar este o caracteristică importantă care afectează semnificativ dezvoltarea competenței ovocitare la canide. Otoi și col. (2000) au clasificat ovocitele în trei grupuri în funcție de diametru (>100 µm; 100 µm; <100 µm) și au observat că numai cele >100 µm (20%) au ajuns în faza MII, în comparație cu ovocitele mici (4-10%). Cu cât ovocitul este mai mare, cu atât capacitatea sa de a ajunge mai departe în metafaza I, anafaza I și metafaza II prin dezorganizarea veziculei germinale este mai crescută. În plus, ovocitele cu diametre mai mari de 120 µm au o capacitate mai mare de a ajunge în stadiile finale ale maturării, rezultate similare cu cele obținute și la alte specii.
Alți factori implicați în maturarea in vitro luați de asemenea în discuție au fost:
Densitatea ovocitelor în cultură poate afecta de asemenea competența meiotică. Un număr mare de ovocite într-un volum insuficient de mediu de maturare duce la inhibarea reluării meiozei probabil datorită factorilor de inhibare produși și secretați de celulele din cumulus oophorus (Otoi și colab., 2002).
Influența stadiului estral este încă studiată și controversată.
Vârsta donatoarei are un efect direct asupra numărului de ovocite recoltate.
Se pare că randamentul de recuperare a ovocitelor este mai mare la multipare.
Starea de sănătate pare că nu are nici un efect direct, nici măcar piometrul, prezent frecvent.
Încă nu s-au tras concluzii în ceea ce privește intervalul de cultură.
3.3.1. Vârsta femelei, rasa, stadiul reproductiv și mărimea foliculului ovarian
Vârsta cățelei influențează direct numărul de ovocite recuperate din ovar.
În cadrul cercetărilor privind maturarea in vitro, Durrant și col. (1998) și Ström Holst și col. (2001) au demonstrat că randamentul de recuperare a fost mai mare în cazul ovocitelor obținute de la cățele în vârstă de 1–6 ani comparativ cu cele mai tinere (˂12 luni) sau mai mari (≥7 ani).
Ovocitele prelevate de la cățele prepubere (în vârstă de 4–6 luni) sunt incapabile să reia și să finalizeze meioza. În această etapă a ciclului de viață se pare că există puține legături între celulele cumulusului și cele ale granuloasei. Ovocitele de la cățele prepubere au de asemenea o sinteză redusă de proteine, dar activități metabolice și transcripționale intense (Haenisch și colab., 2003) ceea ce indică faptul că aceste celule nu au dobândit o competență de dezvoltare completă. În schimb, atunci când femelele au între 6 luni (peripubere) și 7 ani (complet mature), vârsta acestora nu influențează în nici un fel competența meiotică a ovocitului. La cățelele peste această vârstă, capacitatea de dezvoltare a ovocitului se reduce substanțial (Songsasen și colab., 2007).
Deși datele disponibile sunt limitate, se pare că rasa cățelei nu influențează abilitatea de maturare nucleară in vitro (Songsasen și colab., 2007), deși subiecții metiși au prezentat mai mulți foliculi ovarieni decât cățelele de rasă pură (351,8 ± 52,4 față de 288,1 ± 43,6) (Durrant și colab., 1998).
Informațiile publicate cu privire la relația dintre stadiul ciclului reproductiv și competența meiotică a ovocitelor sunt contradictorii. Unii cercetători nu au indicat nici o asociere (Songsasen și Wildt 2007), în timp ce alții au demonstrat că stadiul ciclului sexual are un impact semnificativ asupra capacității de dezvoltare a ovocitului (Cho și colab., 2012).
Luând în discuție acest, aspect unii autori menționează că ovocitele obținute din foliculi preovulatori sau în timpul fazei foliculare (estru/proestru) își finalizează maturarea nucleară cu mai mult succes decât cele recuperate în timpul altor etape reproductive (Otoi și colab., 2001). Ovocitele provenite de la cățele în estru au evoluat către stadiul MII în număr mai mare, comparativ cu cele de la femele în proestru și anestru. Cu toate acestea, ovocitele de la femele în diestru au fost la fel de capabile să atingă stadiul MII in vitro ca și cele provenite de la femele în perioada de estru. De asemenea, stadiul ciclului de reproducere pare să influențeze capacitatea de fecundare, deoarece formarea pronucleilor a fost mai frecvent observată la ovocitele intraovariene recoltate de la femele în stadiul folicular, comparativ cu cele prelevate în stadiul luteal sau în anestru (Rodrigues și col., 2004).
Diferențele în competența meiotică a ovocitelor în funcție de stadiile ciclului reproductiv sunt cel mai probabil corelate cu dimensiunile foliculilor și ale ovocitelor la un anumit stadiu al ciclului reproductiv. Otoi și colab. (2001) au demonstrat că există diferențe semnificative în valoarea medie (±abaterea standard de la medie) a diametrelor ovocitelor recuperate în timpul estrului, diestrului și anestrului (119,2 ± 0,7, 107,7 ± 0,7 și, respectiv, 103,6 ±0.8 μm). Astfel, mai multe ovocite cu diametrul ≥120 μm sunt recuperate în faza foliculară decât în alte stadii reproductive. Acest lucru este important dat fiind faptul că ovocitele trebuie să aibă în medie un diametru de 100–120 μm pentru a permite reluarea meiozei, iar maturarea nucleară este mai bună la ovocite de 120 μm comparativ cu cele de dimensiuni mai mici (Otoi și colab., 2001).
Deși dimensiunea ovocitului pare importantă, se pare că ea nu este singurul factor ce limitează succesul IVM. Se știe că aproximativ 20 % din ovocitele mari (de exemplu, > 120 μm diametru) finalizează maturarea nucleară in vitro (Otoi și colab. 2001). Recent s-a demonstrat că dimensiunea foliculului influențează în mod semnificativ competența de dezvoltare a ovocitelor de câine. Se consideră că 80 % dintre ovocitele aflate în structura unor foliculi cu diametrul > 2 mm finalizează maturarea nucleară in vitro, în comparație 16–38 % dintre cele aflate în foliculi mai mici (0,5–˂ 2 mm) (Songsasen și Wildt, 2007).
Se discută, de asemenea, o posibilă relație între stadiile ciclului reproductiv și distribuția foliculilor de diferite dimensiuni. Spre exemplu, ovarele de la cățele în anestru și diestru conțin mai mulți foliculi mici cu diametrul < 0,5 mm, în timp ce foliculii mari (> 2 mm) sunt observați în cea mai mare parte în timpul proestrului/estrului. Cu toate acestea, foliculii mici pot fi observați în ovarele de la cățele în proestru și, ocazional, câțiva foliculi mari pot fi găsiți la unele femele în diestru. Atunci când datele au fost colectate pe baza analizei ciclurilor reproductive, nu au existat diferențe semnificative între grupuri în proporția de ovocite care au finalizat maturarea meiotică (Songsasen și Wildt, 2005). În acest context este evident faptul că dimensiunea foliculului este un factor important care influențează competența de dezvoltare a ovocitului la cățea.
Cei mai mulți cercetători care studiază maturarea ovocitelor in vitro recuperează ovocitele utilizând o tehnică de feliere aleatoare (Luvoni și colab., 2005), obținând astfel aproape inevitabil o populație ovocitară heterogenă care variază în ceea ce privește stadiul de dezvoltare și capacitatea de a finaliza maturarea nucleară. Aceasta metodă de lucru, fără îndoială, explică parțial diferențele de rezultate între laboratoare, vis-a-vis de datele obținute pe baza studiilor corelate cu stadiile ciclului reproductiv și per total incidența mai redusă a succesului IVM pentru această specie.
La cățelele în anestru, există o lipsă de comunicare între ovoplasmă și celulele cumulusului, și ovocitele obținute în timpul acestui stadiu reproductiv pot necesita condiții diferite de cultură față de cele obținute în alte perioade. Densitatea culturii se pare că influențează și ea semnificativ capacitatea ovocitelor recoltate în timpul anestrului de a finaliza maturarea nucleară in vitro (Otoi și colab., 2001). La o densitate mare (20 de ovocite/100 μl mediu de cultură), cele mai multe ovocite obținute în timpul anestrului (80 %) se opresc în stadiul de veziculă germinativă, în timp ce numai 50 % din cele obținute în timpul diestrului se opresc. Atunci când densitatea culturii a fost scăzută la 10 ovocite/100 μl mediu de cultură, mai multe ovocite obținute în timpul anestrului au reluat meioza și au finalizat maturarea nucleară, dar aceste cifre nu au fost semnificativ diferite de cele obținute în diestru (Otoi și colab., 2002). Diferențele privind competența meiotică între ovocitele obținute de la femele în anestru și diestru au fost eliminate prin utilizarea densității optime a culturii (Songsasen și Wildt, 2007).
3.3.2. Compoziția mediului de cultură
Compoziția mediului de maturare in vitro trebuie să prezinte cât mai multe similarități cu cel secretat in vivo de către celulele tubare, atât în ceea ce privește substanțele conținute, cât și concentrațiile acestora. El trebuie să conțină proteine, hormoni (gonadotropine) și ocazional factori de creștere, substanțe antibacteriene și/sau antifungice.
În decursul timpului au fost utilizate diferite medii de cultură, de la mediile simple de tipul TYH (soluție Krebs-Ringer bicarbonat modificat), mKRB (Krebs Ringer bicarbonat) și SOF (lichid oviductal sintetic), până la medii mai complexe de tipul TCM 199 (mediu de cultură tisular), cu o compoziție mult mai cuprinzătoare (săruri anorganice, aminoacizi, vitamine). Mediul cel mai utilizat în prezent, este TCM 199. Un studiu care a comparat TCM 199 cu un alt mediu complex, CMRL 1066 (utilizat în mod curent pentru IVM pentru ovocitele de maimuță – Macacus rhesus), a demonstrat că o proporție mai mare din ovocitele cultivate în TCM 199 (7–16 %) au finalizat maturarea nucleară, comparativ cu CMRL 1066 (0–1 %). Aceste două medii au compoziții destul de diferite, CMRL conține hipoxantină, mai puține vitamine și este bogat în cisteină și acid ascorbic, în timp ce TCM 199 conține mai multe vitamine și are o concentrație mai mare de cisteină și acid ascorbic decât CMRL 1066, dar compușii responsabili pentru eficiența mediului TCM 199 nu sunt cunoscute. A fost demonstrat că cisteina și acidul ascorbic protejează celulele de stresul oxidativ și îmbunătățește maturarea ovocitelor vacă și de (Songsasen și colab., 2002).
În plus, adăugarea unui component tiol, β-mercaptoetanol, la mediul de maturare a îmbunătățit maturarea meiotică a ovocitelor de câine. Prezența acestor antioxidanți poate fi esențială pentru maturarea ovocitelor de canide, care conțin o cantitate mare de lipide intracelulare și este probabil să fie mult mai sensibile la stresul oxidativ (Salavati și colab., 2012)
Inițial, Hewitt și England (1999) nu au raportat nici o diferență în succesul maturării ovocitelor canine cultivate într-un mediu complex, TCM 199, față de SOF, un mediu simplu. Fluidul oviductal sintetic (SOF), nu a îmbunătățit ratele nici pentru stadiul de dezorganizare a veziculei germinale, nici pentru stadiile MI-MII. Dar, într-un studiu mai recent, TCM s-a dovedit a fi superior față de SOF pe baza numărului de ovocite care au reluat meioza și s-au dezvoltat până la stadiile MI/AI/MII (Rota și Cabianca, 2004).
Totuși, deoarece numeroși parametrii (cicluri naturale sau induse, suplimentare cu BSA sau FCS) au fost diferiți în aceste lucrări, sunt dificil de evaluat separat efectele originii ovocitelor sau ale calității mediului de cultură.
