Studii Privind Obtinerea Unir Biopreparate cu Activitate Lipolitica din Surse Microbiene Si Plante Medicinale Indigene

CUPRINS

TABLE OF CONTENTS

INTRODUCERE

Enzimele care prezintă interes ca biocatalizatori utilizabili la nivel industrial sunt din ce în ce mai numeroase, datorită faptului că reacțiile în cataliza enzimatică reprezintă alternative atractive la sintezele chimice clasice, deseori complicate și costisitoare.

Lipazele (EC – 3.1.1.3) sunt enzime deosebit de importante datorită capacității lor de a cataliza un număr mare de reacții chemo- și stereoselective, ceea ce explică interesul față de utilizarea acestui tip de biocatalizatori în domeniul sintezei organice precum și în alte domenii aplicative precum: industria farmaceutică, industria alimentară, industria detergenților, industria cosmetică etc [1, 2].

Spre deosebire de celelalte hidrolaze, care acționează în mediu apos, lipazele se caracterizează prin faptul că acționează la interfața ulei-apă. Din acest motiv, reacțiile enzimatice catalizate de lipaze se caracterizează printr-o cinetică particulară. Astfel, lipazele acționează asupra trigliceridelor emulsionate și, deoarece reacția are loc la interfața ulei-apă, viteza de reacție va depinde nu numai de concentrația de substrat ci și de mărimea suprafeței de contact între cele două faze [2-4].

Pe lângă acțiunea lipolitică, acești biocatalizatori posedă și activitate esterazică, astfel încât ele se numără printre puținele enzime cu o specificitate redusă de substrat [5, 6]. Din acest motiv, studiul unor protocoalele experimentale adecvate pentru determinarea activității lipazelor ocupă un loc important în cercetările referitoare la aceste enzime. Activitatea lipazelor se poate determina cu ajutorul unei game largi de metode care diferă între ele atât în ceea ce privește principiul lor de bază, cât și în ceea ce privește selectivitatea de substrat, sensibilitatea și aplicabilitatea lor. Deoarece valoarea comercială a acestor enzime este în continuă creștere, ca urmare a importanței și lărgirii domeniilor lor de utilizare, elaborarea de noi procedee de obținere a lipazelor reprezintă una din direcțiile cele mai importante de dezvoltare a noilor biotehnologii.

Rolul biologic al lipazelor pentru organismele vii este deosebit de important, întrucât ele asigură funcționarea membranelor, participă la metabolismul lipidic, la procesul de depozitare al grăsimilor de rezervă, etc. Din aceste motive, lipazele au o importanță deosebită în medicină, ca mijloc terapeutic și de diagnosticare [7].

Enzimele lipolitice pot fi obținute din surse de origine animală, vegetală sau microbiana.

În ultimele decenii, pentru producerea unui spectru larg de enzime și substanțe biologic active, se utilizează cu succes microorganismele. Expoatarea metabolismului microbian la nivel industrial este favorizată de următoarele proprietăți specifice microorganismelor, care conduc la avantaje tehnologice:

dimensiunile reduse ale microorganismelor permit cultivarea acestora în bioreactoare de capacitate adecvată necesităților tehnologice;

intensitatea excepțională a activității metabolice, datorată printre altele suprafeței mari de contact a celulelor microbiene cu mediul înconjurător, creează posibilitatea unor schimburi multiple cu mediul înconjurător și permite desfășurarea reacțiilor biochimice cu viteze mari;

multiplicarea rapidă creează premizele obținerii unei cantități mari de biomasă și implicit de metaboliți de interes, într-un timp relativ scurt;

capacitatea de a-și menține constante proprietățile fiziologice în anumite condiții de mediu asigură reproductibilitatea proceselor biochimice și a produselor obținute în urma acestora;

diversitatea căilor metabolice specifice microorganismelor permite utilizarea, ca substraturi nutritive, a unei game largi de substanțe, inclusiv a unor substanțe existente în materii prime regenerabile, care, prin prețul lor redus, influențează favorabil rentabilitatea proceselor industriale.

Până în prezent însă, numărul microorganismelor semnificative din punct de vedere biotehnologic ca producătoare de lipază, este destul de redus, iar capacitatea biosintetică relativ scazută a acestora nu asigură rentabilitatea proceselor tehnologice de producție la scară industrială.

Obținerea preparatelor enzimatice hidrolitice de origine microbiană reprezintă una din direcțiile în continuă dezvoltare a biotehnologiilor. În această direcție se încadreaza și interesul față de lipaze, care își găsesc aplicații în diferite domenii ca: industria alimentară [8-10], ca aditivi alimentari, industria chimico-farmaceutică [11, 12], pentru producția și prelucrarea grăsimilor și uleiurilor vegetale și obținerea biodieselului [13], în industria farmaceutică, pentru obtinerea unor medicamente indicate în dispensii sau de tip antiinflamator non-steroidal, în industria textilă și pielăritului, pentru îndepărtarea grăsimilor de pe fibrelor de bumbac și degresarea pieilor și a blănurilor [10], la obținerea detergenților, în ecologie, pentru epurarea apelor reziduale, precum și în agricultură și zootehnie, la prepararea nutrețurilor ușor asimilabile [10]. Detectarea însușirii lipazelor de a cataliza nu numai hidroliza, dar și sinteza lipidelor, prin reactii de esterificare și transesterificare, a creat posibilitatea aplicarii acestora în sinteza organică fină, în industria petrolieră sau pentru obținerea substanțelor tensioactive [14, 15].

Utilizarea lipazelor ca biocatalizatori în industria farmaceutică, precum și ca substanțe active ce intră în compoziția unor preparate farmaceutice, impune obținerea lor într-un grad de puritate avansată și cunoașterea proprietăților lor, referitoare nu numai la specificitatea de substrat, ci și la principalii parametrii care influențează activitatea enzimatică: pH-ul și temperatura [16]. Acești parametrii prezintă o deosebita importanță atât în etapele de izolare, purificare și caracterizare a enzimei native, cât și pentru formularea farmaceutică a preparatelor conținând această enzimă ca substanță activă sau pentru stabilirea condițiilor optime de utilizare a lipazei ca biocatalizator al transformării unor substraturi organice.

Din cele expuse, este evidentă importanța cercetărilor de selectare și studiere a microorganismelor potențial producătoare de lipaze, precum și de determinare a căilor de sporire a capacității biosintetice a microorganismelor selectate.

Întrucât o mare parte din timpul alocat procesului de extracție și purificare a unei enzime este folosit pentru dozarea activității enzimatice, eficiența cerecetării unor noi procedee de biosinteză și prelucrare post-biosinteză pentru obținerea lipazelor depinde, în mare măsură, de dezvoltarea unor protocoale experimentale rapide și simple de screening și cuantificare a activității acestor enzime, bazate pe substraturi cât mai specifice.

Lipazele pot fi întalnite și în regnul vegetal, în special la plantele oleaginoase și boabele de cereale. Dintre plantele oleaginoase, s-a remarcat faptul că boabele de ricin sunt foarte bogate în lipaze, enzima fiind localizată în protoplasma bobului. Aceste plante servesc ca materie primă pentru obținerea preparatelor lipazice de natura vegetală [16, 17].

Medicina bazata pe plante a fost larg practicată până la începutul secolului 20, când a fost rapid abandonată, datorită introducerii formelor medicamentoase sintetice. În ultimii 20 de ani, fitoterapia a cunoscut un nou avânt pe plan mondial. „Relansarea" ei a apărut ca o tendință de combatere a totalitarismului și conservatorismului științific, dar și drept recunoaștere, fără rezerve, a virtuților sale, de către OMS (Organizația Mondială a Sănătății) [18].

Fitoterapia e un domeniu extrem de variat. Astăzi se acordă o atenție din ce în ce mai mare plantelor, apreciindu-se că ele reprezintă surse inepuizabile de materii prime care se regenerează an de an. Acestea pot fi utilizate ca materie primă la prepararea unor medicamente sau la extragerea industrială a principiilor active. În prezent, datorită progreselor științifice și de perfecționare a metodelor de izolare s-a reușit să se obțină în stare pură în majoritatea cazurilor substanțele chimice răspunzătoare de activitatea terapeutică a plantelor respective [18].

Este cunoscut faptul că alimentatia inadecvată bazată în principal pe preparate exclusiv prelucrate de tip „fast-food” ce au luat o amploare mare și în România, asociată și cu alți numeroși factori, cum ar fi stresul zilnic și lipsa de mișcare, conduc la obezitate, o boală care generează afecțiuni complexe ale organismului. Această maladie este cauzată de disfuncțiile ce apar în cadrul metabolismului lipidic [19]. Conform celor mai noi statistici ale OMS, în prezent, datorită ridicării nivelului de viață, creșterea în greutate și obezitatea constituie o amenințare din ce în ce mai mare pentru sănătatea populației mondiale.

În acest context, obiectivul principal al cercetărilor prezentate în cadrul acestei teze de doctorat a constat în obținerea unor biopreparate cu activitate lipolitică, stabile din punct de vedere fizico-chimic, alcătuite din lipază obținută din surse microbiene și preparate de origine vegetală, care se adresează unui segment al populației din ce în ce mai numeros, cu afecțiuni complexe, generate dezechilibrul lipidic din organism.

Pornind de la aceste considerente, obiectivele cercetărilor prezentate în cadrul acestei lucrări au constat în:

selectarea microorganismelor potențial producatoare de lipază;

studiul influenței componentelor mediului de cultură asupra bioproductivitătii microorganismului selectat în ceea ce privește lipaza și stabilirea compoziției optime a mediului de fermentație;

studiul influenței parametrilor de cultivare asupra activității lipolitice a tulpinii selctate și stabilirea valorilor optime ale acestora;

parcurgerea unor etape de prelucrare postbiosinteză în scopul izolării și purificării lipazelor microbiene, urmărind în mod special stabilirea particularităților de aplicare a metodelor de purificare a enzimelor microbiene în condițiile specifice;

studiul stabilității activității enzimatice a lipazelor obținute prin biosinteză;

selectarea unor preparate vegetale cu un conținut crescut în principii active implicate în reglarea metabolismul lipidic;

caracterizarea farmacognostică a produselor vegetale selectate;

identificarea și dozarea compușilor activi din extractele vegetale obținute;

formularea unor biopreparate cu activitate lipolitică, stabile din punct de vedere fizico-chimic, obținute prin combinarea lipazei microbiene cu preparate de origine vegetală.

PARTEA I. ASPECTE TEORETICE

CAPITOLUL 1. PREZENTAREA GENERALĂ A LIPAZELOR

1.1. Noțiuni generale privind lipazele

Lipazele (triacilglicerol acilhidrolaze, EC 3.1.1.3) sunt enzime care fac parte din clasa hidrolazelor, subclasa esterazelor [2].

Esterazele sunt hidrolaze care acționează asupra legăturilor esterice dintre acizii organici, acidul fosforic sau acidul sulfuric și diferiți alcooli sau fenoli [5, 6].

În funcție de natura alcoolilor implicati în legăturile esterice pe care le hidrolizează, enzimele lipolitice pot fi divizate în [5, 20]:

carboxil-ester hidrolaze simple, care hidrolizează esteri ai alcoolilor – alții decât glicerina – sau fenolilor;

lipaze propriu-zise, care hidrolizează esteri ai glicerinei;

fosfolipaze, lizofosfolipaze și galactolipaze, care hidrolizează derivați ai gliceridelor);

colesterol-esteraza, care hidrolizează esteri ai sterolilor.

Lipazele sunt carboxil-ester hidrolaze care catalizează reacția de hidroliză a esterilor glicerolului sau a altor alcooli, cu acizi grași cu catenă lungă, cu formare de acizi grași liberi și glicerină sau alcoolul corespunzător (figura 1) [2].

Figura 1. Reacția de hidroliză a trigliceridelor catalizată de lipaze

Figure 1. Hydrolysis reaction of triglycerides catalysed by lipases

Spre deosebire de celelalte esteraze, care hidrolizează substraturi solubile sau dispersate total într-un mediu apos, lipazele posedă proprietatea unică și specifică de a acționa la interfața ulei-apa. Pe această proprietate se bazeaza rolul important al lipazelor în metabolismul lipidelor, precum și potențialul lor tehnologic în procesarea grăsimilor și a uleiurilor. Principala diferență între esteraze și lipaze este fenomenul activării la interfața apos-neapos, care este specific lipazelor, nu și esterazelor [21].

Argumentele pentru potențialul enorm biotehnologic al lipazelor microbiene includ o serie de factori, dintre care menționăm:

stabilitatea în solvenți organici;

faptul că nu necesită cofactori;

posedă specificitate mare de substrat;

manifestă o enantioselectivitate înaltă [16].

În funcție de proveniența lor, lipazele pot fi clasificate în:

lipaze de origine animală (pancreatice);

lipaze de origine vegetală;

lipaze de origine microbiană [22].

Dintre acestea, lipazele microbiene și pancreatice prezintă o importantă deosebită pentru utilizarea drept biocatalizatori [4].

La om, lipazele sunt răspândite mai ales în pancreas, peretele intestinal, tesutul adipos și ficat.

Lipaza pancreatică este produsă de celulele acinoase ale pancreasului și este eliberată în duoden unde este activată de sărurile biliare și Ca2+ și inactivată de sucul pancreatic și acizii grași produși. Sunt enzime care hidrolizează acizii grași din pozițiile și ’ din trigliceride, dar și lipaze care atacă -monogliceridele din peretele intestinului. Determinarea activității lipazei pancreatice are importantă în clinica medicală pentru diagnosticarea pancreatitelor cronice și a cancerului de pancreas și se realizează prin dozarea acizilor grași rezultați prin metode titrimetrice cu NaOH, în prezența fenoftaleinei [4].

Fosfolipazele sunt de mai multe tipuri: tip A, care catalizează hidroliza legaturilor esterice formate între grupările carboxil ale acizilor grași și părțile gliceril ale fosfolipidelor, și de tip C și D, care sunt fosfodiesteraze [17].

Lipazele vegetale se găsesc mai ales în plantele oleaginoase și boabele de cereale. Dintre plantele oleaginoase s-au remarcat boabele de ricin, la care s-a determinat cea mai mare cantitate de lipaze întâlnită la plante, enzima fiind localizată în protoplasma bobului [17, 23, 24].

Lipazele microbiene ocupă azi un loc deosebit de important printre biocatalizatori, datorită capacității acestora de a cataliza o gama largă de reacții în medii apoase și neapoase. Comportamentul acestor enzime chemo-, enantio- specifice a determinat un interes imens printre cercetători. Deși, în prezent, producerea industrială a lipazelor are o importanță mai redusă comparativ cu obținerea de proteaze sau amilaze, se preconizează ca în viitor această situație să se schimbe, iar piața lipazelor va atinge o valoare pecuniară, similară cu piața proteazelor sau a altor carbohidraze [8, 25, 26].

Dezvoltarea mai lentă a acestui domeniu din industria enzimelor s-a datorat faptului că enzima microbiană este foarte instabilă, iar tulpinile raportate în literatură produc cantități reduse, de ordinul a câtorva mg/l de lipază. În plus, aria restrânsă de aplicare a enzimei, facea dificilă elaborarea unei tehnologii viabile și eficiente pentru producția industrială a acesteia. În prezent, situația a început să se schimbe, deoarece în ultima vreme, au fost raportate din ce în ce mai multe domenii de aplicare ale acestei enzime.

1.2. Specificitatea catalitică și mecanismul de acțiune al lipazelor

Lipazele aparțin clasei serin-hidrolazelor și nu necesită nici un cofactor pentru a-și manifesta acțiunea catalitică. Substraturile naturale ale lipazelor sunt triacilglicerolii, compuși foarte puțin solubili în apă.

În ceea ce privește specificitatea de acțiune a lipazelor, aceasta se poate manifesta prin [16]:

afinitatea enzimei față de molecula substratului – specificitate de substrat;

afinitatea enzimei față de legătura esterică dintr-o anumită poziție –specificitate de poziție;

afinitatea enzimei față de un anumit stereoizomer – stereospecificitate.

Astfel, sunt enzime care „recunosc” numai tipul legăturii chimice și manifestă o slabă specificitate de substrat, sunt enzime care „recunosc” tipul legăturii și o parte din structura substratului, și manifesta o specificitate de grup, după cum sunt și enzime care „recunosc” întreaga structură a substratului și tipul legăturii chimice și manifestă o specificitate absolută.

Puține enzime manifestă o slabă specificitate de substrat. Odată cu dezvoltarea chimiei proteinelor și enzimelor, s-a evidențiat faptul că o serie de enzime, care erau considerate puțin specifice, reacționând cu o gamă largă de substraturi cu același tip de legatură chimică, s-au dovedit a fi preparate impure, amestecuri de mai multe enzime și proteine. Cu toate acestea, lipaza este o enzimă considerată a avea o slabă specificitate de substrat, catalizând hidroliza unui numar mare de substraturi emulsionate. Trigliceridele, digliceridele și monogliceridele sunt scindate hidrolitic sub acțiunea catalitică a lipazei, cu viteze din ce în ce mai mici. Hidroliza completă a trigliceridelor are loc treptat (figura 2), având loc mai întâi hidroliza rapidă a legăturilor α si α' și, mai apoi, hidroliza lentă a monogliceridelor cu funcțiunea hidroxil în poziția β a glicerolului esterificat cu un acid gras [6, 27].

Principala particularitate a lipazelor este aceea că, în condiții naturale, aționează asupra unor substraturi emulsionate (esteri ai glicerolului sau ai altor alcooli cu acizi grași cu catena lungă), insolubile, reacția având loc la interfața ulei-apă, viteza de reacție depinzând de mărimea suprafeței de contact și de concentrația substratului (figura 3). Substratul efectiv al enzimei este reprezentat de un agregat de molecule de ester, micele sau film monomolecular la interfața cu mediul apos. Din acest motiv, activitatea enzimei este proporțională cu concentrația moleculelor de substrat la interfața [28-30].

Figura 2. Mecanismul de hidroliză al trigliceridelor

Figure 2. Hydrolyse mechanism of triglycerides

În condiții speciale, cum ar fi absența apei, lipazele sunt capabile să catalizeze reacția inversă, conducând la formarea de gliceride din acizi grasi și glicerină [31].

Figura 3. Principalele caracteristici al moleculelor de lipaze

Figure 3. Main characteristics of lipase molecules

Datorită faptului că, spre deosebire de celelalte hidrolaze, care acționează în mediu apos, lipazele acționează la interfața ulei-apă, reacțiile catalizate de aceste enzime se caracterizează printr-o cinetică particulară, în sensul că viteza de reacție depinde nu numai de concentrația de substrat ci și de mărimea suprafeței de contact între cele două faze [3]. Această suprafață poate fi marită în mod considerabil, până la limita de saturare, prin utilizarea de agenți de emulsionare și printr-o agitare eficientă. Limita de saturare depinde de ingredientele și de condițiile de reacție folosite. Astfel, activitatea lipazelor poate fi influențată în mod semnificativ prin aplicarea unor metode adecvate de creștere a dimensiunilor micelelor din emulsie [23, 32].

Figura 4. Reacția catalizată de lipaze la interfața ulei-apă

Figure 4. Chemical reaction catalyzed by lipases on oil-water interface

Specificitatea de substrat a lipazelor variază în mod considerabil în funcție de originea acestora. Astfel, în ceea ce privește radicalul acil, unele lipaze prezintă afinitate față de grupa acil provenită de la acizi grași cu catenă scurtă (acetic, butiric, caproic, caprilic etc.), altele preferă acizii grași nesaturați (oleic, linoleic, linolenic), iar altele nu prezintă specificitate față de un anumit tip de acid gras. În principiu, acțiunea catalitică a lipazelor se poate manifesta specific față de o anumită lungime a catenei acizilor grași implicați în legătura esterică (Candida, Chrombacterium si Penicillium) sau față de o anumită structură a grupei acil [32].

Lipazele prezintă stereo- și regioselectivitate față de porțiunea alcoolică a substratului. În ceea ce privește poziția grupei ester pe care o hidrolizează, majoritatea lipazelor acționează în mod specific, în sensul că atacă legatură esterică de la C1 sau C3 a gliceridei sau de la ambii (Candida cylindracea, Aspergillus niger, Rhizopus arrhizus, Mucor miehei și Pseudomonas fluorescens), dar nu de la C2 [33]. Totuși, prin migrarea aleatorie a grupei acil, moleculele monogliceridelor cu grupa ester în poziția C2 se rearanjază, împingând radicalul acil în pozitia C1 sau C3 a glicerinei. Cum migrarea grupei acil este un proces lent, viteza hidrolizei enzimatice scade. Un număr restrâns de lipaze (Geotrichum candidum) manifestă o acțiune specifică asupra grupei acil din poziția C-2 a triacilglicerolilor [29].

În principiu, acțiunea catalitică a lipazelor se poate manifesta specific față de o anumită lungime a catenei acizilor grași implicați în legatura esterică (Candida, Chrombacterium si Penicillium) sau față de o anumită structură a grupei acil [34].

În mod caracteristic, substraturile acestor enzime nu sunt formate dintr-o singură specie moleculară, ci din agregate lipidice aflate în faza neapoasă.

Pentru determinarea activității enzimatice a lipazelor se folosesc atât substraturi naturale (uleiuri vegetale, grăsimi animale, ulei de pește, ulei de măsline, grăsimi din lapte) cât și triacilgliceroli sintetici cum este trioleina sau alți esteri sintetici.

1.3. Microorganisme producătoare de lipaze

Microorganismele fac parte din resursele naturale comune ale întregii omeniri și satisfac, prin produsele lor de metabolism, necesității fundamentale cum ar fi: găsirea unor noi surse de hrană, de energie, menținerea stării de sănătate sau combaterea unor boli grave.

Enzimele produse de microorganisme sunt preferate în biotehnologii datorită numeroaselor avantaje pe care le prezintă: capacitate de multiplicare rapida, lipsa exigentelor nutriționale complexe, posibilitatea de cultivare continuă și într-un spatiu limitat, cât și de faptul că enzimele pot fi extrase, concentrate și purificate relativ usor.

Microorganismele produc atât lipaze intracelulare (endolipaze), biosintetizate în interiorul celulei, cât și extracelulare (exolipaze), eliberate in mediul de cultură.

În concepția lui Pollock, denumirea de proteine extracelulare sau exoproteine este atribuită moleculelor proteice care există libere în mediul de fermentație, complet disociate de celule sau legate de peretele celular exterior. Ele pot fi legate de membrană în cazul celulelor tinere și eliberate ca exoenzime pe măsură ce cultura intră în faza staționară [8].

Microorganismele care au capacitatea de a biosintetiza și acumula lipaze sunt bacteriile, fungii, actinomicetele și drojdiile [35-41].

Lipazele microbiene, se deosebesc între ele prin proprietățile fizico-chimice și mecanismul de acțiune.

Lipazele microbiene sunt enzime relativ nespecifice, ceea ce le permite hidroliza lipidelor care conțin acizi grași, cu catene de diferite lungimi. Spre exemplu, în urma studiilor făcute asupra specificității lipazelor sintetizate de micromicetele Oospora lactis și Penicillium sp., s-a demonstrat că ele hidrolizează toate cele trei legături esterice din moleculele lipidice cu aceeași viteză. Lipazele provenite de la tulpinile de Rhizopus microsporus și Mucor miehei se aseamănă cu lipaza pancreatică, din punct de vedere al mecanismul de acțiune, ele hidrolizând legăturile esterice în poziția α a trigliceridelor. Aceasta permite folosirea lipazelor în anumite procese biotehnologice în care este nevoie de hidroliza selectivă a lipazelor [22].

Dupa modul de acțiune, lipazele microbiene se împart în patru categorii:

tipul I, reprezentat de lipaze care hidrolizează grupele acil din pozițiile C-1 sau C-3 ale trigliceridelor, produse de Pseudomonas aeruginosa, Candida lipolytica, Penicillium roqueforti. Acțiunea acestor lipaze este lentă asupra mono- și digliceridelor, față de trigliceride. Alte lipaze, hidrolizează ambele grupări acil din pozițiile C-1 si C-3 (Aspergillus, Rhizopus, Mucor și Pseudomonas), conducând la formarea de acizi grași și di- sau monogliceride. 2-monogliceridele și câteva din 1,2- sau 2,3-digliceride sunt instabile și, ca urmare a migrării gruparii acil, se transformă în 1,3-digliceride sau 1-monogliceride. Din acest motiv, acțiunea prelungită a lipazelor poate conduce la hidroliza completa a triacilglicerolilor la acizi grasi si glicerina [42, 43];

tipul II, reprezentat de un numar restrâns de lipaze (Geotrichum candidum), care manifestă o acțiune specifică asupra grupării acil din poziția C-2 a triacilglicerolilor. Specificitatea față de poziția 2 a trigliceridelor este întâlnită extrem de rar [42];

tipul III, reprezentat de lipazele produse de Staphylococcus aureus, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Rhizopus sp., nu au specificitate de poziție și pot hidroliza grăsimi naturale și sintetice [42];

tipul IV, reprezentat de lipaza produsă de Fusarium oxysporum, care cliveaza preferențial acizii grasi saturați [42].

Dintre bacterii, cei mai activi producători de lipaze sunt reprezentanții genurilor Pseudomonas [31, 44-47], Bacillus [48], Acinetobacter [49], Serratia [50], Staphylococus [51].

Lipazele bacteriene, de regulă, sunt endoenzime, însă la unele tulpini de bacterii au fost detectate și lipaze exogene, spre exemplu la Pseudomonas fragi [31].

Studiile asupra activității lipolitice la tulpinile de bacterii din genul Pseudomonas au demonstrat, că domeniul de activitate al acestor lipaze este foarte mare. Lipazele microbiene activează de regulă în mediu neutru sau slab bazic, dar tulpinile Pseudomonas nitroreducens și Pseudomonas fragi biosintetizează o cantitate mare de lipaze la un pH al mediului de 9,5. Preparatele enzimatice obținute din aceste tulpini sunt stabile în intervalul de pH = 5,0 – 11,0 și rezistă la temperatura de 700C, timp de 20 min, fără să se inactiveze [52].

Activitate lipolitică mare posedă și tulpina Pseudomonas fluorescens BKMB-1151 selectată din apă. Activitatea lipolitică a preparatelor enzimatice obținute din aceste tulpini diferă în funcție de substrat [52].

Bacteriile din genul Pseudomonas pot sintetiza diferite enzime lipolitice: lipaza, lipoproteinlipaza, fosfolipaza [53].

Dintre fosfolipaze, cea mai studiată este fosfolipaza C sau lecitinaza, care este biosintetizată de multe tulpini din genul Pseudomonas: aurantica, aeruginosa și aureofaciens [31], precum și de Bacillus cereus [54].

De activitate lipolitică au dat dovadă și tulpinile bacteriene Pseudomonas sp. 1 și Pseudomonas sp. 2, precum și Propionibacteriile: freudeichi s.s. shermanii, cocoides, jensenii [47, 55].

Activitate lipolitică a fost depistată și unele bacterii termofile. Astfel nouă tulpini de Bacillus spp și trei de Pseudomonas sp. posedă activitate lipolitică la temperatura de 600C [56].

Enzimele lipolitice din Staphylococus hyicus (lipază SHL) și Staphylococus aureus (lipază SAL) diferă în funcție de activitatea biochimică. Astfel, SHL posedă o înaltă activitate fosfolipazică, hidrolizând lipidele neutre, indiferent de lungimea catenei, pe când SAL, descompune numai esterii acizilor grași cu catenă scurtă [51].

Cele mai bune producătoare de lipaze sunt drojdiile, în special cele din genul Candida [30, 38, 57-64]

Activitatea lipolitică a drojdiilor este diferită, în funcție de condițiile de creștere, natura substratului, prezența în mediul nutritiv a inductorilor și inhibitorilor.

Optimizarea parametrilor de creștere și biosinteză a drojdiei Candida rugosa a permis creșterea producției de enzime lipolitice cu 18 U/ml [65]. La preparatul enzimatic obținut din tulpina Candida rugosa, termostabilitatea crește sub acțiunea alcoolului polivinilic cu masă moleculară de 22 kD [65].

Lipaza din Candida rugosa hidrolizează grăsimile de origine animală. Amestecul de acizi grași liberi, formați în urma hidrolizei complete a grăsimii de vită, inhibă activitatea acestei lipaze cu 70%, atunci când concentrația lor atinge valori foarte mari [58, 65].

Producătorii de lipaze depistați printre actinomicete fac parte din genurile Streptomyces și Thermoactinomyces.

Activitate lipolitică considerabilă a fost depistată și în mediul de cultură al tulpinii Streptomyces fradiae, producător de tirozină [66].

Pentru obținerea la scară industrială a lipazelor sunt folosiți mai ales fungi, grație însușirii acestora de a biosintetiza cantități însemnate de enzime în mediul de fermentație. În rândul producătorilor activi ai acestor enzime se numără reprezentanți ai genurilor: Aspergillus [67; 68], Rhizopus [9, 69, 70], Geotrrichum [71, 72], Fusarium [73], Penicillium [74].

O serie de lipaze fungice nu manifestă specificitate la lipoliza uleiurilor și a grăsimilor de diferite tipuri și le hidrolizează cu aceeași viteză. Astfel, la lipoliza uleiurilor de măsline, de floarea soarelui și de soia, precum și la untura de porc, untura de morsă și uleiul din semințe de rapiță, cu ajutorul lipazei din Rhizopus, viteza de acțiune și profunzimea hidrolizei au fost aproximativ la același nivel [9].

Lipaza obținută la cultivarea submersă a tulpinii Rhizopus oryzae manifestă activitate lipolitică optimă la valoarea 8,5 a pH-ului și temperatura 300C [9, 75].

Lipaza produsă de Geotrichum sp., purificată prin fracționare cu sulfat de amoniu, este compusă din două subunități cu mase moleculare de 52 și 57 kD. Preparatul enzimatic manifestă activitate optimă în intervalul de pH = 7,5 – 9 și temperatura de 450C [71].

Preparatul enzimatic obținut din tulpina Penicillium roqueforti 141 este stabil la temperatura de 550C și în intervalul de pH = 3,0 – 10,0. Este constituit din trei forme moleculare de lipaze: I, II, III. Activitatea lipolitică maximă a formelor I și III a fost înregistrată la o valoare a pH-ului de 7,0 și temperatura 400C, lipaza II manifestă maximum de activitate la pH = 6,0 și temperatura de 450C [74].

Un alt producător important de lipaze este și Mucor miehei. Maximul activității lipolitice a fost înregistrată la pH = 6,0 – 7,0 si 400C. Prin cultivarea tulpinii în mediu lichid se obțin două forme de lipaze: A și B. Raportul dintre ele variază în funcție de vârsta culturii și condițiile de cultivare. S-a stabilit că această lipază este stabilă la 600C și în intervalul de pH=4,0-10,0. Activitatea maximă a formei A a fost înregistrată la pH=8,7 și 550C, a formei B, la pH=8,2 și 450C [48].

În prezent se realizează numeroase studii de mutageneză clasică, cu scopul îmbunatățirii procesului de fermentație și studiul izolării și clonării genei lipazei.

Clonarea si secvențierea genelor răspunzătoare pentru sinteza lipazei s-a realizat doar în puține cazuri. Până în prezent, au fost clonate și secvențiate genele de la Mucor miehei, Staphylococcus hyicus, Alcaligenes denitrificans, Pseudomonas fragii, Staphylococcus aureus si Humicola lanuginosa.

Tabelul 1. Microorganisme producătoare de lipaze [77]

Table 1. Producing microorganisms of lipase

1.4. Mutageneza indusă, ca factor de ameliorare al productivității microorganismelor

Pentru sporirirea capacității biosintetice a tulpinilor microbiene de interes biotehnologic, una metodele larg aplicate este mutageneza indusă cu ajutorul agenților mutageni fizici și chimici.

Agenții fizici potențial mutageni sunt radiațiile electromagnetice (radiațiile UV, X și gama), sau corpusculare (electroni, neutroni, particule alfa și beta). Frecvența mutațiilor depinde de doza radiației.

Agenții mutageni de natură chimică, utilizați pentru creșterea frecvenței mutațiilor la microorganisme sunt etil- sau metilmetansulfonatul, analogi ai bazelor azotate. Pentru tratarea culturii, agenții mutageni chimici se adaugă în diverse concentrații în mediul de cultură a microorganismelor. După trecerea timpului de expunere, cultura este transferată într-un mediu de cultură fără agenți mutageni [78].

La aplicarea mutagenezei induse, există două mecanisme esențiale prin care se realizează variabilitatea la microorganisme: variația fiziologică (negenetică) și variația genetică. Astfel, variațiile fiziologice nu sunt înscrise genetic și pot apărea ca răspuns la acțiunea unui factor nou sau ca etapă intermediară în procesul de reparare. Variațiile genetice sunt neereditare fenotipic. Unele dintre acestea au la bază modificări biochimice ale unor căi metabolice. Din punct de vedere industrial, prezintă importanță mutantele modificate sau nu morfologic, care produc cantități mari de enzime, antibiotice, vitamine, aminoacizi ș. a.

Odată cu îmbunătățirea bioproductibilității, la tulpinile mutante apar și alte modificări, de natură diferită, ceea ce duce la alterarea metabolismului în general și la apariția unor noi cerințe față de condițiile de creștere și dezvoltare. Toate modificările nou apărute implică un studiu aprofundat al proprietăților fiziologice și biochimice ale tulpinilor mutante.

Folosirea mutagenezei induse cu scopul sporirii potențialului biosintetic al tulpinilor de importanță industrială este argumentată de multe rezultate pozitive [79].

Utilizarea factorilor mutageni diferă în funcție de microorganismul testat.

Astfel, prin tratarea sporilor de Asbbya grossypii cu raze gama și neutroni rapizi, s-a reușit, încă din anul 1977, obținerea unei tulpini mutante producătoare de vitamina B12, cu potențial biosintetic superior tulpinii de origine [80].

Folosirea razelor UV și a NTG, asupra sporilor tulpinii de Aspergillus tericola s-a dovedit a fi eficientă pentru obținerea a patru noi tulpini cu activitate proteolitică mărită de 1,4 – 1,2 ori față de martor [81].

Prin lucrările de mutageneză, efectuate asupra tulpinii de Bacillus subtilis IFO 3039, utilizând ca factor mutagen neutronii rapizi la doze de 60, 90 și 120 krazi, s-a obținut o creștere a activității enzimatice cu aproximativ 150% față de tulpina parentală [79].

În urma iradierii combinate cu raze gama și UV a tulpinii Streptomyces canosus CNM-71 a fost obținută o variantă stabilă Streptomyces canosus var. 2-IV-12, a cărei bioproductivitate lipazică și cantitate de biomasă a fost mărită cu 75,2%, respectiv 179,4%. Tulpina obținută, posedă acțiune antimicrobiană sporită față de agenți patogeni care provoacă bolilor infecțioase la albine (Bacillus alvei, Bacillus learvae, Streptococcus apis, Salmonella typhimurium, Candida albicans) [82].

Rezultate pozitive au fost obținute și la utilizarea razelor gama, ca factor mutagen, asupra sporilor tulpinii Aspergillus niger 33, producător de amilaze. Cel mai mare număr de variante pozitive, stabile, cu o capacitate de biosinteză a amilazelor de 1,5-2,0 ori mai ridicată față de tulpina inițială, au fost obținute la iradierea tulpinii cu raze gama, la doze cuprinse între 300-1500 gray. Iradierea gama a micromicetei Rhizopus arrhizus a permis obținerea a trei variante, în care activitatea pectolitică depășește cu 22,06-242,59% tulpina inițială. Cea mai efectivă doză de iradiere a fost 4000 gray [83].

Analiza datelor din literatură ne demonstrează că industria microbiologică contemporană, orientată spre obținerea preparatelor enzimatice cu activitate fermentativă înaltă, se bazează pe utilizarea tulpinilor de microorganisme modificate prin diferite tehnici de ameliorare a capacității biosintetice. Deși în prezent există tulpini productive de enzime lipolitice, problema selecției unor noi producători si sporirea capacităților de biosinteză, rămâne a fi o temă actuală.

1.5. Studiul biosintezei lipazelor

Obținerea unor productivități înalte de enzime lipolitice depinde atât de alegerea mediilor nutritive cu compoziție adecvată necesităților nutriționale ale microorganismelor, cât și de folosirea condițiilor optime de cultivare [84].

1.5.1. Influența compoziției mediilor de cultură asupra biosintezei lipazelor

Compoziția mediului nutritiv joacă un rol important atât pentru creșterea și dezvoltarea microorganismelor, cât și pentru biosinteza enzimatică.

1.5.1.1. Surse de carbon si energie

Microorganismele posedă însușirea de a asimila variate surse de carbon. Pentru studierea necesităților fiziologice ale microorganismelor potențial producatoare de lipaze, ca surse de carbon, s-au utilizat glucidele, acizii grași, lipidele, melasa ș.a. Făina de soia s-a utilizat atât ca sursă de carbon cât și ca sursă de azot [85]. S-a constatat ca formarea lipazelor exogene este stimulată de conținutul de lipide din făina de soia [85].

O creștere considerabilă a activității lipolitice s-a obținut în cazul tulpinii de Porphyridium cruentum, ca urmare a folosirii ca sursă de carbon a glucidelor, excepție făcând numai arabinoza [86]. La Pseudomonas fragi, biosinteza lipazelor a atins nivelul maxim în prezența glucozei, pe când la Oospora lactis, prezența acesteia determină o scădere activității lipolitice [87].

Toate aceste date sugerează faptul că sursele de carbon influențează diferit metabolismul microorganismelor producatoare de lipaze, fapt care demonstrează necesitatea selectării unor surse de carbon, specifice fiecărei tulpini în parte.

1.5.1.2. Surse de azot

Ca surse de azot sunt folosite atât sărurile minerale, cât și sursele organice [85]. Combinarea surselor de azot organic și mineral (sulfat de amoniu cu malț de orz) a determinat creșterea de 2-3 ori a activitatii lipolitice la tulpina fungică Mucor miehei [76]. O intensificare considerabilă a biosintezei lipazelor s-a evidențiat în cazul tulpinii Oospora lactis, atunci când în mediul nutritiv au fost introduse săruri de amoniu si extract de drojdie [48].

Din datele bibliografice, reiese că, în general, mediul nutritiv pentru cultivarea producătorilor de enzime lipolitice conține 0,1 – 0,3% azot mineral sau 2,5 – 5% azot organic [86].

Unii cercetători au demonstrat că la introducerea ureei în mediul de cultură a tulpinii Rhizopus microsporus, activitatea lipolitică se mărește, iar în lichidul de cultură s-au evidențiat cinci forme moleculare de lipaze, care se deosebesc prin compoziția subunităților componente [87]. Toate formele moleculare prezintă proteine oligomere, cu mase moleculare de 28 x 103, 39 x 103, 43 x 103, 65 x 103, 68 x 103 și sunt compuse din două subunități, A și B, în diferite combinații: A + B(1), 2A + B(2), A + 2B(3), 4A + 4B(4), 3A + 2B(5) [88].

