Studiu Asupra Raspunsului Inflamator In Hipoxia Acuta Si Cronica

LUCRARE DE LICENȚĂ

„Studiu asupra răspunsului inflamator în hipoxia acută și cronică”

CUPRINS

Introducere

Partea generală

1. Inflamația

1.1 Repere istorice

1.2 Inflamația acută

1.3 Inflamația cronică

1.4 Mediatorii chimici ai inflamației

1.5 Citokinele și chemokinele

1.6 Efectele sistemice ale inflamației

2. Hipoxia

2.1 Definiția și evaluarea hipoxiei

2.2 Clasificar

2.3 Tipurile de hipoxie

2.4 Simptomele și semnele din hipoxie

2.5 Mecanisme compensatorii în hipoxie

2.6 Mecanisme adaptative celulare și moleculare

2.7 Hipoxia, o particularitate a tumorilor maligne

3. Răspunsul inflamator asociat hipoxiei

3.1 Rolul factorului Nf-kappaB în inflamație

3.2 Activarea NF-kappaB de către hipoxie și inter-relația cu HIF

3.3 Efectele hipoxiei asupra imunității înnăscute

3.4 Efectele hipoxiei asupra imunității adaptative

3.5 Rolul hidroxilazelor în inflamația asociată hipoxiei

3.6 Semnalizarea purinergică în inflamația asociată hipoxiei

4. Modele de hipoxie acută și cronică

4.1 Hipoxia cronică din BPOC

4.2 Hipoxia acută din stroke

Partea specială

1. Introducere

2. Materiale și metode

3. Rezultate

4. Discuții

Concluzii

Bibliografie

Introducere

Hipoxia este starea caracterizată de o presiune scăzută a oxigenului în țesut, fiind întâlnită într-o gamă variată de condiții fiziopatologice, precum ischemia, cancerul sau inflamația.

Hipoxia și inflamația sunt însă și interconectate la nivel molecular, celular și clinic, fiind implicate în patogeneza unui mare număr de patologii, ce reprezintă cauze de dizabilitate de interes global, motivând studiul aprofundat al inflamației asociate hipoxiei.

Atunci când este declanșată de ocluzia vasculară, hipoxia este asociată cu ischemia tisulară și exprimarea unui fenotip proinflamator.

Acest răspuns inflamator indus de hipoxie rezultă în recrutarea celulelor inflamatorii, activarea căilor de semnalizare și secreția citokinelor proinflamatorii și a chemokinelor. De asemenea, concentrațiile scăzute de oxigen prelungesc supraviețuirea neutrofilelor, cresc permeabilitatea endotelială și exsudatul vascular.

Inflamația nu este numai cauzată de hipoxie, dar este la rândul ei o cauză de hipoxie, țesutul inflamat devenind hipoxic ca urmare a infiltratului celular, a edemului și a microtrombilor. Scăderea consecutivă a presiunii oxigenului va induce din nou inflamație, contribuind la menținerea unei bucle de autoîntreținere a inflamației și hipoxiei și la constituirea de noi leziuni tisulare.

Pentru a exemplifica această inter-relație dintre hipoxie și inflamație, am luat în considerare două modele fiziopatologice, al ischemiei din stroke, ca model de hipoxie acută, respectiv al hipoxiei cronice din bronhopneumopatia cronică obstructivă, model în care hipoxia și inflamația se potențează reciproc.

Aceste modele fiziopatologice sunt cu atât mai relevante cu cât atât BPOC cât și stroke ocupă primele locuri în ceea ce privește morbiditatea, mortalitatea și cauza de dizabilitate în lume, având poveri crescute pentru societate.

În studiul răspunsului inflamator s-au utilizat nivelele citokinelor, markeri fideli ai inflamației.

Așadar, în cazul pacienților cu BPOC am analizat nivelele serice ale citokinelor IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 și TNFα, cu rol central în dezvoltarea răspunsului inflamator local și sistemic ce stă la baza patogenezei BPOC și a comorbidităților din BPOC.

În cazul pacienților cu stroke am urmărit nivelele serice și în LCR ale citokinelor IL-6, IL-10 și TNFα, cea care se corelează constant cu evoluția clinică și severitatea fiind IL-6.

În urma importanței pe care aceste citokine o prezintă în dezvoltarea celor două patologii, se impune discutarea mecanismelor care le cresc expresia în condiții de hipoxie și inflamație, ajungând la concluzia că acestea sunt reprezentate, printre altele, de comunicarea dintre căile de semnalizare ale factorului indus de hipoxie (HIF), factorul cheie în adaptarea la hipoxie, și factorul de transcripție NF-κB, reglatorul principal din inflamație.

Această comunicare este asemănătoare, binențeles, cu unele particularități, în hipoxia acută și în cea cronică, reprezentând un punct de legătură între răspunsurile inflamatorii din cele două modele de hipoxie.

Partea generală

Inflamația

Inflamația este un proces fiziologic complex, robust și bine conservat din punct de vedere evolutiv care ajută organismul să se adapteze la schimbările din mediul intern sau extern. În mod virtual, orice afecțiune, fie acută, fie cronică este indusă sau modulată de inflamație. Se observă o recunoaștere crescândă a faptului că rolul inflamației în homeostazie este o parte integrantă în procese considerate a fi „inevitabile” în cursul vieții, cum ar fi îmbatrânirea, obezitatea, diabetul sau ateroscleroza [1].

Printre afecțiunile în care inflamația are un rol unanim recunoscut se numără infecțiile/sepsis, traumatismele, bolile inflamatorii intestinale, afecțiunile reumatologice, astmul bronșic, iar multe alte boli, cum ar fi cancerul, diabetul, ateroscleroza , boli degenerative ca boala Alzheimer și obezitatea, sunt de asemenea asociate cu perturbări inflamatorii [2].

Inflamația poate fi considerată ca un proces acut, cu debut rapid și durată scurtă, de ore sau zile (cum ar fi în stările de sepsis, traume, vindecarea leziunilor) sau cronic (în boli cum ar fi artrita reumatoidă, colita ulcerativă, boala Crohn, etc), în funcție de natura stimulului și de eficiența reacției inițiale în eliminarea stimulului sau țesuturilor deteriorate. Totuși, deși anterior se considera ca acestea se desfășoară pe căi total diferite, actual se acceptă faptul că aceste două procese sunt interconectate pentru a da organismului o mai mare flexibilitate în protecția împotriva diferiților factori nocivi [3]. Mai mult decât atât, răspunsul inflamator poate fi declanșat nu doar de leziunile tisulare, ci și de stress, disfuncția celulară sau chiar de hipoxie [4].

Răspunsul inflamator acut implică o cascadă de evenimente mediate de către o gamă largă de celule și molecule care au rolul de a localiza patogenii sau țesutul deteriorat, de a recruta alte celule și molecule, de a elimina agenții ofensatori și, în cele din urmă, de a restabili echilibrul organismului. Reacțiile vasculare sau celulare ale inflamației sunt generate de factori solubili produși de diferite celule sau derivate din proteinele plasmatice produse sau activate ca răspuns la stimulul inflamator. Acești mediatori inițiază și amplifică răspunsul inflamator și determină gradul de severitate precum și manifestările clinice și patologice. Inflamația este terminată atunci când este eliminat agentul ofensator. Reacția se rezolvă rapid pentru că mediatorii sunt disipați și leucocitele au viață scurtă în țesuturi. În plus, mecanismele anti-inflamatorii sunt activate și servesc pentru a controla răspunsul și a preveni producerea de daune excesive gazdei. Răspunsul inflamator este strâns legat de procesul de reparare. Reparația începe în timpul inflamației, dar ajunge la finalizare, de obicei, după ce influența dăunătoare a fost neutralizată. În procesul de reparare, țesutul rănit este înlocuit prin regenerarea celulelor parenchimatoase native, prin umplerea defectului cu țesut fibros (cicatrici) sau, mai frecvent, printr-o combinație a acestor două procese [5].

În mod paradoxal, deși răspunsul inflamator este necesar pentru buna desfășurare a procesului reparator, prin perpetuarea unei bucle de feedback pozitiv, acesta poate evolua chiar pâna la producerea de leziuni extensive, disfuncții de organe și chiar deces [6]. Pe de altă parte, acest răspuns inflamator puternic susținut ar putea fi un corespondent care să sugereze severitatea leziunii inițiale precum și pregătirea timpurie a organismului pentru o infecție secundară [7].

Îmbinarea buclelor de feedback pozitiv și negativ precum și mecanismele complexe și uneori redundante ce stau la baza inflamației conferă acestui proces robustețea necesară apărării organismului, în condițiile unei funcționări fiziologice [8], însă existența totodată a numeroase puncte de control în aceste mecanisme complexe supune procesul inflamației la un echilibru fragil între o desfășurare normală, caracteristică unei reacții de apărare, și un proces patologic scăpat de sub control [9].

Repere istorice

Pentru a avea o înțelegere mai profundă asupra răspunsului inflamator și a nivelului la care a ajuns cercetarea inflamației astăzi, este necesar să se ia în considerare și istoria dezvoltării acestei cunoașteri.

Semne și consecințe ale inflamatiei au fost cunoscute încă de medicii din vechile culturi sumeriene și egiptene, astfel, chiar în Codul lui Hammurabi (2000 î.Hr.) se face referire la modalitatea de a trata abcese ale ochiului [10]. Cu toate acestea, abia Hipocrate din Cos, cu termenii pe care i-a introdus, ca “edem” și “erizipel”, a început sa dezvolte un vocabular legat de inflamație.

Prima descriere a simptomelor clasice ale inflamației se găsește în scrierile lui Aulus Celsus (d. 38), care, în lucrarea sa De Medicina, a introdus patru din cele cinci simptome cardinale ale inflamatiei: rubor, tumor, calor și dolor (eritem, edem, căldură, și durere). Mai târziu, Galenus din Pergam va adăuga și al cincilea semn, functio laesa. Acest semn va fi observat și de Rudolf Virchow (1871), care va face observații și asupra aderării și migrării leucocitelor. Cele mai importante contribuții în acest domeniu în sec. al XIX-lea vor fi aduse de biologul Ilia Mecinikov (1893) și de Julius Cohnheim (1877, 1889), care a descris aderarea și migrarea leucocitelor[11].

Marele merit al lui Mecinikov a fost că, într-un context în care încă majoritatea patologilor nu credea în rolul protectiv al inflamației, a susținut faptul că aceasta reprezintă de fapt răspunsul de aparare al organismului împotriva agenților agresori, iar fagocitele constituie prima linie în această apărare[12]. Pentru această contribuție revoluționară, Mecinikov, părintele teoriei celulare a inflamației, va primi în 1908 Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină, pe care îl va împărți cu Paul Ehrlich, cel ce susținea, de pe o poziție concurentă, teoria umorala, cercetând cascada complementului și anticorpii[13].

Sir Thomas Lewis, studiind raspunsul inflamator la nivelul pielii, a sugerat faptul că substanțe chimice, cum ar fi histamina ar media modificările vasculare ale inflamatiei, acest aspect fiind apoi studiat cu ajutorul microscopului electronic de către Majno și Palade [14]. Acest concept fundamental va sta la baza descoperirii unor mediatori chimici ai inflamației și utilizării medicamentelor anti-inflamatoare în medicina clinică.

Dacă timp de 200 de ani cercetările s-au desfășurat la nivel celular, în ultimii 30 de ani acestea analizat nivelul molecular. Odată cu dezvoltarea tehnologiilor de recombinare genică s-au putut face pași înainte în fiziologia inflamației, prin studiul citokinelor, chemokinelor, a receptorilor lor și a moleculelor de adeziune[12].

Aceste descoperiri ce s-au realizat de-a lungul timpului au facilitat, pe lângă o cunoaștere teoretică mai aprofundată a fenomenului, și o aplicabilitate clinică mai coerentă. Totuși, dacă ne orientăm după ritmul alert în care se defășoară cercetarea în acest domeniu, se pare că, în ciuda istoriei de câteva mii de ani, studiul răspunsului inflamator încă ne oferă surprize și, totodată, posibilități multiple de cercetare.

Inflamația acută

Inflamația acută este răspunsul imediat la injuriile tisulare. Acesta este un proces nespecific, cu valoare primară de apărare și este de scurtă durată, fiind în principal o reacție vasculară (Figura 1.1).

Figură 1.1 Componentele celulare implicate în inflamație. (Kumar, V, Abbas, A K, Fausto, N, Mitchell, R N, Robbins Basic Pathology, 9th ed., Elsevier Health Sciences, 2012.)

Semnele clinice cardinale

Descrierea clasică a reacției locale inflamatorii s-a perpetuat încă din primele secole, când Celsus și apoi Virchow au introdus cele ce ulterior vor fi cunoscute ca ”semnele cardinale ale inflamației”: rubor (eritem), tumor (edem), calor (căldură locală), dolor (durere) și functio laesa (impotență funcțională). Dacă pentru primele trei semne sunt responsabile modificările vasculare și recrutarea celulară, următoarele două sunt consecințele elaborării de mediatori și a distrugerii celulare de către leucocite[15].

Etiologie

Reacția inflamatorie acută poate fi inițiată de o varietate de stimuli, cum ar fi:

Infecțiile (bacteriene, virale, fungice, parazitare) și toxinele microbiene căile de semnalizare fiind de obicei cele inițiate prin cuplarea cu receptorii TLR.

Necroza tisulară de orice cauză, inclusiv cea cauzată de ischemie (ca în infarctul miocardic acut), traumatisme, agenți fizici sau chimici (de ex. leziunile termice, ca arsurile sau degerăturile; iradiere; expunerea la anumite substanțe chimice din mediu). De asemenea, hipoxia, care adesea stă la baza injuriei celulare, este el însuși un inductor al răspunsului inflamator. Acesta este în mare măsură mediat de o proteină numită HIF-1α, produsă de către celulele private de oxigen și care activează transcrierea mai multor gene implicate in inflamație, printre care și cea care codifică factorul de creștere endotelial (VEGF), ce va crește permeabilitatea vasculară[16].

Corpuri străine (cioburi, murdărie, suturi) care provoacă leziuni traumatice sau transportă agenți agresori biologici.

Reacțiile imune (numite și reacții de hipersensibilitate) sunt reacțiile în care sistemul imunitar își pierde funcția de protecție și devine dăunător propriilor țesuturi. Răspunsul imun poate fi îndreptat împotriva propriilor antigene, cauzând boli autoimune, sau pot fi reacții exagerate împotriva substanțelor din mediu sau a germenilor. Pentru că, în acest caz, stimulii nu pot fi eliminați, reacțiile imune tind să persiste în timp și să se asocieze cu inflamația cronică, cauză importantă de morbiditate și mortalitate[17].

Etapele desfășurării reacției inflamatorii

Reacțiile inflamatorii, de orice cauză, se desfășoară după o schemă de principiu, ce cuprinde o secvență de etape distinctive:

Apariția unor modificări vasculare locale;

Reacția celulară și constituirea local a unui infiltrat celular proinflamator;

Reparația tisulară.

Modificări vasculare locale

Vasodilatația locală

Vasodilatația este una dintre manifestările ce apar imediat după o injurie, urmând de multe ori unei vasoconstricții tranzitorii, ce durează câteva secunde. Vasodilatația va acționa întâi asupra arteriolelor si apoi asupra patului capilar, determinând creșterea fluxului de sânge. Aceasta va avea corespondent clinic în creșterea temperaturii locale și apariția eritemului local. Această modificare a calibrului vascular se produce sub efectul mai multor mediatori, în special histamină și NO (oxid nitric) asupra mușchiului neted vascular. Din punct de vedere biologic, creșterea patului vascular va determina scăderea vitezei sângelui, cu creșterea vâscozității sangvine și stază. Staza și vasodilatația au în final rolul de a determina acumularea masivă de leucocite și factori umorali în vasele locale.

Creșterea permeabilității vasculare

Aproape simultan cu vasodilatația se constată un alt fenomen caracteristic inflamației acute și anume creșterea permeabilității vasculare, ce va duce la constituirea exudatului inflamator în parenchim și, astfel, la apariția edemului local. Acestea vor avea la bază câteva mecanisme, cum ar fi: contracția celulelor endoteliale, provocată de mediatori ca histamina, bradikinina, leucotriene, neuropeptidul P; leziuni ale endoteliului, produse de neutrofilele ce aderă la endoteliu, de arsuri sau microorganisme; și transcitoza, favorizată de VEGF.

Modificări fenotipice ale endoteliului vascular

Pe lângă modificările deja menționate și în același timp cu ele, se va constata la nivelul celulelor endoteliale aflate strict în focar, activate de către mediatori, creșterea expresiei receptorilor de adeziune intercelulară, ceea ce va favoriza aderarea leucocitelor la endoteliu și ulterior trecerea lor prin diapedeză în țesutul interstițial[18].

Reacția celulară și constituirea infiltratului celular proinflamator

Una dintre funcțiile esențiale în inflamație este atracția leucocitelor la locul leziunii și activarea lor pentru eliminarea agenților incriminați. Leucocitele cele mai importante în reacția inflamatorie tipică sunt cele capabile de fagocitoză, și anume neutrofilele și macrofagele. Aceste leucocite ingeră și ucid bacteriile și alți microbi și elimină țesutul necrozat și substanțele străine. Leucocitele produc, de asemenea, factori de creștere, care ajută la reparația țesuturilor în urma inflamației. Un preț care este plătit însă pentru potența defensivă a leucocitelor este că, atunci când sunt activate puternic, pot induce leziuni tisulare și prelungi inflamația, deoarece produșii leucocitelor care lizează microorganismele și țesuturile necrotice pot leza, de asemenea, și țesuturile normale.

Secvențele majore care vizează leucocitele se referă mai întâi la 1. recrutarea lor în focarul inflamator și apoi la funcția lor de 2. recunoaștere și îndepărtare a microorganismelor și celulelor parenchimatoase moarte.

Recrutarea leucocitelor în focarul inflamator

Drumul leucocitelor din lumenul vascular până în focarul inflamator poate fi împărțită în următoarele etape: (1) marginația și rularea, (2) aderarea și migrarea prin diapedeză printre celulele endoteliale și (3) chemokinezia în țesuturile interstițiale către un stimul chemoatractant.

Marginația și rularea. Odată cu circulația sângelui din capilare în venulele postcapilare, leucocitele sunt împinse din coloana axiala centrală înspre periferie. Acest proces de acumulare a leucocitelor la periferia vaselor este numit marginație. Ulterior, leucocitele se vor rostogoli pe suprafața endoteliului vascular pavimentos, legându-se tranzitoriu pe parcurs, un proces denumit rulare.

Legăturile relativ slabe și tranzitorii implicate în rulare sunt realizate de către familia selectinelor. Selectinele sunt receptori exprimați pe leucocite și endoteliu. Acestea includ selectina E (numit CD62E), limitată la endoteliu; selectina P (CD62P), prezentă pe endoteliu, în organismele intracelulare Weibel-Palade, și trombocite; și selectina L (CD62L), pe suprafața celor mai multe leucocite. Selectinele leagă oligozaharidele sialice (de exemplu, oligozaharida Lewis de pe leucocite), care tapetează glicoproteinele de pe celulele țintă[19].

Aderarea și diapedeza. În cele din urmă, leucocitele aderă ferm de suprafața endoteliului (aderare) înainte de a migra printre celulele endoteliale și prin membrana bazală în spațiul extravascular (diapedeză). Molecule de adeziune endoteliale includ ICAM-1 (molecula de adeziune intercelulară-1) și VCAM-1 (molecula de adeziune a celulelor vasculare-1); citokinele, cum ar fi TNF si IL-1 induce expresia ICAM-1 și VCAM-1. Integrinele sunt glicoproteine transmembranare heterodimerice (lanțuri α și β), care, de asemenea, funcționează ca receptori celulari pentru matricea extracelulară. Principalele integrine care se vor lega de ICAM-1 sunt LFA-1 (CD11a/CD18) și Mac-1 (CD11b/CD18); VCAM-1 se leagă de integrina VLA-4. Integrinele sunt în mod normal exprimate pe leucocite dar nu aderă la liganzii corespunzători până când leucocitele sunt activate de factorii chemotactici sau de alți stimuli produși de endoteliu sau de alte celule din focar[20].

După aderarea fermă la suprafața endotelială, leucocitele migrează în primul rând prin aplatizare si strecurarea printre celule la nivelul joncțiunilor intercelulare (deși a fost descrisă mișcarea intracelulară prin citoplasma celulelor endoteliale).

Chemoatracția și activarea. După extravazare, leucocitele migrează către focarul inflamator de-a lungul unui gradient chimic într-un proces numit chemoatracție. Factorii chemoatractanți pentru leucocite pot fi atât exogeni cât și endogeni: (1) produsele solubile bacteriene; (2) C5a și C3a; (3) leucotriena B4 (LTB4); și citokine (4), în special cele din familia chemokinelor (de exemplu, IL-8).

Aceste molecule se leagă de receptorii specifici, activând fosfolipaza C mediat de proteina G; fosfolipaza C hidrolizează fosfatidilinozitol bisfosfatul (PIP2) din membrana plasmatică în diacilglicerol (DAG) și inozitol trisfosfat (IP3). DAG apoi provoacă o serie de evenimente secundare, în timp ce IP3 crește concentrația Ca intracelular (eliberare din reticululul endoplasmatic și influx extracelular). Aceasta determină asocierea elementelor contractile citoscheletale necesare locomoției. Leucocitele se deplasează prin emiterea unui lamelipod ce se va ancora la matricea extracelulară și apoi va trage celula în direcția prelungirii. Astfel, la vârful lamelipodului, actina este polimerizată în filamente lungi; în același timp, filamentele de actină în altă parte în celula trebuie demontate pentru a permite fluxul în direcția prelungirii. Direcția de mișcare astfel este determinată de o mai mare densitate a interacțiunii receptori-liganzi chemoatractanți de la nivelul polului celular aflat spre focarul inflamator și spre factorul chemoatractant (în primele 24 ore neutrofilele, iar în următoarele 24-48 ore macrofagele)[21] (Figura 1.2).

Figură 1.2 Derularea evenimentelor celulare în inflamație. (Kumar, V, Abbas, A K, Fausto, N, Mitchell, R N, Robbins Basic Pathology, 9th ed., Elsevier Health Sciences, 2012.)

Pe lângă locomoție, factorii chemoatractanți induc, de asemenea, alte răspunsuri ale leucocitelor, denumite generic activarea leucocitară.

Funcția leucocitelor în focarul inflamator

Fagocitoza constă din trei distincte dar interdependente etape: (1) recunoașterea și atașarea particulei; (2) endocitoza; și (3) liza materialului endocitat.

Recunoașterea și fixarea de leucocite la cele mai multe microorganisme este facilitată de proteine serice generic numit opsonine. Opsoninele cele mai importante sunt imunoglobulina G (IgG) (mai exact porțiunea Fc a moleculei), un fragmentul C3b al complementului și colectinele, care se leagă de grupări glucidice din peretele microbian. Macrofagele pot capta însă și particulele sau fragmente de bacterii/virusuri neopsonizate. Prin intermediul receptorilor TLR se recunosc și se leagă direct de diferite structuri biochimice din componența microorganismelor. Odată cu captarea se transmit semnale activatoare care contribuie la activarea generala a celulelor proinflamatorii.

Ultimul pas în fagocitoză este reprezentat de liza totală a particulei endocitate. Citotoxicitatea poate fi oxigen-dependentă sau oxigen-independentă. Prima se realizează în mare parte prin speciile reactive de oxigen (ROS) și de azot. Acesti radicali liberi de oxigen și azot atacă și deteriorează lipidele, proteinele și acizii nucleici ai microbilor precum și macromoleculele gazdei.

Citotoxicitatea oxigen-independentă se realizează prin ionii de hidrogen, ce activează și factorii bactericizi, lizozim, hidrolaze acide, proteine cationice, lactoferină și defensine cuprinși în granulele leucocitelor[22].

Reparația tisulară

Reparația țesuturilor se suprapune procesului inflamator și este un răspuns la leziunile tisulară, pentru a menține structura și funcția lor normale. Leziunile severe sau îndelungate distrug atât celulele parenchimatoase cât și matricea extracelulară în așa măsură încât reparația nu se mai poate realiza doar prin regenerarea parenchimatoasă, în aceste condiții fiind necesară înlocuirea cu țesut conjunctiv, care cuprinde următoarele etape:

1) Fibroplazia

Acest proces se desfășoară în două etape: (1) migrarea și proliferarea fibroblaștilor în focarul inflamator și (2) depunerea de matrice extracelulară (MEC) de către aceste celule. Fiind stimulați de celulele din focarul inflamator, fibroblaștii capătă un fenotip secretor, realizând sinteza de colagen. Ca urmare, se formează țesutul de granulație compus în mare parte din fibroblaști mari, inactivi, fibre dense de colagen, fragmente de țesut elastic și alte componente ale MEC.

2) Angiogeneza

Angiogeneza sau neovascularizația se realizează printr-o succesiune de evenimente și anume: degradarea proteolitică a membranei bazale (MB), cu formarea de fenestrații, migrarea celulelor endoteliale prin aceste fenestrații către stimulul angiogenetic, proliferarea celulelor restante pentru a ocupa locul celor migrate și, în final, maturarea endoteliului, cu inhibiția creșterii și tubularizarea capilarelor nou formate. Cei mai importanți factori care stimulează acest proces al angiogenezei sunt FGF și factorul de creștere al endoteliului vascular (VEGF).

3) Remodelarea tisulară

Trecerea de la țesutul de granulație la cicatricea definitivă implică anumite modificări în componența MEC și presupune un echilibru între sinteza și degradarea MEC. Degradarea colagenului și a altor componente ale MEC se realizează prin intermdiul unor enzime numite metaloproteinaze. Aceste enzime sunt secretate de o mare varietate de celule (macrofage, fibroblaști, neutrofile, sinoviocite, unele celule epiteliale), iar sinteza lor este controlată de factori de creștere, citokine, fagocitoză și chiar stress-ul fizic. De asemenea, acestea, fiind foarte active în acțiunea lor degradativă, pot fi rapid inhibate de către inhibitorii tisulari ai metaloproteazelor (TIMP), produși de cele mai multe celule mezenchimale. Sinteza acestor metaloproteaze și a inhibitorilor lor este spațiată temporal în cadrul reparării țesuturilor, fiind esențială în debridarea țesuturilor lezate și în remodelarea MEC, necesară reparației defectelor tisulare[23].

Rezultatul inflamației acute (Figura 1.3)

• Rezoluția completă este de obicei rezultatul atunci când prejudiciul este limitat sau de scurtă durată sau atunci când distrugerea țesutului a fost redusă.

• Vindecarea prin fibroză apare dacă lezarea țesutului a fost substanțială sau când există un exudat fibrinos abundent în țesuturi sau cavități seroase (pleură, peritoneu).

• Evoluția către inflamația cronică se produce fie din cauza persistenței agentului agresor fie din cauza unor interferențe cu procesul normal de vindecare[17].

Figură 1.3 Rezultatul răspunsului inflamator. (Kumar, V, Abbas, A K, Fausto, N, Mitchell, R N, Robbins Basic Pathology, 9th ed., Elsevier Health Sciences, 2012.)

Inflamația cronică

Inflamația cronică este o inflamație de durată lungă (săptămâni sau luni) în care inflamația, leziunile tisulare și încercările de reparație coexistă, în diferite combinații. Aceasta este cauza leziunilor tisulare în unele dintre cele mai comune și dizabilitante patologii, precum artrita reumatoidă, ateroscleroza, tuberculoza și fibroza pulmonară. Este, de asemenea, implicată în progresia cancerului și în boli odată considerate a fi pur degenerative, cum ar fi boala Alzheimer.

Caracteristici morfologice: • Infiltratul alcătuit în special din celule mononucleare, care includ macrofage, limfocite și celulele plasmatice. • Leziuni tisulare importante. • Încercări de refacere tisulară prin înlocuirea cu țesut conjunctiv, realizată prin angiogeneză și, în special, fibroză.