Pentru îmbunătățirea calității maturării in vitro, în mediul de bază utilizat pentru cultură pot fi adăugați diferiți compuși cu scopul de a apropia compoziția sa de cea a mediului intrafolicular sau oviductal. Pentru a mima condițiile in vivo, au fost efectuate și studii în mediu oviductal. Diferiți autori (Hewitt și England, 1999) au testat cultura ovocitelor în prezența celulelor oviductale canine, dar nu au observat efecte pozitive. O altă echipă (Luvoni și colab., 2003) a testat un sistem de cultură în care ovocitele canine erau cultivate în oviduct izolat și ligaturat. Ei au obținut ovocite în stadiile de metafază I și II după numai 30 de ore, în proporție de 32 %.
S-au testat deja mai multe sisteme de cultură de către diferiți autori, în funcție de suplimentarea față de compoziția de bază a mediului de cultură:
Suplimentare cu FCS (ser fetal de vițel) 10 sau 20 %;
Suplimentarea cu BSA (serumalbumină bovină) 0,3 % sau 4 %;
Suplimentarea cu gonadotrofine (FSH și/sau LH);
Suplimentarea cu hormoni steroizi: estradiol, progesteron sau estradiol+progesteron și suplimentarea cu ser estral de cățea 10 % și estradiol 20 μg.
3.3.2.1. Suplimentarea mediului cu hormoni
Deoarece maturarea meiotică intervine în interiorul oviductului după un interval prelungit, ovocitul la canide este expus la un mediu extracelular foarte fluctuant în ceea ce privește componentele endocrine. Succesul mai mare al maturării nucleare la canide ar putea fi corelat cu un sistem de cultură care să imite cât mai eficient mediul hormonal natural in vivo (De los Reyes M. și colab., 2005).
Dintre hormonii utilizați frecvent în compoziția mediului de maturare in vitro la toate speciile, mai frecvent întâlniți sunt: gonadotropinele (FSH, LH, hCG), progesteronul, estrogenii și hormonul somatotrop (factor de creștere).
Gonadotropinele
Comparativ cu rezultatele obținute la pisica domestică, suplimentarea mediului de cultură cu gonadotropine nu reușește să promoveze maturarea meiotică a ovocitului de câine (Hewitt și England, 1999). În plus, adăugarea de LH în mediul pentru IVM, respectiv prezența acestuia pe întreaga perioadă de cultură, reduce semnificativ proporția de ovocite dezvoltate în stadiul MII.
Deși cultivarea ovocitelor în mediu cu gonadotropine pe întreaga perioadă de incubație nu este benefică, expunerea pe termen scurt sau temporar a acestora la FSH sau LH poate ajuta maturarea nucleară.
O scurtă expunere a ovocitelor la FSH (hormon foliculostimulant) induce producerea unui agent activator al meiozei de către celulele din cumulus oophorus, stimulează maturarea nucleară și eliminarea primului globul polar la ovocitele de șoarece și porc. Utilizarea FSH recombinat a îmbunătățit semnificativ rezultatele. Rezultate similare au fost raportate și la canide, la care expunerea scurtă a ovocitelor la gonadotropină corionică ecvină (eCG) promovează reluarea meiozei și crește capacitatea de dezvoltare la stadiile MI/MII (Songsasen și colab., 2007).
Suplimentarea cu FSH exercită un efect pozitiv asupra reluării meiozei la alte specii de mamifere, la canide însă nu are nici un efect în concentrațiile uzuale (1 mg/ml). LH, în aceeași doză, nu a avut nici un efect pozitiv asupra ratei de reluare a meiozei, nici singur, nici în asociere cu FSH. În asociere cu β-mercaptoetanol, LH scade puternic rata de reluarea meiozei (Songsasen și colab. 2007).
Promovarea luteinizării foliculare preovulatorii timpurii la cățea este realizată de către LH (Concannon și colab., 1989). Inducția dezvoltării foliculare preovulatorii utilizând steroizi exogeni (estrona) și gonadotropine (gonadotropina corionică ecvină și gonadotropina corionică umană – hCG) îmbunătățesc randamentul de IVM la ovocitele de câine. În plus, cultivarea ovocitelor de câine în prezența a 10 UI hCG timp de 48 de ore, urmată de încă 48 de ore în absența acesteia pare să crească incidența ovocitelor în stadiul MII (De los Reyes, M. și col., 2005). Suplimentarea mediului de cultură cu hCG inițiază dezorganizarea veziculei germinative, probabil stimulând expansiunea cumulusului și desfacerea punților de joncțiune dintre celulele cumulusului și ovocite. Interesant, este faptul că omițând din mediu hCG în a doua jumătate a celor 96 de ore de cultură s-a observat ca formarea de ovocite în stadiul MII a crescut în comparație cu cele cultivate cu hCG pe întreaga perioadă (sau cu cele cultivate în absența totală a acesteia).
In vivo, ovocitul de câine finalizează maturarea nucleară la câteva zile după peak-ul de LH. Prin urmare, este probabil ca LH să exercite influența sa asupra inițierii maturării meiotice prin intermediul celulelor cumulusului (de exemplu, inițiază expansiunea cumulusului și întrerupe comunicarea dintre celulele cumulusului și ovocit). Cu toate acestea, in vitro prezența sa prelungită poate să nu fie esențială sau poate să fie chiar în detrimentul ovocitelor în timpul evoluției lor de la stadiul de dezorganizare a veziculei germinative la stadiul MII (Songsasen și Wildt, 2007).
Hormoni steroizi
Au fost testate și efectele adăugării de steroizi (estradiol, progesteron, sau estradiol+progesteron), dar nici unul dintre aceste tratamente hormonale nu a îmbunătățit maturarea ovocitară.
Adăugarea de progesteron în mediul pentru maturare in vitro imită contextul luteinizării preovulatorii la cățea. Cu toate acestea, până în prezent nu s-a evidențiat nici un efect benefic asupra ratei de maturare ovocitară. Totuși, progesteronul poate să acționeze asupra spermatozoizilor inducând reacția acrozomială. Progesteronul sau combinația progesteron și estradiol influențează pozitiv maturarea nucleară a ovocitelor de câine izolate în timpul fazei foliculare (Kim, M.K. și col., 2005).
Concentrațiile testate in vitro (1 și 2 μg/ml; Kim și colab., 2005) sunt cu mult sub concentrațiile fiziologice intrafoliculare. Doar un singur studiu recent a folosit suplimentarea cu progesteron a culturii (20 mg/ml), în concentrație mai apropiată de concentrația intrafoliculară fiziologică, singur sau în asociere cu estradiol (20 μg/ml) și a dovedit un efect pozitiv în cultură. Această concluzie este considerată însă relativă deoarece studiul folosește o metodă de determinare mai puțin precisă a stadiului nuclear (microscopie optică în fluorescență și marcarea ADN-ului cu colorație Hoechst), de aici rezultând mai multe erori și un procent deloc neglijabil de ovocite rămase în stadii nedeterminate. Mai mult decât atât, procentul pentru metafaza II este zero, atât în grupul de control cât și în grupurile la care mediul a fost suplimentat cu progesteron.
Ar fi oportun să se ia în considerare nu numai concentrațiile intrafoliculare de progesteron (care ar putea afecta maturarea citoplasmatică premeiotică finală), dar și concentrația de progesteron din lichidul oviductal, necunoscută în prezent, deoarece reluarea meiozei are loc în timpul tranzitului tubar. Concentrația de progesteron de la nivelul trompelor uterine, care rămâne să fie măsurată, depinde nu numai de nivelul de progesteron din circulație, aproximativ de 40 ng / ml la momentul de debut al metafazei II, dar și de nivelul de progesteron conținut în lichidul folicular, acesta din urmă fiind eventual colectat de către oviduct. Dacă rolul progesteronului asupra ovocitelor canine este încă necunoscut, este bine stabilit faptul că steroizii favorizează reacția acrozomică a spermatozoizilor la canide.
Kim și col. (2005) au adăugat estradiol-17β la mediul de maturare. Proporția de ovocite canine care s-au dezvoltat în stadiul MII in vitro a crescut semnificativ, dar numai când s-au utilizat ovocite în faza foliculară, impactul fiind minim asupra ovocitelor recuperate în timpul anestrului sau fazei luteale.
În schimb, în alte studii nu s-a găsit nici un beneficiu în suplimentarea cu progesteron asupra maturării meiotice indiferent de stadiul reproductiv al donatorului ovocitelor.
S-au utilizat medii suplimentate cu estradiol, progesteron, FSH, LH, eCG, L-cisteină și acid arahidonic, dar nici unul nu a avut un efect pozitiv asupra ratelor de maturare ovocitară când s-au comparat rezultatele cu cele obținute în loturile de control.
Diferiți hormoni de creștere și factori de creștere (STH – hormonul uman de creștere, somatotrop; STB – hormon bovin creștere) au fost adăugați la mediul de maturare.
STB (somatotropina bovină) intensifică maturarea meiotică la ovocitele de la vulpea albastră, în absența expansiunii celulelor din cumulus. Acest hormon nu a adus însă nici o ameliorare a ratei de maturare in vitro la canide, pentru că favorizează extinderea cumulusului, fenomen fiziologic ce succede vârful de LH in vivo, dar rareori observat în timpul maturării in vitro. STB nu reușește să îmbunătățească proporția de ovocite în stadiul MII, deși se pare că sporește reluarea meiozei.
Deși s-a observat expansiunea stratului exterior al celulelor granuloasei (cumulusului), corona radiata a rămas strâns legată, fiind dificil de înlăturat (Songsasen și colab., 2012). Astfel de modele de expansiune a cumulusului s-au întâlnit la ovocitele de la vulpea albastră expuse la FSH, dar în absența sporirii maturării nucleare.
La mai multe specii de mamifere, factorul de creștere epidermal (EGF) în mediul pentru IVM este benefic pentru dezvoltarea ovocitului.
EGF activează AMP-kinaza și receptorii pentru EGF din cumulus oophorus, provocând expansiunea sa. La câini, EGF influențează maturarea meiotică a ovocitelor într-o manieră dependentă de doză. Cel mai mare număr de ovocite MII au fost obținute după 72 de ore de cultură în prezența a 20 ng/ml de EGF.
Nu există efecte sinergice asupra maturării nucleare între LH și EGF, și între EGF și estradiol. Adăugând EGF mediului cu FSH, inhibă maturarea nucleară la câine, probabil datorită efectului inhibitor al EGF asupra diferențierii celulelor granuloasei stimulate de FSH. Datorită posibilei interacțiuni cu gonadotrofinele și estrogenul, nu este surprinzător faptul că EGF nu a reușit să promoveze maturarea ovocitelor canine când FSH, LH și estrogenul erau prezente împreună în mediul de cultură (Rota și Cabianca, 2004).
În schimb, Conti a arătat în 2006 că proporția de ovocite în curs de dezvoltare la stadiile MI și MII a crescut când s-a adăugat EGF în mediul conținând LH sau estradiol comparativ cu cele cultivate numai cu gonadotrofină sau numai cu steriod. S-a sugerat că LH îmbunătățește efectul de inițiere meiotică al EGF pe calea cumulusului celular prin stimularea exprimării EGF m-ARN.
3.3.2.2. Suplimentarea mediului cu proteine
Influența suplimentării mediului cu proteine asupra ovocitelor canine cultivate a fost examinată extensiv, deși cu rezultate contradictorii (Rodrigues și Rodrigues, 2004).
Cele mai multe medii testate pentru maturarea in vitro la canide au fost suplimentate cu proteine ca: albumină serică bovină (BSA) și diferite seruri de origine animală (ser fetal de vițel/vacă, ser de căței/cățea în anestru sau estru). Compoziția exactă a acestor seruri rămâne necunoscută și este extrem de variabilă.
Suplimentarea mediului de cultură TCM 199 cu 0,3 % albumină serică bovină (BSA) sau 10 – 20 % ser fetal bovin (FBS) pare optimă pentru maturarea ovocitelor de câine. Mediul TCM-199 cu serumalbumina bovină și somatotropină umană ajută reluarea meiozei la ovocitele de cățea până la stadiul de metafază II (Rodrigues și Rodrigues, 2004). Când s-a utilizat SOF, un mediu simplu, a fost necesară o concentrație mai mare de BSA (4 % w/v) pentru a obține un efect benefic (Hewitt și England, 1999).