1.5.1.3. Inductori și inhibitori ai enzimelor lipolitice

Majoritatea lipazelor prezintă un caracter inductibil pregnant [60].

Enzimele lipolitice de origine microbiană sunt biosintetizate ca răspuns la acțiunea inductorilor introduși în mediul nutritiv. Biosinteza enzimelor într-un mediu nutritiv ce conține inductori, crește considerabil, față de cultivarea aceleași tulpini pe un mediu fără inductori.

Ca inductori ai lipazelor pot fi folosite grăsimile de origine animală sau vegetală, tween-urile, acizii grași, tributerina, diverse săruri, cationi și anioni.

Astfel, pentru tulpinile din genul Geotrichumt, buni inductori s-au dovedit a fi uleiurile de origine vegetală (măsline și soia), înregistrându-se rezultate pozitive diferite, în funcție de substratul folosit. Tween-urile, cu excepția Tween 21, uleiul de floarea soarelui și tributerina s-au dovedit buni inductori pentru această tulpină [40].

Efect stimulator a fost marcat și la cultivarea tulpinii Pseudomonas fraji 34 pe medii cu inductori ca uleiul de floarea soarelui, untura de vită, tributerina [40].

La introducerea uleiului de bumbac în mediul nutritiv cultivat cu Mucor miehei, biosinteza enzimatică a crescut de 1,5 – 2,0 ori, pe când folosirea uleiului de floarea soarelui și a uleiului de măsline a condus la inhibarea producției de enzimă în mediul de cultură [40].

În schimb, utilizarea tributerinei, a uleiului de soia și de floarea soarelui, în calitate de inductori ai activității lipolitice, sporesc acest indice la tulpinile de Pseudomonas sp CNM-PsB-01, cu 98%, iar la Pseudomonas sp CNM-PsB-02, cu 55% [40].

Surse bibliografice indică faptul că unele uleiuri vegetale, ca uleiul de măsline, soia, constituie inductori puternici ai biosintezei lipazelor, gradul de influență depinzâd de concentrația lor în mediul de cultură [89, 90]. Ca inductori pot fi folosite și tween-urile, care sunt hidrolizate de majoritatea microorganismelor ce posedă activitate lipolitică. Din literatură, este cunoscut faptul că tween-urile apar deseori ca stimulatori de creștere și de biosinteză ai lipazelor la diverse micromicete, însă uneori pot avea și efect inhibitor [90].

Este cunoscut faptul că multe substanțe pot acționa stimulator sau inhibitor asupra biosintezei enzimatice [69, 91]. Astfel, sărurile de Cu2+, Fe2+, Zn2+ sunt prezentate atât ca stimulatori [69], cât și ca inhibitori [69] ai bosintezei lipazelor.

Rezultate pozitive au fost obținute la folosirea sărurilor de Cu2+, Fe2+, Zn2+, în calitate de stimulatori, la cultivarea tulpinii Candida paralipolytica 739 [42].

Stimulatori ai biosintezei enzimatice s-au dovedit a fi și unii cationi, dar și unii anioni. Activitatea crescută a lipazelor, atunci când sunt adăugați în mediul nutritiv ioni de Ca2+, s-a dovedit a fi rezultatul legării acizilor grași cu ionii de Ca2+ [63]. S-a stabilit că ionii de Mg2+, Cu2+, Co2+, Zn2+ manifestă efect inhibitor asupra biosintezei lipazelor în cazul cultivării tulpinii Pseudomonas fluorescens 2D, în timp ce ionii Mg2+, Ca2+ stimulează biosinteza enzimatică a tulpinii [59].

Efectulul stimulator al ionilor de Ca2+ s-a demonstrat și în cazul culturilor de Candida cylindracea [93].

1.5.2. Influența parametrilor de cultivare asupra biosintezei lipazelor

1.5.2.1. Influența temperaturii de cultivare

Temperatura mediului în care are loc procesul de biosinteza al enzimelor hidrolitice este un factor extrem de important pentru activitatea microorganismelor. Variațiile de temperatură au efect asupra randamentului de transformare a substratului în produsul finit, asupra cerințelor nutritive ale microorganismului și compoziția biomasei obținute și, nu în ultimul rând, asupra vitezei de creștere microbiană.

Temperatura este un factor care acționează în mod direct asupra microorganismului viu. Temperaturile ridicate pot dăuna microorganismelor prin denaturarea enzimelor, a proteinelor transportatoare, sau a altor tipuri de proteine.

Variațiile temperaturii au efect direct asupra randamentului de transformare a substratului în produsul dorit, asupra cerințelor nutritive ale microorganismului și compoziției biomasei obținute, și nu în ultimul rând asupra vitezei de creștere microbiană [77].

Temperatura optimă pentru biosinteza lipazei diferă de la o specie la alta. Astfel, pentru specia Pseudomonas, temperatura optimă se situează, în general, în domeniul 20-300C. Totuși, pentru Pseudomonas mephitica var. lipolytica producția maximă de lipază s-a observat la 370C, în timp ce pentru Pseudomonas fragi randamentul maxim în lipază s-a obținut menținând cultura timp de 3 zile la 150C, la 300C neobservandu-se activitate lipazica. În cazul culturilor de Geothricum candidum si Rhizopus nigr leans randamentele maxime în lipază s-au înregistrat la 300C, iar la Penicillium roqueforti temperatura optimă a fost de 270C [93].

Tulpina bacteriană termofilică Bacillus coagulans BTS-3 produce lipaze alcaline extracelulare, producția fiind îmbunătățită atunci când au fost optimizate sursele de carbon, azot si pH-ul inițial. Acivitatea lipolitică, de 1,16 U/ml a fost obținută la 48 ore la 550C și pH = 8,5, cu ulei rafinat, ca sursă de carbon și o combinație de peptonă și extract de drojdii (1 : 1), ca sursa de azot. Enzima a prezentat o activitate maximă la 550C și pH = 8.5, și este stabilă în domeniu de pH = 8.0 – 10.5 și la temperaturi ridicate de 700C. Enzima s-a dovedit a fi inhibată de ioni de Al3+, Co2+, Mn2+si Zn2+, pe când K+, Fe3+ Hg2+, și Mg2+ activează activitatea lipolitică; ionii Na+ nu au nici un efect asupra activității enzimatice [94].

S-a observat că lipazele bacteriene sunt inhibate de prezența proteazelor sintetizate simultan în mediu, atunci când Pseudomonas fluorescens este crescută la temperaturi ridicate (30-400C). Domeniul de temperatură, cuprins între 22-350C s-a determinat a fi optim pentru producerea de lipaze de către A. wentii, M. heimalis, R. nigricans, M. racemosus R. oligosporus si P. aeruginosa [95].

1.5.2.2. Influența pH-ului mediului de cultură

S-a constatat că pH-ul inițial al mediului de cultură reprezintă de asemenea un parametru important pentru producerea de lipază. În funcție de pH-ul optim de activitate al enzimei, s-au găsit următoarele tipuri de lipaze produse de diferite microorganisme: lipaze active la pH = 5,5, lipaze active la pH = 7,5, lipaze active la pH = 5,5 si 7,5, lipaze alcaline, active la pH > 9. Majoritatea tulpinilor microbiene produc lipaze active la pH-uri cuprinse între 5-8, dar o importanță deosebită a fost acordată în ultimul timp enzimelor produse de microorganisme alcalofile care au aplicații importante în industria detergenților [77].

Maximul activității lipolitice a fost observat la pH > 7,0 pentru Pseudomonas fragi și la pH = 9,0 pentru Pseudomonas aeruginosacum. În schimb, maximul creșterii activității lipolitice a fost observat în domeniul de pH acid (4,0 – 7,0) la S. lipolytica, M. caseolyticus, B. licheniformis, A. wentii, M. hiemalis, R. nigricans., Mucor racemosus, R. oligosporus și P. aeruginosa EF2. [77]

S-a constatat ca pH-ul optim pentru lipaza produsă de Calvatia gigantea este 7, iar temperatura optimă de acțiune a fost 300C. Profilul stabilității termice la această lipază arată că valoarea perioadei de înjumătățire este de 75,7, 46,4 și 22,9 minute la 450C, 500C si 550C. Această enzimă prezintă proprietăți similare cu lipaza izolată de la Rhizopus japonicus [93] și Streptococcus aureus [77].

În cazul lipazei de la Candida rugosa, pentru îmbunătățirea termostabilității enzimei s-au utilizat polivinilalcoolii cu diferite greutăți moleculare [96].

În prezent, cercetăarile de izolare a microorganismelor lipolitice s-au orientat spre obținerea de tulpini termofile și/sau alcalofile, care produc lipaze foarte căutate în industria detergenților sau pentru sinteze organice. O asfel de tulpină microbiană este cea de Pseudomonas SD 705, care produce lipaza activa la pH 10-11 si 55-650C [97].

1.5.2.3. Influența aerării mediului de cultură

Cercetările au evidențiat creșterea producției de lipază în cazul culturilor aerate, pentru majoritatea microorganismelor producătoare de lipază, însă gradul de aerare necesar pare să difere de la o specie la alta.

În cazul lipazei din Mucor mucedo, activitatea lipazei pentru culturi în flacoane agitate a fost mai mare cu 40% decât în cazul flacoanelor neagitate [98].

Efectul aerării nu este însă întotdeauna pozitiv asupra productiei de lipază. S-a constatat, de exemplu, că în cazul culturilor de Pseudomonas fragi, aerarea intensă determină reducerea activității lipazice. În cazul microorganismelor Candida lipolytica, Pseudomonas fragi și Pseudomonas fluorescens s-a observat că, utilizând culturi agitate, se obține inițial o creștere pronunțată a celulelor și a producției de lipază, urmată însă de o scădere rapidă a activității lipazice, în cazul continuării agitării [93].

Capitolul 2. Metode de IZOLARE ȘI purificare a proteinelor enzimatice cu activitate lipoliticĂ

În literatura de specialitate sunt menționate diferite metode utilizate pentru izolarea și purificarea lipazelor de origine animală, vegetală sau microbiană, metode care includ: fracționarea cu sulfat de amoniu [99, 100-106], precipitarea cu acetonă [105-108], gel-filtrarea, cromatografia de schimb ionic [107-111]. În ultimii ani s-au dezvoltat tehnici moderne de purificare bazate pe cromatografia de afinitate [112-114], cu ajutorul cărora se urmarește obținerea unui preparat enzimatic cu o cât mai mare activitate specifică, în condițiile unui număr redus de etape tehnologice de prelucrare post-biosinteză (trepte de purificare).

2.1. Fracționarea cu sulfat de amoniu

Fracționarea cu sulfat de amoniu este menționată în datele de literatură că prima treaptă de prelucrare post-biosinteză a mediilor de fermentație conținând lipaze de origine microbiană, indiferent de tulpina producătoare [99]. Utilizarea acestei metode, ca etapă de purificare primară a lipazelor microbiene din lichidele de fermentație se bazează pe modificarea diferențiată a solubilității acestor proteine enzimatice față de a altor proteine de balast, în funcție de concentrația de sulfat de amoniu [100].

Este cunoscut faptul că, în cazul unei proteine date, solubilitatea ei creste cu concentrația unei sări neutre (salting-in), atinge o valoare maximă, dupa care scade treptat, până când precipită din soluție (salting-out). Fiecare proteină, în funcție de structura ei, precipită la o anumită concentrație dintr-o sare, deci teoretic este posibilă precipitarea fracționată, treptată, a proteinelor dintr-un amestec și deci separarea lor.

Între solubilitatea S și tăria ionică μ a unei soluții saline, există relația matematică:

log S = β – Ks ∙ μ

unde Ks este constanta de precipitare, caracteristică pentru o anumită proteină și pentru o sare neutră cu care a fost realizată precipitarea [103, 115].

Relația poate fi reprezentată grafic (figura 5) într-un sistem de axe rectangulare, pe ordonata indicând log S, iar pe abscisă, tăria ionică μ. Se obțin drepte a căror pante permit calcularea valorii Ks și care intersectează ordonata într-un punct egal cu β. Pentru aceeași proteină P și pentru aceeași sare S se obțin drepte paralele, în funcție de pH și temperatura la care are loc precipitarea. De aceea, în experimențele de precipitare fracționată este necesară menținerea constantă a pH-ului și temperaturii [115].

Figura 5. Variația solubilității unei proteine P într-o soluție salină, în funcție de tăria ionică

Figure 5. Variation of solubility of a protein in a salty solution depending on ionic strength

Precipitarea proteinelor cu ajutorul concentrațiior mari de sare se datorează faptului că ionii sării îndepartează mare parte din moleculele de apă care în mod obișnuit hidratează suprafața proteinelor, fenomen care conduce în final la precipitarea acestora din soluție [100, 115]. Fenomenul de precipitare este reversibil. Prin reluarea precipitatului într-un volum limitat de apă, aceasta se redizolva – semn ca nu a fost alterată structura terțiară a macromoleculei proteice.

Pentru ca o sare neutră să fie utilizată ca agent de precipitare fracționată a unui amestec de mai multe proteine, aceasta trebuie să îndeplinească urmatoarele condiții:

să prezinte o mare solubilitate în apă, pentru a permite obținerea unei game largi de concentrații la care să precipite diferențiat proteinele din amestec;

prin dizolvarea sării în mediul apos să nu aibă loc procese exoterme, care pot termodenatura proteinele sau provocă variații de pH;

sarea nu trebuie să interacționeze chimic cu proteina, astfel încât să poată fi ușor separată ulterior din precipitatele proteice.

Sarea care corespunde cel mai bine condițiilor sus-menționate este sulfatul de amoniu, care, din acest motiv, este cel mai des utilizat agent de precipitare fracționată în chimia proteinelor. Este o sare deosebit de solubilă (70,6 g la 100 ml, la 00C) care, în plus, manifestă un efect protector asupra multor enzime. Utilizarea sulfatului de amoniu prezintă și unele dezavantaje: interferă în dozarea proteinelor prin metoda Lowry, iar prin solubilizare, au loc mici variații de temperatură și de pH [102].

2.2. Fracționarea cu solvenți organici

Solvenții organici (acetona, metanolul, etanolul, cloroformul etc.) sunt agenți de precipitare a proteinelor aflate în soluție apoasă datorită efectului lor de micșorare a constantei dielectrice a mediului. Moleculele proteice fiind polielectroliți, ele sunt solubile în mediul apos, întrucât prezența apei, care are o constantă dielectrică mare (aproximativ 80), micșorează forțele de atracție dintre sarcinile de semn opus de la suprafața moleculelor proteice. Adăugând treptat un solvent organic cu constanta dielectrică mai mică decât a apei, constanta dielectrică a mediului scade, forța de atracție dintre moleculele proteice crește în mod corespunzător, acestea se agregă prin interacții electrostatice și precipită din soluție [107].

În cazul particular al unui amestec de mai multe specii moleculare proteice diferite, care prezintă o încărcare electrică și o distribuție a sarcinilor la suprafața structurilor tridimensionale distincte, precipitarea lor se va realiza diferențiat la diferite constante dielectrice ale mediului și deci la diferite concentrații procentuale ale solventului organic utilizat. Deci, crescând treptat concentrația solventului organic în amestecul proteic multicomponent, proteinele vor precipita pe rând, fiind posibilă separarea lor. Dacă sarcina electrică a două proteine este similară, ele vor precipita la aceeași concentrație în solvent și deci nu va fi posibilă separarea lor. În această situație, prin modificarea pH-ului sau/și a tăriei ionice a mediului se pot realiza diferențieri în sarcina electrică globală a proteinelor din amestec și deci precipitări fracționate [107, 115].

Acțiunea precipitantă a solvenților organici este realizată nu numai prin scăderea constantei dielectrice a mediului, ci și prin efectul deshidratant asupra moleculelor proteice. Moleculele solventului organic interacționează cu moleculele apei care hidratează macromoleculele proteice prin interacții ion-dipol. Deoarece interacția moleculelor de solvent organic cu apa este exotermă, toate operațiunile de precipitare se efectuează la temperaturi scazute, sub 00C [108].

2.3. Purificarea prin cromatografie de schimb ionic

Separarea proteinelor prin cromatografie de schimb ionic se bazează pe proprietatea acestora de polielectroliți amfoteri, care, teoretic se pot fixa, prin legături electrostatice și reversibile de orice schimbător de ioni. Schimbătorii de ioni sunt substanțe alcătuite dintr-o matrice hidrofobă, insolubilă în majoritatea solvenților, de care sunt legate grupări ionizate, ce pot da reacții de schimb ionic cu alți ioni cu care vin în contact [111]. Proteinele fixate reversibil pe schimbătorii de ioni pot fi dezlocuite apoi, tot în urma unor reacții de schimb ionic, de alți ioni, proveniți din soluții de electroliți mai puternici.

În practica cromatografică există două tipuri de schimbători de ioni: schimbători sintetici (rășini schimbătoare de ioni) și schimbători naturali (celuloza și dextran) [110].

Schimbătorii de ioni sintetici sunt constituiți din două părți: o parte hidrofobă, reprezentată de matrice, care este o rețea tridimensională, elastică, fixă, insolubilă în majoritatea solvenților și inertă chimic, și o parte hidrofilă, reprezentată de grupări ionizate legate chimic de matrice, ioni activi, mobili care reacționează chimic. Dacă o particulă a unui astfel de schimbător de ioni este pusă în contact cu o soluție apoasă ce conține ioni, se va realiza un schimb ionic, astfel că ionii din soluție vor înlocui ionii mobili din rășină [111].

În funcție de natura grupărilor ionizate atașate de matrice, schimbătorii de ioni se împart în doua clase: schimbători de cationi (cationiți) și schimbători de anioni (anioniți).

Datorită proprietăților fizice și chimice remarcabile rășinile pe bază de vinilbenzen prezintă o serie de avantaje: sunt insolubile în acizi, baze și săruri concentrate, sunt rezistente la oxidare, reducere și radiații, au o înaltă capacitate de schimb (matricea prezintă multe grupări ionice funcționale). Natura schimbătorului de ioni este determinată de natura chimică a grupării ionice fixată pe matrice, astfel, dacă aceste grupări sunt acizi sau baze puternic ionizate, se obțin schimbători puternic acizi sau bazici, iar dacă aceste grupări sunt slab ionizate schimbătorii obținuti sunt slab acizi sau slab bazici.

În urma copolimerizării acidului metacrilic cu divinilbenzenul se poate de asemenea obține un alt tip de schimbator de ioni slab acid.

Identificarea schimbătorilor de ioni se face pe baza denumirii comerciale, formulei chimice, mărimii particulelor, gradului de inrețelare, capacității și naturii ionice a rășinii.

Se disting patru tipuri de schimători de ioni:

Mărimea particulelor unui schimbator de ioni variază de la 1μ la câțiva mm și se exprimă prin termenul mesh [109, 111]:

Pentru procedeele „batch” și pentru operații generale de cromatografie pe coloane se recomandă schimbătorii cu particule de 100-200 mesh. Particulele „coarse” cu un diametrul mai mic de 100 mesh se recomandă pentru operații pe scară largă – staționări rapide și viteze de eluție foarte mari. În scopul fracționării cu putere mare de rezoluție se recomandă schimbători de ioni cu particule de 200 – 400 mesh.

Procentajul în divinilbenzen (% DVB) dintr-o rășină se exprimă prin simbolul X urmat de un numar (Amberlite IR-120 X 8 = copolimer cu 8% DVB). Identificarea ionului de schimb trebuie facută înaintea utilizării lui. Schimbătorul poate fi complet transformat de la o formă ionică necunoscută la o formă cunoscută prin simpla spălare cu o soluție salină adecvată. Cationitii sunt ținuti numai în formele H+ sau Na+, iar anioniții în forma Cl-. Pe ambalajul unui schimbător de ioni sunt trecute o serie de date [116]:

Amberlite IRA-400 X 8

200-400 mesh

forma Cl-

RN(CH3)3+ Cl-

La schimbătorii de ioni s-a constatat apariția unui fenomen denumit efect de cernere ionică. Acesta apare în cazul când porii rășinii sunt de trei ori mai mari decât diametrul ionului. Astfel, gradul de înrețelare trebuie realizat astfel încât ionii luați în studiu să difuzeze liber în și din porii rășinii. Din această cauză rășinile schimbătoare de ioni nu pot fi utilizate pentru separarea macromoleculelor mari (peste 500).

Substanțele cu mase moleculare mari (proteine, acizi nucleici) pot fi separate cromatografic folosind schimbători de ioni pe bază de dextran și de celuloză, la care distanțele între situsurile de schimb sunt mai mari, ceea ce scade probabilitatea formării de legături multiple între macromolecula și schimbător.

Datorită mărimii porilor, a suprafeței mari, a numărului mic de situsuri de schimb și naturii hidrofile, schimbătorii de ioni pe bază de dextran și celuloză sunt cele mai indicate pentru separarea cromatografică a macromoleculelor [109]. Proprietățile schimbătorilor de ioni (afinitate, capacitate de reținere, rezistență mecanică) variază în funcție de sursa și de procedeul de fabricație al acestora. În tabelul 2 sunt prezentați principalii schimbători de ioni pe bază de celuloză și caracteristicile acestora.

Tabelul 2. Schimbători de ioni celulozici

Table 2. Cellulosic ion exchangers

Între schimbătorii de ioni celulozici și polielectroliți se stabilesc legături de tip electrostatic, care disociază si se refac continuu datorită prezentei ionilor sare care concurează și ei pentru situsurile lor de sorbție. Creșterea concentrației saline mărește șansa ionilor de sare de a ajunge la situsurile de sorbție, de a câștiga competiția cu substanța de separat – cea din urmă fiind desorbită datorită disocierii simultane a tuturor legăturilor care o țin legată de stratul cromatografic. Cu cât concentrația salină este mai mare, cu atât zona cromatografică va migra mai repede. În cursul acestei eluții au loc sorbții și desorbții multiple.

Desorbția se poate realiza prin două procedee: în gradient și în trepte. Gradientul trebuie să prezinte o pantă suficient de lină pentru a permite separarea componentelor ăi suficient de abruptă pentru a împiedica lățirea picurilor. Pentru a obține o rezoluție maximă, panta gradientului trebuie să permită atingerea gradientului de sorbție pe toată lungimea coloanei. În cazul eluției în trepte, coloana este eluată cu mai multe soluții cu putere de eluție crescândă. Acest procedeu prezintă dezavantajul că nu permite atingerea unui echilibru de sorbție, astfel că într-un pic pot fi eluate două sau mai multe componente, corespunzator intervalului în care a fost crescută puterea de eluție. Cu toate acestea, eluția în trepte este foarte utilizată în practica de laborator, deoarece este realizabilă într-un interval de timp scurt, iar componentele se obțin într-o formă mai concentrată.

2.4. Purificarea prin cromatografie de afinitate

2.4.1. Noțiuni generale cu privire la cromatografia de afinitate

Cromatografia de afinitate este o metodă biospecifică de separare a biomoleculelor dintr-un amestec ce se bazează pe diferențele caracteristicilor funcționale ale componentelor ce urmează sa fie separate, prin folosirea unor interacțiuni specifice între suportul afin și componentul de separat [113].

Ca supoturi pentru cromatografia de afinitate se folosesc diferiți adsorbanți modificați în mod special prin fixarea unor liganzi (de exemplu inhibitori, coenzime), față de care enzima manifestă forțe de interacțiune specifice, numite și forțe de afinitate (legături de hidrogen, interacțiuni polare) care stau la baza funcției biologice a enzimei.

Desorbția enzimei de pe suportul afin se realizează prin modificarea condițiilor experimentale folosite la absorbție, de exemplu utilizând ca eluant o soluție conținând substratul, sau un inhibitor al enzimei, sau crescând concentrația de electrolit.

Suporturile afine, reprezentând faza staționară în cromatografia de afinitate, se obțin în mod obisnuit prin imobilizarea pe un suport inert a unui compus (ligand) capabil să interacționeze cu componentul ce urmează a fi separat dintr-un amestec. Compusul imobilizat poate fi apoi utilizat ca sorbent selectiv pentru molecula complementară. Prin urmare, factorul care controlează separarea compușilor în cromatografia de afinitate este faza staționară.

Există o multitudine de tipuri de liganzi de afinitate, care pot fi clasificați în următoarele două categorii [113]:

liganzi înalt specifici – sunt compuși care leagă numai una, sau câteva molecule foarte apropiate ca structură;

liganzi generali – sunt molecule care leagă o familie sau clasă de molecule înrudite structural.

Printre macromoleculele des folosite ca suporturi solide se numără: albumina serică bovină, acidul glicoproteic, cheratina, colagenul, amiloza – tris (3,5 dimetilcarbonat).

În general, obținerea unui suport afin se realizează prin următoarea succesiune de etape:

1) preparea suportului de baza;

2) activarea suportului de baza;

3) cuplarea liganzilor afini pe suportul activat.

Un suport ideal pentru cromatografia de afinitate trebuie să îndeplinească următoarele condiții [113]:

structură poroasă corespunzatoare și rezistență mecanică adecvată pentru a permite fluxuri de presiune ridicată sau scăzută;

grupe reactive disponibile (cum ar fi -OH, -NH2, -SH, -COOH) pentru cuplarea mai departe de brațe („spacer”) sau liganzi;

stabilitate chimică și fizică în condiții dure, temperatură ridicată sau sterilizare chimică, dacă este cazul;

o suprafață hidrofilă pentru acoperirea înaltă a activității proteice.

Obținerea suportului afin se realizează prin imobilizarea moleculelor de ligand pe un suport de bază.

2.4.2. Suporturi afine utilizate în cromatografie

2.4.2.1. Proprietățile suporturilor afine

Un suport ideal pentru cromatografia de afinitate trebuie să îndeplinească următoarele condiții [112, 113]:

să fie complet insolubil în H2O, dar în același timp să posede o capacitate bună de umectare și imbibare;

să posede o rețea tridimensională suficient de largă, care să permită și moleculelor mai mari accesul nestingherit la efectorul imobilizat situat în interiorul rețelei tridimensionale a suportului;

să fie inert, adică să nu prezinte interacțiuni nespecifice cu substanțele ce urmează a fi separate, dar mai ales să nu posede fracțiuni schimbătoare de ioni;

să fie chimic stabil față de diferitele condiții de cuplare si eluare, adică să reziste la un domeniu de pH cuprins între 2 si 12, la variații de tărie ionică și la acțiunea unor denaturanți cum sunt: ureea, clorhidratul de guanidină;

să dispună de grupări funcționale care să permită legarea covalentă a efectorului, grupări care să fie suficiente ca număr și situate de preferință la capătul unor brațe suficient de lungi pentru a evita orice incomodare sterică între partenerul său afin;

să posede proprietățti mecanice bune, adică dimensiunea, forma și gradul de compresiune al particulelor sale să permită – încărcat în coloana cromatografică – viteze bune de curgere, condiții care sunt asigurate de un suport cu particule uniforme, de preferință sferice și în același timp rigide.

2.4.2.2. Tipuri de suporturi

Până în prezent nu s-a descris nici un suport care să îndeplinească în mod ideal toate condițiile necesare. Au fost elaborate însă o serie de suporturi, dintre care unele se apropie destul de mult de aceste cerințe [113].

Derivații dextranului

Deosebit de utili ca suporturi insolubile pentru imobilizarea biomoleculelor sunt o serie de polimeri hidrofili ai polizaharidelor. Derivații dextranului reticulat (Sephadex) posedă majoritatea proprietăților unui bun suport pentru cromatografia de afinitate, cu excepția gradului de porozitate. Din acest motiv, derivații dextranului nu se recomandă ca suport pentru purificarea de enzime.

Derivații agarozei

Literatura de specialitate menționează o serie de derivați ai agarozei, comercializați de firma Pharmacia Upsala sub diverse denumiri (Sepharose 2B, 6B, CH-Sepharose 4B, Br-CN-Sepharose 4B) sau de firma BIO-RAD California (biogeluri), care posedă aproape toate proprietățile unui suport ideal. Din această categorie fac parte și gelurile perlate de agaroză, cu sau fără brațe laterale [113].

Gelurile perlate ale agarozei au rețeaua deosebit de largă și permit difuzia nestingherită prin matricea gelului, chiar și a unor molecule cu greutăți moleculare ce depasesc 106 Da.

Gelurile de poliacrilamidă

Poliacrilamida, polimerul obținut prin polimerizarea radicalică a acrilamidei, este un polimer deosebit de important, utilizat în numeroase domenii. Datorită solubilității mari în apa și în soluții de electroliți, precum și a masei moleculare extrem de mari cu care se poate obține, se aplică pentru destabilizarea sistemelor disperse apoase prin floculare, ca aditiv pentru pasta de hârtie, pentru modificarea și prelucrarea fibrelor textile, în industria alimentară, pentru stabilizarea și îngroșarea dispersiilor, în medicina, cosmetică, etc.

Copolimerii obtinuți prin copolimelizarea cu comonomeri bifuncționali ca de exemplu N, N’ – metilenbisacrilamida sau polifuncționali, folosiți ca agenți de reticulare, se utilizează ca stabilizatori pentru polimerizarea în emulsie, la îngroșarea pastelor și cernelurilor tipografice, la fracționarea polimerilor solubili în apă prin cromatografie de penetrație în gel, la fracționarea polimerilor solubili în apă prin electroforeza pe gel de poliacrilamidă sau de poliacrilamidă dodecilsulfat de sodiu, ca suporturi pentru imobilizarea enzimelor sau a altor proteine, etc.

Colagenul

Unitatea structurală de bază a colagenului este tropocolagenul, care poate fi extras din colagenul matur al țesuturilor conjunctive tinere. Compoziția în aminoacizi este caracteristică, predominând glicina și prolina. În plus, o parte din prolină și lizină este hidrolizată și unităti glucidice se combină cu hidroxilizine [113].

Tropocolagenul este format din trei catene polipeptidice, fiecare în formă de spirală foarte alungită, stabilizată nu prin legaturi de hidrogen intracatenare, ci prin respingeri slabe ale resturilor ciclice de proline. Cele trei capete suferă o suprarulare analogă unui cablu, fapt explicabil prin abundența resturilor de glicina. La rândul său, tropocolagenul face obiectul unui nou aranjament; fibrele se asociază în patru cu un anumit decalaj longitudinal, pentru a forma fibra de colagen.

Colagenul prezintă o serie de proprietăți care îl fac un biomaterial adecvat pentru imobilizarea enzimelor sau a celulelor microbiene. În primul rand, este un suport relativ ieftin și accesibil, fiind cea mai abundentă proteină din constituția vertebratelor animale, funcția ei principală „in vivo” fiind structurală, de a susține celulele în țesuturi. Poate fi izolat ușor din numeroase surse biologice și reconsituit în forme diferite (membrane), fără să-și piardă structura nativă. Există deja în lume o tehnologie bine dezvoltată pentru extragerea și prelucrarea colagenului sub forma de membrane, utilizabile ca inveliș comestibil, cu aplicații în industria alimentară și farmaceutică.

În plus, colagenul are o structură internă deschisă, conținând un număr de situsuri de legare, favorabile fixării enzimelor.

Grupele funcționale terminale sau din catenele laterale ale resturilor de aminoacizi polari și nepolari din compoziția colagenului, pot interacționa cu moleculele enzimatice, prin legaturi ionice, legături de hidrogen și forte Van der Waals [116].

Accesul enzimei la situsurile de legare ale colagenului este facilitată de caracterul hidrofil al acestuia. La pH neutru el poate absorbi apa la un nivel de 100% din greutatea sa uscată; la pH-uri acide sau bazice capacitatea de absorbție a apei poate crește la 500%. Această proprietate asigură mediul apos adecvat pentru enzima legată, micșorând rezistența interioară la transport în procesul de difuzie al substratului și al produșilor reacției enzimatice.

Prin urmare, natura proteică hidrofilă a suportului matriceal are un efect de stabilizare asupra enzimei conjugate.

O altă proprietate importantă a colagenului este structura sa fibroasă, care îl face adecvat, din punct de vedere al rezistenței și formei, pentru imobilizarea enzimelor. O dispersie microfibrilară de colagen poate fi folosită pentru a prepara complexe colagen-enzimă sub formă de membrane. Se cunosc multe enzime care „in vivo” sunt localizate pe sau în variate structuri membranare ale celulei. Astfel, enzimele atașate la un material membranar de origine biologică cum este colagenul, pot constitui un model de sistem real de studiere „in vivo” a reacțiilor enzimatice, precum și în construirea diferitelor tipuri de reactoare biochimice.

Capitolul 3. Metode de dozare a activitĂȚii lipazelor

3.1. Aspecte generale privind măsurarea vitezei reacțiilor enzimatice

O reacție enzimatică poate fi pusă în evidență prin consumarea substratului sau prin apariția produsului de reacție. În general, viteza unei reacții enzimatice crește proporțional numai în cursul primelor minute de reacție, după care scade, rămâne constantă, sau crește neproporțional. Aceste abateri pot fi datorate scăderii gradului de saturație a enzimei în substrat, deplasării echilibrului de reacție, instabilității enzimei, inhibiției prin produsul final etc. Pentru aceste motive, se recomandă determinarea vitezei inițiale a reacției, care se realizează indirect prin calcularea acestui parametru dintr-o curbă care redă variația vitezei în timp.

Pentru a asigura acuratețea rezultatelor, toate soluțiile componente ale amestecului de reacție trebuie termostatate la temperatura de lucru, iar reacția enzimatică trebuie să fie condusă într-o baie termostat, reglată la această temperatură. Prepararea tuturor reactivilor în soluții tampon preîntâmpină orice modificare a pH-ului, ce poate apărea în cursul reacției enzimatice, efect ce conduce la rezultate eronate.

Metodele de măsurare ale vitezei enzimatice sunt de două feluri: continue și discontinue [117]. Principiul care stă la baza metodelor continue este următorul: enzima și substratul sunt amestecați și este urmărită continuu sau periodic o funcție dependentă de concentrația produsului sau substratului – ca de exemplu absorbanța sau presiunea unui gaz.

În cazul metodelor discontinue, se recoltează probe din amestecul de reacție, la diferite intervale de timp, se stopează reacția enzimatică cu un agent de precipitare a proteinelor (de exemplu, soluții de acid tricloracetic) și se dozează cantitativ componentul consumat sau eliberat în cursul reacției.

Fiecare probă în care se determină activitatea unei anumite enzime, trebuie însoțită de un martor, care în general conține toți reactivii, cu excepția enzimei sau mai corect toți reactivii și enzima inactivată.

În continuare, vor fi prezentate câteva dintre cele mai des folosite metode de dozare a lipazelor, metode care diferă între ele atât prin substratul folosit (natural sau sintetic), cât și prin principiul de determinare a produsului de reacție format.

3.2. Metoda titrimetrică

Când în cursul reacțiilor enzimatice se formează sau se consumă acizi sau baze și când se formează un acid sau o bază mai tare decât substratul, viteza acestor procese poate fi urmărită titrimetric. De fapt, concentrația în ioni de hidrogen este menținută constantă pentru a asigura pH – ul optim de acțiune al enzimei prin adăugarea cantității necesare de agent de titrare, cantitate care este o măsură a vitezei de reacție [118]. Astfel, în cazul lipazei, o glicoproteină cu un conținut de 4,2% glucide și o cantitate mare de aminoacizi nepolari, enzima care catalizează hidroliza esterilor emulsionați ai glicerolului, se formează acizi grași cu catenă hidrocarbonată, care acidifică mediul de reacție. Substratul efectiv al enzimei reprezintă un agregat de molecule de ester, micele sau film monomolecular la interfața cu mediul apos. Activitatea enzimei este proporțională cu concentrația moleculelor de substrat la interfață. Activitatea lipazei se determină prin titrare potențiometrică, realizată fie cu ajutorul unui titrator automat, fie cu un pH metru de laborator. O unitate de lipază eliberează un micromol de acid gras pe minut, din ulei de măsline emulsionat la 250C și pH = 8,0, în condiții specifice. Uleiul de măsline se emulsionează cu guma arabică și emulsia se menține cu albumină (în cazul lipazei din drojdie) sau cu taurocolat de sodiu (în cazul enzimei din pancreas de porc). Practic se înregistrează volumul soluției folosite pentru titrare (NaOH 0,01 – 0,02 M) necesară pentru a menține pH-ul mediului de reacție la valoarea 8,0 o anumită perioadă de timp, cât enzima acționează asupra substratului emulsionat.

3.3. Metoda spectrofotometrică

În cazul metodelor spectrofotometrice, funcția cu ajutorul căreia se urmărește activitatea enzimatică este absorbanța soluției ce conține substratul sau/și produsul reacției enzimatice. În măsurătorile fotoelectrice, unitatea de măsura este extincția E (densitatea optică D.O.) care este proporțională atât cu concentrația c a produsului de dozat cât și cu drumul optic d.

E = log I0 / I = – log T

unde: Io = intensitatea luminii incidente;

I = intensitatea luminii transmise;

T = transmisia.

Măsurătorile de extincție trebuie efectuate în domeniul de concentrații unde este respectată legea Lambert-Beer [118]:

E = ε x c x d

unde ε este coeficientul de extincție molară și reprezintă extincția unei anumite substanțe la o concentrație egală cu 1 mol/1 și la un drum optic de 1 cm. În țările germanofone, cantitatea de substanță din mediu este raportată la volum, exprimat în cm3 (mol/ml), iar ε are dimensiunile:

În țările anglofone, concentrația se exprimă în moli/litru (M), iar ε în M-1۰cm-1. Coeficientul de extincție molară, bazat pe mol/ml, este de 1000 ori mai mare decât cel exprimat prin mol/litru. Cea mai mare sensibilitate pentru determinarea spectrofotometrică a unui compus există la lungimea de undă unde acesta prezintă o absorbție maximă.

În multe reacții enzimatice sunt înregistrate modificarile proprietăților spectrale ale reactanților sau produșilor de reacție, modificări ce apar, de obicei, în ultraviolet sau în regiunea vizibilă a spectrului lor de absorbție și care pot fi puse în evidență și măsurate cantitativ la concentrații foarte mici de substanță. Deoarece este putin probabil ca substratul și produsul reacției enzimatice studiate să aibă spectre identice, se alege o lungime de undă la care transformarea unuia în celălalt este însoțită de modificarea absorbției.

În literatura de specialitate sunt menționate metode spectrofotometrice de dozare a activității lipazelor pe diferite substraturi, substraturi în funcție de care apar produși de reacție care prezintă absorbție caracteristică în UV sau VIS sau se pot transforma în compuși cu această proprietate [119].

Astfel, una din metodele colorimetrice de determinare a activității lipazelor se bazează pe determinarea absorbției în VIS a sărurilor de cupru ale acizilor grași eliberați în urma acțiunii enzimelor. Substratul utilizat în cadrul acestei metode este trioleina, (triglicerida acidului oleic), care nu poate fi hidrolizată de alte esterase. Emulsia substratului se realizează prin tratare cu un agent tensioactiv (Triton X-100) în tampon Tris-HCl. Acidul oleic liber, rezultat în urma reacției enzimatice, este extras în eter etilic și apoi în toluen, iar soluția toluenică se tratează cu o soluție de acetat cupric în piridină. Se formează sarea de cupru, colorată, a acidului oleic, care prezintă absorbție caracteristică la λ = 715 nm.