Celulele și mediatorii implicați în inflamația cronică

Macrofagele reprezintă celulele cheie în inflamația cronică. Monocitele încep să migreze în țesuturile extravasculare destul de devreme în inflamația acută și, în termen de 48 de ore, poate constituie tipul predominant de celule, transformându-se în macrofage. Activarea macrofagelor determină un nivel crescut de enzime lizozomale și de specii reactive de oxigen și azot precum și sinteza de citokine, factori de creștere și alți mediatori ai inflamației. Diferitele populații de macrofage servesc funcții distincte — unele pot fi importante pentru eliminarea microorganismelor și inflamație, iar altele pentru reparație. Aceasta este cauza pentru care distrugerea țesutului este unul din semnele distinctive din inflamația cronică. Distrugerea tisulară poate la rândul său să activeze cascada inflamatorie, astfel încât în anumite circumstanțe pot coexista caracteristici ale ambelor tipuri de inflamație, acută și cronică.

Limfocitele sunt recrutate în focarul inflamator de către citokinele secretate de macrofagele activate, în special TNF, IL-1 și chemokine, stimulând persistența răspunsului inflamator. Limfocitele și macrofagele interacționează în mod bidirecțional, aceste reacții jucând un rol important în inflamația cronică. Din cauza acestor interacțiuni între LT și macrofage, odată ce sistemul imunitar este implicat într-o reacție inflamatorie reacția tinde să devină cronică și severă și este uneori numită inflamație imună. Plasmocitele reprezintă LB activate ce produc anticorpi împotriva antigenelor persistente sau împotriva componentelor tisulare alterate.

De asemenea, în afara infiltratului celular, în reacțiile inflamatorii cronice se observă și o creștere a patului vascular sanguin și limfatic, stimulată de factori de creștere, precum VEGF, produs de macrofage și celule endoteliale[24].

Mediatorii chimici ai inflamației

Mediatorii pot fi plasmatici (de obicei sintetizați de ficat) sau pot fi produși local de celulele din focarul de inflamație. Mediatorii plasmatici circulă ca precursori inactivi, care trebuie să fie supuși clivajului proteolitic pentru a dobândi proprietățile lor biologice, iar mediatorii celulari se găsesc în mod normal în granule intracelulare și sunt secretați la sau sunt sintetizați de novo ca răspuns la un stimul. Funcția mediatorilor este în general este strict controlată. Acest control strict se datorează faptului că majoritatea mediatorilor au potențialul de a provoca efecte dăunătoare inclusiv asupra țesuturilor normale (Figura 1.4).

Figură 1.4 Mediatorii chimici ai inflamației. (Kumar, V, Abbas, A K, Fausto, N, Mitchell, R N, Robbins Basic Pathology, 9th ed., Elsevier Health Sciences, 2012.)

Mediatorii plasmatici

Sistemul complementului constă dintr-o cascadă de peste 20 de proteine plasmatice, care joacă un rol important atât în imunitate cât și în inflamație. Clivarea C3 se realizează: (1) prin intermediul căii clasice, declanșată de fixarea C1 la complexele antigen-anticorp; (2) prin calea alternă, declanșată de polizaharide bacteriene; sau (3) calea lectinică, în care lectina din plasmă se leagă de manoza de pe microorganisme și activează direct C1. Oricare dintre aceste căi este urmată, convertaza C3 scindează C3 la C3a și C3b. C3b se leagă apoi la complexul convertazei C3 pentru a forma convertaza C5; Aceasta scindează C5 pentru a genera C5a care va fi eliberat și C3b care va rămâne legat de suprafața celulară și va lega celelalte componente (C6-C9) pentru a forma complexul de atac al membranei (MAC) care va determina liza celulară prin constituirea unor pori în membrana celulei. C3a și C5a (numite anafilotoxine) cresc permeabilitatea vasculară și cauzează vasodilatație prin inducerea eliberării histaminei din mastocite. C5a activează leucocitele și este un puternic agent chemotactic. C3b si C3bi acționează ca opsonine pentru suprafețele germenilor, favorizând fagocitoza lor[25].

Coagularea și sistemul kininelor. Inflamația și coagularea sunt două procese ce se împletesc deseori, promovându-se reciproc.

Sistemul coagulării este împărțit în două căi care converg, culminând în activarea trombinei și formarea de fibrina. Calea intrinsecă de coagulare este reprezentată de o serie de proteine plasmatice, care pot fi activate cu ajutorul factorului Hageman (factorul XII). Inflamația crește producția mai multor factori de coagulare, face suprafața endotelială pro-trombogenică și inhibă mecanismele de anticoagulare. De asemenea, trombina promovează inflamația prin legarea de niște receptori numiți receptori activați de proteze (PAR).

Concomitent cu activarea coagulării, factorul XIIa induce și activarea sistemului fibrinolitic pentru a contrabalansa efectul primei.

Kininele sunt peptide vasoactive derivate din kininogen, clivat prin acțiunea proteazei numite kalikreină. Sistemele kininei și coagulării sunt, de asemenea, strâns legate.

Astfel, factorul Hageman activat (factor XIIa) inițiază patru sisteme implicate în cadrul răspunsului inflamator: sistemul kininei, care produce kinine vasoactive (bradikinina); sistemul coagulării, care induce formarea trombinei, cu proprietăți inflamatorii; sistemul fibrinolitic, ce produce plasmina și degradează fibrina pentru a produce fibrinopeptide, care induc inflamația; și sistemul complementului, care produce anafilatoxine și alți mediatori. Unii produși din aceste cascade, în special kalikreina, pot activa factorul Hageman, rezultând în amplificarea reacției[26].

Mediatorii celulari

Amine vasoactive. Histamina este distribuită în special în mastocitele adiacente vaselor, deși este de asemenea prezentă bazofilele și trombocitele circulante. Histamina preformată este stocată în granule și este eliberată ca răspuns la o varietate de stimuli: traumatismele sau căldura, imunitari, C3a și C5a, neuropeptidele (de exemplu, substanța P) și anumite citokine (de exemplu, IL-1 și IL-8). Histamina determină dilatarea arteriolelor și este mediatorul principal al fazei precoce de creștere a permeabilității vasculare, inducând contracția endoteliului.

Serotonina (5-hidroxitriptamina) este, de asemenea, un mediator vasoactiv preformat, cu efecte similare cu cele ale histaminei. Acesta este găsit în principal în granulele trombocitelor și este eliberat în timpul agregării plachetare.

Constituenții lizozomali ai leucocitelor. În timp ce proteazele acide au un pH acid optim la care sunt active, proteazele neutre, cum sunt elastaza, colagenaza și catepsina, sunt active și în matricea extracelulară și pot leza membrana bazala sau proteine din matrice. Aceste efecte sunt însă combătute de o serie de antiproteaze, cum ar fi α2-macroglobulin (în ser), sau α1-antitripsina, evitându-se astfel leziunile tisulare exagerate.

Neuropeptidele sunt peptide mici, ca substanța P sau neurokinina A, secretate de fibrele nervoase senzitive (în special din plămâni și tractul gastrointestinal) și unele leucocite, care au rol în inițierea și propagarea răspunsului inflamator. Substanța P are ca funcții biologice transmiterea semnalelor de durere, controlul tensiunii arteriale, stimularea secreției endocrine, și creșterea permeabilității vasculare[22].

Metaboliții acidului arahidonic (eicosanoide): prostaglandine, leucotriene și lipoxine. Substanțele derivate din metabolismul AA afectează o mare varietate de procese biologice, inclusiv inflamația și hemostaza. AA este un acid gras polinesaturat cu 20 de atomi de carbon prezent în organism în principal în formă esterificată ca o componentă a fosfolipidelor membranare. Metabolismul AA continuă de-a lungul uneia dintre cele două căi majore: a ciclooxigenazei, cu sinteza de prostaglandine și tromboxani, sau a lipoxigenazei, sintetizând leucotriene și lipoxine.

Calea ciclooxigenazei. Cuprinde două enzime cheie, COX-1, exprimată constitutiv și COX-2, inductivă. Cele mai importante produse în inflamație din această cale includ prostaglandinele (PG) E2 (PGE2), PGD2, PGF2α, PGI2 (prostaciclinei), și tromboxan A2 (TXA2). Astfel, trombocitele conțin enzima tromboxan sintază, rezultând TXA2, un puternic agregand plachetar si vasoconstrictor, iar celulele endoteliale, pe de altă parte, nu au tromboxan sintază dar posedă prostaciclin sintază, ceea ce duce la formarea de PGI2, un vasodilatator și un inhibitor puternic al agregării plachetare. PGD2 este metabolitul din mastocite și este chemoatractant pentru neutrofile; PGE2 și PGF2α provoacă vasodilatație și potențează formarea de edem. Prostaglandinele sunt, de asemenea, implicate în patogeneza durerii și febrei în inflamație.

Calea Lipoxigenazei. Dintre cele 3 lipoxigenaze, 5-lipoxigenaza (5-LO) este enzima predominantă în neutrofile. Prima generată se numește leucotriena A4 (LTA4), care la rândul său generează LTB4 prin hidroliza enzimatica sau LTC4 prin adăugarea de glutation. LTB4 este un agent puternic chemotactic pentru neutrofile. LTC4 și metaboliții săi ulteriori, LTD4 și LTE4, provoacă vasoconstricție, bronhospasm și creșterea permeabilității vasculare.

Lipoxinele sunt sintetizate folosind metabolismul transcelular. Astfel, trombocitele vor sintetiza lipoxinele A4 și B4 (LXA4 și LXB4), din intermediarul LTA4 din neutrofile. Lipoxinele au mai ales acțiuni antiinflamatorii, inhibând chemotaxia și aderarea neutrofilelor. Relația inversă între formarea lipoxinelor și cea a leucotrienelor sugerează faptul că lipoxinele ar putea fi inhibitori naturali ai acțiunilor leucotrienelor, contribuind astfel la rezoluția inflamației.

Factorul activator plachetar (PAF) este un alt mediator derivat din fosfolipide cu un spectru larg de efecte inflamatorii. În afară de stimularea plachetară, PAF cauzează vasoconstricție și bronhoconstricție și este 100 la 10.000 de ori mai puternic decât histamina în inducerea vasodilatației și creșterea permeabilității vasculare la concentrații foarte reduse[27].

Oxidul nitric (NO) și radicalii liberi de oxigen. NO este un gaz solubil, descoperit inițial ca EDRF (factorul de relaxare derivat din endoteliu) și cunoscut pentru efectul său vasodilatator prin relaxarea musculaturii netede vasculare. NO este sintetizat din L-arginină de către sintaza oxidului nitric (NOS). Există trei tipuri diferite de NOS: endotelială (eNOS), neuronală (nNOS) și inductibilă (iNOS).

Radicalii liberi de oxigen sunt sintetizați prin calea NADPH oxidazei. Superoxidul este ulterior transformat în H2O2, OH• și derivați toxici de NO. La niveluri scăzute, aceste specii reactive de oxigen pot crește expresia chemokinelor, citokinelor și moleculelor de aderare, la niveluri mai ridicate, aceste molecule sunt implicate în mai multe mecanisme lezionale tisulare, inclusiv leziuni endoteliale[28].

Citokinele și chemokinele

Citokinele sunt polipeptide produse de diferite tipuri de celule (dar în principal limfocite activate și macrofage), care modulează funcția altor celule. Acestea includ factori de stimulare a coloniilor; mulți din factorii de creștere; interleukinele; și chemokinele.

Celulele produc diverse tipuri de citokine, efectele lor tind să fie pleiotropice (diferite celule sunt afectate în mod diferit de aceeași citokină), iar secreția lor este de obicei tranzitorie și bine controlată.

Cunoscute pentru implicarea lor în răspunsul imun celular, citokinele au efecte adiționale cu rol important atât în inflamația acută cât și în cea cronică. Ele pot acționa autocrin, paracrin, sau sistemic (efect endocrin); activitățile sunt mediate de legarea de receptori specifici.

Citokinele sunt frecvent redundante, astfel că aceeași activitate poate fi indusă de mai multe proteine diferite. Există, de asemenea, o suprapunere considerabilă între citokinele implicate în inflamație acută și cronică. Mai exact, toate citokine enumerate în inflamația acută pot contribui și la reacția inflamatorie cronică.

Interleukina-1 și factorul de necroză tumorală (TNF-α)

Deși din punct de vedere istoric sunt asociate cu răspunsurile imune celulare, diverse citokine, în special IL-1 și TNF, au efecte suplimentare care sunt importante în răspunsurile inflamatorii. Atât IL-1 cât și TNF sunt produse de macrofagele activate (IL-1 poate fi sintetizată și de alte tipuri de celule), iar secreția lor este stimulată de endotoxine, complexe imune, toxine, traumatisme, sau diverși mediatori ai inflamației. Atât IL-1 cât și TNF induc activarea endotelială cu creșterea expresiei moleculelor de adeziune, secreția de citokine suplimentare și factori de creștere, sinteza eicosanoidelor și oxid nitric (NO) și stimularea trombogenicității endoteliale. TNF determină, de asemenea, recrutarea și activarea neutrofilelor și eliberarea de enzime proteolitice din celulele mezenchimale, contribuind astfel la deteriorarea țesutului. Ambele citokine activează fibroblastele tisulare, stimulând proliferarea și producerea matricei extracelulare.

Sinteza de IL-1 este controlat de un complex multi-proteic numit ”inflamasom”, ce răspunde la stimuli proveniți din microorganisme sau celule moarte. Acesta activează proteaze din familia caspazelor, care vor cliva precursorul inactiv al IL-1 în citokina activă. Mutațiile genelor ce codifică proteinele din acest complex sunt responsabile pentru apariția sindroamelor autoinflamatoare moștenite, cum ar fi cele din familia febrei mediteraneene. De asemenea, inflamasomul poate fi activat de cristale de urat, în gută, în cadrul căreia se pare că inflamația este mediată cel puțin parțial de IL-1.

IL-1 și TNF precum și IL-6 sunt implicate și în răspunsul de fază acută asociat inflamației. Acesta include febra, letargia, sinteza hepatică a diferitelor proteine, eliberarea de neutrofile în circulație și eliberarea de hormon adrenocorticotrop. TNF controlează și balanța energetică prin mobilizarea lipidelor și proteinelor și suprimarea apetitului, contribuind la apariția cașexiei (caracterizată prin sădere ponderală și anorexie) ce însoțește unele infecții cronice sau boli neoplazice. Tot TNF joacă un rol important în medierea efectelor hipotensive ale șocului septic, inclusiv scăderea contractilității miocardice și relaxarea musculaturii netede vasculare (Figura 1.5).

O altă citokină proinflamatorie este IL-17, produsă în principal de limfocitele T, care promovează recrutarea de neutrofile[29].

Figură 1.5 Efectele citokinelor IL-1 și TNFα. (Kumar, V, Abbas, A K, Fausto, N, Mitchell, R N, Robbins Basic Pathology, 9th ed., Elsevier Health Sciences, 2012.)

IL-6

Deși a fost considerată inițial strict o citokină proinflamatorie, acum îi sunt recunoscute și proprietățile antiinflamatorii precum și implicarea intr-o multitudine de alte procese printre care răspunsul de fază acută, hematopoieza, gliogeneza, boli autoimune și chiar neurotroficitatea. IL-6 este produsă mai ales de fibroblaștii activați, limfocitele recrutate în focar, celulele endoteliale și printre acțiunile sale se numără stimularea sintezei hepatice de proteine de fază acută și a axului hipotalamo-hipofizo-corticosuprarenalian, cu creșterea secreției de hormoni glucocorticoizi, ambele cu rol antiinflamator. De asemenea, această citokină inhibă recrutarea neutrofilelor și antagonizează și realizează un control asupra citokinelor proinflamatorii precum IL-1β și TNF-α.

Lista citokinelor implicate în inflamație este în continuă dezvoltare însă, acestea ocupînd un rol central atât în inflamația acută cât și în cea cronică[27].

Chemokinele sunt o familie de mici (8-10 kD) proteine care acționează în primul rând ca chemoatractanți pentru diferite tipuri de leucocite.[63] Până acum au fost identificate circa 40 de chemokine diferite și 20 de receptori pentru chemokine. Acestea sunt clasificate în patru grupe majore, în funcție de dispunerea reziduurilor de cisteină conservate în proteina matură:

• Chemokinele C-X-C (numite și α-chemokine) au un rest de aminoacid ce separă primele două resturi conservate de cisteină. Acestea acționează în primul rând pe neutrofile și au ca reprezentant IL-8 (CXCL8). Acesta este secretat de macrofagele activate, celulele endoteliale dar și alte tipuri de celule și realizează activarea și chemotaxia neutrofilelor, având o activitate limitată pe monocite și eozinofile. Secreția sa este indusă în special de produșii microbieni precum și de alte citokine, mai ales, IL-1 și TNF.

• Chemokinele C-C (numite și β-chemokine) includ MCP-1 (monocyte chemoattractant protein), eotaxin, MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1α), și RANTES (regulated and normal T-cell expressed and secreted) și acționează, în general, asupra monocitelor, eozinofilelor, bazofilelor, limfocitelor dar nu și asupra neutrofilelor. Deși cele mai multe dintre chemokinele din această clasă au acțiuni suprapuse, eotaxina recrutează selectiv eozinofilele.

• Chemokinele C (numite și γ-chemokine) sunt relativ specifice pentru limfocite (de ex., limfotactin).

• Chemokinele CX3C conține trei aminoacizi între două resturi de cisteină. Singurul membru cunoscut din această clasă este numit fractalkin.

Chemokinele se leagă de receptori transmembranari cuplați cu proteina G. Acești receptori (numiți CXCR sau CCR, pentru C-X-C sau C-C) prezintă de obicei specificitate încrucișată și leucocitele au, în general, mai multe tipuri de receptori. Chemokinele au două funcții principale: recrutarea leucocitelor în inflamație și controlul migrării normale a celulelor prin diferite țesuturi[30].

Efectele sistemice ale inflamației

Aceste efecte sunt numite colectiv reacție de fază acută sau, uneori, sindromul răspunsului inflamator sistemic. Febra este unul dintre cele mai evidente din aceste efecte, altele includ somnolență, malaise, anorexie, catabolism accelerat al proteinelor musculare scheletice, hipotensiune arterială, sinteza hepatică de proteine (de exemplu, complement și de coagulare) și modificări în bazinul de celule albe din sângele circulant.

Citokinele IL-1, IL-6 și TNF sunt cei mai importanți mediatori ai reacției de fază acută. Aceste citokine sunt produse de leucocite (și alte tipuri de celule) ca răspuns la infecție, sau la leziunile toxice și imune și sunt eliberate sistemic, frecvent în cascadă. Astfel, TNF induce sinteza de IL-1, care la rândul său stimulează producția de IL-6. Deși există unele diferențe, TNF și IL-1 au efecte similare, spre exemplu, ambele acționează asupra centrului de termoreglare din hipotalamus, prin intermediul sintezei locale de PGE, pentru a induce febra. De asemenea, citokinele stimulează sinteza hepatică a proteinelor de fază acută, IL-6 pe cea a proteinei C reactive (CRP) și a fibrinogenului, iar IL-1 și TNF pe cea amiloidului seric A (SAA). Leucocitoza este o caracteristică comună a reacțiilor inflamatorii, în special cele induse de infecția bacteriană. Leucocitoza este inițial rezultată prin eliberarea celulelor din măduva osoasă (cauzată de IL-1 și TNF) și este asociată cu un număr crescut de neutrofile relativ imature în sânge ("virare la stânga"). Infecții prelungite pot de asemenea să inducă proliferarea precursorilor în măduva osoasă, prin creșterea producției de factori de stimulare a coloniei, determinată de IL-1 și TNF.

În infecții bacteriene grave (sepsis), cantitățile mari de microorganisme și LPS din sânge stimulează sinteza unor cantități enorme de diverse citokine, în special TNF și IL-1. Aceste nivele ridicate de citokine provoacă diverse manifestări clinice, cum ar fi coagularea intravasculară diseminată, insuficiență cardiovasculară, și tulburări metabolice, ce sunt descrise ca șoc septic[31].

Hipoxia

Definiția și evaluarea hipoxiei

Hipoxia se referă la procesul patologic în care țesuturile suferă de o lipsă de oxigen, fie din cauza unui aport inadecvat comparativ cu nevoile lor, fie din cauza unor deficiențe in utilizarea oxigenului. Astfel, hipoxia poate fi cauzată de una sau mai multe din următoarele situații:

Scăderea presiunii parțiale a oxigenului în sângele arterial (PaO2);

Scăderea capacității de legare a oxigenului;

Scăderea fluxului sanguin către țesuturi;

Scăderea utilizării oxigenului de către țesuturi.

Parametri ai oxigenului sangvin necesari pentru evaluarea hipoxiei:

Presiunea parțială a oxigenului este influențată de PO2 din aerul inspirat, de funcția extrarespiratorie și de șunturile arterio-venoase. Valori normale: PaO2= 100 mmHg,PvO2 = 40 mmHg.

Capacitatea de legare a oxigenului reprezintă cantitatea de oxigentransportată în 100 ml de sânge, depinde de cantitatea de Hb existentă și de afinitatea acesteia pentru oxigen, având ca valori normale: CaO2 max = CvO2 max = 20ml/dl.

Conținutul în oxigen depinde de PO2 și de capacitatea de legare a oxigenului și are ca valori normale: CaO2 = 19ml/dl, CvO2 = 14ml/dl, diferența arterio-venoasă de oxigen, DAV = CaO2-CvO2 = 5ml/dl.

Saturația în oxigen a Hb reprezintă unul dintre cei mai importanți parametri în evaluarea hipoxiei, este procentul de oxihemoglobină față de hemoglobina totală (teoretic, saturația ar fi 100%, dar din cauza șuntului dreapta ‐ stânga scade la 97‐98%) și este determinată de PaO2 la o afinitate normală, iar la o PaO2 dată poate fi influențată de câțiva parametri precum: pH, PaCO2, temperatura și 2,3-difosfoglicerat. SaO2 = (CaO2-O2 dizolvat/CaO2 max) x 100%, NSaO2 > 95%, NSvO2 = 70%.

Curba de disociere a oxihemoglobinei reprezintă legătura dintre PaO2 și SaO2 și are la normal formă sigmoidă, de S italic. Creșterea concentrației de hidrogen, a pCO2, a temperaturii și a 2,3-DPG scade afinitatea Hb pentru oxigen și deplasează curba la dreapta, pe când scăderea acestora crește afinitatea pentru oxigen și deplasează curba la stânga. (Figura 2.1)

P50 este presiunea parțială a oxigenului la care 50% din Hb este saturată și are valori normale de P50 = 26-27 mmHg. Scăderea P50 semnifică faptul că Hb se saturează mai ușor și astfel curba de disociere se deplasează la stânga, iar creșterea P50 deplasează curba la dreapta[32].

Clasificare

În funcție de mecanismul de producere, se pot întâlni patru tipuri de hipoxie:

Hipoxia hipoxemică;

Hipoxia anemică;

Hipoxia circulatorie;

Hipoxia histotoxică.

Fiecare dintre aceste mecanisme se pot manifesta în formă acută sau cronică și, de asemenea, două sau mai multe mecanisme de producere pot fi prezente simultan.

În funcție de durata desfășurării, hipoxia poate fi clasificată în:

Hipoxia cronică este cel mai frecvent întâlnită, fiind cea care însoțește patologiile cronice respiratorii, cardiovasculare sau hematologice.

Hipoxia acută este mai puțin frecventă și poate fi prezentă în cazul ascensiunilor montane rapide la mari altitudini, al obstrucțiilor căilor aeriene, inhibării centrului respirator, insuficiență cardiacă acută și șoc.

Hipoxia fulminantă este o formă ce se dezvoltă într-un timp foarte scurt și în condiții speciale, cum ar fi avaria cabinei avionului la altitudini de peste 10 km, caz în care presiunea oxigenului din mediul extern este sub presiunea în sângele venos și astfel, organismul cedează oxigen mediului.

Tipurile de hipoxie

Hipoxia hipoxemică

Hipoxia hipoxemică se datorează scăderii presiunii parțiale a oxigenului în sângele arterial, capacitatea de transport al oxigenului și utilizarea oxigenului de către țesuturi rămânând normale (Tabel 2.3.1).

Cauze:

Presiune scăzută a oxigenului în aerul inspirat, cum se întâmplă la altitudini mari;

Patologii ce cauzează hipoventilație: patologii obstructive precum astmul bronșic, patologii neuromusculare precum poliomielita, deprimarea centrilor respiratorii în tumori cerebrale, pneumotorax;

Reducerea ratei de difuziune a oxigenului prin membrana respiratorie: emfizem pulmonar, fibroză pulmonară, edem pulmonar, pneumonie, lipsa surfactantului;

Patologii cardiovasculare cu șunt dreapta – stânga.

Hipoxia anemică

Apare în condițiile scăderii capacității de transport al oxigenului de către sânge.

Cauze:

Număr scăzut de eritrocite, din insuficiențe medulare, hemoragii;

Cantitatea scăzută de hemoglobină din sânge;

Formarea de Hb alterată, cum este methemoglobina;

Combinarea Hb cu gaze precum monoxidul de carbon, hidrogen sulfurat sau oxid nitros, cu pierderea capacității de a transporta oxigen.

Hipoxia ischemică sau distributivă

Este determinată de scăderea fluxului sanguin către țesuturi.

Cauze:

Generalizată: șoc, insuficiență cardiacă congestivă;

Localizată: ateroscleroză, tromboză, embolism.

Hipoxia citotoxică

Este produsă de incapacitatea țesuturilor de a utiliza oxigenul.

Cauze:

Hipoxia histotoxică apare în cazul intoxicațiilor cu cianuri sau sulfuri, substanțe ce alterează enzimele oxidative și sistemul oxidativ citocromial[33].

Tabel I Caracteristicile diferitelor tipuri de hipoxie

Simptomele și semnele din hipoxie

Simptomele din hipoxie depind de rapiditatea instalării, severitatea ei și eficiența mecanismelor compensatorii. În funcție de acestea, hipoxia se va prezenta sub formă fulminantă, acută sau cronică.

Hipoxia fulminantă se referă la hipoxia severă, instalată foarte rapid, în decursul a câtorva secunde după expunerea la o presiune parțială a oxigenului arterial mai mică de 20 mmHg, astfel, se va produce pierderea conștienței în 15 – 20 de secunde și moartea cerebrală în aproximativ 4 – 5 minute.

Hipoxia acută se dezvoltă în urma expunerii la o PaO2 între 25 – 40 mmHg, iar simptomele sale seamănă cu cele din intoxicația acută cu etanol: lipsa coordonării, încetinirea reflexelor, limbaj incoerent, tulburări de comportament și, în final, pierderea conștienței. Coma și moartea se pot produce în câteva minute pâna la câteva ore, în cazul în care mecanismele compensatorii sunt ineficiente.

Hipoxia cronică apare în urma expunerii prelungite la PaO2 scăzute (40 – 60 mmHg) și prezintă ca simptome: oboseală, dispnee, respirații ineficiente, cum ar fi respirația Cheyne-Stokes.

Principalele semne din hipoxie includ:

Cianoza reprezintă colorația albastră a tegumentelor și mucoaselor ca urmare a prezenței a mai mult de 5 mg deoxihemoglobină/100 ml de sânge capilar. Aceasta este însă un semn inconstant, putând lipsi în hipoxia anemică sau în cea histotoxică.

Tahicardia, un mecanism compensator cardiac.

Tahipneea este prezentă în hipoxia hipoxemică ce are PaO2 scăzută, dar lipsește în cea anemică și în cea distributivă[34].

Mecanisme compensatorii în hipoxie

Acomodarea

Se referă la adaptarea imediată a sistemelor respirator și cardiovascular la hipoxie și includ:

Hiperventilația se produce secundar stimulării chemoreceptorilor periferici de către presiunea parțială de oxigen scăzută în sângele arterial. Aceasta va cauza creșterea PaO2 și scăderea PCO2, cu alcaloză respiratorie, care va cauza, la rândul său, reducerea frecvenței respiratorii.

Tahicardia este determinată tot de răspunsul chemoreceptorilor periferici la concentrația scăzută de oxigen și are rolul de a crește fluxul sanguin tisular prin creșterea indexului cardiac.

Creșterea concentrației de 2,3 – difosfoglicerat (2,3 – DPG) în eritrocite are loc ca răspuns la hipoxie și alcaloză și crește P50 a Hb, ajutând astfel la o creștere ușoară a cantității oxigenului ce ajunge la țesuturi.