Bolamba și col. (2002) au contrazis aceste rezultate prin constatarea că suplimentarea cu proteine nu a fost esențială pentru maturarea nucleară in vitro a ovocitelor canine cultivate în SOF. De asemenea, Songsasen și Wildt (2007) au raportat o proporție mai mare de ovocite în MII după 48 de ore de cultură într-un mediu fără proteine. În plus, inseminarea in vitro a dus la dezvoltarea a 30 % dintre aceste ovocite în stadii embrionare incipiente.
Cultura fără suplimentarea cu proteine este fezabilă și permite (cu rată scăzută) reluarea meiozei, fertilizarea in vitro, și dezvoltarea până la primele etape embrionare (Songsasen și Wildt, 2007).
Adăugarea de ser la mediul de maturare duce la obținerea unui număr mai mare de ovocite cu organizare nucleară neclară după maturare (Hewitt și colab., 1999). Adaosul de BSA la un mediu care conține ser, a scăzut procentul de ovocite degenerate comparativ cu serul singur (Bolamba și colab., 2002). Totuși, majoritatea studiilor până în prezent au utilizat serul ca supliment proteic în mediul de maturare cu rezultate foarte variabile.
Prin suplimentarea mediul de cultură cu 20 % ser estral de vacă (ECS), ser estral de cățea (EBS) sau FBS, mai multe ovocite s-au dezvoltat în stadiile MI/MII când au fost cultivate în prezența FBS. Serul estral de cățea, care are o concentrație mai mare de estradiol și progesteron, s-a dovedit eficient în susținerea maturării nucleare a ovocitelor de câine. Cu toate acestea, Rodrigues (2004) a demonstrat că nu a fost nici o diferență între BSA și ECS în susținerea maturării ovocitare, dar ECS a fost superior față de EBS.
Concentrația optimă raportată de FCS în sistemele de cultură ce au utilizat acest model a fost de 10 % sau 20 %, dar numai M199 + 20 % FCS permite o creștere în rata de maturare după 96 de ore de cultură. O concentrație mai mică de FCS (5 %) crește rata de degenerare ovocitară.
Motivele pentru care au apărut aceste diferențe între studii sunt neclare, dar se pot datora modului în care s-a stabilit faza ciclului estral în care se afla cățeaua în momentul recoltării sângelui, ca sursă pentru suplimentul de ser. De exemplu, Otoi și col. (1999) au clasificat statutul donatorului de sânge în funcție de analizele histologice ale ovarelor. Rodrigues (2004) a utilizat semnele clinice, de exemplu receptivitatea la montă și citologia vaginală ca și criterii pentru clasificarea stadiului reproductiv. Astfel, este probabil ca diferențele de concentrație ale progesteronului și estradiolului între sursele de probe de ser utilizate pentru a crea suplimente să fi contribuit la rezultatele contradictorii între studii.
3.3.2.3. Suplimentarea mediului cu surse de energie
Deși este bine cunoscut că substratul energetic joacă un rol important în reglarea maturării ovocitare, doar câteva studii au examinat influența lui asupra maturării ovocitelor de câine.
Glucoza în sine poate să nu fie suficientă ca sursă de energie pentru ovocitele de câine. Adăugarea de glucoză, are un efect pozitiv la șoareci, însă nu are nici un efect și în doze mari (11 mM), în absența piruvatului, chiar reduce rata de reluarea meiozei la ovocitele cultivate în concentrație mare de oxigen (≈20 %) (Songsasen și Wildt, 2007).
Adaosul de piruvat (între 0 și 2,5 mM) și glutamină (între 0 și 4 mM) nu are un efect semnificativ asupra maturării nucleare a ovocitelor canine. Mai recent, s-a constatat că ovocitele de câine folosesc predominant glucoza, dar că maturarea in vitro este legată atât de metabolismul glucozei, cât și de al glutaminei (Songsassen și Wildt, 2007).
3.3.2.4. Suplimentarea mediului cu antioxidanți
Au fost de asemenea testate pe ovocitele canine substanțe cunoscute pentru rolul de de inițiere a maturării ovocitare și de protecție a celulelor față de efectele oxidative, ca de exemplu beta-mercaptoetanol sau βME și combinații insulină-transferină-seleniu.
Adaosul de β-mercaptoethanol (antioxidant), a îmbunătățit maturarea nucleară la bovine, dar nu a avut nici un efect semnificativ la câini.
Adăugarea în TCM199 de insulină-transferină și seleniu crește numărul de ovocite în dezvoltare la stadiile MI/AI/MII (Rota și Cabianca, 2004). Pe lângă protejarea celulelor de stresul oxidativ, βME crește producția de glutation intracelular, care îmbunătățește capacitatea de dezvoltare a ovocitelor de mamifere. La câine, βME intensifică maturarea nucleară a ovocitelor de fază foliculară într-un mod dependent de doză; concentrația optimă a fost de 50–100 μM. La o concentrație mai mică (25 μM), βME nu a reușit să exercite un efect pozitiv (Songsasen și Wildt., 2007).
3.3.2.5. Substanțe inhibitoare ale meiozei
Ovocitele de câine din foliculii mici nu sunt capabile să obțină cu ușurință maturarea meiotică in vitro (Bolamba și colab., 2002; Songsasen și Wildt, 2007). Astfel, un sistem de cultură secvențial, care permite ovocitului să rămână inițial în etapa de veziculă germinativă, să finalizeze transcripția și să treacă prin modificări ultrastructurale esențiale pentru maturarea meiotică și citoplasmatică, poate fi un mijloc eficient de intensificare a IVM.
La alte specii de mamifere, inhibiția temporară a meiozei folosind fosfodiesteraza sau un inhibitor ciclin-kinază dependent îmbunătățește competența de dezvoltare a ovocitului, inclusiv la cele recoltate din foliculi mici. Expunerea ovocitelor de câine la inhibitorul fosfodiesterazei, dbcAMP (dibutiril-cAMP), a blocat temporar reluarea meiozei. Roscovitina, un inhibitor ciclin-kinază dependent, a fost mai puțin eficient decât dbcAMP pentru menținerea ovocitelor de canide în arest meiotic. În ciuda capacității sale de a inhiba temporar reluarea meiozei, autorii nu au reușit să îmbunătățească competența meiotică a ovocitelor de câine după cultivarea lor timp de 48 de ore în absența acestora, și aceasta deoarece durata expunerii la dbcAMP nu a fost poate suficientă pentru ca ovocitele să dobândească capacitatea de a finaliza maturarea nucleară.
3.3.3. Condițiile și intervalul de cultură
Un alt aspect discutat în corelație cu rezultatele maturării in vitro la canide este legat de modularea condițiilor de cultură. În ceea ce privește metoda de cultură în laborator, sunt discutate rezultatele diferite în funcție de metoda de organizare a culturii.
Condițiile normale de cultură sunt: temperatură de 37 – 39° C în atmosferă modificată (5% CO2, 5% O2, saturată în apă). Impactul lor pozitiv nu a fostdemonstrat în mod clar la câine.
Unii autori cultivă ovocitele în godeuri sub ulei, deoarece prezența uleiului previne deshidratarea și contaminarea. Trebuie ținut cont că 2 ml de apă adăugată între godeuri este suficientă pentru prevenirea deshidratării și că unii componenți ai mediului de cultură pot fi lipofilici și pot fi absorbiți în ulei. De exemplu, steroizii (adăugați în mediul de cultură sau produși de ovocite/celule din cultură) sunt foarte lipofilici. De acest aspect trebuie ținut cont dacă se fac teste pentru steroizi după cultura sub ulei.
Majoritatea cercetătorilor care efectuează studii privind maturarea ovocitelor de câine utilizează cultura în picături sau godeuri, cu gruparea de ovocitelor într-un volum mediu de 400 – 500 μl.
La canide, reducerea ratei de oxigen din atmosferă de la 20% la 5% pare a nu avea nici un efect.
În cazul în care cultura este efectuată în picătură sub ulei, uleiul are rolul de a proteja mediul de cultură de atmosfera înconjurătoare, limitând efectelele sale oxidante. Există însă inconvenientul de a atrage de compușii lipofili din mediul de cultură.
Densitatea ovocitelor ar putea influența și ea rata de reluare a meiozei in vitro. Rata metafazei II a fost semnificativ mai mare cultivând 10 ovocite per picătură de 100 μl mediu față de 5 ovocite per picătură (16,2% față de 4,6%).
Durata optimă de maturare in vitro la câine, 72 de ore, este mult mai lungă decât la alte mamifere (expulzarea globulului polar la bovine are loc în 16 ore de cultură). Rata de metafază II este într-adevăr maximă la 72h, dar creșterea duratei la 96 de ore nu a adus nici o îmbunătățire a ratei și chiar a crescut rata de degenerare.
Ovocitele de câine necesită 48 – 72 de ore pentru a-și finaliza maturarea nucleară in vivo, în oviduct (Reynaud și colab., 2005).
Când sunt recuperate direct din foliculii ovarieni și incubate in vitro, unele ovocite avansează la stadiul MII chiar și în 24 de ore de cultură. Creșterea perioadei de cultură la 48 de ore a dus la obținerea unui număr mai mare de ovocite care și-au finalizat maturarea nucleară. O incubare prelungită peste 48 de ore nu reușește să crească numărul total de ovocite ajunse la MII, antrenând frecvent o degenerare ovocitară (Saint-Dizier și colab., 2004).
Intervalul optim pentru IVM pentru ovocitele de câine pare să fie de 48 de ore, durată ce se corelează de asemenea cu cea mai bună dezvoltare embrionară după IVF.
3.3.4. Cocultura
Având în vedere toate aceste încercări nereușite de maturare in vitro, și urmărind să se creeze un context mai apropiat de condițiile de maturare in vivo, câteva studii au urmărit cultura ovocitelor împreună cu celule oviductale, dar nici celulele oviductale bovine, nici cele canine nu au îmbunătățit în mod semnificativ rata de metafază II obținută (Enginler și colab., 2014).
Atunci când ovocitele sunt cultivate ex-vivo, într-un oviduct de cățea în anestru, rata de metafază (I și II) crește în mod semnificativ, ajungând la 12 – 32 % (Luvoni și colab., 2003). Acest principiu pare a fi promițător și merită să fie aprofundat pentru a îmbunătăți supraviețuirea ovocitelor ex–vivo (48 de ore maxim), precum și pentru a utiliza oviducte de la femelele în perioada post-ovulatorie.
Mediul oviductal este compus din suprafața celulelor care mărginesc lumenul oviductal și lichidul oviductal. Proteinele specifice oviductului (glicoproteine cu greutate moleculară mare) sunt principalele produse ale celulelor epiteliale oviductale. Producerea acestor proteine oviductale este reglată de ciclul reproductiv și, în special, de estrogenul circulant.
Proteinele facilitează capacitarea spermatozoizilor, previn fecundarea polispermică la vacă și porc și promovează dezvoltarea embrionară la embrionii de șoarece cultivați.
Pentru că ovocitele de canide finalizează maturarea, se fecundează și se dezvoltă până în stadiul de morulă în interiorul oviductului, este posibil ca celulele epiteliului oviductal și proteinele să joace un rol major în succesul maturării, fecundării și dezvoltării timpurii a embrionilor preimplantați la această specie (Reynaud și colab., 2005).
Hewitt și England (1999) au cultivat ovocite canine cu celule epiteliale oviductale și nu au găsit nici o îmbunătățire în capacitatea de dezvoltare. Acest lucru poate fi datorat faptului că majoritatea celulelor epiteliale au fost recoltate de la cățele în diestru, când există o lipsă a proteinelor esențiale pentru inițierea maturării meiotice deoarece celulele oviductale secretorii sunt cele mai active în timpul estrului, nu diestrului. Concentrațiile intraoviductale de glicozaminoglicani sunt mai mari la cățelele în estru comparativ cu cele în diestru (Kawakami și colab., 2001).