O altă metodă colorimetrică discontinuă de dozare a lipazelor foloseste β-naftilesterul acidului caproic, ca substrat al reactiei enzimatice și se bazează pe măsurarea absorbției în vizibil a β-naftolului rezultat în urma acțiunii lipazelor [120].

Întrucat această metodă, ca și precedenta, este foarte laborioasă, ea a fost transformată într-un procedeu continuu, bazat pe determinarea spectrofotometrică a absorbției în UV a β-naftolului rezultat în urma reacției enzimatice. Succesul acestei modificări se datorează faptului că substratul prezintă o absorbție nesemnificativă la λ = 233 nm, în comparație cu β-naftolul.

3.4. Metoda fluorimetrică

Spectrele de emisie se realizează de obicei în conditii de neechilibru termodinamic a substanței luate în studiu, utilizându-se diferite metode de excitare (de exemplu, excitarea prin absorbție de fotoni). Excitarea poate fi efectuată cu ajutorul unei radiații cu o compoziție spectrală cunoscută, în particular, cu ajutorul unei radiatii monocromatice. După întreruperea excitației optice este măsurată emisia netermica a atomilor. Metodele care folosesc proprietățile fluorescente sunt deosebit de sensibile, deoarece sunt înregistrate modificări ale emisiei spectrale, chiar la concentrații extrem de mici ale substanței de investigat.

Figura 6. Mecanismul reacțiilor enzimatice cu substraturi fluorogene

Figure 6. Mechanism of enzymatic reactions in case of fluorogenic substrates

Metodele fluorimetrice de dozare a activității enzimatice se bazează pe utilizarea unor markeri fluorogeni legați în mod direct de evoluția reacției enzimatice [121].

Deși folosirea substraturilor fluorogene nu permite testarea directă a reacției enzimatice pe un anume substrat de interes, ele sunt deosebit de utile pentru detectarea claselor de enzime care prezintă anumite tipuri de reactivitate recurentă. Recent, s-a demonstrat eficiența folosirii bibliotecilor de substraturi fluorogene, ca mijloace analitice de caracterizare a tipurilor de reactivitate a anumitor enzime, mult superioare metodelor bazate pe utilizarea unor substraturi singulare.

Clasa substraturilor fluorogene include fluorogeni de tip FRET (fluorescence resonance energy transfer), în care scindarea unei legături interne sau izomerizarea intramoleculară modifică energia de transfer specifică interacțiunilor dintre perechile de electroni din porțiunea fluorescentă a substratului. Cele mai multe substraturi fluorogene sunt compuși cu structuri ce conțin grupe funcționale din care se poate elibera grupa fenol acidă sau grupa anilină. Exemple tipice de astfel de substraturi sunt nitrofenil-esterii și umbelliferil-esterii folosiți pentru testarea lipazelor. Datorită reactivității superioare a esterilor proveniți de la alcooli aromatici, aceste substraturi sunt mult mai reactive decât substraturile sintetice conținând grupe ester provenite de la alcooli alifatici.

Ca urmare, acești derivați fluorogenici au tendința de a reacționa foarte repede și nespecific, ceea ce nu îi recomandă în cazul unor condiții drastice de screening, cum ar fi cele aplicate pentru testarea extractelor impure sau a celor în care se folosesc valori mari de temperatură sau pH-uri extreme. Datorită acestor particularități, astfel de substraturi pot fi folosite pentru izolarea biocatalizatorilor incapabili de a transforma anumite substraturi sintetice mai puțin reactive, dar care prezintă interes practic.

Nitrofenil-esterii acizilor carboxilici pot fi folosiți pentru detectarea activității lipazelor și prin metode colorimetrice, întrucât prin hidroliza acestora se formează nitrofenolul, compus de culoare galbenă. Dezavantajul substraturilor nitrofenilesterice constă în faptul că ele pot reacționa chiar și cu enzima denaturată sau cu fragmente non-catalitice ale acesteia și pot hidroliza și spontan, neenzimatic, prin încălzire sau în mediu ușor alcalin. În ultimul timp s-au realizat progrese semnificatice în proiectarea de noi tipuri de substraturi fluorogene și cromogene, care prezintă grupe funcționale inactive față de reactanții neenzimatici și astfel pot fi utilizate pentru determinarea riguroasă a activității enzimatice.

Recent, Verger și colaboratorii [122] au semnalat existența unui triacilglicerol cu catenă lungă care se găsește în Parinari glaberrimum și poate fi utilizat ca substrat fluorogen pentru lipaze. Întrucât acest substrat este un compus natural, el este recunoscut cu ușurință de lipaze și permite o dozare extrem de sensibilă, chiar a unor cantități foarte mici de enzimă.

O soluție general valabilă [123] de utilizare a substraturilor fluorogene cu grupe funcționale inactive se bazează pe cuplarea reacțiilor enzimatice ce urmează a fi analizate cu o secvență de reacții secundare, secvență care are rolul de a transforma primul produs de reacție într-un compus fluorescent.

Hidroliza sub acțiunea lipazelor a substraturilor fluorogene trigliceridice, conduce la eliberarea unui acid gras conținând o grupă fluorescentă, cum este, de exemplu, acidul pirendecanoic sau a unui alcool aromatic flurescent.

În cazul unui substrat trigliceridic fluorogen ce conține grupa piren a cărei fluorescență este mascată intramolecular de grupa trinitrofenil, cum este 1-trinitrofenil-amino-dodecanoil-2-pirendecanoil-3-0-hexadecil-sn-glicerolul [123], acțiunea lipazelor determină scindarea radicalului trinitrofenil și eliberarea grupei piren fluorescente.

Creșterea intensității fluorescenței la 370C este proporțională cu activitatea lipazei. Substratul sus-menționat nu poate fi hidrolizat de alte esterase sau de fosfolipaza A2.

CAPITOLUL 4. FITOTERAPIA – cea mai curată și mai naturală știință aplicativă

4.1. Noțiuni generale privind terapia cu ajutorul plantelor

Existența omului, încă din preistorie, a fost legată cel mai mult de lumea vegetală, care i-a furnizat acestuia hrană, combustibil și medicamente. Astfel, nu este de mirare că omul, încă din perioada ancestrală a existenței sale, a apelat prima dată la plante, în scopul alinării suferințelor. Natura ca aliat al omului, i-a oferit din grădina sa, primele leacuri încă din zorii existenței sale, născându-se astfel: fitoterapia.

Fitoterapia (phyton = plantă + therapea = tratament) este o știință străveche, care folosește plantele medicinale, numite și oficinale, în scopul vindecării. Odată cu descoperirile științifice ale secolului XX, fitoterapia a ieșit din empirism, punându-se bazele terapeuticii cu plante pe baze științifice, luându-se în studiu principiile active din vegetale. Nu mică le-a fost însă mirarea cercetătorilor, când pe baza analizelor chimice și a testelor clinice, au confirmat în proporție de peste 80%, proprietățile farmacodinamice ale plantelor, întocmai cum erau prescrise de către intuitiva medicină populară [124].

Deși fitoterapia azi se bazează pe efectele curative ale unor compuși biologici prezenți în plante sau în alte organisme vegetale, substanțe care poartă denumirea de principii active, această veche știință a tămăduirii, își respectă regulile originare, valorificând materialul vegetal fără a extrage selectiv anumite substanțe sau principii din țesuturile plantelor, așa cum fac alte științe care valorifică vegetalele, ca farmaceutica sau aromaterapia. Din acest motiv, se poate spune, că fitoterapia a rămas cea mai curată și mai naturală dintre științe [125].

Principiile active din plantele medicinale se sintetizează la nivelul celulelor vegetale. Pentru ca aceste substanțe naturale, cu acțiune biologică asupra omului, să poată fi valorificate corespunzător de către organism, în diferite dereglaje și tulburări, ele trebuie să se regăsească în diferite forme fitoterapeutice (fitofarmaceutice).

Forme fitoterapeutice simple

 Cele mai simple forme fitofarmaceutice sunt acelea în care anumite părți ale plantelor se mestecă sau se consumă ca atare, fie crude, fie uscate și măcinate – sub formă de pulberi. Majoritatea plantelor medicinale care se folosesc în stare crudă, apar primăvara, fiind ușor de consumat prin frăgezimea lor. De cele mai multe ori, însă, fitoterapia recurge la extragerea, însă neselectivă, a principiilor active din plante prin diferite metode, obținându-se preparate numite extracte fitoterapeutice [126].

Extractele fitoterapeutice

Extractele  folosite în fitoterapie, sunt acele preparate obținute din plante medicinale, în care se regăsesc principiile active din organele vegetale, după ce acestea au părăsit materialul vegetal și s-au dizolvat în anumite medii (apă, alcool, ulei vegetal sau alte grăsimi, etc.). În cazul acestor preparate, plantele medicinale devin o materie primă care poartă denumirea de drog. Cele mai cunoscute preparate fitoterapeutice de acest fel, sunt extractele hidrice (infuzia, decoctul, maceratul, siropul) și extractele hidroalcoolice (tinctura). Extractele hidrice (apoase) sunt cunoscute sub denumirea uzuală de ceaiuri [126].

După ce timp de milenii, fitoterapia a fost singura furnizoare de „medicamente", dezvoltarea modernă explozivă din secolele XIX – XX a făcut din acest străvechi domeniu, o cenușăreasă a medicinii, o alternativă oferită de o rudă săracă. Uriașa amploare a medicamentelor de sinteză și marile promisiuni legate de ele, au aruncat fitoterapia într-un con de umbră. Însă natura are legile ei, iar marile succese ale farmaceuticii moderne, de necontestat, au fost presărate cu destule eșecuri, unele uriașe. Statisticile actuale arată că, în mod oficial, a patra cauză a decesului la om rezidă din administrarea produselor industriei farmaceutice.

4.2. Metode de extracție a unor componente cu acțiune lipolitică din surse vegetale

Extractele vegetale sunt preparate farmaceutice lichide, moi sau uscate, obținute prin extracția principiilor active din produsele vegetale cu diferiți solvenți, urmată de evapoararea parțială sau totală a solventului și aducerea masei reziduale sau a pulberii la concentrația sau la consistența prevăzută [127].

În funcție de consistența, extractele pot fi:

extracte fluide (lichide);

extracte moi (vâscoase), care conțin maxim 20% materii volatile;

extracte uscate (pulverizabile), care conțin maxim 5% materii volatile.

Extracte fluide sunt lichide limpezi, colorate, cu miros și gust caracteristice componentelor produsului vegetal din care au fost preparate. Acestea sunt miscibile cu solventul folosit la prepararea lor și se tulbură prin diluare cu apă. Extractele fluide, prin păstrare, pot forma un ușor sediment pe fundul recipientului [127].

Extractele moi sunt preparate vâscoase, semisolide, colorate, cu aspect uniform, întinse pe o lamă de sticlă nu trebuie să prezinte particule solide [127].

Extractele uscate se prezintă sub formă de pulberi higroscopice, cu aspect uniform, sub formă de lamele sau de masă spongioasă care se pulverizează ușor [127].

Prepararea extractelor vegetale se face prin macerare, macerare repetată sau percolare cu diferiți solvenți: apă acidulată, apă alcalinizată, alcool etilic diluat, alcool acidulat, eter etc. Solventul folosit la extracție este, în general, alcoolul diluat, în unele cazuri acidulate [127].

Prepararea extractelor fluide:

1. Macerarea

Peste produsul vegetal, adus la gradul de marunțire prevăzut în monografia respectivă, se adaugă solventul sau amestecul de solvenți prevăzuti, într-un vas bine închis. Se mențin la temperatura camerei timp de 10 zile, agitând conținutul de 3-4 ori pe zi. Lichidul extractiv se separă și produsul vegetal se presează. Lichidele extractive reunite și omogenizate se lasă să sedimenteze timp de 6 zile, la 5-100C, dupa care se filtrează [128].

În cazul obținerii extractelor moi sau uscate, în continuare se procedează la aplicarea mai multor tratamente pentru îndepărtarea substanțelor de balast și concentrare prin distilare la presiune redusă, la o temperatură de maxim 500C, până la obținerea unei mase vâscoase cu un conținut de maxim 20% materii volatile.

În cazul extractelor uscate, după îndepărtarea solventului de extracție prin distilare, reziduul se usucă în vid, la o temperatură care să nu depașească 500C, până la obținerea extractului uscat [128].

Extractele fluide se mai pot prepara și prin dizolvarea extractelor uscate și aducerea la concentrația în principii active prevăzută.

2. Macerarea repetată

Peste produsul vegetal, adus la gradul de marunțire prevazut în monografia respectivă, se adaugă succesiv, părți egale din volumul total de solvent prevăzut, într-un vas bine închis. Se mențin la temperatura camerei, timp de 10 zile, agitând conținutul de 3-4 ori pe zi. Lichidul extractiv se separă și produsul vegetal se presează, după care se adaugă porțiunea următoare de solvent. Lichidele extractive reunite și omogenizate se lasă să sedimenteze timp de 6 zile, la 5-100C, după care se filtrează [128].

3. Percolarea

Produsul vegetal marunțit la gradul de diviziune prescris, se amestecă uniform cu o cantitate de solvent egală cu jumatate din greutatea sa și se lasă în repaus 3 ore, într-un vas bine închis. Se trece prin sita I și se introduce în percolator, presând usor, se adaugă treptat solvent, până când acesta începe să curga prin robinetul inferior deschis, iar deasupra amestecului se mai află un strat de 3-4 cm de lichid. Robinetul se închide, se lasă în repaus timp de 12-48 de ore, apoi se începe percolarea. Viteza de percolare trebuie astfel reglată încât în 24 de ore să se obțină 1,5 g soluție extractivă pentru fiecare gram de produs vegetal. Pe toată perioada extracției produsul vegetal trebuie să fie acoperit cu solvent. Percolarea se efectuează până când se obține masa de extract prevazută în monografia respectivă, se lasă în repaus la temperatura de 5-100C, timp de 6 zile ăi se filtrează [128].

Conservarea extractelor vegetale se realizează în recipiente din sticlă, de capacitate mică, bine închise și ferite de lumină, 8-150C.

4.3. Selecția materialului vegetal

Se consideră de către specialiștii din toate țările cu standard de viață ridicat și cu incidență mare a obezitatii și complicatiilor acesteia, că sunt necesare noi grupe de produse naturale, de suplimente nutritive, care să completeze, pe de o parte, carențele din hrana industrializată procesată, și pe de altă parte, să furnizeze preparate fitoterapice ce pot modela metabolismul lipidic menținându-l în limite biochimice și fiziologice normale [129].

Astfel, un loc important în prevenirea și tratamentul afecțiunilor cardiovasculare trebuie să il ocupe produsele naturale, fitoterapice complexe, cu puternic efect antioxidant, alături de alte fitoterapice cu proprietăți lipolitice și de intervenție favorabilă în reglarea metabolismului lipidic.

Pentru selectarea materialului vegetal se va ține seama de o mare varietate de factori fiziologici și biochimici ai metabolismului lipidic din organismul uman.

De asemenea, trebuie avut în vedere rolul esențial al unor enzime lipolitice (lipaze, lipoproteinlipaze, etc.)

Din punct de vedere medical, fiziologic, trebuie luați în considerare și multipli factori care influențează mecanismul declanșării producerii de grăsime și de depozitare în tesuturi. Exemplu: tiroida poate regla lipoliza prin încetinirea sau accelerarea arderii grăsimilor; pancreasul, prin intermediul insulinei, poate degrada zaharurile și evita transformarea lor în grăsimi; ficatul, prin secreția biliară asigură metabolizarea grăsimilor; hipotalamusul reglează sistemul glucostat diminuând sau crescând senzația de foame și de sațietate; glandele sexuale (ovare, testicule) intervin prin reducerea producției de hormoni, etc.

Ținând seama de extrem de marea varietate de factori ce intervin în metabolismul general lipidic, este necesar să se realizeze mai multe produse al căror tropism sa acopere această largă arie, sau un produs de mare complexitate cu sferă largă de acțiune.

Plecând de la complexitatea factorilor ce intervin în instalarea dezechilibrului metabolic al grăsimilor și de aici la consecințele patologice grave care succed, sunt prezentate două grupe mari de plante ăi de extracte ale acestora, pentru realizarea de noi produse fitoterapice cu acțiune lipolitică și de reglare metabolică, pentru reducerea riscului de boli cardiace și de obezitate.

Prima grupa este reprezentată de fitoextracte din plante medicinale mature, multe dintre ele fiind cunoscute individual pentru efectele lor benefice în tratamentul bolilor cardiovasculare sau în obezitate, iar a doua grupă este reprezentată de gemoderivate – o clasa nouă de complexe fitoterapice extrase în anumite condiții din cele mai tinere organe ale plantelor.

4.3.1. Extracte vegetale din plante și semințe mature

1. Uleiul din germeni de porumb

Uleiul din germeni de porumb obținut prin presare la rece – pentru a conserva toate componentele sale biologic active – este folosit în afecțiuni cardiovasculare. Acest ulei, folosit și în alimentația dietetică, are o compoziție total diferită de cea a altor uleiuri comestibile, ceea ce il face deosebit de util în tratamentul și prevenirea bolilor cardiovasculare, a obezității, a diabetului și a hipercolesterolemiei, cu toate consecințele sale negative asupra sănătătii.

Compoziția acestui ulei se impune prin conținutul ridicat de acizi grași esențiali, peste 50% (acid linoleic si acid linolenic), cu rol antioxidant, blocând radicalii liberi care determină apariția bolilor cardiovasculare și a arteriopatiilor, ca și depunerea defectuoasă a grăsimilor în țesuturi [130].

Conține, de asemenea, vitamine liposolubile (A, D, E) și oligominerale, necesare funcțiilor enzimatice din metabolismul general și în special lipidic.

Uleiul este în cantitate mică în germenii de porumb, dar valoarea produsului justifică prepararea lui la scară industrială.

Ca exemplificare, se poate menționa că pentru obținerea a 100 g ulei din germeni de porumb sunt necesari aproape 100000 de germeni recoltați și prelucrați proaspeți [131].

Pe plan mondial se recomandă în alimentația suferinzilor de ateroscleroză, de hipercolesterolemie, obezitate, constipatie și tulburari de circulație periferică.

2. Extractul din fructe de cătină (Hyppophae rhamnoides)

Fructul de cătină, ca și uleiul de cătină extras prin diferite tehnologii din fructele coapte, este mult studiat și folosit la noi în țară.

Fitoterapia modernă are meritul de a fi studiat în detaliu compoziția fructelor de cătină ca și a altor părti ale acestei plantei, evidențiind numeroși și importanți compuși chimici, care justifică calitățile fructelor de cătină.

Din bogația compusilor existenți în fructele de cătină coapte, menționăm [131]:

400-1.500 mg% vitamina C;

carotenoide (α- si β-caroten, criptoxantina, fizaliena, licopina, zeaxantina);

vitaminele B1, B2, PP, P (heterozide ale quercetolului, Kaempferolului si izoramnetolului)

acid folic;

provitamina D;

vitamina E;

proantociani;

12-14% lipide (gliceride ale acizilor palmitic, oleic, linolic, linolenic);

triterpene (acid ursolic si oleanolic);

catechol.

enzime (lipaza, amilaza, proteaza, peroxidaza, etc.);

aminoacizi esențiali liberi și legați;

minerale (Ca, P, Mg, K, Fe, Zn – în cantități mari), Na (de aproximatriv 100 x mai puțin decât Ca, Mg, P).

De importanță mare sunt și flavonoidele prezente în fructele de cătină (ramnitina si izoramnitina, naringina si naringenina, etc.), cu remarcabile efecte antiinflamatoare și chiar antitumorale. La fel de numeroși sunt și acizii polifenolcarboxilici, care contribuie la efectul antioxidant ridicat al componentelor din fructul de cătină.

Prezența acizilor amirinici și a derivaților acestora, care se găsesc în partea liposolubilă din fructul de cătină, conferă cătinei calități imunomodulatoare și imunostimulatoare, care sunt sensibil potențate de celelalte trofine prezente.

Datorită numeroaselor grupe de substanțe biologic active care actionează simultan prin însumarea și completarea efectelor terapeutice, cătină sub forma dată, este ca atare, un produs destinat tratării multiplelor afecțiuni generate de dereglarea metabolismului lipidic, de la bolile cardiovasculare la obezitate și boli de circulatorii, la boli hepatice și renale, la diabet și la refacerea organismului, în stari de convalescență sau de surmenaj și pentru protejarea organismului în timpul tratamentelor de durată cu citostatice sau antibiotice ori cu alte chimioterapice steroidice sau nesteroidice – cum sunt antiinflamatoarele de sinteză, regenerând și stimulând capacitatea de apărare proprie a organismului.

Pe baza celor mai recente informații din literatură, această materie primă vegetală va fi una din cele selectate pentru realizarea unui supliment nutritiv sau alt produs fitoterapic cu acțiune largă lipolitică, indicat în prevenirea, ameliorarea și tratarea numeroaselor boli generate de dereglarea metabolismului lipidic [130, 132].

3. Extractul de usturoi (Allium Sativum)

Este bine cunoscut, din cele mai vechi timpuri, pentru multiplele efecte benefice asupra sănătății printre care și folosirea lui în bolile de inima.

Este recomandat în peste 50 de afecțiuni și este cultivat pe toate meridianele lumii.

Are o compoziție chimică foarte complexă, acoperind toate grupele de substante fitochimice utile pentru sănătate.

Pentru afecțiunile cardiovasculare, ca și pentru obezitate sunt de menționat [131]:

enzime: invertaza, ribonucleaza, polifructozidaza, aliinliaza, lipaze;

0,04% saponazide: protodesgalactotigonozida, F-gitonozida, sativozidele B1, R1 si R2, erubozida);

triterpene: heterozide ale acidului oleanolic;

scordinina A1: glucosinolat cu structură complexă alcătuit din alilmercaptan, acid fructuronic și o tripeptidă;

23-27% glucide simple: glucoza, fructoza, maltoza, rafinoza, zaharoza;

fructani: sinistrina;

6-7% protide;

adenozina;

0,1-0,2% lipide: gliceride ale acizilor caproic, lauric, miristic, palmitic, stearic, oleic, linolic, linolenic;

0,10% fitosteroli: sitosterol, campesterol, stigmasterol, colesterol;

acizi organici: citric, malic, oxalic, piruvic, succinic, glucuronic;

vitamine: A, B1, B2, C, E, PP;

saruri minerale: potasiu, fosfor, calciu, magneziu, sodiu, clor, fier, cupru, siliciu, mangan, seleniu, cadmiu.

Constituentul principal al bulbului proaspăt de usturoi, nesfărâmat, este aliina sau S-alil-L-(+)-cistein-sulfoxid. Prin zdrobirea bulbului proaspăt, sub influența S-alkil-L(+)-cistein-sulfoxid-liaza (aliinaza) rezultă mai mulți compuși volatili, practic artefacte, dintre care dialil disulfidul (alicina) este preponderent (80-90%), în timp ce dialil-trisulfidul reprezintăa doar 20%. Analiza HPLC a distilatului obținut la presiune scăzută și temperatura mediului, a evidențiat pe langă alicina și prezența tiosulfinatilor cu structura generală R-S(O)S-R’.

Acțiunile terapeutice ale usturoiului (prin compusii lui biologic activi) sunt următoarele [124, 133]:

antibacterian și antifungic (prin tioderivați);

hipocolesterolemiant (prin reducerea absorbției colesterolului și lipidelor de către sinistrină și prin acțiunea hidrolitică a lipazei);

hipoglicemiant (prin reducerea absorbției de glucoză de către sinistrină și alte poliholozide);

antihipertensiv;

antiagregant plachetar (datorită ajoenilor, inhibitori ai lipoxigenazei);

fibrinolitică;

antioxidantă (datorită seleniului care, în calitate de constituent al glutationperoxidazei, catalizează degradarea peroxizilor rezultați din acțiunea radicalilor liberi oxigenati);

tireostimulantă;

citostatică (prin tioderivați).

Ionii de calciu din compușii organici, prezenți în cantitate relativ mare și aici ca și în fructul de cătină, stimulează lipaza pancreatică.

Ansamblul fitochimic din usturoi prezintă și proprietăți antiinflamatoare, imunostimulatoare și antiseptice asupra multor tulpini de germeni patogeni inclusiv asupra Mycobacterium tuberculosis și a unor paraziți intestinali [134].

Se consideră că un asemenea extract trebuie luat în considerare pentru preparatele lipolitice preconizate a fi obtinute, pentru ca intrevine direct la nivel hepatic in reglarea metabolismului lipidic si in deblocarea canalului fiziologic principal pentru degradarea lipidelor [134].

4. Extractul de anghinara (Cynara scolimus)

Este printre plantele medicinale mult folosite înca din antichitate, în special pentru afectiunile hepatobiliare ăi anume pentru proprietatea de drenare a bilei.

Compoziția chimică cunoscută a anghinarei este următoarea [131]:

1-2% polifenoli (derivați cafeoil-chinici);

0,10-0,50% flavone (cinarotriozida, scolimozida, cinarozida);

principii amare azulenogene (lactucerol, taraxasterol);

steroli;

un sapogenol steroidic;

tanin;

mucilagii;

pectine;

aminoacizi;

glucide;

acizi organici;

enzime (labenzima = cheag vegetal).

Dupa numarul moleculelor de acid cafeic care esterifică acidul chinic, se cunosc esteri monocafeoil chinici și dicafeoil chinici. Din totalul derivaților o-dihidroxifenolici, 40% îl reprezintă acidul clorogenic (acid 3-cafeoil chinic). Acesta este însotit de izomerii săi denumiți acid criptoclorogenic (acid 1-cafeoil chinic), acid neoclorogenic (acid 4-cafeoil chinic), acid izoclorogenic (acid 5- cafeoil chinic).

Dintre esterii dicafeoil chinici, cinarina (acid 1,5- cafeoil chinic) rezultă în timpul extracției polifenolilor cu apă, la cald, în cantitate de 0,10-0,20%. Izomerul sau (acid 1,3- cafeoil chinic) reprezintă 30% din totalul ODP-urilor și este capabil să treacă în cinarina, sub influența căldurii, la pH alcalin. După poziția hidroxililor acidului chinic, seterificati cu acid cafeic, în produs se mai pot întălni și alti izomeri, ca de exemplu: acidul 1,4- cafeoil chinic, acid 3,4- cafeoil chinic, acid 3,5- cafeoil chinic, acid 4,5- cafeoil chinic.

Din grupul flavonozidelor au fost izolate și identificate: 7-rutinozida-4’-glucozida luteolului (cinarotriozida); 7-rutinozida-luteolului (scolimozida) si 7-glucozida luteolului (cinarozida).

Acțiunile terapeutice ale anghinarei sunt date de substanțele biologic active din plantă.

Prezintă acțiune coleretică, este hepatoprotectoare (datorită derivaților cefeici); tonic amară (cinaropicrina și derivați); scade concentrația lipidelor totale și a colesterolului din ser (cinarina) fiind un inhibitor al lipolizei de tip acid nicotinic (fără efectele secundare ale acestuia); diuretică (prin flavone); antialergică prin inhibarea complementului seric (cinarina); febrifuga; bacteriostatică făță de Salmonella, Staphylococus su Proteus.

Este întrebuințată în insuficiențe hepatice și renale, alergii pe fond hepatic, hipercolesterolemie și hiperlipidemie, obezitate, ateroscleroză, reumatism.

5. Extractul de paducel (Crataegus oxycantha)

Plantă originară din Europa și Irlanda, păducelul este un antioxidant folosit pe bătrânul continent de sute de ani ca remediu naturist pentru tratarea bolilor de inimă.

Compoziția chimică este foarte bogată. În părțile înflorite cu frunze se află acidul crategic care este de fapt un complex format din compuși triterpenici: acid crategolic, neotegolic și acantolic; acid ursolic și oleanolic; derivați de natură flavonoidică: hiperozidul, un ramnozid al vitexinei, leucoantocianidină, un heptaoxiflavonbiozid cu acțiune cardiotonică, cvercetină, acid clorogenic, acid cafeic, amigdalină, colină, sorbitol, vitamina C; amine: trimetilamina și amilamina; ulei volatil ce conține aldehidă anisică; taninuri de natură catehică, pectine, săruri minerale etc. Fructele conțin taninuri de natură catehică, vitaminele B și C, antociani, flavonoizi, acizi tartric, citric, ursolic, oxalic, nicotinic, clorogenic, sorbitol, colină, acetiloolină, glucoza, fructoză, pectine, ceară, ulei gras, substanțe minerale. Semințele nu conțin principii active [135].

La fel de complexe ca și compoziția chimică, produsele farmaceutice din frunzele, florile și fructele de păducel acționează sinergic asupra aparatului cardiovascular și asupra sistemului nervos central. Substanțele chimice din plantă acționează direct asupra muschiului cardiac, mărind sau scăzând puterea și rata bătăilor inimii, și asupra vaselor de sânge, relaxând arterele sangvine din jurul cordului; de asemenea, păducelul acționeaza indirect, lărgind vasele de sânge aflate aproape de suprafața pielii, scăzând presiunea arterială. Efectele simpaticolitice, hipotensive arteriale, vasodilatatoare în special asupra coronarelor și acțiunea sedativă asupra sistemului nervos central a acestor specii au fost demonstrate de majoritatea cercetătorilor prin experimentări pe animale de laborator și au fost aplicate clinic cu bune rezultate [134].

Păducelul este cunoscut și pentru efectele sale calmante, fiind folosit în tratarea anxietatii și a insomniei (deși nu a fost realizat nici un studiu în acest sens). Un alt beneficiu al acestei plante este faptul că scade nivelul colesterolului [133].

6. Armurariul (Sylibum marianum) este o specie de origine mediteraneană care crește și necultivată în Europa Meridională, Africa Septentrională și Asia de Est.

Compoziția chimică cunoscută a acestei plante este:

1,5-3% flavanonol lignani;

flavonoli (quercetol);

flavononoli (taxifolina).

Amestecul acestor constituenți este cunoscut sub numele de silimarină. Constituentul majoritar al amestecului este silibina (cu structură lactonică) și silicristina (cu structura dihidrobenzofuranică), 3-desoxiizosilibina (silimonina) si 3-desoxisilidianina (silandrina), precum și 20-30% lipide, proteine, oze [126].

Acțiunea acestei plante este: antihepatotoxică și hepatoregeneratoare (constituenții silimarinei), inhibă peroxidarea lipidelor având astfel un efect stabilizator de membrană.

Cele mai frecvente întrebuințări ale armurariului sunt în hepatite cronice evolutive, hepatite virale, hepatite etilice, ciroza hepatică. Se asociază preventiv cu medicamente ce prezintă un potențial hepatotoxic.

În cadrul prezentei teze, se vor studia plante medicinale și aromatice și extracte de plante obținute în diferite conditii tehnologice pentru favorizarea extracției cu precădere a acelor grupe de substanțe și structuri fitochimice care să satisfacă în măsura cât mai mare cerințele de realizare a temei.

Așa cum a fost menționat anterior, afectiunile generale datorate diferitelor grade de dislipidemii sunt de o extrem de mare complexitate, la care participă și factori ereditari, alături de modul de nutriție, de stilul viată-stres, etc., de sedentarism, de consumul prelungit de medicamente de sinteză (antibiotice, anticancerigene, antiinflamatoare nesteroidice sau steroidice), anticonceptionale, droguri, consum exagerat de alcool sau de tutun.

Toate acestea sunt situații concrete de care trebuie să tinem seama în cercetarea și elaborarea de produse cu acțiune „lipolitică” într-un context foarte amplu.

4.3.2. Gemoderivate

Gemoderivatele sunt extracte din țesuturi vegetale tinere, în creștere (muguri, boboci, semințe germinate, mlădițe, radicele). Inițiată în anul 1950 de către medicul belgian Pol Henry, a prins teren de folosire largă în Europa, abia în ultimele decenii, deși în medicina indiană și chineză se practică de milenii folosirea mugurilor din plante pentru diferite tratamente [136].

Mediul de extracție (glicerina-alcool-apă, în anumite rapoarte) prin macerare de lungă durată, lentă, asigură o compoziție a extactelor de mare valoare terapeutică (enzime, vitamine, acizi grași esențiali, acizi aminați esențiali, microelemnte, glucide foarte variate, structuri terpenice, steroidice, etc.), care își păstrează proprietățile active pentru o lungă perioadă de timp.

Multe dintre aceste extracte au proprietăți de revigorare a organismului, de îndepărtare a oboselii, de activare a funcțiilor de eliminare a toxinelor, de reglare a metabolismului lipidic, astfel încât normalizează o serie de parametri biologici (hemoleucograma, indicatorii imunologici, aspectul electroforetic al lipidelor și proteinelor, etc.) prin stimularea sistemului reticulo-endotelial și a funcțiilor drenoare.

Un exemplu edificator este experimentul efectuat pe șoareci albi cărora li s-a injectat suspensie de carbon coloidal, după care au căpătat culoare gri. În urma injectării sau a administrarii orale a unui extract de muguri de mesteacăn, care are capacitate mare de epurare a sângelui, șoarecii s-au albit din nou în scurt timp.

Dintre extractele de tip gemoderivate, indicate pentru cercetarile specifice de laborator, pot fi menționate:

1. Extractul gemoderivat de jugastru (Acer campestre)

Acționează asupra arterelor sanguine prin îndepartarea depozitului de colesterol, intervine favorabil în metabolismul lipidic și glucidic, normalizând valorile lipoproteinelor și ale colesterolului, având și o ușoară acțiune anticoagulantă. Este și un bun drenor al căilor biliare favorizând emulsionarea și metabolizarea normală a grăsimilor [136].

2. Extractul gemoderivat de sânger (Cornus sanguinea)

Are proprietăți coronarodilatatoare acționând benefic asupra miocardului, reglează metabolismul tiroidei favorizând arderea grăsimilor, actionează și ca antiagregant plachetar, diminuând depunerile de lipide pe pereții vaselor de sânge.

3. Extractul gemoderivat de orz (Hordeum vulgare)

Acționează favorabil în dislipidemii, în obezitate, în steatoza hepatică (reducerea depozitului de grăsime din ficat). Intervine prin acțiunea puternic antioxidantă în metabolismul lipidic protejând distrugerea pereților celulari ca și regenerarea acestora prin mecanismul radicalilor liberi. Reduce obezitatea și diabetul prin același efect antioxidant.

4. Extractul gemoderivat de dud negru (Murus nigra)

Este un important antidiabetic. Intervine atât în metabolismul proteic, cât și în metabolismul lipidic și glucidic. Reduce lipidemia și colesterolul semnificativ, fiind în același timp indicat în tratamentul obezității.

5. Extractul gemoderivat de rozmarin (Rosmarinus officinalis)

Este un excelent drenor al secreției biliare favorizând degradarea lipidelor și stopând depozitarea lor, normalizează lipoproteinele și colesterolul total și esterificat. Se foloseste cu succes în afecțiuni cardiovasculare, insuficiență circulatorie cerebrală și periferică, arteroscleroză și în hipertensiunea arterială.

6. Extract gemoderivat de afin (Vaccinium myrtillus)

Este un puternic antioxidant și protector al perețtilor vasculari prin protejarea lipidelor de construcție celulară, reduce stările de fragilitate și alterare a permeabilității vasculare, este un bun drenor pancreatic și hipoglicemiant, uricozuric, antiedematos și antiinflamator asupra vaselor sanguine și asupra mucoaselor intestinale. Prin mecanisme antioxidante dă rezultate bune și în tulburări de vedere. Intervine pozitiv în reducerea obezitătii prin efectul antioxidant și depurativ.

7. Extractul gemoderivat de porumb (Zea mays)

Are tropism asupra inimii și a arterelor coronare. De asemenea în afecțiunile degenerative hepatice normalizează valorile transaminazei glutamatoxalacetică (GOT). Are eficiență reparatorie a țesutului miocardic în faza de post-infarct și în miocardo-angio-scleroză.

Partea II – CERCETĂRI EXPERIMENTALE

Din analiza critică a datelor de literatură au reieșit urmatoarele aspecte esențiale pentru cercetările experimentale referitoare la obținerea lipazelor din surse microbiene și plante medicinale:

obținerea lipazelor extracelulare depinde atât de tulpina utilizată cât și de compoziția mediului de fermentație și de condițiile de cultivare;

activitatea și stabilitatea enzimatică a produsului de biosinteză depinde de metodele de izolare și purificare a enzimelor microbiene din mediul de fermentație;

plantele reprezintă surse importante de enzime și numeroase principii active cu rol important în reglarea metabolismului lipidic.

Obiectivul principal al cercetărilor realizate în cadrul acestei teze de doctorat a constat în obținerea unor biopreparate cu activitate lipolitică, stabile din punct de vedere fizico-chimic, alcătuite din lipază obținută din surse microbiene și preparate de origine vegetală, care se adresează unui segment al populației din ce în ce mai numeros, cu afecțiuni complexe, generate de dezechilibrul lipidic din organism.

Pentru realizarea obiectivului urmărit, cercetările experimentale efectuate în cadrul acestei teze de doctorat s-au orientat către urmatoarele direcții principale:

selecția microorganismelor potențial producătoare de lipaze;

îmbunătațirea capacității de biosinteză a tulpinii selecționate;

studiul influenței compoziției mediului de fermentație, sub aspect calitativ și cantitativ, asupra potențialului bioproductiv al microorganismelor selectate;

studiul condițiilor de cultivare (temperatură, pH, aerare, durată);

alegerea metodelor optime de izolare și purificare a enzimelor din mediul de biosinteza în condiții reproductibile și într-un grad de puritate cât mai avansat;

caracterizarea biochimică a preparatelor enzimatice izolate din mediile de fermentație;

studiul stabilității activității enzimatice a lipazelor obținute prin biosinteză;

selectarea unor materiale vegetale cu conținut ridicat în enzime lipolitice și principii bioactive;

caracterizarea biochimică a extractelor obținute din materialele vegetale;

studiul posibilităților de asociere a lipazei microbiene, cu lipaze de origine vegetală în vederea formulării unor forme farmaceutice solide;

caracterizarea sumară a comprimatelor obținute prin asocierea lipazei microbiene cu materiale vegetale, bogate în numeroase principii bioactive.

CAPITOLUL 5. CERCETĂRI PRIVIND SELECȚIA MICROORGANISMELOR PRODUCĂTOARE DE LIPAZĂ ȘI ÎMBUNĂTĂȚIREA CAPACITĂȚII DE BIOSINTEZĂ A ACESTORA

Obiectivele specifice urmărite în cadrul acestui capitol au fost următoarele:

selecția microorganismelor potențial producătoare de lipaze;

îmbunătățirea capacității de biosinteză a tulpinii selecționate.