Aclimatizarea

Se referă la modificările țesuturilor și organelor ca răspuns la expunerea de lungă durată la hipoxie:

Policitemia, datorată creșterii eliberării eritropoietinei;

Creșterea ventilației gradual până la de 5 ori mai mult decât normalul;

Modificările cardiovasculare, ce includ creșterea frecvenței, a forței de contracție și a debitului cardiac, încep din perioada de acomodare și vor reveni la normal abia după ce aportul oxigenului la țesuturi se normalizează;

Hipertensiunea pulmonară se produce secundar vasoconstricției pulmonare generalizate datorate hipoxiei;

Creșterea capacității pulmonare totale și a capacității de difuziune apare evidentă la locuitorii la mari altitudini comparativ cu cei ce locuiesc la altitudini joase;

Aclimatizarea tisulară și celulară se petrece după o perioadă lungă de locuit la altitudini mari și se referă la:

Creșterea concentrației enzimelor oxidative mitocondriale;

Creșterea densității mitocondriilor în celule și

Creșterea densității capilare în mușchii scheletici și cardiac[34].

Mecanisme adaptative celulare și moleculare

În ciuda pericolului evident pe care îl pune supraviețuirii celulare, hipoxia este o stare fiziologică și fiziopatologică destul de des întâlnită. Hipoxia fiziologică este întâlnită în câteva procese normale, cum sunt dezvoltarea fetală, adaptarea la altitudine și reglarea funcției de barieră epitelială la nivelul suprafeței mucoasei tractului gastro-intestinal. Stările patologice în care hipoxia a fost clar identificată includ condițiile în care aportul de sânge la țesuturi este afectat, precum infarctul miocardic, ateroscleroza sau stroke. Regiuni hipoxice au fost identificate și în majoritatea tumorilor solide. De asemenea, de curând, a fost identificată o varietate de boli inflamatorii în care hipoxia este o caracteristică predominantă a micromediului, inclusiv bolile inflamatorii intestinale, artrita reumatoidă sau infecțiile cronice[35].

Oxigenul reprezintă un substrat esențial pentru organismele aerobe, astfel încât, diverse condiții fiziologice sau patologice care prezintă hipoxie vor duce la modificări fundamentale în metabolismul și funcțiile celulare. Celulele se vor opri temporar în ciclul celular, își vor reduce consumul de energie și vor secreta factori de supraviețuire și proangiogenetici, evenimente coordonate prin diverse căi celulare. Adaptarea acută include creșterea ventilației, modificări metabolice, protecția împotriva morții celulare induse de hipoxie și vasodilatația. Adaptarea la hipoxia cronică se caracterizează în schimb prin încercarea de a restabili livrarea oxigenului la țesuturi. Acest lucru este realizat prin îmbunătățirea capacității de transport al oxigenului prin creșterea hemoglobinei și a masei eritrocitare. De asemenea, adaptarea pe termen lung include remodelarea vaselor existente precum și formarea de noi vase. Majoritatea adaptărilor la hipoxie implică expresia unor gene determinată de factori de transcripție activați în mod special în condiții de hipoxie, cum ar fi factorul indus de hipoxie 1 (HIF-1). Totodată, în anumite țesuturi au fost descrise modificări moleculare independente de HIF-1 ca răspuns la hipoxie, cum ar fi activarea Nf-kB, CREB sau Notch.

Efectele hipoxiei asupra transcripției

În general, transcripția este redusă de hipoxie pentru a conserva energie, cu excepția acelor gene necesare adaptării la condiții de stres hipoxic. Aceste gene sunt controlate de diferiți factori de transcripție ce răspund la hipoxie. Astfel, dacă cel mai cunoscut dintre aceștia, HIF-1, se activează direct și comun pentru toate țesuturile, ceilalți factori de transcripție sunt specifici de țesut și depind de gradul și durata hipoxiei.

Factorul de transcripție indus de hipoxie (HIF)

Identificarea de către Semenza et. al. a HIF ca factorul cheie în homeostazia oxigenului a reprezentat un punct de cotitură în înțelegerea adaptării celulare la hipoxie[36].

HIF este un heterodimer alcătuit din două subunități, α, subunitatea labilă, respectiv, β, subunitatea stabilă, activitatea sa fiind controlată, mai ales, de subunitatea α. Au fost descrise trei tipuri diferite de subunități α: HIF-1α, HIF-2α și HIF-3α. În timp ce HIF-1α este exprimată ubicuitar, HIF-2α are o distribuție selectivă de țesut, cum ar fi endoteliul vascular, pneumocitele tip II, celulele interstițiale renale, celulele parenchimului hepatic, celulele liniei mieloide, aceste două tipuri de subunități având și anumite funcții neredundante in vivo. Astfel, dacă HIF-1α este crucial pentru cele mai multe adaptări de scurtă durată la hipoxie, cum ar fi trecerea metabolismului de la fosforilarea oxidativă la glicoliză, ca principală sursă de energie, HIF-2α se pare ca e implicat în adaptarea pe termen lung și mediu, prin creșterea eritropoiezei și angiogeneză. Funcțiile și distribuția celulară ale HIF-3α nu sunt complet cunoscute, dar s-ar părea că acționează ca un antagonist endogen al HIF-1α[37].

Reglarea HIFα

În funcție de concentrația în oxigen, HIF-1α și HIF-2α sunt controlate în mod similar: ambele gene sunt exprimate constitutiv și translatate în proteinele respective, dar acestea sunt rapid degradate în condiții de PO2 normală. Degradarea începe prin hidroxilarea unor resturi de prolină de către PHD (hidroxilaza prolinei specifică pentru HIF), enzimă ce aparține familiei de deoxigenaze 2-oxo-glutarat dependente, și a cărei activitate este dependentă de oxigenul molecular, fapt ce o califică în senzor celular de oxigen. Mai mult, 2-oxo-glutaratul, vitamina C și ionul feros reprezintă cofactori indispensabili pentru activitatea sa enzimatică. HIF-α hidroxilat este recunoscut de proteina supresoare tumorală von Hippel-Lindau (VHL), care recrutează componente ale complexului de ubiquitin ligaza E3, pentru a ubicuitina HIF-α și a servi ca semnal pentru degradarea proteazomala. De asemenea, hidroxilarea unui rest de asparagină de către FIH (factorul inhibitor al HIF), folosind oxigenul și α-cetoglutaratul ca substraturi, inhibă recrutarea coactivatorilor transcripționali p300/CBP (CREB binding protein). (Figura 2.2)

Ca urmare a deficitului de oxigen din hipoxie, activitatea celor două hidroxilaze este inhibată și, astfel, subunitatea HIFα devine stabilă. Aceasta se va dimeriza în nucleu cu subunitatea β, ce este ubicuitară și neafectată de concentrația oxigenului, formând complexul HIF[38].

Figură 2.2 Sumar al reglării HIF. (Volker H. Haase, Oxygen regulates epithelial-to-mesenchymal transition: insights into molecular mechanisms and relevance to disease, Kidney Int. Sep 2009; 76(5): 492–499.)

În reglarea HIF sunt implicate însă și alte mecanisme, în care se evidențiază o diferență între controlul HIF-1α, respectiv, al HIF-2α.

Un exemplu este controlul realizat de sirtuine. Sirtuinele sunt o familie de deacetilaze a histonelor (NAD+)-dependente care influențează transcripția genelor, metabolismul, repararea ADN și supraviețuirea. Astfel, dacă SIRT3 controlează în mod special HIF-1α, într-o manieră dependentă de PHD, iar SIRT6 inhibă HIF-1α și glicoliza, SIRT1 și SIRT7 se pare ca acționează colaborând cu ambele izoforme ale HIF[39] (Figura 2.3).

De asemenea, HIF-1α, dar nu și HIF-2α, se pare că este degradat în hipoxie dependent de proteina de șoc Hsp70/CHIP. Totodată, translația mARN a HIF2α răspunde la concentrația în fier. În celulele endoteliale hipoxice, a fost identificat un tip de microARN, miR424, care promovează stabilizarea HIF-1 și angiogeneza[40].

Funcțiile HIF

Heterodimerii HIF se leagă specific de elementele de răspuns la hipoxie (HRE) din secvențele enhencer sau promoter ale genelor țintă pentru a induce sau suprima expresia lor. Dacă inițial a fost identificat ca fiind factorul de transcripție responsabil pentru creșterea sintezei de eritropoietină în hipoxie, acum se consideră că ar controla câteva sute de gene ce răspund la hipoxie. Aceste gene se împart în trei mari categorii în funcție de mecanismul de a restabili homeostazia oxigenului al proteinelor lor:

Stimularea metabolismului anaerob prin creșterea cantității de substrat necesar glicolizei;

Protecția împotriva morții celulare induse de hipoxie;

Îmbunătățirea oxigenării tisulare prin stimularea vasodilatației, angiogenezei și eritropoiezei.

De altfel, se admite astăzi că HIF, prin subunitățile sale, este implicat atât în dezvoltarea și fiziologia organismului uman cât și în diverse stări patologice. Așadar, în ceea ce privește metabolismul celular, HIF-1α promovează consumul de glucoză și glicoliza, iar HIF-2α, depozitarea acizilor grași. De asemenea, ambele isoforme inhibă fosforilarea oxidativă și formarea de ROS, consecutiv (Figura 2.4).

Figură 2.4 Controlul metabolismului celular de către HIFα. (Amar J. Majmundar,, Waihay J. Wong, M. Celeste Simon, Hypoxia-Inducible Factors and the Response to Hypoxic Stress, Molecular Cell, Volume 40, Issue 2, 22 October 2010, Pages 294–309)

De asemenea, o stare puternic influențată de HIF o reprezintă inflamația, prin activitatea sa dependentă de NF-kB; acesta induce expresia genelor implicate în comportamentul macrofagelor: (a) liza bacteriană, (b) migrarea și invazia, (c) sinteza de citokine (IL1β, IL6, IL12, TNFα) și (d) metabolismul. Totdată, stabilizarea HIF-1α în celulele endoteliale crește (a) expresia VEGF, (b) migrarea și (c) proliferarea, iar stabilizarea HIF-2α promovează (d) aderarea celulelor la matricea endotelială[41].

Factorul nuclear kappaB

Factorul nuclear kappaB face parte dintr-o familie de factori de transcripție ce mai cuprinde ca cel mai activ dimer complexul alcătuit din proteinele p65 și p50. Inițial a fost descris ca factorul necesar pentru expresia lanțului ușor k al imunoglobulinelor, însă astăzi este considerat cel mai important factor de transcripție implicat în răspunsul inflamator, fiind indispensabil pentru sinteza unei mari varietăți de citokine inflamatorii, pentru supraviețuirea celulelor implicate în inflamație și, mai mult decât atât, fiind un controlor din amonte a expresiei genei pentru HIF-1α.

NF-kB, în absența unui stimul, este legat de o moleculă supresoare, IkB, ce îi acoperă secvența de localizare nucleară și astfel îl blochează în citosol. Însă, în urma stimulării, de către citokine, specii reactive de oxigen (ROS) sau lipopolizaharide bacteriene, IkB este fosforilat de către kinaze specifice și apoi, după ubicuitinare, degradat în proteazomi, astfel, NF-kB putând fi translocat în nucleu.

Deși nu se cunoaște exact mecanismul activării NF-kB de către hipoxie, se pare că există o legătură între HIF și NF-kB. De asemenea, s-ar părea că ROS provenite din mitocondrii în condiții de hipoxie ar influența activarea NF-kB.

Activarea acestei căi, a NF-kB, s-ar dovedi în special utilă în condiții de hipoxie severă sau ischemie asupra aderării și infiltrării monocitelor sau pentru a stimula expresia genelor cărora le lipsesc elementele de răspuns la hipoxie, fiind, însă, în majoritatea situațiilor, o cale adițională de a stimula expresia genelor indusă de HIF, dar foarte importantă pentru integrarea stimulilor inflamatori și hipoxici în vederea adaptării la stresul hipoxic[42].

Proteina de legare a elementului de răspuns al cAMP

CREB (cAMP response element binding protein) face parte dintr-o familie de factori de transcripție moderați de nivelul intracelular al cAMP sau al Ca2+. Deși are ca țintă gene cu funcții asemănătoare cu cele controlate de HIF, implicate în metabolismul celular, apoptoză sau inflamație, spre deosebire de efectele imediate și generale ale HIF, activarea CREB are efecte protectoare doar când este indusă de precondiționarea ischemică și pare a fi restricționată doar în anumite țesuturi, fiind realizată prin intermediul fosforilării de către protein kinaza A (PKA).

În țesutul nervos, CREB activează gena anti-apoptotică Bcl-2, având rol neuroprotectiv în condiții de hipoxie.

În plămâni, CREB se activează în condiții de hipoxie moderată, fiind responsabilă de stimularea sintezei de endotelină-1 și VEGF, contribuind la creșterea rezistenței vasculare pulmonare și la remodelare[43].

Efectele hipoxiei asupra translației

În condiții de hipoxie, în mod normal, celulele își reduc activitatea de translație pentru a economisi energie, unele dintre cele mai importante căi de semnalizare fiind mTOR (mammalian target of rapamycin kinase – factorul-țintă al rapamicinei la mamifere) și UPR (unfolded protein response – răspunsul la proteine nepliate). Activarea mTOR determină fosforilarea efectorilor săi, dintre care cel mai bine studiați sunt proteina 1 de legare a factorului eucariot de inițiere 4E (eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1, 4E-BP1) și kinaza 1S6 (S6K1). Hiperfosforilarea 4E-BP1 duce la inhibarea legării 4E-BP de factorul eucariot de inițiere 4E (eIF4E), activând translația. eIF4E este factorul limitant de viteză pentru translația dependentă de secvența cap (cu formare de eIF4F)[44]. Dacă de regulă, activarea mTOR este inhibată în condiții hipoxice, se pare totuși că translația dependentă de mTOR este crescută în condiții de hipoxie, în cazul unor proteine, în funcție de gradul și durata hipoxiei. Unele dintre aceste proteine induse de hipoxie, cum sunt HIF-1α și VEGF, scapă de sub obligativitatea formării eIF4F la secvența cap 5’, având un alt site interior ribozomal, cu ajutorul căruia translația se poate realiza eficient chiar și în condițiile hipoxiei[37].

Hipoxia, o particularitate a tumorilor maligne

Actual, este recunoscut faptul că tumorile solide suferă adesea de stress hipoxic. Celulele maligne cu rată crescută de proliferare lasă în urmă capacitatea de a le vasculariza și oxigena. De asemenea, vasele ce se formează prezintă structură și funcție anormale, contribuind la stressul hipoxic. De aceea, multe tumori solide prezintă nivele crescute de HIFα[45].

Expresia HIFα în celulele tumorale e crescută însă și prin alte mecanisme diferite de hipoxie. Mutații genetice, cum e cea a genei VHL în carcinomul renal cu celule clare, mutații în calea de semnalizare Wnt/β-catenină în cancerul de colon, sau alte mutații oncogenice au fost arătate că stabilizează HIFα.

Astfel, s-a arătat că genele reglate de HIF joacă roluri cheie în aproape toate etapele dezvoltării tumorale: menținerea celulelor „stem” tumorale, recrutarea TAM (macrofage asociate tumorilor), proliferare (MYC), angiogeneză (VEGF, PDGF), apoptoză/autofagie (NDRG2, BNIP3), metabolism (PDK1, LDHA), repararea ADN-ului (GADD45A), microARN (MIR210), remodelarea matricei extracelulare (LOX, MMP1), migrarea celulară și invazia (CXCR4, SDF1)[46].

Rolul important al HIF în dezvoltarea tumorală este încă o dată întărit prin faptul că expresia crescută a HIFα se corelează cu pronostic prost în mai multe tipuri de cancer. Mai mult, se pare că PHD și FIH1 au o influență independentă de HIF în cancer. PHD2 este folosită de către celulele endoteliale din vasele tumorale pentru a sesiza și corecta dezechilibrul în aportul de oxigen, agenții farmacologici anti-PHD2 fiind potențiali terapeutici prin îmbunătățirea arhitecturii și funcției vascularizației tumorale[47]. (Figura 2.5)

Figură 2.5 Factorii implicați în activarea de căre HIF a genelor de răspuns la hipoxie.( Adrian L. Harris, Hypoxia — a key regulatory factor in tumour growth, Nature Reviews Cancer 2, 38-47, January 2002.)

MicroARN-urile sunt molecule cu un singur lanț de ncARN, ce reglează expresia genelor prin inhibarea translației mARN sau prin facilitarea clivării mARN. În ultimii ani s-au identificat multiple miARN-uri controlate de hipoxie în diverse celule, de exmplu miR-20a, -21, -24, -103, -107, -210, -424, și let-7. Majoritatea dintre acestea s-a dovedit a fi însă specifice de țesuturi, miR-210 fiind singurul cunoscut a fi indus constant în condiții de hipoxie in vivo sau in vitro, în celule tumorale sau în celule normale[48].

MiR-210 este o țintă constantă pentru HIF, creșterea expresiei sale fiind întâlnită în diverse patologii ce prezintă o componentă hipoxică, inclusiv în majoritatea tumorilor solide. Astfel, miR-210 este supraexprimat în carcinomul renal cu celule clare, care prezintă nivele crescute de HIF din cauza inactivării genetice a genei supresoare tumorale von Hippel-Lindau. De asemenea, nivele ridicate de miR-210 au fost legate de un pronostic prost în cancerele de sân sau de pancreas. Țintele miR-210 sunt diverse, sugerând că acesta are influență asupra metabolismului mitocondrial, angiogenezei, reparării ADN, apoptozei și a supraviețuirii celulare și că înțelegerea funcțiilor sale ar putea contribui la dezvoltarea unor noi abordări diagnostice și terapeutice în cancer[49]. (Figura 2.6)

Figură 2.6 miARN-urile în adaptarea celulară la hipoxie. (Shriram Nallamshetty, Stephen Y. Chan, and Joseph Loscalzo, Hypoxia: A Master Regulator of MicroRNA Biogenesis and Activity, Free Radic Biol Med. Sep 2013; 64: 20–30.)

Datorită rolului major al oxigenului în supraviețuirea celulară, în restabilirea homeostaziei sale se întâlnește o mare varietate de mecanisme, fie acute, cum ar fi inhibarea transcripției și translației proteinelor mai puțin ale celor implicate în trecerea șa metabolismul anaerob, fie cronice, cum ar fi eritropoieza și angiogeneza, menite să crească transportul oxigenului la țesuturi. În mijlocul acestor mecanisme de adaptare se găsește HIF, ce poate fi numit factorul cheie în controlul homeostaziei oxigenului[36].

Răspunsul inflamator asociat hipoxiei

Hipoxia și inflamația au o relație interdependentă, multe publicații recente ținând cont de inflamația indusă de hipoxie în evoluția unei game variate de patologii.

Pe de o parte, conceptul că hipoxia poate induce inflamația a câștigat acceptabilitate generalizată din studiile care au investigat căile de semnalizare din hipoxie. La persoanele cu rău de altitudine, concentrațiile citokinelor circulante proinflamatorii au crescut, iar extravazarea de lichid a determinat edem pulmonar sau cerebral. Concentrații crescute de IL-6, receptor pentru IL-6 sau proteină C reactivă, toți markeri ai inflamației, s-au găsit la voluntari sănătoși ce au petrecut trei nopți la o altitudine mai mare de 3400 m. La 8400 m, alpiniști sănătoși ce au urcat pe Muntele Everest au suferit de hipoxemie severă (PaO2=25 mm Hg) și de edem pulmonar subclinic de altitudine[50]. În mod similar, la șoarecii expuși la hipoxie acută (de ex. la 8% oxigen timp de 8h) s-au găsit nivele plasmatice crescute de citokine, edem pulmonar și infiltrate de celule inflamatorii în plămâni și în alte organe[51].

Dezvoltarea unui răspuns inflamator în timpul hipoxiei are mare însemnătate clinică. Astfel, în timpul transplanturilor, grefa ischemică devine inflamată, iar orientarea spre aceasta ar putea fi o strategie terapeutică pentru a îmbunătăți funcția imediată a organului și a scădea riscul unui rejet acut. La pacienții care au suferit un transplant de rinichi, expresia în țesutul renal a TLR4 (toll-like receptor) — receptor pentru LPZ bacteriene — s-a corelat cu gradul ischemiei. În acest studiu, rinichii donați care aveau o alelă TLR4 nefuncțională au avut o rată mai mare a funcției imediate a grefei comparativ cu cei ce aveau alela genei TLR4 funcțională. Mai mult decât atât, creșterea nivelelor citokinelor pulmonare și a expresiei TLR s-a corelat cu un grad mai mare de ischemie și pierderea acută a funcției grefei în plămânii transplantați[52].

În cazul obezității, dezechilibrul dintre aportul și necesarul de oxigen în adipocitele hipertrofice determină hipoxie tisulară și creșterea nivelelor de adipokine inflamatorii. Consecutiv, se vor întâlni infiltrat alcătuit din macrofage și o ușoară inflamație sistemică cronică ce vor cauza rezistența la insulină[53].

Totodată, leziunea de ischemie-reperfuzie este caracterizată de dezvoltarea unui răspuns inflamator care va duce la o disfuncție de organ consecutivă. Așadar, rolul semnalizării din hipoxie și al stabilizării HIF în timpul răspunsului inflamator a fost subiectul multor studii recente care, în mod surprinzător, au arătat că stabilizarea farmacologică a HIF funcționează într-o manieră adaptativă pentru a crește toleranța ischemică și a controla răspunsul inflamator exagerat, astfel că au fost propuse mai multe abordări terapeutice ce țintesc ischemia miocardică, renală, hepatică, sau intestinală ischemia[54].

De cealaltă parte, stările patologice inflamatorii sunt frecvent caracterizate de hipoxie tisulară sau stabilizarea factorilor de transcripție dependenți de hipoxie. Din cauza suprafeței lor mari mucoasele intestinale sau respiratorii sunt în mod particular predispuse la hipoxia inflamatorie. Ca rezultat al gradientului deficitar de oxigen dintre lumenul intestinal anaerobic și mucoasa metabolic activă, celulele epiteliale intestinale suferă în mod normal de un grad de hipoxie. În schimb, în bolile inflamatorii intestinale, întreaga mucoasă devine și mai hipoxică, iar în țesutul recoltat s-au întâlnit nivele crescute HIF-1α și HIF-2α[55]. De asemenea, inflamația pulmonară din injuria pulmonară acută (ALI) este asociată cu modificări metabolice ce duc la stabilizarea HIF1α[56].

La hipoxia tisulară din inflamație contribuie creșterea cerințelor metabolice și scăderea aportului de substrat metabolic din cauza trombozelor, traumei, compresiei datorate hipertensiunii interstițiale sau atelectaziei. Mai mult, multiplicarea patogenilor contribuie de asemenea la privarea celulelor de oxigen.

Mai mult decît atât, s-au observat condiții de hipoxie și activarea HIF în biopsii de la pacienți cu alte boli inflamatorii, cum ar fi artrită, ateroscleroză sau boli autoimune.

Undeva la granița dintre cele două procese, adică inflamația indusă de mediul hipoxic, respectiv, hipoxia indusă de patologia inflamatorie, se regăsește patologia tumorală. Hipoxia și inflamația se întâlnesc în mai multe etape ale dezvoltării tumorale (Fig. 4). Relația interdependentă dintre hipoxie și inflamație în tumori constă în faptul că multe tumori dezvoltă regiuni hipoxice ce vor fi infiltrate de către celulele inflamatorii, pentru ca această inflamație să sporească hipoxia tisulară din cadrul tumorii[57]. (Figura 3.1)

Rolul factorului Nf-kappaB în inflamație

Factorul de transcripție NF-κB a fost studiat ca având o varietate mare de funcții în imunitatea înnăscută, răspunsul la stres, apoptoză, supraviețuirea și creșterea celulară. El este de asemenea considerat principalul factor de control al răspunsului inflamator.

Familia NF-κB cuprinde cinci membri: p65, Rel B, c-Rel, p50 și p52. Aceste proteine împart un domeniu homolog Rel foarte bine conservat. Pentru a lega ADN-ul și a modula expresia genelor, acestea formează homodimeri sau heterodimeri, cu excepția Rel B, care formează doar heterodimeri cu p50 sau p52. Cel mai des întâlnit dimer este p50-p65.

Există două căi majore de activare a NF-κB: calea canonică, ce este în mod special dependentă de inhibitorul kinazei κB (IKK) beta, și cea necanonică, IKKα-dependentă.

În condiții normale, NF-κB este legat în citosol de molecula sa supresoare IκB cu care interacțonează la nivelul domeniilor repetitive de ankirină. În acest fel, secvența pentru localizare nucleară a proteinei p65 este mascată și rămâne sechestrată în compartimentul citosolic. În urma stimulării, IκBα este fosforilată, marcată pentru ubicuitinare și degradată în proteazomi. Secvența de localizare nucleară este descoperită și NF-κB poate fi translocat în nucleu, unde devine activ transcripțional prin legarea de locații specifice din regiunile promoter ale genelor țintă. Stimulul pentru ca IκBα să își înceteze inhibiția asupra NF-κB a fost identificat ca fiind fosforilarea de către complexul de proteine IKKα/β/γ[42].

Genele induse de NFκB sunt în principal cele implicate în inflamație, cum ar fi cele pentru TNFα, IL-1, IL-6, IL-8, proteina inflamatorie 1 alfa a macrofagelor (MIP-1α), methyl-accepting chemotaxis protein 1, moleculele de adeziune celulară, ca E-selectina, molecula de adeziune vasculară 1 și ICAM-1, enzimele inductive, cum sunt COX-2 și iNOS, și molecule de supraviețuire ca moleculele inhibitoare celulare a apoptozei 1 și 2 și BCL-XL.

S-a arătat că un număr de stimuli activează NF-κB pe calea canonică, inclusiv citokinele proinflamatorii, produșii bacterieni, factorii de creștere și hipoxia. Punctul de convergență pentru acești stimuli se găsește la nivelul complexului IKK. NF-κB mai este activat de lumina ultravioletă, de stresul oxidativ precum și prin alte mecanisme[58]. (Figura 3.2)

Figură 3.2 Activarea căii de semnalizare NF-κB prin inhibitorul kinazei κB. (Kathryn M Oliver, Cormac T Taylor, and Eoin P Cummins, Hypoxia. Regulation of NFκB signalling during inflammation: the role of hydroxylases, Arthritis Res Ther. 2009; 11(1): 215.)

Activarea NF-kappaB de către hipoxie și inter-relația cu HIF

Mai multe studii au evidențiat rolul hipoxiei în activarea NFκB. Ciclooxigenaza 2, TNFα, IL-6 și MIP-2 sunt printre genele țintă ale NFκB indus de hipoxie, subliniind importanța acestui factor în semnalizarea din inflamație.

Bazându-se pe această observație, că NFκB este activat in hipoxie, s-a studiat implicarea unei căi ce include activarea IκB kinase-β (IKKβ), ducând la degradarea prin fosforilare a IκBα și eliberarea NF-κB, indicând că activarea NF-κB de către hipoxie s-ar realiza prin reducerea hidroxilării de către PHD a IKKβ. Aceste rezultate vin oarecum în contradicție cu mai multe studii ce au arătat în mod repetat rolul antiinflamator al inhibitorilor hidroxilazelor, cum ar fi dimetiloxalil glicina (DMOG). Deși rămâne de demonstrat dacă IKKβ este hidroxilat de către PHD, rolul acestora și mai ales al izoformei PHD-2 în reglarea stabilității HIF este bine documentat[59].

Inițial, între NF-κB și HIF-1α a fost propusă o legătură la nivel molecular într-un studiu ce analiza expresia eritropoietinei. De atunci un mare număr de studii au examinat inter-relația dintre NFκB și HIF-1α.

Dincolo de căile de activare O2-dependente, HIF pot fi induși și de citokinele inflamatorii, de factori de creștere sau de produși bacterieni în condiții normoxice, chiar dacă căile moleculare exacte nu se cunosc încă în întregime. Citokinele proinflamatorii TNF-α și IL-1β cresc accumularea și activitatea transcripțională a HIF-1α. Stimularea HIF-1α indusă de TNF-α necesită NF-κB la nivelul stabilizării proteinei HIF-1α fără să o afecteze la nivelul mRNA. În mod similar, IL-1β acționează asupra stabilității HIF-1α prin activarea NF-κB și inhibiția degradării mediate de VHL[60].