Cultivând ovocite de canide cu celule oviductale recuparate de la cățele în anestru s-a îmbunătățit proporția de ovocite care și-au reluat meioza și s-au dezvoltat la stadiul MII (Kawakami și colab., 2001, Luvoni și colab., 2003).
Deoarece caracteristicile morfologice și ultrastructurale ale celulelor secretorii pot varia de-a lungul oviductului, porțiunea de oviduct de unde sunt recuperate celulele influențează tipul și concentrația proteinelor produse, dictând astfel efectul final asupra dezvoltării ovocitului. La canide, celulele oviductale din infundibulum și ampulă sunt capabile în mod egal să inițieze maturarea meiotică.
De asemenea, merită notat faptul că interacțiunea fizică dintre ovocit și oviduct poate influența pozitiv maturarea. Cocultura ovocitelor în oviduct ligaturat a crescut proporția de ovocite în stadiile de dezorganizare a veziculei germinative și MI-MII în comparație cu cele cultivate fără oviduct sau pe epiteliul mucoasei oviductului deschis. Cultivarea ovocitelor în oviducte ligaturate mai mult de 30 de ore a dus la degenerarea unei proporții mai mari de ovocite (Luvoni și colab., 2003), probabil datorită unui mediu ostil cauzat de degenerarea celulelor somatice și acumuarea de metaboliți de degradare. Acest sistem este ingenios și dă bune rezultate (32 % în MI-MII după 30 de ore), dar este dificil de utilizat. El necesită oviducte de cățea, deci ovariohisterectomie, și este dificil de standardizat deoarece caracteristicile oviductale variază substanțial în funcție de faza ciclului, în timp ce mediul de cultură este ușor de standardizat și efectele unui tratament pot fi comparate.
Într-un studiu ulterior, Luvoni și col. (2003) au descris un sistem secvențial de cultură: 24 de ore de cultură a ovocitelor în prezența celulelor oviductale, urmată de 48 – 72 de ore în mediu lipsit de celule somatice. Comparativ cu cultivarea ovocitelor în prezență de celule oviductale pe întreaga perioadă, sistemul secvențial a îmbunătățit capacitatea ovocitelor de câine de a relua meioza și a redus numărul de ovocite degenerate.
Până în prezent, producerea de blastociști obținuți prin fertilizarea ovocitelor maturate in vitro a fost raportată într-un singur studiu (Otoi și colab., 2000). În acest caz, ovocitele recuperate au fost cultivate într-un strat hrănitor de cumulus celular bovin care a fost folosit anterior ca model de cultură pentru embrioni bovini timp de 13 – 14 zile. Deși frecvența de maturare și dezvoltare a ovocitelor a fost scăzută, succesul producerii de embrioni in vitro până la stadiul de blastocist s-ar fi putut datora factorilor embriotropici produși de cumulusul celular sau de embrionii bovini.
3.3.5. Influența spermatozoizilor
Influența spermatozoizilor asupra maturării ovocitului la canidele domestice rămâne încă să fie investigată. Se cunoaște că spermatozoizii de câine au capacitatea de a penetra in vitro ovocite imature și de a forma pronuclei masculi (Mahi și Yanagimachi, 1976).
Saint-Dizier și colab. (2001a, b) au raportat ca penetrarea spermatozoizilor a dus la obținerea unor procente mai mari de ovocite canine care au reluat meioza și s-au dezvoltat după stadiul MI în comparație cu cele nepenetrate.
Mai recent, Rodrigues și col. (2004) au descoperit că numai 4 % din ovocitele canine cultivate timp de 48 de ore s-au dezvoltat la MII. Cu toate acestea, atunci când au fost cultivate timp de 48 de ore și inseminate in vitro, au fost fecundate mai multe ovocite, 24 % formând pronuclei și s-au dezvoltat în stadii embrionare incipiente (13 % embrioni cu 4 – 8 celule).
Dacă și cum își exercită spermatozoidul influența nu se cunoaște. Cu toate acestea, în timpul fecundării la mamifere, spermatozoidul induce modificări oscilatorii asupra Ca2+ ovocitar intracelular, care sunt esențiale pentru finalizarea diviziunii meiotice secundare și pentru continuarea dezvoltării embrionare. S-a sugerat că, Ca2+ intra și extracelular poate să joace un rol important în reluarea și finalizarea meiozei. Astfel, este posibil ca penetrarea ovocitului canin de către spermatozoid să inducă reluarea meiozei pe una sau mai multe căi depedente de Ca2+ (Songsasen și Wildt, 2007).
PARTEA A II-A
CERCETĂRI PROPRII
1. SCOPUL ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI
Obiectivul principal al studiului a fost cel de optimizare a metodelor de prelevare și cultivare in vitro a ovocitelor de canide, în vederea creșterii indicelui de fecundație și de obținere a embrionilor prin tehnici de fertilizare in vitro (FIV convențional și ICSI).
În acest scop, s-au definit două subobiective:
Definirea unor noi criterii morfocitometrice de evaluare și de selecție a ovocitelor.
Testarea și evaluarea unor parametri ce influențează direct maturarea in vitro.
Cercetările efectuate au fost orientate astfel către:
Evaluarea și identificarea celor mai performante tehnici de recoltare a ovocitelor;
Creșterea ratei de viabilitate a ovocitelor prin cultivarea în medii consacrate și/sau îmbunătățite și în anumite condiții de cultură modulate, care să asigure atingerea unui nivel corespunzător de maturare nucleară și citoplasmatică;
Aprecierea morfocitometrică și clasificarea în funcție de aceste caracteristici a ovocitelor de cățea din momentul recoltării până la maturarea in vitro, cu surprinderea în fiecare etapă a principalelor caracteristici biologice de etapă.
2. MATERIALE ȘI METODE
Metodele folosite în acest studiu pentru obținerea, maturarea și evaluarea ovocitelor de canide sunt prezentate în Figura 7.
Fig. 7. Schemă experimentală.
2.1. Materiale
– Recipient izoterm; tuburi Falcon, 50 ml.
– Bisturiu sau lame de ras, foarfecă fină pentru disecție, pensetă fină nr. 5.
– Stereomicroscop cu iluminare de jos în sus, echipat cu placă încălzitoare (Olympus, stereomicroscop SZX + placă încălzitoare MATS-SZX).
– Plăcă termostatată individuală.
– Vase de cultură pentru organe sau țesuturi: Petri (Falcon, 60×15 mm), cu godeu central (Falcon 3037) și vase cu patru godeuri (Nunc 176740).
– Seringi de 1 ml sterile cu ac hipodermic de 0,5 mm.
– Pipetă automată de 10-200 µl sau pipetă de gură (Sigma A-5177).
– Mediu de transport PBS (Phosphate-buffered saline): 0,01 M fosfat tamponat, 2,7 mM clorură de potasiu, și 0,127 M clorură de sodiu; pH 7,4 (PBS Lonza) (Fig. 8A).
– Mediu de disecție la 38˚C: M 199 cu 25 mM Hepes și sărurile lui Earl, suplimentat cu 20 % ser fetal de vițel (FCS) inactivat prin căldură, penicilină G (100 μg/ml), și streptomicină sulfat (100 IU/ml) (Sigma) și filtrat (filtru steril de 0,2 μm). Se decomplementează serul prin încălzire la 56°C timp de 30 de minute; apoi, se împarte și se depozitează la -20°C.
– Mediu de maturare: mediu de cultură fără Hepes – Medium 199 (LONZA) (Fig. 8B), MI IVM Medium (ORIGIO), MII Oocyte Maturation Medium (SAGE) și MIII Blastassist (ORIGIO). Compoziția detaliată se regăsește în tabelul nr. 2.
– Ulei pentru cultură (Sigma) (Fig. 8C).
– Incubator cu atmosferă umidificată cu 5 % CO2 în aer și 38°C.
Fig. 8. Medii utilizate (A) Mediu pentru disecție; (B) Mediu pentru cultură; (C) Ulei pentru cultură.
Tabel nr. 2. Compoziția mediilor de cultură utilizate pentru maturarea in vitro a ovocitelor de canide
1Clorură de sodiu, clorură de potasiu.
2Alanil-glutamină, L-glutamină, asparagină, acid aspartic, glicină, prolină, serină.
3Arginină, dihidroclorură de L-cistină, histidină, izoleucină, leucină, lizină, fenilalanină, treonină, triptofan, tirozină, valină.
4Pantotenat de D-calciu, clorură de colină, acid folic, l-inozitol, nicotinamidă, piridoxină HCl, riboflavină, tiamină.
5Adenină, guanină, xantină, hipoxantină, si respectiv, timină și uracil.
HSA 0,4% adăugată chiar inainte de incubarea mediului.
2.2. Metode
2.2.1. Pregătirea vaselor și a mediilor de cultură
În ziua dinaintea recoltării (ziua 0), s-au pregătit vasele de cultură în condiții sterile (hotă cu flux laminar). S-au utilizat vase cu patru godeuri (Nunc 176740), în medie 2 vase/ovar. S-a pipetat 0,5 ml mediu de cultură în fiecare godeu și s-a umplut spațiul dintre godeuri cu 2 ml mediu sau apă sterilizată pentru a evita deshidratarea.
S-au lăsat vasele de cultură să se echilibreze peste noapte în incubatorul cu gaze la 38°C și 5% CO2.
S-a pregătit mediul de disecție PBS (50 ml/ovar) și s-a lăsat să se echilibreze la 38°C.
În dimineața ovariectomiei, s-au pregătit:
– vasele Petri cu 25 ml mediu de disecție/vas și s-au lăsat pe o placă încălzită;
– vasele pentru selecție cu câte 1 ml mediu de disecție în fiecare vas de cultură;
– recipientul izoterm cu apă la 38°C;
– tuburile Falcon cu PBS plasate în blocul termostatat.
2.2.2. Recoltarea ovarelor și prelevarea ovocitelor
A B C
Fig. 9. Material tehnic și biologic pentru recoltarea ovocitelor de canide.
A) Ovarele separate de bursa ovariană și grăsime; B) Ovare secționate; C) Selectarea ovocitelor de bună calitate stereomicroscop.
Cea mai simplă cale pentru obținerea ovocitelor de canide este recoltarea ovarelor după ovariectomia de rutină. Aceasta este în mod clasic recomandată în timpul anestrului. Ovariectomia în timpul proestrului sau estrului poate părea mai dificilă din punct de vedere chirurgical datorită unei vascularizări mai puternice a tractului genital; în plus, neutralizarea în timpul metestrului poate să inducă și pseudogestația și lactația persistentă. La bovine, ovocitele sunt acum colectate pe scară largă in vivo prin puncție foliculară ghidată ecografic sau endoscopic. Această tehnică permite obținerea în medie a 5 ovocite de două ori pe săptămână mai multe luni, fără tratament hormonal. Din păcate, metoda endoscopică este dificil de transpus la cățea datorită prezenței unei burse ovariene adipoase care înconjoară ovarul; puncția ghidată ecografic rămâne să fie testată, dar indiferent de metoda aleasă, limita rămâne în raritatea fazelor foliculare (Reynaud și colab., 2004).
Majoritatea ovarelor sunt în stadiul de anestru, ovocitele colectate din aceste ovare provin din foliculi mici, și competența lor de maturare nucleară (capacitatea de a relua meioza) poate fi limitată. Cu toate acestea, uneori este posibil să se stabilească protocoale de stimulare ovariană și să se obțină ovocite din foliculi mari/preovulatori. În acel studiu, 32 % dintre ovocitele în metafaza II au fost obținute după 72 de ore de cultură, și s-au observat chiar embrioni, din păcate blocați între stadiile de două și opt celule (Reynaud și colab., 2004).
Când are loc ovariohisterectomia datorită unui piometru, ovarele nu sunt adecvate pentru IVM. Examinarea macroscopică a acestor ovare relevă de multe ori un aspect anormal (numeroși chiști). În plus, infecția bacteriană uterină poate contamina ovarele.