5.1. Materiale și metode

5.1.1. Microorganisme testate

În cadrul cercetărilor privind selecția microorganismelor potențial producătoare de lipaze s-au utilizat tulpini microbiene provenite din Colecția de Microorganisme a Facultății de Biotehnologii, din cadrul Universității de Științe Agronomice și Medicină-Veterinară, Bucuresti (tabelul 3).

Tabelul 3. Tulpini utilizate pentru selecția microorganismelor producătoare de lipază

Table 3. Selection of microorganisms potentially capable to produce lipase

5.1.2. Medii de cultură

Mediile de cultură utilizate în cadrul experimențelor desfățurate în acest capitol au avut următoarele compoziții (% g/v):

Mediu geloza (pentru bacterii):

Mediu YPG (pentru drojdii):

Mediul Sabouraud (pentru fungi):

5.1.3. Evidențierea potențialului lipolitic

Capacitatea tulpinilor microbiene de a biosintetiza lipaze s-a realizat printr-o metodă microbiologică calitativă. Metoda constă în dezvoltarea tulpinilor potențial producătoare de lipaze pe mediu specific solid, în prezența Tween 80, adăugat în mediul de cultură alături de CaCl2.

Tehnica de lucru constă în însămânțarea tip „gazon” a microorganismelor pe mediu solid, repartizat în plăci Petri, prin metoda diluțiilor zecimale, însămânțarea făcându-se în cazul bacteriilor din dilutia 10-7 și 10-6 pentru fungi și drojdii. Incubarea s-a realizat diferențiat, la 280C, pentru drojdii si 370C, pentru bacterii.

Dupa incubarea timp de 48 de ore pentru bacterii, 3 – 4 zile pentru drojdii și 7 zile pentru fungi, tulpinile care produc enzime lipolitice vor prezenta în jurul lor zone de opacitate de diferite diametre. Aceste zone sunt alcătuite din cristale de săpun de calciu formate în urma acțiunii enzimelor lipolitice asupra Tween-ului, în prezența CaCl2 [137].

Pentru fiecare tulpină microbiană s-a determinat indicele lipolitic al coloniei și indicelui lipolitic mediu, prin măsurarea diametrele zonelor de opacitate ale coloniilor apărute.

De asemenea, viabilitatea fiecărei tulpini microbiene cultivată pe mediul cu Tween 80 s-a determinat prin calculul unităților formatoare de colonii (UFC).

Tulpinile microbiene testate au fost încadrate, în funcție de capacitatea lor de biosinteza enzime lipolitice, în mai următoarele categorii:

bune producătoare;

moderat producătoare;

slab producătoare;

neproducătoare.

Pentru fiecare tulpină microbiană s-a calculat:

indicele lipolitic = raportul dintre diametrul zonei de opacitate și diametrul coloniei, exprimat în mm;

indicele lipolitic mediu = media aritmetică a indicilor lipolitici calculată pentru 3 sau 5 colonii microbiene ce aparțin unei singure specii microbiene;

UFC (unități formatoare de colonii).

5.1.4. Inducerea mutagenezei folosind radiații UV

Tehnica de lucru:

Pentru studiile de mutageneza s-a preparat un inocul în vârstă de 24 h, prin cultivare pe medii specifice lichide. Inoculul a fost folosit pentru obținerea diluțiilor zecimale (până la diluții de 10-5 si 10-6).

Obținerea martorului: inoculul a fost diluat, iar din diluția 10-6 s-au prelevat 0,1 ml care s-au folosit pentru însămânțarea a trei plăci Petri cu mediu specific și Tween 80. Aceastea s-au incubat la temperatura optimă, timp de 48 de ore, 3-4 zile sau 7 zile, în funție de tipul microorganismului. După incubare, s-au numărat coloniile apărute, s-a măsurat diametrul lor, s-a stabilit numărul de celule/ml și s-a calculat valoarea indicelui lipolitic mediu.

Obținerea probei: din diluția 10-5 s-au însămânțat câte 15 plăci cu mediul specific și Tween 80, cu câte 0,1 ml inocul. Plăcile au fost grupate câte trei, iar fiecare grupă de plăci a fost supusă radiatiilor UV, pentru perioade diferite de timp: 20, 40, 60, 80, 120 secunde. După incubare, s-a determinat numarul de celule din fiecare placă, pentru a calcula numărul de celule/ml probă și diametrul zonelor de hidroliză ale coloniilor mutante. Pentru fiecare doză de agent mutagen s-a stabilit indicele lipolitic mediu și indicele pentru fiecare colonie mutantă apărută.

S-a determinat viabilitatea (%), curba de supraviețuire și doza letală pentru mutageneza cu radiații UV.

Viabilitatea s-a calculat cu jutorul următoarei formule:

V (%) = P/M x 100

unde: P = număr de celule/ml din proba expusă la acțiunea radiatiilor UV (exprimate in UFC/ml);

M = număr de celule/ml din martor (exprimate in UFC/ml).

Numărul de celule/ml (exprimat în UFC) se calculează astfel: media aritmetică a numărului de colonii apărute pe cele trei plăci Petri x inversul diluției x 10.

5.1.5. Determinarea numărului de celule viabile prin metoda diluțiilor successive

Principiul metodei

Fiecare colonie care se dezvoltă după incubare, la o temperatură adecvată, are ca punct de plecare o singură celulă. Toate coloniile izolate pot fi folosite ca inocul, pot fi studiate ca formă, culoare, dimensiune, textură și pot fi numărate colonii aparținând mai multor specii deodată. Unul dintre dezavantajele acestei metode este că, în unele cazuri, coloniile izolate pot fi inițiate nu de o singură celulă, ci de aglomerări de celule. Rezultatele obținute diferă în funcție de natura mediului de cultură și de durata de incubație [138].

Tehnica de lucru

Determinarea numărului de microorganisme se face din fiecare probă prelevată. Pentru probele luate la intervalele de 0, 4, 8 ore, se vor face diluții în ser fiziologic steril, de până la 10-3, iar pentru probele luate după un timp mai lung de incubare se vor face diluții mai mari (10-6 – 10-7) [138].

Pentru diluția I (10-1), se procedează astfel: 1 ml probă se introduce în 9 ml ser fiziologic. Pentru diluția II (10-2), se ia 1 ml din diluția I și se introduce în altă eprubetă cu 9 ml ser fiziologic. Pentru diluțiile 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, se procedează în mod similar. Fiecare diluție se omogenizează bine și se însământează pe trei plăci Petri cu mediu solid agarizat, câte 0,1 ml/placă. Suspensia se dispersează steril, pe o masă rotativă cu ajutorul unei baghete de sticlă sterilă. Plăcile Petri se incubează timp de 24 – 48 de ore, la temperatura optima dezvoltarii microorganismului testat.

Toate plăcile se notează mentionând următoarele: denumirea mediului, a microorganismului, ora de dezvoltare, diluția, data.

La sfârșitul perioadei de incubare se numără coloniile dezvoltate pentru fiecare diluție în parte și se calculează numărul de microorganisme din mediu, pentru fiecare diluție:

UFC = n / D x 10

unde: UFC = unități formatoare de colonii/ml;

n = numărul de colonii;

D = diluția;

10 = factor pentru a raporta la 1 ml [138].

5.2. Rezultate și discuții

În urma selecției efectuate asupra tulpinilor supuse testării, s-a evidențiat, pentru capacitatea de a biosinteza lipaze, tulpina Yarrowia lipolytica, din Colecția de Microorganisme a Facultății de Biotehnologii.

5.2.1. Selecția microorganismelor potențial producătoare de lipaze

Pentru selecția microorganismelor care manifestă potențial de biosinteză al lipazelor, s-au obtinut următoarele rezultate [139]:

Tabelul 4. Selecția tulpinilor microbiene potențial producătoare de lipaze

Table 4. Selection of microorganisms potentially capable to produce lipase

Din analiza datelor prezentate în tabelul anterior a reieșit că tulpina de Yarrowia lipolytica, cultivată pe mediu YPG cu Tween 80, a prezentat cel mai mare indice lipolitic mediu 1,19.

Tulpina levuriană Hansenula anomala s-a dovedit, de asemenea, a fi o destul de bună producătoare de enzime lipolitice, în timp ce restul microorganismelor testate au dat fie rezultate satisfăcătoare, fie s-au au dovedit a fi slab producătoare de lipaze, fie neproducătoare (Serratia marcescens, Saccharomyces carlsbergensis).

Astfel, s-a decis ca experimente ulterioare, privind obținerea lipazelor din surse microbiene să se defasoare folosind tulpina Yarrowia lipolytica.

5.2.2. Yarrowia lipolytica – o drojdie „neconvențională” producătoare de lipază

5.2.2.1. Caracteristici microscopice și macroscopice

Yarrowia lipolytica a fost izolată pentru prima dată de către Jacobson [22], în Olanda, din margarina alterată. În urma efectuării unor studii cu privire la acțiunea lipolitică a acesteia, Jacobson o numește Torula lipolytica. Harrison [22], este însă primul care descrie acest microorganism în ceea ce priveste creșterea, dezvoltarea pe diferite medii de cultură (extract de malț, lapte, mediu agarizat), capacitatea de lichefiere și de fermentație a unor substraturi.

Până în prezent s-au studiat 12 tulpini ce aparțin acestei specii, acestea fiind izolate din margarină, masline și leziuni ale corneei și unghiilor. În urma acestor studii s-a ajuns la realizarea unei prezentări standard a acestui microorganism [10,140, 141].

La microscopul optic tulpina de Yarrowia lipolytica prezintă o structură caracteristică, fiind formată din celule tip drojdie și pseudomiceliu, de unde și încadrarea ca drojdie “neconvențională”. Celulele au în general forma rotundă (unele sunt ovale și alungite), iar printre ele există și celule mai mici, nealungite (figura 7) [48, 140, 141].

Dimensiunile celulelor variază între (2 – 4,5) x (4 – 22) , celulele mici putând măsura (2 – 4,5) x (4,8 – 5) , iar cele alungite ajungând chiar la (2 – 4,5) x (9,5 – 22) . Alături de celule se evidențiază și pseudomiceliul, sub forma unor hife alungite, ramificate (figura 8).

În cazul culturilor pe tuburi înclinate se poate observa dezvoltarea pseudomiceliului, acesta apărând fie sub formă de filamente ramificate neseptate, fie sub forma unor micelii subțiri, filamentoase, septate.

Din punct de vedere macroscopic [48], la cultivarea acestei tulpini pe medii cu extract de malț, după 3 zile la 250C sau o lună la 170C se observă un fenomen de sedimentare, care este mult mai pronunțat în al doilea caz; pelicula capătă un aspect compact devenind în același timp mai rezistentă.

După o lună la 170C, culturile prezintă un aspect gălbui, fiind în totalitate reticulate sau prezentând porțiuni netede ce alternează cu cele reticulate.

Tulpina de Yarrowia lipolytica a fost însămânțată și pe mediul de înreținere (YPG) folosind metoda de însămânțare tip „gazon” din ultima diluție (10-5) și au fost stabilite (după incubare la 250C, timp de 3 – 4 zile) caracterele de colonie [139].

Coloniile apărute după 3 zile se caracterizează prin:

formă rotundă;

celule mari;

contur intreag;

profil ridicat;

culoare albă, opacă;

suprafață rugoasă (unele), netedă la alte colonii (apare un fenomen de disociere);

consistență păstoasă;

adera la substrat

Conform datelor de literatură, Yarrowia lipolytica este o specie heterotalică ce prezintă două tipuri de împerechere A și B [101, 140]. Din fuziunea celulelor vegetative sau a sporilor A și B rezultă diploizi, care se reproduc vegetativ. În comparație cu Saccharomyces cerevisiae, celulele haploide de Yarrowia lipolytica cu tip de împerechere opus, fuzionează rar, iar majoritatea zigoților rezultați avortează. Prin sporularea diploizilor se formează asce ce conțin 1 – 4 ascospori, care prezintă o capacitate scăzută de germinare (>1%). Aceste trăsături negative pot fi remediate prin încrucișări repetate frate×soră până când 80 – 90% dintre asce conțin 4 ascospori, cu o capacitate de germinare de 90%.

Această tulpină a fost reclasificată prima dată în Endomycopsis lipolytica [22], apoi în Saccharomycopsis lipolytica și în final în Yarrowia lipolytica [22].

5.2.2.2. Dimorfismul la Yarrowia lipolytica

Tulpinile de tip sălbatic de Yarrowia lipolytica prezintă colonii de forme variate, netede și lucioase sau mate. Morfologia coloniilor este determinată de condițiile de dezvoltare (aerație, surse de carbon și azot, pH) și de fondul genetic al tulpinii.

Yarrowia lipolytica este un fung dimorfic natural – după unii cercetători, o drojdie – după alții, ale cărei celule se prezintă atât sub formă specifică drojdiilor, cât și sub formă de pseudohife și hife septate. Miceliul constă în hife septate de 3 – 5 μm. Celulele apicale ating adesea 100 μm, pe când articulațiile au 50 – 70 μm lungime [22].

Proporția diferitelor forme de celule depinde de tulpina utilizată, probabil în concordanță cu diferențele morfologice observate la nivelul coloniei.

Sunt cunoscute condițiile care determină preferențial forma celulelor de drojdie sau induce dezvoltarea miceliului. S-a observat că sursele de carbon, cum sunt uleiul de măsline, acidul oleic, oleil alcoolul, acidul linoleic și trioleina, împreună cu sursele de azot ca soia, cazeina din laptele de bovine sau extractul de carne induc puternic formarea hifelor la câteva tulpini de Yarrowia lipolytica. Dezvoltarea miceliului a fost inhibată prin deficiența în sulfat de Mg și clorură ferică sau adiția de cisteină sau glutation. S-a realizat inducerea completă și reproductibilă a miceliului de drojdie la tranziția tulpinilor în mediu minimal care conține N-acetilglucozamină ca unică sursă de carbon, dar acestea par a fi tulpini auxotrofe. Unele studii au dus la detectarea unor schimbări fiziologice operate pe durata tranziției drojdie – hifă. Comparând compoziția drojdiei și a celulelor hifale, s-a arătat că pereții hifali prezintă un conținut ridicat în aminoglucide și un conținut redus în proteină. Pe deasupra, activitatea ornitin decarboxilazică și cantitatea de poliamină celulară, măresc dezvoltarea celulelor hifale pe mediu cu N-acetilglucozamină.

5.2.3. Puritatea culturii de Yarrowia lipolytica

Cultura de Yarrowia lipolytica, utilizată ca material de însămânțare în fermentațiile la nivel de laborator, a fost examinată microscopic și macroscopic, confirmându-se caracteristicile menționate în literatura de specialitate pentru această specie.

La microscopul optic tulpina de Yarrowia lipolytica are structura caracteristică unui fung imperfect, fiind formată din celule și pseudomiceliu. Celulele au în general formă rotundă (unele sunt ovale și alungite), iar printre ele există și celule mai mici, nealungite. Dimensiunile celulelor variază, putând fi cuprinse între (2 – 4,5) x (4 – 22) . Alături de celule se evidențiază și pseudomiceliul, sub forma unor hife alungite, ramificate (figura 12).

Figura 12 . Celule de Yarrowia lipolytica văzute la microscopul electronic (90x)

Figure 12. Yarrowia lipolytica cells observed on electronic microscope

Din punct de vedere macroscopic, după însămânțare pe mediu YPG solid și incubare la 280C, timp de 3 – 4 zile, Yarrowia lipolytica a prezentat următoarele caractere de colonie:

formă rotundă;

celule mari;

margine întreagă;

profil ridicat;

culoare albă, opacă;

unele au suprafața rugoasă, altele netedă (apare un fenomen de disociere);

consistență pastoasă.

5.2.4. Îmbunătațirea capacității de biosinteză a tulpinii selectate prin mutageneză cu radiații UV

La inducerea mutațiilor, un rol important îl are dozarea agentului mutagen (fizic, chimic sau biologic). Dozarea se poate face în funcție de doi parametri:

timpul de acțiune;

puterea dozei.

Doza de agent mutagen utilizat ți timpul de acțiune, variază în funcție de specia testată.

În experimentele de inducere a mutațiilor trebuie să se țină cont de următoarele condiții:

să se supună acțiunii agentului mutagen celule uniforme din punct de vedere fiziologic (se preferă studiul pe populații sincrone);

numărul de celule trebuie să fie destul de mare, pentru a putea obține date asigurate statistic, dar bineînteles să nu formeze aglomerări care să ducă la o dispersare inegală a agentului mutagen;

durata de expunere trebuie să reprezinte, de regulă, o mică parte din durata de viață a unei generații, ceea ce duce la păstrarea uniformității stării fiziologice a celulelor în timpul inducerii mutațiilor (sunt de preferat celulele în stare latentă sau care nu se divid);

oprirea acțiunii agentului mutagen trebuie să se facă prin înlăturarea lui completă din mediu sau prin inactivarea lui.

Îndeplinirea acestor condiții permite simplificarea procedurii de calcul a numărului de mutații obținute și selectarea rapidă a celor mai valoroase mutane.

În funcție de numărul de celule mutante, se pot observa celulele rămase viabile și cele care au suferit mutația sub influența agentului mutagen, adică frecvența mutantelor induse. Folosind aceste date, se poate calcula gradul de supraviețuire al celulelor (viabilitatea), care se exprimă în procente de celule viabile din proba, față de celulele viabile întâlnite la martor. De regulă, dozele agentului mutagen care induc mutații scad în același timp supraviețuirea celulelor. Moartea celulelor sau pierderea capacității lor de a se divide se numește inactivare (în mod obișnuit este legată de afectarea nucleului).

Efectul mutagen poate fi exprimat grafic și analitic prin determinarea dependenței dintre frecvența mutațiilor și mărimea dozei respective, adică regresia lor. Pe axa abscisei, se trece mărimea dozei mutagene, iar pe ordonată, procentul de mutante.

Pentru obținerea unor rezultate sigure, se recomandă ca pentru fiecare doză să se repete de câteva ori experimentul. În acest caz, punctele experimentale care corespund unei mărimi a dozei, pot fi prelucrate ca un șir de variație, iar pe grafic se pot trece mărimea mijlocie și granițele posibile ale abaterii ei.

Dependența supraviețuirii de doza agentului mutagen se poate reprezenta tot grafic, prin trasare curbei de supraviețuire. În acest caz, pe axa absciselor se trece mărimea dozei mutagene, iar pe axa ordonatelor viabilitatea (%). Curba obținută este de tip exponențial și dovedeste faptul că numărul de celule inactivate crește odată cu mărirea dozei de agent mutagen.

Pentru a compara acțiunea letală a agenților mutageni, se calculează constantele dependenței „doză-efect”. Pentru un anumit agent mutagen se poate calcula doza letala a mutagenului (LD50), adică doza la care numărul de microorganisme viabile se reduce cu 50% din total. Pe grafic, LD50 se determină astfel: din punctul de pe ordonată care corespunde la 50% viabilitate, se trage o linie dreaptă cu axa absciselor, până ce aceasta întretaie curba experimentală. Din punctul de întretăiere se coboară o perpendiculara pe axa absciselor. Punctul care se obține va corespunde cu 50% din doza letală.

Pe parcursul experimențelor de mutageneză cu UV la tulpina Yarrowia lipolytica s-a urmărit:

construirea curbei de supraviețuire;

determinarea dozei letale (LD50);

stabilirea viabilității (%);

selectarea unor mutante valoroase, cu activitate lipolitică superioară tulpinii parentale.

În figura 13 poate fi analizată curba de supraviețuire a populației microbiene Yarrowia lipolytica la acțiunea radiațiilor UV și determinarea dozei letale (LD50) de agent mutagen.

Figura 13. Curba de supraviețuire la mutageneză cu radiații UV la tulpina Yarrowia lipolytica

Figure 13. Surviving curve of Yarrowia lipolytica strains after UV mutagenesis

Valoarea dozei letale (LD50) la ultraviolete este de 22 secunde.

Viabilitatea a fost calculată pentru fiecare timp de expunere la acțiunea razelor UV.

În tabelul 5 sunt prezentate valorile obținute la diferiți timpi de acțiune ai radiațiilor UV pentru viabilitate și indicele lipolitic mediu.

Tabelul 5. Rezultatele mutagenezei cu radiații UV la tulpina Yarrowia lipolytica

Table 5. Results obtained after UV mutagenesis os Yarrowia lipolytica strains

În urma studiului de mutageneza cu radiatii UV, a tulpinii de Yarrowia lipolytica, a fost selectată mutantă Yarrowia lipolytica UV-40, obținută prin iradiere, timp de 40 de secunde cu raze UV, care a prezentat un indice lipolitic superior (1,5), comparativ cu tulpina parentală (1,19) (tabelul 5).

Interesant de remarcat este faptul că în urma iradierii cu UV, toate tulpinile mutante obținute au format pe mediul YPG cu Tween 80 doar colonii netede, în timp ce la tulpina parentală studiul caracterelor morfo-fiziologice a evidențiat prezența unui fenomen de disociere (unele colonii rugoase, altele netede). Această constatare dovedește că ambele tipuri de colonii sunt implicate în producerea lipazei la tulpina Yarrowia lipolytica, dar coloniile netede sunt mai bune producătoare de lipaze.

Figura 14. Curbele de creștere ale tulpinilor de Yarrowia lipolytica modificate prin mutageneză

Figure 14. Growing curve of Yarrowia lipolytica strains modified by mutagenesis

Pentru tulpinile mutante de Yarrowia lipolytica, s-a trasat graficul curbei de creștere pe mediul YPG, comparându-se rezultatele cu curba de creștere a tulpinii parentale. Astfel, s-a observat că cele două tulpini mutante au o perioadă de lag mult mai mare decât în cazul tulpinii parentale. La 48 ore de cultivare, populația microbiană, în toate cele trei cazuri, se găseste la începutul fazei staționare de creștere, în timp ce faza de declin apare după 72 ore (figura 14).

5.3. Concluzii parțiale

Cercetările efectuate pentru selecția unei tulpini bune producătoare de lipaze, au permis selectarea drojdiei Yarrowia lipolytica, care a prezentat un indice lipolitic mediu de 1,19.

La microscopul optic, tulpina de Yarrowia lipolytica are structura caracteristică a unui fung imperfect, fiind formată din celule și pseudomiceliu, având următoarele caractere de colonie:

formă rotundă;

celule mari;

margine întreagă;

profil ridicat;

culoare albă, opacă;

unele au suprafața rugoasă, altele netedă (apare fenomenul de disociere);

consistență păstoasă.

În urma experimențelor de mutageneză cu radiații UV, realizate asupra tulpinii de Yarrowia lipolytica, s-a selectat o mutantă cu un potențial de biosinteză a enzimelor lipolitice îmbunătățit cu 25%. Aceasta s-a obținut după 40 de secunde de expunere a tulpinii la radiații UV și a prezentat un indice lipolitic mediu de 1,5;

Studiul dinamicii de creștere a tulpinii mutante de Yarrowia lipolytica UV-40 a arătat că prezintă o faza de lag mult mai mare decât tulpina parentală. Ulterior, după 48 – 60 ore, cantitatea de biomasă formată la tulpinile mutante este usor mai mare, dacât în cazul tulpinii parentale;

În cadrul experimențelor de mutageneză cu UV s-a stabilit că:

LD50 = 22 secunde;

viabilitatea pentru fiecare doză de agent mutagen a fost de:

V20 = 54.38%;

V40 = 13.21%;

V60 = 2.24%;

V120 = 1.07%..

Rezultatele obținute au permis selectarea unei mutante valoroase, Yarrowia lipolytica UV-40, cu un indice lipolitic mediu superior (1,5) celui determinat la tulpina parentală (1,19).

CAPITOLUL 6. CERCETĂRI PRIVIND BIOSINTEZA LIPAZEI

Cercetările experimentale efectuate în cadrul acestui capitol au avut drept scop stabilirea condițiilor de fermentație care permit dirijarea metabolismului tulpinii de Yarrowia lipolytica UV-40 în sensul biosintezei lipazei la un nivel cât mai ridicat și reproductibil.

Pentru realizarea scopului propus s-au urmarit două obiective, și anume:

stabilirea compoziției optime a mediului de fermentație, în special în ceea ce privește utilizarea unor inductori;

determinare influenței parametrilor de cultivare asupra activității lipolitice a tulpinii de Yarrowia lipolytica UV-40 și stabilirea valorilor optime ale acestora.

6.1. Materiale și metode

6.1.1. Medii de cultură

În cadrul experimențelor de biosinteză a lipazelor folosind tulpina Yarrowia lipolytica UV-40 s-au folosit medii de cultură cu următoarele compoziții:

Mediu YPG – lichid (mediu pentru inocul):

Mediul de fermentatie (mediu A):

Variante de medii de fermentație:

Mediile de cultură testate conțin aceleași componente ca mediul martor, la care se adaugă Tween 80 sau uleiuri vegetale (ulei de măsline sau de floarea soarelui), uneori în lipsa glucozei, în diferite concentrații, conform tabelului 6:

Tabelul 6. Variante de medii de fermentație

Table 6. Variants of fermentation media

6.1.2. Prepararea conservului vegetativ

Tehnica de lucru:

Conservul vegetativ (subcultura) s-a preparat prin reînsămânțarea periodică a tulpinii microbiene cu care se efectuează biosinteza, pe un mediu YPG, solid, proaspăt, repartizat în eprubete înclinate.

Mediul de întreținere s-a preparat prin dizolvarea ingredientelor în apă distilată, la cald. Soluției obtinute i s-a ajustat pH-ul la valoarea 7. Mediul s-a sterilizat prin autoclavare la 1200C, 15 minute, s-a răcit și, după solidificare, s-a însămânțat cu o suspensie de celule de Yarrowia lipolytica UV-40. Cultura s-a incubat la 280C, timp de 48 ore. După dezvoltarea corespunzătoare a culturii, s-a acoperit suprafața însămânțată cu un strat de ulei de parafina steril. Materialul microbian se poate păstra în acest fel timp de maxim 6 luni la frigider (1 – 40C), dupa care se repeta însămânțarea pe un mediu de cultură proaspăt. Procentul de supraviețuire al microorganismelor păstrate în aceste condiții este variabil. Un procent de supraviețuire de 10%, în condițiile păstrării nealterate a trăsăturilor inițiale este considerat acceptabil.

6.1.3. Prepararea inoculului

Tehnica de lucru:

Din cultura de întreținere se prepară o suspensie microbiană în apă distilată sterilă. Cu 2 ml suspensie se însămânțează 20 ml mediu YPG lichid (mediul de inocul), cu următoarea compoziție: extract de drojdie – 1%, peptonă Bacto – 2%, glucoză – 2%, sterilizat în prealabil prin autoclavare 20 minute, la 1210C și având pH = 6. Cultura inocul se dezvoltă în flacoane Erlenmayer de 200 ml timp de 20 – 24 h la 280C, în condiții de agitare continuă pe agitator rotativ, la 240 rpm.

6.1.4. Trasarea curbei de creștere a tulpinii Yarrowia lipolytica UV-40

Tehnica de lucru:

În cazul celulelor de drojdii, care se caracterizează printr-o creștere uniformă în mediul de cultură lichid, cea mai uzuală și practică metodă de trasare a curbei de creștere este metoda turbidimetrică. Aceasta constă în determinarea spectrofotometrică a densității optice a mediului de fermentație, la λ = 570 nm.

Rolul acestei determinări este acela de a identifica perioada de timp în care se găseste populația bacteriană într-o anumită fază de creștere.

Pentru stabilirea curbei de creștere, 100 ml de mediu YPG lichid s-au însămânțat cu o tulpina de Yarrowia lipolytica UV-40 în raport 1%. Mediul de cultură s-a incubat timp de 4 zile la 280C sub agitare. Pe parcursul fermentației s-au luat probe la diferite intervale de timp: 0 h, 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, … 96 h, s-au diluat 1 : 25 cu apă distilată, după care s-a determinat densitatea lor optică, la 570 nm. În final, s-a reprezentat grafic densitatea optică în funcție de timp și s-au delimitat fazele de dezvoltare.

6.1.5. Biosinteza lipazei

Tehnica de lucru:

Pentru biosinteza lipazei s-au folosit atât mediul A, cât și variante ale acestuia, obținute prin adăugarea urmatoarelor componente: ulei de măsline, ulei de floarea soarelui sau Tween 80, în concentrații cuprinse între 0,5 – 2% sau prin înlocuirea glucozei cu uleiurile respective, ca surse de carbon și energie. Câte 50, 75, 100, 125 ml din mediul astfel preparat, s-au repartizat în flacoane cu capacitatea de 500 ml și s-au sterilizat prin autoclavare 20 minute la 1210C. După răcire, mediile s-au însămânțat cu cultura inocul, în proporții variind între 2 si 10%. Fermentațiile s-au desfășurat pe o durată de 72 h, la 280C, pe agitator rotativ, la o turație de 240 rpm. Periodic, din 6 in 6 ore s-au efectuat determinări de densitate optică, pH și activitate lipazică în mediul de fermentație [32].

6.1.6. Metode de determinarea a activității lipolitice

6.1.6.1. Determinarea activității lipolitice prin metoda titrimetrică

Principiul metodei

Determinarea activității lipazice prin metoda titrimetrică se bazează pe utilizarea ca substrat a trigliceridelor din uleiul de măsline. Cantitatea de acizi grași formată sub acțiunea enzimei se măsoară prin titrare cu o soluție diluată standadizată de NaOH. Cantitatea de soluție de NaOH necesară pentru neutralizarea acizilor grași eliberați (fenolftaleina, viraj incolor → roșu, pH = 8,2 – 10) este proporțională cu activitatea lipazică [32].

O unitate (U) de activitate lipazică este definită ca fiind cantitate de enzimă ce eliberează prin hidroliza trigliceridelor din uleiul de măsline 1 µmol de acid gras, în condițiile analizei (temperatură = 370C, pH = 7, timp de reacție = 60 minute).

Reactivi și materiale necesare:

substrat: ulei de măsline preparat sub formă de emulsie în soluție apoasă de gumă arabică astfel:

se dizolvă 16,5 g guma arabica în 130 ml apă distilată;

după solubilizarea completă se diluează până la 165 ml cu apă distilată;

se adaugă 20 ml ulei de măsline și 15 g gheață sfărâmată;

amestecul obținut se omogenizează bine pe agitator.

Observatie: Substratul se prepara proaspăt, în ziua utilizării.

soluție tampon citrat 0,2 M, pH = 7;

soluție de clorură de calciu 0,6%;

preparat enzimatic: pulbere sau lichid de fermentație;

reactiv de stopare – etanol : acetona (1 : 1);

soluție de NaOH 0,1M cu factor determinat;

soluție indicator de fenolftaleină.

Tehnica de lucru:

Reacția enzimatică se efectuează într-un pahar Erlenmeyer de 100 ml, comparativ cu o proba martor, efectuată de asemenea într-un pahar Erlenmeyer de 100 ml, conform următoarelor scheme de lucru:

a) pentru enzima din mediul de cultură

b) pentru enzima pulbere

Calculul activității enzimatice:

(VP – VM) x F x 100

A (U/h) =

g (V)

unde: VP = volumul de soluție de NaOH 0,1 N cu care s-a titrat proba (ml)

VM = volumul de soluție de NaOH 0,1 N cu care s-a titrat martorul (ml)

F = factorul soluției de NaOH 0,1 N

100 = factor care include transformarea volumului de soluție de NaOH 0,1 N în μmoli acizi grași corespunzători

g = cantitatea de enzimă pulbere luată în analiză (mg)

v = volumul de lichid de fermentație luat în analiză (ml)

6.1.6.2. Determinarea activității lipolitice prin metoda colorimetrică

Principiul metodei

Nitrofenil-esterii acizilor carboxilici pot fi folosiți pentru detectarea activității lipazelor prin metode colorimetrice, întrucât prin hidroliza acestora se formează nitrofenolul, compus de culoare galbenă. Metoda se bazează pe determinarea spectrofotometrică a concentrației de p-nitrofenol (substanță colorată) rezultat în urma acțiunii hidrolitice a enzimei asupra grupei ester din substratul sintetic pNPA (para-nitrofenilacetat).

p-nitrofenilacetat

Reactivi și materiale necesare:

Soluție A : soluție 0,5 mM de p-nitrofenilacetat în alcool izopropilic;

Soluție B: soluție tampon fosfat 50 mM, pH = 7;

Soluție de enzimă etalon de concentrație variabilă.

Mod de lucru:

a) Prepararea soluției A

Se cântăresc 0,009 g de p-nitrofenilacetat și se transvazează într-un balon cotat de 100 ml, adăugând treptat alcool izopropilic pentru dizolvare, până la semn. Se omogenizează foarte bine soluția obținută.

b) Prepararea soluției B: tampon fosfat 0,05 M, pH = 7

c) Reacția enzimatică: în cuva de cuarț a spectrofotometrului se introduc 0,8 ml soluție B, 0,1 ml soluție de enzimă și 0,1 ml soluție A după care se pornește cronometrul. Se urmărește la spectrofotometru variația absorbanței la 410 nm, până când aceasta se menține constantă timp de 15 minute (notând valorile absorbanței din minut în minut). Măsurătorile se efectuează față de un blanc reprezentat de amestecul de reacție.

d) Prepararea curbei etalon de p-nitrofenol

Se prepară o soluție stoc de p-nitrofenol de concentrație 0,5 mM, prin dizolvare într-un amestec format din: 1 parte i-PrOH și 9 părți tampon fosfat pH = 7 (în volume) și apoi din ea, mai multe dilutii, după cum urmează:

După realizarea amestecului se citește absorbanța soluțiilor la 410 nm, față de un blanc reprezentat de solutia B și se trasează curba etalon.

Activitatea specifică s-a determinat prin raportarea activității enzimatice la conținutul în proteine, determinat prin metoda Lowry [142].

6.2. Rezultate și discuții

6.2.1. Stabilirea dinamicii curbei de creștere a tulpinii Yarrowia lipolytica UV-40

În urma determinărilor spectrofotometrice, s-a constatat că populația microbiană de Yarrowia lipolytica UV-40 se găsește, atunci când este cultivată în sistem discontinuu, în faza de creștere logaritmică la 12 ore de la cultivare, parcurgând o perioadă de lag destul de scurtă.

La 48 ore de la cultivare, populația microbiană intră în faza staționară de creștere, aceasta fiind faza în care se acumulează enzimele lipolitice.

După 60 ore de la cultivare asistăm la un declin accelerat, ceea ce înseamnă că multiplicarea bacterienă a încetat, iar numărul celulelor vii scade progresiv, atingând un ritm logaritmic.

Figura 15. Curba de creștere a tulpinii Yarrowia lipolytica UV-40

Figure 15. Growing curve of Yarrowia lipolytica UV-40

6.2.2. Determinarea activității lipolitice

Pentru cuantificarea exactă a capacității de biosinteză a lipazelor de către tulpinile de Yarrowia lipolytica UV-40 în mediul de fermentație este necesară folosirea unor metode cât mai exacte de determinare a activității enzimatice.

Pentru realizarea acestui scop s-au testat două metode diferite de dozare, una titrimetrică și alta colorimetrică.

În urma experimențelor realizate, s-a decis ca dozarea acestor enzime să se realizeze prin metoda titrimetrică, întrucât este o metoda accesibilă, prezintă o exactitate mare a rezultatelor, iar reactivii folosiți sunt ușor de procurat și nu implică costuri mari de achiziție.

Metoda colorimetrică a prezentat un mare dezavantaj, și anume, instabilitatea chimică a reactivului folosit, p-nitrofenilacetatul, care scindează la p-nitrofenol, în mod spontan, la temperatura camerei.

6.2.3. Influența raportului de inoculare asupra biosintezei lipazei

Calitatea și cantitatea inoculului joacă un rol important pentru obținerea unor metaboliți cu viteze și randamente dorite de biosinteză. Importanța standardizării inoculului vegetativ este de asemenea hotărâtoare.

Pentru cultivarea tulpinii de Yarrowia lipolytica UV-40 s-au folosit concentrații de inocul de laborator cuprinse în intervalul 2 – 10%, adăugat în 75 ml mediu de fermentație A. Fermentațiile s-au desfășurat în flacoane Erlenmeyer de 500 ml, pe o durată de 48 h, la 280C, pe agitator rotativ, la o turație de 240 rpm.

Rezultatele cercetărilor efectuate în această etapă a experimențelor sunt redate în continuare.

Figura 16. Influența raportului de inoculare asupra activității lipolitice în mediul de fermentație

Figure 16. Influence of inoculation ratio on lipolytic activity of the fermentation media

Tabelul 7. Influența concentrației inocului asupra activității lipolitice

Table 7. Influence of concentration of inoculum on lipolytic activity

Din examinarea datelor prezentate în figura 16, se constată că în cazul utilizării unei concentrații de inocul de 10% v/v, raportat la mediul de biosinteză, se obține cea mai ridicată activitate lipolitică în finalul fermentației, astfel că în toate studiile ulterioare s-a folosit acest raport de însămânțare.

6.2.4. Influența compoziției mediului de fermentație asupra activității lipolitice

Având în vedere că substanțele de natură lipidică pot constitui surse de energie pentru metabolismul celular mai bogate, chiar decât glucidele, și, întrucât în literatura de specialitate este menționată utilizarea uleiurilor vegetale sau sintetice ca inductori ai biosintezei lipazei, am considerat că este util a cerceta aceste aspecte și în cazul tulpinii de Yarrowia lipolytica UV-40. Astfel, am studiat influența a trei tipuri de uleiuri: de măsline, de floarea soarelui și Tween 80 (monooleat de sorbitan polietoxilat), atât ca inductori, cât și ca substraturi nutritive.

Monooleat de sorbitan polietoxilat (Tween 80)

6.2.4.1. Utilizarea uleiului de măsline

Pentru fermentațiile realizate cu scopul de a studia influența uleiului de măsline s-a preparat în prealabil un inocul conform capitolului 6.1.3., iar parametrii de biosinteză au fost următorii [143; 144]:

concentrație inocul = 10%;

volum mediu/volum flacon = 1/6,7;

temperatură = 280C;

agitare = 240 rpm;

durată = 48 ore.

S-au experimentat 5 variante ale mediului A, 4 dintre ele conținând glucoza ca sursa de carbon și diferite concentrații de ulei de măsline și a cincea, în care glucoza este înlocuită cu ulei de măsline, conform tabelului de mai jos:

Tabelul 8. Variante de medii de fermentație A

Table 8. Variants of fermentation media A

Figura 17. Influența uleiului de măsline folosit ca inductor sau ca substrat asupra biosintezei lipazei

Figure 17. Influence of olive oil used as inductor or substrate on the biosyntesis of lipase

Tabelul 9. Influența uleiului de măsline asupra biosintezei lipazei

Table 9. Influence of olive oil on the biosyntesis of lipase

Din figura 17 se observă că activitatea lipolitica este direct proporțională cu conținutul uleiului de măsline din mediu. Concentrația maximă a enzimei, de 13,5 U/ml, se atinge la un conținut de 2% ulei de masline, în absența glucozei și descrește cu scăderea concentrației lui în mediu și introducerea glucozei. Valoarea biomasei acumulate este maximă în cazul variantei de mediu cu conținut minim de ulei (varianta 1) și minimă în cazul variantei de mediu în care glucoza este înlocuită cu uleiul de măsline ca sursă de carbon (varianta 5).