Pe lângă citokine, bacteriile și produșii acestora, cum ar fi LPS stimulează de asemenea activitatea HIF-1α. Mai multe căi au fost identificate ca fiind folosite, printre care NF-κB, ROS, PHD și MAPK (p42/p44 mitogen-activated protein kinases). Implicarea NF-κB în acest process este totuși controversată. Frede et al. au arătat că LPS induc expresia mARN a HIF-1α în monocitele umane prin legarea NF-κB la promoterul genei pentru HIF-1α[61].

Folosind macrofage mutante la nivelul IKK-β, s-a arătat de asemenea că NF-κB este responsibil pentru transcripția HIF-1α și a stabilizării proteinei și că deficitul în IKK-β duce la expresia scăzută a țintelor HIF, cum ar fi transportorul de glucoza 1 (GLUT1). În schimb, alte studii au demonstrat că inducerea HIF-1α de către LPS nu este dependentă de NF-κB, ci, mai degrabă, de generarea ROS[62].

Totodată, s-a arătat că LPS crește acumularea de HIF-1α prin scăderea nivelelor PHD2 și PHD3 în macrofage în mod dependent de TLR4[63]. Binențeles, că, dată fiind importanța relației dintre NF-κB și HIF-1α, mai multe studii pe această temă ar fi bine venite în viitor pentru clarificarea acestei legături. (Figura 3.3)

Figură 3.3 Relația dintre HIF și NF-κB în promovarea inflamației mediate de celulele mieloide în prezența hipoxiei și a LPS bacteriene. (Sarah R Walmsley, Edwin R Chilvers, and Moira KB Whyte, Hypoxia. Hypoxia, hypoxia inducible factor and myeloid cell function, Arthritis Res Ther. 2009; 11(2): 219.)

Efectele hipoxiei asupra imunității înnăscute

Celulele din linia mieloidă – neutrofile, macrofage și celulele dendritice – joacă un rol cheie atât în inflamația acută cât și în cea cronică, iar inactivarea HIF1α or HIF2α în aceste celule a arătat că ambele subunități sunt importante în medierea răspunsului inflamator.

Macrofagele cărora le lipsește HIF1α au arătat motilitate, invazivitate și activitate bactericidă reduse. La fel, pierderea HIF2α în celulele mieloide a scăzut motilitatea si invazivitatea macrofagelor și a redus severitatea inflamației cutanate și a endotoxemiei induse de LPS.

Totodată, răspunsul citokinelor la sepsisul indus de LPS, caracterizat prin sinteza de TNF-α, IL-1β, IL-6 și IL-12, scade în absența HIF1α sau a HIF2α. HIF1α and HIF2α coordonează răspunsul inflamator în mod similar dar prin mecanisme distincte. HIF1α controlează shift-ul metabolic de la fosforilarea oxidativă la glicoliză în macrofagele activate. În schimb, HIF2α reglează transcripția citokinelor, printre care se numără IL1β, IL12, and TNFα, precum și genelor implicate în migrarea și chemotaxia macrofagelor, cum ar fi FN1 și CXCR4, adenozina A2a (ADORA2A) și ICAM1. Se pare că HIF1α și HIF2α induc în macrofage expresia unor gene care, deși se suprapun, rămân totuși distincte[64].

Mai mult, expunerea la patogeni și LPS induce activarea HIF-1α în macrofage dependent de TLR-4. De asemenea, HIF-1α se leagă direct la promoterul locusului pentru TLR4, crescându-i expresia în timpul privării de O2. Astfel, relația interdependentă dintre activarea HIF-1α și a TLR4 poate să ducă la o bucla de feedback pozitiv, amplificând răspunsurile HIF în timpul hipoxiei și infecției[63]. (Figura 3.4)

Neutrofilele sunt fagocite importante mai ales în timpul răspunsului inflamator acut. De asemenea, acestea se pare că sunt bine adaptate pentru a funcționa în mediul hipoxic ce caracterizează leziunile inflamatorii, bazându-se mai ales pe glicoliza anaerobă pentru a genera ATP. Totuși, se pare că în acest proces, neutrofilele au nevoie de HIF-1α pentru a realiza glicoliza, dar și pentru a evita apoptoza în condiții hipoxice, pentru migrarea și aderarea la endoteliu mediată de β2 integrină (CD18). Mai mult, supraviețuirea mediată de HIF este dependentă și de NF-κB, fiind anulată sub efectul inhibitorilor NF-κB (gliotoxin și parthenolide)[65].

În ceea ce privește celulele dendritice (CD), s-a demonstrat că hipoxia și HIF-1α modulează maturarea, activarea, glicoliza și funcția de prezentare a antigenelor, iar hipoxia împreună cu LPS au dus la creșterea expresiei moleculelor co-stimulatoare, la sinteza de citokine proinflamatorii și la inducerea proliferării limfcitare[66].

La nivelul mastocitelor, s-a arătat că activarea HIF-1α stimulează expresia unor mediatori foarte importanți în derularea răspunsului inflamator, cum sunt VEGF, CXCL8 (IL-8), IL-6 și TNF[67].

Cât privește răspunsurile mediate de PAMP (pathogen-associated molecule pattern), acestea reprezintă căi mult utilizate de către celule pentru a declanșa căi de semnalizare intracelulare ce iniția răspunsul inflamator și sinteza citokinelor. Printre acestea se numără și receptorii TLR, dintre care mulți acționează într-o manieră sinergică cu HIF-1. S-a discutat deja cum hipoxia crește expresia TLR-4 în macrofage, dar, de asemenea, hipoxia induce expresia TLR-2 și a TLR-6 în CD și monocite, via HIF-1α. Așadar, atât HIF-1α cât și receptorii toll-like stimulează expresia genelor inflamatorii dependent de NF-κB și ROS[68].

Efectele hipoxiei asupra imunității adaptative

Nu trebuie trecută însă cu vederea nici influența pe care o prezintă HIF-1α asupra imunității adaptative. Creșterea nivelului de HIF-1α în LT determină un shift de la fenotipul LTh1, care promova funcțiile macrofagelor și ale LT citotoxice, la un fenotip LTh2, care inhibă acțiunea citotoxică mediată de LTh1, prin creșterea sintezei de IL-10 și scăderea celei de IFN-γ. De asemenea, căile de semnalizare induse de hipoxie stimulează diferențierea și proliferarea celulelor T reglatorii, cu rol inhibitor, și cresc nivelul extracelular de adenozină, ce protejează țesuturile de efectele LT[69]. (Figura 3.5)

Efectele anti-inflamatorii ale HIF la nivelul barierei epiteliale

Spre deosebire de funcțiile mai ales proinflamatorii evidențiate anterior, o funcție majoră anti-inflamatorie a HIF se dezvoltă prin îmbunătățirea funcției de barieră epitelială intestinală prin creșterea expresiei genelor pentru factorul trefoil intestinal, CD55, factori care promovează semnalizarea adenozinei extracelulare, p-glicoproteina și mucina MUC3[70]. (Figura 3.6)

Figură 3.6 Acțiunile pro- și antiinflamatorii ale HIF. (Carsten C Scholz,

Cormac T Taylor, Targeting the HIF pathway in inflammation and immunity, Current Opinion in Pharmacology

Volume 13, Issue 4, August 2013, Pages 646–653)

Rolul hidroxilazelor în inflamația asociată hipoxiei

Hidroxilazele joacă un rol central în relația hipoxie-inflamație. Mai exact, trei prolil-hidroxilaze, PHD-1, PHD2, și PHD3, și asparagin-hidroxilaza FIH au fost implicate în reglarea posttranslațională a căilor implicate în hipoxie și inflamație. Aceste enzime sunt cunoscute pentru rolul lor în stabilizarea subunității α a HIF, fiind senzori de oxigen, așa după cum am arătat mai sus.

NF-κB, cu rol cheie în inflamație, este un alt factor de transcripție implicat în hipoxie. Deși modul în care hidroxilazele controlează NF-κB nu este bine cunoscut, rolul acestora în inflamație este evident prin efectul protectiv al inhibitorilor farmacologici ai hidroxilazelor (cum ar fi dimetiloxalilglicina – DMOG).

În studiul lor, Scholz et al. confirmă acest efect protectiv al DMOG, dar demonstrează că acesta este asociat cu reducerea activității indusă de IL-1β a NF-κB in vitro sau in vivo de către hidroxilazele inhibate de hipoxie[71].

IL-1β este secretat de diverse celule, fiind asociat cu mai multe patologii inflamatorii, metabolice sau infecțioase: artrita reumatoidă, boli inflamatorii intestinale, diabet zaharat tip II, șoc septic. După legarea de receptorul specific, se declanșează o cascadă de semnalizare via TNF, TRAF6 (receptor-associated factor 6) și complexul IKK, rezultând în activarea NF-κB. Atât activitatea NF-κB indusă de IL-1β cât și cea indusă de TRAF6 au fost reduse de către DMOG, sugerând că inhibarea hidroxilazelor ar putea fi un efect comun pentru semnalizările ce utilizează TRAF6. Pentru a identifica hidroxilazele responsabile de acest control, s-a realizat represia mediată de siRNA a hidroxilazelor, descoperind că este în cauză o combinație de PHD1 și FIH. Următorul pas ar fi identificarea substratelor asupra cărora acestea acționează, descoperind că există câteva proteine din calea IL-1β care formează complexe cu PHD1 sau cu FIH, unele dintre aceste proteine suferind hidroxilare (UEV1A, OTUB1 și UBC13). De asemenea, și IκBβ ce urmează complexului TRAF6 este hidroxilată de către FIH precum și alte proteine ce urmează complexului TRAF6 în semnalizarea IL-1β, arătând că hidroxilarea este un fenomen întâlnit la multiple proteine din această cale de semnalizare, principalele izoforme care reglează activitatea NF-κB fiind PHD1 și FIH, cu efecte anti-inflamatorii în multiple modele de inflamație[71].

Totuși, și alte mecanisme contribuie la aceste efecte protective, cum ar fi expresia de gene protective la nivelul barierei epiteliale, reglarea de către hidroxilaze a apoptozei celulelor epiteliale intestinaleale în bolile inflamatorii intestinale, dar și controlul LTreg sau stimularea semnalizării adenozinice[70].

Este de luat în considerare și faptul că aceste efecte anti-inflamatorii ale inhibitorilor hidroxilazelor sunt independente de HIF-1α, indicând o influență amplă a acestora și în afara semnalizării HIF. Aceste descoperiri stau la bază pentru dezvoltarea de noi agenți terapeutici, ca, de exemplu, cei pentru anemia de cauză renală, pentru condiții caracterizate de inflamație asociată hipoxiei (leziunea de ischemie-reperfuzie) sau pentru bolile inflamatorii caracterizate de hipoxie[72].

Semnalizarea purinergică în inflamația asociată hipoxiei

Adenozina aparține familiei de nucleozide purinice, fiind principala componentă a mult mai bine cunoscutului ATP. Pe de altă parte, adenozina extracelulară este cunoscută pentru funcția sa de moleculă de semnalizare.

Ea poate activa patru receptori pentru adenozină, cu funcții diferite: ADORA1, ADORA2A, ADORA2B sau ADORA3. Aceștia sunt receptori cuplați cu proteina G, având printre mesagerii secunzi cAMP. Astfel, în timp ce semnalizarea prin ADORA1 și ADORA3 scade nivelul intracelular de cAMP, activarea ADORA2A și a ADORA2B îl crește.

Semnalizarea prin adenozină a dovedit multiple efecte, mediate diferit de către receptori: efectul cronotop este dependent de ADORA1, ADORA2A a dovedit funcții anti-inflamatorii în multiple țesuturi, antagoniștii săi arătând efecte benefice în boala Parkinson ADORA2B joacă rol în adaptarea la condiții de hipoxie, inflamație și ischemie, iar agoniștii ADORA3 au prezentat efecte benefice în tratarea sindromului ochilor uscați[73]. (Figura 3.7)

Așadar, adenozina extracelulară are un rol critic în adaptarea la hipoxie.

Mai întâi, în timpul unor condiții de injurie, celulele eliberează precursori de adenozină, sub formă de ATP sau ADP în spațiul extracelular. Același lucru se întâmplă în urma stimulării celulelor inflamatorii sau endoteliale în timpul inflamației sau hipoxiei. ATP și ADP extracelular sunt rapid degradate la adenozină, printr-un proces enzimatic ce include o conversie dependentă de CD39 a ATP/ADP la AMP, și apoi, o conversie dependentă de CD73 a AMP la adenozină. Hipoxia și HIF-1α induc la nivel transcripțional expresia CD39 și a CD73, modificând balanța de la semnalizarea ATP pro-inflamatorie, către cea anti-inflamatorie a adenozinei.

În al doilea rând, hipoxia, ischemia și HIF-1α par a induce și expresia A2BAR, iar ADORA2A, ar fi indus de către HIF-2α în celulele epiteliale din plămâni în condiții hipoxice[74].

Semnalizarea adenozinică extracelulară este terminată prin transportul adenozinei în compartimentul intracelular cu ajutorul ENT1 și al ENT2 (equilibrative nucleoside transporters), urmat de metabolizarea la inozină de către deaminaza adenozinei intracelulară sau la AMP de către adenozin kinază. În al treilea rând, HIF-1 scade expresia ENT1 și ENT2, promovând stimularea extracelulară. În ultimul rând, HIF reglează de asemenea modificările transcripționale din metabolismul intracelular adenozinic[73]. (Figura 3.8)

Stimularea semnalizării adenozinice prin netrina-1

Mai multe studii au arătat că netrina-1 indusă de hipoxie este implicată în stimularea semnalizării adenozinice extracelulare în timpul hipoxiei inflamatorii, prin mecanisme rămase deocamdată necunoscute. Netrina-1 (NTN1) a fost inițial descrisă ca fiind o moleculă de ghidaj axonal. Studii recente au descoperit însă și efecte anti-inflamatorii pentru NTN1 în boli ca ALI sau bolile inflamatorii intestinale. Hipoxia induce direct transcripția NTN1, care se pare că acționează stimulând semnalizarea prin receptorul ADORA2B. NTN1 inhibă migrarea leucocitelor, reducând infiltratul inflamator în condiții de hipoxie[75].

Implicațiile semnalizării purinergice în patologia inflamatorie

Datorită efectelor protective anti-inflamatorii ale semnalizării adenozinice, multe patologii inflamatorii ar putea beneficia de noi agenți terapeutici bazați, de exemplu, pe agoniști de receptori pentru adenozină.

În cazul ALI și al edemului pulmonar, mecanismele protective includ creșterea sintezei de adenozină via CD39 și CD73, împreună cu semnalizarea prin A2BAR, dar și cea prin A2AAR, mecanism căruia i s-ar opune hiperoxigenarea iatrogenă, cu rol în promovarea inflamației pulmonare. Tot prin CD73 și a A2BAR s-a arătat că hipoxia controlează extravazarea de lichid din patologii pulmonare, sepsis, SIRS, dar și inflamația intestinală. De asemenea, modele de sepsis și inflamație acută au prezentat implicarea A2AAR în semnalizare, iar pentru semnalizarea prin A2BAR s-au evidențiat multiple efecte protective în inflamația și leziunea vasculară, în ischemia și inflamația intestinală sau în activarea mastocitelor[76].

Semnalizarea purinergică în modelul de ischemie-reperfuzie

Leziunea de ischemie–reperfuzie are un mare impact clinic, fiind implicată în diferite condiții caracterizate și de activarea unor căi inflamatorii, cum ar fi transplantul de organe sau bolile cardiovasculare.

Pe de o parte, eliberarea ATP-ului în spațiul extracelular poate iniția un răspuns imun în timpul ischemiei și reperfuziei, activând inflamazomul NLRP3 și având efect chemoatractant pentru celulele inflamatorii. Pe de altă parte, adenozina extracelulară este considerată un factor protectiv ce reduce inflamația indusă de hipoxie din ischemie-reperfuzie, conversia ATP-ului la adenozină având un rol central în acest caz. Mai mult, s-a evidențiat rolul protectiv al semnalizării adenozinice în diferite modele de ischemie-reperfuzie, prin activarea ADORA2A în celulele inflamatorii sau a ADORA2B în endoteliul vascular, în epiteliu sau în cardiomiocite[73].

Modele de hipoxie acută și cronică

Hipoxia cronică din BPOC

Inflamația, ca principal mecanism fiziopatologic în dezvoltarea BPOC

Bronhopneumopatia cronică obstructivă (BPOC) este o patologie respiratorie des întâlnită ce afectează mai mult de 5% din populația globului, fiind asociată cu morbiditate și mortalitate crescute[77].

GOLD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease) definește BPOC ca fiind „o patologie comună prevenibilă și tratabilă, caracterizată printr-o limitare a fluxului de aer ce este de obicei progresivă și asociată cu o intensificare a răspunsului inflamator cronic în căile aeriene și în plămân la diferite noxe. Exacerbările și comorbiditățile contribuie la severitatea globală a bolii în cazul fiecărui pacient[77].

Rolul central în fiziopatologia BPOC-ului se pare că îl deține inflamația cronică ale căilor aeriene prin creșterea numărului de celule caliciforme, hiperplazia glandelor mucoase, fibroză, îngustarea căilor aeriene mici precum și distrucția peretelui alveolar în emfizem. De asemenea, în emfizem crește activitatea enzimelor proteolitice (MMP-2, MMP-9, MMP-12, catepsinele K, L și S și elastază), activate în urma inflamației și a stresului oxidativ.

Macrofagele au rol important în inflamația din BPOC. Fumatul precum și alți iritanți inhalați determină dezvoltarea unui răspuns inflamator în parenchim și în căile aeriene mici. Macrofagele activate eliberează un mare număr de mediatori ai inflamației și agenți chemotactici, cum ar fi TNF-α, IL-6, IL-8, monocyte chemotactic peptide (MCP)-1, LTB4 și ROS, precum și enzime proteolitice, MMP-9 și MMP-12, ale căror acțiuni vor duce la dezvoltarea emfizemului pulmonar[78].

Cele mai multe dintre aceste proteine sunt controlate de către NF-κB, ce este activat în macrofagele alveolare în BPOC, mai ales în timpul exacerbărilor.

Sub influența factorilor chemotactici, mai ales IL-8 și LTB-4, neutrofilele trec direct în tractul respirator unde cauzează suprastimularea glandelor mucoase și a celulelor caliciforme[79].

De asemenea, în biopsiile bronhice s-au descoperit infiltrate cu LT CD4+ și CD8+ la pacienții cu BPOC, arătându-se o corelație între limfocitele CD8+ și creșterea apoptozei celulelor alveolare în emfizem.

Un alt rol important este deținut de către celulele dendritice și celulele epiteliale. Celulele dendritice activează mai multe celule implicate în răspunsul imun printre care macrofagele, limfocitele B și T și neutrofilele[80].

Celulele epiteliale din alveole și căi secretă numeroși factori ca TNF-α, TGF-β, interleukinele IL-1β și IL-8 și GM-CSF (factorul stimulator al coloniilor de granulocite și macrofage), cauzând activarea fibroblaștilor și fibroză. Totodată ele produc mucusul necesar apărării epiteliale, iar diferiții factori nocivi acostați pe suprafața lor determină metaplazia scuamoasă și a glandelor submucoase și a celulelor caliciforme, cu întreruperea activității lor (Figura 4.1) .

În cele din urmă, un rol dominant în fiziopatologia BPOC-ului e deținut de stresul oxidativ care va cauza daune serioase prin dezechilibrarea balanței proteaze-antiproteaze.

ROS sunt produse de către neutrofile, macrofage, eozinofile și celulele epiteliale activate de inflamația din tractul respirator[81].

Figură 4.1 Mediatorii inflamatori în BPOC. (Alice M Wood, Robert A Stockley, The genetics of chronic obstructive pulmonary disease, Respir Res. 2006; 7(1): 130.)

Cauzele hipoxiei în BPOC

Odată cu progresia bolii crește și posibilitatea apariției hipoxiei alveolare și a hipoxemiei consecutive, care s-a dovedit a avea un rol cheie în procesele maladaptative și în comorbiditățile din BPOC.

Hipoxemia din BPOC se pare că ar contribui la scăderea calității vieții, scăderea toleranței la efort, diminuarea funcției mușchilor scheletici și creșterea riscului de deces, iar terapia de durată cu oxigen (LTOT) prelungește viața pacienților cu BPOC și hipoxemie severă[82].

Hipoxemia rezultă din dezechilibrul ventilație/perfuzie (V/Q) cauzat de limitarea progresivă a fluxului de aer și distrucția emfizematoasă a patului capilar pulmonar[77].

Dezechilibrul crește cu progresia bolii și, de asemenea, exacerbările sunt asociate cu hipoxemie.

Obezitatea este frecvent întâlnită printre pacienții cu BPOC. Aceasta contribuie la hipoxemie, chiar în absența BPOC-ului fiind asociată cu dezechilibru V/Q, scăderea complianței cutiei toracice și consum periferic de oxigen crescut.

În cazul pacienților cu BPOC se întâlnește și un control neregulat al ventilației din cauza obstrucției cronice a fluxului de aer, situație regăsită mai degrabă la pacienții cu hipoxemie cronică.

De asemenea, până la jumătate dintre pacienții cu BPOC întâmpină dificultăți în somn. Acestea pot fi cauzate de sumarea efectelor hipoventilației fiziologice din timpul somnului. Hipoventilația în timpul somnului a fost demonstrată și în cazul BPOC-ului, mai ales în timpul somnului REM (rapid eye movement), fiind asociată cu scăderea saturării în oxigen. Acesta este mai ales cazul pacienților cu sindrom overlap, adică cei care se confruntă atât cu BPOC cât și cu sindromul de apnee în somn, pacienți ce au o hipoxemie nocturnă mai pronunțată și un risc mai mare de a dezvolta hipertensiune pulmonară[83].

Hipoxia acută din stroke

Stroke este una dintre primele cauze de morbiditate și mortalitate pe glob, provocând aproximativ 6 milioane de morți în fiecare an și cauzând dizabilități pe termen lung[84].

AVC-ul (accidentul vascular cerebral) sau stroke-ul se produce când fluxul sanguin este întrerupt printr-o ocluzie embolică sau trombotică a unei artere cerebrale (AVC ischemic) sau când se rupe un vas de sânge (AVC hemoragic).

Deși AVC-ul ischemic reprezintă aproximativ 80% din totalitatea AVC-urilor, există deocamdată puține variante de terapii eficiente. În acest moment, tromboliza unei ocluzii trombotice este singura strategie farmacologică aprobată pentru terapia AVC-ului acut, strategie ce este însă limitată de o fereastră terapeutică îngustă de numai 3 h, astfel că înțelegerea mecanismelor patologice sunt extrem de importante pentru dezvoltarea de noi strategii terapeutice care să fie eficiente.

În urma ocluziei vasculare, rezultă aproape imediat un teritoriu cerebral privat de oxigen și glucoză. Se pare că în progresia patogenică rolurile centrale le au leziunea ischemică și inflamația consecutivă[84].

Leziunea de ischemie-reperfuzie din stroke

Cascada ischemică

În câteva minute de la limitarea fluxului sanguin către creier, se declanșează cascada ischemică care va duce la dezintegrarea membranei celulare și la moartea neuronală în centrul zonei de infarctizare. Hipoperfuzia focală duce la excitotoxicitate și leziuni oxidative, ce, la rândul lor vor determina leziuni microvasculare, cu pierderea funcției barierei hematoencefalice și inițierea inflamației postischemice

În zona de penumbră a infarctului, pot avea loc depolarizări repetitive, cu creșterea eliberării de glutamat și, respectiv, leziuni celulare excitotoxice[85] (Figura 4.2).

Figură 4.2 Cascada ischemică ce duce la leziunea cerebrală. (Shaheen E Lakhan, Annette Kirchgessner and Magdalena Hofer, Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: therapeutic approaches, Journal of Translational Medicine 2009, 7:97)

Stresul oxidativ

Stresul oxidativ contribuie la patogeneza mai multor boli, printre care și stroke-ul. Acesta implică formarea speciilor reactive de oxigen și de azot prin diverse mecanisme, cum ar fi leziunea de reperfuzie și inflamația. De asemenea, în timpul stroke-ului ischemic acut ROS reprezintă un mediator important în injuria tisulară[86].

Nrf2 (Nuclear factor erythroid-related factor 2) este un factor de transcripție care reglează un set de gene antioxidante îndreptate pentru a înlătura ROS. Mai multe studii au arătat că activitatea acestui factor este neuroprotectivă, împotriva toxicității glutamatului, H2O2 și supraîncărcării cu Ca2+[87].

Leziunea de ischemie-reperfuzie

Cascada ischemică poate dura de la câteva ore la câteva zile, chiar și după restaurarea fluxului sanguin, reperfuzia fiind cauză de leziuni secundare, numite leziuni de ischemie-reperfuzie.

Deși fiziopatologia leziunii de ischemie-reperfuzie nu e pe deplin cunoscută, stresul oxidativ, cu ROS eliberate de celulele inflamatorii din zonă s-ar părea că joacă un rol esențial.

Mai mult, cascada complementului este de asemenea implicată în această injurie și, de asemenea, leziunea de ischemie-reperfuzie induce un răspuns inflamator implicând activarea complementului cu generarea anafilatoxinelor C3a și C5a[85].

Inflamația din stroke ischemic

Inflamația ocupă un loc important în patogeneza stroke-ului ischemic. Acesta contribuie însă atât inițial la injuria ischemică și apoi la regenerarea tisulară.

Inițial, leucocitele circulante infiltrează regiunea ischemică trecând bariera hematoencefalică disfuncțională. De asemenea, sunt activate microgliile endogene. Leucocitele vor elibera diverși mediatori ai inflamației ce vor amplifica leziunea ischemică.

Cu toate că mecanismele leziunii de ischemie-reperfuzie sunt incomplet elucidate, s-a arătat că aceste leucocite care se infiltrează în regiune eliberează factori citotoxici, inclusiv citokine proinflamatorii (TNFα, IL-1β, IL-6, IL-12 și IL-18), ROS, NO prin iNOS și matrix metaloproteine (MMP-2 și MMP-9). Aceste MMP determină distrugerea matricei extracelulare și bariera hematoencefalică, amplificând edemul cerebral, hemoragia și moartea neuronală[84] (Figura 4.3).

Figură 4.3 Răspunsul inflamator postischemic. (Judy Huang, Urvashi M. Upadhyay, Rafael J. Tamargo, Inflammation in stroke and focal cerebral ischemia, Surgical Neurology, Volume 66, Issue 3, September 2006, Pages 232–245)

Citokinele în stroke

Citokinele IL-1, TNF-α, IL-6, IL-10 și TGF-β (transforming growth factor-β) au fost cel mai bine studiate în ischemia cerebrală. Dintre acestea, IL-1 mediază leziunea ischemică, TNF-α se pare că ar contribui atât la leziunea cât și la protecția neuronală, IL-10 și TGF-β ar fi neuroprotective, pe când rolurile IL-6 par a fi contradictorii.

IL-1 este implicat în patogeneza ischemiei cerebrale ca mediator neurotoxic. Această citokină are două izoforme, IL-1α și IL-1β, și un inhibitor endogen, antagonistul receptorului IL-1 (IL-1ra). Dintre aceștia, IL-1β este mai degrabă implicat în patogeneza ischemică, având o evoluție bifazică, cu peak-uri la 1 h și la 6-24 de ore, rămânând ridicată timp de 4 zile.

O evoluție similară are și TNF-α, însă prezintă atât efecte neurotoxice cât și neuroprotective, fiind legat de fenomenul de toleranță ischemică.

TNF-α stimulează apoptoza celulelor endoteliale și la deteriorarea barierei hematoencefalice. Pe de altă parte, acesta activează procesele reparatorii ale microvascularizației și mediază neuroplasticitatea. Explicații posibile pentru aceste efecte contradictorii ar putea fi faza în care își desfășoară activitatea sau existența receptorilor diferiți de TNF-α, cu efecte nocive pe receptorul 1 și neuroprotective pe receptorul 2[88].

Sinteza IL-20 este indusă de IL-1β ce modulează activitatea căilor MAPK și NF-κB și, la rândul ei, va induce sinteza de IL-6.