Metoda de rutină rămâne ovariosalpingohisterectomia. Ovarele sunt recoltate prin ovariectomii de rutină și sunt transportate la laborator în PBS în tuburi la 38°C (pentru a evita șocul termic). Ovarele trebuie prelucrate în cel mai scurt timp posibil (ovocitele trebuie puse în mediul de cultură la 30 de minute – 1 oră de la recoltarea ovarelor) (Fig. 9A).
Țesutul ovarian de cățea poate fi păstrat până la 4 ore după recoltare în soluție salină la 4°C fără pierderea capacității de maturare și a dezvoltării posibile la stadiul de metafază a II-a.
Ovarele au fost puse în mediul de disecție pe o placă încălzită la 38°C, bursa ovariană a fost disecată, și s-a îndepărtat grăsimea. Prezența grăsimii în timpul tăierii ovarului îngreunează vizibilitatea în timpul selecției ovocitelor. Dimensiunea ovarului depinde de rasa câinelui (de la 5 – 10 mm la 15 – 30 mm). Chiar înainte de ovulație, dimensiunea medie a foliculilor preovulatori (care sunt 4 – 5 /ovar) poate ajunge la 7 mm. În majoritatea timpului, ovarele sunt în metestru sau anestru și nu sunt vizibili foliculi antrali mari. Dacă pot fi obținute ovare în stadiul preovulator, este posibilă puncția fiecărui folicul preovulator cu o seringă de 1 ml cu ac de 26G și recoltarea ovocitelor și a lichidului folicular.
După ce bursa a fost îndepărtată, s-a pus ovarul în alt vas Petri cu mediu de disecție proaspăt și s-a realizat secționarea (Fig. 9B). Pentru a secționa ovarele și a elibera complexele cumulus-ovocite (COC), s-au folosit lame de ras sau de bisturiu. Fragmentele rezultate s-au agitat în mediul lichid și apoi s-au examinat la stereomicroscop (Fig. 9C). Complexele cumulus-ovocite s-au colectat într-un vas Petri cu mediu pentru exterior (M199 cu Hepes) acoperit cu ulei.
După dilacerarea mecanică, se poate utiliza digestia enzimatică, pentru recuperarea foliculilor ovarieni preantrali. După tratarea enzimatică cu colagenază și ADN-ază, ovocitele pot fi capabile sa-și reia diviziunile meiotice.
După prelevare ovocitele pot fi imediat prelucrate pentru fertilizarea in vitro (IVF) sau pot fi congelate la -18°C.
După prelucrare ovocitele au fost evaluate morfologic. Calitatea bună a ovocitelor de cățea este în concordanță cu următoarele standarde morfologice:
citoplasmă pigmentată întunecat și omogenă;
diametru peste 100 μm;
pezența a două sau mai multe straturi de celule de cumulus oophorus.
2.2.3. Evaluarea și perfecționarea metodelor de recoltare a ovocitelor de canide
Având în vedere importanta acestei etape în obținerea unui număr cât mai mare de ovocite care să fie utilizate în cadrul protocolului de maturare in vitro, cercetările întreprinse au avut drept scop identificarea celor mai performante tehnici de recoltare a ovocitelor de canide și de caracterizare a gradului de maturare.
Prelevarea ovocitelor s-a realizat prin cele două tehnici prezentate în literatura de specialitate, respectiv puncționarea foliculilor ovarieni (Yamada și colab., 1993; Cho și colab., 2012) și secționarea fină a țesutului ovarian (Reynaud și colab., 2005; Enginler și colab., 2014). Ambele tehnici se aplică după ovariectomia de rutină.
Cercetările au fost realizate pe un număr de 464 ovocite, recoltate din structura a 20 de ovare provenite de la femele sănătoase, de vârste variabile, în diferite faze ale ciclului sexual la care s-a practicat ovariohisterectomia.
Ovarele au fost recoltate în primele 10 minute ale intervenției și transportate la laborator în tuburi Falcon cu soluție 0,9% clorură de sodiu sau PBS păstrat la temperatura de 38°C, în vederea asigurării viabilității ovocitelor până în momentul prelucrării.
În laborator ovocitele de cățea au fost prelevate din structura ovarului prin două metode:
1. Prin metoda aspirației foliculilor vizibili pe suprafața ovarelor: s-au folosit ace de seringa cu un diametru 25G atașate la o seringă de 1 ml ce conținea 0,2 ml mediu de recoltare.
2. Prin metoda secționării foliculilor și a țesutului ovarian în fragmente cu dimensiuni mici în mediu T199 cu Hepes: pentru aspirarea ovocitelor s-a utilizat pipeta automată de 10-200 µl.
2.2.4. Identificarea ovocitelor și evaluarea caracterelor morfologice
Identificarea ovocitelor de cățea și evaluarea caracterelor morfologice s-a realizat sub stereolupă și/sau sub microscopul cu inversie prevăzut cu o cameră foto.
Ovocitele recoltate au fost clasificate în:
ovocite de calitate bună – formă sferică, diametru >100 µm (fără zona pellucida), citoplasmă închisă la culoare și uniform pigmentată, înconjurate complet de minim două straturi de celule din granuloasă;
ovocite de calitate slabă – diametru <100 µm sau mult mai mare (gigante), citoplasmă deschisă la culoare, neomogenă, granulară, denudate parțial sau total.
Ovocitele de bună calitate au fost trecute mai departe în sistemul de cultură in vitro (Fig. 10).
Fig. 10. Ovocit de calitate bună selectată pentru cultivare in vitro (Microscop inversat, obiectiv 10x)
2.2.5. Cultivarea in vitro și maturarea ovocitelor
Ovocitele au fost maturate în mediu de timp de 72 de ore. Se iau 20 de ovocite din vasul de selecție, spălate în primul și în al doilea godeu al vasului de cultură echilibrat (38°C și 5 % CO2), și apoi s-au pus câte 10 ovocite în al treilea și al patrulea godeu.
După 24, 48 și 72 de ore de cultură s-a evaluat maturarea ovocitelor (determinarea stadiului nuclear). Timpul de maturare trebuie să fie de cel puțin 24 de ore, iar rata maximă pentru metafaza II se obține după 48 – 72 de ore. O perioadă mai lungă nu îmbunătățește semnificativ rata și ovocitele tind să degenereze.
Cercetările au fost realizate pe un număr de 273 ovocite de calitate bună selectate pe baza criteriilor morfologice, distribuite în mod egal în cele 4 medii de cultură utilizate, evaluându-se maturarea după 24, 48 și 72 de ore.
Au fost proiectate mai multe sisteme de cultură in vitro, incluzând atât medii de bază, cât și medii suplimentate.
S-a utilizat un mediu de cultură consacrat în literatura de specialitate pentru maturarea ovocitelor de canide (M 199, 68 ovocite) și trei medii de cultură condiționate, notate cu MIII (68 ovocite), MII (68 ovocite) și MIII (69 ovocite), menite să asigure o susținere nutritivă și energetică corespunzătoare necesarului crescut din timpul maturării ovocitare in vitro.
Protocolul de maturare a fost realizat în trei sisteme de cultură în funcție de perioada de incubare stabilită – cultură pe termen scurt (24 de ore), cultură pe termen mediu (36 de ore) și cultură pe termen lung (72 de ore) – utilizând cele patru medii de cultură în vase de cultură cu patru godeuri.
Condițiile de cultură au fost: temperatura de 38˚C și atmosfera cu 5% CO2.
Ovocitele au fost schimbate în mediu proaspăt după fiecare interval de 24 de ore.
În fiecare etapă (schimbul de mediu), la încheierea perioadei de cultură ovocitele au fost examinate la microscopul cu inversie în vederea stabilirii gradului de maturare pe baza caracteristicilor morfologice.
Ovocitele de calitate slabă cu citoplasmă deschisă la culoare, cele lizate sau prea mici (˂100μm) au fost îndepărtate, iar ovocitele de calitate bună au fost puse în cultură. După 48 de ore nu s-a observat aproape deloc expansiunea cumulusului, dar numeroase celule din granuloasă au fost aplatizate pe fundul vasului de cultură. La sfârșitul culturii (48 sau 72 de ore), ovocitele au fost denudate. Stadiul nuclear poate fi observat uneori chiar sub stereomicroscop.
2.2.6. Aprecierea morfologică, morfocitometrică și clasificarea ovocitelor după cultură
A. Caracteristicile morfologice analizate au fost:
expansiunea cumulusului;
apariția primului globul polar;
uniformitatea spațiului perivitelin;
integritatea zonei pellucida;
aspectul și omogenitatea citoplasmei;
prezența granulației și a vacuolelor.
Pe baza acestor caractere, ovocitele au fost încadrate în trei clase de calitate:
mature – cumulus expandat la peste 10 straturi de celule în jurul ovocitei, globul polar, citoplasmă omogenă, membrana pellucida integră și spațiu perivitelin uniform și fără granulații;
imature – cumulus compact, primul globul polar neexprimat;
degenerate – expandarea insuficientă a celulelor cumulus sau denudări parțiale, citoplasmă granulată, vacuolizată, heterogenă și spațiu perivitelin neuniform.
B. Evaluarea morfocitometrică – am urmărit de asemenea elaborarea unei clasificări a ovocitelor în funcție de criteriile morfocitometrice evaluate, stabilind astfel competența lor pentru fecundarea in vitro. Analiza morfologică la stereomicroscop a fost completată cu măsurători morfometrice.
Examenul morfocitometric – analiza morfocitometrică s-a realizat cu softul NIS-Elements BR 2.30 al microsopului cu inversie, luându-se în studiu grosimea zonei pelucida și a expandării cumulusului după maturare, diametrul ovocitului, apariția și dimensiunea primului globul polar. Măsurătorile morfocitometrice efectuate, completate de examenul morfologic, au permis reîncadrarea ovocitelor în patru clase de calitate în funcție de diametrul ovocitului, dimensiunea cumulusului expandat, grosimea membranei pellucida, lungimea și lațimea primului globul polar.
3. REZULTATE ȘI DISCUȚII
3.1. Evaluarea și perfecționarea metodelor de recoltare a ovocitelor de canide
S-au obținut în medie 46 ovocite de la fiecare femelă, respectiv: 265 (57,11%) ovocite prin metoda secționării fine a țesutului ovarian (10 ovare), 11 (0,02%) prin metoda aspirației foliculilor vizibili și 188 (40,51%) în urma secționării țesutului ovarian după aspirația foliculilor (Fig. 11). Putem concluziona că metoda fragmentării ovarului într-un mediu lichid a avut randamentul cel mai bun.
Fig. 11. Rata de recoltare a ovocitelor în funcție de metoda de recoltare
Numărul de 26 ovocite per ovar obținute prin metoda secționării țesutului ovarian este totuși mai mic față de cel raportat în literatură pentru canide care este de 29-35 ovocite per ovar (Wesselowski, 2008; Ström Holst și colab., 2001). Prin metoda aspirației foliculilor ovarieni s-a obținut în medie 1 ovocit/ovar, mai puțin față de 2,8-3,9 ovocite/ovar (Reynaud și colab., 2005; Songsasen și colab., 2009). Totuși, numărul de femele utilizate în studii este relativ mic, iar variabilitatea în ceea ce privește faza ciclului estral este mare.
Luând în considerare natura studiului și rezultatele publicate anterior (Otoi și colab., 2001; Songsasen și Wildt, 2007), în recoltarea probelor nu s-a ținut cont de stadiul reproductiv al animalului, rasă, greutate, sau dimensiune. Deoarece ovariohisterectomia în timpul estrului este evitată datorită hemoragiei mai accentuate, un număr mic de ovare au prezentat foliculi antrali.
3.2. Identificarea ovocitelor și evaluarea caracterelor morfologice
În urma evaluării morfologice și încadrării în clase de calitate, dintre ovocitele obținute au putut fi utilizate pentru cultură: 156 de ovocite (58,86%) obținute prin metoda secționării fine a țesutului ovarian, 8 ovocite (72,72%) obținute prin metoda aspirației foliculilor vizibili și 130 de ovocite (69,14%) obținute în urma secționării țesutului ovarian după aspirația foliculilor. Rezultatele au subliniat superioritatea metodei de recoltare prin secționarea fină a țesutului ovarian, numărul ovocitelor de calitate bună, destinate culturii in vitro, fiind semnificativ mai mare (Fig. 12). În schimb, prin metoda aspirației foliculilor s-a obținut un procent mai mare de ovocite de calitate.