Se observă de asemenea, că inlocuirea glucozei cu uleiul de măsline, în aceeași concentrație de 2%, are efect favorabil asupra activității lipolitice înregistrată în finalul fermentației (A = 3,70 U/ml în mediul cu 2% glucoză, față de 13,5 în mediul în care glucoza este înlocuită cu 2% ulei de măsline).

Asfel, se poate concluziona că prezența glucozei în mediul de cultură stimulează creșterea cantității de biomasă, pe când uleiul de măsline, determină biosinteza în cantități mari a enzimelor lipolitice.

Cercetările experimentale au confirmat studiile documentare în care se prezintă efectul stimulativ al inductorilor asupra bisintezei enzimelor de către tulpinile de Yarrowia lipolytica.

6.2.4.2. Utilizarea uleiului de floarea soarelui

Pentru fermentațiile realizate cu scopul de a studia influența uleiului de floarea soarelui s-au utilizat aceleași condiții de cultivare ca cele menționate anterior și variantele de mediu 6 – 10 prezentate în capitolul 6.1.1., după cum urmează [143, 144]:

Tabelul 10. Variante de medii de fermentațtie A

Table 10. Variants of fermentation media A

Figura 18. Influența uleiului de floarea soarelui folosit ca inductor sau ca substrat asupra biosintezei lipazei

Figure 18. Influence of sun flower oil used as inductor or substrate on the biosyntesis of lipase

Tabelul 11. Influența uleiului de floarea soarelui asupra biosintezei lipazei

Table 11. Influence of sun flower oil on the biosyntesis of lipase

Din figura 18 se poate observa că activitatea lipolitică este invers proporțională cu conținutul în ulei de floarea soarelui a mediului de fermentație. Concentrația maximă a enzimei, de 6,8 U/ml, se atinge la un conținut de 0,5% ulei și scade brusc, odată cu creșterea conținutului acestuia în mediile ce conțin 2% glucoză. Valoarea biomasei acumulate este maximă în cazul variantei de mediu cu conținut minim de ulei (varianta 6) și minimă în cazul variantei de mediu în care glucoza este înlocuită cu uleiul de măsline ca sursă de carbon (varianta 10).

În figura de mai sus, se observă că înlocuirea glucozei cu uleiul de floarea soarelui, în aceeași concentrație, de 2%, nu mai are același efect favorabil asupra activității lipolitice ca cea înregistrată în cazul uleiului de măsline la finalul fermentației, ci provoacă scăderea drastica a acesteia (de la 15,0 la 2,8 U/ml).

Pe de altă parte, analizând rezultatele ilustrate în figura 18, se poate constata că uleiul de floarea soarelui are un efect inhibitor asupra creșterii biomasei și biosintezei enzimelor lipolitice atunci cand concentrația lui în mediu crește peste valoarea de 0,5%.

6.2.4.3. Utilizarea uleiului sintetic Tween 80

Pentru studiul influenței prezenței Tween 80 în mediul de fermentație ca inductor sau chiar ca substrat s-au realizat fermentații la nivel de laborator, în condiții similare celor prezentate în capitolele anterioare, utilizând următoarele formule de mediu (conform capitolului 6.1.1.) [143, 144]:

Tabelul 12. Variante de medii de fermentație A

Table 12. Variants of fermentation media A

Figura 19. Influența Tween 80 folosit ca inductor sau ca substrat asupra

biosintezei lipazei

Figure 19. Influence of Tween 80 used as inductor or substrate on the biosyntesis of lipase

Tabelul 13. Influența Tween 80 asupra biosintezei lipazei

Table 13. Influence of Tween 80 on the biosyntesis of lipase

Ca și în cazul uleiului de floarea soarelui, uleiul sintetic Tween 80 are efect stimulator asupra biosintezei enzimelor lipolitice de către tulpina studiată, dar mai puțin pronunțat. Valoarea maximă a activității enzimatice, 5,2 U/ml, a fost atinsă la o concentrație de 0,1% a uleiului în mediul de fermenație. De asemenea, se menține variația invers proporțională a activității lipazei în funcție de concentrația de Tween 80 în mediu.

6.2.4.4. Analiza comparativă a efectului inductorilor testați

Comparând valorile activității lipolitice maxime, obținute prin adaugarea în mediul martor (mediul A) a inductorilor mai sus-menționați, cu cele rezultate în urma cultivării tulpinii pe mediul fără inductori, se observă clar eficiența diferită a uleiurilor cercetate, la aceleași concentrații folosite.

Din examinarea rezultatelor prezentate în figura 20 se poate observa efectul inductor al uleiurilor vegetale asupra biosintezei lipazelor, adăugarea uleiului de măsline in mediul de fermentație în locul glucozei determinând o creștere de 4,7 ori a activității lipazei, comparativ cu mediul martor, fără ulei.

Tabelul 14. Variația efectului inductor al diferitelor uleiuri asupra activității lipolitice produsa de Yarrowia lipolytica UV-40

Table 14. Variation of the inductor effect of different oils on the liplytic activity of Yarrowia lipolytica UV-40

Figura 20. Influența tipului de inductor asupra biosintezei lipazei

Figure 20. Influence of the inductor type on the biosyntesis of lipase

Se remarcă, de asemenea, faptul că și uleiul de floarea soarelui manifestă efect stimulator asupra biosintezei lipazelor, dar la o concentrație mai mică și în prezența glucozei în mediul de fermenație. Depășirea valorii de 0,5% în mediu duce la scăderea activității până la un minim de 2,8, când sursa de carbon, reprezentată de glucoză, a fost înlocuitî cu ulei.

6.2.5. Studiul influenței factorilor fizico-chimici asupra biosintezei lipazei de către Yarrowia lipolytica UV-40

Pe lângă factorii de nutriție, biosinteza enzimelor de către microorganisme este considerabil influențată de un șir de alți factori, fizici și chimici: temperatura, durata cultivării, pH-ul mediului nutritiv.

Masura in care acesti factori influențează biosinteza enzimelor difera în funcție de microorganismul producător utilizat și de aceea este necesar a fi studiati pentru fiecare tulpină de lucru.

6.2.5.1. Efectul temperaturii asupra biosintezei lipazei

Temperatura la care se efectuează biosinteza este un factor esențial pentru formarea și acumularea enzimelor în mediul de fermentație. Ea influențează viteza de dezvoltare a microorganismului, rata de disociere a componentelor mediului nutritiv și implicit de asimilare a acestora, viteza de formare și de inactivare a enzimei. Există o temperatură optimă de creștere a microorganismului la care rata de disociere este minimă. În cele mai multe cazuri, la drojdii, temperatura optimă de creștere coincide cu temperatura optimă de biosinteză. Din literatură, este cunoscut faptul că pentru majoritatea producătorilor de enzime lipolitice temperatura optimă de creștere și dezvoltare este cuprinsă între 26 – 320C. În același timp este cunoscut ca tulpina Yarrowia lipolytica UV-40 – producătoare de lipaze, are temperatura oprimă de creștere și dezvoltare de 250C .

Pornind de la aceste considerente, seria de experimente prezentată în acest capitol a fost inițiată cu scopul determinării valorii optime a parametrului temperatură, în ceea ce privește activitatea lipolitică în mediul de fermentație. În acest scop, tulpina studiată s-a cultivat pe varianta 5 de mediu nutritiv (conform cap. 6.1.1.), utilizând trei regimuri de temperatură: 250C, 280C și 350C, o aerare corespunzătoare unui raport volum mediu/volum flacon de 1/6,7 și un regim de agitare de 240 rpm.

Rezultatele obținute sunt prezentate în continuare.

Figura 21. Influența temperaturii mediului de fermentație asupra activității lipolitice

Figure 21. Influence of temperature of fermentation media on lipolytic activity

Analizând datele din tabelul 15, rezultă că biosinteza maximă a lipazei de către tulpina Yarrowia lipolytica UV-40 are loc la valoarea temperaturii de 280C și se concretizează într-o activitate de enzimatică de 14,9 U/ml după 54 de ore de cultivare.

Micșorarea temperaturii la 250C a dus la încetinirea procesului de fermentație, astfel că pentru atingerea aceluiași nivel de activitate, fermentația ar trebui dirijată pe o perioadă mult mai lungă de timp. În schimb, creșterea temperaturii la 350C a determinat obținerea unei valorii a activității lipolitice în mediul de fermentație cu 46% mai mică decât cea corespunzatoare temperaturii de 280C.

Tabelul 15. Evoluția activității lipolitice în funcție de temperatura mediului de fermentație

Table 15. Evolution of lipolytic activity depending on the temperature of the fermentation media

6.2.5.2. Efectul pH-ului asupra biosintezei lipazei

Întrucât enzimele sunt proteine funcționale, proprietățile și biosinteza lor sunt influențate de valorile pH-lui. Utilizarea unui pH adecvat are ca urmare limitarea fenomenului de disociere a componentelor mediului nutritiv. Există un pH optim de dezvoltare a microorganismului și un pH optim de biosinteză a enzimelor.

pH-ul optim de cultivare a majorității microorganismelor producăatoare de lipaze este situat în domeniul 6 – 9 [74], cu câteva excepții, ca de exemplu lipazele din Mucor pusillus, care prezintă activitate lipolitică maximă la un pH situat în intervalul 5 – 6 [74].

Ținând cont de cele menționate, cercetările prezentate în continuare au fost efectuate pentru a stabili valoarea pH-lui optim pentru manifestarea activității lipolitice a culturii de Yarrowia lipolytica UV-40, obținută prin fermentații desfășurate pe o durată de 54 de ore, în condițiile menționate în capitolul anterior, cu diferența că pH-urile inițiale ale mediilor de cultivare au avut valori cuprinse între 5 si 8.

Figura 22. Influența pH-ului mediului de fermentatie asupra activității lipolitice

Figure 22. Influence of pH values of fermentation media on lipolytic activity

Din rezultatele prezentate în figura 22 rezultă că pH-ul inițial optim al mediului de fermentație este 6, obținandu-se în aceste condiții o activitate lipolitică maximă de 14,6 U/ml, față de 14,0 U/ml la pH = 7, 13,9 U/ml la pH = 5 si 12,8 U/ml la pH = 8.

Tabelul 16. Evoluția activității lipolitice în funcție de pH-ul mediului de fermentație

Table 16. Evolution of lipolytic activity depending on the pH value of the fermentation media

6.2.5.3. Influența aerării asupra activității lipolitice în mediul de fermentație

Întrucât este cunoscut faptul că Yarrowia lipolytica UV-40 este un microorganism obligatoriu aerob, am considerat ca este necesar a se stabili valoarea optimă a regimului aerare-agitare, cu scopul asigurării dezvoltării adecvate a biomasei și a unui nivel de biosinteză optim și reproductibil. În acest sens, am efectuat o serie de experiențe la nivel de laborator, în flacoane agitate. Fermentațiile în flacoane agitate s-au realizat utilizând între 30 si 125 ml de mediu nutritiv (varianta 5 conform capitolului 6.1.1.), sub un regim de agitare de 240 rpm, în condițiile determinate ca optime pe parcursul experiențelor anterioare.

Figura 23. Influența aerării asupra biosintezei lipazei

Figure 23. Influence of aeration of fermentation media on lipolytic activity

Tabelul 17. Evoluția activității lipolitice în funcție de gradul de aerare a mediului de fermentație

Table 17. . Evolution of lipolytic activity depending on the aeration of the fermentation media

Conform rezultatelor prezentate în figura 23, se poate observa că o aerare puternică, realizată prin utilizarea unui volum de mediu de fermentație de 30 ml/flacon de 500 ml conduce la o creștere semnificativă atât a activității enzimatice cât și a masei celulare, A=20 U/ml si D.O.=1,96, față de A=7-16 U/ml si D.O.=1-1,5, în experiențele cu un volum mai mare de mediu de cultură per balon de 500 ml.

Prin urmare, un regim de agitare-aerare corespunzător unui raport volum mediu/volum balon = 1/16,6 la 240 rpm asigură condițiile optime pentru biosinteza lipazei în cazul tulpinii utilizate.

6.3. Concluzii parțiale

În conformitate cu obiectivele propuse, testele efectuate pentru stabilirea condițiilor optime și reproductibile de biosinteză a lipazei cu tulpina Yarowia lipolytica UV-40 au condus la următoarele concluzii:

S-a stabilit compoziția optimă a mediului pentru biosinteza lipazei la nivel de laborator, bazată pe o combinație de substraturi organice și anorganice, ca surse de azot, la care se adaugă diverse săruri și ulei de măsline:

Ulei de măsline 2%;

Peptonă 0,5%;

Extract de drojdie 0,5%;

Fosfat de amoniu 0,5%;

Sulfat de magneziu 0,1%;

Fosfat monopotasic 0,2%.

Suplimentarea mediului de fermentație cu uleiuri naturale și sintetice, în scopul stimulării biosintezei lipazei, a evidențiat efectul inductor al uleiurilor vegetale, adăugarea acestora în mediul de fermentație în concentrație de 2%, determinând o creștere de 4,7 ori a activității lipazei, față de mediul martorul, ăn cazul uleiului de măsline, de 2,4, ori pentru uleiul de floarea soarelui și 1,8 ori, pentru Tween 80;

S-a evidențiat efectul favorabil al condițiilor de aerare puternică, corespunzătoare unui raport volum mediu/volum flacon = 1:6,7;

Condițiile optime pentru biosinteza lipazei cu tulpina sus-menționată s-au realizat prin aplicarea următorilor parametrii de lucru:

raport de inoculare = 10%

temperatură = 280C;

pH = 6

agitare = 240 rpm

aerare corespunzătoare unui raport volum mediu / volum flacon = 1/6,7

durata fermentației = 54 de ore

În condițiile menționate s-au efectuat mai multe experiențe de biosinteză a lipazei cu tulpina de Yarrowia lipolytica UV-40 la nivel de laborator, obținându-se rezultate reproductibile, concretizate într-o activitate lipolitică medie de 15 U/ml mediu de fermentație.

CAPITOLUL 7. Cercetări privind izolarea și purificarea lipazeI microbiene

Cercetările efectuate în cadrul acestui capitol au avut în vedere realizarea următoarelor obiective:

Evaluarea comparativă a unor metode de izolare a lipazei din mediile de cultivare a tulpinii de Yarrowia lipolytica UV-40, respectiv precipitarea cu sulfat de amoniu sau cu solvenți organici;

Stabilirea unei succesiuni adecvate de etape de prelucrare post-biosinteza a mediilor de fermentație în scopul izolării enzimei în condiții reproductibile și într-un grad de puritate cât mai avansat;

Caracterizarea biochimică a preparatelor enzimatice izolate din mediile de fermentație cu tulpina Yarrowia lipolytica UV-40;

Studiul stabilității activității enzimatice a lipazelor obținute prin biosinteză.

7.1. Materiale și metode

7.1.1. Separarea și concentrarea lipazei din mediul de fermentație

În finalul fermentației, biomasa s-a separat de lichidul extracelular prin centrifugare timp de 30 minute, la 4000 rpm. Sedimentul obținut s-a reluat în 2 volume de ser fiziologic, iar suspensia rezultata s-a centrifugat din nou, în aceleași condiții și s-a adaugat peste supernatantul separat după prima centrifugare.

A doua etapă de prelucrare post-biosinteza (după separarea biomasei) a constat în concentrarea sub vid a lichidului acelular, la temperatura de 350C, până la 1/3 din volumul inițial. În final, s-a determinat activitatea enzimatică a soluției concentrate. Lichidul extracelular concentrat s-a prelucrat în continuare în vederea izolării și purificării lipazelor prin următoarea succesiune de etape [100, 101]:

I. Izolarea lipazelor prin precipitare cu sulfat de amoniu sau acetonă;

II. Purificarea lipazelor prin precipitare cu alcool etilic.

7.1.2. Izolarea lipazei din mediile de fermentație

7.1.2.1. Izolarea lipazei microbiene prin precipitare fractionată cu sulfat de amoniu

S-a testat posibilitatea izolării lipazei brute din lichidul extracelular prin precipitarea acesteia cu sulfat de amoniu în domeniul de saturație 30 – 60%, conform protocolului experimental prezentat în continuare.

Reactivi și materiale necesare:

lichid de fermentație concentrat conținând lipază, caracterizat prin:

activitate lipolitică = 42 U/ml;

conținut în proteine (metoda Warburg-Christian [142] = 20 mg/ml;

activitate specifică = 2,1 U/mg proteină.

sulfat de amoniu cristalizat;

reactivi pentru determinarea activității lipazice prin metoda titrimetrică.

Tehnica de lucru:

Saturația în sulfat de amoniu a lichidului de fermentație concentrat se realizează prin adăugarea unei cantități de sare solidă. Astfel, din 100 ml lichid concentrat, se păstrează 2 ml pentru dozarea proteinelor, iar în 98 ml se adaugă 17,15 g sulfat de amoniu pentru a atinge 30% saturație în această sare. Pentru realizarea fracționării, lichidul de fermentație se răcește la +5 … +100C, iar adăugarea cantității prevazute de sulfat de amoniu se face treptat, sub agitare și răcire. După dizolvarea sării, proces facilitat prin agitarea suspensiei, se perfectează precipitarea prin staționare la +40C, timp de 30 minute.

Suspensia rezultată este centrifugată la 4.000 rpm timp de 15 minute, iar sedimentul obținut (fractia P1) se reia în 25 ml apă distilată, pentru determinarea conținutului în proteină și a activității enzimatice. În supernatant se adaugă 19 g sulfat de amoniu, care se dizolva prin agitare, în condițiile sus mentionațe. După 30 minute, fracția P2 a proteinelor precipitate în domeniul de saturație 30-60% se separă prin centrifugare. Precipitatul este reluat în 25 ml apă distilată, pentru determinarea conținutului în proteină și a activității enzimatice. În soluția de supernatant se adaugă 21,5 g sulfat de amoniu, iar după dizolvarea sării și perfectarea precipitării (staționare la 40C, timp de 30 minute) se centrifughează timp de 15 minute, la 6000 rpm. Supernatantul, care reprezintă o soluție salină saturată 90% în sulfat de amoniu, se aruncă, iar precipitatul, care reprezintă fracția P3, a proteinelor precipitate în domeniul de saturație 60%-90%, este reluat în aproximativ 25 ml apă distilată. De asemenea, în fracția P3 este determinată concentrația proteică și activitatea enzimatică.

7.1.2.2. Izolarea lipazei microbiene prin precipitare fracționată cu acetonă

Experiențele privind utilizarea acetonei ca solvent de precipitare a lipazei din mediile de biosinteză microbiană s-au realizat pornind de la soluții enzimatice rezultate în urma concentrării sub vid a lichidului de fermentație extracelular și s-au bazat pe următorul protocol experimental:

Reactivi și materiale necesare:

lichid de fermentație concentrat conținând lipază, caracterizat prin:

activitate lipolitică = 42 U/ml;

conținut în proteine (metoda Warburg-Christian [142] = 20 mg/ml;

activitate specifică = 2,1 U/mg proteină.

acetonă p.a.;

reactivi pentru determinarea activității lipazice prin metoda titrimetrică.

Tehnica de lucru:

100 ml lichid de fermentație concentrat se introduc într-un pahar Erlenmeyer de 250 ml și se aduc la temperatura de +40C. Când se atinge temperatura urmarită, se începe adăugarea a 43 ml solvent, în fir subțire, sub agitare și la temperatura sus-menționată. După adăugarea întregii cantități de solvent, suspensia se menține static, la aceeați temperatură, pentru perfectarea precipitării, timp de 30, 60 sau 90 de minute. Proteinele precipitate la 30% solvent (v/v) – fractia P1, sunt separate prin centrifugare la 4000 rpm, timp de 15 minute.

În supernatant este crescută concentrația în solvent până la 60%, prin adăugarea a 61 ml solvent. Precipitarea este realizată în aceleași condiții descrise mai sus. Prin centrifugare la 4000 rpm, timp de 15 minute, se separă fracția P2 (proteinele precipitate în domeniul de concentrații 30 – 60% acetonă – v/v), iar în supernatant este crescută concentrația în solvent organic până la 90%, prin adăugarea a 87 ml solvent. După perfectarea precipitării, se separă prin centrifugare fracția P3 (proteinele precipitate în domeniul de concentrații 60 – 90% solvent).

Cele trei fracții proteice: P1, P2 si P3 sunt reluate, fiecare dintre ele, în volume minime de soluție de CaCl2 0,01M și analizate din punctul de vedere al concentrației proteice și al activității enzimatice.

7.1.3. Purificarea lipazei prin precipitare cu alcool etilic

Experiențele privind purificarea avansată a lipazei prin precipitare cu alcool etilic s-au realizat pornind de la soluții enzimatice de diferite concentrații, rezultate în urma precipitării fracționate cu sulfat de amoniu sau cu acetona a lichidului de fermentație concentrat și reluarea în soluție de CaCl2 0,01M a enzimei precipitată.

Tehnica de lucru:

Precipitarea cu alcool etilic s-a efectuat prin adăugarea solventului în fir subțire, sub agitare și răcire, în următoarele condiții:

– raportul soluției apoase : solvent – 1 : 2; 1 : 3; 1 : 4; 1 : 5;

– durata contactului cu solventul: 1, 2, 3 ore;

– temperatura mediului de precipitare: +40C, +200C, +300C;

– valoarea pH –ului mediului: 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0;

– concentrația ionilor de Ca2+ introdusă în mediu sub formă de soluție de CaCl2: 0,01; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25%, în raport cu volumul mediului de reacție.

În continuare, suspensiile rezultate în urma precipitării cu alcool etilic în condițiile sus-mentionate se centrifughează, sedimentul se spală cu alcool etilic de concentrație corespunzătoare varianței experimentate și se centrifughează din nou. Preparatul enzimatic sedimentat se usucă în exicator, la temperatura camerei, sub vid și se analizează activitatea lipolitică.

7.1.4. Determinarea influenței factorilor fizico-chimici asupra activității lipazei microbiene

7.1.4.1. Efectul ionilor de calciu

Studiul influenței ionilor de calciu s-a efectuat pe fracția P2 obtinută în urma precipitării cu sulfat de amoniu (30 – 60% saturație sulfat de amoniu), care s-a reluat într-o soluție de CaCl2 0,01M și s-a preincubat 1 ora la 370C, analizându-se ulterior activitatea enzimatică a preparatului, comparativ cu cea a soluției obținute prin reluarea fracției P2 în apă distilată.

7.1.4.2. Efectul pH-ului

Pentru studiul influenței pH-ului asupra activității lipazei s-au folosit preparate enzimatice obținute în urma purificării cu alcool etilic. S-a efectuat reacția enzimatică la diferite valori ale acestui parametru, cuprinse în domeniul 4 – 10, folosind diferite soluții tampon (tampon citrat pentru pH = 3 – 6, tampon fosfat pentru pH = 7 – 8 și tampon borat pentru pH = 9 – 10).

7.1.4.3. Efectul temperaturii

Studiul acestui parametru s-a realizat utilizând, ca și în cazul precedent, preparate enzimatice obținute prin purificare cu alcool etilic. S-au efectuat determinări ale activității lipolitice, în condițiile descrise în metoda de analiză, cu excepția faptului că reacțiile enzimatice s-au efectuat la temperaturi cuprinse între 20 – 900C.

7.1.5. Studiul stabilității activității catalitice a lipazei microbiene

Pentru evidențierea termostabilității, preparatele enzimatice obținute prin precipitare cu alcool etilic s-au reluat în soluții tampon citrat pH = 6, 0,2 M și s-au menținut timp de 24 ore la temperaturi cuprinse între 200C si 600C. După incubare, soluțiile s-au răcit imediat pe baie de gheață, timp de 15 minute și s-a determinat activitatea enzimatică reziduală.

Pentru studiul stabilității enzimatice în funcție de pH, preparatele enzimatice obținute prin precipitare cu alcool etilic s-au reluat în soluții tampon citrat pH = 6, 0,2 M, iar soluțiile obținute s-au amestecat cu volume egale de soluții tampon de diferite pH-uri, cuprinse între 4 și 10, la temperatura de 300C. Soluțiile obținute s-au menținut în aceste condiții timp de 24 ore, după care s-a determinat activitatea reziduală.

7.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII

7.2.1. Izolarea lipazei din mediile de fermentație prin fracționare cu sulfat de amoniu

Rezultatele experimentale obținute în urma dozării proteinelor și a determinării activității lipolitice în precipitatele reluate după fiecare treaptă de fracționare cu sulfat de amoniu în domeniul de saturație cuprins între 30 – 60% sunt redate tabelul 18 [144, 145].

Factorul de purificare și activitatea enzimatică recuperată în fiecare din fracțiile precipitate sunt raportate la activitatea enzimatică și conținutul în proteine al lichidului de fermentație supus fracționării.

Din examinarea datelor prezentate în tabelul 18, se poate observa că salefierea cu sulfat de amoniu în procente de saturație cuprinse între 30 – 60% (treapta a doua de fracționare) a permis recuperarea a 52% din activitatea lipolitică inițială și realizarea unui factor de purificare de 3,3. În celelalte trepte de fracționare, I si III, s-au regăsit 21%, respectiv 17% din activitatea lipolitică initială, iar activitățile specifice au fost cu mult mai mici decât cele ale soluției inițiale, ceea ce evidențiază clar, faptul că în fracțiile I și III a precipitat o cantitate mare de proteine inactive, astfel încât preluarea acestor fracții pentru următoarea etapă de purificare nu se justifică.

Aceste rezultate conduc la concluzia că o primă treaptă de izolare a lipazei din lichidul de fermentație filtrat se poate realiza prin precipitarea enzimei cu sulfat de amoniu în procente de saturație cuprinse între 30 – 60%, cu recuperarea a 52% din activitatea lipolitică inițială și realizarea unui factor de purificare de 3,3 [145].

7.2.2. Izolarea lipazei din mediile de fermentație prin fracționare cu acetonă

Rezultatele experimentale obținute în urma dozării proteinelor și a determinării activității enzimatice în precipitatele reluate după fiecare treaptă de fracționare cu acetonă sunt redate tabelul 19 [144, 145].

Factorul de purificare și activitatea enzimatică recuperată în fiecare din fracțiile precipitate sunt raportate la activitatea enzimatică și conținutul în proteine al lichidului de fermentație supus fracționării.

Din examinarea datelor prezentate în tabelul 19 se poate observa că, față de precipitarea cu sulfat de amoniu, fracționarea cu acetonă nu conduce la o separare eficientă a lipazei de celelalte proteine din mediu. Prelucrarea cu acetonă a mediului de fermentație conținând lipază poate conduce la o concentrare a soluției proteice cu recuperarea unui procent semnificativ din activitatea lipazică (55%), dar impurificate în continuare cu proteine de balast (factor de purificare față de mediul de fermentație filtrat = 1,54). În aceste condiții, precipitarea cu acetonă s-ar putea aplica doar în etapele ulterioare de prelucrare, când se vor obține soluții purificate de enzimă, în scopul concentrării acestora.

Tabelul 18. Izolarea lipazei din mediul de fermentație prin precipitare fracționată cu sulfat de amoniu

Table 18. Isolation of lipase from the fermentation media by fractionate precipitation with ammonium sulphate

Tabelul 19. Izolarea lipazei din mediul de fermentație prin precipitare fracționată cu acetonă

Table 19. Isolation of lipase from the fermentation media by fractionate precipitation with acetone

7.2.3. Purificarea lipazei prin precipitare cu alcool etilic

Purificarea lipazelor prin precipitare cu alcool etilic s-a aplicat în cazul preparatelor enzimatice cu activitate lipolitică de 88 U/ml, obținute prin reluarea în soluție de clorură de calciu 0,01M a enzimei precipitată inițial cu sulfat de amoniu.

Astfel, s-au realizat diferite variante de precipitare prin adăugarea alcoolului etilic în soluția concentrată de enzimă, în fir subțire și sub agitare.

7.2.3.1. Influența concentrației de alcool etilic folosită la precipitare

Studiul acestui parametru s-a realizat în condițiile menționate în paragraful anterior, cu precizarea ca precipitarea s-a efectuat la +40C, prin agitare timp de 4 ore.

Rezultatele obținute sunt prezentate în figura 24 și tabelul aferent. În conformitate cu datele prezentate în tabel, se constată că cea mai înaltă activitate lipolitică, raportată la 6900 U/g, cantitatea totală de lipază obținută în urma precipitării fracționate cu sulfat de amoniu (fracția P2), a fost de 5610 U/g preparat enzimatic pudră, corelat cu un randament de recuperare a activității enzimatice din mediul de fermentație de 81%, s-a obținut în varianta cu raportul soluție enzimă : solvent = 1 : 3. În variantele cu raporturi soluție enzima : solvent de 1 : 4, respectiv 1 : 5, deși se obțin randamente de recuperare ale activității enzimatice foarte apropiate, preparatul enzimatic rezultat în urma precipitării se caracterizează printr-o activitate inferioară raportată la unitatea de masă, ceea ce înseamnă ca odată cu creșterea volumului de etanol încep să precipite și alte substanțe împreună cu enzima cercetată.

Figura 24. Influența concentrației de alcool etilic asupra izolării lipazei din soluții concentrate

Figure 24. Influence of ethylic alchool concentration on isolation of lipase from concentrated solutions

Rezultatele prezentate în figura 24 sunt detaliate în tabelul de mai jos.

Tabelul 20. Influența concentrației alcoolului etilic asupra izolării lipazei din soluția apoasă concentrată

Table 20. Influence of ethylic alchool concentration on isolation of lipase from concentrated solutions

7.2.3.2. Influența duratei de perfectare a precipitării

Studiul acestui parametru s-a efectuat folosind 3 volume etanol pentru un volum soluție concentrată de enzima, iar precipitarea s-a realizat la +40C. Rezultatele experiențelor privind determinarea duratei optime de precipitare, prezentate în figura 25, indică faptul că randamentul de precipitare obținut după două ore de agitare superior randamentului obținut după o oră de perfectare a precipitării și egal cu cel obținut după 3 ore. Prin urmare, pentru precipitarea completă a lipazei din soluția apoasă concentrată sunt suficiente 2 ore de agitare a suspensiei rezultate în urma adăugării etanolului.

Figura 25. Stabilirea duratei optime de perfectare a precipitării lipazei

Figure 25. Establishing the optimal duration of lipase precipitation

Rezultatele prezentate în figura 25 sunt detaliate în tabelul următor.

Tabelul 21. Stabilirea duratei optime de perfectare a precipitării lipazei

Table 21. Establishing the optimal duration of lipase precipitation

7.2.3.3. Influența temperaturii asupra activității și a randamentului de recuperare a lipazei

Din experientele efectuate privind dependența de temperatură a activității enzimatice a preparatului izolat sub formă de pudră și a randamentului de recuperare a activității enzimatice (figura 26), a reiesit că temperatura mai scăzută (+40C) favorizează acești indicatori. Astfel activitatea lipolitică a preparatului obținut prin precipitare la +40C este de 5610 U/g față de 3540 U/g, corespunzătoare temperaturii de 200C si 3550 U/g, la 300C.

Rezultatele obținute au condus la diferențe mari de recuperare a activității enzimatice globale, în favoarea variantei realizate la +40C.

Figura 26. Stabilirea temperaturii optime de precipitare a lipazei

Figura 26. Establishig the optimal temperature of lipase precipitation

Rezultatele prezentate în figura 26 sunt detaliate în tabelul prezentat în continuare.

Tabelul 22. Stabilirea temperaturii optime de precipitare a lipazei

Table 22. Establishig the optimal temperature of lipase precipitation

7.2.3.4. Influența ionilor de calciu asupra activității lipazei purificate

Procesul de sedimentare a proteinelor enzimatice dintr-un mediu hidroalcoolic este influențat de prezența ionilor unor metale, precum: Ca2+, Mg2+ ș.a. Acești ioni metalici pot influența atât activitatea enzimatică, asupra căreia pot exercita o influență de stabilizare, cât și randamentul de precipitare, acești ioni metalici pot influența și viteza de sedimentare și structura precipitatului [7, 146].

Studiul influenței ionilor de calciu s-a efectuat asupra fracției P2, precipitată cu sulfat de amoniu în domeniul 30 – 60% saturație, care s-a reluat într-o soluție de clorură 0,01M și s-a preincubat 1 oră la 370C, analizându-se ulterior activitatea enzimatică a preparatului, comparativ cu cea a soluției obținute prin reluarea fractiei P2 în apă distilată.

Rezultatele obtinute atesta faptul ca ionii de Ca2+ in concentratii de 0,01 M favorizeaza semnificativ activitatea lipazei, determinand o crestere cu 24% fata de activitatea enzimei in solutie apoasa, conform datelor prezentate in tabelul urmator.

Tabelul 23. Influența ionilor de Ca2+ asupra activității lipazei precipitate cu sulfat de amoniu

Table 23. Influence of Ca2+ on the lipase activity precipitated with ammonium sulphate

7.2.4. Efectul pH-ului asupra activității lipazei

Studiul influenței pH-ului asupra activității lipazei s-a realizat efectuând reacția enzimatică la diferite valori ale acestui parametru, cuprinse în domeniul 4 – 10, folosind diferite soluții tampon (tampon citrate pentru pH = 3 – 6, tampon fosfat pentru pH = 7 – 8 și tampon borat pentru pH = 9 – 10. În acest scop, s-au folosit preparare enzimatice obținute după purificarea cu alcool etilic.

Rezultatele obținute și prezentate în figura 27 au evidențiat faptul că pH-ul optim pentru acțiunea catalitică a lipazei obținută prin biosinteză este 6.

Figura 27. Influența pH-ului asupra activității lipazei izolată din mediul de biosinteză

Figure 27. Influence of pH value on the lipase activity isolated from the fermentation media

7.2.5. Efectul temperaturii asupra activității lipazei

Pentru studiul acestui parametru s-au efectuat determinări ale activității enzimatice a preparatelor obținute prin precipitare cu alcool etilic.

Reacțiile enzimatice s-au efectuat la temperaturi cuprinse între 20 – 800C.

Rezultatele obținute și prezentate în figura 28 au evidențiat faptul că temperatura optimă pentru acțiunea catalitică a lipazei obținută prin biosinteză este de 370C.

Figura 28. Influența temperaturii asupra activitătii lipazei izolată din mediul de biosinteză

Figura 28. Influence of temperature on the lipase activity isolated from the fermentation media

7.2.6. Stabilitatea fizico-chimică a preparatelor enzimatice obținute

Pentru evidențierea termostabilității, preparatele enzimatice obținute prin precipitare cu alcool etilic s-au reluat în soluții tampon citrat pH = 6 0,2 M și s-au incubat timp de 24 ore la temperaturi cuprinse între 200C și 600C. După incubare, soluțiile s-au răcit imediat în baie de gheață, timp de 15 minute și s-a determinat activitatea enzimatică reziduală.

Pentru studiul stabilității enzimatice în funcție de pH, preparatele enzimatice obținute prin precipitare cu alcool etilic s-au reluat în soluții tampon de diferite pH-uri, cuprinse între 4 și 10, la temperatura de 300C. Soluțiile obținute s-au menținut în aceste condiții timp de 24 ore, după care s-a determinat activitatea reziduală.

Rezultatele obținute în urma acestui set de experiențe, sunt redate în figurile 29 și 30.

Din figura 29 se poate observa că enzima cercetată este stabilă și reține mai mult de 80% din activitatea inițială dacă este menținută timp de 24 de ore, la 200C, 300C si 350C, în timp ce după 24 de ore, la 500C se regăsește 60% din activitatea inițială.

Figura 29. Influența temperaturii asupra stabilității activității catalitice a lipazei parțial purificată

Figure 29. Influence of temperature on the stability of catalitic activity of partialy purified lipase

În ceea ce privește stabilitatea enzimei la diferite valori ale pH-ului s-au constatat următoarele (figura 30): în domeniul 4 – 7 lipaza este foarte stabilă, reținând, după 24 de ore, aproape 100% din activitatea inițială. La pH = 8 și 9, enzima își pierde aproximativ 30%, respective 60% din activitatea inițială.

Figura 30. Influența pH-ului asupra stabilității activității catalitice a lipazei parțial purificată

Figure 30. Influence of pH value on the stability of catalitic activity of partialy purified lipase

7.3. Concluzii parțiale

Pentru izolarea și purificarea parțială a lipazei din mediile de biosinteză s-a aplicat metoda fracționării cu sulfat de amoniu și metoda precipitării cu solvenți organici.

Din aplicarea acestor tehnici în cazul mediului final de fermentație cu activitate lipolitică s-au desprins concluziile prezentate în continuare.

O primă treaptă de izolare a lipazei din lichidul de fermentație filtrat se poate realiza prin precipitarea enzimei cu sulfat de amoniu în procente de saturație cuprinse între 30 – 60%, cu recuperarea a 52% din activitatea lipolitică initială și realizarea unui factor de purificare de 3,3;

Față de precipitarea cu sulfat de amoniu, fracționarea cu acetonă nu conduce la o separare eficientă a lipazei de celelalte proteine din mediu. Prelucrarea cu acetonă a mediului de fermentație conținând lipaza poate conduce la o concentrare a soluției proteice cu recuperarea unui procent semnificativ din activitatea lipazică (55,5%), dar impurificate în continuare cu proteine de balast (factor de purificare = 1,54). În aceste condiții, precipitarea cu acetonă s-ar putea aplica doar în etapele ulterioare de prelucrare, când se vor obține soluții purificate de enzima, în scopul concentrării acestora;

În cazul precipitării cu alcool etilic, ca metodă de purificare a lipazei, s-au stabilit valorile optime ale parametrilor care influențează acest proces, în sensul asigurării unui randament cât mai mare și reproductibil de recuperare a activității enzimatice, după cum urmează:

raportul soluție enzimă : etanol = 1 : 3;

temperatura de precipitare: +40C;

timp de perfectare a precipitarii = 2 ore;

Prin aplicarea acestor parametrii s-au obținut preparate cu activități enzimatice cuprinse între 5610U/g și 6900 U/g.

În ceea ce privește caracterizarea preparatelor enzimatice microbiene cu activitate lipolitică, cercetările efectuate au evidențiat aspectele menționate în cele ce urmează:

Prezența ionilor de calciu în concentrații de 0,01 M favorizează semnificativ activitatea lipazei, determinând o creștere cu 24% față de activitatea enzimei în absența acestor ioni;

Parametrii optimi pentru acțiunea catalitică a preparatelor enzimatice produse de tulpinile sus-menționate și izolate din mediile de biosinteză sunt: temperatura = 370C, pH = 6;

Referitor la termostabilitatea preparatelor enzimatice obținute, s-a constatat că acestea sunt stabile și rețin mai mult de 80% din activitatea inițială dacă sunt menținute timp de 24 de ore la 200C, 300C si 350C, în timp ce după 24 de ore la 500C, se regasește 60% din activitatea inițială;

În ceea ce privește stabilitatea preparatelor lipolitice la diferite valori ale pH-ului, s-a constatat că în domeniul 4 – 7 sunt foarte stabile, reținând, după 24 de ore, aproape 100% din activitatea inițială; la un pH cuprins între 8 și 9, enzima își pierde aproximativ 30%, respectiv 60% din activitatea inițială.