IL-1β crește sinteza IL-6, nivelul seric al IL-6 corelându-se cu aria de infarct și fiind un predictor pentru deteriorarea neurologică precoce[89].

Rolul exact al IL-6 în stroke-ul ischemic nu a fost încă clar identificat, fiind identificate atât efecte nocive cât și benefice pentru această citokină. Există studii ce prezintă o puternică corelație între nivelul seric al IL-6 și mortalitatea în spital la pacienții cu stroke[90]. De asemenea, se pare că IL-6 contribuie la nivel cerebral la neoangiogeneză și supraviețuirea neuronală prin activarea STAT3[91].

IL-10 și IL-4 sunt citokine antiinflamatorii. IL-10 inhibă citokinele proinflamatorii IL-1 și TNF-α, scade expresia receptorilor citokinelor și semnalizarea lor, având sinteza crescută în microglii și astrocite după un stroke. IL-4 determină diferențierea limfocitelor T în fenotipul Th2, antiinflammator. TGF-β1 reduce răspunsul inflamator, microgliile protejând neuronii prin sinteza de TGF-β1[92].

Inflamația este recunoscută ca fiind un factor important în progresia patologică a stroke-ului ischemic, cu efecte nocive sau benefice, în funcție de severitate și de etapele în care intervine. Probabil, răspunsul inflamator imediat potențează leziunea ischemică, pe când cel târziu contribuie la reparație. În direcția aflării cum sistemul imun trece de la efecte nocive la efecte protective și rolul lor în evoluția stroke-ului ar trebui lucrat în viitor pentru dezvoltarea de noi strategii terapeutice.

Partea specială

Introducere

Această lucrare și-a propus să studieze existența unei asociații între răspunsul inflamator și hipoxia acută și cronică, analizând cantitativ nivelele serice și în LCR ale citokinelor pro- și anti-inflamatorii, ca markeri ai inflamației.

Pentru modelul de hipoxie acută am folosit un grup de pacienți care au suferit un accident vascular cerebral ischemic (stroke), iar pentru modelul de hipoxie cronică a fost luat în considerare un grup de pacienți cu BPOC.

De asemenea, acest studiu încearcă să analizeze comparativ răspunsurile inflamatorii în cele două modele de hipoxie și să găsească posibile puncte comune în căile de desfășurare a inflamației din cele două situații.

Materiale și metode

BPOC

Studiul nostru analitic observațional a analizat probele biologice sangvine provenind de la un lot de 40 de pacienți cu BPOC, dintre care 14 femei și 26 de bărbați, cu media de vârstă de 57.6 ± 10.1 ani.

Criteriul de includere a fost confirmarea diagnosticului de BPOC.

Conform GOLD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease), trebuie să se ia în considerare diagnosticul de BPOC, dacă oricare dintre indicatorii de mai jos este prezent la un individ cu vârsta de peste 40 de ani:

Dispnee

progresivă

se agravează la efort

persistentă

Tuse cronică ce poate fi intermitentă

Producție cronică de spută: orice pattern poate indica BPOC

Istoric de expunere la factori de risc:

fumatul de țigarete, inclusiv preparatele locale populare

noxe de mediu: prafuri și chimice

fumul rezultat din gătit și încălzit

Antecedente familiale patologice de BPOC.

Pentru confirmarea diagnosticului, este necesară efectuarea spirometriei. Spirometria reprezintă gold standardul în diagnosticul și evaluarea BPOC, ca fiind cea mai reproductibilă, standardizată și obiectivă metodă de măsurare a limitării fluxului de aer[93].

Spirometria măsoară:

Capacitatea vitala forțată (FVC)

Volumul expirator maxim pe secundă (VEMS sau FEV1)

FEV1/FVC

Prezența unui raport FEV1/FVC < 0.70 după administrarea de bronhodilatator confirmă existența unei limitări persistente a fluxului de aer și, deci, a BPOC-ului.

Figură 2.2 Exemplu de spirometrie comparativă a unui individ sănătos și a unui pacient cu BPOC. Adaptată după GOLD Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of COPD 2011.

Stroke

Pentru evaluarea răspunsului inflamator din stroke am analizat probele sangvine și din LCR a 45 de pacienți cu stroke ischemic, dintre care 14 femei și 31 de bărbați, cu media de vârstă de 67.65±10.11 ani.

Criteriul de includere a pacienților în studiu a fost confirmarea diagnosticului de stroke ischemic prin tomografie computerizată.

În cazul unui pacient cu stroke vorbim de obicei despre un pacient cu factori de risc vascular, HTA, fibrilație atrială, dislipidemie, DZ, fumător.

Debut este brusc cu semne de focar neurologic,+/- afectarea stării de conștiență.

Clinica este în funcție de localizarea și întinderea ischemiei:

AVC ischemic emisfer cerebral:

– deficit motor, sindrom senzitiv, HHL, sindroame corticale

AVC ischemic trunchi cerebral/cerebel:

– deficit motor, semne de n. cranieni, sindrom senzitiv, sindrom cerebelos, uneori comă

AVC lacunar: deficit pur motor sau pur senzitiv, hemipareză ataxică, tulburare de vorbire

Deficitele neurologice au evolutie variabilă, cu deficit maxim de la început sau dezvoltat lent în minute, ore, zile.

La pacienții cu suspiciune de AVC sau AIT se recomandă CT cranian de urgență. Acesta este de obicei suficient pentru a ghida tromboliza de rutină, de care pacienții cu AVC ischemic pot beneficia în primele 3 ore de la debut. CT cranian identifică majoritatea afecțiunilor care mimează AVC, distinge AVC ischemic de cel hemoragic în primele 5-7 zile și este metoda imagistică cea mai cost-eficientă pentru pacienții cu AVC acut. [eso-stroke.org]

Tomografia cerebrală are rolul de a exclude hemoragia cerebrală intraparenchimatoasă sau o altă patologie care ar putea determina semnele clinice ale pacientului (tumoră cerebrală, hematom subdural, encefalită etc).

Modificări ischemice precoce pe CT cerebral:

– edem focal sau efectul de masă, definite ca fiind orice îngustare focală a spațiului ocupat de lichidul cefalorahidian (spațiul subarahnoidian sau ventriculii cerebrali), determinată de compresia exercitată de structurile adiacente (de exemplu, ștergerea girațiilor sau compresia ventriculară).

– Hipoatenuarea parenchimatoasă, definită ca o regiune cu densitate (atenuare) scăzută, comparativ cu densitatea structurilor similare din emisferul contralateral (de exemplu, ștergerea conturului ganglionilor bazali, sau ștergerea diferenței între cortex și substanța albă subcorticală) (Figura 2.3)[94].

Figură 2.3 Imagine CT cu contrast la 4 h de la debutul unui stroke (stânga) și imagine CT fără contrast la 32 h de la debutul stroke-ului la același pacient (dreapta). această figură arată evoluția hipoatenuării pe parcursul timpului într-un stroke acut. (James M. Provenzale et al. Assessment of the patient with hyperacute stroke: imaging and therapy. Radiology. 2003; 229:347-359.)

În cazul ambelor loturi, pacienții sau familiile lor și-au dat consimțământul informat scris pentru a participa la acest studiu.

Metode

În ambele cazuri, pentru a evalua răspunsul inflamator am analizat cantitativ nivelul citokinelor din sângele sau LCR-ul pacienților.

De la pacienții cu BPOC am prelevat probe sangvine prin puncție venoasă și am măsurat nivelele serice ale citokinelor IL-1ß, TNFα, IL-6, IL-8 și IL-10, ca markeri ai inflamației, pe care le-am comparat cu normalul.

De la pacienții cu stroke am prelevat de asemenea probe sangvine prin puncție venoasă și am măsurat în dinamică nivelele serice ale citokinelor TNFα, IL-6 și IL-10 pe care le-am comparat cu cele din lichidul cefalorahidian, prelevat prin puncție lombară, și cu cele din lotul martor.

Ambele măsurători s-au realizat cu tehnica imunoenzimatică ELISA, utilizând kituri pentru interleukine umane.

ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) este o metodă de detectare cantitativă sau calitativă a unor molecule (proteine, carbohidrați, etc.) cu ajutorul complexelor antigen-anticorp conjugate cu o enzimă. Datorită sensibilității (pg/ml) și a specificității mari popularitatea ei a crescut în ultimul timp, fiind una dintre cele mai utilizate metode pentru a analiza nivelele de: hormoni, markeri tumorali, droguri, medicamente, citokine, antigene virale, bacteriene, parazitare, Ac din diverse probe bilogice precum: ser, plasmă, urină, scaun, lichid sinovial, LCR, lichid de lavaj bronșic (Figura 2.5).

Enzimele utilizate sunt: peroxidaza, fosfataza alcalină, glucozoxidaza, G6PH, iar intensitatea reacției depinde de cantitatea de enzimă. Substraturile folosite de enzime sunt substanțe cromogene, care formează produși de reacție colorați (cromofore), utili pentru citirea la spectrofotometru[95].

Tipuri de ELISA:

ELISA necompetitiva “sandwich”

ELISA competititiva

ELISA indirecta (dozarea Ac)

Pentru analiza citokinelor s-a folosit tehnica ELISA sandwich.

În acest caz, Ag trebuie să prezinte cel puțin 2 epitopi (identici sau diferiți):

Ac primar (Ac1): imobilizat în faza solidă în godeurile plăcii, nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2): marcat enzimatic

Etape (Figura 2.6):

Se pipetează proba (cu Ag) în godeurile cu Ac1 fixat

Se incubează complexe Ag-Ac1

Se spală excesul de Ag (Ag liber)

Se pipetează Ac2 (marcat enzimatic)

Se incubeaza complexe Ac1-Ag-Ac2

Se spală excesul de Ac2 (Ac2 liber)

Se adaugă substratul colorarea mediului de reacție ~ cantitatea de Ag din proba

Se citește la spectrofotometru

Figură 2.6 Metoda ELISA. (JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. Journal of Visualized Experiments, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5061 (2014).)

Analiza statistică a datelor

Rezultatele au fost exprimate ca medii și deviații standard folosind testul t Student pentru variabile cantitative continue.

O valoare a lui p<0.05 a fost considerată semnificativă.

Datele au fost prelucrate folosind programul Microsoft Excel 2013.

Rezultate

BPOC

Au fost analizate concentrațiile serice ale citokinelor IL-1ß, TNFα, IL-6, IL-8 și IL-10 de la 40 de pacienți, acestea fiind crescute față de normal în cazul tuturor citokinelor analizate, însă doar IL-1ß, TNFα și IL-8 au prezentat creșteri semnificative statistic.

În ceea ce privește TNFα s-a decelat o creștere semnificativă statistic (p 0.023) și cantitativ: 46.206 ± 17.353 pg/ml față de normal: 19.127 ± 9.22 pg/ml. (Figura 3.1)

Figură 3.1 Valorile TNFα la pacienții cu BPOC comparativ cu subiecții sănătoși

O analiză comparativă a nivelului IL-1β în serul pacienților cu BPOC și în cel al indivizilor sănătoși a arătat o concentrație aproape dublă a acestei citokine în BPOC: 8.0 ± 3.36 pg/ml față de normal: 4.72 ± 2.2 pg/ml. Această creștere a prezentat și o semnificație statistică extrem de mare: p 0.0045. (Figura 3.2)

Figură 3.2 Valorile IL-1beta în BPOC și la normal

În cazul IL-6, diferența nu a fost foarte mare, deși nivelul seric în BPOC a fost în continuare crescut față de normal: 13.883 ± 4.64 pg/ml față de 11.748 ± 3.46 pg/ml. Rezultatul însă nu a fost semnificativ statistic, cu p 0.49. (Figura 3.3)

Figură 3.3 Valorile IL-6 în BPOC și la subiecții sănătoși

IL-8 a prezentat cea mai mare concentrație serică dintre toate citokinele: 341.336 ± 77.304 pg/ml, față de normal: 259 ± 56.28 pg/ml. Rezultatul a avut, de asemenea, semnificație statistică: p 0.04. (Figura 3.4)

Figură 3.4 Valorile IL-8 în BPOC și la normal

În cele din urmă, nivelul seric al IL-10, deși crescut față de normal: 28.48 ± 4.94 pg/ml, față de 20.867 ± 19.8 pg/ml, nu a prezentat semnificație statistică: p 0.35. (Figura 3.5)

Figură 3.5 Valorile IL-10 în BPOC și la normal

Analizând concentrațiile serice ale tuturor celor cinci citokine, cel mai mare nivel seric l-a prezentat IL-8. (Figura 3.6)

Diferențele dintre concentrațiile serice ale pacienților cu BPOC și normalul au arătat că, deși cel mai mare nivel în sânge îl prezintă citokina IL-8, cea mai mare diferență o prezintă TNFα, care este crescut de 2.41 ori mai mult decât normalul. (Figura 3.7)

Figură 3.7Arată de câte ori este mai mare concentrația fiecărei citokine studiate în BPOC față de normal

Stroke

La analiza probelor biologice sangvine și din LCR de la cei 45 de pacienți incluși în studiu, nu s-au obținut modificări semnificative pentru concentrațiile citokinelor IL-10 și TNFα, ci doar pentru IL-6, ale cărei nivele sangvine au fost urmărite în timp.

Astfel, în primele 2-5 zile de la episodul de stroke ischemic s-au înregistrat nivele serice crescute față de martor:51.04±38.22 pg/ml versus 1.71±0.35 pg/ml. (Figura 3.8)

Figură 3.8 Nivelul în ser al IL-6 la normal și la 2-5 zile de la stroke

De asemenea, în LCR nivelul a fost semnificativ crescut față de martor: 68.27±36.54 pg/ml versus 0, cu p< 0.05. (Figura 3.9)

Figură 3.9 Nivelul IL-6 în LCR la martor și la 2-5 zile de la stroke

Totodată, nivelul IL-6 în LCR a fost semnificativ crescut față de cel din ser după 2-5 zile de la stroke ischemic (p<0.05). (Figura 3.10)

Figură 3.10 Nivelul IL-6 comparativ în ser și în LCR la 2-5 zile de la stroke

Și la 7-11 zile de la episodul de stroke ischemic nivelul de IL-6 în ser (39.45 ± 24.03 pg/ml) a fost mult crescut față de martor. (Figura 3.11)

Figură 3.11 Nivelul IL-6 în ser la martor și la 7-11 zile de la stroke

În LCR, la 7-11 zile de la stroke ischemic, nivelul a fost crescut față de martor: : 55.66 ± 32.74 pg/ml față de 0. (Figura 3.12)

Figură 3.12 Nivelul IL-6 în LCR la martor și la 7-11 zile de la stroke

Astfel, atât în ser cât și în LCR, nivelul IL-6 a fost semnificativ crescut față de martor (p<0.05), în LCR nivelul fiind și de această dată mai mare decât în ser. (Figura 3.13)

Figură 3.13 Nivelul IL-6 comparativ în ser și în LCR la 7-11 zile de la stroke

Ultima perioadă urmărită a fost cea între zilele 13 și 26 de la stroke ischemic, când s-au înregistrat de asemenea nivele serice crescute față de martor:43.33 ± 36.14pg/ml. (Figura 3.14)

Figură 3.14 Nivelul IL-6 în ser la martor și la 13-26 zile de la stroke

Și în LCR nivelul IL-6 a fost crescut față de martor și în această perioadă: 37.08 ± 5.67pg/ml. (Figura 3.15)

Figură 3.15 Nivelul IL-6 în LCR la martor și la 13-26 zile de la stroke

Comparând nivelele IL-6 în ser și în LCR observăm că de această dată, deși din nou ambele sunt semnificativ crescute față de martor (p<0.05), nivelul seric este mai ridicat față de cel din LCR. (Figura 3.16)

Figură 3.16 Nivelul IL-6 comparativ în ser și în LCR la 13-26 zile de la stroke

Analizând dinamica nivelului IL-6 în ser, vedem că în a doua perioadă, între zilele 7 și 11, acesta (39.45 ± 24.03 pg/ml) este semnificativ scăzut (p<0.05) față de prima perioadă, între zilele 2-5, (51.04±38.22 pg/ml), pentru ca în cea de-a treia perioadă, în zilele 13-26, acesta (IL-6:43.33 ± 36.14pg/ml) să fie apropiat cu cel din a doua parte a intervalului urmărit. (Figura 3.17)

Figură 3.17 Dinamica nivelului seric al IL-6 între zilele 2-26 de la stroke

De asemenea, în LCR dinamica nivelului IL-6 între zilele 2-26 de la episodul de stroke ischemic ne arată că în a doua parte a intervalului (7-11 zile) nivelul (55.66 ± 32.74 pg/ml) este semnificativ (p<0.05) scăzut față de prima perioadă (IL-6:68.27±36.54 pg/ml), iar în cea de-a treia (37.08 ± 5.67pg/ml) este mai scăzut decât în a doua (p>0.05). (Figura 3.18)

Figură 3.18 Dinamica nivelului IL-6 în LCR între zilele 2-26 de la stroke

Am comparat nivelul seric al citokinei IL-6 în cele două modele de hipoxie: acută, din stroke, și cronică, din BPOC, obținând nivele mult crescute în acut decât în modelul cronic. (Figura 3.19)

Figură 3.19 Comparație între nivelul seric al IL-6 la pacienții cu stroke (între zilele 2 și 26) și la cei cu BPOC

Discuții

Hipoxia și inflamația prezintă o relație interdependentă, studii recente făcând referire tot mai des la asociația hipoxie-inflamație pentru a descrie evoluția unei game largi și variate de patologii[96].

Pe de o parte, stările patologice ce prezintă inițial presiuni reduse de oxigen vor dezvolta ulterior și modificări inflamatorii secundare, una dintre căile de semnalizare care răspund la hipoxie fiind cea a factorului de transcripție NF-κB, factorul reglator „cheie” în inflamație. Astfel, leziunea de ischemie-reperfuzie este caracterizată și de un răspuns inflamator bine constituit, ce va duce la leziuni și disfuncții ulterioare[54].

Pe de altă parte, bolile inflamatorii sunt în mod frecvent caracterizate și de hipoxie tisulară și de activarea căilor de semnalizare și a factorilor de transcripție dependenți de hipoxie. De exemplu, inflamația din plămâni este asociată cu modificări metabolice și stres oxidativ ce vor duce la stabilizarea HIF-1α[56].

Pentru a exemplifica această interrelație dintre hipoxie și inflamație au fost analizate două modele patologice, stroke-ul, ca model de hipoxie acută asociată cu inflamația, și bronhopneumopatia cronică obstructivă, ca model de hipoxie cronică asociată cu un răspuns inflamator.

Stroke-ul, patologie caracterizată primar de ischemie și de hipoxia consecutivă, generează un răspuns inflamator ca rezultat la factori precum celulele necrotice sau ROS. Acestea induc sinteza unor factori de transcripție, cum ar fi NF-κB, HIF-1 și STAT3.

Ca rezultat, mai multe citokine sunt sintetizate în țesutul cerebral, cum ar fi TNFα, IL-1β, IL-6 și IL-18, de către celule ca astrocitele, microgliile, celulele endoteliale (Figura 4.1).

Aceste citokine induc și expresia unor molecule de adeziune importante pentru infiltrarea altor celule în timpul reperfuziei, cauzând leziunile secundare din reperfuzie[92].

La oameni, în stroke-ul acut s-au înregistrat nivele crescute ale citokinelor proinflamatorii TNF, IL-1β și IL-6 în LCR și în sânge. Aceste citokine se asociază totodată și cu creșterea expresiei genelor inflamatorii atât în celulele din sânge cât și în cele din măduva hematogenă.

Aceste descoperiri sugerează că aceste citokine ar putea modula evoluția zonei de infarct, reprezentând markeri utili în predicția severității și a disfuncției neurologice, fiind folosiți din ce în ce mai mult în studiile ce își propun să îmbunătățească metodele de diagnostic, de investigare a prognosticului și de tratament pentru pacienții care au suferit un stroke[97].

Figură 4.1 Citokinele implicate în inflamația post-ischemică din stroke. (Brad R. S. Broughton, Rebecca Lim, Thiruma V. Arumugam, Grant R. Drummond, Euan M. Wallace and Christopher G. Sobey, Post-stroke inflammation and the potential efficacy of novel stem cell therapies: focus on amnion epithelial cells, Front. Cell. Neurosci., 17 January 2013)

De asemenea, BPOC-ul este o altă patologie care, odată cu progresia se caracterizează prin hipoxie alveolară și hipoxemie consecutivă. Aceasta are mai multe cauze, printre care dezechilibrul ventilație/perfuzie, exacerbările, controlul neregulat al ventilației, obezitatea și dereglările de somn, frecvent asociate la pacienții cu BPOC[77].

Hipoxia alveolară induce inflamație în plămâni care va deveni sistemică și în care macrofagele alveolare joacă un rol important, în plămânii hipoxici fiind crescută expresia HIF-1α, NF-κB și a citokinelor proinflamatorii. În acest context, HIF are o poziție centrală. Pe lângă PO2 tisulară scăzută, se cunoaște că și speciile reactive de oxigen și mediatorii inflamatori pot promova stabilizarea HIF, subliniind legătura dintre hipoxie și inflamație[98].

Expresia HIF-1α în plămâni este controlată de concentrația oxigenului. Chiar în condiții de hipoxie moderată s-a înregistrat acumulare de macrofage, neutrofile și albumină extravascular. De asemenea, a crescut activitatea NF-κB și nivelul mRNA pentru HIF-1α, TNFα, ICAM-1, MCP-1 și proteina inflamatorie a macrofagelor (MIP)-1β.

Pe lângă inflamația pulmonară, hipoxia alveolară cronică este frecvent asociată cu efecte sistemice, precum cașexia și atrofia musculară.

Aceste efecte au o componentă inflamatorie, inflamația sistemică fiind încă un proces ce însoțește hipoxia alveolară.

La fel ca în cazul altor boli cronice, și pacienții cu BPOC prezintă nivele ridicate ale mediatorilor inflamației sistemică în circulație[99].

Chiar și în BPOC stabil, s-au determinat nivele ridicate în circulație ale CRP, TNF-α, interleukinele IL-6 și IL-8. De asemenea, mici creșteri s-au înregistrat în nivlele receptorilor solubili ai TNF (sTNF-R55 și sTNF-R75), IL-10 și IL-18. Aceste creșteri ale mediatorilor inflamatori, de ex. IL-6, se corelează cu scăderea funcției pulmonare. Totodată, nivelul receptorului solubil al IL-1 (sIL-1RII), mediator antiinflamator, nu crește pentru a contrabalansa creșterea sTNF-R55. S-a observat că pe o perioadă de 12 luni mediatorii inflamatori IL-6, TNF-α și CRP s-au repetat constant, existând o asociație între nivelele IL-6 și CRP[100].

Așadar, dată fiind importanța rolului citokinelor în evoluția acestor două patologii studiate, s-a considerat reprezentativ să se studieze, ca metodă ușor de abordat în practica medicală nivelele serice, respectiv în LCR, a citokinelor TNFα, IL-6 și IL-10, în stroke, și a citokinelor IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8 și IL-10 în BPOC.

Am luat în considerare aceste investigații pentru a analiza răspunsul inflamator din hipoxie, având în vedere faptul că nivelele serice sau din LCR ale citokinelor pro- sau antiinflamatorii sunt specifice severității răspunsului inflamator, corelându-se cu evoluția și prognosticul pacienților.

TNFα

Acest studiu a arătat o creștere semnificativă statistic și cantitativ a nivelului citokinei TNFα în sângele pacienților cu BPOC, fiind, de fapt, citokina cu cea mai mare creștere față de normal, crescută de 2.41 ori mai mult decât normalul.

Aceasta se corelează cu datele din literatură, ținând cont de faptul că rolul TNFα este considerat a fi central atât în inflamația pulmonară cât și în cea sistemică, iar nivelul său plasmatic a fost găsit crescut la pacienții cu BPOC[101].

TNF-α este sintetizat ca precursor (pro-TNF-α) și este depozitat într-o formă legată de membrană. În urma stimulării, pro-TNF-α este transformat în forma sa activă TNF-α de către o metaloprotează numită TACE (TNF-α converting enzyme). Modele murine sugerează însă faptul că eliberarea TNF-α din macrofage după expunerea acută la fumat este dependentă atât de TACE cât și de MMP-12[102].

TNF-α activează NF-κB, care induce expresia genelor inflamatorii, inclusiv pe cele ale citokinelor, chemokinelor și proteazelor, în celulele epiteliale și în macrofage. De asemenea, activează în mod similar MAP kinaza, care va activa, la rândul ei, un spectru similar de gene, interacționând cu calea factorului NF-κB, sugerând rolul TNF-α în amplificarea inflamației din BPOC. Un interes deosebit trezește rolul polimorfismului genei TNF-α în patogeneza BPOC-ului, pentru că a fost asociat cu creșterea transcripției și a concentrației de TNF-α și, în unele studii, cu o susceptibilitate crescută de a dezvolta BPOC[103].

TNF-α are un mare număr de efecte relevante în patologia BPOC-ului, fiind implicat în activarea neutrofilelor, monocitelor, macrofagelor, celulelor epiteliale, secreția de mucus și distrucția parenchimului pulmonar prin eliberarea de proteaze. Totodată, acesta influențează consecințele sistemice din BPOC[103].

Într-un studiu în care nivelul seric al TNFα a fost măsurat prin tehnica analizei imunoradiometrice, acesta a fost semnificativ mai ridicat la pacienții cu BPOC și cu pierdere în greutate față de subiecții sănătoși[104].

De asemenea, un alt studiu a raportat nivele serice crescute atât la pacienții cu BPOC stabil cât și la cei cu exacerbări, nivele care s-au corelat cu severitatea bolii[105].

Rolul TNFα în atrofia musculară este controversat, existând date atât pentru afirmarea cât și pentru negarea lui. În orice caz, TNFα poate afecta celulele musculare în mod variat. TNFα activează transcripția Nf-κB în miocite, degradând lanțurile grele de miozină prin complexul ubiquitină/proteazom, dereglarea acestui sistem contribuind la pierderea de masă musculară, cum ar putea fi cazul și în BPOC.

Mai mult, TNFα poate induce apoptoza în diverse celule, printre care și cele ale mușchiului scheletic.

Pe de altă parte, efectele TNFα ar putea fi și de natură indirectă, contribuind la amplificarea cascadei inflamatorii prin inducerea sintezei altor citokine proinflamatorii regăsite în serul pacienților cu pierdere în greutate indicând faptul că aceasta ar fi datorată unui răspuns inflamator mai general, mai ales datorită faptului că tratamentul cu infliximab (un anticorp anti- TNFα) nu a prezentat niciun beneficiu în evoluția pacienților cu BPOC[106].

Un alt efect sistemic al TNFα în BPOC s-ar părea că este osteopenia, știut fiind faptul că TNFα și IL-1 sunt implicate în fiziopatologia osteoporozei[101].

În ceea ce privește nivelul TNFα în stroke, acest studiu nu a găsit valori semnificativ crescute nici în LCR, nici în ser.

Acest lucru nu este totuși neapărat în contradicție cu datele din studiile anterioare, care au avut rezultate contradictorii în ceea ce privește nivelul TNF în LCR, dar mai ales în ser după stroke.

Într-un studiu din 1997, care a urmărit dinamica citokinelor TNF, IL-8 și IL-10 în LCR, la 0-3, 7-9, 21-26 zile și la 3 luni de la stroke, TNF a fost crescut doar la pacienții cu leziuni ale substanței albe la 3 luni de la stroke[107].

Aceste rezultate au fost contrazise într-un studiu din 2001, care, nu numai că a detectat nivele crescute ale TNF la 24 de ore de la stroke, dar le-a și corelat cu severitatea și evoluția neurologică[108].

Studii mai recente au arătat că TNF crește la 6 ore de la stroke, dar că nu se corelează cu severitatea, cu mărimea leziunii sau cu evoluția neurologică[109].

Pe de altă parte, comparativ cu situația din LCR, probele din ser ar putea sau nu să reflecte producția centrală de citokine, datele în acest sens fiind încă și mai contradictorii.

Astfel, unele studii nu au raportat modificări în nivelul TNF din ser după stroke[110], pe când altele au descoperit valori crescute ale acestei citokine, chiar dacă au avut și rezultate contradictorii în legătură corelația acestora cu severitatea[111], [112].