Procentele obținute sunt asemănătoare ce cele de 26-83% raportate în literatura de specialitate (Lopes colab., 2007; Santos colab., 2006).
Fig. 12. Corelarea numărului de ovocite și calitatea acestora cu metoda de recoltare.
Identificarea ovocitelor de calitate pe baza caracterelor morfologice ne-a oferit informații asupra capacității lor de maturare. Viabilitatea ovocitelor este considerată un factor major ce influențează succesul maturării in vitro (Rodrigues și Rodrigues, 2010).
3.3. Aprecierea morfologică, morfocitometrică și clasificarea ovocitelor după cultură
Cercetările întreprinse au evaluat indicele de maturare in vitro în cele trei sisteme de cultură în funcție de perioada de incubare stabilită – termen scurt, mediu și lung, în variantele de lucru propuse (medii de cultură simple și suplimentate).
În acest studiu am realizat o comparație între patru medii de cultură: un mediu simplu, două medii pentru maturare in vitro și un mediu pentru cultură de blastociști. După 72 de ore de cultură, am obținut un procent de maturare (stadiul MI sau MII) de 68,65% în mediul pentru cultură de blastociști, în timp ce în M199 rata a fost de numai 15,15%.
A. Clasificarea ovocitelor din punct de vedere morfologic
Comparând rezultatele maturării pe termen scurt (24 de ore) în cele patru medii s-a observat că aspectul ovocitelor a fost aproape identic cu cel din momentul recoltării, procentul de degenerare fiind redus (<3%, 8 ovocite).
Comparând rezultatele maturării pe termen mediu (48 de ore), se observă că procentele de maturare au rămas scăzute în toate cele 4 medii, procentul de degenerare fiind ușor mai crescut în mediul M199.
După 72 de ore (maturare pe termen lung), ovocitele au fost încadrate în două categorii de calitate: mature (50,54%, 138 ovocite) și degenerate (49,45%, 135 ovocite). Procentele de maturare în mediile II și III au fost asemănătoare (63,63%, 42 ovocite și 68,65%, 46 ovocite), în timp ce în mediul I s-a înregistrat un procent de maturare de 42,42% (28 ovocite), iar în mediul M199 s-a observat cel mai mic procent de maturare (15,15%, 10 ovocite) și o rată de degenerare de 84,85% (Fig. 13).
Fig. 13. Rata de maturare a ovocitelor de cățea în sistem de cultură pe termen lung
(A) (B)
(C) (D)
(E)
Fig. 14. Încadrarea ovocitelor în clase de calitate după criterii morfologice
(A) Ovocite de calitate slabă cu citoplasmă deschisă la culoare; (B) Ovocit de calitate bună; (C) După 48 de ore, numeroase celule din granuloasă sunt aplatizate pe fundul vasului de cultură; (D) Ovocit denudat, după 48-72 de ore de cultură; (E) Ovocit în stadiul de metafază II, cu globul polar vizibil (GP). Microscopul cu inversie, obiective 10x (A) și 20x (B-E).
Comparând rezultatele maturării în cele patru medii, se evidențiază ovocitele obținute în mediile II și III în cultură pe termen lung, unde procentul de maturare a fost mai ridicat.
Caracterele morfologice stabilite după cultivarea pe termen mediu și lung au permis încadrarea ovocitelor în două clase de calitate:
"mature", care prezentau cumulus expandat, primul globul polar, citoplasma omogenă, membrana pelucida integră și spațiu perivitelin uniform;
"degenerate", care aveau cumulus neexpandat, cu pierderi totale sau parțiale de celule, citoplasmă granulată, retractată și spațiu perivitelin neuniform (Fig 14).
În urma aplicării protocolului de maturare pe o perioadă de 72 de ore s-a observat o creștere semnificativă a numărului de ovocite mature comparativ cu sistemele de cultură de 24 și 36 de ore, corelat cu dezvoltarea ovocitelor, atingerea maturității și pregătirea lor pentru fecundație. Rezultatele satisfacătoare în ceea ce privește procentul de ovocite mature obținute în aceste medii s-au datorat atât prelungirii intervalului de cultură, cât și compoziției mediilor bogate în aminoacizi care susțin maturarea și dezvoltarea celulară ulterioară.
B. Clasificarea ovocitelor din punct de vedere morfocitometric
Măsurătorile morfocitometrice efectuate după cultivarea pe termen mediu și lung, completate de examenul morfologic, ne-au permis reîncadrarea celor 273 de ovocite în patru clase de calitate (Fig. 15, 16, 17), astfel:
31 ovocite (11,35%) au fost încadrate în clasa "mature excelente", având diametrul mai mare de 120 µm, citoplasmă omogenă și zona pellucida intactă, de 12-18 µm, cumulusul expandat la peste 50 µm grosime, spațiu perivitelin uniform și primul globul polar cu un diametru de 9-15 µm;
49 ovocite (17,94%) în clasa "mature bune", cu diametrul de 100-120 µm, cumulus expandat de 40-50 µm grosime, zona pellucida fără rupturi, cu o grosime de 12-18 µm, primul globul polar cu diametrul de 9-15 µm și spațiu perivitelin uniform;
46 ovocite (16,84%) în clasa "imature", cu diametrul mai mic de 100 µm, cumulus compact de maxim 20 µm grosime, zona pellucida fără rupturi, cu o grosime de 10-12 µm, primul globul polar absent și spațiu perivitelin uniform;
restul de 147 ovocite (53,84%) fiind considerate "degenerate", cu denudări parțiale sau totale ale cumulusului, diametru mai mic de 100 µm, citoplasmă heterogenă, granulată, zona pellucida ruptă sau cu o grosime sub 10 µm și spațiu perivitelin neuniform.
Fig. 15. Caracteristici morfocitometrice utilizate pentru clasificarea ovocitelor de cățea cultivate in vitro pe termen lung.
Fig. 16. Clasificarea ovocitelor de cățea cultivate pe termen lung după criterii morfocitometrice.
a. Ovocit încadrat în clasa mature excelente
b. Ovocit încadrat în clasa degenerate c. Ovocit încadrat în clasa imature
Fig.17. Încadrarea ovocitelor în clase de calitate după criterii morfocitometrice. GP=Globul polar. Microscopul cu inversie, obiectiv 20x (a, b și c).
Rezultatele obținute sunt semnificativ mai mari față de cele raportate de literatura de specialitate. Din motive practice, MIV se realizează în cele mai multe cazuri cu ovocite prelevate din ovare în anestru sau diestru. Din această cauză, indiferent de sistemul de maturare, numai 10-20% din ovocite ajung în stadiile MI sau MII (Luvoni și colab., 2005). Cele mai multe ovocite nu își reiau meioza (60%), iar 25% degenerează. Cele care ajung în stadiul MII sunt de slabă calitate, nu se fecundează sau nu pot susține dezvoltarea embrionului (Viaris de Lesegno și colab., 2008). Ovocitele recoltate din foliculi în anestru au ajuns în stadiul MI sau MII în procent de numai 12%, în timp ce cele recoltate din foliculi preovulatori au atins aceste stadii cu o rată de 21-32% (Yamada și col., 1993; Cho și colab., 2012; Enginler și colab., 2014). Randamentele scăzute de maturare și procentele mari de degenerare in vitro comparativ cu in vivo sugerează faptul că mediile de cultură utilizate trebuie îmbunătățite (Reynaud și colab., 2005).
4. CONCLUZII
1. Metoda secționării fine a ovarului într-un mediu lichid a excelat prin numărul mare de ovocite de calitate bună (316 ovocite).
2. Caracterizarea morfologică a ovocitelor de cățea imediat după recoltare permite identificarea celor cu potențial pentru parcurgerea etapelor maturării nucleare și citoplasmatice, condiție esențială pentru realizarea ulterioară a fecundației in vitro.
3. Considerăm utilă completarea aprecierii morfologice realizată la stereolupă cu examenul efectuat la microscopul cu inversie, datorită informațiilor structurale suplimentare pe care le oferă.
8. Maturarea meiotică este un eveniment biologic complex care are loc sub influența factorilor intrinseci și extrinseci. Baza succesului pentru maturarea și fertilizarea ovocitelor este stabilită în timpul creșterii și diferențierii gameților când aceștia sunt în strânsă legatură cu foliculul.
9. În mod clar, la canide există specificitate de specie în ceea ce privește mecanismele de reglare care controlează maturarea meiotică, deoarece aplicarea directă a cunoștințelor obținute la șoarece și vacă, specii la care s-a studiat intens maturarea nucleară, nu a avut succes.
10. Deoarece nu există date privind mecanismele care controlează maturarea meiotică la câine, cercetările ulterioare trebuie îndreptate către identificarea factorilor intrinseci și extrinseci care reglează maturarea meiotică la aceste specii. Aceștia includ:
studii moleculare și celulare despre activarea și fosforilarea protein-kinazei și expresia genelor (ARNm și concentrații de proteine) ce controlează ciclul celular pe parcursul proceselor de foliculogeneză și ovogeneză;
identificarea rolului foliculului, oviductului și spermatozoizilor în maturarea ovocitară.
În plus, determinarea ratelor metabolice ale ovocitelor ar fi de un real folos pentru:
stabilirea normativelor necesităților metabolice;
optimizarea condițiilor de cultură pentru consolidarea IVM și IVF.
BIBLIOGRAFIE
Barber M.R., Lee S.M., Steffens W.L., Ard M., Fayrer-Hosken R.A., 2001. Immunolocalization of zona pellucida antigens in the ovarian follicle of dogs, cats, horses and elephants. Theriogenology 55:1705–1717.
Beijerink N.J., Kooistra H.S., Dieleman S.J., Okkens A.C., 2004. Serotonin antagonist-induced lowering of prolactin secretion does not affect the pattern of pulsatile secretion of follicle stimulating hormone and luteinizing hormone in the bitch. Reproduction, 128:181–188.
Blackmore D.G., Baillie L.R., Holt J.E., Dierkx L., Aitken R.J., McLaughlin E.A., 2004. Biosynthesis of the canine zona pellucida requires the integrated participation of both oocytes and granulosa cells. Biol Reprod, 71:661–668.
Bolamba D., Russ K.D., Olson M.A., Sandler J.L., Durrant B.S., 2002. In vitro maturation of bitch oocytes from advanced preantral follicle in synthetic oviduct fluid medium: serum is not essential. Theriogenology 58:1689–1703.
Chastant-Maillard S., de Lesegno C.V., Chebrout M., Thoumire S., Mezlheuc T., Fontbonne A., Chodkiewicy M., Saint-Dizier M., Reynaud K, 2011. The canine oocyte: uncommon features of in vivo an in vitro maturation. Reprod. Fertil. Dev. 23: 391-402.
Cho S.J., Kim D.H., Min C.S., Kong I.K., 2012. Effects of ovary status and in vitro maturation condition on the developmental competence of canine oocytes. J. Emb. Trans., Vol. 27, No. 4, pp. 265-270.
Christensen B.W. http://longtrailvetsdotcom.files.wordpress.com/2011/12/the-physiology-of-ovulation-timing-in-the-bitch.pdf.
Concannon P., Lasley P, Vanderlip S., 1997. LH release, estrous induction and fertile ovulations in response to pulsatile administration of GnRH in anestrous dog. J. Reprod. Fert. 51:41-54.
Concannon P., Temple M., Montenez A., Newton L., 2006. Effect of dose and duration of continuous GNRH agonist-treatment on induction of estrus in beagle bitches: Competing and concurrent up-regulation and downregulation of LH release. Theriogenology 66:1488-96.
Concannon P.W., McCann J.P., Temple M., 1989. Biology and endocrinology of ovulation, pregnancy, and parturition in the dog. J. Reprod. Fertil. 39(Suppl):3–25.