Procedeele de izolare și purificare aplicate au condus la obținerea unor preparate cu activitate lipolitică similară unor produse din import, iar cercetările privind caracteristicile biochimice și stabilitatea acestor preparate au condus la rezultate importante pentru utilizarea ulterioară, ca biocatalizatori, a acestor preparate, în diferite domenii.

CAPITOLUL 8. CERCETĂRI PRIVIND OBȚINEREA UNOR PREPARATE BOGATE ÎN PRINCIPII ACTIVE CU EFECT POZITIV ASUPRA METABOLISMULUI LIPIDIC

Astăzi se acordă o atenție din ce în ce mai mare plantelor, aprecindu-se că ele reprezintă surse inepuizabile de materii prime care se regenerează an de an. Acestea pot fi utilizate ca materii prime la prepararea unor medicamente sau la extragerea industrială a principiilor active. În prezent, datorită progreselor științifice și de perfecționare a metodelor de izolare s-a reușit să se obțină în stare pură, în majoritatea cazurilor, substanțele chimice răspunzătoare de activitatea terapeutică a plantelor respective [147].

Pornind de la aceste considerente, principalul obiectiv al cercetărilor efectuate în cadrul acestui capitol a fost obținerea unor preparate complexe, cu un conțtinut ridicat în principii active cu efect pozitiv asupra metabolismului lipidic.

Dintre extractele menționate în capitolele 4.3.1 și 4.3.2. ca fiind indicate în prevenirea și tratarea multor afecțiuni cardiace și a cauzelor sau chiar a diferitelor stadii de obezitate cu consecințe grave de boli asociate, se vor reține pentru scopul propus în cadrul tezei de doctorat doar acelea care vor dovedi efectele cele mai adecvate.

Extractele obținute vor fi analizate prin metode moderne pentru a le caracteriza ca și compoziție în produși fitoterapici, bioactivi, în vederea corelării și stabilirii relațiilor dintre compoziția fitochimică și comportarea lor fitoterapică.

În cadrul prezentelor cercetări experimentale s-a optat pentru studiul următoarelor materiale vegetale:

fructe de cătină (Hippophae rhamnoides);

frunze și flori de păducel (Crataegus oxyacantha);

bulbi de usturoi (Allium sativum);

muguri de jugastru (Acer campestre).

Pentru atingerea scopului propus s-au avut în vedere mai multe obiective:

selectarea unor preparate vegetale cu un conținut crescut în principii active implicate în reglarea metabolismul lipidic;

caracterizarea farmacognostică a produselor vegetale selectate;

identificarea și dozarea compușilor activi din extractele vegetale obținute.

8.1. Materiale și metode

8.1.1. Materiale vegetale

În cadrul prezentelor cercetări experimentale s-au analizat următoarele materiale vegetale:

pubere din fructe de cătină (Hippophae rhamnoides);

pulbere din frunze și flori de păducel (Crataegus oxyacantha);

bulbi de usturoi (Allium sativum);

muguri de jugastru (Acer campestre).

8.1.2. Determinări farmacognostice ale produselor vegetale

Analiza farmacognostică reprezintă un ansamblu de metode calitative și cantitative efectuate cu scopul determinării identitătii, puritătii și calității unui produs vegetal [148].

În acest scop s-au efectuat o serie determinări:

examenul macroscopic;

determinarea purității;

determinarea umidității și a factorului de îmbibare.

8.1.2.1. Examenul macroscopic

Prin acest examen, care reprezintă primul stadiu de investigare a produselor vegetale, se urmăreste stabilirea caracterelor morfologice observate cu ochiul liber sau cu lupa, precum și a caracterelor organoleptice.

Determinările aplicate în cadrul acestui studiu impun anumite particularități, în funcție de natura organelor vegetale din care sunt constituite, precum și de felul prezentării lor, întregi, fragmente sau pulberi.

Caracterele organoleptice, prin culoarea, gustul și mirosul lor, oferă de multe ori și unele orientări asupra compoziției chimice a produselor analizate.

Parametrii urmăriți în cadrul examenului macroscopic sunt descriși în continuare.

Aspectul, prin care se stabilesc: forma produsului (întreg sau fragmentat), particularitățile fețelor, fractura, consistența, tipul secțiunii transversale și raportul dintre țesuturi.

Dimensiunile, se apreciază în:

centimetri – pentru majoritatea produselor, folosind rigla;

milimetrii – pentru fructele și semințele mici, folosind hârtia milimetrică.

Culoarea se observă cu ochiul liber, la exterior și la interior. Culoarea galbenă, roșie, albastră, portocalie a florilor presupune prezența pigmenților flavonici sau carotenoidici, culoarea portocalie la scoarțe, codițe și organe subterane indică prezența derivaților antrachinonici, culoarea brună la frunze, organe subterane și unele cotiledoane este explicată prin conținutul în taninuri catehice ale acestor produse.

Mirosul se percepe pe produsul ca atare, zdrobit între degete (frunze și flori) sau pulverizat. Mirosul aromat este corelat cu prezența uleiurilor volatile și/sau al cumarinelor.

Gustul se determină pe produsul ca atare sau pe decoct, nu se înghite, ci se aruncă, după care se clătește gura cu apă. Gustul amar al produselor se poate datora prezenței substantelor amare, heterozidelor cardiotonice sau unor alcaloizi, gustul astringent se datorează taninurilor, gustul aromat este dat de prezența uleiurilor volatile sau a rezinelor, iar gustul dulce este atribuit glucidelor.

8.1.2.2. Determinarea purității

Determinarea purității se face conform normelor prevăzute în farmacopee, de standarde interne sau de fișe tehnice, urmărind stabilirea impuritătilor din planta și a corpurilor străine.

Determinarea impurităților din produsele vegetale

Aceste impurități pot fi constituite din părți ale altor organe ale plantei. Tot în aceasta cetegorie intră produsele alterate (atacate de boli, insecte) sau degradate (frunze zdrobite, frunze brunificate) [149].

Determinarea corpurilor străine

Aceleași norme prevăd sau exclud prezența în produsele vegetale a unor corpuri străine (părți din alte plante, substanțe minerale, pământ, nisip etc).

Tehnica de lucru:

Impuritatile din planta sau părtile din alte plante și substantele minerale se aleg cu o pensetă, se cântăresc separat, iar rezultatele se exprimă în procente la100 g de produs [148, 149].

8.1.2.3. Determinarea umidității și a factorului de îmbibare

Determinarea umidității

Gradul de umidiate al produselor vegetale trebuie să se încadreze în anumite limite, care permit asigurarea conservării lor.

Determinarea umidității se poate face prin mai multe metode: uscare în etuvă, în vid, în exicator sau prin antrenare cu solvenți organici.

Tehnica de lucru:

Într-o fiolă de cântărire adusă la greutate constantă prin încălzire în etuvă, la aceeași temperatură la care urmează să se facă uscarea și răcită la exicator, se introduc 1-2 g din proba de analizat. Diametrul fiolei se alege astfel încât cantitatea de material vegetal luată în lucru să nu formeze un strat mai gros de 5 mm. Fiola cu produs vegetal se menține timp de 4 ore în etuvă, la 1050C, se răcește în exicator și se cântărește. Se continuă uscarea câte 60 min, răcirea în exicator și cântărirea până la greutate constantă.

Determinarea factorului de îmbibare

Factorul de îmbibare reprezintă volumul total (ml) ocupat de 1 g de produs vegetal și mucilagiu aderent, dupa îmbibare cu apă [149].

Determinarea factorului de îmbibare se efectuează într-un cilindru sau într-o eprubetă gradată de 25 ml, cu dop rodat, cu scara de gradație înaltă de 10-12,5 cm și cu subdiviziuni de 0,1 ml.

Tehnica de lucru:

1 g produs vegetal, pulverizat sau nu, cântărit la balanța analitică, se introduce în cilindrul sau eprubeta gradată și se umectează cu 1 ml alcool sau cu 1 ml acetonă. Se adaugă 25 ml apă și se agită energic timp de 1 h, astfel: primele patru agitări la intervale de câte 5 min, apoi din 10 in 10 min, până la 1 h, agitând de fiecare dată câte 1 min. Se lasă în repaus timp de 5 ore, apoi se citește volumul de produsul vegetal și mucilagul care aderă la acesta.

Pentru stabilirea factorului de îmbibare se calculează valoarea medie a trei determinări și se raportează la 1 g de produs vegetal.

8.1.3. Extracția substanțelor biologic active din materialele vegetale

8.1.3.1. Obținerea extractului din fructe de cătină (Hippophae rhamnoides)

Cătina (Hippophae rhamnoides) este un arbust spinos. Partea utilizată a plantei este reprezentată de fructele mature (Fructus Hippophae), proaspete sau uscate, dar cercetările din ultimul timp au arătat ca și celelalte părți ale plantei prezintă interes terapeutic.

Fructele de cătină se remarcă prin conținutul foarte mare în principii bioactive, nutritive și terapeutice, sau ca materie primă pentru realizarea de produse fitofarmaceutice, cosmetice, sau suplimente nutritive.

Utilizarea lor se datorează conținutului foarte bogat în vitamine, săruri minerale, microelemente, antioxidanți, fitohormoni etc. Fructele de cătină conțin vitamina C în proporție de două ori mai mare decât maceșele și de zece ori mai mare decât citricele. Vitaminele A, B1, B2, B6, B9, E, K, P și F sunt și ele prezente în fructele de cătină în concentrații importante. Aceste fructe conțin β-caroten în proporție mai mare decât la morcov și alți carotenoizi, microelemente ca fosfor, calciu, magneziu, potasiu, fier, proteine cu conținut ridicat în aminoacizi esențiali (în special lizina), uleiuri complexe (acizi grași saturați și nesaturați, steroli), acizi organici, cum sunt acidul malic, acidul succinic, acidul ursolic etc., precum și flavonoizi identici cu cei din Gingko biloba. Remarcabil este conținutul fructelor și frunzelor de cătină în substanțe cu efect hormonal, în special serotonina, substanță recunoscută ca având efecte fiziologice deosebite, legate de sistemul nervos central, sinteza proteinelor, stimularea sistemului imunoinductor etc [150].

Procedeul de extracție a principiilor active din fructele de cătină s-a aplicat asupra produsului sub formă de pulbere, procurată de la firma S.C. HOFIGAL S.A.

Tehnica de lucru:

Pentru prepararea extractului din fructe de cătină s-au introdus 50 g de pulbere într-un balon Erlenmeyer de 500 ml peste care s-au adăugat, 5 volume de alcool etilic. Amestecul obținut s-a lăsat la macerat timp de 5 zile, sub agitare, la temperatura camerei (nu mai mult de 250C), după care s-a decantat și s-a filtrat. Lichidul limpede obținut s-a folosit pentru determinarile ulterioare.

Schema 1. Schema fluxului tehnologic de obținere a extractului alcoolic din pulbere de fructe de cătină (Hippophae rhamnoides)

Scheme 1. Scheme of the technological process of obtaining alchoolic extract from underbrush fruts (Hippophae rhamnoides)

8.1.3.2. Obținerea extractului din bulbi de usturoi (Allium sativum)

Usturoiul (Allium sativum), membru al aceleeași familii de plante din care aparține și ceapa, face parte din familia Liliaceae. Usturoiul a fost considerat mult timp un medicament minune, datorită excepționalelor efecte terapeutice și puterilor vindecătoare care i-au fost atribuite.

Allium sativum este apreciat pentru proprietățile lui terapeutice ca activator al peristaltismului intestinal, antibacterial, antifungic, antiseptic general cu spectru foarte larg, hipotensor, antitrombotic, produce o scădere a colesterolului sanguin precum și a trigliceridelor, lipoproteinelor și fosfolipidelor serice [150].

Extractul de usturoi s-a obținut din bulbii (Allii satixi bulbus), denumiți curent „căței de usturoi”, procurați din surse proprii.

Tehnica de lucru:

Pentru prepararea extractului de usturoi s-au mărunțit 100 g de bulbi proaspeți, până la obținerea unei paste cât mai omogene. Pasta a fost introdusă într-un balon Erlenmeyer de 500 ml peste care s-au adăugat 2,5 volume de alcool etilic. Amestecul obținut s-a lăsat la macerat timp de 5 zile, sub agitare, la temperatura camerei (nu mai mult de 250C), dupa care s-a decantat și s-a filtrat. Lichidul limpede obținut s-a folosit pentru determinările ulterioare.

Schema tehnologiei de obținere a extractului din bulbi de usturoi este prezentat în continuare.

Schema 2. Schema fluxului tehnologic de obținere a extractului alcoolic din bulbi de usturoi

Scheme 2. Scheme of the technological process of obtaining alchoolic extract from garlic bulbs

8.1.3.3. Obținerea extractului din frunze și flori de păducel (Crataegus oxyacantha)

Denumit și gherghinar sau pomul lui Dumnezeu, păducelul este un arbust cunoscut încă din Antichitate de către daci, romani și greci, care îl utilizau în tratarea bolilor de inima, ficat și insomnii. Puține plante sau medicamente din lume au fost atât de studiate și de atât de multe ori confirmate și reconfirmate ca valoare terapeutică de către medici, ca acesta.

În fitoterapie, de la păducel se folosesc cu bune rezultate atât florile și frunzele cât și fructele.

Substanțele chimice din extractul de păducel acționează direct asupra muschiului cardiac, reglând bătăile inimii, și asupra vaselor de sânge, relaxând arterele sangvine din jurul cordului. De asemenea, păducelul acționează indirect, lărgind vasele de sânge aflate aproape de suprafața pielii, scăzând presiunea arterială. Substantele active din păducel scad nivelul colesterolului și reduc depunerile de grăsime de pe pereții arterelor și din alte țesturi (un bun aliat în curele de slăbire) [150].

Tehnica de lucru:

Tehnica de lucru aplicată pentru obținerea extractului de păducel se realizează conform capitolului 8.1.3.1.

Schema 3. Schema fluxului tehnologic de obtinere a extractului alcoolic din pulbere de frunze și flori de păducel (Crataegus oxyacantha)

Scheme 3. Scheme of the technological process of obtaining alchoolic extract from hawthorn (Crataegus oxyacantha) leafs and flowers

8.1.3.4. Obținerea extractului macerat glicerinat din muguri jugastru (Acer campestre)

Jugastrul este un arbore de dimensiune medie, circa 15-20 m înalțime, întâlnit foarte des în zonele împădurite.

Mugurii de jugastru se remarcă prin conținutul în acizi aminati, fitosteroli, zaharuri simple și complexe, enzime, minerale, taninuri și flavone, structuri chimice cu pronunțat efect antioxidant, hipocolesterolemiant, antiinflamator, vasodilatator și regenerator.

Extractele de jugastru se folosesc în special ca vasodilatator și anticolesterolemiant la nivel coronarian, SNC și periferic, și ca drenor hepato-biliar [150].

Extracția substanțelor biologic active din mugurii de jugastru s-a aplicat asupra produsului proaspăt, recoltat personal.

Tehnica de lucru:

Se recoltează mugurii proaspeți, înainte de a se dezvolta frunza. Se mărunțesc astfel încat să se pastreze o cantitate cât mai mare de sevă. Se trec 50 g din materialul vegetal într-un balon Erlenmeyer de 500 ml peste care se adaugă cantitatea corespunzătoare de alcool etilic de 96%, în raport de 1,5 : 1. Se lasă la macerat timp de 4 zile, după care se adaugă cantitatea corespunzatoare celui de-al doilea solvent, glicerina 10%, în raport de 2,5 : 1. Se lasă în continuare la macerat timp de 7 zile, agitând ușor și periodic conținutul vasului.

Extractul obținut se filtrează prin filtru cu dimensiunea porilor de aproximativ 0,45 µm, urmărindu-se obținerea unui lichid cât mai limpede.

Schema de prelucrare la nivel laborator a mugurilor de jugastru sub formă de extract macerat glicerinat este prezentată în continuare:

Schema 4. Schema fluxului tehnologic de obținere a extractului hidro-glicero-alcoolic din muguri de jugastru (Acer campestre)

Schema 4. Scheme of the technological process of obtaining hydro-glycero-alchoolic extract from (Acer campestre) buds

8.1.4. Determinarea calitativă a principiilor active din produsele vegetale

8.1.4.1. Identificarea flavonelor

a) Reacția Shibata

Principiul metodei

Reacția are la bază reducerea grupării cetonice a flavonelor în prezența hidrogenului rezultat din reacția magneziului cu acidul clorhidric concentrat. În urma reacției se formează clorura de oxoniu colorată în roșu.

Reactivi necesari:

HCl concentrat;

magneziu metalic.

Tehnica de lucru:

1 ml soluție probă se introduce într-o eprubetă cu câteva fragmente de magneziu metalic. La adăugarea a 4-6 picături de acid clorhidric concentrat apare o colorație roșie sau portocalie.

b) Reacția cu hidroxidul de sodiu

Principiul metodei

Flavonozidele se dizolvă în alcali cu obținerea unor fenolați (flavoxizi) colorați în galben intens.

Reactivi necesari:

soluție NaOH 5%.

Tehnica de lucru:

La 1 ml soluție de analizat se adaugă 1 ml solutie de hidroxid de sodiu 5%.

În cazul unei reacții pozitive, colorația galbenă a soluției de analizat se intensifică comparativ cu cea a martorului, în care nu s-a adăugat soluție de NaOH 5%.

c) Reacția cu clorura de aluminiu

Principiul metodei

Metoda are la bază formarea chelaților cu săruri ale metalelor bi- și trivalente. Chelații obținuți sunt de culoare galbenă intensă și au o fluorescență galben-verzuie sau albastră în UV.

Reactivi necesari:

soluție acetat de sodiu 10%;

soluție clorură de aluminiu 2,5%.

Tehnica de lucru:

La 1 ml soluție de analizat se adaugă 0,5 ml acetat de sodiu 10% și 1 ml clorura de aluminiu 2,5%. Colorația galbenă a soluției rezultate se intensifică.

8.1.4.2. Identificarea carotenoidelor

Carotenoidele sunt compuși vegetali lipofili, colorați în galben, portocaliu, roșu sau violet. Acești compuși constituie principala sursă de vitamina A pentru regnul animal și însoțesc perment colorofila.

Principiul metodei

Carotenoidele reacționează cu reactivul Carr-Price cu formarea unui compus de culoare caracteristică.

Reactivi necesari:

reactiv Carr-Price (triclorura de stibiu, soluție saturată în cloroform);

soluție H2SO4 concentrat.

Tehnica de lucru:

0,5 ml soluție extractivă se evaporă la sicitate într-o capsulă de porțelan (pe baia de nisip). Reziduul se tratează cu 1-2 picături reactiv Carr-Price sau cu 1-2 picături de H2SO4 concentrat. În cazul unei reacții pozitive, apare o colorație albastră intensă în prezența H2SO4 concentrat sau o colorație albastră care trece în roșu-purpuriu, apoi în roșu-brun în prezența reactivului Carr-Price.

8.1.4.3. Identificarea compușilor polihidroxifenolici

Principiul metodei

Metoda se bazează pe proprietatea fenolilor de a forma cu acidul azotos nitrozoderivați, ce se izomerizează spontan în izonitrozoderivați sau oxime care datorită caracterului lor slab acid, se dizolvă în soluții alcaline dând colorații roșii.

Reactivi necesari:

soluție HCl 0,1N;

reactiv Arnow (soluție apoasă de azotit de sodiu și molibdat de sodiu);

soluție NaOH 0,1N.

Tehnica de lucru:

La 0,5 ml soluție de analizat se adaugă 1 ml HCl 0,1N, 1 ml reactiv Arnow și 1 ml soluție NaOH 0,1N. În cazul unei reacții pozitive se obține o colorație roșie.

8.1.4.4. Identificarea compușilor reducători

Principiul metodei

În mediul alcalin, la cald, compușii reducători reduc complexul cuprotartric, format prin amestecarea soluțiilor Fehling I și Fehling II, până la oxid cupros (Cu2O), precipitat roșu cărămiziu.

Reactivi necesari:

soluție Fehling I (soluție apoasă de sulfat de cupru);

soluție Fehling II (soluție bazică de tartrat dublu de sodiu și potasiu în hidroxid de sodiu = sare Seignette).

Tehnica de lucru:

Într-un flacon Erlenmeyer de 500 ml, se pipetează 10 ml Fehling I, 10 ml Fehling II, 20 ml apă distilată și 1-3 ml probă. Se încălzește la flacără potrivită, pe o sită de azbest, astfel încât soluția să ajungă la fierbere în aproximativ 3 minute, după care se menține la fierbere 2 minute. Apariția unui precipitat roșu-brun depus la fundul vasului indică prezența compușilor reducători.

8.1.4.5. Identificarea fitosterolilor

Fitosterolii, sunt lipide ce intră în structura plantelor și au o compoziție similară cu a colesterolului (diferența constă în existența unui grup suplimentar etil). Toate plantele, incluzând fructele, legumele, cerealele, semințele conțin compuși sterol (numiți și steroline), dintre care cel mai frecvent întâlniți sunt β-sitosterolul, stigmasterolul și campesterolul. Ei au importanță în biosinteza hormonilor steroidici dar și a vitaminelor D. De asemenea, fitosterolii joacă un rol important în organism prin menținerea nivelului colesterolului la un nivel cât mai mic. Inhibă absorbția intestinală a colesterolului.

a) Reacția Liebermann-Burchard

Principiul metodei

În prezența acidului sulfuric concentrat și a anhidridei acetice, sterolii formează un dimer colorat în violet sau verde.

Reactivi necesari:

H2SO4 concentrat;

anhidridă acetică.

Tehnica de lucru:

3-4 ml soluție extractivă se evaporă la sicitate pe baia de apă. Reziduul se dizolvă cu 1-2 ml soluție anhidridă acetică. Se prelevează 1 ml peste care se adaugă 1 ml acid sulfuric concentrat. Apariția unei colorații violete indică prezența fitosterolilor în proba analizată.

b) Cromatografie în strat subțire

Principiul metodei

Cromatografia în strat subțire, reprezintă ca și celelalte tehnici cromatografice, un proces de distribuție diferențiată a compușilor analizați între două faze nemiscibile. Acest proces implică: un adsorbant convenabil (silicagelul), un solvent organic sau amestec de solvenți și probele de analizat.

Reactivi și materiale necesare:

Absorbant: silicagel pe suport de aluminiu (Sigma) ;

Developant: benzen : cloroform : metanol (15 : 8 : 2);

Reactiv de identificare: H2SO4 20%;

Soluție proba: extract din materialul vegetal;

Soluții etalon: -sitosterol, colesterol, stigmasterol, acid ursolic si acid oleanolic 0,1%.

Tehnica de lucru:

Vasul cromatografic se saturează cu vaporii developantului prin căptușirea pereților vasului cromatografic cu hârtie de filtru, lăsâdu-se o mică porțiune neacoperită, se introduce solutia developanta, astfel încât să formeze un strat de 10 mm, se acoperă vasul și se lasă aprox. 30 min.

Linia de strart trebuie situată la o distanță de 2 cm de marginea plăcii. Pe placuta cromatografica, la linia de start, se aplica cate 5 l din solutiile de extract si solutiile etalon de sitosterol, colesterol, stigmasterol, acid ursolic si acid oleanolic. După uscarea spoturilor, placa cromatografică se introduce în vasul cromatografic, unde se lasa la migrat cca. 15 cm. Cromatograma se scoate din vasul cromatografic, se usucă in etuva și se pun în evidență spoturile prin pulverizare cu reactivul de identificare.

Plăcuța cromatografică se examinează imediat la lumina zilei pentru interpretarea rezultatelor.

8.1.4.6. Identificarea aminoacizilor

Punerea în evidență a aminoacizilor s-a realizat prin cromatografie în strat subțire, metoda prezentată anterior.

Reactivi și materiale necesare:

Absorbant: silicagel pe suport de aluminiu (Sigma), 15 cm x n (în funcție de numărul spoturilor aplicate);

Developant: butanol : acid acetic : apă (4 : 1 : 5);

Reactiv de identificare: ninhidrină 0,5% in acetonă;

Soluție probă: extract din materialul vegetal;

Soluții etalon: -sitosterol, colesterol, stigmasterol, acid ursolic și acid oleanolic 0,1%.

Tehnica de lucru:

5 g de extract macerat glicerinat din muguri de jugastru se hidrolizeză timp de 6 ore cu 15 ml HCl 6N. Hidrolizatul se evaporă până la 1 ml.

Se pipetează pe cromatogramă câte 5 l de hidrolizat și soluții etalon de aminoacizi preparați în concentrație de 0,1%. După uscarea spoturilor, placa se introduce în vasul cromatografic, unde se lasă la migrat pe toată lungimea placutei, oprindu-se la 5 mm de marginea superioară. Cromatograma se scoate din vasul cromatografic, se usucă în etuva la 1000C și se pulverizează cu soluție de ninhidrină 0,5% pentru evidențierea spoturilor. Se introduce din nou în etuvă la 1000C timp de 2 minute.

Plăcuța cromatografică se examinează imediat la lumina zilei pentru interpretarea rezultatelor.

8.1.5. Determinarea cantitativa principiilor active din produsele vegetale

8.1.5.1. Determinarea activității lipolitice

Determinarea activității enzimatice a lipazelor din extractele preparate se face conform metodei titrimetrice descrisă în capitolul 6.1.6.1.

8.1.5.2. Dozarea flavonelor

Principiul metodei

Flavonele care au grupări hidroxil libere, extrase în solvenți hidrofili, formează cu clorura de aluminiu chelați de culoare galbenă intensă a căror extincție se determină spectrofotometric la 430 nm. Intensitatea culorii chelaților formați este direct proporțională cu concentrația flavonelor în mediul de reacție.

Reactivi necesari:

metanol;

soluție clorură de aluminiu 2,5%;

soluție acetat de sodiu 10%;

rutozid (Fluka).

Tehnica de lucru:

Prepararea probei de analizat:

La 1 g de produs vegetal mărunțit se adaugă 100 ml alcool etilic de 500, într-un balon cu dop rodat și de încălzește la fierbere, pe baia de apă, la reflux, timp de 30 min. Soluția fierbinte se filtrează într-un balon cotat, iar după răcire se completează la 100 ml, prin spălarea reziduului cu același solvent.

Analiza propriu-zisă:

10 ml soluție probă se diluează cu metanol la 25 ml, într-un balon cotat. Se agita timp de 2-3- min și se lasă în repaus 10 min. Se filtrează și se îndepărtează primele porțiuni de filtrat. La 5 ml filtrat de adăuga 5 ml acetat de sodiu 10 % și 3 ml clorură de aluminiu 2,5%, se agită bine și se completează cu metanol până la 25 ml, într-un balon cotat. Se determină absorbanța la soluției la 430 nm, folosind ca martor o soluție obținută în aceleași condiții la și proba, din 5 ml filtrat, 8 ml apă și metanol până la 25 ml, într-un balon cotat.

Concentrația în flavonoide se calculează cu ajutorul unei curbe etalon în care se folosește ca etalon o soluție de rutozid 0,01% în metanol.

Trasarea curbei de etalonare:

În patru baloane cotate se introduc câte 1, 2, 3 si 4 ml soluție etalon de rudozid 0,01% în metanol, 5 ml acetat de sodiu 10% și 3 ml clorură de aluminiu 2,5% și metanol până la 25 ml. Se citesc absorbanțele celor patru soluții la 430 nm, față de un martor preparat din 8 ml apă și metanol până la 25 ml.

8.1.5.3. Dozarea compușilor polihidroxifenolici

Pentru determinarea cantitativă a polihidroxifenolilor s-a folosit metodă spectrofotometrică prevazută în Farmacopeea Europeană Ediția 5 [151].

Principiul metodei

Fenolii formează în prezența acidului azotos nitrozoderivați care izomerizează spontan atunci când se află în mediu alcalin, în derivați izonitrozo sau în oxime. Acestea, având caracter slab acid, se dizolvă în soluții alcaline, dând colorații roșii.

Reactivi necesari:

soluție HCl 0,5M;

reactiv Arnow (soluție apoasă de azotit de sodiu și molibdat de sodiu);

soluție NaOH10%;

metanol 50%;

apă distilată.

Tehnica de lucru:

Prepararea soluției de analizat:

1 g produs vegetal se refluxează în 25 ml metanol 50%. Se răcește, se filtrează și se spală filtrul cu 5 ml metanol 50%. Soluția se aduce într-un balon cotat la 25 ml și se completează până la semn cu acelați solvent.

Analiza propriu-zisă:

Într-un balon cotat de 10 ml se introduc 1 ml soluție extractivă, 2 ml soluție acid clorhidric 0,5M, 2 ml soluție obținută prin dizolvarea a 10 g azotit de sodiu și 10 g molibdat de sodiu în 100 ml apă distilată, apoi 2 ml soluție hidroxid de sodiu 10% și s-a completat la semn cu apă distilată. Se agită bine și se determină absorbanța la 525 nm, față de un martor preparat în aceleași condiții, dar în care reactivul Arnow a fost înlocuit cu apă distilată.

Procentul de polihidroxifenoli din proba analizată se exprimă în acid clorogenic și se calculează dupa formula:

A x 5,3

C% =

m

unde: A = absorbanța la 525 nm (pentru acidul clorogenic A=188);

m = masa de probă luată în lucru.

8.1.5.4. Dozarea zaharurilor reducătoare

Principiul metodei

În mediul alcalin, la cald, glucidele reducătoare reduc complexul cuprotartric, format prin amestecarea soluțiilor Fehling I și Fehling II, până la oxid cupros (Cu2O), precipitat roșu cărămiziu. Gruparea aldehidică se oxidează la carboxil.

Soluția de sulfat de cupru și sarea Seignette, în exces de hidroxid de sodiu, poartă numele de soluție Fehling. De obicei, aceasta se prepară în momentul întrebuințării prin amestecarea a două soluții de bază, în cantități egale:

soluție Fehling I (soluție apoasa de sulfat de cupru);

soluție Fehling II (soluție bazică de tartrat dublu de sodiu si potasiu in hidroxid de sodiu = sare Seignette).

Complexul cuprotartric oxidează funcțiunea aldehidică a glucidului reducător (glucoza), reducându-se la oxid cupros. Cantitatea de oxid cupros este proporțională cu cantitatea de glucoză din mediul de reacție.

În metoda Schoorl, restul de Cu(OH)2 care nu a fost redus se acidulează cu H2SO4, transformându-se din nou în CuSO4 și I2, care se titrează cu tiosulfat de sodiu.

La titrare, se utilizează ca indicator o soluție de amidon care formează cu iodul un compus colorat în albastru închis. După titrare, soluția devine albă.

Reactivi necesari:

soluție Fehling I;

soluție Fehling II;

soluție H2SO4%;

soluție KI 20%;

soluție amidon 1%.

Tehnica de lucru:

Într-un flacon Erlenmeyer de 500 ml, se pipetează 10 ml Fehling I, 10 ml Fehling II, 20 ml apă distilată și 1-3 ml probă. Se încălzește la flacără potrivită, pe o sită de azbest, astfel încât soluția să ajungă la fierbere în aproximativ 3 minute, după care se menține la fierbere 2 minute. Apariția unui precipitat roșu-brun depus la fundul vasului indică prezența compușilor reducători. Deasupra flaconului se așează o pâlnie de sticlă pentru condensarea vaporilor de apă. Se răcește flaconul cu apă curentă, după care se adaugă 10 ml acid sulfuric 25% și 10 ml iodură de potasiu 20%.

Soluția obținută se titrează sub agitare cu tiosulfat de sodiu 0,1N, până când soluția devine gălbuie. Se adaugă câteva picături de amidon 1% și se continuă titrarea până când culoarea soluției devine albă.

În paralel se realizează un martor, folosind 20 ml apă distilată, 10 ml Fehling I și 10 ml Fehling II. La martor nu este necesară fierberea. În continuare se lucrează identic ca proba.

Tabelul 24. Corespondența între concentrația substantelor reducătoare și volumul de tiosulfat utilizat la titrare

Table 24. Relation between the concentration of reducing substances and the volume of thiosulphate used for titration

Calculul rezultatelor:

(N – n)* F = X ml Na2S2O3

Concentrație SR (%) = mgSR x 0,1

unde: N = volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit pentru titrarea martorului;

n = volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei;

F = factorul soluției de tiosulfat de sodiu 0,1N (0.9900);

mg SR = echivalența în susbstanță reducătoare citită în tabelul 24.

8.1.5.5. Determinarea cantității de acid ascorbic

Vitamina C este un nutrient esențial vieții. Ea se găsește în majoritatea plantelor verzi și în fructe, mai ales citrice. Acidul ascorbic este una dintre cele mai importante vitamine necesare organismului uman, întrucat joacă un rol esențial, de agent reducător. El este implicat în producția de glucocorticosteroizi și de anumiți neurotransmițători (substanțe care permit transmisia influxului nervos), în metabolismul glucozei, al colagenului, al acidului folic și al anumitoraminoacizi, în neutralizarea radicalilor liberi și a nitrozaminelor, în reacții imunologice, care facilitează absorbția fierului la nivelul tubului digestiv.

Determinarea și dozarea acestuia, din diverse materiale vegetale, constituie obiectul de studiu a numeroși cercetători.

a) Metoda 2-6 diclorfenol

Principiul metodei

In solutie acida, acidul ascorbic reduce 2-6 diclorfenol-indofenolul la leucoderivat. Capacitatea unui extract de vitamina C de a reduce o solutie de colorant este direct proportionala cu continutul de acid ascorbic [152].

Reactivi necesari:

2-6 diclorfenol-indofenol;

soluție tampon de fosfat pH = 6,8-7,0;

soluție acid oxalic 1%.

Tehnica de lucru:

0,2 g de 2-6 diclorfenol-indofenol se introduc într-un balon Erlenmeyer de 100 ml peste care se adaugă apoi 30 ml apă distilată. Se încălzește la fierbere timp de 2-3 minute, apoi conținutul este filtrat prin hârtie calitativă într-un balon cotat de 500 ml. Peste reziduul din balonul Erlenmeyer se adaugă o nouă porțiune de apă distilată, se încălzește la fierbere, apoi conținutul este trecut prin același filtru în balonul cotat.

Operația se repetă până la solubilizarea completă a substanței colorante. Se răceste conținutul balonului cotat, se adaugă 150 ml soluție tampon fosfat pH = 7,0 și se aduce la semn cu apă distilată.

Se cântaresc 5 g pulbere cătină într-un cilindru gradat 100 ml și se aduce la semn cu acid oxalic soluție 1%. Se omogenizează bine, după care amestecul este centrifugat. Din supernatant, se prelevează 10 ml, se trec într-un balon Erlenmeyer de 100 ml și se titrează cu soluție 2-6 diclorfenol-indofenol, până la apariția colorației roz.

În cazul produselor sulfitate efectul reducător al bioxidului de sulf se îndepărtează prin adaugarea a 20 ml acetonă în cilindrul gradat peste materialul cântarit. Se aduce apoi la semn cu acid oxalic 1%.

Calculul cantității de acid ascorbic conținut în probă analizată se face cu ajutorul următoarei formule:

V x F x 0,088 x 10

Acid ascorbic (mg/g) =

n

unde: V = ml de 2-6 diclorfenol-indofenol folosiți la titrare;

F = factorul soluției de 2-6 diclorfenol-indofenol (1,189463);

0,088 = mg acid ascorbic corespunzătoare la 1 ml soluție 2-6 diclorfenol-indofenol 0,01 N (mg);

n = cantitatea de pulbere luată în analiză (g).

b) Metoda titrimetrică

Reactivi necesari:

– acid sulfuric 10%;

– soluție iod 0,1N.

Tehnica de lucru:

2,5 g pulbere degresată din fruct de cătină (probă) se cântăresc într-un vas de titrare, se adaugă 100ml apă purificată după care se încălzește până la fierbere 1 minut. Peste soluția fierbinte se adaugă 5 ml acid sulfuric 10% și se titrează cu soluție iod 0.1N până la colorație albastră persistentă, în prezență de amidon soluție 1%, ca indicator [153].

1ml soluție 0,1N corespunde la 0,008806g acid ascorbic (Vitamina C).

Formula de calcul:

V x 0,008806

Acid ascorbic (g %) = x 100

n

unde: V = volumul de soluție iod 0.1N cu care se titreaza proba (ml);

n = masa probei luate in lucru (g).

8.2. Rezultate și discuții

8.2.1. Determinări farmacognostice ale produselor vegetale

8.2.1.1. Examenul macroscopic

În urma examinării macroscopice a produselor vegetale mărunțite s-au constatat urmatoarele aspecte:

Aspectul

pulbere din fructe de cătină: pulbere omogenă, higroscopică, provenită din fructe mature;

pulbere de frunze și flori de păducel: pulbere neomogenă, higroscopică, provenită din frunze și flori mature;

bulbi de usturoi: produs întreg, provenit de la planta matură;

muguri de jugastru: produs întreg, provenit de la planta imatură, înainte de a se dezvolta frunza (înainte de germinație).

Dimensiunile

pulbere din fructe de cătină: fragmente de 1-2 mm;

pulbere de frunze și flori de păducel: fragmente cu dimensiuni variate, cuprinse între 0,5-0,1 mm;

bulbi de usturoi: produs întreg cu dimensiuni cuprinse între 2-2,5 cm;

muguri de jugastru: produs întreg cu dimensiuni cuprinse între 0,5-0,7 cm.

Culoarea

pulbere din fructe de cătină: portocaliu-închis;

pulbere de frunze și flori de păducel: combinație de verde-închis cu alb;

bulbi de usturoi: alb-gălbui;

muguri de jugastru: verde.

Mirosul

pulbere din fructe de cătină: plăcut, caracteristic fructelor;

pulbere de frunze și flori de păducel: plăcut, caracteristic;

bulbi de usturoi: caracteristic;

muguri de jugastru: plăcut, proaspăt.

Gustul

pulbere din fructe de cătină: acrișor;

pulbere din frunze și flori de păducel: amărui, puțin astringent;

bulbi de usturoi: caracteristic;

muguri de jugastru: caracteristic.

8.2.1.2. Determinarea purității

În privința determinării impuritaților, în urma examinării macroscoscopice a pulberii de cătină nu s-au gasit părți ale altor organe ale plantei sau alte produse alterate sau degradate decât cele specificate.

În cazul păducelului, s-au găsit fragmente de frunze și flori brunificate, 1,7%, respectiv 5,1%, resturi de ramuri mai lungi de 1 cm, 2,3%.

Rezultate mai bune s-au obtinut în cazul determinării corpurilor străine prezente în pulberea de păducel 0,2% și pulberii de cătină 0,5%.

Pentru mugurii de jugastru și bulbii de usturoi, ambele determinări au fost 0%, întrucât probele au fost recoltate personal și menținute în condiții de laborator.