Așadar, deși în acest studiu am obținut nivele semnificativ crescute ale TNFα doar la pacienții cu BPOC, nu și la cei cu stroke, nu putem nega rolul acestuia în răspunsul inflamator din cele două patologii, punând rezultatul mai degrabă pe seama efectului său local și nu sistemic în stroke.

IL-1β

Nivelul IL-1β a fost investigat în acest studiu doar la pacienții cu BPOC, nu și la cei cu stroke, obținând, cu o semnificație statistică foarte mare (p 0.0045), o concentrație aproape dublă în serul pacienților cu BPOC față de normal.

IL-1β are acțiuni similare cu TNFα și activează macrofagele alveolare de la pacienții cu BPOC[113].

Nivelul IL-1β din ser se corelează negativ cu FEV1 la pacienții cu BPOC[114], iar șoarecii care aveau supraexprimat IL-1β în epiteliul pulmonar au prezentat un fenotip asemănător celui din BPOC, cu inflamație pulmonară, emfizem și fibroză. Totodată, un rol important în inflamația pulmonară i s-a atribuit și IL-1α și receptorului IL-1R1, responsabil de inflamația pulmonară a șoriceilor expuși la fumul de țigarete, ce poate fi redusă prin antagonizarea IL-1α sau a IL-1β.

La subiecții umani, IL-1α și IL-1β au fost semnificativ crescute în țesutul pulmonar și în sputa pacienților cu BPOC, comparativ cu nefumătorii[81].

Rezultatele studiilor anterioare confirmă ceea ce s-a obținut în acest studiu, ce este totuși unul din puținele care prezintă nivele crescute ale IL-1β în ser la pacienții cu BPOC.

IL-8

IL-8 a fost în această analiză studiată de asemenea doar la pacienții cu BPOC, la care a înregistrat cele mai mari valori în ser dintre toate citokinele analizate.

IL-8/CXCL8 este o chemokină puternic atractantă pentru neutrofile și monocite și este recunoscută contribuția sa la patogeneza BPOC-ului prin recrutarea acestor leucocite în plămâni, dar și la dezvoltarea unei inflamații sistemice[115].

Studii anterioare au arătat că IL-8 este semnificativ crescută în sputa pacienților cu BPOC, fiind corelată cu creșterea proporției de neutrofile, aceste creșteri fiind amplificate în timpul exacerbărilor, contribuind la caracterul purulent al sputei[116].

Studii recente sugerează și o asociere a IL-8/CXCL8 cu remodelarea din căile respiratorii mici la fumători dar și cu reglarea expresiei genelor pentru mucină și inhibiția proliferării fibroblastice în plămâni[117].

De asemenea, la nivel sistemic, nivelul IL-8/CXCL8 în ser se corelează cu atrofia musculară la pacienții spitalizați sau stabili cu BPOC și ar putea fi implicat în patogeneza bolii cardiovasculare, una dintre comorbiditățile cu mare impact în evoluția pacienților cu BPOC[118].

IL-8 nu este depozitată, fiind sintetizată mai ales de celulele epiteliale, macrofage și neutrofile ca răspuns la diverși stimuli.

În BPOC, celulele epiteliale din căile respiratorii secretă IL-8 ca răspuns la stimuli precum TNF-α, IL-1β, lipopolizaharide, virusuri, stres oxidativ și fum de țigarete[119].

Macrofagele alveolare de la pacienții cu BPOC secretă și ele mai mult IL-8 ca răspuns la aceiași stimuli, comparativ cu subiecții sănătoși, și, de asemenea, neutrofilele secretă IL-8, autoîntreținând atracția de noi neutrofile și starea inflamatorie[120].

Această sinteză de IL-8 este controlată de către NF-κB, la nivel transcripțional, dar și prin căile de semnalizare a MAP kinazei și a ERK. Activarea NF-κB în urma stresului oxidativ rezultă în hiperacetilarea histonelor și în creșterea consecutivă a transcripției genei pentru IL-8[121].

Factorul represor al NF-κB (NRF) este un represor transcripțional implicat în atenuarea bazală a expresiei genelor țintă reglate de NF-κB, printre care interferon-β, IL-8/CXCL8 și iNOS. NRF pare să medieze inducerea IL-8/CXCL8 de către IL-1β, dar NRF poate fi și indus, jucând un rol represiv ca răspuns la stimularea de către TNF-α, cu nivele serice crescute la pacienții cu BPOC.

Un posibil mecanism ce duce la inflamația sistemică cronică din BPOC este scăderea expresiei NRF în celulele mononucleare din sângele periferic al pacienților cu BPOC, care eliberează promoterul IL-8/CXCL8 din represie, crescând sinteza acestei citokine ca răspuns la semnalizarea NF-κB activată de stresul oxidativ sau prin alte mecanisme în condiții de boală stabilă sau de exacerbare.

Astfel, o potențială strategie terapeutică pentru controlul inflamației sistemice și al comorbidităților asociate s-ar putea adresa reabilitării expresiei NRF[117].

Așadar, studiul nostru confirmă studiile anterioare care au atribuit citokinei IL-8 importante contribuții la dezvoltarea inflamației locale și sistemice din BPOC.

IL-10

IL-10, singura citokină anti-inflamatorie studiată, a fost analizată atât la pacienții cu BPOC cât și la cei cu stroke. Însă, dacă în stroke nivelul acesteia nu a fost crescut semnificativ nici în ser, nici în LCR, în BPOC, pacienții au prezentat nivele serice crescute față de normal, dar fără semnificație statistică (p 0.35).

IL-10 este o citokină anti-inflamatorie potentă eliberată din monocite și macrofage alveolare ca răspuns la diferiți stimuli.

Concentrația sa este scăzută în sputa pacienților cu BPOC[122] și a fost eliberată în cantitate redusă din țesutul pulmonar al pacienților cu BPOC la stimularea cu LPZ, comparativ cu subiecții sănătoși[123].

IL-10 are potențial terapeutic în BPOC, având un spectru larg de efecte anti-inflamatorii mediate de inhibiția NF-κB, cu scăderea sintezei unor proteine inflamatorii precum TNF-α, IL-1β, GM-CSF, chemokine, dar și a MMP-9 din monocite, care sunt supraexprimate în BPOC[124].

IL-10 are efecte anti-inflamatorii și în stroke, inhibând citokinele proinflamatorii IL-1 și TNF-α și activitatea receptorilor citokinelor proinflamatorii. Atât administrarea exogenă cât și transferul de genă a IL-10 au prezentat efecte benefice în modelele de ischemie cerebrală. Pacienții cu stroke au prezentat nivele crescute de IL-10 în LCR[107], iar subiecții cu nivele scăzute ale IL-10 ar prezenta risc crescut de stroke[89].

Astfel, studiul nostru a avut rezultate particulare cu privință la nivelul IL-10, mai ales ținând cont de faptul că este printre puținele care investighează nivelul IL-10 în ser la pacienții cu BPOC sau cu stroke.

Dacă lipsa creșterii semnificative a acesteia în serul pacienților cu stroke era oarecum de așteptat, valoarea crescută față de normal în serul pacienților cu BPOC este surprinzătoare, aceasta nefiind însă semnificativă statistic.

IL-6

IL-6 este un marker al inflamației, fiind sintetizat prin activarea NF-κB, însă rolul său în inflamație este incert, având efecte atât anti-inflamatorii cât și proinflamatorii, determinate de prezența altor citokine.

La pacienții cu BPOC, nivelul seric al IL-6 a fost în continuare crescut față de normal, deși nu cu o mare diferență, însă rezultatul nu a fost semnificativ statistic (p 0.49).

S-a arătat că IL-6 este crescut în sputa, aerul expirat și plasma pacienților cu BPOC, mai ales în timpul exacerbărilor[125].

Concentrația plasmatică a IL-6 se corelează cu nivelul CRP, IL-6 fiind principala citokină care stimulează eliberarea CRP din ficat. Cum IL-6 este stabilă în circulație, ar putea contribui în comorbiditățile și la caracteristicile sistemice din BPOC, mai ales prin disfuncția endotelială, rezistența la insulină, osteoporoză și depresie[124].

Spre deosebire de pacienții cu BPOC, la pacienții cu stroke incluși în acest studiu nivelul IL-6 a fost singurul semnificativ crescut atât în ser cât și în LCR, urmărindu-se în dinamică până în ziua 26 după stroke.

Mai multe studii au investigat nivelele IL-6 în sângele și LCR-ul pacienților cu stroke, mare parte dintre ele observând nivele crescute ale acestei citokine și corelându-le cu severitatea.

Într-un studiu din 2011, s-a înregistrat o corelație pozitivă între nivelul crescut al IL-6 în LCR la 6 ore de la stroke și mărimea leziunii la 24 de ore[109], creșterea IL-6 fiind mai pronunțată în cazul existenței leziunilor în substanța cenușie.

Într-un alt studiu, nivelul IL-6 a fost neschimbat la pacienții cu infarcte reduse, indicând din nou faptul ca această citokină ar fi un marker al severității leziunii, în special al celei din substanța cenușie[126].

Este de reținut faptul că citokina găsită cel mai constant crescută în LCR după stroke este IL-6, care ar putea fi produsă atât de microglii cât și de neuroni în stroke, ceea ce a evidențiat și studiul nostru, în care IL-6 a prezentat nivele maxime în LCR în zilele 2-5 de la stroke și s-a menținut crescută în tot intervalul de timp studiat.

În ceea ce privește nivelul seric al IL-6 în stroke, se poate spune că există un consens general asupra creșterii acestuia din prima săptămână după stroke.

Unele contradicții există însă în ceea ce privește momentul când acesta își atinge peak-ul, precum și asupra corelației cu volumul final al leziunii.

Valori crescute ale IL-6 s-au înregistrat de la câteva ore la 1 zi de la stroke, iar în alte studii maximul a fost atins în ziua 3[127] sau undeva în prima săptămână după stroke[128], corelându-se cu severitatea și mărimea leziunii și evoluția neurologică[129]. Un alt studiu a avut însă rezultate opuse, cu o corelație negativă între nivelele de început ale IL-6 și dimensiunea leziunii și evoluția ulterioară, indicând mai degrabă un rol neuroprotectiv pentru IL-6[112].

Un studiu recent, din 2013, a arătat că, deși mai multe citokine, printre care IL-6, IL-8 și TNFα, au valori crescute în plasma pacienților după un stroke, acționând în rețea pentru a descrie și un răspuns inflamator periferic, nu doar unul central, în stroke, doar IL-6 s-a corelat cu severitatea și evoluția clinică. Creșterea valorilor plasmatice ale IL-6 s-a asociat cu gravitatea disfuncției neurologice și, deci, cu pronostic prost pentru pacienții cu stroke[130].

Acest studiu care arată că IL-6 este cea mai importantă citokină din sângele pacienților cu stroke, fiind un biomarker pentru predicția severității și a evoluției clinice, vine în concordanță cu studiul nostru, care a arătat că nivelul IL-6 în serul pacienților cu stroke crește și atinge maximul între zilele 2-5 de la stroke și rămâne crescut față de martor până în ziua 26 după stroke, adică pe tot intervalul de timp studiat.

Consecințele citokinelor în stroke

Ischemia din stroke duce la necroză neuronală ce va declanșa un răspuns imun și activarea și infiltrarea celulelor inflamatorii. Reperfuzia spontană sau terapeutică va duce la influxul masiv de ROS și leucocite.

ROS poate stimula celulele ischemiate să secrete citokine inflamatorii și chemokine care vor promova expresia moleculelor de adeziune și recrutarea leucocitelor periferice. Odată activate, celulele inflamatorii eliberează o varietate de agenți citotoxici, printre care mai multe citokine, matrix metaloproteaze, NO și mai multe ROS. Aceste substanțe induc leziuni celulare precum și ale barierei hematoencefalice și matricei extracelulare[131], care vor contribui la leziuni secundare.

Aceste leziuni secundare apar ca o consecință a edemului cerebral, staza microvasculară post-ischemică și deficitelor hemodinamice ce duc la hipoperfuzie și inflamație post-ischemică, implicând activarea microgliilor și infiltrarea creierului de către celulele inflamatorii periferice. Migrarea leucocitelor periferice în creier duce la amplificarea cascadei de semnalizare inflamatorie și a distrucției tisulare[89].

Consecințele citokinelor în BPOC

Mai mulți factori joacă un rol în declanșarea acestei inflamații sistemice din BPOC, printre care fumatul, inflamația din căile aeriene, obstrucția căilor și hiperinflația, însă, un rol independent de acestea s-ar părea că îl joacă hipoxia tisulară.

Pe de altă parte este cunoscut faptul că factorul de transripție NF-κB este factorul cheie în reglarea răspunsului inflamator, controlând expresia unor citokine precum TNFα și IL-8, și că hipoxia participă la inducerea acestui factor. S-a arătat că după 24 de ore de hipoxie susținută a crescut activitatea NFκB în țesutul pulmonar și cardiac[132]. De asemenea, pacienții cu BPOC au nivele serice crescute de TNFα și receptori solubili de TNF odată cu descreșterea presiunii de oxigen[133].

Ca explicație pentru această inflamație sistemică s-a mai adus în discuție activarea macrofagelor alveolare, cu consecințe sistemice. Acestea eliberează în circulație citokine care vor mobiliza din măduvă leucocite și trombocite și vor iniția o inflamație sistemică. O explicație posibilă este un “overspill” al mediatorilor eliberați de celulele pulmonare, inclusiv macrofage alveolare, în circulația sistemică[101].

O altă sursă pentru mediatorii proinflamatori ar fi țesutul adipos la pacienții cu BPOC și obezi. La aceștia țesutul adipos prezintă inflamație și, mai mult, hipoxia tisulară se pare că joacă un rol important în apariției inflamației și în acest caz.

Nivelele mari de TNF-α de la șoarecii obezi au fost asociate cu obezitatea și rezistența la insulină.

Până la o treime din concentrația serică totală de IL-6 ar fi originară din țesutul adipos.

IL-8 este de asemenea produs în cantități mari de țesutul adipos și, la fel ca în cazul IL-6, TNF-α este un stimul potent pentru producerea IL-8 de adipocite. Totuși, nu există încă suficiente date pentru a stabili o asociație între producerea IL-6 și IL-8 de către adipocite și nivelul lor seric în BPOC[134].

În hipoxia cronică, fibroblastele în cadrul inflamației arteriale pulmonare perivasculare s-au dovedit a fi proinflamatorii, exprimând nivele crescute de IL-1, IL-6, RANTES (chemotactic cytokine regulated and normal T cell expressed and secreted), SDF-1 (stromal derived factor 1) și CXCR4 (chemokine receptor type 4).

Hipoxia induce expresia TLR2 și TLR6 dependent de HIF-1α, ceea ce va activa NF-κB.

O revărsare a factorilor chemotactici, cum ar fi VEGF, leukotriena B4 (LTB4) și altele din plămânul hipoxic contribuie la acțiunea directă a hipoxiei asupra măduvei, mobilizând precursori megacariocitari, mastocitari și celule dendritice, astfel, întărind afirmația că inflamația hipoxică este un răspuns sistemic[135].

La rândul ei, inflamația sistemică induce apariția aterosclerozei, a patologiei cardiovasculare și contribuie la disfuncția musculară, osteopenie și depresie la pacienții cu BPOC, corelându-se cu evoluția clinică[136] (Figura 4.2).

Figură 4.2 Consecințele inflamației sistemice în BPOC. (Peter J. Barnes, Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Effects beyond the Lungs, PLoS Med. Mar 2010; 7(3): e1000220.)

Disfuncția musculară

Hipoxia contribuie la disfuncția musculară din BPOC prin variate mecanisme. Mai întâi, aceasta generează un grad de inflamație sistemică cronică.

TNFα poate induce apoptoza miocitelor și degradarea proteinelor. Nivelele TNFα și ale IL-8 se corelează cu gradul disfuncției musculare din BPOC, iar la pacienții cu BPOC și cu greutate corporală redusă, în mușchii scheletici se activează NFκB.

Stresul oxidativ contribuie și el la această disfuncție, iar hipoxemia cronică poate afecta și direct funcția mușchilor netezi. Calea AKt/mTOR (mammalian target of rapamycin) ține sub masa musculară scheletică și previne atrofia muscular[137].

Hipertensiunea pulmonară (HTP)

Hipertensiunea pulmonară se datorează obliterării patului capilar pulmonar de către emfizem, bolii tromboembolice și constricției și remodelării vasculare, iar rolul HIF în remodelarea vasculară este binecunoscut.

Implicarea HIF-1α în HTP a fost documentată prin faptul că șoarecii heterozigoți expuși cronic la hipoxie au prezentat grade mai reduse de policitemie, hipertrofie ventriculară dreaptă, HTP, remodelare vasculară pulmonară și pierdere în greutate față de cei sălbatici.

Hipoxia induce influxul de calciu, cu depolarizarea membranară în celulele musculare netede din arterele pulmonare și crește sinteza și eliberarea endotelinei din celulele endoteliale, determinând un dezechilibru în favoarea creșterii tonusului vascular pulmonar și a stării proliferative a peretelui vascular[83] (Figura 4.3).

Dacă până acum era evidentă asociația dintre HTP și vasoconstricție, de curând o astfel de asociație s-a stabilit și cu inflamația. Pe lângă citokinele IL1, IL6, VEGF, la aceasta contribuie și EndMT ( Endothelial-mesenchymal transition) cu care a fost asociată și activarea căilor Notch și NF-κB și, ținând cont de legătura dintre hipoxie, HIF-1α și NF-κB, se poate spune ca la dezvoltarea EndMT în vasele pulmonare contribuie și hipoxia cronică[135].

Figură 4.3 Exemple de remodelare în căile respiratorii din BPOC. Imaginea A prezintă metaplasia mucoasă a endoteliului (MM) și hipertrofia mușchiului neted (SM), B prezintă fibroza peribronhială, C metaplasia scuamoasă, D infiltrat limfocitar în adventicea bronhiolei. (Victor Kim, Thomas J. Rogers, and Gerard J. Criner, New Concepts in the Pathobiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease, Proc Am Thorac Soc. May 1, 2008; 5(4): 478–485.)

Răspunsul celular la hipoxia acută vs. hipoxia cronică

În hipoxia acută:

Modificări metabolice

Deși cea mai eficientă cale de a genera energie este prin fosforilarea oxidativă, lipsa oxigenului determină shif-ul metabolismului spre glicoliză. În acest răspuns la stresul hipoxic acut sunt implicate două căi: cea a AMPK (AMP-activated protein kinase) și cea a HIF.

AMPK acționează ca un senzor caloric celular, activându-se la modificări ale raportului AMP:ATP, astfel, când nivelul ATP scade, cel al AMP crește, iar AMPK va stimula procesele catabolice și le va inhiba pe cele anabolice. Așadar, va crește expresia transportorilor glucozei GLUT4 și GLUT1, cu respectiva creștere a transportului transmembranar intracelular al glucozei, vor fi stimulate glicoliza și oxidarea acizilor grași și, dimpotrivă, inhibate sinteza de proteine și glicogen[138].

De asemenea, un număr mare de enzime glicolitice reprezintă ținte ale HIF-1 și sunt induse în câteva minute de la debutul hipoxiei. Printre acestea, PDK-1 (kinaza-1 piruvat dehidrogenaza) și LDHA (lactat dehidrogenaza A) determină creșterea transformării piruvatului în lactat pentru a genera ATP, în locul intrării lui în ciclul Krebs, care este astfel inhibat. Astfel, rezultă un deficit de succinat și fumarat, ce reprezintă substraturi pentru PHD, mimând un răspuns celular hipoxic[139].

Rolul speciilor reactive de oxigen

Deși până de curând au fost considerați doar produși toxici, deșeuri rezultate în urma lanțului de transport al electronilor, noi date sugerează că generarea de ROS în spațiul intermembranar reprezintă o cale importantă de semnalizare a hipoxiei, cu efecte asupra altor căi de semnalizare necesare în răspunsul la hipoxie. ROS contribuie în unele răspunsuri posttranslaționale, controlând activarea AMPK în hipoxie, dar are și un rol important în stabilizarea HIF, prin inhibiția PHD și FIH. Pe de altă parte, speciile reactive de oxigen și azot inhibă citocrom C oxidaza mitocondrială care nu va mai acționa ca o ”capcană” pentru oxigen, permițându-i distribuția spre alte compartimente celulare, pentru a crește activitatea PHD[140].

Efectele hipoxiei asupra mobilității, invaziei și diferențierii celulare

Una dintre cele mai importante căi în diferențierea, mobilitatea și invazia celulară o reprezintă semnalizarea Notch. Domeniul intracelular al receptorului Notch (Notch-ICD) este una dintre proteinele ce interacționează cu FIH-1. Aceasta interacțiune reduce activitatea Notch, dar în același timp reprezintă un mecanism de sechestrare a FIH-1, care nu mai hidroxilează HIF-1α, a cărui activitate va crește[141].

În hipoxia cronică:

Adaptarea pe termen lung încearcă să restaureze fluxul de oxigen normal la țesuturi fie prin creșterea hemoglobinei și a masei eritrocitare, fie prin formarea de noi vase sau remodelarea celor existente.

Rolul eritropoietinei

Eritropoietina a fost descrisă inițial ca fiind factorul cheie necesar pentru diferențierea și proliferarea precursorilor eritrocitari în măduva hematogenă, fiind sintetizată în principal în fibroblaștii interstițiali peritubulari din rinichi la adult și în hepatocitele fetale. În ultimii ani s-au identificat totuși și alte sedii de sinteză, cum ar fi creierul, cordul și sistemul reproducător, unde se pare că eritropoietina nu mai are funcție erotripoietică, ci de factor protector celular și tisular. Epo acționează într-o manieră paracrină pentru a proteja țesutul nervos de leziunile hipoxice și ischemice, stimulând și creșterea și diferențierea neuronală și, de asemenea, protejează cardiomiocitele de apoptoză și de leziunile de ischemie/reperfuzie[142]. (Figura 4.4) În acest sens au fost discutate mai multe mecanisme de protecție. Se știe că Epo activează kinazele IP3/Akt și căile de semnalizare dependente de MAPK, rezultând în creșterea nivelului de NOS și, respectiv, de NO, ca principal factor antiapoptotic. Totodată, recent s-a raportat rolul Epo în stimularea ventilației indusă de hipoxie, marcând legătura realizată de aceasta între răspunsul cronic eritropoietic și cel acut, ventilator la hipoxie[143].

Figură 4.4 Reprezentare schematică a efectelor biologice ale eritropoietinei. (Murat O. Arcasoy, Non-erythroid effects of erythropoietin, Haematologica. Nov 2010; 95(11): 1803–1805.)

Precondiționarea hipoxică

Principiul precondiționării ischemice a fost descris mai întâi în 1986, prin câteva cicluri de ischemie, urmate de scurte episoade de reperfuzie, care au redus semnificativ zona de infarct dintr-un accident ischemic cardiac ulterior. La fel, studii recente au arătat că leziunile ischemice ale pacienților cu angină cardiacă îi protejează pe aceștia în cazul unui infarct miocardic sever[144]. Precondiționarea hipoxică acționează însă și în alte organe precum creierul, măduva spinării, retina, ficat, plămâni și mușchii scheletici și, deși mecanismul molecular exact nu se cunoaște încă, a fost discutată implicarea factorilor de transcripție induși de hipoxie sau a modificărilor în metabolismul energetic[37].

Metabolismul fierului

Fierul este un cofactor esențial pentru toate proteinee care leagă oxigenul, fiind necesar și pentru formarea hemului și eritropoieză, metabolismul său, eritropoieza și homeostazia oxigenului fiind strâns legate. Pe de o parte, deficitul de fier va scădea activitatea PHD și va cauza hipoxie anemică, ambele ducând la creșterea expresiei HIF, iar pe de altă parte, genele responsabile pentru sinteza transferinei, a receptorului transferinei, a ceruloplasminei și a hem oxigenazei 1 sunt ținte pentru HIF-1.

Metabolismul fierului poate fi influențat și direct de concentrația oxigenului intracelular, IRP (iron regulatory proteins), cu rol important la nivelul mARN-ului proteinelor implicate în metabolismul fierului, fiind controlate de nivelul 2-oxoglutaratului, fierului și al PHD-dependente de oxigen[145].

Angiogeneza și remodelarea vasculară

Acestea sunt două dintre cele mai întâlnite mecanisme de adaptare la hipoxia cronică.

Angiogeneza implică un proces complex la care iau parte o multitudine de factori a căror gene sunt ținte ale HIF, însă, de departe cel mai descris este VEGF. În cadrul tumorilor, în regiunile perinecrotice, se întâlnește un micromediu hipoxic în care expresia mARN a VEGF este foarte crescută, ca mecanism de stimulare a angiogenezei. Atât celulele tumorale cât și macrofagele care infiltrează tumora (TAM) eliberează VEGF pentru a construi o arhitectură vasculară funcțională (Figura 4.5).

În cazul remodelării vasculare, rolul HIF nu este atât de bine definit, dar utilizarea terapeutică a HIF-1α în anumite condiții patologice de ischemie și hipoxie, ca în cardiomiopatia hipertrofică, în vindecarea rănilor la pacienți diabetici sau în neovascularizația retiniană, a arătat creșterea numărului de vase și a oxigenării regionale[146].

Figură 4.5 Remodelarea vasculară pulmonară hipoxică la șobolani expuși la 3 săptămâni de hipoxie cronică. Imaginea a prezintă artera pulmonară în condiții de normoxie, b imunofluorescență a unei artere pulmonare normale, c îngroșarea peretelui arterial în condiții de hipoxie cronică, d extensia stratului muscular a unei artere secționate longitudinal, e imunofluorescență ce arată îngroșarea stratului medial al unei artere pulmonare în condiții de hipoxie cronică, f detecția oxigenului cellular cu hidroxiprobe a arătat pete pe celulele endoteliale și epiteliale II în hipoxie cronică. (Rubin M. Tuder , Jeong H. Yun, Anil Bhunia and Iwona Fijalkowska, Hypoxia and chronic lung disease, Journal of Molecular Medicine, Springer-Verlag, 2007)

Căile comune de declanșare a răspunsului inflamator în hipoxia acută și în cea cronică

Căile de semnalizare în hipoxie

Factorul indus de hipoxie 1 (HIF-1) este un mediator critic al răspunsului la hipoxia acută și cronică.

Mai întâi, HIF-1 este necesar pentru dezvoltarea embrionară a sistemelor care vor media răspunsurile la hipoxie, inclusiv cordul, sângele și vasele de sânge, iar șoriceii cu deficit complet de HIF-1α manifestă defecte în dezvoltarea celor trei componente ale sistemului circulator.

În al doilea rând, HIF-1 mediază modificările în expresia genelor care răspund de răspunsul la hipoxia cronică, cum ar fi creșterea eritropoiezei și a angiogenezei. Șoriceii heterozigoți, Hif1a(+/-), cu deficit parțial de HIF-1α, prezintă diminuarea remodelării vasculare pulmonare induse de hipoxie[147].

De asemenea, și alți factori de transcripție semnalizează răspunsul la hipoxie, printre care NF-κB și CREB.

De fapt, se pare că există o suprapunere și o intermodulație între diferiți factori, mai ales între cei implicați și în răspunsul inflamator, NF-κB fiind un activator transcripțional al HIF-1α.

Pe lângă activarea factorilor de transcripție specifici, hipoxia este asociată cu reglarea expresiei genelor și prin inducerea de microARN-uri.

VEGF este una dintre cele mai importante ținte ale miARN-ului.

Un studiu recent afirmă faptul că la subiecții umani normali expunerea la hipoxie acută (timp de 60 de minute) induce expresia HIF-1α și a VEGF, mai degrabă decât un răspuns inflamator generalizat, sugerând un mecanism mai complex față de modelele celulare sau animale[148].

La rândul său, HIF este controlat de hidroxilazele PHD și FIH-1. Deși acest mecanism de stabilizare a HIF prin inhibiția hidroxilazelor este foarte important pentru răspunsul rapid la hipoxia profundă celulară, HIF poate fi activat și prin alte mecanisme cu latență crescută, ce implică sinteza de noi proteine HIF-α.