Cornilă, N., 2000. Embriologia generală. În: Morfologia microscopică a animalelor domestice (cu elemente de embriologie), Volumul II. Ed. BIC ALL, București, 232-237.
De los Reyes M., de Lange J., Miranda P., Palominos J., Barros C., 2005. Effect of human chorionic gonadotrophin supplementation during different culture periods on in vitro maturation of canine oocytes. Theriogenology 64:1–11.
Driancourt M.A, Gougeon A., Monniaux D., Royere D., Thibault C., 2001. Folliculogenèse et ovulation. În: La reproduction chez les mammifères et l’Homme. Ed. Ch. Thibault, M.C. Levasseur, 316 – 347.
Durrant B.S., Pratt N.C., Russ K.D., Bolamba D., 1998. Isolation and characterization of canine advanced preantral and early antral follicles. Theriogenology 49:917-32.
Enginler S.O., Sandal A.I., Özdaș O.B., Arici R., Ertürk E., Çinar E.M., Mohammed I.F., Baran A., Tek Ç., Gündüz M.C., 2014. The effect of oviductal cells on in vitro maturation of canine oocytes in different culture media. Türk. J. Vet: Anim. Sci. 38: 14-19.
Haenisch A., Kolle S., Neumuller C., Sinowatz F., Braun J., 2003. Morphology of canine cumulus-oocyte complexes in pre-pubertal bitches. Anat. Histol. Embryol. 32:373–377.
Hewitt D.A., England G.C., 1999. Synthetic oviductal fluid and oviductal cell coculture for canine oocyte maturation in vitro, Anim. Reprod. Sci. 55(1):63 – 75.
Hossein M.S., Jeong Y.W., Kim S., Kim J.J., Park S.W., Jeong C.S., Hyun S.H., Hwang W.S., 2008. Protocol for the recovery of in vivo matured canine oocytes based on once daily measurement of serum progesterone. Cloning Stem Cells 10(3):403-8.
Ishijima T., Kobayashi Y., Lee D.S., Ueta Y.Y., Matsui M., Lee J.Y., Suwa Y., Miyahara K., Suzuki, H., 2006. Cryoprezervation of canine ovaries by vitrification, J. Reprod. Dev. 52(2):293 – 299.
Jeukenne P., Verstegen J., 1997. Termination of diestrous and induction of estrous in diestrous non pregnant bitches by the prolactin antagonist cabergoline. J. Reprod. Fert. 51:59-66.
Kawakami E., Kashiwagi C., Hori T., Tsutsui T., 2001. Effects of canine oviduct cells on movement and capacitation of homologous spermatozoa in vitro. Anim. Reprod. Sci. 68:121–131.
Kim M.K., Fibrianto Y.H., Oh H.J., Jang G., Kim H.J., Lee K.S., Kang S.K., Lee B.C., Hwang W.S., 2005. Effects of estradiol-17β and progesterone supplementation on in vitro nuclear maturation of canine oocytes. Theriogenology 63:1342–1353.
Lee B.C., 2014. Cloning of Canines. În: Principles of Cloning (Second Edition). Wilmut I., Jaenisch R., Gurdon J., Lanza R., West M., Campbel K.l Cibelli J. (Eds.), Academic Press, 273-285.
Lopes G., Sousa M., Luvoni G.C., Rocha A., 2007. Recovery rate, morphological quality and nuclear maturity of canine cumulus-oocyte complexes collected from anestrous or diestrous bitches of different ages. Theriogenology 68(6):821-5.
Luvoni G.C., Chigioni S., Allievi E., Macis D., 2003. Meiosis resumption of canine oocytes cultured in the isolated oviduct. Reprod. Domest. Anim. 38(5):410 – 414.
Luvoni G.C., Chigioni S., Allievi E., Macis D., 2005. Factors involved in vivo and in vitro maturation of canine oocytes. Theriogenology, 63:41-59.
Mahi C.A., Yanagimachi R., 1976. Maturation and sperm penetration of canine ovarian oocytes in vitro. J. Exp. Zool.;196:189–196.
McDougall K., Hay M.A., Goodrowe K,L., Gartley C.J., King W.A., 1997. Changes in the number of follicles and of oocytes in ovaries of prepubertal, peripubertal and mature bitches. J. Reprod. Fertil. 51(Suppl):25–31.
Miyano T., 2005. In vitro growth of mammalian oocytes. J. Reprod. Dev. 51:169–176.
Otoi T., Ooka A., Murakami M., Karja N.W., Suzuki T. 2001. Size and meiotic competence of oocytes obtained from bitch ovaries at various stages of the oestrous cycle. Reprod. Fertil. Dev. 13(2 – 3):151 – 155.
Otoi T., Willingham L., Shin T., Kraemer D.C., Westhusin M., 2002. Effects of oocyte culture density on meiotic competence of canine oocytes. Reproduction 124(6):775 – 781.
Parrish, J. http://www.ansci.wisc.edu/jjp1/ansci_repro/index.html
Pereira L.M.C., Bicudo S.D., Lopes M.D., 2012. Oocyte maturation in bitches. Anim. Reprod., v.9, n.3, p. 205-209.
Renton J.P., Boyd J.S., Eckersall P.D., Ferguson J.M., Harvey M.J., Mullaney J., Perry B., 1991. Ovulation, fertilization and early embryonic development in the bitch (Canis familiaris). J. Reprod. Fert. 93:221-31.
Reynaud K., Fontbonne A., Marseloo N., Thoumire S., Chebrout M., de Lesegno C.V., Chastant-Maillard S., 2005. In vivo meiotic resumption, fertilization and early embryonic development in the bitch. Reproduction 130:193–201.
Reynaud K., Saint–Dizier M., Chastant–Maillard S., 2004. In vitro maturation and fertilization of canine oocytes. Methods Mol. Biol. 253:255 – 272.
Rocha A.A., Bastos R., Cunha I.C.N., Quirino C.R., 2007. Maturação in vitro de oócitos de cadelas domésticas:efeitos na qualidade oocitária e presença espermática na maturaçao in vitro. Rev. Port. Ciênc. Vet., 102:267-273.
Rodrigues B.A., Dos Santos L.C., Rodrigues J.L., 2004. Embryonic development of in vitro matured and in vitro fertilized dog oocytes. Mol. Reprod. Dev. 67:215–223.
Rodrigues B.A., Rodrigues J.L., 2010. In vitro maturation of canine oocytes: a unique conundrum. Anim. Reprod. 7:3-15.
Rota A., Cabianca G., 2004. In vitro maturation rates of canine oocytes from anoestrous bitches in simple media. Reprod. Nutr. Dev. 44:105–109.
Rota A., Mollo A., Marinelli L., Gabai G., Vincenti L., 2003. Evaluation of cabergoline and busserelin efficacy for oestrus induction in the bitch. Reprod. Dom. Anim. 38:440-43.
Saint-Dizier M., Renard J.P., Chastant-Maillard S., 2001a – Induction of final maturation by sperm penetration in canine oocytes. Reproduction 121:97–105.
Saint-Dizier M., Reynaud K., Chastant-Maillard S., 2004. Chromatin, microtubules and kinases activities during meiotic resumption in bitch oocytes. Mol. Reprod. Dev. 68:205–212.
Saint-Dizier M., Salomon J.F., Petit C., Renard J.P., Chastant-Maillard S., 2001b – In vitro maturation of bitch oocytes: effect of sperm penetration. J. Reprod. Fertil. 57 (Suppl):147–150.
Salavati M., Ghafari F., Zhang, T., Fouladi-Nashta A.A., 2012. Effects of oxygen concentration on in vitro maturation of canine oocytes in a chemically defined serum-free medium. Reproduction, 144: 547–556.
Santos L.C., Rodrigues B.A., Rodrigues J.L., 2006. In vitro nuclear maturation of bitch oocytes in the presence of polyvinyl-pyrrolidone. Anim. Reprod., v.3, n.1, p.70-75.
Silva A.R., Cardoso R.C.S., Silva L.D.M., 2003. Principais aspectos ligados à aplicação da inseminação artificial na espécie canina. Rev. Port. Ci. Vet. 98:53-60.
Songsasen N, Wildt D.E., 2007. Oocyte biology and challenges in developing in vitro maturation systems in the domestic dog. Anim. Reprod. Sci. 98(1-2):2-22.
Songsasen N., Apimeteetumrong M., 2001. Effect of β-mercaptoethanol on formation of pronuclei and developmental competence of swamp buffalo oocytes. Anim. Reprod. Sci. 72:193–202.
Songsasen N., Comiyyoli P., Nagashima J., Fujihara M., Wildt D.E., 2012. The domestic dog an cat as models for understanding the regulation of ovarian follicle development in vitro. Reprod. Domest. Anim. 47 (Suppl. 6):13-18.
Songsasen N., Fickes A., Pukazhenthi B.S., Wildt D.E., 2009. Follicular morphology, oocyte diameter and localization of fibroblast growth factors in the domestic dog ovary. Reprod. Domest. Anim. 44 (Suppl. 2):65-70.
Ström Holst B., Larsson B., Linde-Forsberg C., Rodriguez-Martinez H., 2000. Sperm binding capacity and ultrastructure of the zona pellucida of stored canine oocytes. J. Reprod. Fertil. 119:77–83.
Ström Holst B., Larsson B., Rodriguez-Martinez H., Lagerstedt A.S., Linde-Forsberg C., 2001. Prediction of the oocyte recovery rate in the bitch. J. Vet. Med. A. Physiol. Pathol. Clin. Med., 48(10):587-92.
Velilla E., Rodriguez-Gonzalez E., Vidal F., Paramio M.Y., 2005. Microtubule and microfilament organization in immature, in vitro matured and in vitro fertilized prepubertal goat oocytes. Zygote 13:155–165.
Viaris de Lesegno C.V., Reynaud K., Pechoux C., Chebrout M., Maillard S.C., 2008. Ultrastructural evaluation of in vitro-matured canine oocytes. Reprod. Fertil. Dev., 20:626-639.
Volkman D.H. Kutzler M.A., Wheeler R., Krekeler N., 2006. The use of deslorelin implants for the synchronization of estrus in diestrous bitches. Theriogenology 66(6-7):1497-501.
Wesselowski S. http://krex.k-state.edu/dspace/bitstream/handle/2097/770/SonyaWesselowski 2008.pdf?sequence=1
Yamada S., Shimazu Y., Kawano Y., Nakazawa M., Naito K., Toyoda Y., 1993. In vitro maturation and fertilization of preovulatory dog oocytes. J. Reprod. Fertil. Suppl. 47:227-9.
Zărnescu, O., 2002. Gametogeneza. În: Biologia moleculară a dezvoltării, Partea a II-a. Ed. Universității din București, 9-66.
BIBLIOGRAFIE
Barber M.R., Lee S.M., Steffens W.L., Ard M., Fayrer-Hosken R.A., 2001. Immunolocalization of zona pellucida antigens in the ovarian follicle of dogs, cats, horses and elephants. Theriogenology 55:1705–1717.
Beijerink N.J., Kooistra H.S., Dieleman S.J., Okkens A.C., 2004. Serotonin antagonist-induced lowering of prolactin secretion does not affect the pattern of pulsatile secretion of follicle stimulating hormone and luteinizing hormone in the bitch. Reproduction, 128:181–188.
Blackmore D.G., Baillie L.R., Holt J.E., Dierkx L., Aitken R.J., McLaughlin E.A., 2004. Biosynthesis of the canine zona pellucida requires the integrated participation of both oocytes and granulosa cells. Biol Reprod, 71:661–668.
Bolamba D., Russ K.D., Olson M.A., Sandler J.L., Durrant B.S., 2002. In vitro maturation of bitch oocytes from advanced preantral follicle in synthetic oviduct fluid medium: serum is not essential. Theriogenology 58:1689–1703.
Chastant-Maillard S., de Lesegno C.V., Chebrout M., Thoumire S., Mezlheuc T., Fontbonne A., Chodkiewicy M., Saint-Dizier M., Reynaud K, 2011. The canine oocyte: uncommon features of in vivo an in vitro maturation. Reprod. Fertil. Dev. 23: 391-402.