8.2.1.3. Determinarea umidității și a factorului de îmbibare

În urma uscării produselor vegetale în etuvă, s-au obținut următoarele valori ale umidității:

pulbere din fructe de cătină: 1%;

pulbere din frunze și flori de păducel: 0,8%;

bulbi de usturoi: 93%;

muguri de jugastru: 82%.

În urma determinării factorului de îmbibare am stabilit pentru produsele vegetale luate în studiu, valori ale factorului de îmbibare de:

pulbere din fructe de cătină: 10,3-10,9%;

pulbere din frunze și flori de păducel: 10,7-11,2%;

bulbi de usturoi: 2,8-2,9%;

muguri de jugastru: 2,1-2,3%.

Valorile relativ ridicate obținute în cazul produselor pulverizate, pot fi corelate cu prezența în cantități relativ mari a diverselor mucilagii.

8.2.2. Identificarea principiilor active din materialele vegetale

În urma reacțiilor de identificare a principiilor active din cele patru tipuri de materiale vegetale testate, s-a constatat ca majoritatea prezintă în compoziția lor compușii testați.

Evaluarea rezultatelor obținute este prezentată în tabelele următoare:

Tabelul 25. Identificarea flavonelor în materialele vegetale

Table 25. Identification of flavons in plant materials

Tabelul 26. Identificarea carotenoidelor in materialele vegetale

Table 26. Identification of carotenoids in plant materials

Tabelul 27. Identificarea compușilor polihidroxifenolici în materialele vegetale

Table 27. Identification of polyhydroxyphenols in plant materials

Tabelul 28. Identificarea compusilor reducători în materialele vegetale

Table 28. Identification of reducing compounds in plant materials

Tabelul 29. Identificarea fitosterolilor în materialele vegetale

Table 29. Identification of phytosterols in plant materials

Tabelul 30. Identificarea aminoacizilor în materialele vegetale

Table 30. Identification of aminoacids in plant materials

În cazul bulbilor de usturoi s-au identificat aproximativ 10 aminoacizi: cisteină, arginină, leucină, alanină, histidină, acidul L-aspartic, lizină, serină, tirozină, acid L-glutamic, fenilalanină, glicină (figura 37).

8.2.3. Determinarea cantitativă a principiilor active din produsele vegetale

8.2.3.1. Determinarea activității lipolitice

În urma analizelor efectuate pentru determinarea activității lipolitice a extractelor obținute în fazele anterioare ale prezentelor cercetări, s-a observat că o activitate lipolitică ridicata se întâlnește la fructele de cătină, 6,3 U/g produs uscat, precum și la extractul din bulbi de usturoi, 4,9 U/g produs proaspat. De asemenea, o activitate lipolitică ridicată s-a regăsit și la frunzele și florile de păducel, 3,2 U/g produs uscat, în timp ce la extractul glicerinat din muguri de jugastru aceasta a fost foarte scăzută, de numai 0,4 U/g produs proaspăt.

Rezultate obținute în cadrul cercetărilor de dozare a activității lipolitice din extractele vegetale sunt prezentate în figura următoare:

Figura 38. Activitatea lipazică determinată în extractele materialelor vegetale

Figure 38. Lipolytic activity of plant materials

Tabelul 31. Valorile activității lipolitice determinate la extractele vegetale

Table 31. Values of lipolytic activity determined in the plant extracts

8.2.3.2. Dozarea flavonelor

Dozarea flavonelor din mediile de extracție s-a realizat printr-o metodă spectrofotometrică prin care se determină absorbanța chelaților formați în urma reacției flavonelor cu clorura de aluminiu.

Pentru evaluarea cantității de flavone din mediul de reacție s-a trasat curba de etalonare conform metodei descrise la capitolul 8.1.5.2. Ca substanță etalon se folosește o soluție de rutozid 0,01% în metanol. Conținutul în flavone al probelor s-a calculat prin interpolarea extincțiilor citite pe curba de etalonare și raportarea la 100 g produs vegetal (uscat sau proaspăt).

Astfel, pentru fiecare din produsele vegetale s-a determinat cantitatea de flavone, exprimatat în rutozid, rezultatele fiind reprezentate grafic în figura următoare:

Figura 39. Curba de etalonare pentru rutozid

Figure 39. Etalon curve of rutozid

Tabelul 32. Conținutul în flavone al materialelor vegetale

Table 32. Flavone content of plant materials

Figura 40. Conținutul în flavone al materialelor vegetale

Figura 40. Flavone content of vegetable materials

Din analiza rezultatelor prezentate în tabelul 32 se observă că valorile cele mai mari ale conținutului în flavone s-au obținut în cazul frunzelor și florilor de păducel. De asemenea, un conținut destul de mare s-a obținut și în cazul fructelor de cătină. Un conținut mai mic s-a observat la mugurii de jugastru. În cazul bulbilor de usturoi au fost confirmate analizele preliminare de identificare a acestor compuși, în cadrul cărora rezultatele pentru conținutul în flavone a fost nul.

8.2.3.3. Dozarea compușilor polihidroxifenolici

Pentru determinarea cantitătivă a acestor compuși s-a folosit o metoda spectrofotometrică prin care sunt puși în evidență izonitrozoderivații formați din fenolii aflați în mediu alcalin, în prezența acidului azotos.

Conținutul în compuși polihidroxifenolici determinat în materialele vegetale este exprimat în grame de acid clorogenic la 100 g material vegetal și poate fi observat în tabelul 33.

Tabelul 33. Conținutul în compuși polihidroxifenolici al materialelor vegetale

Table 33. Polyhydroxyphenols content of plant materials

Figura 41. Conținutul în compuși polihidroxifenolici al materialelor vegetale

Figura 41. Polyhydroxyphenols content of vegetable materials

8.2.3.4. Dozarea zaharurilor reducătoare (metoda Schorl)

Determinarea cantitțăii de zaharuri reducătoare s-a realizat printr-o metodă titrimetrică, foarte des utilizată, cunoscută sub denumirea de metoda Schorl.

Din analiza rezultatelor prezentate în tabelul 34 se observă că valorile cele mai mari ale conținutului în zaharuri reducătoare s-a obținut în cazul fructelor de cătină. De asemenea, un conținut relativ ridicat s-a obținut și în cazul frunzelor și florilor de păducel și usturoi. Un conținut redus s-a observat la mugurii de jugastru.

Tabelul 34. Conținutul în compuși reducători al materialelor vegetale

Table 34. Reducing compounds content of plant materials

Figura 42. Conținutul în compuși reducători al materialelor vegetale

Figure 42. Reducing compounds content of plant materials

8.2.3.5. Determinarea cantității de acid ascorbic

Dozarea cantității de acid ascorbic din materialele vegetale s-a realizat pe baza unei metode titrimetrice bazată pe proprietatea vitaminei C de a reduce 2-6 diclorfenol-indofenolul la leucoderivat.

Rezultatele obținute și prezentate în figura 43 au evidențiat faptul că, așa cum se specifică și în literatura de specialitate, conținutul cel mai ridicat în vitamina C s-a obținut în cazul fructelor de cătină, atingând valoarea maximă de 483 mg/100 g de produs uscat. Pentru celelalte materiale vegetale testate s-au obținut valori mici, dar cuprinse în limitele normale menționate în datele de literatură. Astfel, în cazul frunzelor și florilor de păducel cantitatea de vitamina C a fost de 23,4 mg/100 g produs vegetal uscat, iar pentru bulbii de usturoi, 17,3 mg/100 g produs proaspăt. Mugurii de jugastru nu au prezentat în compoziția lor viatmina C.

Figura 43. Conținutul în acid ascorbic al materialelor vegetale

Figura 43. Ascorbic acid content of vegetable materials

Tabelul 35. Conținutul în vitamina C al materialelor vegetale

Table 35. Ascorbic acid content of plant materials

8.3. Concluzii parțiale

În urma cercetărilor efectuate asupra produselor vegetale selectate s-au putut desprinde următoarele concluzii:

În privința caracterizării farmacognostice s-au stabilit aspestul, dimensiunea, culoarea, mirosul, gustul, puritatea și umiditatea materialelor vegetale;

Analiza calitativă a extractelor obținute a permis identificarea a numeroase principii bioactive:

La pulberea din fructe de cătină s-a determinat prezența flavonelor, carotenoidelor, compușilor polihidroxifenolici, compușilor reducători, aminoacizilor și fitosterolilor, în special -sitosterol și stigmasterol (dar și acid ursolic și oleanolic);

La frunzele și florile de păducel s-a determinat prezența flavonelor, carotenoidelor (mai puțin decât la fructele de cătină), compușilor polihidroxifenolici, compușilor reducători, fitosterolilor, în special -sitosterol și stigmasterol (dar și acid ursolic și oleanolic); s-a remarcat lipsa aminoacizilor;

La bulbii de usturoi: s-a determinat prezența compușilor polihidroxifenolici, compușilor reducători, aminoacizilor (10 aminoacizi) și fitosterolilor; s-a remarcat lipsa flavonelor și carotenoidelor;

La mugurii de jugastru s-a determinat prezența flavonelor (cantități mici), carotenoidelor (cantități mici), compușilor polihidroxifenolici (cantități mici), aminoacizilor și fitosterolilor (cantități mari); nu s-au determinat compuși reducători.

Activitate lipolitică ridicată, s-a determinat la fructele de cătină, 6,3 U/g produs uscat, precum și la extractul din bulbi de usturoi, 4,9 U/g produs proaspăt. De asemenea, o activitate lipolitică ridicată s-a regăsit și la frunzele și florile de păducel, 3,2 U/g produs uscat, în timp ce la extractul glicerinat din muguri de jugastru aceasta a fost foarte scazută, de numai 0,4 U/g produs proaspăt;

Determinările cantitative au confirmat testele calitative în privința conținutului în principii bioactive:

Cele mai mari valori ale conținutului în flavone s-au obținut în cazul frunzelor (0,22 g/100 g) și florilor de păducel (0,37 g/100 g). Un conținut mai scăzut s-a observat la mugurii de jugastru, iar în cazul bulbilor de usturoi conținutul în flavone a fost nul;

Cel mai ridicat conținut în compuși polihidroxifenolici s-a determinat la păducel și cătină, 1,7g/100 g, respectiv 1,55 g/100 g;

Compușii reducători au fost determinați în cantitate mare la fructele de cătină (1,45 g/100 g), celelalte materiale testate prezentând un conținut cu 50% mai scăzut decât cătină;

Conținutul cel mai ridicat în vitamina C s-a obținut în cazul fructelor de cătină, atingând valoarea de 483 mg/100 g de produs uscat. Pentru celelalte materiale vegetale testate s-au obținut valori mici. În cazul frunzelor și florilor de păducel cantitatea de vitamina C a fost de 20 de ori mai mică decât la fructele de cătină;

Coroborând rezultatele obținute în cadrul analizelor calitative și cantitative ale materialelor vegetale testate s-au putut selecta, în vederea obținerii unor biopreparate complexe, pulberea din fructe de cătină, pulberea din funze și flori de păducel și extractul din bulbi de usturoi, bogate în numeroase principii bioactive cu rol în reglarea metabolismului lipidic.

CAPITOLUL 9. CERCETăRI PRELIMINARE LA NIVEL DE LABORATOR PRIVIND COMBINAREA COMPUșILOR BIOLOGICI OBțINUțI SUB FORMă DE COMPRIMATE

Realizarea și introducerea unui nou preparat vegetal în terapeutică necesită efectuarea unor studii complexe bazate pe cunoștințe amănunțite în domeniile științelor farmaceutice, agronomice, biologice, biochimice și medicale.

În alegerea materialului de cercetat, date importante sunt furnizate de practica medicinii populare și de cercetările de chemotaxonomie.

Se acordă prioritate plantelor din flora spontană care se găsesc în cantități necesare stabilite prin lucrările de cartare [132].

Cercetarile efectuate în cadrul prezentului studiu experimental au vizat realizarea următoarelor obiective:

formularea unor biopreparate cu activitate lipolitică, stabile din punct de vedere fizico-chimic, alcătuite din lipază obținută din surse microbiene și preparate origine vegetală;

obținerea unor granule care să poată fi în continuare prelucrate sub formă de comprimate;

obținerea comprimatelor conținând lipaze microbiene și preparate vegetale bogate în principii active cu rol în reglarea metabolismului lipidic.

9.1. Materiale și metode

9.1.1. Formulări realizate

Cercetările au vizat formularea unor biopreparate cu activitate lipolitică, stabile din punct de vedere fizico-chimic, în alcătuirea cărora să intre lipaza obținută din surse microbiene alături de preparate de origine vegetală, pulbere din fructe de cătină, pulbere din funze și flori de păducel, extract de usturoi, bogate în numeroase principii bioactive cu rol în reglarea metabolismului lipidic.

Variantele de preparate obținute prin asocierea materiilor prime menționate mai sus, sunt prezentate în tabelul următor.

Tabelul 36. Variante de preparate asociate

Table 36. Variants of asociated preparates

Inițial, s-a încercat asocierea dintre lipaza de biosinteză, extractul din fructe de cătină și extractul din bulbi de usturoi, rapoartele de asociere folosite variind de la 1 : 25 : 20, până la 1 : 40 : 5, pentru 100 g de produs finit.

Un alt grup de cercetări, au constat în folosirea pulberii de lipază microbiană, alături de pulberea din fructe de cătină și pulberea din frunze și flori de păducel, care conține, de asemenea, o cantitate considerabilă de lipaze (3,2 U/g de produs uscat) la rapoarte de asociere de 1 : 25 : 25 si 2 : 20 : 20 .

Raportul de asociere între cele trei componente a urmărit atât necesarul de lipază pe unitatea de formă farmaceutică cât și efectul antioxidant determinat de complexul fitochimic obținut prin asocierea menționată care asigură beneficii terapeutice crescute în ceea ce privește prevenirea și tratatrea bolilor generate de dezechilibrul lipidic din organism.

Pentru asigurarea stabilității în timp a produsului finit, nu s-au folosit conservanți de sinteză ci uleiuri esențiale de cimbru, de fenicul și de rozmarin cu un pronunțat efect antiseptic. Uleiurile esențiale, pe lângă efectele antifungice și antibacteriene, au și proprietăți de potențare a efectelor cumulate antilipemice, anticolesterolemiante și de ameliorare a circulației coronare și cerebrale.

9.1.2. Prepararea granulei în vederea realizării comprimatelor

Pentru prepararea granulei care să conțină principalii produși naturali selectați ca fiind cei mai eficienți, sub aspect fitofarmaceutic pentru scopul propus, pulberea din fructe de cătină, pulberea de păducel, alături de lipaza de biosinteză și uleiuri esențiale, s-au folosit următorii excipienți: lactoza, stearat de magneziu, Tween, propilenglicol, derivați de Pullulan (carboximetil), amidon, alcool etilic, lecitină, etc [154-158].

Cu produșii naturali menționati și cu diferite combinații între excipienți s-au realizat mai multe formule pentru obținerea unor granule care să poată fi în continuare comprimate.

S-a considerat că forma de condiționare solidă este cea mai accesibilă și convenabilă atât pentru forma de prezentare a materiilor prime fitoterapice și de biosinteză, cât și pentru stabilitatea produsului și pentru administrarea lui orală este comprimarea.

Un aspect dificil care a trebuit sa fie soluționat a fost acela legat de protejarea formei farmaceutice de atacul și solubilizarea sa în sucul gastric, unde enzimele lipolitice sunt complet inactivate.

Pentru aceasta, s-a folosit un produs enterosolubil, carboximetilpullulanul, solubilizat în anumite concentrații în propilenglicol, alcool și apă [155, 156].

Pentru experimentele de granulare s-au încercat trei formule care sunt prezentate în următorul tabel:

Tabelul 37. Variante de formule sub forma de granula, evaluate pentru 100 g de produs

Table 37. Variants of granules composition, evatuated for 100 g product

9.1.3. Descrierea tehnologiei de obținere a comprimatelor la nivel de laborator

Amestecul materiilor prime bioactive, cântărite separat și sitate prin site fine pentru omogenizare, se amestecă cu lactoză și se sitează din nou.

În cazul formulelor propuse pentru a asigura o încorporare uniforma a lipazei se realizează un amestec primar între lipază și lactoză, care se introduce apoi în amestecul total de pulberi. Granularea se obtine prin sitare folosind ca liant hidrogelul de amidon. Acestea se întind în tăvi și se usucă în curent de aer cald la 40-450C (în etuvă).

După uscare granulele se lubrefiază cu stearat de magneziu și se uniformizează din nou prin sitare pentru a realiza o repartizare omogenă la comprimare.

Soluția enterosolubilă (gastrorezistentă) este preparată prin dizolvarea agentului filmogen, carboximetilpullulanul, în alcool, după care, în soluția obținută se adaugă plastifiantul, propilenglicolul, și agentul tensioactiv, Tween. Pelicula filmogenă gastrorezistentă se obține prin pulverizarea soluției pe suprafața granulelor.

În final, granulele se usucă în etuvă, la 40-450C, până la greutate constantă, urmând a fi supuse operației de comprimare [157, 158].

Forma farmaceutică obținută urmează a fi supusă unei serii întregi de analize fizico-chimice, farmacognostice, farmacotehnice și biologice, necesare introducerii produsului pe piața în vederea tratării unor afecțiuni. Cu ocazia efectuării acestor analize se va decide și necesitatea unei îmbunătățire a preparatului din punct de vedere terapeutic.

Schema 5. Schema fluxului tehnologic de obținere a comprimatelor de lipază

Scheme 5. Scheme of the technological process of obtaining the comprimates of lipase

9.1.4. Verificarea calității microbiologice a produselor farmaceutice

9.1.4.1. Determinarea numărului total de microorganisme aerobe

Principiul metodei

Verificarea microbiologică constă în determinarea numărului total de microorganisme viabile care cresc în condiții aerobe (bacterii și fungi) și se efectuează prin inocularea directă a probei de analizat în medii de cultură care asigură dezvoltarea de microorganisme. Produsul, ca materie primă, face parte din categoria produselor medicinale preparate din plante la care nu se efectuează o pretratare antimicrobiană înainte de folosire.

Determinarea numărului total de bacterii aerobe

Reactivi și materiale necesare:

Mediul nr. 1 (Mediu geloză):

– Bacto-peptonă 10 g

– Clorură de sodiu 5 g

– Agar 20 g

– Extract de carne 10 g

– Apă până la 1 000 ml

Bacto-peptona, clorura de sodiu, agarul sub formă de pulbere și extractul de carne se dispersează într-un volum de apă, se adaugă apoi restul de apă și se încălzește la fierbere pană la dizolvare completă. pH-ul soluției se ajustează astfel încât după sterilizare să fie 7,4±0,1. Se filtrează, se repartizează în flacoane și se sterilizează la 1210C, timp de 15 min [149].

Tehnica de lucru:

10 g proba luată în lucru se dizolvă în 100 ml tampon fosfat pH = 7, într-un balon cotat. Se repartizează câte 1 ml din diluțiile 1 la 10, 1 la 100 și 1 la 1000 în câte două plăci Petri sterile, cu diametrul de 9 – 10 cm. Se adaugă în fiecare placă aproximativ câte 15 ml mediu nr. 1 topit și răcit la 450C. Se acoperă placa cu capacul, se rotește usor pentru a amesteca diluția probei cu mediul de cultură și se lasă să se solidifice la temperatura camerei. Se întorc plăcile cu capacul în jos și se incubează la 30 – 350C, timp de 48 h. Se numără coloniile de bacterii aerobe dezvoltate. Se calculează rezultatele, folosind plăcile care prezintă cel mai mare număr de colonii și considerind că 300 colonii reprezintă numarul maxim pentru o evaluare satisfăcătoare [149].

Determinarea numărului total de fungi, levuri și fungi filamentoși

Reactivi și materiale necesare:

Mediul nr. 2 (Mediu Sabouraud):

– Bacto-peptonă 10 g

– Glucoză monohidrat 20 g

– Agar 20 g

– Apă până la 1 000 m1

Bacto-peptona, glucoza monohidrat și agarul sub formă de pulbere se dispersează în apă și se încălzește la fierbere până la dizolvare completă. pH-ul soluției se ajustează astfel încât după sterilizare să fie 5,5±0,1. Se filtrează, se repartizează în flacoane și se sterilizează la 1210C, timp de 15 min [149].

Tehnica de lucru:

Se procedează conform prevederilor de la „Determinarea numărului total de bacterii aerobe” cu deosebirea că se folosește mediul nr. 2 și că incubarea se efectuează la 20-250C, timp de 7 zile. Numărarea coloniilor dezvoltate se efectuează după 3, 5 și 7 zile. Se calculează rezultatele folosind plăcile care prezintă cel mult 100 colonii. Determinarea numărului de fungi se poate efectua comparativ pe un mediu Sabouraud care a fost făcut selectiv prin adăugarea de antibiotice: benzilpenicilină potasică 100 U.I./ml și clorhidrat de tetraciclină 100 U.I./ml, sub formă de soluții sterile înainte de folosire, sau cloramfenicol 0,5 mg/ml care se poate adăuga înaintea sterilizării mediului [149].

Determinarea numărului total de bacterii coliforme pe g sau pe ml probă

Reactivi și materiale necesare:

Mediul nr. 3 (Mediu bulion lactozat):

– Bacto-peptonă 5 g

– Extract de carne 3 g

– Lactoză 10 g

– Albastru de bromtimol 2 g/l 36 ml

– Apă până la 1 000 ml

Bacto-peptona, extractul de carne și lactoza se dizolvă în apă încălzită la aproximativ 500C, se ajustează pH-ul la 7,4 se filtrează și se adaugă albastru de bromtimol 2 g/l. Se repartizează în eprubete prevăzute cu tuburi de fermentație și se sterilizează la 1150C, timp de 20 min [149].

Mediul nr. 4 (Mediu MacConkey):

– Bacto-peptonă 20 g

– Clorură de sodiu 5 g

– Taurocolat de sodiu 5 g

– Purpuriu de bromcrezol 0,2 % 5 ml

– Lactoză 10 g

– Apă pană la 1 000 ml

Bacto-peptona, clorura de sodiu și taurocolatul de sodiu se dizolvă în apă încălzită la aproximativ 500C. Se ajustează pH – ul la 8,0 și se încălzește la fierbere, timp de 20 min. Se răcește, se filtrează și se ajustează pH-ul la 7,4. Se adaugă lactoza și purpuriul de bromcrezol 2 g/l, se amestecă, se repartizează în eprubete prevăzute cu tuburi de fermentație si se sterilizează la 1150C, timp de 30 min [149].

Tehnica de lucru:

Se efectuează prin însămanțarea a câte 1 ml din diluțiile 1 la 10, 1 la 100 și 1 la 1000, în două serii a câte trei eprubete: primele trei eprubete, prevăzute cu tuburi de fermentație, conțin câte 10 ml mediu nr. 3, iar celelalte trei eprubete conțin câte 10 ml mediu nr. 4. Prima serie de eprubete cu mediul nr. 3 se incubează la 30-350C, timp de 48 h și a doua serie de eprubete cu mediul nr. 4 se incubează la 440C timp de 48 h. Se examinează eprubetele în care s-au dezvoltat bacteriile cu producere de gaz. Numărul maxim probabil de bacterii coliforme pe gram sau pe mililitru probă se calculează conform prevederilor din următorul table [149]:

Tabelul 38. Calculul numărului maxim probabil de bacterii coliforme pe g sau pe ml probă

Table 38. Maximum probable number of coliform bacteria per g or per ml

9.2. Rezultate și discuții

9.2.1. Studiul formulelor realizate

Prin cercetările realizate s-a urmărit obținerea unor biopreparate cu activitate lipolitică, stabile din punct de vedere fizico-chimic, în alcătuirea cărora să intre lipaza obținută din surse microbiene alături de preparate de origine vegetală.

Variantele de preparate obținute prin asocierea materiilor prime meționate anterior, au fost prezentate în capitolul 9.1.

După mai multe încercări, s-a constatat faptul că extractul de usturoi nu poate fi folosit la prepararea unor granule, din cauza mucilagiului gumos pe care-l conține și care împiedică uscarea granulelor, favorizând astfel lipirea între ele. Ca urmare, s-a renunțat la folosirea lui. Din studiul biblografic realizat pe aceasta tema, a reieșit că extractul de usturoi (macerat mucilaginos), poate fi condiționat doar prin asociere cu uleiuri comestibile, care la rândul lor ridică dificultați de asociere cu alte produse pulverulente și nu pot fi granulate [129; 154].

Folosirea pulberii de cătină se justifică prin faptul că pe lângă lipază, ea reprezintă și un complex fitochimic de mare valoare terapeutică cu valoare antioxidantă mare. Este un valoros polimineralizant, având în cantitate de ordinul sutelor de mg% calciu, necesar pentru activitatea lipazei, este un polivitaminizant care are toată gama de vitamine hidrosolubile și liposolubile, conține de asemenea acizi grași esențiali, lecitine și fosfolecitine, caroteni, acizi aminati cu sulf și ceilalți în cantități mari (de circa 10% exprimați ca proteine totale), zaharuri foarte variate, flavone și acizi polifenolcarboxilici, enzime oxidoreducătoare și altele, conferindu-i acestui produs vegetal o valoare antioxidantă foarte crescută la concentrații foarte mici. S-a considerat că acest produs reprezintă un valoros anticolesterolemiant și antilipemic, iar prin adăugarea lipazei de biosinteză efectul lipolitic este sensibil crescut.

Ca urmare, pe lângă aceste două componente de bază, pulberea din fructe de cătină și lipază de biosinteză, s-a mai adaugat și pulberea din frunze și flori de păducel, care, datorită compoziției sale în acizi crategici, acid ursolic și oleanolic, în antociani și proantociani, flavone și acizi polifenolicarboxilici, colina, vitamina C și minerale, realizează un bun efect vasodilator, hipotensiv și sedativ la nivelul coronarelor și al SNC, prin ameliorarea circulației coronare și cerebrale având și un efect antioxidant foarte bun. În tabelul următor este prezentată compoziția finală a produsului obtinut:

Tabelul 39. Compoziția produsului finit

Table 39. Composition of the final product

9.2.2. Caracterizarea sumară a produselor realizate la nivel de laborator

Produsul realizat la nivel de laborator, în mai multe formule, a fost testat treptat prin metode fizico-chimice specifice.

Astfel, s-a considerat că forma farmaceutică cea mai potrivită pentru noul tip de produs este aceea de comprimat, ușor de dozat și de administrat, permițând și protejarea gastrică a granulelor prin acoperire cu film enterosolubil.

Rezultatele analizelor realizate asupra preparatului sub formă de comprimate sunt prezentate în tabelul 40.

Tabelul 40. Caracterizarea produsului obținut sub formă de comprimate obținute la nivel de laborator

Table 40. Characterization of the final product under comrpimate form, at laboratory level

9.3. Concluzii parțiale

Din cercetările experimentale realizate în vederea obținerii unor preparate fitofarmaceutice obținute prin asocierea preparatelor lipolitice de origine microbiană cu materiale vegetale bogate în principii active s-au desprins următoarele concluzii:

Asocierea cea mai potrivită obiectivului urmărit este cea obținută dintre lipaza de biosinteză, pulberea din fructe de cătină și pulberea din frunze și flori de păducel, care conțin un complex fitochimic de mare valoare terapeutică, cu valoare antioxidantă ridicată;

Condiționarea noului tip de produs s-a făcut sub formă de comprimate, ușor de dozat și de administrat, permițând și protejarea gastrică a granulelor prin acoperire cu film enterosolubil;

Caracterizarea sumară a comprimatelor obținute a întrunit toate condițiile necesare unei eventuale introduceri a produsului pentru folosirea acestuia în vederea prevenirii sau ameliorării unor afecțiuni ale metabolismului lipidic;

Comprimatele obținute au un efect puternic anticolesterolemiant și antilipemic, polimineralizant și polivitaminizant, întrucât fructele de cătină conțin toată gama de vitamine hidrosolubile și liposolubile, iar vitamina C se găsește în cantități foarte mari. Datorită conținutului în pulbere de păducel, au un bun efect vasodilator hipotensiv și sedativ la nivelul coronarelor și al SNC, prin ameliorarea circulației coronare și cerebrale. De asemenea, conține acizi grași esențiali, lecitine și fosfolecitine, caroteni, aminoacizi, zaharuri, flavone și acizi polifenolcarboxilici, enzime oxidoreducatoare, conferindu-i acestui produs vegetal o valoare antioxidantă foarte crescută la concentrații foarte mici.

CONCLUZII GENERALE

În urma cercetărilor efectuate în cadrul tezei de doctorat se pot desprinde următoarele concluzii generale:

Tulpina cu cele mai bune rezultate în privința potențialului de lipolitic s-a dovedit a fi drojdia Yarrowia lipolytica, cu un indice lipolitic mediu de 1,19;

Studiile de microscopie optică au arătat că tulpina de Yarrowia lipolytica are structura caracteristică a unui fung imperfect, fiind formată din celule și pseudomiceliu;

Experimențele de mutageneză cu radiații UV a permis selectarea unei mutante,Yarrowia lipolytica UV-40 cu un indice lipolitic de 1,5;

În cadrul experimențelor de mutageneză cu UV s-a stabilit că viabilitatea pentru fiecare doză de agent mutagen a fost de:

V20 = 54.38%;

V40 = 13.21%;

V60 = 2.24%;

V120 = 1.07%.

Testele efectuate pentru stabilirea condițiilor optime de biosinteză a lipazei cu tulpina Yarowia lipolytica UV-40 au condus la următoarele concluzii:

Mediul pentru biosinteza lipazei la nivel de laborator are următoarea compoziție:

Ulei de măsline 2%;

Peptonă 0,5%;

Extract de drojdie 0,5%;

Fosfat de amoniu 0,5%;

Sulfat de magneziu 0,1%;

Fosfat monopotasic 0,2%.

Adăugarea în mediul de fermentație a uleiului de măsline, în concentrație de 2%, a determinat o creștere de 4,7 ori a activității lipazei, față de mediul martor;

Aerarea puternică a mediului de fermentație, corespunzătoare unui raport volum mediu/volum flacon de 1:6,7, a avut un efect favorabil asupra biosintezei lipazei;

Condițiile optime pentru biosinteză s-au realizat prin aplicarea următorilor parametrii de lucru:

raport de inoculare = 10%

temperatură = 280C;

pH = 6;

agitare = 240 rpm;

aerare corespunzătoare unui raport volum mediu / volum flacon = 1/6,7;

durata fermentației = 54 de ore.

În condiții optime de biosinteză s-a obținut o activitate lipolitică de 15 U/ml mediu de fermentație.

Aplicarea tehnicilor de izolarea și purificarea parțială a lipazei din mediile de biosinteză, prin fracționare cu sulfat de amoniu și precipitare cu solvenți organici au condus la următoarele concluzii:

O primă treaptă de izolare a lipazei din lichidul de fermentație filtrat se poate realiza prin precipitarea enzimei cu sulfat de amoniu în procente de saturație cuprinse între 30 – 60%, cu recuperarea a 52% din activitatea lipolitică inițială și realizarea unui factor de purificare de 3,3;

Față de precipitarea cu sulfat de amoniu, fracționarea cu acetonă nu conduce la o separare eficientă a lipazei de celelalte proteine din mediu. Prelucrarea cu acetonă a mediului de fermentație conținând lipază poate conduce la o concentrare a soluției proteice cu recuperarea unui procent semnificativ din activitatea lipazică (55,5%), dar impurificate în continuare cu proteine de balast (factor de purificare = 1,54);

În cazul precipitării cu alcool etilic ca metodă de purificare a lipazei, s-au stabilit valorile optime ale parametrilor care influențează acest proces, în sensul asigurării unui randament cât mai mare și reproductibil de recuperare a activității enzimatice, după cum urmează:

raportul soluție enzimă : etanol = 1:3;

temperatura de precipitare: +40C;

timp de perfectare a precipitării: 2 ore;

concentrație de clorură de calciu: 0,2%.

Prin aplicarea acestor parametrii s-au obținut preparate cu activități enzimatice cuprinse între 5610U/g și 6900 U/g.

În ceea ce privește caracterizarea preparatelor enzimatice microbiene cu activitate lipolitică, cercetările efectuate au evidențiat aspectele menționate în cele ce urmează:

Prezența ionilor de calciu în concentrații de 0,01 M favorizează semnificativ activitatea lipazei, determinând o creștere cu 24% față de activitatea enzimei în absența acestor ioni;

Parametrii optimi pentru acțiunea catalitică a preparatelor enzimatice sunt: 370C, pH = 6;

Referitor la termostabilitatea preparatelor enzimatice obținute, s-a constatat că acestea sunt stabile și rețin mai mult de 80% din activitatea inițială dacă sunt menținute timp de 24 de ore la 20, 30 și 350C, în timp ce după 24 de ore la 500C, se regăsește 60% din activitatea inițială;

În ceea ce privește stabilitatea lipazelor la pH, s-a constatat că în domeniul 4 – 7 sunt foarte stabile, reținând, după 24 de ore, aproape 100% din activitatea inițială; la pH = 8 și 9, enzima își pierde aproximativ 30%, respectiv 60% din activitatea inițială.

Procedeele de izolare și purificare aplicate au condus la obținerea unor preparate cu activitate lipolitică similară unor produse din import, iar cercetările privind caracteristicile biochimice și stabilitatea acestor preparate au condus la rezultate importante pentru utilizarea ulterioară, ca biocatalizatori, a acestor preparate, în diferite domenii.

Cercetările efectuate asupra conținutului în principii active a materialelor vegetale au condus la următoarele concluzii:

La pulberea din fructe de cătină s-a determinat prezența flavonelor, carotenoidelor, compușilor polihidroxifenolici, compușilor reducători, aminoacizilor și fitosterolilor, în special -sitosterol și stigmasterol;

La frunzele și florile de păducel s-a determinat prezența flavonelor, carotenoidelor (mai punțin decât la fructele de cătină), compușilor polihidroxifenolici, compușilor reducători, fitosterolilor, în special -sitosterol și stigmasterol;

La bulbii de usturoi: s-a determinat prezența compușilor polihidroxifenolici, compușilor reducători, aminoacizilor (10 aminoacizi) și fitosterolilor; s-a remarcat lipsa flavonelor și carotenoidelor;

La mugurii de jugastru s-a determinat prezența flavonelor (cantități mici), carotenoidelor (cantități mici), compușilor polihidroxifenolici (cantități mici), aminoacizilor și fitosterolilor (cantități mari); nu s-au determinat compuși reducători.

Activitate lipolitică ridicată s-a determinat la fructele de cătină 6,3 U/g produs uscat, precum și la extractul din bulbi de usturoi 4,9 U/g produs proaspăt. De asemenea, o activitate lipolitică ridicată s-a regăsit și la frunzele și florile de păducel, 3,2 U/g produs uscat, în timp ce la extractul glicerinat din muguri de jugastru aceasta a fost foarte scăzută, de numai 0,4 U/g produs proaspăt.

Determinările cantitative au confirmat testele calitative în privința conținutului în principii bioactive:

Cele mai mari valori ale conținutului în flavone s-au obținut în cazul frunzelor (0,22 g/100 g) și florilor de păducel (0,37 g/100 g). Un conținut mai scăzut s-a observat la mugurii de jugastru, iar în cazul bulbilor de usturoi conținutul în flavone a fost nul;

Cel mai ridicat conținut în compuși polihidroxifenolici s-a determinat la păducel și cătină, 1,7g/100 g, respectiv 1,55 g/100 g;

Compușii reducători au fost determinați în cantitate mare la fructele de cătină (1,45 g/100 g), celelalte materiale testate prezentând un conținut cu 50% mai scăzut decât cătină;

Conținutul cel mai ridicat în vitamina C s-a obținut în cazul fructelor de cătină, atingând valoarea de 483 mg/100 g de produs uscat. Pentru celelalte materiale vegetale testate s-au obținut valori mici. În cazul frunzelor și florilor de păducel cantitatea de vitamina C a fost de 20 de ori mai mic decât la fructele de cătină;

Ținând cont de rezultatele obținute în urma analizelor calitative și cantitative ale materialelor vegetale testate s-au selectat pentru obținerea unor biopreparate complexe, pulberea din fructe de cătină, pulberea din funze și flori de păducel și extractul din bulbi de usturoi;

Din cercetările experimentale realizate în vederea obținerii unor preparate fitofarmaceutice obținute prin asocierea preparatelor lipolitice de origine microbiană cu materiale vegetale bogate în principii active s-au desprins următoarele concluzii:

asocierea cea mai potrivită obiectivului urmărit este cea obținută dintre lipaza de biosinteză, pulberea din fructe de cătină și pulberea din frunze și flori de păducel, care conțin un complex fitochimic de mare valoare terapeutică, cu valoare antioxidantă ridicată;

condiționarea noului produs s-a făcut sub formă de comprimate, ușor de dozat și de administrat, permițând și protejarea gastrică a granulelor prin acoperire cu film enterosolubil;

comprimatele obținute au un efect puternic anticolesterolemiant și antilipemic, polimineralizant și polivitaminizant, întrucât fructele de cătină conțin toată gama de vitamine hidrosolubile și liposolubile, iar vitamina C se găsește în cantități foarte mari. Datorită conținutului în pulbere de păducel, au un bun efect vasodilator hipotensiv și sedativ la nivelul coronarelor și al SNC, prin ameliorarea circulației coronare și cerebrale. De asemenea, conține acizi grași esențiali, lecitine și fosfolecitine, caroteni, aminoacizi, zaharuri, flavone și acizi polifenolcarboxilici, enzime oxidoreducătoare, conferindu-i acestui produs vegetal o valoare antioxidantă foarte crescută la concentrații foarte mici.

Produsul fitoterapeutic realizat reprezintă o asociere complexă de principii bioactive naturale și elemente minerale sub formă de săruri ușor asimilabile în organism, care acționează sinergic la anumite concentrații, având acțiune de reducere a nivelului lipidelor serice, a colesterolului seric, a concentrației LDL – colesterol și a trigliceridelor serice.

El prezintă următoarele avantaje:

este ușor de administrat;

nu produce reacții adverse;

nu prezintă contraindicații;

nu interferă linia metabolică a altor medicamente.

Varietatea mare de substanțe bioactive din principiile active asociate în formula produsului, fac din acesta un important și eficient preparat hipolipemiant.

Lucrarea de față constituie un punct de plecare în realizarea și comercializarea unei forme farmaceutice destinate administrării orale, pentru prevenirea sau ameliorarea unor afecțiuni determinate de dezechilibrul lipidic din organism.

Originalitatea acestei teze de doctorat constă în obținerea unui preparat biologic prin asocierea unor produse de origine microbiană, alături de produse vegetale, bogate în principii active și elemente minerale, sub formă de săruri ușor asimilabile în organism, care acționează asupra reducerii nivelului trigliceridelor serice și a colesterolului seric, prevenind sau ameliorând astfel, unele tulburări apărute în organism, la nivelul metabolismului lipidic.