Astfel, HIF-1 crește rapid într-o oră de hipoxie și rămâne constantă pentru următoarele 23 de ore. După 15 zile de hipoxie cronică, HIF-1 își scade nivelul la 10 % din cea măsurată în hipoxia acută[149].

La 5 zile de hipoxie severă, nivelul proteinei HIF-1α rămâne același ca cel de după o zi de hipoxie, în ciuda creșterii mARN a HIF, sugerând maniera complexă în care hipoxia acționează la nivelul căilor de semnalizare, cu creșterea expresiei și a hidroxilazelor, ca posibilă explicație[150].

Pe de altă parte, datorită interrelației dintre HIF și NF-κB, activarea răspunsului imun înnăscut crește expresia HIF-1α într-o manieră independentă de hipoxie, cu creșterea transcripției genei HIF-1α dependent de NF-κB, în timp de ore sau zile (Figura 4.6). Un al doilea mecanism independent de hipoxie prin care se crește expresia HIF implică activarea căii PI3K/Akt ca răspuns la citokine și factori de creștere, inclusiv factorii de creștere insulin-like. Această cale este legată și cu expresia de lungă durată a HIF în cancerul de colon și de plămâni.

Un alt mecanism care contribuie la stabilizarea HIF a fost descris în țesutul cardiac ischemic, creșterile adenozinei extracelulare induse de hipoxie cauzând creșterea expresiei HIF-1α[151].

Figură 4.6 Modularea reciprocă a activității căilor HIF și NF-κB în hipoxie. (Kathryn M Oliver, Cormac T Taylor, and Eoin P Cummins, Hypoxia. Regulation of NFκB signalling during inflammation: the role of hydroxylases, Arthritis Res Ther. 2009; 11(1): 215.)

Calea de semnalizare NF-κB din inflamație

Totuși, HIF nu este singurul factor de transcripție ce mediază răspunsul transcripțional la hipoxie.

Inhibiția PHD de către hipoxie stabilizează și alte proteine în afară de HIF, producând răspunsuri la hipoxie independente de HIF, activarea factorului NF-κB ca răspuns la hipoxie fiind, cel puțin în parte rezultatul inhibiției PHD.

Activarea NF-κB este responsabilă de reglarea unui număr mare de gene cu impact în procesele imune, inflamatorii și apoptotice, deși se pare că prezintă funcții contradictorii și adesea opuse în cadrul acestora. Astfel, NF-κB reglează expresia citokinelor (TNFα,IL-1), a moleculelor de adeziune (ICAM, E-selectin) și a enzimelor (COX-2 și iNOS), fiind considerat un reglator central al inflamației[152].

Inhibiția hipoxică a PHD-1 sau a PHD-2 stabilizează IKK-β și îi crește activitatea, ducând la degradarea dependentă de fosforilare a IκB-α și la eliberarea și translocarea nucleară a NF-κB (Figura.

De asemenea, într-un studiu recent, Scholz et al. au evidențiat rolul global al hidroxilazelor în reglarea NF-κB, independent de HIF. Ei au arătat că există câteva proteine din calea IL-1β care formează complexe cu PHD1 sau cu FIH, unele dintre aceste proteine de la nivelul complexului TRAF6 suferind hidroxilare și că aceste hidroxilaze controlează activitatea NF-κB indusă de IL-1β[153]. Așadar, se pare că hidroxilazele, ce pot fi considerate senzori ai oxigenului, conferă sensibilitate la hipoxie ambelor căi, a HIF și a NF-κB.

NF-κB în BPOC

NF-κB este factorul de transcripție în mod particular legat de inflamația din cadrul BPOC, inducând expresia genelor unor mediatori esențiali în patogeneza acestei boli, inclusiv IL-1, IL-6, IL-8, MCP-1 și TNF-α[154].

În câteva studii s-a demonstrat că NF-κB este un mediator al efectelor fumului de țigarete asupra transcripției genelor în diferite celule[155][156], iar dimerul său activat s-a arătat a fi indus în produsul de biopsie bronșică a fumătorilor[157].

La baza activării transcripției genelor inflamatorii de către NF-κB și inițierii inflamației cronice s-ar părea că stă dezechilibrul acetilare/deacetilare a histonelor, cu creșterea acetilării, cauzat probabil de stresul oxidativ ce caracterizează fiziopatologia BPOC-ului[158].

Expresia și translocarea sa NF-κB sunt crescute în țesutul pulmonar și în sputa pacienților cu BPOC, comparativ cu martorii nefumători, fiind asociate cu exacerbările[159].

Mai mult, și într-un studiu realizat de Di Stefano et al. s-a demonstrat creșterea activării NF-κB în celulele epiteliale și în macrofagele de la pacienți cu BPOC și de la fumători sănătoși, ce s-a corelat cu limitarea fluxului de aer, însoțită de creșterea produșilor de peroxidare lipidică, ca marker al stresului oxidativ[160].

Acestea sugerează faptul că activarea NF-κB joacă un rol important în răspunsul inflamator cronic din BPOC.

NF-κB în stroke

Rolul NF-κB în stroke este controversat, acesta apărând a fi implicat și în neuroprotecție, pe lângă răspunsul inflamator.

Șoarecii tratați cu un inhibitor al NF-κB au fost protejați de ischemia cerebrală. De asemenea, inhibiția IKK a redus zona de infarct, iar activarea sa a crescut-o[161].

Pe de altă parte, inhibiția NF-κB cu dietildithiocarbamat a crescut zona de infarct, sugerând un rol benefic pentru NF-κB.

Aceste diferențe din datele din literatură, deși controversate, ar putea fi totuși datorate tipului de celulă în care NF-κB este activat sau modelului experimental studiat[92].

Comunicarea dintre HIF și NF-κB

În ultimii ani a devenit din ce în ce mai clar faptul că, pe lângă activitatea lor independentă, HIF și NF-κB au o relație interdependentă de un nivel semnificativ în ceea ce privește inflamația asociată hipoxiei[162].

HIF, pe lângă răspunsul la hipoxie, poate fi activat și de alți stimuli non-hipoxici, cum ar fi LPZ bacteriene, TNFα, ROS și IL-1β.

Faptul că HIF poate fi activat ca răspuns la citokinele inflamatorii indică faptul că acesta joacă un rol important în inflamație.

Mecanismul activării HIF de către toți acești factori implică creșterea nivelului mARN a HIF-1α în mod dependent de NF-κB.

NF-κB este implicat totodată și în expresia mARN a HIF-1α indusă de hipoxie. Mai mult, s-a arătat că NF-κB este important și pentru expresia genei HIF-1α la nivel bazal. Promoterul HIF-1α conține un sit de legare pentru NF-κB în amonte de locul de start al transcripției[163] (Figura 4.7).

Figură 4.7 Interacțiunea moleculară dintre căile HIF și cea canonică a NF- κB în condiții de hipoxie. (Holger K. Eltzschig, M.D., Ph.D., and Peter Carmeliet, M.D., Ph.D., Hypoxia and Inflammation, N Engl J Med 2011;)

Pe de altă parte, s-a investigat și interacțiunea dintre HIF și NF-κB în semnalizarea inflamatorie în condiții de hipoxie prin studierea supraviețuirii neutrofilelor indusă de hipoxie. Astfel, s-a ajuns la concluzia că HIF-1α crește expresia NFκB p65 și a IKKα în neutrofile, inhibând apoptoza lor[42].

Mai mult decât atât, hipoxia alveolară, cu implicarea atât a HIF-1 cât și a NF-κB, a indus recrutarea de macrofage, extravazarea de albumină și creșterea expresiei mediatorilor inflamatori, un rol critic în inflamația din plămâni având macrofagele alveolare. Acest mecanism a fost confirmat și de faptul că HIF-1α este esențial pentru inflamația mediată de celulele mieloide. În mod similar s-a arătat că activarea genelor cu răspuns la hipoxie de către lipopolizaharide în macrofage a implicat calea HIF-1α[164].

Studiul nostru a analizat nivelele serice și în LCR ale unor citokine pro- și anti-inflamatorii în două modele de patologie, de hipoxie acută, respectiv cronică, obținând nivele crescute ce indică o asociație între hipoxie și răspunsul inflamator.

Ca orice studiu, și acesta a prezentat limite și puncte forte.

O limită a studiului o reprezintă eventualele surse multiple pentru producția de citokine, spre exemplu, nivelul acestora ar putea fi datorat și bolilor cardiovasculare asociate în BPOC și nu doar strict inflamației din BPOC. Dat fiind faptul că aceste comorbidități oricum se datorează în parte și inflamației sistemice din BPOC, poate exista totuși o corelație cu inflamația sistemică din BPOC chiar și în cazul acestei posibilități a unor surse multiple pentru citokinele din ser.

Un punct forte o reprezintă gama largă de citokine analizate, contribuind la îmbogățirea literaturii de specialitate, care, în cazul unora dintre citokine, prezintă date contradictorii.

Analiza comparativă a răspunsului inflamator în hipoxia acută față de cea cronică pe care și-a propus-o și a realizat-o acest studiu reprezintă un alt punct forte al acestei lucrări, fiind totodată un element de noutate printre datele actuale din literatură.

Așadar, putem spune că o bogată literatură de specialitate confirmă legătura dintre răspunsul inflamator și hipoxia atât acută cât și cronică, studiată și în această lucrare, această legătură avându-și rădăcina la nivelul căilor de semnalizare moleculare, NFκB și HIF-1α, care se potențează reciproc într-o buclă pozitivă în condiții de hipoxie și inflamație.

Concluzii

Hipoxia și inflamația sunt condiții implicate în patogeneza unei game largi de patologii, de la ischemie, la cancere, la bolile inflamatorii intestinale sau la bolile pulmonare cronice, având mecanisme robuste și bine conservate, dar și interconectate.

Lucrarea aceasta a analizat răspunsul inflamator constituit în două patologii caracterizate de hipoxie, în stroke, caracterizat de o stare de hipoxie acută și în BPOC, caracterizat de hipoxie cronică. Ca markeri ai inflamației, au fost urmărite nivelele citokinelor pro- și anti-inflamatorii în două grupuri de pacienți, cu stroke, respectiv cu BPOC.

La pacienții cu stroke am analizat nivelele în ser și în LCR ale citokinelor TNFα, IL-6 și IL-10, înregistrând creșteri semnificative față de subiecții sănătoși doar pentru IL-6 atât în LCR cât și în ser. Nivelele IL-6 au fost urmărite în dinamică, obținând maximul între zilele 2-5 de la stroke și rămânând crescute pe tot parcursul intervalului de timp studiat (până în ziua 26 de la stroke). Citokinele sunt implicate în leziunile secundare din reperfuzie, ele crescând expresia moleculelor de adeziune și recrutarea leucocitelor. De asemenea, ele modulează zona de infarct, fiind markeri de predicție pentru evoluția clinică ulterioară. Dintre toate citokinele, IL-6 reprezintă însă cel mai important marker în stroke, corelându-se cu severitate crescută și pronostic prost.

În cazul pacienților cu BPOC, am analizat nivelele serice ale citokinelor TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8 și IL-10. Toate au fost crescute față de normal, însă, valorile pentru IL-6 și pentru IL-10 nu au fost semnificative statistic. Cea mai mare valoare în ser a fost cea a IL-8. Această citokină este puternic chemoatractantă pentru neutrofile, contribuind la inflamația locală pulmonară. IL-10 are efecte anti-inflamatorii, scade sinteza citokinelor proinflamatorii, reprezentând o posibilitate terapeutică în BPOC.

Toate cele patru citokine proinflamatorii acționează în „rețea” în desfășurarea inflamației sistemice și dezvoltarea comorbidităților din BPOC. Aceste comorbidități (bolile cardiovasculare, sindromul metabolic, cașexia, atrofia musculară, osteopenia, depresia) contribuie semnificativ la „povara” bolii, astfel, aceste citokine devenind și mai atractive pentru dezvoltarea de noi strategii terapeutice având țintă comorbiditățile din BPOC.

În ambele stări patologice de hipoxie acută, respectiv cronică, s-a declanșat un răspuns inflamator asociat hipoxiei, concretizat prin nivelele crescute ale citokinelor. Această asociere dintre hipoxie și inflamație reprezintă de fapt consecința relației interdependente dintre căile de semnalizare și factorii de transcripție specifici. Printre aceștia semnificativi sunt mai ales HIF, ca factor cheie pentru adaptarea la hipoxie, și NF- κB, ca modulator principal al inflamației.

În concluzie, dată fiind frecvența cu care această asociere este regăsită în patologiile umane, răspunsul inflamator asociat hipoxiei deschide ușa spre un mare număr de noi posibilități terapeutice, atât prin modularea efectelor citokinelor, cât și prin acționarea la nivelul căilor de semnalizare, o și mai avansată înțelegere a interrelației dintre acestea dovedindu-se a fi tot mai necesară pe măsură ce ne apropiem mai mult de deslușirea mecanismelor moleculare ce stau în spatele relației dintre hipoxie și inflamație.

Bibliografie

[1] Y. Vodovotz, G. Constantine, J. Rubin, M. Csete, E. O. Voit, and G. An, “Mechanistic simulations of inflammation: current state and future prospects.,” Math. Biosci., vol. 217, no. 1, pp. 1–10, Jan. 2009.

[2] Q. Mi, N. Y.-K. Li, C. Ziraldo, A. Ghuma, M. Mikheev, R. Squires, D. O. Okonkwo, K. Verdolini-Abbott, G. Constantine, G. An, and Y. Vodovotz, “Translational systems biology of inflammation: potential applications to personalized medicine.,” Per. Med., vol. 7, no. 5, pp. 549–559, Sep. 2010.

[3] F. S. Laroux, “Mechanisms of inflammation: the good, the bad and the ugly.,” Front. Biosci., vol. 9, pp. 3156–62, Sep. 2004.

[4] P. H. Black, “The inflammatory response is an integral part of the stress response: Implications for atherosclerosis, insulin resistance, type II diabetes and metabolic syndrome X.,” Brain. Behav. Immun., vol. 17, no. 5, pp. 350–64, Oct. 2003.

[5] T. Lawrence and C. Fong, “The resolution of inflammation: anti-inflammatory roles for NF-kappaB.,” Int. J. Biochem. Cell Biol., vol. 42, no. 4, pp. 519–23, Apr. 2010.

[6] J. C. Marshall, “Inflammation, coagulopathy, and the pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome.,” Crit. Care Med., vol. 29, no. 7 Suppl, pp. S99–106, Jul. 2001.

[7] Y. Vodovotz, M. Csete, J. Bartels, S. Chang, and G. An, “Translational systems biology of inflammation.,” PLoS Comput. Biol., vol. 4, no. 4, p. e1000014, Apr. 2008.

[8] R. Medzhitov, “Origin and physiological roles of inflammation.,” Nature, vol. 454, no. 7203, pp. 428–35, Jul. 2008.

[9] C. Nathan, “Points of control in inflammation.,” Nature, vol. 420, no. 6917, pp. 846–52.

[10] V. Eisen, “Past and present views of inflammation.,” Agents Actions. Suppl., no. 3, pp. 9–16, Jan. 1977.

[11] K. Ley, Physiology of inflammation. Oxford ;: Oxford University Press,, 2001.

[12] A. M. Silverstein, A history of immunology. Amsterdam ;: Academic Press,, 2009.

[13] S. H. E. Kaufmann, “Elie Metchnikoff’s and Paul Ehrlich's impact on infection biology.,” Microbes Infect., vol. 10, no. 14–15, pp. 1417–9.

[14] G. Majno and G. E. Palade, “Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.,” J. Biophys. Biochem. Cytol., vol. 11, pp. 571–605, Dec. 1961.

[15] F. J. C. and W. P. A., “Inflammation,” in Pathology, 3rd ed., E. Rubin and J. L. Farber, Eds. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1999, pp. 37–75.

[16] T. Hellwig-Bürgel, D. P. Stiehl, A. E. Wagner, E. Metzen, and W. Jelkmann, “Review: hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): a novel transcription factor in immune reactions.,” J. Interferon Cytokine Res., vol. 25, no. 6, pp. 297–310, Jun. 2005.

[17] V. Kumar, A. K. Abbas, N. Fausto, and J. C. Aster, “Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease, Professional Edition: Expert Consult – Online,” 8th ed., Elsevier Health Sciences, 2009, pp. 30–65.

[18] J. M. Cook-Mills and T. L. Deem, “Active participation of endothelial cells in inflammation.,” J. Leukoc. Biol., vol. 77, no. 4, pp. 487–95, Apr. 2005.

[19] W. A. Muller, “Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response.,” Trends Immunol., vol. 24, no. 6, pp. 327–34, Jun. 2003.

[20] B. Petri and M. G. Bixel, “Molecular events during leukocyte diapedesis.,” FEBS J., vol. 273, no. 19, pp. 4399–407, Oct. 2006.

[21] P. J. M. Van Haastert and P. N. Devreotes, “Chemotaxis: signalling the way forward.,” Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 5, no. 8, pp. 626–34, Aug. 2004.

[22] V. Kumar, A. K. Abbas, N. Fausto, and R. N. Mitchell, “Robbins Basic Pathology,” 9th ed., Elsevier Health Sciences, 2012, pp. 29–70.

[23] C. N. Serhan and J. Savill, “Resolution of inflammation: the beginning programs the end.,” Nat. Immunol., vol. 6, no. 12, pp. 1191–7, Dec. 2005.

[24] R. A. Hannon, C. Pooler, and C. M. Porth, Porth Pathophysiology: Concepts of Altered Health States. Lippincott Williams & Wilkins, 2009, pp. 385–395.

[25] P. J. Delves, S. J. Martin, D. R. Burton, and I. M. Roitt, Roitt’s Essential Immunology, 12th ed. Wiley, 2011, pp. 19–23.

[26] C. T. Esmon, “The interactions between inflammation and coagulation.,” Br. J. Haematol., vol. 131, no. 4, pp. 417–30, Nov. 2005.

[27] C. N. Serhan, P. A. Ward, and D. W. Gilroy, Fundamentals of Inflammation. Cambridge University Press, 2010, pp. 283–300.

[28] D. Salvemini, T. M. Doyle, and S. Cuzzocrea, “Superoxide, peroxynitrite and oxidative/nitrative stress in inflammation.,” Biochem. Soc. Trans., vol. 34, no. Pt 5, pp. 965–70, Nov. 2006.

[29] A. K. Abbas, A. H. H. Lichtman, and S. Pillai, Cellular and Molecular Immunology: with STUDENT CONSULT [anonimizat], 7th ed. Elsevier Health Sciences, 2011, pp. 380–390.

[30] I. F. Charo and R. M. Ransohoff, “The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.,” N. Engl. J. Med., vol. 354, no. 6, pp. 610–21, Feb. 2006.

[31] J. A. Owen, J. Punt, and S. A. Stranford, Kuby Immunology, 7th ed. W.H. Freeman, 2013, pp. 170–180.

[32] A. Fauci, E. Braunwald, D. Kasper, S. Hauser, D. Longo, J. Jameson, and J. Loscalzo, Harrison’s Principles of Internal Medicine, 17th ed. Mcgraw-hill, 2008, pp. 1628–1630.

[33] K. Sembulingam and P. Sembulingam, Essentials of Medical Physiology, 6th ed. Jaypee Brothers Medical Publishers, 2012, pp. 726–728.

[34] I. Khurana, Essentials of Medical Physiology. Elsevier India Pvt. Limited, 2008, pp. 274–275.

[35] C. C. Scholz and C. T. Taylor, “Targeting the HIF pathway in inflammation and immunity.,” Curr. Opin. Pharmacol., vol. 13, no. 4, pp. 646–53, Aug. 2013.

[36] G. L. Semenza, “Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.,” Curr. Opin. Genet. Dev., vol. 8, no. 5, pp. 588–94, Oct. 1998.

[37] N. R. Prabhakar and G. L. Semenza, “Adaptive and maladaptive cardiorespiratory responses to continuous and intermittent hypoxia mediated by hypoxia-inducible factors 1 and 2.,” Physiol. Rev., vol. 92, no. 3, pp. 967–1003, Jul. 2012.

[38] W. G. Kaelin and P. J. Ratcliffe, “Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway.,” Mol. Cell, vol. 30, no. 4, pp. 393–402, May 2008.

[39] M. E. Hubbi, H. Hu, Kshitiz, D. M. Gilkes, and G. L. Semenza, “Sirtuin-7 inhibits the activity of hypoxia-inducible factors.,” J. Biol. Chem., vol. 288, no. 29, pp. 20768–75, Jul. 2013.

[40] S. N. Greer, J. L. Metcalf, Y. Wang, and M. Ohh, “The updated biology of hypoxia-inducible factor.,” EMBO J., vol. 31, no. 11, pp. 2448–60, May 2012.

[41] G. L. Semenza, “Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine.,” Cell, vol. 148, no. 3, pp. 399–408, Feb. 2012.

[42] K. M. Oliver, C. T. Taylor, and E. P. Cummins, “Hypoxia. Regulation of NFkappaB signalling during inflammation: the role of hydroxylases.,” Arthritis Res. Ther., vol. 11, no. 1, p. 215, Jan. 2009.

[43] C. T. Taylor, G. T. Furuta, K. Synnestvedt, and S. P. Colgan, “Phosphorylation-dependent targeting of cAMP response element binding protein to the ubiquitin/proteasome pathway in hypoxia.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 97, no. 22, pp. 12091–6, Oct. 2000.

[44] F. Meric-Bernstam and A. M. Gonzalez-Angulo, “Targeting the mTOR signaling network for cancer therapy.,” J. Clin. Oncol., vol. 27, no. 13, pp. 2278–87, May 2009.

[45] G. L. Semenza, “Hypoxia-inducible factors: mediators of cancer progression and targets for cancer therapy.,” Trends Pharmacol. Sci., vol. 33, no. 4, pp. 207–14, Apr. 2012.

[46] J. A. Bertout, S. A. Patel, and M. C. Simon, “The impact of O2 availability on human cancer.,” Nat. Rev. Cancer, vol. 8, no. 12, pp. 967–75, Dec. 2008.

[47] G. L. Semenza, “HIF-1 mediates metabolic responses to intratumoral hypoxia and oncogenic mutations.,” J. Clin. Invest., vol. 123, no. 9, pp. 3664–71, Sep. 2013.

[48] X. Huang and J. Zuo, “Emerging roles of miR-210 and other non-coding RNAs in the hypoxic response.,” Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai)., vol. 46, no. 3, pp. 220–32, Mar. 2014.

[49] M. Ivan and X. Huang, “miR-210: fine-tuning the hypoxic response.,” Adv. Exp. Med. Biol., vol. 772, pp. 205–27, Jan. 2014.

[50] G. Hartmann, M. Tschöp, R. Fischer, C. Bidlingmaier, R. Riepl, K. Tschöp, H. Hautmann, S. Endres, and M. Toepfer, “High altitude increases circulating interleukin-6, interleukin-1 receptor antagonist and C-reactive protein.,” Cytokine, vol. 12, no. 3, pp. 246–52, Mar. 2000.

[51] T. Eckle, M. Faigle, A. Grenz, S. Laucher, L. F. Thompson, and H. K. Eltzschig, “A2B adenosine receptor dampens hypoxia-induced vascular leak.,” Blood, vol. 111, no. 4, pp. 2024–35, Feb. 2008.

[52] C. F. Andrade, H. Kaneda, S. Der, M. Tsang, M. Lodyga, C. Chimisso Dos Santos, S. Keshavjee, and M. Liu, “Toll-like receptor and cytokine gene expression in the early phase of human lung transplantation.,” J. Heart Lung Transplant., vol. 25, no. 11, pp. 1317–23, Nov. 2006.

[53] J. Ye, “Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance.,” Int. J. Obes. (Lond)., vol. 33, no. 1, pp. 54–66, Jan. 2009.

[54] H. K. Eltzschig and T. Eckle, “Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation.,” Nat. Med., vol. 17, no. 11, pp. 1391–401, Jan. 2011.

[55] J. Karhausen, G. T. Furuta, J. E. Tomaszewski, R. S. Johnson, S. P. Colgan, and V. H. Haase, “Epithelial hypoxia-inducible factor-1 is protective in murine experimental colitis.,” J. Clin. Invest., vol. 114, no. 8, pp. 1098–106, Oct. 2004.

[56] T. Eckle, K. Brodsky, M. Bonney, T. Packard, J. Han, C. H. Borchers, T. J. Mariani, D. J. Kominsky, M. Mittelbronn, and H. K. Eltzschig, “HIF1A reduces acute lung injury by optimizing carbohydrate metabolism in the alveolar epithelium.,” PLoS Biol., vol. 11, no. 9, p. e1001665, Sep. 2013.

[57] J. Rius, M. Guma, C. Schachtrup, K. Akassoglou, A. S. Zinkernagel, V. Nizet, R. S. Johnson, G. G. Haddad, and M. Karin, “NF-kappaB links innate immunity to the hypoxic response through transcriptional regulation of HIF-1alpha.,” Nature, vol. 453, no. 7196, pp. 807–11, Jun. 2008.

[58] P. N. Moynagh, “The NF-kappaB pathway.,” J. Cell Sci., vol. 118, no. Pt 20, pp. 4589–92, Oct. 2005.

[59] E. P. Cummins, E. Berra, K. M. Comerford, A. Ginouves, K. T. Fitzgerald, F. Seeballuck, C. Godson, J. E. Nielsen, P. Moynagh, J. Pouyssegur, and C. T. Taylor, “Prolyl hydroxylase-1 negatively regulates IkappaB kinase-beta, giving insight into hypoxia-induced NFkappaB activity.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 103, no. 48, pp. 18154–9, Nov. 2006.

[60] Y.-J. Jung, J. S. Isaacs, S. Lee, J. Trepel, and L. Neckers, “IL-1beta-mediated up-regulation of HIF-1alpha via an NFkappaB/COX-2 pathway identifies HIF-1 as a critical link between inflammation and oncogenesis.,” FASEB J., vol. 17, no. 14, pp. 2115–7, Nov. 2003.

[61] S. Frede, C. Stockmann, P. Freitag, and J. Fandrey, “Bacterial lipopolysaccharide induces HIF-1 activation in human monocytes via p44/42 MAPK and NF-kappaB.,” Biochem. J., vol. 396, no. 3, pp. 517–27, Jun. 2006.

[62] K. Nishi, T. Oda, S. Takabuchi, S. Oda, K. Fukuda, T. Adachi, G. L. Semenza, K. Shingu, and K. Hirota, “LPS induces hypoxia-inducible factor 1 activation in macrophage-differentiated cells in a reactive oxygen species-dependent manner.,” Antioxid. Redox Signal., vol. 10, no. 5, pp. 983–95, May 2008.

[63] C. Peyssonnaux, P. Cejudo-Martin, A. Doedens, A. S. Zinkernagel, R. S. Johnson, and V. Nizet, “Cutting edge: Essential role of hypoxia inducible factor-1alpha in development of lipopolysaccharide-induced sepsis.,” J. Immunol., vol. 178, no. 12, pp. 7516–9, Jun. 2007.

[64] T. Cramer, Y. Yamanishi, B. E. Clausen, I. Förster, R. Pawlinski, N. Mackman, V. H. Haase, R. Jaenisch, M. Corr, V. Nizet, G. S. Firestein, H. P. Gerber, N. Ferrara, and R. S. Johnson, “HIF-1alpha is essential for myeloid cell-mediated inflammation.,” Cell, vol. 112, no. 5, pp. 645–57, Mar. 2003.

[65] S. R. Walmsley, C. Print, N. Farahi, C. Peyssonnaux, R. S. Johnson, T. Cramer, A. Sobolewski, A. M. Condliffe, A. S. Cowburn, N. Johnson, and E. R. Chilvers, “Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.,” J. Exp. Med., vol. 201, no. 1, pp. 105–15, Jan. 2005.

[66] J. Jantsch, D. Chakravortty, N. Turza, A. T. Prechtel, B. Buchholz, R. G. Gerlach, M. Volke, J. Gläsner, C. Warnecke, M. S. Wiesener, K.-U. Eckardt, A. Steinkasserer, M. Hensel, and C. Willam, “Hypoxia and hypoxia-inducible factor-1 alpha modulate lipopolysaccharide-induced dendritic cell activation and function.,” J. Immunol., vol. 180, no. 7, pp. 4697–705, Apr. 2008.