Cho S.J., Kim D.H., Min C.S., Kong I.K., 2012. Effects of ovary status and in vitro maturation condition on the developmental competence of canine oocytes. J. Emb. Trans., Vol. 27, No. 4, pp. 265-270.
Christensen B.W. http://longtrailvetsdotcom.files.wordpress.com/2011/12/the-physiology-of-ovulation-timing-in-the-bitch.pdf.
Concannon P., Lasley P, Vanderlip S., 1997. LH release, estrous induction and fertile ovulations in response to pulsatile administration of GnRH in anestrous dog. J. Reprod. Fert. 51:41-54.
Concannon P., Temple M., Montenez A., Newton L., 2006. Effect of dose and duration of continuous GNRH agonist-treatment on induction of estrus in beagle bitches: Competing and concurrent up-regulation and downregulation of LH release. Theriogenology 66:1488-96.
Concannon P.W., McCann J.P., Temple M., 1989. Biology and endocrinology of ovulation, pregnancy, and parturition in the dog. J. Reprod. Fertil. 39(Suppl):3–25.
Cornilă, N., 2000. Embriologia generală. În: Morfologia microscopică a animalelor domestice (cu elemente de embriologie), Volumul II. Ed. BIC ALL, București, 232-237.
De los Reyes M., de Lange J., Miranda P., Palominos J., Barros C., 2005. Effect of human chorionic gonadotrophin supplementation during different culture periods on in vitro maturation of canine oocytes. Theriogenology 64:1–11.
Driancourt M.A, Gougeon A., Monniaux D., Royere D., Thibault C., 2001. Folliculogenèse et ovulation. În: La reproduction chez les mammifères et l’Homme. Ed. Ch. Thibault, M.C. Levasseur, 316 – 347.
Durrant B.S., Pratt N.C., Russ K.D., Bolamba D., 1998. Isolation and characterization of canine advanced preantral and early antral follicles. Theriogenology 49:917-32.
Enginler S.O., Sandal A.I., Özdaș O.B., Arici R., Ertürk E., Çinar E.M., Mohammed I.F., Baran A., Tek Ç., Gündüz M.C., 2014. The effect of oviductal cells on in vitro maturation of canine oocytes in different culture media. Türk. J. Vet: Anim. Sci. 38: 14-19.
Haenisch A., Kolle S., Neumuller C., Sinowatz F., Braun J., 2003. Morphology of canine cumulus-oocyte complexes in pre-pubertal bitches. Anat. Histol. Embryol. 32:373–377.
Hewitt D.A., England G.C., 1999. Synthetic oviductal fluid and oviductal cell coculture for canine oocyte maturation in vitro, Anim. Reprod. Sci. 55(1):63 – 75.
Hossein M.S., Jeong Y.W., Kim S., Kim J.J., Park S.W., Jeong C.S., Hyun S.H., Hwang W.S., 2008. Protocol for the recovery of in vivo matured canine oocytes based on once daily measurement of serum progesterone. Cloning Stem Cells 10(3):403-8.
Ishijima T., Kobayashi Y., Lee D.S., Ueta Y.Y., Matsui M., Lee J.Y., Suwa Y., Miyahara K., Suzuki, H., 2006. Cryoprezervation of canine ovaries by vitrification, J. Reprod. Dev. 52(2):293 – 299.
Jeukenne P., Verstegen J., 1997. Termination of diestrous and induction of estrous in diestrous non pregnant bitches by the prolactin antagonist cabergoline. J. Reprod. Fert. 51:59-66.
Kawakami E., Kashiwagi C., Hori T., Tsutsui T., 2001. Effects of canine oviduct cells on movement and capacitation of homologous spermatozoa in vitro. Anim. Reprod. Sci. 68:121–131.
Kim M.K., Fibrianto Y.H., Oh H.J., Jang G., Kim H.J., Lee K.S., Kang S.K., Lee B.C., Hwang W.S., 2005. Effects of estradiol-17β and progesterone supplementation on in vitro nuclear maturation of canine oocytes. Theriogenology 63:1342–1353.
Lee B.C., 2014. Cloning of Canines. În: Principles of Cloning (Second Edition). Wilmut I., Jaenisch R., Gurdon J., Lanza R., West M., Campbel K.l Cibelli J. (Eds.), Academic Press, 273-285.
Lopes G., Sousa M., Luvoni G.C., Rocha A., 2007. Recovery rate, morphological quality and nuclear maturity of canine cumulus-oocyte complexes collected from anestrous or diestrous bitches of different ages. Theriogenology 68(6):821-5.
Luvoni G.C., Chigioni S., Allievi E., Macis D., 2003. Meiosis resumption of canine oocytes cultured in the isolated oviduct. Reprod. Domest. Anim. 38(5):410 – 414.
Luvoni G.C., Chigioni S., Allievi E., Macis D., 2005. Factors involved in vivo and in vitro maturation of canine oocytes. Theriogenology, 63:41-59.
Mahi C.A., Yanagimachi R., 1976. Maturation and sperm penetration of canine ovarian oocytes in vitro. J. Exp. Zool.;196:189–196.
McDougall K., Hay M.A., Goodrowe K,L., Gartley C.J., King W.A., 1997. Changes in the number of follicles and of oocytes in ovaries of prepubertal, peripubertal and mature bitches. J. Reprod. Fertil. 51(Suppl):25–31.
Miyano T., 2005. In vitro growth of mammalian oocytes. J. Reprod. Dev. 51:169–176.
Otoi T., Ooka A., Murakami M., Karja N.W., Suzuki T. 2001. Size and meiotic competence of oocytes obtained from bitch ovaries at various stages of the oestrous cycle. Reprod. Fertil. Dev. 13(2 – 3):151 – 155.
Otoi T., Willingham L., Shin T., Kraemer D.C., Westhusin M., 2002. Effects of oocyte culture density on meiotic competence of canine oocytes. Reproduction 124(6):775 – 781.
Parrish, J. http://www.ansci.wisc.edu/jjp1/ansci_repro/index.html
Pereira L.M.C., Bicudo S.D., Lopes M.D., 2012. Oocyte maturation in bitches. Anim. Reprod., v.9, n.3, p. 205-209.
Renton J.P., Boyd J.S., Eckersall P.D., Ferguson J.M., Harvey M.J., Mullaney J., Perry B., 1991. Ovulation, fertilization and early embryonic development in the bitch (Canis familiaris). J. Reprod. Fert. 93:221-31.
Reynaud K., Fontbonne A., Marseloo N., Thoumire S., Chebrout M., de Lesegno C.V., Chastant-Maillard S., 2005. In vivo meiotic resumption, fertilization and early embryonic development in the bitch. Reproduction 130:193–201.
Reynaud K., Saint–Dizier M., Chastant–Maillard S., 2004. In vitro maturation and fertilization of canine oocytes. Methods Mol. Biol. 253:255 – 272.
Rocha A.A., Bastos R., Cunha I.C.N., Quirino C.R., 2007. Maturação in vitro de oócitos de cadelas domésticas:efeitos na qualidade oocitária e presença espermática na maturaçao in vitro. Rev. Port. Ciênc. Vet., 102:267-273.
Rodrigues B.A., Dos Santos L.C., Rodrigues J.L., 2004. Embryonic development of in vitro matured and in vitro fertilized dog oocytes. Mol. Reprod. Dev. 67:215–223.
Rodrigues B.A., Rodrigues J.L., 2010. In vitro maturation of canine oocytes: a unique conundrum. Anim. Reprod. 7:3-15.
Rota A., Cabianca G., 2004. In vitro maturation rates of canine oocytes from anoestrous bitches in simple media. Reprod. Nutr. Dev. 44:105–109.
Rota A., Mollo A., Marinelli L., Gabai G., Vincenti L., 2003. Evaluation of cabergoline and busserelin efficacy for oestrus induction in the bitch. Reprod. Dom. Anim. 38:440-43.
Saint-Dizier M., Renard J.P., Chastant-Maillard S., 2001a – Induction of final maturation by sperm penetration in canine oocytes. Reproduction 121:97–105.
Saint-Dizier M., Reynaud K., Chastant-Maillard S., 2004. Chromatin, microtubules and kinases activities during meiotic resumption in bitch oocytes. Mol. Reprod. Dev. 68:205–212.
Saint-Dizier M., Salomon J.F., Petit C., Renard J.P., Chastant-Maillard S., 2001b – In vitro maturation of bitch oocytes: effect of sperm penetration. J. Reprod. Fertil. 57 (Suppl):147–150.
Salavati M., Ghafari F., Zhang, T., Fouladi-Nashta A.A., 2012. Effects of oxygen concentration on in vitro maturation of canine oocytes in a chemically defined serum-free medium. Reproduction, 144: 547–556.
Santos L.C., Rodrigues B.A., Rodrigues J.L., 2006. In vitro nuclear maturation of bitch oocytes in the presence of polyvinyl-pyrrolidone. Anim. Reprod., v.3, n.1, p.70-75.
Silva A.R., Cardoso R.C.S., Silva L.D.M., 2003. Principais aspectos ligados à aplicação da inseminação artificial na espécie canina. Rev. Port. Ci. Vet. 98:53-60.
Songsasen N, Wildt D.E., 2007. Oocyte biology and challenges in developing in vitro maturation systems in the domestic dog. Anim. Reprod. Sci. 98(1-2):2-22.
Songsasen N., Apimeteetumrong M., 2001. Effect of β-mercaptoethanol on formation of pronuclei and developmental competence of swamp buffalo oocytes. Anim. Reprod. Sci. 72:193–202.
Songsasen N., Comiyyoli P., Nagashima J., Fujihara M., Wildt D.E., 2012. The domestic dog an cat as models for understanding the regulation of ovarian follicle development in vitro. Reprod. Domest. Anim. 47 (Suppl. 6):13-18.
Songsasen N., Fickes A., Pukazhenthi B.S., Wildt D.E., 2009. Follicular morphology, oocyte diameter and localization of fibroblast growth factors in the domestic dog ovary. Reprod. Domest. Anim. 44 (Suppl. 2):65-70.
Ström Holst B., Larsson B., Linde-Forsberg C., Rodriguez-Martinez H., 2000. Sperm binding capacity and ultrastructure of the zona pellucida of stored canine oocytes. J. Reprod. Fertil. 119:77–83.
Ström Holst B., Larsson B., Rodriguez-Martinez H., Lagerstedt A.S., Linde-Forsberg C., 2001. Prediction of the oocyte recovery rate in the bitch. J. Vet. Med. A. Physiol. Pathol. Clin. Med., 48(10):587-92.
Velilla E., Rodriguez-Gonzalez E., Vidal F., Paramio M.Y., 2005. Microtubule and microfilament organization in immature, in vitro matured and in vitro fertilized prepubertal goat oocytes. Zygote 13:155–165.
Viaris de Lesegno C.V., Reynaud K., Pechoux C., Chebrout M., Maillard S.C., 2008. Ultrastructural evaluation of in vitro-matured canine oocytes. Reprod. Fertil. Dev., 20:626-639.
Volkman D.H. Kutzler M.A., Wheeler R., Krekeler N., 2006. The use of deslorelin implants for the synchronization of estrus in diestrous bitches. Theriogenology 66(6-7):1497-501.
Wesselowski S. http://krex.k-state.edu/dspace/bitstream/handle/2097/770/SonyaWesselowski 2008.pdf?sequence=1
Yamada S., Shimazu Y., Kawano Y., Nakazawa M., Naito K., Toyoda Y., 1993. In vitro maturation and fertilization of preovulatory dog oocytes. J. Reprod. Fertil. Suppl. 47:227-9.
Zărnescu, O., 2002. Gametogeneza. În: Biologia moleculară a dezvoltării, Partea a II-a. Ed. Universității din București, 9-66.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Studiul Metodelor Si Tehnicilor Utilizate In Maturarea In Vitro A Ovocitelor LA Canide (ID: 158173)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.