BIBLIOGRAFIE

ANEXA 1

REZUMAT LA TEZA DE DOCTORAT CU TITLUL

„Studii privind obținerea unor biopreparate cu activitate lipolitică din surse microbiene și plante medicinale indigene”

Este cunoscut faptul că alimentația inadecvată, bazată în principal pe preparate exclusiv prelucrate de tip „fast-food”, care au luat o amploare mare și în România, asociată și cu alți numeroși factori, cum ar fi stresul zilnic și lipsa de mișcare, conduc la obezitate, o boală care generează afecțiuni complexe ale organismului. Această maladie este cauzată de disfuncțiile ce apar în cadrul metabolismului lipidic.

Teza de doctorat cu titlul „Studii privind obținerea unor biopreparate cu activitate lipolitică din surse microbiene și plante medicinale indigene” este extinsa pe 211 pagini și este alcătuită, în conformitate cu prevederile legale actuale, din doua părti principale, una teoretică, si cea de-a doua, experimentală. Prima parte, intitulată „Aspecte teoretice”, structurată în 4 capitole, este desfașurată pe parcursul a 55 de pagini, conținând 2 tabele și 6 de figuri, iar partea a doua, denumită „Cercetări experimentale”, alcătuită din 5 capitole, cuprinde 135 pagini, conținând 38 de tabele, 39 de figuri.

Prima parte este alcătuită din patru capitole, în care sunt prezentate succint, informații din literatura de specialitate referitoare la subiectul tezei, care au fost folosite ulterior pentru elaborarea metodelor și procedurilor aplicate în partea experimentală, precum și pentru interpretarea și compararea datelor obținute.

Primul capitol, intitulat „Prezentarea generală a lipazelor”, prezintă date din literatura de specialitate referitoare caracterizarea lipazelor și a surselor principale de obținere ale acestora. Lipazele sunt carboxil-ester hidrolaze care catalizează reacția de hidroliză a esterilor glicerolului sau a altor alcooli cu acizi grași cu catenă lungă, cu formare de acizi grași liberi și glicerină sau alcoolul corespunzător. Particularitatea lipazelor constă în proprietatea unică și specifică de a acționa la interfața ulei-apă dintr-un mediu eterogen (emulsii).

Rolul biologic al lipazelor pentru organismele vii este deosebit de important, întrucât ele asigură funcționarea membranelor, participă la metabolismul lipidic, la procesul de depozitare al grăsimilor de rezervă, etc.

Lipazele își găsesc numeroase aplicații, printre care putem enumera: la obținerea unor medicamente indicate în dispersii sau de tip antiinflamator non-steroidal, ca aditivi alimentari, pentru obținerea biodieselului, pentru îndepărtarea grăsimilor de pe fibrele de bumbac, a pieilor și blănurilor sau pentru epurarea apelor reziduale.

Enzimele lipolitice pot fi obținute din surse animale, vegetale sau microbiene. În ultimele decenii, pentru obținerea unui spectru larg de enzime și substante biologic active, se utilizează cu succes microorganismele. Pentru creșterea randamentelor de biosinteză, este necesară cunoașterea necesităților nutriționale ale microorganismelor producătoare de enzime.

Utilizarea lipazelor ca substanțe active ce intră în compoziția unor preparate farmaceutice, impune obținerea lor într-un grad de puritate cât mai avansată, standardizarea conținutului lor, precum și cunoașterea proprietăților, referitoare nu numai la specificitatea de substrat, ci și la principalii parametrii care influențează activitatea enzimatică. Astfel, în capitolul 2 sunt prezentate „Metodele de izolare și purificare a proteinelor enzimatice cu activitate lipolitică”, iar în capitolul 3 sunt descrise „Metodele aplicate pentru dozarea activității lipazelor”.

Astăzi se acordă o atenție din ce în ce mai mare plantelor, aprecindu-se că ele reprezintă surse inepuizabile de materii prime care se regenerează an de an. Acestea pot fi utilizate ca materie primă la prepararea unor medicamente sau la extragerea industrială a anumitor principii active. În ultimul capitol al primei părți, intitulat „Fitoterapia – cea mai curată și mai naturală știință aplicativă”, sunt prezentate avantajele utilizării plantelor în terapeutică și sunt exemplificate anumite preparate vegetale folosite pentru prevenirea sau tratarea anumitor afecțiuni.

În acest context, obiectivul principal al cercetărilor realizate în cadrul tezei de doctorat a constat în obținerea unor biopreparate cu activitate lipolitică, stabile din punct de vedere fizico-chimic, obținute prin combinarea lipazei microbiene cu preparate vegetale, care prezintă un conținut bogat în principii active, ce se adresează unui segment al populației cu afecțiuni complexe, generate de dezechilibrul lipidic din organism.

Pornind de la aceste considerente, obiectivele specifice cercetărilor prezentate în cadrul acestei teze au constat în:

selectarea microorganismelor potențial producătoare de lipază;

studiul influenței componentelor mediului de cultură asupra bioproductivității microorganismului selectat și stabilirea compoziției optime a mediului de fermentație;

studiul influenței parametrilor de cultivare asupra activității lipolitice a tulpinii selectate și stabilirea valorilor optime ale acestora;

stabilirea etapelor de prelucrare post-biosinteză în scopul izolării și purificării lipazei microbiene, urmărind în mod special stabilirea particularităților de aplicare a metodelor de purificare a enzimelor microbiene în condițiile specifice;

studiul stabilității activității enzimatice a lipazei obținute prin biosinteză;

selectarea unor preparate vegetale cu un conținut crescut în principii active implicate în reglarea metabolismul lipidic;

caracterizarea farmacognostică a produselor vegetale selectate;

identificarea și dozarea compusilor activi din extractele vegetale obtinuțe;

formularea unor biopreparate cu activitate lipolitică, stabile din punct de vedere fizico-chimic, obținute prin combinarea lipazei microbiene cu preparate de origine vegetală.

Capitolul 5, denumit „Cercetări privind selecția microorganismelor producătoare de lipază și îmbunătățirea capacitătii de biosinteză a acestora”, marchează începutul cercetărilor experimentale. În acest capitol sunt prezentate tulpinile și metodele folosite pentru testarea capacității de biosinteză a lipazei, precum și metodele aplicate pentru îmbunătățirea productivității acesteia. Astfel, s-au testat 13 tulpini microbiene, aparținând Colecției de Microorganisme a Facultății de Biotehnologii. Evaluarea capacității de biosinteză a lipazei de către tulpinile testate s-a realizat printr-o metodă microbiologică calitativă, care presupune măsurarea zonelor de opacitate aparute în jurul coloniilor producătoare, dezvoltate pe medii specifice, solide, în prezența Tween 80, adăugat în mediul de cultură alături de CaCl2. Pentru fiecare tulpină în parte s-a calculat indicele lipolitic al coloniei și indicele lipolitic mediu. Tulpina de Yarrowia lipolytica, cultivată pe mediu YPG cu Tween 80, a prezentat cel mai mare indice lipolitic mediu, 1,19. În continuare, s-a procedat la îmbunătățirea productivității acestei tulpini, prin mutageneză cu radiatii UV. Astfel, după expunerea tulpinii de Yarrowia lipolytica timp de 40 de secunde la UV s-a reușit creșterea capacității de biosinteză cu 25%, față de tulpina parentală.

Cel de-al 6-lea capitol, intitulat „Cercetări privind biosinteza lipazei” este stucturat în trei subcapitole distincte, materialele și metodele folosite, rezultatele obtinuțe și concluziile partiale deduse. Obiectivele specifice urmărite, au constat în: stabilirea compoziției optime a mediului de fermentație pentru biosinteza lipazei, determinarea influenței parametrilor de cultivare asupra activității lipolitice a tulpinii de Yarrowia lipolytica UV-40 și stabilirea valorilor optime ale acestora.

Pentru realizarea acestor obiective s-au testat mai multe medii de cultură în compoziția cărora s-au introdus concentrații diferite de uleiuri naturale și sintetice: ulei de măsline, de floarea soarelui și Tween 80, în prezența sau absența glucozei. Concentrația maximă a enzimei (13,5 U/ml), s-a atins la un conținut de 2% ulei de măsline, în absența glucozei. S-a constatat că această valoare se micșorează o dată cu descreșterea concentrației de ulei și introducerea glucozei în mediul de fermentație. S-a observat că prezență glucozei în mediul de cultură stimulează cresterea cantitatii de biomasa, pe când uleiul de masline, determina biosinteza in cantități mari a enzimelor lipolitice. În cazul utilizării uleiului de floarea soarelui și Tween 80, s-au obținut rezultate mult mai scăzute, activitatea lipazică crescând de doar 2,4, respectiv 1,8 ori față de mediul martor, fără ulei. De asemenea, în urma cercetărilor realizate cu scopul stabilirii parametrilor optimi de biosinteză, s-a evidențiat efectul favorabil al aerării intense a mediului de fermentație (corespunzătoare unui raport volum mediu/volum flacon = 1:6,7), precum și folosirii următoarelor condiții de mediu: 280C, pH=6, agitare=240 rpm, durată=54 h.

În cadrul celui de-al 7-le a capitol, „Cercetări privind izolarea și purificarea lipazei microbiene”, s-au efectuat experimente constând în prelucrări post-biosinteză ale mediilor de fermentație, la nivel de laborator, cu scopul elaborării unui procedeu cât mai eficient de izolare și purificare a lipazei microbiene.

Având în vedere localizarea extracelulară a lipazei sintetizată de Yarrowia lipolytica UV-40, izolarea enzimei a impus separarea biomasei, operație care s-a realizat în conditii optime prin centrifugarea mediului de fermentatie la 4000 rpm, timp de 30 minute. Apoi, lichidul acelular s-a concentrat sub vid până la 1/3 din volumul inițial, ajungându-se la o cantitate de aprox. 42 U/ml.

În urma experimentelor efectuate, s-a constatat că izolarea lipazei se poate realiza cu rezultate bune prin precipitarea enzimei cu sulfat de amoniu, în procente de saturație cuprinse între 30 – 60%, cu recuperarea a 52% din activitatea lipolitică inițială și realizarea unui factor de purificare de 3,3.

Precipitarea cu etanol, aplicată ca metodă de purificare a lipazei, a condus la obținerea unor preparate enzimatice cu activități lipolitice cuprinse între 5610 și 6900 U/g, atunci când raportul soluție enzimă : etanol = 1 : 3, temperatura = +40C, timpul de perfectare a precipitării = 2 ore.

Pentru izolarea în condiții optime a lipazei microbiene sub formă de pulbere, am aplicat un procedeu bazat pe prelucrarea în trepte a proteinei enzimatice, conform următoarei succesiuni de etape:

Centrifugare mediu de biosinteză Concentrare lichid acelular Precipitare lipază cu sulfat de amoniu Reluare precipitat lipază în clorură de calciu Precipitare lipază cu alcool etilic Uscare la 30-350C Precipitat lipaza

În ceea ce privește caracterizarea lipazei microbiene din punct de vedere al cineticii reacției enzimatice specifice, în urma experimentelor realizate la valori diferite de temperatură și pH, am constat că parametrii optimi pentru acțiunea catalitică a preparatelor enzimatice obținute sunt 370C si pH=6.

Referitor la termostabilitatea preparatelor enzimatice obținute, s-a constatat că acestea sunt stabile și retin mai mult de 80% din activitatea inițială dacă sunt menținute timp de 24 de ore la 200C, 300C si 350C, în timp ce după 24 de ore, la 500C, se regăsește 60% din activitatea inițială.

La diferite valori ale pH-ului, preparatele enzimatice au prezentat, după 24 de ore, o mare stabilitate în domeniul 4 – 7, reținând aproape 100% din activitatea inițială. La valori ale pH-ului cuprinse între 8 si 9, enzima își pierde aproximativ 30%, respectiv 60% din activitatea inițială.

În capitolul 8, intitulat „Cercetări privind obținerea unor preparate bogate în principii active cu efect pozitiv asupra metabolismului lipidic” sunt prezentate, pe parcursul a trei subcapitole, materialele și metodele necesare obținerii și caracterizării preparatelor complexe conținând principii active, rezultatele și concluziile obținute în urma experimentelor realizate. În acest capitol s-au studiat următoarele materiale vegetale: fructe de cătină (Hippophae rhamnoides), frunze și flori de păducel (Crataegus oxyacantha), bulbi de usturoi (Allium sativum) și muguri de jugastru (Acer campestre). Acestea au fost supuse unor serii de determinări cu scopul caracterizării, identificării și determinării conținutului în compuși activi a materialelor vegetale luate în lucru.

Din punct de vedere al caracterizării macroscopice a materialelor vegetale, acestea au îndeplinit toate condițiile de calitate impuse de folosirea acestora pentru testele calitative și cantitative ulterioare, fiind conforme normelor descrise în Farmacopeea Romana Editia X.

În urma analizei extractelor obținute, s-a constatat un conținut foarte ridicat în lipază la fructele de cătină, de 6,3 U/g produs uscat, precum și la extractul din bulbi de usturoi, 4,9 U/g produs proaspăt. De asemenea, o activitate lipolitică ridicată s-a regăsit și la frunzele și florile de păducel, 3,2 U/g produs uscat, în timp ce la extractul glicerinat din muguri de jugastru aceasta a fost foarte scazute, de numai 0,4 U/g produs proaspăt.

Cele mai mari valori ale continuțului în flavone s-au obtinut în cazul frunzelor și florilor de păducel (0,22 g/100 g) (0,37 g/100 g). Cel mai ridicat conținut în compuși polihidroxifenolici s-a determinat la păducel și cătină, 1,7g/100 g, respectiv 1,55 g/100 g.

Compușii reducători au fost determinați în cantitate mare la fructele de cătină (1,45 g/100 g), celelalte materiale testate prezentând un conținut cu 50% mai scăzut.

Cătina s-a remarcat de asemenea, prin conținutul extrem de mare în vitamina C, atingând valoarea de 483 mg/100 g de produs uscat.

Datele obținute în cadrul acestui capitol experimental, a permis selectarea, în vederea asocierii cu lipaza micobiană, pulberea din fructe de cătină, pulberea din funze și flori de păducel și extractul din bulbi de usturoi, bogate în numeroase principii bioactive cu rol în reglarea metabolismului lipidic.

În ultimul capitol, 9, „Cercetări preliminare la nivel de laborator privind combinarea compușilor biologici obtinuți sub formă de comprimate”, experimentele au vizat formularea unor biopreparate cu activitate lipolitică, stabile din punct de vedere fizico-chimic, alcătuite din lipaza obținută din surse microbiene și preparate origine vegetală și condiționarea lor sub formă de comprimate. Pentru îndeplinirea obiectivului urmărit s-au realizat mai multe variante de preparate, conținând cantități diferite din cele patru ingrediente (lipaza microbiană, pulbere din fructe de cătină, extract din bulbi de usturoi, pulbere din frunze și fructe de păducel).

Raportul de asociere dintre cele patru componente a urmărit atât necesarul de lipază pe unitatea de formă farmaceutică, cât și efectul antioxidant determinat de complexul fitochimic obținut prin asocierea menționată care asigură beneficii terapeutice crescute în ceea ce privește prevenirea și tratarea bolilor generate de dezechilibrul lipidic din organism.

Pentru asigurarea stabilității în timp a produsului finit, s-au folosit uleiuri esențiale de cimbru, de fenicul și de rozmarin, cu un pronuntat efect antiseptic. Uleiurile esențiale, pe lângă efectele antifungice și antibacteriene, au și proprietăți de potențare a efectelor cumulate antilipemice, anticolesterolemiante și de ameliorare a circulației coronare și cerebrale.

După mai multe incercări, s-a constatat faptul că extractul de usturoi nu poate fi folosit la prepararea unor granule, din cauza mucilagiului gumos pe care-l conține și care împiedică uscarea granulelor, favorizând astfel lipirea lor. Astfel, am decis folosirea pulberii din frunze și flori de păducel, care are efect vasodilator, hipotensiv și sedativ la nivelul SNC, având și un efect antioxidant foarte bun.

Cercetările s-au finalizat prin stabilirea compoziției produsului finit și a tehnologiei de obținere a comprimatelor, obținându-se astfel, un preparat valoros cu un efect puternic anticolesterolemiant și antilipemic, polimineralizant și polivitaminizant.

Produsul fitoterapeutic realizat reprezintă o asociere complexă de principii bioactive naturale și elemente minerale sub formă de săruri usor asimilabile în organism, care acționează sinergic la anumite concentrații, având acțiune de reducere a nivelului lipidelor serice, a colesterolului seric, a concentrației LDL – colesterol și a trigliceridelor serice.

Varietatea mare de substanțe bioactive din principiile active asociate în formula produsului, fac din acesta un important și eficient preparat hipolipemiant.

Lucrarea de față constituie un punct de plecare în realizarea și comercializarea unei forme farmaceutice destinate administrării orale, pentru prevenirea sau ameliorarea unor afecțiuni determinate de dezechilibrul lipidic din organism.

Originalitatea acestei teze de doctorat constă în obținerea unui preparat biologic prin asocierea unor produse de origine microbiană, alături de produse vegetale, bogate în principii active și elemente minerale, sub formă de săruri ușor asimilabile în organism, care acționează asupra reducerii nivelului trigliceridelor serice și a colesterolului seric, prevenind sau ameliorând astfel, unele tulburari apărute în organism, la nivelul metabolismului lipidic.

ANEXA 2

ABSTRACT

“Studies on obtaining biological products with lipolytic activity from microbial sources and indigenous medicinal plants”

It is known that improper diet, mainly based on products exclusively processed as "fast food", which took a large scale in Romania too, associated with many other factors, such as daily stress and lack of movement, lead to obesity, a disease that produces other complex diseases. This disease is caused by the dysfunctions that occur in lipid metabolism.

Thesis entitled "Studies on obtaining biological products with lipolytic activity from microbial sources and indigenous medicinal plants” is extended on to 211 pages and is made, in accordance with current legal provisions, by two main parts, one theoretical and the second, experimental. The first part, entitled "Theoretical aspects", structured in 4 chapters, is held over 55 pages, containing 2 tables and 6 figures, and the second part, called "Experimental research", consists of 5 chapters, contains 135 pages containing 38 tables and 39 figures.

The first part consists of 4 chapters which are summarized, information from literature on the subject of the thesis, which was subsequently used to develop methods and procedures applied in the experimental and for interpreting and comparing data.

The first chapter, entitled “General presentation of lipases”, presents data from the literature on characterization of lipases and the main sources for obtaining them. Lipases are carboxyl-ester hydrolase that catalyzes the hydrolysis reaction of esters of glycerol or other alcohols with long chain fatty acids, to formation of free fatty acids and glycerin or alcohol properly. The main characteristic of lipases consists in their unique and specific property to act on oil-water interface in a heterogeneous environment (emulsions).

Biological role of lipases for living organisms is particularly important because they ensure the functioning of membranes, participate in lipid metabolism, and in the process of fat storage reserve.

Lipases find numerous applications, among which we can mention: to obtain drugs indicated in dispersions or in non-steroidal anti-inflammatory type, as food additives, to obtain biodiesel, to remove grease from cotton fibers, leather or fur, or for water treatment waste.

Lipolytic enzymes can be obtained from animal sources, plant or microbes. In recent decades, to achieve a wide range of enzymes and biologically active substances, microorganisms are used successfully.

Use of lipases, as active substances entering the composition of pharmaceutical preparations, requires them to obtain a purity as advanced standardization of their content, and knowledge of properties, relating not only to substrate specificity, but the main parameters that influence enzymatic activity. Thus, in Chapter 2 are presented the “methods for the isolation and purification of enzyme protein with lipolytic activity”, and in Chapter 3 are described “methods applied for determination of lipases activity”.

Today is given increasingly larger attention to plants and is appreciated that they represent an inexhaustible source of raw materials which regenerate each year. They can be used as raw material for the preparation of drugs or industrial extraction of certain active principles. In the last chapter of the first part, entitled "Phytotherapy – the cleanest and most natural applied science" are presented the therapeutic advantages of using plants and are exemplified some herbal preparations used to prevent or treat certain diseases.

In this context, the main objective of the research conducted in the thesis was to obtain biological products with lipolytic activity, physically and chemically stable, obtained by combining microbial lipase with herbal preparations, rich in active principles, which addresses to specific segment of the population with advanced disease, generated by the imbalance of body fat..

Based on these considerations, the specific objectives of the research presented in this thesis were:

selection of microorganisms producing lipase

study the influence of culture medium ingredients on the bio-productivity of the selected microorganisms and determining the optimal composition of fermentation medium

study the influence of cultivation parameters on lipolytic activity of the selected strain and determining their optimal values

setting post-processing steps in the biosynthesis of microbial lipase for isolation and purification, aiming in particular to establish the peculiarities of the methods of purification of microbial enzymes in specific conditions

study the stability of lipase enzyme activity obtained by biosynthesis

selection of herbal preparations with a high content in active principles involved in regulating lipid metabolism

pharmacognostical characterization of selected plant products

identification and determination of active compounds derived from plant extracts

formulation of biological products with lipolytic activity, physically and chemically stable, by combining microbial lipase with plant preparations.

The chapter 5, entitled "Research on selection of the lipase producing microorganisms and improvement of their capacity of biosynthesis" marks the beginning of experimental research. In this chapter, strains and methods used for testing the capacity of biosynthesis of lipase, and methods used to improve its productivity are presented. Thus, 13 microbial strains were tested, belonging of Collection of Microorganisms of the Faculty of Biotechnology. Evaluation of the lipase biosynthesis by the presented strains was done by a qualitative microbiological method, which involves measuring the areas of opacity appeared around the producing colonies, developed in specific areas, strong in the presence of Tween 80 added in the culture medium together with CaCl2. Separately, for each strain, was calculated the lipolytic index of the colony of and the average lipolytic index. Yarrowia lipolytica strain, grown on YPG medium with Tween 80, presented the highest average of lipolytic index, 1.19. Next, I proceeded to improve the productivity of this strain by mutagenesis with ultraviolet radiation. Thus, after exposure for 40 seconds to UV radiations, the capacity of biosynthesis of Yarrowia lipolytica did increase by 25%, compared to the parental strain.

The 6th chapter, entitled "Research on biosynthesis of lipases“ is structured into three distinct chapters, materials and methods, results and discussions and partial conclusions. Specific objectives, consisted of: determining the optimal composition of fermentation medium for lipase biosynthesis, determining the influence of cultivation parameters on the lipolytic activity of Yarrowia lipolytica UV-40 and establish their optimal values.

To achieve these objectives many compositions of culture media have been tested in which were introduced various concentrations of natural and synthetic oils: olive oil, sunflower oil and Tween 80, in the presence or absence of glucose. The maximum concentration of enzyme (13,5 U/ml), reached a content of 2% olive oil, in the absence of glucose. It was found that this value decreases along with decrease in concentration of oil and the introduction of glucose in the fermentation medium. It was observed that the presence of glucose in the culture medium stimulates the growth of the amount of biomass, while the olive oil in large quantities causes biosynthesis of lipolytic enzymes. In case of sunflower oil and Tween 80 were obtained much lower results, increasing lipase activity of only 2,4, 1,8 times respectively, over the control culture, without oil. Also, from the researches made in order to establish the optimum parameters of biosynthesis, the positive impact of intensive aeration of the fermentation medium (corresponding to a volume ratio medium / bottle volume = 1:6,7) and use the following environmental conditions: 280C, pH 6, agitation = 240 rpm, duration = 54 h were highlighted.

In the 7th chapter, "Research on the isolation and purification microbial lipases”, experiments were performed consisting post-processing of the fermentation media, at the laboratory level, to develop an effective process of isolation and purification of microbial lipase.

Given the extracellular location of Yarrowia lipolytica UV-40 lipase, enzyme isolation imposed biomass separation, performed by centrifugation of the fermentation media at 4000 rpm, for 30 minutes. Then, the acellular fluid concentrated under vacuum conditions to 1/3 of its original volume, leading to an amount of about 42 U / ml.

After the experiments, it was found that lipase isolation can be achieved with good results by enzyme precipitation with ammonium sulphate, saturation percentage between 30-60%, with recovery of 52% of the initial lipolytic activity and achieving a purification factor 3.3.

Precipitation with ethanol, applied as a method of purifying lipase, led to obtain enzyme preparations with lipolytic activities between 5610 and 6900 U / g, when the ratio of enzyme solution : ethanol was 1 : 3, the temperature 400C and the time for completing the precipitation, 2 hours.

For isolation in optimal conditions of microbial lipase powder, I applied a method based on enzymatic protein processing in steps, according to the following sequence:

Centrifuging the fermentation medium Concentration the acellular fluid Precipitation of lipase with ammonium sulfate Resume precipitated lipase in calcium chloride solution Precipitation of lipase with alcohol

Drying at 30-350C Lipase preparate

Regarding the characterization of microbial lipase, in terms of specific enzyme reaction kinetics, after experiments performed at different values of temperature and pH, I found that the optimal parameters for the catalytic action of enzyme preparations are 370C and pH=6.

On thermal stability of enzyme preparations obtained, it was found that they are stable and retain over 80% of initial activity if they are kept for 24 hours at 200C, 300C and 350C, while after 24 hours at 500C, 60% of the initial activity was found.

At different pH values, enzyme preparations showed a great stability after 24 hours, at 4-7 pH values, retaining almost 100% of initial activity. At a pH value between 8 and 9, the enzyme loses about 30%, and 60% respectively, of initial activity.

In Chapter 8, entitled "Investigations on obtaining preparations rich in active principles with positive effects on lipid metabolism" are presented during the three chapters, the materials and methods necessary to obtain and characterize complex preparations containing active ingredients, the results obtained from experiments and the conclusions. In this chapter the followed plant materials were studied: underbrush frutes (Hippophae rhamnoides), hawthorn leaves and flowers (Crataegus oxyacantha), garlic bulbs (Allium sativum) and maple buds (Acer campestre). They were subjected to a series of determinations in order to characterize, identify and determine the active compounds content of plant material.

In terms of macroscopic characterization of plant material, they have fulfilled all the quality requirements of their use for further quantitative and qualitative tests, corresponding to the rules described in Romanian Pharmacopoeia Xth Edition.

Following the analysis of extracts, it was found a very high lipase content in underbrush frutes, 6.3 U / g dry product, as well as the garlic bulbs extract, 4.9 U / g fresh product. Also, a high lipolytic activity was found in hawthorn leaves and flowers of, 3.2 U / g dry product, while the glycerin extract of maple buds was very low, only of 0.4 U / g fresh product.

The highest values of the flavones content were obtained in hawthorn leaves and flowers (0.37 g/100 g) and underbrush frutes (0.22 g/100 g). The highest content of polyhydroxyphenols was determined to hawthorn and underbrush, 1,7 g/100 g and 1,55/100 g respectively.

Reducing compounds were determined in large amounts in underbrush fruits (1.45 g/100 g), the other plant materials presenting 50% less.

Underbrush was noted also by the extremely high content of vitamin C, reaching 483 mg/100 g dried product.

Data obtained in this experimentally chapter allowed the selection, in order to be associated with microbial lipase of underbrush fruit powder, hawthorn leaves and flowers powder and of garlic bulbs extract, rich in many bioactive principles important in regulating the lipid metabolism.

In the last chapter, "Preliminary research on laboratory level for combining biological compounds produced as tablets”, experiments have concerned on the formulation of biological products with lipolytic activity, physically and chemically stable, consisting of lipase obtained from microbial sources and plant preparations preserved as tablets. To attain its objective were made several versions of preparations containing various quantities of the four ingredients (microbial lipase, underbrush fruit powder, garlic bulbs extract, hawthorn leaves and flowers powder).

Association report of the four ingredients aimed both lipase necessary per unit of pharmaceutical form, and antioxidant effect determined by the phytochemical complex obtained by the association mentioned, that provides therapeutic benefits in terms of increased prevention and treatment of diseases caused by imbalance of body fat.

To ensure stability of the final product, essential oils of thyme, fennel and rosemary with a strong antiseptic effect were used. Essential oils, besides the antifungal and antibacterial effects, have potentiating properties of antilipemic, anti-cholesterol and enhanced coronary and cerebral circulation.

After several attempts, it was found that garlic extract can not be used in the preparation of granules due gumos mucilages which it contains and which prevents drying of grain, thereby sticking together. Thus, I was decided to use hawthorn leaves and flowers powder, which is an effective vasodilator, hypotensive and CNS depressant, and having a very good antioxidant effect.

The research were completed by establishing the composition of the finished product and technology for obtaining tablets, thus obtaining a valuable preparation with a strong antilipemic, anti-cholesterol and mineralizing and vitamining effect.

The phytotherapeutic product is a complex combination of natural bioactive principles and nutrient salts which can be easily assimilated into the body and act synergistically at certain concentrations, lowering the level of serum lipids, serum cholesterol, the concentration of LDL – cholesterol and triglycerides.

The large variety of active principles associated in the product makes it an important and effective hypolipemiant preparate.

This paper is a starting point in creating and marketing a pharmaceutical form for oral administration used for prevention or improvement of diseases caused by imbalance of body fat.

The originality of this thesis consists of obtaining a biological preparation by combination of microbial products with plant materials, rich in active principles and minerals, easily to assimilate by the body, acting by reducing the serum triglyceride levels and serum cholesterol, thus preventing or improving some disturbances occurring in the body, at the lipid metabolism.

ANEXA 3

ListĂ DE PUBLICAȚII

GROPOȘILĂ-CONSTANTINESCU DIANA-GABRIELA

lucrĂri ȘtiinȚifice Și articole publicate

Producerea L-asparaginazei II de către tulpini recombinante de Escherichia coli

(Production of L-asparaginase II by recombinant Escherichia coli strains)

Autori: Călina-Petruța Cornea, Irina Lupescu, Ion Vătafu, Gabriela-Valeria Săvoiu, Marian Dorobanțu, Gheorghe Câmpeanu, Diana Constantinescu

A 12a Ediție a Zilelor Balcanice ale Biochimiei și Biofizicii cu tema “Bioștiințele Moleculare în Era Post-Genomică”, 10-13 mai, 2001, București; Volum de rezumate, P-57, pag. 77-78)

Roum. Biotechnol. Lett., 7(3), 2002, 717-722

Cercetări privind biosinteza, izolarea și purificarea fitazei de origine microbiană: selecția și caracterizarea unor tulpini din genul Aspergillus producătoare de fitază

(Studies concerning the microbial phytase biosynthesis, isolation and purification)

Autori: Gabriela Săvoiu, Eugenia Mocanu, Irina Lupescu, Maria Pamfil, Diana Constantinescu, Ciuhu I.

Al III-lea Simpozion cu participare internațională “Cercetarea medicamentului între informație și științele vieții”, București, 7-8 nov., 2002; Vol. de rezumate, pag 50-51

Îmbunătățirea potențialului de biosinteză a L-asparaginazei II de către tulpini de Escherichia.coli prin modificări genetice

(Improvement of L-asparaginase II biosynthesis in Escherichia coli strains by genetic modifications)

Autori: Calina Petruța Cornea, Irina Lupescu, Tudora Caraiani, Gabriela Săvoiu, Diana Constantinescu, Irina Grebenișan

Al III-lea Simpozion cu participare internațională “Cercetarea medicamentului între informație și științele vieții”, București, 7-8 nov., 2002; Vol. de rezumate, pag.15-16

Studii comparative privind imobilizarea prin două metode diferite a celulelor de Escherichia coli cu activitate aspartazică

(Comparative studies on the immobilization of aspartase containing Escherichia coli cells by two different methods)

Autori: Irina Lupescu, Maria Pamfil, Gabriela Săvoiu, Diana Constantinescu

Al III-lea Simpozion cu participare internațională “Cercetarea medicamentului între informație și științele vieții”, București, nov., 2002; Volum de rezumate, pag.32-33

Sweetness Power QSAR’s by PRECLAV Software

(Relații cantitative structură – putere edulcorantă cu ajutorul software-ului PRECLAV)

Autori: Tarko Laszlo, Irina Lupescu, Diana Gropoșilă Constantinescu

ARKIVOC, vol. 2005, part. X, 254-271 (2005)

QSAR Studies on Amino-succinamic Acid Derivatives Sweeteners

(Studii QSAR asupra îndulcitorilor din clasa derivatilor acidului amino-succinamic)

Autori: Laszlo Tarko, Irina Lupescu, Diana Constantinescu-Groposila

ARKIVOC, vol. 2006, part XIII, 22-40 (2006)

Studii privind obtinetrea unor polihidroxiesteri alifatici prin biosinteza microbiana

Autori: Irina Lupescu, Diana Groposila-Constantinescu, Carmen-Nicoleta Ionescu

Simpozionul Facultatii de Biotehnologii, Bucuresti, ian. 2007

Noi precursori ai unor aspartil-dipeptide potențial edulcorante

Autori: Irina Lupescu, Diana Groposila-Constantinescu, Carmen-Nicoleta Ionescu

Simpozionul Facultatii de Biotehnologii, Bucuresti, ian. 2007

New PHA producing bacteria isolated from poluted soils

Autori: Cornea Calina-Petruta, Voaides Catalina, Ciuca Matilda, Lupescu Irina, Groposila-Constantinescu Diana, Stefanescu Mircea, Voicu Ana

European Polymer Congress 2007, Portoroz, Slovenia, pag. 245

Studies on biosynthesis of PHA by some Pseudomonas spp. strains

Autori: Lupescu Irina, Groposila-Constantinescu Diana, Cornea Calina-Petruta, Voaides Catalina, Eremia Mihaela, Cercel Maria, Moscovici Misu

European Polymer Congress 2007, Portoroz, Slovenia, pag. 142

Polyhydroxyalkanoate biosynthesis in new bacterial strains with antimicrobial properties

Autori: Cornea Calina-Petruta, Lupescu Irina, Voaides Catalina, Groposila-Constantinescu Diana, Ciuca Matilda, Eremia Mihaela

Bull. USAMV-Cluj-Napoca, 63-64, pag. 540, 2007

Producerea lipazei de catre o tulpina a drojdiei neconventionale Yarrowia lipolytica si izolarea enzimei brute

(Production of lypase by a strain of the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica and isolation of crude enzyme)

Autori: Irina Lupescu, Diana Groposila-Constantinescu, Stefana Jurcoane, Camelia Diguta, Andreea Cozea, Luminita Tcacenco

Romanian Biotehnological Letters, vol.12 (3), 3261-3268, 2007

Influenta unor factori nutritionali asupra producerii de lipaza de catre Yarrowia lipolytica

(Influence of some nutritional factors on lipase production by Yarrowia lipolytica)

Autori: Sasarman Elena, Diguta Camelia, Jurcoane Stefana, Lupescu Irina, Groposila Constantinescu Diana, Tcacenco Luminita,

Romanian Biotehnological Letters, vol.12 (6), 3483-3488, 2007

Derivati ai acidului L-aspartic ca precursori ai edulcorantilor aspartil-dipeptidici. I. Sinteza acidului L-aspartic prin aminarea reductiva biocatalitica a acidului fumaric

Autori: Irina Lupescu, Diana Gropoșilă-Constantinescu, Maria Pamfil, Gabriela Valeria Săvoiu

Revista de Chimie, 2, 210-213, 2007

Biosynthesis and Recovery of MCL-PHA Produced by a Pseudomonas putida Mutant Strain

(Biosinteza si izolarea MCL-PHA produsi de o tulpina mutanta de Pseudomonas putida)

Autori: Lupescu Irina, Groposila-Constantinescu Diana, Cornea Calina Petruta, Voaides Catalina, Ciuca Matilda

Al 33-lea Congres al Federatiei Europene a Societatilor de Biochimie si a 11-a Conferinta a Uniunii Internationale de Biochimie si Biologie Moleculara (33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Conference), Atena, Grecia, 28.06. – 03.07.2008

FEBS Journal, 275 (suppl 1), pag. 412, 2008

The Influence of Carbon Source upon the Structure of PHA Produced by a Mutant Strain of Pseudomonas putida

Autori: Lupescu Irina, Constantinescu-Groposila Diana, Cornea Petruta Calina, Voaides Catalina, Eremia Mihaela, Gabriela-Valeria Savoiu, Moscovici Misu

Al XII Congress InternationaL de Bacteriologie si Microbiologie Aplicata, Istambul, Turcia, 5.08.-11.08.2008

Abstract Book, pag. 87, 2008

Msc-PHA accumulatrion in Pseudomonas putida P5 (wild trype and mutants) in lipid containig media

(Acumularea msc-PHA in Pseudomonas putida P5 – tip salbatic si mutante – in medii lipidice)

Autori: Cornea Calina-Petruta, Lupescu Irina, Voaides Catalina, Groposila-Constantinescu Diana, Ciuca Matilda, Briceag Ilie, Pop Aneta

Conferinta Internationala de Microbiologie industriala si biotehnologie aplicata, 09.10. – 11.10.2008, Galati, Romania, Book of Abstracts, pag. 29 (premiat ca cel mai bun poster al conferintei)

Immobilization of cellulases on solid substrates and permselective membranes

(Imobilizarea celulazelor pe substraturi solide și membrame permselective)

Autori: Lupescu Irina, Gropoșilă-Constantinescu Diana, Moscovici Mișu, Lefter Emilia, Toma Radu

34rd FEBS Congress, 2009, Praga, Republica Cehă

FEBS Journal, 276 (suppl. 1), pag. 91, 2009

Screening and production of microbial extracellular lipases

(Selecția microorganismelor și producția lipazelor microbiene)

Autori: Gropoșilă-Constantinescu Diana, Câmpeanu Gheorghe, Lupescu Irina, Tcacenco Luminița, Toma Radu

3rd Congress of European Microbiologists (FEMS 2009), Goteborg, Suedia

Abstract Book, 2009

Lipase-catalyzed transesterification of triolein

(Reacții de transesterificare catalizate de trioleina)

Autori: Gropoșilă-Constantinescu Diana, Câmpeanu Gheorghe, Lupescu Irina, Tcacenco Luminița, Toma Radu

34rd FEBS Congress, 2009, Praga, Republica Ceha

FEBS Journal, 276 (suppl. 1), pag. 87, 2009

CĂrȚi / CURSURI

1. Jurcoane Ștefana, Gropoșilă-Constantinescu Diana, Diguță Camelia-Filofteia, Biotehnologie Generală-Îndrumător de lucrări practice, 2010, Ed. Univ. Buc. “ARS DOCENDI”.

BREVETE

1. Noi derivati N-substituiti ai acidului L-aspartic si procedeu de obtinere a acestora

Autori: Irina Lupescu, Diana Groposila Constantinescu, Tarko Laszlo, Caproiu Teodor

Cerere de brevet de invenție nr: A/00941/2005

2. Procedeu de obținere a lipazei cu o tulpină de Yarrowia lipolytica   

Autori: Ștefana Jurcoane, Irina Lupescu, Luminița Tcacenco, Diana Gropoșilă-Constantinescu, Camelia Diguta Filofteia, Andreea Cozea, Diana Pelinescu, Elena Săsărman

Cerere de brevet de invenție nr.: A/01178/2007

CONTRACTE DE CERCETARE (nationale)