[67] H.-J. Jeong, H.-S. Chung, B.-R. Lee, S.-J. Kim, S.-J. Yoo, S.-H. Hong, and H.-M. Kim, “Expression of proinflammatory cytokines via HIF-1alpha and NF-kappaB activation on desferrioxamine-stimulated HMC-1 cells.,” Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 306, no. 4, pp. 805–11, Jul. 2003.

[68] J. Jantsch, M. Wiese, J. Schödel, K. Castiglione, J. Gläsner, S. Kolbe, D. Mole, U. Schleicher, K.-U. Eckardt, M. Hensel, R. Lang, C. Bogdan, M. Schnare, and C. Willam, “Toll-like receptor activation and hypoxia use distinct signaling pathways to stabilize hypoxia-inducible factor 1α (HIF1A) and result in differential HIF1A-dependent gene expression.,” J. Leukoc. Biol., vol. 90, no. 3, pp. 551–62, Sep. 2011.

[69] M. V Sitkovsky, “T regulatory cells: hypoxia-adenosinergic suppression and re-direction of the immune response.,” Trends Immunol., vol. 30, no. 3, pp. 102–8, Mar. 2009.

[70] S. P. Colgan and C. T. Taylor, “Hypoxia: an alarm signal during intestinal inflammation.,” Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol., vol. 7, no. 5, pp. 281–7, May 2010.

[71] C. C. Scholz, M. A. S. Cavadas, M. M. Tambuwala, E. Hams, J. Rodríguez, A. von Kriegsheim, P. Cotter, U. Bruning, P. G. Fallon, A. Cheong, E. P. Cummins, and C. T. Taylor, “Regulation of IL-1β-induced NF-κB by hydroxylases links key hypoxic and inflammatory signaling pathways.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 110, no. 46, pp. 18490–5, Nov. 2013.

[72] J. Karhausen, G. T. Furuta, J. E. Tomaszewski, R. S. Johnson, S. P. Colgan, and V. H. Haase, “Epithelial hypoxia-inducible factor-1 is protective in murine experimental colitis.,” J. Clin. Invest., vol. 114, no. 8, pp. 1098–106, Oct. 2004.

[73] H. K. Eltzschig, M. V Sitkovsky, and S. C. Robson, “Purinergic signaling during inflammation.,” N. Engl. J. Med., vol. 367, no. 24, pp. 2322–33, Dec. 2012.

[74] A. Grenz, D. Homann, and H. K. Eltzschig, “Extracellular adenosine: a safety signal that dampens hypoxia-induced inflammation during ischemia.,” Antioxid. Redox Signal., vol. 15, no. 8, pp. 2221–34, Oct. 2011.

[75] P. Rosenberger, J. M. Schwab, V. Mirakaj, E. Masekowsky, A. Mager, J. C. Morote-Garcia, K. Unertl, and H. K. Eltzschig, “Hypoxia-inducible factor-dependent induction of netrin-1 dampens inflammation caused by hypoxia.,” Nat. Immunol., vol. 10, no. 2, pp. 195–202, Feb. 2009.

[76] H. K. Eltzschig, “Adenosine: an old drug newly discovered.,” Anesthesiology, vol. 111, no. 4, pp. 904–15, Oct. 2009.

[77] J. Vestbo, S. S. Hurd, A. G. Agustí, P. W. Jones, C. Vogelmeier, A. Anzueto, P. J. Barnes, L. M. Fabbri, F. J. Martinez, M. Nishimura, R. A. Stockley, D. D. Sin, and R. Rodriguez-Roisin, “Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary.,” Am. J. Respir. Crit. Care Med., vol. 187, no. 4, pp. 347–65, Feb. 2013.

[78] P. J. Barnes, S. D. Shapiro, and R. A. Pauwels, “Chronic obstructive pulmonary disease: molecular and cellular mechanisms.,” Eur. Respir. J., vol. 22, no. 4, pp. 672–88, Oct. 2003.

[79] P. J. Barnes, “Mechanisms in COPD: differences from asthma.,” Chest, vol. 117, no. 2 Suppl, p. 10S–4S, Feb. 2000.

[80] K. F. Chung and I. M. Adcock, “Multifaceted mechanisms in COPD: inflammation, immunity, and tissue repair and destruction.,” Eur. Respir. J., vol. 31, no. 6, pp. 1334–56, Jun. 2008.

[81] N. Rovina, A. Koutsoukou, and N. G. Koulouris, “Inflammation and immune response in COPD: where do we stand?,” Mediators Inflamm., vol. 2013, p. 413735, Jan. 2013.

[82] V. Kim, J. O. Benditt, R. A. Wise, and A. Sharafkhaneh, “Oxygen therapy in chronic obstructive pulmonary disease.,” Proc. Am. Thorac. Soc., vol. 5, no. 4, pp. 513–8, May 2008.

[83] B. D. Kent, P. D. Mitchell, and W. T. McNicholas, “Hypoxemia in patients with COPD: cause, effects, and disease progression.,” Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis., vol. 6, pp. 199–208, Jan. 2011.

[84] D. Y.-W. Fann, S.-Y. Lee, S. Manzanero, P. Chunduri, C. G. Sobey, and T. V Arumugam, “Pathogenesis of acute stroke and the role of inflammasomes.,” Ageing Res. Rev., vol. 12, no. 4, pp. 941–66, Sep. 2013.

[85] S. E. Lakhan, A. Kirchgessner, and M. Hofer, “Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: therapeutic approaches.,” J. Transl. Med., vol. 7, no. 1, p. 97, Jan. 2009.

[86] S. Cuzzocrea, D. P. Riley, A. P. Caputi, and D. Salvemini, “Antioxidant therapy: a new pharmacological approach in shock, inflammation, and ischemia/reperfusion injury.,” Pharmacol. Rev., vol. 53, no. 1, pp. 135–59, Mar. 2001.

[87] J. A. Johnson, D. A. Johnson, A. D. Kraft, M. J. Calkins, R. J. Jakel, M. R. Vargas, and P.-C. Chen, “The Nrf2-ARE pathway: an indicator and modulator of oxidative stress in neurodegeneration.,” Ann. N. Y. Acad. Sci., vol. 1147, pp. 61–9, Dec. 2008.

[88] J. Huang, U. M. Upadhyay, and R. J. Tamargo, “Inflammation in stroke and focal cerebral ischemia.,” Surg. Neurol., vol. 66, no. 3, pp. 232–45, Sep. 2006.

[89] Q. Wang, X. N. Tang, and M. A. Yenari, “The inflammatory response in stroke.,” J. Neuroimmunol., vol. 184, no. 1–2, pp. 53–68, Mar. 2007.

[90] L. S. Rallidis, M. Vikelis, D. B. Panagiotakos, I. Rizos, M. G. Zolindaki, K. Kaliva, and D. T. Kremastinos, “Inflammatory markers and in-hospital mortality in acute ischaemic stroke.,” Atherosclerosis, vol. 189, no. 1, pp. 193–7, Nov. 2006.

[91] K. Gertz, G. Kronenberg, R. E. Kälin, T. Baldinger, C. Werner, M. Balkaya, G. D. Eom, J. Hellmann-Regen, J. Kröber, K. R. Miller, U. Lindauer, U. Laufs, U. Dirnagl, F. L. Heppner, and M. Endres, “Essential role of interleukin-6 in post-stroke angiogenesis.,” Brain, vol. 135, no. Pt 6, pp. 1964–80, Jun. 2012.

[92] J. Y. Kim, M. Kawabori, and M. A. Yenari, “Innate inflammatory responses in stroke: mechanisms and potential therapeutic targets.,” Curr. Med. Chem., vol. 21, no. 18, pp. 2076–97, Jan. 2014.

[93] G. I. for C. O. L. D. (GOLD), “Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of COPD,” 2013.

[94] “Guidelines for management of ischaemic stroke and transient ischaemic attack 2008.,” Cerebrovasc. Dis., vol. 25, no. 5, pp. 457–507, Jan. 2008.

[95] S. D. Gan and K. R. Patel, “Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.,” J. Invest. Dermatol., vol. 133, no. 9, p. e12, Sep. 2013.

[96] H. K. Eltzschig and P. Carmeliet, “Hypoxia and inflammation.,” N. Engl. J. Med., vol. 364, no. 7, pp. 656–65, Feb. 2011.

[97] G. C. Jickling and F. R. Sharp, “Blood biomarkers of ischemic stroke.,” Neurotherapeutics, vol. 8, no. 3, pp. 349–60, Jul. 2011.

[98] S. K. Leeper-Woodford and K. Detmer, “Acute hypoxia increases alveolar macrophage tumor necrosis factor activity and alters NF-kappa B expression,” Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, vol. 276, no. 6, pp. L909–916, Jun. 1999.

[99] T. M. L. Eagan, T. Ueland, P. D. Wagner, J. A. Hardie, T. E. Mollnes, J. K. Damås, P. Aukrust, and P. S. Bakke, “Systemic inflammatory markers in COPD: results from the Bergen COPD Cohort Study.,” Eur. Respir. J., vol. 35, no. 3, pp. 540–8, Mar. 2010.

[100] U. Kolsum, K. Roy, C. Starkey, Z. Borrill, N. Truman, J. Vestbo, and D. Singh, “The repeatability of interleukin-6, tumor necrosis factor-alpha, and C-reactive protein in COPD patients over one year.,” Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis., vol. 4, pp. 149–56, Jan. 2009.

[101] N. J. Sinden and R. A. Stockley, “Systemic inflammation and comorbidity in COPD: a result of ‘overspill’ of inflammatory mediators from the lungs? Review of the evidence.,” Thorax, vol. 65, no. 10, pp. 930–6, Oct. 2010.

[102] A. Churg, R. D. Wang, H. Tai, X. Wang, C. Xie, J. Dai, S. D. Shapiro, and J. L. Wright, “Macrophage metalloelastase mediates acute cigarette smoke-induced inflammation via tumor necrosis factor-alpha release.,” Am. J. Respir. Crit. Care Med., vol. 167, no. 8, pp. 1083–9, Apr. 2003.

[103] V. M. Keatings, “A Polymorphism in the Tumor Necrosis Factor-α Gene Promoter Region May Predispose to a Poor Prognosis in COPD<xref rid=‘AFF1’>*</xref>,” CHEST J., vol. 118, no. 4, p. 971, Oct. 2000.

[104] M. Di Francia, D. Barbier, J. L. Mege, and J. Orehek, “Tumor necrosis factor-alpha levels and weight loss in chronic obstructive pulmonary disease.,” Am. J. Respir. Crit. Care Med., vol. 150, no. 5 Pt 1, pp. 1453–5, Nov. 1994.

[105] F. Karadag, A. B. Karul, O. Cildag, M. Yilmaz, and H. Ozcan, “Biomarkers of systemic inflammation in stable and exacerbation phases of COPD.,” Lung, vol. 186, no. 6, pp. 403–9.

[106] M. A. Dentener, E. C. Creutzberg, H.-J. Pennings, G. T. Rijkers, E. Mercken, and E. F. M. Wouters, “Effect of infliximab on local and systemic inflammation in chronic obstructive pulmonary disease: a pilot study.,” Respiration., vol. 76, no. 3, pp. 275–82, Jan. 2008.

[107] E. Tarkowski, L. Rosengren, C. Blomstrand, C. Wikkelsö, C. Jensen, S. Ekholm, and A. Tarkowski, “Intrathecal release of pro- and anti-inflammatory cytokines during stroke.,” Clin. Exp. Immunol., vol. 110, no. 3, pp. 492–9, Dec. 1997.

[108] J. Zaremba and J. Losy, “Early TNF-alpha levels correlate with ischaemic stroke severity.,” Acta Neurol. Scand., vol. 104, no. 5, pp. 288–95, Nov. 2001.

[109] M. Beridze, T. Sanikidze, R. Shakarishvili, N. Intskirveli, and N. M. Bornstein, “Selected acute phase CSF factors in ischemic stroke: findings and prognostic value.,” BMC Neurol., vol. 11, p. 41, Jan. 2011.

[110] H. Ormstad, H. C. D. Aass, N. Lund-Sørensen, K.-F. Amthor, and L. Sandvik, “Serum levels of cytokines and C-reactive protein in acute ischemic stroke patients, and their relationship to stroke lateralization, type, and infarct volume.,” J. Neurol., vol. 258, no. 4, pp. 677–85, Apr. 2011.

[111] D. Intiso, P. Stampatore, M. M. Zarrelli, G. L. Guerra, G. Arpaia, P. Simone, P. Tonali, and E. Beghi, “Incidence of first-ever ischemic and hemorrhagic stroke in a well-defined community of southern Italy, 1993-1995.,” Eur. J. Neurol., vol. 10, no. 5, pp. 559–65, Sep. 2003.

[112] S. Sotgiu, B. Zanda, B. Marchetti, M. L. Fois, G. Arru, G. M. Pes, F. S. Salaris, A. Arru, A. Pirisi, and G. Rosati, “Inflammatory biomarkers in blood of patients with acute brain ischemia.,” Eur. J. Neurol., vol. 13, no. 5, pp. 505–13, May 2006.

[113] R. E. K. Russell, A. Thorley, S. V Culpitt, S. Dodd, L. E. Donnelly, C. Demattos, M. Fitzgerald, and P. J. Barnes, “Alveolar macrophage-mediated elastolysis: roles of matrix metalloproteinases, cysteine, and serine proteases.,” Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., vol. 283, no. 4, pp. L867–73, Oct. 2002.

[114] B. Singh, S. Arora, and V. Khanna, “Association of severity of COPD with IgE and interleukin-1 beta.,” Monaldi Arch. Chest Dis., vol. 73, no. 2, pp. 86–7, Jun. 2010.

[115] A. Agustí, L. D. Edwards, S. I. Rennard, W. MacNee, R. Tal-Singer, B. E. Miller, J. Vestbo, D. A. Lomas, P. M. A. Calverley, E. Wouters, C. Crim, J. C. Yates, E. K. Silverman, H. O. Coxson, P. Bakke, R. J. Mayer, and B. Celli, “Persistent systemic inflammation is associated with poor clinical outcomes in COPD: a novel phenotype.,” PLoS One, vol. 7, no. 5, p. e37483, Jan. 2012.

[116] S. D. Aaron, J. B. Angel, M. Lunau, K. Wright, C. Fex, N. Le Saux, and R. E. Dales, “Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.,” Am. J. Respir. Crit. Care Med., vol. 163, no. 2, pp. 349–55, Feb. 2001.

[117] K.-Y. Lee, S.-C. Ho, Y.-F. Chan, C.-H. Wang, C.-D. Huang, W.-T. Liu, S.-M. Lin, Y.-L. Lo, Y.-L. Chang, L.-W. Kuo, and H.-P. Kuo, “Reduced nuclear factor-κB repressing factor: a link toward systemic inflammation in COPD.,” Eur. Respir. J., vol. 40, no. 4, pp. 863–73, Oct. 2012.

[118] P. J. Barnes and B. R. Celli, “Systemic manifestations and comorbidities of COPD.,” Eur. Respir. J., vol. 33, no. 5, pp. 1165–85, May 2009.

[119] C. Schulz, “Activation of Bronchial Epithelial Cells in Smokers Without Airway Obstruction and Patients With COPD<xref rid=‘AFF1’>*</xref>,” CHEST J., vol. 125, no. 5, p. 1706, May 2004.

[120] S. V Culpitt, D. F. Rogers, P. Shah, C. De Matos, R. E. K. Russell, L. E. Donnelly, and P. J. Barnes, “Impaired inhibition by dexamethasone of cytokine release by alveolar macrophages from patients with chronic obstructive pulmonary disease.,” Am. J. Respir. Crit. Care Med., vol. 167, no. 1, pp. 24–31, Jan. 2003.

[121] K. Tomita, P. J. Barnes, and I. M. Adcock, “The effect of oxidative stress on histone acetylation and IL-8 release,” Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 301, no. 2, pp. 572–577, Feb. 2003.

[122] S. Takanashi, Y. Hasegawa, Y. Kanehira, K. Yamamoto, K. Fujimoto, K. Satoh, and K. Okamura, “Interleukin-10 level in sputum is reduced in bronchial asthma, COPD and in smokers.,” Eur. Respir. J., vol. 14, no. 2, pp. 309–14, Aug. 1999.

[123] T.-L. Hackett, R. Holloway, S. T. Holgate, and J. A. Warner, “Dynamics of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokine release during acute inflammation in chronic obstructive pulmonary disease: an ex vivo study.,” Respir. Res., vol. 9, no. 1, p. 47, Jan. 2008.

[124] P. J. Barnes, “The cytokine network in chronic obstructive pulmonary disease.,” Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., vol. 41, no. 6, pp. 631–8, Dec. 2009.

[125] A. Bhowmik, T. A. Seemungal, R. J. Sapsford, and J. A. Wedzicha, “Relation of sputum inflammatory markers to symptoms and lung function changes in COPD exacerbations.,” Thorax, vol. 55, no. 2, pp. 114–20, Feb. 2000.

[126] Y. Sun, C.-J. Lu, C.-H. Lin, and L.-L. Wen, “Interleukin-1beta is increased in the cerebrospinal fluid of patients with small infarcts.,” Eur. J. Neurol., vol. 16, no. 7, pp. 858–63, Jul. 2009.

[127] F. Perini, M. Morra, M. Alecci, E. Galloni, M. Marchi, and V. Toso, “Temporal profile of serum anti-inflammatory and pro-inflammatory interleukins in acute ischemic stroke patients.,” Neurol. Sci., vol. 22, no. 4, pp. 289–96, Aug. 2001.

[128] C. J. Smith, H. C. A. Emsley, C. M. Gavin, R. F. Georgiou, A. Vail, E. M. Barberan, G. J. del Zoppo, J. M. Hallenbeck, N. J. Rothwell, S. J. Hopkins, and P. J. Tyrrell, “Peak plasma interleukin-6 and other peripheral markers of inflammation in the first week of ischaemic stroke correlate with brain infarct volume, stroke severity and long-term outcome.,” BMC Neurol., vol. 4, p. 2, Jan. 2004.

[129] U. Waje-Andreassen, J. Kråkenes, E. Ulvestad, L. Thomassen, K.-M. Myhr, J. Aarseth, and C. A. Vedeler, “IL-6: an early marker for outcome in acute ischemic stroke.,” Acta Neurol. Scand., vol. 111, no. 6, pp. 360–5, Jun. 2005.

[130] L. Zeng, Y. Wang, J. Liu, L. Wang, S. Weng, K. Chen, E. F. Domino, and G.-Y. Yang, “Pro-inflammatory cytokine network in peripheral inflammation response to cerebral ischemia.,” Neurosci. Lett., vol. 548, pp. 4–9, Aug. 2013.

[131] G. H. Danton and W. D. Dietrich, “Inflammatory mechanisms after ischemia and stroke.,” J. Neuropathol. Exp. Neurol., vol. 62, no. 2, pp. 127–36, Feb. 2003.

[132] S. F. Fitzpatrick, M. M. Tambuwala, U. Bruning, B. Schaible, C. C. Scholz, A. Byrne, A. O’Connor, W. M. Gallagher, C. R. Lenihan, J. F. Garvey, K. Howell, P. G. Fallon, E. P. Cummins, and C. T. Taylor, “An intact canonical NF-κB pathway is required for inflammatory gene expression in response to hypoxia.,” J. Immunol., vol. 186, no. 2, pp. 1091–6, Jan. 2011.

[133] N. Takabatake, H. Nakamura, S. Abe, S. Inoue, T. Hino, H. Saito, H. Yuki, S. Kato, and H. Tomoike, “The relationship between chronic hypoxemia and activation of the tumor necrosis factor-alpha system in patients with chronic obstructive pulmonary disease.,” Am. J. Respir. Crit. Care Med., vol. 161, no. 4 Pt 1, pp. 1179–84, Apr. 2000.

[134] R. Tkacova, “Systemic inflammation in chronic obstructive pulmonary disease: may adipose tissue play a role? Review of the literature and future perspectives.,” Mediators Inflamm., vol. 2010, p. 585989, Jan. 2010.

[135] N. F. Voelkel, S. Mizuno, and H. J. Bogaard, “The role of hypoxia in pulmonary vascular diseases: a perspective.,” Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., vol. 304, no. 7, pp. L457–65, Apr. 2013.

[136] A. G. N. Agusti, A. Noguera, J. Sauleda, E. Sala, J. Pons, and X. Busquets, “Systemic effects of chronic obstructive pulmonary disease,” Eur. Respir. J., vol. 21, no. 2, pp. 347–360, Feb. 2003.

[137] C. A. Raguso and C. Luthy, “Nutritional status in chronic obstructive pulmonary disease: role of hypoxia.,” Nutrition, vol. 27, no. 2, pp. 138–43, Feb. 2011.

[138] A. J. Majmundar, W. J. Wong, and M. C. Simon, “Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress.,” Mol. Cell, vol. 40, no. 2, pp. 294–309, Oct. 2010.

[139] M. C. Simon, “Coming up for air: HIF-1 and mitochondrial oxygen consumption.,” Cell Metab., vol. 3, no. 3, pp. 150–1, Mar. 2006.

[140] P. T. Schumacker, “Lung cell hypoxia: role of mitochondrial reactive oxygen species signaling in triggering responses.,” Proc. Am. Thorac. Soc., vol. 8, no. 6, pp. 477–84, Nov. 2011.

[141] X. Zheng, S. Linke, J. M. Dias, X. Zheng, K. Gradin, T. P. Wallis, B. R. Hamilton, M. Gustafsson, J. L. Ruas, S. Wilkins, R. L. Bilton, K. Brismar, M. L. Whitelaw, T. Pereira, J. J. Gorman, J. Ericson, D. J. Peet, U. Lendahl, and L. Poellinger, “Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 105, no. 9, pp. 3368–73, Mar. 2008.

[142] M. O. Arcasoy, “Non-erythroid effects of erythropoietin.,” Haematologica, vol. 95, no. 11, pp. 1803–5, Nov. 2010.

[143] K. Maiese, Z. Z. Chong, F. Li, and Y. C. Shang, “Erythropoietin: elucidating new cellular targets that broaden therapeutic strategies.,” Prog. Neurobiol., vol. 85, no. 2, pp. 194–213, Jun. 2008.

[144] Z. Cai, W. Luo, H. Zhan, and G. L. Semenza, “Hypoxia-inducible factor 1 is required for remote ischemic preconditioning of the heart.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 110, no. 43, pp. 17462–7, Oct. 2013.

[145] C. Peyssonnaux, A. S. Zinkernagel, R. A. Schuepbach, E. Rankin, S. Vaulont, V. H. Haase, V. Nizet, and R. S. Johnson, “Regulation of iron homeostasis by the hypoxia-inducible transcription factors (HIFs).,” J. Clin. Invest., vol. 117, no. 7, pp. 1926–32, Jul. 2007.

[146] G. L. Semenza, “HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia,” J Appl Physiol, vol. 88, no. 4, pp. 1474–1480, Apr. 2000.

[147] G. L. Semenza, L. A. Shimoda, and N. R. Prabhakar, “Regulation of gene expression by HIF-1.,” Novartis Found. Symp., vol. 272, pp. 2–8; discussion 8–14, 33–6, Jan. 2006.

[148] N. K. Burki and S. U. Tetenta, “Inflammatory response to acute hypoxia in humans.,” Pulm. Pharmacol. Ther., vol. 27, no. 2, pp. 208–11, Apr. 2014.

[149] M. Samaja, P. Bianciardi, A. Caretti, M. Fantacci, R. Ronchi, and G. Milano, “Molecular adaptation to acute, chronic and intermittent hypoxia in rat hearts: a study on HIF-1 and apoptosis,” FASEB J, vol. 20, no. 4, p. A788–d–, Mar. 2006.

[150] K. J. Staples, F. Sotoodehnejadnematalahi, H. Pearson, M. Frankenberger, L. Francescut, L. Ziegler-Heitbrock, and B. Burke, “Monocyte-derived macrophages matured under prolonged hypoxia transcriptionally up-regulate HIF-1α mRNA.,” Immunobiology, vol. 216, no. 7, pp. 832–9, Jul. 2011.

[151] S. Fröhlich, J. Boylan, and P. McLoughlin, “Hypoxia-induced inflammation in the lung: a potential therapeutic target in acute lung injury?,” Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., vol. 48, no. 3, pp. 271–9, Mar. 2013.

[152] C. T. Taylor and E. P. Cummins, “The role of NF-kappaB in hypoxia-induced gene expression.,” Ann. N. Y. Acad. Sci., vol. 1177, pp. 178–84, Oct. 2009.

[153] C. C. Scholz, M. A. S. Cavadas, M. M. Tambuwala, E. Hams, J. Rodríguez, A. von Kriegsheim, P. Cotter, U. Bruning, P. G. Fallon, A. Cheong, E. P. Cummins, and C. T. Taylor, “Regulation of IL-1β-induced NF-κB by hydroxylases links key hypoxic and inflammatory signaling pathways.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 110, no. 46, pp. 18490–5, Nov. 2013.

[154] H. Yao and I. Rahman, “Current concepts on oxidative/carbonyl stress, inflammation and epigenetics in pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease.,” Toxicol. Appl. Pharmacol., vol. 254, no. 2, pp. 72–85, Jul. 2011.

[155] D. Preciado, J. Lin, B. Wuertz, and M. Rose, “Cigarette smoke activates NF kappa B and induces Muc5b expression in mouse middle ear cells.,” Laryngoscope, vol. 118, no. 3, pp. 464–71, Mar. 2008.

[156] D. Preciado, E. Kuo, S. Ashktorab, P. Manes, and M. Rose, “Cigarette smoke activates NFκB-mediated Tnf-α release from mouse middle ear cells.,” Laryngoscope, vol. 120, no. 12, pp. 2508–15, Dec. 2010.

[157] X. Liu, S. Togo, M. Al-Mugotir, H. Kim, Q. Fang, T. Kobayashi, X. Wang, L. Mao, P. Bitterman, and S. Rennard, “NF-kappaB mediates the survival of human bronchial epithelial cells exposed to cigarette smoke extract.,” Respir. Res., vol. 9, no. 1, p. 66, Jan. 2008.

[158] S. Rajendrasozhan, S.-R. Yang, I. Edirisinghe, H. Yao, D. Adenuga, and I. Rahman, “Deacetylases and NF-kappaB in redox regulation of cigarette smoke-induced lung inflammation: epigenetics in pathogenesis of COPD.,” Antioxid. Redox Signal., vol. 10, no. 4, pp. 799–811, Apr. 2008.

[159] V. Brown, J. S. Elborn, J. Bradley, and M. Ennis, “Dysregulated apoptosis and NFkappaB expression in COPD subjects.,” Respir. Res., vol. 10, no. 1, p. 24, Jan. 2009.

[160] A. Di Stefano, G. Caramori, T. Oates, A. Capelli, M. Lusuardi, I. Gnemmi, F. Ioli, K. F. Chung, C. F. Donner, P. J. Barnes, and I. M. Adcock, “Increased expression of nuclear factor-kappaB in bronchial biopsies from smokers and patients with COPD.,” Eur. Respir. J., vol. 20, no. 3, pp. 556–63, Sep. 2002.

[161] O. Herrmann, B. Baumann, R. de Lorenzi, S. Muhammad, W. Zhang, J. Kleesiek, M. Malfertheiner, M. Köhrmann, I. Potrovita, I. Maegele, C. Beyer, J. R. Burke, M. T. Hasan, H. Bujard, T. Wirth, M. Pasparakis, and M. Schwaninger, “IKK mediates ischemia-induced neuronal death.,” Nat. Med., vol. 11, no. 12, pp. 1322–9, Dec. 2005.

[162] C. T. Taylor, “Interdependent roles for hypoxia inducible factor and nuclear factor-kappaB in hypoxic inflammation.,” J. Physiol., vol. 586, no. Pt 17, pp. 4055–9, Sep. 2008.

[163] P. van Uden, N. S. Kenneth, and S. Rocha, “Regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha by NF-kappaB.,” Biochem. J., vol. 412, no. 3, pp. 477–84, Jun. 2008.

[164] J. J. Haddad and H. L. Harb, “Cytokines and the regulation of hypoxia-inducible factor (HIF)-1α,” Int. Immunopharmacol., vol. 5, no. 3, pp. 461–483, 2005.